MXPA04011425A - Metodos que utilizan una combinacion de un inhibidor de 3-heteroaril-2-indolinona y de ciclooxigenasa-2 apra el tratamiento de neoplasia. - Google Patents

Metodos que utilizan una combinacion de un inhibidor de 3-heteroaril-2-indolinona y de ciclooxigenasa-2 apra el tratamiento de neoplasia.

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Abstract

La presente invencion provee metodos y composiciones utiles para el tratamiento o prevencion de neoplasia al administrar una combinacion que comprende un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona y un inhibidor selectivo de COX-2; ademas se proveen composiciones, composiciones farmaceuticas y paquetes para el tratamiento y prevencion de neoplasia.

Description

METODOS QUE UTILIZAN UNA COMBINACION DE UNA 3-HETEROARIL- 2-INDOLINONA Y UN INHIBIDOR DE CICLOOXIGENASA-2 PARA EL TRATAMIENTO DE NEOPLASIA CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones y métodos que utilizan combinaciones de un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona y un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 (COX-2) para el tratamiento de neoplasias.
ANTECEDENTES DE LA INVENCION Un neoplasma o tumor es una proliferación anormal, sin regulación y desorganizada del crecimiento de células. Un neoplasma es maligno o canceroso si tiene propiedades de crecimiento destructivo, invasividad y metástasis. La invasividad se refiere a la dispersión local de un neoplasma por infiltración o destrucción del tejido circundante, típicamente abriéndose paso a través de las láminas básales que definen los límites de los tejidos y de esta manera con frecuencia entran al sistema circulatorio del cuerpo. La metástasis típicamente se refiere a la diseminación de las células tumorales por los vasos linfáticos o sanguíneos. La metástasis también se refiere a la migración de células tumorales por extensión directa a través de las cavidades cerosas o subaracnoideas u otros espacios. A través del proceso de metástasis, la migración de células tumorales a otras áreas del cuerpo establece neoplasmas en áreas alejadas del sitio de aparición inicial. El cáncer ahora es la segunda causa de muerte en los Estados Unidos en donde más de 8,000,000 de individuos se les ha diagnosticado alguna forma de cáncer. En 1995, el cáncer constituía el 23.3% de todas las muertes en Estados Unidos (véase U.S. Dept. of Helath and Human Services, National Center for Health Statistics, Health United States 1996-97 and Injury Chartbook 117 (1997)). El cáncer no ha sido comprendido completamente a nivel molecular. Se sabe que la exposición de una célula a un carcinógeno tales como ciertos virus, sustancias químicas o radiación genera una alteración del ADN que inactiva un gen "supresor" o que activa un "oncogen". Los genes supresores son genes reguladores del crecimiento los cuales, ante la mutación, ya no pueden controlar el crecimiento celular. Los oncogenes son inicialmente genes normales (denominados protooncogenes) que, por mutación o un contexto de expresión alterado se vuelven genes transformantes. Los productos de los genes transformantes provocan crecimiento inapropiado de las células. Más de 20 genes celulares normales diferentes se vuelven oncogenes por alteración genética. Las células transformadas difieren de las células normales de muchas maneras, que incluyen morfología celular, interacciones célula a célula, contenido de membrana, estructura del citoesqueleto, secreción proteínica, expresión de genes y mortalidad (las células transformadas pueden crecer indefinidamente). El cáncer ahora es tratado principalmente con uno o una combinación de tres tipos de tratamientos: cirugía, radiación y quimioterapia. La cirugía involucra la extirpación en volumen del tejido enfermo. Aunque la cirugía algunas veces es eficaz para eliminar tumores que se localizan en ciertos tejidos, por ejemplo en la mama, colon y piel, no se puede utilizar en el tratamiento de tumores que se localizan en otras áreas tales como la médula espinal, ni el tratamiento de condiciones diseminadas neoplásicas tales como leucemia. La quimioterapia involucra la interrupción de la replicación celular o del metabolismo celular. Se utiliza con mayor frecuencia en el tratamiento de cáncer de mama, de pulmón y testicular. Los efectos adversos de la quimioterapia sistémica utilizada en el tratamiento de enfermedades neoplásicas son muy temidas por pacientes que experimentan tratamientos para el cáncer. De estos efectos adversos la náusea y el vómito son los efectos secundarios más comunes y graves. Otros efectos secundarios perjudiciales incluyen citopenia, infección, caquexia, mucositis en pacientes que reciben altas dosis de quimioterapia con rescate de médula ósea o terapia de radiación; halopecia (pérdida de pelo); complicaciones cutáneas (véase M.D. Abeloff, et al: Alpecia and Cutaneous Complications. P. 755-56. En Abeloff, M.D., Armitage, J.O., Lichter, A.S., and Niederhuber, J.E. (eds) Clinical Oncology. Churchill Livingston, New York, 1992, para reacciones cutáneas a agentes quimioterapéuticos), tales como prurito, urticaria y angioedema; complicaciones neurológicas; complicaciones pulmonares y cardíacas en pacientes que reciben radiación o quimioterapia; y complicaciones tanto en la reproducción como en el sistema endocrino. Los efectos secundarios inducidos por quimioterapia tienen un impacto significativo en la calidad de vida del paciente y pueden alterar de manera notable el cumplimiento del paciente con el tratamiento. Adicionalmente, los efectos secundarios adversos asociados con los agentes quimioterapéuticos generalmente son una toxicidad mayor limitante de la dosis (DLT) en la administración de estos medicamentos. Por ejemplo, la mucositis es una toxicidad limitante de dosis principal para varios agentes anticancerígenos que incluyen los agentes citotóxicos antimetabolito 5-FU, metotrexato y antibióticos antitumorales tales como doxorrubicina. Muchos de estos efectos secundarios inducidos por quimioterapia son graves y pueden llevar a hospitalización o requieren tratamiento con analgésicos para el tratamiento del dolor. Los efectos secundarios adversos inducidos por agentes quimioterapéuticos y radioterapia se han vuelto de importancia principal en la administración clínica de pacientes con cáncer. La patente de E.U.A. No. 5,843,925 describe un método para inhibir angiogénesis y proliferación de células endoteliales utilizando 7-[amino sustituido]-9-[(glicilo sustituido)amido]-6-desmetil-6-desoxitetraciclina.
La patente de E.U.A. No. 5,854,205 describe una proteína de endostatina aislada que es un inhibidor de la proliferación y angiogénesis de células endoteliales. La patente de E.U.A. No. 5,863,538 describe métodos y composiciones para dirigir vasculatura tumoral de tumores sólidos utilizando reactivos inmunológicos y basados en factor de crecimiento, en combinación con quimioterapia y radiación. La patente de E.U.A. No. 5,837,682 describe el uso de fragmentos de un inhibidor de proliferación de células endoteliales, angiostatina. La patente de E.U.A. No. 5,861,372 describe el uso de inhibidor endotelial agregado, angiostatina y su uso en la inhibición de angiogénesis. El documento PCT/US97/09610 describe la administración de un anticuerpo monoclonal contra endogina o fragmentos del mismo, los cuales se conjugan a por lo menos un inhibidor de angiogénesis o un agente antitumoral para uso en el tratamiento de tumores y enfermedades asociadas con angiogénesis. El documento PCT/IL96/00012 describe un fragmento de la cadena B de trombina para el tratamiento de cáncer. El documento PCT/US95/16855 describe composiciones y métodos para destruir células tumorales seleccionadas utilizando vectores virales recombinantes.
Ravaud, A. et al. describen la eficacia y tolerancia de interleucina-2 (IL-2), interferón a-2a, y fluorouracilo en pacientes con carcinoma de células renales metastásicas. J. Clin. Oncol. 16, No. 8, 2728-32, 1998. Stadler, W.M. et al. describen la tasa de respuesta y la toxicidad de ácido 13-cis-retinoico oral agregado a un régimen en pacientes ambulatorios de interleucina-2 subcutánea e interferón a en pacientes con carcinoma de células renales metastásicos. J. Clin. 16, No. 5, 1820-25, 1998. Rosenbeg, S.A. et al. describen el tratamiento de pacientes con melanoma metastásico utilizando quimioterapia con cisplatino, dacarbazina y tamoxifeno solos o combinados con interleucina-2 e interferón a-2b. J. Clin. Oncol. 17, No. 3, 968-75, 1999. Tourani, J-M. et al describen el tratamiento de carcinoma de células renales utilizando interleucina-2 e interferón a-2a administrado combinado con fluorouracilo. J. Clin. Oncol. 16, No. 7, 2505-13, 1998. Majewski, S. describe la acción anticancerígena de retinoides, vitamina D3 y citocinas (interferones e interleucina-12) en relación con los efectos antiangiogénicos y antiproliferativos. J. Invest. Dermatol. 108, No. 4,571 ,1997. Ryan, C.W. describe el tratamiento de pacientes con cáncer de células renales metastásicas con GM-CSF, interleucina-2 e interferón a más acido cis-retinoico oral en pacientes con cáncer de células renales metastásico. J. Invest. Med. 46, No. 7, 274A, 1998.
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La patente de E.U.A. No. 5,837,696 describe el uso de compuestos de tetraciclina para inhibir el crecimiento de cáncer. El documento WO 97/48,685 describe varios compuestos sustituidos que inhiben a metaloproteasas. El documento EP 48/9,577 describe derivados de peptidilo utilizados para evitar la metástasis e invasión por células tumorales. El documento WO 98/25,949 describe el uso de N5-sustituido 5-amino-1 ,3,4-tiadiazol-2-tioles para inhibir las enzimas metaloproteinasa. El documento WO 99/21 ,583 describe un método para inhibir metástasis en pacientes que tienen cáncer en ios cuales se expresa de manera predominante p53 de tipo silvestre utilizando una combinación de radioterapia y un inhibidor selectivo de matriz de metaloproteinasa-2. El documento WO 98/33,768 describe los derivados de ácido arilsulfonilaminohidroxámico en el tratamiento de cáncer. El documento WO 98/30,566 describe derivados de sulfona cíclicos útiles en el tratamiento de cáncer. El documento WO 98/34,981 describe derivados de ácido arilsulfonilhidroxámico útiles en el tratamiento de cáncer. El documento WO 98/33,788 describe el uso de derivados de ácido carboxílico o hidroxámico para el tratamiento de tumores. El documento WO 97/41,844 describe un método que utilizar combinaciones de compuestos angiostáticos para la prevención o tratamiento de neovascularización en pacientes humanos.
El documento EP 48/9,579 describe derivados de peptidilo con acción selectiva de gelatinasa que pueden ser de uso en el tratamiento de cáncer y para controlar metástasis tumoral. El documento WO 08/03,516 describe compuestos basados en fasfinato útiles en el tratamiento de cáncer. El documento WO 93/24,475 describe derivados de sulfamida que pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer para controlar el desarrollo de metástasis. El documento WO 98/16,227 describe un método para utilizar [Pirozol-1-il]bencensulfonamidas en el tratamiento y prevención de neoplasias. El documento 98/22,101 describe un método para utilizar [Pirozol-1-il]bencensulfonamidas como agentes antiangiogénicos. El documento WO 96/03,385 describe compuestos de pirazol 3,4-disustituidos que se proporcionan solos o combinados con los AINE, esteroides, inhibidores de 5-LO, antagonistas de LTB4 o inhibidores de hidrolasa LTA4 que pueden ser útiles en el tratamiento de cáncer. El documento WO 98/47,890 describe derivados de benzopirano sustituidos que pueden ser utilizados solos o combinados con otros principios activos. Se han descubierto compuestos que inhiben selectivamente a ciclooxigenasa-2. Estos compuestos inhiben de manera selectiva la actividad de COX-2 en un grado mayor que la actividad de Cox- . Se considera que los inhibidores selectivos de COX-2 ofrecen ventajas que incluyen la capacidad de evitar o reducir la inflamación y al mismo tiempo evitan efectos secundarios dañinos asociados con la inhibición de Cox-1. De esta manera, los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 han demostrado ser promisorios para uso en tratamientos -especialmente en tratamientos que requieren administración extensa por ejemplo para el dolor y control de inflamación para artritis. La • información adicional respecto a la identificación de inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 se puede encontrar en: (1 ) Buttgereit, F. et al., Am. J. Med., 110(3 Suppl. i;. 3-9 (2001 ); (2) Osiri, M. et al, Arthritis Care Res., 12(5):351- 62 (1999); (3) Buttar, N.S. et al., Mayo Clin. Proc, 75(70 ;1027-38 (2000); (4) Woliheim, F. A., Current Opin. Rheumatol., 3:193-201 (2001); (5) patentes de E.U.A. Nos. 5,434,178 (compuestos pirazol 1,3,5-trisustituidos); (6) 5,476,944 (derivados de tioéteres fenólicos cíclicos); (7) 5,643,933 (sulfonilfenilheterociclos sustituidos); 5,859,257 (compuestos de isoxazol); (8) 5,932,598 (precursores de bencensulfonamida que contienen inhibidores de COX-2); (9) 6,156,781 (pirazolilbencensulfonamidas sustituidas); y (10) 6,1 10,960 (para dihidrobenzopirano y compuestos relacionados). Se ha reportado la eficacia y los efectos secundarios de inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 para el tratamiento de inflamación. Las referencias incluyen: Hillson, J. L. et al., Expert Opin. Pharmacother., 1(5) \ 053-66 (2000), (para rofecoxib, VioxxMR, Merck & Co., Inc.); Everts, B. ef al., Clin. 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El celecoxibMR, un inhibidor selectivo de COX-2, ejerce una inhibición potente en la angiogénesis de córnea inducida por factor de crecimiento de fibroblastos en ratas. (Masferrer eí ai, Proc. Am. > ssoc. Cáncer Research 1999, 40:396). El documento WO 98/41511 describe derivados de 5-(4-sulfunilfenil)-piridazinona útiles para tratar cáncer. El documento WO 98/41516 describe derivados de (metilsulfonil)fenil-2-(5H)-furanona que pueden ser utilizados en el tratamiento de cáncer. Kalgutkar, A.S. et al., Curr. Drug. Targets, 2(1 ):79 -106 (2001 ) sugiere que los inhibidores selectivos de COX-2 puedan ser utilizados para evitar o tratar el cáncer al alterar la viabilidad, crecimiento y metástasis tumorales. Masferrer et al., en Ann. NY Acad. Sci., 889:84 - 86 (1999) describe inhibidores selectivos de COX-2 como agentes antiangiogénicos con potencial utilidad terapéutica en varios tipos de cánceres. La utilidad de la inhibición de COX-2 en la prevención de cáncer clínico fue descrita por Lynch, P. M., en Oncology, 15(3) 21 - 26 (2001), y Watanabe et al., en Biofactors 2000, 12 (1 - 4,1:129 - 133 (2000) describen el potencial de inhibidores selectivos de COX-2 para agentes quimiopreventivos contra el cáncer de colon. Adicionalmente también se han reportado diversos tratamientos combinados que utilizan inhibidores de COX-2 con otros regímenes de combinación seleccionados para el tratamiento de cáncer. Véase, por ejemplo FR 27 71 005 (composiciones que contienen un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un antagonista de N-metil-d-aspartato (NMDA) utilizado para tratar cáncer y otras enfermedades); WO 99/18960 (combinación que comprende un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un inhibidor inducido de óxido nítrico sintasa (¡NOS) que se puede utilizar para tratar cáncer colorrectal y de mama); WO 99/13799 (combinación de un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un analgésico opioide); WO 97/36497 (combinación que comprende un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un inhibidor de 5-lipooxigenasa útil para tratar el cáncer); WO 97/29776 (composición que comprende un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un antagonista de receptor de leucotrieno B4 y un medicamento ¡nmunosupresor); WO 97/29775 (el uso de un inhibidor de ciclooxigenasa-2 combinado con inhibidor de leucotrieno A4 hidrolasa en un medicamento ¡nmunosupresor); WO 97/29774 (combinación de un inhibidor de cicloox¡genasa-2 y prostaglandina o agente antiúlcera útil en el tratamiento de cáncer); WO 97/11701 (combinación que comprende un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un antagonista de receptor de leucotrieno B útil para tratar cáncer colorrectal); WO 96/41645 (combinación que comprende un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y un inhibidor de leucotrieno A hidrolasa); WO 96/03385 (compuestos de pirazol 3, 4-d ¡sustituidos que se proporcionan solos o combinados con AINES, esteroides, inhibidores de 5-LO, antagonistas de LTB4 o inhibidores de hidrolasa LTA4 para el tratamiento de cáncer); WO 98/47890 (derivados de benzopiranos sustituidos que pueden ser útiles solos o combinados con otros principios activos); WO 00/38730 (método que utiliza un inhibidor de ciclooxigenasa-2 y uno o más agentes antineoplásicos como un tratamiento combinado en el tratamiento de neoplasia); Mann, M. et ai, Gastroenterology, 120(7)-A 7 3 - 1719 (2001 ) (tratamiento combinado con COX-2 e inhibidores de HER-2/neu que reducen el crecimiento de carcinoma colorrectal. De esta manera, es deseable desarrollar métodos novedosos o mejorados para el tratamiento y prevención de neoplasias.
BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Brevemente, por lo tanto, la presente invención se relaciona con un método novedoso para el tratamiento o prevención de trastornos de neoplasia en un sujeto en necesidad de tal tratamiento o prevención, en donde el método comprende administrar al sujeto una combinación que comprende un compuesto de 3-heteroar¡l-2-indolinona o un precursor (profármaco o promedicamento) del mismo y un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o un precursor del mismo. En una modalidad, las 3-heteroaril-2-indolinonas de la presente invención incluyen compuestos que tienen la fórmula: en donde: R-i es H o alquilo; R2 es O o S; R3 es hidrógeno, R4, R5, R6 y R7 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halógeno, trihalometilo, S(0)R, S02NRR\ S03R, SR, N02, NRR\ OH, CN, C(O)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH3)nC02R, y CONRR'; A es un anillo heteroarilo de cinco miembros que se selecciona del grupo que consiste de tiofeno, pirrol, pirazol, imidazol, 1 ,2,3-triazol, 1 ,2,4-triazol, oxazol, isoxazol, tiazol, ¡sotiazol, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1 ,2,3-oxadiazol, 1 ,2,4-oxadiazol, 1 ,2,5-oxadiazol, 1 ,3,4-oxadiazol, 1 ,2,3,4-oxatriazol, 1 ,2,3,5-oxatriazol, 1 ,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1 ,2,5-tiadiazol, 1 ,3,4- tiadiazol, 1 ,2,3,4-tiatriazol, 1 ,2,3,5-tiatriazol y tetrazol, opcionalmente sustituido con una o más posiciones con alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halógeno, trihalometilo, S(0)R, S02NRR\ S03R, SR, N02> NRR', OH, CN, C(0)R, OC(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R y CONRR'; n es 0-3; R es H, alquilo o arilo; y R' es H, alquilo o arilo. Los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona de la presente invención incluyen, pero no se limitan a 3-[(3-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(2-metiltien-5-il)metileno]2-indolinona; 3-3-metiltien-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-{[4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il)]met¡len}-2-indolinona; 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-[(5-metil¡midazol-2-il)metilen]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)met¡lenl]-2-indolinona; 3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona; 3-[(3-(2-carboxietil)-4-metilpirrol-5-il)metilen]-2-indol¡nona; 5-cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; y 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-¡ndolinona, y precursores de los mismos. En una modalidad preferida de la invención, el compuesto es 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5416) o un precursor del mismo. La presente invención también se relaciona con una composición novedosa para el tratamiento o prevención de neoplasias, que comprende al compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o un precursor del mismo y un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 o un precursor del mismo. La presente invención también se relaciona con una composición farmacéutica novedosa que comprende una 3-heteroaril-2-indolinona o un precursor del mismo, un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 o un precursor del mismo y un excipiente farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, el compuesto 3-heteroaril-2-indolinona es 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]2-indolinona (SU5416) o un precursor del mismo. La presente invención también se relaciona con un equipo novedoso que es adecuado para uso en el tratamiento o prevención de neoplasia, en donde el equipo comprende una primera forma de dosificación que comprende un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o un precursor del mismo, y una segunda forma de dosificación que comprende un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 o un precursor del mismo, en cantidades las cuales comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos para el tratamiento o prevención de un trastorno neoplásico.
DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El término "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifático de cadena lineal, ramificada o cíclico, saturado. Preferiblemente, el grupo alquilo tiene 1 a 12 carbonos. De manera más preferible, es un alquilo inferior de 1 a 7 carbonos, de manera más preferible de 1 a 4 carbonos. Los grupos alquilo típicos incluyen metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, terbutilo, pentilo, hexilo y similares. El grupo alquilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, N02, halógeno, N(CH3)2 amino, y SH. El término "alquenilo" se refiere a un grupo de hidrocarburo de cadena lineal, ramificada o cíclica insaturado que contiene por lo menos un enlace doble carbono-carbono. Preferiblemente, el grupo alquenilo tiene 1 a 12 carbonos. De manera más preferible es un alquenilo inferior de 1 a 7 carbonos, de manera más preferible de 1 a 4 carbonos. El grupo alquenilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, O2, halógeno, N(CH3)2, amino y SH. El término "alquinilo" se refiere a un hidrocarburo de cadena lineal, ramificada o cíclica insaturado que contiene por lo menos un enlace triple carbono-carbono. Preferiblemente, el grupo alquinilo tiene de 1 a 12 carbonos. De manera más preferible, es un alquinilo inferior de 1 a 7 carbonos, de manera más preferible de 1 a 4 carbonos. El grupo alquinilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de hidroxilo, ciano, alcoxi, =0, =S, N02, halógeno, N(CH3)2, amino y SH. El término "alcoxi" se refiere a un grupo "-O-alquilo", El término "arilo" se refiere a un grupo aromático el cual tiene por lo menos un anillo que tiene un sistema de electrones p conjugados y que incluyen grupos arilcarboxílico, aril heterocíclico y biarilo. El grupo arilo puede estar sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes que se seleccionan del grupo que consiste de halógeno, trihalometilo, hidroxilo, SH, OH, NO2, amina, tioéter, ciano, alcoxi, alquilo y amino. El término "alcarilo" se refiere a un alquilo que está unido covalentemente a un grupo arilo. Preferiblemente, el alquilo es un alquilo inferior. El término "arilo carbocíclico" se refiere a un grupo arilo en donde los átomos en el anillo son carbono. El término "arilo heterocíclico" se refiere a un grupo arilo que tiene de 1 a 3 heteroátomos como átomos en el anillo, el resto de los átomos en el anillo son carbono. Los heteroátomos incluyen oxígeno, azufre y nitrógeno. Por lo tanto, los grupos arilo heterocíclicos incluyen furanilo, tienilo, piridilo, pirrolilo, N-alquilo inferior pirrólo, pirimidilo, pirazinilo, imidazolilo y similares. El término "amida" se refiere a -C(0)--NH~R, en donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno. El término "tioamida" se refiere a -C(S)-NH-R, en donde R es alquilo, arilo, alquilarilo o hidrógeno.
El término "amina" se refiere a un grupo -N(R')R", en donde R' y R" se seleccionan independientemente del grupo que consiste de alquilo, arilo y alquilarilo. El término "tioéter" se refiere a -S--R, en donde R es alquilo, arilo o alquilarilo. El término "sulfonilo" se refiere a -S(0)2-R, en donde R es arilo, C(CN)=C-arilo, CH2) CN, alquilarilo, sulfonamida, NH-alquilo, NH-alquilar¡lo o NH-arilo. Como se utiliza en la presente, el término "3-heteroaril-2-indolinona" incluye sales farmacéuticamente aceptables del mismo. Como se utiliza en la presente, el precursor 3-heteroaril-2-¡ndolinona se refiere a un agente que se convierte a la 3-heteroaril-2-indolinona original in vivo. Los precursores pueden ser más fáciles de administrar que el medicamento original en algunas situaciones. Por ejemplo, el precursor puede estar biodisponible por administración oral pero el compuesto original no, o el precursor puede mejorar la solubilidad para permitir la administración intravenosa. Una clase de precursores de 3-heteroaril-2-indolinonas se describen en la patente de E.U.A. No. 6,316,635. La referencia en la presente a "indolinonas", "oxiindoles", "compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona", etc. incluye los precursores de los mismos, a menos que el contexto no lo permita así. La presente invención proporciona métodos para el tratamiento o prevención de neoplasias en un sujeto en necesidad de tal tratamiento o prevención, en donde el método comprende administrar al sujeto una combinación que comprende un compuesto de 3-heteroaril-2-¡ndolinona o un precursor del mismo y un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 o un precursor del mismo. Los métodos y combinaciones de la presente invención se pueden utilizar para el tratamiento o para prevención de trastornos de neoplasia que incluyen melanoma acral lentiginoso, queratosis actínica, adenocarcinoma, carcinoma cístico adenoide, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoscamoso, tumores astrocíticos, carcinoma de la glándula de bartolini, carcinoma de células básales, carcinomas de glándulas bronquiales, capilares, carcinoides, carcinoma, carcinosarcoma, cavernoso, cnolangiocarcinoma, condosarcoma, papiloma/carcinoma del plexo coroideo, carcinoma de células del cristalino, cistadenoma, tumor de seno endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, ependimal, epiteloide, sarcoma de EWing, fibrolamelar, hiperplasia nodular focal, gastrinoma, tumores de células germinales, glioblastoma, glucagonoma, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatosis hepática, carcinoma hepatocelular, insulinoma, neoplasia intaepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales, carcinoma de células escamosas invasivas, carcinoma de células grandes, leiomiosarcoma, melanomas de lentigo maligno, melanoma maligno, tumores mesoteliales malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, meningio, mesotelial, carcinoma metastásico, carcinoma mucoepidermoide, neuroblastoma, melanoma nodular de adenocarcinoma neuroepitelial, carcinoma de células de avena, oligodendroglial, osteosarcoma, polipéptido pancreático, adenocarcinoma ceroso papilar, células pineales, tumores de la hipófisis, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma ceroso, carcinoma de células pequeñas, carcinomas de tejido suave, tumor secretor de somatostatina, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, submesotelial, melanoma de dispersión superficial, carcinoma no diferenciado, melanoma uveal, carcinoma verrucoso, vipoma, carcinoma bien diferenciado y tumor de Wilm. En una modalidad, los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona de la presente invención incluye compuestos que tienen la fórmula: en donde: Ri es H o alquilo; R2 es O o S; R3 es hidrógeno, R4. R5, R6 y 7 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halógeno, trihalometilo, S(0)R, S02NRR', S03R, SR, N02, NRR', OH, CN, C(0)R, OC(0)R, NHC(0)R, (CH3)nC02R, y CONRR'; A es un anillo heteroarilo de cinco miembros que se selecciona del grupo que consiste de tiofeno, pirrol, pirazol, imidazol, 1 ,2,3-triazol, 1,2,4-triazol, oxazol, isoxazol, tiazol, isotiazol, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazol, 1 ,2,4-oxadiazol, 1 ,2,5-oxadiazol, 1,3,4-oxadiazol, 1 ,2,3,4-oxatriazol, ,2,3,5-oxatriazol, 1 ,2,3-tiadiazol, 1 ,2,4-tiadiazol, 1 ,2,5-tiadiazol, 1,3,4-tiadiazol, 1 ,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol y tetrazol, opcionalmente sustituido con una o más posiciones con alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halógeno, trihalometilo, S(0)R, S02NRR', S03R, SR, N02, NRR', OH, CN, C(0)R, OC(0)R, NHC(0)R, (CH2)nC02R y CONRR'; n es 0-3; R es H, alquilo o arilo; y R' es H, alquilo o arilo. Los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona de la presente invención incluyen, pero no se limitan a 3-[(3-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(2-metiltien-5-il)metileno]2-indolinona; 3-3-metiltien-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-{[4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il)]metilen}-2-indolinona; 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-[(5-metilimidazol-2-il)metilen]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)met¡lenl]-2-indolinona; 3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona; 3-[(3-(2-carboxiet¡l)-4-metilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; y 3-[(2,4-d¡metilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona, y precursores de los mismos. Véase la patente de E.U.A. No. 5,792,783 para una descripción detallada de los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona. En una modalidad preferida de la invención, los compuesto es 3-heteroaril-2-indolinona es 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5416) o un precursor del mismo. En otra modalidad, la indolinona combinada con el inhibidor de COX-2 para tratar, evitar o inhibir neoplasias es una 2-indolinona sustituida con pirrol, o una sal o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, el cual modula la actividad de proteínas cinasa. Tales indolinonas y los métodos para proporcionarlas o prepararlas se describen completamente en la solicitud de patente de E.U.A. pendiente 09/322,297, la cual se ha otorgado, y la publicación internacional No. W099/61422, las cuales se incorporan en la presente como referencia. En una modalidad preferida, la indolinona es 3-[3,5-dimetil-4-(2-carboxietil)pirrol-2-ilmetiliden]-2-indolinona (SU-6668). Las fórmulas químicas de los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona a los que se hace referencia en la presente pueden mostrar el fenómeno de tautomerismo o isomerismo estructural. Por ejemplo, los compuestos que se describen en la presente pueden adoptar una conformación cis o trans alrededor del enlace doble que conecta al sustituyente 3 de S-indolinona con el anillo indolinona, o pueden ser mezclas de isómeros cis y trans. Respecto a las fórmulas dibujadas dentro de la especificación únicamente pueden representar una forma tautomérica o isomérica estructural posible, debe entenderse que la invención abarca cualquier forma tautomérica o isomérica estructural, o mezclas de las mismas, las cuales posean la capacidad para regular, inhibir o modular la traducción de señal de tirosina cinasa o la proliferación celular y no se limita a ninguna otra forma tautomérica o isomérica estructural utilizada dentro de los dibujos de las fórmulas. Además, los compuestos descritos en lo anterior y sus sales farmacéuticamente aceptables, las indolinonas de la invención incluyen, cuando sea aplicable, formas solvatadas así como no solvatadas de los compuestos (por ejemplo formas hidratadas) que tienen la capacidad de regular o modular la proliferación celular. Los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona descritos en la presente se pueden preparar por cualquier procedimiento conocido para ser aplicable a la preparación de compuestos relacionados químicamente. Los procedimientos adecuados se ilustran en los ejemplos. Los materiales iniciales necesarios se pueden obtener por procedimientos estándar de química orgánica. La actividad relevante y la eficacia de un compuesto individual, como un agente para alterar la transducción de señal mediada por un receptor de tirosina cinasa se puede determinar utilizando técnicas disponibles. De manera preferencial, un compuesto se someté a una serie de pruebas sistemáticas o cribados para determinar la capacidad del compuesto para modular, regular o inhibir la proliferación celular. Estos análisis, en el orden en el cual se llevan a cabo, incluyen ensayos bioquímicos, ensayos de crecimiento celular y experimentos in vivo. Preferiblemente, un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o un precursor del mismo se administra combinado con un inhibidor selectivo de COX-2 o un precursor del mismo a una dosis baja, es decir, una dosis menor que aquella que se ha utilizado convencionalmente en situaciones clínicas para cada uno de los componentes individuales administrados solos. Un beneficio de disminuir la dosis de los compuestos, composiciones, agentes y tratamientos de la presente invención administrados a un sujeto incluye una disminución en la incidencia de efectos adversos relacionados con dosificaciones más elevadas. Por ejemplo, al disminuir la dosificación de un agente quimioterapéutico tal como Sugen 5416, una reducción en la frecuencia y en la gravedad de los efectos secundarios resultará cuando se compare con lo que se observa a dosificaciones más elevadas. Se contemplan beneficios similares para uso en otros compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona descritos en la presente en combinación con inhibidores selectivos de COX-2. Al disminuir la incidencia de efectos adversos, se contempla una mejoría en la calidad de vida del paciente que se encuentra bajo el tratamiento. Los beneficios adicionales de disminuir la incidencia de efectos adversos incluyen una mejoría en el cumplimiento por parte del paciente, una reducción en el número de hospitalizaciones necesarias para el tratamiento de efectos adversos y una reducción en la administración de agentes analgésicos necesarios para tratar dolor asociado con los efectos adversos. Las combinaciones de los inhibidores selectivos de COX-2 y compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona descritos en la presente son útiles para tratar trastornos relacionados con transducción de señal de tirosina cinasa no regulada, que incluyen trastornos proliferativos celulares, trastornos fibróticos y trastornos metabólicos. La capacidad de utilizar 3-heteroaril-2-indolinonas para tratar tales enfermedades se basa en el hecho de que estos compuestos regulan, modulan o inhiben la transmisión de la señal de tirosina cinasa al alterar la actividad de las tirosinas cinasas con receptor (RTK) o las tirosinas cinasas sin receptor e interferir con la señal transducida por tales proteínas. La transducción de señal de tirosina cinasa juega un papel importante en la proliferación, diferenciación y metabolismo celulares. La proliferación celular anormal puede resultar en una amplia gama de trastornos y enfermedades que incluyen el desarrollo de neoplasia tales como carcinoma, sarcoma, leucemia, glioblastoma, hemangioma, psoriasis, arteriosclerosis, artritis y retinopatía diabética (u otros trastornos relacionados con angiogénesis o vasculogénesis no controlada). De esta manera, las combinaciones que se describen en la presente que contienen compuestos 3-heteroaril-2-indolinona son útiles, por ejemplo, para tratar enfermedades que resultan de transducción de señal anormal de tirosina cinasa.
Los trastornos proliferativos celulares que pueden ser tratados o estudiados adicionalmente por la presente invención incluyen, además de los cánceres, trastornos proliferativos de vasos sanguíneos y trastornos proliferativos de células del mesangio. Los trastornos proliferativos de vasos sanguíneos se refieren a trastornos angiogénicos y vasculogénicos que generalmente resultan en proliferación anormal de vasos sanguíneos. La formación y diseminación de vasos sanguíneos, o la vasculogenesis y angiogénesis, respectivamente, juegan papeles importantes en una diversidad de procedimientos fisiológicos tales como el desarrollo embriónico, formación del cuerpo lúteo, sanado de heridas y regeneración de órganos. También juegan un papel fundamental en el desarrollo de cáncer. Otros ejemplos de trastornos en la proliferación de vasos sanguíneos incluyen artritis, en donde los vasos sanguíneos capilares nuevos invaden a la articulación y destruyen cartílago, así como enfermedades oculares como retinopatía diabética, en donde los capilares nuevos en la retina invaden el cuerpo vitreo, y sangran y provocan ceguera. Inversamente, los trastornos relacionados con el encogimiento, contracción o cierre de vasos sanguíneos, tales como restenosis, también están implicados. Los trastornos fibróticos se refieren a la formación anormal de matriz extracelular. Los ejemplos de trastornos fibróticos incluyen cirrosis hepática y trastornos proliferativos de células del mesangio. La cirrosis hepática está caracterizada por incremento en los constituyentes de la matriz extracelular que resultan en la formación de cicatrización hepática. La cirrosis hepática puede provocar enfermedades tales como cirrosis del hígado. Una matriz extracelular aumentada que resulta en una cicatrización hepática también puede ser causada por infección viral tal como hepatitis. Los lipocitos parecen jugar un papel en la cirrosis hepática. Otras trastornos fibróticos implicados incluyen aterosclerosis (véase abajo). Los trastornos proliferativos de células del mesangio se refieren a trastornos que se presentan por proliferación anormal de células del mesangio. Los trastornos proliferativos del mesangio incluyen diversas enfermedades renales humanas tales como glomerulonefritis, nefropatía diabética, nefroesclerosis maligna, síndromes de microangiopatía trombótica, rechazo de transplante y glomerulopatías. El PDGF-R se ha relacionado en el mantenimiento de la proliferación de células del mesangio. Floege et al., 1993, Kidney International 43:47S-54S. Las PTK se han relacionado con tales trastornos de células proliferativas. Por ejemplo, algunos miembros de la familia de RTK se han asociado con el desarrollo de cáncer. Algunos de estos receptores, como EGFR (Tuzi et al., 1991 , Br. J. Cáncer 63:227-233; Torp et al., 1992, APMIS 100:713-719) HER2/neu (Slamon et al., 1989, Science 244:707-712) y PDGF-R (Kumabe et al., 1992, Oncogene 7:627-633) se sobreexpresan en muchos tumores o se activan de manera persistente por bucles autocrinos. De hecho, en los cánceres más comunes y graves, las sobreexpresiones de estos receptores (Akbasak y Suner-Akbasak et al., 1992, J. Neurol. Sci. 111:119-133; Dickson et al., 1992, Cáncer Treatment Res. 61 :249-273; Korc et al., 3 1992, J. Clin. Invest. 90:1352-1360) y los bucles autocrinos (Lee y Donoghue, 1992, J. Cell. Biol. 118:1057-1070; Korc et al., supra; Akbasak y Suner-Akbasak et al., supra) han sido demostrados. Por ejemplo, el receptor EGFR se ha asociado con carcinoma de células escamosas, astrocitoma, glioblastoma, cáncer de cabeza y cuello, cáncer pulmonar y cáncer de vejiga. Se ha relacionado a HER2 con cáncer de mama, de ovario, gástrico, de pulmón, de páncreas y de vejiga. El PDGF-R se ha relacionado con glioblastoma, cáncer de pulmón, de ovario, de melanoma y de próstata. El RTK c-met se ha relacionado generalmente con hepatocarcinogénesis y por lo tanto con carcinoma hepatocelular. Adicionalmente, se ha relacionado a c-met con formación de tumor maligno. De manera más específica, se ha relacionado a RTK c-met, entre otros cánceres, con cáncer colorrectal, de tiroides, pancreático y carcinoma gástrico, leucemia y linfoma. Adicionalmente, la sobreexpresión del gen c-met se ha detectado en pacientes con enfermedad de Hogkins, enfermedad de Burkitts y con la línea de células de linfoma. El IGF-IR, además de estar implicado en el soporte nutricional y en diabetes tipo II, también se ha relacionado con varios tipos de cánceres. Por ejemplo, IGF-I se ha implicado en el estimulador de crecimiento autocrino para varios tipos de tumores, por ejemplo células de carcinoma de cáncer de mama humanas (Arteaga et al., 1989, J. Clin. Invest. 84:1418-1423) y células pequeñas de tumor pulmonar (Macauley et al., 1990, Cáncer Res. 50:251 -2517). Además, IGF-I, involucrado integralmente en el crecimiento normal y en la diferenciación del sistema nervioso, parece ser un estimulador autocrino de gliomas humanos. Sandberg-Nordqvist et al., 1993, Cáncer Res. 53:2475-2478. La importancia de IGF-IR y sus ligandos en la proliferación celular está fundamentada adicionalmente por el hecho de que muchos tipos de células en cultivo (fibroblastos, células epiteliales, células de músculo liso, linfocitos T, células mieloides, condrocitos, osteoblastos, las células pluripotenciales de la médula ósea) son estimuladas para crecer por IGF-I. Goldring and Goldring, 1991 , Eukaryotic Gene Expression 1 :301-326. En una serie de publicaciones recientes, Baserga incluso sugiere que IGF-I-R juega un papel central en el mecanismo de transformación y, como tal, debe ser el objetivo preferido de las intervenciones terapéuticas para un espectro amplio de cánceres malignos humanos. Baserga, 1995, Cáncer Res. 55:249-252; Baserga, 1994, Cell 79:927-930; Coppola et ai., 1994, Mol. Cell. Biol. 14:4588-4595. No obstante, la asociación entre las anomalías en RTK y enfermedad no solo se limitan a cáncer. Por ejemplo, las RTK se han relacionado con enfermedades metabólicas como psoriasis, diabetes mellitus, sanado de heridas, inflamación y enfermedades neurodegenerativas. Por ejemplo, se indica EGF-R en sanado de heridas de córnea y dérmicas. Los defectos en la insulina-R y en IGF-R están indicados en diabetes mellitus tipo II. Una correlación más completa entre las RTK específicas y sus indicaciones terapéuticas se establecen en Plowman et al., 1994, DN&P 7:334-339. No solo las tirosinas sinasas de tipo de receptor sino también muchas tirosinas cinasas celulares (CTK) que incluyen a src, abl, fps, yes, fyn, lyn, lck, blk, hck, fgr, yrk (revisado por Bolen et al., 1992, FASEB J. 6:3403-3409) están involucradas en la vía de transducción de señal proliferativa y metabolica y por lo tanto en indicaciones de la presente invención. Por ejemplo, se ha demostrado que src mutada (v-src) es una oncoproteína (pp60v"src) en pollo. Además, su homólogo celular, el protooncogen PP60c"src, transmite señales oncogénicas de muchos receptores. Por ejemplo, la sobreexpresión de EGF-R o de HER2/neu en tumores genera la activación constitutiva de pp60c"src, lo cual es característico para las células malignas pero que no se presenta en células normales. Por otra parte, ratones deficientes para la expresión de c-src muestran un fenotipo osteopetrótico, lo que indica una participación clave de c-src en la función de osteoclastos y una posible relación en trastornos relacionados. De manera, Zap 70 está implicado en la señalización de los linfocitos T. Además, la identificación de compuestos que modulan a las CTK para aumentar o incluso sinergizar con los bloqueadores dirigidos a RTK es un aspecto de la presente invención. Finalmente, tanto las RTK como las cinasas de tipo que no son receptoras se han relacionado con trastornos hiperinmunes. De esta manera, además de ser utilizadas para tratar neoplasia, el tratamiento de combinación de la presente invención se puede utilizar para tratar enfermedades tales como trastornos proliferativos de vasos sanguíneos, trastornos fibróticos, trastornos proliferativos de células del mesangio y enfermedades metabólicas. Como se utiliza en la presente, el término "inhibidor de ciclooxigenasa-2" abarca compuestos los cuales inhiben selectivamente a ciclooxigenasa-2 sobre ciclooxigenasa-1 , y también incluyen sales o ésteres de estos compuestos farmacéuticamente aceptables. En la práctica, la selectividad de un inhibidor de COX-2 varía en base en la condición bajo la cual se realiza la prueba y en base en los inhibidores que se prueban. No obstante, para los propósitos de esta especificación, la selectividad de un inhibidor de COX-2 se puede medir como una relación del valor CI50 in vitro o in vivo para inhibición de Cox-1 , dividido entre el valor Cl50 para inhibición de COX-2 (Cl50 de Cox-1 /CI50 de COX-2). Un inhibidor selectivo de COX-2 es cualquier inhibidor para el cual la relación de la CI50 de Cox-1 respecto respecto a I Cl50 de COX-2 es mayor de 1 , preferiblemente mayor de 2, y de manera más preferible mayor de 5, y de manera aún mucho más preferible mayor de 10 y de manera mucho más preferible mayor de 50 y de manera mucho más preferible aún mayor de 100. Como se utiliza en la presente, el término "CI50" se refiere a la concentración de un compuesto que se requiere para producir 50% de inhibición de la actividad de ciclooxigenasa. Los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 preferidos de la presente invención tienen una CI50 de ciclooxigenasa-2 menor de aproximadamente 1 pm, de manera más preferida de aproximadamente 0.5 µ?. Los inhibidores selectivos de ciclooxigenasa-2 preferidos tienen una CI50 para ciclooxigenasa-1 mayor de aproximadamente 1 µ? y de manera más preferible de más de 20 µ?. Tal selectividad preferida puede indicar la capacidad de reducir la incidencia de efectos secundarios inducidos por los AINE comunes. También se incluyen dentro del alcance de la presente invención los compuestos que actúan como precursores de inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2. Como se utiliza en la presente con referencia a los inhibidores selectivos para COX-2, el término "precursor" se refiere a un compuesto químico que se puede convertir en un inhibidor selectivo para COX-2 activo por procedimientos metabólicos o por procedimientos químicos sencillos dentro del cuerpo del sujeto. Un ejemplo de un precursor para un inhibidor selectivo para COX-2 es parecoxib, el cual es un precursor terapéuticamente eficaz del inhibidor tricíclico selectivo para ciclooxigenasa-2, valdecoxib. Un ejemplo de un precursor inhibidor selectivo para COX-2 preferido es parecoxib de sodio. Una clase de precursores de inhibidores de COX-2 se describe en la patente de E.U.A. No. 5,932,598. Las referencias en la presente "inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2", "inhibidores selectivos para COX-2", etc. incluyen precursores de los mismos, a menos que el contexto lo indique de otra manera. En una modalidad, los inhibidores para COX-2 utilizados en los métodos y composiciones que se describen en la presente se seleccionan del grupo que consiste de las formas sustituidas de benzotiopiranos, dihidroquinolinas o dihidronaftalenos que tienen la fórmula general (I): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde n es un número entero el cual es 0, 1 , 2, 3 ó 4; en donde G es O, S o NRa; en donde Ra es alquilo; en donde R1 se selecciona del grupo que consiste de H y arilo; en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de carboxilo, aminocarbonilo, alquilsulfonilaminocarbonilo y alcoxicarbonilo; en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de haloalquilo, alquilo, aralquilo, cicloalquílo y arilo opcionalmente sustituido con uno o más radicales que se seleccionan de alquiltio, nitro y alquilsulfonilo; y en donde cada R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste de uno o más radicales que se seleccionan de H, halo, alquilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, aralquiloxi, heteroaralquiloxi, haloalquilo, haloalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroarilalquilamino, nitro, amino, aminoslfunilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, heteroarilaminosulfonilo, aralquilaminosulfonilo, heteroaralquilaminosulfonilo, . heterociclosulfonilo, alquilsulfonilo, hidroxiarilcarbonilo, nitroarilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, arilcarbonilo, aminocarbonilo y alquilcarbonilo; o en donde R4 junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos y el resto del anillo E forma un radical naftilo; o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, un éster o un precursor del mismo. En otra modalidad, los inhibidores para COX-2 utilizados en la presente tienen la fórmula general (II): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo: en donde: D se selecciona del grupo que consiste de anillos heterociclilo parcialmente insaturados o saturados y anillos carbocíclicos parcialmente insaturados o saturados; R13 se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, en donde R13 está sustituido opcionalmente en una posición sustituible con uno o más radicales que se seleccionan de alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi y alquiltio; R es metilo o amino; y R15 es H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, oxo, ciano, carboxilo, cianoalquilo, heterocicliloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilcarbonilo, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, heterociclilo, cicloalquenilo, aralquilo, heterocicloalquilo, acilo, alquiltioalquilo, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, aralquenilo, alcoxialquilo, ariltioalquilo, ariloxialquilo, aralquiltioalquilo, aralcoxialquilo, alcoxiaralcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilo, aminocarbonilalquilo, alquilaminocarbonilo, N-arilaminocarbonilo, N-alquil-N-arilaminocarbonilo, alquilaminocarbonilalquilo, carboxlalquilo, alquilamino, N-arilamino, N-aralquilamino, N-alquil-N-aralquilamino, N-alquil-N-arilamino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, N-arilaminoalquilo, N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-arilaminoalquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, alquiisulfinilo, alquilsulfonilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, N-arilaminosulfonilo, arilsulfonilo o N-alquil-N-arilaminosulfonilo. De acuerdo con otra modalidad, la presente invención también se menciona con composiciones novedosas para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un inhibidor de ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y 3-heteroaril-2-indolinona en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad es una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor para COX-2 y t-3-heteroaril-2-indolinona, y en donde el inhibidor para COX-2 comprende un derivado de fenilacético representado por la fórmula general (III): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R16 es metilo o etilo; R17 es cloro o fluoro; R18 es hidrógeno o fluoro; R19 es hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, etilo, metoxi, etoxi o hidroxi; R20 es hidrógeno o fluoro; y R2 es cloro, fluoro, trifluorometilo o metilo, con la condición de que R17, R18, R19 y R20 no sean todos fluoro cuando R16 es etilo y R19 es H.
En otra modalidad, los inhibidores de COX-2 útiles en las composiciones y métodos de la presente invención están representados por la fórmula (IV): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: X es O o S; J es un carbociclo o un heterociclo; R22 es NHSO2CH3 o F; R23 es H, N02 o F; y R24 es H, NHSO2CH3 o (S02CH3)C6H4. De acuerdo con otra modalidad, los inhibidores para COX-2 descritos en la presente tienen la fórmula estructural (V): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: T y M independientemente son fenilo, naftilo, un radical derivado de un heterociclo que comprende 5 a 6 miembros y que tiene 1 a 4 heteroátomos, o un radical derivado de un anillo de hidrocarburo saturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono; Q1, Q2, L1 o L2 son independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, trifluorometilo o metoxi inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y por lo menos uno de Q , Q2, L1 o L2 está en posición para y es -S(0)n-R, en donde n es 0, 1 ó 2 y R es un radical alquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono o un radical haloalquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono o un -SO2NH2; o, Q y Q2 son metilendioxi; o L1 y L2 son metilendioxi; y R25, R26, R27 y R28 son independientemente hidrógeno, halógeno, un radical alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un radical haloalquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un radical aromático que se selecciona del grupo que consiste de fenilo, naftilo, tienilo, furilo y piridilo; o R25 y R26 son O; o R27 y R28 son O; o R , R , junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono; o R27, R28, junto con el átomo de carbono al cual están unidos, forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono. El inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 de la presente invención puede ser, por ejemplo, el inhibidor selectivo para COX-2 meloxicam, fórmula B-0 (número de registro CAS 71125-38-7), o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo.
En otra modalidad de la invención, el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 puede ser un inhibidor selectivo para COX-2 RS 57067, 6-[[5-(4-clorobenzoil)-1 ,4-dimetil-1 H-pirrol-2-il]metil]-3(2H)-piridazinona, fórmula B-2 (número de registro CAS 179382-91-3), o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 de la presente invención puede ser, por ejemplo, el inhibidor selectivo para COX-2, ácido [2-(2,4-dicloro-6-etil-3,5-d¡met¡l-fenilamino)-5-propilfenil]-acético, que tiene la fórmula B-1 , o un isómero o una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo.
En una modalidad preferida de la invención, el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 es de la clase estructural de cromeno que es un benzopirano sustituido o un análogo de benzopirano sustituido, e incluso de manera más preferible se selecciona del grupo que consiste de las formas sustituidas de benzotiopiranos, dihidroquinolinas o dihidronaftaienos que tienen una estructura que se muestra por la fórmula general I, que se muestra en la presente, y que poseen, a modo de ejemplo y no de limitación, las estructuras descritas en el cuadro 1 , que incluyen los diastereoisómeros, enantiómeros, racematos, tautómeros, sales, ésteres, amidas y precursores de los mismos. Además, los inhibidores selectivos para COX-2 de benzopirano útiles en la práctica de la presente invención se describen en la patente de E.U.A. No. 6,034,256 y 6,077,850.
El inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 también puede ser un compuesto de fórmula (I) o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, éster o un precursor del mismo, en el que: n es un número entero el cual es 0, 1 , 2, 3 ó 4; G es oxígeno o azufre; R1 es H; R2 es carboxilo, alquilo inferior, aralquilo inferior o alcoxicarbonilo inferior; R3 es haloalquilo inferior, cicloalquilo inferior o fenilo; y cada R4 es H, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, alquilamino inferior, nitro, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo inferior, heteroarilalquilaminosulfonilo de 5 miembros, heteroarilalquilaminosulfonilo de 6 miembros, aralquilaminosulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 5 miembros, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno de 6 miembros, alquilsulfonilo inferior, fenilo opcionalmente sustituido, aralquilcarbonilo inferior o alquilcarbonilo inferior; o en donde R4 junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos y el resto del anillo E forman un radical naftilo. El inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 también puede ser un compuesto de fórmula (I) o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, éster o precursor del mismo, en donde: R2 es carboxilo; R3 es haloalquilo inferior; y cada R4 es H, halo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, alquilamino inferior, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo inferior, heteroarilalquilaminosulfonilo de 5 miembros, heteroarilarilalquilaminosulfonilo de 6 miembros, aralquilaminosulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 6 miembros, fenilo opcionalmente sustituido, aralquilcarbonilo inferior o alquilcarbonilo inferior; o en donde R4 junto con el anillo E forma un radical naftilo. El inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 también puede ser un compuesto de fórmula (I) o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, éster o un precursor del mismo; en donde: n es un número entero el cual es 0, 1 , 2, 3 ó 4; R3 es fluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluoroetilo, difluoropropiio, dicloroetilo, dicloropropilo, difluorometilo o trifluorometilo; y cada R4 es H, cloro, fluoro, bromo, yodo, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, metoxi, etoxi, isopropiloxi, terbutiloxi, trifluorometilo, difluorometilo, trifluorometoxi, amino, ?,?-dimetilamino, N,N-dietilamino, N-fenilmetilaminosulfonilo, N-feniletilaminosulfonilo, N-(2-furilmetil)aminosulfonilo, nitro, ?,?-dimetilaminosulfonilo, aminosulfonilo, N-metilaminosulfonilo, N-etilsulfonilo, 2,2-dimetiletilaminosulfonilo, N,N-dimetilaminosulfonilo, N-(2-metilpropil)aminosulfonilo, N-morfolinosulfonilo, metilsulfonilo, bencilcarbonilo, 2,2-dimetilpropilcarbonilo, fenilacetilo o fenilo; o en donde R4 junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos y el resto del anillo E forman un radical naftilo. El inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 también puede ser un compuesto de fórmmulaa (I) o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, éster o un precursor del mismo; en donde: n es un número entero el cual es 0, 1 , 2, 3 ó 4; R3 es trifluorometilo o pentafluoroetilo; y cada R4 es independientemente H, cloro, fluoro, bromo, yodo, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, metoxi, trifluorometilo, trifluorometoxi, N-fenilmetilaminosulfonilo, N-feniletilaminosulfonilo, N-(2-furilmetil)aminosulfonilo, ?,?-dimetilaminosulfonilo, N-metilaminosulfonilo, N-(2,2-dimetiletilo)aminosulfonilo, dimetilaminosulfonilo, 2-metilpropilaminosulfonilo, N-morfolinosulfonilo, metilsulfonilo, bencilcarbonlio, o fenilo; o en donde R4 junto con los átomos de carbono a los cuales están unidos y el resto del anillo E forman un radical naftilo. El inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 utilizado en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención también puede ser un compuesto que tenga la estructura de fórmula (I) o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, éster o precursor del mismo: en donde: n = 4; G es O o S; R1 es H; R2 es C02H; R3 es haloalquilo inferior; un primer R4 que corresponde a R9 es hídrido o halo; un segundo R4 que corresponde a R10 es H, halo, alquilo inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior, aralquilcarbonilo inferior, dialquilaminosulfonilo inferior, alquiiaminosulfonilo inferior, aralquilaminosulfonilo inferior, aralquilaminosulfonilo inferior, heteroaralquilaminosulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno de 5 miembros o heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno de 6 miembros; un tercer R4 que corresponde a R1 es H, alquilo inferior, halo, alcoxi inferior o arilo; y un cuarto R4 que corresponde a R12 es H, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior y arilo; en donde la fórmula (I) está representada por la fórmula (la): o un isómero, una sal farmacéuticamente aceptable, éster o precursor del mismo.
El inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 utilizado en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención también puede ser un compuesto que tenga la estructura de fórmula (la) o un isómero, sal, éster 0 un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo; en donde: R8 es trifluorometilo o pentafluoroetilo; R9 es H, cloro o fluoro; R10 es H, cloro, bromo, fluoro, yodo, metilo, terbutilo, trifluorometoxi, metoxi, bencilcarbonilo, dimetilaminosulfonilo, isopropilaminosulfonilo, metilaminosulfonilo, bencilaminosulfonilo, feniletilaminosulfonilo, metilpropilaminosulfonilo, metilsulfonilo o morfolinosulfonilo; R11 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, cloro, metoxi, dietilamino o fenilo; y R12 es H, cloro, bromo, fluoro, metilo, etilo, terbutilo, metoxi o fenilo. La presente invención también se relaciona con un método novedoso para el tratamiento de trastornos neoplásicos que comprende la administración a un sujeto en necesidad del mismo de una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2, que comprende BMS-347070 (B-74), ABT 963 (B-25), NS-398 (B-26), L-745337 (B-214), RWJ-63556 (B-215), o L-784512 (B-216). De los inhibidores para COX-2, los que se incluyen en el cuadro 1 son inhibidores para COX-2 de tipo cromeno, como se indica en lo siguiente: 4 CUADRO 1 Ejemplos de inhibidores selectivos para COX-2 de cromeno En una modalidad preferida adicional de la invención el inhibidor de ciclooxigenasa, cuando se utiliza combinado con indoiinona se puede seleccionar de la clase de inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 tricíclicos representados por la estructura general de la fórmula (II): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo: en donde: D se selecciona del grupo que consiste de un heterociclilo parcialmente ínsaturados o insaturados y anillos carbocíclicos parcialmente insaturados o insaturados; R 3 se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, en donde R13 está sustituido opcionalmente en una posición susceptible de ser sustituida con uno o más radicales que se seleccionan de alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi y alquiltio; R14 se selecciona del grupo que consiste de metilo o amino; y R15 se selecciona del grupo que consiste de un radical que se selecciona de H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, oxo, ciano, carboxilo, cianoalquilo, heterocicliloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilcarbonilo, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, heterociclilo, cicloalquenilo, aralquilo, heterocicloalquilo, acilo, alquiltioalquilo, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, aralquenilo, alcoxialquilo, ariltioalquilo, ariloxialquilo, aralquiltioalquilo, aralcoxialquilo, alcoxiaralcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilo, aminocarbonilalquilo, alquilaminocarbonilo, N-arilaminocarbonilo, N-alquil-N-arilaminocarbonilo, aiquilaminocarbonilalquilo, carboxialquilo, alquilamino, N-arilamino, N-aralquilamino, N-alquil-N-araiquilamino, N-alquil-N-arilamino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, N-arilaminoalquilo, N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-aralquilaminoalquilo, N-alquii-N-arilaminoalquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, N-arilaminosulfonilo, arilsulfonilo, N-alquil-N-arilaminosulfonilo. En una modalidad aún más preferida de la invención, uno o varios de los inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 tricíclicos para uso en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención en combinación con una indolinona se representa por la fórmula anterior (II) y se seleccionan del grupo de compuestos, que se ilustran en el cuadro 2, que consisten de celecoxib (B-18), valdecoxib (B-19), deracoxib (B-20), rofecoxib (B-21), etoricoxib (MK-663; B-22), JTE-522 (B-23), o un isómero, una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo.
CUADRO 2 Ejemplos de inhibidores selectivos para COX-2 tricíclicos En una modalidad incluso más preferida de la invención, el inhibidor selectivo para COX-2, cuando se utiliza combinado con una indolinona, se selecciona del grupo que consiste de celecoxib, rofecoxib y etoricoxib. En otra modalidad preferida de la invención, el parecoxib, (B-24), el cual es un precursor terapéuticamente eficaz de un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 tricíclico, valdecoxib, (B-19), se puede utilizar ventajosamente como una fuente de un inhibidor de ciclooxigenasa (véase, por ejemplo, el documento de E.U.A. No, 5,932,598) en relación con uno o varios de los métodos en la presente invención.
Una forma preferida de parecoxib es parecoxib de sodio. En otra modalidad preferida de la invención, el compuesto ABT-963 que tiene la fórmula (B-25) que ha sido descrito previamente en la publicación internacional No. WO 00/24719, es otro inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 tricíclico el cual puede ser utilizado ventajosamente en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención.
Otro inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 preferido que es útil en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención es la N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)-metansulfonamida (NS-398) - que tiene una estructura que se muestra a continuación como B-26. Las aplicaciones de este compuesto se han descrito, por ejemplo, por Yoshimi, N. eí al., en Japanese J. Cáncer Res., 90(4J:406-412 (1999); Falgueyret, J.P-. et al., en Science Spectra, disponible en http://www.gbhap.com/Science_Spectra/20-1-article.htm (06/06/2001); e Iwata, K. et al., en Jpn. J. Pharmacol., 750:191 -194 B-26 Otros compuestos que son útiles para la inhibición selectiva para ciclooxigenasa-2 en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a: ácido 6-cloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-27); ácido 6-cloro-7-met¡l-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-28); ácido 8-(1 -metiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-29); ácido 6-cloro-8-(1-metiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-30); ácido 2-trifluorometil-3H-nafto[2,1-b]piran-3-carboxíl¡co (B-31 ); ácido 7-(1 ,1-dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-32); ácido 6-bromo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B- 33) ; ácido 8-cloro-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B- 34) ; ácido 6-trifluorometoxi-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-35); ácido 5,7-dicloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-36); ácido 8-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B- 37); ácido 7,8-dimetil-2-trifiuorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-38); ácido 6,8-bis(d¡met¡letil)-2-tr¡fluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-39); ácido 7 -(1 -metiletil)-2-trfluorometil-2H-1 -benzop¡ran-3-carboxílico (B-40); ácido 7-fenil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B- 41); ácido 6-cloro-7-etil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-42); ácido 6-cloro-8-etil-2-tr¡fIuorometil-2H-1-benzop¡ran-3-carboxílico (B-43); ácido 6-cloro-7-fen¡l-2-tr¡fiuorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-44); ácido 6,7 -dicloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-45); ácido 6,8-dicloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-46); ácido 6-cloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-47); ácido 8-cloro-6-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-48); ácido 8-cloro-6-metoxi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-49); ácido 6-bromo-8-cloro-2- trifluorometil-2H-1-benzop¡ran-3-carboxílico (B-50); ácido 8-bromo-6-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-51); ácido 8-bromo-6-metil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-52); ácido 8-bromo-5-fluoro-2-tr¡fluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-53); ácido 6-cloro-8-fluoro-2 -trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-54); ácido 6-bromo-8-metoxi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-55); ácido 6-[[(fenilmetil)arnino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-56); ácido 6-[(dimetilamino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-57); ácido 6-[(metilamino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-58); ácido 6-[(4-morfolino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxilico (B-59); ácido 6-[(1 ,1-dimetiletil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1- benzopiran-3-carboxílico (B-60); ácido 6-[(2-metilpropil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-61 ); ácido 6-metilsulfonil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-62); ácido 8-cloro-6-[[(feni1metil)amino]sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-63); ácido 6-fen¡lacetil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxíl¡co (B-64); ácido 6,8-dibromo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-65); ácido 8-cloro-5,6-dimetil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-66); ácido 6,8-dicloro-(S)-2-trifluorometil-2H-1-benzop¡ran-3-carboxílico (B-67); ácido 6-bencilsulfonil-2-tr¡fluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-68); ácido 6-[[N-(2-furilmet¡l)amino]sulfonil]-2-tr¡fluoromet¡l-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-69); ácido 6-[[N-(2-feniletil)amino]sulfonil]-2-trifiuorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-70); 6-yodo-2-trifIuorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-71 ); ácido 7-(1 ,1-dimetiletil)-2-pentafluoroetil-2H-1-benzopiran-3- carboxílico; (B-72); ácido 6-cloro-2-trifluorometil-2H-1-benzot¡opiran-3-carboxílico (B- 73); ácido 3-[(3-cloro-fenil)-(4-metanesulfonil-fenil)-metilen]-dih'idro-furan-2-ona o BMS-347070 (B-74); 8-acetil-3-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonil}fenil-¡midazo(1 ,2-a)piridina (B-75); 5,5-dimetil-4-(4-metilsulfonil)fenil-3-fenil-2-(5H)-furanona (B-76); 5-(4-fluorofenil)-1-[4-(metilsulfonil)-fenil]-3-(trifluorometil)pirazol (B-77); 4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-1-fenil-3-(trifluorometil)pirazol (B-78); 4-(5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonamida (B-79); 4-(3,5-bis(4-metilfenil)-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonamida (B-80); 4-(5-( 4-clorofenil)-3-fenil-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonamida (B- 81) ; 4-(3,5-bis( 4-metoxifenil)-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonamida (B- 82) ; 4-(5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1 H-pirazol-1 - ¡l)bencensulfonamida (B-83); 4-(5-( 4-clorofenil)-3-(4-nitrofenil)-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonamida (B-84); 4-(5-(4-clorofenil)-3-(5-cloro-2-t¡en¡l)-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonam¡da (B-85); 4-(4-cloro-3,5-difenil-1 H-pirazol-1 -il)bencensulfonamida (B-86); 4-[5-(4-clorofen¡l)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -¡l]bencensulfonamida (8-87); 4-[5-fenil-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -il]bencensulfonamida (B- 88); 4-[5-(4-fluorofenil)-3-(trifluoromet¡l)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-89); 4-[5-(4-metoxifenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-90); 4-[5-(4-clorofen¡l)-3-(difluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-91 ); 4-[5-(4-metilfenil)-3-(tr¡fluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-92); 4-[4-cloro-5-(4-clorofenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-93); 4-[3-( d ¡fIuorometil)-5-(4-metilfenil)-1 H-pirazol-1 -il]bencensulfonamida (8-94); 4-[3-(difluorometil)-5-fenil-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B- 95); 4-[3-(difluorometil)-5-(4-metoxifenil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-96); 4-[3-ciano-5-( 4-fluorofenil)-1 H-p¡razol-1-¡l]bencensulfonamida (B- 97); 4-[3-(dif luorometil)-5-(3-f luoro-4-metoxifeniI)-1 H-pirazol-1 -il]bencensulfonamida (B-98); 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenii)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 - ¡Ijbencensulfonamida (B-99); 4-[4-cloro-5-fenil-1 H-pirazol-1-il]bencensulfonamida (B-100); 4- [5-(4-clorofenil)-3-(h¡drox¡met¡l)-1 H-pirazol-1 -il]bencensulfonamida (B-101); 4-[5-(4-(N,N-dimetilamino)fenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida (B-102); 5- (4-fluorofenil)-6-[4-(metilsulfonil)fenil]espiro[2.4]hept-5-eno (B- 103); 4- [6-(4-fluorofenil)espiro[2.4]hept-5-en-5-il]bencensulfonamida (B-104); 6- (4-fluorofenil)-7-[4-(m9tilsulfonil)fenil]espiro[3.4]oct-6-eno (B- 105); 5- (3-cloro-4-metoxifenil)-6-[4-(metilsulfonil)fenil]espiro[2.4]hept-5-eno (8-106); 4-[6-(3-cloro-4-metoxifenil)espiro[2.4]hept-5-en-5-il]bencensulfonam¡da (B-107); 5-(3,5-dicloro-4-metoxifenil)-6-[4-(metiIsulfonil)fen¡l]esp¡ro[2.4]hept-5-eno (B-108); 5-(3-cloro-4-fluorofenil)-6-[4-(met¡lsulfonil)fen¡l]espiro[2.4]hept-5-eno (B-109); 4- [6-(3,4-diclorofenil)esp¡ro[2.4]hept-5-en-5-¡l]bencensulfonam¡da (B-110); 2 -(3-cloro-4-fluorofen¡l)-4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-met¡lsulfoni!fenil)tiazol (B-111); 2-(2-clorofen¡l)-4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-metilsulfonilfen¡l)tiazol (B- 112); 5- (4-fluorofen¡l)-4-(4-met¡lsulfon¡lfenil)-2-met¡ltiazol (B-113); 4-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-2-trifluorometiltiazol (B- 114); 4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-metilsulfon¡lfenil)-2-(2-t¡enil)t¡azol (B-115); 4- (4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-2-bencilaminotiazol (B- 116) ; 4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-metilsulfonilfenil)-2-(1 -propilamino)tiazol (B- 117) ; 2-[(3,5-diclorofenox¡)met¡l)-4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]t¡azol (B-118); 5- (4-fluorofenil)-4-(4-met¡lsulfonilfenil)-2-tr¡fluorometiltiazol (B-119); 1-metilsulfon¡l-4-[1 ,1-d¡met¡l-4-(4-fluorofenil)c¡clopenta-2.4-d¡en-3-iljbenceno (B-120); 4-[4-(4-fluorofen¡l)-1 , 1 -dimet¡lciclopenta-2,4-dien-3- iljbencensulfonamida (B-121); 5- (4-fluorofenil)-6-[4-(metilsulfonil)fenil]espiro[2.4]hepta-4,6-dieno (B-122); 4-[6-(4-fluorofenil)espiro[2.4]hepta-4,6-dien-5-il]bencensulfonamida (B-123); 6- (4-fluorofenil)-2-metoxi-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-piridina-3-carbonitrilo (B-124); 2- bromo-6-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-piridin-3-carbonitrilo (B-125); 6-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-fenil-piridin-3-carbonitrilo (B-126); 4-[2-(4-metilpiridin-2-il)-4-(trifluorornetil)-1 H-imidazol-1-¡l]bencensulfonam¡da (B-127); 4-[2-(5-met??p¡r¡din-3-il)-4-(tGifluoGomet¡l)-1 H-im?dazol-1-iljbencensulfonamida (B-128); 4-[2-(2-metilpiridin-3-il)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1-il]bencensulfonamida (B-129); 3- [1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-il]piridina (B-130); 2-[1 -[4-(metilsulfonil)fenil-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-2-iljpiridina (B-131); 2-metil-4-[1-[4-(metilsulfonil)fenil-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-2-il]piridina (B-132); 2-metil-6-[1-[4-(metilsulfonil)feni1-4-(trifluorometil)-1H-imidazol-2-¡Opiridina (B-133); 4-[2-(6-metilp¡r¡din-3-¡l)-4-(tr¡fluorometil)-1 H-imidazol-1 -¡l]bencensulfonamida (B-134); 2-(3,4-d¡fluorofen¡l)-1-[4-(metilsulfon¡l)fenil]-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol (B-135); 4-[2-(4-metilfenil)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonam¡da (B-136); 2-(4-clorofenil)-1 -[4-(metilsulfonil)fenil]-4-metN-1 H-imidazol (B-137); 2-(4-clorofen¡l)-1 -[4-(metilsulfonil)fenil]-4-fenil-1 H-imidazol (B- 138); 2-(4-clorofenil)-4-(4-fluorofenil)-1-[4-(metilsulfonil)fen¡l]-1 H-imidazol (B-139); 2-(3-fIuoro-4-metoxifenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil-4-(trifluorometil)-1H-imidazol (B-140); 1- [4-(metilsulfonil)fenil]-2-fenil-44rifluorometil- H-imidazol (B- 141); 2- (4-metilfenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-trifluorometil-1 H-imidazol (B-142); 4-[2-(3-cloro-4-metilfenil)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida (B-143); 2-(3-fluoro-5-metilfenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-(trifluorometil)- 1 H-imidazol (B-144); 4-[2-(3-fluoro-5-metilfenil)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida (B-145); 2-(3-metilfenil)-1 -[4-(metilsulfonil)fenil]-4-trifluorometil-1 H-¡midazol (B-146); 4-[2-(3-metilfenil)-4-trifIuorometil-1 H-imidazol-1 -iljbencensulfonamida (B-147); 1-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-(3-clorofenil)-4-trifluorometil-1 H-imidazol (B-148); 4-[2-(3-clorofenil)-4-trifluorometil-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida (B-149); 4-[2-fenil-4-trifluorometil-1 H-imidazol-1-il]bencensulfonamida (B- 150); 4-[2-(4-metoxi-3-clorofenil)-4-trifluorometil-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida (B-151 ); 1-alil-4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(trifluorometil)-1H-pirazol (B-152); 4-[1 -etil-4-(4-fluorofenil)-5-(trifiuorometil)-1 H-pirazol-3-il]bencensulfonamida (B-153); N-fenil-[4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljacetamida (B-154); [4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-¡l]acetato de etilo (B-155); 4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-1-(2-feniletil)-1 H-pirazol (B-156); 4- (4-fluorofen¡l)-3-[4-(metilsulfon¡l)fenil]-1-(2-fen¡let¡l)-5-(trifluorometil)pirazol (B- 57); 1 -etil-4-(4-f luorofen¡l)-3-[4-(metilsulfonil)fen¡l]-5-(tr¡fluorometil)-1 H-pirazol (B-158); 5- (4-fluorofenil)-4-(4-metilsulfonilfenil)-2 rifluorometil-1H-imidazol (B-159); 4- [4-(metilsulfonil)fenil]-5-(2-tiofenil)-2-(trifluorometil)-1H-imidazol (B-160); 5- (4-fluorofenil)-2-metoxi-4-[4-(metilsu!fonil)fenil]-6-(trifluorometil)piridina (B-161); 2-etoxi-5-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-6-(trifluorometil)piridina (B-162); 5-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-(2-propiniloxi)-6-(trifluorometil)piridina (B-163); 2-bromo-5-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-6-(trifiuorometil)piridina (B-164); 4- [2-(3-cioro-4-metoxifenil)-4,5-difluorofenil]bencensulfonamida (B-165); 1-(4-fluorofenil)-2-[4-(metilsulfonil)fenil]benceno (B- 66); 5- difIuorometil-4-(4-metilsulfonilfenil)-3-fenilisoxazol (B- 67); 4-[3-etil-5-fenilisoxazol-4-il]bencensu!fonamida (B-168); 4-[5-difluorometil-3-fenilisoxazoI-4-il]bencensulfonamicla (B-169); 4-[5-hidroximetil-3-fenilisoxazol-4-il]bencensulfonamida (B-170); 4-[5-metil-3-fenil-¡soxazol-4-il]bencensulfonam¡da (B-171 ); 1-[2-( 4-fluorofenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-172); 1-[2-(4-fluoro-2-metilfenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-173); 1 -[2-(4-clorofenil)ciclopenten-1 -il]-4-(metilsulfonif)benceno (B- 174) ; 1-[2-(2.4-diclorofenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B- 75) ; 1-[2-(4-trifIuorometilfenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-176); 1-[2-(4-metiltiofenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-177); 1-[2-(4-fluorofenil)-4,4-dimetilciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-178); 4-[2-( 4-fluorofenil)-4,4-dimetilciclopenten-1-il]bencensulfonamida (B- 79); 1-[2-( 4-clorofenil)-4,4-dimetilciclopenten-1-il]-4- (metilsulfonil)benceno (B-180); 4-[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclopenten-1-il]bencensulfonamida (B-181 ); 7 4-[2-(4-fluorofenil)ciclopenten-1 -il]bencensulfonam¡da (B-182); 4-[2-(4-clorofenil)ciclopenten-1 -il]bencensulfonamida (B-183); 1-[2-(4-metoxifenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B- 184); 1-[2-(2,3-difluorofenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-185); 4-[2-(3-fIuoro-4-metoxifenil)ciclopenten-1-il]bencensulfonamida (B-186); 1- [2-(3-cloro-4-metoxifenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno (B-187); 4-[2-(3-cloro-4-fluorofenil)ciclopenten-1-il]bencensulfonamida (B- 188) ; 4-[2-(2-met¡lpir¡din-5-il)ciclopenten-1-¡l]bencensulfonam¡da (B- 189) ; 2-[4-(4- fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil) fenil]oxazol-2-il]-2-bencil-acetato de etilo (B-190); ácido 2-[4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fen¡l]oxazol-2-il]acét¡co (B-191); 2- (tert-butil)-4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]oxazol (B-192); 4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-feniloxazol (B-193); 4-(4-fluorofenil)-2-metil-5-[4-(metilsulfonil)fenil]oxazol (B-194); 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-2-trifIuorometil-4- oxazoiil]bencensulfonamida (B-195); ácido 6-cloro-7-(1 ,1-dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico (B-196); ácido 6-cloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico (B-197); 5,5-dimetil-3-(3-fluorofenil)-4-metilsulfonil-2-(5H)-furanona (B- 198) ; ácido 6-cloro-2-trifluorometil-2H-1 -benzotiopiran-3-carboxíiico (B- 199) ; 4-[5-(4-clorofenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]bencensulfonamida (B-200); 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -il]bencensulfonamida (B-201); 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-3-(difluorometil)-1 H-pirazol-1 -il]bencensulfonamida (B-202); 3- [1-[4-(meti sulfonil)fenil]-4-trifIuorometil-1 H-imidazol-2-il]piridin (B-203); 2-metil-5-[1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-trifluorometil-1 H-imidazol-2-il]piridina (B-204); 4-[2-(5-metilpiridin-3-il)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida (B-205); 4- [5-metil-3-fenilisoxazol-4-il]bencensulfonamida (B-206); 4-[5-hid rox¡metil-3-fenilisoxazol-4-il]bencensulfonamida (B-207); [2-tr¡fluoromet¡l-5-(3,4-difluorofenil)-4-oxazolil]bencensuIfonamida (B-208); 4-[2-metil-4-fenil-5-oxazolil]-bencensulfonamida (B-209); 4- [5-(2-fluoro-4-metoxifenil)-2-trifluoromet¡l-4-oxazol¡l]bencensulfonam¡da (B-210); ácido [2-(2-cloro-6-fiuoro-fen¡lamino)-5-metil-fen¡l]-acético o COX 189 (B-211); N-(4-nitro-2-fenox¡-fen¡l)-metanesulfonamida o nimesulide (B- 212); N-[6-(2,4-difluoro-fenoxi)-1 -oxo-indan-5-il]-metanesulfonamida o flosulide (B-213); sal de sodio de la N-[6-(2,4-difluorofenilsulfan¡l)-1-oxo-1H-inden-5-il]-metanesulfonamida, o L-745337 (B-214); N-[5-(4-fluorofenilsulfenil)-tiofen-2-il]-metansulfonamida o RW J-63556 (B-215); 3-(3,4-difluorofenoxi)-4-(4-metansulfonilfenil)-5-metil-5-(2,2,2-trifluoroetil)-5H-furan-2-ona o L-784512 o L-784512 (B-216); (5Z)-2-amino-5-[[3,5-bis(1 ,1-dimetiletil)-4-hidroxifenil]metilen]-4(5H)-tiazolona o darbufelona (B-217); CS-502 (B-218); LAS-34475 (B-219); LAS-34555 (B-220); 5- 33516 (B-221); SD-8381 (B-222); L-783003 (B-223); N-[3-(formilamino)-4-oxo-6-fenoxi-4H-1-benzopiran-7-il]-metanesulfonamida o T-614 (B-224); D-1367 (B-225); L-748731 (B-226); ácido (6aR, 10aR)-3-(1 , 1 -dimetilheptil)-6a,7,10,10a-tetrahidro-1 -hidroxi-6,6-dimetil-6H-d¡benzo[b,d]piran-9-carboxíl¡co o CT3 (B-227); CGP-28238 (B-228); 4- [[3,5-bis(1 -dimetiletil)-4-hidroxifenil]metilen]dihidro-2-metil-2H-1 ,2-oxazin-3(4H)-ona o 8F-389 (B-229); GR-253035 (B-230); ácido 6-dioxo-9H-purin-8-il-cinámico (B-231 ); o 5- 2474 (B-232); o un isómero, una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, respectivamente. En una modalidad preferida adicional de la invención, el inhibidor de ciclooxigenasa utilizado en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención se puede seleccionar de la clase de inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 derivados de ácido fenilacético representados por la estructura general de la fórmula (III): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R16 es metilo o etilo; R 7 es cloro o fluoro; R18 es hidrógeno o fluoro; R19 es hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, etilo, metoxi, etoxl o hldroxi; R20 es hidrógeno o fluoro; y R21 es cloro, fluoro, trifluorometilo o metilo, con la condición de que R17, R18, R19 y R20 no sean todos fluoro cuando R16 es etilo y R19 es H. Un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 derivado de ácido fenilacético preferido particularmente utilizado en relación con uno o varios de los métodos de la presente invención es un compuesto que tiene la designación de COX 189 (B-211) y que tiene la estructura que se muestra en la fórmula (III) o un isómero, una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R16 es etilo; R17 y R19 son cloro; R18 y R20 son hidrógeno; y R2 es metilo, De acuerdo con otra modalidad, la invención se relaciona con un método para el tratamiento de trastornos neoplásicos que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo un inhibidor para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y una indolinona en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad son una cantidad terapéuticamente eficaces del inhibidor para COX-2 y una indolinona y en donde el inhibidor para COX-2 está representado por la fórmula (IV): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable, del mismo, en donde: X es O o S; J es un carbociclo o un heterociclo; R22 es NHSO2CH3 o F; R23 es H, NO2 o F; y R24 es H, NHSO2CH3 o (SO2CH3)C6H4.
La información adicional de las aplicaciones de N-(2-ciclohexiloxinitrofen¡l)metansulfonamida (NS-398, CAS RN 123653-11-2), que tiene una estructura como se muestra en la fórmula B-26 han sido descritas, por ejemplo, por Yoshimini, N. et al., en Japanese J. Cáncer Res., 90(4):406-412 (1999); Falgueyret, J.P- et al., en Science Spectra, disponible en: http://www.gbhap.com/Science_Spectra/20-1-article.htm (06/06/2001 ); e Iwata, K. eí al., en Jpn. J. Pharmacoi, 75{2):\ \ - 194 ( 997). Una evaluación de la actividad antiinflamatoria del inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2, RWJ 63556, en un modelo de inflamación en perros se ha descrito por Kirchner et al., en J Pharmacoi Exp Ther 282, 1094-1 101 (1997). De acuerdo con otra modalidad, los inhibidores para COX-2 utilizados en combinación con una indolina tiene la fórmula estructural (V): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: T y M independientemente son fenilo, naftilo, un radical derivado de un heterociclo que comprende 5 a 6 miembros y que tiene 1 a 4 heteroátomos, o un radical derivado de un anillo de hidrocarburo saturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono; Q1, Q2, L1 o L2 son independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, trifluorometilo o metoxi inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y por lo menos uno" de Q , Q2, L1 o L2 está en posición para y es -S(0)n-R, en donde n es 0, 1 ó 2 y R es un radical alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un radical haloalquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un -SO2NH2; o, Q y Q2 son metilendioxi; o L1 y L2 son metilendioxi; y R25, R26, R27 y R28 son independientemente hidrógeno, halógeno, un radical alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un radical haloalquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un radical aromático que se selecciona del grupo que consiste de fenilo, naftilo, tienilo, furilo y piridilo; o R25 y R26 son O; o R27 y R28 son O; o R25, R26, junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono; o R , R , junto con el átomo de carbono al cual están unidos, forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono. Los materiales particulares que se incluyen en esta familia de compuestos y los cuales pueden servir como el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 en la presente invención incluyen N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)metansulfonamida y (E)-4-[(4-metilfenil)(tetrahidro-2-oxo-3-furaniliden)metil]bencensulfonamida. Los materiales particulares que se incluyen en esta familia de compuestos y los cuales pueden servir como el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 en la presente invención incluyen N-(2-ciclohexiloxinitrofen¡l)metansulfonamida y (E)-4-[(4-metilfenil)(tetrahidro-2-oxo-3-furaniliden)metil]bencensulfonamida. Los inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 preferidos que son útiles en la presente invención incluyen darbufelona (Pfizer), CS-502 (Sankyo), LAS 34475 (Almirall Profesfarma), LAS 34555 (Almirall Profesfarma), S-33516 (Servier), SD 8381 (Pharmacia, descrito en la patente de E.U.A. No. 6,034,256), BMS-347070 (Brlstol Myers Squibb, descrito en la patente de E.U.A. No. 6,180,651), MK-966 (Merck), L-783003 (Merck), T-614 (Toyama), D- 367 (Chiroscience), L-748731 (Merck), CT3 (Atlantic Pharmautical), CGP-28238 (Novartis), BF-389 (Biofor/Scherer), GR-253035 (Glaxo Wellcome), ácido 6-dioxo-9H-purin-8-il-cinám¡co (Glaxo Wellcome), y S-2474 (Shionogi).
La información acerca de S-33516 mencionada en lo anterior se puede encontrar en Current Drugs Headline News, en http://www.current-drugs.com/NEWS/lnflam1.htm, 10/04/2001 , en donde se ha reportado que S-33516 es un derivado de tetrahidroisoinde el cual tiene valores de CI50 de 0.1 y 0.001 mM contra ciclooxigenasa-1 y ciclooxigenasa-2, respectivamente. En sangre completa humana, se ha reportado que S-33516 tiene una DE50 = de 0.39 mg/kg. Los inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 descritos en lo anterior y a los que se puede hacer referencia en la presente de manera colectiva como inhibidores selectivos para COX-2 o inhbidores selectivos para ciclooxigenasa-2. Los inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 que son útiles en la presente invención se pueden suministrar por cualquier fuente en la medida en que el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 sea farmacéuticamente aceptable. Los inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 se pueden aislar y purificar de fuentes naturales o se pueden sintetizar. Los inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 pueden ser de una calidad y pureza que es convencional en el comercio para uso en productos farmacéuticos. Como se utiliza en la presente, una "cantidad eficaz" significa la dosis o cantidad eficaz que se va a administrar a un paciente y la frecuencia de administración al sujeto la cual se determina fácilmente por una persona habitualmente experta en la técnica mediante el uso de técnicas conocidas y mediante la observación de resultados obtenidos bajo circunstancias análogas. La dosis o cantidad eficaz que se va a administrar a un paciente y la frecuencia de administración al sujeto se pueden determinar fácilmente por una persona habitulmente experta en la técnica mediante el uso de técnicas conocidas y mediante observación de resultados obtenidos bajo circunstancias análogas. Al determinar la cantidad o dosis eficaz, se consideran muchos factores por el médico que atiende, que incluyen pero que no se limitan la potencia y duración de acción de los compuestos utilizados; la naturaleza y gravedad de la enfermedad que se va a tratar así como el sexo, edad, peso, salud general y capacidad de respuesta individual del paciente que va a ser tratado, así como otras circunstancias pertinentes. La frase "terapéuticamente eficaz" indica la capacidad de un agente para impedir o mejorar la gravedad del trastorno y al mismo tiempo evitar efectos secundarios adversos típicamente relacionados con tratamientos alternativos. La frase "terapéuticamente eficaz" debe entenderse que es equivalente a la frase "eficaz para el tratamiento o prevención" y que ambas se pretende que establezcan la calidad de la cantidad de cada agente para uso en el tratamiento combinado el cual obtendrá el objetivo de mejoramiento en la gravedad de la neoplasia y la frecuencia de incidencia sobre el tratamiento de cada agente por sí mismo, mientras que evitar efecto secundarios adversos típicamente asociados con tratamientos alternativos. Los expertos en la técnica apreciarán que las dosificaciones también se pueden determinar con guía en el texto Goodman & Goldman's The Pharmaco Qical Basis of Therapeutics, Novena Edición (1996), Apéndice II, pp. 1707-1711. Para los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona utilizados en los métodos de la invención la dosis terapéuticamente eficaz contenida en cualquier combinación se puede calcular inicialmente a partir de ensayos de cultivo de células. Por ejemplo, se puede formular una dosis en uno de los animales para obtener un intervalo de concentración circulante que incluye la CI5o determinada por cultivo celular (es decir, la concentración de compuesto de prueba que obtiene una inhibición semimáxima de la actividad de PTK). Tal información se puede utilizar con mayor precisión para determinar dosis útiles en humanos. La toxicidad y eficacia terapéutica de los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona contenidos en cualquier combinación descrita en la presente se puede determinar por procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos de células o en animales de experimentación, por ejemplo para determinar la DL50 (la dosis que mata al 50% de la población) y la DE50 (la dosis terapéuticamente eficaz en 50% de la población). La relación de dosis entre los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico y se puede expresar como la relación entre DL50 y DE50. Se prefieren compuestos de indolinona que muestren índices terapéuticos altos. Los datos obtenidos a partir de estos ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden utilizar para formular una gama de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales compuestos se encuentra preferiblemente dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la DE50 con poca o nula toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo en base en la forma de dosificación utilizada y la vía de administración que se utilice. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación se pueden seleccionar por el médico individual al considerar la condición del paciente (véase, por ejemplo, Fingí et al., 1975, en "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Capítulo 1 , p. 1). La cantidad de dosificación y el intervalo se pueden ajusfar individualmente para proporcionar concentraciones en plasma de la porción activa las cuales sean suficientes para mantener los efectos moduladores de cinasa, o la concentración eficaz mínima (MEC). La MEC variará para cada compuesto pero se puede calcular a partir de datos in vitro; por ejemplo, la concentración necesaria para obtener 50-90% de inhibición de la cinasa utilizando los ensayos que se describen en la presente. Las dosificaciones necesarias para obtener la MEC dependerán de las características individuales y la vía de administración. No obstante, se pueden utilizar ensayos de CLAR o bioensayos para determinar las concentraciones en plasma. También se pueden determinar los intervalos de dosificación utilizando el valor de MEC. Los compuestos de 3-heteroaril-2-indolinona se deben administrar utilizando un régimen que mantenga las concentraciones en plasma por encima del MEC durante 10-90% del tiempo, de manera preferible entre 30-90% y de manera mucho más preferible entre 50 y 90%.
En casos de administración local o captación selectiva, la concentración local eficaz del medicamento puede no relacionarse con la concentración en plasma. Por supuesto, la cantidad de composición administrada dependerán del sujeto que sea tratado, del peso del sujeto, la gravedad de la enfermedad, el modo de administración y el juicio del médico que realiza la prescripción. En el presente método, la cantidad de un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona que se utiliza es tal que, cuando se administra con el inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2, es suficiente para constituir una cantidad eficaz de la combinación. Se prefiere que la dosificación de la combinación constituya una cantidad terapéuticamente eficaz. Se prefiere que la cantidad de un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona que se utiliza combinado con un inhibidor selectivo de COX-2 para una dosificación de tratamiento única este dentro del intervalo de aproximadamente 0.001 mg/kg de peso corporal del sujeto a aproximadamente 200 mg/kg. Se prefiere adicionalmente que la cantidad sea de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, y se prefiere adicionalmente que sea de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 12 mg/kg y se prefiere de manera adicional que sea de aproximadamente 0.2 mg/kg a aproximadamente 10 mg/kg. La frecuencia de la dosis dependerá, en parte, de la vida media de un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona. Si un compuesto de 3- heteroaril-2-indolinona tiene una vida media corta (por ejemplo de aproximadamente 2 a 10 horas) puede ser necesario proporcionar una o más dosis al día. Alternativamente, si el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona tiene una vida media prolongada (por ejemplo de aproximadamente 2 a aproximadamente 15 días), puede ser necesario únicamente proporcionar una dosificación una vez al día, por semana o incluso cada 1 ó 2 meses. Una tasa de dosificación preferida es administrar la cantidades de dosificación descritas en lo anterior a un sujeto una vez al día. De manera similar, la cantidad de inhibidor selectivo para COX-2 que se utiliza en el presente método puede ser una cantidad que, cuando se administra con un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona, sea suficiente para constituir una cantidad eficaz de la combinación. Preferiblemente, tal cantidad será suficiente para proporcionar una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación. La cantidad terapéuticamente eficaz también se puede describir en la presente como un tratamiento o prevención para la neoplasia en una cantidad efectiva de la combinación. En el presente método, la cantidad de inhibidor selectivo para COX-2 que se utiliza en el método de tratamiento novedoso preferiblemente varía de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 miligramos al día por kilogramo de peso corporal del sujeto (mg/día»kg), de manera más preferible de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 50 mg/día.kg, e incluso de manera más preferible de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/día'kg.
Cuando el inhibidor selectivo para COX-2 comprende rofecoxib, se prefiere que la cantidad utilizada esté dentro de un intervalo de aproximadamente 0.15 a aproximadamente 1.0 mg/día»kg, e incluso de manera más preferible de aproximadamente 0.18 a aproximadamente 0.4 mg/día»kg. Cuando el inhibidor selectivo para COX-2 comprende etoricoxib, se prefiere que la cantidad utilizada esté dentro de un intervalo de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 5 mg/día-kg e incluso de manera más preferible de aproximadamente 0.8 a aproximadamente 4 mg/día-kg. Cuando el inhibidor selectivo para COX-2 comprende celecoxib, se prefiere que la cantidad utilizada esté dentro de un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 mg/día*kg e incluso de manera más preferible de aproximadamente 1.4 a aproximadamente 8.6 mg/día*kg, y de manera aún más preferible de aproximadamente 2 a aproximadamente 3 mg/día«kg. En el presente método y en las composiciones de esta invención, se administra un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona con, o se combina con un inhibidor selectivo de COX-2. Se prefiere que la proporción en peso de la cantidad de un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona respecto al compuesto de inhibidor selectivo para COX-2 que se administra al sujeto esté dentro de un intervalo de aproximadamente 0.0001:1 a aproximadamente 2000:1 , de manera más preferible que esté en un intervalo de aproximadamente 0.002:1 a aproximadamente 1200:1 , y de manera más preferida que se encuentre en un intervalo de aproximadamente 0.01 :1 a aproximadamente 1 :1. La combinación de un compuesto de 3-heteroaril-2-indol¡nona y un inhibidor selectivo para COX-2 se puede suministrar en forma de una composición terapéutica novedosa que se considera está dentro del alcance de la presente invención. Las cantidades relativas de cada componente en la composición terapéutica pueden variar y pueden ser como se acaba de describir. Un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona y un inhibidor selectivo para COX-2 que se describe de lo anterior se pueden proporcionar en la composición terapéutica de manera que las cantidades preferidas de cada uno de los componentes sea suministrada por una dosificación única, una inyección única o una cápsula única, por ejemplo, o hasta por cuatro o más formas de dosificación solas. Cuando la combinación novedosa se suministra junto con un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable, se forma una composición farmacéutica. Una composición farmacéutica de la presente invención se relaciona con una composición adecuada para la prevención o tratamiento de una enfermedad relacionada con transducción de señal por tirosina cinasa. La composición farmacéutica comprende un portador farmacéuticamente aceptable, un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona y un inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2. En una modalidad preferida, el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona es 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5416).
Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a solución salina fisiológica, solución o amortiguador de fosfato de Ringer, solución salina amortiguada y otros portadores conocidos en la técnica. Las composiciones farmacéuticas también pueden incluir estabilizantes, antioxidantes, colorantes y diluyentes. Los portadores y aditivos farmacéuticamente aceptables se seleccionan de manera que los efectos secundarios del compuesto farmacéutico se minimicen y el funcionamiento del compuesto no se cancele o inhiba en un grado tal que el tratamiento no sea eficaz. El término "cantidad farmacológicamente eficaz" significará aquella cantidad de un medicamento o agente farmacéutico que inducirá la respuesta biológica o médica de un sistema de tejido, animal o humano que se busque por un investigador o un médico. Esta cantidad puede ser una cantidad terapéuticamente eficaz. El término "farmacéuticamente aceptable" se utiliza en la presente para significar que el sustantivo modificado es apropiado para uso en un producto farmacéutico particular. Los cationes farmacéuticamente aceptables incluyen iones metálicos y iones orgánicos. Los iones metálicos más preferidos incluyen, pero no se limitan a sales de metal alcalino, sales de metal alcalinotérreo y otros iones metálicos fisiológicamente aceptables, apropiados. Los iones ejemplares incluyen aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc en sus valencias habituales. Los iones orgánicos preferidos incluyen aminas terciarias protonadas y cationes de amonio cuaternario que incluyen en parte trimetilamina, dietilamina, ?,?'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína. Ejemplos de ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen, sin limitación, ácido clorhídrico, ácido yodrhídico, ácido bromhídrico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido metansulfónico, ácido acético, ácido fórmico, ácido tartárico, ácido maleico, ácido málico, ácido cítrico, ácido isocítrico, ácido succínico, ácido láctico, ácido glucónico, ácido glucurónico, ácido pirúvico, ácido oxalacético, ácido fumárico, ácido propiónico, ácido aspártico, ácido glutámico, ácido benzoico y similares. También se incluyen en la combinación de la invención las formas isoméricas y tautómeros de las sales farmacéuticamente aceptables de inhibidores selectivos de eiclooxigenasa-2. Las sales farmacéuticamente aceptables ilustrativas se preparan a partir de los ácidos fórmico, acético, propiónico, succínico, glicólico, glucónico, láctico, málico, tartárico, cítrico, ascórbico, glucurónico, maleico, fumárico, pirúvico, aspártico, glutámico, benzoico, antranílico, mesílico, esteárico, salicílico, p-hidroxibenzoico, fenilacético, mandélico, embónico (pamoico), metansulfónico, etansulfónico, bencensulfónico, pantotenico, toluensulfónico, 2-hidroxietansulfónico, sulfanílico, ciciohexilaminosulfónico, algénico, ß-hidroxibutírico, galactárico y galacturónico. Las de adición de base farmacéuticamente aceptables adecuadas de los compuestos de la presente invención incluyen sales de iones metálicos y sales de iones orgánicos. Las sales de iones metálicos más preferidas incluyen, pero no se limitan a sales de metal alcalino (grupo la), sales de metal alcalinotérreo (grupo lia) y otros iones metálicos aceptables fisiológicos apropiados. Tales sales se pueden elaborar a partir de los iones de aluminio, calcio, litio, magnesio, potasio, sodio y zinc. Las sales orgánicas preferidas se pueden elaborar a partir de aminas terciarias y sales de amonio cuaternario que incluyen en parte trimetilamina, dietilamina, ?,?'-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, meglumina (N-metilglucamina) y procaína. La totalidad de las sales anteriores se pueden preparar por los expertos en la técnica por medios convencionales a partir del compuesto correspondiente de la presente invención. Los términos "tratar" o "someter a tratamiento" significa aliviar los síntomas, eliminar la causa ya sea en una base temporal o permanente, o impedir o frenar la aparición de síntomas. El término "tratamiento" incluye el alivio, eliminación de la causa o la prevención de neoplasia. Además de ser útil para el tratamiento en humanos, estas combinaciones también pueden ser útiles para el tratamiento de mamíferos que incluyen caballos, perros, gatos, ratas, ratones, borregos, cerdos, etc. Para propósitos de tratamiento, el término "sujeto" incluye cualquier sujeto humano o animal quien se encuentre en necesidad de un tratamiento particular, especialmente por prevención de neoplasia o que presente dicho trastorno. El sujeto típicamente es un mamífero. Un "mamífero", es un término que se utiliza en la presente para referirse a cualquier animal clasificado como un mamífero que incluye a humanos, animales domésticos y de granja y animales de zoológico, de caza o mascotas tales como perros, caballos, gatos, ganado, etc. Preferiblemente, el mamífero es un humano. Para métodos de prevención, el sujeto es cualquier sujeto humano o animal y preferiblemente es un sujeto que se encuentra en necesidad de prevenir o tratar la neoplasia. El sujeto puede ser un sujeto humano quien se encuentra en riesgo de un trastorno o condición, tal como neoplasia. El sujeto se puede encontrar en riesgo debido a la predisposición genética, estilo de vida sedentaria, exposición a agentes provocadores de trastorno, exposición a agentes patogénicos y similares. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar por vía enteral o parenteral. La administración parenteral incluye la vía subcutánea, intramuscular, intradérmica, intramamaria, intravenosa y otros métodos de administración conocidos en la técnica. La administración enteral incluye soluciones, tabletas, cápsulas de liberación sostenida, cápsulas con recubrimiento entérico y jarabes. Cuando se administra, la composición farmacéutica puede estar en o cerca de la temperatura corporal. Las frases "tratamiento combinado", "administración conjunta", "administración con" o "tratamiento conjunto" definen el uso de un agente inhibidor para ciclooxigenasa-2 y una indolinona y se pretende que abarque la administración de cada agente de una manera secuencial en un régimen que proporcionará efectos benéficos de la combinación de medicamentos y se pretende también que abarque la administración conjunta de estos agentes de una manera sustancialmente simultánea, por ejemplo como en una cápsula única o un dispositivo de dosificación que tenga una proporción fija de estos agentes activos o en cápsulas separadas o dispositivos de dosificación múltiples para cada agente, en donde las cápsulas separadas o los dispositivos de dosificación se pueden tomar juntos de manera contemporánea o se pueden tomar dentro de un período de tiempo suficiente para recibir un efecto benéfico de ambos agentes constitutivos de la combinación. Aunque la combinación de la presente invención puede incluir la administración de un componente de 3-heteroaril-2-indolinona y un componente inhibidor selectivo de ciclooxigenasa-2 dentro de un tiempo eficaz de cada componente respectivo, es preferible administrar ambos componentes respectivos de manera simultánea, y de manera más preferible administrar ambos componentes respectivos en una sola dosis de suministro. En particular, las combinaciones de la presente invención se pueden administrar por vía oral, por ejemplo como tabletas, tabletas recubiertas, grageas, trocizcos, tabletas para chupar, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránuios dispersables, emulsiones, cápsulas duras o suaves, o jarabes o elíxires. Las composiciones diseñadas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la elaboración de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes que se seleccionan del grupo que consiste de agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes y agentes conservadores con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables al paladar. Las tabletas contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos los cuales son adecuados para la elaboración de las tabletas. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granulantes y desintegrantes, por ejemplo almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo, almidón, gelatina o goma acacia y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar sin recubrimiento o pueden estar recubiertas por técnicas conocidas para retrasar la desintegración y absorción en el tracto gastrointestinal y de esta manera proporcionar una acción sostenida durante un período más prolongado. Por ejemplo, se puede utilizar un material de retraso en tiempo tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo. Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura en donde los ingredientes activos se mezclan con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín o como cápsulas de gelatina suave en donde los ingredientes activos están presentes como tales o se mezclan con agua o un medio oleoso, por ejemplo, aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.
Se pueden elaborar suspensiones acuosas que contengan los materiales activos mezclados con excipientes adecuados para la elaboración de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes que mejoran la suspensión, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma acacia; agentes dispersantes o humectantes que pueden ser fosfátidos que se presenten de manera natural, por ejemplo lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un excitol tal como monooleato de polioxietilen sorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polioxietilen sorbitano. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo, p-hidroxibenzoato de etilo o de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, o uno o más agentes edulcorantes tales como sacarosa o sacarina. Las suspensiones oleosas se pueden formular al suspender los ingredientes activos en un ácido graso O-3, un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de ajonjolí o aceite de coco, o en un agente mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abeja, parafina dura o alcohol cetílico. Se pueden agregar agentes edulcorantes tales como los que se establecen en lo anterior y agentes saborizantes con el fin de proporcionar una preparación oral agradable al paladar. Estas composiciones se pueden conservar mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico. Los polvos y gránulos dispersables adecuados para preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente que mejora la suspensión y uno más conservadores. Los agentes dispersantes o humectantes adecuados y los agentes que mejoran la suspensión están ejemplificados por los ya mencionados en lo anterior.
También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, saborizantes y colorantes. Los jarabes y elíxires que contienen la combinación novedosa se pueden formular con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, sorbitol o sacarosa. Tales formulaciones pueden contener un demulsente, un conservador y agentes saborizantes y colorantes. Las presentes combinaciones también se pueden administrar por vía parenteral ya sea por vía subcutánea, intravenosa, intramuscular o intraesternal o bien por técnicas de infusión, en forma de suspensiones acuosas u oleosas inyectables estériles. Tales suspensiones se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida utilizando aquellos agentes dispersantes o humectantes adecuados y agentes que mejoren la suspensión los cuales ya se han mencionado en lo anterior, u otros agentes aceptables. La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente parenteralmente aceptable no tóxico, por ejemplo como una solución en 1 ,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que se pueden utilizar están el agua, solución de Ringer y solución de cloruro de sodio isotónica. Además, los aceites fijos estériles se utilizan convencionalmente como un solvente o un medio de suspensión. Para este propósito se puede utilizar cualquier aceite fijo combinado que incluye monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además los ácidos grasos n-3 poliinsaturados pueden encontrar uso en la preparación de inyectables. La presente combinación también se puede administrar por inhalación, en forma de aerosoles o soluciones para nebulizantes o bien por vía rectal en forma de supositorios preparados al mezclar el medicamento con un excipiente no irritante adecuado es sólido a temperatura ambiente, pero es líquido a temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el medicamento. Tales materiales son manteca de cacao y polietilenglicoles. Las composiciones novedosas también se pueden administrar por vía tópica, en forma de cremas, ungüentos, jaleas, colirios, soluciones o suspensiones. Las dosificaciones diarias pueden variar dentro de límites amplios y se ajustarán a los requerimientos individuales en cada caso particular. En general, para administración a adultos se ha descrito en lo anterior una dosificación diaria apropiada, aunque los límites que se identifican como preferidos se pueden exceder si se considera adecuado. La dosificación diaria puede ser administrada como una dosificación única o en dosificaciones divididas. Los diversos sistemas de administración incluyen cápsulas, tabletas y cápsulas de gelatina, por ejemplo. La presente invención comprende además equipos que son adecuados para uso en la realización de los métodos de tratamiento o prevención de neoplasia como se describe en lo anterior. En una modalidad, el equipo contiene una primera forma de dosificación que comprende una 3-heteroaril-2-indolinona o un compuesto relacionado y una segunda forma de dosificación que comprende uno o más de los inhibidores selectivos de para ciclooxigenasa-2 o precursores del mismo, en cantidades suficientes para llevar a cabo los métodos de la presente invención. Preferiblemente, la primera forma de dosificación y la segunda forma de dosificación juntas comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de los compuestos para el tratamiento o prevención de neoplasias. Los siguientes ejemplos describen modalidades de la invención. Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones en la presente serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la consideración de la especificación o la práctica de la invención como se describe en la presente. Se pretende que la especificación, junto con los ejemplos, se 7 considere únicamente como ejemplar, en donde el alcance y espíritu de la invención está indicado por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos.
EJEMPLOS EJEMPLO 1 Síntesis general Método A Una mezcla de reacción de 1 equivalente del oxiindol apropiado (2-indolinona), 1.2 equivalentes del aldehido apropiado y 0.1 equivalentes de piperidina en etanol (1-2 ml/1 mmol de oxiindol) se agita a 90°C durante 3-5 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar el compuesto objetivo.
Método B Preparación de los aldehidos apropiados vía reacción de Vilsmeier. A una solución de 1.2 equivalentes de ?,?-dimetilformamida en 1 ,2-dicloroetano (2.0 ml/1.0 mmoles de material inicial) se agrega a gotas 1.2 equivalentes de oxicloruro de fósforo a 0°C. Se retira el baño con hielo y la mezcla de reacción se agita adicionalmente durante 30 min. Se agregan 1.0 equivalentes del material inicial apropiado a la solución anterior en porciones y la mezcla de reacción se agita a 50°-70°C durante 5 h-2 días. La mezcla de reacción se vierte en una solución de hidróxido de sodio 1 N enfriada con hielo (pH = 9 después de mezclar) y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La capa orgánica se separa y la capa acuosa se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lava con salmuera hasta pH = 7, se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora. El residuo se somete a cromatografía sobre una columna de gel de sílice eluyendo con una mezcla de solventes de acetato de etilo y hexano para proporcionar el compuesto del título. Síntesis de análogos de 3-sustituido-2-¡ndolinqna. Una mezcla de reacción de 1 equivalente del oxiindol apropiado (2-indolinona), (1.2 equivalentes del aldehido apropiado y 0.1 equivalentes de piperidina en etanol (1-2 ml/1 mmol de oxiindol) se agita a 90°C durante 3-5 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar el compuesto objetivo. Síntesis de 3-benciliden-2-indolinona (SU4928) El método preferido para sintetizar 3-benciliden-2-indolinona es como sigue: Se agregan 123.2 µ? de benzaldehído y 40 µ? de piperidina a una solución de 137.0 mg de oxiindol en 2.0 mi de metanol. Se somete a reflujo la mezcla de reacción durante 3 horas y se enfría la mezcla en un baño de hielo y agua. Se filtra el precipitado resultante, se lava con metanol frío y se seca en un horno a 40°C durante la noche. Utilizando este protocolo se obtienen aproximadamente 129.0 mg del compuesto. Síntesis de 3-[(pirid-4-il)metilen]-2-indolinona (SU5212) El método preferido para sintetizar 3-[(pirid-4-il)metileno]-2-indolinona es como sigue: Se agregan 117.0 µ? de 4-piridincarboxaldehído y 40 pl de piperidina a una solución de 138.0 mg de oxiindol en 2.0 mi de metanol. La mezcla de reacción se somete a reflujo durante 3 horas y se enfría en un baño de hielo y agua. El precipitado resultante se filtra, se lava con metanol frío y se seca en un horno a 40°C durante la noche para proporcionar 134.5 mg del compuesto. Síntesis de 3-[4-(morfolin-4-il)bencilidenil]-2-indolinona (SU4981 ) (Método B): 4-(morfolin-4-il)benzaldehído. A una solución de 15 mi de N,N-dimetilformamida en 50 mi de 1 ,2-dicloroetano se agrega a gotas 10 mi de oxicloruro de fósforo a 0°C. Se retira el baño de hielo y la mezcla de reacción se agita adicionalmente durante 30 min. Se agregan 16.3 g de 4-fenilmorfolina a la solución anterior, en porciones y la mezcla de reacción se somete a reflujo durante 2 días. Se agregan 2.5 mi de trietilamina a la mezcla de reacción anterior y la reacción se somete a reflujo durante 2 días. La mezcla de reacción se vierte en una solución de hidróxido de sodio 1N enfriada con hielo (pH = 9 después de mezclar) y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La capa orgánica se separa y la capa acuosa se extrae con 2 x 20 mi de diclorometano. La capa orgánica combinada se lava con salmuera hasta pH = 7, se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora. El residuo se separa sobre una columna de gel de sílice eluyendo con una mezcla de solventes de acetato de etilo y hexano para proporcionar 12.95 g (68%) como un sólido blanco. 3- [4-(morfolin-4-il)-bencilidenil]-2-indolinona (SU4981 ). Una mezcla de reacción de 6.66 g de oxiindol, 11.50 g de 4-(morfolin-4-il)benzaldehído y 5 mi de piperidina en 50 mi de etanol se agita 90°C durante 5 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 15.0 g (98%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntresis de 3-[4-(4-form¡lpiperazin-¡l)bencilidenil)-2-indolinona (SU4984) (Método B): 4- (4-formilpiperazin-1-il)benzaldehído. A una solución de 3.9 mi (30 mmoles) de ?,?-dimetilformamida en 20 mi de 1 ,2-dicloroetano se agregan a gotas 3.0 mi (3.9 mmoles) de oxicloruro de fósforo a 0°C. Después se retira el baño de hielo y la mezcla de reacción se agita adicionalmente durante 15 min. Se agregan a la solución en porciones 1 -fenilpiperazina (16.0 g, 10 mmoles) y la mezcla de reacción se agita a 50°C durante 1 h. La mezcla de reacción se vierte en una solución de hidróxido de sodio 1 N enfriada con hielo y se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La capa orgánica se separa y la capa acuosa se extrae con 2 x 20 mi de acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lava con salmuera hasta pH = 7, se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora. El residuo se separa en una columna de gel de sílice que eluye con una mezcla de acetato de etilo y hexano para proporcionar 9.0 g (41%) del compuesto del título como un sólido amarillo claro. 3- [4-(4-formilpiperazin-1 -il)bencilidenil]-1 -indolinona (SU4984). Una mezcla de reacción de 133.15 mg de oxiindol, 228.3 mg de 4-(piperazin-il)benzaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 5 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 199.5 mg (65%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[4-(piperidin-1-il)bencilidenil]-2-indolinona (SU5450) (Método B). 4- (piperidin-1-il)benzaldehído. A una solución de 2.3 mi ( mmoles) de ?,?-dimetilformamida en 10 mi de 1 ,2-dicloroetano se agregan a gotas 2.8 mi (30 mmoles) de oxicloruro de fósforo a 0°C. El baño de hielo se retira y la mezcla de reacción se agita durante 15 min. Se agrega 1-fenilpiperidina (3.2 mi, 20 mmoles) a la solución anterior, en porciones y la mezcla de reacción se somete a reflujo durante la noche. La mezcla de reacción se vierte en una solución de hidróxido de sodio 2N enfriada con hielo y se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La capa orgánica se separa y la capa acuosa se extrae con 2 x 20 mi de acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lava con salmuera hasta pH = 7, se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora. El residuo se separa sobre una columna de gel de sílice eluyendo con acetato de etilo y hexano para proporcionar 1.5 g (40%) del compuesto del título como un sólido blanco. 3-[4-(p¡per¡d¡n-1 -il)bencilid8nil]-2-indolinona (SU5450). Una mezcla de reacción de 134.0 mg de oxiindol, 226.8 g de 4-(piperidin-l-il)benzaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 5 h. Después de enfriar el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 268.5 mg (88%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[2-cloro-4-metoxibencilidenil]-2-indolinona (SU5480). 2- cloro-4-metox¡benzaldehído. La mezcla de reacción de 1.0 g (6.4 mmoles) de 2-cloro-4-hidroxibenzaldehído, 4.4 g (32 mmoles) de carbonto de potasio y 1.4 g (9.6 mmoles) de yoduro de metilo en 10 mi de N,N-dimetilformamida se agita a 70°C durante 2 h y se vierte en agua con hielo. El precipitado se filtra, se lava con agua y se seca a 40°C en un homo a! vacío durante la noche para proporcionar 750 mg (68%) del compuesto del título como un sólido rosa claro. 3- [2-cloro-4-metoxibenciliden¡l]-2-indolinona (SU5480). La mezcla de reacción de 487.9 mg (3.7 mmoles) de oxiindol, 750 mg (4.3 mmoles) de 2-cloro-4-metoxibenzaldehído y 4 gotas de piperidina en 5 mi de etanol se calienta a 90°C durante 2 h y se enfría a temperatura ambiente. El precipitado amarillo se filtra, se lava con etanol frío y se seca a 40°C en un horno al vacío durante la noche para proporcionar 680.2 mg (62%) del compuesto del título. Síntesis de 3-[(4-metiltien-2-il)metiIen]-2-indolinona (SU5401).
Una mezcla de reacción de 133.0 mg de oxündol, 151.2 mg de 4-metilt¡ofen-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 3 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol y se seca para proprcionar 147.3 mg (61 %) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[(3-metilpirrol-2-il)met¡len]-2-indolinona (SU5404). Una mezcla de reacción de 133.0 mg de oxündol, 130.9 mg de 3-metilpirroi-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 150.9 mg (67%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-ll)metilen]-2-indolinona (SU5406) Se sintetiza 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-¡ndolinona como se describe en J. Heterocyclic Chem. 13:1145-1147 (1976). 4-metilpirrol-3-carboxilato de etilo. Una solución de 11.86 g (0.1 moles) de crotonato de etilo y 19.50 g (0.1 moles) de metilisocianuro de p-toluensulfonilo en 500 mi de éter/su Ifóxido de dimetilo 2:1 se agrega en porciones a una suspensión de 6.8 de hidruro de sodio (dispersión en aceite mineral 60%, 0.17 moles) en éter a temperatura ambiente. Al finalizar la adición de la mezcla de reacción se agita durante 30 min y se diluye con 400 mi de agua. La capa acuosa se extrae con 3 x 100 mi de éter. Los extractos etéreos combinados se hacen pasar a través de una columna de alúmina eluyendo con diclorometano. El solvente orgánico se evapora y el residuo resultante se solidifica al dejar reposar. El sólido se lava con hexano y se seca a 40°C en un horno al vacío durante la noche para proporcionar 13.38 g (80%) del compuesto del título. Preparación de 3,4-dimetilpirrol. A una solución de 23 g (80 mmoles) de dihidrobis(2-metoxietoxi aluminato) de sodio se agregan a gotas una solución de 5 g (34 mmoles) de 4-metilpirrol-3-carboxilato de etilo en 50 mi de benceno a temperatura ambiente bajo una atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se agita durante 18 h. Se agregan 100 mi de agua a la mezcla de reacción. La capa orgánica se separa, se lava con salmuera y se seca sobre sulfato de sodio anhidro. El solvente se separa y el residuo se destila lo que proporciona 1.2 g (44%) del compuesto del título. Preparación de 3,4-dimetilpirrol-2-carboxaldehído. A una solución de 0.92 mi (12 mmoles) de ?,?-dimetilformamida en 1 mi de 1 ,2-dicloroetano se agrega a gotas 1.0 mi (12 mmoles) de oxicloruro de fósforo a 0°C. Se retira el baño de hielo y la mezcla de reacción se agita adicionalmente durante 30 min. Se agregan a la solución anterior en porciones 3,4-dimetilpirrol (960.0 mg, 10 mmoles) y la mezcla de reacción se agita a 50°C durante 5 h. La mezcla de reacción se vierte en una solución de hidróxido de sodio 1N enfriada con hielo (pH = 9 después del mezclado) y la mezcla resultante se agita a temperatura ambiente durante 1 h. La capa orgánica se separa y la capa acuosa se extrae con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se lava con salmuera hasta pH = 7, se seca sobre sulfato de sodio anhidro y se evapora. El residuo se somete a cromatografía sobre una columna de gel de sílice eluyendo con una mezcla de solvente de acetato de etilo y hexano para proporcionar 610 mg (50%) del compuesto del título. 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5406). Una mezcla de reacción de 67.0 mg (0.5 mmoles) de oxiindol, 73.0 mg (0.6 mmoles) de 3,4-dimetilp¡rrol-2-carboxaldehído y 2 gotas de piperidina en 2 se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 87.7 mg (37%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[(2,4-dimetil-3-etoxicarbonilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5408) Una mezcla de reacción de 134.0 mg de oxiindol, 234.3 mg de 4-etoxicarbonil-3,5-dimetilpirrol-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 3 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 244.6 mg (79%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-¡l)metilen]-2-indolinona (SU5416) Una mezcla de 134.0 mg de oxiindol, 147.8 mg de 3,5-dimetilpirrol-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 136.7 mg (57%) del compuesto del título como un sólido amarillo.
Síntesis de 3-[(2-met¡lmercat¡ofen-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5419) Una mezcla de reacción de 134.0 mg de oxiindol, 189.9 mg de 5-metilmercaptotiofen-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 246.6 mg (90%) del compuesto del título como un sólido naranja. Síntesis de 3-[(2-metilt¡en-5-il)metilenl]-2-indol¡nona (SU5424) Una mezcla de reacción de 134.0 mg de oxiindol, 151.42 mg de 5-metiltiofen-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 237.8 mg (99%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-[(3-metilt¡en-2-il)metilen]-2-índolinona (SU5427) Una mezcla de reacción de 134.0 mg de oxiindol, 151.4 mg de 3-metiltiofen-2-carboxaldehído y 3 gotas de piperidina en 2 mi de etanol se agita a 90°C durante 3 h. Después de enfriar, el precipitado se filtra, se lava con etanol frío y se seca para proporcionar 157.8 mg (65%) del compuesto del título como un sólido amarillo. Síntesis de 3-(2,5-dimetoxibencilidenil)-2-indolinona (SU4793) 3-(2,5-d¡metoxibencil¡denil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(2,3-dimetoxibencilidenil)-2-indolinona (SU4794) 3-(2,3-d¡metoxibencil¡denil)-2-¡ndol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(3-bromo-6-metoxibencilidenil)-2-indolinona (SU4796) 3-(3-bromo-6-metoxibencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-(4-t-butilcarbonil-piperazin-1 -il)bencilidenil)-2-indolinona (SU5393) 3-[4-(4-t-butilcarbonil-p¡perazin-1-il)bencilidenil]-2-ndolinona se sintetiza de acuerdo al Método B. Síntesis de 3-[(furan-2-il)metilen]-2-indolinona (SU4798) 3-[(furan-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-acetamidobencilidenil)-2-indolinona (SU4799) 3-(4-acetamidobencil¡denil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(2-cloro-4-hidroxibencilidenil)-2-indolinona (SU4932) 3-(2-cloro-4-hidroxibencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-bromobencilidenil)-2-indolinona (SU4942) 3-(4-bromobencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-acetilaminobencilidenil)-2-indolinona (SU4944) 3-(4-acetilaminobencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(2-metoxibencilidenil)-2-indol¡nona (SU4949) 3-(2-metoxibencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-( 4-dimetilaminobencilidenil)-1-metil-2-indolinona (SU4952) 3-(4-dimetilam¡nobencilidenil)-1-met¡l-2-indol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-dimetilaminobencilidenil)-2-indolinona (SU4312) 3-(4-dimetilaminobencilidenil)-2-indolinona está disponible de Maybridge Chemical Co. Ltd. Síntesis de 3-(4-bromobencilidenil)-1-metil-2-indolinona (SU4956) 3-(4-bromobencilidenil)-1-metil-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-(4-dimetilaminobencilidenil)-2-indolinona (SU4967) 5-cloro-3-(4-dimetilaminobenc¡liden¡l)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-bromobencilidenil)-5-cloro-2-indolinona (SU4972) 3-(4-bromobencilidenil)-5-cloro-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-dietilaminobencilidenil)-2-indolinona (SU4978) 3-(4-dietilaminobencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-di-n-butilaminobencilidenil)-2-indolinona (SU4979) 3-(4-d¡-n-butilaminobencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 1-metil-3-[4-(morfolin-4-il)bencilidenil]-2-indolinona (SU4982) 1-metil-3-[4-(morfolin-4-il)bencil¡denil]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método B. Síntesis de 5-cloro-3-(4-(morfolin-4-il)bencilidenil]-2-indolinona (SU4983) 5-cloro-3-(4-(morfolin-4-il)bencilidenil]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método B. Síntesis de 3-(3,4-diclorobencilidenil)-2-indolínona (SU5201) 3-(3,4-diclorobencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(2-etoxibencilídenil]-2-indolinona (SU5204) 3-(2-etoxibencilidenil]-2-indolínona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-fluorobencilidenil)-2-indolinona (SU5205) 3-(4-fluorobencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(tien-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5208) 3-[(tien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(2-metoxibencilidenil)-2-indolinona (SU5214) 3-(2-metoxibencilidenil)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A.
Síntesis de 3-[2-[3,5-di-(tnfluorometil)fenil]furan-5-¡l]metilen]-2-indolinona (SU5217) 3-[2-[(3,5-d¡-(trifluorometil)fenil]furan-5-il]metiien]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 2,6-di-(dimetilamino)-3,5-di-[(indolin-2-ona-3-ilidenil)metíl]-fenilcianida (SU5219) 2,6-di-(dimetilamino)-3,5-di-[(¡ndolin-2-one-3-iliden¡l)met¡l]-fenilcianida se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-(2-carboxietil)-4-metilp¡rrol-5-¡l)met¡len]-2-indolinona (SU5402) 3-[(3-(2-carboxietil)-4-metilplrrol-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método Síntesis de 3-[(3,4-dibromo-5-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5403) 3-[(3,4-dibromo-5-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método B. Síntesis de 3-[(3,4-dimetil-2-formilpirrol-5-il)metilen)-2-indolinona (SU5405) 3-[(3,4-dimetil-2-formilpirrol-5-il)metilen)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-{[4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-¡l]metilen}-2-indolin (SU5407) 3-{[4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il]met¡len}-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[2-yodofuran-5-il)metilen]-2-indo!inona (SU5409) 3-[2-yodofuran-5-il)metilen]-2-indol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-etoxicarbonil-2-metilfuran-5-iI)metilen]-2-indolinona (SU5410) 3-[(3-etoxicarbonil-2-metilfuran-5-il)metilen]-2-¡ndolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-bromotien-2-il)met¡len]-2-¡ndolinona (SU5418) 3-[(3-bromotien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-clorotien-5-il)metilen)-2-indolinona (SU5420) 3-[(2-clorotien-5-il)metilen)-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2,3-dimetilfuran-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5421 ) 3-[(2,3-dimetilfuran-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-nitrotien-2-il)metilen]-5 2-indolinona (SU5422) 3-[(5-nitrotien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-carboxitien-5-il)metilen]-2-¡ndolinona (SU5423) 3-[(2-carboxitien-5-¡l)metilen]-2-indolínona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-bromotien-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5425) 3-[(2-bromotien-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A.
Síntesis de 3-[(4-bromotien-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5426) 3-[(4-bromotien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis la sal de sodio de 3-[(2-Sulfon¡lfuran-5-il)metilen]-2-indolinona sodium salí (SU5428) La sal de sodio de la 3-[(2-Sulfonilfuran-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(furan-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5429) 3-[(furan-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-metilfuran-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5430) 3-[(2-metilfuran-5-il)met¡len]-2-¡ndolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-etilfuran-5-il)metilen-2-indolinona (SU5431 ) 3-[(2-etilfuran-5-il)metilen-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-nitrofuran-5-il)metilen]-2-índolinona (SU5432) 3-[(2-nitrofuran-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-bromofuran-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5438) 3-[(5-bromofuran-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(2-etiltien-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5451) 3-[(2-etilt¡en-5-il)met¡len]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5453) 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-etoxicarbon¡l-4-etox¡carboniletil-3-etox¡carbonilmetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5454) 3-[(5-etoxicarbonil-4-etoxicarboniletil-3-etoxicarbonilmetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-carboxi-3-etil-4-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5455) 3-[(5-carboxi-3-etil-4-metilpirrol-2-¡l)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo a Síntesis de 3-[(3,5-diyodo-4-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5456) 3-[(3,5-diyodo-4-metilp¡rrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-cloro-3-metoxicarbonil-4-metoxicarbonilmetilpirrol-2-il)metilen]-2-¡ndolinona (SU5459) 3-[(5-cloro-3-metoxicarbonil-4-metoxicarbonilmetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-acetil-5-etoxicarbonil-4-metilpirrol)-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5460) 3-[(3-acetil-5-etoxicarbonil-4-metilpirrol)-2-il)metilen]-2-indol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A.
Síntesis de 3-{[1-(3,5-diclorofen¡l)pirrol-2-il]metilen}-2-índolinona (SU5461) 3-{[1 -(3,5-d¡clorofen¡l)pirrol-2-il]metilen}-2-¡ndolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[1-(4-clorofenil)pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5462) 3-[1-(4-clorofenil)pirrol-2-il)metilen]-2-índolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(4-etoxicarbonil-3-metil)pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5463) 3-[(4-etoxicarbonil-3-metil)pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(1-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5464) 3-[(1-metilp¡rrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-etoxicarbonil-3-etoxicarboniletil-4-etoxilcarbonilmetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5465) 3-[(5-etoxicarbonil-3-etoxicarboniletil-4-etoxilcarbonilmetilpirrol-2-il)metilen]-2-se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[4-(pirrolidin-1-il)bencilidenil]-2-indolinona (SU5466) 3-[4-(pirrolidin-1-il)bencilidenil]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-metilimidazol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5468) 3-[(5-metiIimidazol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A.
Síntesis de 3-[(5-metiltiazol-2-il)metiien]-2-indolinona (SU5469) 3-[(5-metiltiazol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-metilpirazol-5-il)metilen]-2-indolinona (SU5472) 3-[(3-metilpirazol-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(imidazol-4-il)metilen]-2-indolinona (SU5473) 3-[(¡m¡dazol-4-il)met¡len]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(4-cloropirazol-3-il)metilen]-2-indolinona (SU5474) 3-[(4-cloropirazol-3-il)rnetilen]-2-¡ndoIinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(4-bromo-1 -(4-clorobencil)pirazol-5-iljmetilen]-2-indolinona (SU5475) 3-[(4-bromo-1 -(4-clorobencil)pirazol-5-il)met¡len]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(4-cloro-1-metilpirazol-3-il)metilen]-2-indolinona (SU5476) 3-[(4-cloro-1-metilpirazol-3-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(4-etil-3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5477) 3-[(4-etil-3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método B. Síntesis de 3-[(5-etilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5478) 3-[(5-et¡lp¡rrol-2-¡l)met¡len]-2-indol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método B. . Síntesis de 3-E3,5-dimetil-4-(propen-2-il)pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5479) 3-[3,5-dimetil-4-(propen-2-il)pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método B. Síntesis de 5,6-dimetoxil-3-[2,3-dimetoxilbencilidenil]-2-indolinona (SU5495) 5,6-dimetoxil-3-[2,3-d¡metoxilbencilidenil]-2-indol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[2,4,6-Trimetoxibencilidenil]-2-indolinona (SU5607) 3-[2,4,6-Trimetoxibencilidenil]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5612) 5-cloro-3-[(pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(3-metilpirrol-2-il)metilene]-2-indolinona (SU5613) 5-cloro-3-[(3-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-(4-isopropilbenciliden¡l)-2-indolinona (SU4313) 3-(4-isopropilbencilidenil)-2-indolinona está disponible de Maybridge Chemical Co. Ltd. Síntesis de 5-cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5614) 5-cloro-3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU4314) 3-[(pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona está disponible de Maybridge Chemical Co. Ltd. Síntesis de 5-cloro-3-[(indol-3-il)metilen]-2-indolinona (SU5615) 5-cloro-3-[(indol-3-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(tien-2-il)metilene]-2-indolinona (SU5616) 5-cloro-3-[(tien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(3-metiltien-2-il)metilen]-2-indolinona-(SU5617) 5-cloro-3-[(3-metiltien-2-il)metilen]-2-35 indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5618) 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(5-etiltien-2-il)met¡len]2-indolinoria (SU5619) 5-cloro-3-[(5-etiltien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(5-metilmercaptotien-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5620) 5-cloro-3-[(5-metilmercaptotien-2-il)metilen]-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-cloro-3-[(imidazol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5621 ) 5-cloro-3-[(imidazol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[2,4-dimetoxi-6-metilbencilidenil]2-indolinona (SU5623) 3-[2,4-dimetoxi-6-metiibencilidenil]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-nitro-3-[(pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona (SU5624) 5-nitro-3-[(pirrol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-metilpirrol-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona (SU5625) 3-[(3-metilpirrol-2-il)metilen]-5-nitro-2-olinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]5-nitro-2-indolinona (SU5626) 3-[(3,5-dimet¡lpirrol-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(lndol-3-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona (SU5627) 3-[(lndol-3-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 5-nitro-3-[(tien-2-il)metiien]-2-indolinona (SU5628) 5-nitro-3-[(tien-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-metiltien-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona (SU5629) 3-[(3-metiltien-2-il)metilen]-5-nitro-2-ndol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A.
Síntesis de 3-[(5-metilt¡en-2-il)metilen]-5-nitro-2-¡ndolinona (SU5630) 3-[(5-met¡ltien-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-etiltien-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona (SU5631 ) 3-[(5-etiltien-2-il)metilen]-5-nitro-2-dol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-metiimercaptotien-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona (SU5632) 3-[(5-metiimercaptotien-2-¡l)metilen]-5-nitro-2-olinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(¡midazol-2-il)met¡len]-5-nitro-2-indolinona (SU5633) 3-[(¡midazol-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(oxazol-2-il)metilen]-2-5 indolinona (CS7127) 3-[(oxazol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(oxazol-4-il)metilen]-2-indolinona (CS7128) 3-[(oxazol-4-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(oxazol-5-il)metilen]-2-indolinona (CS7129) 3-[(oxazol-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(tiazol-2-il)metilen]-2-indolinona (CS7130) 3-[(tiazol-2-il)metilen]-2 -indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(tiazol-4-il)metilen]-2-indolinona (CS7131) 3-[(tiazol-4-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(tiazol-5-il)metilen]-2-indolinona (CS7132) 3-[(tiazol-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(¡midazol-2-il)metilen]-2-indolinona (CS7133) 3-[(imidazol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(pirazol-3-il)metilen]-2-indolinona (CS7135) 3-[(pirazol-3-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(pirazol-4-il)metilen]-2-indolinona (CS7136) 3-[(pirazol-4-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(isoxazol-3-il)metilen]-2-indolinona (CS7 37) 3-[(isoxazol-3-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(isoxazol-4-il)metilen]-2-indolinona (CS7138) 3-[(¡soxazol-4-il)metilen]-2-¡ndol¡nona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(¡soxazol-5-il)metilen]-2-indolinona (CS7139) 3-[(isoxazoI-5-¡l)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(isotiazol-3-il)metilen]-2-indolinona (CS7140) 3-[(isotiazol-3-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(isotiazol-4-il)metilen]-2-indolinona (CS7141 ) 3-[(isotiazol-4-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(isotiazol-5-il)metilen]-2-indolinona (CS7142) 3-[(isotiazol-5-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(1 ,2)3-triazol-4-il)met¡len]2-indolinona (CS7143) 3-[(1 ,2,3-triazol-4-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(1 ,3,4-tiadiazol-2-il)metilen]-2-indolinona (CS7144) 3-[(1 ,3,4-tiadiazol-2-il)metilen]-2-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(5-fenil-1 ,2,4-oxadiazol-3-il)metilen]-2-indolinona (CS7145) 3-[(5-fenil-1 ,2,4-oxadiazol-3-il)metilen]-2-¡ndolinona se sintetiza de acuerdo al Método A. Síntesis de 3-[(3-fenil-1,2,4-oxadiazol-5-il)metilen]-2-indolinona (CS7146) 3-[(3-fenil-1 ,2,4-oxadiazol-5-il)metilen]-2-¡ndolinona se sintetiza de acuerdo al Método A.
Síntesis de 3-[(3-fenil-1 ,2,5-oxadiazol-4-il)metilen]-2-indolinona (CS7147) 3-[(3-fenil-1 ^.S-oxadiazoW-i metilenl^-indolinona se sintetiza de acuerdo al Método A.
EJEMPLO 2 Ensayos de RTK in vitro Se pueden utilizar los siguientes ensayos in vitro para determinar el nivel de actividad y el efecto de los diferentes compuestos de la presente invención sobre una o más de las RTK. Se pueden diseñar ensayos similares a lo largo de las mismas líneas para cualquier tirosina cinasa utilizando técnicas bien conocidas en el arte.
Ensayo inmunosorbente unido a Enzima (ELISA) Se pueden utilizar los ensayos ¡nmunosorbentes unidos a enzima (ELISA) para detectar y medir la presencia de actividad de tirosina cinasa. La prueba de ELISA se puede llevar a cabo de acuerdo con protocolos conocidos los cuales se describen, por ejemplo, en Voller, et al., 1980, "Enzyme-Linked Immunosorbent Assay," en: Manual of Clinical Immunology, 2d ed., editado por Rose y Friedman, pp.359-371 Am. Soc. Of Microbiology, Washington, D.C. El protocolo que se describe se puede adaptar para determinar la actividad con respecto a una RTK específica. Por ejemplo, los protocolos preferidos para llevar a cabo los experimentos de ELISA para las RTK específicas se proporcionan en lo siguiente. La adaptación de estos protocolos para determinar la actividad de un compuesto por otras membranas de la familia RTK, así como la s tirosinas cinasas sin receptor se encuentran dentro del alcance de aquellos expertos en la técnica.
Elisa para FLK-1 Se lleva a cabo un ensayo de ELISA para medir la actividad de cinasa del receptor FLK-1 y de manera más específica, la inhibición o activación de la actividad de proteína tirosina cinasa sobre el receptor FLK-1. Específicamente, se llevan a cabo los siguientes ensayos para medir la actividad de cinasa del receptor FLK-1 en células FLK-1/NIH3T3. Materiales y métodos. Materiales. Se utilizan los siguientes reactivos y suministros: a. Placas de ELISA de 96 pozos Corning (Corning, Catálogo No. 25085-96); b. Cappel de anticuerpo de chivo contra IgG de conejo (catálogo no. 55641); c. PBS (catálogo Gibco No. 450-1300EB); d. Amortiguador TBSW (Tris 50mM (pH 7.2), NaCI 150 mM y Tween-20 0.1%); e. Concentrado de Etanolamina (etanolamina 10% (pH 7.0), almacenado a 4°C); f. Amortiguador HNTG (amortiguador HEPES 20mM (pH 7.5), NaC1 150 mM, Tritón X-100 0.2% y glicerol 10%); g. EDTA (0.5 M (pH 7.0) como un concentrado 100X); h. Ortovanadato de sodio (0.5 como un concentrado 100X); i. Pirofosfato de sodio (0.2M como un concentrado 100X); j. Placas de propileno de fondo en V de 96 pozos NUNC (Applied Scientific Catálogo No. AS-72092); k. Células NIH3T3 C7#3 (células que expresan FLK-1); I. DMEM con L- Glutamina con alta concentración de glucosa 1X (catálogo No. 11965-050); m. FBS, Gibco (catálogo No. 16000-028); n. L-glutamina, Gibco (catálogo No.25030-016); o. VEGF, PeproTech, Inc. (catálogo No. 100-20) (que se mantiene con 1 pg/100 µ? de concentrado en Milli-QdH20 y se almacena a -20°C. Antisuero contra FLK-1 purificado por afinidad, Enzymology Lab, Sugen, Inc.; q. Anticuerpo monoclonal UB40 específico para fosfotirosina, Enzymology Lab, Sugen, Inc. (véase Fendly, et al., 1990, Cáncer Research 50: 550-1558); r. Anticuerpo de chivo contra IgG de ratón-POD, grado EIA (BioRad catálogo No. 172-101 ); s. Solución de 2,2-azino-bis(3-etilbenz-tiezolin-6-sulfónico (ABTS) (ácido cítrico 100 mM (anhidros), Na2HP04 250 mM (pH 4.0), ABTS 0.5 mg/ml (Sigma catálogo No. A-1888)), la solución debe mantenerse almacenada en la oscuridad a 4°C hasta que este lista para utilizarse; t. H202 (solución 30%) (Fisher catálogo No. H325); u. ABTS/H2O2 (15 mi de solución de ABTS, 2 µ? H202) se prepara 5 minutos antes de su uso y se mantiene a temperatura ambiente; v. Concentrado de HCI 0.2M en H20; w. Sulfóxido de dimetilo (100%) (Sigma, catálogo No. D-84 8); e y. Tripsina-EDTA (Gibco BRL catálogo No. 25200-049). Protocolo. Se utiliza el siguiente protocolo para llevar a cabo el ensayo: 1. Las placas de ELISA en 96 pozos Corning recubiertas, con 1.0 pg por pozo de anticuerpo Cappel contra IgG de conejo en Na2C03 0.1 M, pH 9.6. Se llevan a un volumen final 150 µ? por pozo. Las placas se recubren durante la noche a 4°C. Las placas se pueden mantener hasta por dos semanas cuando se almacenan a 4°C. 2. Se hacen crecer las células en medio de crecimiento (DMEM, complementado con L-Glutamina 2.0 mM, FBS 10%) en cajas de cultivo adecuadas hasta confluencia a 37°C, C02 5%. 3. Se cosechan las células por tripsinización y se siembran en placas de pozos redondos de 96 pozos de poliestireno Corning 25850, 25 000 células/pozo en 200 µ? de medio de crecimiento. 4. Se hacen crecer las células por lo menos un día a 37°C y C02 5%. 5. Se lavan las células con D-PBS 1X. 6. Se agregan 200 µ?/???? de medio de ayuno (DMEM, I- Glutamina 2.0 mM, FBS 0.1%). Se incuba durante la noche a 37°C, C02 5%. 7. Se diluyen los compuestos/extractos 1 :20 en placas de 96 5 pozos de polipropileno utilizando medio de ayuno. Se utiliza en los pozos control sulfóxido de dimetilo diluido 1 :20. 8. Se separa el medio de ayuno de las placas de cultivo celular ? de 96 pozos y se agregan 162 µ? de medio de ayuno fresco a cada pozo. » 9. Se agregan 18 µ? de dilución de compuesto/extracto diluido 10 1 :20 (de la etapa 7) a cada pozo más una dilución 1 :20 de sulfóxido de dimetilo a los pozos control (+/-VEGF) para una dilución final 1 :200 después de estimulación celular. El sulfóxido de dimetilo final es 0.5%. Se incuba la placa a 37°C, CO2 5% durante dos horas. 10. Se separa el anticuerpo no unido de las placas de ELISA al 15 voltear la placa para retirar el líquido. Se lava 3 veces con TBSW + etanolamina 0.5%, pH 7.0. Se seca por contacto la placa sobre toallas de papel para eliminar el exceso de líquido y burbujas. 11. Se bloquean las placas con TBSW + etanolamina 0.5%, pH 7.0, 150 µ? por pozo. Se incuba la placa treinta minutos mientras se agita en 20 un agitador de placa de microtitulación. 12. Se lava la placa 3 veces como se describe en la etapa 10. 13. Se agregan 0.5 µ?/???? de antisuero de conejo policlonal contra FLU-1 purificado por afinidad. Se lleva a un volumen final de 150 µ?/???? con TBSW + etanolamina 0.5%, pH 7.0. Se incuba la placa durante treinta minutos mientras se agita. 14. Se agregan 180 pl de medio de ayuno a las células y se estimulan las células con 20 µ?/???? de una solución 10.0 mM de orto vanadato de sodio y 500 ng/ml de VEGF (lo que resulta en una concentración final de orto vanadato de sodio 1.0 mM y VEGF en 50 ng/ml por pozo) durante ocho minutos a 37°C, CO2 5%. Los pozos de control negativo reciben únicamente medio de ayuno. 15. Después de ocho minutos, el medio debe ser separado de las células y se lava una vez más con 200 µ?/???? de PBS. 16. Se lisan las células en 150 µ?/???? de HNTG mientras se agita a temperatura ambiente durante cinco minutos. La formulación de HNTG incluye orto vanadato de sodio, pirofosfato de sodio y EDTA. 17. Se lava la placa de ELISA tres veces como se describe en la etapa 10. 18. Se transfiere los lisados de células desde la placa de células a la placa de ELISA y se incuba mientras se agita durante dos horas. Para transferir el lisado de células se somete a pipeteado ascendente y descendente mientras se raspan las paredes. 19. Se lava la placa tres veces como se describe en la etapa 10. 20. Se incuba la placa de ELISA con 0.02 pg/pozo de UB40 en TBSW + etanolamina 0.5%. Se lleva a un volumen final de 150 µ?/????. Se incuba mientras se agita durante 30 minutos. 21. Se lava la placa tres veces como se describe en la etapa 10. 22. Se incuba la placa ELISA con anticuerpo de chivo contra IgG de ratón conjugado con peroxidasa de rábano grado EIA diluido 1 :10 000 en TBSW + etanolamina 0.5%, pH 7.0. Se lleva a un volumen final de 150 µ?/????. Se incuba mientras se agita treinta minutos. 23. Se lava la placa como se describe en la etapa 10. 24. Se agregan 100 µ? de una solución de ABTS/H202 al pozo, se incuba diez minutos mientras se agita. 25. Se agregan 100 µ? de HCI 0.2M por HCI 0.1 M final para detener la reacción de desarrollo de color. Se agita 1 minuto a temperatura ambiente. Se eliminan las burbujas con una corriente lenta de aire y se lee la placa de ELISA en un lector de placas de ELISA a 410nm.
Elisa para HER-2 Ensayo 1, Ensayo de Receptor Quimérico de Receptor EGF-HER2 en células completas. Se mide la actividad de cinasa HER2 en células EGFR-NIH3T3 completas, como se describe a continuación: Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos para llevar a cabo el ensayo: a. EGF: concentración concentrada = 16.5 ILM; EGF 201 , TOYOBO, Co., Ltd, Japón. b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular de EGFR). c. Anticuerpo antifosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal) (véase, Fendley, et al., supra). d. Anticuerpo de detección: anticuerpo de chivo contra IgG de conejo conjugada a peroxidasa de rábano, TAGO, Inc., Burlingame California. e. Amortiguador TBST: Tris-HCI, pH 7.2 50 mM NaCI 150 mM Tritón X-100 0.1 f. HNTG, concentrados 5X: HEPES 0.1M NaCI 0.75M Glicerol 50% Tritón X-100 1.0% g. Concentrado de ABTS: Acido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM HCI concentrado 0.5 pM ABTS* 0.5 mg/ml *(ácido 2,2-azinobis-(3-etilbenztiazolinsulfónico)). Se mantiene la solución la oscuridad a 4°C hasta su uso. h. Reactivos concentrados de: EDTA 100 mM pH 7.0 Na3VQ4 0.5M Na4P207) 0.2M Procedimiento. Se utiliza el siguiente protocolo: A. Placa de ELISA recubierta previamente 1. Las placas de ELISA recubiertas (Corning, 96 pozos, Cat. #25805-96) con anticuerpos 05-101 a 0.5 g por pozo en PBS, 100 µ? de volumen final/pozo, y se almacenan durante la noche a 4°C. Las placas recubiertas son útiles hasta por 10 días, cuando se almacenan a 4°C. 2. En el día de uso, se retira el amortiguador de recubrimiento y se sustituye con 100 µ? de amortiguador de bloqueo (leche seca sin grasa instantánea Carnation 5% en PBS). Se incuba la placa, se agita a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C a 25°C) durante 30 minutos. Justo antes de su uso, se retira el amortiguador de bloqueo y se lava la placa 4 veces con amortiguador TBST. B. Sembrado de células 1. Se puede utilizar para este ensayo una línea de células NIH3T3 que sobre expresa un receptor quimérico que contiene el dominio extracelular EGFR y el dominio de cinasa HER2 extracelular. 2. Se seleccionan las cajas que tienen una confluencia de 80-90% para el experimento. Se tripsinizan las células y se detiene la reacción al agregar suero bovino fetal 10%. Las células se suspenden en medio D EM (medio de DMEM CS 10%) y se centrífuga una vez a 1500 rpm, a temperatura ambiente durante 5 minutos. 3. Las células se resuspenden en medio de siembra (DMEM; suero bovino 0.5%) y se cuentan las células viables utilizando azul de tripan. Es aceptable una viabilidad superior a 90%. Se siembran las células en medio de DMEM (suero bovino 0.5%) a una densidad de 10 000 células por pozo, 100 µ? por pozo, en una placa de microtitulación de 96 pozos. Se incuban las células sembradas en C025% a 37 °C durante aproximadamente 40 horas. C. Procedimientos de ensayo 1. Se verifican las células sembradas para determinar contaminación utilizando un microscopio invertido. Se diluye el concentrado de medicamento (10 mg/ml en DMSO) 1 :10 en medio DMEM, y después se transfieren 5 I a un pozo de TBST hasta una dilución final de medicamento de 1 :200 y una concentración final de DMSO de 1%. Los pozos control reciben únicamente DMSO. Se incuba en CO2 5% a 37°C durante dos horas. 2. Preparación del ligando EGF: se diluye EGF concentrado en DMEM de manera que ante la transferencia del 10 µ? EGF diluido (dilución 1:12), se obtienen 100 nM de concentración final. 3. Se prepara HNTG* fresco suficiente para 100 µ? por pozo; y se coloca en hielo. HNTG*(10 ml): Concentrado de HNTG 2.0 mi milli-QH2O 7.3 mi EDTA, 100 mM, pH 7.0 0.5 mi Na3VO4> 0.5M 0.1 mi Na4(P207), 0.2 0.1 mi 4. Después de 120 minutos de incubación con un medicamento se agregan el ligando SGF preparado con las células, 10 µ? por pozo, a una concentración final de 1000 nM. Los pozos control reciben únicamente D EM. Se incuba, se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. 5. Se separa el medicamento, EGF y DMEM. Se lavan las células dos veces con PBS. Se transfiere HNTG* a las células, 100 µ? por pozo. Se colocan en hielo durante 5 minutos. Mientras tanto, se separa el amortiguador de bloqueo de otra placa de ELISA y se lava con TBST como se describe en lo anterior. 6. Con una punta de pipeta ajustada de manera segura a un equipo de micropipeteo, se raspan las células de la placa y se homogeniza el material celular al aspirar y suministrar repetidamente el amortiguador de lisis de HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa de ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba el agitado a temperatura ambiente durante una hora. 7. Se separa el lisado y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo contra Ptyr recién diluido a la placa de ELISA a 100 µ? por pozo. Se incuba en agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia de antisuero contra Ptyr (dilución 1 :3000 en TBST): 8. Se separa el anticuerpo contra Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo contra IgG de conejo TAGO recién diluido a la placa de ELISA a 100 µ? por pozo. Se incuba bajo agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos (anticuerpo contra IgG de conejo: dilución 1 :3000 en TBST). 9. Se separa el anticuerpo de detección TAGO y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere una solución recién preparada de ABTS/H2O2 a placas de ELISA, 100 µ? por pozo. Se incuba bajo agitación a temperatura ambiente durante 20 minutos (solución de ABTS/H202: 1.0 µ? de H202 30% en 10 mi de concentrado ABTS). 10. Se detiene la reacción al agregar 50 µ? de H2S045N (opcional) y se determina DO a 410 nm. 1 1. Se determina la señal máxima de fosfotirosina por sustracción del valor de los controles negativos a partir de los controles positivos. Después se calcula el por ciento de inhibición de contenido de fosfotirosina para los pozos que contienen extracto después de la sustracción de los controles negativos. ENSAYO 2:Prueba de ELISA para HER-2-BT474. Se puede llevar a cabo un segundo ensayo para medir la actividad de las células HER2 completas. Tal ensayo se puede llevar a cabo como sigue: Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos: a. BT-474 (ATCC HBT20), una línea de células de tumor de mama humanas que expresan concentraciones elevadas de cinasa HER2. b. Medio de crecimiento que comprende RPMI + FBS10% + GMS-G (suplemento Gibco) + glutamina para uso en BT-474 en crecimiento en un incubador con C025% a 37°C. c. Un anticuerpo monoclonal contra HER2. d. D-PBS: KH2 HP04 0.20 g/l 10 (GIBCO, 310-4190AJ) K2 HPO4 2.16 g/l KCI 0.20 g/l NaCI 8.00 g/l (pH 7.2) e. Amortiguador de bloqueo: TBST más leche 5% (leche seca sin grasa instantánea Carnation). f. Amortiguador TBST: Tris-HCI 50 mM NaCI 150 mM (pH 7.2, HCI 10N) Tritón X-100 0.1% en donde la solución concentrada de TES (10X) se prepara y se agrega Tritón X-100 al amortiguador durante la dilución. g. Amortiguador HNTG (5X): HEPES 0.1M NaCI 750 mM (pH 7.2 (HCI, 10 N) Glicerol 50% Tritón X-100 1.0% Se prepara una solución concentrada (5x) y se mantiene a 40°C h. EDTA-HCI: 0.5M pH 7.0 (HCI 10N) como concentrado 500X. i. Na3V04: 0.5M como un concentrado 100X que se mantiene a -80°C como alícuotas. j. Na4(P207): 0.2M como un concentrado 100X. k. Antisuero policlonal contra fosfotirosina. I. Anticuerpo de chivo contra IgG de conejo, conjugado con peroxidasa de rábano (POD) (anticuerpo de detección), Tago (catálogo No. 4520; Lote No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, California, m. Solución ABTS: Acido cítrico 100 mM Na2HP04 250mM (pH 4.0, 1 N HCI) ABTS 0.5 mg/ml en donde ABTS es ácido (2,2'-az¡nobis(3-et¡lbenzotiazolin sulfónico). Para este ensayo, la solución de ABTS debe mantenerse en la oscuridad a 4°C. La solución de debe desechar cuando se vuelve verde. n. Peróxido de hidrógeno: solución 30% que se mantiene en la oscuridad a 4°C. Procedimiento. Todas las etapas siguientes son a temperatura ambiente y se realizan asépticamente, a menos que se establezca de otra manera. Todos los lavados de placa ELISA se realizan por enjuagado con agua destilada tres veces y una vez con TBST. A. Siembra de células 1. Se hacen crecer células BT474 en placas de cultivo de tejido (Corning 25020-100) hasta 80-90% de confluencia y se recolectan utilizando Trypsin-EDTA (0.25%, GIBCO). 2. Se resuspenden las células en medio fresco y se transfieren a placas de cultivo de tejido de 96 pozos (Corning, 25806-96) a aproximadamente 25 000-50 000 células/pozo (100 µ?/????). Se incuban las células en C02 5% a 37°C durante la noche. B. Recubrimiento de la placa de ELISA y bloqueo 1. Recubrir la placa de ELISA (Corning 25805-96) con anticuerpo contra HER2 a 0.5 µg/pozo en 150 µ? de PBS durante la noche a 4°C y sellar con Parafilm. Las placas recubiertas con anticuerpos se pueden utilizar hasta 2 semanas, cuando se almacenan a 4°C. 2. En el día de uso, separar la solución de recubrimiento, sustituir con 200 µ? de amortiguador de bloqueador, agitar la placa y después separar el amortiguador de bloqueo y lavar la placa justo antes de agregar el lisado. C. Procedimientos de ensayo 1. TBST los medicamentos a condición sin suero. Antes de agregar los medicamentos, se sustituye el medio viejo con RPMI sin suero (90 2. Diluir la solución la solución concentrada de medicamentos (en DMSO 100%) 1:10 con RPMI y transferir 10 µ?/???? de esta solución a las células para obtener una concentración final de DMSO con medicamento a 1%. Incubar las células en C02 5% 37°C. 3. Preparar amortiguador de lisis celular fresco (HNTG*) 5xHNTG 2 mi EDTA 0.2 mi Na3V04 0.1 mi Na4P207 0.1 mi H2o 7.3 mi 4. Después de preincubación de medicamento durante dos horas, separar toda la solución de la placa, transferir HNTG* (100 µ?/pozo) a las células, y agitar durante 10 minutos. 5. Utilizar una pipeta de 12 canales para raspar las células de la placa y homogenizar el lisado por aspiración y suministro repetidos. Se transfiere la totalidad de lisado a la placa de ELISA y se agita durante 1 hora. 6. Se separa el lisado, se lava la placa y se agregan anticuerpo contra pTyr (1:3 000 con TBST) 100 µ?/???? y se agita durante 30 minutos. 7. Se separa el anticuerpo contra pTyr, se lava la placa y se agrega anticuerpo de chivo contra IgG de conejo conjugado (1:5 000 con TBST) 100 µ?/???? y se agita durante 30 minutos. 8. Se separa el anticuerpo contra IgG de conejo, se lava la placa y se agrega ABTS/H202 fresco (1.2 µ? de H202 a 10 mi de ABTS) 100 l/pozo a la placa para iniciar el desarrollo de color el cual habitualmente requiere 20 minutos. 9. Medir la DO a 410 nm en un equipo Dynatec MR5000.
Elisa para PDGF-R Todos los medios de cultivo celular, la glutamina, el suero bovino fetal se adquirieron de Gibco Life Technologies (Grand Island, N.Y.) a menos que se especifique de otra manera. Todas las células se hacen crecer en un atmósfera húmeda de aire 90-95% y C02 5-10% a 37°C. Todas las líneas celulares se subcultivan habitualmente dos veces una semana y son negativas para microplasma determinado por el método Mycotect (Gibco). Para los ensayos de ELISA, se hacen crecer células (U1242, obtenidas de Joseph Schlessinger, NYU) hasta 80-90% de confluencia en medio de crecimiento ( EM con FBS 10%, NEAA, NaPyr 1mM y GLN 2 mM) y se siembran en placas de cultivo de tejido de 96 pozos en suero 0.5% a 25000 a 30 000 células por pozo. Después de incubación durante la noche en medio que contiene suero 0.5%, las células se cambian a medio libre de suero y se tratan con el compuesto de prueba durante 2 h en un incubador con C02 5%, 37°C. Las células después se estimulan con ligando durante 5-10 minutos seguido por lisis con HNTG (Hepes 20m , NaCI 150mM, glicerol 10%, EDTA 5mM, Na3V04 5mM, Tritón X-100 0.2% y NaPyr 2mM). Los lisados celulares (0.5 mg/pozo en PBS) se transfieren a placas de ELISA previamente recubierto con anticuerpo específico para receptor y el cual ha sido bloqueado con leche 5% en TBST (Tris-HCI 50mM pH 7.2, NaCL 150 mM y Tritón X-100 0.1 %) a temperatura ambiente durante 30 min. Los lisados se incuban con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavan con TBST cuatro veces y después se incuban con anticuerpo policlonal contra 9 fosfotirosina a temperatura ambiente durante 30 minutos. El exceso de anticuerpo contra fosfotirosina se separa por enjuagado de la placa con TBST cuatro veces. El anticuerpo de chivo contra IgG de conejo se agrega a la placa de ELISA durante 30 min a temperatura ambiente, seguido por enjuagado con TBST cuatro veces más. Se agrega ABTS (ácido cítrico 100mM, Na2HP04 250 m y 0.5 mg/ml de ácido 2,2'-azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-sulfón¡co)) más H202 (1.2 mL, H202 30% a ABTS 10 mi) a las placas de ELISA para iniciar el desarrollo de color. La observancia 410 nm con una longitud con onda de referencia de 630 nm se registra aproximadamente 15 a 30 minutos y después de la adición de ABTS.
Elisa para IGF-1 Se puede utilizar el siguiente protocolo para medir la concentración de fosfotirosina en el receptor IGF-1, lo que indica la actividad de tirosina cinasa para receptor IGF-1. Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos : a. La línea de células utilizada en este ensayo es 3T3/IGF-1R, una línea celular que sobreexpresa receptor IGF-1. b. Se hace crecer NIH3T3/IGF-1 R en una incubadora con C02 5% a 37°C. El medio de crecimiento es DMEM + FBS 10% (inactivado por calor) + L-glutamina 2mM. c. Se utiliza anticuerpo contra IGF-1R denominado 17-69. Los anticuerpos se purifican por Enzymology Lab SUGEN, Inc. d. D-PBS: KH2 HP04 0.20 g/l KCI 0.20 g/l NaCI 8.00 g/l (pH 7.2) e. Amortiguador de bloqueo: TBST más leche 5% (leche seca sin grasa instantánea Carnation). f . Amortiguador TBST: Tris-HCI 50 mM NaCI 150 mM (pH 7.2 HC1 10N) Tritón X-100 0.1% se prepara solución concentrada de TBS (10X) y se agrega Tritón X-100 al amortiguador durante la dilución. g. Amortiguador HNTG HEPES 20 mM NaCI 50 mM (pH 7.2/HCI, 1 N) Glicerol 10% Tritón X-100 0.2% Se prepara una solución concentrada (5x) y se mantiene a 4°C. h. EDTA-HCI: 0.5M pH 7.0 (NaOH) como concentrado 100X. i. Na3V04: 0.5M como un concentrado 100X y se mantienen alícuotas en -80°C. j. Na4P207: 0.2M como un concentrado 100X. k. factor -1 de crecimiento similar insulina de Promega (Cat#G5111). I. Antisuero policlonal contra fosfotirosina; suero de conejo generado por Enzymology Lab. SUGEN Inc. m. Anticuerpo de chivo contra IgG de conejo, conjugado con POD (anticuerpo de detección), Tago (catálogo No. 4520; Lote No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, California. n. Solución ABTS (ácido 2,2'azinobis(3-etilbenzotiazilinsulfónico)): Acido cítrico 100 mM Na2HP04 250mM (pH 4.0/1 N HCI) ABTS 0.5 mg/ml la solución de ABTS debe mantenerse en la oscuridad a 4°C. La solución debe desecharse cuando vira a verde. o. Peróxido de hidrógeno: solución 30% que se mantiene en la oscuridad y a 4°C. Procedimiento. Todas las etapas siguientes se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique específicamente en otro sentido. Todos los lavados de placa ELISA se realizan por enjuagado de placa con agua corriente tres veces, seguido por un enjuague con TBST. El secado de la placa se realiza con toallas de papel. A. Siembra de células: 1. Se hacen crecer células en cajas de cultivo de tejido (Corning 25020-100) hasta 80-90% de confluencia y se cosechan con Trypsin-EDTA (0.25%,0.5 ml/D-100, GIBCO). 2. Se resuspenden las células en DMEM fresco + FBS 10% + L-Glutamina 2 mM y se transfieren a placas de cultivo de tejido de 96 pozos (Corning, 25806-96) a 20 000 células/pozo (100 µ?/????). Se incuba durante 1 día y después se sustituye el medio por 90 µ? de medio sin suero y se incuba en C02 5% y 37°C durante la noche. B. Recubrimiento de la placa de ELISA y bloqueo 1. Se recubre la placa de ELISA (Corning 25805-96) con anticuerpo contra IGF-!R a 0.5 pg/pozo en 100 µ? de PBS por lo menos 2 horas. 2. Se retira la solución de recubrimiento y se sustituye con 100 pl de amortiguador de bloqueo y se agita durante 30 minutos. Se retira el amortiguador de bloqueo y se lava la placa justo antes de agregar el lisado. C. Procedimientos de ensayo 1. Los medicamentos se prueban en una condición sin suero. 2. Se diluye el medicamento concentrado (en DMSO 100%) 1 :10 con DMEM en placa de polipropileno de 96 pozos y se transfieren 10 µ?/???? de esta solución a las células para obtener una dilución final de medicamento 1 :100 y una concentración final DMSO de 1%. Se incuban las células en C02 5% a 37°C. durante 2 horas. 3. Se prepara amortiguador de lisis de células fresco (HNTG*) HNTG 2 mi EDTA 0.1 mi Na3V04 0.1 mi Na4(P207) 0.1 mi H20 7.3 mi 4. Después de incubación de medicamento durante dos horas, se transfieren 10 µ?/???? de ligando IGF-1 200 nM en PBS a las células (concentración final = 20 nM) y se incuba a CO2 5% y 37°C durante 10 minutos. 5.Se separa el medio y se agregan 100 µ?/???? de HNTG* y se agita durante 10 minutos. Se observan las células bajo microscopio para observar sí se han lisado adecuadamente. 6. Se utiliza una pipeta de 12 canales para raspar las células de la placa y homogenizar el lisado mediante aspiración y suministro repetidos.
Se transfiere la totalidad de lisado a la placa de ELISA recubierta con anticuerpo y se agita durante 1 hora. 7. Se separa el lisado, se lava la placa y se transfiere el anticuerpo contra pTyr (1 :3 000 con TBST) 100 µ?/???? y se agita durante 30 minutos. 8.Se separa el anticuerpo contra pTyr, se lava la placa, se transfiere Tago (1 :3 000 con TBST) 100 µ?/???? y se agita durante 30 minutos. 9. Se separa el anticuerpo de detección, se lava la placa y se transfiere ABTS fresco/H202 (1.2 pl de H202 a 10 mi de ABTS) 100 µ?/pozo a la placa para iniciar el desarrollo de color. 10. Medir la DO en un equipo Dynatec MR5000, que se conecta a un equipo Ingres.
Elisa para el receptor EGF Se mide como se describe en lo siguiente la actividad del receptor de cinasa EGF (ensayo EGFR-NIH3T3) en células completas: Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos. a. Ligando EGF: concentración concentrada = 16.5 µ?; EGF 201, TOYOBO, Co., Ltd, Japón. b. 05-101 (UBI) (un anticuerpo monoclonal que reconoce un dominio extracelular EGFR). c. Anticuerpo contra fosfotirosina (anti-Ptyr) (policlonal). d. Anticuerpo de detección: anticuerpo de chivo contra IgG de conejo conjugada con peroxidasa de rábano, TAGO, Inc., Burlingame California. e. Amortiguador TBST: Tris-HCI, pH 7 50 mM NaCI 150 m Tritón X-100 0.1 f. Concentrado de HNTG 5X: HEPES 0.1 M NaCI 0.75M Glicerol 50 Tritón X-100 1.0% g. Concentrado de ABTS: Acido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM HCI concentrado 4.0 pH ABTS* 0.5 mg/ml Se mantiene la solución en la oscuridad a 4°C hasta que se utilizado, h. Reactivos concentrados de: EDTA 100 mM pH 7.0 Na3V04 0.5M Na4(P207) 0.2M Procedimiento. Se utiliza el siguiente protocolo: A. Placa de ELISA precubierta 1. Se recubren las placas de ELISA (Corning, 96 pozos, Cat. #25805-96) con anticuerpos 05-101 a 0.5 pg por pozo en PBS, volumen final de 150 µ?/????, y se almacena durante la noche a 4°C. Las placas recubiertas son buenas hasta por 10 días cuando se almacenan a 4°C. 2. En el día de uso, se separa el amortiguador de recubrimiento y se sustituye con de amortiguador de bloqueo (leche seca sin grasa instantánea Carnation 5% en PBS). Se incuba la placa, se agita a temperatura ambiente (aproximadamente 23°C a 25°C) durante 30 minutos. Justo antes de su uso, se separa el amortiguador de bloqueo y se lava la placa 4 veces con amortiguador TBST. B. Siembra de células 1. Se puede utilizar la línea de células NIH3T3/C7 (Honegger, et al., Cell 51 :199-209, 1987) para este ensayo. 2. Se seleccionan las cajas que tengan 80-90% de confluencia para el experimento. Se tripsinizan las células y se detiene la reacción al agregar medio DMEM CS 10%. Se suspenden las células en medio D EM (medio de DMEM CS 10%) y se centrífuga una vez a 1000 rpm, y una vez a temperatura ambiente durante 5 minutos. 3. Se resuspenden las células en medio de siembra (DMEM; suero bovino 0.5%) y se cuentan las células utilizando azul de tripan. Es aceptable una viabilidad superior a 90%. Las células se siembran en medio de DMEM (suero bovino 0.5%) a una densidad de 10 000 células por pozo, 100 pl por pozo, en una placa de microtitulación de 96 pozos. Se incuban las células sembradas en C02 5% a 37 °C durante aproximadamente 40 horas. C. Procedimientos de ensayo 1. Se verifican las células sembradas para determinar contaminación utilizando un microscopio invertido. Se diluye el concentrado de medicamento (10 mg/ml en DMSO) 1 :10 en medio DMEM, y después se transfieren 5 µ? a un pozo de prueba para una dilución final del medicamento de 1:200 y una concentración final de DMSO de 1%. Los pozos control únicamente reciben DMSO. Se incuba en CO2 5% a 37°C durante una horas. 2. Se prepara el ligando EGF: se diluye EGF concentrado en DMEM de manera que cuando se realice la transferencia del 0 pl EGF diluido (dilución 1 :12), se obtiene una concentración final 25 nM. 3. Se preparan 10 mi de HNTG* fresco suficiente para 100 pl por pozo; en donde HNTG* comprende:2.0 mi de concentrado de HNTG, 7.3 mi de milli-QH2O, 0.5 mi EDTA, 100 mM, pH 7.0, 0.1 mi de Na3VO4 0.5M y 0.1 mi Na4(P2Or), 0.2M. 4. Se coloca en hielo. 5. Después de 2 horas de incubación con medicamento se agrega ligando EGF preparado a las células, 10 µ? por pozo, para proporcionar uña concentración final de 25 nM. Los pozos control reciben únicamente DMEM. Se incuba, se agita a temperatura ambiente durante 5 minutos. 6. Se separa el medicamento, EGF y DMEM. Se lavan los pozos dos veces con PBS. Se transfiere HNTG* a los pozos, 100 µ? por pozo. Se coloca en hielo durante 5 minutos. Mientras tanto, se separa el amortiguador de bloqueo de otra placa de ELISA y se lava con TBST como se describe en lo anterior. 7. Con una punta de pipeta colocada de manera segura en un equipo de transferencia por micropipeta, se raspan las células de la placa y se homogeneiza el material celular al aspirar y suministrar repetidamente el amortiguador de lisis de HNTG*. Se transfiere el lisado a una placa de ELISA recubierta, bloqueada y lavada. Se incuba el agitado a temperatura ambiente durante una hora. 8. Se separa el lisado y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere el anticuerpo contra Ptyr recién diluido a la placa de ELISA a 100 µ? por pozo. Se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos en presencia de antisuero contra Ptyr (dilución 1 :3000 en TBST): 9. Se separa el anticuerpo contra Ptyr y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere anticuerpo TAGO 30 contra IgG de conejo recién diluido a la placa de ELISA a 100 µ? por pozo. Se incuba con agitación a temperatura ambiente durante 30 minutos (anticuerpo contra IgG de conejo: dilución 1 :3000 en TBST). 10. Se separa el anticuerpo de detección y se lava 4 veces con TBST. Se transfiere solución de ABTS/H2O2 recién preparada a placas de ELISA, 100 µ? por pozo. Se incuba a temperatura ambiente durante 20 minutos. Solución de ABTS/H202: 1.0 µ? de H202 30% en 10 mi de concentrado ABTS. 11. Se detiene la reacción al agregar 50 µ? de H2S04 (opcional) y se determina DO a 410 nm. 12. La señal máxima de fosfotirosina se determina a restar el valor de los controles negativos de los controles positivos. Después se calcula el por ciento de inhibición de contenido de fosfotirosina para los pozos que contienen extracto, después de restar los controles negativos.
Prueba de ELISA para el Receptor de Insulina Celular Se utiliza el siguiente protocolo para determinar si los compuestos de la presente invención poseen actividad de tirosina cinasa con receptor para insulina. Materiales y reactivos. Se utilizan los siguientes materiales y reactivos para medir los niveles de fosfotirosina sobre el receptor de insulina (que indica la actividad de tirosina cinasa con receptor para insulina): 1. La línea de células preferidas es la línea de células NIH3T3 (ATCC No. 1658) la cual sobreexpresa receptor de insulina (células H25); 2. Se hacen crecer células H25 en un incubador con CO2 5% a 37°C. El medio de crecimiento es DMEM + FBS 10% (inactivado por calor) + 2 mm de L-glutamina; 3. Para el recubrimiento de placa para ELISA, se utiliza el anticuerpo monoclonal contra anticuerpo IR, denominado BBE. Tales anticuerpos se purifican por Enzymology Lab, SUGEN, Inc.; 4. D-PBS, que comprende: KH2PO4 0.20 g/l (GIBCO, 310-4190AJ) K2 HPO4 2.16 g/l KCI 0.20 g/l NaCI 8.00 g/l (pH 7.2); 5 5. Amortiguador de bloqueo: TBST más leche 5% (leche seca sin grasa instantánea Carnation); 6. Amortiguador TBST, que comprende: Tris-HCI 50 mM NaCI 150 mM pH 7.2 (HC1 , 1 N) Tritón X-100 0.1 % Nota: la solución concentrada de TBS (10X) se prepara y se agrega Tritón X-100 al amortiguador durante la dilución; 7. Amortiguador HNTG, que comprende: HEPES 20 mM NaCI 150 mM pH 7.2 (HCI, 1 N) Glicerol 10% Tritón X-100 0.2% Nota: se prepara una solución concentrada (5X) y se mantiene a 4°C. 8. EDTA HCI: 0.5M pH 7.0 (NaOH) como concentrado 100X; 9. Na3VÜ4: 0.5M como concentrado 100X y las alícuotas se mantienen a -80°C; 10 Na4P207: 0.2M como concentrado 100X; 11. Insulina de GIBCO BRL (Cat # 18125039); 12. Antisuero policlonal contra fosfotirosina; sueros de conejos generados por Enzymology Lab., SUGEN Inc.; 13. Anticuerpo de detección, preferiblemente anticuerpo de chivo contra IgG de conejo, conjutado con POD, Tago (Cat. No. 4520: Lot No. 1802): Tago, Inc., Burlingame, CA; 14. Solución ABTS, que comprende: Ácido cítrico 100 mM Na2HP04 250 mM pH 4.0 (1 N HCI) ABTS 0.5 mg/ml. en donde ABTS es 2,2'azinobis (ácido 3-etilbenatiazolina sulfónico) y se almacena en la oscuridad de 4°C y se desecha cuando se vuelve verde. 5. Peróxido de hidrógeno: solución 30% que se mantiene en la oscuridad a 40°C. Protocolo. Todas las etapas siguientes se llevan a cabo a temperatura ambiente a menos que se especifique de otra manera. Todos los lavados de placa de ELISA se realizan al enjuagar la placa con agua corriente tres veces seguido por un enjuagado con TBST. Todas las placas se secan por contacto con toallas de papel antes de su uso. A.^ Siembra de células: 1. Las células se hacen crecer en recipientes de cultivo de tejido (10 cm, Corning 25020-100) hasta 80-90% de confluencia y se cosechan con tripsina-EDTA (0.25%, 0.5 ml/D-100, GIBCO); 2. Se resuspenden las células en DMEM fresco + FBS 10% + L-glutamina 2 mM, y se transfieren a una placa de cultivo de tejido de 96 pozos (Corning, 25806-96) a 20,000 céiulas/pozo (100 µ?/????). Las células después se incuban durante 1 día. Después de tai incubación 90 mi de medio de suero 0.01% sustituye al medio fresco y las células se incuban en C02 5% y 37°C durante la noche. B. Recubrimiento y bloqueo de la placa de ELISA: 1. Se recubre la placa de ELISA (Corning 25805-96) con anticuerpo Anti-IR a 0.5 pg/pozo en 100 pl de PBS durante por lo menos 2 horas. 2. Se separa la solución de recubrimiento y se sustituye con 100 µ? de amortiguador de bloqueo, y se agita durante 30 minutos. Se separa el amortiguador de bloqueo y se lava la placa justo antes de agregar el lisado. C. Procedimientos de ensayo. 1. Los medicamentos se prueban en condición libre de suero. 2. Se diluye el concentrado de medicamento (en DMSO 100%) 1:10 con DMEM en placa de polipropileno de 96 pozos y se transfieren 10 µ?/???? de esta solución a las células para obtener una dilución final de medicamento 1:100 y una concentración final de DMSO de 1.0%. Se incuban las células en CO25% a 37°C durante 2 horas. 3. Se preparan amortiguador de lisis para células frescas (HNTG*) HNTG (5x) 2 mi EDTA 0.1 mi Na3VO4 0.1 mi Na4P207 0.1 mi H20 7.3 mi HNTG* 10 ml 4. Después de la incubación del medicamento durante 2 horas, se transfieren 10 µ?/???? de insulina 1 µ? en PBS a las células (concentración final = 100 nM) y se incuba a C02 5% a 37°C durante 10 minutos. 5. Se separa el medio y se agregan 100 µ?/???? de HNTG* y se agita durante 10 minutos. Se observan las células bajo microscopio para observar si se han lisado adecuadamente. 6. Utilizando una pipeta de 12 canales, se raspan las células de la placa y se homogeiniza el lisado por aspiración y suministro repetidos. Se transfiere todo el lisado a la placa de ELISA recubierta con anticuerpo y se agita durante 1 hora. 7. Se separa el lisado, se lava la placa, se transfiere anticuerpo contra p-Tyr (1:3,000 con TBST) 00 µ?/???? y se agita durante 30 minutos. 8. Se separa el anticuerpo contra p-Tyr, se lava la placa, se transfiere Tago (1 ;3,000 con TBST) 100 µ?/???? y se agita durante 30 minutos. 9. Se separa el anticuerpo de detección, se lava la placa y se transfiere ABTS/H2 O2 fresco (1.2 µ? de H2 02 a 10 mi de ABTS), 100 µ?/???? a la placa para iniciar el desarrollo de color. 10. Se mide la DO en un equipo Dynatec MR5000, la cual se conecta a un equipo Ingres. Todas las etapas siguientes deben seguir las instrucciones de Ingres.
Resultados Experimentales para Ensayos de ELISA Los resultados experimentales de los diversos compuestos de acuerdo con la invención utilizando los protocolos descritos en lo anterior se establecen en el cuadro 1.
CUADRO 1 CUADRO 1 (continuación) Ensayos de Crecimiento de Células Se pueden llevar a cabo los siguientes ensayos para medir el efecto de los compuestos reclamados y las combinaciones sobre el crecimiento celular como resultado de la interacción de los compuestos con uno o más RTK. A menos que se especifique de otra manera, los siguientes ensayos se pueden aplicar de manera general para medir la actividad de un compuesto contra una RTK particular. En la medida de ensayo, que se establece en lo siguiente, la referencia a una RTK específica, una persona experta en la técnica puede ser capaz de adaptar el protocolo que se describe para uso con el fin de medir la actividad de una segunda RTK.
Ensayo en Aqar Suave Se puede utilizar el ensayo en agar suave para medir los efectos de sustancias o combinaciones que contienen tales sustancias en el crecimiento celular. A menos que se establezca de otra manera, los ensayos en agar suave se llevan a cabo como sigue: Material y Reactivos. Se utiliza los siguientes materiales y reactivos: a. Un baño maría que se ajusta a 39°C y otro baño maría a 37°C. b. Un medio de ensayo 2X que está constituido de medio de Eagle modificado por Dulbeco 2X (DMEM) (Gibco Cat. # CA400-4AN03) complementado con lo siguiente: suero bovino fetal (FBS) 20%, piruvato de sodio 2 mM, glutamina amina 4 mM; y aminoácidos no esenciales HEPES 20 mM (1:50 de un concentrado 100x). c. Medio de ensayo 1X elaborado de DMEM 1X suplementado con FBS 10%, piruvato de sodio 1 mM, glutamina 2 mM, HEPES 10 mM, aminoácidos no esenciales (1:100 a partir de un concentrado 100x). d. Agarosa SeaPlaque 1.6% en un frasco que se puede utilizar en autoclave. e. Placas Corning estériles de 35 mm (F C Bioproducts Cat.#50102). f. Pipetas de vidrio estériles de 5 mi (envueltas individualmente) g. Tubos de centrífuga cónicos de 15 mi y 50 mi, estériles h. Pipetas y puntas estériles. i. Tubos estériles de microcentrífuga. j. Células en matraces T75: SKOV-3 (ATCC HTB77). k. Solución de tripsina 0.25% (Gibco #25200-0 5). Procedimiento. Se utiliza el siguiente procedimiento para llevar a cabo el ensayo en agar suave: A. Procedimiento para producir la capa de base 1. Se tienen todos los medios calentados en baño maría a 37°C. 2. Para elaborar 1X de medio de ensayo + agar 0.8%: se realiza una dilución 1:2 (vohvol) de agar fundido (enfriado a 39°C) con medio de ensayo 2X. 3. Se mantienen todos los medios con el agar tibio en el baño maría a 39°C cuando no se utilizan. 4. Se suministra 1 mi de medio de ensayo 1X + agar 0.8% dentro de las cajas y se hace girar suavemente la placa para formar una capa de base uniforme. Deben evitarse burbujas. 5. Se refrigeran las capas de base para que solidifiquen (aproximadamente 20 minutos). Las capas de base se pueden almacenar durante la noche en el refrigerados. B. Procedimiento para recolectar células 1. Se toma un matraz por línea de célula del incubador; se separa por aspiración del medio; se lava una vez con PBS y se separa por aspiración; se agregan 3 mi de solución de tripsina. 2. Después de que las células se disocian del matraz, se agregan 3 mi de medio de ensayo 1X para inhibir la actividad de tripsina. Se pipetean las células hacia arriba y hacia abajo, y después se transfiere la suspensión a un tubo de 15 mi. 3. Se determina la concentración de células utilizando un contador Coulter y se determina la viabilidad por exclusión de azul de tripan. 4. Se toma el volumen apropiado necesario para sembrar 3300 células viables por placa y se diluye a 1.5 mi con medio de ensayo 1X. C. Procedimiento para elaborar la capa de agarosa 0.4% superior: Se agregan compuestos TBST a dos veces la concentración de ensayo final deseada; + 1.5 mi de suspensión celular en medio de ensayo 1X FBS 10%; + 1.5 mi de medio de ensayo 1X + agarosa* 0.8%: Total = 3.0 mi de medio 1X FBS 10% + agarosa 0.4% con 3300 células viables/ml, con y sin los compuestos TBST. * (elaborado por dilución 1:2 de medio 2X con agar 30 1.6% para el procedimiento de capa base anterior). 2. Se colocan en placa 1 mi de la mezcla de ensayo sobre la capa de base de 1 mi. Los duplicados se colocan en placa a partir de un volume de 3 mi. 3. Se incuban las cajas durante 2-3 semanas en un incubador humidificado al 100% con C02 10%. 4. Las colonias que tienen 60 micrómetros o más grandes se califican como positivas.
Ensayos de Crecimiento de Sulforodamina B (SRB) Se pueden utilizar los ensayos con SRB para medir los efectos de sustancias sobre el crecimiento celular. Los ensayos se llevan a cabo como sigue: Ensayo 1 : Ensayo de SRB sobre el crecimiento de células 3T3/E/H+TGF-a(T) Materiales: Placas estériles de fondo plano de 96 pozos. Placas estériles de fondo redondo de 96 pozos. Depósitos de 25 mi o 100 mi estériles. Pipetas, un equipo de pipetas multicanal. Puntas de pipeta estériles.
Tubos estériles de 15 mi y 50 mi. Reactivos: SRB 0.4% en ácido acético 1 %. Base Tris 10 mM TCA 10% Ácido acético 1 % DMSO estéril (Sigma) Compuesto en DMSO (100 mM o menos de solución concentrada) Tripsina-EDTA 25% en solución de disociación celular (Sigma) Linea celular y medio de crecimiento: 3T3/E/H +TG F-a(T) (células NIH 3T3 clon 7 que expresan la quimera EGF-R HER2 y TGF-a, células de bucle autocrino derivadas de tumor) Suero bovino 2%/DMEM + glutamina 2 mM Protocolo: Día 0: colocación en placa de las células: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. Se tripsinizan las células como es habitual. Se transfieren 100 µ? de suspensión celular a 10 mi de material isótono. Se realiza la cuenta de células con un Coulter Counter. 2. Se diluyen las células en medio de crecimiento a 60,000 células/ml. Se transfieren 100 µ? de células a cada pozo en una placa de fondo plano de 96 pozos para proporcionar 6000 células/pozo. 3. Se utiliza la mitad de la placa (4 hileras) para cada compuesto control y pozos por cuadruplicado para cada concentración de compuesto, como se establece para cuatro pozos para el control de medio y cuatro pozos para el control de DMSO. 4. Se agitan suavemente las placas para permitir la unión uniforme de las células. 5. Se incuban las placas a 37°C en un incubador con CO2 10%. Día 1 : Adición de compuesto: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. En una placa de fondo redondo de 96 pozos se agregan 125 µ? de medio de crecimiento a las columnas 3-11. Esta placa se utiliza para titular el compuesto, 4 hileras por compuesto. 2. En un tubo estéril de 15 mi, se elabora una solución 2X de la concentración más elevada del compuesto al agregar 8 µ? del compuesto a un total de 2 mi de medio de crecimiento para una dilución de 1 :250. A esta dilución, la concentración de D SO es de 0.4% para una solución 2X o de 0.2% para una solución 1X en las células. La concentración inicial del compuesto habitualmente es de 100 µ? pero esta concentración puede variar en base en la solubilidad del compuesto. 3. Se transfiere la solución del compuesto inicial 2X a pozos por cuadruplicado en la columna 12 o a una placa de fondo redondo de 96 pozos. Se realizan diluciones seriadas 1 :2 a través de la placa desde la derecha a la izquierda al transferir 125 µ? de la columna 12 a la columna 11 , de la columna 11 a la 10 y así sucesivamente. Se transfieren 100 µ? de la diluciones de compuesto en 100 µ? de medio sobre células en los pozos correspondientes de la placa de fondo plano de 96 pozos. El volumen total por pozo debe ser de 200 µ?. 4. Para un control de vehículo, se prepara una solución 2X de DMSO a DMSO 4% en medio de crecimiento. Se transfieren 100 µ? de la solución de DMSO a los pozos apropiados de las células. La concentración final de DMSO es 0.2%. 5. Para los pozos para control de medio, se agregan 100 µ?/???? de medio de crecimiento a los pozos de células apropiados. 6. Se regresa la placa al incubador y se incuba durante 4 días. Día 5: desarrollo del ensayo Esta parte del ensayo se lleva a cabo en el gabinete. 1. Se aspira o se elimina por vertido el medio. Se agregan 200 µ? de TCA 10% frío a cada pozo para fijar las células. Se incuba la placa durante por lo menos 60 min a 4°C. 2. Se desecha el TCA y se enjuagan los pozos 5 veces con agua. Las placa se secan al voltearlas al revés sobre toallas de papel. 3. Se tiñen las células con 100 µ?/???? de SRB 0.4% durante 10 min. 4. Se elimina por vertido SRB y se enjuagan los pozos 5 veces con ácido acético 1%. Se secan las placas completamente volteándolas al revés sobre toallas de papel. 5. Se solubiliza el colorante con 100 µ?/pozo de base Tris 10 mM durante 5-10 min en un agitador. 6. Se leen las placas en un lector de placa ELISA Dynatech a 570 nm con referencia a 630 nm.
Ensayo 2: Ensayo de SRB para el crecimiento de células 3T3/EGF-R+TGF-a(T) Los materiales y reactivos son los mismos que para el ensayo 1. Línea celular y medio de crecimiento: 3T3/EGF+TGF-a(T) (células NIH 3T3 clon 7 que expresan EGF-R y TGF-a, células de bucle autocrino derivadas de tumor), 2% de suero bovino/DMEM + glutamina 2 mM Protocolo: Día 0: colocación en placa de las células: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. Se tripsinizan las células como es habitual. Se transfieren 100 µ? de suspensión celular a 10 mi de isótono. Se cuentan las células con equipo Coulter Counter. 2. Se diluyen las células en medio de crecimiento a 60,000 células/ml. Se transfieren 100 µ? de células a cada pozo en una placa de fondo plano de 96 pozos para proporcionar 6000 células/pozo. 3. Se utiliza la mitad de la placa (4 hileras) para cada compuesto y se realizan pozos por cuadruplicado para cada concentración de compuesto, como se establece para cuatro pozos para el control de medio y cuatro pozos para el control de DMSO. 4. Se agitan suavemente las placas para permitir la unión uniforme de las células. 5. Se incuban las placas a 37°C en un incubador con C02 10%. Día 1 : Adición del compuesto: igual que para el ensayo 1. Día 5: desarrollo del ensayo: igual que para el ensayo 1.
Ensayo 3: Ensayo de SRB en el crecimiento de células 3T3/PDGF-3R/PDGF-BBm Línea celular y medio de crecimiento 3T3/PDGF- R/PDGF-BB(T) (células NIH 3T3 clon 7 que expresan el receptor PDGFp y PDGF-BB, a partir de tumores extirpados de ratones atímicos), suero bovino 2%/DMEM + glutamina 2 mM Protocolo: Día 0: colocación en placa de células: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. Se tripsinizan las células como es habitual. Se transfieren 200 5 µ? de suspensión celular a 10 mi de material isotónico. Se cuentan las células con equipo Coulter Counter. 2. Se diluyen las células en medio de crecimiento hasta 60,000 células/ml. Se transfieren 100 µ? de células a cada pozo en una placa de fondo plano de 96 pozos para proporcionar 6000 células/pozo. " 10 3. Se permite que la mitad de la placa (4 hileras) para cada , compuesto y los pozos por cuadruplicado para cada concentración de compuesto, un grupo de cuatro pozos para el control del medio y cuatro pozos para el control de DMSO. 4. Se agitan suavemente las placas para permitir la unión 15 uniforme de las células a la placa. 5. Se incuban las placas a 37°C en un incubador de C02 10%. Día 1 : Adición del compuesto: igual que para el ensayo 1. Día 5: desarrollo del ensayo: igual que para el ensayo 1. 20 Ensayo 4: Ensayo de SRB en el crecimiento de células de músculo liso (SMC) humanas Los materiales y reactivos son los mismos que para el ensayo 1 : Línea de células y medio de crecimiento: Células de músculo liso aórticas humanas (Clonetics) Equipo Bullet (bala) Clonetics: medio basal de músculo liso (SmBM) el cual se modifica por MCDB 131 que contiene suero bovino fetal 5%, 2 ng/ml de hFGF, 0.1 ng/ml de hEGF, 5.0 pg/ml de insulina, 50 pg/ml de gentamicina y 50 pg/ml de anfotericina B. Protocolo: Día 0: colocación en placa de las células: Esta parte del ensayo se lleva a cabo en una campana de flujo laminar. 1. Se tripsinizan las células como es habitual. Se transfieren 200 µ? de suspensión celular a 10 mi de solución isotónica. Se cuentan las células con equipo Coulter Counter. 2. Se diluyen las células en medio de crecimiento a 20,000 células/ml. Se transfieren 100 pl de células a cada pozo en una placa de fondo plano de 96 pozos para proporcionar 2000 células/pozo. 3. Se permite que la mitad de la placa (4 hileras) para cada compuesto y los pozos por cuadruplicado para cada concentración de compuesto, un grupo de cuatro pozos para el control de medio y cuatro pozos para el control de DMSO. 4. Se agitan suavemente las placas para permitir la unión uniforme de las células a la placa. 5. Se incuban las placas a 37°C en un incubador de C02 10%. Día 1 : Adición del compuesto: igual que para el ensayo 1.
Día 5: desarrollo del ensayo: igual que para el ensayo 1.
Ensayo de crecimiento de células 3T3 Ensayo 1: Ensayo de Incorporación de BrdU Inducido por PDGF Materiales y reactivos: (1) PDGF: PDGF humano B/B; 1276-956, Boehringer Mannheim, Alemania (2) Reactivo de marcado BrdU: 10 mM en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) Solución de fijación FixDenat: (lista para usarse), Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anticuerpo monoclonal contra BrdU-ROO: de ratón conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usarse, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania.. (6) Solución de lavado PBS: PBS 1X, pH 7.4, elaborada en el local. (7) Albúmina bovina (BSA): fracción V pulverizada; A-8551 , Sigma Chemical Co., E.U.A. Protocolo (1) Línea de células 3T3 sometida a ingeniería: 3T3/EGFRc7. 68 (2) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, CS 10%, Gln 2 mM en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37°C en C02 5%. (3) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS y después se suspende el suministro de suero en medio sin suero (DMEM CS 0% con BSA 0.1 %) durante 24 horas. (4) En el día 3, se agregan el ligando (PDGF = 3.8 nM, preparado en DMEM con BSA 0.1 %) y los compuestos de prueba a las células simultáneamente. Los pozos para el control negativo reciben DMEM sin suero con BSA 0.1% únicamente. Las células de control positivo reciben el ligando (PDGF) pero no el compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pozos y se someten a dilución seriada a 7 concentraciones de prueba. (5) Después de 20 horas de activación del ligando, se agrega el reactivo etiquetado BrdU diluido (1 :100 en DMEM, BSA 0.1 %) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µ?t?) durante 1.5 horas. (6) Después de incubación con reactivo de etiquetado, se retira el medio al decantar y se seca por contacto de la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 µ?-????) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placa. (7) La solución FixDenat se separa perfectamente al decantar y secar por contacto la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada 5% en PBS, 200 µ?/????) como una solución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (8) Se retira la solución de bloqueo por decantación y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega solución contra BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, BSA 1%) (100 µ?/pozo) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (9) El conjugado de anticuerpo se separa perfectamente al decantar y enjuagar los pozos 5 veces con PBS y la placa se seca al invertir y secar por contacto sobre una toalla de papel. (10) Se agrega solución de sustrato TMB (100 µ?/????) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa hasta que se produce desarrollo de color suficiente para detección fotométrica. (11) Se mide la absorbencia de las muestras a 410 nm (en el modo de "longitud de onda doble" con un filtro que lee a 490 nm como una longitud de onda de referencia), en un lector de placa Dynatech ELISA.
Ensayo 2: Ensayo de incorporación de BrdU inducida por EGF Materiales y reactivos: (1) EGF: EGF de ratón, 201 ; Toyobo, Co., Ltd, Japón (2) Reactivo de etiquetado BrdU: 10 mM en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) Solución de fijación FixDenat: (lista para usarse), Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anticuerpo monoclonal de ratón contra BrdU-POD conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usarse, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de lavado PBS: PBS 1X, pH 7.4, elaborada en el laboratorio. (7) Albúmina bovina (BSA): polvo con fracción V; A-8551 , Sigma Chemical Co., E.U.A. Protocolo (1) Línea de células 3T3 sometida a ingeniería: 3T3/EGFRc7. (2) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en CS 10%, Gln 2 mM en DMEM, en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37°C en C025%. (3) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS y después se elimina el suero en medio sin suero (DMEM CS 0% con BSA 0.1%) durante 24 horas. (4) En el día 3, el ligando (EGF = 2 nM, preparado en DMEM con BSA 0.1%) y los compuestos de prueba que se agregan a las células simultáneamente. Los pozos del control negativo reciben DMEM libre de suero únicamente con BSA 0.1%; las células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero no el compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pozos y se diluyen de manera seriada para 7 concentraciones de prueba. (5) Después de 20 horas de activación de ligando, se agrega el reactivo etiquetado BrdU diluido (1 :100 en DMEM, BSA 0.1%) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 pm) durante 1.5 horas. (6) Después de incubación con el reactivo de etiquetado, el medio se separa por decantación y se seca por contacto de la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 µ?/????) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placa. (7) La solución FixDenat se separa perfectamente por decantación y se seca por contacto la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada 5% en PBS, 200 µ?/????) como solución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (8) Se retira la solución de bloqueo por decantación y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega solución contra BrdU-POD (dilución 1:100 en PBS, BSA 1%) ( 00 µ?/pozo) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (9) El conjugado de anticuerpo se separa perfectamente por decantación y se enjuagan los pozos 5 veces con PBS y la placa se seca al invertir y secar por contacto sobre una toalla de papel. (10) Se agrega solución de sustrato T B (100 µ?/????) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa hasta que existe suficiente desarrollo de color para detección fotométrica. (11 ) La absorbencia de las muestras se mide a 410 nm (en un modo de "longitud de onda doble" con un filtro que lee a 490 nm como una longitud de onda de referencia) en un lector de placa Dynatech ELISA.
Ensayo 3: Incorporación de BrdU activada por Her2 Inducida por EGF Materiales y reactivos: (1 ) EGF: EGF de ratón, 201 ; Toyobo, Co., Ltd, Japón (2) Reactivo de etiquetado BrdU: 10 mM en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) Solución de fijación FixDenat: (lista para usarse), Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anticuerpo contra BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usarse, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de lavado PBS: PBS 1X, pH 7.4, elaborada en el laboratorio. (7) Albúmina bovina (BSA): polvo de fracción V; A-8551, Sigma Chemical Co., E.U.A. Protocolo (1) Línea de células 3T3 sometida a ingeniería: 3T3/EGFr/Her2/EGFr (EGFr con un dominio de cinasa Her2) (2) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, Cs 10%, Gln 2 mM en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37°C en C02 5%. (3) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS y después se elimina el suero en medio sin suero (DMEM CS 0% con BSA 0.1 %) durante 24 horas. (4) En el día 3, se agregan el ligando (EGF = 2 nM, preparado en DMEM con BSA 0:1 %) y los compuestos de prueba a las células simultáneamente. Los pozos con control negativo reciben DMEM libre de suero únicamente con BSA 0.1 %; las células de control positivo reciben el ligando (EGF) pero no el compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pozos y se diluyen de manera seriada para 7 concentraciones de prueba. (5) Después de 20 horas de activación de ligando, se agrega el reactivo etiquetado BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA 0.1 %) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µ??) durante 1.5 horas. (6) Después de incubación con el reactivo de etiquetado, el medio se separa por decantación y se seca por contacto de la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 µ?/????) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placa. (7) La solución FixDenat se separa perfectamente por decantación y se seca por contacto la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada 5% en PBS, 200 µ?/????) como solución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (8) Se separa la solución de bloqueo por decantación y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega solución contra BrdU-POD (dilución 1 :100 en PBS, BSA 1%) (100 µ?/????) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (9) El conjugado de anticuerpo se separa perfectamente por decantación y se enjuagan los pozos 5 veces con PBS y la placa se seca al invertir y secar por contacto sobre una toalla de papel. (10) Se agrega solución de sustrato T B (100 µ?/????) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa hasta que existe suficiente desarrollo de color para detección fotométrica. (11) La absorbancia de las muestras se mide a 410 nm (en un modo de "longitud de onda doble" con un filtro que lee a 490 nm como una longitud de onda de referencia) en un lector de placa Dynatech ELISA.
Ensayo 4: Ensayo de Incorporación de BrdU Inducido por IGF1 Materiales y reactivos: (1 ) Ligando IGF1 : humano, recombinante; G511 , Promega Corp.
E.U.A. (2) Reactivo de etiquetado BrdU: 10 mM en PBS (pH7.4), Cat.
No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) Solución de fijación FixDenat: (lista para usarse), Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anticuerpo contra BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usarse, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de lavado PBS: PBS 1X, pH 7.4, elaborada en el laboratorio. (7) Albúmina bovina (BSA): polvo de fracción V; A-8551 , Sigma Chemical Co., E.U.A. Protocolo (1 ) Línea de células 3T3 sometida a ingeniería: 3T3/IGF1 r. (2) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, CS 10%, Gln 2 mM en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37°C en C025%. (3) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS y después se elimina el suero en medio sin suero (DMEM CS 0% con BSA 0.1%) durante 24 horas. (4) En el día 3, se agregan a las células simultáneamente el ligando (IGF1 = 3.3 nM, preparado en DMEM con BSA 0.1 %) y los compuestos de prueba. Los pozos con control negativo reciben DMEM libre de suero únicamente con BSA 0.1%; las células de control positivo reciben el ligando (IGF1) pero no el compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pozos y se diluyen de manera seriada para 7 concentraciones de prueba. (5) Después de 16 horas de activación de ligando, se agrega el reactivo etiquetado BrdU diluido (1:100 en DMEM, BSA 0.1 %) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 AM) durante 1.5 horas. (6) Después de incubación con el reactivo de etiquetado, el medio se separa por decantación y se seca por contacto de la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 µ?/????) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placa. (7) La solución FixDenat se separa perfectamente por decantación y se seca por contacto la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada 5% en PBS, 200 µ?/pozo) como solución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (8) Se separa la solución de bloqueo por decantación y los pozos se lavan una vez con PBS. La solución contra BrdU-POD (dilución 1 :100 en PBS, BSA 1%) se agrega (100 µ?/????) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (9) El conjugado de anticuerpo se separa perfectamente por decantación y se enjuagan los pozos 5 veces con PBS y la placa se seca al invertir y secar por contacto sobre una toalla de papel. (10) Se agrega solución de sustrato T B (100 µ?/pozo) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa hasta que el desarrollo de color es suficiente para detección fotométrica. (11) La absorbancia de las muestras se mide a 410 nm (en un modo de "longitud de onda doble" con un filtro que lee a 490 nm como una longitud de onda de referencia) en un lector de placa Dynatech ELISA.
Ensayo 5: Ensayo de Incorporación de BrdU Inducido por Insulina Materiales y reactivos: (1 ) Insulina: cristalina, bovina, zinc; 13007, Gibco BRL, E.U.A. (2) Reactivo de etiquetado BrdU: 10 mM en PBS (pH7.4), Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (3) Solución de fijación FixDenat: (lista para usarse), Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (4) Anticuerpo contra BrdU-POD: anticuerpo monoclonal de ratón conjugado con peroxidasa, Cat. No. 1 647 229, Boehringer Mannheim, Alemania. (5) Solución de sustrato TMB: tetrametilbenzidina (TMB), lista para usarse, Cat. No. 1 647229, Boehringer Mannheim, Alemania. (6) Solución de lavado PBS: PBS 1X, pH 7.4, elaborada en el laboratorio. (7) Albúmina bovina (BSA): polvo de fracción V; A-8551 , Sigma Chemical Co., E.U.A. Protocolo (1 ) Línea de células 3T3 sometida a ingeniería: H25. (2) Las células se siembran a 8,000 células/pozo en DMEM, CS 0%, Gln 2 mM en una placa de 96 pozos. Las células se incuban durante la noche a 37°C en C025%. (3) Después de 24 horas, las células se lavan con PBS y después se elimina el suero en medio sin suero (DMEM CS 0% con BSA 0.1 %) durante 24 horas. (4) En el día 3, se agregan a las células simultáneamente el ligando (Insulina = 10 nM, preparado en DMEM con BSA 0.1%) y los compuestos de prueba. Los pozos de control negativo reciben DMEM libre de suero únicamente con BSA 0.1%; las células de control positivo reciben el ligando (Insulina) pero no el compuesto de prueba. Los compuestos de prueba se preparan en DMEM libre de suero con ligando en una placa de 96 pozos y se diluyen de manera seriada para 7 concentraciones de prueba. (5) Después de 16 horas de activación de ligando, se agrega el reactivo etiquetado BrdU diluido (1 :100 en DMEM, BSA 0.1 %) y las células se incuban con BrdU (concentración final = 10 µ?) durante 1.5 horas. (6) Después de incubación con el reactivo de etiquetado, el medio se separa por decantación y se seca por contacto de la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega solución FixDenat (50 µ?/????) y las placas se incuban a temperatura ambiente durante 45 minutos en un agitador de placa. (7) La solución FixDenat se separa perfectamente por decantación y se seca por contacto la placa invertida sobre una toalla de papel. Se agrega leche (leche deshidratada 5% en PBS, 200 µ?/????) como solución de bloqueo y la placa se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (8) Se separa la solución de bloqueo por decantación y los pozos se lavan una vez con PBS. Se agrega solución de anticuerpo contra BrdU-POD (dilución 1 :100 en PBS, BSA 1%) (100 µ?/????) y la placa se incuba durante 90 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa. (9) El conjugado de anticuerpo se separa perfectamente por decantación y se enjuagan los pozos 5 veces con PBS y la placa se seca al invertir y secar por contacto sobre una toalla de papel. (10) Se agrega solución de sustrato TMB (100 µ?/????) y se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente en un agitador de placa hasta que el desarrollo de color es suficiente para detección fotométrica. (11) La absorbancia de las muestras se mide a 410 nm (en un modo de "longitud de onda doble" con un filtro que lee a 490 nm como una longitud de onda de referencia) en un lector de placa Dynatech ELISA. Ensayo HUV-EC-C El siguiente protocolo también se puede utilizar para medir la actividad de la composición: DIA O 1. Se lavan y tripsinizan células HUV-EC-C (células endoteliales de vena umbilical humanas (American Type Culture Collection; catálogo no. 1730 CRL). Se lavan con solución salina amortiguada con fosfato de Dulbecco (D-PBS; que se obtiene de Gibco BRL; catálogo no. 14190-029) 2 veces a aproximadamente 1 ml/10 cm2 de matraz del cultivo de tejido. Se tripsiniza con tripsina-EDTA 0.05% en una solución de disociación celular no enzimática (Sigma Chemical Company; catálogo no. C-1544). La tripsina 0.05% se elabora al diluir tripsina 0.25%/EDTA 1 mM (Gibco; catálogo no. 25200-049) en la solución de disociación celular. Se tripsiniza con aproximadamente 1 ml/25-30 cm2 de matraz de cultivo de tejido durante aproximadamente 5 minutos a 37°C. Después las células se separan del matraz, se agrega un volumen Igual de medio de ensayo y se transfiere a un tubo de centrífuga estéril de 50 mi (Fisher Scientifics; catálogo no. 05-539-6). 2. Se lavan las células con aproximadamente 35 mi de medio de ensayo en el tubo de centrífuga estéril de 50 mi al agregar el medio de ensayo, se centrifuga durante 10 minutos a aproximadamente 200 x g, se aspira el sobrenadante y se resuspende con 35 mi de D-PBS. Se repite el lavado dos veces más con D-PBS, se resuspenden las células en aproximadamente 1 mi de medio de ensayo/15 cm2 de matraz de cultivo de tejido. El medio de ensayo consiste de medio F12K (Gibco BRL, catálogo no. 12127-014) + suero bovino fetal inactivado por calor 0.5%. Se cuentan las células con un equipo Coulter Counter.RTM.v Coulter Electronics, Inc.) y se agrega medio de ensayo a las células para obtener una concentración de 0.8-1.0 x 05 células/ml. 3. Se agregan células a placas de fondo plano de 96 pozos a 100 µ?/pozo o 0.8-1.0 veces x 04 células/pozo; se incuban durante aproximadamente 24 h a 37°C y C02 5%.
DIA 1 1. Se elaboran titulaciones dobles de medicamento en placas de 96 pozos separadas, generalmente de 50 µ? hasta 0 µ?. Utilizando el mismo medio de ensayo al mencionado en el día 0, etapa 2 anterior. Las titulaciones se realizan al agregar 90 µ?/???? de medicamento a 200 µ? (4 X de la concentración final de pozo) a la parte superior del pozo de una columna de placa particular. Dado que la concentración del medicamento concentrado habitualmente es de 20 mM en DMSO, la concentración de medicamento 200 µ? contiene DMSO 2%. Por lo tanto, el diluyente constituye hasta DMSO 2% en el medio de ensayo (F12K + suero bovino fetal 0.5%) que se utiliza como diluyente para las titulaciones de medicamento con el fin de diluir el medicamento pero mantener constante la concentración de DMSO. Se agrega este diluyente a los pozos restantes en la columna a 60 µ?/????. Se toman 60 µ? de los 120 µ? de la dilución de medicamento de 200 µ? en el pozo superior de la columna y se mezcla con 60 µ? del segundo pozo de la columna. Se toman 60 µ? de este pozo y se mezclan con 60 µ? en el tercer pozo de la columna, y así sucesivamente hasta que se completan las titulaciones dobles. Cuando se mezcla el penúltimo pozo, se toman 60 µ? de los 120 µ? en este pozo y se desechan. Se deja el último pozo con 60 µ? de DMSO/medio diluyente, como un control que no contiene medicamento. Se elaboran 9 columnas de medicamento titulado, suficiente para triplicar los pozos cada uno para 1 ) VEGF (obtenido de Pepro Tech Inc., catálogo no. 100-200, 2), factor de crecimiento de células endoteliales (ECGFA) (también conocido como factor de crecimiento de fibroblastos ácido o aFGF) (obtenido de Boehringer Mannheim Biochemica, catálogo no. 1439 600) y un control de medio de ensayo. El ECGF se presenta como una preparación con heparina sódica. 2. Se transfieren 50 µ?/ pozo de las diluciones de medicamento a las placas de ensayo de 96 pozos que contiene 0.8-1.0x104 células/100 µ?/???? de las células HUV-EC-C del día 0 y 20, se incuban a aproximadamente 2 h a 37°C con C025%. 3. Por triplicado, se agregan 50 µ?/???? de 80 ng/ml de VEGF, 20 ng/ml de ECGF, o control de medio a cada condición de medicamento. Al igual que con los medicamentos, las concentraciones del factor de crecimiento son 4X la concentración final deseada. El uso del medio de ensayo del día 2, etapa 0 para elaborar las concentraciones de los factores de crecimiento. Se incuba aproximadamente 24 horas a 37°C, CO2 5%. Cada pozo tendrá 50 µ? de dilución de medicamento, 50 µ? de factor de crecimiento o medio y 100 µ? de células = 200 µ?/???? total. Por lo tanto, las concentraciones 4X de los medicamentos y los factores de crecimiento se vuelven 1X una vez que todo ha sido agregado a los pozos.
DIA 2 1. Se agrega 3H-timidina (timidina tritiada) (Amersham; catálogo no. TRK-686) a 1 pCi/pozo (10 µ?/???? o 100 µ??/??? de solución constituido en medio (RPMI + suero bovino fetal inactivado por calor 10%) y se incuba durante 24 h a 37°C, C025%. Nota: la 3H-timidina se elabora en medio RPMI debido a que la totalidad de las otras aplicaciones para las cuales utilizamos 3H-timidina involucran experimentos realizados en RPMI. La diferencia de medio en esta etapa probablemente no es significativa. Se obtiene RPMI de Gibco BRL, catálogo no. 11875-051.
DIA 3 1. Se congelan las placas durante la noche -20°C.
DIA 4 1. Se recalientan las placas y se cosechan con un cosechador de placas de 96 pozos (Tomtec Harvester 96.RTM) sobre almohadillas de filtro (Wallac; catálogo no. 1205-401); se leen las cuentas en un contador de centelleo líquido Wallac BetaplateMR.
Ensayo Celular para PDGF-R El ensayo para cinasa celular de PDGF se lleva a cabo como sigue: se lisan las células en Hepes 0.2 M, NaCI 0.15 , glicerol 10% v/v, Tritón X-100 0.04%, EDTA 5 mM, vanadato de sodio 5 mM y pirofosfato de sodio 2 mM; los iisados celulares después se agregan a una placa de ELISA recubierta con un anticuerpo receptor contra PDGF (Genzyme); las placas de ELISA se recubren a 0.5 pg de anticuerpo/pozo en 150 pl de PBS durante 18 horas a 4°C, antes de la adición del lisado; el lisado se incuba en las placas recubiertas durante 1 hora y después se lava 4 veces en TBST (Tris-HCI 35 mM, pH 7.0, NaCI 0.15 M, tritón X-100 0.1%); se agrega anticuerpo contra fosfotirosina (100 µ? en PBS) y la mezcla se incuba durante 30 minutos a temperatura ambiente; los pozos después se lavan 4 veces en TBST, se agrega a cada pozo un anticuerpo secundario conjugado a POD (TAGO) y los pozos tratados se incuban durante 30 minutos a temperatura ambiente; los pozos después se lavan 4 veces en TBST, se agrega una solución de ABTS/H2 O2 a cada pozo y los pozos se incuban durante 2 minutos; después se mide la absorbencia a 410 nm.
Resultados Experimentales del Ensayo de Crecimiento Celular Los resultados para los diversos compuestos que se obtienen de los ensayos descritos en lo anterior se establecen en los cuadros que siguen: CUADRO 2 CUADRO 2 (continuación) CUADRO 2 (continuación) itogénesis en Células Endoteliales Incorporación de [3H] Timidina COMPUESTO HUV-EC Ensayo VEGF (µ?) a-FGF (µ?) SU5427 5.7 SU5429 27.6 SU5432 0.16 0.14 SU5438 39.8 33.0 SU5451 1.2 30.0 SU5454 3.8 3.4 SU5455 20 20 SU5461 <0.07 <0.07 SU5462 0.5 0.8 SU5463 0.14 7.9 SU5464 3.8 12.9 SU5466 1.3 3.2 SU5468 0.54 8.7 SU5472 2.0 5.0 SU5473 1.2 14.1 SU5477 0.05 37.8 SU5480 1.2 3.8 CUADRO 3 Mitogénesis en Células 3T3/EGFR Incorporación de BrdU COMPUESTO PDGFR FGFR EGFR ligando PDGF ligando FGF ligando EGFR CI50 (µ?) CI50 (µ?) CI50 (µ?) SU4312 75 SU4313 6 5.5 5.5 SU4314 2.5 SU4967 9 4.9 60 SU4981 3 10 20 SU5402 50 40 SU5404 3 25 SU5406 5.2 SU5407 7.5 70 100 SU5416 2.8 70 SU5451 30 16 SU5463 23 SU5464 70 60 95 SU5465 40 25 50 SU5466 18 15 17 SU5468 8 SU5469 4 15 28 SU5473 4 50 54 SU5475 6.5 9 48 CUADRO 4 3T3/E/H+TGF-a(T): células NIH 3T3 que expresan la quimera EGFR/HER2 y TGF-a, 3T3/EGFR+TGF-a(T) derivados de tumor: células NIH 3T3 que expresan EGFR y TGF-a, 3T3/PDGFR+PDGF(T) derivadas de tumor: células NIH 3T3 que expresan PDGF- R y PDGF-ßß, SMC derivado de tumor: células de músculo liso humanas de Clonetics.
Medición de la Toxicidad Celular Los compuestos terapéuticos deben ser más potentes para inhibir la actividad de tirosina cinasa con receptor al ejercer un efecto citotóxico. Una medida de la eficacia de la toxicidad celular de un compuesto se puede obtener al determinar el índice terapéutico: Cl5o DL5 . CI50 es la dosis que se requiere para obtener 50% de inhibición y se puede medir utilizando técnicas estándar tales como las que se describen en la presente. LD50 es la dosificación que resulta en 50% de toxicidad, que también se puede medir por técnicas estándar (Mossman, 1983, J. Immunol. Methods, 65:55.63), al determinar la cantidad de LDH liberado (Korzeriiewski y Callewaert, 1983. J. Immunol. Methods 54:313; Decker and Lohmann-Matthes, 1988, J. Immunol. Methods 115:61), o al medir la dosis mortal en modelos en animal. Se prefieren los compuestos con un índice terapéutico grande. El índice terapéutico debe ser mayor de dos, preferiblemente por lo menos 10, y de manera más preferible por lo menos 50.
Modelos de Animales In Vivo Modelo de Animales de Xenoinierto La capacidad de los tumores humanos para crecer como xenoinjertos en ratones atímicos (por ejemplo Balb/c, nu/nu) proporciona un modelo in vivo útil para estudiar la respuesta biológica para tratamientos para tumores humanos. Desde el primer xenotrasplante exitoso de tumores humanos a ratones atímicos (Rygaard y Povlsen, 1969, Acta Pathol. Microbial. Scand. 77:758-760), se han trasplantado y se han hecho crecer con éxito muchas líneas de células tumorales humanas diferentes (por ejemplo de cáncer mamario, de pulmón, genitourinario, gastrointestinal, de cabeza y cuello, glioblastoma, de hueso y melanomas malignos) en ratones atímicos. Las líneas de células tumorales mamarias humanas, que incluyen MCF-7, ZR75-I y MDA-MB-231 se han establecido como xenoinjertos subcutáneos en ratones atímicos (Warri et al., 1991, Int. J. Cáncer 49:616-623; Ozzello y Sordat, 1980, Eur. J. Cáncer 16:553-559; Osborne et al., 1985, Cáncer Res, 45:584-590; Seibert et al., 1983, Cáncer Res. 43:2223-2239).
Ensayo 1 : Modelo en Animales de HER2/Xeno¡njerto Para estudiar del efecto de los medicamentos antitumorales candidatos sobre tumores que expresan HER2, las células tumorales debe ser capaces de crecer en ausencia de estrógeno suplementario. Muchas líneas de células mamarias dependen de estrógeno para su crecimiento in vivo en ratones atímicos (Osbome et. al., supra) no obstante, el estrógeno exógeno suprime la expresión de HER2 en ratones atímicos (Warri et al., supra, Dati et al., 1990, Oncogene 5:1001 -1006). Por ejemplo, en presencia de estrógeno, las células MCF-7, ZR-75-1 , y T47D crecen bien in vivo, pero expresan concentraciones muy bajas de HER2 (Warri et al., supra, Dati et al., supra). Se puede utilizar el siguiente tipo de protocolo para xenoinjerto: 1 ) Implantar células tumorales (subcutáneamente) dentro del flanco posterior de ratones atímicos Balbfc nu/nu hembra de 5 a 6 semanas de edad; 2) Administrar el compuesto antitumoral; 3) Medir el crecimiento del tumor al medir el volumen del tumor. Los tumores también puede ser analizados para determinar la presencia de un receptor, tal como HER2, EGF o PDGF, mediante transferencia Western o análisis ¡nmunoistoquímt'co. Utilizando técnicas conocidas en el arte, una persona experta en la técnica puede variar los procedimientos anteriores, por ejemplo mediante el uso de regímenes de tratamiento diferentes. 92 Ensayo 2: Modelo FLK-1/Xenoinierto Se examinó la capacidad de los compuestos de la presente invención para inhibir líneas de células de tumor de ovario, melanoma, próstata, pulmón y mamario en xenoinjertos en SC. Estos estudios se llevaron a cabo utilizando dosis que varían de 1 a 75 mg/kg/día. Materiales y Métodos. Las células tumorales se implantaron subcutáneamente en las cepas indicadas de ratones. Los tratamientos se iniciaron en el día 1 posterior a la implantación a menos que se indique de otra manera (por ejemplo el tratamiento de ratones SCID en relación a la línea de células de melanoma A375 comienza en el día 9). En cada grupo de prueba se incluyen ocho (8) a dieciseis (16) ratones. De manera específica: Animales. Ratones atímicos hembra (BALB/c, nu/nu), ratones BALB/c, ratas Wistar y ratas Fisher 344 se obtienen de Simonsen Laboratories (Gilroy. Calif). Los ratones A/l/hembra se obtienen de Jackson Laboratory (Bar Harbor, Me.). Las ratas DA se obtienen de B&K Universal, Inc. (Fremont, Calif.). Las ratas atímicas R/Nu, los ratones DBA/2N y los ratones BALB/c se obtienen de Harían Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.). Los ratones C57BL/6 hembras se obtienen de Taconic (Germantown, N.Y.). Todos los animales se mantienen bajo condiciones de laboratorio limpio en jaulas Micro-isolator con un lecho Alpha-dri. Reciben alimento de roedor estéril y agua a voluntad. Todos los procedimientos se llevan a cabo de acuerdo con la guía NIH para el cuidado y uso de animales de laboratorio.
Modelo de xenoinjerto subcutáneo. Se hacen crecer líneas de células en medio apropiado como se describe. Las células se cosechan en o cerca de confluencia con tripsina 0.05%-EDTA y se sedimentan a 450 x g durante 10 min. Los sedimentos se resuspenden en PBS estéril o en medio (sin FBS) a una concentración adecuada indicada por las leyendas de la figura y las células se implantan en el flanco posterior de los ratones. Se mide el crecimiento de tumor a las 3 a 6 semanas utilizando calibradores vernier y se calculan los volúmenes de tumor como un producto de la longitud por anchura por altura, a menos que se indique de otra manera. Se calculan los valores P utilizando la prueba t de Student. Se suministran diferentes concentraciones de un compuesto en 50-100 pl de excipiente (sulfóxido de dimetilo, PBTE, PBTE6C:D5W o PBTE:D5W) mediante inyección IP. Modelo de Xenoinjerto Intracerebral. Para el modelo IC en ratones, se cosechan células de glioma C6 de rata y se suspenden en PBS estéril a una concentración de 2.5 x 107 células/ml y se colocan en hielo. Las células se implantan en ratones BALB/c nu/nu de la siguiente manera: se trasquila el cuero cabelludo frontoparietal de los ratones con grapas animales si es necesario antes de frotar con etanol 70%. Se anestesia a los animales con ¡sofluorano y se insertan agujas a través del cráneo en el hemisferio izquierdo del cerebro. Las células se suministran de jeringas Hamilton herméticas a gas utilizando agujas de media pulgada (1.27 cm) calibre 30 con manguitos que permiten una penetración de únicamente 3 mm. Se utiliza un surtidor repetidor para un suministro preciso de 4 pl de suspensión celular. Los animales son vigilados diariamente respecto a su bienestar y se sacrifican cuando presentan una pérdida de peso de aproximadamente 40% o muestra síntomas neurológicos. Para el modelo de IC en rata, las ratas (Wistar, Sprague Dawley, Fisher 344, o atímica R/Nu de aproximadamente 200-400 g (algunas 3-400 g)) se anestesian por inyección IP de 100 mg/kg de Ketaset (clorhidrato de quetamina; Aveco, Fort Dodge, lowa) y 5 mg/kg de Rompun (xilazine, solución 2%; Bayer, Alemania). Después del inicio de la anestesia se rasura el cráneo y se orienta al animal en su aparato esterotáxico (Stoelting, Wood Dale, III). La piel en el sitio de incisión se limpia 3 veces son hisopos alternantes de etanol 70% y Povidona-yodo 10%. Se realiza una incisión mediana de 1.0-1.5 cm en el cuero cabelludo utilizando un bisturí quirúrgico estéril. La piel se desprende ligeramente y se jala a los lados para exponer las suturas sobre la superficie del cráneo. Se utiliza un taladro dental (Stoeltng, Wood Dale, III). Para realizar una pequeña perforación (1-2 mm de diámetro) en el cráneo aproximadamente 1 mm anterior y 2 mm lateral a la bregma. La suspensión celular se extrae en una jeringa Hamilton de 50 µ? colocada con una aguja biselada estándar de 23 ó 25 g. La jeringa se orienta en la perforación a nivel de la parte aractoidea y se hace descender hasta que la punta de la aguja es de 3 mm de profundidad dentro de la estructura del cerebro, en donde la suspensión celular se inyecta lentamente. Después de que las células se inyectan, las agujas se dejan en la perforación durante 1-2 minutos para permitir el suministro completo de las células. Se limpia el cráneo y la piel se cierra con 2 a 3 suturas. Se observa a los animales para recuperación de cirugía y anestesia. Durante todo el experimento se observa a los animales por lo menos dos veces cada día para determinar el desarrollo de síntomas relacionados con el avance de tumor intracerebral. Los animales que muestran síntomas avanzados (inclinación, pérdida de equilibrio, deshidratación, pérdida de apetito, pérdida de coordinación, cese de actividades de acicalamiento o pérdida significativa de peso) se sacrifican y los órganos y tejidos de interés se extirpan. Modelo Intraperítoneal. Se hacen crecer líneas de células en medios apropiados. Las células se cosechan y se lavan en PBS estéril o en medio sin FBS se resuspenden hasta una concentración adecuada y se inyectan en la cavidad IP de ratones de la cepa apropiada. Se observan los ratones diariamente para determinar la presencia de formación de ascitis. Los animales individuales se sacrifican cuando se presentan con una ganancia de peso de 40% o cuando la carga de tumor IP comienza a provocar tensión indebida y dolor en el animal.
Modelo de Pella de VEGF In Vivo En el siguiente ejemplo se utiliza el modelo de pella para probar la actividad de los compuestos contra el receptor FLK-1 y contra trastornos relacionados con la formación de vasos sanguíneos. En este modelo, se empaca VEGF en una pella de liberación de tiempo y se implanta subcutáneamente en el abdomen de ratones atímicos para inducir respuesta de "enrojecimiento" y hinchado subsecuente alrededor de la pella. Después se implantan inhibidores potenciales de FLK-1 en metilcelulosa cerca de la pella VEGF para determinar si tal inhibidor se puede utilizar para inhibir la respuesta de "enrojecimiento" e hinchado subsecuente. Materiales y Métodos. Se utilizan los siguientes materiales: 1 ) El producto liofilizado recombinante humano de VEGF está disponible comercialmente y se puede obtener de Peprotech, Inc., Princeton Business Park, G2; P.O. box 275, Rocky Hill, N.J. 08553. 2) Se empaca VEGF en pellas de liberación de 21 días que se obtienen de Innovative Research of America (Innovative Research of America, 3361 Executive Parkway, P.O. Box 2746, Toledo, Ohio 43606), utilizando el sistema de suministro impulsado por matriz patentada. Las pellas se empacan a 0.20, 0.21 ó 2.1 pg de VEGF/pella. Estas dosis se aproximan a 10 y 100 ng/día de liberación de VEGF. 3) Metilcelulosa 4) Agua (estéril) 5) Metanol 6) Medicamentos/inhibidores apropiados 7) Placas de cultivo de 10 cm 8) Parafilm El siguiente protocolo después se sigue para llevar a cabo el modelo de pella de VEGF: 1) Se envía VEGF, adquirido de Peprotech a Innovative Research para una preparación de pella específica; 2) Se prepara metilcelulosa a 1.5% (p/v) en agua estéril; 3) Los medicamentos se solubilizan en metanol (intervalo de concentración habitual = 10 a 20 mg/ml); 4) Se coloca Parafilm estéril en placas de 10 cm estériles; 5) Se agregan 150 µ? de medicamento en metanol a 1.35 mi de metilcelulosa 1.5% y se mezcla/somete a remolino perfectamente; 6) Se colocan alícuotas de 25 µ? de homogeneizado en Parafilm y se seca en discos; 7) Se anestesian ratones (6-10 semanas, Balb/c atímicos nu/nu, hembra, por medio de inhalación de isoflurano; 8) Se implantan subcutáneamente en el abdomen las pellas de VEGF y los discos de metilcelulosa; y 9) Se califica a los ratones 24 horas y 48 horas para determinar enrojecimiento y respuesta de hinchazón. El diseño experimental específico utilizado en este ejemplo es: N = 4 animales/grupo Controles: pella de VEGF + medicamento placebo VEGF placebo + pella de medicamento Resultados experimentales: Se espera que los compuestos de la presente invención demuestren actividad de acuerdo con este ensayo.
Modelo de Almohadilla Grasa Mamaria Debido al papel establecido jugado por muchas de las RTK, por ejemplo el receptor HER2 en cáncer de mama, el modelo de almohadilla de grasa mamaria es particularmente útil para medir la eficacia de los compuestos los cuales inhiben tales RTK. Al implantar células tumorales directamente en el lugar de interés, los modelos in situ reflejan con mayor precisión la biología del desarrollo de tumor en vez de los modelos subcutáneos. Se han hecho crecer células de líneas mamarias humanas que incluyen a MCF-7 en la almohadilla grasa mamaria de ratones atímicos. Shafie and Grantham, 1981, Nati. Cáncer Instit. 67:51-56; Gottardis et al., 1988, J. Steroid Biochem. 30:311-314. De manera más específica, se puede utilizar el siguiente procedimiento para medir el efecto inhibidor de un compuesto sobre el receptor HER2: 1) El implante, a diversas concentraciones, las células MDA-MB-231 y MCF-7 se transfecran con HER-2 en las almohadillas de grasas mamarias axilares de ratones atímicos hembra; 2) Se administra el compuesto; y 3) Se mide el crecimiento de tumor en diversos puntos en el tiempo. Los tumores también pueden ser analizados para determinar la presencia de un receptor tal como HER2, mediante transferencia Western y análisis inmunoistoquímico. Mediante la utilización de técnicas conocidas en el arte, una persona experta en la técnica puede variar los procedimientos anteriores, por ejemplo mediante el uso de regímenes de tratamiento diferentes.
Modelo de Invasión Tumoral El siguiente modelo de invasión tumoral ha sido desarrollado y se puede utilizar para la evaluación del valor y la eficacia terapéuticas de las composiciones de interés. Procedimiento Se utilizan ratones (hembra) atímicos de 8 semanas de edad (Simonsen Inc.) como animales de experimentación. La implantación de células tumorales se realiza en una campana de flujo laminar. Para la anestesia se administra intraperitonealmente la combinación de xilazina/quetamina (100 mg/kg de quetamina y 5 mg/kg). Se realiza una incisión en la línea media para exponer la cavidad abdominal (aproximadamente 1.5 cm de longitud) para inyectar 107 células tumorales y un volumen de 100 µ? de medio. Las células se inyectan ya sea en el lóbulo duodenal del páncreas o debajo de la capa serosa del colon. El peritoneo y los músculos se cierran con sutura continua de ceda 6-0 y la piel se cierra utilizando grapas para heridas. Los animales son observados diariamente.
Análisis Después de 2-6 semanas, dependiendo de las observaciones generales de los animales, se sacrifica a los ratones y se extirpan y analizan las metástasis tumorales locales, a diversos órganos (pulmón, hígado, cerebro, estómago, vaso, corazón y músculo) (mediciones del tamaño de tumor, grado de invación, inmunohistoquímica e hibridación in situ).
Resultados Los resultados para los diversos compuestos que se obtienen de los ensayos ¡n vivo descritos en lo anterior se establecen en el cuadro 5 a continuación: CUADRO 5 La presente invención no se limita en alcance a las modalidades ejemplificadas las cuales están diseñadas como ilustraciones de aspectos únicos de la invención. En realidad, diversas modificaciones de la invención, además de las que se describen en la presente se volverán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción precedente. Se pretende que tales modificaciones se encuentren dentro del alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias que se mencionan en la presente se incorporan en este documento como referencia en su totalidad.
EJEMPLO 3 La combinación de Celecoxib y SU-5416 resulta en inhibición de tumor en el modelo de tumor HN1483 Se utilizan ratones atímicos de xenoinjerto de tumor humano (HN1483) para investigar los efectos inhibidores de tumor de las combinaciones de Celecoxib y SU-5416. Los modelos de ratón atímico de xenoinjerto de tumor humano de carcinoma de células escamosas de cabeza y cuello (línea de células 1483) que expresan COX-2 en las células tumorales y en la vasculatura, similar a los cánceres epiteliales humanos. Se mezcla Matrigel (30%) con la suspensión celular lo que resulta en una presentación de 100% de crecimiento de tumor. De esta manera, los cánceres epiteliales humanos del modelo de ratón HN1483 que expresan ciclooxigenasa-2 (COX-2) en las células tumorales y en la vasculatura y son un buen modelo para relacionar la eficacia de los medicamentos anticancerígenos que incluyen inhibidores para COX-2 para la eficacia en humanos.
Protocolo para HN1483 Materiales y Métodos Cultivo Celular: Se almacenan células de carcinoma celular escamoso de cabeza y cuello humano 1483 (HNSCC) en frascos congelados que contienen 3 x 106 células, suero bovino fetal (FBS) 90% y sulfóxido de dimetilo (DMSO) 10%. Se toma un frasco congelado y se entibia rápidamente a 37°C y se coloca en un matraz T- 62 cm2 (Corning) que contiene medio D-MEM/F12 (GibcoBRL) con amortiguador Hepes 15 mM, -.-glutamina, clorhidrato de piridoxina y FBS 0%. Las células se hacen crecer en un incubador con C02 5% y una temperatura de 37°C. El medio se cambia cada tercer día y las células se hacen pasar hasta 80-90% de confluencia. Para el pasado de las células, se lava el matraz con 10 mi de solución salina amortiguada con fosfato (PBS), se elimina el aspirado y se agregan 2 mi de tripsina/EDTA (0.25%/1 mM, GibcoBRL) y se colocan nuevamente en un incubador, después de 5 min, las células se desprenderán. Se agregan 8 mi del medio anterior a un matraz de enjuagado y se transfiere a un tubo de centrífuga estéril de 50 mi. Se agregan 30 mi adicionales de medio y se mezclan y se realiza el conteo celular utilizando un hemocitómetro, se sedimentan las células en un T-162 cm2 que contiene 3-4 x 106 células.
Modelo Animal 1483: Se cambia el medio 24 horas antes de la cosecha de células 1483 antes de la inyección en ratones atímicos. Se tripsinizan las células 1483 como se describe en lo anterior en la sección de cultivo celular. Se realiza la cuenta de células y se determina el número de células. Se separa por centrifugación las células a 1000 rpm durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se resuspenden los sedimentos de células y se acumulan (si sori múltiples tubos centrífugos de 50 mi) en un tubo centrífugo de 50 mi con solución salina amortiguada de Hank (HBSS; GibcoBRL) y se centrifuga como en lo anterior. Se pueden obtener células adicionales, si así se prefiere. Se prepara las células para inyección en ratones. Se inyectan las células 1483 a 1 x 106 células en 0.03 ml/ratón. 100 ratones x 0.03 mi = volumen total de 3 mi. Se inyectan las células con 30% de Matrigel (Collaborative Biomedical Products) y HBSS 70%. Se resuspende el sedimento acumulado con 2.1 mi (70%) de HBSS frío y después se agrega 0.9 mi (30%) de Matrigel fría licuada y recalentada y se mezcla bien en hielo. Se mantiene esta preparación celular en hielo en todo momento antes de inyectarla en ratones. En los estudios se utilizan ratones atímicos macho de 4-6 semanas de edad (Harlen). Se anestesia a los ratones utilizando C02/gaseoso y se inyecta a los ratones en la parte media de la planta de la pata posterior derecha utilizando una jeringa para tuberculina de 0.5 ce (Beckerson & Dickerson). Se pesa a los ratones para determinar el peso corporal en el día de la inyección (día 0) para determinar el peso de valor inicial para el inicio del estudio. Comenzando en el día 7, se pesa a los ratones y se mide la planta de la pata posterior derecha para determinar el volumen del tumor en la planta de la pata utilizando un pletismómetro (Stoelting Co.). El pletismómetro es una máquina que mide el volumen de la planta de la pata por desplazamiento de agua. Se realiza una medición de planta de la pata que quedaron sin inyectar y se promedian para determinar una medición de fondo para restarla de planta de la pata que presenta tumor, en el lado derecho. Los ratones se pesan y miden durante el estudio los días 7, 10, 14, 17, 21 , 24 y 28. Los animales después se inician con el tratamiento del compuesto en el día 0 (profiláctico) o una vez que se ha establecido el tumor, aproximadamente el día 7 (terapéutico). Aproximadamente en el día 30 los ratones a los que se administró vehículo (control) tendrán tumores grandes (-1.0 - 1.5 mi) y comenzarán a perder peso, en este momento los animales tratados con vehículo pueden ser finalizados.
Protocolo para Tratamiento de ratones HN1483 con Celecoxib. SU-5416 v combinaciones de los mismos Resultados: 1. ) Crecimiento de tumor, inhibición 2. ) Pérdida de peso como determinación del grado de salud Se inyectan células en las plantas derechas de las patas a una concentración de 1 x 10 6 células/planta de pata en HBSS con Matrigel 30%.
Se administra SU-5416 por vía subcutánea diariamente y se administra Celecoxib a la mitad en la comida y la mitad por sonda a las 11 :00 am. Los animales se marcan en la oreja y se alojan en jaulas de policarbonato con lecho, 4 animales/jaula. Los animales se colocan bajo una dieta normal Chow a la llegada y se colocan con el compuesto de prueba y el alimento Chow cuando los tumores tienen un tamaño de 100-200 µ? y continúan con el alimento del compuesto durante el estudio. Se mide el peso corporal dos veces a la semana. Se mide el volumen del tumor dos veces a la semana utilizando el pletismómetro.
Datos respecto al volumen del tumor de los ratones tratados El cuadro 6 ilustra los datos sin tratar que muestran las mediciones de volumen de tumor de los ratones tratados.
Datos respecto a los pesos de los ratones HN1483 tratados Los datos respecto a los pesos de los ratones HN1483 tratados con Celecoxib, SU-5416 y combinaciones de los mismos se reproducen en el cuadro 7.
O en en CUADRO 6 K3 O Oí en CUATRO 6 (continuación 4 SU-S416 / 25 mpkd 4a 6 29 0.23 0.13 0.2 0.1 0.18 0.08 0.22 0.12 0.22 0.12 0.23 0.13 0.27 0.17 0.31 0.21 30 0.4 0.3 0.35 0.25 0.33 0.23 0.31 0.21 0.28 0.18 0.26 0.16 0.29 0.19 0.77 0.17 31 0.32 022 0.3 0.2 028 0.18 0.27 0.17 0.28 0.18 0.28 0.16 0.27 0.17 0.25 0.15 32 0.19 0.09 0.19 0.09 0.19 0.09 0.21 0.11 0.2 0.10 0.22 0.12 0.25 0.15 0.26 0.16 4b 7 33 0.45 0.35 0.5 0.4 0.46 0.38 0.42 0.32 0.37 0.27 0.28 0.18 0.31 0.21 0.29 0.19 34 0.3S 028 0.4 0.3 0.35 0.25 0.38 0.28 0.27 0.17 0.27 0.17 0.28 0.18 0.28 0.18 35 0.25 0.15 0.23 0.13 0.28 0.18 0.3 0.20 0.28 0.18 0.25 0.15 0.28 0.18 0.29 0.19 36 0.23 0.13 0.24 0.14 0.26 0.16 0.23 0.13 0.22 0.12 0.24 0.14 0.26 0.16 0.28 0.18 promedio 0.21 0.2 0.19 0.19 0.17 0.16 0.18 0.18 SE | 0.034 0.039 0.032 0.027 0.019 0.007 0.007 0.007 STDEV 0.10 0.11 0.09 0.08 0.05 0.02 0.02 0.02 5 SU-5416 / 50 mpkd 5a a 37 0.18 0.08 0.24 0.14 025 0.15 0.27 0.17 0.24 0.14 0.29 0.19 0.28 0.18 0.24 0.14 38 0.53 0.43 0.6 0.50 0.46 0.36 0.38 0.28 0.27 0.17 0.22 0.12 0.24 0.14 0.26 0.16 39 0.15 0.05 0.18 0.08 0.19 0.09 0.19 0.09 0.2 0.10 0.32 0.22 0.24 0.14 0.22 0.12 40 0.25 0.15 0.21 0.11 028 0.18 0.31 0.21 0.3 0.1 0.20 0.27 0.17 0.27 0.17 0.25 0.15 5b 14 41 0.69 0.59 0.83 0.73 0.52 0.42 0.44 0.34 0.32 0.22 0.24 0.14 0.31 0.21 0.27 0.17 42 0.16 0.06 0.24 0.14 0.18 0.08 0.22 0.12 0.22 0.12 0.26 0.16 0.24 0.14 0.23 0.13 43 0.S5 0.75 0.72 0.62 0.74 0.64 0.63 0.53 0.39 0.29 0.21 0.11 0.27 0.17 0.24 0.14 44 0.74 0.64 0.68 0.58 0.56 0.48 0.43 0.38 0.34 0.24 0.27 ¦ 0.17 0.24 0.14 0.24 0.14 promedio 0.34 0.36 0.30 0.27 0.19 0.18 0.18 0.14 SEM | 0.103 0.036 0.072 0.06 0.023 0.013 0.009 0.008 STDEV 0.29 0.27 0.20 0.15 0.06 0.04 0.03 0.02 6 SU-S416 / 50 mpkd 6a 16 45 0.15 0.05 0.19 0.D9 0.21 0.11 0.21 0.11 0.24 0.14 0.23 0.13 0.24 0.14 0.22 0.12 46 0.52 0.42 0.S4 0.44 0.39 0.29 0.41 0.31 0.31 0.21 0.26 0.16 0.32 0.22 0.32 0.22 47 0.29 0.19 0.36 0.26 0.33 0.23 0.37 0.27 0.28 0.18 0.28 0.16 0.27 0.17 0.26 0.16 48 0.41 0.31 0.48 0.38 0.32 0.22 0.33 0.23 0.28 0.18 0.24 D.14 0.28 0.18 0.24 0.14 6b 17 49 0.23 0.13 0.26 0.16 0.27 0.17 0.27 0.17 0.24 0.14 0.21 0.11 0.26 0.18 0.23 0.13 50 0.46 0.36 0.48 0.38 0.44 0.34 0.41 0.31 0.31 0.21 0.3 0.20 0.31 0.21 0.24 0.14 51 0.41 0.31 0.35 0.25 0.29 0.19 0.38 0.28 0.3 0.2 0.24 0.14 0.28 0.18 0.24 0.14 52 0.31 0.21 0.47 0.37 0.41 0.31 0.33 0.23 0.3 0.2 0.28 0.16 0.27 0.17 0.22 0.12 promedio 0.26 0.29 0.23 0.24 0.18 0.16 0.18 0.16 SEM | 0.044 0.043 0.027 0.025 0.010 0.009 0.009 0.011 STDEV 0.12 0.12 0.08 0.07 0.03 0.03 0.03 0.03 7 SU-5416 / 50 mpkd 7a I 18 53 0.22 0.12 0.24 0.14 0.21 0.11 0.23 0.13 0.25 0.15 0.28 0.18 0.28 0.18 0.25 0.15 Celecoxib/ 160 ppm 54 0.33 0.23 0.33 0.23 0.29 0.19 0.27 0.17 0.26 0.16 0.25 0.15 0.25 0.15 0.22 0.12 55 0.5 0.4 0.51 0.41 0.48 0.38 0.48 0.38 0.44 0.34 0.38 0.28 0.31 0.21 0.28 0.18 56 0.14 0.04 0.19 0.09 0.21 0.11 0.2 0.10 0.23 0.13 0.2 0.10 0.24 0.14 0.2 0.1 7b 22 57 0.18 0.08 0,24 0.11 0.23 0.13 0.21 0.11 0.21 0.11 0.24 0.14 0.24 0.14 0.23 0.13 58 0.22 0.12 0.21 0.11 0.22 0.12 0.25 0.1S 0.25 0.15 0.22 0.12 0.27 0.17 0.24 0.14 59 0.24 0.14 0.24 0.14 0.24 0.14 0.27 0.17 0.25 0.15 0.25 0.15 0.3 0.20 0.25 0.15 60 0.25 0.15 0.25 15 0.26 0.16 0.25 0.15 promedio 0.16 0.18 0.17 0.17 0.17 0.16 0.17 0.14 SEM | 0.046 0.042 0.037 0.038 0.026 0.019 0.009 0.008 STDEV 0.12 0.11 0.10 0.1 0.07 0.05 0.03 0.02 o en o en CUATRO 6 fcontinuación o en en CUADRO 7 Datos originales que muestran el peso de ratones tratados I I Ratones pesados el día de la inyección Dosis inicial Peso corporal Día 35 Día 31 Día 24 Día 21 Día 17 Día 14 Día 10 Día 7 Día 0 Asignado 4/3/01 3/30/01 3/23/01 3/20/01 3/16/01 3/13/01 3/9/01 3/6/01 2/27/01 Grupo Jaula # Jaula original peso peso peso peso peso peso peso peso peso corp. corp. corp. corp. corp. corp. corp. corp. corp. 1 Vehículo 1a 10 1 34.05 34.53 32.01 31.21 30.27 33.41 31.08 30.69 29.67 2 35.79 35.65 34.34 33.58 33.17 30.59 32.53 33.15 31.8 3 31.61 32.69 30.51 30.16 28.77 28.33 29.2 29.75 28.71 4 2S.41 29.12 27.45 27.65 26.78 25.91 26.31 26.39 25.27 1b 11 1 24.4 26.69 28.03 28.62 28.26 27.97 28.71 28.62 26.9 2 28.67 30.43 31 32.04 32.14 32.09 32.31 32.04 30.01 3 27.68 27.86 27.6 27.3 26.49 26.02 26.34 26.6 24.99 4 31.24 32.35 31.72 32.29 31.57 29.87 30.41 30 28.46 20 1 24.53 25.14 24.62 24.8 25.01 25.13 25.09 24.26 19.89 2 30.52 31.88 31.76 30.86 30.93 23.41 29.82 29.37 26.43 3 28.24 27.35 27.54 27.19 26.23 25.29 23.35 23.16 21.82 4 24.43 24.91 24.83 24.25 23.27 30.23 23.72 23.78 22 promedio 29.13 29.88 29.28 29.16 28.57 28.19 28.24 28.15 26.33 SEM 1.067 1.036 0.879 0.865 0.893 0.895 0.925 0.949 1.061 STDEV 3.70 3.59 3.04 3.00 3.09 3.10 3.20 3.29 3.68 2 SU5416 2a 2 1 26.84 22.69 27.88 28.31 28.98 29.47 30.14 29.59 28.71 25 mg/kg/Día s.c. 2 23.55 23.86 24.83 25.2 26.16 28.02 27.48 27.28 26.6 3 21.74 17.88 21.3 22.29 23.34 23.54 24.19 24.61 24.24 4 30.55 27.3B 30.13 31.41 31.49 32.11 32.36 32.41 31.93 2b 3 1 22.95 27.9 22.29 23.29 23.48 23.91 25.96 25.96 25.48 2 22.47 23.36 22.93 24.3 25.66 27.08 28.31 27.54 26.36 3 18.42 20.51 18.15 18.32 18.97 21.18 24.22 23.83 22.53 4 27.58 29.73 29.02 28.9 29.34 29.41 31 30.4 29.41 promedio 24.26 24.16 24.54 25.25 25.93 26.84 27.96 27.70 26.91 SEM 1.357 1.40B 1.473 1.477 1.421 1.297 1.085 1.042 1.064 STDEV 3.84 3.98 4.17 4.18 4.02 3.67 3.07 2.95 3.01 3 SU-5416/25 mpkd 3a 4 1 22.7 21.56 22.21 23.97 24.56 25.66 26.05 26.54 25.11 Celecoxib / 40 ppm 2 26.34 25.73 26.39 27.35 27.S 29.34 29.99 29.46 28.34 3 27.14 27.5 28.8 29.09 29.18 29.05 30.72 29.54 28.7 4 30.07 28.95 30.5 30.45 30.85 29.98 31.17 29.9 28.09 3b 5 1 24.24 25.18 25.53 25.92 27.95 27.88 28.84 28.04 26.8 2 24.5 25.17 25.93 26.08 27 27.06 27.43 27.19 26.03 3 27.05 26.66 26.96 26.11 27.77 28.66 30.07 29.89 29.66 4 26.83 26.82 28.13 28.78 29.68 29.96 30.75 29.92 29.82 promedio 26.11 25.95 26.81 27.22 28.06 28.45 29.38 28.81 27.82 SEM 0,801 0.770 0.877 0.746 0.674 D.532 0.640 0.480 0.599 STDEV 2.27 2.18 2.48 2.11 1.91 1.51 1.81 1.36 1.69 G O Oí n CUADRO 7 (continuación) 4 SU-5416/ 25 mpkd 4a 6 1 29.3 29.62 29.59 30.39 29.36 28.52 29.38 30.03 28.66 Celecoxib / 16C ppm 2 27.3 27.34 27.06 28.34 27.64 23.54 29.08 28.76 27.8 3 25.57 25.88 26.82 27.9 27.14 25.16 27.64 27.86 27.32 4 27.18 27.29 26.95 28.02 27.17 23.83 27.2 27.4 27.23 4b 7 1 24.06 23.51 25.56 25.6 27.06 25.24 28.6 28.82 27.54 2 24.95 25.11 25.34 25.58 26.52 27.49 28.31 28.62 27.69 3 26.52 27.1 28.59 28.65 29.87 31.38 31.43 30.77 29.58 4 25.5 25.76 28.46 29.4 30.72 28.53 31.23 30.77 30.44 promedio 26.30 26.45 27.30 27.99 28.19 26.71 29.11 29.13 28.28 SEM 0.580 0.644 0.527 0.595 0.553 0.963 0.545 0.449 0.415 STDEV 1.64 1.82 1.49 1.68 1.56 2.72 1.54 1.27 1.17 5 SU-5416/ S0 mpkd 5a 9 1 25.06 23.48 24.36 26.09 26.78 27.6 29.2 29.04 26.74 2 25.86 25.06 25.64 26.64 26.26 27.47 27.93 27.85 25.91 3 22.4 22.49 22.85 23.59 24.3 25.89 27.67 27.13 26.04 4 23.S9 22.54 24.01 25.9S 26.57 27.54 28.95 28.82 26.14 5b 14 1 23.51 24.94 24.93 25.64 26.39 27.7 29.52 29.12 27.7 2 27.79 26.64 26.23 26.74 27.92 29.06 30.71 29.67 27.87 3 26.37 2S.03 24.79 24.96 26.1 27.27 28.54 28.34 28.26 4 25.74 26.47 25.24 25.2 25.89 26.48 27.84 27.09 22.8 promedio 25.04 24.71 24.76 25.60 26.28 27.38 28.80 28.38 26.43 SEM 0.625 0.596 0.368 0.363 0.357 0.329 0.363 0.337 0.610 STDEV 1.77 1.69 1.04 1.03 1.01 0.93 1.03 0.95 1.72 e SU-5416/ 50 mpkd 6a 16 1 24.4 24.54 25.93 27.13 28.04 29.3 28.07 27.22 26.32 Celecoxib / 40 ppm 2 26.47 27.19 28.22 28.37 28.41 28.5 30.2 29.55 29.08 3 23.45 23.76 24.7 26.07 25.62 26.33 29.04 27.67 26.85 4 23.22 24.02 25.33 26.01 27.45 28.25 29.39 28.9S 26.18 6b 17 1 22.72 22.4 24.43 24.72 25.S6 26.36 27.21 26.72 25.79 2 22.15 20.41 20.06 21.42 23.29 25.34 26.52 26.77 25.48 3 25.19 22.68 25.07 25.2 26.06 26.88 28.39 28.32 26.55 4 22.51 25.5 26.2 25.82 26.5 27.6 28.95 28.45 26.84 promedio 23.76 23.81 24.99 25.59 26.42 27.32 28.47 27.96 26.64 SEM 0.525 0.72S 0.819 0.718 0.574 0.468 0.422 0.366 0.388 STDEV 1.48 2.06 2.32 2.03 1.62 1.32 1.19 1.03 1.10 o en o en CUADRO 7 (continuación) 7 SU-5416 /50 mpkd 7a 18 1 26.56 27.24 27.67 28.07 28.59 29.78 29.5 29.45 28.09 Celecoxib / 60 ppm 2 24.28 24.29 23.73 23.73 24 30.63 25.25 24.72 23,59 3 23.29 23.07 23.11 2359 24.59 31.22 26.99 26.54 25.81 4 19.36 20.41 20.92 21.89 22.82 28.91 25.01 24.09 22.64 7b 22 1 24.95 24.2 24.01 23.25 24.45 29.64 26.08 25.07 24.19 2 27.8 27.46 27.31 26.37 27.54 30.21 28.56 27.46 27.69 3 31.53 31.15 31.69 30.98 30.68 34.55 31.26 30.33 29.56 4 28.09 27.27 29.82 29.2 28.64 promedio 25.40 25.40 25.49 25.37 26.35 30.28 27.81 27.11 26.28 SEM 1.440 1.325 1.366 1.228 0.972 0.742 0.817 0.841 0.913 STDEV 3.81 3.50 3.61 3.25 2.75 2.10 2.31 2.38 2.58 8 Celecoxib / 4D ppm 8a 24 1 29.46 30.26 30.04 29.74 29.59 29.2 29.2 28.79 28.67 2 32.46 32.88 31.99 31.46 30.83 28.42 30.66 29.73 29.13 3 31.41 31.78 31.3 31.11 31.09 27.85 30.96 30.34 29.59 4 29.65 30.11 29.94 29.53 29.36 27.08 28.27 27.88 28.06 8b 26 1 30.23 30.1 30.11 29.09 29.S9 27.49 27.82 27.8 27.38 2 31.21 31.55 31.12 30.62 30.49 26.65 30.84 33.05 29.07 3 34.39 34.5 34.23 34.37 34.48 30.45 32.99 29.6 31.1 4 26.43 27.24 28.01 27.43 27.19 30.63 27.04 26.16 25.01 promedio 30.68 31.05 30.84 30.42 30.33 28.47 29.72 29.17 28.50 SEM 0.830 0.767 0.642 0.722 0.732 0.530 0.701 0.728 0.631 STDEV 2.35 2.17 1.82 2.04 2,07 1.50 1.98 2.06 1.79 9 Celecoxib / 160 ppm 9a 27 1 30.7 29.08 25.72 25.43 25.39 25.77 25.35 24.92 23.85 2 28.58 29.1 28.98 2S.5 28.01 28 27.51 26.75 24.71 3 30.12 30.01 29.62 28.62 28.12 28.65 27.91 27.81 27.06 4 30.41 31.67 31.6 31.34 31.82 32.28 33.27 32.64 29.88 9b 28 1 23.01 24.25 30.48 30.38 30.02 30.36 30.98 30.6S 29.69 2 31.33 32.44 31.02 30.71 31.18 31.23 30.01 29.2 28.33 3 32.8T 33.12 32.36 32.05 32.31 32.27 32.66 32.11 30.97 4 29.34 29.77 28.23 28.5 26.87 27.9B 28.43 27.52 25.77 promedio 29.55 29.93 29.75 29.44 29.22 29.57 29.52 28.96 27.53 SEM 1.038 0.975 0.750 0.749 0.883 0.827 0.959 0.955 0.921 STDEV 2.94 2.76 2.12 2.12 2.50 2.34 2.71 2.70 2.60

Claims (1)

  1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES 1.- El uso de una combinación que comprende una primera cantidad de un compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo y una segunda cantidad de un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, para preparar un medicamento para tratar o evitar un trastorno neoplásico en un sujeto. 2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la 3-heteroaril-2-indolinona comprende un compuesto que tiene la fórmula: o una sal o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: Ri es H o alquilo; R2 es O o S; F¾ es hidrógeno, R4) R5, R6 y R7 se seleccionan, cada uno independientemente, del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halógeno, trihalometilo, S(0)R, S02NRR\ S03R, SR, N02, NRR', OH, CN, C(0)R, OC(0)R, NHC(0)R, (CH3)nC02R, y CONRR'; A es un anillo heteroarilo de cinco miembros que se selecciona del grupo que consiste de tiofeno, pirrol, pirazol, imidazol, 1 ,2,3-triazol, 1 ,2,4-triazol, oxazol, isoxazol, tiazol, ¡sotiazol, 2-sulfonilfurano, 4-alquilfurano, 1,2,3-oxadiazol, 1 ,2,4-oxadiazol, 1 ,2,5-oxadiazol, 1 ,3,4-oxadiazol, 1,2,3,4-oxatriazol, 1 ,2,3,5-oxatriazol, 1,2,3-tiadiazol, 1,2,4-tiadiazol, 1 ,2,5-tiadiazol, 1 ,3,4-tiadiazol, 1 ,2,3,4-tiatriazol, 1,2,3,5-tiatriazol y tetrazol, opcionalmente sustituido con una o más posiciones con alquilo, alcoxi, arilo, ariloxi, alcarilo, alcariloxi, halógeno, trihalometilo, S(O)R, SO2NRR', SO3R, SR, NO2> NRR', OH, CN, C(0)R, OC(O)R, NHC(O)R, (CH2)nC02R y CONRR'; n es 0-3; R es H, alquilo o arilo; y R* es H, alquilo o arilo. 3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 2, en donde el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona comprende 3-[(3-metilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-[(3,4-dimetilpirrol-2-il)metileno]-2-indolinona; 3-[(2-metiltien-5-il)metileno]2-¡ndolinona; 3-3-metiltien-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-{[4-(2-metoxicarboniletil)-3-metilpirrol-5-il)]metilen}-2-¡ndolinona; 3-[(4,5-dimetil-3-etilpirrol-2-il)metilen]-2-indolinona; 3-[(5-metilimidazol-2-il)metilen]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(5-metiltien-2-il)metilenl]-2-indolinona; 3-[(3,5-dimetilpirrol-2-il)metilen]-5-nitro-2-indolinona; 3-[(3-(2-carboxietil)-4-metilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona; 5-cloro-3-[(3,5-d¡metilpirrol-2-il)metilen]-2-¡ndolinona; o 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indol¡nona, o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 4.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona es 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 5.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la neoplasia se selecciona del grupo que consiste de melanoma acral lentiginoso, queratosis actínica, adenocarcinoma, carcinoma cístico adenoide, adenomas, adenosarcoma, carcinoma adenoscamoso, tumores astrocíticos, carcinoma de la glándula de bartolini, carcinoma de células básales, carcinomas de glándulas bronquiales, capilares, carcinoides, carcinoma, carcinosarcoma, cavernoso, colangiocarcinoma, condrosarcoma, papiloma/carcinoma del plexo coroideo, carcinoma de células del cristalino, cistadenoma, tumor de seno endodérmico, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, ependimal, epiteloide, sarcoma de EWing, fibrolamelar, hiperplasia nodular focal, gastrinoma, tumores de células germinales, glioblastoma, glucagonoma, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangiomas, adenoma hepático, adenomatosis hepática, carcinoma hepatocelular, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de células escamosas interepiteliales, carcinoma de células escamosas invasivas, carcinoma de células grandes, leiomiosarcoma, melanomas de lentigo maligno, melanoma maligno, tumores mesoteliales malignos, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, meningio, mesotelial, carcinoma metastásico, carcinoma mucoepidermoide, neuroblastoma, melanoma nodular de adenocarcinoma neuroepitelial, carcinoma de células de avena, oligodendroglial, osteosarcoma, polipéptido pancreático, adenocarcinoma ceroso papilar, células pineales, tumores de la hipófisis, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, carcinoma de células renales, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma ceroso, carcinoma de células pequeñas, carcinomas de tejido suave, tumor secretor de somatostatina, carcinoma escamoso, carcinoma de células escamosas, submesotelial, melanoma de dispersión superficial, carcinoma no diferenciado, melanoma uveal, carcinoma verrucoso, vipoma, carcinoma bien diferenciado y tumor de Wilm. 6. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la combinación es administrable de una manera secuencial. 7. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la combinación es administrable de una manera sustancialmente simultánea. 8. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la cantidad del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o una sal farmacéuticamente aceptable o precursor del mismo está dentro de un intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg/día. - 9.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-¡ndolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es administrable oralmente. 10.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 9, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg/día. 11.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o un precursor del mismo es administrable tópicamente como una solución, crema, ungüento, gel, loción, suspensión o emulsión. 12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es de aproximadamente 0.01% a aproximadamente 10%. 13. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es administrable intravenosamente. 14. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 13, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg/día. 15. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2- ¡ndolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es administrable por vía rectal. 16. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 15, en donde la cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo es de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 20 mg/día. 17. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una Cl50 para ciclooxigenasa-2 menor de aproximadamente 0.2 pmol/l. 18. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una CI5o para ciclooxigenasa-1 de por lo menos aproximadamente 1 pmol/l. 19.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 18, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una CI50 para ciclooxigenasa-1 de por lo menos aproximadamente 10 pmol/l. 20.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende 6-[[(5-(4-clorobenzoil)-1 ,4-dimetil-1 H-pirrol-2-il]met¡l]-3(2H)-p¡ridazinona, que tiene la fórmula: o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 21. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un cromeno. 22. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 se selecciona del grupo que consiste de benzotiepiranos sustituidos, dihidroquinolinas o dihidronaftalenos que tiene la fórmula general en donde G se selecciona del grupo que consiste de O o S o NRa; en donde Ra es alquilo; en donde R1 se selecciona del grupo que consiste de H y arilo; en donde R2 se selecciona del grupo que consiste de carboxilo, aminocarbonilo, alquilsulfonilaminocarbonilo y alcoxicarbonilo; en donde R3 se selecciona del grupo que consiste de haloalquilo, alquilo, aralquilo, cicloalquilo y arilo opcionalmente sustituido con uno o más radicales que se seleccionan de alquiltio, nitro y alquilsulfonilo; y en donde R4 se selecciona independientemente del grupo que consiste de uno o más radicales que se seleccionan de H, halo, alquilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, aralquiloxi, heteroaralquiloxi, haloalquilo, haloalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroarilalquilamino, nitro, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, heteroarilaminosulfonilo, aralquilaminosulfonilo, heteroaralquilaminosulfonilo, heterociclosulfonilo, alquilsulfonilo, hidroxiarilcarbonilo, nitroarilo, arilo opcionalmente sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, arilcarbonilo, aminocarbonilo y alquilcarbonilo; o en donde R4 junto el anillo E forma un radical naftilo; o un isómero del mismo; e incluye los diastereoisómeros, enantiómeros, racematos, tautómeros, sales, ésteres, amidas, sales y precursores farmacéuticamente aceptables de los mismos. 23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un compuesto que tiene la fórmula: en donde: Y se selecciona del grupo que consiste de O o S o NRb; en donde Rb es alquilo; R5 se selecciona del grupo que consiste de carboxilo, aminocarbonilo, alquilsulfonilaminocarbonilo y alcoxicarbonilo; R6 se selecciona del grupo que consiste de haloalquilo, alquilo, aralquilo, cicloalquilo y arilo, en donde cada uno de haloalquilo, alquilo, aralquilo, cicloalquilo y arilo está independientemente sustituido de manera opcional con uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de alquiltio, nitro y alquilsulfonilo; y R7 es uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de hídrido, halo, alquilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, aralquiloxi, heteroaralquiloxi, haloalquilo, haloalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroarilalquilamino, nitro, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, heteroarilaminosulfonilo, aralquilaminosulfonilo, heteroaralquilaminosulfonilo, heterociclosulfonilo, alquilsulfonilo, arilo opcionalmnte sustituido, heteroarilo opcionalmente sustituido, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, arilcarbonilo, aminocarbonilo y alquilcarbonilo; o en donde R7 junto con el anillo A forma un radical naftilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 24.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde: Y se selecciona del grupo que consiste de oxígeno y azufre; R5 se selecciona del grupo que consiste de carboxilo, alquilo inferior, aralquilo inferior y alcoxicarbonilo inferior; R6 se selecciona del grupo que consiste de haloalquilo inferior, cicloalquilo inferior y fenilo; y R7 son uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de hídrido, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, alquilamino inferior, nitro, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo inferior, heteroaralquilaminosulfonilo de cinco miembros, heteroarilalquilaminosulfonilo de 6 miembros, aralquilaminosulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 5 miembros, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno de 6 miembros, alquilsulfonilo inferior, opcionalmente sustituido con fenilo, aralquilcarbonilo inferior y alquilcarbonilo inferior; o en donde Rr junto con el anillo A forman un radical naftilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 25.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde: R5 es carboxilo; R6 es haloalquilo inferior; y R7 son uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de hídrido, halo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, alquilamino inferior, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo inferior, heteroaralquilaminosulfonilo de 5 miembros, heteroarilalquilaminosulfonilo de 6 miembros, aralquilaminosulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 6 miembros, opcionalmente sustituido con fenilo, aralquilcarbonilo inferior y alquilcarbonilo inferior; o en donde R7 junto con el anillo A forman un radical naftilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 26 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde: R6 se selecciona del grupo que consiste de fluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo, dicloropropilo, difluorometilo y trifluorometilo; y R7 son uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de hídrido, cloro, fluoro, bromo, yodo, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, metoxi, etoxi, isopropiloxi, terbutiloxi, trifluorometilo, difluorometilo, trifluorometoxi, amino, N,N-dimetilamino, ?,?-dietilamino, N-fenilmetilaminosulfonilo, N-feniletilaminosulfonilo, N-(2-furilmetil)aminosulfonilo, nitro, ?,?-dimetilaminosulfoniio, aminosulfonilo, N-metilaminosulfonilo, N-etilsulfonilo, 2,2-dimetiletilaminosulfonilo, N,N-dimetilaminosulfonilo, N-(2-metilpropil)aminosulfonilo, N-morfolinosulfonilo, metilsulfonilo, bencilcarbonilo, 2,2-dimetilpropilcarbonilo, fenilacetilo y fenilo; o en donde R2 junto con el anillo A forma un radical naftilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 27.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 23, en donde: R6 se selecciona del grupo que consiste de trifluorometilo y pentafluoroetilo; y R7 son uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de hídrido, cloro, fluoro, bromo, yodo, metilo, etilo, ¡sopropilo, terbutilo, metoxi, trifluorometilo, trifluorometoxi, N-fenilmetilaminosulfonilo, N-feniletilaminosulfonilo, N-(2-fur¡lmetil)aminosulfonilo, N,N-dimetilaminosulfonilo, N-metilaminosulfonilo, N-(2,2-d¡metiletil)aminosulfonilo, dimetilaminosulfonilo, 2-metilpropilaminosulfonilo, N-morfolinosulfonilo, metilsulfonilo, bencilcarbonilo y fenilo; o en donde R7 junto con el anillo A forma un radical naftilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 28.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende: a1) 8-acetil-3-(4-fluorofenil)-2-(4-metilsulfonil)fenil-imidazo(1 ,2-a)piridina; a2) 5,5-dimetil-4-(4-metilsulfonil)fenil-3-fenil-2-(5H)-furanona; a3) 5-(4-fluorofenil)-1-[4- (metilsulfonil)-fenil]-3-(trifluorometil)pirazol; a4) 4-(4-fluorofenil)-5-[4-(met¡lsulfon¡l)fen¡l]-1 -fen¡Í-3-(tr¡fluorometil)p¡razol; a5) 4-(5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1 H-pirazol-1-il)bencensulfonamida; a6) 4-(3,5-bis( 4-metilfenil)-1H-pirazol-1-il)bencensulfonamida; a7) 4-(5-( 4-clorofenil)-3-fenil-1H-pirazol il)bencensulfonamida a8) 4-(3,5-bis( 4-metoxifenil)-1H-pirazol-il)bencensulfonamida a9) 4-(5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1 H-pirazol-il)bencensulfonamida a10) 4-(5-(4-clorofenil)-3-(4-nitrofenil)-1 H-pirazol-il)bencensulfonamida b1 ) 4-(5-(4-clorofenil)-3-(5-cloro-2-tienil)-1 H-pirazol-il)bencensulfonamida b2) 4-(4-cloro-3,5-difenil-1 H-pirazol-il)bencensulfonamida b3) 4-[5-(4-clorofeni!)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-il]bencensulfonamida b4) 4-[5-fenil-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-iljbencensulfonamida b5) 4-[5-(4-fluorofenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol il]bencensulfonamida b6) 4-[5-(4-metoxifenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol iljbencensulfonamida b7) 4-[5-(4-clorofenil)-3-(difluorometil)-1 H-pirazol il]bencensulfonamida b8) 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol iljbencensulfonamida b9) 4-[4-cloro-5-(4-clorofenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida; b10) 4-[3-(difluorometil)-5-(4-metilfenil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida; c1 ) 4-[3-(difluorometil)-5-fenil-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida; c2) 4-[3-(difluorometil)-5-(4-metoxifenil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida; c3) 4-[3-ciano-5-(4-fluorofenil)-1 H-pirazol-1-iljbencensulfonamida; c4) 4-[3-(difluorometil)-5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-1 H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida; c5) 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-3-(trifluorometil)-l H-pirazol-1 -iljbencensulfonamida; c6) 4-[4-cloro-5-fenil-1 H- pirazol-1-il]bencensulfonam¡da; c7) 4-[5-(4-clorofenil)-3-(hidrox¡metil)-1 H-pirazol-1-il]bencensulfonam¡da; c8) 4-[5-(4-(N,N-dimet¡lamino)fenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-¡l]bencensulfonani¡da; c9) 5-(4-fluorofenil)-6-[4-(metilsulfonil)fenil]espiro[2.4]hept-5-eno; c10) 4-[6-(4-fIuorofenil)espiro[2.4]hept-5-en-5-il]bencensulfonamida; d1) 6-(4-fluorofenil)-7-[4-(met¡lsulfonil)fenil]esp¡ro[3.4]oct-6-eno; d2) 5-(3-cloro-4-metoxifenil)-6-[4-(met¡lsulfonil)fenil]espiro[2.4]hept-5-eno; d3) 4-[6-(3-cloro-4-metox¡fenil)espiro[2.4]hept-5-en-5-¡l]bencensulfonamida; d4) 5-(3,5-dicloro-4-metoxifenil)-6-[4-(metilsulfon¡l)fenil]espiro[2.4]hept-5-eno; d5) 5-(3-cloro-4-fluorofen¡l)-6-[4-(metilsulfonil)fenil]espiro[2.4]hept-5-eno; d6) 4-[6-(3,4-diclorofen¡l)espiro[2.4]hept-5-en-5-¡l]bencensulfonamida; d7) 2-(3-cloro-4-fluorofenil)-4-(4-fluorofenil)-5-(4-met¡lsulfon¡lfenil)tiazol; d8) 2-(2-clorofenil)-4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-metilsulfon¡lfen¡l)tiazol; d9) 5-(4-fluorofenil)-4-(4-metilsulfon¡lfen¡l)-2-metiltiazol; d10) 4-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfenil)-2-trifluorometiltiazol; e1) 4-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfon¡lfenil)-2-(2-t¡enil)tiazol; e2) 4-(4-fluorofen¡l)-5-(4-metilsulfonilfenil)-2-bencilaminot¡azol; e3) 4-(4-fluorofenil)-5-(4-metilsulfonilfen¡l)-2-(1 -propilamino)tiazol; e4) 2-[(3,5-diclorofenoxi)metil)-4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]tiazol; e5) 5-(4-fluorofenil)-4-(4-metilsulfon¡lfenil)-2-trifluorometilt¡azol; e6) 1 -metilsulfonil-4-[1 ,1-dimetil-4-(4-fluorofenil)ciclopenta-2.4-dien-3-il]benceno; e7) 4-[4-(4-fluorofenil)-1 ,1-dimet¡lciclopenta-2,4-dien-3-il]bencensulfonam¡da; e8) 5-(4-fluorofen¡l)-6-[4-(metilsulfonil)fenil]espiro[2.4]hepta-4,6-d¡eno; e9) 4-[6-(4-fluorofenil)espiro[2.4]hepta-4,6-dien-5-¡l]bencensulfonamida; e10) 6-(4- fluorofen¡i)-2-metox¡-5-[4-(met¡lsulfon¡l)fenil]-pir¡d¡na-3-carbon¡tr¡lo; fl ) 2-bromo-6-(4-fluorofen¡l)-5-[4-(met¡lsulfonil)fenil]-p¡ridin-3-carbonitr¡lo; f2) 6-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfon¡l)fenii]-2-fenil-pir¡din-3-carbon¡trilo; f3) 4-[2-(4-rnet¡lpir¡din-2-il)-4-(trifluoromet¡l)-1 H-im¡dazol-1 -iljbencensulfonamida; f4) 4-[2-(5-met¡lpiridin-3-¡l)-4-(tr¡fluorometil)-1H-imidazol-1-¡l]bencensulfonam f5) 4-[2-(2-metilp¡r¡d¡n-3-¡l)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -iljbencensulfonamida; f6) 3- [1-[4-(metilsulfonil)fen¡l]-4-(trifluoromet¡l)-1 H-¡midazol-2-il]p¡ridina; f7) 2-[1-[4-(metilsulfonil)fen¡l-4-(tr¡fluorometil)-1 H-im¡dazol-2-il]pir¡d¡na; f8) 2-metil-4-[1-[4-(met¡lsulfonil)fenil-4-(trifluoromet¡l)-1 H-im¡dazol-2-il]p¡ridina; f9) 2-metil-6-[1 -[4-(met¡lsulfonil)fenil-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-2-il]pirid¡na; f10) 4-[2-(6-metilp¡ridin-3-il)-4-(trifluorometil)-1H-¡midazol-1-¡l]bencensulfonam¡ g1) 2-(3,4-difluorofen¡l)-1-[4-(met¡lsulfonil)fenil]-4-(tr¡fluorometil)-1 H-imidazo g2) 4-[2-(4-metilfenil)-4-(trifluoromet¡l)-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida; g3) 2-(4-clorofenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-metil-1 H-imidazol; g4) 2-(4-clorofenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-fenil-1 H-imidazol; g5) 2-(4-clorofenil)-4-(4-fluorofenil)-1 -[4-(met¡lsulfonil)fenil]-1 H-imidazol; g6) 2-(3-fluoro-4-metoxifenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol; g7) 1-[4-(metilsulfon¡l)fenil]-2-fen¡l-4-tr¡fluorometil-1 H-imidazol; g8) 2-(4-metilfenil)-1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-trifluorometil-1 H-imidazol; g9) 4-[2-(3-cloro-4-metilfenil)-4-(trifluoromet¡l)-1 H-imidazol-1 -iljbencensulfonamida; g10) 2-(3-fluoro-5-metilfenil)-1-[4-(met¡lsulfonil)fenil]-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol; h1 ) 4-[2-(3-fluoro-5-metilfenil)- 4- (trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -iljbencensulfonamida; h2) 2-(3-metilfenil)-1 -[4-(metilsulfonil)fenilj-4-trifluorometil-1 H-imidazol; h3) 4-[2-(3-metilfenil)-4- tr¡fluoromet¡l-1 H-¡midazol-1-il]bencensulfonam¡da; h4) 1-[4-(metilsulfonil)fenil]-2-(3-clorofenil)-4-tr¡fluorometil-1 H-imidazol; h5) 4-[2-(3-clorofenil)-4-trifluorometil-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida; h6) 4-[2-fenil-4-trifluorometil-1 H-imidazol-1 -iljbencensulfonamida; h7) 4-[2-(4-metoxi-3-clorofenil)-4-trifluorometil-1 H-imidazol-1 -iljbencensulfonamida; h8) 1-alil-4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(trifluorometil)-1 H-pirazol; h10) 4-[1-etil-4-(4-fluorofenil)-5-(trifluorometil)-1 H-pirazol-3-il]bencensulfonamida; ¡1 ) N-fenil-[4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1-iljacetamida; ¡2) [4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(tr¡fluorometil)-1 H-pirazol-1-il]acetato de etilo; ¡3) 4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-1-(2-feniletil)-1 H-pirazol; ¡4) 4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfonil)fenil]-1-(2-feniletil)-5-(trifluorometil)pirazol; ¡5) 1-etil-4-(4-fluorofenil)-3-[4-(metilsulfon¡l)fenil]-5-(trifluorometil)-l H-pirazol; i6) 5-(4-fluorofenil)-4-(4-metilsulfonilfenil)-2-trifluorometil-1 H-imidazol; ¡7) 4-[4-(metilsulfonil)fenil]-5-(2-tiofenil)-2-(trifluorometil)-l H-imidazol; i8) 5-(4-fluorofenil)-2-metoxi-4-[4- (met¡lsulfonil)fenil]-6-(trifluorometil)piridina; ¡9) 2-etoxi-5-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-6-(trifluorometil)piridina; i10) 5-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfon¡l)fenil]-2-(2-propyniloxi)-6-(trifluorometil)piridina; J1 ) 2-bromo-5-(4-fluorofenil)-4-[4-(metilsulfonil)fenil]-6-(trifluorometil)piridina; j2) 4-[2-(3-cloro-4-metoxifenil)-4,5-difluorofenil]bencensulfonamida; j3) 1-(4-fluorofenil)-2-[4-(metilsulfonil)fenil]benceno; j4) 5-difluorometil-4-(4-metilsulfonilfenil)-3-fenilisoxazol; j5) 4-[3-etil-5-fenilisoxazol-4-il]bencensulfonamida; j6) 4-[5-difluorometil-3-fenilisoxazol-4-il]bencensulfonamida; j7) 4-[5-hidroximetil-3- fenil¡soxazol-4-¡l]bencensulfonamida; j8) 4-[5-metil-3-fenil-isoxazol-4-iljbencensulfonamida; j9) 1 -[2-( 4-fluorofen¡l)ciclopenten-1-¡I]-4- (metilsulfonil)benceno; j10) 1 -[2-(4-fluoro-2-met¡lfenil)ciclopenten-1 -ilJ-4- (metilsulfonil)benceno; k1 ) 1-[2-(4-clorofenil)ciclopenten-1 -il]-4- (metilsulfonil)benceno; k2) 1 -[2-(2,4-d¡clorofenil)ciclopenten-1 -il]-4- (metilsulfonil)benceno; k3) 1-[2-(4-trifluoromet¡lfen¡l)ciclopenten-1-il]-4- (metilsulfonil)benceno; k4) 1 -[2-(4-metiltiofenil)ciclopenten-1 -il]-4-(metilsulfonN)benceno; k5) 1-[2-(4-fluorofen¡l)-4,4-dimetilciclopenten-1 -il]-4-(metilsulfonil)benceno; k6) 4-[2-(4-fluorofenil)-4,4-dimetilciclopenten-1 -illbencensulfonamida; k7) 1-[2-(4-clorofenil)-4,4-dimet¡lciclopenten-1-il]-4- (metHsuIfonil)benceno; k8) 4-[2-(4-clorofenil)-4,4-dimetilciclopenten-1 -illbencensulfonamida; k9) 4-[2-(4-fluorofenil)c¡clopenten-1 -illbencensulfonamida; k10) 4-[2-(4-clorofenil)ciclopenten-1-illbencensulfonamida; 11 ) 1 -[2-(4-metoxifenil)ciclopenten-1 -il]-4-(metilsulfonil)benceno; 12) 1-[2-(2,3-difluorofenil)ciclopenten-1-il]-4-(metilsulfonil)benceno; 13) 4-[2-(3-fIuoro-4-metox¡fenil)ciclopenten-1 -illbencensulfonamida; 14) 1-[2-(3-cloro-4-metoxifenil)ciclopenten-1 -il]-4-(metilsulfonil)benceno; 15) 4-[2-(3-cloro-4-fluorofenil)c¡clopenten-1 -illbencensulfonamida; 16) 4-[2-(2-metilpiridin-5-il)ciclopenten-1-il]bencensulfonamida; 17) 2-[4-(4- fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]oxazol-2-ü]-2-bencil-acetato de etilo; 18) ácido 2-[4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfon¡l)fenil]oxazol-2-il]acético; 19) 2-(tert-butil)-4-(4-fIuorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]oxazol; 110) 4-(4-fluorofenil)-5-[4-(metilsulfonil)fenil]-2- feniloxazol; m1 ) 4-(4-fluorofenil)-2-metil-5-[4-(metilsulfonil)fenil]oxazol; m2) 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-2-trifluorometil-4-oxazolil]bencensulfonamida; m3) ácido 6-cloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; m4) 6-cloro-7-metil-2-tr¡fluoromet¡l-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico; m5) 8-(1 -metiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; m6) ácido 6-cloro-7-(1 ,1-dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; m7) ácido 6-cloro-8-(1 -metiletil)-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico; m8) 2-trifluorometil-3H-naftopiran-3-carboxílico; m9) ácido 7-(1,1-d¡metiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; m10) 6-bromo-2-trifluoromet¡l-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n1 ) ácido 8-cloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n2) ácido 6-trifIuorometoxi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n3) ácido 5,7-dicloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxilico; n4) ácido 8-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n5) ácido 7,8-dimetil-2-trifluoromet¡l-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n6) ácido 6,8-bis(dimetiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n7) ácido 7-(1-metiletil)-2-trifluorometil-2H-1-benzop¡ran-3-carboxílico; n8) ácido 7-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n9) ácido 6-cloro-7-6til-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; n10) ácido 6-cloro-8-etil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o1) ácido 6-cloro-7-fenil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o2) ácido 6,7-dicloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o3) ácido 6,8-dicloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o4) ácido 2-trifluorometil-3H-nafto[2,1-b]-p¡ran-3-carboxílico; o5) ácido 6-cloro-8-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3- carboxílico; 06) ácido 8-cloro-6-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o7) ácido 8-cloro-6-metoxi-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; 08) ácido 6-bromo-8-cloro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o9) ácido 8-bromo-6-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; o10) ácido 8-bromo-6-metil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; p1) ácido 8-bromo-5-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; p2) ácido 6-cloro-8-fluoro-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; p3) ácido 6-bromo-8-metoxi-2-trifluorometil-2H-1-benzop¡ran-3-carboxílico; p4) ácido 6-[[(fenilmetil)amino]sulfonil]-2 r¡fluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; p5) ácido 6-[(dimetilamino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; p6) ácido 6-[(metilamino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico; p7) ácido 6-[(4-morfolino)sulfonil]-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; p8) ácido 6-[(1 ,1-dimetiletil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico; p9) ácido 6-[(2-metilpropil)aminosulfonil]-2-trifluorometil-2H-1 -benzopiran-3-carboxílico; p10) ácido 6-metilsulfonil-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q1) ácido 8-cloro-6-[[(fen¡lmetil)amino]sulfonil-2-trifluoromet¡l-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q2) ácido 6-fenilacetil-2-trifluoromet¡l-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q3) ácido 6,8-dibromo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q4) ácido 8-cloro-5,6-dimetil-2-trifIuorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q5) ácido 6,8-dicloro-(S)-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q6) ácido 6-bencilsulfonil-2-tr¡fluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q7) ácido 6-[[N-(2-furilmetil)amino]sulfonil]-2- trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q8) ácido 6-[[N-(2-fen¡letil)amino]sulfonil]-2-tr¡fluorometil-2H-1-benzop¡ran-3-carboxíl¡co; q9) ácido 6-yodo-2-trifluorometil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; q10) ácido 7-(1 ,1-dimetiletil)-2-pentafluoroetil-2H-1-benzopiran-3-carboxílico; r1 ) 5,5-dimet¡l-3-(3-fluorofenil)-4-metilsulfonil-2-(5H)-fluranona; r2) ácido 6-cloro-2-trifluoromet¡l-2H-1-benzotiopiran-3-carboxílico; r3) 4-[5-(4-clorofenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1-il]bencensulfonamida; r4) 4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-1 H-pirazol-1-il]bencensulfonam¡da; r5) 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-3-(difluorometil)-1 H-pirazol-1-il]bencensulfonamida; r6) 3-[1-[4-(metilsulfonil)fenil]-4-trifluorometil-1H-im¡dazol-2-il]piridina; r7) 2-metil-5-[1 -[4-(metilsulfonil)fen¡l]-4-trifluoromet¡l-1 H-imidazol-2-il]piridina; r8) 4-[2-(5-metilpiridin-3-il)-4-(trifluorometil)-1 H-imidazol-1 -il]bencensulfonamida; r9) 4-[5-metil-3-fen¡lisoxazol-4-il]bencensulfonamida; r10) 4-[5-hidroximetil-3-fenilisoxazol-4-il]bencensulfonamida; s1 ) [2-trifluorometil-5-(3,4-difluorofenil)-4-oxazolil]bencensulfonam¡da; s2) 4-[2-metil-4-fenil-5-oxazolil]-bencensulfonamida; s3) 4-[5-(3-fluoro-4-metoxifenil)-2-tr¡fluoromet¡l-4-oxazolil]bencensulfonamida; o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 29.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un compuesto que tiene la fórmula: en donde: X se selecciona del grupo que consiste de O y S; R es haloalquilo inferior; R9 se selecciona del grupo que consiste de hídrido y halo; R10 se selecciona del grupo que consiste de hídrido, halo, alquilo inferior, haloalcoxi inferior, alcoxi inferior, aralquilcarbonílo inferior, dialquilaminosulfonilo inferior, alquilaminosulfonilo inferior, aralquilaminosulfonilo inferior, heteroaralquilaminosulfonilo inferior, heterociclo sulfonilo que contiene nitrógeno, de 5 miembros y heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 6 miembros; R11 se selecciona del grupo que consiste de hídrido, alquilo inferior, halo, alcoxi inferior y arilo; y R12 se selecciona del grupo que consiste del grupo que consiste de hídrido, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior y arilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 30.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 29, en donde: R8 se selecciona del grupo que consiste de trifluorometílo y pentafluoroetilo; R9 se selecciona del grupo que consiste de hídrido, cloro y fluoro; R10 se selecciona del grupo que consiste de hídrido, cloro, bromo, fluoro, yodo, metilo, terbutilo, trífluorometoxi, metoxi, bencílcarbonilo, dimetilamínosulfonilo, isopropilaminosulfonilo, metilaminosulfonílo, bencilaminosulfonílo, feniletilamínosulfonilo, metílpropilaminosulfonilo, metilsulfonilo y morfolinosulfonilo; R11 se selecciona del grupo que consiste de hídrido, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, cloro, metoxi, dietilamino y fenilo; y R12 se selecciona del grupo que consiste de hídrido, cloro, bromo, fluoro, metilo, etilo, terbutilo, metoxi y fenilo; o un isómero, sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 31.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un material que se selecciona de la clase de inhibidores selectivos para ciclooxigenasa-2 tricíclicos representados por la estructura general: en donde: Z se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo parcialmente insaturado o insaturado y anillos carbocíclicos parcialmente insaturados o insaturados; R13 se selecciona del grupo que consiste de heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, en donde R13 está opcionalmente sustiuido en una posición sustituible con uno o más radicales que se seleccionan de alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi y alquiltio; R14 se selecciona del grupo que consiste de metilo o amino; y R15 se selecciona del grupo que consiste de un radical que se selecciona de H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, oxo, ciano, carboxilo, cianoalquilo, heterocicliloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilcarbonilo, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, heterociclilo, cicloalquenilo, aralquilo, heterociclialquilo, acilo, alquiltioalquilo, hidroxiaiquilo, alcoxicarbonilo, arilcarbonilo, aralquilcarbonilo, aralquenilo, alcoxialquilo, ariltioalquilo, ariloxialquilo, aralquiltioalquilo, aralcoxialquilo, alcoxiaralcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilo, aminocarbonilalquilo, alquilaminocarbonilo, N-arilaminocarbonilo, N-alquil-N-arilaminocarbonilo, alquilaminocarbonilalquilo, carboxialquilo, alquilamino, N-arilamino, N- aralquilamino, N-alquil-N-aralquilamino, N-alquil-N-arilamino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, N-arilaminoalquilo, N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N- aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-arilaminoalquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, N- arilaminosulfonilo, ariisulfonilo, N-alquil-N-arilaminosulfonilo; o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 32.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende valdecoxib, que tiene la siguiente estructura: o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 33.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa 2 comprende un compuesto que tiene la estructura: o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 34.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 se selecciona del grupo que consiste de celecoxib, JTE-522, deracoxib, un cromeno, un cromano, parecoxib, valdecoxib, etoricoxib, rofecoxib, N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)metansulfonamida, COX189, ABT963, meioxicam, sales farmacéuticamente aceptables de cualquiera de los anteriores, precursores de cualquiera de los anteriores y mezclas de los mismos. 35.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 34, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende celecoxib o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 36.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un derivado de ácido fenilacético representado por la estructura general: en donde R 6 es metilo o etilo; R17 es cloro o fluoro; R18 es hidrógeno o fluoro; R19 es hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, etilo, metoxi, etoxi o hidroxi; R20 es hidrógeno o fluoro; y R21 es cloro, fluoro, trifluorometilo o metilo, con la condición de que R17, R13, R19 y R20 no sean todos fluoro cuando R16 es etilo y R19 es H, o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 37. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 36, en donde: R16 es etilo; R 7 y R19 son cloro; R 8 y R20 son hidrógeno, y R21 es metilo; o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 38. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un derivado de diarilmetilidenfurano. 39. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 38, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un derivado de diarilmetilidenfurano que tiene la fórmula general: en donde: los anillos T y M son independientemente: un radical fenilo, un radical naftilo, un radical derivado de un heterociclo que comprende 5 a 6 miembros y que posee 1 a 4 heteroátomos, o un radical derivado de un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono; por lo menos uno de los sustituyentes Q-i, Q2, Li o l_2 es: un grupo --S(0)n--R, en el cual n es un número entero igual 0, 1 ó 2 y R es un radical alquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono, o un radical haloalquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono o un grupo -SO2NH2; y se localiza en la posición para, los otros son independientemente: un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un radical alquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono, un radical trifluorometilo, o un radical O-alquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono, o Q1 y Q2 o U y L2 son un grupo metilendioxi; y R24, R25, R26 y R27 son independientemente: un átomo de hidrógeno, un átomo de halógeno, un radical alquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono, un radical haloalquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono, o un radical aromático que se selecciona del grupo que selecciona de fenilo, naftilo, tienilo, furilo y piridilo; o R24, R25 o R26, R27 son un átomo de oxígeno, o R24, R25 o R26, R27 junto con el átomo de carbono al cual están unidos, forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono; o un isómero, sal farmacéuticamente aceptable o precursor del mismo. 40. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un compuesto que se selecciona del grupo que consiste de N-(2-ciclohexiloxin¡trofenil)metansulfonamida, y (E)-4-[(4-metilfenil)(tetrahidro-2-oxo-3-furaniliden)metil]bencensulfonamida. 41. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)metansulfonam¡da. 42. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 39, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende (E)-4-[(4-metilfenil)(tetrahidro-2-oxo-3-furaniliden)metil]bencensulfonamida. 43.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 comprende un material que se selecciona del grupo que consiste de nimesulida flosulida NS-398, L-745337, RWJ-63556, L-784512, darbufelona, CS-502, LAS-34475, LAS-34555, S-33516, SD-8381, BMS-347070, S-2474, mezclas de cualquiera dos o más de los anteriores, sales y precursores farmacéuticamente aceptables de los mismos. 44.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 8, en donde la cantidad de inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo está dentro de un intervalo de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 100 mg/día por kg de peso corporal del sujeto. 45. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 44, en donde en donde la cantidad de inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo está dentro de un intervalo de aproximadamente 1 a aproximadamente 20 mg/día por kg de peso corporal del sujeto. 46. - Una composición para el tratamiento o prevención de neoplasias, que comprende un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo y un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 47. - Una composición farmacéutica que comprende un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo; y un excipiente farmacéuticamente aceptable. 48. - La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 47, caracterizada además porque el compuesto 3-heteroaril-2-indolinona es 3-[(2,4-dimetilpirrol-5-il)metilen]-2-indol¡nona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo. 49.- Un equipo que es adecuado para uso en el tratamiento, prevención o inhibición de neoplasias, en donde el equipo comprende una primera forma de dosificación que comprende una 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, y una segunda forma de dosificación que comprende un inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en cantidades las cuales comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de la combinación de los compuestos para el tratamiento o prevención de neoplasias. 50.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 3, en donde el inhibidor selectivo para ciclooxigenasa-2 se selecciona de uno que es como se describe en cualquiera de las reivindicaciones 20 a 43. 51. - Una composición para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 o una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos en el sujeto. 52. - La composición de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizada además porque el inhibidor de COX-2 o isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una Cl50 para COX-2 menor de aproximadamente 5 pmol/l. 53. - La composición de conformidad con la reivindicación 52, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 o el isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una proporción de selectividad de inhibición para COX-2 respecto a la inhibición para Cox-1 de por lo menos aproximadamente 1.5. 54. - La composición de conformidad con la reivindicación 53, caracterizada además porque el Inhibidor para COX-2 o un isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una CI5o para COX-2 menor de aproximadamente 1 pmol/l y una proporción de selectividad de inhibición para COX-2 respecto a inhibición para Cox-1 de por lo menos aproximadamente 100. 55. - La composición de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 o el isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una CI5o para Cox-1 de por lo menos aproximadamente 1 pmol/l. 56. - La composición de conformidad con la reivindicación 55, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 o el isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una Cl50 para Cox-1 de por lo menos aproximadamente 20 pmol/l. 57. - Una composición para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos en un sujeto en necesidad de tal tratamiento, que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 o una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, que se selecciona del compuesto que consiste de benzotiopiranos sustituidos, dihidroquinolinas y dihidronaftalenos en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2- indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad comprende una cantidad terapéuticamente eficaz para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos en el sujeto. 58.- Una composición para tratar trastornos neoplásicos que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad es una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor para COX-2 y la 3-heteroaril-2-indolinona y en donde el inhibidor para COX-2 está representado por la fórmula (I): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde G es O, S o NRa; Ra es alquilo; R es H o arilo; R2 es carboxilo, aminocarbonilo, alquilsulfonilaminocarbonilo o alcoxicarbonilo; R3 es haloalquilo, alquilo, aralquilo, cicloalquilo o arilo opcionalmente sustituido con uno o más radicales que se seleccionan de alquiltio, nitro y alquilsulfonilo; n es un número entero el cual es 1, 2, 3 ó 4; y cada R4 es independientemente H, halo, alquilo, arilo, aralquilo, alcoxi, ariloxi, heteroariloxi, aralquiloxi, heteroaralquiloxi, haloalquilo, haloalcoxi, alquilamino, arilamino, aralquilamino, heteroarilamino, heteroarilalquilamino, nitro, amino, aminosulfonilo, mono o dialquilaminosulfonilo, arilaminosulfonilo, heteroarilaminosulfonilo, aralquilaminosulfonilo, heteroaralquilaminosulfonilo, heterociclosulfonilo, alquilsulfonilo, hidroxiarilcarbonilo, nitroarilo, aralquilcarbonilo, heteroarilcarbonilo, arilcarbonilo, aminocarbonilo, alquilcarbonilo, arilo o heteroarilo; en donde los radicales arilo y heteroarilo están sustituidos opcional e independientemente con uno o más radicales los cuales son alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalquilo, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi o alquiltio; o en donde R4 junto con los átomos a los cuales están unidos y el resto del anillo E forma un radical naftilo. 59.- La composición de conformidad con la reivindicación 58, caracterizada además porque: G es O o S; R2 es carboxilo, alquilo inferior, aralquilo inferior y alcoxicarbonilo inferior; R3 es haloalquilo inferior, cicloalquilo inferior y fenilo; y cada uno o más de R4 es independientemente H, halo, alquilo inferior, alcoxi inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, alquilamino inferior, nitro, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo inferior, heteroarilalquilaminosulfonilo de 5 miembros, heteroarilalquilaminosulfonilo de 6 miembros, aralquilaminosulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno de 5 miembros, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 6 miembros, alquilsulfonilo inferior, aralquilcarbonilo inferior, alquilcarbonilo inferior y fenilo sustituido opcional e independientemente con uno o más radicales que se seleccionan del grupo que consiste de alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi o alquiltio; o en donde R4 junto con los átomos a los cuales R4 está unido y el resto del anillo E forma un radical naftilo. 60.- La composición de conformidad con la reivindicación 59, caracterizada además porque: R2 es carboxilo; R3 es haloalquilo inferior; y cada uno o más de R4 es independientemente H, halo, alquilo inferior, haloalquilo inferior, haloalcoxi inferior, alquilamino inferior, amino, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo inferior, heteroarilalquilaminosulfonilo de 5 miembros, heteroarilalquilaminosulfonilo de 6 miembros, aralquilaminosulfonilo inferior, alquilsulfonilo inferior, heterociclosulfonilo que contiene nitrógeno, de 6 miembros, fenilo opcionalmente sustituidoo, aralquilcarbonilo inferior o alquilcarbonilo inferior; o en donde R4 junto con los átomos a los cuales R4 está unido y el resto del anillo E forman un radical naftilo. 61.- La composición de conformidad con la reivindicación 60, caracterizada además porque: el haloalquilo inferior R3 es trifluorometilo, clorometilo, diclorometilo, triclorometilo, pentafluoroetilo, heptafluoropropilo, difluoroetilo, difluoropropilo, dicloroetilo, dicloropropilo, difluorometilo o trifluorometilo; y cada uno de uno o más de R4 es independientemente H, cloro, fluoro, bromo, yodo, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, butilo, isobutilo, pentilo, hexilo, metoxi, etoxi, isopropiloxi, terbutiloxi, trifluorometilo, difluorometilo, trifluorometoxi, amino, ?,?-dimetilamino, ?,?-dietilamino, N-fenilmetilaminosulfonilo, N-feniletilaminosulfonilo, N-(2-fur¡lmetil)am¡nosulfon¡lo, nitro, ?,?-dimetilaminosulfonilo, aminosulfonilo, N-metilaminosulfonilo, bencilaminosulfonilo, N-etilsulfonilo, 2,2-dimetiletilaminosulfonilo, ?,?-dimetilaminosulfonilo, isopropilaminosulfonilo, N-(2-metilpropil)-aminosulfonilo, N-morfolinosulfoniio, metilsulfonilo, bencilcarbonilo, 2,2-dimetilpropilcarbonilo, fenilacetilo o fenilo; o en donde R4 junto con los átomos a los cuales R4 está unido y el resto del anillo E forma un radical naftilo. 62.- La composición de conformidad con la reivindicación 61, caracterizada además porque: R3 es trifluorometilo o pentafluoroetilo; y cada uno de uno o más de R4 es independientemente H, cloro, fluoro, bromo, yodo, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, metoxi, trifluorometilo, trifluorometoxi, N,N-dietilamino, N-fenilmetilaminosulfonilo, N-feniletilaminosulfonilo, N-(2-furilmetil)aminosulfonilo, ?,?-dimetilaminosulfonilo, N-metliaminosulfonilo, bencilaminosulfonilo, N-(2,2-dimetiletil)aminosulfonilo, isopropilaminosulfonilo, dimetilaminosulfonilo, 2-metilpropilaminosulfonilo, N-morfolinosulfonilo, metilsulfonilo, bencilcarbonilo o fenilo; o en donde R4 junto con los átomos a los cuales R4 está unido y el resto del anillo E forma un radical naftilo. 63. - La composición de conformidad con la reivindicación 62, caracterizada además porque: R3 es trifluorometilo o pentafluoroetilo; cada uno de uno o más de R4 es independientemente H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, cloro, bromo, fluoro, yodo, metilo, terbutilo, trifluorometoxi, metoxi, bencilcarbonilo, dimetilaminosulfonilo, isopropilaminosulfonilo, N-metilaminosulfonilo, bencilaminosulfonilo, feniletilaminosulfonilo, metilpropilaminosulfonilo, metilsulfonilo, morfolinosulfonilo, ?,?-dietilamino o fenilo. 64. - Una composición para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos en un sujeto en necesidad de dicho tratamiento, que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 o una sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, que se selecciona del grupo que consiste de inhibidores para COX-2 tricíclicos en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad comprende una cantidad terapéuticamente eficaz para el tratamiento, prevención o inhibición de trastornos neoplásicos en el sujeto. 65. - Una composición para tratar trastornos neoplásicos, que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptables del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad es una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor para COX-2 y el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde el inhibidor para COX-2 está representado por la fórmula (II): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: D es un anillo heterociclilo parcialmente insaturados o saturados o un anillo carbocíclico parcialmente insaturados o saturados; R13 es heterociclilo, cicloalquilo, cicloalquenilo y arilo, en donde R 3 está sustituido opcionalmente en una posición susceptible de ser sustituida, con uno o más radicales los cuales son alquilo, haloalquilo, ciano, carboxilo, alcoxicarbonilo, hidroxilo, hidroxialquilo, haloalcoxi, amino, alquilamino, arilamino, nitro, alcoxialquilo, alquilsulfinilo, halo, alcoxi o alquiltio; R14 es metilo o amino; y R15 es H, halo, alquilo, alquenilo, alquinilo, oxo, ciano, carboxilo, cianoalquilo, heterocicliloxi, alquiloxi, alquiltio, alquilcarboniio, cicloalquilo, arilo, haloalquilo, heterociclilo, cicloalquenilo, aralquilo, heterocicloalquilo, acilo, alquiltioalquilo, hidroxialquilo, alcoxicarbonilo, arilcarbonilo, aralilcarbonilo, aralquenilo, alcoxialquilo, ariltioalquilo, ariloxialquilo, aralquiltioalquilo, aralcoxialquilo, alcoxiaralcoxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminocarbonilo, aminocarbonilalquilo, alquilaminocarbonilo, N-arilaminocarbonilo, N-alquil-N-arilaminocarbonilo, alquilaminocarbonilalquilo, carboxialquilo, alquilamino, N- arilamino, N-aralquilamino, N-alquil-N-aralquilamino, N-alquil-N-arilamino, aminoalquilo, alquilaminoalquilo, N-arilaminoalquilo, N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-aralquilaminoalquilo, N-alquil-N-arilaminoalquilo, ariloxi, aralcoxi, ariltio, aralquiltio, alquilsulfinilo, alquilsulfonilo, aminosulfonilo, alquilaminosulfonilo, N-arilaminosulfonilo, arilsulfonilo o N-alquil-N-arilaminosulfonilo. 66. - La composición de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 o isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una Cl50 para COX-2 de menos de aproximadamente 5 µ????/?. 67. - La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 o isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una proporción de selectividad de inhibición para COX-2 respecto a la inhibición para Cox-1 de por lo menos aproximadamente 1.5. 68. - La composición de conformidad con la reivindicación 66, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 o isómero, sal, éster o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo tiene una Cl50 para COX-2 de menos de aproximadamente 1 µ????/? y una proporción de selectividad de inhibición para Cox-2 respecto a inhibición para Cox-1 de por lo menos aproximadamente 100. 69. - Una composición para tratar trastornos neoplásicos, que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indoiinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad es una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor para COX-2 y el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o la sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo y en donde el inhibidor para COX-2 está representado por la fórmula (III): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R 6 es metilo o etilo; R17 es cloro o fluoro; R18 es hidrógeno o fluoro; R19 es hidrógeno, fluoro, cloro, metilo, etilo, metoxi, etoxi o hidroxi; R20 es hidrógeno o fluoro; y R21 es cloro, fluoro, trifluorometilo o metilo, con la condición de que R17, R 8, R 9 y R20 no sean todos fluoro cuando R16 es etilo y R19 es H. 70.- La composición de conformidad con la reivindicación 69, caracterizada además porque: R16 es etilo; R17 y R19 son cloro; R18 y R20 son hidrógeno y R21 es metilo. 71.- Una composición para tratar un trastorno neoplásico que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad es una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor para COX-2 y el compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo y en donde el inhibidor para COX-2 está representado por la fórmula (IV): o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: X es O o S; J es un carbociclo o un heterociclo; R22 es NHSO2CH3 o F; R23 es H, NO2 o F; y R24 es H, NHSO2CH3 o (SO2CH3)CsH4. 72. - La composición de conformidad con la reivindicación 71, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 es nimesulide (B-2 2), flosulide (B-213), NS-398 (B-26), L-745337 (B-214), RWJ-63556 (B-215) o L-78512 (B-216). 73. - Una composición para tratar trastornos neoplásicos que comprende un inhibidor para ciclooxigenasa-2 (COX-2) en una primera cantidad y un compuesto de 3-heteroaril-2-indolinona o una sal o precursor farmacéuticamente aceptable del mismo en una segunda cantidad, en donde la primera cantidad junto con la segunda cantidad es una cantidad terapéuticamente eficaz del inhibidor para COX-2 y el compuesto de 3-heteroar¡l-2-indolinona o la sal o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, y en donde el inhibidor para COX-2 está representado por la fórmula (V): Q o un isómero, una sal, un éster o un precursor farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: T y M independientemente son fenilo, naftilo, un radical derivado de un heterociclo que comprende 5 a 6 miembros y que tiene 1 a 4 heteroátomos, o un radical derivado de un anillo de hidrocarburo saturado que tiene 3 a 7 átomos de carbono; Q1, Q2, L1 o L2 son independientemente hidrógeno, halógeno, alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, trifluorometilo o metoxi inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono; y por lo menos uno de Q1, Q2, L1 o L2 está en posición para y es -S(0)n-R, en donde n es 0, 1 ó 2 y R es un radical alquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono o un radical haloalquilo inferior que tiene 1 a 6 átomos de carbono o un -S02NH2; o, Q y Q2 son metilendioxi; o L1 y L2 son metilendioxi; y R25, R26, R27 y R28 son independientemente hidrógeno, halógeno, un radical alquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono, un radical haloalquilo inferior que tiene de 1 a 6 átomos de carbono o un radical aromático que se > selecciona del grupo que consiste de fenilo, naftilo, tieniio, furilo y piridilo; o R25 y R26 son O; o R27 y R28 son O; o R25 y R26, junto con el átomo de carbono al cual están unidos forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono; o R27 y R28, junto con el átomo de carbono al cual están unidos, forman un anillo de hidrocarburo saturado que tiene de 3 a 7 átomos de carbono. 74.- La composición de conformidad con la reivindicación 73, caracterizada además porque el inhibidor para COX-2 es N-(2-ciclohexiloxinitrofenil)metansulfonamida, o (E)-4-[(4-metilfenil)(tetrahidro-2-oxo-3-furaniliden)metil]bencensulfonamida.
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