MXPA05004628A - Uso de resveratrol para la preparacion de un medicamento util para el tratamiento de infecciones del virus de influenza. - Google Patents

Abstract

Se describe el uso de resveratrol para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de la influenza. Dicho medicamento ejerce su actividad terapeutica a traves de la inhibicion de la replicacion viral.

Description

USO DE RESVERATROL PARA LA PREPARACION DE UN MEDICAMENTO UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE INFECCIONES DEL VIRUS DE INFLUENZA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención descrita en la presente se refiere al uso de resverat ol como un ingrediente activo en la preparación de un medicamento para tratar infecciones del virus de influenza. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El resveratrol, es decir, 3,4,5-trihidroxiestilbeno, he sido intensivamente estudiado recientemente, con relación a las propiedades benéficas conocidas del vino tinto, del cual es uno de los ingredientes fundamentales (Life Sci., 71, 2145-52, 2002) . El resveratrol está ubicado en las cáscaras de las uvas negras en cantidades que varían desde 50 hasta 100 g/g y su concentración en vinos tintos varía desde 1.5 hasta 3 mg/1. Han demostrado numerosos estudios una actividad anticarcinogénica de resveratrol, los mecanismos de acción de los cuales pueden subdividirse como sigue : inhibición de la activación del factor de transcripción NF-kB, que es capaz de regular la expresión de varios genes implicados en procesos inflamatorios y carcinogénicos . (Lancet, 341, 1103-1104, 1993; Science, 275, 218-220, 1997; (Ref. 163044) Proc. Nati. Acad. Se, 94, 14138-14143, 1997; Life Science, 61, 2103-2110, 1997; Brit. J. Pharm. , 126, 673-680, 1999; J. Imm. 164, 6509-6519, 2000); inhibición de diversas proteínas, incluyendo la proteína cinasa C (Bioch., 38, 13244-13251, 1999), ribonucleotido reductasa (FEBS Lett., 421, 217-279, 1998) y ciclo-oxigenasa-2 (COX-2) en células epiteliales de mamífero (Ann. N. Y. Acad. Sci, 889, 214-223, 1999; carcinog., 21, 959-963, 2000); activación de caspasas 2, 3, 6 y 9 [FASEB J., 1613-1615, 2000) y modulación del gen p53 que es un supresor tumoral conocido {Cáncer Research, 59, 5892-5895, 1999; Clin. Bioch., 34, 415-420, 2001). Entre las acciones benéficas de resveratrol también se menciona su actividad antioxidante, sugerida por la capacidad antes mencionada para contrarrestar los efectos dañinos producidos por diversas substancias y/o condiciones que provocan stress oxidante intracelular (Free Radie. Res., 33, 105-114, 2000) . El resveratrol puede inducir relajación vascular por medio de la producción de óxido nítrico en el nivel endotelial vascular (Cáncer Res., 59, 2596-01, 1999), inhibe la síntesis de tromboxano en plaquetas {Clin. Chin. Acta, 235, 207-219, 1995; Int. J. Tissue React. , 17, 1-3, 1995), y de leucotrienos en neutrófilos y previene la oxidación y agregación de lipoproteínas de baja densidad (LDL) (Lancet, 341, 1103-1104, 1993; Life Sci. , 64, 2511-1521, 1999).

Recientemente, ha sido demostrada una actividad inhibidora de resveratrol contra el virus Herpes Simple de DNA {Antiv. Res., 43, 145-155, 1999) a base de sistemas experimentales in-vitro. Datos obtenidos por los presentes autores y por otros grupos de científicos de investigación han revelado que diversas substancias antioxidantes son capaces de inhibir la replicación del virus de parainfluenza Sendai (SV) tipo 1, del virus Herpes Simple 1 (VHS-1) y del virus de inmunodeficiencia adquirida (VIH) in vitro (AIDS Res. Hum. Retoviruses, 1997: 1537-1541; Biochem. Biophys . Res. Commun., 1992; 188, 1090-1096; Antivir. Res., 1995, 27, 237.253). La eficacia antiviral de substancias antioxidantes también se ha demostrado en un modelo murino con SIDA (MAIDS) , así como en la queratitis del VHSl [AIDS Res. Hum. Retroviruses, 1996: 12, 1373-1381: Exp. Eye. Res., 200: 70, 215-220) . : La influenza es un problema epidemiológico de proporciones mundial con serios problemas de salud pública como resultado y con mayores repercusiones económicas del cuidado de la salud. El virus responsable de la influenza es propagado y altamente infeccioso. Desafortunadamente, las terapias actualmente disponibles son todavía no efectivas completamente y con frecuencia conducen a la selección de cepas virales resistentes (Fields, cap47, 1533-79, 2001) y, más aún, las campañas de vacunación, además de las desventajas inherentes en la prevención a base de vacunas, todavía no proporciona protección satisfactoria debido a la variabilidad antigénica extrema del virus (Fields, cap47, 1533-79, 2001) . Entre diversas estrategias para atacar la replicación viral, estudios recientes (J. of Viral., 74, 1781-1786, 2000) han reportado el desempeño importante de la proteína MI en la transportación de ribonucleoproteínas especificas de virus al citoplasma. Esto parece ser una fase fundamental en el ciclo de replicación del virus, tanto que la inhibición de la replicación viral puede ser perseguido a través de la retención de la nucleoproteína en el núcleo de la célula infectada debido a la síntesis inhibida de la proteína M. Este fenómeno puede ser atribuible a la inhibición de las proteínas celulares con una función de cinasa. De hecho, se ha demostrado recientemente que la inhibición de las cinasas provoca la retención del NP del núcleo celular (Na ture Cell. Biol. , 3, 301-5, 2001; J. of Virol . , 74, 1781-86, 2000), junto con una acción inhibidora potente contra la replicación del virus de influenza. GSH es conocido por ser el principal antioxidante en el sistema de redox celular y ha sido asociado con la replicación de diversos virus. De hecho, estudios previos conducidos por los presentes inventores han demostrado que durante la infección viral es posible observar una reducción en los niveles de GSH como resultado de la infección misma (Rotilio et al., "Oxidative stress on cell activation in viral infection", 143-53, 1993; Palamara et al., Antiviral Research, 27, 237-53, 1995) . La regulación aberrante del mecanismo conocido de apoptosis es el factor fundamental responsable de numerosas enfermedades en seres humanos, como una variedad de enfermedades autoinmunes, infecciosas o neurológicas como SIDA y cáncer. En estudios previos, se ha descrito que el resveratrol permite la eliminación de células tumorosas a través de la inducción de la apoptosis de las células. Recientemente, estudios conducidos por Tinhofer I. et al. (FASEB J. , 18, 1613-15, 2001) han revelado que los primeros casos de apoptosis inducidos por resveratrol se caracterizan por la alteración de la membrana potencial mitocondrial (?Ft?) , mediante la liberación de especies de oxígeno reactivos (ROS) y mediante la activación de caspasas 2, 3, 6 y 9. También se conoce que el virus de influenza induce apoptosis en varios porcentajes, de acuerdo con la cepa viral y la multiplicidad de la infección. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se ha descubierto que el resveratrol ejerce una acción inhibidora sobre la replicación del virus de influenza. En una manera completamente sorprendente, también se ha descubierto que el resveratrol ejerce su acción inhibidora sobre la replicación del virus de influenza no a través de la actividad antioxidante esperada, sino a través de un mecanismo particular de inhibición de la proteína cinasa C, una enzima celular que juega un papel principal en el proceso de replicación del virus de influenza. La ventaja principal producida por el uso de resveratrol consistiría por lo tanto en su capacidad para atacar el virus indirectamente, es decir, al interferir con una estructura celular funcional del virus, más bien que con la partícula viral en si misma. Este tipo de enfoque conduciría por lo tanto a la invención del virus, evitando el suceso del fenómeno de resistencia a los fármacos antivirales más comunes. Por consiguiente, un objeto de la presente invención es el uso de resveratrol para la preparación de un medicamento útil para la prevención y/o tratamiento de infecciones del virus de influenza. En una aplicación preferida de la presente invención, se utiliza resveratrol contra el virus de influenza humana. En una aplicación más amplia de la invención, sus objetivos también incluyen el uso de resveratrol para la preparación de un medicamento útil para el tratamiento de infecciones del virus de influenza en el campo veterinario . La presente invención será ilustrada ahora en detalle, también con la ayuda de los ejemplos y de las figuras, donde: las Figuras 1A-1C ilustran el efecto de resveratrol en la replicación del virus de influenza PR8 en células MDCK, y, mas precisamente, en la Figura 1A en el caso de administración post-infección, en la Figura IB en el caso de administración pre-infección, y en la Figura 1C en el caso de administración pre- y post-infección; las Figuras 2A-2B ilustran el efecto de resveratrol en monocapas confluentes de células MDCK no infectadas, y, mas precisamente, el número de células viables; las Figuras 3A-3B ilustran la caracterización de la actividad antiviral de resveratrol, y, mas precisamente, en la Figura 3A el tratamiento durante la adsorción viral y en la Figura 3B el efecto en las partículas virales; las Figuras 4A-4C ilustran la caracterización de la actividad viral de resveratrol, y, de ser preciso, en la Figura 4A en el caso de administración inmediatamente después de la infección y eliminación en tiempos diferentes, y, en la Figura 4B, en el caso de adición en tiempos diferentes con relación a la infección; la Figura 5 ilustra la apoptosis en células MDCK tratadas con resveratrol (rombos: no infectados, cuadrados: infectados); la Figura 6 ilustra la correlación entre el efecto antiviral de resveratrol y el estado de redox intracelular; la Figura 7 ilustra el efecto de resveratrol sobre la síntesis de proteínas virales del virus de influenza PR8 ; la Figura 8 ilustra el resultado de la PCR para mARN de las proteínas virales precedentes; la Figura 9 ilustra el efecto de resveratrol in vivo después de la infección con el virus de influenza PR8. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Para los propósitos de ilustrar la eficacia de la presente invención, estudios in vi tro se han conducido utilizando virus de influenza A/PR8/34, subtipo H1N1 (de aquí en adelante referido en resumen como virus PR8) . Esta cepa se utilizó puramente por medio de un ejemplo, siendo entendido que la presente invención es aplicable para el virus de influenza en el sentido general del término. Materiales y métodos Resveratrol es un producto que está comúnmente disponible en el mercado o que puede obtenerse utilizando los métodos conocidos reportados en la literatura. La substancia utilizada .se disuelve en DMSO (80 mg/ml) . Las concentraciones utilizadas para los experimentos se obtuvieron por medio de diluciones sucesivas en RPMI 1640. Todas las muestras control se trataron con DMSO en las mismas dosis utilizadas para disolver el resveratrol . En estas concentraciones el DMSO produjo efectos no tóxicos sobre las células. Cultivos celulares Para el estudio de la replicación del virus de influenza se utilizaron células MDCK (células epiteliales de riñon de perro) . Las células se cultivaron en frascos pequeños T-25 o en placas de Libno de 6- y 24 cavidades en un medio de cultivo RPMI agregado con L-glutamina, penicilina-estreptomicina y 10% de suero de ternero fetal (FCS, por sus siglas en inglés) y mantenido a 37°C en una atmosfera de G¾ al 5%. Las monocapas celulares confluentes fueron separadas con una solución de tripsina al 0.25%, se centrifugaron y se volvieron a germinar en un medio fresco. la cuenta celular se hizo utilizando un hemocitómetro y la viabilidad celular se determinó por medio de la exclusión con coloración de viabilidad Azul Tripan (0.02%) . Producción del virus El virus se produjo por medio de inoculación de una suspensión viral diluida adecuadamente en la cavidad de alantoidea de huevo de gallina embrionado (incubado) 10 días. Después de incubar los huevos a 37°C durante 72 horas, el fluido de alantoidea que contiene las partículas virales formadas nuevamente fue clarificado por centrifugación a +4°C y almacenado a -80 °C. Titulación del virus . - La titulación del virus se hizo utilizando la técnica de hemoaglutinina que está basada en la capacidad, peculiar a este virus, para aglutinarse en las células sanguíneas . El virus sin diluirse en el fluido de alantoidea se tituló por dilución escalonada con solución salina de tampón fosfato (PBS) en placas de 96 pozos, a las cuales se les agregó más tarde una suspensión de células sanguíneas humanas al 0.5% del grupo O Rh+. Las placas se dejaron luego a temperatura ambiente suficiente tiempo para que la reacción de hemoaglutinación ocurriera. El título viral de la muestra, expresado en unidades hemoaglutinantes (HAU) , fue representado por la dilución final ocasionando hemoaglutinación completa. La liberación del virus en la parte de las células infectadas se evaluó con el mismo procedimiento sobre los sobrenadantes de las muestras infectadas que fueron obtenidas 24 y 48 horas después de la infección. Infección viral Las monocapas confluentes de células MDC se lavaron con PBS y se infectaron con el virus (0.2 multiplicidad de infección [m.o.i.]). En particular, el virus se diluyó, adecuadamente en RP I sin FCS y se agregó a la célula en el volumen mínimo. Después de- 1 hora de incubación a 37°C (período de adsorción del virus) , el inoculo se eliminó y las monocapas, después de lavado con PBS eliminaron el exceso de virus no adsorbido, se mantuvieron en un medio fresco que contenía 2% de FCS. Se agregó resveratrol a diversas concentraciones (1, 5, 10, 15, 20 y 40 /xg/ml) , de acuerdo con los siguientes planes de tratamiento: a) 24 horas antes de la infección (pre-) ; b) inmediatamente después de la adsorción del virus a las células de infección (post-) ; y e) 24 horas antes e inmediatamente después de la adsorción del virus a las células de infección (pre-post) . En todos los casos, la substancia se dejó incubar para la duración completa del experimento. 24 y 48 horas después de la infección, el virus liberado en el sobrenadante se tituló mediante la evaluación de las unidades hemoaglutinantes . Como se muestra en las Figuras 1A-1C, el resveratrol agregado post-infección inhibió la replicación viral en una forma dependiente de dosis. En la concentración de 20 /¿g/ml, el título viral se redujo por 87% comparado con los controles infectados y no tratados, sin que sean detectados ninguno de los efectos tóxicos sobre las células no infectadas. Para los propósitos de determinar el grado posible de toxicidad sobre las células MDCK, éstas últimas fueron tratadas con resveratrol después de la confluencia de la monocapa, a varias concentraciones (5, 10, 15, 20 y 40 /¿g/ml) . Los resultados obtenidos demuestran que en la dosis que provocó una inhibición significativa del virus de influenza (10-20 µg/ml) , se observó una ligera reducción en el número de células, probablemente debido a una disminución lenta de la proliferación celular (Figura 2A) . Sin embargo, en estas dosis, no se observaron alteraciones morfológicas de las células. En la concentración de 40 µg/ml, en el cual la replicación viral fue bloqueada completamente r sin embargo, se observaron efectos tóxicos con un aumento en la mortalidad celular (Figura 2B) . A base de este resultado, en los siguientes experimentos se utilizó la dosis de 20 ^g/ml, que produjo actividad antiviral máxima sin efectos secundarios . Con la finalidad de identificar las fases del ciclo de replicación viral controladas por resveratrol, la substancia se agregó de acuerdo con los planes de tratamiento diferentes con relación a las diversas fases del ciclo de vida del virus. En la primera, fase, para los propósitos de valorar si el resveratrol interfiere con la entrada del virus en las células, la substancia se agrega a una concentración de 20 Mg/ml exclusivamente durante la fase de adsorción viral (durante una hora a 37°C) y luego se eliminó. La medición de la replicación viral después de 24 horas probado, comparable con la replicación obtenida en las células control, demostrando así que la entrada del virus no fue inhibida por el fármaco (Figura 3) . Además, para valorar si el resveratrol es capaz de inactivar directamente el virus, la última se incubó con la substancia a una concentración de 40 Mg/ml durante una hora a 37°C. Más tarde, el virus tratado de esta forma se diluyó 1:500 y se utilizó para infectar las células. En estas condiciones no se observó reducción en la replicación viral. Estos resultados indicaron que el resveratrol no inactiva directamente la partícula viral. En una segunda fase, las células fueron infectadas y tratadas con resveratrol , utilizando nuevamente la misma concentración (20 µg/ l) , pero la substancia se agregó en diversos tiempos después de la infección (0, 3, 6 y 9 horas) . La replicacion viral, valorada como HAU/ml 24 horas después de la infección, reveló que ésta fue significativamente inhibida solo si fue agregado resveratrol dentro de 3 horas de infección (Figura 4B) . En contraste, si resveratrol, agregado inmediatamente después de la infección, fue eliminado en diversos tiempos (0, 3, 6, 9 y 24 horas), la inhibición de replicacion fue observada solo si el tratamiento permaneció durante al menos 9 horas. Además, los resultados presentados en la Figura 4 también mostraron que la actividad antiviral, una vez obtenida, no es reversible en discontinuar el tratamiento. La replicacion viral también fue valorada con análisis del caso de antígenos virales en la superficie de la célula infectada por medio de inmunofluorescencia . El análisis de proteínas virales por inmunofluorescencia se hizo con un microscopio de fluorescencia utilizando un emisor de filtro en el verde (FITC) (lentes lOOx) . Las células DCK, cultivados sobre portaobjetos cubiertos durante 24 horas fueron infectadas y, 18 horas después de la infección, se fijaron con metanol-acetona 1:1 a 4°C durante 15 minutos. Más tarde, las células se lavaron dos veces en PBS y se permeabilizaron con una solución de PBS-TRITON al 0.1% durante 5 minutos. El bloqueo de los sitios específicos se hizo con 1% de leche disuelta en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Más tarde, se agregaron anticuerpos monoclonales específicos (NP anti-influenza de ratón y M anti-influenza de ratón) a proteínas virales, diluidas 1:50 en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente. Se detectó el anticuerpo primario con un anticuerpo secundario conjugado con fluoresceína (FITC anti-ratón, Sigma) . Análisis de síntesis de proteínas virales y correlación con actividad antiviral de resveratrol Se analizaron proteínas virales por Electroinmuno-transferencia . En tiempos diferentes después de la infección viral, las células se Usaron utilizando tampones de lisis especiales . Luego fueron cargadas cantidades iguales de proteínas sobre gel de poliacrilamida en SDS . Después de la electroforesis , las proteínas se transfirieron en un membrana de nitrocelulosa y se trataron con anticuerpo policlonal anti-influenza . Después de la incubación y lavados adecuados, los filtros se trataron con un segundo anticuerpo conjugado con peroxidasa y las proteínas virales se hacen resaltar por medio de la técnica quimicoluminiscencia (ECL) , utilizando un substrato de peroxidasa (luminol) que, en la reacción con la enzima, emite una luz y hace una impresión sobre la placa de autorradiografxa . Las células se trataron con resveratrol a varias concentraciones (5, 10, 15 y 20 µg/ml) . Para permitir una mejor imagen de las proteínas virales, la corrida de electroforesis se hizo utilizando un gel de poliacrilamida al 10% (Figura 7A) y un gel de gradiente (Figura 7B) . El resveratrol a concentraciones de 15 y 20 µ^/t? casi inhibió totalmente la síntesis de la hemoaglutinina del virus de influenza precedente (H0-H1, H2) y proteínas matrices (M) . En contraste, la expresión de proteínas de nucleocápsida prematura (nucleoproteína [NP] y proteína de polimerasa [P] se inhibió, aunque en menor grado que aquel de las proteínas precedentes . Análisis de la síntesis de AR s mensajeros Para el propósito, de identificar el mecanismo de inhibición de proteínas virales, las células MDCK, infectadas y tratadas con resveratrol a las concentraciones diferentes descritas anteriormente, fueron analizadas por medio de la técnica de PCR descrita por Tobita et al. (J. General Virol., 78, 563-566, 1997) . Las células CDK infectadas con el virus y/o tratadas con resveratrol fueron homogeneizadas con el reactivo GIBCO BRL TRIZOL. Después de la incubación a temperatura ambiente durante 5 minutos, se agregó cloroformo (0.2 mi por muestra) y las muestras fueron incubadas a 15-30°C durante 3 minutos, luego fueron centrifugadas a 10,000 rpm durante 15 minutos a +4°C y la fase acuosa que contenía el ARN fue recuperada. Se agregaron 0.5 ral de isopropanolol y las muestras se incubaron a 15-30°C durante 10 minutos y luego se centrifugaron. Los sobrenadantes obtenidos se eliminaron y el precipitado de ARN se trató con 75% de etanol a 8,000 rpm durante 5 minutos a 2-8°C. Finalmente, el precipitado se secó por aire y se disolvió en 20 µ? de agua-DEPC (pirocarbonato de dietilo) . El ARN se transcribió utilizando transcriptasa inversa. La retrotranscripcion se hizo en 5 µ? de ARN de cada muestra en una mezcla que consistía de cebadores aleatorios, los cuatro desoxinucleótidos (dNTP=dATP , dCTP, dGTP, dTTP) , ditiotreitol (DTT) , y tampón RT (Life Technologies) . La síntesis de DNA complementaria (cDNA) se hizo dejando la mezcla durante 10 minutos a 22 °C, luego durante 60 minutos a 42 °C y finalmente la reacción fue inactivada durante 10 minutos a 75 °C. El cDNA obtenido así se utilizó luego en la PC . .La polimerasa tag se utilizó en la PCR. Se condujo la PCR en sus tres fases de desnaturalización, renaturalización y elongación a las temperaturas respectivas de 95, 48 y 72°C. El ciclo se repitió 20 veces. Los oligonucleótidos utilizados para la amplificación de ARN viral fueron: para la codificación del gen viral de la proteína de hemoaglutinina (HA) cebador 5' : 5'-ACCAAAATGAAGGCAAACC-3 ' , cebador 3': 5 ' -TTACTGTTAGACGGGTGAT-3'; para la codificación del gen viral de la proteína matriz (M) cebador 5': 5 ' -ATGAGTCTTCTAACCG-3 ' , cebador 3': 5'-ACTGCTTTGTCCATGT-3 ' . El producto de la PCR se corrió en electroforesis (100 voltios) sobre un gel de agarosa al 1% en un tampón en el cual ha sido colocado bromuro de etidio para mostrar el DNA con un transiluminador . Las muestras obtenidas se evaluaron en 4, 8 y 20 horas, respectivamente, después de la infección viral. Los ARNs mensajeros para las proteínas virales HA y M no fueron observadas en 4 horas ya sea en el control o en el grupo tratado con resveratrol . Los resultados muestran que la síntesis de los mARNs 20 horas después de la infección no se afectó por tratamiento con resveratrol . La observación en 4 horas mostró que el resveratrol provoca solo un retardo en la síntesis mensajero para estas proteínas (Figura 8) . Estos resultados sugieren que el resveratrol a dosis de 20 µ?/ml provoca un retardo en la liberación de los ARNs mensajeros para las proteínas virales precedentes (HA y M) , evaluados 8 horas después de la infección. Localización del NP proteínico Considerando que la inhibición de la proteína cinasa C en células infectadas por el virus de influenza provoca una reducción substancial en la expresión M proteínica, junto con la retención de la nucleoproteína del núcleo de la célula infectada (J. Virol . , 74, 1781-86, 2000), las células MDCK infectadas con el virus PR8 y tratadas o no con resveratrol en la concentración de 20 µ?/ml se colorearon con anticuerpos específicos anti-M y anti-NP y se observaron bajo el microscopio de fluorescencia. Los resultados revelaron que, mientras que en las células NP no infectadas se observó tanto en el núcleo como en el citoplasma y frecuentemente MI en el citoplasma, en células tratadas con resveratrol el NP es retenido en el núcleo y M, que es significativamente inhibido, puede igualmente ser observado solamente en el núcleo. Este fenómeno puede ser atribuible a la inhibición de las proteínas celulares con una función cinasa. Los datos sugieren luego que el mecanismo de acción antiviral puede relacionarse con la inhibición de proteínas con una función cinasa descrita anteriormente (FEBS Letters, 45, 63-7, 1999) . Ensayo de glutatión reducido y oxidado El ensayo de glutatión ha sido realizado como resultado de -la formación de derivados de S-carboximetilo de tioles libres con ácido yodoacético seguido por la conversión de los grupos terminales NH2 a derivados de 2 , 4-dinitrofenilo después de la reacción de 1-fluoro-2 , 4-dinitrobenceno (Anal. Biochem., 106, 55-62, 1980). Las células MDCK se separaron por medio de la técnica de arrastre por raspador. Más tarde, las células se centrifugaron a 1,200 rpm durante 5 minutos. Las células se lavaron dos veces en PBS y el precipitado, obtenido después de la centrifugación, se resuspendió en 200 µ? de tampón.

Los lisados celulares, obtenidos con ciclos repetidos de congelación y descongelación, fueron desproteinizados por medio de precipitación en 5% de ácido metafosfórico . Después de la centrifugación a 22,300 g, los tioles de bajo peso molecular presentes en el sobrenadante se derivatizaron con 10% de ácido yodoacético v/v y se neutralizaron con NaHC03 en forma de polvo. Después de 1 hora de incubación en la oscuridad se agregó una solución de 1.5% de l-cloro-2,4-dinitrobenceno v/v (1.5 ml/98.5 mi de etanol absoluto). Después de agregar el reactor de Sanger, las muestras se incubaron durante 12 horas en la oscuridad, y la separación de las diversas especies de glutatión se hizo por medio de una columna de CLAR de H2 /¿Bondapak de 3.9 x 300 mm (Millipore) . Para medir el contenido total de GSH se hizo referencia a una curva estándar obtenida con GSH purificada. El contenido de GSH se expresó en proteínas de GSH nmol/mg presentes;- en la muestra de lisado. La concentración de proteína se calculó utilizando el método de Lowry (Biol. Chem. , 193, 265-75, 1951) . Este método aprovechó la capacidad de las proteínas para reducir el reactivo de Folin-Ciocalteau en una solución alcalina con iones Cu2+, gracias a la presencia de los grupos fenol de una variedad de aminoácidos tales como triptófano, tirosina, cisteína e histidina. El triptófano y la tirosina se hacen reaccionar por medio de sus grupos fenol particularmente reactivos, la cisterna a través del grupos -SH y la histidina con el anillo de imidazol . El producto de reacción de reducción se detecta por la formación de compuestos teñidos mediante la reacción con los aminoácidos aromáticos de las proteínas. De hecho, la solución tomó sobre un color azul particularmente intenso que tiene absorción pico a 695 nm. A base de las proporciones de la absorción, la concentración de las proteínas es obtenida por lo tanto con relación a una curva de calibración en línea recta obtenida. utilizando diversas concentraciones de albúmina de bovino en tambor como el estándar. Para los propósitos de evaluación de la correlación posible entre la actividad antiviral y la modulación del estado de redox, la concentración del GSH celular de células MDCK, tratada con diferentes concentraciones de resveratrol e infectada o no con el virus, fue valorada por análisis de CLAR 24 horas después de la infección. Sorprendentemente, el resveratrol agregado a las células MDCK no infectadas, produjo una reducción en niveles de GSH intracelulares comparado con las células no tratadas (Figura 6) . La adición de resveratrol a células infectadas, aunque inhibiendo la replicación viral, no restaura los niveles de GSH reducidos por la infección. Análisis de apoptosis En cuanto al análisis de apoptosis. Las células MDCK se infectaron con el virus PR8. Después de la adsorción viral, las células se trataron con resveratrol a varias concentraciones (5, 10, 15 y 20 µ$/t?1) . Veinticuatro horas después de la infección, las células se separaron utilizando una solución de tripsina al 0.25% y luego se centrifugó a 1,200 rpm durante 5 minutos. El precipitado obtenido así se analizó por medio de la técnica de FACS después de marcar con yoduro de propidio. Para los propósitos de valorar si la inducción de muerte celular por apoptosis fue implicada en el efecto antiviral de resveratrol, las células MDCK fueron infectadas o no con el virus y tratadas con la substancia en las diversas concentraciones. La muerte celular por apoptosis se evaluó por FACS después de marcar con yoduro de propidio. Como se muestra en la Figura 5, el resveratrol provocó un cierto grado de muerte celular por apoptosis en células no infectadas que varía de 8 a 32% de acuerdo con las dosis (5 y 20 respectivamente) . La infección en sí misma indujo la apoptosis en 12% de células infectadas. Aunque la adición de dosis aumentadas provocó un aumento en la mortalidad, no se observó diferencia significativa entre las células infectadas y las células no infectadas tratadas con dosis antivirales del fármaco (35 y 37% de apoptosis, respectivamente) . Por vía de otra confirmación de los resultados de la presente invención, y por vía de los ejemplos, se describen los siguientes estudios in-vivo.

Ejemplo Se utilizaron ratones hembras innatos o congénitos Balb/c AnCrIBR de cuatro semanas de edad. El resveratrol, disuelto en PBS, se administró a los animales vía la ruta intraperitoneal en varios tiempos después de la infección con el virus de influenza. Las concentraciones de resveratrol se eligieron para obtener una intervalo de dosis en la sangre de los animales similar al intervalo efectivo in vitro (10 a 20 g/ml) . Los ratones se inocularon de manera intranasal (i.n.) con una suspensión que contenía el virus de influenza A/PR en una multiplicidad de infección de 2 HAU/ratón, después de anestesia ligera con éter. A base de datos experimentales previos, el virus de influenza en esta multiplicidad de infección produce neumonía hemorrágica que conduce a la muerte del 80% de los animales por una semana después de la infección. Para los propósitos de monitorear el curso de la infección, tanto · los parámetros virológicos como inmunológicos se monitorearon además de analizar las curvas de supervivencia". . Como un parámetro virológico, se determinó la carga viral . En diferentes tiempos después" de la infección, los pulmones de ratones control e infectados fuero tomados como muestras, se pesaron y homogeneizaron en RP I que contenía antibióticos. Después de centrifugar, los sobrenadantes se diluyeron adecuadamente y la carga viral se analizó por medio de la prueba de CPE al 50%. A base de este método, se infectaron células DCK confluentes con los sobrenadantes diluidos en serie en RPMI agregados con antibióticos en 2% de FCS y se incubaron durante tres días a 37°C en una atmósfera de C02 al 50%. Por último, para cada dilución, las cavidades que muestran efectos positivos fueron contadas y comparadas con aquellas que muestran efectos citopáticos negativos de acuerdo con la fórmula de Reed y Muench. Se calculó el título de CPE al 50% en unidades/ml. Como un parámetro inmunológico, se evaluaron los niveles de citocinas inflamatorias utilizando el método de ELISA. Se utilizó una placa de 96 cavidades para el experimento. La placa se cubrió con anticuerpos monoclonales a las citocinas que son estudiadas, incubadas durante la noche a 4°C. Más tarde, se agregaron 200 µ?/cavidad de 1% de BSA en tampón de carbonato durante 30 minutos a 37°C. Se hicieron luego lavados con TBS al 0.25% + Tween 200 y se agregaron las muestras durante 24 horas a 37°C. Como una curva de referencia se utilizaron citocinas recombinantes en dilución escalonada. Se realizaron luego lavados y se agregó un anticuerpo policlonal anti-citocina, diferente del primer anticuerpo, y se dejó durante la noche a +4°C. Más tarde, se agregó a los lavados con TBS al 0.5% + Tween 20, MgCl2 2 nM y el tercer anticuerpo conjugado a la enzima fosfatasa alcalina durante 4 horas a 37°C. Finalmente, se agregó un substrato para la enzima (100 ?/cavidad) y la lectura se tomó utilizando el lector ELISA y un filtro de 405 nm. Se analizaron los siguientes anticuerpos: 1) TNF-alfa anti-ratón de rata monoclonal/IL-6 de ratón recombinante; 2) TNF-alfa de ratón recombinante/lL-6 de ratón recombinante; 3) TNF-alfa anti-ratón de conejo policlonal/lL-6 anti-ratón de cabra policlonal; 4) IgG-fosfatasa alcalina anti-conejo de cabra/IgG fosfatasa alcalina anti -cabra. La eficacia de resveratrol se estudió en un modelo experimental de infección del virus de influenza en el ratón. En este modelo, la inoculación intranasal del virus provoca neumonía hemorrágica severa que conduce a la muerte de los animales en el trascurso de 7 a 10 días de infección. El diseño experimental considera la evaluación de la eficacia terapéutica de la substancia de estudio, como se valoró a base de la supervivencia de los animales infectados. Para este final, se administró resveratrol a los animales en diversas dosis, en una base diaria durante 7 días, iniciando a partir de unas pocas horas después de la infección. Los resultados obtenidos mostraron que, mientras que la mortalidad de los animales no tratados fue tan alta como el 80%, la administración de resveratrol (1 mg/kg) reduce significativamente la mortalidad y el 60% de los animales que sobrevivieron a la infección (Figura 9) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere .

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES
2. Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1. Uso de resveratrol como un ingrediente activo en la preparación de un medicamento útil para la prevención y/o tratamiento de infecciones del virus de influenza. 2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el virus es el virus de influenza humana.
3. 3. Uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el medicamento es útil para el tratamiento de infecciones del virus en el campo de la veterinaria.