MXPA04012116A

MXPA04012116A - Uso del il-21 en cancer y otras aplicaciones terapeuticas.

Info

Publication number: MXPA04012116A
Application number: MXPA04012116A
Authority: MX
Inventors: R Kindsvogel Wayne
Original assignee: Zymogenetics Inc
Priority date: 2002-06-07
Filing date: 2003-06-06
Publication date: 2005-04-19
Also published as: WO2003103589A3; EP1531850B1; EP1531850A2; US20100316598A1; AU2003243415A8; JP2006514601A; US20070048269A1; EP1531850A4; ES2381265T3; EP2289525A1; AU2003243415A1; ATE546150T1; US20070048271A1; US20070059284A1; US20070048266A1; US20110002882A1; US20100322898A1; US7959908B2; US20070041940A1; US20100316599A1

Abstract

Se describen los metodos para tratar mamiferos con cancer e infecciones, utilizando moleculas que tiene una actividad funcional de IL-21. Las moleculas que tienen actividades funcionales de IL-21 incluyen los polipeptidos que tienen homologia a la secuencia del polipeptido IL-21, y proteinas fusionadas a un polipeptido con actividad funcional de il-21. las moleculas pueden ser utilizadas como una monoterapia o en combinacion con otros agentes terapeuticos anticancerosos o antivirales.

Description

USO DE IL-21 EN CANCER Y OTRAS APLICACIONES TERAPEUTICAS ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las citocinas estimulan en general la proliferación o diferenciación de células de la línea hematopoyética o participan en los mecanismos de la respuesta inmune inflamatoria del cuerpo. Los ejemplos de citocina que afectan la hematopoyesis son la heritropoyetina (EPO) , que estimula el desarrollo de las células sanguíneas rojas; trombopoyetina (TPO) , que estimula el desarrollo de las células de la línea de los megacariocitos ; y el factor de estimulación de colonias de granulocitos (G-CSF por sus siglas en inglés) , que estimula el desarrollo de neutrófilos. Estas citocinas son útiles en la restauración de los niveles normales de las células sanguíneas en pacientes que sufren de anemia, trombocitopenia, y neutropenia o que reciben quimioterapia para el cáncer. Las interleucinas son una familia de citocinas que son mediadoras de las respuestas inmunológicas . Central a una respuesta inmune es la célula T, la cual produce muchas citocinas e inmunidad adaptativa a los antígenos. Las citocinas producidas por las células T han sido clasificadas como tipo 1 y tipo 2 (Kelso, A. Immun. Cell Biol . 76: 300-317, 1998) . Las citocinas tipo 1 incluyen IL-2, IFN-?, LT-cc, y están involucradas en las respuestas inflamatorias, la REF: 160355 inmunidad viral, la inmunidad contra parásitos intracelulares y el rechazo de aloinjertos. Las citocinas del tipo 2 incluyen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, y están involucradas en las respuestas humorales, inmunidad a helmintos y respuesta alérgica. Las citocinas compartidas entre el tipo 1 y 2 incluyen IL-3, GM-CSF Y TNF-a. Existe cierta evidencia que sugiere que las poblaciones de células T productoras del Tipo 1 y del Tipo 2 migran preferentemente hacia diferentes tipos de tejido inflamado. Las células T maduras pueden ser activadas, por ejemplo, por un antígeno u otro estímulo, para producir, por ejemplo, citocinas, moléculas de señalización bioquímica, o receptores que influyen adicionalmente el destino de la población de células T. Las células B pueden ser activadas vía los receptores sobre su superficie celular, incluyendo el receptor de células B y otras moléculas accesorias para realizar funciones de células accesorias, tales como la producción de citocinas. Las células asesinas naturales (NK por sus siglas en inglés) tienen una célula progenitora común con las células T y las células B, y juegan un papel en la supervivencia inmune. Las células NK, las cuales comprenden hasta 15% de los linfocitos sanguíneos, no expresan receptores antigénicos, y por lo tanto no utilizan el reconocimiento de MHC como requerimiento para el enlace a una célula diana u objetivo.

Las células NK están involucradas en el reconocimiento y muerte de ciertas células tumorales y células viralmente infectadas. In vivo, se cree que las células NK requieren activación, no obstante, in vitro, las células NK han mostrado que matan algunos tipos de células tumorales sin activación. Los linfomas son malignidades del sistema linfático, que son heterogéneos en etiología, morfología y curso clínico. Los linfomas son en general clasificados ya sea como enfermedad de Hodgkin o linfomas no Hodgkin. La enfermedad de Hodgkin está caracterizada por histocitos gigantes, mientras que la ausencia de las células abarca todos los linfomas no Hodgkin. Los linfocitos, los cuales son el componente principal de la linfa, pueden ser linfocitos de células B o linfocitos de células T. En general, cuando un linfoma surge tempranamente en la maduración celular, la malignidad es más agresiva que las malignidades que surgen de las células maduras. La quimioterapia es usualmente más efectiva en el tratamiento del linfoma agresivo, mientras que los linfomas indolentes no pueden ser tratados tan fácilmente y por lo tanto es probable que nunca sean curados, siempre y cuando la enfermedad permanezca indolente . Para una supervisión de la información relacionada al linfoma, ver, por ejemplo, Lymphoma Treatments and Managing Their Side Effects, Lymphoma Res. Found. Of Amer., Los Angeles, 2001. En particular, las interleucinas son una familia de citocinas que son mediadoras de la respuesta inmunológic . Central a una respuesta inmune es la célula T, la cual produce muchas citocinas y efectúa la inmunidad adaptativa a los antígenos. Las células T maduras pueden ser activadas, por ejemplo, por un antígeno u otro estímulo, para producir, por ejemplo, citocinas, moléculas de señalización de química, o receptores que influyen adicionalmente el destino de la población de células T. Las infecciones virales pueden ser clasificadas de diversas maneras. Por ejemplo, los virus pueden ser clasificados filogenéticamente, de acuerdo a la célula objetivo infectada o al órgano infectado, o por el estado de enfermedad que éstos inducen. No obstante, no todos los virus y las enfermedades virales son tratadas idénticamente debido a los factores adicionales, tales como si una infección es o no aguda o crónica y la salud subyacente del paciente, la influencia del tipo de tratamiento que es recomendado. En general, el tratamiento de las infecciones agudas de los pacientes inmunocompetentes debe reducir la severidad de la enfermedad, las complicaciones y la disminución de la proporción de transmisión, haciendo a la seguridad, al costo y a · la conveniencia, consideraciones esenciales en la recomendación de un agente antiviral. Los tratamientos para las infecciones crónicas deben prevenir el daño viral a los órganos tales como el hígado, los pulmones, el corazón, el sistema nervioso central y el sistema gastrointestinal, haciendo a la eficacia la consideración primaria. Existen pocos tratamientos efectivos para la hepatitis. Para el tratamiento del virus de la hepatitis B (HBV, por sus siglas en inglés) y el virus de la hepatitis C (HCV, por sus siglas en inglés) , la FDA ha aprobado la administración de interferón alfa recombinante (IFN-oc) . No obstante, el IFN-a está asociado con un número de efectos adversos dependientes de la dosis, incluyendo trombocitopenia, leucopenia, infecciones bacterianas y síntomas tipo influenza. Otros agentes utilizados para tratar HBV o HCV crónicas incluyen el análogo de nucleósido RIBAVIRIN1^ y el ácido ursodesoxicólico; no obstante, ninguno ha mostrado que sea muy efectivo. La terapia en combinación de RIBAVIRIN" + IFN da como resultado una tasa de 47% de despejo viral sostenido (Lanford, R.E. y Bigger, C. Virology 293: 1-9 (2002). (Ver, Medicine, (D.C. Dale y D. D. Federman, eds . ) (Scientific American, Inc., New York), 4:VIII:l-8 (1995)). La enfermedad hepática crónica progresiva como resultado de las infecciones crónicas, tal como HCV y HBV, y la tumorigénesis asociada con HIV, son tres ejemplos de enfermedades que pueden' ser tratadas con la terapia de intervención y/o con terapia preventiva utilizando los métodos de la presente invención. La presente invención proporciona los métodos para el tratamiento de las infecciones, particularmente infecciones virales, mediante la administración de IL-21 al sujeto. En ciertas modalidades, la IL-21 puede ser administrada en conjunto con otros compuestos antivirales . En otros aspectos, la presente invención proporciona tales métodos para tratar tumores sólidos y linfornas mediante la administración de las composiciones de IL-21 que pueden ser utilizadas como una monoterapia o en combinación con quimioterapia, radioterapia, u otros productos biológicos. Estos y otros usos deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas de la presente. Estos y otros usos deben ser aparentes para aquellos expertos en la técnica a partir de las enseñanzas en la presente . BREVE DESCRIPCION DE LA I VENCION Dentro de un aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento del linfoma no Hodgkin, que comprende administrarle a un sujeto en necesidad de la misma una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21. En ciertas modalidades, se ha mostrado que el polipéptido no provoca proliferación de las células cancerosas aisladas antes de la administración al sujeto. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para tratamiento del cáncer, que comprende administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde el cáncer se selecciona del grupo de carcinoma de células renales, carcinoma epitelial, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon. En una modalidad, existe una respuesta tumoral. En otra modalidad, la respuesta tumoral es medida como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en el tiempo hasta la progresión. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para el tratamiento del linfoma no Hodgkin que comprende administrarle a un sujeto en necesidad de la misma, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, y un segundo polipéptido. En otras modalidades, el cáncer se selecciona del grupo de carcinoma de células renales, carcinoma epitelial, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon. En una modalidad, existe una respuesta tumoral. En otra modalidad más, la respuesta tumoral es medida como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en el tiempo hasta la progresión . En otro aspecto más, los métodos de la presente invención proporcionan un método de tratamiento de una infección, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde la infección se selecciona del grupo del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana, síndrome respiratorio agudo súbito provocado por coronavirus, virus del herpes simple, virus de Epstein Barr, citomegalovirus ; virus de la viruela, virus del papiloma, adenovirus, poliovirus; ortomixovirus , paramyxovirus , virus de la influenza, calicivirus, virus de la rabia y de la ictericia hematúrica . En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para tratamiento de una infección viral en un mamífero, que comprende el administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde la infección viral da como resultado una infección viral seleccionada del grupo que consiste de inmunodeficiencia adquirida; hepatitis; gastroenteritis; enfermedades hemorrágicas ; enteritis; carditis; encefalitis; parálisis; bronquiolitis ,- enfermedad de las vías respiratorias superior o inferior; papilomatosis respiratoria; artritis; enfermedad diseminada; meningitis, y mononucleosis . En un aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de una ¦ infección, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, y un segundo polípéptido, en donde la infección se selecciona del grupo del virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana, síndrome respiratorio agudo súbito provocado por coronavirus, virus del herpes simple, virus de Epstein Barr, citomegalovirus , virus de la viruela; virus del papiloma; adenovirus, poliovirus; ortomyxovirus, paramyxovirus , virus de la influenza; calicivirus ; virus de la rabia, y virus de la ictericia hematúrica. En ciertas modalidades, los métodos de tratamiento de las infecciones virales utilizando polipéptidos y proteínas de fusión que tienen una actividad funcional de IL-21, reducen el nivel de infección viral. En otras modalidades, la reducción en el nivel de infección viral es medida como la reducción en la carga viral, anticuerpos específicos virales incrementados, reducción en el nivel de alanina-aminotransferasa (ALT) , o mejoramiento histológico en un tejido objetivo como se mide mediante inmunohistoquímica . La presente invención también proporciona un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, que comprende el administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polípéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde la infección bacteriana es una infección por una bacteria seleccionada del grupo que consiste de chlamydiae, listeriae, Helicobacter pylori, mycobacterium, mycoplasma, salmonella y shigella.

En otros aspectos, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene la actividad funcional de IL-21 y un segundo polipéptido, en donde la infección bacteriana es una infección por una bacteria seleccionada del grupo que consiste de chlamydiae, listeriae, Helicobacter pylori, mycobacterium, mycoplasma, salmonella y shigella . Para todos los aspectos y modalidades de la presente invención, el polipéptido o el primer polipéptido en una proteína de fusión puede comprender un polipéptido que tiene al menos 80%, 90%, 95% o identidad completa a un polipéptido IL-21 que comprenden los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCION Antes de describir la invención con detalle, puede ser de auxilio para el entendimiento de la misma, definir los .siguientes términos: El término "marcador de afinidad" es utilizado en la presente para denotar un segmento polipeptídico que puede ser enlazado a un segundo polipéptido, para proporcionar la purificación o la detección del segundo polipéptido, o proporciona los sitios para el enlace del segundo polipéptido a un sustrato. En principio, cualquier péptido o proteína para el cual un anticuerpo u otro agente de enlace específico sea disponible, puede ser utilizado como un marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad incluyen un tramo de polihistidina, proteína A (Nilsson et al., EMBO J. 4: 1075, 1985; Nilsson et al., Methods E zymol . 198: 3, 1991), glutatión-S-transferasa (Smith y Johnson, Gene 67: 31, 1988), marcador de afinidad Glu-Glu (Grussenmeyer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 82: 7952-4, 1985), sustancia P, péptido FlagMR (Hopp et al., Biotechnology 6: 1204-10, 1988), péptido de enlace a la estreptavídina, u otro epítopo antigénico o dominio de enlace. Ver, en general, Ford et al., Protein Expression and Purification 2: 95-107, 1991. Los ADNs que codifican para los marcadores de afinidad son disponibles de los proveedores comerciales (por ejemplo, Pharmacia Biotech, Piscata ay, NJ) . El término "variante alélica" se utiliza en la presente para denotar cualquiera de dos o más formas alternativas de un gen que ocupa el mismo locus cromosómico. La variación alélica surge naturalmente a través de la mutación, y puede dar como resultado el polimorfismo fenotípico dentro de las poblaciones. Las mutaciones génicas pueden ser silenciosas (ningún cambio en el polipéptido codificado) o pueden codificar para polipéptidos que tienen secuencia alterada de aminoácidos. El término variante alélica se utiliza también en la presente para denotar una proteína codificada por una variante alélica de un gen. Los términos "amino-terminal" y "carboxilo-terminal" son utilizados en la presente para denotar las posiciones dentro de los polipéptidos . Donde el contexto lo permita, estos términos son utilizados con referencia a una secuencia particular o porción particular de un polipeptido para denotar proximidad o posición relativa. Por ejemplo, una cierta secuencia colocada carboxilo-terminal a una secuencia de referencia dentro de un polipéptido, está localizada próxima al extremo carboxilo de la secuencia de referencia, pero no está necesariamente en el extremo carboxilo del polipéptido completo . El término "cáncer" o "célula cancerosa" se utiliza en la presente para denotar un tej ido o célula encontrada en un neoplasma, que posee características que la diferencian del tejido normal o de las células tisulares. Tales características incluyen, pero no están limitadas a: el grado de anaplasia, irregularidad en la forma, indistinción del perfil celular, tamaño nuclear, cambios en la estructura del núcleo o citoplasma, otros cambios fenotípicos, presencia de proteínas celulares indicadoras de un estado canceroso o precanceroso, número incrementado de mitosis, y habilidad para realizar la metástasis. Las palabras que pertenecen a "cáncer" incluyen carcinoma, sarcoma, tumor, epitelioma, leucemia, linfoma, pólipo, y escirro, transformación, neoplasma y similares . El término "par complemento/anticomplemento" denota porciones no idénticas que forman un par estable, no covalentemente asociado, bajo condiciones apropiadas. Por ejemplo, la biotina o avidina (o estreptavidina) son miembros prototípicos de un par complemento/anticomplemento. Otros pares complemento/anticomplemento incluyen los pares receptor/ligando, pares anticuerpo/antígeno (o hapteno o epitopo) , pares de polinucleótidos sentido/antisentido, y similares. Donde la disociación subsiguiente del par complemento/anticomplemento es deseable, el par complemento/anticomplemento tiene preferentemente una afinidad de enlace <109 M"1. El término "complementos de una molécula polinucleotídica" denota una molécula polinucleotídica que tiene una secuencia de bases complementaria y orientación inversa en comparación a una secuencia de referencia. El término "secuencia nucleotídica degenerada" denota una secuencia de nucleótidos que incluye uno o más codones degenerados (en comparación a una molécula polinucleotídica de referencia que codifica para un polipéptido) . Los codones degenerados contienen tripletes diferentes de nucleótidos, pero codifican para el mismo residuo de aminoácidos (por ejemplo, los tripletes GAU y GAC cada uno codifican para Asp) .

El término "vector de expresión" se utiliza para denotar una molécula de ADN, lineal o circular, que comprende un segmento que codifica para un polipéptido de interés operablemente enlazado a los segmentos adicionales que proporcionan su transcripción. Tales segmentos adicionales incluyen las secuencias promotoras y terminadoras, y pueden también incluir uno o más orígenes de replicacion, uno o más marcadores seleccionables, un aumentador, una señal de poliadenilación, etc. Los vectores de expresión son en general derivados de ADN plasmídico o viral, o pueden contener elementos de ambos . El término "aislado", cuando se aplica a un polinucleótido, denota que el polinucleótido ha sido removido de su medio genético natural y está de este modo libre de otras secuencias de codificación extrañas o no deseadas, y está en una forma adecuada para el uso dentro de los sistemas de producción de proteínas, manipulados mediante ingeniería genética. Tales moléculas aisladas son aquellas que son separadas de su ambiente natural e incluyen ADNc y clones genómicos. Las moléculas aisladas de ADN de la presente invención están libres de otros genes con los cuales están ordinariamente asociadas, pero pueden incluir regiones no traducidas 5' y 3' de origen natural, tales como los promotores y los terminadores . La identificación de las regiones asociadas será evidente para una persona de experiencia ordinaria en la técnica (ver por ejemplo, Dynan y Tijan, Nature 316: 774-78, 1985). Un polipéptido o proteína "aislada" es un polipéptido o proteína que se encuentra en una condición diferente de su ambiente nativo, tal como aparte del tejido sanguíneo y animal. En una forma preferida, el polipéptido aislado está sustancialmente libre de otros polipéptidos , particularmente otros polipéptidos de origen animal. Se prefiere proporcionar los polipéptidos en una forma altamente purificada, por ejemplo, más de 95% puros, más preferentemente más de 99% puros. Cuando se utiliza en este contexto, el término "aislado" no excluye la presencia del mismo polipéptido en formas físicas alternativas, tales como los dímeros o formas alternativamente glucosiladas o derivatizadas . El término "nivel" cuando se hace referencia a las células inmunes, tales como las células NK, células T, en particular células T citotóxicas, células B y similares, un nivel incrementado es ya sea el número incrementado de las células o la actividad aumentada de la función celular. El término "nivel" cuando se hace referencia a las infecciones virales, se refiere a un cambio en el nivel de la infección viral e incluye, pero no está limitado a, un cambio en el nivel de CTLs o células NK (como se describió anteriormente), una disminución en la carga viral, un incremento en el título de anticuerpo antiviral, disminución de los niveles serológicos de la alanina-aminotransferasa, o mejoramiento como es determinado por el examen histológico de un tejido u órgano objetivo. La determinación de si estos cambios en el nivel son diferencias o cambios significativos, está muy por dentro de la experiencia de alguien en la técnica . El término "neoplásico" cuando se hace referencia a las células, indica las células que sufren proliferación nueva y anormal, particularmente en un tejido en donde la proliferación es descontrolada y progresiva, dando como resultado un neoplasma. Las células neoplásicas pueden ser ya sea malignas, por ejemplo invasoras y metastáticas o benignas.

El término "operablemente enlazado" cuando se hace referencia a los segmentos de ADN, indica que los segmentos están acomodados de modo que éstos funcionan en concierto para sus fines pretendidos, por ejemplo, la transcripción inicia en el promotor y procede a través del segmento de codificación hacia el terminador. Un "polinucleótido" es un polímero de hebra simple o de doble hebra de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5' al extremo 3'. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden ser aislados de fuentes naturales, sintetizados in vitro, o preparados a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. Los tamaños de los polinucleótidos son expresados como pares de bases (abreviados "pb" ) , nucleótidos ("nt"), o kilobases ("kb"). Donde el contexto lo permita, los últimos dos términos pueden describir polinucleótidos que son de una sola hebra o de doble hebra. Cuando el término es aplicado a las moléculas de doble hebra, éste es utilizado para denotar la longitud completa y será entendido como equivalente al término "pares de bases" . Podrá ser reconocido por aquellos expertos en la técnica que las dos hebras de un polinucleotido de doble hebra pueden diferir ligeramente en longitud y que los extremos de los mismas pueden ser escalonados como resultado de la escisión enzimática; de este modo, todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica de doble hebra pueden no estar apareados. Un "polipéptido" es un polímero de residuos de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos, ya sea producidos naturalmente o de manera sintética. Los polipéptidos de menos de aproximadamente 10 residuos de aminoácidos son comúnmente denominados como "péptidos" . El término "promotor" se utiliza en la presente para su significado reconocido en la técnica, para denotar una porción de un gen que contiene secuencias de ADN que proporcionan el enlace de la ARN-polimerasa y el inicio de la transcripción. Las secuencias promotoras son comúnmente, pero no siempre, encontradas en las regiones 5' de no codificación de los genes .

Una "proteína" es una macromolécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas . Una proteína puede también comprender componentes no peptídicos, tales como grupos carbohidratos. Los carbohidratos y otros sustituyentes no peptídicos pueden ser agregados a una proteína por la célula en la cual es producida la proteína, y variarán con el tipo de célula. Las proteínas son definidas en la presente en términos de sus estructuras de cadena principal de aminoácidos; los sustituyentes tales como grupos carbohidrato son en general no especificados, pero pueden no obstante estar presentes. El término "receptor" denota una proteína asociada a la célula, que se enlaza a una molécula bioactíva (por ejemplo, un ligando) y es mediadora del efecto del ligando sobre la célula. Los receptores enlazados a la membrana son caracterizados por una estructura multipeptídica que comprende un dominio extracelular de enlace al ligando y un dominio efector intracelular que está típicamente involucrado en la transducción de señales. El enlace del ligando al receptor da como resultado un cambio conformacional en el receptor, que provoca una interacción entre el dominio efector y otra u otras moléculas en la célula. Esta interacción a su vez conduce a una alteración en el metabolismo de la célula. Los eventos metabólicos que están vinculados a las interacciones receptor-ligando incluyen la transcripción de genes, fosforilación, desfosforilación, incrementos en la producción de AMP cíclico, movilización del calcio celular, movilización de los lípidos membranales, adhesión celular, hidrólisis de lípidos de inositol e hidrólisis de fosfolípidos . En general, los receptores pueden estar enlazados a la membrana, ser citosólico o nucleares; monoméricos (por ejemplo, receptor de la hormona estimulante de la tiroides, receptor beta-adrenérgico) o multiméricos (por ejemplo, receptor de PDGF, receptor de la hormona del crecimiento, receptor de IL-3, receptor de GM-CSF, receptor de G-CSF, receptor de eritropoyetina y receptor de IL-S) . El término "secuencia de señal secretora" denota una secuencia de ADN que codifica para un polipeptido (un "péptido secretor") que, como un componente de un polipeptido más grande, dirige el polipéptido más grande a través de una vía secretora de una célula en la cual éste es sintetizado. El polipéptido más grande es comúnmente escindido para remover el péptido secretor durante el tránsito a través de la vía secretora . Los pesos moleculares y las longitudes de los polímeros determinados por métodos analíticos imprecisos (por ejemplo, electroforesis en gel) serán entendidos como valores aproximados . Cuando tal valor es expresado como "aproximadamente" X o "cercano" a X, el valor establecido de X será entendido como una precisión ± de 10%. Todas las referencias citadas en la presente son incorporadas por referencia en su totalidad. La presente invención está basada en parte en el descubrimiento de que la administración de una cantidad terapéu icamente efectiva de IL-21 da como resultado la inhibición de la proliferación de ciertas células neoplásicas o cancerosas, ya sea directa o indirectamente, con lo cual se limitan los efectos patológicos provocados por el cáncer. Las células neoplásicas incluyen, pero no están limitadas a, ciertas células linfocíticas y células metastáticas que se originan de tumores sólidos. La presente invención también está basada en el descubrimiento de que la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-21 a linfomas específicos y tumores sólidos específicos, da como resultado una respuesta tumoral . En los ejemplos siguientes, los modelos animales y los ensayos in vi tro demuestran la actividad de IL-21 sobre las muestras biológicas, en particular tumores sólidos, linfocitos B neoplásicos y linfocitos T. La presente invención está también basada en el descubrimiento de que IL-21 tiene actividad antivíral contra infecciones agudas específicas tales como influenza e infecciones crónicas específicas tales como hepatitis. Estos efectos antivirales pueden ser mediados a través de las células del sistema inmune, tales como las células T citotóxicas y las células NK. En la descripción y en los ejemplos siguientes, los modelos animales y los ensayos in vi tro demuestran las actividades antivirales de IL-21. A. Descripción de IL-21 y su receptor 11-21 humana (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2) fue designada IL-21, y es descrita en la Patente de los Estados Unidos de pertenencia común No. 6,307,024, la cual se incorpora por referencia en la presente. El receptor de IL-21, (previamente designado zalfall) ahora designado IL-21R (SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6) , y el receptor heterodimérico IL-21R/IL- 2Ry son descritos en las Publicaciones de la IPO de pertenencia común Nos. WO01/17235 y WO01/77171, que se incorporan por referencia en la presente. Como se describe en estas publicaciones, IL-21 fue aislada de una biblioteca de ADNc generada a través de células de sangre periférica humana (hPBCs por sus siglas en inglés) , que fueron seleccionadas para CD3. CD3 es un marcador de la superficie celular único en las células de origen linfoide, particularmente las células T.

La secuencia de aminoácidos para IL-21R indicaron que el receptor codificado pertenecía a la subfamilia del receptor de citocina de la Clase I que incluye, pero no está limitada a, los receptores para IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, EPO, TPO, G -CSF y G-CSF (para una revisión ver Cosman, "The Hematopoietin Receptor Superfamily" en Cytokine 5(2): 95-106, 1993). La distribución tisular del receptor sugiere que un objetivo para IL-21 son las células de la línea hematopoyética, en particular células progenitoras linfoides y células linfoides.

Otras citocinas conocidas de cuatro grupos helicoidales que actúan sobre las células linfoides incluyen IL-2, IL-4, IL-7 e IL-15. Para una revisión de las citocinas de cuatro grupos helicoidales, ver Nicola et al., Advances in Protein Chemistry 52: 1-65, 1999 y Kelso, A., Immunol . Cell Biol .. 76: 300-317, 1998. Para IL-21, la secuencia de señal secretora está comprendida de los residuos de aminoácidos 1 (Met) a 31 (Gly) , y el polipéptido maduro está comprendido de los residuos de aminoácidos 32 (Gln) a 162 (Ser) (como se muestra en la SEQ ID NO: 2) . En general, se predice que las citocinas tienen una estructura de cuatro hélices alfa, con las hélices A, C y D que son las más importantes en las interacciones ligando-receptor, y están más altamente conservadas entre los miembros de la familia. Con referencia a la secuencia de aminoácidos de IL-21 humana, mostrada en la SEQ ID NO: 2, un alineamiento en las secuencias de aminoácidos de IL-21 humana, IL-15 humana, IL-4 humana y GM-CSF humano, predijo que la hélice A de IL-21 es definida por los residuos de aminoácidos 41-56; la hélice B por los residuos de aminoácidos 69-84; la hélice C por los residuos de aminoácidos 92-105; y la hélice D por los residuos de aminoácidos 135-148; como se muestra en la SEQ ID NO: 2. El análisis estructural sugiere que el rizo A/B es largo, el rizo B/C es corto y el rizo C/D es largo y paralelo. Esta estructura en rizo da como resultado una organización helicoidal arriba-arriba-abajo-abajo. Los residuos de cisteína están absolutamente conservados entre IL-21 e IL-15. Los residuos de cisteína que están conservados entre IL-15 e IL-21 corresponden a los residuos de aminoácidos 71, 78, 122 y 125 de la SEQ ID NO: 2. La conservación de algunos de los residuos de cisteína es también encontrada en IL-2, IL-4, GM-CSF e IL-21, correspondientes a los residuos de aminoácidos 78 y 125 de la SEQ ID NO: 2. La colocación de cisteína consistente es además la confirmación de la estructura de cuatro grupos helicoidales. También altamente conservada en la familia que comprende IL-15, IL-2, IL-4, GM-CSF e IL-21, está la secuencia Glu-Phe-Leu como se muestra en la SEQ ID NO: 2 en los residuos 136-138. El análisis adicional de IL-21 basado en alineamientos múltiples, predice que los residuos de aminoácidos 44, 47 y 135 (como se muestra en la SEQ ID NO: 2) juegan un papel importante en el enlace de IL-21 a su receptor cognado. Además, la secuencia predicha de aminoácidos de IL-21 murina (SEQ ID NO: 4) muestra 57% de identidad a la proteína humana predicha. Con base en la comparación entre las secuencias de IL-21 humana y murina, fueron encontrados residuos bien conservados en las regiones predichas para codificar las hélices alfa A y D. Los polinucleótidos correspondientes que codifican para las regiones polipeptídicas de IL-21, los dominios, las porciones, los residuos, y las secuencias descritas en la presente, son como se muestran en la SEQ ID NO: 1. Los residuos de aminoácidos que comprenden las hélices A, B, C y D, y los rizos A/B, B/C y C/D para IL-21, IL-2, IL-4, IL-15 y GM-CSF se muestran en la Tabla 1. Tabla 1 Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la secuencia descrita en la SEQ ID NO: 1 representa un alelo simple de IL-21 humana, y que se espera que ocurra la variación alélica y el empalme alternativo. Las variantes alélicas de esta secuencia pueden ser clonadas mediante el sondeo del ADNc de las bibliotecas genómicas a partir de diferentes individuos de acuerdo a los procedimientos estándares. Las variantes alélicas de la secuencia de ADN mostrada en la SEQ ID NO: 1, incluyendo aquellas que contienen mutaciones silenciosas y aquellas en las cuales las mutaciones dan como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, están dentro del alcance de la presente invención, como lo están las proteínas que son variantes alélicas de la SEQ ID NO: 2. Los ADNcs generados a partir de los ARNms alternativamente empalmados, que conservan las propiedades del polipéptido IL-21, se incluyen dentro del alcance de la presente invención, como los son los polipéptidos codificados por tales ADNcs y ARNms. Las variantes alélicas y las variantes de empalme de estas secuencias pueden ser clonadas mediante el sondeo de ADNc o de bibliotecas genómicas provenientes de diferentes individuos o tejidos, de acuerdo a los procedimientos estándares conocidos en la técnica. La presente invención también proporciona los polipéptidos IL-21 aislados que tienen una identidad secuencial sustancialmente similar a los polipéptidos de la SEQ ID NO: 2 o sus ortólogos. El término "identidad secuencial sustancialmente similar" se utiliza en la presente para denotar los polipéptidos que comprenden al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95%, o más de 95% de identidad secuencial a las secuencias mostradas en la SEQ ID NO: 2 o sus ortólogos. La presente invención también incluye los polipéptidos que comprenden una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o más de 95% de identidad secuencial a la secuencia de residuos de aminoácidos 1 al 162 o 33 al 162 de la SEQ ID NO: 2. La presente invención incluye además las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales polipéptidos . Los métodos para determinar la identidad porcentual se describen más adelante . El por ciento de identidad secuencial es determinado mediante métodos convencionales. Ver, por ejemplo, Altschul et al., Bull. Math. Bio. 48: 603 (1986), y Henikoff y Henikoff, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 89: 10915 (1992). En resumen, dos secuencias de aminoácidos son alineadas para optimizar las calificaciones de alineamiento, utilizando una penalidad por aber ura de espacio vacío de 10, una penalidad por extensión de espacio vacío de 1 , y la matriz de calificación "BLOSUM62" de Henikoff y Henikoff (ibid.) como se muestra en la Tabla 2 (los aminoácidos son indicados por los códigos estándares de una sola letra) . Número total de concordancias idénticas x 100 [longitud de la secuencia más larga más el número de espacios vacíos introducidos en la secuencia más larga, con el fin de alinear las dos secuencias] Tabla 2 A R N D C Q E G H I L K M F P S T W Y V A 4 R -1 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3 -3 -3 9 Q -1 1 0 0 -3 5 E -1 0 0 2 -4 2 5 G 0 -2 0 -1 -3 -2 -2 6 H -2 0 1 -1 -3 0 0 -2 8 1 -1 -3 -3 -3 -1 -3 -3 -4 -3 4 L -1 -2 -3 -4 -1 -2 -3 -4 -3 2 4 K -1 2 0 -1 -3 1 1 -2 -1 -3 -2 5 M -1 -1 -2 -3 -1 0 -2 -3 -2 1 2 -1 5 F -2 -3 -3 -3 -2 -3 -3 -3 -1 0 0 -3 0 6 P -1 -2 -2 -1 -3 -1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S 1 -1 1 0 -1 0 0 0 -1 -2 -2 0 -1 -2 -1 4 T 0 -1 0 -1 -1 -1 -1 -2 -2 -1 -1 -1 -1 -2 -1 1 5 w -3 -3 -4 -4 -2 -2 -3 -2 -2 -3 -2 -3 -1 1 -4 -3 -2 11 Y -2 -2 -2 -3 -2 -1 -2 -3 2 -1 -1 -2 -1 3 -3 -2 -2 2 7 V 0 -3 -3 -3 -1 -2 -2 -3 -3 3 1 -2 1 -1 -2 -2 0 -3 -1 4 ¦Aquellos expertos en la técnica apreciarán que existen muchos algoritmos establecidos disponibles para alinear dos secuencias de aminoácidos. El algoritmo de búsqueda de similitud "FASTA" de Pearson y Lipman es un método adecuado de alineamiento de proteínas, para examinar el nivel de identidad compartido por una secuencia de aminoácidos descrita en la presente, y la secuencia de aminoácidos de una variante putativa de IL-21. El algoritmo FASTA es descrito por Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 85: 2444 (1988), y por Pearson, Meth. Enzymol . 183: 63 (1990). Los polipéptidos de IL-21 variantes o los polipéptidos con identidad secuencial sustancialmente similar, son caracterizados como poseedores de una o más sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácidos. Estos cambios son preferentemente de una naturaleza menor, es decir sustituciones conservadoras de aminoácidos (ver Tabla 3) y otras sustituciones que no afectan significativamente el plegamiento o la actividad del polipéptido; supresiones pequeñas, típicamente de uno a aproximadamente 30 aminoácidos; y extensiones amino- o carboxilo-terminales , tales como el residuo de metionina amino-terminal , un péptido enlazador pequeño de hasta 20-25 residuos, o un marcador de afinidad. La presente invención incluye de este modo los polipéptidos de aproximadamente 108 a 216 residuos de aminoácidos que comprenden una secuencia que es al menos 80%, preferentemente al menos 90%, y más preferentemente 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la región correspondiente de la SEQ ID NO: 2. Los polipéptidos que comprenden marcadores de afinidad pueden comprender además un sitio de escisión proteolítica entre el polipéptido IL-21 y el marcador de afinidad. Tales sitios preferidos incluyen los sitios de escisión de trombina y los sitios de escisión del factor Xa. Tabla 3 Sustituciones conservadoras de aminoácidos Básicos arginina lisina histidina Acidos : ácido glutámico ácido aspártico Polares glutamina asparagina hidrofóbicos : leucina isoleucina valina Aromáticos fenilalanina triptofano tirosina Pequeños glicina alanina serma treonina metionina Puede ser llevada a cabo la determinación de los residuos de aminoácidos que comprenden las regiones o dominios que son críticos para mantener la integridad estructural. Dentro de estas regiones, se pueden determinar los residuos específicos que serán más o menos tolerantes del cambio y mantendrán la estructura terciaria completa de la molécula. Los métodos para analizar la estructura de la secuencia incluyen, pero no están limitados a, alineamiento de secuencias múltiples con alta identidad de aminoácidos o de nucleótidos, propensiones de la estructura secundaria, patrones binarios, empaquetamiento complementario e interacciones polares enterradas (Barton, Current Opin. Struct. Biol. 5: 372-376, 1995 y Cordes et al., Current Opin. Struct. Biol. 6: 3-10, 1996). En general, cuando se diseñan modificaciones a las moléculas o se identifican fragmentos específicos, la determinación de la estructura será acompañada por la evaluación de la actividad de las moléculas modificadas . Los cambios en la secuencia de aminoácidos son realizados en los polipéptidos IL-21 para reducir al mínimo la perturbación de la estructura de más alto orden, esencial para la actividad biológica. Por ejemplo, donde el polipéptido IL-21 comprende una o más hélices, los cambios en los residuos de aminoácidos serán realizados para no perturbar la geometría de la hélice, y otros componentes de la molécula donde los cambios en la conformación abaten cierta función crítica, por ejemplo, el enlace de la molécula a sus socios de enlace, por ejemplo, las hélices A y D, los residuos 44, 47 y 135 de la SEQ ID NO: 2. Los efectos de los cambios en la secuencia de aminoácidos pueden ser predichos por, por ejemplo, modelación en computadora como se describe anteriormente o como se determina por el análisis de la estructura cristalina (ver, por ejemplo, Lapthorn et al., Nat . Struct . Biol . 2: 266-268, 1995) . Otras técnicas que son bien conocidas en la materia comparan el plegamiento de una proteína variante a una molécula estándar (por ejemplo, la proteína nativa) . Por ejemplo, puede ser realizada la comparación del patrón de cisteína en una variante y en las moléculas estándares. La espectrometría de masa y la modificación química utilizando reducción y alquilación, proporciona los métodos para determinar los residuos de cisteína que están asociados con enlaces disulfuro o están libres de tales asociaciones (Bean et al., Anal. Biochem. 201: 216-226, 1992; Gray, Protein Sci. 2: 1732-1748, 1993; y Patterson et al., Anal. Chem. 66: 3727-3732, 1994) . Se cree en general que si una molécula modificada no tiene el mismo patrón de cisteína que la molécula estándar, el plegamiento podría ser afectado. Otro método bien conocido y aceptado para la medición del plegamiento, es el dicrosismo circular (CD por sus siglas en inglés) . La medición y la comparación de los espectros de CD generados por una molécula modificada y una molécula estándar, son rutinarios (Johnson, Proteins 7: 205-214, 1990). La cristalografía es otro método bien conocido para analizar el plegamiento y la estructura. La Resonancia Magnética Nuclear (RMN) , el trazado del mapa peptídico digestivo y el trazado del mapa de epítope son también métodos conocidos para analizar el plegamiento y las similitudes estructurales entre las proteínas y los polipéptidos (Schaanan et al., Science 257: 961-964, 1992). Un perfil de hidrofilicidad de Hopp/Woods de la secuencia de la proteína IL-21 como se muestra en la SEQ ID NO: 2, puede ser generado (Hopp et al., Proc . Nati. Acad. Sci . 78: 3824-3828, 1981; Hopp, J. Immun. Meth. 88: 1-18, 1986 y Triquier et al., Protein Engineering 11: 153-169, 1998). El perfil está basado en una ventana de seis residuos deslizantes. Los residuos G, S y T enterrados y los residuos H, Y y W expuestos fueron ignorados. Por ejemplo, en IL-21, las regiones hidrofílicas incluyen los residuos de aminoácidos 114-119 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de aminoácidos 101-105 de la SEQ ID NO: 2 y los residuos de aminoácidos 126-131 de la SEQ ID NO: 2, los residuos de aminoácidos 113-118 de la SEQ ID NO: 2, y los residuos de aminoácidos 158-162 de la SEQ ID NO: 2. Aquellos expertos en la técnica reconocerán que la hidrofilicidad o la hidrofobicidad serán tomadas en cuenta cuando se diseñen las modificaciones en la secuencia de aminoácidos de un polipéptido IL-21, para no perturbar el perfil estructural y biológico completo. De interés particular para el reemplazo son los residuos hidrofóbicos seleccionados del grupo que consiste de Val, Leu e lie o el grupo que consiste de Met, Gly, Ser, Ala, Tyr y Trp. Por ejemplo, los residuos tolerantes de la sustitución podrían incluir los residuos 100 y 103 como se muestra en la SEQ ID NO: 2. Los residuos de cisteína en las posiciones 71, 78, 122 y 125 de la SEQ ID NO: 2, serán relativamente intolerantes de la sustitución . Las identidades de los aminoácidos esenciales pueden ser también inferidas del análisis de la similitud de secuencia entre IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF con IL-21. Utilizando los métodos tales como el análisis "FASTA" descrito previamente, las regiones de alta similitud son identificadas dentro de una familia de proteínas, y utilizadas para analizar la secuencia de aminoácidos para las regiones conservadas . Un procedimiento alternativo para identificar un polinucleótido variante de IL-21 con base en la estructura, es determinar si una molécula de ácido nucleico codifica o no para un gen potencial de la variante de IL-21, que pueda hibridarse a una molécula de ácido nucleico que tenga la secuencia nucleotídica de la SEQ ID NO: 1, como se describió anteriormente. Otros métodos para identificar aminoácidos esenciales en los polipéptidos de la presente invención son los procedimientos conocidos en la técnica, tales como la mutagénesis dirigida al sitio o la mutagénesis de selección de alanina (Cunningham y Wells, Science 244: 1081 (1989), Bass et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 88: 4498 (1991), Coombs y Corey, "Site-Directed utagenesis and Protein Engineering" , en Proteins: Analysis and Design, Angeletti (ed.), páginas 259-311 (Academic Press, Inc. 1998)). En la última técnica, son introducidas mutaciones simples de alanina en cada residuo en la molécula, y las moléculas mutantes resultantes son probadas para la actividad biológica o bioquímica como se describe más adelante, para identificar los residuos de aminoácidos que son críticos para la actividad de la molécula. Ver también, Hilton et al., J. Biol. Chem. 271: 4699 (1996). La presente invención también incluye la administración de las moléculas que tienen la actividad funcional de IL-21. De este modo, la administración de los fragmentos funcionales y los polipéptidos modificados funcionales de los polipéptidos IL-21 y las moléculas de ácido nucleico que codifican para tales fragmentos y polipéptidos funcionales. Una IL-21 "funcional" o fragmento de la misma como se define en la presente, está caracterizada por su actividad proliferativa o diferenciación, por su habilidad para inducir o inhibir funciones celulares especializadas, en particular para células efectoras inmunes, tales como las células NK, células T, células B y células dendríticas. IL-21 funcional también incluye la habilidad para mostrar efectos anticancerosos y antivirales in vi tro o in vivo, o por su habilidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-IL-21 o receptor de IL-21 (ya sea soluble o inmovilizado) . Como se describió previamente en la presente, IL-21 está caracterizada por una estructura de cuatro grupos helicoidales que comprenden la hélice A (residuos de aminoácidos 41-56) , la hélice B (residuos de aminoácidos 69-84) , la hélice C (residuos de aminoácidos 92-105) y la hélice D (residuos de aminoácidos 135-148), como se muestra en la SEQ ID NO: 2. De este modo, la presente invención proporciona además las proteínas de fusión que abarcan: (a) las moléculas polinucleotídicas que comprenden una o más de las hélices descritas anteriormente; y (b) fragmentos funcionales que comprenden una o más de estas hélices. La otra porción polipeptídica de la proteína de fusión puede ser contribuida por otra citocina de cuatro grupos helicoidales, tales como IL-15, IL-2, IL-4 y GM-CSF, o por un p ptido de señal secretor no nativo y/o no relacionado que facilita la secreción de la proteína de fusión. El análisis de supresión rutinario de las moléculas de ácido nucleico puede ser realizado para obtener los fragmentos funcionales de una molécula de ácido nucleico qu codifica para un polipéptido IL-21. Como una ilustración, las moléculas de ADN que tienen la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1 o fragmentos de la misma, puede ser digerida con la nucleasa Bal31 para obtener una serie de supresiones anidadas . Estos fragmentos de ADN son luego insertados dentro de los vectores de expresión en la estructura de lectura adecuada, y los polipéptidos expresados son aislados y probados para la actividad de IL-21, o para la habilidad de enlazarse a los anticuerpos anti- IL-21 o el receptor zalfall. Una alternativa a la digestión con exonucleasa es utilizar la mutagénesis dirigida al oligonucleótido para introducir supresiones o codones de detención para especificar la producción de un fragmento de IL-21 deseado. Alternativamente, los fragmentos particulares de un gen IL-21 pueden ser sintetizados utilizando la reacción en cadena de polimerasa. Los métodos estándares para identificar los dominios funcionales son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los estudios sobre el truncamiento en uno o en ambos de los extremos de los interferones, han sido resumidos por Horisberger y Di Marco, Pharmac . Ther. 66: 507 (1995) . Además, las técnicas estándares para el análisis funcional de las proteínas son descritas por, por ejemplo, Treuter et al., Molec. Gen. Genet . 240: 113 (1993); Content et al., "Expression and preliminary deletion analysis of the 42 kDa 2-5A synthetase induced by human interferon" , en Biological Interferon Systems, Proceedings of ISIR-TNO Meeting on Interferon Systems, Cantell (ed.) páginas 65-72 (Nijhoff 1987); Herschman, "The EGF Receptor", en Control of Animal Cell Proliferation 1. Boyton et al., (eds.) páginas 169-199 (Academic Press 1985); Coumailleau et al., J. Biol . Chem. 270: 29270 (1995); Fukunaga et al., J. Biol. Chem. 270. 25291 (1995); Yaraaguchi et al., Biochem. Pharmacol . 50: 1295 81995); y Meisel et al., Plant Molec. Biol.. 30: 1 (1996). Pueden ser realizadas múltiples sustituciones de aminoácidos y probadas utilizando métodos conocidos de mutagénesis y selección, tales como aquellos descritos por Reidhaar-Olson y Sauer (Science, 241: 53 (1988)) o Bowie y Sauer (Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 86: 2152 (1989)). En resumen, estos autores describen los métodos para aleatorizar simultáneamente dos o más posiciones en un polipéptido, seleccionando el polipéptido funcional, y luego secuenciando los polipéptidos mutagenizados para determinar el espectro de sustituciones permisibles en cada posición. Otros métodos que pueden ser utilizados incluyen la representación visual de fago (por ejemplo, Lowman et al., Biochem. 30. 10832 (1991), Ladner et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,223,409, Huse, Publicación Internacional No. WO92/06204) , y la mutagénesis dirigida a la región (Derbyshire et al., Gene 46: 145 (1986), y Ner et al., DNA 7 : 127, (1988)). Las variantes descritas de las secuencias de nucleótidos y de polipéptidos de IL-21, pueden ser también generadas a través del entremezclado de ADN como se describe por Stemmer, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 91: 10747 (1994), y la Publicación Internacional No. WO97/20078. En resumen, las moléculas variantes de ADN son generadas mediante recombinación homologa in vitro mediante fragmentación aleatoria de un ADN progenitor, seguido por el reensamble utilizando PCR, dando como resultado mutaciones puntuales aleatoriamente introducidas. Esta técnica puede ser modificada mediante el uso de una familia de moléculas de ADN progenitoras, tales como las variantes alélicas o las moléculas de ADN de diferentes especies, para introducir variabilidad adicional dentro del proceso. La selección o la clasificación para la actividad deseada, seguida por las iteraciones adicionales de mutagénesis y de ensayo, proporciona la "evolución" rápida de las secuencias mediante selección de las mutaciones deseables, mientras que se selecciona simultáneamente contra cambios dañinos. Los métodos de mutagénesis como se describen en la presente pueden ser combinados con los métodos de selección automatizados de alto rendimiento, para detectar la actividad de los polipéptidos mutagenizados, clonados, en células hospederas. Las moléculas de ADN mutagenizadas que codifican para polipéptidos biológicamente activos, o los polipéptidos que se enlazan con los anticuerpos anti-IL-21 o el receptor zalfall soluble, pueden ser recuperados de las células hospederas y rápidamente secuenciados utilizando equipo moderno. Estos métodos permiten la determinación rápida de la importancia de los residuos de aminoácidos individuales en un polipéptido de interés, y pueden ser aplicados a los polipéptidos de estructura desconocida. Además, las proteínas de la presente invención (o los fragmentos polipeptídicos de las mismas) pueden ser unidos a otras moléculas bioactivas, particularmente otras citocinas, para proporcionar moléculas multifuncionales . Por ejemplo, una o más hélices de IL-21 pueden ser unidas a otras citocinas para mejorar sus propiedades biológicas o eficiencia de producción. La presente invención proporciona de este modo una serie de novedosas moléculas híbridas en las cuales un segmento que comprende una o más de las hélices de IL-21, se fusiona a otro polipéptido. La fusión es preferentemente realizada mediante el empalme al nivel del ADN para permitir la expresión de las moléculas quiméricas en sistemas de producción recombinantes . Las moléculas resultantes son luego evaluadas para propiedades tales como la solubilidad mejorada, estabilidad mejorada, vida media de despejo prolongada, expresión mejorada y niveles de secreción mejorados, y farmacodinámica . Tales moléculas híbridas pueden comprender además residuos adicionales de aminoácidos (por ejemplo, un ligador polipeptídico) entre las proteínas o polipéptidos componentes . Los aminoácidos de origen no natural incluyen, sin limitación, trans-3 -metilprolina, 2 , 4-metanoprolina, cis-4-hidroxiprolina, trans-4-hidroxiprolina, N-metilglicina, alo- treonina, metiltreonina, hidroxietilcisteína, hidroxietilhomocisteína, nitroglutamina, homoglutamina, ácido pipecólico, ácido triazolidin-carboxílico, deshidroprolina, 3-y 4-metilprolina, 3 , 3-dimetilprolina, ter-leucina, norvalina, 2-azafenilalanina, 3 -azafenilalanina, 4-azafenilalanina y 4- fluorofenilalanina . Son conocidos diversos métodos en la técnica para incorporar los residuos de aminoácidos de origen no natural dentro de las proteínas. Por ejemplo, puede ser empleado un sistema in vitro, en donde las mutaciones no en sentido son suprimidas utilizando los AR ts supresores, químicamente aminoacilados. Los métodos para sintetizar aminoácidos y aminoacilar ARNt, son conocidos en la técnica. La transcripción y la traducción de plásmidos que contienen mutaciones no en sentido es típicamente llevada a cabo en un sistema libre de células que comprende un extracto de E. coli S30 y las enzimas comercialmente disponibles y otros reactivos. Las proteínas son purificadas mediante cromatografía. Ver, por ejemplo, Robertson et al., J. Am. Chem. Soc. 113: 2722 (1991), Ellman et al., Methods Enzymol . 202: 301 (1991), Chung et al., Science 259: 806 (1993), y Chung et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 90: 10145 (1993). En un Segundo método, la traducción es llevada a cabo en oocítos de Xenopus mediante microinyeccion de ARNm mutado y ARNts supresores, químicamente aminoacilados (Turcatti et al., J. Biol . Chem. 271: 1991 (1996)). Dentro de un tercer método, las células de E. coli son cultivadas en ausencia de un aminoácido natural que va a ser remplazado (por ejemplo, fenilalanina) y en presencia de uno o varios aminoácidos de origen natural (por ejemplo, 2 -azafenilalanina, 3-azafenilalanina, -azafenilalanina, o r-fluorofenilalanina) . El aminoácido de origen no natural es incorporado dentro de la proteína en lugar de su contraparte natural. Ver, Koide et al., Biochem. 33: 7470 (1994). Los residuos de aminoácidos de origen natural pueden ser convertidos a las especies de origen no natural mediante modificación química in vitro. La modificación química puede ser combinada con la mutagénesis dirigida al sitio para expandir adicionalmente el intervalo de sustituciones (Wynn y Richards, Protein Sci. 2: 395 (1993). Puede ser ventajoso estabilizar IL-21 para extender la vida media de la molécula, particularmente para prolongar la persistencia metabólica en un estado activo. Para lograr la vida media prolongada, las moléculas de IL-21 pueden ser químicamente modificadas utilizando los métodos descritos en la presente. La PEGilación es un método comúnmente utilizado que se ha demostrado que incrementa la vida media plasmática, la. solubilidad incrementada, y la antigenicidad . e inmunogenicidad disminuidas (Nucci et al. , Advanced Drug Delivery Reviews 6: 133-155, 1991 y Lu et al . , Int. J. Peptide Protein Res. 43: 127-138, 1994). Un número limitado de aminoácidos no conservadores, aminoácidos que no son codificados por el código genético, aminoácidos de origen no natural, y aminoácidos no naturales, pueden ser sustituidos por los residuos de aminoácidos de IL- 21. La presente invención también proporciona los fragmentos polipeptídicos o péptidos que comprenden una porción que posee epítopo de un polipéptido de IL-21, descrito en la presente. Tales fragmentos o péptidos pueden comprender un "epítopo inmunogénico" , el cual es una parte de una proteína que promueve una respuesta de anticuerpo cuando la proteína completa es utilizada como un inmunógeno. Los péptidos inmunogénicos que poseen epítopo pueden ser identificados utilizando métodos estándares (ver por ejemplo, Geysen et al., Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 81: 3998 (1983)). En contraste, los fragmentos polipeptídicos o péptidos pueden comprender un "epítopo antigénico" el cual es una región de una molécula de proteína a la cual puede enlazarse específicamente un anticuerpo. Ciertos epítopos consisten de un tramo lineal o contiguo de aminoácidos, y la antigenicidad de tal epítopo no es perturbada por los agentes de desnaturalización. Es conocido en la técnica que los péptidos sintéticos relativamente cortos que pueden imitar a los epítopos de una proteína, pueden ser utilizados para estimular la producción de anticuerpos contra la proteína (ver, por ejemplo, Sutcliffe et al., Science, 219: 660 (1983)). En consecuencia, los péptidos y polipéptidos que poseen epítopo antigénico, de la presente invención, son útiles para producir anticuerpos que se enlazan con los polipéptidos descritos en la presente. Los perfiles de hidrofilicidad de Hopp/Woods pueden ser utilizados para determinar las regiones que tienen el potencial más antigénico (Hopp et al., 1981, ibid. y Hopp, 1986, ibid.). En IL-21, estas regiones incluyen: los residuos de aminoácidos 114-119, 101-105, 126-131, 113-118 y 158-162 de la SEQ ID NO: 2. Los péptidos y polipéptidos que poseen epítopo antigénico, contienen preferentemente al menos cuatro a diez aminoácidos, al menos diez a catorce aminoácidos, o aproximadamente catorce a aproximadamente treinta aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 4. Tales péptidos y polipéptidos que poseen epítopo pueden ser producidos por la fragmentación de un polipéptido IL-21, o por síntesis química de péptidos, como se describe en la presente. Además, los epítopos pueden ser seleccionados por una representación visual de fago de bibliotecas peptídicas aleatorias (ver, por ejemplo, Lañe y Stephen, Curr. Opin. Immunol . 5: 268 (1993); y Córtese et al., Curr. Opin. Biotechnol. 7: 616 (1996)). Los métodos estándares para identificar los epítopos y producir los anticuerpos a partir de péptidos pequeños que comprenden un epítopo son descritos, por ejemplo, por Mole, "Epitope Map ing" , en Methods in Molecular Biology, Vol . 10, Manson (ed.), páginas 105-116 (The Humana Press, Inc. 1992); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies" , en Monoclonal Antibodies: Production, Engineering, and Clinical Application, Ritter y Ladyman (eds.), páginas 60-84 (Cambridge University Press 1995), y Coligan et al. (eds.), Current Protocole in Immunology, páginas 9.3.1-9.3.5 y páginas 9.41-9.4.11 (John Wiley & Sons 1997) . No obstante de la secuencia nucleotídica particular de un polinucleótido IL-21 variante, el polinucleótido codifica para un polipéptido que está caracterizado por su actividad proliferativa o de diferenciación, su habilidad para inducir o inhibir las funciones celulares especializadas, o por la habilidad para enlazarse específicamente a un anticuerpo anti-IL-21 o un receptor zalfall. Más específicamente, los polinucleótidos IL-21 variantes codificarán para polipéptidos que muestren al menos 50%, y preferentemente, más de 70%, 80% ó 90% de la actividad del polipéptido como se muestra en la SEQ ID NO: 2. Para cualquier polipéptido IL-21, incluyendo variantes y proteínas de fusión, una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede generar fácilmente una secuencia polinucleotídica completamente degenerada, que codifica para esa variante, utilizando el código genético y métodos conocidos en la técnica.

La presente invención proporciona además una variedad de otras fusiones polipeptídicas (proteínas multiméricas relacionadas que comprenden una o más fusiones polipeptídicas) . Por ejemplo, un polipéptido IL-21 puede ser preparado como una fusión a una proteína de dimerización como se describe en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5,155,027 y 5,567,584. Las proteínas de dimerización preferidas a este respecto incluyen los dominios de la región constante de inmunoglobulina . Las fusiones inmunoglobulina-polipéptido IL-21 pueden ser expresadas en células manipuladas mediante ingeniería genética (para producir una variedad de análogos multiméricos de IL-21) . Los dominios auxiliares pueden ser fusionados a los polipéptidos IL-21 para dirigirlos a células específicas, tejidos específicos, o macromoléculas específicas. Por ejemplo, un polipéptido o proteína IL-21 podría ser dirigido a un tipo celular predeterminado mediante la fusión de un polipéptido IL-21 a un ligando que se enlaza específicamente a un receptor sobre la superficie de esa célula objetivo. De esta manera, los polipéptidos y proteínas pueden ser dirigidos para fines terapéuticos o de diagnóstico. Un polipéptido IL-21 puede ser fusionado a dos o más porciones, tal como un marcador de afinidad para la purificación y un dominio de dirección al objetivo. Las fusiones de polipéptido pueden también comprender uno o más sitios de escisión, particularmente entre dominios. Ver, Tuan et al., Connective Tissue Research 34: 19, 1996. Utilizando los métodos discutidos en la presente, una persona de experiencia ordinaria en la técnica puede identificar y/o preparar una variedad de polipéptidos que tienen identidad de secuencia sustancialmente similar a los residuos 1-162 ó 33-162 de la SEQ ID NO: 2, o fragmentos o fusiones funcionales de los mismos, en donde tales polipéptidos o fragmentos o fusiones conservan las propiedades de la proteína de tipo silvestre, tal como la habilidad para estimular la proliferación, diferenciación, inducir función celular especializada o enlazarse al receptor de IL-21 o a los anticuerpos para IL-21. Los polipéptidos IL-21 utilizados en la presente invención pueden ser producidos en células hospederas manipuladas por ingeniería genética, de acuerdo a las técnicas convencionales. Las células hospederas adecuadas son aquellos tipos celulares que pueden ser transformados o transíectados con ADN exógeno y desarrollados en cultivo, e incluyen bacterias, células de hongos, y células eucarióticas superiores cultivadas. Las células eucarióticas, particularmente células cultivadas de organismos multicelulares, son las preferidas. Las técnicas para manipular las moléculas de ADN clonadas e introducir ADN exógeno en una variedad de células hospederas, son descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. 1989, y Ausubel et al . , eds . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley y Sons, Inc., ?, 1987. En general, una secuencia de ADN que codifica para un polipéptido IL-21 está operablemente enlazada a otros elementos genéticos requeridos para su expresión, que incluyen en general un promotor y terminador de la transcripción, dentro de un vector de expresión. El vector contendrá también comúnmente uno o más marcadores seleccionables y uno o más orígenes de replicación, aunque aquellos expertos en la técnica reconocerán que dentro de ciertos sistemas, pueden ser proporcionados los marcadores seleccionables sobre vectores separados, y la replicación del ADN exógeno puede ser proporcionada mediante la integración dentro del genoma de la célula hospedera. La selección de los promotores, terminadores , marcadores seleccionables, vectores y otros elementos es un asunto de diseño rutinario dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Muchos de tales elementos son descritos en la literatura y son disponibles a través de los proveedores comerciales. Para dirigir un polipéptido IL-21 o fragmento del mismo hacia la vía secretora de una célula hospedera, una secuencia de señal secretora (también conocida como una secuencia guía, secuencia prepro o secuencia pre) es proporcionada en el vector de expresión. La secuencia de señal secretora puede ser aquella de IL-21, o puede ser derivada de otra proteína secretada (por ejemplo, t-PA) o sintetizada de novo. La secuencia de señal secretora está operablemente enlazada a la secuencia de ADN de IL-21, por ejemplo, las dos secuencias están unidas en la estructura de lectura correcta y colocadas para dirigir el polipéptido recién sintetizado hacia la vía secretora de la célula hospedera. Las secuencias de señal secretoras están comúnmente colocadas 5' a la secuencia de ADN que codifica para el polipéptido de interés, aunque ciertas secuencias de señal secretora pueden ser colocadas en otro sitio en la secuencia de ADN de interés (ver, por ejemplo, Welch et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,037,743; Holland et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,143,830).

Las células de mamífero cultivadas son hospederos adecuados dentro de la presente invención. Los métodos para introducir ADN exógeno dentro de las células hospederas de mamífero incluyen la transfeccion mediada por fosfato de calcio (Wigler et al., Cell 14: 725, 1978; Corsaro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7: 603, 1981: Graham y Van der Eb, Virology 52: 456, 1973), electroporación (Neumann et al., EMBO J.- 1: 841-15, 1982), transfeccion mediada por DEAE-dextrano (Ausubel et al., ibid.), y transfeccion mediada por liposomas (Hawley-Nelson et al., Focus 15: 73, 1993; Ciccarone et al., Focus 15-80, 1993) y vectores virales (Miller y Rosman, BioTechniques 7: 980-90, 1989; ang y Finer, Nature Med. 2: 714-6, 1996) . Una amplia variedad de células hospederas recombinantes , adecuadas, incluyen, pero no están limitadas a, organismos hospederos procarióticos gram negativos. Las cepas adecuadas de E. coli incluyen W3110, cepas derivadas de K12, MM294, TG-1, JM-107, BL21 y UT5600. Otras cepas adecuadas incluyen: BL21(DE3), BL21 (DE3 ) LysS , BL21 (DE3 ) pLysE, DH1 , DH4I, DH5, DH5I, DH5IP' , DH5IMCR, DH10B, DH10B/p3, DH11S, C600, HB101, JM101, JM105, JM109, JM110, K38, RR1 , Y1088, Y1089, CSH18, ER1451, ER167, E. coli ¥.12, E. coli K12 RV308, E. coli K12 C600, E. coliHBlOl, E. coli K12 C600 R.sub.k-M.sub.k-, E. coli K12 RR1 (ver, por ejemplo, Brown (ed.) Molecular Biology Labfax (Academic Press 1991) ) . Otros hospederos procarióticos gram-negativos pueden incluir Serratia, Pseudomonas, Caulobacter. Los hospederos procarióticos pueden incluir organismos gram-positivos , tales como Bacillus, por ejemplo, B. subtilis y B. thuringienesis, y B. thuringienesis variedad israelensis, así como Stre toinyces, por ejemplo, S. lividans, S. a bof ciens, S. fradiae, y S. griseofuscus. Las cepas adecuadas de Bacillus subtilis incluyen BR151, YB886, MI119, I120, y B170 (ver, por ejemplo, Hardi, "Bacillus Cloning Methods", en DNA Cloning: A Practical Approach, Glover (ed.) (IRL Press 1985)). Las técnicas estándares para la propagación de vectores en hospederos procarióticos son bien conocidas por aquellos expertos en la técnica (ver, por ejemplo, Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 3a edición (John Wiley & Sons 1995); Wu et al., Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, Inc. 1997)). En una modalidad, los métodos de la presente invención utilizan IL-21 expresada en la cepa W3110, la cual ha sido depositada en la American Type Culture Collection (ATCC) como ATCC # 27325. Cuando se requiere la producción a gran escala de IL-21 utilizando el sistema de expresión de la presente invención, se puede utilizar la fermentación por lotes. En general, la fermentación por lotes comprende que se prepare un matraz de siembra de primera etapa mediante el desarrollo de las cepas de E. coli que expresan IL-21, en un medio adecuado en cultivo en matraz con agitación, para permitir el desarrollo hasta una densidad óptica (DO) de entre 5 y 20 a 600 nm. Un medio adecuado podría contener nitrógeno proveniente de una o varias fuentes tales como sulfato de amonio, fosfato de amonio, cloruro de amonio, extracto de levadura, proteínas animales hidrolizadas, proteínas vegetales hidrolizadas o caseínas hidrolizadas . El fosfato será suministrado a partir de fosfato de potasio, fosfato de amonio, ácido fosfórico o fosfato de sodio. Otros componentes podrían ser el cloruro de magnesio o sulfato de magnesio, sulfato ferroso o cloruro ferroso, y otros elementos en trazas. El medio de crecimiento puede ser suplementado con carbohidratos, tales como fructosa, glucosa, galactosa, lactosa y glicerol, para mejorar el crecimiento. Alternativamente, un cultivo de lote alimentado es utilizado para generar un alto rendimiento de proteína IL-21. Las cepas de E. coli productoras de IL-21 son desarrolladas bajo condiciones similares a aquellas descritas para el recipiente de primera etapa utilizado para inocular una fermentación por lotes . Después de la fermentación las células son cosechadas mediante centrifugación, resuspendidas en el amortiguador de homogenización y homogeneizadas, por ejemplo, en un homogeneizador APV-Gulin (Invensys APV, Tonawanda, New York) u otro tipo de equipo de desintegración celular, tales como molinos de esferas o sonicadores. Alternativamente, las células son tomadas directamente del termentador y homogeneizadas en un homogeneizador APV-Gaulin. La preparación de los cuerpos de inclusión lavados puede ser solubilizada utilizando clorhidrato de guanidina (5-8 M) o urea (7-8 M) que contiene un agente reductor tal como el beta-mercaptoetanol (10-100 mM) o ditiotreitol (5-50 mM) . Las soluciones pueden ser preparadas en Tris, fosfato, HEPES u otros amortiguadores apropiados . Los cuerpos de inclusión pueden también ser solubilizados con urea (2-4 M) que contiene laurilsulfato de sodio (0.1-2%). En el proceso para la recuperación de IL-21 purificada a partir de las cepas hospederas de E. coli transformadas en las cuales IL-21 se acumula como cuerpos de inclusión refráctiles, las células son desintegradas y los cuerpos de inclusión son recuperados mediante centrifugación. Los cuerpos de inclusión son luego solubilizados y desnaturalizados en clorhidrato de guanidina 6 M que contiene un agente reductor. La IL-21 reducida es luego oxidada en un paso de renaturalización controlada. La IL-21 replegada puede ser pasada a través de un filtro para la clarificación y retiro de la proteína insoluble. La solución se pasa luego a través de un filtro para la clarificación y retiro de la proteína insoluble. Después de que la proteína IL-21 es replegada y concentrada, la proteína IL-21 replegada es capturada en amortiguador diluido sobre una columna de intercambio catiónico y purificada utilizando cromatografía de interacción hidrofóbíca. Se prefiere purificar los polipéptidos de la presente invención a una pureza >80%, más preferentemente pureza >90%, aún más preferentemente pureza >95%, y particularmente preferido es un estado farmacéuticamente puro, que es más de 99.9% puro con respecto a las macromoléculas contaminantes, particularmente otras proteínas y ácidos nucleicos, y libre de agentes infecciosos y pirógenos. Preferentemente, un pol-ipéptido purificado está sustancialmente libre de otros' polipéptidos, particularmente otros polipéptidos de origen animal . Una variedad de ensayos conocidos por aquellos expertos en la técnica pueden ser utilizados para detectar los anticuerpos que se enlazan a las proteínas o polipéptidos IL-21. Los ensayos ejemplares son descritos con detalle en Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe (Eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988. Los ejemplos representativos de tales ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo, radioinmunoprecipitación, ensayo inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA por sus siglas en inglés) , transferencia por puntos o transferencia de Western, ensayo de inhibición de competencia y ensayo de emparedado. Además, los anticuerpos pueden ser seleccionados para enlazarse a la proteína o polipéptido IL-21 tipo silvestre versus mutante . Los métodos de la presente invención también contemplan el uso de composiciones de 11-21 químicamente modificadas, en las cuales un polipéptido IL-21 está ligado con un polímero. Los polipéptidos IL-21 ilustrativos son polipéptidos solubles que carecen de un dominio transmembranal funcional, tal como un polipéptido IL-21 maduro. Típicamente, el polímero es soluble en agua, de modo que el conjugado de IL-21 no se precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Un ejemplo dé un polímero adecuado es uno que ha sido modificado para tener un grupo reactivo simple, tal como un éster activo para la acilación, o un aldehido para la alquilacíón. De esta manera, el grado de polimerización puede ser controlado. Un ejemplo de un aldehido reactivo es el propionaldehído de polietilenglicol , o mono- (alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono) , o derivados ariloxi de los mismos (ver, por ejemplo, Harris et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,252,714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Además, se puede utilizar una mezcla de polímeros para producir conjugados de IL-21. Los conjugados de IL-21 utilizados para terapia pueden comprender porciones poliméricas solubles en agua, farmacéuticamente aceptables. Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG) , monometoxi-PEG, mono- (alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono) -PEG, ariloxi-PEG, poli- (N-vinilpirrolidona) PEG, tresil-monometoxi-PEG, PEG-propionaldehído, carbonato de bis-succinimidilo-PEG, homopolímeros de propilenglicol , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato. El PEG adecuado puede tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60,000, incluyendo, por ejemplo, 5,000, 12,000, 20,000 y 25,000. Un conjugado de IL-21 puede también comprender una mezcla de tales polímeros solubles en agua. B. El Uso de IL-21 para el Tratamiento del Cáncer La diferenciación es un proceso progresivo y dinámico, que comienza con las células madre pluripotenciales , y que termina con las células terminalmente diferenciadas. Las células madre pluripotenciales que pueden regenerarse sin compromiso hacia una línea, expresan un grupo de marcadores de diferenciación que se pierden cuando se realiza el compromiso hacia una línea celular. Las células progenitoras expresan un grupo de marcadores de diferenciación que pueden o no continuar expresándose conforme las células progresan hacia la vía de la línea celular, hacia la maduración. Los marcadores de diferenciación que son expresados exclusivamente por las células maduras son usualmente propiedades funcionales tales como los productos celulares, enzimas para producir productos celulares, y receptores. La etapa de la diferenciación de una población celular es monitorizada por la identificación de los marcadores presentes en la población celular. Existe evidencia que sugiere que los factores que estimulan los tipos de células específicas hacia una vía, hacia la diferenciación terminal o la desdiferenciación, afectan la población celular completa que se origina de una célula madre o precursora común. De este modo, la presente invención incluye la estimulación o inhibición de la proliferación de células linfoides, células hematopoyéticas y células epiteliales. IL-21 fue aislada del tejido que se sabe tiene función inmunológica importante y que contiene células que juegan un papel en el sistema inmune. IL-21 es expresada en células sanguíneas periféricas, activadas, seleccionadas por CD3+, y se ha mostrado que la expresión de IL-21 se incrementa después de la activación de las células T. Además, los resultados de los experimentos descritos en la sección de ejemplos en la presente, demuestran que los polipéptidos de la presente invención tienen un efecto sobre el crecimiento/expansión y/o el estado diferenciado de las células NK o de las progenitoras de NK. Los factores que estimulan la proliferación de los progenitores hematopoyéticos y activan las células maduras, son en general conocidos. Las células NK responden a IL-2 sola, pero la proliferación y la activación requieren en general factores de crecimiento adicionales. Por ejemplo, se ha mostrado que IL-7 y el Factor Steel (ligando c-kit) fueron requeridos para la formación de colonias de las progenitoras de NK. IL-15 + IL-2 en combinación con IL-7 y el Factor Steel fue más efectivo (Mrózek et al., Blood 87: 2632-2640, 1996). No obstante, las citocinas no identificadas pueden ser necesarias para la proliferación de subgrupos específicos de células NK y/o progenitoras de NK (Robertson et al., Blood 76: 2451-2438, 1990) . Una composición que comprende IL-21 e IL-15 estimula las progenitoras de NK y las células NK, con evidencia de que esta composición es más potente que los factores previamente descritos y combinaciones de factores. Además, IL-21 promueve la expansión de las células NK, e IL-21 puede superar en gran medida los efectos inhibitorios de IL-4 sobre el desarrollo de las células NK, éste es sinérgico con IL-2 para promover el desarrollo de las células NK, e IL-21 promueve selectivamente la expresión de IFN-? y deprime la expresión de IL-13. Estos datos sugieren que IL-21 tiene un papel indirecto en el tratamiento de los tumores sólidos, tumores metastáticos y linfornas, mediante la estimulación de las células efectoras inmunes, dando como resultado actividad anti -linforna. Además, para ciertas células cancerosas donde el receptor de IL-21 es expresado, el efecto anticanceroso de IL-21 puede ser directo. La evidencia adicional demuestra que IL-21 afecta la proliferación y/o diferenciación de las células T y las células B in vivo. Se muestra que IL-21 puede inhibir o mejorar ya sea la proliferación de las células B normales dependiendo de la naturaleza del coestímulo proporcionado a las células. IL-21 inhibe la proliferación de algunas líneas de células B, pero no otras aún cuando la mayoría de las líneas celulares no respondedoras expresan IL-21R como se mide por el enlace específico a IL-21. Muchas líneas celulares B humanas se desarrollarán en y matarán a los ratones SCID (Bonnefoix et al., Leukemia and Lymphoma 25: 169-178, 1997). Los ejemplos en la presente describen tres líneas de células B que son inhibidas por IL-21 y tres líneas de células B que no responden a IL-21. Todas las líneas celulares fueron positivas a IL-21R, y fueron colocadas dentro de ratones SCID para determinar si IL-21 podría prolongar la supervivencia de los animales que tienen linfoma. IL-21 mostró eficacia significativa contra las tres líneas celulares cuya proliferación fue inhibida in vi tro. En un experimento separado, el agotamiento de células NK de los ratones SCID falló en abrogar el efecto de IL-21 en el modelo I -9, sugiriendo que las células NK no son requeridas para la eficacia de IL-21 en este modelo. Los ensayos que miden la diferenciación incluyen, por ejemplo, la medición de los marcadores celulares asociados con la expresión específica de la etapa, de un tejido, la actividad enzimática, la actividad funcional o los cambios morfológicos (Watt, FASEB, 5: 281-284, 1991; Francis, Differentiation 57: 63-75, 1994; Raes, Adv. Anim. Cell Biol . Technol . Bioprocesses , 161-171, 1989: todas incorporadas por referencia en la presente) . Alternativamente, el polipéptido IL-21 mismo puede servir como un marcador de la superficie celular o marcador secretado, adicional, asociado con la expresión específica de la etapa, de un tejido. Como tal, la medición directa del polipéptido de IL-21 o sus receptores expresados sobre las células cancerosas, o su pérdida de expresión en un tejido conforme éste se diferencia, puede servir como un marcador para la diferenciación de los tejidos.

La clasificación de los linfomas más comúnmente utilizados es el sistema de clasificación REAL (Ottensmeier, Chemico-Biological Interactions 135-136: 653-664, 2001). Los marcadores inmunológicos específicos han sido identificados para clasificaciones de linfornas. Por ejemplo, los marcadores del linfoma molecular incluyen CD20+, CD3-, CD10+, CD5-; los marcadores del linfoma linfocítico pequeño incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; los marcadores del linfoma de células B de la zona marginal incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD23-; los marcadores del linfoma de células B grandes, difusos, incluyen CD20+, CD3-; los marcadores del linfoma de células del manto incluyen CD20+, CD3-, CD10-, CD5+, CD23+; los marcadores del linfoma de células T periféricas incluyen CD20-, CD3+; los marcadores del linfoma de células B grandes primarias mediastinales incluyen CD20+, CD3-; los marcadores del linfoma linfoblástico incluyen CD20-, CD3+, Tdt+; y los marcadores del linfoma de Burkitt incluyen CD20+, CD3-, CD10+, CD5- (Decisión Resourses, Non-Hodgkins Lymphoma, Waltham, MA. , febrero del 2002) . Los especímenes de linfoma primario son rutinariamente adquiridos por biopsia de los tumores nodales o extranodales en el diagnóstico del linfoma. Para algunos neoplasmas linfoides, en particular la Leucemia Linfocítica Crónica (CLL) , las células malignas pueden ser adquiridas de la sangre del paciente. Un método para probar si un linfoma específico o un paciente es idóneo para el tratamiento con IL-21, es el cultivo de las células de linfoma. Los especímenes de biopsia o de sangre pueden ser preparados para el cultivo de tejidos por una combinación de métodos bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, las muestras pueden ser preparadas mediante desmenuzamiento, despedazamiento, digestión enzimática o centrifugación en gradiente de densidad (Ficoll) (Jacob et al., Blood 75(5): 1154-1162, 1990). Las células tumorales son luego marcadas con una tinción de ADN fluorescente tal como el éster de succinimidilo de diacetato de carboxifluoresceína (CFSE; Molecular Probes, Eugene, OR) y cultivadas en IL-21. La distribución de las células tumorales que han sufrido una o más rondas de división celular, puede ser cuantificada mediante citometría de flujo, con las células que pierden la 1/2 de su intensidad de CFSE con cada ronda de replicación. La proporción de las células no viables y el número de células apoptóticas es también analizada para el efecto de IL-21 utilizando 7-AAD y la tinción con anexina V. El número de células supervivientes, la distribución de la tinción de CFSE y el porcentaje de células que son apoptóticas pueden ser todos utilizados para determinar si IL-21 promueve o inhibe el desarrollo y la supervivencia de un espécimen maligno dado. En tal análisis las células de linfoma son distinguidas de las células normales que contaminan el espécimen, por una combinación de un marcador específico de la línea de células B, el anticuerpo específico lambda y kappa de cadena ligera de la inmuno-globulina, y las propiedades de dispersión de la luz. Para especímenes CLL CD5, la tinción puede ser también utilizada como un auxiliar en la definición de las células malignas. Ya que la proporción de las células que proliferan in vivo es probable que sea demasiado baja, es esencial que las células tumorales sean distinguidas de las células normales. Es preferido Un método de análisis de datos tal como citometría de flujo que puede medir parámetros múltiples sobre las células individuales. Un método ejemplar para la determinación de la sensibilidad del linfoma específico a IL-21 utiliza las células de biopsia o de sangre cultivadas en medio libre de suero o en medio que contiene suero o plasma, preferentemente, suero bovino fetal o suero humano, a dosis variantes de IL-21, en general en el intervalo de 0.1 a 10 n , y que incluye un control negativo. En diversos puntos de tiempo, por ejemplo, 1, 2, 4 y 7 días las células son cosechadas o sometidas a métodos citométricos de flujo para determinar la distribución de células que se han dividido una o más veces (intensidad de CFSE) , la proporción de las células no viables (tinción con 7-AAD; Hausner et al., J. Immunol . Methods 247 (1-2): 175-186, 2001) y el número de células apoptóticas (tinción con anexina V; Lagneaux et al., Br. J. Hematol. 112 (2): 344-352, 2001). El número de células supervivientes, la distribución de la tinción con CFSE y el porcentaje de células que son apoptóticas, puede ser todo utilizado para determinar si IL-21 promueve o inhibe el desarrollo y la supervivencia de un espécimen maligno dado. En tal análisis las células del linfoma son distinguidas de las células normales que contaminan el espécimen por una combinación de un marcador especifico de las líneas de células B, el anticuerpo específico lambda y kappa de cadena ligera de inmunoglobulina y las propiedades de dispersión de luz. Para especímenes de CLL, la tinción con CD5 puede ser también utilizada como un auxiliar en la definición de las células malignas. Ya que la proporción de las células que proliferan in vitro puede ser muy baja, es crítico que las células tumorales sean distinguidas de las células normales en el análisis de datos y eso es por lo que un método tal como la citometría de flujo que puede medir parámetros múltiples en células individuales, es útil . Tal prueba de los especímenes tumorales individuales proporcionará la base para elegir cuáles pacientes es probable que respondan a IL-21 favorablemente, y para cuáles pacientes IL-21 puede estar contraindicada. Los pacientes cuyos linfocitos malignos proliferan más lentamente en respuesta a IL-21 que en cultivos control, o mueren más rápidamente que los cultivos control, podrían ser considerados como candidatos para la terapia con IL-21. Similármente, un paciente cuya velocidad de proliferación de células malignas o la supervivencia de las mismas es aumentada por IL-21 in vitro, en general, no sería candidato para la terapia con IL-21 (excepto como se anota más adelante) . Una vez que son acumulados los datos que demuestran una fuerte correlación entre un tipo particular de linfoma (por ejemplo, linfoma folicular o CLL) y la sensibilidad a IL-21 in vitro, puede ser evitada la necesidad de probar todos los pacientes dentro de tal subgrupo para su respuesta a IL-21, con la condición que no se encuentren pacientes dentro del grupo que muestren proliferación incrementada en respuesta a IL-21 in vitro. Similarmente, la medición directa del polipéptido IL-21, o su pérdida de expresión en un tejido puede ser determinada en un tejido o en células conforme éstas sufren progresión tumoral . Los incrementos en la invasividad y en la motilidad de las células, o la ganancia o la pérdida de expresión de IL-21 en una condición precancerosa o cancerosa, en comparación al tejido normal, puede servir como un diagnóstico para la transformación, invasión y metástasis en la progresión del tumor. Como tal, el conocimiento de una etapa tumoral de progresión o metástasis ayudará al médico a elegir la terapia más adecuada, o la agresividad del tratamiento, para un paciente con cáncer, individual, dado. Los métodos de medición de ganancia y pérdida de expresión (ya sea del AR m o de la proteína) son bien conocidos en la técnica y se describen en la presente, y pueden ser aplicados a la expresión de IL-21. Por ejemplo, la aparición o desaparición de polipéptidos que regulan la motilidad celular, puede ser utilizada para ayudar al diagnóstico y al pronóstico de cáncer de próstata (Banyard, J. y Zetter, B.R., Cáncer and Metast. Rev. 17: 449-458, 1999). Como un efector de la motilidad celular, la ganancia o pérdida de expresión de IL-21 puede servir como un diagnóstico para cánceres linfoides. Como se discutió anteriormente, el modelo de ratón IM-9 para el cáncer demostró que la actividad tumoral no es dependiente de las células NK. Existen varios modelos de ratones singénicos que han sido desarrollados para estudiar la influencia de los polipéptidos, los compuestos u otros tratamientos sobre la progresión del tumor. En estos modelos, las células tumorales pasadas en el cultivo son implantadas en los ratones de la misma cepa que el donador del tumor. Las células se desarrollarán en tumores que tienen características similares en los ratones recipientes, y la metástasis ocurrirá también en algunos de los modelos. Modelos tumorales apropiados para los presentes estudios incluyen el carcinoma pulmonar de Lewis (ATCC No. CRL-1642) y el melanoma B16 (ATCC No. CRL-6323) ,. entre otros. Estas son ambas líneas tumorales comúnmente utilizadas, singénicas para el ratón C57BL6/J, que son fácilmente cultivadas y manipuladas in vi tro. Los tumores que resultan de la implantación de cualquiera de estas líneas celulares, son capaces de realizar la metástasis hacia el pulmón en los ratones C57BL6/J. El modelo de carcinoma pulmonar de Lewis ha sido utilizado recientemente en ratones para identificar un inhibidor de angiogénesis (O'Reilly MS . et al. Cell 79: 315-328, 1994). Los ratones C57BL6/J son tratados con un agente experimental ya sea a través de la inyección diaria de la proteína recombinante, el agonista o el antagonista o la inyección de una sola vez del adenovirus recombinante. Tres días después de este tratamiento, 105 a 106 células son implantadas bajo la piel dorsal. Alternativamente, las células mismas pueden ser infectadas con adenovirus recombinante, tal como uno que expresa IL-21, antes de la implantación, de modo que la proteína es sintetizada en el sitio del tumor o intraceluíármente, en vez de sistémicamente . Los ratones normalmente desarrollan tumores visibles dentro de 5 días. Se deja que los tumores se desarrollen en un periodo de hasta 3 semanas, tiempo durante el cual éstos pueden alcanzar un tamaño de 1500 a 1800 mm3 en el grupo control tratado. El tamaño del tumor y el peso corporal son cuidadosamente monitorizados a todo lo largo del experimento. Al tiempo del sacrificio, el tumor es retirado y pesado junto con los pulmones y el hígado. Se ha mostrado que el peso de los pulmones correlaciona perfectamente con la carga tumoral metastática. Como una medida adicional, se cuentan las metástasis en la superficie tumoral. El tumor resecado, los pulmones y el hígado son preparados para el examen histopatológico, la inmunohistoquímica, y la hibridación in si tu, utilizando métodos conocidos en la técnica, descritos en la presente. De este modo puede ser evaluada la influencia del polipéptido expresado en cuestión, por ejemplo, IL-21, sobre la habilidad del tumor para reclutar vasculatura y sufrir metástasis. Además, aparte del uso del adenovirus, las células implantadas pueden ser transitoriamente transfectadas con IL-21. El uso de transfectantes estables de IL-21, así como el uso de promotores inducibles para activar la expresión de IL-21 in vivo, son conocidos en la técnica y pueden ser utilizados en este sistema para evaluar la inducción de la metástasis por IL-21. Además, IL-21 purificada o los medios condicionados con IL-21 pueden ser directamente inyectados en este modelo de ratón, y por lo tanto ser utilizados en este sistema. Para una referencia general ver, O'Reilly MS, et al. Cell 79: 315-328, 1994; y Rusciano D., et al. Murine Models of Liver Metástasis. Invasión Metástasis 14: 349-361, 1995. La actividad de IL-21 y sus derivados (conjugados) sobre el desarrollo y diseminación de las células tumorales derivadas de las malignidades hematológicas humanas, pueden ser medidas in vivo. Varios modelos de ratón han sido desarrollados, en los cuales las células tumorales humanas son implantadas dentro de ratones inmunodeficientes (colectivamente denominados como modelos de xenoinj erto) ; ver, or ejemplo, Cattan AR, Douglas E, Leuk. Res. 18: 513-22, 1994 y Flavell, DJ, Hematological Oncology 14: 67-82, 1996. Las características del modelo de enfermedad varían con el tipo y cantidad de células distribuidas al ratón, y varios modelos de enfermedad son conocidos en la técnica. En un ejemplo de este modelo, las células tumorales (por ejemplo, células Raj i (ATCC No. CCL-86) ) podrían ser pasadas en cultivo y aproximadamente 1 x 106 células inyectadas intravenosamente en ratones inmunodeficientes combinados, severos (SCID) . Tales células tumorales proliferan rápidamente dentro del animal y pueden ser encontradas circulando en la sangre y poblando numerosos sistemas de órganos. Las terapias diseñadas para matar o reducir el desarrollo de las células tumorales utilizando IL-21 y sus derivados, agonistas, conjugados o variantes, pueden ser probadas mediante la administración de los compuestos IL-21 a ratones que poseen las células tumorales. La eficacia de tratamiento es medida y estadísticamente evaluada como la supervivencia incrementada dentro de la población tratada, con el tiempo. La carga tumoral puede también ser monitorizada con el tiempo utilizando métodos bien conocidos tales como la citometría de flujo (o PCR) para cuantificar el número de células tumorales presentes en una muestra de sangre periférica. Por ejemplo, estrategias terapéuticas apropiadas para la prueba en tal modelo incluyen el tratamiento directo con IL-21 o conjugados relacionados, o la toxicidad inducida por el anticuerpo basada en la interacción de IL-21 con su o sus receptores, o para las terapias basadas en células que utilizan IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes. El último método, comúnmente denominado como inmunoterapia adoptiva, podría involucrar el tratamiento del animal con componentes del sistema inmune humano (por ejemplo, linfocitos, células NK, médula ósea) y pueden incluir la incubación ex vivo en células con IL-21 con o sin otros agentes inmunomoduladores descritos en la presente, o conocidos en la técnica. La actividad de IL-21 sobre la destrucción de las células tumorales mediadas por células inmunes (efectoras) puede ser medida in vivo, utilizando la forma murina de la proteína IL-21 (SEQ ID NO: 2) en modelos tumorales de ratones singénicos. Varios de tales modelos han sido desarrollados con el fin de estudiar la influencia de los polipéptidos, los compuestos u otros tratamientos sobre el desarrollo de las células tumorales y la interacción con su hospedero natural, y pueden servir como modelos para terapéutica en enfermedad humana. En estos modelos, las células tumorales pasadas en cultivo o en ratones son implantadas dentro de los ratones de la misma cepa que el donador tumoral . Las células se desarrollarán en tumores que tienen características similares en los ratones recipientes. Para referencia, ver, por ejemplo, van Elsas et al., J. Exp. Med. 190: 355-66, 1999; Shrikant et al., Immunity 11: 483-93, 1999; y Shrikant et al., J. Immunol . 162: 2858-66, 1999. Los modelos tumorales apropiados para estudiar la actividad de IL-21 sobre la destrucción de células tumorales mediada por células inmunes (efectoras) , incluyen el melanoma B16-F10 (ATCC No. CRL-6457) , y el timoma EG.7 (ATCC No. CRL-2113) , descritos en la presente, entre otros. Estas son líneas de células tumorales comúnmente utilizadas, singénicas al ratón C57BL6, que son fácilmente cultivadas y manipuladas in vi tro. En un ejemplo de un modelo in vivo, las células tumorales (por ejemplo melanoma B16-F10) (ATCC No. CRL-6475) se pasan en cultivo y aproximadamente 100,00 células son inyectadas intravenosamente en los ratones C57BL6. En este modo de administración, las células B16-F10 colonizarán selectivamente los pulmones. Focos tumorales pequeños son establecidos y se desarrollarán dentro de los pulmones del ratón hospedero. Las terapias diseñadas para matar o reducir el desarrollo de las células tumorales utilizando IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados, o variantes, pueden ser probadas por la administración de los compuestos a ratones que poseen las células tumorales. La eficacia del tratamiento es medida y estadísticamente evaluada mediante la cuantificación de la carga tumoral en la población tratada en un punto de tiempo discreto, dos a tres semanas después de la inyección de las células tumorales. Las estrategias terapéuticas apropiadas para la prueba en tal modelo incluyen el tratamiento directo con IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes, o terapias basadas en células que utilizan IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes. El último método, comúnmente denominado como terapia adoptiva, podría involucrar el tratamiento del animal con componentes del sistema inmune (por ejemplo, linfocitos, células NK, células dendríticas o médula ósea, y similares) y pueden incluir la incubación ex vivo de las células con IL-21 con o sin otros agentes inmunomoduladores descritos en la presente o conocidos en la técnica. Otra línea celular de tumor de ratón, singénica, puede ser utilizada para probar la eficacia anticancerosa de IL-21, y para identificar la población de células inmunes (efectoras) responsables para mediar este efecto. EG.7ova es una línea celular de timoma que ha sido modificada (transíectada) para expresar ovoalbúmina, un antígeno extraño al hospedero. Los ratones que poseen un receptor de células T transgénicas , específico para EG.7ova son disponibles (transgénicos OT-I, Jackson Laboratory) . Se ha demostrado que las células T CD8 aisladas de estos animales (células T OT-I) matan las célluas EG.7 in vitro y promueven el rechazo del tumor in vivo. Las células EG.7ova pueden ser pasadas al cultivo y aproximadamente 1,000,000 de células inyectadas intraperitonealmente a ratones C57BL6. Múltiples sitios de tumor son establecidos y se desarrollan dentro de la cavidad peritoneal . Las terapias diseñadas para matar o reducir el desarrollo de las células tumorales, utilizando IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes, pueden ser probadas por administración de los compuestos a ratones que poseen las células tumorales. Las células T OT-I pueden ser administradas a ratones para determinar si su actividad es aumentada en presencia de IL-21. La eficacia del tratamiento es medida y estadísticamente evaluada por el tiempo de supervivencia en las poblaciones tratadas. Las estadísticas terapéuticas apropiadas para la prueba en tales modelos incluyen el tratamiento directo con IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes, o terapias basadas en células que utilizan IL-21 o sus derivados, agonistas, conjugados o variantes. El tratamiento ex vivo de los linfocitos T citotóxicos (CTL) podría ser también utilizado para probar IL-21 en la estrategia basada en células. El análisis de la eficacia de IL-21 para tratar ciertos tipos específicos de cánceres, es preferentemente realizado utilizando animales que han mostrado que correlacionan a otra enfermedad de mamífero, particularmente enfermedad humana. Después de que se administra IL-21 en estos modelos, se realiza la evaluación de los efectos sobre las células cancerosas o los tumores. Se utilizan xenoinjertos para la mayor parte del trabajo preclínico, utilizando ratones inmunodeficientes . Por ejemplo, un modelo de ratón singénico para carcinoma de ovario utiliza la línea celular de carcinoma de ovario murino C57BL6 que sobreexpresa la isoforma BEGF16 y la proteína fluorescente verde aumentada (Zhang et al., Am. J. Pathol . 161: 2295-2309, 2002). Modelos de ratón con carcinoma de células renales utilizando inyecciones de células Renca, han mostrado que establecen tumores metastáticos de células renales que responden al tratamiento con los agentes inmunoterapeuticos tales como IL-12 e IL-2 (Wigginton et al., J. of Nat. Cáncer Inst . 88: 38-43, 1996). Ha sido establecido un modelo de ratón con carcinoma colorrectal mediante la implantación de células MC-26 de tumor colónico de ratón dentro de la subcápsula esplénica de ratones BALB/c (Yao et al., Cáncer Res. 63 (3): 586-592, 2003). Un modelo de ratón que responde al agente inmunoterapéutico para el cáncer de mama, ha sido desarrollado utilizando un ratón que espontáneamente desarrolle tumores en la glándula mamaria y demuestra tolerancia periférica y central a MUC1 (Mukherjee et al., J. Immunotherapy 26: 47-42, 2003). Para probar la eficacia de IL-21 en cáncer de próstata, modelos animales que se asemejan estrechamente a la enfermedad humana, han sido desarrollados. Un adenocarcinoma transgénico del modelo de próstata de ratón (TRAMP) es el modelo singénico más comúnmente utilizado (Kaplan-Lefko et al., Prostate 55 (3): 219-237, 2003; Kwon et al., PNAS 96: 15074-15079, 1999; Arap et al., PNAS 99: 1527-1531, 2002).

IL-21 será útil en el tratamiento de la tumorigénesis, aumentando la actividad de CTLs y NK, y por lo tanto son útiles en el tratamiento del cáncer. Además de los defectos directos e indirectos sobre las células CTLs y NK, como se muestra en varios modelos de tumor descritos en la presente, IL-21 inhibe la proliferación estimulada por IL-4 de las células B normales estimuladas por anti-IgM, y se observa un efecto similar en las líneas tumorales de células B, sugiriendo que puede existir un beneficio terapéutico en tratamiento de pacientes con IL-21, con el fin de inducir las células B tumorales hacia un estado menos proliferativo . El ligando puede ser administrado en combinación con otros agentes ya en uso, incluyendo ambos agentes quimioterapéuticos convencionales, así como los moduladores inmunes tales como el interferón alfa. Los interferones alfa/beta han demostrado que son efectivos en el tratamiento de algunas leucemias y modelos de enfermedad animal , y efectos inhibitorios del desarrollo de INF-a e IL-21 son aditivos para al menos una línea celular derivada de tumores de células B. El establecimiento del nivel de dosis óptima y la programación para IL-21, se realiza mediante una combinación de medios, incluyendo la farmacocinética y la farmacodinámica de IL-21, la sensibilidad de las líneas de células B humanas y los especímenes del linfoma primario para IL-21 in vitro, las dosis efectivas en modelos animales y la toxicidad de IL-21. Óptimamente, para tener un efecto antitumoral directo, la concentración de IL-21 en plasma debe alcanzar un nivel que in vi tro es máximamente activo contra líneas de células B del linfoma, y linfornas primarios. Además de los tiempos óptimo y mínimo de la exposición a IL-21 para promover el desarrollo inhibitorio o apoptótico, las respuestas pueden ser modeladas in vi tro con líneas celulares y células tumorales primarias. Mediciones f rmacocinéticas directas realizadas en primates, y pruebas clínicas pueden ser entonces utilizadas para predecir las dosis teóricas en pacientes que alcanzan niveles de IL-21 plasmáticos que son de suficiente magnitud y duración para lograr una respuesta biológica en pacientes. Además, IL-21 estimula una variedad de respuestas en linfocitos normales, tal que los marcadores subrogados pueden ser empleados para medir la actividad biológica de IL-21 sobre las células efectoras en pacientes. Ya que los pacientes con linfoma son tratados con una variedad de fármacos quimioterapéuticos y combinaciones de fármacos, el desarrollo de un protocolo para integrar IL-21 dentro de un régimen de tratamiento estándar existente, puede dar como resultado una producción terapéutica mejorada. El efecto de combinar fármacos quimioterapéuticos e IL-21 es principalmente modelado con las líneas de células B humanas sensibles a IL-21, in vitro, midiendo la proliferación celular, la viabilidad celular y la apoptosis. Las curvas de respuesta dependientes del tiempo y a la dosis para los fármacos quimioterapéuticos (por ejemplo, clorambucilo, etopósido, o fludaribina) son establecidos para las líneas celulares individuales. IL-21 es entonces probado en una amplia gama de concentraciones bajo condiciones subóptimas de cada fármaco quimioterapéutico. El orden de exposición de las células a IL-21 versus un agente quimioterapéutico puede afectar significativamente el resultado de la interacción con la línea celular probada. Como tal, IL-21 debe ser introducida a los cultivos de varias maneras, para encontrar el modo de tratamiento óptimo. Este debe incluir, por ejemplo, el tratamiento previo con IL-21 por varias horas a varios días (0, 4, 24, 48 y 72 horas), seguido por un lavado de IL-21 y la adición de una dosis subóptima/tiempo de exposición de un fármaco quimioterapéutico. Después de 1-3 días, el análisis del cultivo para la viabilidad celular, la proliferación y la apoptosis, es realizado. En una variación al experimento anterior, la IL-21 no es lavada antes de la adición del fármaco quimioterapéutico. El grupo completo de condiciones para la prueba podrían incluir también el tratamiento simultáneo de las células con IL-21 y un fármaco quimioterapéutico con tiempo variante del lavado de IL-21, así como la adición retrasada (de unas pocas horas a varios días) de IL-21 hasta la exposición final a un fármaco quimioterapéutico. La sincronización y la concentración de la exposición a IL-21 que da una reducción máxima en el desarrollo celular/viabilidad celular objetivo, o un incremento máximo en la respuesta apoptótica, será entonces considerado óptimo para la prueba adicional en modelos animales o el diseño de un protocolo clínico. La combinación de IL-21 con fármacos quimioterapéuticos in vitro utilizando líneas celulares cuyo crecimiento es estimulado por IL-21, tal como RPMI-1788, podría ser realizado para identificar los fármacos que eliminan los efectos potenciales adversos de IL-21, que pueden ser encontrados en un subgrupo de pacientes. Tales fármacos podrían ser identificados de aquellos conocidos por poseer actividad contra linfornas, y seleccionados con base en su habilidad in vitro para prevenir el crecimiento aumentado y/o la supervivencia de RPMI 1788 o similarmente las líneas celulares que responden a IL-21. De esta manera, la terapia con IL-21, cuando se combina con los regímenes quimioterapéuticos seleccionados, podría ser de beneficio para aquellos pacientes cuya malignidad es sensible a la supresión del crecimiento mediada por IL-21, mientras que protege a algunos pacientes que pueden de otro modo responder desfavorablemente a la monoterapia con IL-21. Los pacientes con linforna son también tratados con productos biológicos, tales como RITUXANR, IL-2 e interferón. Esos agentes biológicos que tienen un efecto inhibitorio directo sobre el tumor y ya no son dependientes de las células efectoras para su actividad, pueden ser modelados de una manera similar a los experimentos in vi tro anteriores, para su interacción con IL-21. Por ejemplo, RITUXAN1 se enlaza a las células de linfomas y puede inducir la apoptosis directamente in vi tro, pero es también capaz de inducir una variedad de mecanismos efectores tales como la citotoxicidad dependiente del complemento, y la citotoxicidad mediada por las células dependientes de anticuerpo (ADCC) . Por lo tanto, es posible definir las condiciones in vitro en las cuales IL-21 y RITUXANMR interactúan en sinergia para inhibir el desarrollo de los linfomas o estimular la apoptosis. El uso de un modelo de linfoma humano xenogénico en ratones SCID tiene el potencial para medir una más amplia gama de interacciones potenciales que involucran mecanismos efectores del hospedero entre RITUXANMR (o algún otro agente biológico) e IL-21. Para determinar si existe sinergia signi icativa IL-21 y otro agente biológico antitumoral en un modelo de ratón SCID con linfoma xenogénico, IL-21 y el otro agente biológico son probados bajo condiciones que producen resultados terapéuticos marginales con cualquier agente solo. IL-21 e IL-2 muestran sinergia en sus efectos sobre las células NK in vitro -con respecto a la producción- y proliferación de IFN-?. Además, la terapia con IL-2 a una alta dosis es altamente tóxica y requiere hospitalización extensa. Muchos regímenes de dosis baja de IL-2 han sido probados, y se ha encontrado que son bien tolerados, pero con poca evidencia de eficacia antitumoral (Atkins, Semin. Oncol . 29 (3 Suppl . 7): 12, 2002). La combinación de IL-2 a bajas dosis con IL-21 puede ser por lo tanto clínicamente útil por el aumento de la estimulación del sistema inmune de IL-2 a baja dosis, mientras que proporciona un efecto anti-linfoma directo. Los efectos de combinar IL-2 e IL-21 son estudiados en modelos de linfoma singénico de ratón o en modelos de linfoma humano xenogenico de ratón SCID, como se describe en la presente. Los efectos relativos sobre la activación de células efectoras y la toxicidad de combinar IL-2 e IL-21 a diferentes dosis, pueden ser determinados en primates normales para optimizar un nivel de dosificación y un programa para evitar la necesidad para hospitalizar a los pacientes. Para aquellos pacientes cuyos linfocitos malignos son estimulados para proliferar in vitro en respuesta a IL-21, un curso de IL-21 podría ser contraindicado (en ausencia de combinación con otros fármacos como se discutió anteriormente) a no ser que las células malignas tengan una tasa de conversión muy baja in vivo, tales como CLL. El estado relativamente en reposo de las células CLL puede estar relacionado a la resistencia de esta enfermedad a la quimioterapia. En tales casos, los pacientes podrían ser tratados pulsándolos con IL-21 justo antes de la administración del o de los agentes quimioterapéuticos . La sincronización óptima de la dosificación de IL-21 o la quimioterapia podría ser modelada in vitro para predecir cuánto tiempo después de la exposición a IL-21, las células malignas se vuelven máximamente sensibles a los fármacos quimioterapéuticos específicos. La presente invención proporciona un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas, que comprende mezclar a un mamífero con un linfoma de células B o T, una cantidad de una composición de IL-21, suficiente para reducir la proliferación de las células de linfoma B o T. En otras modalidades, la composición puede comprender al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, IL-18, GM-CSF, ligando de Flt3, interferón o factor de células madre. En otro aspecto más, la presente invención proporciona un método para reducir la proliferación de células B o T neoplásicas, que comprende administrarle a un mamífero con un neoplasma de células B o T, una cantidad de una composición de un antagonista de IL-21, suficiente para producir la proliferación de las células B o T neoplásicas. En otras modalidades, la composición puede comprender al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, IL-18, GM-CSF, ligando de Flt3 , interferón o factor de células madre. Además, el antagonista de IL-21 puede ser una proteína de fusión 1igando/toxina .

Una toxina de fusión IL-21-saporina, u otra fusión IL-21-toxina, puede ser empleada contra un grupo similar de leucemias y linfornas, extendiendo la gama de leucemias que pueden ser tratadas con IL-21. Además, tales fusiones de IL-21-toxina pueden ser empleadas contra otros cánceres en donde IL-21 se enlaza a sus receptores. La activación mediada por la toxina de fusión del receptor de IL-21, proporciona dos medios independientes para inhibir el desarrollo de las células objetivo, siendo el primero idéntico a los efectos observados o en el ligando solo, y el segundo debido a la distribución de la toxina a través de la internalización del receptor. El patrón de expresión restringido a la línea linfoide del receptor de IL-21, sugiere que el conjugado ligando-saporina puede ser tolerado por los pacientes. Cuando el tratamiento para las malignidades incluye médula ósea alogénica o transplante de células madre, IL-21 puede ser valiosa en el aumento del efecto de injerto versus tumor. IL-21 estimula la generación de células NK líticas a partir de progenitores de médula ósea y estimula la proliferación de las células T después de la activación de los receptores de antígeno. Por lo tanto, cuando los pacientes reciben trasplantes de médula alogénica, IL-21 aumentará la generación de respuestas anti-cáncer, con o sin la infusión de linfocitos del donador. Los métodos modernos para la inmunoterapia del cáncer están basados en el principio que de que el sistema inmune puede detectar y defenderse contra tumores espontáneos. La evidencia que apoya el concepto de "supervisión inmunológica" (ver, Burnet FM Lancet 1: 1171-4, 1967), viene en parte de los estudios epidemiológicos que indican que la incidencia del cáncer se incrementa en pacientes que están inmunocomprometidos por la enfermedad, tal como una infección (ver, Klein G. Harvey Lect. 69: 71-102, 1975; y Kuper et al., J. Intern. Med. 248: 171-83, 2000), o después de las intervenciones médicas tales como la ablación de médula ósea (ver, Birkeland et al., Lancet 355: 1886-7, 2000; y Penn I. Cáncer Detect Prev. 18: 241-52, 1994). Los experimentos realizados en ratones dirigidos a los genes, también muestran que el sistema inmune la susceptibilidad a los tumores espontáneos en ratones viejos (ver, Smyth, . et al., J. Exp. Med. 192: 755-760, 2000; y Davidson, . et al., J. Exp. Med. 187: 1825-1838, 1998) o después de la exposición a carcinógenos químicos (ver, Peng, S et al., J. Exp. Med. 184: 1149-1154, 1996; Kaplan, D. et al., Proc . Nati. Acad. Sci . EUA 95: 7556-7561, 1998; y Shankaran V. et al., Nature 410: 1107-1111, 2001) . La prueba de que el reconocimiento inmune de tumores ocurre frecuentemente en hospederos que poseen tumores, viene de la identificación de las células T que son reactivas a una amplia gama de antígenos asociados al tumor incluyendo los antígenos de diferenciación, antígenos mutacionales, antígenos específicos de tejido, antígenos de testículos con cáncer, autoantígenos que son sobreexpresados en tumores, y antígenos virales (Boon T et . Al., Immunol . Today 18: 267-8, 1997). Además, se sabe que las células B producen altos títulos de anticuerpos IgG circulantes que reconocen estas mismas clases de antígenos tumorales (Stockert E. et al., J. Exp. Med. 187: 1349-54, 1998; Sahin U et al., Curr. Opin. Immunol. 9: 709-16, 1997; y Jáger, E. et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 97: 12198-12203, 2000), y las células NK han sido aisladas, las cuales pueden reconocer y matar células tumorales que expresan diversos genes relacionados al estrés (Bauer, S et al., Science 285: 727-729, 1999) . El concepto de que la inmunoterapia puede ser un método efectivo para tratar el cáncer es firmemente establecido en modelos de animales experimentales, y mientras que las metodologías son mucho menos avanzadas para sujetos humanos, existe una fuerte sugerencia de que el sistema inmune puede ser estimulado para rechazar la enfermedad establecida. El primer intento en la inmunoterapia contra el cáncer fue reportado por. William Coley en 1893 quien, utilizando extractos de bacterias pirogénicas, logró respuestas anticancerosas más probablemente a través de la inducción de la inflamación sistémica y de la inmunidad mediada por las células (Coley WB. The Treatment of malignant tumors by repeated inoculations of erysipelas. ith a report of ten original cases. 1893, Clin Orthop. 262: 3-11, 1991). En tiempos más modernos, han sido empleadas cinco estrategias generalizadas para incrementar los números de células efectoras, y/o modular su actividad anticancerosa (revisado en Rosenberg, SA. (Ed.), Principies and practice of the biologic therapy of cáncer, 3a edición, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, PA, 2000) : la terapia con citocinas, la terapia de transferencia de células, terapia con anticuerpos monoclonales, vacunas para el cáncer y terapia con genes. A la fecha, cada método ha mostrado efectividad en la mediación de una respuesta anticancerosa aunque la durabilidad de estas respuestas, con unas pocas excepciones, es en su mayor parte temporal. Este hecho refleja nuestro entendimiento limitado de la inmunología tumoral y arguye que los mejoramientos en la tecnología espera la utilización de elementos previamente no reconocidos de la respuesta anticancerosa. La presente invención proporciona tal elemento para mejorar nuestro entendimiento de la inmunología tumoral, así como proporciona los polipéptidos que son terapéuticamente útiles en el tratamiento y prevención de cánceres humanos . .Un requerimiento para lograr la inmunidad sostenida y las respuestas clínicas durables, es la amplificación en el nivel, por ejemplo, en los números y actividad de las células que son mediadoras de la muerte celular. De este modo, nuevos factores que median sus efectos sobre linfocitos incluyendo células T citotóxicas (CTLs) , células NK, y células B, así como células mieloides tales como neutrófilos y células monocíticas, mejorarán la actividad anticancerosa. IL-21 es un producto de las células T "cooperadoras" CD4+ activadas que son requeridas para la inmunidad humoral y mediada por células y para sostener la memoria a largo plazo al nuevo reto antigénico (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024; Parrish-Novak J et al., Nature 408: 57-63, 2000). El receptor para IL-21 es expresado sobre las células que median las respuestas anticancerosas, y los experimentos previos han mostrado que IL-21 puede estimular la proliferación de estos tipos celulares in vi tro (Publicaciones del WIPO de pertenencia común Nos. WO 01/17235 y WO 01/77171). Experimentos adicionales afirman estas actividades de IL-21 in vivo. Los polipéptidos IL-21 para los métodos de la presente invención muestran que estimulan las células CTL y NK contra tumores in vivo en modelos animales, dando como resultado carga tumoral disminuida y células tumorales disminuidas, y supervivencia incrementada. IL-21 puede por lo tanto ser utilizada en aplicaciones terapéuticas anticancerosas en humanos. Como tal, la actividad anticancerosa de IL-21 es útil en el tratamiento y prevención del cáncer en humanos . Tales indicaciones incluyen, pero no están limitadas a las siguientes: carcinomas (tejidos epiteliales) , sarcomas de los tejidos suaves y del hueso (tejidos mesodérmicos) , adenomas (tejidos glandulares), cánceres de todos los sistemas de órganos, tales como hígado (hepatoma) y riñon (carcinomas de células renales), Sistema Nervioso Central (gliomas, neuroblastoma) , y cánceres hematologicos, cánceres asociados a virus (por ejemplo, asociados con infecciones retrovirales, HPV, hepatitis B y C, y similares) , cánceres de pulmón, cánceres endocrinos, cánceres gastrointestinales (por ejemplo, cáncer del tracto biliar, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de estómago y cáncer colorrectal) , cánceres genitourinarios (por ejemplo, cáncer de próstata, cáncer de vejiga, cáncer de células renales), cánceres ginecológicos (por ejemplo, cáncer uterino, cáncer cervical, cáncer de ovario) cánceres de mama y otros cánceres del sistema reproductivo, cánceres de la cabeza y del cuello, y otros. De interés particular son los cánceres hematopoyéticos , incluyendo pero no limitados a leucemia linfocítica, leucemia mieloide, linfoma de Hodgkin, linfornas no Hodgkin, leucemia linfocítica crónica, y otras leucemias y linfomas. Además IL-21 puede ser utilizada terapéuticamente en cánceres de diversas etapas no metastáticas así como metastáticas, tales como la "Etapa 1" Localizada (confinada al órgano de origen) ; "Etapa 2" Regional; "Etapa 3" Extensiva; y "Etapa 4" cánceres ampliamente diseminados. Además, IL-21 puede ser utilizada en diversas aplicaciones para el cáncer, inmunoterapia, y en conjunto con la quimioterapia y similares. La administración de IL-21 utilizando los métodos de la presente invención dará como resultado una respuesta tumoral . Mientras que cada protocolo puede definir de manera diferente el acceso a la respuesta tumoral, pueden ser encontrados lineamientos generales en Clinical Research Associates Manual, Southwest Oncology Group, CRAB, Seattle, WA, 6 de octubre de 1998, actualizado en agosto de 1999. De acuerdo al Manual CRA (ver, Capítulo 7 "Response Accessment" ) , la respuesta tumoral significa una reducción o eliminación de todas las lesiones o metástasis mensurables. La enfermedad es en general considerada mensurable si ésta comprende lesiones bidimensionalmente mensurables con márgenes claramente definidos por fotografía médica o rayos X, tomografía axial computarizada (CT) , formación de imagen de resonancia magnética (MRI) , o palpación. La enfermedad evaluable significa que la enfermedad comprende lesiones unidimensionalmente mensurables, masas con márgenes no claramente definidos, lesión con ambos diámetros menores de 0.5 cm, lesiones sobre cicatrización con diámetro más pequeño que la distancia entre los cortes, lesiones palpables con diámetro menor de 2 cm, o enfermedad ósea. La enfermedad no evaluable incluye efusiones pleurales, ascitis, y enfermedad documentada por evidencia indirecta. Lesiones previamente radiadas no han progresado también en general son consideradas no evaluables . Los criterios para el estado objetivo son requeridos para los protocolos para evaluar la respuesta del tumor sólido. Un criterio representativo incluye el siguiente: (1) Respuesta Completa (CR, por sus siglas en inglés) definida como la desaparición completa de toda la enfermedad mensurable o evaluable. No hay lesiones nuevas. No hay síntomas relacionados a la enfermedad. No hay evidencia de enfermedad no evaluable; (2) Respuesta Parcial (PR, por sus siglas en inglés) definida como mayor que o igual a 50% de disminución a partir de la línea base en la suma de los productos de los diámetros perpendiculares de todas las lesiones mensurables. No hay progresión de enfermedad evaluable. No hay nuevas lesiones. Aplica a pacientes con al menos una lesión mensurable; (3) Progresión definida como 50% o un incremento de 10 cm2 en la suma de los productos de las lesiones mensurables, sobre la suma más pequeña observada utilizando las mismas técnicas que la línea base, o empeoramiento claro de cualquier enfermedad evaluable, o reaparición de cualquier lesión que hubiera desaparecido, o aparición de cualquier nueva lesión, o falla para regresar para evaluación debido a muerte o deterioro de la condición (a no ser que esté no relacionada a este cáncer) ; (4) Estable o sin Respuesta, definido como que no califica para CR, PR, o Progresión. (Ver, Clinical Research Associates Manual, supra) . Los ejemplos de los métodos para utilizar IL-21 en el tratamiento de cáncer incluyen, pero no están limitados a, los siguientes : 1) IL-21 puede ser utilizada como un agente simple para la actividad inhibitoria directa contra tumores que expresan el receptor de IL-21 (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024; Publicaciones IPO Nos. WO 01/17235 y WO 01/77171). Tal actividad es mostrada en la presente. La administración en un vehículo farmacéutico para el uso terapéutico puede ser lograda utilizando los métodos en la técnica y descritos en la presente . 2) IL-21 puede ser conjugada a un compuesto tóxico que se enlaza a y mata las células tumorales que expresan el receptor de IL-21, tales como los linfornas de células B, linfornas de células T y linfornas de células NK. El compuesto tóxico puede ser un fármaco de molécula pequeña como la calicamicina utilizada de una manera similar al conjugado de anticuerpo anti-CD33 + fármaco, MYLOTARG", que se utiliza para tratar leucemia mielogénica aguda (por ejemplo, ver, Sievers El et al., J Clin Oncol . 19: 3244-54, 2001; y Bernstein ID Clin. Lymphoma Suppl . 1: S9-S11, 2002); o un radioisótopo como 125I (Kaminski MS, et al., J. Clin. Oncol. 19: 3918-28, 2001) o 90Y (Revisado en Gordon LI et al., Semin. Oncol. (1 suppl. 2): 87-92, 2002) que ha sido acoplado a un anticuerpo anti-CD20 utilizado para el tratamiento de linfoma no Hodgkin; o una toxina proteica de origen natural tal como Ricina A (Lynch TJ Jr, et al., J. Clin. Oncol . 15: 723-34, 1997) o toxina de la difteria B que fue elabora como una proteína de fusión con IL-2 para el tratamiento de linfoma de células T cutáneas (Talpur R et 1., Leuk. Lymphoma 43: 121-6, 2002). El acoplamiento de estos compuestos tóxicos a IL-21 puede ocurrir a través de la conjugación química (Rapley R. Mol. Biotechnol . 3: 139-54, 1995) o recombinación genética (Foss FM. Clin. Lymphoma Suppl 1: S27-31, 2000). Tales conjugados de toxina con IL-21, por ejemplo conjugados de IL-21-saporina, muestran que matan a diversos tumores in vivo e in vitro (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024; y descrita en la presente) . 3) IL-21 puede ser utilizada como un agente inmunoes imulador para la monoterapia contra el cáncer. Una variedad de citocinas tales como IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IL-15, e interferón, se sabe que estimula las respuestas anticancerosas en modelos animales vía la estimulación del sistema inmune (revisado en Rosenberg SA ibid.). Además, se muestra que IL-21 también estimula el sistema inmune (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024; y descrita en la presente).- La monoterapia con citocina es una práctica aceptada para los pacientes humanos con cáncer. Por ejemplo, el uso de IL-2 e IFN-a son utilizados para los tratamientos de melanoma metastático y carcinoma de células renales (por ejemplo, ver, Atkins MB et al., J. Clin. Oncol . 17: 2105-16, 1999; Fyfe G et al., J. Clin. Oncol. 13: 688-96, 1995; y Jonasch E, y Haluska FG, Oncologist 6: 34-55, 2001). El mecanismo de acción de estas citocinas incluye, pero no está limitado a, un aumento de una de las respuestas mediadas por células Thl, incluyendo la muerte directa de las células tumorales por las células T CD8+ y las células NK. Se muestra que IL-21 similarmente aumenta las respuestas mediadas por Thl, incluyendo la muerte directa de las células tumorales por CTLs, por ejemplo las células T CD8+ y las células NK in vivo e in vi tro, como se describe en la presente. De este modo, IL-21 de la presente invención puede ser utilizada terapéutica o clínicamente para matar activamente las células tumorales en enfermedad humana, y para regular estas actividades, así como en respuestas anticancerosas adicionales. 4) IL-21 puede ser utilizada como un agente inmunoestimulador en combinación con quimioterapia, radiación y mieloablación. Además de funcionar sola para reforzar la inmunidad anticancerosa en pacientes, IL-21 puede funcionar en sinergia con tipos estándares de quimioterapia o radiación. Por ejemplo, en modelos preclínicos de linfoma y carcinoma de células renales, la combinación de IL-21 con doxorrubicina (Ehrke MJ et al., Cáncer Immunol . Immunother. 42: 221-30, 1996), o las combinaciones de IL-2 (Younes E et al., Cell Immunol. 165: 243-51, 1995) o IFN-a (Nishisaka N et al., Cytokines Cell Mol Ther. 6: 199-206, 2000) con radiación, proporcionó resultados superiores sobre el uso de agentes simples. En este ajuste, IL-21 puede reducir adicionalmente la carga tumoral y permitir la muerte más eficiente por el agente quimioterapéutico . Adicionalmente, dosis letales de quimioterapia o radiación seguido por el trasplante de médula ósea o reconstitución de células madre, podría reducir la carga tumoral a un nivel suficientemente pequeño (por ejemplo enfermedad residual mínima) para permitir mejor un efecto anticanceroso mediado por IL-21. Los ejemplos de este tipo de régimen de tratamiento incluyen los usos de IL-2 e IFN-cc para modificar las respuestas anticancerosas después de la mieloablación y del trasplante (Porrata LF et al., Bone Marro Transplant . 28: 673-80, 2001; Slavin S, y Nagler A. Cáncer J. Sci. Am. Suppl. 1: S59-67, 1997; y Fefer A et al., Cáncer J. Sci. Am. Suppl. 1: S48-53, 1997). En el caso del linfoma y otros cánceres, dependiendo de cuándo se utilice IL-21 con relación a los agentes quimioterapéuticos, IL-21 puede ser empleada para sinergizarse directamente con el efecto del efecto quimioterapéutico sobre las células tumorales, o alternativamente empleado después de la quimioterapia para estimular el sistema inmune. Aquellos expertos en la técnica podrían diseñar un protocolo para tomar ventaja de ambas posibilidades . 5) IL-21 puede ser utilizada como un agente protector de tejidos en combinación con formas estándares de quimioterapia o los métodos que realización la ablación de la médula ósea. IL-21 regula la proliferación y diferenciación de las células. Como resultado, IL-21 puede proteger a diversos tejidos y órganos de las toxicidades asociadas con las quimioterapias comúnmente utilizadas y la radiación. Como un ejemplo, el epitelio del intestino expresa el receptor de IL-15 y los experimentos en modelos anímales muestran que IL-15 protege al epitelio intestinal de la toxicidad inducida por quimioterapia, y previene la morbididad (Shinohara H et al., Clin. Cáncer Res. 5: 2148-56, 1999; Cao S et al., Cáncer Res. 58: 3270-4, 1998; y Cao S et al., Cáncer Res. 58: 1695-9, 1998) . Además de proteger contra el daño, los efectos proliferativos de IL-21 pueden acelerar la regeneración de los tejidos después de la toxicidad inducida por f rmacos. Ejemplos relevantes de este tipo de actividad incluyen la reconstitución aumentada del sistema inmune estimulado por IL-7, después del trasplante de médula ósea (Alpdogan O et al., Blood 98: 2256-65, 2001; y ackall CL et al., Blood 97: 1491-7, 2001) y el uso de G-CSF para tratar la neutropenia después de la quimioterapia (Lord, BI et al., Clin. Cáncer Res. 7: 2085-90, 2001; y Holmes FA et al., J. Clin. Oncol . 20: 727-31, 2002) . Debido a que IL-21 muestra que aumenta la proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas y linfoides, IL-21 de la presente invención puede ser utilizado terapéutica o clínicamente para ayudar a la recuperación, así como a aumentar los esquemas de dosificación quimioterapéutica después de la administración de los agentes quimioterapéuticos en enfermedad humana. 6) IL-21 puede ser utilizada en combinación con otros compuestos inmunomoduladores incluyendo diversas citocinas y moléculas co-estimuladoras/inhibidoras . La actividad inmunoestimuladora de IL-21 en la mediación de una respuesta anticancerosa puede ser aumentada en pacientes cuando IL-21 es utilizada con otras clases de moléculas inmunomodul doras . Estas podrían incluir, pero no están limitadas a, el uso de citocinas adicionales. Por ejemplo, el uso combinado de IL-2 e IL-12 muestra efectos benéficos en linfoma de células T, carcinoma de células escamosas y cáncer de pulmón (Zaki MH et al., J. Invest. Dermatol . 118: 366-71, 2002; Li D et al., Arch. Otolaryngol. Head Neck Surg. 127: 1319-24, 2001; e Hiraki A et al., Lung Cáncer 35: 329-33, 2002). Además, IL-21 podría ser combinada con reactivos que coestimulan diversas moléculas de la superficie celular encontradas sobre células efectoras basadas en el sistema inmune, tales como la activación de CD137 (Wilcox RA et al., J. Clin. Invest. 109: 651-9, 2002) o la inhibición de CTLA4 (Chambers CA et al., Ann. Rev. Immunol . 19: 565-94, 2001). Alternativamente, IL-21 podría ser utilizada con reactivos que inducen la apoptosis de células tumorales por interacción con los receptores relacionados a TRAIL (Takeda K et al., J. Exp. Med. 195: 161-9, 2002; y Srivastava RK, Neoplasia 3: 535-46, 2001). Tales reactivos incluyen el ligando de TRAIL, fusiones del ligando de TRAIL-Ig, y anticuerpos anti-TRAIL, y similares. 7) IL-21 puede ser utilizada en combinación con Terapia con Anticuerpos Monoclonales . El tratamiento del cáncer con anticuerpos monoclonales se está volviendo una práctica estándar para muchos tumores, incluyendo linfoma no Hodgkin (RITUXAN^) , formas de leucemia (MYLOTARGMR) , carcinoma de células de mama (HERCEPTIN") , y carcinoma de colón (ERBITUXMR) . Un mecanismo mediante el cual los anticuerpos son mediadores de un efecto anticanceroso, es a través de un proceso denominado como citotoxicidad mediada por células dependientes de anticuerpo (ADCC) en las cuales las células basadas en el sistema inmune, incluyendo las células NK, macrófagos y neutrófilos, matan aquellas células que son enlazadas por el complejo del anticuerpo. Debido a su actividad inmunomoduladora, IL-21 puede ser utilizada para aumentar la actividad de la terapia con anticuerpos. Los ejemplos de este tipo de paradigma de tratamiento incluyen el uso en combinación de RITUXANMR y cualquiera de IL-2, IL-12 o IF -a'para el tratamiento del linfoma de Hodgkin y no Hodgkin-(Keilholz U et al., Leuk. Lymphoma 35: 641-2, 1999; Ansell SM et al., Blood 99: 67-74, 2002; Carson WE et al., Eur. J. Immunol. 31: 3016-25, 2001; y Sacchi S et al., Haematologica 86: 951-8, 2001) . Similarmente , debido a que IL-21 muestra que aumenta la proliferación y diferenciación de las células hematopoyéticas y linfoides, así como las células K, IL-21 de la presente invención puede ser utilizada terapéutica o clínicamente para aumentar la actividad y efectividad de la terapia con anticuerpo en la enfermedad humana. 8) IL-21 puede ser utilizada en combinación con terapia adoptiva de células. Un método utilizado para tratar el cáncer es aislar las células efectoras anticancerosas directamente de los pacientes, expandir éstas en cultivo a números muy altos, y luego reintroducir estas células nuevamente a los pacientes. El desarrollo de estas células efectoras, las cuales incluyen células NK, células LAK y células T específicas en tumor, requiere citocinas tales como IL-2 (Dudley ME et al., J. Immunother. 24: 363-73, 2001). Dadas sus propiedades estimuladoras del desarrollo sobre los linfocitos, IL-21 podría ser también utilizada para propagar estas células en cultivo para la reintroducción subsecuente en pacientes en necesidad de tales células. Después de la transferencia de células nuevamente a los pacientes, son empleados métodos para mantener su viabilidad mediante el tratamiento de los pacientes con citocinas tales como IL-2 (Bear HD et al., Cáncer Immunol . Immunother. 50. 269-74, 2001; y Schultze JL et al., Br. J. Haematol. 113: 455-60, 2001) . Nuevamente, IL-21 puede ser utilizada después de la terapia adoptiva para incrementar la función y sobrevivencia de las células efectoras . 9) IL-21 puede ser utilizada en combinación con vacunas tumorales. El objetivo principal de la vacunación contra el cáncer es promover una respuesta inmune activa contra antígenos expresados por el tumor. Numerosos métodos para inmunizar pacientes con antígenos cancerosos, han sido empleados, y está siendo utilizada una variedad de técnicas para amplificar la resistencia de la respuesta inmune después de la administración del antígeno (revisado en Rosenberg, SA ibid.) . Los métodos en los cuales puede ser utilizada IL-21 en combinación con una vacuna tumoral incluyen, pero no están limitados a, la distribución de células tumorales autólogas y alogénicas que expresan el gen IL-21 o en el cual IL-21 es distribuido en el contexto de una proteína adyuvante. Similarmente, IL-21 puede ser distribuida en combinación con inyección de la proteína purificada del antígeno tumoral, el antígeno tumoral expresado a partir del ADN inyectado, o los péptidos del antígeno tumoral que son presentados a las células efectoras utilizando terapias basadas en células dendríticas. Los ejemplos de estos tipos de terapias incluyen el uso de citocinas como IL-2 en el contexto de la vacunación con células tumorales modificadas (Antonia SJ et al . , J. Urol . 167: 1995-2000, 2002; y Schrayer DP et al., Clin. Exp. Metástasis 19: 43-53, 2002), ADN (Niethammer AG et al., Cáncer Res. 61: 6178-84, 2001), y células dendríticas (Shimizu K et al., Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 96: 2268-73, 1999). Similarmente, IL-21 puede ser utilizada como un adyuvante de vacuna anticancerosa. 10) IL-21 puede ser utilizada en el contexto de la terapia génica. La terapia génica puede ser ampliamente definida como la transferencia de material genético a una célula para alterar transitoria o permanentemente el fenotipo celular. Están siendo desarrollados numerosos métodos para la distribución de citocinas, antígenos tumorales, y moléculas coestimuladoras adicionales vía la terapia génica a sitios específicos dentro de los pacientes con tumores (revisado en Rosenberg, SA ibid.). Estas metodologías podrían ser adaptadas a utilizar ADN o ARN de IL-21, IL-21 podría ser utilizado como un adyuvante de proteína para aumentar la inmunidad en combinación con un procedimiento de terapia génica como se describe en la presente. La distribución tisular de un receptor para una citocina dada ofrece una fuerte indicación de los sitios potenciales de acción de esa citocina. El análisis de Northern del receptor de IL-21 reveló transcritos en bazo, timo, nodulos linfáticos, médula ósea y leucocitos de sangre periférica humanos. Fueron identificados tipos celulares específicos que expresan los receptores de IL-21, y fueron observadas señales fuertes en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) y en el linfoma de Burkitt, Raj i . Las dos líneas de células monocíticas, THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cáncer 26: 171-176, 1980) y U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cáncer 17: 565-577, 1976) , fueron negativas. El receptor de IL-21 es expresado a niveles relativamente altos en la MLR, en la cual las células mononucleares de sangre periférica (PBMNC) provenientes de dos individuos son mezcladas, dando como resultado activación mutua. La detección de altos niveles del transcrito en la MLR pero no en las poblaciones de células T o B restantes, sugiere que la expresión del receptor de IL-21 puede ser inducida en uno o más tipos celulares durante la activación. La activación de poblaciones aisladas de células T y B puede ser artificialmente lograda mediante la estimulación de las células con PMA e ionomicina. Cuando las células clasificadas fueron sometidas a estas condiciones de activación, los niveles del transcrito del receptor de IL-21 se incrementaron en ambos tipos celulares, apoyando un papel para este receptor e IL-21 en las respuestas inmunes, especialmente en las expansiones de células T y B autócrinas y paracrinas durante la activación. IL-21 puede jugar también un papel en la expansión de progenitores más primitivos involucrados en la linfopoyesis . Se encontró que el receptor de IL-21 está presente a bajos niveles en las células T y B restantes, y fue suprarregulado durante la activación en ambos tipos celulares. De manera interesante, las células B también subregulan el mensaje más rápidamente que como lo hacen las células T, sugiriendo que la amplitud de la señal y la sincronización del apagado de la señal son importantes para la regulación apropiada de las respuestas de células B. IL-21 en conjunto con IL-15 expande las células MK de los progenitores de la médula ósea y aumenta la función efectora de las células NK. IL-21 también coestimula las células B maduras estimuladas con los anticuerpos anti-CD40, pero inhibe la proliferación de células B a señales a través de IgM. IL-21 aumenta la proliferación de células T en concierto con una señal a través del receptor de células T, y la sobreexpresion en ratones transgénicos conduce a linfopenia y una expansión de los monocitos y granulocitos , como se describe en la presente. Los polipéptidos y proteínas de IL-21 pueden ser también utilizados ex vivo, como en un cultivo de médula autóloga. En resumen, la médula ósea es retirada de un paciente antes de la quimioterapia o del transplante de órganos, y tratada con IL-21, opcionalmente en combinación con una o más de otras citocinas . La médula tratada es luego devuelta al paciente después de la quimioterapia, para acelerar la recuperación de la médula o después del trasplante, para suprimir la enfermedad injerto versus huésped. Además, las proteínas de la presente invención pueden ser también utilizadas para la expansión ex vivo de la médula o de las células progenitoras de sangre periférica (PBPC) . Antes del tratamiento, la médula puede ser estimulada con el factor de célula madre (SCF) para liberar células progenitoras tempranas hacia la circulación periférica. Estos progenitores pueden ser recolectados y concentrados de la sangre periférica y luego tratados en cultivo con IL-21, opcionalmente en combinación con una o más de otras citocinas, incluyendo, pero no limitadas a SCF, IL-2, IL-4, IL-7, IL-15, IL-18, o interferón, para diferenciar y proliferar hacia cultivos linfoides de alta densidad, que pueden ser luego devueltos al paciente después de la quimioterapia o del trasplante. La presente invención proporciona un método para la expansión de células hematopoyéticas y de los progenitores de células hematopoyéticas, que comprende el cultivo de la médula ósea o de las células de sangre periférica con una composición que comprende una cantidad de IL-21, suficiente para producir un incremento en el número de células linfoides en la médula ósea o las células de sangre periférica, en comparación a la médula ósea o a las células de sangre periférica, cultivadas en ausencia de IL-21. En otras modalidades, las células hematopoyéticas y las células progenitoras hematopoyéticas son células linfoides. En otra modalidad más, las células linfoides son células NK o células T citotóxicas. Además, la composición puede además comprender al menos otra citocina seleccionada del grupo que consiste de IL-2, IL-15, IL-4, G -CSF, ligando de Flt3 y el factor de células madres. C. El uso de IL-21 para infecciones Un requerimiento para lograr la inmunidad sostenida y las respuestas clínicas durables es la amplificación en los números y la actividad de las células, que suprimen la replicación viral, previenen la reinfección y matan a las células infectadas. De este modo, los nuevos factores que son mediadores de los efectos sobre los linfocitos, incluyendo células T citotóxicas (CTLs) , células NK y células B, así como células mieloides tales como neutrófilos y células monocíticas, mejorarán la actividad antiviral por parte del sistema inmune. IL-21 es un producto de las células T "cooperadoras" CD4+ activadas, que son requeridas para la inmunidad humoral y mediada por las células y para sostenimiento de la memoria a largo plazo al nuevo reto antigénico (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024; Parrish-Novak et al., Nature 408: 57-63, 2000). El receptor para IL-21 es expresado sobre las células que median las respuestas antivirales, y los experimentos previos han mostrado que IL-21 puede estimular la proliferación de estos tipos celulares in vitro (Publicaciones del WIPO Nos. WO 01/17235 y WO 01/77171) . Experimentos adicionales afirman estas actividades de IL-21 in vivo.

Un papel central del sistema inmune es proteger contra la infección microbiana (revisado por Paul, E (Ed) , Fundamental Immunology. Lippincott-Raven, New York, NY, 1999) . El sistema inmune realiza una respuesta rápida y altamente específica a un amplio espectro de bacterias, parásitos y virus a través de una orquestación de las interacciones celulares y la síntesis de factores solubles, incluyendo citocinas. Dos categorías de actividad describen esta respuesta protectora: la inmunidad innata y la inmunidad adaptativa. La respuesta inmune innata es una respuesta aguda y funciona para limitar la replicación de los patógenos. Los macrófagos, las células dendríticas, las células NK y los granulocitos neutrófilos constituyen algunos de los tipos celulares responsables de esta actividad. La inmunidad innata está acompañada por una respuesta más prolija, la respuesta inmune adaptativa, mediante la cual un sistema efector específico del antígeno regulado por células dendríticas células T y células B, es mediador de la resolución de la infección y de la memoria a largo plazo. Las citocinas juegan un papel principal en la regulación de las respuestas inmunes a la infección. Por ejemplo, INF-a y ? son críticos para inhibir la replicación viral y prevenir la replicación de las células que albergan el virus (revisado por Vilcek J, y Sen GC, BN, Knipe DM, Howley PM (Eds.), Interferons and other cytokines, Fields Fundamental Virology, 3a ed., Lippincott-Raven Publishers Philadelphia, PA, 1996, páginas 341-365). Los IFN's también estimulan las células que regulan la inmunidad innata y son requeridos para el inicio de la respuesta inmune adquirida. Citocinas adicionales producidas a tiempos tempranos durante la infección viral incluyen IFN-? producido por células NK, factor a de necrosis tumoral e IL-15. Estas moléculas ayudan a conformar las respuestas inflamatorias a la infección, así como a estimular la proliferación y diferenciación de los linfocitos críticos para la inmunidad adaptativa. Con respecto a la infección viral, las células T CD4+ que se llegan a inactivar en respuesta a los antígenos virales, inician una respuesta de células T cooperadoras tipo I (TH1) y la cascada subsiguiente requerida para la inmunidad mediada por las células. Es decir, después de su expansión por los factores de crecimiento específicos como la citocina IL-2, estas células T estimulan las células T CD8+ específicas del antígeno, los macrófagos, las células NK para matar las células hospederas viralmente infectadas. Nuevamente, las citocinas juegan un papel importante en la mediación de estos tipos de respuestas. IFN-y, por ejemplo, es crítico para regular la diferenciación de las células T Thl y para estimular la inmunidad mediada por las células (revisado por Paul, WE supra.). Las estrategias para tratar la enfermedad infecciosa frecuente se enfocan a las formas para aumentar la inmunidad.

Por ejemplo, el método más común para tratar la infección viral involucra vacunas profilácticas que inducen respuestas de memoria basadas en el sistema inmune. Muchas enfermedades infantiles endémicas tales como las paperas, la varicela y el sarampión son ahora muy raras en los Estados Unidos, gracias a los programas de vacunación agresivos (Dowdle WR, y Orenstein A, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 91: 2464-8, 1994). Otro método más para tratar la infección viral incluye la inmunización pasiva vía la terapia con inmunoglobulina tal como la infusión de anticuerpos para el virus sincitial respiratorio (RSV) , a los pacientes en alto riesgo (Meissner HC, J. Pediatr. 124: S17-21, 1994) . IFN-ct es otro método más para tratar las infecciones virales tales como las verrugas genitales (Reichman RC et al., Ann. Intern. Med. 108: 675-9, 1998) y enfermedades crónicas como HCV (Davis GL et al., New Engl . J. Med. 339: 1493-9, 1998) y HBV. Aunque frecuentemente son eficaces, estos métodos tienen limitaciones en el uso clínico. Por ejemplo, muchas infecciones virales no son adecuadas para el desarrollo de vacunas, ni tampoco son tratables con anticuerpos solos. Además, los IFN' s solos no son extremadamente efectivos y éstos pueden provocar toxicidades significativas; de este modo, existe una necesidad para terapias mejoradas. Los métodos mejorados para tratar las enfermedades tales como las infecciones virales son dependientes del aislamiento de los reactivos que específicamente aumentan la inmunidad innata y adquirida; los compuestos que estimulan las células efectoras de una respuesta antiviral . Hemos reportado previamente el descubrimiento de IL-21 (Parrish-Novak J et al., supra; Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). Esta citocina es producida por las células T CD4+ activadas. El receptor de IL-21 es expresado por una variedad de células dentro del sistema inmune tales como las células T CD4+ y CD8+, células B, células NK y células dendríticas. Como IL-2, IL-21 actúa como un factor autocrino que impulsa la proliferación de las células T, un requerimiento crítico para la amplificación de una respuesta antiviral. Además, IL-21 aumenta las actividades de proliferación y muerte de las células T CD8 , y las células NK demostrando de este modo un papel importante en la inmunidad mediada por las células (Parrish-Novak, J. et al., supra.; Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024; y Kasaian MT et al., Immunity 16: 559-69, 2002) . Finalmente, IL-21 aumenta la proliferación de las células B en presencia de células T cooperadoras, con lo cual se sugiere un papel importante en la estimulación del proceso mediado por anticuerpos (Parrish-Novak, J. et al., supra.; Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). Además, los datos descritos en la presente han mostrado no solamente los efectos inmunoestimuladores de IL-21 sobre el sistema inmune con respecto a las CTLs, sino también IL-21 es inmunoestimulador y representa un nuevo tratamiento para la enfermedad viral. Los polipéptidos IL-21 de la presente invención muestran que estimulan las células CTL y NK. IL-21 puede por lo tanto ser utilizada en aplicaciones antivirales terapéuticas en humanos. Como tal, la actividad antiviral de IL-21 es útil en el tratamiento y prevención de infecciones virales humanas. Los ejemplos de los tipos de infecciones virales para el uso de IL-21 incluyen, pero no están limitados a: infecciones provocadas por virus de ADN (por ejemplo, herpes virus, tales como el virus del herpes simple, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus , virus de la viruela tales como virus Varióla (viruela) ; hepadnavirus (por ejemplo virus de la hepatitis B) ; virus del papiloma; adenovirus) ; virus de ARN (por ejemplo, HIV I, II, HTLV I, II; poliovirus, hepatitis A; coronavirus, tal como el síndrome respiratorio agudo súbito (SARS) ; orthomyxoviruses (por ejemplo, virus de la influenza) ; paramyxoviruses (por ejemplo, virus del sarampión) ,- virus de la rabia; virus de la hepatitis C) , flavivirus, virus de la influenza; calicivirus ; virus de la rabia, virus de la ictericia hematúrica, arena virus y similares. Además, los ejemplos de los tipos de enfermedades relacionadas al virus para los cuales IL-21 podría ser utilizada incluyen, pero no están limitadas a: inmunodeficiencia adquirida; hepatitis; gastroenteritis; enfermedades hemorrágicas ; enteritis; carditis; encefalitis; parálisis; bronquiolitis ; enfermedad respiratoria superior e inferior; papilomatosis respiratoria; artritis; enfermedad diseminada, meningitis, mononucleosis . Además, IL-21 puede ser utilizada en diversas aplicaciones para la inmunoterapia antiviral, y en conjunto con otras citocinas, otros agentes antivirales proteicos o de molécula pequeña y similares. Además, IL-21 será útil en el tratamiento de otras infecciones microbianas. Estos tipos de microbios incluyen bacterias y hongos. Las infecciones bacterianas específicas que pueden ser tratadas con IL-21 incluyen, pero no están limitadas a, clamydiae, listeriae, Helicobacter pylori, mycobacterium, mycoplasma, Bacillus anthracis, sal onella y shigella. Un ejemplo de una infección por hongos incluye, pero no está limitada a candidiasis. Por ejemplo: (1) IL-21 puede ser utilizada como una monoterapia para las infecciones virales agudas y crónicas y para los pacientes inmunocomprometidos. Los métodos que aumentan la inmunidad pueden acelerar el tiempo de recuperación en pacientes con infecciones no resueltas. Una lista parcial de los tipos de infecciones es proporcionada (ver arriba) . La inmunoterapia pueden tener un impacto aún mayor sobre los subgrupos de pacientes inmunocomprometidos, tales como los muy jóvenes o muy viejos, así como pacientes que sufren de inmunodeficiencias adquiridas a través de la infección, o inducidas después de las intervenciones médicas tales como la quimioterapia o la ablación de la médula ósea. Los ejemplos de los tipos de indicaciones que son tratadas vía la inmunomodulación incluyen: el uso de IFN-a para la hepatitis crónica (Perry CM, y Jarvis B, Drugs 61: 2263-88, 2001), el uso de IL-2 después de la infección por HIV (Mitsuyasu R. , J Infect Dis. 185 Suppl 2: S115-22, 2002; y Ross RW et al., Expert Opin Biol . Ther. 1: 413-24, 2001), y el uso de cualquier interferón (Faro A, Springer Semin Immunopathol . 20: 425-36, 1998) para el tratamiento de las infecciones por el virus de Epstein-Barr después del trasplante. Los experimentos realizados en modelos animales indican que IL-2 y GM-CSF pueden también ser eficaces para el tratamiento de las enfermedades relacionadas a EBV (Baiocchi RA et al., J Clin. Invest. 108: 887-94, 2001). (2) IL-21 puede ser utilizada en combinación con agentes antivirales. Algunos de los tratamientos más comunes para la infección viral incluyen fármacos que inhiben la replicación viral tales como ACYCLOVIR^. Además, el uso combinado de algunos de estos agentes forman la base para la terapia antirretroviral altamente activa (HAART) utilizada para el tratamiento del HIV. Los ejemplos en los cuales la combinación de inmunoterapia (por ejemplo citocinas) y fármacos antivirales muestra eficacia mejorada, incluyen el uso de interferón más RIBAVIRIN para el tratamiento de la infección crónica por HCV (Maddrey WC, Semin. Liver. Dis. 19 Suppl 1: 67-75, 1999) y el uso combinado de IL-2 y HAART (Ross, RW et al., ibid.) . De este modo, ya que IL-21 puede estimular el sistema inmune contra la enfermedad, ésta puede ser utilizada similarmente en combinación con HAART y otros f rmacos antivirales . En particular, IL-21 puede ser útil en la monoterapia o en la terapia en combinación con IFN-oc (con o sin RIBAVIRINMR) en pacientes que no responden bien a la terapia con IFN. Estos pacientes no pueden responder a la terapia con IFN debido a que tienen menos receptor de interferón tipo I sobre la superficie de sus células (Yatsuhashi et al . , J Hepatol Jun. 30(6): 995-1003, 1999; Mathai et al., J. Interferón Cytokine Res Sep. 19(9): 1011-8, 1999; Fukuda et al. J Med Virol Mar. 63(3): 220-7, 2001). IL-21 puede ser también útil en la monoterapia o en terapia en combinación con IFN-ct (con o sin RIBAVIRIN"*) en pacientes quienes tienen menos receptor del interferón tipo I sobre la superficie de sus células, debido a la subregulación del receptor del interferón tipo I después del tratamiento con el interferón tipo I (Dupont SA, et al. J. Interferón Cytokine Res. Apr. 22(4): 491-501, 2002). (3) IL-21 puede ser utilizada en combinación con otras inmunoterapias que incluyen citocinas, transferencia de inmunoglobulina y diversas moléculas coestimuladoras . Además de los fármacos antivirales, IL-21 podría ser utilizada en combinación con cualquier otra inmunoterapia que esté destinada a estimular el sistema inmune. De este modo, IL-21 podría ser utilizada con otras citocinas tales como interferón o IL-2. IL-21 podría ser también agregada a los métodos de inmunización pasiva que involucran la transferencia de inmunoglobulina , siendo un ejemplo el uso de los anticuerpos para tratar la infección RSV en pacientes en alto riesgo (Meissner HC, ibid. ) . Además, IL-21 podría ser utilizada con moléculas coestímuladoras adicionales tales como el ligando 4-1BB que reconocen diversas moléculas de la superficie celular como CD137 (Tan, JT et al., J Immunol . 163: 4859-68, 1999). (4) IL-21 puede ser utilizada como un adyuvante para vacunas antivirales. El uso de vacunas profilácticas para la prevención de la enfermedad viral es bien conocido. IL-21 podría ser utilizada como un adyuvante con estas vacunas para indicaciones donde se reduce la eficacia de la vacuna, siendo un ejemplo la vacuna para la hepatitis B (Hasan MS et al., J Infect Dis. 180: 2023-6, 1999; y Evans TG et al., Clin Nephrol. 54: 138-42, 2000). Además de las vacunas profilácticas, están siendo desarrolladas vacunas terapéuticas que están destinadas a detener una infección por venir. Las metodologías para estas vacunas son muy variadas e incluyen, pero no están limitadas a, antígenos virales distribuidos vía el ADN, péptidos virales, proteínas virales, porciones de partículas virales y antígenos virales cargados en terapias basadas en células, tales como las células dendríticas. Similarmente al tratamiento combinado de un cáncer terapéutico con una citocina como IL-2 (Shimizu K et al. Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 96: 2268-73, 1999), IL-21 podría ser utilizado en combinación con una vacuna antiviral terapéutica. La distribución tisular de un receptor para una citocina dada ofrece una fuerte indicación de los sitios potenciales de acción de esa citocina. El análisis de Northern del receptor de IL-21 reveló transcritos en bazo, timo, nodulos linfáticos, médula ósea y leucocitos de sangre periférica, humanos. Fueron identificados tipos celulares específicos que expresan los receptores de IL-21, y fueron observadas señales fuertes en una reacción de linfocitos mixtos (MLR) y en el linfoma de Burkitt Raji. Las dos líneas de células monocíticas THP-1 (Tsuchiya et al., Int. J. Cáncer 26: 171-176, 1980) y U937 (Sundstrom et al., Int. J. Cáncer 17: 565-577, 1976), fueron negativas. Como se discute en la presente, IL-21 puede activar el sistema inmune, que es importante en el refuerzo de la inmunidad a las enfermedades infecciosas, el tratamiento de pacientes inmunocomprometidos, tales como pacientes HIV positivo, o en el mejoramiento de las vacunas. En particular, la estimulación y expansión de IL-21 de las células NK o sus progenitoras , podría proporcionar valor terapéutico en el tratamiento de la infección viral, y como un factor antineoplásico (anticáncer) . Se piensa que las células NK juegan un papel mayor en la eliminación de las células tumorales metastáticas y los pacientes con metástasis y tumores sólidos tienen niveles disminuidos de actividad de células NK (Whiteside et al., Curr. Top. Microbiol . Immunol . 230: 221-244, 1998). Similarmente, la estimulación con IL-21 de la respuesta inmune contra los agentes patógenos virales y no virales (incluyendo bacterias, protozoarios , y hongos) podrían proporcionar valor terapéutico en el tratamiento de tales infecciones mediante la inhibición del desarrollo de tales agentes infecciosos. La determinación directa o indirecta de los niveles de un patógeno o antígeno, tal como una célula tumoral, presentes en el cuerpo, puede ser lograda por un número de métodos conocidos en la técnica, y descritos en la presente. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva de IL-21 incluye una cantidad suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en los mamíferos viralmente infectados; tales cambios pueden incluir, pero no están limitados a, una cantidad de IL-21 suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en el nivel de CTLs o células NK; una cantidad de IL-21 suficiente para producir un cambio clínicamente significativo en la carga viral, y en el título de anticuerpo antiviral. La determinación de tales diferencias o cambios clínicamente significativos, está muy por dentro de la experiencia de una persona en la técnica. La medición de las CTLs antivirales, células NK, la carga viral y los títulos de anticuerpo antiviral han sido estudiados después de la administración de citocinas a modelos agudos y crónicos de la infección por el virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) en el ratón (Blattman et al. supra.). Las mediciones de CTL que incluyen la enumeración, actividad citolítica, producción de citocina y proliferación, han sido realizadas junto con la carga viral en pacientes crónicamente infectados con el HCV ( edermeyer et al. J. Immunol. 169: 3447-3458, 2002). Clínicamente, las pruebas de diagnóstico para HCV incluye ensayos serológicos para anticuerpos y pruebas moleculares para partículas virales. Los inmunoensayos enzimáticos son disponibles (Vrielink et al., Transfusión 37: 845-849, 1997) , pero pueden requerir la confirmación utilizando pruebas adicionales tales como un ensayo de inmunotransferencia (Pawlotsky et al., Hepatology 27: 1700-1702, 1998) . Los ensayos cualitativos y cuantitativos utilizan en general las técnicas de reacción en cadena de polimerasa, y son preferidas para evaluar la viremia y la respuesta al tratamiento (Poynard et al., Lancet 352: 1426-1432, 1998; McHutchinson et al., N. Engl . J. Med. 339: 1485-1492, 1998). Son disponibles varias pruebas comerciales, tales como, la RT-PCR cuantitativa (Amplicor HCV MonitorMR, Roche Molecular Systems, Branchburg, NJ) y un ensayo de amplificación de señal de ADN ramificado (ácido desoxirribonucleico) (Ensayo de AR de HCV QuantiplexMR [bDNA] , Chiron Corp., Emeryville, CA) . Una prueba de laboratorio no específica para la infección por el HCV, mide el nivel de alanina-aminotransferasa (ALT) y es barato y fácilmente disponible (National Institutes of Health Consensus Development Conference Panel, Hepatology 26 (Suppl. 1) : 2S-10S, 1997) . La evaluación histológica de la biopsia de hígado es en general considerada el medio más preciso para la determinación de la progresión de HCV (Yano et al . , Hepatology 23: 1334-1340, 1996). Para una revisión de las pruebas clínicas para HCV, ver Lauer et al., N. Engl . J. ed. 345: 41-52, 2001. Existen varios modelos in vivo para probar HBV y HCV que son conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, los efectos de IL-21 sobre los mamíferos infectados con HBV pueden ser accedidos utilizando un modelo de marmota norteamericana. En resumen, las marmotas infectadas crónicamente con el virus de la hepatitis de la marmota (WHV) desarrollan la hepatitis y el carcinoma hepatocelular que es similar a la enfermedad en humanos crónicamente infectados con el HBV. El modelo ha sido utilizado para la evaluación preclínica de la actividad antiviral . Una cepa de WHV infectada crónicamente, ha sido establecida y los neonatos son inoculados con suero para proporcionar animales para estudiar los efectos de ciertos compuestos utilizando este modelo. (Para una revisión, ver, Tannant et al., ILA J. 42(2): 89- 102, 2001) . Los chimpancés pueden ser también utilizados para evaluar el efecto de IL-21 sobre los mamíferos infectados con HBV. Utilizando chimpancés, fue realizada la caracterización de HBV y estos estudios demostraron que la enfermedad en el chimpancé fue notablemente similar a la enfermedad en humanos (Barker et al., J. Infect. Dis. 132: 451-458, 1975 y Tabor et al., J. Infect. Dis. 147: 531-534, 1983). El modelo de chimpancé ha sido utilizado en la evaluación de vacunas (Prince et al., en: Vaccines 97, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997) . Las terapias para el HIV son rutinariamente probadas utilizando primates no humanos infectados con el virus de inmunodeficiencia de simios (para una revisión, ver, Hirsch et al., Adv. Pharmacol . 49: 437-477, 2000 y Nathanson et al., AIDS 13 (suppl. A): S113-S120, 1999). Para una revisión del uso de los primates no humanos en el HIV, la hepatitis, malaria, virus sincitial respiratorio, y otras enfermedades, ver, Sibal et al., ILAR J. 42(2): 74-84, 2001. Para el uso farmacéutico, las proteínas de la presente invención son formuladas para la administración parenteral , particularmente intravenosa o subcutánea, de acuerdo a métodos convencionales. El polipéptido bioactivo o los conjugados con anticuerpo descritos en la presente, pueden ser administrados intravenosamente, intraarterialmente o intraductalmente, o pueden ser introducidos localmente en el sitio destinado de acción. La administración intravenosa será mediante inyección de bolo o infusión en un periodo típico de una a varias horas. En general, las formulaciones farmacéuticas incluirán una proteína IL-21 en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina, solución salina amortiguada, dextrosa al 5% en agua o similares. Las formulaciones pueden incluir además uno o más excipientes, conservadores, solubilizadores , agentes amortiguadores, albúminas para prevenir la pérdida de proteínas sobre la superficie del frasco, etc. Los métodos de formulación son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Gennaro, ed. , Mack Publishing Co., Easton, PA, 19a ed. , 1995. Las dosis terapéuticas en general estarán en el intervalo de 0.1 a 100 µg/kg de peso del paciente por día, preferentemente de 0.5 a 20 µg/kg por día, con la dosis exacta determinada por el médico, de acuerdo a los estándares aceptados, tomando en cuenta la naturaleza y la severidad de la condición que va a ser tratada, los rasgos del paciente, etc. La determinación de la dosis está dentro del nivel de experiencia ordinaria en la técnica. Las proteínas pueden ser administradas para el tratamiento agudo, en una semana o menos, frecuentemente en un periodo de uno a tres días, o pueden ser utilizadas en el tratamiento crónico, en varios meses o años . La presente invención también contempla las composiciones de IL-21 químicamente modificadas, en las cuales un polipéptido IL-21 está ligado con un polímero. Los polipéptidos IL-21 ilustrativos son polipéptidos solubles que carecen de un dominio transmembranal funcional, tal como un polipéptido de IL-21 maduro. Típicamente, el polímero es soluble en agua, de modo que el conjugado con IL-21 no precipita en un ambiente acuoso, tal como un ambiente fisiológico. Un ejemplo de un polímero adecuado es uno que ha sido modificado para tener un grupo reactivo simple, tal como un éster activo para la acilación, o un aldehido para la alquilación. De esta manera, el grado de polimerización puede ser controlado. Un ejemplo de un aldehido reactivo es el polietilenglicol-propionaldehído, o los derivados de mono- (alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono) o de ariloxi de los mismos (ver, por ejemplo, Harris, et al., Patente de los Estados Unidos No. 5,252,714). El polímero puede ser ramificado o no ramificado. Además, puede ser utilizada una mezcla de polímeros para producir los conjugados de IL-21. Los. conjugados de IL-21 utilizados para la terapia pueden comprender porciones poliméricas solubles en agua farmacéuticamente aceptables. Los polímeros solubles en agua adecuados incluyen polietilenglicol (PEG) , monometoxi-PEG, mono- (alcoxi de 1 a 10 átomos de carbono) -PEG, ariloxi-PEG, poli- (N-vinilpirrolidona) PEG, tresil-monometoxi-PEG, PEG-propionaldehído, carbonato de bis-succinimidilo-PEG, homopolímeros de propilenglicol , un copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polioles polioxietilados (por ejemplo, glicerol) , alcohol polivinílico, dextrano, celulosa, u otros polímeros basados en carbohidrato. PEG adecuado puede tener un peso molecular de aproximadamente 600 a aproximadamente 60,000, incluyendo, por ejemplo, 5,000, 12,000, 20,000 y 25,000. Un conjugado de IL-21 puede también comprender una mezcla de tales polímeros solubles en agua. La PEGilación de IL-21 puede ser llevada a cabo mediante cualquiera de las reacciones de PEGilación conocidas en la técnica (ver, por ejemplo Patente Europea EP-0, 154 , 316, Delgado et al., Critical Revie s in Therapeutic Drug Carrier Systems 9: 249 (1992), Duncan y Spreafico, Clin Pharmacokine . 27: 290 (1994), y Francis et al., Int J Hematol 68: 1 (1998)).

La presente invención contempla los métodos para tratar el cáncer utilizando las composiciones que comprenden un polipéptido de IL-21 o un polipéptido como se describe en la presente . Tales composiciones pueden comprender además un portador. El portador puede ser un portador orgánico o inorgánico convencional. Los ejemplos de portadores incluyen agua, solución amortiguadora, alcohol, propilenglicol, macrogol, aceite de ajonjolí, aceite de maíz, y similares. La invención es además ilustrada por los siguientes e emplos no limitantes. EJEMPLOS Ejemplo 1 IL-21 de ratón es activa en el ensayo de médula ósea de ratón A. Aislamiento de células de médula de baja densidad, no adherentes : Se obtuvo aspirado de fémur (médula) de ratón, fresco de ratones Balb/C o C57B1/6 machos, de 6 a 10 semanas de edad. La médula fue luego lavada con RMPI +10% de FBS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) y suspendida en RPMI+10% de FBS como una suspensión celular de médula completa. La suspensión celular de médula completa fue luego sometida a un gradiente de densidad (Nycoprep, 1.077, Animal; Gibco BRL) para enriquecer las células principalmente mononucleares de baja densidad como sigue: la suspensión celular de médula completa (aproximadamente 8 mi) fue cuidadosamente colocada con pipeta sobre la parte superior de aproximadamente 5 mi de una solución de gradiente Nycoprep en un tubo cónico de 15 mi, y luego se centrífugo a 600 x g por 20 minutos. La capa de interfaz, que contenía las células mononucleares de baja densidad, fue luego retirada, lavada con RPMI + 10% de FBS en exceso, y concentrada mediante centrifugación a 400 x g por 5 a 10 minutos. Este botón se resuspendió en RPMI + 10% de FBS y se colocó en placa en un matraz T-75 aproximadamente a 10s células/ml, y se incubó a 37 °C con 5% de C02 por aproximadamente 2 horas. Las células resultantes en suspensión fueron Células de Médula de Baja Densidad No Adherentes (NA LD) B. Ensayo en 95 Pozos Las Células de Médula de Ratón NA LD fueron colocadas en placa a 25,000 a 45,000 células/pozo en las placas de cultivo de tejido de 96 pozos en RPMI + 10% de FBS + 1 ng/ml de Factor de Células Madre de ratón (mSCF) (R&D Systems, Minneapolis, MN) , más 5% de medio condicionado proveniente de uno de los siguientes: (1) células BHK 570 que expresan IL-21 de ratón (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024), (2) células BHK 570 que expresan IL-21 humana (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024, o (3) células BHK 570 control que contienen el vector y que no expresan ningún ligando. Estas células fueron luego sometidas a una variedad de tratamientos con citocina para probar la expansión o la diferenciación de células hematopoyéticas de la médula. Para probar, las células de médula de ratón NA LD sembradas en placa fueron sometidas a Interleucina 15 humana (hIL-15) (R&D Systems), o uno de un panel de otras citocinas (R&D Systems) . La dilución en serie de hIL-15, o las otras citocinas, fueron probadas con dilución en serie al 50% de aproximadamente 50 ng/ml hasta aproximadamente 6025 ng/ml de concentración. Después de 8 a 12 días los ensayos de 96 pozos fueron calificados para la proliferación celular mediante el ensayo de azul de Alamar como se describe en la Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024. C. Resultados del Ensayo de Médula de Ratón NA LD de 96 pozos Medios condicionados provenientes de las células BHK que expresan IL-21 de ratón y de humano, actuaron en sinergia con hIL-15 para promover la expansión de una población de células hematopoyéticas en la médula de ratón NA LD. Esta expansión de células hematopoyéticas no fue mostrada con el medio condicionado con BHK control más IL-15. Las células hematopoyéticas de la población expandidas por la IL-21 de ratón con hIL-15, y aquellas células hematopoyéticas expandidas por la IL-21 humana con hIL-15, fueron adicionalmente propagadas en cultivo celular. Estas células hematopoyét cas fueron teñidas con un anticuerpo anti-células Pan NK, marcado con ficoeritrina (Pharmingen) y sometido a análisis de citometría de flujo, lo cual demostró que las células expandidas se tiñeron positivamente para este marcador de células asesinas naturales NK. El mismo ensayo de 96 pozos fue corrido, utilizando células de médula humana frescas compradas de Poietic Technologies, Gaithersburg, MD. Nuevamente, en conjunto con IL-15, IL-21 de humano y de ratón expandió una población de células hematopoyéticas que se tiñeron positivamente, para el marcador de células NK utilizando el anticuerpo descrito anteriormente . Ejemplo 2 Ratones Transgénicos de IL-21 A. Generación de ratones transgénicos que expresan IL-21 humana y de ratón. Fragmentos de ADN y vectores transgénicos (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) que contenían las secuencias flanqueantes 5' y 3' del promotor respectivo (promotor específico de hígado MT-1 (IL-21 de ratón (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) o el promotor LCK específico linfoide (IL-21 de humano y de ratón (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024), el intrón de la insulina II de rata, el ADNc de IL-21 y la secuencia poli-A de la hormona humana del crecimiento, se prepararon y se utilizaron para la microinyección dentro de oocitos murinos B6C3fl fertilizados (Taconic, Germantown, NY) utilizando un protocolo de microinyección estándar. Ver, Hogan, B. et al., Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Pres, 1994. Ocho ratones transgénicos que expresan IL-21 humana proveniente del promotor EµLCK específico linfoide, fueron identificados entre 44 crías. Cuatro de éstas fueron crías que murieron y 4 se desarrollaron hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron claramente bajos en estos animales. Veinte ratones transgénicos que expresan IL-21 de ratón proveniente del promotor EµLCK específico linfoide, fueron identificados entre las 77 crías. Los 20 se desarrollaron hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron claramente bajos en estos animales. Tres ratones transgénicos expresan IL-21 de ratón proveniente del promotor MT-1 específico del hígado, fueron identificados entre las 60 crías. Dos de estas crías murieron y 1 se desarrolló hasta la edad adulta. Los niveles de expresión fueron claramente bajos en estos animales. Fueron preparados los tejidos y examinados histológicamente como se describe más adelante. B. Evaluación microscópica de los tejidos provenientes de ratones transgénicos El bazo, el timo y los nodulos linfáticos mesentéricos fueron recolectados y preparados para el examen histológico a partir de animales transgénicos que expresan IL-21 de humano y de ratón (Ejemplo 2A) . Otros tejidos que fueron rutinariamente cosechados incluyeron los siguientes: hígado, corazón, pulmón, riñon, piel, glándula mamaria, páncreas, estómago, intestino delgado y grueso, cerebro, glándulas salivales, tráquea, esófago, glándulas adrenales, pituitaria, tracto reproductivo, glándulas sexuales masculinas accesorias, músculo esquelético incluyendo nervio periférico, y fémur con médula ósea. Los tej idos fueron cosechados de una cría neonata que murió inesperadamente, y varios ratones transgénicos adultos, como se describe más adelante. Las muestras fueron fijadas en formalina amortiguada al 10%, rutinariamente procesadas, incrustadas en parafina, seccionadas a 5 micrómetros, y teñidas con hematoxilina y eosina. Los portaobjetos fueron examinados y calificados para la severidad de los cambios tisulares (0=ninguno, l=leve, 2=moderado, 3=severo) por un patólogo veterinario certificado, ciego al tratamiento. La cría y 2 ratones adultos hembra que expresan la IL-21 humana, y 3 de los 6 ratones adultos machos que expresan la IL-21 de ratón mostraron infiltrados inflamatorios en muchos de los tejidos examinados. Los órganos afectados variaron algo de ratón a ratón. El infiltrado inflamatorio estuvo compuesto principalmente de neutrófilos y macrofagos en diversos números y proporciones, y fue en general de grado leve a moderado en severidad. Además, estos animales mostraron cambios en los órganos linfoides, incluyendo linfopenia moderada a severa en el bazo y en el timo (transgénicos IL-21 de humano y de ratón) ; y linfopenia severa (transgénicos de IL-21 humana) , o supurativos leves a severos a la linfadenitis piogranulomatosa (transgénicos de IL-21 de ratón) en nodulos linfáticos. Además, fue evidente la hematopoyesis extramedular incrementada en los bazos. Estos cambios no fueron observados en ratones control de igual edad.

C. Análisis citométrico de flujo de los tejidos de ratones transgénicos que sobreexpresan IL-21 Animales transgénicos que sobreexpresan ya sea el ligando zalfall humano o de ratón (Ejemplo 2A) fueron sacrificados para el análisis citométrico de flujo de sangre periférica, timo, nodulo linfático, médula ósea y bazo. Las suspensiones celulares fueron elaboradas a partir del bazo, timo, y nodulos linfáticos mediante desmenuzamiento del órgano con fórceps en medio de cultivo enfriado con hielo (500 mi de medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ; 5 mi de L-glutamina 100 x (Gibco BRL, Grand Island, Y) ; 5 mi piruvato de sodio lOOx (Gibco BRL) ; 5 mi de lOOx de penicilina, estreptomicina, neomicina (PSN) (Gibco BRL) y luego presionando suavemente las células a través de un tensor de células (Falcon, V R Seattle, WA) . 200 mi de sangre periférica fueron recolectados en tubos heparinizados y diluidos a 10 mi con HBSS que contenía 10 U de heparina/ml . Los eritrocitos fueron removidos del bazo y de las preparaciones de sangre periférica mediante lisis hipotónica. Las suspensiones celulares de médula ósea fueron realizadas mediante lavado a chorro de la médula desde los fémures con medios de cultivo enfriados con hielo. Las células fueron contadas y probadas para la viabilidad utilizando Azul de Trypan (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) . Las células fueron resuspendidas en medio de tinción enfriado con hielo (HBSS, 1% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio) a una concentración de diez millones por mililitro. El bloqueo del receptor de Fe y el enlace no específico de anticuerpos a las células, fue logrado mediante la adición de 10% de suero de cabra normal y Fe Block (Pharmingen, La Jolla, CA) a la suspensión celular. Las suspensiones celulares se mezclaron con volúmenes iguales de anticuerpos monoclonales marcados con fluorocromo (PharMingen) , incubados sobre hielo por 60 minutos y luego lavados dos veces con amortiguador de lavado enfriado con hielo (PBS, 1% de suero fetal bovino, 0.1% de azida de sodio) antes de resuspender en 400 mi de amortiguador de lavado que contenía 1 mg/ml de 7-AAD (Molecular Probes, Eugene, OR) como un marcador de viabilidad en algunas muestras. Los datos de flujo fueron adquiridos sobre un citómetro de flujo FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems, San José, CA) . La adquisición y el análisis fueron realizados utilizando software CellQuest (BD Immunocytometry Systems) . Los animales transgénicos que expresaron ya sea IL-21 humana o de ratón a los más altos niveles, tuvieron poblaciones celulares dramáticamente alteradas en todos los órganos linfoides analizados. Los cambios observados incluyeron pérdida completa de la celularidad tímica, ausencia completa de células B positivas a CD45R y tamaño incrementado y celularidad incrementada de los bazos . El bazo y la médula ósea tuvieron números incrementados de células de tamaño mieloide, que fueron explicadas por incrementos en los monocitos y neutrófilos. El marcador de células pan NK (DX5) fue incrementado en muchas poblaciones . Los fundadores de expresión moderada tuvieron cambios menos dramáticos pero todavía significativos, consistentes con el fenotipo observado en los altos expresadores . Los ratones con más bajo nivel de expresión no tuvieron un incremento significativo en las células mieloides ni una disminución en los números de células B. Estos sí mostraron cambios significativos en las poblaciones de timocitos con disminuciones en las células doblemente positivas a CD4+CD8+ e incrementos en las células positivas simples a CD4 y a CD8. Ejemplo 3 Estudio de Dosis-Respuesta de la Proteína Humana Recombinante Purificada IL-21, en Ratones Normales A. Sumario Ratones hembras C57BL/6 normales de seis semanas de edad (Harían Sprague Dawley, Indianápolis , IN) , fueron tratados por inyección intraperitoneal una vez al día por cuatro u ocho días con uno de los cuatro niveles de dosis de la ' IL-21 humana recombinante purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) a 0.1, 0.5, 5 ó 50 µg/ratón/día o con vehículo como un control . Los pesos corporales y las temperaturas corporales fueron monitorízados diariamente. Ya sea en el día cuatro o en el día nueve, cuatro de los ocho ratones de cada grupo de tratamiento con proteína y cinco de los diez ratones en el grupo control con vehículo fueron sacrificados. La sangre, la médula ósea y los tejidos fueron cosechados y analizados. Las perturbaciones potenciales en los tejidos linfoides fueron examinadas, así como los parámetros fisiológicos y toxicológicos generales. No hubo evidencia de toxicidad de la proteína IL-21 humana a cualquiera de las dosis probadas. Los pesos corporales y las temperaturas permanecieron sin cambio. Los pesos corporales y las temperaturas permanecieron sin cambio. No existieron cambios aparentes en los parámetros de la química clínica. No obstante, existieron hallazgos consistentes relacionados a porcentajes incrementados de células de la línea mieloide en médula ósea, bazo y sangre periférica en ratones tratados con la más alta dosis de IL-21, en comparación al control con vehículo. Existió un incremento estadísticamente significativo en las células de tamaño de la línea mieloide, identificadas mediante análisis citométrico de flujo del homogeneizado del bazo en el grupo de alta dosis. Los bazos de los dos grupos de más alta dosis fueron estadísticamente significativamente más grandes que los otros grupos. Después del examen histopatológico, no obstante, únicamente fue observado un incremento marginal en la hematopoyesis extramedular en el grupo de más alta dosis.

Existió un incremento estadísticamente significativo en la proporción mieloide a eritroide de la médula ósea en el grupo de más alta dosis, en comparación a los otros grupos. Finalmente, existieron elementos observados en la sangre periférica en las cuentas de células sanguíneas blancas totales y en el porcentaje de monocitos en el mismo grupo. B. Preparación de solución de dosificación IL-21 humana recombinante purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) fue diluida en solución salina amortiguada con fosfato, estéril (GibcoBRL, Island, NY) a concentraciones para distribuir 50, 5, 0.5 ó 0.1 microgramos de proteína en 0.1 mi de vehículo PBS. Las dosis para los primeros cuatro días fueron realizadas en el día 0 y congeladas en un congelador a -20°C antes del uso. Las dosis para los días cinco al ocho fueron realizadas en el día cinco y congeladas como se describe anteriormente. Las alícuotas del mismo PBS fueron similarmente congeladas para el grupo control tratado con vehículo. Eri el día de la administración las alícuotas apropiadas fueron descongeladas y se inyectó 0.1 mi de solución intraperitonealmente dentro de los ratones cada ¦ día. por cuatro u ocho días. C. Diseño del estudio Los ratones fueron de seis semanas de edad al inicio del estudio. Cada grupo de tratamiento consistió de ocho ratones, excepto por el grupo control con vehículo que incluyó diez ratones. La mitad de los ratones en cada grupo de tratamiento fueron sacrificados después de cuatro días de tratamiento y la otra mitad después de ocho días. Antes del tratamiento cada día, cada ratón fue pesado y su temperatura corporal registrada utilizando un sistema de libreta programable portátil (BMDS, Inc. Maywood, NJ) , mediante exploración del ratón para el número de identificación y la temperatura corporal a partir de los transpondedores implantados subcutáneamente (IPTT-100, BMDS, Maywood, NJ) . En el sacrificio, los tejidos cosechados para evaluar las poblaciones de células sanguíneas blancas mediante análisis citométrico de flujo, incluyeron médula ósea, timo y bazo. El análisis de FACS de los órganos linfoides y de la médula ósea fueron realizados con FACSCalibur, (Becton Dickinson, Mansfield, MA) . Los tejidos cosechados para el examen histológico para los signos de la toxicidad de la proteína incluyeron: bazo, timo, hígado, riñon, glándula adrenal, corazón y pulmones. Todos los tejidos fijados para histología fueron mantenidos a 4°C toda la noche en Solución Salina Amortiguada Normal al 10% (NBF) (Surgipath, Richmond, IL) . El día siguiente la NBF fue reemplazada con etanol al 70% y los tejidos devueltos a 4°C hasta el procesamiento para histología . Los tejidos fueron procesados y teñidos para hematoxilina y eosina domésticamente, luego enviados a un patólogo por contrato para el análisis histopatológico . La sangre fue recolectada para las cuentas completas de células sanguíneas (CBC) y los perfiles de la química del suero. Las CBC s fueron analizadas domésticamente con el Analizador de Hematología Cell Dyn 3500 (Abbott Diagnostics División, Abbott Park, IL) y las cuentas de células sanguíneas blancas di erenciales, manuales fueron analizadas en Phoenix Central Laboratory (Everett, WA) . El suero fue mantenido congelado a -20 °C hasta el envío al Phoenix Central Laboratory para los paneles de química sérica completa. Para evaluar las proporciones mieloide:eritroide, la médula ósea proveniente de un fémur fue aplicada a portaobjetos CytoSpin (CYTOSPIN 3 CITOCENTRIFUGE y CYTO SLIDES, Shandon, Pittsburg, PA) y enviados a Phoenix Central Laboratories para el análisis. D. Resultados del estudio No existieron indicaciones clínicas aparentes de los efectos fisiológicos o de la toxicidad de IL-21 humana a dosis de 50 µg/día o menores. Los pesos corporales y las temperaturas permanecieron normales para la duración de los tratamientos . Los parámetros de química estuvieron en los intervalos normales. Las cuentas de células sanguíneas rojas y de plaquetas parecieron normales. En los ratones que recibieron 50 µg/día por 8 días, las cuentas de células sanguíneas blancas diferenciales mostraron que el porcentaje de monocitos fue elevado en la sangre periférica, y un incremento aparente en las cuentas de las células sanguíneas blancas totales. En la médula ósea lavada a chorro de un fémur, las proporciones de mieloide a eritroide fueron incrementadas en el grupo de dosis de 50 g, y a un grado menor el grupo de dosis de 5 µ a partir del grupo de dosis de 8 días. En una comparación de columnas múltiples no paramétricas utilizando InStat (InStat MA.C; GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) , esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=.0049). La diferencia entre el grupo de más alta dosis y el vehículo fue también significativa, (p=.0286). Las células sanguíneas blancas incrementadas en sangre periférica y el incremento significativo en los precursores mieloides en la médula pueden estar de este modo relacionados.

La evaluación histológica de los siguientes tejidos no mostró evidencia aparente de cambios citológicos o estructurales, eventos mitóticos o necrosis: timo, hígado, riñon, glándula adrenal, duodeno, páncreas, yeyuno, ciego, colon, nodulos linfáticos mesentéricos, útero, ovario, glándulas salivales, corazón, tráquea, pulmón y cerebro. No existieron diferencias aparentes entre los grupos de tratamiento en los pesos del timo, riñon, hígado o cerebro. De todos los tejidos examinados, únicamente los pesos del bazo fueron significativamente afectados. El peso del bazo de cada ratón fue normalizado a su peso cerebral. En el grupo de tratamiento de 50 <3/?±& en comparación al vehículo, los grupos de tratamiento de 0.1 µg y 0.5 µ9, el promedio de los pesos de los bazos fue casi 50% mayor después de cuatro días de tratamiento, y casi 100% mayor después de ocho días que los pesos promedio de los bazos de los otros tres grupos. En el grupo de cuatro días, el grupo de 5 ^g/áía también tendió a tener pasos más grandes que el control y que los grupos de baja dosis. La diferencia entre los pesos del bazo/cerebro con los datos provenientes de los grupos de cuatro días y de ocho días combinados por el grupo de tratamiento, fue estadísticamente significativa (p=.0072) mediante ANDEVA no paramétrica de Kruskall-Wallace, la prueba de comparación de columnas múltiples utilizando el programa InStat (GrphPad Software) . Un incremento marginal en la hematopoyesis extramedular , especialmente en la pulpa roja fue observado en los bazos de ratones proveniente del grupo de más alta dosis, incluso en los ratones tratados por cuatro días. El análisis citométrico de flujo de los bazos mostró un incremento significativo en la proporción de las células de tamaño mieloide en el grupo de más alta dosis (p=0.01, prueba t de Student) , representando incrementos en los monocitos y en los neutrófilos. Este efecto puede estar relacionado al porcentaje incrementado de células mononucleares en sangre periférica, así como el incremento aparente en los precursores mieloides en la médula ósea, descritos anteriormente. Además, los ratones transgénicos derivados de la inserción del gen zalfall humano tuvo hematopoyesis extramedular incrementada en sus bazos, en comparación a los compañeros de carnada no transgénicos. Diversos cambios fueron observados en el grupo de dosis de 50 µ por día, en comparación al grupo control que implica IL-21 en producción o desarrollo de las células de la línea mieloide. Tomados conjuntamente, los cambios observados sugieren que zalfall puede ser útil como una proteína terapéutica en especialidades médicas tales como el cáncer y desórdenes inmunológicos descritos en la presente. Ejemplo 4 Examen Preliminar y Estudio de Distribución Tisular de la Proteína IL-21 Humana Recombinante, Purificada A. Sumario Con el fin de elucidar la distribución del tejido y los patrones de eliminación de rhIL-21 purificada, se emprendió un estudio farmacocinético preliminar. Ratones C57B1/6 macho de nueve semanas de edad fueron administrados con la proteína IL-21 humana, recombinante purificada marcada con li:LIndio (i:L1In) (NEN, Boston, MA) por una de las tres rutas. Una inyección de bolo simple fue administrada a cada ratón ya sea mediante la ruta intravenosa (IV) , intraperitoneal (IP) , subcutánea (SC) . Los ratones inyectados por cualquiera de las rutas subcutánea o intraperitoneal fueron sacrificados a la una o tres horas después de la inyección. Los ratones inyectados intravenosamente fueron sacrificados después ya sea de diez minutos o una hora después de la inyección. La sangre, el plasma y te idos seleccionados fueron cosechados a diversos puntos de tiempo y contados por un contador gamma para estimar la vida media aproximada y la distribución tisular de la proteína marcada exógena. Los tejidos que fueron cosechados para el conteo, así como los intervalos de sacrificio fueron seleccionados con base en los reportes de la distribución de otras citocinas marcadas con radionúclidos . En el sacrificio, los tejidos cosechados para el conteo de la radioactividad incluyeron timo, bazo, riñon, un lóbulo del hígado, un lóbulo del pulmón, y vejiga urinaria. En el grupo que recibió la inyección intraperitonealmente, el intestino fue también contado para evaluar la incidencia de la inyección dentro del intestino, y los ratones subcutáneamente dosificados, se contó la piel con las estructuras subyacentes en el área de la inyección. Las cpm para el hígado completo y el pulmón fueron calculadas a partir de una sección que fue contada, y un porcentaje del peso del órgano completo, representado por la sección. Después del final del estudio los tejidos recolectados, la sangre completa y el plasma fueron contados sobre el contador gamma COBRA II AUTO-GAMMA® (Packard Instrument Company, Meriden, CT) . Una alícuota de la solución de dosificación marcada original fue también contada al final del estudio con los tejidos. Esto permitió el cálculo del porcentaje de radioactividad inyectada total para cada ratón, y la corrección simultánea de todas las cuentas para el decaimiento radioactivo. Aproximaciones del volumen sanguíneo remanente y de los pesos de los órganos indicaron que la mayoría de las cuentas administradas fueron explicadas, y por lo tanto el porcentaje de cuentas protegido fue una representación razonable de la distribución de las cuentas después de la administración de IL-21 marcada, por cada ruta. B. Marcación con ulIndio de IL-21 IL-21 humana recombinante purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) fue conjugada con un exceso molar de 10 veces de DTPA (Peirce, Rockford, II) mediante la incubación 30 minutos a temperatura ambiente en PBS . DTPA sin reaccionar y los hidrolizados fueron removidos mediante intercambio con amortiguador en un Biomax-5k NM L (Ultrafree-15, Millipore, Bedford, MA) . El pico de proteína de volumen vacío fue concentrado a 5 mg/ml y fue tomada una alícuota para la prueba en un bioensayo (estimulación con anti-CD40 de las células B murinas (Ejemplo 10)). Después de la confirmación de' que el conjugado con DTPA todavía tuvo bioactividad completa, el conjugado fue diluido a 0.5 mg/ml con acetato de sodio 1 M pH 6.0. Dos mCi de i:L1Indio ueron recogidos en 0.5 mi de acetato de sodio 1 pH 6.0, y mezclados con DTPA-IL-21 humana por 30 minutos a temperatura ambiente. El li:iIndio no incorporado fue eliminado durante el intercambio con amortiguador a PBS sobre una columna PD-10 (Pharmacia, Piscataway, NJ) . El material radiomarcado fue diluido con IL-21 humana no marcada, para dar una actividad específica de 100 mCi/mg, se esterilizó por filtración y se almacenó a 4°C toda la noche. Cien por ciento de la protelna marcada fue retenida sobre una membrana Biomax-5k MWL (Millipore) . La IL-21 humana marcada con li:LIn fue administrada a ratones en los estudios de eliminación y de farmacocinética . Cincuenta µ9 de proteína IL-21 marcada con 5 µCi de IL-21 humana marcada en 0.1 mi de vehículo PBS se administró a cada animal . C. Resultados de Estudio de Distribución Preliminar Después de una y tres horas después de la administración por las tres rutas, la más alta concentración de 111In-IL-21 humana, se encontró en el riñon, y la segunda más alta fue en orina y vejiga urinaria, como se puso en evidencia por estos tejidos que tienen la más alta cpm. Las cuentas promedio recuperadas de los ríñones fueron de 3 a 8 veces mayores que las cuentas hepáticas totales, dependiendo de la ruta de inyección y del punto de tiempo de sacrificio. Por ejemplo, la cpm de riñon, promedio a 60 minutos después de la inyección fue 4.5 veces mayor que las cuentas promedio calculadas para el hígado completo del mismo grupo. En el grupo que fue sacrificado diez minutos después de la administración intravenosa, la cpm más alta fue nuevamente en riñón, y la segunda acumulación más alta fue equivalente en hígado, vejiga urinaria y orina. D. Estudio Farmacocinético Preliminar Se realizaron recolecciones de sangre y plasma a los 10, 30 y 60 minutos después de la inyección por las tres rutas. Después de la inyección por la ruta intravenosa, a un grupo separado de ratones se le tomaron muestras de sangre y plasma a los 2, 5 y 10 minutos. A otro grupo más de ratones quienes recibieron sus inyecciones ya sea por la ruta intraperitoneal y subcutánea se les tomaron muestras de sangre a la una, dos y tres horas. Para los grupos de tratamiento ver Tabla 4. Los tiempos de recolección cortos entre corchetes representan la vida media reportada de IL-2 después de la inyección intravenosa. La Tl/2 reportada estuvo en el intervalo de 2.5 a 5.1 minutos . Para referencia a la administración in vivo a IL-2, ver Donohue JH y Rosenberg SA J. Immunol . 130: 2203, 1983. Los puntos de tiempo prolongados fueron elegidos para delinear la fase de eliminación anticipada .

Tabla 4 IL-21 no marcada ha mostrado que es eliminada del suero con una vida media de aproximadamente tres minutos en ratones después de la inyección IV. Para referencia ver Donahue, JH y Rosenburg supra . Después de la inyección IP y SC de cantidades similares de IL-2, la duración de la persistencia de la actividad de IL-2 fue prolongada de 2 unidades/ml para menos de 30 minutos después de la inyección IV a más de 2 unidades/ml para 2 horas después de IP, y 6 horas después de las inyecciones SC. La ruta principal de despejo de IL-2 parece ser el riñon. Se ha mostrado que IL-21 es estructuralmente similar a IL-2, como se discute en la presente. La evaluación preliminar de la eliminación de IL-21 parece ser consistente con el despejo aparente de IL-2 por los ríñones, con base en la acumulación de cpm predominantemente en los ríñones, seguido por la vejiga urinaria y la orina en el presente estudio. Se realizaron estimaciones de los parámetros farmacocinéticos con base en el análisis no compartimental de los datos de cpm obtenidos del plasma, utilizando el programa de análisis PK Win onLin, Versión 1.1, (Scientific Consulting Inc., Cary, NC) . Las vidas medias plasmáticas de IL-21 fueron estimadas utilizando las constantes de velocidad de eliminación terminal predichas para la administración intravenosa, subcutánea e intraperitoneal de una dosis de 50 µg. Los resultados farmacocinéticos fueron estimaciones debidas a los puntos de datos limitados en la región de eliminación terminal de los perfiles de concentración plasmática versus tiempo. Además, el ajuste de la fase de eliminación terminal para la dosificación de SC e IP requirió el uso de datos a partir de los puntos de tiempo durante los cuales la absorción de i:L1In-IL-21 humana esta aparentemente ocurriendo. No obstante, las estimaciones de las vidas medias después de la dosificación intravenosa, subcutánea e intraperitoneal fueron de 13.6 minutos, 18.8 minutos, y 34.3 minutos, respectivamente. Ya que un intervalo de dosificación no fue evaluado no fue aparente si la eliminación saturable o activa (cinética de Michaelis Menten) estaba ocurriendo. Por lo tanto, estos cálculos de la vida media son estimaciones. Los estimados de la biodisponibilidad de la proteína marcada fueron realizados con base en el área bajo la curva (AUC) después de la dosificación subcutánea o intraperitoneal comparada a aquella de la dosificación intravenosa. La biodisponibilidad estimada después de la inyección subcutánea e intraperitoneal fue de 35.8% y 63.9% respectivamente. Debido a que únicamente una dosis de proteína fue estudiada, la biodisponibilidad no fue evaluada como una función de la dosis. El despejo estimado y el volumen de distribución (con base en los datos provenientes de la inyección intravenosa) fueron de 0.48 mi/minuto y 6.1 mi, respectivamente. Aunque los datos son preliminares, el destino de IL-21 administrada IV fue similar a aquel reportado para IL-2, otra citocina de grupo de 4 hélices (Donahue, JH y Rosenburg, SA supra.). Como IL-2, IL-21 administrada IV tuvo una vida media plasmática únicamente de minutos con el despejo principal en el riñon. Tres horas después de la inyección, la mayor parte del material marcado extraído del riñon permanecía todavía en una membrana Biomax 5K NMLW (Millipore) . Ya que se ha reportado previamente que el indio permanece asociado con la proteína incluso durante la degradación lisosomal (Staud, F. et al., J. Pharm. Sciences 88: 577-585, 1999) IL-21 se está acumulando y puede ser degradada en el riñon. El estudio actual también mostró, como se observó con otras muchas proteínas, incluyendo IL-2 (Donahue, JH y Rosenburg, SA, supra.), que la administración IP y SC prolongó significativamente los niveles plasmáticos de IL-21.

Ej emplo 5 Aislamiento y Expansión de la Fracción MNC CD34+ de Médula Ósea Humana Fresca, Utilizando IL-21 para la Evaluación de la Actividad de NK A. Selección y Aislamiento de células CD34+ a partir de Médula Ósea Humana Células mononucleares de médula ósea humana fresca (MNC, por sus siglas en inglés) fueron preparadas para enriquecer las células que tienen actividad de células NK. Las MNCs humanas frescas fueron obtenidas de Poeitic Technologies (Gaithersburg, MD) . 10 mi de alfa-MEM (JRH, Lenexa, KS) que contiene 10% de HIA FBS (Hyclone, Logan, UT) y el antibiótico PSN al 1% (Gibco, BRL, Grand Island, NY) se agregó a la suspensión celular y las células fueron pasadas a través de un tamiz de 100 µp?. Las células fueron luego contadas, concentradas, lavadas con 10 mi de PBS que contenía 2% de FBS, luego concentradas nuevamente y resuspendidas en 1 mi de PBS que contenía 2% de FBS. Las células que tenían un marcador superficial de las células CD34 (células CD34+) fueron magnéticamente separadas utilizando un equipo Detachabead con Dynabeads M-450 CD34 (Dynal, Oslo, Noruega) , siguiendo las instrucciones del fabricante. Las fracciones de las células CD34+ y de las células CD34- fueron adicionalmente analizadas más adelante.

B. Expansión de células CD34+ utilizando IL-21 Una fracción de células CD34+ fue sembrada en placa en cuatro pozos en una caja de 24 pozos. 50,000 células seleccionadas positivamente suspendidas en 1 mi de Alfa ME (JRH) que contenían 10% de HIA FBS (Hyclone) y 1% de PSN (Gibco/BRL) , más las diversas citocinas descritas más adelante, fueron sembradas en placa en cada uno de los cuatro pozos (1-4) . Se utilizaron diversos reactivos para probar la expansión inducida por IL-21 de las MNCs de médula ósea seleccionadas para CD34+. Los reactivos incluyeron flt3 humano (R&D, inneapolis, MN) ; IL-21 humana purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024); IL-15 humana (R&D). Los reactivos fueron combinados como sigue en el día 0. En el pozo #1, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano. En el pozo #2, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml de IL-21 humano purificado. En el pozo #3, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 20 ng/ml de IL-15 humano. En el pozo #4, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano, 15 ng/ml de IL-21 humana purificada y 20 ng/ml de IL-15 humana. Después de la incubación por 18 días, las células en suspensión de cada pozo fueron concentradas, y luego resuspendidas en 0.5 mi de alfa MEM (JRH) que contenía 10% de HIA FBS (Hyclone) y 1% de PSN (Gibco/BRL), y se contaron para evaluar la proliferación de la reacción de células CD34+. Un bajo nivel de proliferación fue observado en presencia de flt3 solo (pozo control #1) , pero la presencia de IL-15 o IL-21 además de flt3 no tuvo efecto significativo sobre la expansión (pozos, #2 y #3) . No obstante, la expansión más allá del control flt3 fue evidente en el pozo #4 el cual contenía IL-15 e IL-21 además de flt3. Este resultado sugirió que IL-21 e IL-15 actúan en sinergia para expandir la población de células CD34+ humanas. Además, los resultados de este experimento apoyaron los resultados observados con el ratón IL-21 en el ensayo BM en ratón (Ejemplo 1) . Todas las poblaciones celulares fueron luego probadas para la actividad de NK y sometidas a análisis de citometría de flujo, como se muestra más adelante (Ejemplo 7) . C. Expansión de células CD34+ o CD34- utilizando IL-21 con adición retardada de IL-15 Las fracciones positiva a CD34 y negativa (CD34-) fueron separadas en placas separadamente en seis pozos de placas de 12 pozos (1-6) . Cada uno de los seis pozos contenían 100,000 células positiva o negativamente seleccionadas en 2 mi de alfa MEM que contenía 10% de HIA FBS y PSN, descritos anteriormente. Los reactivos utilizados fueron como se describen anteriormente. En el pozo #1, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano en el día 0. En el pozo #2, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano en el día 0, y después de 5 días de incubación se agregaron 20 ng/ml de IL-15 humana. En el pozo #3, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml de IL-21 humana en el día 0. En el pozo #4, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 15 ng/ml de IL-21 humana en el día 0, y después de 5 días de incubación se agregaron 20 ng/ml de IL15 humana. En el pozo #5, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano y 20 ng/ml de IL15 humana en el día 0. En el pozo #6, se agregaron 2 ng/ml de flt3 humano, 15 ng/ml de IL-21 humana y 20 ng/ml de IL15 humana en el día 0. Después de incubar por un total de 15 días desde el inicio del experimento, las células de cada pozo f eron cosechadas y contadas . En la población CD34+ se observó un bajo nivel de proliferación en presencia de flt3 solo (pozo control #1) , pero la presencia de IL-15 o IL-21 agregada en el día 0 además de flt3, no tuvo efecto significativo sobre la expansión (pozos, 3# y #5) . La adición de IL-15 después de 5 días tuvo algún efecto proliferativo en comparación al control de flt3 (pozo #2 en comparación al pozo #1) y un efecto proliferativo en presencia de zalfall (pozo #4 comparado al pozo #3) . No obstante, la mayor expansión fue evidente en el pozo #6 que contenía IL-15 e IL-21 además de flt3 en el día 0. En la población CD34-, no se observó proliferación en presencia de flt3 solo (pozo control #1) , y de hecho fue evidente una disminución en la población celular. La presencia de zalfall agregada en el día 0 además de flt3 (pozo #3) fue similar al control de flt3. La presencia de IL-15 agregada en el día 5 incrementó el efecto de proliferación de las células en presencia (pozo #4) o ausencia (pozo #2) de IL-21.

Nuevamente, la mayor expansión fue evidente en el pozo #6 que contenía IL-15 e IL-21, además flt3 en el día 0. Todas las poblaciones celulares fueron luego probadas para la actividad de NK y sometidas a análisis FACS, como se muestra más adelante (Ejemplo 7) . Ejemplo 6 Aislamiento y expansión de Células de Ratón Frescas Utilizando IL-21 Humana y de Ratón para la Evaluación de la Actividad de NK y los Marcadores de Células NK A. Aislamiento y expansión de células de médula ósea de baja densidad, de ratón, frescas utilizando IL-21 humana y de ratón Las células de médula ósea frescas de ratón fueron aisladas mediante el pinzado de ambos extremos de los fémures de ratón, e inundando con dos a tres mililitros de medio de crecimiento (ver más adelante) a través de la parte interna del hueso hacia el tubo de reconexión. El medio de crecimiento fue 500 mi de Medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) ; 5 mi de lOOx L-glutamina (Gibco BRL, Grand Island, NY) ; 5 mi de lOOx de piruvato de sodio (Gibco BRL) ; 5 mi de lOOx penicilina, estreptomicina, neomicina (PSN) (Gibco BRL) ; y 50 mi de Suero Fetal Bovino inactivado por calor (FBS) (Hyclone Laboratories, Logan, UT) . Las células de la médula fueron luego desintegradas mediante toma con pipeta del medio hacia arriba y hacia abajo varias veces. Las células fueron luego concentradas y lavadas una vez con el medio de crecimiento, y pasadas a través de un tamiz de 70 mierómetros . Las células mononucleares de baja densidad fueron luego aisladas al someter las células de la médula a un gradiente de densidad. Las células de la médula en cinco a ocho mililitros de medio de crecimiento, fueron cuidadosamente tomadas con pipeta sobre la parte superior de cinco a ocho mililitros de NycoPrep 1.077 Animal (Nycomed Oslo, Noruega) en un tubo para centrífuga. Este gradiente fue luego centrifugado a 600 X g por 20 minutos. Las células mononucleares de baja densidad fueron cosechadas a partir de la capa de la interfaz entre NycoPrep y el medio. Estas células fueron luego diluidas aproximadamente a 20 mililitros en medio de crecimiento, concentradas y lavadas . Las células fueron luego sembradas en placa aproximadamente a 0.5-1.5xl06 células por mililitro en el medio de crecimiento, en un matraz estándar de cultivo de tejidos e incubadas a 37°C, con 5% de C02 por dos horas. Las células de la médula de baja densidad (NA LD) no adherentes fueron luego cosechadas y sembradas en placa a 0.5-2.0xl06 células por mililitro en medio de crecimiento, más 2.5 nanogramos por mililitro de flt3 de ratón (R y D Systems, Minneapolis, MN) más 25 a 50 nanogramos por mililitro de Interleucina-15 (IL-15) (R and D Systems) con o sin 50 a 150 nanogramos por mililitro de IL-21 humana; o con o sin 0.12 a 10 nanogramos por mililitro de IL-21 de ratón. No existió expansión significativa sin la adición de la IL-21 humana o de ratón. Las células no adherentes fueron expandidas en los cultivos que contenían IL-21 de ratón tan baja como 0.12 ng/ml y en los cultivos que contenían IL-21 humana tan baja como 22 ng/ml. En cultivos que contenían IL-21 humana y de ratón, la expansión de las células no adherentes se incrementó con la dosis cada vez mayor de IL-21, con la respuesta de saturación del ligando de ratón aproximadamente a 5-10 ng/ml y la humana que no alcanza una respuesta de saturación incluso a la más alta dosis de 200 ng/ml. La IL-21 humana pareció ser aproximadamente 20 a 100 veces menos potente sobre las células de ratón que la IL-21 de ratón. Después de aproximadamente cinco a diez días las células de ratón expandidas con IL-21 fueron cosechadas y analizadas mediante citometría de flujo (FACSCalibur; Becton Dickinson, Mansfield, MA) para determinar qué porcentaje de ellas eran positivas para los antígenos de las células NK, donde 46% fueron positivas para el marcador celular de PanNK DX5 (Pharmingen) . B. Aislamiento y expansión de Células de Médula de Ratón, Agotadas en la Línea, Frescas Células de médula agotadas en la línea (lin-) de ratón, frescas fueron, aisladas de células de médula ósea de ratón frescas primeramente mediante la incubación de las células con los siguientes anticuerpos: TER119, Gr-1, B220, MAC-1, Cd3e e I-Ab (Pharmingen, San Diego, CA) . Las células lin+ fueron luego removidas del anticuerpo IgG de oveja anti-rata de Dynabeadas M-450 (Dynal, Lake Success, NY) siguiendo las instrucciones del fabricante. Las células de médula lin- negativamente seleccionadas fueron luego sembradas en placa como se describe anteriormente en el medio de crecimiento ya sea más 2.5 ng/ml de flt3 (R&D Systems) y 25 ng/ml de IL-15 (R&D Sytesm) ; o flt3, IL-15 e IL-21 de ratón, medio condicionado con IL-21 de ratón con 2 a 5% de BHK. Después de seis días de crecimiento, los cultivos fueron cosechados, cortados y sometidos a un ensayo de actividad de células NK (Ejemplo 7) . Las células desarrolladas con IL-21 de ratón fueron aproximadamente dos a tres veces más efectivas en la lisis de las células objetivo de células NK (células YAC-1) que las células desarrolladas sin IL-21. C. Aislamiento y Expansión de Timocitos CD4- CD8- (doblemente negativos o DN) Timocitos frescos de ratón fueron aislados mediante el desmenuzamiento y tamizado de los timos provenientes de ratones de tres a ocho semanas de edad. Las células CD4- CD8-(DN) fueron luego negativamente seleccionadas mediante la incubación de los timocitos con anticuerpos anti-CD4 y anti-CD8 (Phar ingen) , eliminando luego las células CD4+ CD8+ con el anticuerpo IgG de oveja anti-rata Dynabeads M-450 (Dynal) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los timocitos de ratón DN fueron luego desarrollados en el medio de crecimiento más 2.5 ng/ml de fl53 (R&D Systems), 25 ng/ml de IL-15 (R&D Systems) y 10 ng/ml de IL-7 (R&D Systems) con o sin IL-21 de ratón como se describe anteriormente. Seis días después las células fueron cosechadas, contadas, analizadas mediante citometría de flujo como se describió anteriormente, y también sometidas a un ensayo de actividad de células NK (Ejemplo 7) . El cultivo desarrollado con IL-21 de ratón produjo aproximadamente 480,000 células mientras que el cultivo sin IL-21 produjo únicamente aproximadamente 160,000 células. El cultivo desarrollado con IL-21 de ratón se encontró que era aproximadamente 16.2% positivo para el antígeno Pan NK de células NK, DX5 (PharMingen) . El cultivo desarrollado sin IL-21 fue 14.6% positivo para DX5. Las células desarrolladas con las células objetivo NK lasadas con IL-21, YAC-1, fueron aproximadamente dos veces mejores que las células desarrolladas sin IL-21. Las células expandidas no lisaron significativamente una línea celular objetivo, control negativo, EL4. Estos resultados sugirieron que IL-21 expande selectivamente las células NK líticas. Ej emplo 7 Actividad de Células Expandidas con IL-21 de Humano y de Ratón y Células NK Murinas Maduras en los Ensayos de Citotoxicidad de Células NK A. Ensayo de células NK La citólisis objetivo mediada por células NK fue examinada mediante un ensayo de liberación de 51Cr estándar. Las células objetivo (células K562 (ATCC No. CCL-243) en ensayos humanos, y células YAC-1 (ATCC No. TIB-160) en ensayos de ratón) carecen de la expresión de las moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) , haciéndolas susceptibles a la lisis mediada por las células NK. Una línea celular objetivo control negativo en los ensayos de ratón es el timoma EL4 de MHC+ (ATCC No. TIB.39). Desarrollamos las células K562, EL4 y YAC-1 en el medio RP10 (RP I 1640 estándar (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de FBS (Hyclone, Logan, UT) , así como glutamina 4 mM (Gibco/BRL) , 100 U.I./ml de penicilina + 100 MCG/ml de estreptomicina (Gibco/BRL) , ß-mercaptoetanol 50 µ? (Gibco/BRL) y amortiguador HEPES 10 mM (Gibco/BRL) . En el día del ensayo, l-2xl06 células objetivo fueron cosechadas y resuspendidas a 2.5-5xl06 células/ml en medio RP10. Se agregaron 50-100 µ? de cromato de 51Cr-sodio a 5 mCi/ml ( EN, Boston, MA) directo a las células y se les incubó por 1 hora a 37°C, luego se lavaron dos veces con 12 mi de PBS y se resuspendieron en 2 mi de medio RP10. Después de contar las células en un hemocitómetro, las células objetivo fueron diluidas a 0.5-lxl05 células/ml y se mezclaron 100 µ? (0.5-lxl04 células) con las células efectoras como se describe más adelante . En ensayos con humanos, las células efectoras fueron preparadas a partir de células BM CD34+ humanas, seleccionadas y expandidas (Ejemplo 5B) que fueron cosechadas, lavadas, contadas, mezcladas a diversas concentraciones con las células objetivo marcadas con 51Cr en placas de fondo redondo de 96 pozos, y se incubaron por 4 horas a 37°C. Después de la coincubación de las células efectoras y las células objetivo marcadas, la mitad del sobrenadante de cada pozo se recolectó y se contó en un contador gamma por 1 minuto/muestra. El porcentaje de liberación de 51Cr específico fue calculado a partir de la fórmula 100 x (X-Y)/(Z-Y), donde X es la liberación de 51Cr en presencia de células efectoras, Y es la liberación espontánea en ausencia de efectoras, y Z es la liberación de 51Cr total a partir de las células objetivo incubadas con 0.5% de Tritón X-100. Los datos fueron trazados gráficamente como el % de lisis específica versus la proporción efectora a objetivo en cada pozo. B. Actividad de células expandidas con IL-21 humana HPCs humanas CD34+ aisladas, cultivadas con flt3 ± IL-21 y flt3 ± IL-15 +/- IL-21 (Ejemplo 5) , fueron cosechadas las células en el día 15 para evaluar su capacidad de lisar las células K562 HC" en un ensayo estándar de liberación de 51Cr como se describió anteriormente, y para analizar su fenotipo superficial mediante citometría de flujo. Como se esperaba de los reportes previos (Mrozek, E et al., Blood 87: 2632-2640, 1996; y Yu, H et al., Blood 92: 3647-3657, 1998), la adición simultánea de IL-15 y flt3L indujo el sobredesarrollo de una población pequeña de células CD56+. De manera interesante, aunque las células BM cultivadas simultáneamente con IL-21 y flt3L no se expandieron significativamente, existió un incremento significativo en el número total de células en cultivos que contenían una combinación de flt3L, IL-21 e IL-15 (ver, Ejemplo 5) . Para una evaluación del fenotipo superficial de estos cultivos de BM humanos, se tiñeron alícuotas pequeñas para el análisis citométrico de flujo de 3 colores con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 -FITC, anti-CD56-PE y anti-CD16-CyChrome (todos de PharMingen, San Diego, California) , y se analizaron sobre un FACSCalibur utilizando el software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Este análisis citométrico de flujo confirmó que las células que se desarrollan a partir de estos cultivos fueron células NK diferenciadas, ya que éstas fueron grandes y granulares, y expresaron CD56 y CD16, y fueron CD3" (Lanier, LL Annu. Rev. Immunol . 16: 359-393, 1998) . Además, estas células mostraron función efectora significativamente mayor que aquellas células desarrolladas con IL-15 y flt3. Más específicamente, las células desarrolladas en las tres citocinas lisaron más del 40% de los objetivos K562 a una proporción efectora a objetivo (E:T) de 1.5, mientras que las células desarrolladas en IL-15+flt3L lisaron menos de 5% de los objetivos a una E:T de 2. Estos datos demuestran que, en combinación con IL-15, IL-21 estimula la diferenciación de las células NK a partir de las células BM CD34\ C. Actividad de células expandidas con IL-21 de ratón Al probar los efectos de IL-21 sobre las células progenitoras hematopoyéticas murinas, las células de médula ósea negativas a la línea (Lin-) purificadas provenientes de ratones C57B1/6 fueron expandidas en fIt3+IL-15±IL-21 , como se describe en el Ejemplo 6B. En el día 6 del cultivo, las células ( "efectoras" ) fueron cosechadas y contadas, luego resuspendidas en 0.4 mi de medio RP10 (Ejemplo 7A) . Dos alícuotas (0.15 mi cada una) de cada muestra expandidas con o sin IL-21 (Ejemplo 7A) fueron diluidas en serie 3 veces por duplicado en palcas de fondo redondo de 96 pozos, para un total de 6 pozos de 100 µ? cada uno. Los 100 µ? restantes de células fueron teñidos para los marcadores superficiales de las células NK con los anticuerpos FITC-anti-2B4 y PE-anti-DX5 mAbs (PharMingen) y se analizaron mediante citométria de flujo. Cada grupo de células expuestas a flt3+IL-15 con o sin la presencia de IL-21, tuvieron fracciones similares de 2B4+DX5+células, en el intervalo de 65 a 75% positivas para ambos marcadores de NK. Para el ensayo de lisis de NK, las células objetivo (YAC-1 y EL4) fueron marcadas con 51Cr como se describió anteriormente. Después de contar las células objetivo sobre un hemocitómetro, las células objetivo fueron diluidas a 0.5- lxlO5 células/ml y 100 µ? de YAC-1 o EL4 (0.5-lxl04 células) se mezclaron con 100 µ? de células efectoras y se incubaron por 4 horas a 37°C. La lisis específica fue determinada para cada pozo como se describió anteriormente. Se encontró que las células se desarrollaron en presencia de fIt3+IL-15+IL-21, y mostraban actividad lítica aumentada (aproximadamente 2 veces) contra los objetivos YAC-1 (pero no mataron la línea de células control EL4 MHC+) . A una proporción efectora objetivo (E.-T) de 5, las células NK generadas en presencia de las 3 citocinas (IL-21+fIt3+IL-15) lisaron 12% de las células YAC-1, mientras que aquellas células NK expandidas con flt3+IL-15 lisaron 6% de los objetivos YAC-1. Experimentos subsecuentes confirmaron esta tendencia . En un segundo procedimiento para determinar la actividad biológica de IL-21 sobre las células NK murinas, se aislaron timocitos de ratón inmaduros CD4"CD8+ ("doble negativas", DN) como se describe en el Ejemplo 6C y se cultivaron con IL-15+flt3+IL-7 o IL-15+flt3+IL-2 , con o sin IL-21. En el día 6 del cultivo, las células fueron cosechadas y evaluadas para la actividad lítica de NK sobre células YAC-1 y EL4 como se describió anteriormente. Se encontró que las células cultivadas en presencia de IL-21 tuvieron la mayor actividad lítica en este ensayo, con actividad lítica aumentada sobre aquellas células cultivadas en presencia de las otras citocinas. Específicamente, los timocitos DN desarrollados con IL-15+flt3+IL-7 mataron 18% de las células YAC-1 a una E:T de 24, mientras que las células desarrolladas en presencia de IL-15+flt3+IL-7 más IL-21 mataron 48% de los objetivos a la misma E:T. Los timocitos DN desarrollados en IL-15+fIt3+IL-21 mataron 15% de los objetivos YAC-1 a una E:T de 6, mientras que las células desarrolladas con estas 3 citocinas e IL-21 mataron 35% de las células YAC-1 a una E:T de 9. La citometría de flujo fue realizada sobre las células cultivadas un día antes del ensayo de lisis de NK. Como fue verdadero para los cultivos de médula ósea, a pesar del efecto proliferativo de IL-21 (los números de células se incrementan aproximadamente 2 veces cuando se agrega IL-21) , esto no aumentó significativamente la fracción de células DX5+ (17-20% de las células totales en los cultivos cón IL-7, y 35-46% del total en cultivos con IL-2) . Estos datos implican que IL-21, en combinación con IL-15 y flt3 , aumenta la actividad lítica de las células NK generadas a partir de médula ósea murina o timo. D. Actividad de IL-21 de ratón sobre las células NK murinas, maduras " Con el fin de probar los efectos de IL-21 de ratón sobre las células NK maduras, se aislaron bazos de ratones C57B1/6 de 5 semanas de edad (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) y se machacaron con portaobjetos de vidrio de extremo congelado para crear una suspensión celular. Las células sanguíneas rojas fueron retiradas mediante lisis hipotónica como sigue: las células fueron concentradas y el sobrenadante removido mediante aspiración. Se desintegró el botón con agitación suave en torbellino, luego se agregaron 900 µ? de agua estéril mientras se agitaba, seguido rápidamente (menos de 5 segundos después) por 100 µ? de 10X HBSS (Gibco/BRL) . Las células fueron luego resuspendidas en 10 mi de IX HBSS y el desecho fue retirado al hacer pasar las células sobre un tamiz celular revestido con malla de nailon (Falcon) . Estas células del bazo agotadas en RBC fueron luego concentradas y resuspendidas en amortiguador MACS (PBS+1% de BSA+ EDTA 2 mM) y contadas. Se tiñeron 300 x 105 de las células con esferas magnéticas recubiertas con anti-DX5 (Miltenyi Biotec) y las células NK DX5+ positivamente seleccionadas sobre una columna de separación MACS VS+, de acuerdo a las instrucciones del fabricante, conduciendo a la recuperación de 8.4 x 106 células DX5+ y 251 x 105 células DX5". Cada uno de estos grupos de células fueron cultivadas en placas de 24 pozos (0.67 x 106 células/pozo, 2 pozos por condición de tratamiento) en medio RP10 (Ejemplo 7A) solo o con 1) 30 ng/ml de IL-21 de ratón, 2) 30 ng/ml de IL-2 recombinante de ratón (R&D Systems, Inc., Minneapolis, M ) , 3) 30 ng/ml de IL-15 humana recombinante (R&D) , 4) 30 ng/ml de cada uno de IL-21 de ratón y hIL-15, o 5) 30 ng/ml de cada uno de mIL-2 y hIL-15. Las células fueron cosechadas después de 21 horas, lavadas, y resuspendidas en el medio RP10 y contadas. Las células fueron luego evaluadas por su habilidad para lisar las células objetivo YAC-1 o EL4 marcadas con 51Cr, como se describe en el Ejemplo 7A. En general, existió poca actividad de NK a partir de los grupos DX5" (células no NK) , pero las células DX5" cultivadas con IL-21 y hIL-15 lisaron 25% de las células objetivo YAC-1 a una E :T de 82. Por comparación, las células CS5" cultivadas con hIL-15 solo lisaron 14% de los objetivos YAC-1 a una E:T de 110. Esto sugiere que IL-21 e IL-15 están actuando conjuntamente sobre las células NK residuales NK1.1+ en esta preparación celular. Como para la preparación de las células DX5+, el tratamiento con IL-21 de ratón sola no incrementó significativamente su función efectora (su lisis de las células YAC-1 fue similar al grupo no tratado) . Como se esperaba, IL-2 e IL-15 mejoraron significativamente la actividad de NK. El más alto nivel de lisis, no obstante, fue detectado en el grupo tratado con IL-21 y hIL-15 (65% de lisis de las células YAC-1 a una E:T de 3.3, versus 45% de lisis a una E : de 4 para el grupo de tratamiento con hIL-15) . Tomados conjuntamente, estos resultados sugieren que aunque IL-21 sola no puede incrementar la actividad de lisis de las células NK, ésta sí aumenta la actividad de lisis de las células NK maduras, cuando se administra con IL-15.

Ej emplo 8 Proliferación de IL-21 de las Células T de Humano y de Ratón en un Ensayo de Proliferación de Células T A. Proliferación de Células T de Ratón por IL-21 Murina Las células T provenientes de ratones C57B1/6 (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) fueron aisladas de esplenocitos y linfocitos combinados provenientes de nodulos linfáticos axilares, braquiales, inguinales, cervicales y mesentéricos (LNs) . Los bazos fueron machacados con portaobjetos de vidrio de extremo congelado para crear una suspensión celular. Los LNs fueron desmenuzados con fórceps y pasados a través de un tamiz celular para eliminar los desechos. Los esplenocitos y células LN combinadas fueron separados en subgrupos CD8+ y CD4+ utilizando dos columnas de separación magnéticas MACS sucesivas, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) . Los timocitos completos fueron recolectados de los mismos ratones. Las células fueron cultivadas a 3 x 105 células/pozo (timocitos) o 105 células/pozo (células T maduras) con concentraciones cada vez mayores de IL-21 murina purificada (0-30 ng/ml) (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) en placas de fondo redondo de 96 pozos pre-recubiertas toda la noche a 4°C con diversas concentraciones del anticuerpo monoclonal 2C11 anti-CD3 (PharMingen) por 3 días a 37°C. El anticuerpo anti-CD3 sirvió para activar las células T murinas a través del receptor de células T. Cada pozo fue pulsado con 1 µ?? de 3H-timidina en el día 2 y las placas fueron cosechadas y contadas 16 horas después para evaluar la proliferación. Cuando se probó IL-21 en los ensayos de proliferación de células T, se encontró que éste co-estimulaba los timocitos murinos activados con anti-CD3, conduciendo a un sobredesarrollo acelerado de las células CD8+ CD4" (la mayoría de los timocitos cultivados con anti-CD3+IL-2l fueron CD8+ CD4" por el día 3 del cultivo, mientras que las células cultivadas con anti-CD3 solo, no se desviaron significativamente de este fenotipo hasta el día 5) . No se observaron niveles significativos de proliferación de los timocitos a IL-21 en ausencia de anti-CD3. De manera interesante, cuando se evaluaron las células T murinas periféricas maduras para su habilidad de responder a IL-21+anti-CD3 , se encontró que únicamente las CD8+, pero no el subgrupo de CD4*, respondieron a IL-21 de una manera dependiente de la dosis. Se observó también proliferación débil pero reproducible de las células CD8+ (pero no células CD4+) en respuesta a IL-21 sola. De manera interesante, esto no fue observado para las células T humanas (ver Ejemplo 8B más adelante) . B. Proliferación de IL-21 Humana de Células T Humanas Las células T CD4+ y CD8+ humanas fueron aisladas de PBMC como se describe en el E emplo 9 (más adelante) . Las células fueron cultivadas aproximadamente a 105 células/pozo con concentraciones cada vez mayores de IL-21 humana purificada (0-50 ng/ml) (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) en placas de fondo plano de 96 pozos pre-recubiertas toda la noche a 4°C con concentraciones variantes del anticuerpo monoclonal UCHT1 anti-CD3 humano (PharMingen) por 3 días a 37°C. Cada pozo fue pulsado con 1 µ(G? de 3H-timidina en el día 2, y las placas fueron cosechadas y contadas 16 horas después. De manera contraria a los presentes resultados con las células T de ratón, nuestros datos preliminares sugieren que IL-21 humana co-estimula las células T humanas CD4+ , pero no CD8+, de una manera dependiente de la dosis . En otros experimentos, las células T CD4+ y CD8+ murinas, maduras, fueron enriquecidas a partir de células de LN y de bazos C57B1/6 combinadas mediante agotamiento de las células B CD19+ utilizando una columna de esferas magnéticas. Las poblaciones celulares resultantes fueron evaluadas para la proliferación hacia el anticuerpo monoclonal anti-CD3s de ratón, enlazado a la placa, en ausencia o presencia de concentraciones cada vez mayores de IL-21 humana, como se indica. Los datos mostrados son representativos de los resultados de 4 experimentos . Las células T provenientes de ratones C57B1/6 fueron aisladas de los esplenocitos combinados y de los linfocitos provenientes de LNs auxiliares, braquiales, inguinales, cervicales y mesentéricos . Los bazos fueron luego triturados con portaobjetos de vidrio de extremo congelado para crear una suspensión celular. Los LNs fueron luego desintegrados con fórceps y pasados a través de un tamiz celular para eliminar los desechos. Los esplenocitos combinados y las células de LN fueron separadas en subgrupos CD8+ y CD4+ utilizando dos columnas de separación magnética MA.CS sucesivas, de acuerdo a las instrucciones del fabricante (Miltenyi Biotec, Sunnyvale, CA) . Las células fueron cultivadas a 105/pozo con concentraciones cada vez mayores de IL-21 murina (0-30 ng/ml) en placas de fondo plano de 96 pozos pre-recubiertas toda la noche a 4°C con diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal 2C11 anti-CD3s (PharMingen) por 3 días a 37°C. Cada pozo fue pulsado con 1 µ?. de 3H-timidina en el día 2 y las placas fueron cosechadas y contadas 16 horas después. La Tabla 5 ilustra que mIL-21 co-estimula la proliferación de células T CD8+ murinas . Los valores representan las CPM incorporadas de 3H-timidina (promedio ± la desviación estándar de los pozos por triplicado) .

Tabla 5 0 405 ± 67895 ± 141175 202251 24 6626 101 18752 ± 6733 ± 35571 45106 1 . 2 247 ± 80872 ± 126487 178863 205861 86 23598 ± 7472 ± 33583 ±14675 CD4 + 6 302 ± 75192 ± 102005 191598 218718 106 5323 ± 20059 ± 15881 ± 12142 30 364 ± 86164 ± 141065 18 6089 266650 126 8065 4921 ± 17585 ± 39839 0 168 ± 40198 ± 70272 ± 84771 ± 97869 ± 47 4557 4141 9450 3368 1 . 2 268 + 50095 ± 84319 ± 105176 113394 117 3959 6373 ± 10828 ± 3657 CD8 + 6 323 ± 78113 ± 1084 61 132301 178551 159 6967 ± 2175 ± 13386 ± 16373 30 2007 ± 132238 182485 272229 330434 470 ± 1915 ± 4991 ± 9325 ± 47185 Ejemplo 9 PCR en Tiempo Real Muestra la Expresión de IL-21 en Células CD4+ Humanas A. Células T Humanas Purificadas como una Fuente Primaria utilizadas para Evaluar la Expresión de IL-21 Humana Se recolectaron 150 mi de sangre completa proveniente de un donador humano saludable y se mezclaron 1:1 con PBS en tubos cónicos de 50 mi. Treinta mi de sangre diluida fueron luego recubiertos con 15 mi de Ficoll Paque Plus (Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) . Estos gradientes fueron centrifugados 30 minutos a 500 g y se dejaron detener sin frenado. Las células agotadas en células sanguíneas rojas en la interfaz (PBMC) fueron recolectadas y lavadas 3 veces con PBS. Las PBMC humanas aisladas producidas fueron 200 x 106 antes de la selección, como se describe más adelante. Las PBMCs fueron suspendidas en 1.5 mi de amortiguador MACS (PBS, 0.5% de EDTA, EDTA 2 mM) y 3 x 106 células fueron apartadas para el ARN control y para el análisis citométrico de flujo. Se agregaron 0.25 mi de microesferas anti-CD8 humano (Miltenyi Biotec) y la mezcla se incubó por 15 minutos a 4°C. Estas células marcadas con esferas CD8 fueron lavadas con 30 mi de amortiguador MACS , y luego resuspendidas en 2 mi de amortiguador MACS . Se preparó una columna VS+ (Miltenyi) de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La columna VS+ fue luego colocada en un campo magnético VarioMA.CS (Miltenyi) . La columna fue equilibrada con 5 mi de amortiguador MACS . Las células de ratón primarias aisladas fueron luego aplicadas a la columna. Las células negativas a CD8 se dejaron pasar a la siguiente etapa. La columna fue enjuagada con 9 mi (3 X 3 mi) de amortiguador MACS. La columna fue luego removida del imán y colocada sobre un tubo Falcon de 15 mi . Las células CD8+ fueron eluidas mediante la adición de 5 mi de amortiguador MACS a la columna y las células enlazadas se lavaron a chorro utilizando el émbolo proporcionado por el fabricante. El rendimiento de las células T periféricas humanas seleccionadas CD8+ fue aproximadamente 51 x 106 células totales. El flujo de células negativas a CD8+ se recolectó, se contó y se tiñó con esferas recubiertas con CD4 anti-humano, luego se incubaron y se pasaron sobre una nueva columna VS+ a las mismas concentraciones que se describen anteriormente. El rendimiento de las células T periféricas humanas seleccionadas por CD4+ fue de 42 x 106 células totales. Una muestra de cada una de las células T humanas seleccionadas CD8+ y CD4+ fue removida para la tinción y clasificación sobre un clasificador de células activado por fluorescencia (FACS) , para evaluar su pureza. Un anticuerpo anti-CD4 humano conjugado a PE, un anticuerpo anti-CD8 humano-FITC, y un anticuerpo anti-CD19 humano-CyChrorne (todos de PharMingen) se utilizaron para teñir las células seleccionadas por CD8+ y CD4+. Las células seleccionadas por CD8 en este primer experimento fueron 80% CD8+, y las células seleccionadas por CD4 fueron 85% CD4+. En 2 experimentos subsiguientes (Ejemplo 9B) , las células purificadas por CD8+ fueron 84% y 81% puras, y las células CD4+ fueron 85% y 97% puras, respectivamente. En un experimento, se tiñeron las células no enlazadoras (flujo de lado a lado) con las esferas recubiertas con anti-CD19 humano (Miltenyi) y se corrieron sobre una tercera columna de esferas magnéticas para aislar las células B CD19+ (éstas fueron 92% puras) . Las células humanas seleccionadas por CD8+, CD4+ y CD19+ fueron activadas mediante la incubación de 0.5 X 106 células/ml en RPMI + 5% de ultrasuero humano (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) + PMA 10 ng/ml y Ionomicina 0.5 µ9/t?1 (Calbiochem) por aproximadamente 4, 16 ó 24 horas a 37°C. Las células T (2.5 x 106/pozo) fueron alternadamente estimuladas en placas de 24 pozos pre-recubiertas toda la noche con 0.5 µg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CD3 enlazado a la placa, UCHT1 (Phar ingen) con o sin el anticuerpo monoclonal soluble anti-CD28 (PharMingen) a 5 µ9/p?1. En cada punto de tiempo, las células fueron cosechadas, concentradas, lavadas una vez con PBS y luego concentradas nuevamente. El sobrenadante fue retirado y los botones celulares fueron luego congelados instantáneamente en un baño de hielo seco/etanol, luego almacenadas a -80°C para la preparación de ARN en una fecha posterior. La PCR en tiempo real fue realizada sobre estas células humanas seleccionadas por CD8+ , CD4+ y CD19+ como se describen en el Ejemplo 9B y el Ejemplo 9C más adelante, para evaluar la IL-21 humana y la expresión del receptor. B. Cebadores y Sondas para RT-PCR Cuantitativa para la expresión de IL-21 humana RT-PCR cuantitativa en tiempo real utilizando el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7700 (PE Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA9 ha sido previamente descrito (ver, Heid, CA et al., Genome Research 6: 986-994, 1996; Gibson, UEM et al., Genome Research 6: 995-1001, 1996; y Sundaresan S et al., Endocrinology 139: 4756-4764, 1998). Este método incorpora el uso de una sonda específica del gen que contiene el reportero y los colorantes apagadores. Cuando la sonda está intacta la emisión del colorante reportero es negada debido a la proximidad del colorante apagador. Durante la extensión por PCR utilizando los cebadores delantero e inverso específicos del gen, adicionales, la sonda es escindida por la actividad de nucleasa 5' de la polimerasa Taq, la cual libera el colorante reportero dando como resultado un incremento en la emisión de fluorescencia. Los cebadores y las sondas utilizadas para los análisis de RT-PCR cuantitativos en tiempo real, fueron diseñados utilizando el software de diseño de cebador Primer ExpressMR (PE Applied Biosystems) . Los cebadores para la IL-21 humana fueron diseñados abarcando una unión de intrón-exon para eliminar la amplificación del ARN genómico. El cebador delantero, ZC22,281 (SEQ ID NO: 11) y el cebador inverso, ZC22,279 (SEQ ID NO: 12) fueron ambos utilizados a una concentración de 300 nM para sintetizar un producto de 80 pares de bases. La sonda TaqMan de IL-21 correspondiente, ZG32 (SEQ ID NO: 3) fue sintetizada por PE Applied Biosystems. La sonda fue marcada con un colorante fluorescente reportero (6-carboxi-fluoresceína) (FAM) (PE Applied Biosystems) en el extremo 5' y un colorante fluorescente apagador (6-carboxi-tetrametil-rodamina) (TAMRA) (PE Applied Biosystems) en el extremo 3'. Con el fin de probar la integridad o calidad de todas las muestras de ADN, éstas fueron seleccionadas para el ARNr utilizando el cebador y el equipo de sondas ordenado de PE Applied Biosystems (cat. No. 4304483) . El colorante fluorescente reportero para esta sonda es VIC (PE Applied Biosystems) . Los resultados del ARNr permitirán la normalización de los resultados de IL-21. El ARN fue preparado a partir de las pellas proporcionadas en el Ejemplo 9A, utilizando el equipo RNeasy Miniprep™ (Qiagen, Valencia, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. ARN control fue preparado a partir de aproximadamente 10 millones de células BHK que expresan IL-21 humana .

C. Cebadores y Sondas para RT-PCR Cuantitativa para la expresión del Receptor zalfall humano La PCR en tiempo real fue realizada para evaluar la expresión del receptor de IL-21 como en el Ejemplo 9B y el Ejemplo 9D, utilizando las células preparadas bajo las condiciones detalladas en 43A, y las sondas específicas para el receptor de IL-21. El cebador delantero, ZC22,277 (SEQ ID NO: 14) y el cebador inverso, ZC22,276 (SEQ ID NO: 15) fueron utilizadas en una reacción de PCR (arriba) a una concentración de aproximadamente 300 nM, para sintetizar un producto de 143 pares de bases. La sonda de IL-21 correspondiente TaqMan®, designada ZG31 (SEQ ID NO: 16) fue sintetizada y marcada por PE Applied Biosystems. El ARN proveniente de las células BaF3 que expresan el receptor de IL-21 humana se utilizó para generar el control apropiado para las curvas estándares para la PCR en tiempo real descrita en el Ejemplo 9D más adelante.

D. RT-PCR cuantitativa en tiempo real Los niveles relativos del ARN de IL-21 serán determinados mediante el análisis de las muestra de ARN total utilizando el método de RT-PCR en un Solo Paso (PE Applied Biosystems) . El ARN proveniente de las células BHK que expresan IL-21 humana se utilizó para generar una curva estándar. La curva consistió de diluciones en serie en el intervalo de 2.5-2.5 x 10"4 ng para la selección del ARNr y 25-0.0025 ng para la selección de IL-21, con cada punto analizado por triplicado. Las muestras de ARN total fueron también analizadas por triplicado para los niveles de transcrito de IL-21 humano y para los niveles de ARNr como un control endógeno. Cada reacción de RT-PCR de un solo paso consistió de 25 ng de ARN total en amortiguador A (cloruro de potasio 50 mM, Tris-HCl 10 mM, y el colorante estándar interno, ROX (PE Applied Biosystems) , cebadores apropiados (50 nM para las muestras de ARNr, 300 nM para las muestras de IL-21) y la sonda (50 nM para el ARNr, 100 nM para IL-21) , cloruro de magnesio 5.5 mM, 300 µ? de cada d-CTP, d-ATP y d-GTP y 600 µ? de d-UTP, transcriptasa inversa (0.25 U/µ?) , ADN-polimerasa AmpliTaq (0.025 U/µ?) e inhibidor de ARNasa (0.4 U/µ?) en un volumen total de 25 µ? . Las condiciones de ciclo térmico consistieron de un paso inicial a temperatura ambiente hasta 48°C por 30 minutos, un paso de activación con AmpliTaq Gold de 95°C por 10 minutos, seguido por 40 ciclos de amplificación por 15 segundos a 95°C y 1 minuto a 60°C. Los niveles relativos de ARN de IL-21 fueron determinados mediante el Método de la Curva Estándar como se describe en el Boletín del Usuario No. 2 (PE Biosystems; Boletín del Usuario #2; ABI Prism 7700 Squence Detection System, Relative Quantitation of Gene Expression, 11 de diciembre de 1997) utilizando las mediciones de ARNr para normalizar los niveles de IL-21. Las muestras fueron comparadas con relación al calibrador dentro de cada experimento. El calibrador fue arbitrariamente elegido con base en el ARN de buena calidad y un nivel de expresión al cual pudieron ser comparadas significativamente otras muestras. Los resultados de los experimentos que analizan la expresión de IL-21 y el receptor de IL-21 en. células estimuladas y no estimuladas (Ejemplo 9A) son como se describen en el Ejemplo 9E más adelante. E. Expresión del Receptor de IL-21 humana y el ligando en las células CD4+, CD8+ y CD19+ El primer experimento utilizó RT-PCR, descrito anteriormente, para evaluar la expresión del receptor de zalfall en muestras de CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3 y no estimuladas, a los puntos de tiempo de 0 horas (células no estimuladas ("en reposo")), y a las 4 horas, 15.5 horas y 24 horas, después de la estimulación. La muestra de CD4+ en reposo fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Existió aproximadamente un incremento en 4 veces en la expresión del receptor en las células CD4+ no estimuladas de las 4 horas a las 24 horas de cultivo, y aproximadamente un incremento de 8 veces sobre el mismo periodo de tiempo en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3. Las células CD8+ mostraron un incremento de 7 veces en la expresión del receptor de IL-21, que llegó a un máximo a la 4 horas y disminuyó con el tiempo. Con la estimulación con anti-CD3, las células CD8+ tuvieron un incremento constante de 8 veces en la expresión del receptor.

Este primer experimento también utilizó RT-PCR para evaluar la expresión de IL-21 en las mismas muestras de CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3 y no estimuladas. La muestra de CD8+ estimulada con anti-CD3 a las 4 horas, fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Los resultados mostraron que las células CD4+ y CD8+ no estimuladas no expresan IL-21. Se observó una elevación significativa de la expresión en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 a las 4 horas, con un incremento de aproximadamente 30 veces en la señal observada a las 1.5 horas. Las células CD8+ expresaron una pequeña cantidad del ligando después de la estimulación con anti-CD3, no obstante esto es probablemente debido a la contaminación de la población de CD8+ por un pequeño número de células CD4+. El segundo experimento utilizó RT-PCR para evaluar la expresión del receptor de IL-21 en muestras de CD4+ y CD8+ estimuladas con anti-CD3, estimuladas con P A + Ionomicina y no estimuladas, a los puntos de tiempo de 0 horas, y a las 3.5 horas, 16 horas y 24 horas después de la activación. La muestra CD8+ en reposo fue arbitrariamente elegida como el calibrador y s.e le dio un valor de 1.00. Las células CD4+ y CD8+ en reposo no tuvieron cantidades significativas de expresión del receptor. La expresión fue aproximadamente 3 veces mayor en las muestras de CD4+ estimuladas con PMA + Ionomicina a las 3.5 horas, 16 horas y 24 horas después de la estimulación. La expresión en las células CD4+ activadas con anti-CD3 llegó a un máximo de 10 veces por arriba de los niveles antecedentes a las 3.5 horas después de la estimulación, luego regresó a los niveles 4 veces por arriba del antecedente a las 16 horas después de la estimulación. Las células CD8+ mostraron un incremento en la expresión de 4 veces a las 3.5 horas después de la estimulación con PMA + Ionomicina, con la expresión que disminuyó a puntos de tiempo subsiguientes. Como en el primer experimento, las células CD8+ estimuladas por anti-CD3 nuevamente mostraron un incremento de 8 veces por arriba de la inducción antecedente de la expresión del receptor. Estas muestras provenientes del segundo experimento fueron también utilizadas para evaluar la expresión de IL-21. La muestra de CD4+ estimulada con PMA + Ionomicina a las 24 horas fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Los resultados mostraron que nuevamente ninguna de las células no estimuladas expresó IL-21. Existió una inducción de aproximadamente 30 veces de la expresión del ligando en las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 a las 3.5 horas, como se observa en el experimento previo (a las 4 horas) . No obstante, existió únicamente una inducción de aproximadamente 5 veces con estimulación con PMA + Ionomicina a las 3.5 horas, que disminuyó a puntos de tiempo subsecuentes, nuevamente las células CD8+ expresaron una cantidad muy pequeña de IL-21 que fue probablemente atribuida a las células CD4+ contaminantes. El experimento final utilizó RT-PCR para evaluar la expresión del receptor de IL-21 en las muestras de células CD4+ y CD8+ no estimuladas y estimuladas con anti-CD3 y anti-CD3/anti -CD28 , a los puntos de tiempo de 0 horas, y a las 2 horas, 4 horas y 16 horas después de la estimulación. Las células CD19+ activadas con PMA + Ionomicina fueron también seleccionadas para la expresión del receptor a los mismos intervalos de tiempo. La muestra CD4+ en reposo fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Las células CD4+ estimuladas con anti-CD3 a las 2 horas únicamente tuvieron una inducción de 4 veces del receptor, en comparación a la inducción de 10 veces observada a 3.5 horas en el experimento previo. La combinación de anti-CD3 y anti-CD28 incrementó la expresión del receptor de IL-21 a 8 veces por arriba del antecedente. Las células CD8+ estimuladas con anti-CD3/anti-CD28 a las 16 horas tuvieron niveles de expresión del receptor de IL-21 muy bajos, como se observa en las células CD8+ en experimentos previos (ver arriba) . Las células CD19+ estimuladas con PMA + Ionomicina tuvieron la expresión del receptor de IL-21 más significativa con un incremento de 19 veces a las 2 horas, pero los niveles de expresión disminuyeron nuevamente a aquellos de las células en reposo por 16 horas.

Estas muestras provenientes del experimento final fueron también utilizadas para evaluar la IL-21 mediante RT-PCR. La muestra de CD8+ estimulada con anti-CD3/anti-CD28 a las 16 horas fue arbitrariamente elegida como el calibrador y se le dio un valor de 1.00. Los resultados mostraron que a las 2 horas las células CD4+ tuvieron aproximadamente una inducción de 2 veces de la expresión de IL-21 con la estimulación con anti-CD3, y una inducción de 5 veces con estimulación con anti-CD3 más anti-CD28. Estas condiciones de estimulación indujeron la expresión del ligando sobre el tiempo, con las células CD4+ estimuladas a las 16 horas que muestran los niveles de expresión del ligando 70 veces por arriba del antecedente. Las células CD8+ y CD19+ no mostraron expresión de IL-21. Se esperaba una cierta cantidad de variación entre las extracciones sanguíneas (por ejemplo, múltiples muestras a diferentes tiempos provenientes del mismo paciente y entre múltiples pacientes) . Por lo tanto, las tendencias de los datos fueron analizadas dentro de cada estudio o a partir de una muestra de sangre simple, y los tres experimentos anteriores fueron comparados para una conclusión general. La tendencia proveniente de los experimentos de PCR en Tiempo Real descritos anteriormente es que de todos los tipos celulares probados, las células CD19+ activadas con PMA + Ionomicina expresaron los más altos niveles de ARN del receptor de IL-21. Las células CD4+ y CD8+ pueden también ser estimuladas para expresar el receptor, pero a más bajos niveles que en las células B. IL-21 fue expresada casi exclusivamente en células T CD4+ estimuladas (y no por las células T CD8+ o las células B CD19+) . Aunque la estimulación con PMA + Ionomicina indujo una buena señal de IL-21 en este ensayo, una señal significativamente más alta fue obtenida a partir de las células T CD4+ estimuladas con el anticuerpo monoclonal anti-CD3 o una combinación de los anticuerpos monoclonales anti-CD3 y anti-CD28, condiciones que imitan mejor un encuentro con el antígeno in vivo. E emplo 10 Proliferación dependiente de IL-21 de las Células B Estimuladas con anti-CD40 o anti-IgM A. Purificación de las células B Humanas Un frasco que contenía 1 x 108 células mononucleares de sangre periférica humana (PBMCs por sus siglas en inglés) , sometidas a aféresis, congeladas, fue rápidamente descongelado en un baño de agua a 37°C y resuspendido en 25 mi de medio de células B (medio RPMI 1640 (JRH Biosciences, Lenexa, KS) , 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, 5% de L-glutamina, 5% de Pen/Strep) (Gibco/BRL) en un tubo de 50 mi (Falcon VWR, Seattle, WA) . Las células fueron probadas para la viabilidad utilizando Azul de Tripan (Gibco/BRL) . Diez mililitros de Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) se colocaron en capa bajo la suspensión celular y se centrifugaron por 30 minutos a 1800 rpm y se detuvo con el freno apagado. La interfaz fue luego removida y transferida a un tubo fresco Falcon de 50 mi, aforado hasta un volumen final de 40 mi con PBS y centrifugado por 10 minutos a 1200 rpm con el freno encendido. La viabilidad de las células aisladas fue nuevamente probada utilizando el Azul de Tripan. Alternativamente, sangre humana recién extraída fue diluida 1:1 con PBS (Gibco/BRL) y colocada en placas con Ficoll/Hypaque Plus (Pharmacia) , centrifugada y lavada como se describió anteriormente. Las células aisladas de las fuentes fresca o congelada dieron resultados equivalentes. Las células B fueron purificadas a partir de células sanguíneas periféricas flotadas por Ficoll, de donadores humanos normales (ver arriba) con esferas magnéticas anti-CD19 ( iltenyi Biotec, Auburn, CA) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes fue monitorizada mediante análisis citométrico de flujo con anticuerpo anti-CD22 FITC (Pharmingen, San Diego, CA) . Las preparaciones de células B fueron típicamente más de 90% puras . B. Purificación de células B murinas Una suspensión de esplenocitos murinos fue preparada mediante el desmenuzamiento de bazos de ratón adulto C57B1/6 (Charles River Laboratories, ilmington, MA) con agujas flexionadas en el medio de células B. Las RBCs fueron removidas mediante lisis hipotónica. Las células positivas a CD43 fueron removidas con esferas magnéticas CD43 (Miltenyi Biotec) siguiendo las instrucciones del fabricante. La pureza de las preparaciones resultantes fue monitorizada mediante análisis citométrico de flujo con un anticuerpo anti-CD45R FITC (Pharmingen) . Las preparaciones de células B fueron típicamente más de 90% puras. C. Proliferación de células B estimuladas con anti-CD40 en presencia de IL-21 humana o murina Las células B provenientes de la fuente humana o de ratón fueron resuspendidas a una concentración final de 1 x 106 células/ml en el medio de células B, y sembradas en placa a 100 µ?/???? en una placa de fondo en forma de U de 96 pozos (Falcon, VWR) que contenía diversas condiciones de estimulación, para llevar el volumen final a 200 µ?/????. Para la estimulación con anti-CD40, los cultivos humanos fueron suplementados con 1 µ9/p?. de CD40 anti-humano (Genzyme, Cambridge, MA.) y los cultivos de ratón fueron resuspendidos con 1 µg/ml de CD40 anti-murino (Serotec, UK) . La IL-21 humana o murina fue agregada a diluciones en el intervalo de 1 pg/ml-100 ng/ml . La especificidad del efecto de IL-21 fue confirmada por la inhibición de IL-21 con 25 mg/ml de zalfallCEE soluble (Ejemplo 10A) . Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado. Las células fueron luego incubadas a 37°C en una incubadora humidificada por 120 horas (humano) o 72 horas (ratón) . 16 horas antes de la cosecha, se agregó 1 µ?? de 3H-timidina (Amersham, Piscataway, NJ) a todos los pozos, para evaluar, si las células B habían proliferado. Las células fueron cosechadas en una placa de filtro de 96 pozos (UniFilter GF/C, Packard, Meriden, CT) utilizando un cosechador de células (Packard) y recolectadas de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las placas fueron secadas a 55°C por 20 a 30 minutos y el fondo de los pozos fue sellado con un sellador de placas opaco. A cada pozo se agregaron 0.25 mi de fluido de cintilación (Microscint-O, Packard) y la placa fue leída utilizando un Contador de cintilación de Microplacas TopCount (Packard) . La incubación con IL-21 a concentraciones de 3 ng/ml o más, aumentó la proliferación inducida por anti-CD40 soluble de una manera dependiente de la dosis en la células B murinas y humanas por tanto como 30 veces. Las células B murinas y humanas respondieron igualmente también a su respectiva IL-21. En ambas especies, la estimulación fue específica para IL-21, ya que ésta fue revertida por la presencia del receptor de IL-21 soluble en el cultivo. D. Proliferación de las Células B estimuladas con anti-IgM en presencia de IL-21 humana o murina Las células B provenientes de la fuente humana o de ratón como se describió anteriormente (Ejemplo 10A y Ejemplo 10B) fueron sembradas en placas como se describió anteriormente (Ejemplo 10C) . Para la estimulación con anti-IgM de las células humanas, las placas fueron pre-recubiertas toda la noche con 10 mg/ml de los anticuerpos F(ab')2 anti-IgM humana (Southern Biotech Associates, Birmingham, Alabama) y se lavaron con medios estériles justo antes del uso. Los cultivos fueron suplementados con 0-10 ng/ml de rIL-4 humana (R&D Systems, Minneapolis, MN) . Para la estimulación con anti-IgM de las células murinas se agregó anti-IgM soluble (Biosource, Camarillo, CA) a los cultivos a 10 mg/ml. A cada una de las condiciones precedentes con anti-IgM/IL-4, la IL-21 humana o murina fue agregada a diluciones en el intervalo de 1 pg/ml-100 ng/ml como se describió anteriormente. La especificidad del efecto de IL-21 fue confirmada por la inhibición con el receptor de zalfall humano soluble como se describió anteriormente (Ejemplo 10C) . Todos los tratamientos fueron realizados por triplicado. Las células fueron incubadas con 3H-timidina, cosechadas y analizadas como se describe en el Ejemplo 10C. La incubación con IL-21 a concentraciones de 0.3 ng/ml o más inhibió la proliferación inducida por anti-IgM insoluble (ratón) o anti-IgM e IL-4 (humana) de una manera dependiente de la dosis. Esta inhibición fue específica para IL-21 ya que ésta fue revertida por la presencia del receptor de IL-21 soluble en el cultivo.

Ejemplo 11 Efecto de IL-21 Humana sobre las Células B y la Fusión de Saporina Tóxica con IL-21 Los efectos de la IL-21 humana fueron probados sobre la siguientes líneas de células B humanas: y las líneas de células de linfoma de Burkitt humano Raj i (ATCC No. CCL-86) , y Ramos (ATCC No. CRL-1596) ; la línea celular de linfoma de células B EBV humanas RPMI 1788 (ATCC No. CRL-156) ; la línea celular IM-9 de mieloma/plasmacitoma humano (ATCC No. CRL159) ; y la línea DAKIKI de células B transformadas con EBV humanas (ATCC No. TIB-206) y las células HS Sultán (ATCC No. CRL-1484) . Después de aproximadamente 2 a 5 días de tratamiento con IL-21, se encontraron cambios en las líneas celulares I -9, Raji, Ramos y RPMI1788, mostrando que estas células pueden responder a IL-21. Las líneas de células B humanas tratadas con IL-21 se desarrollaron mucho más lentamente que las células no tratadas cuando fueron colocadas en placa nuevamente en cajas de cultivo de células. Estas células también tuvieron una expresión incrementada del ligando FAS, como se evaluó por citometría de flujo (Ejemplo 11D y Ejemplo 11E) , e incrementó moderadamente la sensibilidad a un anticuerpo FAS de activación (Ejemplo 11A) . Estos resultados indican que IL-21 podría controlar algunos tipos de neoplasmas de células B induciéndolas a diferenciarse a un estado menos proliferativo y más sensible al ligando FAS. Además, el receptor de zalfall es expresado sobre la superficie de varias de estas líneas celulares (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). De este modo, IL-21 y el conjugado de IL-21 humana-inmunotoxina saporina (Ejemplo 11B, más adelante) , u otra fusión de IL-21-toxina, podría ser terapéuticamente utilizada en leucemias y linfornas de células B. A. El efecto de IL-21 humana sobre las líneas de células B Células IM-9 fueron sembradas aproximadamente a 50,000 células por mi ± 50 µ9/?ta de IL-21 humana purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). Después de 3 días de desarrollo las células fueron cosechadas, lavadas y contadas, y luego colocadas nuevamente en placa aproximadamente a 2500 células/ml en placas de 96 pozos, dentro de los pozos con 0, 0.033, 0.1 ó 0.33 µ9/?t?1 del anticuerpo anti-FAS (R&D Systems, Minneapolis) . Después de 2 días se realizó un ensayo de fluorescencia de azul Alamar (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) para evaluar la proliferación de las células. Las células IM-9 tratadas con IL-21 se desarrollaron únicamente a 27% de la densidad de las células no tratadas, en ausencia del anticuerpo anti-FAS. En presencia de 0.33 µ9/t?1, el anticuerpo anti-FAS, las células tratadas con IL-21 fueron inhibidas un 52% adicional mientras que las células no tratadas fueron inhibidas únicamente por 30%. La inhibición total del desarrollo celular con IL-21 y 0.33 µ /p? de tratamiento con anticuerpo anti-FAS, fue de 86%.

Cuando las células IM-9 fueron pretratadas por tres días con o sin IL-21 y luego colocadas nuevamente en placa a 100 células por pozo y desarrolladas con o sin anticuerpo anti-FAS por 6 días, el desarrollo de las células no tratadas evaluadas por el ensayo de Azul de Alamar (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) fue inhibida únicamente 25% por el anticuerpo anti-FAS mientras que el desarrollo de las células tratadas con IL-21 fue inhibido 95% con relación al desarrollo de las células no tratadas en cero anticuerpo anti-FAS. B. El efecto de la IL-21 humana-inmunotoxina saporina sobre líneas de células B La construcción y purificación del conjugado de IL-21 humana-inmunotoxina saporina (zalfallL-sap) se describe en el Ejemplo 12. La zalfallL humana-sap fue mucho más potente que la saporina sola en inhibir el desarrollo celular. Cuando las células tratadas son colocadas nuevamente en placa después de un tratamiento de tres o cuatro días, las células tratadas con zalfallL humano-sap se desarrollaron muy pobremente. Las células IM-9, Ramos y K562 (ATCC No. CCL-243) fueron sembradas aproximadamente a 2500 células/pozo en placas de 96 pozos con cero a 250 ng/ml del conjugado zalfallL humano-sap o 0-250 ng/ml de saporina (Stirpe et al., Biotechnology 10: 405-412, 1992) únicamente como un control. Las placas fueron incubadas 4 días, luego se realizó un ensayo de proliferación con Azul Alamar (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). A la concentración máxima del conjugado zalfall-sap humano, el desarrollo de las células IM-9 y las células Ramos fue inhibido por 79% y 65%, respectivamente. Las células K562 que son ba as/negativas por flujo para la expresión del receptor de IL-21, no fueron afectadas por zalfall-sap, mostrando de este modo la especificidad del efecto del conjugado. Las células IM-9 fueron sembradas a 50,000 células/ml en placas de 6 pozos a cero y 50 ng/ml del conjugado zalfall humano-sap. Después de 3 días las células fueron cosechadas y contadas, y luego colocadas nuevamente en placa desde 100 hasta 0.8 células por pozo en diluciones en serie a la mitad, y 12 pozos por dilución celular sin la IL-21 humana-inmunotoxina saporina. Después de 6 días el número de pozos con crecimiento a cada dilución celular fue calificado de acuerdo a los resultados de un ensayo de proliferación con Azul Alamar (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). Cuando el número de células fue evaluado, por el ensayo de azul Alamar (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024), -después de 6 días de desarrollo las células control sembradas aproximadamente a 12.5 y 6.25 células por pozo tuvieron desarrollo equivalente a las células tratadas con zalfall-sap sembradas a 100 y 50 células/pozo, respectivamente. De este modo, el desarrollo de las células IM-9 tratadas, supervivientes, fue notablemente deteriorado incluso después del retiro, mediante la recolocación en placa, de la zalfall-inmunotoxina sap. La distribución tisular limitada del receptor de IL-21 humana (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024 y Publicaciones del WIPO Nos. O01/17235 y WO01/7717) , y la especificidad de acción de la zalfall-sap a las líneas celulares que expresan el receptor, sugieren que este conjugado puede ser tolerado in vivo. C. El efecto de la IL-21 humana-inmunotoxina saporina sobre la viabilidad de la línea de células B Células HS Sultán (ATCC No. CRL-1484) fueron sembradas aproximadamente a 40,000 células por mi en placas de 12 pozos y desarrolladas por cinco días sin citocinas agregadas o 40 ng/ml de IL-21 humana purificada (6 humana purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) o 25 ng/ml del conjugado zalfallL-sap (Ejemplo 12, más adelante) o con 20 ng/ml de IFN-alfa (RDI) o IL-21 e IFN-alfa. IL-21 inhibió el desarrollo de las células Sultán por 63%. IFN-alfa inhibió el desarrollo en un 38%. IL-21 más IFN-alfa inhibió el desarrollo en un 78%, indicando que los efectos inhibitorios del crecimiento de IL-21 humana e IFN-alfa puede ser aditivo, zalfallL-humana-sap inhibió el desarrollo de las células Hs Sultán por 92%. Los resultados anteriores apoyan el posible uso de IL-21 o zalf llL-humana-sap en el tratamiento de malignidades u otras enfermedades que expresan el receptor de zalfall, particularmente aquellas de origen de células B. La combinación de IL-21 con IFN-alfa es específicamente sugerida por su efecto aditivo en la inhibición de las células HS Sult n. Algunos otros tipos de malignidades linfoides y enfermedades pueden también expresar el receptor de IL-21, ya que las células T activadas también expresan el ARNm del receptor (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024 y Publicaciones del WIPO WOOl/17235 y WO01/7717) y algunas de estas enfermedades pueden también responder a IL-21 de la terapia de fusión con IL-21-tóxico. D. La Expresión de FAS (CD95) sobre Líneas de Células B humanas es incrementada por la Estimulación con IL-21 humana Líneas de células B humanas HS Sultán (ATCC No. CRL-1484), I -9 (ATCC No. CRL159) , RPMI 8226 (ATCC No. CCL-15) , RAMOS (ATCC No. CRL-1596) , DAKIKI (ATCC No. TIB-206) , y RPMI 1788 (ATCC No. CRL-156) , fueron todas tratadas con o sin 10 a 50 ng/ml de IL-21 humana (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) por 2 a 8 días. Las células fueron luego teñidas con el anticuerpo anti-CD95 conjugado a PE (PharMingen, San Diego, CA) , siguiendo el protocolo del fabricante, y analizadas sobre un FACSCalibur (Becton Dickinson, San José, CA) . En todas las líneas celulares, la tinción con anti-CD95 (FAS o APO-1) fue incrementada, en algunos casos más de dos veces, después del tratamiento con IL-21 humana.

E. La Expresión de FAS (CD95) sobre Células B de Bazo de Ratón Primarias es Incrementada por la Estimulación con IL-21 Humana Se obtuvieron esplenocitos primarios de ratón mediante desmenuzamiento de los bazos provenientes de ratones C57/BL6 de 8 a 12 semanas de edad. Los eritrocitos fueron lisados mediante tratamiento de la preparación por 5 segundos con agua y luego pasados a través de un tamiz de 70 micrómetros. Los esplenocitos remanentes fueron lavados y colocados en placa en RMPI (JRH Bioscience) más 10% de HIA-FBS (Hyclone, Logan, UT) . IL-2 (R & D Systems) con o sin IL-21 humana, como se describió anteriormente. Estas fueron luego incubadas a 37°C, en 5% de C02 por 5 días Los esplenocitos fueron cosechados y teñidos con el anticuerpo anti-CD95 conjugado a PE (PharMingen) y el anticuerpo anti-CD19 conjugado a FITC (PharMingen) siguiendo el protocolo del fabricante. Las células fueron analizadas mediante citometría de flujo sobre un FACSCalibur (Becton Dickinson) . Después de la entrada sobre las células B de ratón CD19+, se encontró que la tinción con anti-CD95 fue incrementada sobre las células B tratadas con IL-2 más IL-21 humana, en comparación a aquellas en IL-2 sola. La tinción con anti-CD95 fue de 37 unidades fluorescentes relativas (RFU) sobre las células B en IL-2 solo y de 55 RFU sobre las células B cultivadas en IL-2 e IL-21 humana.

Ejemplo 12 Construcción y Purificación de la Fusión Tóxica con IL- 21 Bajo un contrato de suministro, 10 mg de IL-21 humana (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) fueron enviados a Advanced Targeting Systems (ATS, San Diego, CA) para la conjugación a la toxina saporina vegetal (Stirpe et al., Biotechnology 10: 405-412, 1992) . ZymoGenetics recibió de ATS 1.3 mg de un conjugado de proteína comprendido de 1.1 moléculas de saporina por molécula de IL-21 humana, formulada a una concentración de 1.14 mg/ml en fosfato de sodio 20 nM, cloruro de sodio 300 nM, pH 7.2. Ejemplo 13 Fusión Tóxica de IL-21 in vivo A. Conjugado IL-21-saporina de prueba en ratones El conjugado IL-21-saporina (Ejemplo 11) fue administrado a ratones C57BL6 (hembras, de 12 semanas de edad, adquiridas de Taconic) a dos diferentes dosis: 0.5 y 0.05 mg/kg. Se administraron inyecciones intravenosas en vehículo consistente de 0.1% de BSA (ICN, Costa Mesa, CA) . Se administraron tres inyecciones en un periodo de una semana (días 0, 2 y 7) . Las muestras de sangre fueron tomadas de los ratones en el día 0 (pre-inyección) y en los días 2 y 8 (post-inyección) . La sangre fue recolectada en tubos heparinizados (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ) , y las cuentas celulares fueron determinadas utilizando un analizador de hematología automático (Abbot Cell-Dyn Modelo No. CD-3500CS, Abbot Park, IL) . Los animales fueron sacrificados y se les realizaron necropsias en el día 8 después de la recolección de la sangre. El bazo, el timo, el hígado, el riñon y la médula ósea fueron recolectados para la histopatología . El bazo y el timo fueron pesados, y se recolectó una muestra adicional de sangre en tubos separadores de suero . El suero fue enviado a Phoenix Central Labs, Everett, WA, para la prueba en un panel de química estándar. Las muestras fueron también recolectadas para el análisis citométrico de flujo como se describe en la presente . El conteo de células sanguíneas circulantes y las mediciones de la química del suero no difirieron significativamente entre los ratones tratados con el conjugado de IL-21 y los ratones tratados con una dosis equivalente de la toxina no conjugada (saporina) . El análisis histológico de los tejidos en los ratones tratados con IL-21-saporina no mostró cambios significativos con relación a los ratones tratados con una dosis equivalente de la toxina no conjugada. Estos resultados indicaron que el conjugado de saporina no fue tóxico in vivo. B. Prueba de la fusión de saporina tóxica con IL-21 sobre tumores derivados de células B in vivo Los efectos de la IL-21 humana y la fusión de la IL-21 humana con la saporina tóxica (Ejemplo 12) sobre las células tumorales humanas, son probados in vivo utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón descrito en la presente. Los modelos de xenoinjerto son inicialmente probados utilizando las líneas celulares seleccionadas con base en los experimentos in vitro, tales como aquellos descritos en el Ejemplo 11. Estas líneas celulares incluyen, pero no están limitadas a: líneas de células de linfoma de Burkitt humano Raji (ATCC No. CCL-86) ; y Ramos (ATCC no. CRL-1596) ; la línea de células humanas RPMI 1788 (ATCC No. CRL-156) ; la línea celular IM-9 de mieloma/plasmacitoma humano (ATCC No. CRL159) ; la línea de células humanas DAKIKI (ATCC No. TIB-206) , y las células HS Sultán (ATCC No. CRL-1484) . Las células derivadas directamente de los tumores humanos pueden también ser utilizadas en este tipo de modelo. De esta manera, la selección de las muestras de pacientes para la sensibilidad para el tratamiento con IL-21 o con una fusión de saporina tóxica con IL-21, pueden ser utilizadas para seleccionar las indicaciones óptimas para el uso de zalfall en la terapia anticancerosa . Después de la selección del xenoinjerto apropiado en el modelo in vivo, la actividad inducida por IL-21 de las células asesinas naturales y/o los efectos de IL-21 sobre los tumores derivados de las células B, son evaluados in vivo. La IL-21 humana es probada para su habilidad de generar células efectoras citotóxicas (por ejemplo células NK) con actividad contra los tumores derivados de células B utilizando los modelos de xenoinjerto de tumor de ratón descritos en la presente. Además, pueden ser evaluados los efectos directos de la IL-21 humana sobre tumores. Los modelos de xenoinjerto que van a ser llevados a cabo son seleccionados como se describe anteriormente. Se desarrolló un protocolo utilizando las células humanas estimuladas con IL-21, y probadas para la eficacia en células tumorales en agotamiento y promoción de la supervivencia en ratones inoculados con líneas celulares o tumores primarios . Ejemplo 14 Evaluación Preliminar de la Estabilidad Acuosa de IL-21 Humana Se condujeron estudios preliminares para evaluar las características de estabilidad acuosa de la IL-21 humana en el apoyo del bioprocesamiento, la formulación y la administración in vivo. Los objetivos fueron: 1) verificar la estabilidad y la recuperación a partir de Minimombas Alzet y almacenamiento general y manejo, 2) determinar la naturaleza indicadora de la estabilidad de varios métodos analíticos incluyendo la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC por sus siglas en inglés) de intercambio catiónico (CX-HPLC por sus siglas en inglés) , HPLC de fase inversa (RP-HPLC por sus siglas en inglés) , HPLC de exclusión de tamaño (SEC-HPLC por sus siglas en inglés) , y bioensayo (proliferación de BaF3/azalfallR (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024)), y 3) determinar las vías de degradación limitantes de la estabilidad y sus dependencias cinéticas. Alícuotas de IL-21 humana purificada (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) fueron preparadas mediante dilución a 2 mg/ml en PBS (pH 7.4) y almacenadas en criofrascos de polietileno de baja densidad (LDPE) (Nalgene, 1.8 mi) a -80°C (control), 5°C, 30°C y 37°C. Las muestras fueron evaluadas intermitentemente en 29 días por CX-, RP-, SEC-HPLC y bioensayo. Las alícuotas fueron también almacenadas a -80°C y sometidas a ciclos de congelamiento-descongelamiento (f/t por sus siglas en ingles) ( -80°C/temperatura ambiente; 5X f/t, 10X f/t) . La recuperación de la IL-21 humana fue determinada con relación al control a -80°C (1 f/t) en todos los ensayos . La solución de IL-21 humana remanente proveniente de las muestras control a -80°C fue recongelada (-80°C) después del análisis. Esta alícuota (2 f/t) fue utilizada para evaluar la estabilidad térmica y conformacional de la IL-21 humana, como una función del pH utilizando dicroismo circular (CD) . La solución de 2 mg/ml fue diluida hasta 100 µg/ml en amortiguadores de PBS en el intervalo de pH 3.3 a 8.8. Los espectros CD de UV lejano fueron monitorizados sobre el intervalo de temperatura de 5 a 90°C en intervalos de 5°C (n=3/pH) . El espectropolarímetro de CD utilizado fue un Jasco 715 (Jasco, Easton, MD) . El desplegamiento térmico fue monitorizado mediante cambios en la elipticidad a 222 nm como una función de la temperatura. Los estimados de la Tm fueron estimados asumiendo un modelo de desplegamiento de dos estados. Los datos fueron ajustados (sigmoidal) utilizando Slide rite Plus para Windows v4.1 (Advanced Graphics Software; Encinitas, CA) . La recuperación y estabilidad a partir de Minibombas Alzet (Modelo No. 1007D; ALZA Corporation, Mountan View, CA) fue evaluada mediante el relleno de las bombas con 100 µ? de una solución de IL-21 humana a 2 mg/ml, colocando las bombas en 1.8 mi de LDPE que contenía 1 mi de PBS (pH 7.4), y almacenándolas a 37°C. La liberación/recuperación de la IL-21 humana a partir de las minibombas fue evaluada mediante CX- , RP- y SEC-HPLC en los días 2, 4 y 7. La actividad fue evaluada mediante bioensayo en el día 7. El estudio fue diseñado para evaluar la liberación a partir de 3 bombas por tiempo de muestreo . Los datos cromatográficos sugirieron que los métodos de CX- y SEC-HPLC fueron indicadores de la estabilidad, mientras que el método de RP-HPLC no lo fue. Al menos 3 picos adicionales que indican productos de degradación aparentes fueron observados por CX-HPLC. El método de SEC-HPLC resolvió un agregado de IL-21 humana aparente, eluyendo antes de la IL- 21 humana. No obstante, no fueron observados picos adicionales significativos eluyendo después del pico de IL-21 humana. Esto sugiere que los productos de degradación observados por CX-HPLC más probablemente resultan de las modificaciones de los aminoácidos tales como la desamidación, en vez de los procesos de hidrólisis/proteólisis que conducen a las variantes recortadas. Un grado pequeño de frente/cola fue observado por RP-HPLC (relativo al control) en las muestras que habían mostrado que habían sufrido degradación significativa por SEC-y CX-HPLC. No obstante, los productos de degradación aparentes no fueron resueltos por RP-HPLC. La degradación observada por CX-HPLC se incrementó como una función del tiempo-temperatura, y siguió la cinética de primer orden aparente. El porcentaje de IL-21 humana recuperada por CX-HPLC después de 29 días a 37°C, 30°C y 5°C fue de 39%, 63% y 98%, respec ivamente. La agregación fue también incrementada de una manera dependiente del tiempo- emperatura. El porcentaje de agregado encontrado en las preparaciones almacenadas por 29 días a 37°C, 30°C y 5°C fue de 7.4, 3.4 y por debajo de los límites detectables (BDL) , respectivamente. No se observaron diferencias significativas por el bioensayo en ninguna muestra, sugiriendo que los productos de degradación tienen actividad equivalente a IL-21 humana intacta. No se observó degradación por ningún ensayo en las muestras sometidas hasta 10 ciclos de f/t. La liberación de IL-21 humana de las inibombas Alzet fue consistente con la liberación volumétrica esperada teórica. Esto sugiere que la adsorción superficial significativa podría no deteriorar la distribución de IL-21 humana utilizando las Minibombas Alzet con una concentración de relleno de 2 mg/ml . Se observó la degradación consistente con aquella previamente notada. El porcentaje de pureza determinado por CX-HPLC de IL-21 humana liberada después de 2, 4 y 7 días fue de 96%, 90% y 79%, respectivamente. Se debe reconocer que la degradación también ocurre después de que la IL-21 humana es liberada dentro o diluida con el medio de liberación. Por lo tanto, el porcentaje de pureza dentro de la minibomba puede ser algo diferente que aquel determinado para estar en el medio de liberación. La bioactividad de cada muestra fue consistente con la cantidad esperada de la IL-21 humana liberada de las minibombas. Los espectros de CD de UV lejano de la IL-21 humana, como se esperaba, fueron consistentes con las intervenciones, tales como IL-3 (J". Biochem. , 23: 352-360, 1991), IL-4 (Biochemistry, 30: 1259-1264, 1991), y los mutantes de IL-6 (Biochemistry, 35: 11503-11511, 1996). no fueron observados cambios notables en los espectros de CD de UV lejano como una función del pH. Los resultados mostraron que el pH de la estabilidad térmica máxima/conformacional fue aproximadamente pH 7.4. El análisis de las curvas de desplegamiento estuvo basado en un mecanismo de desplegamiento de dos estados, para permitir la comparación de la estabilidad térmica/conformacional como una función del pH/composición. No obstante, uno o más intermediarios pueden existir durante el proceso de desplegamiento, ya que la cooperatividad fue relativamente baja, con base en la poca profundidad de la curva de desplegamiento. Aunque los estudios no fueron específicamente diseñados para determinar si la IL-21 humana se repliega después del desplegamiento térmico a 90 °c, los datos preliminares sugieren que ocurre al menos el replegamiento parcial después de que la temperatura de la muestra es enfriada hasta 20°C. Estos estudios permiten que sea identificado un paradigma analítico para evaluar la pureza y para identificar la estabilidad de la IL-21 humana. Por ejemplo, puede ser utilizada SEC-HPLC para caracterizar el grado y la proporción de agregación en la solución acuosa. De igual modo, CX-HPLC puede ser utilizada para caracterizar el grado y la velocidad de degradación de la IL-21 humana mediante mecanismos diferentes de la agregación. El bioensayo puede ser utilizado para verificar la actividad de la IL-21 humana, y sus productos de degradación acuosa. Por ejemplo, las variantes de IL-21 humana, generadas en la solución acuosa y resueltas por CX-HPLC, pueden ser por sí mismas útiles como agentes terapéuticos, ya que éstos tienen bioactividad equivalente. También, el hecho de que la IL-21 humana sea degradada por varios procesos diferentes (agregación, modificaciones de aminoácidos) , sugiere una formulación preferida o única que reduce al mínimo la velocidad de cada proceso de degradación, y puede ser necesaria para la estabilidad a largo plazo de un producto en solución. La identificación de la naturaleza de los productos de degradación acuosa y la determinación de sus dependencias cinéticas (pH, concentración, excipientes) está en camino. La estabilidad de IL-21 humana en suero/plasma es determinada para apoyar el diseño e interpretación de los estudios in vivo. Ejemplo 15 Efecto de IL-21 sobre los Tumores Derivados de Células B in vivo A. Infusión de IL-21 utilizando bombas mini-osmóticas La administración de IL-21 por infusión constante vía las bombas mini-osmóticas dio como resultado concentraciones séricas en estado de reposo proporcionales a la concentración de la IL-21 contenida en la bomba. 0.22 mi de IL-21 humana (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) contenidos en la solución salina amortiguada con fosfato (pH 6.0) a una concentración de 2 mg/ml o 0.2 mg/ml se cargó bajo condiciones estériles dentro de las bombas mini-osmóticas (modelo 2004; Alza Corporation Palo Alto, CA) . Las bombas fueron implantadas subcutáneamente en ratones a través de una incisión de 1 cm en la piel dorsal, y la piel fue cerrada con cierres estériles para heridas. Estas bombas son diseñadas para distribuir contenidos a una velocidad de 0.25 µ? por hora en un periodo de 28 días. Este método de administración dio como resultado incremento significativo en la supervivencia en ratones inyectados con células tumorales (ver más adelante) . B. Efecto de IL-21 sobre los tumores derivados de células B in vivo Se probaron in vivo los efectos de IL-21 humana (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) utilizando un modelo de xenoinjerto de tumor de ratón descrito en la presente. Los modelos de xenoinjerto probados fueron la línea celular linfoblastoide humana IM-9 (ATCC No. CRL159) . Ratones C. B-17 SCID (hembras C.B-17/IcrHsd-scid; Harían, Indianápolis, Indiana) fueron divididos en 4 grupos. En el día 0, las células IM-9 (ATCC No. CRL159) fueron cosechadas del cultivo e inyectadas intravenosamente, por medio de la vena de la cola, a todos los ratones (aproximadamente 1,000,000 células por ratón) . En el día 1, las bombas mini-osmóticas que contenían el artículo de prueba o el artículo control fueron implantadas subcutáneamente en los ratones. Los ratones en los grupos 1-3 (ri=9 por grupo) fueron tratados con concentraciones cada vez' mayores de IL-21: el grupo 1 contenía 2.0 mg/ml de IL-21 humana y distribuyó 12 µg por día; el grupo 2 contenía 0.2 mg/ml de IL-21 humana y distribuyó 1.2 g por día; el grupo 3 contenía 0.02 mg/ml de IL-21 humana y distribuyó 0.12 µg por día. Los ratones en el grupo 4 (n=9) fueron un control y fueron tratados con vehículo (PBS pH 6.0) . Los ratones tratados ya sea con 12 µ<3/??? o 1.2 µ9/^?3 de infusión de IL-21, tuvieron supervivencia incrementada en comparación a los ratones tratados con vehículo (p<0.0001 y p<0.005 para 12 µ9/^?3 o 1.2 µg/día versus el vehículo, respectivamente, utilizando las pruebas de rango logarítmico de la función de supervivencia) . Los ratones en el grupo de dosis de 0.12 µg/día tuvieron supervivencia no diferente de los ratones en el grupo tratado con vehículo. Estos resultados mostraron que IL-21 redujo significativamente los efectos de las células tumorales de células B in vivo, dando como resultado significativamente supervivencia incrementada. Ejemplo 6 Efectos anti-tumorales in vivo de IL-21 en los Modelos de Melanoma B16-F10 y de Timoma EG.7 A. Efecto de IL-21 murina sobre el desarrollo de la metástasis de melanoma B16-F10 in vivo Ratones (hembras, C57B16, de 9 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) se dividieron en tres grupos. En el día 0, células de melanoma B16-F10 (ATCC No. CRL-6475) fueron cosechadas del cultivo e inyectadas intravenosamente, vía la vena de la cola, a todos los ratones (aproximadamente 100,000 células por ratón) . Los ratones fueron luego tratados con el artículo de prueba o el vehículo asociado, mediante inyección intraperitoneal de 0.1 mi de la solución indicada. Los ratones en el primer grupo (n=24) fueron tratados con el vehículo (PBS pH 6.0), el cual se inyectó en el día 0, 2, 4, 6 y 8. Los ratones en el segundo grupo (n=24) fueron tratados con IL-21 murina (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) la cual se inyectó a una dosis de 75 µg en el día 0, 2, 4, 6 y 8. Los ratones en el tercer grupo (n=12) fueron tratados con IL-21 murina, la cual fue inyectada a una dosis de 75 µg diariamente desde el día 0 hasta el día 9. Todos los ratones fueron sacrificados en el día 18, y los pulmones fueron recolectados para la cuantificación del tumor. Los focos de crecimiento tumoral mayores de 0.5 mm de diámetro fueron contados sobre todas las superficies de cada lóbulo pulmonar. En ambos grupos de ratones tratados con IL-21 murina, el número promedio de focos tumorales presentes en los pulmones fue significativamente reducido, en comparación a los ratones tratados con vehículo. Los ratones tratados más frecuentemente (por ejemplo diariamente) tuvieron menos focos tumorales que los ratones tratados en días alternados, aunque esto no fue un hallazgo estadísticamente significativo entre estos dos grupos . Estos resultados indicaron que el tratamiento con IL-21 murina retardó ya sea el crecimiento de melanoma B16 o aumentó la habilidad del sistema inmune para destruir las células tumorales. Los efectos del tratamiento sobre las células tumorales fueron probablemente mediados a través de las células del sistema inmune (por ejemplo linfocitos, células NK) , que sí poseen receptores para IL-21, tales como, por ejemplo, el receptor de IL-21 y zalfall/IL-2Ry (Publicaciones del WIPO Nos. WO01/17235 y WOOl/7717) y se sabe que están asociados con la actividad antitumoral. B. Efecto de IL-21 murina sobre el desarrollo de timoma EG.7 in vivo Ratones (hembra, C57B16, de 9 semanas de edad; Charles Ri er Labs, Kingston, NY) se dividieron en tres grupos. En el día 0, las células EG.7 (ATCC No. CRL-2113) se cosecharon del cultivo y se inyectaron 1,000,000 de células intraperitonealmente en todos los ratones . Los ratones fueron luego tratados con el artículo de prueba o el vehículo asociado, mediante inyección intraperitoneal de 0.1 mi de la solución indicada. Los ratones en el primer grupo (n=6) fueron tratados con vehículo (PBS pH 6.0), que se inyectó en el día 0, 2, 4 y 6. Los ratones en el segundo grupo (n=6) fueron tratados con IL-21 murina (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024), que se inyectó a una dosis de 10 g en el día 0, 2, 4 y 6. Los ratones en el tercer grupo (n=6) fueron tratados con IL-21 murina, que se inyectó a una dosis de 75 µg en el día 0, 2, 4 y 6. En ambos grupos de ratones tratados con IL-21 murina, el tiempo de supervivencia fue significativamente incrementado, en comparación a los ratones tratados con vehículo. El grupo tratado con dosis de 75 µ9 de IL-21 tuvo significativamente mayor supervivencia que el grupo tratado con dosis de 10 µg y 33% (2/6 ratones) de este grupo sobrevivieron más de 70 días. Una porción adicional de este estudio probó el efecto de las mismas dosis llevadas a cabo hasta el día 12. Los resultados fueron muy similares al esquema de dosificación más corto, con ambas dosis que tenían supervivencia significativamente incrementada sobre el tratamiento con vehículo, y la más alta dosis dio la mejor respuesta (50% de supervivencia más allá de los 70 días) . En algunos experimentos, se inyectaron aproximadamente 4,000,000 de células T OT-I intraperitonealmente en los ratones en el día previo al día 0. Los ratones fueron luego tratados con IL-21 o vehículo como se describió anteriormente. La presencia de las células T OT-I no tuvo efecto sobre el tiempo de supervivencia de los ratones tratados con vehículo. En ratones tratados con IL-21, la presencia de las células T OT-I aumentó el tiempo de supervivencia en comparación a los ratones tratados con IL-21 sola. Estos resultados indicaron que el tratamiento con IL-21 murina retardó ya sea el crecimiento de los tumores EG.7 o bien aumentó la habilidad del sistema inmune para destruir las células tumorales. El incremento en la supervivencia, conferido por las células T OT-I en presencia del tratamiento con IL-21, sugiere que IL-21 está activando a las células efectoras del sistema inmune. Ejemplo 17 Efectos de IL-21 sobre las Citocinas en Suero y la Fuga Vascular A. Análisis de IL-21 sobre las Citocinas en Suero La terapia con IL-2 es efectiva en el tratamiento de ciertos cánceres. No obstante, el uso de IL-21 como un agente terapéutico ha estado limitado por sus efectos tóxicos, a saber el síndrome de fuga vascular (VLS) . VLS inducido por IL-2 está caracterizado por la infiltración de linfocitos, monocitos y neutrófilos hacia el pulmón, provocando daño endotelial en el pulmón, conduciendo tarde o temprano a fuga vascular (revisado en Lentsch AB et al., Cáncer Immunol . Immunother., 47: 243, 1999). VLS en los ratones puede ser inducido con la administración de altas dosis repetidas de IL-2 y midiendo la fuga vascular mediante la captación de Azul de Evans por el pulmón. Otros parámetros que han mostrado ser característicos de VLS en ratones, incluyen los niveles séricos incrementados de TNFa e IFNy (Anderson JA et al., J. Clin Invest. 97: 1952, 1996) así como los números incrementados de células T activadas, NK y monocitos en diversos órganos. El bloqueo de TNFa con una molécula TNFR-Fc soluble inhibió la infiltración pulmonar por los linfocitos y por lo tanto el daño pulmonar (Dubinett SM et al . , Cell .

Immunol. 157: 170, 1994). El objetivo fue comparar la habilidad de IL-2 e IL-21 para inducir VLS en ratones, y para medir los diferentes parámetros indicadores de VLS (captación de Azul de Evans, análisis de citocina en suero, fenotipo celular del bazo) . Ratones (hembra, C57B16, de 11 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) fueron divididos en cinco grupos. Todos los grupos contenían 11 ratones por grupo. Los grupos son como sigue: Grupo I o grupo con vehículo recibieron Solución Salina Amortiguada con Fosfato (PBS) ; los Grupos II y III recibieron IL-2, a 0.6 o 1.8 millones de Ul/inyección, respectivamente; los Grupos IV y V recibieron IL-21 de ratón (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) o 100 µg/inyección respectivamente. El estudio consistió de 4 días, el peso corporal fue medido diariamente y los animales recibieron 7 inyecciones intraperitoneales de la sustancia de prueba en el periodo de 4 días . Los animales recibieron dos inyecciones diarias en el día 1-3 y en el cuarto día recibieron una inyección matutina simple. Dos horas después de la inyección final los animales recibieron una inyección en la vena de la cola de Azul de Evans al 1% (0.2 mi) . Dos horas después de la inyección del Azul de Evans los ratones fueron anestesiados con isoflurano y se extrajo sangre y se realizó el análisis de la citocina en suero. Después de la extracción de la sangre los animales fueron prefundidos transcardiacamente con solución salina heparinizada (25 U hep/ml de solución salina) . Después de la perfusión, el bazo fue retirado y pesado, el hígado y el pulmón fueron retirados y colocados en 10 mi de formamida por 24 horas de incubación a temperatura ambiente. Después de 24 horas de incubación se cuantificó la fuga vascular mediante extravasación del Azul de Evans vía la medición de la absorbancia del sobrenadante a 650 nm utilizando un espectrofotómetro . Los ratones fueron sangrados y el suero se separó utilizando un tubo estándar separador de suero. 25 µ? de los sueros de cada animal se utilizaron en un ensayo de Arreglo de Esferas de Citocina de Becton Dickinson (BD) (Equipo CBA Thl/Th2 de Ratón) . El ensayo fue realizado siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, 25 µ? de suero fueron incubados con 25 µ? de la mezcla de esferas (IL-2, IL-4, IL-5, TNFa e IFNy) y 25 µ? del reactivo de detección de PE por dos horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Un grupo de estándares de citocina a diluciones en el intervalo de 0 a 5000 pg/ml fue también establecido con las esferas siguiendo las instrucciones del fabricante. Las esferas incubadas fueron lavadas una vez en amortiguador de lavado y los datos adquiridos utilizando un FACScan BD siguiendo las instrucciones descritas en el equipo. Los datos fueron analizados utilizando el Software del Arreglo de Esferas Cítométricas BD (BD Biosciences, San Diego, CA) .

El análisis de citocina en suero utilizando el equipo de citocina CBA (Becton Dickinson, San Diego, CA) no mostró incrementos en los niveles de IL-2, IL-4, IL-5, IFNy o TNFa en los grupos tratados con el control de PBS. Existió un incremento dependiente de la dosis en los niveles de IL-5, IFNy y TNFa en sueros provenientes de ratones tratados con IL-2. No existió incremento en los niveles de las 5 citocinas medidas en el suero de los ratones tratados con IL-21. Los niveles de citocina en la más alta dosis de IL-21 se asemejaron a aquellos de los animales tratados con PBS. Esto muestra que de manera contraria al tratamiento con IL-2 que conduce al incremento en los niveles séricos de las citocinas inflamatorias IL-5, TNFa e IFNy, el tratamiento con IL-21 no tiene ningún efecto sobre estas citocinas inflamatorias. Los resultados de un experimento representativo se dan en la Tabla 6. Todas las concentraciones son expresadas en pg/ml fueron un promedio de 4 animales/grupo.

Tabla 6 Como se muestra en la Tabla 5 anterior, el tratamiento de ratones con IL-2 dio como resultado un incremento dramático en las citocinas inflamatorias en suero, a saber IL-5, IFNy y TNFa. El tratamiento de los ratones con IL-21 no mostró ningún incremento en los niveles de citocina por arriba de los ratones tratados con PBS. Estos resultados muestran que incluso a las más altas dosis, IL-21 no suprarregula las citocinas inflamatorias y su efecto sobre las células in vivo es diferente de IL-2. El tratamiento de ratones con una dosis alta repetida de IL-2 dio como resultado niveles séricos incrementados de IL-5, IFNy y TNFa. Estas citocinas pro-inflamatorias han mostrado que juegan un papel en VLS asociado por la toxicidad de IL-2. El bloqueo de T Fcc dio como resultado infiltración disminuida de linfocitos hacia los pulmones, y daño pulmonar disminuido asociado con la toxicidad de IL-2 (Dubinett S et al., 1994, Cell. Immunol . 157: 170). El tratamiento con IL-21 no tuvo efectos sobre los niveles de IL-5, TNFa o IFNy en suero. Esto sugiere que IL-21 actúe de manera diferente que IL-2 in vivo, y que la falta de citocinas pro-inflamatorias en sueros de ratones tratados con IL-21, puede indicar la menor toxicidad de IL-21 en comparación a IL-2. B. Análisis de IL-21 sobre la inmunofenotipificación de la fuga vascular de células esplénicas El síndrome de fuga vascular (VLS, por sus siglas en inglés) inducido por IL-2, involucra daño a los órganos, que ocurre al nivel del endotelio post-capilar. No obstante, este daño ocurre secundario a dos procesos patológicos distintos: el desarrollo de VLS, y la migración transendotelial de los linfocitos. El daño agudo a órganos es mediado por neutrófilos de infiltración, mientras que el daño crónico a órganos es mediado por los monocitos y linfocitos de infiltración (revisado en Lentsch AB et al., supra) . En ratones, el agotamiento de las células con fenotipos superficiales característicos de LAK o las células NK, mejora el daño a los órganos (Anderson TD et al., Lab. Invest . 59: 598, 1998; Gately, MK et al. J. Immunol., 141: 189, 1988). Números incrementados de células NK y monocitos es por lo tanto un marcador para los efectos celulares mediados por IL-2 de VLS. Además, IL-2 suprarregula directamente la expresión de las moléculas de adhesión (por ejemplo LFA-1, VLA-4 e ICAM-1) sobre los linfocitos y monocítos (Anderson JA et al., supra) . Se piensa que este incremento hace posible que las células se enlacen a las células endoteliales activadas y ayuden a la transmigración de las células al tejido. La expresión incrementada de estas moléculas es considerada otro marcador de la activación celular inducida por IL-2, durante VLS. El objetivo de este estudio fue estudiar las células esplénicas provenientes de ratones tratados con IL-2 e IL-21 bajo un protocolo de VLS, y comparar los efectos de las dos citocinas para mediar los efectos celulares asociados con VLS. Grupos de ratones C57BL/6 de igual edad y sexo, tratados y descritos anteriormente (Ejemplo 17A) fueron analizados. En el día 4, los ratones fueron sacrificados y se estudió el fenotipo de las poblaciones de células esplénicas mediante citometría de flujo estándar. El peso del bazo y la celularidad fueron dramáticamente incrementados en ratones tratados con IL-2 en comparación a ratones tratados con PBS . Los ratones tratados con IL-21 tuvieron un ligero incremento en los pesos esplénicos (a las mayores dosis) pero ningún incremento significativo en la celularidad esplénica en comparación a los grupos tratados con PBS. El análisis de la población celular mostró un incremento significativo en el porcentaje y número de NK, NKT y monocitos en ratones tratados con IL-2, pero no en los ratones tratados con IL-21. Además, existió un incremento dramático dependiente de la dosis en las células que expresan LFA-1, en los grupos tratados con IL-2, en comparación a los controles con PBS . El tratamiento con IL-21 no tuvo efecto sobre la expresión de LFA-1 sobre las células esplénicas . Los bazos fueron aislados de los ratones provenientes de los diversos grupos. Las células sanguíneas rojas fueron lisadas mediante incubación de las células por 4 minutos en amortiguador de lisis ACK (cloruro de amonio 0.15 M, carbonato ácido de potasio 1 m , EDTA 0.1 mM) seguido por la neutralización en medio PMI-10 (RPMI con 10% de FBS) . La expresión de los marcadores de la superficie celular fue analizada mediante la citometría de flujo estándar de tres colores. Todos los anticuerpos fueron obtenidos de BD Pharmingen (San Diego, CA) . CDlla conjugado a isotiocianato de fluoresceína (FITC) (LFA-1), CD49d (VLA-4, cadena a), Gr-I FITC, CD4 conjugado a ficoeritrina (PE), NK1.1, CDllb y CD8 conjugada a CyC, CD3 y B220 se utilizaron para teñir células. 1-3 x 106 células fueron utilizadas para las tinciones individuales. El enlace no específico fue bloqueado mediante-la incubación de las células en el amortiguador de bloqueo (PBS, 10% de FBS, 20 g/ml de 2.4 G2) . Después del bloqueo, las células fueron incubadas con anticuerpos primarios por 20 minutos. A no ser que se especifique de otro modo, todos los anticuerpos monoclonales fueron utilizados a 1 en un volumen de 100 µ? . Las células fueron lavadas una vez en IX PBS y resuspendidas en PBS antes de ser adquiridas utilizando los instrumentos FACScan o FACSCalibur (BD Biosciences, San Diego, CA) .. Son analizados los datos utilizando el Software Cellquest (BD Biosciences) . Los ratones tratados con IL-2 tuvieron pesos del bazo significativamente incrementados en comparación a los grupos tratados con PBS (Tabla 7 más adelante) . Los ratones tratados con IL-21 tuvieron un incremento significativo en el peso del bazo sobre los controles. No obstante, los incrementos en los grupos tratados con IL-21 fueron significativamente menores que los grupos tratados con IL-2 (p=0.0002). El incremento en los pesos del bazo en ambos grupos fue dependiente de la dosis. La Tabla 7 siguiente muestra los grupos de tratamiento; los pesos esplénicos promedio fueron mostrados en mg, y n=4. Tabla 7 Peso total Desviación Valor p del bazo (mg) estándar (versus PBS) PBS 63.5 9.7 0 •IL-2 (0.6) 177.5 17.8 <0.0001 IL-2 (1.8) 204.25 10 <0.0001 IL-2 (3.6) 231.2 9.6 <0.0001 IL-21 (33) 92.8 6 0.0022 IL-21 (100) 117.6 19.3 0.0024 IL-21 (200) 125.85 33 0.0111 Los datos de celularidad esplénica promedio son mostrados en la Tabla 8 siguiente (n=4). El tratamiento con IL-2 a más alta dosis incrementó la celularidad esplénica significativamente sobre los grupos tratados con PBS control. Los grupos tratados con IL-21 no mostraron incremento significativo en la celularidad esplénica en comparación a los grupos de PBS. Tabla 8 VLS inducido por IL-2 está caracterizado por números incrementados de células NK, monocitos y células que expresan el marcador de adhesión LFA-1 (revisado en Lentsch AB, supra.). Los datos anteriores utilizando IL-2 reproducen los reportes publicados sobre el incremento de las células NK, los monocitos y las células LFA-1+. Los ratones tratados con IL-2 muestran todos los signos de VLS en comparación a los controles. En contraste, los ratones tratados con IL-21, aunque tienen una captación incrementada de Azul de Evan, no muestran incremento en las citocinas pro-inflamatorias en suero, o incremento en las células LFA-1+ o las células NK. Además, aunque los ratones tratados con IL-21 sí muestran números incrementados de monocitos, el incremento es menor de lo que es observado con animales tratados con IL-2, sugiriendo que los efectos mediados por IL-2 son más severos que los efectos mediados por IL-21. Tomando conjuntamente los datos de celularidad esplénica y los datos de citocina en suero, IL-21 no induce una respuesta inflamatoria comparable como IL-2. Todos los parámetros podrían indicar que IL-21 induce respuesta inflamatoria menor, si la hay, cuando es administrado un protocolo VLS en dosis similares a IL-2 (peso/peso) . Además, como se muestra en la Tabla 9 y en la Tabla 10 siguientes, el análisis de citometría de flujo de las células del bazo provenientes de ratones reveló que los ratones tratados con IL-2 tuvieron un incremento dependiente de la dosis en el porcentaje y números de células esplénicas NK/T (NK1.1+CD3+) , células NK (NK1.1+CD3), macrófagos (CDllb+) y células LFA-1+ (Tabla III y IV) . Los ratones tratados con IL-21 no tuvieron incremento en las células NK/T, las células NK o las células LFA-1+. Existió un incremento en el porcentaje de macrófagos y granulocitos (datos no mostrados) en el grupo tratado con IL-21 en comparación a los grupos tratados con PBS control. Este incremento fue similar o menor que el incremento en ratones tratados con IL-2. Tabla 9: % Promedio de células de la línea en bazo Tabla 10: Números de células esplénicas (x 106 células, n=4) KT NK CD11b B220 Cd4 Cd8 LFA-1 Gr-1 PBS 0.33 1.54 3.19 24.34 10.19 6.58 5.41 1.11 IL-2 (0.6) 2.34 5.33 7.04 25.23 10.16 5.77 16.60 2.82 IL-2 (1.8) 3.08 14.29 14.16 43.63 15.57 1 1.62 35.11 7.65 IL-2 (3.6) 3.15 14.59 12.08 43.53 15.13 17.64 44.83 4.76 IL-21 (33) 0.37 1.77 4.67 31.50 10.47 6.32 5.05 1.05 IL-21 ( 00) 0.30 1.33 5.35 23.16 8.55 5.40 6.35 1.54 IL-21 (200) 0.56 1.86 8.46 23.85 9.20 6.39 8.43 3.20 Además, se midieron los puntos finales adicionales entre grupos. Los siguientes puntos finales fueron comparados: peso corporal, peso del bazo, fuga vascular en pulmón e hígado, y citocinas séricas. No se observó diferencia significativa en los pesos corporales entre los grupos. Como se discutió anteriormente, animales tratados con ambas dosis de IL-2, Grupo II y III, tuvieron pesos del bazo significativamente más pesados en comparación a los animales tratados con IL-21 y con control PBS ' (p<0.0001). Los animales tratados con ambas dosis de IL-21, Grupos IV y V, tuvieron pesos del bazo significativamente más pesados en comparación a los animales tratados con PBS control (p<0.007 Grupo IV y p<0.0001 Grupo V) . La fuga vascular fue también medida en el pulmón y en el hígado. En el pulmón, ambos grupos de animales tratados con IL-2, Grupo II y III, tuvieron un incremento significativo en la fuga vascular (p<0.0001) en comparación a los animales tratados con PBS control. Únicamente el Grupo III, la más alta dosis de IL-2 tuvo un incremento significativo en la fuga vascular en comparación a la baja dosis y alta dosis de IL-21 (p<0.0001 y p<0.0065) respectivamente. Únicamente la más alta dosis de IL-21, Grupo V, tuvo un incremento significativo en la fuga vascular en comparación a los animales tratados con PBS (p<0.0001). No obstante, la cantidad de fuga vascular fue signi icativamente menor que todos los animales tratados con IL-2. En el hígado, la dosis baja y alta de los animales tratados con IL-2 tuvo un incremento significativo en la fuga vascular (p<0.0016 y p<0.0001 respectivamente), en comparación a los animales tratados con PBS . Los animales tratados con la alta dosis de IL-2 tuvieron un incremento significativo en la fuga vascular en comparación a los animales tratados con IL-21 a baja y alta dosis (p<0.0002 y p<0.0001 respectivamente). Únicamente los anímales tratados con la baja dosis de IL-21 tuvieron un incremento significativo en la fuga vascular en comparación a los animales tratados con PBS (PL. 397) . Ejemplo 18 Expresión del Receptor de IL-21 por Análisis Citométrico de Flujo Se evaluó la expresión de los receptores de IL-21 sobre las células B neoplasicas de los especímenes con linfoma no Hodgkin (NHL) . Se utilizaron múltiples anticuerpos monoclonales para identificar las células B neoplásicas y para co-localizar los receptores de IL-21 (Publicaciones del WIPO Nos. WO01/17235 y WOOl/77171) . La tinción inmunofluorescente por el anticuerpo monoclonal anti-IL-21R o por la biotina-IL-.21, fue registrada como la fluorescencia máxima. Las calificaciones cualitativas fueron evaluadas con base en el desplazamiento en la fluorescencia máxima media con relación a un anticuerpo monoclonal control de igual isotipo. Utilizando ya sea el MAb anti-receptor de IL-21 o biotina-IL-21 (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) detectamos consistentemente el receptor de IL-21 sobre especímenes de linfoma folicular (FL) derivados de nodulos linfáticos. No obstante, casi todos los especímenes derivados de los pacientes con leucemia linfocítica crónica (CLL) no mostraron tinción significativa para los receptores de IL-21, o tinción a muy baja intensidad con relación a los anticuerpos monoclonales control negativos. La tinción por los MAbs anti-receptor de IL-21 y biotina-IL-21 correlacionaron perfectamente y detectaron la tinción moderada del linfoma folicular. Estos datos sugirieron que los receptores de IL-21 representan un objetivo terapéutico para el linfoma folicular. Ejemplo 19 Actividad de CTL Murinos Alorreactivos Tratados con IL- 21 de Ratón (ensayos de citotoxicidad) A. Ensayo de CTL Se examinó la citólisis objetivo mediada por CTL (linfocito T citotóxico) mediante un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Fueron generados CTL alorreactivos (H-2b anti-H-2d) en un cultivo de linfocitos mixtos con los esplenocitos C57B1/6 (H-2B) con esplenocitos Balb/c irradiados con 3000 rad (H-2d) . Después de 7 días, los CTL fueron reestimulados con esplenocitos Balb/c irradiados (y sin citocinas adicionales) . Después de 7 días adicionales, los CTL fueron reestimulados por 5 días en presencia de los sobrenadantes recolectados de esplenocitos de rata activados con conA (una fuente cruda de citocinas que se sabe apoya el desarrollo de CTL) , 10 ng/ml de IL-2 de ratón recombinante (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN) , IL-15 humana recombinante (R&D Systems) , IL-21, o una combinación de IL-15 e IL-21 (5 ng/ml cada uno) . Después de 5 días, los CTL fueron evaluados para su capacidad de lisar las células objetivo marcadas con 51Cr: las células de mastocitoma H-2d P815 (ATCC No. TIB-64) y H-2b de timoma EL4 (ATCC No. TIB-39) como un control negativo. Se desarrollaron células P815 y EL4 en el medio RP10 (RPMI 1640 estándar (Gibco/BRL, Grand Island, NY) suplementado con 10% de FBS (Hyclone) así como glutamina 4 mM (Gibco/BRL) , 100 U.I./ml de penicilina+100 MCG/ml estreptomicina (Gibco/BRL) , ß-mercaptoetanol 5 µ? (Gibco/BRL) y amortiguador HEPES 10 mM (Gibco/BRL) . En el día del ensayo, 1-2 x 106 células objetivo fueron cosechadas y resuspendidas a 2.5 x 106 células/ml en medio RP10. Se agregaron 50-100 µ? de cromato de 51Cr-sodio a 5 mCi/ml (NEN, Boston, MA) directamente a las células, y se les incubó por 1 hora a 37°C, luego se les lavó dos veces con 12 mi de ??? y se resuspendieron en 2 mi de medio' RP10. Después de contar las células sobre un hemocitómetro, las células objetivo fueron diluidas a 0.5-1 x 105 células/ml y se mezclaron 100 µ? (0.5-1 x 104 células) con las células efectoras a diversas proporciones de efector : objetivo . Después de una co-incubaci6n de 4 horas de las células efectoras y de las células objetivo marcadas, a 37°C, la mitad del sobrenadante de cada pozo fue recolectada y contada en un contador gamma por 1 minuto/muestra. El porcentaje de liberación específica de slCr fue calculado a partir de la fórmula 100 x (X-Y) / (Z-Y) , donde X es la liberación de 51Cr en presencia de las células efectoras, Y es la liberación espontánea en ausencia de efectoras, y Z es la liberación total de 51Cr a partir de las células objetivo incubadas con 0.5% de Tritón X-100. Los datos fueron trazados gráficamente como el % de lisis específica versus la proporción de efectoras a objetivo en cada pozo. Los CTLs re-estimulados en presencia de rmIL-2 mostraron la más alta actividad lítica sobre las células objetivo P815, alcanzando >70% de lisis específica a una proporción de efectoras a objetivo de 33:1. Los siguientes CTLs más activos fueron aquellos re-estimulaos en presencia de IL-21+rhIL-15 (62% de lisis específica) , seguido por la CTL cultivados con rhIL-15 (aproximadamente 50% de lisis) , CTL cultivados con IL-21 sola (30% de lisis) , y CTL re-estimulados con sobrenadante conA de rata (aproximadamente 10% de lisis) . Ninguno de los CTL lisó las células E-2b EL4 (todos los CTL lisaron menos de 2% de los objetivos de EL4, incluso a la más alta proporción de efectora a objetivo de 33:1). Este patrón de aumento de citólisis por la citocina (IL-2>IL-21+IL-15>IL-15>IL-21>conA SN) se mantuvo verdadero en 2 experimentos duplicados. Estos datos demuestran que IL-21, particularmente en combinación con IL-15, puede aumentar la función efectora de CTL . Ejemplo 20 Hipersensibilidad Tipo Retrasada en Ratones Suprimidos en el Gen de IL-21 (KO) IL-21 es una citocina que es producida por las células T y ha mostrado que juega un papel en la proliferación y función de células T. La hipersensibilidad tipo retrasada (DTH) es una medida de las respuestas de células T CD4 cooperadoras al antígeno específico. En este, los ratones son inmunizados con una proteína específica (por ejemplo, ovoalbúmina de pollo, OVA) y luego posteriormente retadas con el mismo antígeno en la oreja. El incremento en el espesor de la oreja después del reto es una medida de la respuesta inmune específica al antígeno, mediada principalmente por las células T CD4. Para comprender la función in vivo de IL-21, ratones deficientes en la proteína IL-21 fueron manipulados mediante ingeniería genética (ratones KO a IL-21) . Si IL-21 es importante para las respuestas de las células T, debe esperarse que los ratones IL-21 KO tengan un defecto en las respuestas de células T. Un método para probar esto es inducir una respuesta de DTH en ratones IL-21 KO. Ratones IL-21 KO y carnadas control fueron inmunizados con OVA mezclada con un adyuvante CFA (Adyuvante Completo de Freund) . Los grupos de ratones fueron luego retados nuevamente en la oreja ya sea con PBS (control) u OVA. Los ratones control desarrollaron buena DTH cuando fueron inyectados con OVA, como es mostrado por el incremento en el espesor de la oreja a las 24 horas después del reto. En contraste, ratones IL-21 KO tuvieron un menor grado de espesor de la oreja en comparación a los controles. Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=0.0164). No obstante, a las 48 horas después del reto, no existió diferencia en la respuesta de los ratones tipo silvestre o IL-21 KO. Como se esperaba, los ratones control e IL-21 KO no respondieron a PBS (ningún cambio en el espesor de la oreja) . Ratones IL-21 KO (n=8) y carnadas control de tipo silvestre (n=8) fueron inmunizados en la espalda con 100 µg de ovoalbúmina de pollo (OVA) emulsificada en CFA en un volumen total de 200 µ? . Siete días después de la inmunización, la mitad de los ratones en cada grupo (n=4/gp) fueron inyectados con 10 µ? de PBS en la oreja y la otra mitad inyectada con 10 µ de OVA en PBS en un volumen de 10 µ? . El espesor de la oreja de todos los ratones fue medido antes de inyectar a los ratones en la oreja (medición 0) . El espesor de la oreja fue medido 24 horas y 48 horas después del reto. Fue también calculada la diferencia en el espesor de la oreja entre la medición O y la medición a las 24 horas o 48 horas. A las 24 horas después del reto, los ratones control o los ratones IL-21 KO retados nuevamente con PBS mostraron cambio mínimo o ningún cambio en el espesor de la oreja. En respuesta al nuevo reto con OVA, las orejas de los ratones control mostraron inflamación significativa (7.3 ± 1.1 x 10~3 pulgadas) . En contraste, ratones IL-21 KO mostraron una disminución en el espesor de la oreja en comparación a los controles (5 ± 0.42 x 10~3 pulgadas). Esta diferencia fue estadísticamente significativa (p=0.0164). Esto sugiere que IL-21 sí juega un papel importante en las respuestas de células T CD4. No obstante, a las 48 horas después del reto, las respuestas de los ratones IL-21 KO no fueron diferentes de los controles, sugiriendo que IL-21 no influye la respuesta en esta etapa. Experimentos adicionales están en camino para evaluar el papel de IL-21 en las respuestas de DTH y en las respuestas de células T. Estos resultados sugieren que IL-21 juega un papel importante en las respuestas de las células T CD . Las respuestas de las células T CD4 contribuyen significativamente a la inmunidad, de una manera positiva para reforzar la inmunidad hacia los microbios y los tumores, y de una manera negativa en casos de autoinmunidad e inflamación. El uso de IL-21 puede ser considerado como reforzador de las respuestas de células T CD4 con base en los resultados anteriores.

Ejemplo 21 IL-21 Modifica la Respuesta de las Células T OT-I al Péptido OVA como es Presentado por las Células Dendríticas Murinas A. Aislamiento y marcación de las células T OT-I Ratones que poseen un receptor de células T transgénico, específico para OVA257-264 en H-2Kb, están disponibles (transgénicos OT-I, Jackson Laboratories) . Las células provenientes de los nodulos linfáticos de estos animales fueron agotadas en adherencia, y las células T CD8 (células T OT-I) fueron enriquecidas por selección negativa utilizando columnas CD8 Cellect (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Canadá) . La pureza de las células T CD8 fue evaluada mediante citometría de flujo y fue típicamente de 90 a 95% con <1% de las células T CD4. Células T OT-I fueron marcadas con éster de succinimidilo del diacetato de carboxifluoresceína (CPSE; Molecular Probes, Eugene, OR) al colocarlas en el medio de crecimiento que comprende el medio RMPI-1640 suplementado con 10% de FCS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) , glutamina 2 mM (Gibco/BRL) , penicilina 50 U/ml (Gibco/BRL) , 50 µ /p?1 de estreptomicina (Gibco/B'RL, Grand Island, NY) y 2-mercaptoetanol 50 uM (Sigma, St Louis, O) que contiene CFSE 5 µ? por 5 minutos a temperatura ambiente . Las células fueron luego lavadas tres veces, cada vez mediante la resuspensión en PBS que contenía 5% de FBS, centrifugando 5 minutos a 300 x g, a 20°C, y retirando el sobrenadante. Las células fueron resuspendidas en los medios de crecimiento antes del uso. B. Preparación de las células dendríticas murinas Células dendríticas derivadas de la médula ósea (DCs) provenientes de médula ósea de ratón fueron cultivadas en medios de crecimiento en presencia de GM-CSF utilizando métodos bien conocidos (por ejemplo, Inaba, K. et al., J. Exp. Med. 176: 1693-1702, 1992). Después de seis días en cultivo éstas fueron estimuladas con 1 Mg/ml de LPS (Sigma, St Louis, MO) toda la noche y luego lavadas en medio de crecimiento antes del uso. C. Estimulación in vi tro de las células T Las DCs preparadas como se describió anteriormente fueron pulsadas con el péptido 0VA257-264 10 nm (SEQ ID NO: 17) por 2 horas. Las DCs pulsadas son lavadas en medio de crecimiento para eliminar cualquier péptido no enlazado y luego cultivadas con células T OT-I preparadas como se describe anteriormente, en presencia de medio solo o de 20 ng/ml de rIL-2 de ratón (R&D Systems, Minneapolis, MN) o 50 ng/ml de IL-21 murina (Patente de los Estados Unidos No. 6, 307-, 024). Después ya sea de 48 ó 72 horas de incubación, las células fueron cosechadas y analizadas mediante citometría de flujo para los niveles de la fluorescencia de CFSE y el enlace de la Anexina V (Pharmingen, San Diego, CA) siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Los resultados mostraron que cuando las células T OT-I son presentadas con el antígeno específico sobre DCs, éstas sufren 3 a 5 rondas de división celular por el día 2, y 5 a 7 rondas de división celular por el día 3, como se pone en evidencia por la marcación con CFSE. En presencia de IL-2 su proliferación es incrementada, tal que por el día 2 éstas han sufrido 5 a 6 rondas, y por el día 3, 7 a 9 rondas. Cuando las células T son tratadas con IL-2 éstas sufren apoptosis en el día 3 como es demostrado por el enlace de la Anexina V. En contraste a IL-2, IL-21 induce la proliferación incrementada de células T y previene la marcación de la Anexina V al día 3. IL-21 continúa aumentando la proliferación y previniendo la apoptosis incluso en presencia de IL-21 agregada. IL-21 mejora la proliferación y reduce la apoptosis de las células CTL murinas . Esta actividad implica un papel inmunoestimulador positivo para IL-21 en los ambientes clínicos, tal como la enfermedad viral o el cáncer, donde los CTLs pueden jugar un papel importante. Ejemplo 22 Efecto de IL-21 urina sobre el Desarrollo de Timoma EG.7 in vivo: IL-21 Modifica la Respuesta de las Células T 0T- I en el Modelo de EG-7 de la Actividad anti-tumoral Mediada por CTL Linfocitos T citotóxicos (CTL) reconocen células infectadas y transformadas en virtud de la exhibición de los antígenos virales y tumorales sobre la superficie celular. Respuestas anti-tumorales efectivas requieren la estimulación y expansión de los clones de CTL específicos al antígeno. Este proceso requiere la interacción de varios tipos celulares además de CTL, y usualmente da como resultado el establecimiento de memoria inmunológica . La línea de células tumorales EG-7 es transfectada con ovoalbúmina de pollo y con esto expresa un antígeno de células T bien caracterizado, un péptido OVA (SEQ ID NO: 17) , presentado en H-2Kb. Las células T OT-I (Ejemplo 21) matan las células tumorales EG-7 in vítro e in vivo (Shrikant, P. y Mescher, M. , J. Immunology 162: 2858-2866, 1999) . Ratones (hembra, C57B16, de 9 semanas de edad; Charles River Labs, Kingston, NY) fueron divididos en tres grupos. En el día 0, las células EG.7 (ATCC No. CRL-2113) fueron cosechadas del cultivo y se inyectaron 1,000,000 de células intraperitonealmente en todos los ratones. Los ratones fueron luego tratados con el artículo de prueba o el vehículo asociado mediante inyección intraperitoneal de 0.1 mi de la solución indicada. Los ratones en el primer grupo (n=6) fueron tratados con vehículo (PBS pH 6.0), que fue inyectado en el día 0, 2, 4 y 6. Los ratones en el segundo grupo (n=6) fueron tratados con IL-21 murina, la cual se inyectó a una dosis de 10 µ? en el día 0, 2, 4, y 6. Los ratones en el tercer grupo (n=6) fueron tratados con IL-21 murina, la cual fue inyectada a una dosis de 75 µg en el día 0, 2, 4, y 6. En ambos grupos de ratones tratados con IL-21 murina, el tiempo de supervivencia fue significativamente incrementado, en comparación a ratones tratados con vehículo. El grupo tratado con dosis de 75 de IL-21 tuvo significativamente mayor supervivencia que el grupo tratado con dosis de 10 µg, y 33% (2/6 ratones) de este grupo sobrevivieron por más de 70 días. Una porción adicional de este estudio probó el efecto de las mismas dosis llevadas a cabo hasta el día 12. Los resultados fueron muy similares al esquema de dosificación más corto, con ambas dosis que tenían supervivencia significativamente incrementada sobre el tratamiento con vehículo, y la más alta dosis dio la mejor respuesta (50% de supervivencia más allá de los 70 días) . En algunos experimentos, se inyectaron 4,000,000 de células T OT-I intraperitonealmente en los ratones en el día previo al día 0. Los ratones fueron luego tratados con IL-21 o vehículo como se describe anteriormente . A diversos puntos después del tratamiento las células T OT-I fueron recuperadas de la cavidad peritoneal y contadas . La presencia de las células T OT-I no tuvo efecto sobre el tiempo de supervivencia de los ratones tratados con vehículo. El tratamiento con IL-21 dio como resultado un incremento de 10 veces en el número de células T OT-I, que pudieron ser recuperadas de la cavidad peritoneal. En ratones tratados con IL-21, la presencia de las células T OT-I aumentó el tiempo de supervivencia en comparación a los ratones tratados con IL-21 sola. El incremento en la supervivencia conferido por el tratamiento con IL-21 con o sin células T específicas del tumor exogenamente agregadas, muestra que IL-21 está activando las células efectoras endógenas del sistema inmune. La recuperación incrementada de las células T OT-I de la cavidad peritoneal muestra que IL-21 está incrementando el número de células T específicas de tumor en el sitio del tumor. Como es predicho por la habilidad de IL-21 para aumentar la supervivencia de células T in vitro, estos resultados indican que el tratamiento con IL-21 ha aumentado la habilidad del sistema inmune para destruir las células tumorales in vivo. Estos resultados demuestran in vivo un papel inmunoestimulador positivo para IL-21, en pruebas clínicas relevantes, tal como en un cáncer humano o enfermedad viral, donde los CTLs pueden jugar un papel en combatir la enfermedad. Ejemplo 23 . IL-21 Reduce la Carga Tumoral en el Modelo RMA-RAE1 de la Actividad Anti-Tumoral Mediada por Células NK Las células asesinas naturales sirven como una primera línea de defensa contra ciertas infecciones virales y tumores. La actividad de las células NK efectivas no requiere exposición previa al objetivo ni tampoco se piensa que éstas mantengan memoria inmunológica del objetivo. De este modo, las células NK "detectan" si las células son transformadas, infectadas o de otro modo "estresadas" en virtud de una gama de moléculas sobre la superficie de la célula objetivo. RAE-1 es una proteína expresada sobre la superficie de las células "estresadas" que se compromete específicamente a una activación de un receptor sobre la superficie de las células NK, con lo cual conduce a la lisis de la célula "estresada" . La transfección de la línea de células tumorales RMA con RAE-1, la hace sensible a la lisis por las células NK in vitro e in vivo. La línea de células de linfoma RMA proporcionada por el Dr. L. Lanier y el Dr. Jay Ryan, UCSF, San Francisco, CA) fue desarrollada en medio RPMI-1640 suplementado con 10% de FCS (JRH, Lenexa KS; Hyclone, Logan UT) , glutamina 2 mM (Gibco/BRL) , 50 U/ml de penicilina (Gibco/BRL) , 50 µ9/p?1 de estreptomicina (Gibco/BRL, Grand Island, NY) y 2-mercaptoetanol 50 uM (Sigma, St Louis, MO) . Los transfectantes estables de RMA-RAE-ldelta o de células RMA pseudo-transfectadas, fueron establecidos mediante electroporación: 30 µg del plásmido RAE-ldelta-pCDEF3 (transíectante RAE-ldelta) , o el plásmido pCDEF3 (pseudo-transfectante) se agregó aproximadamente a 1 x 107 células en el medio RPMI-1640 en una cubeta de 4 mm (BioRad, Richmond, CA) , respectivamente. El vector pCDEF3 fue amablemente proporcionado por el Dr. Art Weiss (UCSF, San Francisco California) . La electroporacion fue llevada a cabo mediante el uso de un pulsador de genes BioRad (250 v, 960 µ?) . 48 horas después de la electroporacion, las células R A-RAE-ldelta y pseudo-transfectadas fueron cultivadas en medio RPMI-1640 completo suplementado con 1 mg/ml de G418 (Gibco/BRL) . Grupos de seis o más animales por experimento fueron inyectados intraperitonealmente con células que fueron pseudo-transíectadas o transíectadas con RMA-RAE-ldelta. Experimentos preliminares que titulan el número de células tumorales inyectadas, indicó que 1 x 104 células RMA y 1 x 105 células RMA-RAE-ldelta dieron como resultado formación tumoral y morbididad subsecuente en 100% de los animales. La inoculación intraperitoneal (IP) de los ratones con las células RMA-RAEldelta a números comparables a dosis letales (aproximadamente 1 x 104) de las células RMA progenitoras , da como resultado tumores que son completamente rechazados sin el involucramiento de células T o el establecimiento de memoria inmunológica. La inoculación IP de ratones con un exceso de 10 veces de células RMA-RAEldelta da como resultado la muerte del ratón" presumiblemente por "hundimiento" de la capacidad de las células NK para reaccionar al tumor (Cerwenka et al., Proc. Nati. Acad. Sci . 98: 11521-11526, 2001). Para los experimentos de eficacia de citocina se administraron seis inyecciones IP de 10 µ9 de IL-21 murina o de vehículo control a los ratones cada tercer día en los días -4, -2, 0, 2, 4 y 6. Todos los ratones fueron monitorizados diariamente para el desarrollo de ascitis tumoral, indicada por hinchamiento del abdomen, y fueron sacrificados cuando la carga tumoral se volvió excesiva para evitar dolor y sufrimiento. Los animales fueron considerados libres de tumor cuando sobrevivían más de 8 semanas. Para los experimentos del nuevo reto, los animales sobrevivientes fueron inoculados con 1 x 104 células pseudo-RMA después de 8 semanas. La administración de pequeñas cantidades de IL-21 murina dio como resultado supervivencia aumentada de los ratones que recibieron el número 10 veces en exceso de las células tumorales que poseen RAE1. Algunos ratones tratados con IL-21 se volvieron completamente libres de tumor. El tratamiento con IL-21 no tuvo efecto sobre la supervivencia de los ratones administrados con la línea celular RMA progenitora, mostrando que el efecto fue específicamente mediado por las células NK. Parecía que RAE1 , y por lo tanto las células NK, eran requeridas para el efecto de IL-21. Además, los ratones que sobrevivieron al reto letal con el tumor RMA-RAE1 en virtud del tratamiento con IL-21, fueron capaces de rechazar un reto subsiguiente con la línea celular RMA progenitora. Esto mostró que IL-21 había inducido también la memoria inmunológica en estos ratones. Esta habilidad de IL-21 para aumentar la actividad de las células NK muestra que IL-21 puede tener beneficio terapéutico en el tratamiento de pacientes quienes tienen tumores o enfermedades virales. Ejemplo 24 Inmunohistoquímica de IL-21 en Diversas Líneas de Tejidos y Células Humanas El propósito de este experimento fue determinar si IL-21 podría ser detectada en tejidos selectos por medio de inmunohistoquímica. Los tejidos fueron procesados mediante métodos inmunohistoquimieos estándares utilizando un Techmate 500 (BioTek Solutions, Tucson, AZ) . En resumen, secciones desparafinizadas de tejidos incrustados en parafina fueron tratadas con 5% de suero de cabra normal en PBS en un agente bloqueador (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, CA, Reactivo A y B (listo para usarse) ) para reducir al mínimo la tinción antecedente no específica. Uno de dos anticuerpos primarios anti-IL-21 fue aplicado (E3149 (IL-21 de ratón>humano-CHO, HH4.9.1C2.1A6.1C8 , PAS) o E2865 (IL-21 de ratón>humano-CHO, HH4.3.1.2D1.1C12 , PAS), ambos elaborados domésticamente) seguido por un anticuerpo anti-ratón, biotinilado (Vector Laboratories, Burlingame, CA) . Fue generado un producto de reacción coloreado vía una reacción de peroxidasa-2 ' 3 ' -diaminobencidina (peroxidasa ChemMate/equipo de tinción DAB incluyendo el contador de verde de metilo; CMS/Fisher, Houston, TX) . Los portaobjetos fueron cubiertos con cubreobjetos y luego examinados bajo un microscopio de luz (Nikon Eclipse E600, Nikon Corporation, Tokyo, Japón). Se probaron las siguientes células y tejidos: células BHK transfectadas con IL-21 humana (control positivo) , células BHK-570, tipo silvestre (control negativo) y pulmón normal humano, pulmón humano con inflamación perivascular crónica, nodulo linfático normal humano, nodulo linfático humano con linfoma de células B, bazo humano con mielofibrosis , y duodeno humano. Estos tejidos fueron obtenidos como una base por contrato ya sea de CHTN (Nashville, TN) o NDRI (Philadephia, PA) . También se probaron los tejidos humanos normales sobre un portaobjetos de tejidos múltiples (Biomeda, Hay ard, CA) y tejidos humanos anormales/tumorales sobre un portaobjetos de tejidos múltiples (Biomeda, Hayward, CA) . El anticuerpo E3149 produjo tinción positiva únicamente en las células BHK transfectadas. Con el anticuerpo E2865, se observó tinción intensa en las células control positivas así como las células mononucleares ocasionales de identidad desconocida en el epitelio del intestino delgado en el bloque de tejidos múltiples normales. La localización en el intestino delgado- a partir del cual se obtuvo esta muestra, fue desconocida. Este tipo celular positivo fue raro (1 célula en 3 secciones) en una sección separada de duodeno humano. Además, una población positiva de células mononucleares fue difusamente distribuida a todo lo largo del bazo humano de un paciente con mielofibrosis . Un patrón de tinción similar no fue encontrado en los bazos del bloque de múltiples tejidos humanos normales. Aunque existió alguna tinción en los bazos del bloque de tejidos múltiples, la tinción no fue claramente asociada a las células. Además, una sección de pulmón inflamado contenía células en forma de husillo, teñidas y células mononucleares en lo que parecía como el espacio subpleural (el tamaño y la calidad de la sección hacen difícil la determinación de la localización) . Fue observada tinción positiva en pituicitos dispersos, en pituitarias en el bloque de tejidos múltiples. Las pituitarias teñidas con el anticuerpo isotipo, fueron negativas. La tinción coloidal fue observada en secciones de tiroides del bloque de tejidos múltiples, y en una sección de adenocarcinoma de tiroides en el bloque de tumores múltiples. La significancia de esto es desconocida-el coloide en la sección isotipo ocasionalmente fue teñido (pero mucho menos intensamente que en los tej idos teñidos con anti-IL-21, correspondientes) . Se observó también tinción ligera en el epitelio folicular tiroideo, pero su intensidad fue casi a los niveles antecedentes. La tinción en el carcinoma no diferenciado en el bloque multitumoral está asociada con un área central de desechos necróticos mezclados con células inflamatorias-la especificidad de esta tinción es cuestionable. De igual modo, la tinción en el adenocarcinoma pancreático puede estar asociada con desechos necróticos o células inflamatorias asociadas . Debido a la localización de la tinción en los tejidos anteriores, es posible que IL-21 juegue un papel en la inmunidad mucosal intestinal (células ocasionales en el epitelio intestinal) , inflamación (asociada con células inflamatorias en el pulmón, carcinoma no diferenciado, adenocarcinoma pancreático) y mielofibrosis ; fibrosis en la médula ósea que da como resultado hematopoyesis extramedular en el bazo-podría ésta también involucrar proliferación de la línea de células que produce IL-21 con IL-21 que intenta regular el proceso. Una advertencia con estos resultados es que se obtuvieron diferentes patrones de tinción con diferentes anticuerpos. Esto puede ser debido al reconocimiento de diferentes epítopos por los dos anticuerpos. Ejemplo 25 IL-21 Promueve la Expansión de Células NK Estimuladas con IL-2 en Cultivos de PB NC en Presencia de IL-4 IL-4 inhibe la expansión de las células NK estimuladas con IL-2. En dos experimentos se sembraron células mononucleares de sangre periférica humana (PB NCs) a 200,000 células/pozo en alfa-MEM+10% de suero autólogo con 10 ng/ml de IL-2 (R&D Systems, Minneapolis , MN) con o sin 0.5 ng/ml de IL-4 (R&D Systems, Minneapolis, MN) , y con o sin 10 ng/ml de IL-21 (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) y desarrolladas por 8 días. El número de células viables por pozo fue determinada utilizando métodos estándares, y las células analizadas mediante citometría de flujo para la expresión de CD3 , CD16 y CD56. Las células NK fueron definidas como la población negativa a CD3 , positiva a CD56. Los cultivos provenientes de los dos donadores cultivados con IL-2 solo contenían aproximadamente 151,000 y 326,000 células NK respectivamente en el día 8. Los cultivos provenientes de los grupos donadores, cultivados con IL-2 e IL-21, contenían aproximadamente 446,000 y 588,000 células NK respectivamente. Los cultivos provenientes de los dos donadores cultivados con IL-2 e IL-4 contenían aproximadamente 26,000 y 29,000 células NK en el día 8. No obstante, los cultivos provenientes de los dos donadores, cultivados con IL-2, IL-4 e IL-21 contenían aproximadamente 229,000 y 361,000 células NK que representan un incremento de 8.8 y 12.5 veces en el rendimiento de las células NK sobre el cultivo con IL-2 e IL-4 únicamente. Estos resultados demuestran que IL-21 promueve la expansión de las células NK, y que IL-21 puede superar en gran medida los efectos inhibitorios de IL-4 sobre el desarrollo de células NK. En algunas enfermedades, la expresión de IL-4 puede jugar un papel en la patología. Por ejemplo, los ratones que poseen el melanoma B16F10 generan una población grande de células T CD4+ productoras de IL-4, que parecen limitar la respuesta anti-tumoral del hospedero. Además, ratones deficientes en el gen STAT 6 (requeridos para la señalización de IL-4) muestran una habilidad aumentada para rechazar tumores. La habilidad de IL-21 para antagonizar la acción de IL-4, e inducir la expresión de IFN-? (descrita en la presente) , además de la actividad anti-tumoral in vivo y los datos descritos en la presente, sugiere que IL-21 puede ser útil en el tratamiento de malignidades, infecciones o enfermedad autoinmune donde existe una respuesta de Th2 limitante de la habilidad de los hospederos para controlar la enfermedad . E emplo 26 IL-21 Sinergíza con IL-2 para Promover el Desarrollo de Células NK Provenientes de Sangre Periférica Linfocitos de sangre periférica provenientes de un donador humano saludable fueron preparados mediante un método de centrifugación estándar por Ficoll. Los linfocitos fueron magnéticamente enriquecidos negativamente como se describe en la presente utilizando el sistema de enriquecimiento negativo de células NK humanas de Stem Cell Technologies. Las NK fueron cultivadas a una concentración inicial de aproximadamente 75,000/ml en 2 ml/pozo de alfa MEM con 10% de suero del donador, BME 50 µ?, 2 ng/ml de flt3L, y 0, 0.5, 10 ó 50 ng/ml de IL-2 ± 0, 5 ó 50 ng/ml de IL-21. Después de 15 días de cultivo las células fueron cosechadas, contadas y analizadas mediante citometría de flujo para CD3 , CD56 y CD161. Todas las células analizadas después de 15 días de cultivo fueron CD3-/CD56+, que son definidas como células NK. En el día 0, las células fueron analizadas mediante citometría de flujo y se encontró que eran más de 98% CD3-/CD56+. El "incremento proporcional" en el número de células es definido como el número de células final dividido entre el número de células inicial. Cualquier "incremento proporcional" por debajo de 1 es por lo tanto la disminución en el número de células. En general, los resultados a 10 ng/ml de IL-2 fueron similares a los resultados obtenidos con 50 ng/ml de IL-2, y los resultados de 5 ng/ml de IL-21 fueron similares a aquellos obtenidos con 50 ng/ml de IL-21. Sin IL-2 presente, el incremento proporcional en las células totales fue de 0.064. Cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21 en el cultivo, el incremento proporcional fue de 0.11. Esto indica que IL-21 tiene muy poca actividad proliferativa sobre NK por sí misma. A una baja concentración de 0.5 ng/ml de IL-2, se observó un incremento proporcional de 0.25. Cuando se incluyó 5 ng/ml de IL-21, se observó un incremento proporcional de 2.9. A concentraciones mayores de IL-2 los incrementos proporcionales fueron en general más altos, pero el efecto de IL-21 fue en general disminuido, aunque todavía positivo. A 10 ng/ml de IL-2 se observó un incremento proporcional de 2.9. Cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21 se observó un incremento proporcional de 7. El efecto de IL-21 en estos cultivos fue dependiente de la presencia de al menos una baja de IL-2. Sin IL-2, el efecto de IL-21 fue mínimo. Cuando IL-2 está presente, especialmente a la concentración más baja, quizás fisiológica, el efecto de IL-21 es el más profundo. La falta de efecto de IL-21 solo, aunado con su habilidad para sinergizarse con las bajas concentraciones de otras citocinas, puede permitirle actuar terapéuticamente en sitios de infección o malignidad sin provocar toxicidad sistémica. Ejemplo 27 IL-21 Estimula el Sobrecrecimiento de NK y NKT Proveniente de Cultivos de Linfocitos de Sangre Periférica que Contienen IL-2 o IL-15 Linfocitos de sangre periférica de 3 donadores humanos saludables fueron preparados mediante el método de centrifugación por Ficcol estándar. Los linfocitos fueron luego cultivados a una concentración inicial de 200,000/ml en alfa MEM con 10% de suero donador, BME 50 µ? (Sigma) , 2 ng/ml de flt3L (R&D Systems), y 0, 0.5, 10 ó 50 ng/ml de IL-2 (R&D Systems) o IL-15 (R&D Systems) ± 0, 5 ó 50 ng/ml de IL-21 (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024). Después de 12 días de cultivo, las células fueron cosechadas, contadas y analizadas medíante citometría de flujo para CD3 , CD56 y CD8. Las células NK fueron definidas como CD56+/CD3- y las células NKT fueron definidas como CD56+/CD3+. El "incremento proporcional" en el número de células (definido como el número final de células/número inicial de células) fue ampliamente variable entre los dos donadores, pero las tendencias fueron claramente consistentes. En general, los resultados de 10 ng/ml de IL-2 o IL-15 fueron similares a los resultados obtenidos con 50 ng/ml de IL-2 o IL-15, y los resultados a 5 ng/ml de IL-21 fueron similares a aquellos obtenidos con 50 ng/ml de IL-21. Sin IL-2 o IL-15 presentes, el incremento proporcional en las células totales fue de 0.33, 0.23 y 0.19 entre los tres donadores. Cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21 en el cultivo, los incrementos proporcionales fueron de 0.47, 0.31 y 0.35. A una concentración menor de 0.5 ng/ml de IL-2, se observaron incrementos proporcionales de las células totales de 2.2, 1.1, y 1.0 entre los tres donadores. Cuando se incluyó 5 ng/ml de IL-21, se observaron incrementos de células totales por 5.5, 2.3 y 3.1. Se observaron incrementos proporcionales en los números de NK sin IL-21 de 16, 4.2 y 3.5. Cuando estuvo presente IL-21 (a 5 ng/ml) estos incrementos fueron de 24, 15 y 21 respectivamente. Las NKTs fueron también positivamente efectuadas bajo estas condiciones. Los incrementos proporcionales de NKT fueron de 4.4, 5.7 y 1.8 sin IL-21, y 10, 9 y 15 con 5 ng/ml de IL-21. Estos resultados son semejantes con IL-15. A 0.5 ng/ml de IL-15, se observaron incrementos proporcionales de las células totales de 0.98, 0.43, y 0.88 entre los tres donadores. Cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21, se observaron incrementos en las células totales en una proporción de 1.4, 0.90 y 1.7. Los incrementos proporcionales de los números de NK de 8.0 , 0.85 y 3.7 fueron observados sin IL-21. Cuando estuvo presente 5 ng/ml de IL-21, estos incrementos proporcionales fueron 13, 5.5, y 11. Los incrementos proporcionales de NKT a 0.5 ng/ml de IL-15 fueron de 3.3, 2.3 y 1.6 para los tres donadores, pero éstos fueron de 3.9, 5.2 y 4.7 cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21. A concentraciones m s altas de IL-2 los incrementos proporcionales fueron en general más altos, pero el efecto de IL-21 fue en general disminuido, aunque todavía positivo. A 10 ng/ml de IL-2 se observaron incrementos proporcionales de las células totales de 18, 2.5 y 2.8 entre los tres donadores. Cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21, se observaron incrementos en las células totales en una proporción de 21, 3.6 y 9.8. Se observaron incrementos proporcionales en los números de NK de 114, 13 y 13 sin IL-21. Cuando estuvo también presente IL-21 (a 5 ng/ml) estos incrementos fueron de 100, 19 y 56 respectivamente. Las NKTs fueron también positivamente afectadas bajo estas condiciones. Los incrementos proporcionales de NKT fueron de 33, 15 y 12 sin IL-21, y 52, 20 y 38 con 5 ng/ml de IL-21.

A 10 ng/ml de IL-15, se observaron incrementos proporcionales de las células totales de 18, 0.8 y 1.7 entre los tres donadores. Cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21, se observaron incrementos en las células totales en una proporción de 23, 1.4 y 6.9. Se observaron incrementos proporcionales de los números de NK de 128, 0.58 y 2.0 sin IL-21. Cuando están presentes 5 ng/ml de IL-21, estos incrementos proporcionales fueron de 107, 1.1 y 9.4. Los incrementos proporcionales de NKT a 10 ng/ml de IL-15 fueron de 60, 6.5 y 5.7 para los tres donadores, pero éstos fueron de 66, 12 y 33 cuando se incluyeron 5 ng/ml de IL-21. Los efectos de IL-21 en estos cultivos fueron dependientes de la presencia de al menos la baja dosis de IL-2 o IL-15. Sin esas citocinas, el efecto de IL-21 fue mínimo. Cuando está presente IL-2 o IL-15, especialmente a las concentraciones bajas, quizás fisiológicas, el efecto de IL-21 es el más profundo. La falta de efecto de IL-21 solo, aunado con su habilidad para sinergizarse con las bajas concentraciones de otras citocinas, puede permitirle actuar terapéuticamente en sitios de infección o malignidad sin provocar toxicidad sistémica. Ejemplo 28 IL-21 Inhibe la Producción de IL-13 en Cultivos de Células NK IL-13 comparte subunidades receptoras y muchas de las actividades biológicas de IL-4, pero de manera contraria a IL- 4, IL-13 es producida por las células NK. Ya que las células NK también producen IFN-?, y estas dos citocinas tienen en gran parte actividades opuestas, fueron conducidos experimentos para examinar los efectos de IL-21 sobre la expresión de IL-13 e IFN-? en cultivos de células PBMNC y NK. Células NK de sangre periférica humana, negativamente seleccionadas fueron sembradas a aproximadamente 3.75 x 105 células/ml y estimuladas 2 días con 10 ng/ml de IL-2, IL-4 (R&D Systems) o IL-21 (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024), o sin ninguna citocina en alf -MEM+10% de suero autólogo. Después de dos días en cultivo se agregó IL-2 a todos los pozos a 10 ng/ml, y las células fueron cultivadas por 3 días adicionales, luego los sobrenadantes fueron recolectados y analizados mediante ELISA para IL-13 e IFN-?. Las células NK desarrolladas por dos días sin ninguna citocina produjeron aproximadamente 2130 pg/ml de IFN-? y 175 pg/ml de IL-13. Las células estimuladas con IL-21 produjeron aproximadamente 10,300 pg/ml de IFN-? y 90 pg/ml de IL-13. Las células estimuladas con IL-2 produjeron 12,700 pg/ml de IFN-? y 1000 pg/ml de IL-13. Las células estimuladas con IL-4 no produjeron IFN-? detectable ni IL-13. Hay que hacer notar que las células estimuladas por los primeros dos días con IL-21 produjeron 5 veces más IFN-?, pero únicamente la mitad de IL-13 de las células no estimuladas. Cuando se comparó a las células estimuladas con IL-2 por los primeros dos días de cultivo, las células estimuladas con IL-21 produjeron 80% tanto IFN-?, pero únicamente 9% tanto IL-13. De este modo, IL-21 promueve selectivamente la expresión de IFN-? y disminuye la expresión de IL-13. Ejemplo 29 IL-21 se Sinergiza con IL-2 para Promover la Producción de IFN-? en Células NK de Bazo de Ratón Células NK esplénicas de ratón C57BL/6 fueron preparadas mediante lisis con agua de una suspensión celular proveniente de los bazos, utilizando luego el protocolo de clasificación magnético por enriquecimiento negativo de NK murinas de Stem Cell Technologies. Las células preparadas utilizando este método fueron 65% positivas a Pan-NK en el análisis de flujo utilizando el anticuerpo DX5 Pan NK de PharMingen. Las células NK murinas, negativamente enriquecidas fueron cultivadas por 8 días a 500,000 células/ml en RPMI-1640 con 10% de suero fetal bovino inactivado por calor, y L-glutamina 2 mM, BME 50 µ?, y antibiótico PSN con 20 ng/ml de mIL-2 (R&D Systems) o 10 ng/ml de mIL-21 (Patente de los Estados Unidos No. 6,307,024) o ambas. Los sobrenadantes celulares fueron cosechados y las células fueron contadas al final del periodo de cultivo. Los sobrenadantes celulares fueron evaluados para mIFN-? utilizando un equipo de ELISA comercialmente disponible de PharMingen. Los números celulares al final del periodo de ocho días fueron aproximadamente 1,300,000 para el cultivo que contenía IL-2, 220,000 para el cultivo de IL-2/IL-21 y 10,000 para el cultivo de IL-21. Los niveles de mIFN-? fueron de 2.2 ng/ml, 30 ng/ml, y 0.28 ng/ml respectivamente. Cuando se expresan como pg/500,00 células, los resultados son 238, 14,000 y 12,000. IL-21 aumenta la expresión de IFN-? en estos cultivos, que cuando se combinan con los efectos de la supervivencia/proliferación celular de IL-2, da como resultado altos niveles de IFN-? que es secretada hacia el medio. IFN-? es un iniciador importante de la respuesta inmune y se considera una citocina desviada por Thl . Estos datos apoyan que IL-21 juega un papel en la actividad anticancerosa, antiviral del sistema inmune, y por lo tanto puede ser utilizada como un agente terapéutico anti-cáncer, antiviral y otras aplicaciones. Ejemplo 30 Efectos del Conjugado IL-21-Toxina Saporina sobre las Células T y Líneas de Células T Humanas La habilidad del conjugado IL-21 murina-toxina saporina para enlazarse a las células T murinas normales, fue determinada mediante los ensayos de competencia FACS y comparados al enlace sobre las mismas células por la IL-21 murina. Se mostró que el conjugado IL-21 murina-toxina saporina se enlaza a estas células con la misma afinidad que IL-21 (Ejemplo 30A) . La presencia del receptor de IL-21 humana (Publicaciones del IPO Nos. WO 01/17235 y WO 01/77171) sobre las siguientes líneas de células T se determinó mediante análisis de FACS : la leucemia de células T humanas MOLT-13 (DSMZ No. ACC_436) , el linfoma de células T cutáneas HUT-78 (ATCC No. TIB_161) , el linfoma de células T cutáneas humanas HUT-102 (ATCC No . TIB_162) ; la línea ALCL humana DEL (DSMZ No. ACC_338) , y la leucemia de células T/NK humanas YT (DSMZ No. ACC_434; Ejemplo 30B) . Los efectos del conjugado IL-21 humana-toxina saporina descritos en la presente fueron probados sobre células T humanas normales (Ejemplo 30C) y las líneas de células T humanas mostraron que expresan el receptor de IL-21 humana (por ejemplo, MOLT-13, HUT-78, HUT-102, DEL e YT; Ejemplo 30D) . Los resultados mostraron que las células T humanas normales y las líneas de células T tratadas con el conjugado IL-21-toxina saporina proliferaron mucho menos o no del todo en comparación con las células dejadas sin tratar o las células cultivadas con la IL-21 no conjugada o con la saporina sola . Los resultados indican que el conjugado IL-21-toxina (saporina u otra) pueden controlar algunos tipos de neoplasmas de células T con poco o ningún efecto también sobre la proliferación de las células T humanas normales in vitro a 30 pM o menos . Un mecanismo propuesto de la inhibición observada de la proliferación de la línea celular in vitro es como sigue: el conjugado IL-21 humana-toxina se enlaza con alta afinidad al receptor de IL-21 expresado sobre la superficie de estas células. El conjugado de IL-21 humana-toxina es luego recogido por las células y, en el caso con el conjugado de la toxina saporina, la habilidad de las células para producir proteína y su proliferación, es subsecuentemente bloqueada. De este modo, el conjugado de IL-21- inmunotoxina saporina, u otra fusión de IL-21-toxina, podría ser utilizada terapéuticamente en la prevención y tratamiento de leucemias y linfornas de células T, y otros cánceres en donde son expresados receptores de IL-21. A. El enlace del conjugado IL-21 murina-toxina saporina sobre las Células T murinas normales mediante análisis de citometría de flujo Se aislaron esplenocitos murinos totales de ratones hembra C57/BL6 de 4 meses de edad normales (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Los bazos fueron cosechados . y suavemente aplastados entre portaobjetos congelados para crear una suspensión celular. Las células sanguíneas rojas fueron removidas mediante lisis hipotónica como sigue: las células fueron concentradas y el sobrenadante se eliminó mediante aspiración. El botón se desintegró con agitación suave en torbellino, se agregaron luego 900 µ? de agua estéril mientras que se agitaba, seguido rápidamente (menos de 5 segundos después) por 100 µ? de 10X HBSS (Gibco/BRL; Rockville Maryland) . Las células fueron luego resuspendidas en 10 mi de IX HBSS y el desecho fue eliminado al hacer pasar las células sobre un tamiz de células revestido con malla de nailon (Falcon/BD; Franklin NJ) . Estas células del bazo agotadas en RBC fueron luego concentradas y resuspendidas en amortiguador de tinción FACS : HBSS (Gibco/BRL; Rockville Maryland) que contenía 3% de suero humano, 1% de BSA y HEPES 10 mM. Las alícuotas que contenían aproximadamente lxlO6 células sanguíneas blancas del bazo fueron teñidas para el análisis citométrico de flujo de 3 colores con los anticuerpos monoclonales anti-CD3 murino-FITC, anti-B220 murino-CyChrome (PharMingen, San Diego, CA) e IL-21 murina biotinilada (2 µ9/t?1) seguido por estreptavidina-PE (Caltag; Burlingame CA) . La tinción de la IL-21 murina biotinilada fue competida por cantidades molares equivalentes tituladas (0.0175 nM a 3.5 nM) de IL-21 no biotinilada y el conjugado de IL-21-saporina . Las células fueron analizadas sobre un software FACScan utilizando CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Los resultados demostraron que el conjugado de IL-21 murina-toxina saporina se enlaza a estas células con la misma afinidad que IL-21. B. El enlace de IL-21 murina biotinilada sobre las líneas de células T humanas mediante análisis de citometría de flujo Alícuotas que contenían 0.4xl06 a lxlO6 células MOLT-13, células HuT-78, células HuT-102, células DEL o células YT fueron teñidas para el análisis citométrico de flujo de un color con la IL-21 murina biotinilada (40 ng/ml a 1000 ng/ml) seguido por estreptavidina-PE (Caltag; Burlingame CA) . Las células fueron analizadas sobre un FACSScan utilizando software CellQuest (Becton Dickinson, Mountain Vie , CA) . Los resultados demostraron que la IL-21 murina biotinilada se enlaza a estas líneas celulares con afinidad fuerte. Los resultados también demostraron que la IL-21 murina es reactiva entre especies ya que reconoce y se enlaza a la molécula receptora de IL-21 humana sobre la superficie de las líneas de células T humanas. C. El efecto de la IL-21 humana-inmunotoxina saporina sobre la proliferación de células T humanas normales Sangre completa fue recolectada de un donador humano saludable, se dividió en alícuotas en tubos de 50 mi y se hizo pasar sobre gradientes de densidad Ficoll. Las células agotadas en RBC en la interfaz (PBMC) fueron recolectadas y lavadas extensamente con PBS, seguido por RPMI 1640 suplementado con 10% de ultrasuero humano y L-glutamina 2 mM. Las PBMC fueron suspendidas a lllxl06/ml en amortiguador MACS (PBS, 1% de BSA, 0.8 mg/litro de EDTA) . Las células fueron combinadas con microesferas anti-CD14 humano, microesferas anti-CD19 humano y microesferas anti-CD56 humano (Miltenyi Biotech; Auburn CA) siguiendo las especificaciones del fabricante. La mezcla se incubó por 20 minutos a 4°C. Estas células marcadas con esferas de CD14 , CD19 y CD56 fueron lavadas con 5 volúmenes de amortiguador MACS y luego resuspendidas en 1.5 mi de amortiguador MACS. Una columna VS+ (Miltenyi Biotech; Auburn CA) fue preparada de acuerdo a las instrucciones del fabricante. La columna VS+ fue luego colocada en un campo magnético VarioMACSMR (Miltenyi Biotech; Auburn CA) . La columna fue equilibrada con 3 mi de amortiguador MACS. Las PBMC recubiertas con esferas CD14/CD19/CD56 fueron luego aplicadas a la columna. La fracción CD14 -CD19-CD56-PBMC que contenía células T humanas se dejó pasar a través de la columna y se recolectaron en un tubo de 15 mi. La columna se lavó con 10 mi (2 X 5 mi) de amortiguador MACS para lavar las células T humanas residuales. La columna con las células CD14+CD19+CD56+ enlazadas fue desechada. Las células T humanas y el eluyente del lavado se combinaron entre sí y se contaron. Una muestra de las células T humanas negativamente seleccionadas fue removida para la tinción, para evaluar la pureza de la fracción. Un anticuerpo anti-CD3 humano de ratón conjugado a cychrome (PharMingen) se utilizó para teñir las células seleccionadas. Las células T negativamente seleccionadas mostraron que eran 67% CD3+. Las células T primarias aisladas fueron cultivadas a 0.5xl06/ml con cantidades molares equivalentes tituladas (0.03 pM a 30 pM) de IL-21 y el conjugado IL-21-saporina, sobre una placa recubierta con el anticuerpo anti-CD3 humano titulado (0 a 2 µ9 ?1) (clone UCHT-1; Southern Biotech; Birmingham Alabama) como un co-activador para las células T humanas. Después de 3 días de crecimiento, las células fueron pulsadas con 3H-timidina (5 µ??/t??; AmershamBiosciences , Piscataway NJ) por 18 horas. Las células fueron lisadas y el ADN fue capturado sobre mallas de filtro de vidrio (Packard, Meriden CT) y contadas para la incorporación de 3H-timidina para evaluar la proliferación de las células. Los resultados mostraron que IL-21 a 0.3 pM y mayor tuvieron un efecto estimulador en combinación con anti-CD3 recubierto con 2 g/ml. El conjugado de IL-21-saporina no tuvo tal efecto estimulador. Este tampoco tuvo efecto inhibitorio en comparación con el estímulo de recubrimiento de 2 µg/ml de anti-CD3, solo. En suma, estos datos pueden ser interpretados para dar a entender que mientras un estímulo de IL-21 estaba presente en los pozos que contenían el conjugado de IL-21-saporina, el incremento esperado en una proliferación debida a la parte IL-21 de la molécula, fue abatido por la presencia de la porción saporina de la molécula conjugada. No obstante, la porción saporina de la molécula no abrogó el efecto estimulador debido al anticuerpo recubierto anti-CD3. D. El efecto del conjugado IL-21 humana- inmunotoxina saporina sobre las líneas de células T humanas Se sembraron células a 5,000 células/ml hasta 50,000 células/ml con cantidades molares equivalentes tituladas (0.2 pM a 400 pM) de IL-21 y conjugado IL-21-saporina. Después de 2 días de desarrollo las células fueron pulsadas con 5 µa/ml de 3H-timidina (AmershamBiosciences, Piscataway NJ) por 18 horas. Las células fueron ya sea Usadas y el ADN fue capturado sobre mallas de filtro de vidrio (Packard, Meriden CT) y contadas para la incorporación de 3H-timidina para evaluar la proliferación de las células. Las células MOLT-13 tratadas con IL-21 -saporina habían incorporado la 3H-timidina únicamente a 70% de la incorporación de 3H-timidina por las células MOLT-13 tratadas con IL-21. Las células HuT-78 tratadas con IL-21-saporina se desarrollaron únicamente a 33% de la densidad de las células HuT-78 no tratadas. Las células HuT-102 tratadas con IL-21-saporina se desarrollaron únicamente a 20% de la densidad de las células HuT-102 no tratadas. Las células DEL tratadas con IL-.21- saporina se desarrollaron únicamente a 25% de la" densidad de las células DEL no tratadas. Las células YT tratadas con IL-21-saporina se desarrollaron únicamente a 33% de la densidad de las células YT no tratadas. Los resultados indican que el conjugado de IL-21-toxina (saporina u otra) puede ser efectivo en controlar algunos tipos de neoplasmas de células T. Además, el conjugado de IL-21-inmunotoxina saporina, u otra fusión de IL-21-toxina, podría ser utilizada terapéuticamente en la prevención y tratamiento de las leucemias y linfomas de células T, y otros cánceres en donde son expresados los receptores de IL-21. Ejemplo 31 Efectos in vivo de IL-21 sobre linfomas de Células B Líneas celulares del linfoma B humano son mantenidas in vi tro mediante el pase en medio de crecimiento. Las células son lavadas perfectamente en PBS para eliminar los componentes del cultivo. Ratones SCID son inyectados con (típicamente) 1,000,000 de células de linfoma humano vía la vena de la cola en un volumen de 100 microlitros. (El número óptimo de células inyectadas es determinado empíricamente en un estudio piloto para producir la captación del tumor consistentemente con la cinética deseada) . El tratamiento con IL-21 es comenzado al siguiente día mediante implantación subcutánea de una minibomba osmótica ALZET® (ALZET, Cupertino, CA) o mediante la inyección i.p. diaria de IL-21 o vehículo. Los ratones son monitorizados para la supervivencia y la morbididad significativa. Los ratones que perdieron más de 20% de su peso corporal inicial son sacrificados, así como los ratones que muestran morbididad sustancial tales como la parálisis de las patas posteriores . Dependiendo de la linea celular del linforna empleada, los ratones no tratados típicamente mueren en 3 a 6 semanas. Para linfomas de células B que secretan IgG o IgM, la progresión de la enfermedad puede también ser monitorizada mediante el muestreo de sangre semanalmente y midiendo los niveles de inmunoglobulina humana en suero, mediante ELISA.

A. Modelo de respuesta a la dosis de IL-21/IM-9 Ratones fueron inyectados con 1 x 106 células IM-9, y al siguiente día se implantaron minibombas osmóticas por 28 días. Las bombas fueron cargadas con las siguientes concentraciones de IL-21 para distribuir: 0, 0.12, 1.2 ó 12 microgramos por día con 8 ratones por grupo de dosis. La IL-21 mostró un efecto claro dependiente de la dosis en la protección de los ratones de la línea celular tumoral . Los efectos de IL-21 fueron dependientes de la dosis. Los ratones sobrevivientes al experimento no tuvieron signos de enfermedad y no fue detectable la IgG humana en su suero. B. Modelo de agotamiento en NK por IL-21/IM-9 Los ratones fueron agotados de células NK mediante la administración de 5 dosis del anticuerpo anti-asialo-GM-1 cada tercer día comenzando 15 días antes de la inyección de las células tumorales, o se dejaron no agotados como controles. La mitad de los ratones agotados y no agotados fueron tratados con 12 de IL-21 y la otra mitad fue tratada con vehículo únicamente. El agotamiento de las células NK no disminuyó significativamente la actividad de IL-21. Estos datos demostraron que las células NK no son necesarias para el efecto de IL-21 en el modelo de IM-9 en ratones SCID. C. Otras líneas celulares probadas Las siguientes líneas celulares adicionales fueron probadas utilizando el modelo mostrado para las células IM-9. IL-21 distribuida a 12 g/día por minibomba es efectiva contra las células CESS en ratones SCID. La IL-21 administrada a ratones con los tumores implantados de células RAJI , no tuvieron eficacia. IL-21 administrada a ratones con los tumores implantados de células RAMOS no tuvieron eficacia. IL-21 administrada a ratones con tumores implantados de células HS SULTAN tuvieron la eficacia significativa, pero no previnieron la enfermedad en la mayoría de los ratones, únicamente retarda su inicio. IL-21 DoHH2 no tuvo eficacia. Estos datos demuestran que la eficacia de IL-21 en modelos de linfoma de ratones SCID correlaciona con la habilidad para inhibir el desarrollo de las líneas de células de linfoma in vivo. Además, el agotamiento de células NK de ratones SCID para las células T y las células B no disminuye la efectividad de IL-21 en el modelo de IM-9. Es probable que la eficacia de IL-21 en modelos de linfoma de ratón SCID sea dependiente de sus efectos directos sobre las células tumorales, debido a que no fue observada eficacia en tres de las tres líneas probadas en el modelo, que no fueron inhibidas por IL-21 in vi tro, y el agotamiento de NK no tuvo efecto sobre la eficacia de IL-21 en el modelo de IM-9. En un paciente, con un sistema inmune intacto, los efectos anti-tumorales mediados por las células efectoras dependientes de IL-21 son predichos a partir de los experimentos con ratones inmunocompetentes en modelos de tumor singénico. La demostración de los efectos anti-tumorales directos en ratones SCID sugiere que la terapia con IL-21 pudo haber combinado los efectos antitumorales directos y mediados por el efector, en las malignidades seleccionadas de células B en humanos. Ejemplo 32 Los Efectos de IL-21 en un Modelo de Carcinoma de Ovario Singénico de Ratón Se prueba el efecto de IL-21 para la eficacia en carcinoma de ovario utilizando un modelo singénico de ratón como se describe en Zhang et al., Am. J. of Pathol . 161: 2295-2309, 2002. En resumen, utilizando la transfección retroviral y la clasificación celular activada por fluorescencia es generada una línea de células de carcinoma de ovario ID8 murina de ratones C57BL6, que sobreexpresa establemente la isoforma VEGF164 murina y la proteína de fluorescencia verde aumentada (GFP) . La construcción retroviral que contiene los ADNcs de VEGF164 y de GFP fue transfectada dentro de células BOSC23. Las células fueron analizadas mediante clasificación celular FACS y las células altamente positivas a GFP son identificadas . Las células transfectadas con ID8 VEGF164/GFP son cultivadas hasta la subconfluencia y preparadas en una suspensión de células simples en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) MATRIGEL frío (BD Biosciences, Bedford, A) . Ratones C57BL6 hembra de seis a ocho semanas de edad son inyectados subcutáneamente en el flanco a 5x10s células O células control no transfectadas . Alternativamente, los ratones pueden ser inyectados intraperitonealmente a 7 x 106 células o las células control . Los animales son ya sea seguidos para la supervivencia o sacrificados ocho semanas después de la inoculación y evaluados para el desarrollo de los tumores. Los ratones son tratados con IL-21 murina recombinante comenzando 13 a 14 días después de la implantación del tumor, o cuando es establecido el injerto del tumor y la proporción de crecimiento. Los niveles de tratamiento de 0.5-5 mg/kg serán administrados en una base diaria por 5 a 14 días, y pueden ser continuados después de esto si no se observa evidencia de formación de anticuerpos neutralizadores . E emplo 33 Los Efectos de IL-21 en un Modelo RENCA de Ratón La eficacia de IL-21 en un modelo de carcinoma de células renales, es evaluada utilizando ratones BALB/c que han sido inyectados en células RENCA, un adenocarcinoma renal de ratón de origen espontáneo, esencialmente como se describe en Wigginton et al., J. Nat . Cáncer Instit. 88: 38-43, 1996. En resumen, los ratones BALB/c entre ocho y diez semanas de edad son inyectados con 1 x 105 células RENCA R dentro de la cápsula renal de los ratones. Doce días después de la implantación de las células tumorales, los ratones son nefarectomizados para retirar los tumores primarios. Los ratones se dejan recuperar de la cirugía, antes de la administración de IL-21. Los ratones son tratados con IL-21 murina recombinante, comenzando 3 a 14 días después de la implantación del tumor, o cuando el injerto del tumor y la proporción de crecimiento son establecidos. Los niveles de tratamiento de 0.5-5 mg/kg serán administrados en una base diaria por 5 a 14 días, y pueden ser continuados después de esto si no se observa evidencia de formación de anticuerpos neutralizadores . Alternativamente, las células RENCA pueden ser introducidas mediante inyección subcutánea (5 x 105 células) o intravenosa (1 x 105 células) . Los ratones son evaluados para la respuesta tumoral en comparación a .los ratones no tratados. La supervivencia es comparada utilizando el método de Kaplan-Meier, así como el volumen tumoral que es evaluado.

Ejemplo 34 Los Efectos de IL-21 en un Modelo de Tumor Colorrectal de Ratón Los efectos de IL-21 en un modelo de ratón colorrectal son probados como se describe en Yao et al., Cáncer Res., 63. 586-592, 2003. En este modelo, las células tumorales de colon de ratones MC-26 son implantadas en la subcápsula esplénica de ratones BALB/c. Después de 14 días, los ratones tratados son administrados con IL-21. Los ratones son tratados con IL-21 murina recombinante comenzando 3 a 14 días después de la implantación del tumor, o cuando se establece el injerto del tumor y la proporción de crecimiento. Los niveles de tratamiento de 0.5-5 mg/kg serán administrados en una base diaria por 5 a 14 días, y pueden ser continuados después de esto si no se observa evidencia de formación de anticuerpos neutralizadores . La eficacia de IL-21 en la prolongación de la supervivencia o la promoción de una respuesta tumoral, es evaluada utilizando las técnicas estándares descritas en la presente. Ejemplo 35 El Efecto de IL-21 en un Modelo de Cáncer Pancreático de Ratón Se evalúa la eficacia de IL-21 en un modelo de cáncer pancreático de ratón utilizando el protocolo desarrollado por Muckherjee et al., J. Immunol . 165: 3451-3460, 2000. En resumen, ratones transgénicos MUC1 (MUCl.Tg) son cruzados con ratones que expresan el oncogen, que espontáneamente desarrollan tumores del páncreas (ratones ET) designados como ratones MET.MUCl.Tg. Los ratones ET expresan los primeros 127 aminoácidos del antígeno T grande del SV40 bajo el control del promotor de elastasa de rata. Cincuenta por ciento de los animales desarrollan tumores pancreáticos que amenazan la vida, aproximadamente a las 21 semanas de edad. Las células son rutinariamente probadas mediante citometría de flujo por la presencia de MUC1. Todos los ratones están en el antecedente C57BL/6. Los animales son sacrificados y caracterizados a intervalos de 3 semanas de 3 a 24 semanas. Los ratones son cuidadosamente observados para los signos de enfermedad-salud, incluyendo letargía, distensión abdominal, falla para comer o beber, pérdida marcada de peso, heces pálidas, y postura encorvada. El páncreas completo es disectado para liberarlo de la grasa y de los nodulos linfáticos, pesado y dispersado sobre papel bibulus para la fotografía. Los nodulos son contados, y el páncreas es fijado en metacarn, procesado para microscopía mediante métodos convencionales, seccionado gradualmente a 5 µp? (aproximadamente 10 secciones por páncreas de ratón) , teñidos con hematoxilina y eosina, y examinados mediante microscopía de luz. Los tumores son obtenidos de ratones MET a diversos puntos de tiempo durante la progresión del tumor, fijados en metacarn (€0% de metanol, 30% de cloroformo, 10% de ácido acético glacial) , incrustados en parafina y seccionados para el análisis inmunohistoquímico . Los anticuerpos MUC1 utilizados son CT1, un anticuerpo policlonal de conejo que reconoce la región de cola citoplásmica de ratón y de humano de MUC1, HMFG-2 , BC2 y SM-3, que tienen epítopos en el dominio TR de UC1. La determinación de la actividad de CTL es realizada utilizando un método de liberación de 51Cr estándar después de una estimulación peptídica in vitro de seis días sin las citocinas adicionales agregadas. Los esplenocitos provenientes de ratones MET individuales son cosechados al hacerlos pasar a través de una malla de nailon, seguida por la lisis de las células sanguíneas rojas. Células simples provenientes de bazos de ratones MET son analizadas mediante inmunofluorescencia de dos colores para las alteraciones en las subpoblaciones de linfocitos: CD3, CD4, CD8, Fas, FasL, CDllc, y MHC clase I y II. Los niveles de citocina intracelular fueron determinados después de que las células son estimuladas con el péptido MUC1 (10 µg/ml por 6 días) y tratadas con brefeldina-A (también llamada Golgi-Stop; PharMingen) como es dirigido por la recomendación del fabricante (4 µ?/?.2 x 107 células/6 mi por 3 horas a 37°C antes de la tinción) . Las células son permeabil zadas utilizando el equipo de permeabilización PharMingen y teñidas para IFN-?, IL-2, IL-4 e IL-5 intracelulares como se describe por PharMingen. Todos los anticuerpos marcados fluorescentemente fueron adquiridos de PharMingen. El análisis citométrico de flujo fue realizado sobre FACScan Becton Dickinson utilizando el programa CellQuest (Becton Dickinson, Mountain View, CA) . Los ratones son tratados con IL-21 murina recombinante comenzando 3 a 14 días después de la implantación del tumor, o cuando se establece el injerto del tumor y la proporción de crecimiento. Los niveles de tratamiento de 0.5-5 mg/kg serán administrados en una base diaria por 5 a 14 días, y pueden ser continuados después de esto si no se observa evidencia de formación del anticuerpo neutralizador. Ejemplo 36 Los Efectos de IL-21 en un Modelo de Cáncer de Mama Murino La eficacia de IL-21 en un modelo murino para cáncer de mama, es realizada utilizando un modelo singénico como se describe en Colombo et al., Cáncer Research 62: 941-946, 2002. En resumen, las células TS/A que son un carcinoma mamario espontáneo para ratones BALB/C. Las células son cultivadas por aproximadamente una semana para seleccionar los clones. Las células TS/A seleccionadas son desarrolladas y utilizadas para retar ratones BR CD-1 nu/nu (Charles River Laboratories) por 2 x 102 células TS/A inyectadas, subcutáneamente en el flanco del ratón. Los ratones son tratados con IL-21 murina recombinante comenzando 3 a 14 días después de la implantación del tumor, o cuando el injerto del tumor y la proporción de crecimiento es establecida. Los niveles de tratamiento de 0.5-5 mg/kg serán administrados en una base diaria por 5 a 14 días, y pueden ser continuados después de esto si no se observa evidencia de formación de anticuerpos neutralizadores . Los tumores son extirpados después de sacrificar a los animales y analizados para el volumen y utilizando histoquímica e inmunohistoquímica . Ejemplo 37 Los Efectos de IL-21 en un Modelo de Cáncer de Próstata Murina Los efectos de IL-21 sobre la respuesta tumoral son evaluados en modelo de cáncer de próstata murino, utilizando un modelo similar a aquel descrito en Kwon et al., PNAS 96: 15074-15079, 1999. En este modelo, existe un sobredesarrollo metastático del adenocarcinoma transgénico de la línea celular de cáncer de próstata derivado de próstata de ratón (TRAMP) TRAMP-C2, que son implantados en ratones C57BL/6. La reincidencia metastática es confiable, ocurriendo principalmente en el drenado de los nodulos linfáticos en estrecha proximidad al tumor primario.

En resumen, la línea celular C2 utilizada como una línea de primer pase derivada de ratón TRAMP espontáneamente desarrolla tumores autóctonos atribuibles a la expresión del antígeno SV40 restringido a la próstata. Las células son cultivadas e inyectadas subcutáneamente en los ratones C57BL/6 a 2.5-5 x 106 células/0.1 mi de medio. Los ratones son tratados con IL-21 murina recombinante comenzando 3 a 14 días después de la implantación del tumor, o cuando se establece el injerto tumoral y la velocidad de crecimiento. Niveles de tratamiento de 0.5-5 mg/kg serán administrados en una base diaria por 5 a 14 días, y pueden ser continuados después de esto si no se observa evidencia de formación de anticuerpos neutralizadores . Los tumores son extirpados después de sacrificar a los animales y analizados para el volumen y utilizando histoquímica e inmunohistoquímica . Ejemplo 38 Los Efectos de IL-21 y Productos Quimioterapéuticos sobre el Desarrollo de las Líneas de Células B Humanas In vitro Se probaron los efectos de IL-21 y zeocina sola y en combinación sobre el desarrollo de líneas de células B humanas IM-9 y HS Sult n in vitro, para averiguar si los efectos inhibitorios del desarrollo/citotóxicos de IL-21 y un agente quimioterapéutico serán aditivos o sinérgicos sobre las líneas de células sensibles a IL-21. ZEOCINA (Invitrogen, Carlsbad, California) , es un antibiótico con un mecanismo de acción similar a la bleomicina quimioterapéutica relacionada utilizada . Las líneas de células IM-9 y HS Sultán fueron sembradas en placas a 50,000 células/ml en medio RPMI1640 suplementado con L-glutamina 2 mM y FBS al 10% inactivado por calor con y sin IL-21 (a 20 ng/ml) y/o ZEOCINA (a 15.6 µ9/t?1 para IM-9s y 31 µg/ l para HS Sultán) por dos días, luego las células fueron cosechadas y lavadas una vez para eliminar la zeocina y sembradas en placa nuevamente con o sin IL-21 en una dilución celular en serie, con seis pozos por dilución, en placas de fondo redondo de 96 pozos para determinar su habilidad relativa de crecimiento. Las placas fueron calificadas en 6 días utilizando azul Alamar, como una medida de las células viables por pozo, y reflejando su supervivencia y su sobredesarrollo a partir de tratamiento previo. Poblaciones celulares tratadas con zeocina tuvieron menos de un décimo de la capacidad de crecimiento de las células no tratadas, y la combinación de IL-21 con zeocina redujo adicionalmente la capacidad de crecimiento por aproximadamente un orden de magnitud. -Estos datos . sugieren que IL-21 podría ser exitosamente combinada con quimioterapia para aumentar las proporciones de respuesta en el tratamiento del linfoma.

Ejemplo 39 Modelos de LCMV Los modelos de LCMV son modelos in vitro para probar el efecto de un compuesto sobre las células infectadas con un miembro de la familia Faviviridae, del cual HCV es un miembro. Estos modelos son utilizados para evaluar el efecto que IL-21 tiene sobre CTLs y el efecto que IL-21 tiene sobre la carga viral. Existen dos modelos que son utilizados: la infección de LCMV Armstrong (aguda) y la infección del Clon 13 de LCMV (crónica). (Ver, por ejemplo, herry et al., J. Virol . 77: 4911-4927, 2003; Blattman et al., Nature Med. 9(5): 540-547, 2003; Hoffman et al., J. Immunol . 170: 1339-1353, 2003). Existen tres etapas del desarrollo de las células T CD8 en respuesta al virus: 1) expansión, 2) contracción, y 3) memoria (modelo agudo) . IL-21 es inyectada durante cada etapa para los modelos agudo y crónico. En el modelo crónico, se inyecta 60 días después de la infección para evaluar el efecto de IL-21. Para los modelos agudo y crónico, IL-21 es inyectada, y se examinan los siguientes parámetros: tinción con tetrámero por flujo para contar el número de células T CD8+ específicas de LCMV; la habilidad de las células tetrámero+ para producir citocinas cuando son "estimuladas con su antígeno de LCMV cognado; y la habilidad de las células T CD8+ específicas de LCMV para proliferar en respuesta a su antígeno LCMV cognado. Las células T específicas de LCMV son fenotipificadas mediante citometría de flujo para evaluar la activación de las células y el estado de diferenciación. También, se examina la habilidad de la CTL específica LCMV para lisar las células objetivo que llevan su antígeno LCMV cognado. Se evalúa el número y la función de las células T CD4+ específicas de LCMV, excepto para el ensayo de citólisis. El mejoramiento en la calidad y en la cantidad de las células T CD8+ específicas de LCMV, después de la administración de IL-21, es determinado. Específicamente, son mostrados los resultados en la producción incrementada de citocina, especialmente los porcentajes incrementados de lFN-? de las células tetrámeros- que proliferan, y un incremento en la actividad citolítica. El fenotipo de las células T CD8+ provenientes de ratones tratados con IL-21, refleja la diferenciación a una célula efectora, es decir, la pérdida de expresión de CD27 y la pérdida de expresión de CCR7 así como la expresión incrementada de perforina y de granzyme B. También, se muestra una reducción en la carga viral después del tratamiento con IL-21. Para ratones tratados con IL-21 es considerado significativo un incremento del 20% en el porcentaje de células T positivas al tetrámero que proliferan, elaboran citocina, o muestran un fenotipo maduro con relación a los ratones no tratados. Un incremento del 20% en la actividad citolítica es considerado significativo. Una inyección de IL-21 que conduce a una reducción en la carga viral es debida a control más efectivo de la infección viral, especialmente en el modelo crónico donde en los no tratados, los títulos virales permanecen elevados por un periodo de tiempo prolongado. Una reducción 5 veces en el título viral con relación a los ratones no tratados es considerada significativa. Ejemplo 40 Estudios ex vivo de CTL Humanas Provenientes de Ratones con HCV La sangre obtenida de los pacientes con HCV crónicamente infectados y CTL específica de HCV, es examinada in vitro después del cultivo con IL-21. Las células T específicas del HCV con enumeradas mediante tinción con los tetrámeros que contienen los péptidos HCV y las proteínas HLA solubles de la Clase I. Utilizando citometría de flujo, se evalúa la habilidad de las células T específicas de HCV CD8+ para proliferar y producir citocinas (especialmente interferón ? e IL-2) en respuesta a los antígenos de HCV incubados en presencia o ausencia de IL-21. Las CTLs específicas de HCV son fenotipificadas con respecto al estado de activación y a la función efectora (específicamente para la expresión de CD27 y CCR7) . Se evalúa también la actividad citolítica para las células objetivo aunadas a HLA que llevan péptidos de HCV. (Ver, por ejemplo, Wedemeyer et al., J. Immol . 169: 3447-58, 2002; Gruener et al., J. Virol . 75: 5550-58, 2001; Cramp et al., Gstroenterology 118: 346-55, 2000). El cultivo in vitro de las células T específicas del HCV con su antígeno cognado, con IL-21, es medido para demostrar la supervivencia, proliferación y producción de citocina, incrementadas, por la CTL, en comparación a aquellas cultivadas en medio únicamente. La actividad citolítica de las CTLs específicas del HCV es medida para demostrar los incrementos significativos después del cultivo en IL-21 con relación a las mismas CTL cultivadas en medio. Ejemplo 41 Modelo de Influenza de la Infección Viral Aguda A. Experimento Preliminar para probar la actividad antiviral Para determinar la actividad antiviral de IL-21 sobre el virus de la influenza y medir los diversos parámetros inmunes, se enfoca a la inmunidad mediada por las células y a la inmunidad humoral, un estudio in vivo utilizando ratones C57B1/6 infectados con la influenza, se realizó utilizando el siguiente protocolo: Animales : ratones BALB/c hembras de 6 semanas de edad (Charles River) con 148 ratones, 30 por grupo. Grupos : (1) Control absoluto (no infectado) para correrse en paralelo para el título del anticuerpo y la histopatología (2 animales por grupo) (2) Vehículo (i.p.) salina (3) Amantadina (control positivo) 10 mg/día durante 5 días (per os) comenzando 2 horas antes de la infección (4) Tratados con IL-21 (5 µg, i.p. comenzando 2 horas después de la infección) (5) IL-21 (25 µg i.p. comenzando 2 horas después de la infección) (6) IL-21 (125 µg i.p. comenzando 2 horas después de la infección) Día 0 -Excepto para los controles absolutos, todos los animales infectados con el virus de la influenza Para la carga viral (10 a LD50) Para el trabajo de inmunología (LD30) Día 0-9-Inyecciones diarias de IL-21 (i.p.) Peso corporal y apariencia general registradas (3 veces/semana) Día 3-Sacrificio de 8 animales por grupo Carga viral en el pulmón derecho (TCID50) Histopatología en el pulmón izquierdo Muestra de sangre para la titulación del anticuerpo Día 10-Sacrificio de todos los animales supervivientes recolectando muestras de sangre para la titulación del anticuerpo, aislando linfocitos de pulmón (4 combinados de 3) para el ensayo de CTL directo (en los 5 grupos) , y la inmunofenotipificación cuantitativa para los siguientes marcadores: CD3/CD4, CD3/CD8, CD3/CD8/CDllb, CD8/CD44/CD62L, CD3/DX5, GR-1/F480 y CD19. Los resultados demostraron que el tratamiento con IL-21 aumentó la actividad citolígica específica del virus de las células mononucleares pulmonares. Esta actividad de CTL aumentada es hipotetizada como importante para la resolución de la enfermedad viral humana. El tratamiento no tuvo efecto viral humano. El tratamiento no tuvo efecto significativo sobre la carga viral del día 4, la producción del anticuerpo a los 10 días o pérdida de peso. La falla para alterar la carga viral en el día 4 sugiere que el tratamiento con IL-21 no aumentó significativamente la actividad de NK. La producción del anticuerpo en el día 10 es un punto de tiempo temprano de significancia incierta. La falla para alterar la pérdida de peso sugiere que el aumento de la actividad de CTL por IL-21 fue inadecuado para alterar el curso de la infección. Esto pudo ser debido a que la infección fue simplemente demasiado agresiva . B. Experimento secundario para probar la actividad antiviral Estudio No. 1: 1. La determinación de LD50 de una nueva reserva de virus de influenza adaptado al ratón, y análisis de la capacidad para inducir respuestas inmunes en ratones C57B1/6 infectados. Primeramente, se producen y se titulan dos nuevas reservas del virus de la influenza humana. En segundo lugar, el segundo pase del virus adaptado al ratón se hace pasar en huevos embrionados. También, una reserva viral no adaptada (reserva congelada de la ATCC) pasada a huevos embrionados. En tercer lugar, una reserva control de fluido alantoico es preparada en huevos embrionados, inoculados con PBS . Ambas reservas son tituladas por HAU (utilizando 0.5% de eritrocitos de gallo) y TCID50 (utilizando células DCK) . Las reservas virales y el control con fluido alantoico se congelan a -80°C. 2. Determinación de la LD50 para reservas virales adaptadas al ratón en ratones C57B1/6 se realiza utilizando 6 ratones hembra C57B1/6 (de 8 semanas de edad) (Charles River) . Los ratones son administrados con una inoculación intranasal de 20 µ? con una micropipeta de los animales anestesiados (Ketamina/xilazina, i.p.), y luego se les administran 6 dosis de cada reserva viral (dilución 1/10) +PBS control. Existen 8 animales por dosis. Los números de animales son registrados diariamente, y el peso corporal se mide cada tercer día. En el día 14 después de la infección, el número de animales que sobrevivieron al reto con el virus y su peso corporal se registran, y se calcula la LD30 para ambas reservas virales para los ratones C57B1/6. - 3. Se analiza la respuesta inmune inducida por el virus de la influenza adaptada al ratón, en ratones C57BL/6. Las citotoxicidad mediada por CTL es evaluada utilizando células efectoras (células mononucleares de los pulmones) , 10 días después de la infección en ratones administrados con 1 LD30 de la reserva viral . Las células objetivo son la línea de células tumorales EL-4 infectada por la influenza (H-2b) de la ATCC #TIB39 (Brit . J. Cáncer 4: 372, 1950) . Se realizan los ensayos por cuadruplicado a diferentes proporciones E:T comenzando desde 50:1. Además de comparar la susceptibilidad a las células objetivo infectadas con el virus de la influenza A/PR/8/34 adaptado al ratón y no adaptado, las células objetivo no infectadas y las células EL-4 infectadas con el virus de la influenza B-Lee/40 son utilizadas para el control de especificidad. Se realizan tres experimentos para comparar las respuestas de CTL en ratones infectados con las reservas virales. Inmunofenotipificación: experimentos de inmunofenotipificación preliminares son realizados sobre 3 combinados de células mononucleares a partir de los pulmones cosechados en el día 10 después de la infección, de 3 ratones infectados con 1 LD30 del virus adaptado al ratón. Poblaciones de células pulmonares de interés son también determinadas en ratones C57BL/6 normales utilizando células combinadas de 8 ratones para cada determinación. Estos estudios utilizarán 44 animales . Estudio 2 : Para determinar las dosis infecciosas a las cuales los signos clínicos de enfermedad (pérdida de peso) no son demasiado severos, mientras que todavía inducen una respuesta de CTL pulmonar detectable pero menos que óptima, se realizó un estudio de respuesta a la dosis comenzando con la LD30 del virus adaptado al ratón. El experimento utiliza 40 ratones C57B1/6 hembra (8 semanas de edad) (Charles River) , y los animales son anestesiados. Existen 4 grupos de 2 animales para 1 LD30 y de 4 animales por dosis para dosis más bajas. Las dosis son 1 LD30, dilución 1/10, 1/100 del virus. El número de animales son registrados diariamente, y se registra el peso corporal cada tercer día. 10 días después de la infección: se registra el número de animales que sobrevivieron al reto con el virus y su peso corporal. En el día 10, los animales son sacrificados y evaluados para la inducción de CTL en 4 combinados por dosis (2 ó 4 animales por combinado) , utilizando EL-4 no infectadas, infectadas con A/PR/8/34 y con B/Lee/40 como objetivos, y 7 diferentes proporciones E :T (50/1, 25/1, 12/1, 6/1; 3/1, 1.5/1; y 0.75/1) . Estudio 3 : Estudio de eficacia de IL-21 en ratones C57B1/6 infectados con el virus adaptado al ratón, se realiza utilizando ratones C57B1/6 hembra de 8 semanas de edad (Charles River) . Los grupos tienen 36 animales por grupo. Grupo 1: Vehículo (i.p.) Grupo 2: Control positivo: anticuerpo neutralizador anti-influenza (A/USSR de cabra anti-influenza (H1N1) (Chemicon International, Temecula, CA) ; 40 µg/ratón a las 2 horas y 4 horas después de la infección (10 µ? intranasales ) Grupo 3: ZG-01 (5 µ?, i.p.) Grupo 4: ZG-01 (25 µ?, i.p.) Grupo 5: ZG-01 (125 µg, i.p.) Tabla 11 Grupos de Tratamiento Sacrificados en el día 10 Inmunología RNA+IHC+H&E Grupo 1 (28 ratones) 24 animales 4 animales Vehículo (6 ratones/combinado) Grupo 2 (28 ratones) 24 animales 4 animales + ve control (6 ratones/combinado) (anticuerpo neutralizador) Grupo 3 (28 ratones) 24 animales 4 animales IL-21 (5 µg) (6 ratones/combinado) Grupo 4 (28 ratones) 24 animales 4 animales IL-21 (25 µ?) (6 ratones/combinado) Grupo 5 (28 ratones) 24 animales 4 animales IL-21 (125 µ?) (6 ratones/combinado) Total 120 20 (140 animales) Se preparan observaciones de seguimiento de vida y de los tratamientos inmunológicos : Día 0 - todos los animales infectados con el virus de la Influenza (dosis determinada en el experimento 2) Día 0-9 - inyecciones diarias de IL-21 (i.p.) Se registran el peso corporal y la apariencia general cada tercer día. Día 10 - sacrificio de los animales sobrevivientes (24 animales serán utilizados para la evaluación inmune completa; 4 para el aislamiento de ADN y tinción con H&E) Aislamiento de linfocitos de pulmón (4 combinados de 6) para el ensayo de CTL directo en los pulmones (en los 5 grupos) utilizando EL-4 como objetivos y diferente proporción E:T (con base en los mejores resultados de los experimentos 1 y 2) . Tinción de tetrámero: El número de células T CD8+ que se enlazan a los tetrámeros HC de la Clase I que contienen el epítopo de la nucleoproteína de la influenza A (NP) son evaluados utilizando los complejos de MHC de la Clase I con péptidos virales: FLU-N03S6-374/Db (ASNENMETM) , (péptido LCMV/Db) . • La inmunofenotipificación cuantitativa de lo siguiente: CD8, tetrámero, IFN-? intracelular, NK1.1, CD8, tetrámero, CD62L, CD44, CD3 (+ o - ), NK1.1(+), IFN-? intracelular, CD4, CD8 , NK1.1, DX5 , CD3 (+ o -), NK1.1, DX5, tetrámero, muestras de color simples para el ajuste citométrico. Estudio de supervivencia/re-reto Tabla 12 Día 30: Estudio de supervivencia (12 animales por grupo) con ratones que son tratados por 9 días con diferentes dosis de IL-21 o con el anticuerpo control positivo antiinfluenza. Se miden el peso corporal y la producción de anticuerpo en muestras de suero individuales (Total, IgGl, IgG2a, IgG2b) . Estudio de re-reto: 2 grupos de 32 animales son utilizados en este estudio. Día -0: ambos grupos serán infectados con el virus A/PR (1 LD30) . El Grupo 6 no será tratado. El Grupo 7 será tratado por 9 días con 125 µg de IL-21.

Día 30: Estudio de supervivencia. Se miden el peso corporal y la producción de anticuerpo en muestras de suero individuales (Total, IgGl, IgG2a, IgG2b) . Día 60: Estudio de re-reto. Los sobrevivientes en cada grupo serán divididos en 2 subgrupos . El Grupo 6A y 7A serán retados nuevamente con el virus A/PR (1 LD30) . El Grupo 6B y 7B serán retados nuevamente con el virus A/PR (1 LD30) . Ambos grupos serán seguidos y .serán determinados el dxa del sacrificio. Se miden el peso corporal y la producción de anticuerpo en muestras de suero individuales (Total, IgGl, IgG2a, IgG2b) . De lo anterior, se apreciará que, aunque han sido descritas las modalidades específicas de la invención en la presente para fines de ilustración, pueden ser realizadas diversas modificaciones sin apartarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no está limitada excepto por las reivindicaciones anexas. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la- solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para tratar el linfoma no Hodgkin, caracterizado porque comprende administrarle a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21. 2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se ha mostrado que el polipéptido no provoca proliferación de las células cancerosas aisladas antes de la administración al sujeto. 3. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde el cáncer se selecciona del grupo de carcinoma renal, carcinoma epitelial, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon. 4. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido de una actividad funcional de IL-21, en donde el cáncer se selecciona del grupo de linfoma no Hodgkin, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon, y en donde existe una respuesta tumoral . 5. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde el cáncer se selecciona del grupo de linfoma no Hodgkin, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon, y en donde una respuesta tumoral es medida como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en el tiempo a la progresión. 6. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 80% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 7. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 90% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 8. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 95% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 9. El método de conformidad con las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, caracterizado porque el polipéptido es un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 10. Un método para el tratamiento de linfoma No Hodgkin caracterizado porque comprende administrarle a un sujeto en necesidad del mismo, una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión, que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21 y un segundo polipéptido. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se ha mostrado que el polipéptido no provoca proliferación de las células cancerosas aisladas antes de la administración al sujeto. 12. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende el administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiv de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, y el segundo polipéptido, en donde el cáncer se selecciona del grupo de carcinoma de células renales, carcinoma epitelial, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon. 13. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende el administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, y el segundo polipéptido, en donde el cáncer se selecciona del grupo de linfoma de no Hodgkin, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon, en donde existe una respuesta tumoral . 14. Un método para tratar el cáncer, caracterizado porque comprende el administrarle al sujeto una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, y el segundo polipéptido, en donde el cáncer se selecciona del grupo de linfoma de no Hodgkin, carcinoma de células renales, cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de ovario y cáncer de colon, y en donde una respuesta tumoral es medida como respuesta completa, respuesta parcial o reducción en el tiempo para la progresión. 15. El método de conformidad con las reivindicaciones 10, 11, 12, 13 ó 14, caracterizado porque el primer polipéptido tiene al menos 80% de identidad a un ·' polipéptido IL 21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO : 2 o los residuos 32 (Gln) a 152 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 16. El método de conformidad con las reivindicaciones 10, 11, 12, 13 ó 14, caracterizado porque el primer polipéptido tiene al menos 90% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 17. El método de conformidad con las reivindicaciones 10, 11, 12, 13 ó 14, caracterizado porque el primer polipéptido tiene al menos 95% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 18. El método de conformidad con las reivindicaciones 10, 11, 12, 13 ó 14, caracterizado porque el primer polipéptido es un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 19. Un método para tratar una infección, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde la infección se selecciona del grupo de virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana, síndrome respiratorio agudo súbito provocado por un coronavirus, virus del herpes simple, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus de la viruela; virus del papiloma; adenovirus, poliovirus; ortomyxovirus, paramyxovi us, virus de la influenza; calicivirus ; virus de la rabia, y virus de ganado vacuno . 20. Un método para tratar una infección viral en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde la infección viral da como resultado una enfermedad seleccionada del grupo que consiste de inmunodeficiencia adquirida; hepatitis; gastroenteritis; enfermedades hemorrágicas ; enteritis; carditis; encefalitis; parálisis; bronquiolitis ; enfermedad respiratoria superior e inferior; papilomatosis respiratoria; artritis; enfermedad diseminada; meningitis; y mononucleosis . 21. El método de conformidad con las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 80% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 22. El método de conformidad con las reivindicaciones 19 6 20, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 90% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 23. El método de conformidad con las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 95% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 2 . El método de conformidad con las reivindicaciones 19 ó 20, caracterizado porque el polipeptido es un polipeptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 25. Un método para el tratamiento de una infección, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, y un segundo polipéptido en donde la infección se selecciona del grupo de virus de la hepatitis B, virus de la hepatitis C, virus de inmunodeficiencia humana, síndrome respiratorio agudo súbito provocado por un coronavirus, virus del herpes simple, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus , virus de la viruela; virus del papiloma; adenovirus, poliovirus; ortomyxovirus, paramyxovirus, virus de la influenza; calicivirus; virus de la rabia, y virus del ganado bovino. 26. El método de conformidad con las reivindicaciones 19, 20 ó 25, caracterizado porque el nivel de infección viral es reducido. 27. El método de conformidad con las reivindicaciones 19, 20 ó 25, caracterizado porque se mide una reducción en el nivel de infección viral, como la reducción en la carga viral, anticuerpos específicos virales incrementados, reducción del nivel de alanina-aminotransferasa (ALT) , o mejoramiento histológico en un tejido objetivo, como se mide mediante inmunohistoquimica. 28. Un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, caracterizado porque comprende el administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un polipéptido que tiene una actividad funcional de IL-21, en donde la infección bacteriana es una infección por una bacteria seleccionada del grupo que consiste de cla ydiae, listeriae, Helicobacter pylori, mycobacterium, micoplas a, salmonella, y shigella. 29. método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 80% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 90% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido tiene al menos 95% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 32. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque es un polipéptido IL-21 que comprende los residuos los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 33. Un método para el tratamiento de una infección bacteriana en un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína de fusión que comprende un primer polipéptido que tiene la actividad funcional de IL-21 y un segundo polipéptido, en donde la infección bacteriana es una infección por una bacteria seleccionada clamydiae, listeriae, Helicobacter pylori, ycobacterium, micoplasma, salmonella, y shigella. 34. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el primer polipéptido tiene al menos 80% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 35. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el primer polipéptido tiene al menos 90% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 36. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el primer polipéptido tiene al menos 95% de identidad a un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2. 37. El método de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado porque el primer polipéptido es un polipéptido IL-21 que comprende los residuos 41 (Gln) a 148 (lie) de la SEQ ID NO: 2 o los residuos 32 (Gln) a 162 (Ser) de la SEQ ID NO: 2.