MXPA05003771A - Composiciones estabilizadas de adn desnudo. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un procedimiento para condensar ADN sin ningun agente de condensacion de alto peso molecular condensando ADN plasmidico con un cation divalente y un alcohol liofilizable; la invencion se refiere tambien a una composicion acuosa que incluye ADN plasmidico condensado y un vehiculo tal como un alcohol liofilizable, miscible en agua y un cation divalente.

Description

COMPOSICIONES ESTABILIZADAS PE ADN DESNUDO ANTECEDENTES DE LA INVENCION La aplicación farmacéutica de sistemas de suministro de ADN desnudo requiere la estabilización del ADN tanto durante el procedimiento de fabricación como durante el almacenamiento a largo plazo. El ADN es una molécula inestable que es susceptible no sólo a la degradación enzimática y química por las rutas hidrolítica y oxidativa, sino también al daño mecánico, por ejemplo, inducido por cizalla. El procesado del ADN durante la fabricación de un fármaco producto puede dar como resultado muchos procedimientos de media y alta cizalla que afectan a la estabilidad del ADN. Uno de dichos procedimientos es la etapa de congelación durante la liofilización. Adicionalmente, el flujo turbulento en tuberías y la filtración son procedimientos que aumentan la tensión de cizalla a la que se somete el ADN. Como cualquier rotura de hebra que tenga lugar en el ADN afecta a la calidad y rendimiento del fármaco producto es preciso tratar el potencial del daño relacionado con la cizalla que puede ocurrir durante el procesado del ADN. Proteger al ADN del daño es de suma importancia en los sistemas biológicos. En la naturaleza, la condensación y empaquetado del ADN cromosómico ha evolucionado no sólo para reducir el tamaño del ADN, sino más importante aún para estabilizar el ADN. Aunque los organismos han elaborado mecanismos para empaquetar su ADN, se observa un colapso similar del ADN extendido en estructuras compactas in vitro mediante la adición de diversos reactivos. Muchos de estos reactivos, incluyendo lípidos catiónicos (Zhang, 1997), péptidos (Wyman, 1997), y polímeros catiónicos (Ogris, 1998), se han estudiado como agentes de transfección en terapia génica no viral. Estos reactivos típicamente forman pares iónicos con la estructura aniónica de fosfato del ADN dando como resultado la condensación del ADN, que proporciona una forma compacta para el suministro génico. Adicionalmente, se ha demostrado que los agentes de condensación policatiónicos protegen al ADN de la degradación inducida por sonicación y enzima nucleótica (Adami, 1999). A pesar de sus muchas ventajas, sin embargo, entre sus inconvenientes están los agentes de condensación de alto peso molecular no se presentan sin sus inconvenientes y han tenido un éxito limitado in vivo debido a su citotoxicidad (Wolfert, 1996) y activación complementaria (Planck, 1996). Recientemente, la administración de ADN desnudo ha ganado aceptación como procedimiento preferido de suministro de ADN para terapia génica no viral. El concepto es simple y sin embargo bastante eficaz para administración in vivo de ADN. El ADN desnudo típicamente es ADN plasmídico, sin excipientes de complejación, formulados en un tampón que protege al ADN de la degradación química, aunque también se liofiliza habitualmente para prolongar la estabilidad a temperatura ambiente. Aunque la formulación es simple, la fabricación del fármaco producto final requiere estabilizar el ADN desnudo inestable frente a las tensiones de cizalla a las que puede enfrentarse durante la producción.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se refiere a un procedimiento para condensar el ADN sin agentes de condensación de alto peso molecular, que comprende la condensación de ADN plasmídico con un catión divalente y un alcohol liofilizable. La presente invención se refiere también a una composición acuosa que comprende ADN plasmídico condensado y un vehículo, comprendiendo el vehículo un alcohol liofilizable, miscible en agua y un catión divalente. En una realización de la invención, el alcohol liofilizable, miscible en agua es ferc-butanol. En otra realización de la invención, la concentración de ferc-butanol es de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 35% en volumen, más preferiblemente de aproximadamente el 17% a aproximadamente el 25% en volumen, y en una realización particularmente preferida, la concentración de íerc-butanol es de aproximadamente el 20% en volumen. En otra realización de la invención, el catión divalente se selecciona entre el grupo constituido por Ca+2, Mg+2 o Zn+2, preferiblemente, el catión divalente es Ca+2, más preferiblemente, el catión divalente es Ca+2 y la concentración de Ca+2 es de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 2 milimolar. En una realización aún más preferida, el catión divalente es Ca+2 y la concentración de Ca es de aproximadamente 1 milimolar. En otra realización de la invención, el catión divalente es Ca+2 y la concentración de ADN es de aproximadamente 10 g/ml a aproximadamente 200 g/ml. En otra realización de la invención, la proporción molar de Ca+2 a ADN-fosfato es de aproximadamente 3. En otra realización más de la invención, la concentración de Ca+2 en unidades milimolares, es de aproximadamente 16*e(0' 386 ), donde t es el porcentaje en volumen de tere-butano], y el contraión para el Ca+2 es cloruro, y donde la concentración de íerc-butanol es de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 35% en volumen. En otra realización de la invención, el contraión para el catión divalente es cloruro. En otra realización de la invención, el ADN es estable a cizalla, incluyendo la cizalla inducida por sonicación. En una realización de la invención, el ADN plasmídico permanece intacto después de la sonicación durante 60 segundos usando un sonicador de sonda de 50 vatios. En otra realización de la invención, el porcentaje total de ADN plasmídico superenrollado, circular abierto y linear junto después de la sonicación es mayor del 90% de su valor inicial. En una realización de la invención, el ADN en el condensado está compuesto esencialmente por toroides y bastoncillos. En otra realización de la invención, los toroides muestran un tamaño de partícula medio en el intervalo de aproximadamente 10 a aproximadamente 500, y preferiblemente de aproximadamente 50 a aproximadamente 100 nanómetros, medido por microscopía electrónica. En una realización de la invención, el condensado muestra una distribución bimodal del tamaño de partícula. En otra realización de la invención, la distribución del tamaño de partícula del condensado, medido por dispersión luminosa dinámica, muestra picos en el intervalo de aproximadamente 40 a aproximadamente 70 nanómetros y de aproximadamente 200 a aproximadamente 500 nanómetros. Esta invención se refiere también a un procedimiento para condensar ADN plasmídico que comprende: (a) preparar una solución acuosa de ADN plasmídico desionizado; (b) añadir un alcohol liofilizable, míscible en agua a la solución de la etapa (a); y (c) añadir un catión divalente a la mezcla de la etapa (b). En una realización del procedimiento de esta invención, el alcohol liofilizable, miscible en agua es íerc-butanol. En otra realización del procedimiento de esta invención, la concentración de íerc-butanol es de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 35% en volumen, más preferiblemente, de aproximadamente el 17% a aproximadamente el 25% en volumen, y en una realización particularmente preferida, la concentración de íerc-butanol es de aproximadamente el 20% en volumen. En otra realización del procedimiento de esta invención, el catión divalente se selecciona entre el grupo constituido por Ca , Mg o Zn , preferiblemente, el catión divalente es Ca+2. En otra realización del procedimiento de esta invención, la concentración de Ca+2 es de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 2 milimolar, más preferiblemente, la concentración de Ca+2 es de aproximadamente 1 milimolar, y en una realización particularmente preferida del procedimiento, la concentración de ADN es de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml. En otra realización del procedimiento de esta invención, la proporción molar de Ca+2 a ADN-fosfato es de aproximadamente 3. En otra realización del procedimiento de esta invención, la concentración de Ca+2 en unidades milimolares, es de aproximadamente 16*e(0-i386*o donde t es el porcentaje en volumen de íerc-butanol, y el contraión para el Ca+2 es cloruro, y donde la concentración de íerc-butanol es de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 35% en volumen. En otra realización del procedimiento de esta invención, el contraión para el catión divalente es cloruro. La presente invención contempla también contraiones para el catión divalente, tales como, aunque sin limitación sales de calcio, incluyendo carbonato, fosfato, edato, acetato, oxalato, gluconato y lactato. En otra realización del procedimiento de esta invención, el procedimiento comprende adicionalmente. (d) retirar el agua y el alcohol liofilizable, miscible en agua de la composición; en una realización preferida del mismo, el agua y el alcohol liofilizable, miscible en agua se retiran por liofilización. En otra realización del procedimiento de la invención, la etapa (d) comprende el secado por pulverización de la composición. En otra realización, la presente invención contempla un procedimiento de preparación de un condensado de ADN incluyendo toroides, bastoncillos y esferas que comprende: (a) preparar una solución acuosa de ADN plasmídico desionizado; (b) añadir un alcohol liofilizable, miscible en agua a la solución de la etapa (a); y (c) añadir un catión divalente a la mezcla de la etapa (b). Una composición que comprende ADN plasmídico condensado y un catión divalente estando dicha composición sustancialmente libre de excipientes de estabilización después de la retirada del sistema disolvente mediante secado por pulverización, liofilización, o evaporación.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS Figura 1 : Condiciones para la condensación de ADN en tBuOH y CaC . La condensación se determinó por centrifugación y absorbancia y/o por comparación de la tasa de conteo de mediciones del tamaño de partícula. Figura 2: La condensación inducida por cloruro cálcico conduce a la compactación del ADN que puede cuantificarse usando clasificación de tamaño de partículas por dispersión luminosa cuasielástica. Figuras 3A y 3B: Fotografías de microscopio de transmisión de electrones de ADN en íerc-butanol al 20% con CaCI2 1 mM (figura 3B) y sin CaCl2 1 mM (figura 3A). El aumento de ambas fotografías es de (50,000 X). Figuras 4A y 4B: Dependencia con la temperatura de la formación de partículas. Figura 5: Cinética de la Formación de Partículas. Figura 6: Protección frente a cizalla de ADN en forma condensada (a) y no condensada (b).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Como se ha descrito anteriormente, la administración de ADN desnudo ha ganado aceptación como procedimiento preferido de suministro de ADN para terapia génica no viral. El ADN desnudo es típicamente ADN plasmídico, sin excipientes de complejación, formulado en un tampón que protege al ADN de la degradación química, aunque también se liofiliza habitualmente para prolongar la estabilidad a temperatura ambiente. Aunque la formulación es simple, la fabricación del fármaco producto final requiere estabilizar el ADN desnudo inestable frente a la tensión de cizalla a la que puede enfrentarse durante la producción. Se ha abordado la necesidad de una formulación estable de ADN desnudo condensando ADN plasmídico, por tratamiento con cloruro de calcio en ferc-butanol al 20% (v/v), de manera que se forman pequeños toroides (-50 nm) así como bastoncillos y esferas más grandes (-300 nm), es decir, partículas de ADN condensadas. Las partículas condensadas retenían una carga superficial negativa, que indica concentraciones sub-estequiométricas de calcio. Como se demuestra a continuación, las presentes composiciones de ADN de los solicitantes proporcionan una protección superior a diez veces mayor frente a la tensión de cizalla inducida por sonicación. Una realización preferida de la invención se usa para preparar formulaciones estables de ADN adecuadas para procesado adicional. En esta realización, el ADN plasmídico desionizado purificado a una concentración de 0.1 pg/ml a 1 mg/ml, más preferiblemente de 1 pg/ml a 500 Mg/ml, aún más preferiblemente a 10 pg/ml a 200 pg/ml y más preferiblemente aún a 100 pg/ml se disuelve en una solución acuosa de t-butanol cuya concentración varía del 17% al 25% (v/v). Un catión divalente apropiado compuesto por Ca2+, g2+, o Zn2+ a concentraciones de 0.2 mM a 2 mM se añadiría entonces a la solución codisolvente de t-butanol para condensar el ADN. La proporción estequiométrica de fosfatos aniónicos de la estructura del ADN frente a cationes divalentes está preferiblemente entre (aniones/cationes) 0.1 y 1.0, siendo aproximadamente 0.3 la proporción más preferida. Se deja después que la solución se equilibre, durante aproximadamente 45 min. para permitir obtener la condensación de equilibrio termodinámico. Los bastoncillos, toroides, y partículas esféricas de ADN están en el intervalo de tamaño de aproximadamente 20-500 nm. La solución que contiene el ADN condensado se transfiere después a operaciones de unidades de proceso aguas abajo, tales como filtración estéril a través de filtros de 0.22 µ??, secado por pulverización, o liofilización. Esta solución se fabrica en equipos de procesamiento comercial a gran escala, tales como tanques de mezcla de acero inoxidable de 300 galones (1.14 m3). El ADN condensado filtrado estéril se procesa después mediante liofilización o secado por pulverización para obtener formas de dosificación farmacéuticas estables. Antes de la liofilización el ADN puede combinarse con agentes voluminosos tales como sacarosa, manitol, trehalosa, lactosa, u otros agentes voluminosos habituales. La solución de t-butanol se congela y forma una única fase que puede liofilizarse debido a las propiedades de sublimación del t-butanol. En la torta liofilizada seca, los toroides y bastoncillos del ADN permanecen intactos. Tras la reconstitución la torta de liofilización se disolverá rápidamente y el ADN se solubilizará completamente en ADN plasmídico nativo no condensado listo para dosificarlo siendo las únicas trazas del procedimiento original los cationes y cualquier agente voluminoso añadido. Está sustancialmente libre de t-butanol en esta etapa del procedimiento. Un enfoque alternativo para procesar el ADN es utilizar el secado por pulverización. El secado por pulverización implica tres procesos unitarios fundamentales: atomización de líquidos, mezcla de gas-gotas, y secado de gotas líquidas. La atomización se realiza normalmente mediante uno de estos tres dispositivos de atomización: boquillas de alta presión, boquillas de dos fluidos, y discos centrífugos de alta velocidad. Con estos atomizadores, las soluciones finas pueden dispersarse en gotas tan pequeñas como 2 pm. Las gotas de mayor tamaño raramente son mayores de 500 pm (malla del 35). Debido a la gran superficie de secado total y al pequeño tamaño de las gotas creadas, el tiempo de secado real en un secador de pulverización típicamente no es de más de aproximadamente 30 segundos. Una de las principales ventajas del secado por pulverización es la producción de una partícula esférica, que normalmente no puede obtenerse mediante ningún otro procedimiento de secado. La partícula esférica puede ser sólida o hueca, dependiendo del material, el estado de la alimentación, y las condiciones de secado. Debido a las altas velocidades de transferencia de calor a las gotas, el líqúido del centro de la partícula se vaporiza, haciendo que la carcasa externa se expanda y forme una esfera hueca. Las partículas secas de ADN pueden usarse como una forma en polvo del ADN lista para reconstituirla en una solución de hidratación para administración parenteral incluyendo, aunque sin limitación, administración intravenosa, intramuscular e intraperitoneal. El ADN reconstituido de la presente invención puede administrarse también por vía subcutánea e intraocular. El ADN reconstituido puede administrarse también mediante un aerosol y puede suministrarse en forma de partículas secas directamente en un polvo mediante un aerosol u otro medio de administración por inhalación. La composición de ADN en polvo para dosificación está sustancialmente libre de los disolventes usados para modificar su estructura. Esta invención se refiere también a una composición preparada por cualquiera de los procedimientos anteriores. Esta invención contempla también formaciones estables de ARN preparadas de acuerdo con los procedimientos para preparar formulaciones estables de ADN. Por lo tanto, la presente solicitud contempla preparaciones de formulaciones de ARN desnudo condensado adecuadas para el suministro de ARN para aplicación terapéutica, incluyendo aunque sin limitación terapia génica no viral. En esta solicitud, el término "vehículo" significa cualquier ingrediente inactivo, es decir, distinto de ADN plasmídico. Se contempla que pueden añadirse vehículos además del alcohol liofilizable y del catión divaiente a la composición de la invención para usar en el procesado adicional de la composición acuosa o, preferiblemente, una composición liofilizada de la invención. Los vehículos útiles para la preparación de composiciones farmacéuticas se conocen bien en la técnica (véase Remington: The Practice of Pharmacv. Lippincott Williams and Wilkins. Baltimore MD. 20a ed. 2000). Dentro de la práctica rutinaria del especialista en la técnica está seleccionar y determinar qué vehículos son apropiados para la aplicación pretendida de las composiciones de la invención. Algunos ejemplos de vehículos incluyen diluyentes o cargas inertes, aglutinantes y excipientes, incluyendo ingredientes útiles para potenciar la palatabilidad, por ejemplo, aromatizantes. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables útiles en la preparación de composiciones para administración oral, por ejemplo, comprimidos, incluyen disgregantes tales como almidón, ácido algínico y ciertos silicatos complejos y agentes aglutinantes tales como sacarosa, gelatina y goma arábiga. Otros vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales incluyen agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, lauril sulfato sódico y talco y a menudo son útiles con propósito de formación de comprimidos. Pueden emplearse también composiciones sólidas de un tipo similar en cápsulas duras y blandas de gelatina rellenas; los materiales preferidos incluyen, por lo tanto, los vehículos farmacéuticamente aceptables lactosa, azúcar de la leche y polietilenglicoles de alto peso molecular.

EJEMPLOS En los siguientes ejemplos se usaron los siguientes materiales y ADN plasmídico. Se usó ADN plasmídico que codifica eritropoyetina felina (80% superenrollado, 18% circular abierto), en los siguientes experimentos. La construcción, secuencia y expresión del plásmido se describe en la Solicitud de Patente Europea 99 309201.4, publicada el 28 de junio de 2000 como EP 1013 288 A2, cuyos contenidos se incorporan a este documento como referencia en su totalidad. Las sales, cloruro de zinc y cloruro de magnesio hexahidrato, eran de Aldrich, y el cloruro de calcio era de Fisher. Los alcoholes usados fueron Metanol (J. T. Baker), 2-metil-2-propanol (ferc-butanol, tbuOH) (Aldrich), y etanol (Pharmco). Todas las diluciones se hicieron en agua purificada mediante el sistema de purificación de agua Alpha-Q (Millipore). Las soluciones madre de ADN, alcohol, sal, y agua se prepararon y filtraron a través de una unidad de filtro Millex-GP de 0.22 µ?t? antes de su uso.

EJEMPL0 1 Preparación de Formulaciones de ADN Desnudo Condensado Se preparó una solución desionizada de ADN plasmídico (5600 PB) lavando el ADN en una membrana de ultra-diálisis CO Amicon de P 10,000 usando 10 volúmenes de agua desionizada. El ADN desionizado se disolvió en diHaO hasta una solución madre de 1 mg/ml. The ADN se diluyó a la concentración deseada en una solución acuosa de alcohol. Los alcoholes usados fueron metanol, etanol, isopropanol, o íerc-butanol. Se añadieron diversas cantidades de la forma de sal cálcica de zinc, magnesio, o calcio a la solución de alcohol/ADN. Las soluciones se mezclaron bien con vótice y se incubaron durante 1-1.5 hr a temperatura ambiente.

EJEMPLO 2 Ensayos de centrifuqación-absorbancia La condensación del ADN se determinó mediante centrifugación y medida de la absorbancia. Las muestras se centrifugaron 4 min a 15,800 g. Se diluyó 1 :10 una alícuota de 80 µ? de la parte superior del sobrenadante y se midió la concentración de ADN (A260 nm) y se comparó con la de una alícuota correspondiente tomada antes de la centrifugación. Como alternativa, para muestrear concentraciones de ADN 50 pg/ml, las alícuotas se diluyeron en una tinción de ADN IxGelStar (FMC BioProducts) y se analizaron en un espectrofotómetro de fluorescencia Hitachi F-2000 (excitación a 493 nm, emisión a 527 nm) con resultados similares. La identificación de las formulaciones que condujeron al ADN se realizó la condensación mediante un ensayo de centrifugación. Las muestras condensadas o agregadas mostraron una disminución de 5-10 veces de absorbancia después de la centrifugación, mientras que las muestras no condensadas tenían una reducción del 15% o menor. Se investigó ADN (100 ug/ml) en diversas concentraciones de MgCb, CaC , y ZnC y metanol, etanol, o íerc-butanol. Las condiciones seleccionadas para realizar la condensación fueron íerc-butanol al 20% y CaC 1 mM. En todos los disolventes excepto en íerc-butanol, la agregación (formación de flóculos visibles) tuvo lugar más rápidamente con gCfe Sin embargo, la sal de magnesio fue la menos eficaz de las tres sales para condensar ADN en soluciones de t-BuOH, necesitándose una mayor concentración para inducir la condensación. En t-BuOH al 80 % (v/v), se superó la solubilidad del ADN y tuvo lugar la precipitación del ADN durante la noche en presencia de cualquier ión. Se usó una metodología experimental de diseño factorial para determinar las condiciones óptimas que conducen a la condensación (datos no mostrados). Las condiciones que conducen a una condensación robusta del ADN tuvieron lugar a 100 g/ml de ADN plasmídico en íerc-butanol al 20% con CaCI2 1 mM. Los resultados del ensayo de arriba por condensación inicial sal-alcohol se muestran en el Cuadro 1. Las muestras se observaron después de la adición de la cantidad indicada de sal al disolvente que contiene 100 pg/ml de ADN plasmídico. Las cifran indican el tiempo (hrs) cuando se observó por primera vez una agregación visible. Un guión indica muestras que no mostraron una disminución de la absorbancia después de la centrifugación. La muestra puntual que se condensó pero que no se agrega de manera visible se marca como "condensado". La optimización de las condiciones que conducen a la condensación sin agregación en íerc-butanol al 20% y CaCl2 1 mM se realizó variando las condiciones de disolución alrededor de este punto (Fig. 1). La ecuación de la línea de ajuste es [sal] = 16 exp(0.1386*% t), donde [sal] es la concentración milimolar de CaCI2 y % t es el porcentaje de íerc-butanol. Se descubrió condensación sin agregación en un intervalo de condiciones, requiriéndose menos CaC cuando aumentaba la concentración de íerc-butanol. También se investigó el efecto de variar la concentración del ADN, y se descubrió que se necesitaba más CaC para la condensación cuando aumentaba la concentración del ADN, aunque esta dependencia fue mucho menos drástica que la de las concentraciones de sal-alcohol.

CUADRO 1 EJEMPLO 3 Mediciones del Tamaño de Partícula Las mediciones del tamaño de partícula se realizaron en un Analizador del Tamaño de Partícula 90Plus de Brookhaven Instruments Corporation, Holtsville, NY. Se realizaron tres ensayos de 1 min cada uno sobre cada muestra, y se informó sobre el diámetro medio de los tres ensayos. La viscosidad del disolvente de una solución de ferc-butanol al 20% fue de 1.723 cP medida en un reómetro AR1000 de TA Instruments y se usó para medir el tamaño de partícula en el modo de dispersión luminosa dinámica. Los datos del tamaño de partícula para el ADN condensado con íerc-butanol al 20% y CaC 1 mM indicaban que se formaron espontáneamente dos poblaciones de partículas en solución. Los diámetros de las dos poblaciones de partículas fueron de 40-70 nm y 200-500 nm. Estos tamaños corresponden a dos formas observadas con microscopía electrónica: una forma de toroide con un diámetro de aproximadamente 50-100 nm y una forma de tipo bastoncillo de aproximadamente 50 nm de anchura y varios cientos de nm de longitud (Figura 2). En esta Figura hay una distribución bimodal del tamaño de partículas debido a las diferencias de los radios hidrodinámicos de los toroides de menor diámetro y los bastoncillos de mayor diámetro después de la condensación con CaCb- De esta muestra el 63% de las partículas (en volumen) tienen un diámetro centrado a 64 nm y el 37% de las partículas tienen un diámetro centrado a 220 nm.

EJEMPLO 4 Microscopía Electrónica Las muestras se prepararon e incubaron a temperatura ambiente durante 1.5 hrs antes de teñirlas para la microscopía electrónica. Se trataron rejillas de cobre recubiertas de formvar (malla 200) por descarga luminosa durante 2 min. Se hizo flotar una gota del ADN sobre la rejilla durante 60 s y se secó. Después se aplicó una tinción de acetato de uranilo al 2% durante 60 s y se secó. Las rejillas se observaron en un microscopio electrónico Hitachi a un aumento de 50,000 X a una potencia de 100 kV. El aumento de ambas fotografías es de (50,000 X). Las Figuras 3A y 3B muestran las estructuras de ADN plasmídico obtenidas en ferc-butanol al 20% con CaCI2 1 mM (figura 3B) y sin CaCI2 1 mM (figura 3A). La figura 3B muestra la presencia de bastoncillos y toroides (~100 nm de diámetro) de ADN después de la condensación con CaC½ 1 mM.

EJEMPLO 5 Cinética de Formación de Partículas Se investigó la cinética de formación de partículas con un espectrómetro de fluorescencia Hitachi F-2000 con longitudes de onda de excitación y emisión ajustadas a 400 nm. Se midió la luz total dispersada de una solución equilibrada de ADN en ferc-butanol a 90° durante un intervalo de 5 s. El aumento de la luz dispersada se midió como una función del tiempo después de la adición y mezcla minuciosa de CaC½ para la solución de ADN/ferc-butanol. El efecto de la temperatura sobre la formación de la partícula con respecto al fondo se estudió usando mediciones del tamaño de partícula (Figuras 4A y 4B). Como se muestra en la Figura 4A, la tasa de conteo aumentó con el aumento de temperatura mientras que la tasa de conteo de fondo disminuyó con el aumento de temperatura. El tamaño de partícula presentado disminuyó para la muestra y el control con el aumento de temperatura, aunque la disminución entre 30° y 70° fue mayor para el control (55%) que para la muestra que contenía ADN (40%) (Figura 4B). Controlando la condensación tras la adición de CaCI2 produjo ADN totalmente condensado como se demuestra en la zona de meseta de la Figura, que corresponde a la máxima intensidad de dispersión luminosa. El tamaño de partícula de 400 nm se usó para controlar la condensación y tuvo lugar 45 minutos después de la adición de cloruro de calcio. La muestra de control de t-buOH al 20% demuestra una intensidad de dispersión menor de un orden de magnitud que la de la partícula condensada. Se investigó la cinética de formación de partícula usando intensidad de dispersión luminosa total a 400 nm (Figura 5). Los resultados muestran dos fases de la formación de partícula: la primera, vista también en el control, tiene lugar en los 2 min después de la adición de CaCI2 y se cree que refleja una redisposición estructural del sistema disolvente tras la adición de sal. Después de 5 min, la intensidad de dispersión luminosa está dominada por la condensación del ADN, que alcanza una meseta después de 1 hr y permanece allí durante varias horas. La agregación visible de estas partículas no se observó generalmente después de 24 hr, aunque la fracción de partículas en el intervalo de tamaño de 200-500 nm fue mayor.

EJEMPLO 6 Medida del Potencial Zeta Se midió el potencial zeta del ADN condensado con tBuOH al 20% y CaC 1 mM usando un Analizador del Tamaño de Partícula 90Plus de Brookhaven Instruments Corporation (Holtsville, NY). El potencial zeta se calculó usando el modelo de Smoluchowski ajustando la viscosidad a 1.723 cP y la constante dieléctrica como 66.5. Se realizaron seis ensayos de 15 ciclos cada uno y se presentó la medida media de zeta. El potencial zeta de partículas de ADN condensadas con tBuOH al 20% y CaCI2 1 mM se determinó que era de -17.28 +/- 1.29 mV bajo un campo eléctrico de 7.24 V/cm.

EJEMPLO 7 Resistencia a Tensión por Cizalla Las muestras se prepararon como se ha descrito anteriormente y se incubaron durante 24 hr a temperatura ambiente. Se sonicaron alícuotas de un mililitro de formulaciones de ADN condensado y controles no condensados para diversas cantidades de tiempo usando un sonicador Colé Parmer 4710 Serie 50 W. Se analizó el daño al ADN por electroforesis en gel de agarosa Seakem al 1.1% (FMC BioProdoucts) sometiéndolo a electroforesis durante 60 min a 80 V y se tiñó usando Sybr®-Gold (Molecular Probes, Eugene OR).

Se obtuvo un marcador de ADN lineal por digestión con restricción del ADN plasmídico con EcoRV (Gibco). Se investigó la estabilidad a tensión de cizalla del ADN condensado con tBuOH al 20% y CaCfe 1 mM por sonicación. Se descubrió que la estructura primaria del ADN condensado con tBuOH al 20% y CaCI2 1 mM estaba protegida de la tensión de cizalla inducida por sonicación (Figura 6, cuantificada en el siguiente Cuadro 2). Las cifras por encima de los carriles indican tiempo (segundos) de exposición a una sonda de sonicación de 50 W. Después de 30 s de sonicación el 100% de las formas no condensadas circulares abiertas, lineales, y superenrolladas del ADN plasmídico están completamente degradadas, dando como resultado la mancha de fragmentos observada en el fondo del gel. Por el contrario, el ADN condensado retiene el 100% de la forma superenroilada y circular abierta del ADN plasmídico después de 60 s de sonicación. Mientras que el ADN no condensado se degrada en fragmentos oligonucleótido después de un tiempo tan corto como 5 s de sonicación, la mayoría del ADN condensado estaba aún en su forma inicial superenroilada y circular abierta después de 60 s de sonicación. Esta protección frente a la tensión de cizalla la consigue el ADN simplemente a través de condensación sin la presencia de polímeros u otras macromoléculas. La protección frente a tensión de cizalla inducida por cavitación conseguida para ADN plasmídico condensado se cuantifica en el Cuadro 2. El panel superior tiene los datos de cizalla inducida por sonicación para ADN condensado. El porcentaje total de ADN intacto, definido como formas superenrollada, circular abierta, y lineal del ADN plasmídico, fue del 100% después de 60 segundos de sonicación con sonda (50 W). Sólo hubo una pérdida del 3% de ADN superenrollado después de 60 s. En el panel inferior se muestra un control no condensado de ADN plasmídico. Se observa que más del 60 por ciento del ADN se degrada después de sólo 5 s de sonicación, y que sólo un 1.6 por ciento del ADN plasmídico intacto permanece después de 60 s.

CUADRO 2 SE: ADN plasmídico superenrollado Lineal: ADN plasmídico lineal CA: ADN plasmídico circular abierto Habiendo descrito la invención como antecede se declara como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones.

Claims (15)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Una composición acuosa que comprende ADN plasmídico condensado y un vehículo, comprendiendo el vehículo un alcohol liofilizable, miscible en agua y un catión divalente.

2. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el alcohol liofilizable, miscible en agua es terc-butanol.

3. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el catión divalente se selecciona entre el grupo constituido por Ca+2, Mg+2 o Zn+2.

4. - La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la concentración de ADN es de aproximadamente 10 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml.

5. - La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la proporción molar de Ca+2 a ADN-fosfato es de aproximadamente 3.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque la concentración de Ca+2 en unidades milimolares, es de aproximadamente I6*e(ai386 ), donde t es el porcentaje en volumen de ferc-butanol, y el contraión para el Ca+2 es cloruro, y donde la concentración de ferc-butanol es de aproximadamente el 15% a aproximadamente el 35% en volumen.

7. - Un procedimiento para condensar el ADN plasmídico que comprende: (a) preparar una solución acuosa de ADN plasmídico desionizado; (b) añadir un alcohol liofilizable, miscible en agua a la solución de la etapa (a); y (c) añadir un catión divalente a la mezcla de la etapa (b).

8. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el alcohol liofilizable, miscible en agua es terc-butanol y dicho catión divalente se selecciona entre el grupo constituido por Ca+2, Mg+2 o Zn+2.

9.- El procedimiento de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque la concentración de Ca+2 es de aproximadamente 0.2 a aproximadamente 2 milimolar; y la concentración de ADN es de aproximadamente 20 pg/ml a aproximadamente 200 pg/ml.

10. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque comprende adicionalmente retirar el agua y el alcohol liofilizable, miscible en agua de la composición.

11. - Una composición preparada de acuerdo con la reivindicación 10.

12. - Un procedimiento para proteger al ADN contra la tensión de cizalla que comprende: (a) preparar una solución acuosa de ADN plasmídico desionizado; (b) añadir un alcohol liofilizable, miscible en agua a la solución de la etapa (a); y (c) añadir un catión divalente a la mezcla de la etapa (b).

13. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque dicha tensión de cizalla está inducida por sonicación, dicho alcohol liofilizable, miscible en agua es ferc-butanol; y dicho catión divalente se selecciona entre el grupo constituido por Ca+2( Mg+2 o 2n+2.

14. - Un procedimiento para preparar un condensado de ADN que comprende: (a) preparar una solución acuosa de ADN plasmídico desionizado; (b) añadir un alcohol liofilizable, miscible en agua a la solución de la etapa (a); y (c) añadir un catión divalente a la mezcla de la etapa (b), en el que dicho condensado de ADN está compuesto esencialmente por toroides, bastoncillos y esferas.

15. - El procedimiento de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el alcohol liofilizable, miscible en agua es terc-butanol; dicho catión divalente se selecciona entre el grupo constituido por Ca+2, Mg+2 o Zn+2, comprendiendo opcionalmente dicho procedimiento adicionalmente retirar el agua y el alcohol liofilizable, miscible en agua de la composición.