PROTEINAS DE MERISTEMO NO APICALES, POLINUCLEOTIDOS Y METODOS DE USO PARA LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCION La invención se relaciona generalmente a los campos de agricultura y biología molecular. Más específicamente, la invención se relaciona al aislamiento de un polinucleótido novedoso del maíz. ANTECEDENTES DE LA INVENCION El proceso de doble fertilización de plantas en floración resulta en un embrión diploide y un tejido de endosperma triploide, que de otra manera son genéticamente idénticos . El endosperma tiene 2n del genoma maternal y ln del genoma paternal. Se ha mostrado que tal composición genética única es importante para el desarrollo de la semilla normal. (Rhoades y Dempsey, Genetics 54:505-22 (1966); Lin, Genetics 107:103-15 (1984); Scott y colaboradores, Development 125:3329-41 (1998)). La modificación específica del origen parental de un gen pueden causar varios efectos sobre la expresión de los dos alelos parentales en los descendientes. Entre los diversos efectos parentales, la inscripción genómica, en la cual la expresión del gen es dependiente de la fuente parental de su transmisión, es la más estudiada. La inscripción es un fenómeno de desarrollo en donde un gen en un gameto o cigoto es modificado, tal que la expresión preferencial de un solo alelo parental ocurre en los descendientes. La definición de la inscripción genómica no necesariamente requiere la expresión monoalélica; en cambio, ambos alelos pueden ser expresados pero desigualmente expresados, (Feinberg, Curr. Top. Microhiol. Immunol . 249:87- 99 (2000) ) . Información limitada está disponible en el nivel de expresión de gen acerca de las diferencias entre los genomas parentales, tal como la activación de transcripción y regulación de los genomas maternal y paternal después de la unión de la célula central y de esperma y durante el desarrollo del endosperma. Hasta la fecha, solamente unos cuantos genes que demuestran efectos de inscripción se han encontrado en plantas. Algunos de .los genes inscritos incluyen R, un factor de transcripción implicado en la ruta del pigmento de antocianina del maíz; dzrl, que acondiciona • la baja acumulación de la zeina de 10-kDa en el endosperma del maíz; MEA y FIE, similar a las proteínas de policresta de Drosophila; y FIS2, una proteína reguladora de transcripción de enlace de DNA en Arabidopsis (Kermicle, Genetics 66:69-85 (1970); Chaudhuri and Messing, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 91- 4867-71 (1994) ; Grossniklaus y colaboradores, Science 280:235-41 (1998); Luo y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci USA 96:296-301 (1999); y Luo y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sel USA 97:10637-42 (2000)). Todos los genes inscritos identificados en plantas hasta la fecha implicaron la inactivación del alelo paternal y estuvieron asociados con el tejido del endosperma, aunque hay inconsistencias en el reporte de si MEA afecta el tejido del embrión (Kinoshita y colaboradores, The Plant Cell 11:945-52 (1999)). En contraste a las plantas, los genes que son expresados de solamente uno de los alelos parentales han sido bien caracterizados en mamíferos, donde el disturbio de la inscripción puede resultar en aberraciones de desarrollo dramáticas y cáncer (Reik y Maher, Trend Genet 13(8):330-4 (1997)). En este grupo taxonómico, aproximadamente 20 genes se han identificado como genes inscritos (Bartolomei and Tilghman, Ann. Rev. Genet. 31:439-525 (1997)). Muchos de estos genes inscritos aparecen para regular la expresión de los genes desarrolladamente importantes. Un estudio reciente reportó que el efecto parental de origen en el sitio de atributo cuantitativo (QTLs) para la composición del cuerpo del ratón (De Koning y colaboradores, Pxoc. Nati. Acad. Sci. USA 97:7947-50 (2000). Cuatro de cada cinco QTLs detectados se encontraron sometidos a inscripción, indicando que la inscripción genómica podrían ser un fenómeno más común que lo que se pensó previamente, aun para atributos complejos. En vista de la información limitada acerca de los genes inscritos en plantas, en particular su papel en el desarrollo del endosperma, sería deseable identificar y caracterizar .tales genes. Por consiguiente, los inventores han identificado un gen novedoso en el endosperma del maíz que está inscrito y que muestra homología al gen del Meristemo No Apical (NAM) de Petunia. El NAM (meristemo no apical) se ha mostrado que es requerido para la formación de patrón en embriones y flores, y embriones de Petunia que llevan la mutación NAM no logran desarrollar un meristemo apical de retoño (Souer y colaboradores, Cell 95 (2) : 159-70 (1996) ) . El meristemo apical de retoño es una colección de células no diferenciadas apartadas durante la embriogénesis . La producción de estructuras vegetativas, tales como hojas o retoños, y de estructuras reproductoras, tales como flores, es temporalmente segregada, tal que una hoja o retoño surge temprano en un ciclo de vida de la planta, mientras que una flor se desarrolla después. La transición del desarrollo vegetativo a reproductor es la consecuencia de un proceso llamado inducción floral (Yanofsky, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol . 46:167-88 (1995)). Una vez inducido, el meristemo apical de retoño ya sea que persiste y produce meristemo floral, que da origen a flores, y meristemo lateral, que da origen a ramas, o por sí mismo es convertido a meristemo floral. El meristemo floral se diferencia en una flor individual que tiene un número fijo de órganos florales en una arreglo verticilado. Las dicotiledóneas, por ejemplo, contienen cuatro verticilos (anillos concéntricos) , en los cuales los sépalos (primer verticilo) y los pétalos (segundo verticilo) circundan los estambres (tercer verticilo) y carpelos (cuarto verticilo) . Aunque él meristemo del retoño y meristemo floral ambos consisten de tejido meristémico, el meristemo del retoño es distinguible del meristemo floral más especializado. El meristemo del retoño generalmente es indeterminado y da origen a un número no especifico de meristemos florales y laterales. En contraste, el meristemo floral se determina y da origen al número fijo de órganos florales que comprenden una flor. El gen NAM aparece que es un miembro de una familia grande de genes que es sugerido para comprender factores transcripcionales importantes para el desarrollo de la planta (Souer y colaboradores, supre; Kikuchi y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 262 (6) : 1047-51 (2000)).. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona polinucleótidos, polipéptidos relacionados y todas las variantes conservativamente modificadas de una secuencia NAM recientemente descubierta del maíz. La invención proporciona la secuencia genómica para el gen ZMNAM, ZMNAM es un gen novedoso y está regulado por la inscripción especifica - de genes. La expresión de ZMNAM es especifica del endosperma y expresada por todo el desarrollo del endosperma alcanzando un máximo en 25DAP. La inscripción genómica se ha implicado que juega un papel en el desarrollo del endosperma. Los genes regulados por la inscripción especifica de alelos se sospechan que son no esenciales para el desarrollo de la semilla. La inscripción especifica de los genes sin embargo, regula los genes desarrolladamente importantes. De acuerdo con la invención, dos miembros de la familia NAM se han identificado en el maíz, que son expresados en el endosperma de las plantas. Las secuencias adicionalmente parciales de estos polinucleótidos se han obtenido y son descritas en la presente como SEQ ID NOs:l, 2, 3, 4 o 8. La secuencia de nucleótidos de longitud completa del ZMNAM comprende la secuencia encontrada en la SEQ ID NO: 7, y la secuencia genómica es descrita en la presente como SEQ ID NO: 5. La inscripción especifica de genes única de ZMNAMs y la expresión especifica del endosperma son evidencias de su involucramiento en el control del crecimiento del endosperma y el tamaño del núcleo. ZMNAM por lo tanto se puede utilizar para manipular el endosperma en desarrollo. Debido a que la inscripción especifica del gen de ZMNAM y el patrón de expresión especifico del endosperma un experto en la técnica reconocerá su utilidad para una variedad de propósitos que incluyen, pero no están limitados a: rendimiento mejorado, peso de grano más específicamente mejorado, y velocidades de germinación mejoradas, más específicamente a través del vigor de la semilla me orada y la tolerancia al estrés. Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se relaciona a un ácido nucleico aislado que comprende una secuencia de polinucleótido aislado que codifica una proteína ZMNAM. En un aspecto adicional, la presente invención se selecciona de: (a) un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de la presente invención; (b) un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad a un polinucleótido de la presente invención; (c) un polinucleótido que comprende por lo menos 25 nucleótidos en longitud que híbrida bajo condiciones de alta severidad a un polinucleótido de la presente invención; (d) un polinucleótido que comprende un polinucleótido de la presente invención; (e) un polinucleótido depositado como Depósitos de ATCC Nos. PTA-4738 o PTA-4542; y (f) un polinucleótido que es complementario al polinucleótido de (a) a (e) . En otro aspecto, la presente invención se relaciona a un cásete de expresión recombinante que comprende un ácido nucleico como es descrito. Adicionalmente, la presente invención se relaciona a un vector que contiene el cásete de expresión recombinante. Además, el vector que contiene el cásete de expresión recombinante puede facilitar la transcripción y traducción del ácido nucleico en una célula hospedera. La presente invención también se relaciona a las células hospederas capaces de expresar el polinucleótido de la presente invención. Un número de células hospederas podrían ser utilizadas tal como, pero no limitadas a, microbianas, mamíferas, de plantas o de insectos. En todavía otra modalidad, la presente invención se dirige a una planta o células de planta transgénicas , que contienen los ácidos nucleicos de la presente invención. Las plantas preferidas que contienen los polinucleótidos de la presente invención incluyen, pero no están limitadas' a maíz, soya, girasol, sorgo, cánola, trigo, alfalfa, algodón, arroz, cebada, tomate y mijo. En otra modalidad, la planta transgénica es una planta de maíz o células de planta. Otra modalidad son las semillas transgénicas de la planta transgénica . Esta invención también proporciona un polipéptido aislado que comprende (a) un polipéptido que comprende por lo menos 70% de identidad de secuencia a un polipéptido de la presente invención; (b) un polipéptido codificado por un ácido nucleico de la presente invención; y (c) un polipéptido codificado por el polinucleótido depositado como Depósitos de ATCC Nos. PTA-4738 o PTA-4542. Otra modalidad de la presente invención es una célula hospedera establemente transformada por una construcción de polinucleótido como es descrito en lo anterior, y un método para hacer un polipéptido de un gen recombinante que comprende: a) proporcionar una población de estas células hospederas; y b) cultivar la población de células bajo condiciones mediante las cuales es expresado el polipéptido codificado por la- secuencia de codificación del cásete de expresión; c) aislar el polipéptido resultante. Un' número de sistemas de expresión usando las células hospederas podrían ser utilizados tales, pero no limitado a, microbianos, mamíferos, de plantas o insectos. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra los vestigios o trazos de GeneCalling de ZMNAM para el origen (B=B73; M=Mol7) , el híbrido de 10 DAP (días después de la polinización) , el híbrido de 14 DAP y el híbrido de 21 DAP. El eje x es el tamaño del fragmento de cDNA en pares bases. El eje y es el nivel de expresión en una unidad arbitraria. Las líneas verticales indican el pico o máximo correspondiente del alelo. La Figura 2 muestra la inscripción y los resultados de expresión específica de tejido del gen ZMNA del sistema WAVE dHPLC (Transgenomic, Omaha, NE, USA) (B=B73; M=Mol7; S1=SSS1; N1=NSS1) . En el nombre híbrido, el primer genotipo denota el origen femenino y el segundo genotipo denota el origen masculino. Los resultados de expresión especifica de alelo se muestran para ambos miembros y el miembro de gen individual, respectivamente, para los hibridos 1 (los dos paneles izquierdos alejados) . A la derecha está el mieittbro de gen individual para el híbrido 2. Los alelos párenteles se expresan altamente cuando se transmiten maternalmente . Los alelos paternalmente transmitidos son ya sea completamente o casi completamente silenciados, indicando el efecto parental de origen. La Figura 3 muestra la alineación de secuencia y el análisis de expresión del gen ZMNAM con otras proteínas relacionadas con NAM. La alineación se hizo con el vector NTI (Frederick, MD, USA) . Los números de acceso para los genes usados en la alineación son: NAM:X92204, OsNACl :ABO28180.1, 0sI\¾¾C2:Ab028181.1. Sombreado negro: aminoácidos idénticos en todas las cuatro secuencias. Sombreado gris: aminoácidos idénticos en dos-tres secuencias. Las letras mayúsculas en la secuencia consensual son aminoácidos idénticos en todas las cuatro secuencias y las letras minúsculas son aquellos idénticos en tres de las cuatro secuencias. Las regiones subrayadas corresponden a los cinco dominios NAC (Kikuchi y colaboradores, 2000) . La Figura 4 muestra la expresión específica de tejido usando el análisis de RT-PCR del R A de maíz. En el análisis de expresión específica de tejido, cantidades iguales de RNA total de la raíz, tallo, hoja, mazorca inmadura, espiguilla, endosperma, embrión y óvulo se utilizaron para RT-PCR. Todos los tejidos vegetativos se recolectaron- de B73 en la etapa V12. Los tejidos de endosperma y de embrión se colectaron en 16 DAP y los óvulos se recolectaron antes de la fertilización. La RT-PCR de treinta ciclos se realizó usando los cebadores específicos del gen ZMNAM. a-tubulina se usó como un control para la calidad de cDNA. No se detecta expresión en el tejido del óvulo, indicando que el gen no es expresado antes de la fertilización. La Figura 5 muestra en detalle el perfil de expresión de ZMNAM como es generado mediante MPSS, durante el desarrollo del núcleo. El eje y representa la frecuencia de las etiquetas 17-mer como partes por millón secuenciadas y por lo tanto el nivel de expresión. El eje x es las etapas del desarrollo del núcleo: óvulo (0), 8, 12, 21, 25, 30, 35, 40 y 45 DAP. La expresión ZMNAM durante el desarrollo del núcleo se analizó usando la Secuenciación de Rúbricas Masivamente Paralelas (MPSS) (Brenner y colaboradores, 2000a, 2000b) . Con la técnica MPSS, cada cDNA se une a la superficie de una ¦ microcuenta única. Un mRNA altamente expresado es representado en un número proporcionadamente grande de microcuentas . Las secuencias de rúbrica de 17 nucleótidos luego se obtienen a partir de estas microcuentas mediante ciclos iterativos de restricción con una endonucleasa de tipos lis, ligación del adaptador e hibridación con sondas codificadas. El número de rúbricas en cada biblioteca varió de 1.2 x 106 a 2.2 x 106. Para cada tejido, los datos se-promediaron de una o más bibliotecas. El tejido fue de B73 endogámico. La técnica proporciona una intensidad y sensibilidad sin precedente de la detección de mRNA, incluyendo mensajes' expresados muy bajos. El nivel de expresión (partes por millón, PPM) de un gen se determina mediante la abundancia de su rúbrica en la agrupación total . El gen ZMNAM se expresó a través del desarrollo de endosperma, alcanzando un máximo en 25 DAP y no se detectó en el óvulo. Estos resultados también indican que el gen ZMNAM se expresó solamente después de que ocurre la fertilización. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por un experto ordinario en la técnica a la cual esta invención pertenece. A menos que se mencione de otra manera, las técnicas empleadas o contempladas en la presente son metodologías estándares bien conocidas para un experto ordinario en la técnica. Los materiales, métodos y ejemplos son ilustrativos solamente y no limitativos. Lo siguiente se presenta a manera de ilustración y no se propone para limitar el alcance de la invención. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de botánica, microbiología, cultivo de tejido, biología molecular, química, bioquímica y tecnología de DNA recombinante, que están dentro de la habilidad de la técnica. Tales técnicas son explicadas completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Langenheim y Thimann, BOTANY: PLANT BIOLOGY AND ITS RELATION TO HUMAN AFFAIRS, John iley (1982); CELL CULTURE AND SOMATIC CELL GENETICS OF PLA TS, vol . 1, Vasil, ed. (1984) ; Stanier y colaboradores, THE MICROBIAL WORLD, 5-ed., Prentice-Hall .(1986); Dhringra y Sinclair, BASIC PLANT PATHOLOGY METHODS, CRC press (1985) ; Maniatis y colaboradores, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (1982) ; DNA CLONING, vols. I and II, Glover, ed. (1985); OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS, Gait, Ed. (1984); NUCLEIC ACID HIBRIDIZATION, Hames y Higgins, eds. (1984); y la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, Colowick y Kaplan, eds., Academic Press, Inc., San Diego, CA. Las unidades, prefijos y símbolos pueden ser denotados en su forma SI aceptada. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos están escritos de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' ; las secuencias de aminoácidos están escritas ' de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente ya sea por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por^ los símbolos de una letra recomendados por la IUPAC-IUB Bioc emical Nomenclature Commission. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptados. Los términos definidos enseguida son definidos más completamente con referencia a la especificación como un conjunto. , En la descripción de la presente invención, los siguientes términos serán empleados, y se proponen para ser definidos como es indicado a continuación. Por "microbio" se propone cualquier microorganismo (incluyendo microorganismos tanto eucarióticos como procarióticos) , tales como hongos, levadura, bacterias, actinomicetes, algas y protozoarios, así como otras estructuras unicelulares . Por ??amplificado" se propone la construcción de múltiples copias de una secuencia de ácido nucleico o copias múltiples complementarias a la secuencia de ácido nucleico usando por lo menos una de las secuencias de ácido nucleico como un patrón. Los sistemas de amplificación incluyen el sistema de reacción en cadena de polimerasa (PCR) , sistema de reacción en cadena de ligasa (LCR) , amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario) , sistemas de Q-Beta Replicasa, sistema de amplificación basada en la transcripción (TAS) , y amplificación de desplazamiento de hebra (SDA) . Ver, por ejemplo, DIAGNOSTIC MOLECULAR MICROBIOLOGY: PRINCIPLES AND APPLICATIONS, Persing y colaboradores, eds . , American Society for Microbiology, Washington, DC (1993) . El producto de amplificación es llamado un amplicón. El término "variantes conservativamente modificadas" aplica a secuencias tanto de aminoácidos como de ácidos nucleicos. Con respecto a las secuencias de ácido nucleico particulares, las variantes conservativamente modificadas se refieren a aquellos ácidos nucleicos que codifican variantes idénticas o conservativamente modificadas de las secuencias de aminoácidos. Debido a la degeneración del código genético, un número grande de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier proteina dada. Por ejemplo, los codones GCA, GCC, GCG y GCU todos codificarán el aminoácido alanina. Asi, en cada posición donde una alanina es especificada por un codón, el codón puede ser alterado a cualquiera de los codones correspondientes descritos sin alterar el polipéptido codificado. Tales variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas" y representan una especie de variación conservativamente modificada. Cada secuencia de ácido nucleico en la presente que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa del ácido nucleico. Un experto ordinario reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es ordinariamente el único codón para metionina; una excepción es Micrococcus rubens, para la cual GTG es el codon de metionina (Ishizuka y colaboradores, J. Gen. Microbiol. 139:425-32 (1993)) puede ser modificado para producir una molécula funcionalmente idéntica. Por consiguiente, cada variación silenciosa de un ácido nucleico, que codifica un polipéptido de la presente invención, está implícita en cada secuencia de polipéptido descrita e incorporada en la presente por referencia. En cuanto a las secuencias de aminoácidos, un experto reconocerá que sustituciones, supresiones o adiciones individuales a un ácido nucleico, péptido o polipéptido o secuencia de proteína que altera, adiciona o suprime un solo aminoácido o un pequeño porcentaje de aminoácidos en la secuencia codificada es una "variante conservativamente modificada" cuando la alteración resulta en la sustitución de un aminoácido con un aminoácido químicamente similar. Así, cualquier número de residuos de aminoácidos seleccionados del un grupo de número enteros que consisten de 1 a 15 puede ser alterado de esta manera. Así, por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 7 o 10 alteraciones pueden ser hechas. Las variantes conservativamente modificadas típicamente proporcionan actividad biológica similar como la secuencia de polipéptido modificada de la cual son derivadas. Por ejemplo, la especificidad de sustrato, actividad de enzima, o enlace de ligando/receptor es generalmente por lo menos 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, o 90%, de preferencia 60-90% de la proteina nativa para su sustrato nativo. Las tablas de sustitución conservativas que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares son bien conocidas en la técnica. Los siguientes seis grupos- cada uno contiene aminoácidos que son sustituciones conservativas entre si: 1) Alanina (A), Serina (S) , Treonina (T) ; 2) Acido aspártico (D) , Acido glutámico (E) 3) Asparagina (N) , Glutamina (Q) ; 4) Arginina (R) , Lisina (K) ; 5) Isoleucina (I), Leucina (L) , Metionina (M) , Valina (V) ; y 6) Fenilalanina (F) , Tirosina (Y) , Triptofano (W) Ver también, Creighton, PROTEINS, W.H. Freeman and Co . (1984)
Como se utiliza en la presente, "que consiste esencialmente de" significa la inclusión de secuencias adicionales a un polinucleótido objeto donde las secuencias adicionales no hibridan selectivamente, bajo condiciones de hibridación severas, al mismo cDNA como el polinucleótido y donde las condiciones de hibridación incluyen una etapa de lavado en 0. IX SSC y dodecil sulfato de sodio al 0.1% a 65°C. Por "codificación" o "codificado" con respecto a un ácido nucleico especificado, se propone que comprende la información para la traducción en la proteina especificada. Un ácido nucleico que codifica una proteina puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo intrones) dentro de regiones, traducidas del ácido nucleico, o pueden carecer de tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como el cDNA) . La información mediante la cual una proteína es codificada se especifica por el uso de codones. Típicamente, la secuencia de aminoácidos es codificada por el ácido nucleico usando el código genético "universal". Sin embargo, las variantes del código universal tal como está presente en algunas plantas, animales y mitocondrios fúngales, la bacteria Mycoplasma capricolum (Yamao y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. OSA 82:2306-9 (1985)), o el ciliado Macronucleus, puede ser usado cuando el ácido nucleico se expresa usando estos organismos. Cuando el ácido nucleico se prepara o se altera-sintéticamente, se puede tomar ventaja de las preferencias de codón conocidas del huésped propuesto donde el ácido nucleico va a ser expresado. Por ejemplo, aunque las secuencias de" ácido nucleico de la presente invención pueden ser expresadas en especies de plantas de monocotiledóneas como dicotiledóneas, las secuencias pueden ser modificadas para tener en cuenta las preferencias de codón específicas y las preferencias de contenido de GC de las plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas ya que estas preferencias se ha mostrado que difieren (Murray y colaboradores, Nucleic Acids Res. 17:477-98 (1989) e incorporada en la presente por referencia) . Asi, el codón preferido de maíz para un aminoácido particular podría ser derivado de las secuencias de genes conocidas del maíz. La utilización del codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz es listado en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra. Como se utiliza en la presente, "heterólogo" en referencia a un ácido nucleico es un ácido nucleico que se origina de una especie foránea, o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificado de su forma nativa en composición y/o sitio genómico mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un gen estructural heterólogo es de una especie diferente de aquella de la cual se derivó el gen estructural o, si es de la misma especie, uno o ambos son sustancialmente modificados de su forma original. Una proteína heteróloga puede originarse de una especie foránea o, si es de la misma especie, es sustancialmente modificada de su forma original mediante la intervención humana deliberada. Por célula hospedera" se propone una célula, que contiene un vector y soporta la replicación y/o expresión del vector de expresión. Las células hospederas pueden ser células procarióticas tales como E. coli, o células eucarióticas tales como células de levadura, insecto, planta, anfibio o mamífero. De preferencia, las células hospederas son células de plantas monocotiledóneas o dicotiledóneas, incluyendo pero no limitadas a maíz, sorgo, girasol, soya, trigo, alfalfa, arroz, algodón, cánola, cebada, mijo y tomate. Una célula hospedera de monocotiledónea particularmente preferida es una célula hospedera de maíz. El término "complejo de hibridación" incluye la referencia a una estructura de ácido nucleico dúplex formada por dos secuencias de ácido nucleico de una sola hebra selectivamente hibridadas entre sí . El término "introducido" en el contexto de insertar un ácido nucleico de una célula, significa "transíección" o "transformación" o "transducción" e incluye la referencia a la incorporación de un ácido nucleico en una célula eucariótica o procariótica donde el ácido nucleico puede ser incorporado en el genoma de la célula (por ejemplo, cromosoma, plásmido, plástida o DNA mitocóndrico) , convertido en un replicón autónomo o transientemente expresado (por e emplo, mRNA transfectado) . El término "aislado" se refiere al material, tal como un ácido nucleico o una proteína, que está sustancialmente o esencialmente libre de componentes que normalmente acompañan o interactúan con éste, como es encontrado en su medio ambiente en que surge de manera natural. El material aislado opcionalmente comprende material no encontrado con el material en su medio ambiente natural . Los ácidos nucleicos, que son "aislado", como se define en la presente, también son referidos como ácidos nucleicos "heterólogos" . A menos que se mencione de otra manera, el término "ácido nucleico ZMNAM" significa un ácido nucleico que comprende un polinucleótido ("polinucleótido ZMNAM") que codifica un polipéptido de ZMNAM. Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye la referencia a un polímero desoxirribonucleótido o ribonucleótido en forma ya sea de una sola o doble hebra, y a menos que se limite de otra manera, comprende análogos conocidos que tiene la naturaleza esencial de nucleótidos naturales en que ellos hibridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar a los nucleótidos que surgen de manera natural (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido)
Por "biblioteca de ácido nucleico" se propone una colección de moléculas de DNA o RNA aisladas, que comprenden y sustancialmente representan la fracción transcrita completa de un genoma de un organismo específico. La construcción de bibliotecas de ácidos nucleicos ejemplares, tales como bibliotecas genómicas y de cDNA, se enseña en referencia de biología molecular estándares tales como Berger y immel, GUIDE TO MOLECULAR CLONING TECHNIQUES, de la serie METHODS IN ENZYMOLOGY, vol . 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (1987) Sambrock y colaboradores, MOLECULAR CLONING: LABORATORY MANUAL, 2a ed., vols. 1-3 (1989); y CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. Ausubel y colaboradores, eds., Current Protocols, una empresa colectiva entre Greene Publishing Associates, Inc. y John iley & Sons, Inc. (Suplemento de 1994). Como se utiliza en la presente "operablemente enlazado" incluye la referencia a un enlace funcional entre una primera secuencia, tal como un promotor en una segunda secuencia, en donde la secuencia de promotor inicia y media la transcripción de la secuencia de DNA correspondiente a la segunda secuencia. Generalmente, operablemente enlazado significa que las secuencias de ácidos nucleicos que son enlazadas están contiguas y, donde es necesario unen dos regiones de codificación de proteina, contiguas y en la misma estructura de lectura. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye la referencia a plantas completas, órganos de plantas (por ejemplo, hojas, tallos, raices, etc.) semillas y células de plantas y progenie de las mismas. La célula de planta, como se utiliza en la presente incluye, sin limitación, cultivos de suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido de callo, hojas, raices, retoños, gametofitos, esporofitos, polen y microsporas. La clase de plantas, que pueden ser utilizadas en los métodos de la invención, es generalmente tal amplia como la clase de plantas superiores disponibles para las técnicas de transformación, incluyendo plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas excluyendo las especies de los géneros: Cucúrbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigonella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidopsis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyoscyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solanum, Petunia, Digitalis, Majorana, Ciahorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, Antirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennisetum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucu is, Browaalia, Glycine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Avena, Hordeum, Sécale, Allium y Tr ticum. Una planta particularmente preferida es Zea mays. Como se utiliza en la presente, "polinucleótido" incluye la referencia a un desoxirribopolinucleótido, ribopolinucleótido o análogos de los mismos que tienen la naturaleza esencial de un ribonucleótido natural en que ellos hibridan, bajo condiciones de hibridación severas, a sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos como los nucleótidos que surgen de manera natural y/o permiten la traducción en el mismo aminoácido (s) como el (los) nucleótido (s) que surgen de manera natural. Un polinucleótido puede ser de longitud completa o una subsecuencia de un gen nativo o estructural heterólogo regulador. A menos que se indique de otra manera, el término incluye la referencia a la secuencia especificada asi como la secuencia complementaria de la misma. Asi, los DNAs o RNAs con cadenas principales modificadas para la estabilidad o por otras razones son, "polinucleótidos" como ese término se propone en la presente. Además, los DNAs o RNAs que comprenden bases no usuales, tales como inosina o bases modificadas, tales como bases tritiladas por mencionar solo · dos ejemplos, son polinucleótidos como el término se utiliza en la presente. Será apreciado que una gran variedad de modificaciones se han hecho al DNA y RKA que sirven para muchos propósitos útiles conocidos para aquellos expertos en la técnica. El término polinucleótido como se emplea en la presente, comprende tales formas de polinucleótidos químicamente, e zimáticamente o metabólicamente modificadas, asi como las formas químicas de DNA o RNA característicos de los virus y células, incluyen ínter alia, células simples y complejas. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido que surge de manera natural correspondiente, así como polímeros de aminoácidos que surgen de manera natural . Como se utiliza en la presente, "promotor", incluye la referencia a una región de DNA corriente arriba desde el inicio de transcripción e implicada en el reconocimiento y enlace de RNA polimerasa y otras proteínas para iniciar la transcripción. Un "promotor de planta" es un promotor capaz de iniciar la transcripción en células de plantas. Promotores de plantas ejemplares incluyen, pero no están limitados a, aquellos que son obtenidos de plantas, virus de plantas y bacterias que comprenden genes expresados en células . de plantas tal como Agrobactexium o Rhizobium. Ejemplos son promotores que preferencialmente inician la transcripción en ciertos tejidos, tales como hojas, raíces, semillas, fibras, vasos de xilema, traqueidas o esclerénquima. Tales promotores son referidos como "preferidos de tejidos". Un promotor específico de "tipo de célula" principalmente induce la expresión en ciertos tipos de célula en uno o más órganos, por ejemplo, células vasculares en raíces u hojas. Un promotor "inducible" o "regulable" es un promotor, que está bajo control ambiental. Ejemplos de condiciones ambientales que pueden efectuar la transcripción mediante promotores inducibles incluyen las condiciones anaeróbicas en la presencia de luz. Otro tipo de promotor es un promotor desarrolladamente regulado, por ejemplo, un promotor que induce la expresión durante el desarrollo del polen. Los promotores preferidos de tejido, específicos del tipo de célula, desarrolladamente regulados e inducibles constituyen la clase de promotores "no constitutivos". Un promotor constitutivo" es un promotor que es activo bajo la mayoría de las condiciones ambientales. El término polipéptido ?????" se refiere a una o más secuencias de aminoácidos. El término también es inclusive de fragmentos, variantes, homólogos, alelos o precursores (por ejemplo, prepoproteínas o proproteinas) de los mismos. Una "proteína ZMNAM" comprende un polipéptido ZMNAM. Como se utiliza en la presente "recombinante" incluye la referencia a una célula o vector, que se ha modificado mediante la introducción de un ácido nucleico heterólogo o que la célula es derivada desde una célula asi modificada. Así, por ejemplo, células recombinantes expresan genes que no son encontrados en forma idéntica con la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que son de otra manera normalmente expresados, subexpresados o no expresados en todo como un resultado de la intervención humana deliberada. El término "recombinante" como se utiliza en la presente que no comprende la alteración de la célula o vector mediante eventos que surgen de manera natural (por ejemplo, mutación espontánea, transformación/transducción/transposición natural) tales como aquellas que ocurren sin la intervención humana deliberada. Como se utiliza en la presente, un "cásete de" expresión recombinante" es una construcción de ácido nucleico, generada recombinantemente o sintéticamente, con una serie de elementos de ácido nucleico específicos, que permiten la transcripción de un ácido nucleico particular en una célula objetivo. El cásete de expresión recombinante puede ser incorporado en un plásmido, cromosoma, DNA mitocóndrico, DNA de plástida, virus o fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la porción de cásete de expresión recombinante de un vector de expresión incluye, entre otras secuencias, un ácido nucleico a ser transcrito y un promotor. El término "residuo" o "residuo de' aminoácido" o "aminoácidos" se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un aminoácido que es incorporado en una proteína, polipéptido o péptido (colectivamente "proteína) . El aminoácido puede ser un aminoácido que surge de manera natural y, a menos que se límite de otra manera, puede comprenden análogos conocidos de aminoácidos naturales que-pueden funcionar de una manera similar como los aminoácidos que surgen de manera natural. El término "selectivamente híbrida" incluye la referencia a la hibridación, bajo condiciones de hibridación severas, de una secuencia de ácido nucleico a una secuencia objetivo de ácido nucleico específica a un grado detectablemente más grande (por ejemplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) que su hibridación a la secuencia de ácido nucleico no objetivo y. a la exclusión sustancial de ácido nucleico no objetivo. Las secuencias que se ibridan selectivamente típicamente tienen aproximadamente por lo menos 40% de identidad de secuencia, de preferencia 60-90% de identidad de secuencia y mucho más de preferencia 100% de identidad de secuencia (es decir, complementaria) entre sí. Los términos "condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" incluyen la referencia a condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo, a un grado detectablemente más grande que otras secuencias
(por e emplo, por lo menos 2 veces sobre el antecedente) . Las condiciones severas son dependientes de las secuencias y serán diferentes en circunstancias diferentes. Al controlar la severidad de la hibridación y/o condiciones de lavado, las secuencias objetivo pueden ser identificadas que pueden estar hasta 100% complementarias a la sonda (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad pueden ser ajustadas para permitir alguna desigualación en la secuencia de modo que menores grados de similitud son detectados
(sondeo heterólogo) . Optimamente, la sonda es de aproximadamente 500 nucleótidos en longitud, pero puede variar grandemente en longitud a menos de 500 nucleótidos a igual a la longitud completa de la secuencia objetivo. Típicamente, las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es menor que aproximadamente 1.5 M de ion Na, típicamente de manera aproximada 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) a pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas) . Por ejemplo, 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo, mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden obtener con la adición de agentes desestabilizantes tales como formamida o Denhardt'S. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS (dodecil sulfato de sodio) al 1% a 37°C y un lavado en IX a 2X SSC (20X SSC=3.0 M NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderadas ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 al 45%, NaCl 1M, SDS al 1% a 37 °C y un lavado en 0.5X a IX SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl 1M, SDS al 1% a 3 °C y un lavado en SSC 0. IX SSC a 60 a 65°C. La especificidad es típicamente la función en los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son una resistencia iónica y una temperatura, de la solución de lavado final. Para híbridos de DNA-DWA, la Tm puede ser aproximada de la ecuación de Meinkoth y Walhl, Anal . Biochem. , 138:267-84 (1984: Tm=81.5°C + 16.6 (log M) + 0.41 (% GC) - 0.61 (% form) - 500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina o citosina en el-. DNA,% de form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, Y L es la longitud del híbrido en pares bases. La Tm es la temperatura (bajo resistencia iónica definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria híbrida a una sonda perfectamente igualada. La Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; así, la Tm, la hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar la secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, si se buscan secuencias con =90% de identidad, la Tm puede ser disminuida a 10 °C. Generalmente, se seleccionan condiciones severas que son de aproximadamente 5°C menor que el punto de fusión térmico (Tm) para la secuencia específica y su complemento a una resistencia iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones severamente severas pueden utilizar una hibridación y/o lavado en un 1, 2, 3 o 4°C menor que el punto de fusión términos (Tm) ; las condiciones moderadamente severas pueden, utilizar una hibridación y/o lavado en 6, 7, 8, 9 o 10 °C menor que el punto de fusión térmico (Tm) / las condiciones de baja severidad pueden utilizar una hibridación y/o lavado en 11, 12, 13, 14, 15 o 20°C menor que el punto de fusión térmico (Tn) . Usando la ecuación, la hibridación y las composiciones de lavado, y la Tm deseada aquellos expertos ordinarios entenderán que las variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado son inherentemente descritas. Si el grado deseado de desigualación resulta en una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32 °C (solución de formamida) se prefiere incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guía extensiva para la hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen, LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMIS RY AND MOLECULAR BIOLOGY - HIBRIDIZATION WITH NUCLEIN ACID PROBES, parte I, capítulo 2, "Overview of principies of hibridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York (1993); and CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, capítulo 2, Ausubel y colaboradores, eds., Greene Publishing and Wiley-Interscience, New Yor (1995) . A menos que se mencione de otra manera, en la presente solicitud alta severidad se define como hibridación en 4X SSC, 5X Denhardt's (5 g Ficoli, 5 g polivinilpirrolidona, 5 g de albúmina de suero de bovino en 500 mi de agua), 0.1 mg/ml de DNA de esperma de salmón hervido y 25 mM de fosfato de NA a 65°C, y un lavado de 0. IX SSC, SDS al 0.1% a 65°C. Como se utiliza en . la presente, "planta transgénica" incluye la referencia a una planta, que comprende dentro de su genoma un polinucleótido heterólogo. Generalmente, el polinucleótido heterólogo está establemente integrado dentro del genoma de tal manera que el polinucleótido es pasado a generaciones sucesivas. El polinucleótido heterólogo puede ser integrado en el genoma solo o como parte de un cásete de expresión recombinante . "Transgénico" se utiliza en la presente para incluir cualquier célula, linea de células, callo, tejido, parte de planta o plantas, el fenotipo de la cual se ha alterado mediante la presencia de ácido nucleico heterólogo incluyendo aquellos transgénicos inicialmente alterados de esta manera, asi como aquellos creados por cruzas sexuales o propagación asexual desde el transgénico inicial. El término "transgénico" como se utiliza en la presente no comprende la alteración del genoma (cromosómico o extra-cromosómicos) mediante métodos de reproducción de plantas convencionales o mediante eventos que surgen de manera natural tal como la fertilización cruzada aleatoria, infección viral no recombinante, transformación bacteriana no recombinante, transposición no recombinante o mutación espontánea. Como se utiliza en la presente, "vector"' incluye la' referencia a un ácido nucleico usado en la transfección de una célula hospedera y en la cual puede ser insertado un polinucleótido. Los vectores son frecuentemente replicones. Los vectores de expresión permiten la transcripción de un ácido nucleico insertado en los mismos. Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencias entre dos o más ácidos nucleicos o polinucleótidos o polipéptidos : (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) ??identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia", y (e) identidad sustancial. Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para comparación de secuencias. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto o la totalidad de una secuencia especifica; por ejemplo, como un segmento de un cDNA de longitud completa o secuencia de gen, o el cDNA completo o secuencia de gen. Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" incluye la referencia a un segmento contiguo y' especificado de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido puede ser comparada con una secuencia de referencia y en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. Generalmente, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleotidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100 o más larga. Aquellos expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud a una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios de la secuencia de polinucleótido, típicamente se introduce una sanción de espacio y se sustrae desde el número de igualaciones. Los métodos de alineación de secuencias de nucleótidos y aminoácidos para comparaciones son bien conocidos en la técnica. El algoritmo de homología local (BESTFIT) de Smith and Waterman, Adv. Appl. Math 2:482 (1981), puede conducir a la alineación óptima de secuencias para comparación; mediante el algoritmo de alineación de homología (GAP) de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970); mediante la búsqueda por el método de la similitud (Tfasta y Fasta) de Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:2444 (1988); mediante implementaciones computarizadas de estos algoritmos, incluyendo, pero no limitado a: CLUSTAL en el progrma PC/Gene por Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, BLAST, Fasta, Tfasta en el Paquete de Software de Genética de Wisconsin, Versión 8 (disponible de Genetics Computer Group (programas GCG® (Accelrys, Inc., San Diego, CA) . ) . El programa CLUSTAL es bien descrito por Higgins y Sharp, Gene 73:237-44 (1988); Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-3 (1989); Corpet y colaboradores, Nucleic Acids Res. 16:10881-90 (1988) ; Huang y colaboradores, Computer Applications in the Biosciences 8:155-65 (1992) y Pearson y colaboradores, Meth. Mol. Biol. 24:307-31 (1994). El programa preferido para el uso para la alineación global óptima de secuencias múltiples es PileUp (Feng y Doolittle, J. Mol. Evol. , 25:351-60 (1987) que es similar al método descrito por Higgins and Sharp, ' CABIOS 5:151-53 (1989) e incorporado en la presente por referencia) . La familia de programas BLAST que puede ser usada para búsquedas de similitud de base de datos incluyen: BLASTN para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos; BLASTX para secuencias de consultas de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de proteína; BLASTP para secuencias de consulta de proteína contra secuencias de base de datos de proteína; TBLASTN para secuencias de consulta de proteína contra secuencia de bases de datos de nucleótidos y TBLASTX para secuencias de consulta de nucleótidos contra secuencias de bases de datos de nucleótidos. Ver CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Capítulo 19, Auxubel y colaboradores, eds . , Greene Publishing and Wiley-Interscience, New York (1995) . GAP usa el algoritmo de Needleman and Wunsch, supra, para encontrar la alineación de dos secuencias, completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios . GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios. Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de las igualaciones para cada espacio que este inserta. Si una sanción de extensión de espacio mayor que 0 es elegida, GAP debe hacer, además, un aprovechamiento para cada espacio insertado de la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin son 8 y 2, respectivamente. Las sanciones de creación de espacio y de extensión de espacio pueden ser expresadas como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 100. Asi, por ejemplo, las sanciones de creación espacio y de extensión de espacio pueden ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 o más grande. GAP presenta ' un miembro de la familia de las mejores alineaciones. Pueden existir muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene una mejor calidad. GAP muestra cuatro figuras de mérito para las alineaciones. Cualidad, Relación, Identidad y Similitud. La cualidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La relación es la calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. El por ciento de identidad es el por ciento de símbolos que realmente se igualan. El por ciento de similitud es el por ciento de los símbolos que son similares. Los símbolos que están a través de los espacios son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro usada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin es BLOSUM62 (ver Henikoff y Nehikoff, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)). A menos que se mencione de otra manera, los valores, de identidad/similitud de secuencia proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido usando el sitio BLAST 2.0 de programas usando parámetros de error (Altschul y colaboradores, Nuclelc Acids Res. 25:3389-402 (1997)). Como aquellos expertos ordinarios en la técnica entenderán, las búsquedas BLAST asumen que las proteínas pueden ser modeladas como secuencias aleatorias. Sin embargo, muchas proteínas reales comprenden regiones de secuencias no aleatorias, que pueden ser tractos homopoliméricos, repeticiones de periodo corto o regiones enriquecidas en uno o mas aminoácidos. Tales regiones de baja complejidad puede ser alineada entre los proteínas no relacionadas aunque otras regiones de la proteína son completamente distintas. Un número de programas de filtro de baja complejidad pueden ser empleados para reducir tales alineaciones de baja complejidad. Por ejemplo, los filtros de baja complejidad SEG (Wooten and Federhen, Comput. Chem. 17:149-63 (1993)) y X U (Claverie and States, Comput. Chem. 17:191-201 (1993)) pueden ser empleados solos o en combinación. Como se utiliza en la presente, "identidad de-secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de ácido nucleico o polipéptido incluye la referencia a los residuos de las dos secuencias, que son los mismos cuando se alinean para la correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se usa en referencia a proteínas, se reconoce qué posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácidos son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Donde las secuencias difieren las sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia pueden ser ajustada y arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias, que difieren por tales sustituciones conservativas, se dicen que tienen "similitud de secuencias" o similitud" . Los medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Típicamente esto involucra registrar una sustitución conservativa como, una parcial antes que una igualación completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde a un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y a una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, a una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de las sustituciones conservativas es calculado, por ejemplo de acuerdo con el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic . Biol . Sci. 4:11-17 (1988), por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California, USA) . Como se utiliza en la presente,, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido de la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacio) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje es calculado al determinar un número de posiciones en las cuales la base de ácido nucleico o residuo de aminoácido idéntica ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de porciones en la ventana de comparación y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. El término "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótido significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene entre 50-100% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 50% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 60% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 70%, más de preferencia por lo menos 80%, más de preferencia por lo menos 90% y mucho más de preferencia por lo menos 95%, comparado con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos usando parámetros estándares. Un experto reconocerá que estos valores pueden ser apropiadamente ajustados para determinar la cantidad suficiente de proteínas- codificadas por las dos secuencias de nucleótidos al tomar en cuenta la degeneración del codón, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento de la estructura de lectura y similares. La identidad sustancial de secuencia de aminoácidos para estos propósitos normalmente significa la identidad de secuencia de entre 55-100%, de preferencia por lo menos 55%, de preferencia por lo menos 60%, más de preferencia por lo menos 70%, 80%, 90% y mucho más de preferencia por lo menos 95%.
Otra indicación de que las secuencias de nucleótidos son sustáncialmente idénticas es si dos moléculas hibridan entre si bajo condiciones severas. La degeneración del código genético permite muchas sustituciones de aminoácidos a la variedad en la secuencia de nucleótidos que codifica para el mismo aminoácido, por consiguiente es posible que la secuencia de DNA codificarla para el mismo polipéptido pero no hibridaría entre si bajo condiciones severas. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando una copia de un ácido nucleico se crea usando la degeneración de codon máxima que es permitida por el código genético. Una indicación de que dos secuencias de ácido nucleico son sustáncialmente idénticas es que el polipéptido, que el primer ácido nucleico codifica, es inmunológicamente reactivo cruzadamente con el polipéptido codificado por el segundo ácido nucleico. Los términos "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con entre 55-100% de identidad de secuencia a una secuencia de referencia, de preferencia por lo menos 55% de identidad de secuencia, de preferencia 60%, 'de preferencia 70%, más de preferencia 80%, mucho más de preferencia por lo menos 90% a 95% de identidad de secuencia a la secuencia de referencia sobre una ventana de comparación no especificada. De preferencia, la alineación óptima se conduce usando el algoritmo de alineación de homología de Needleman y Wunsch, supra. Una indicación de que dos secuencias de péptido son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con los anticuerpos resaltados contra el segundo péptido. Asi, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, donde los dos péptidos difieren solamente por una sustitución conservativa. Además, un péptido puede ser sustancialmente idéntico a un segundo péptido cuando ellos difieren por un cambio no conservativo si el epitope que el anticuerpo reconoce sustancialmente idéntico. Los péptidos que son "sustancialmente similares" comparten secuencias, como es mencionado anteriormente excepto que las posiciones de residuo, que no son idénticas, pueden diferir por cambios de aminoácidos conservativos. La invención describe polinucleótidos y polipéptidos de Meristemo No Apical novedosos aislados del maiz. Los nucleótidos y proteínas novedosas de la invención tienen un patrón de expresión que indican que ellos son desarrolladamente regulados y así juegan un papel importante en el desarrollo de la planta. Los polinucleótidos se expresan en el endosperma y ambos son inscritos. Los polinucleótidos o polipéptidos de esta manera proporcionan una oportunidad para manipular el desarrollo del endosperma de la planta para alterar el desarrollo de la semilla, la sincronización de la semilla o la composición de la semilla. Esto se puede usar para crear una planta estéril, una planta sin semilla o una planta con composición de endosperma alterada . Acidos Nucleicos La presente invención proporciona, ínter alia., ácidos nucleicos aislados de R A, DNA y análogos y/o quimeras de los mismos, que comprenden un polinucleótido ZM AM. La presente invención también - incluye' polinucleótidos optimizados para la expresión en organismos diferentes. Por ejemplo, para la expresión del polinucleótido en una planta de maíz, la secuencia puede ser alterada para tener en cuenta las preferencias de codón específicas y para alterar el contenido de GC de acuerdo con Murray y colaboradores, supra. La utilización del codón de maíz para 28 genes de plantas de maíz se enlista en la Tabla 4 de Murray y colaboradores, supra. Los ácidos nucleicos ZMNAM de la presente invención comprenden polinucleótidos ZMNAM aislados que son inclusivos de : (a) un polinucleótido que codifica un polipéptido ZMNAM y variantes conservativamente modificadas y polimórficas del mismo; (b) un polinucleótido que selectivamente híbrida a un polinucleótido de (a) / (c) un polinucleótido que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia con los polinucleótidos de (a) o (b) ; (d) secuencias complementarias de polinucleótidos de (a), (b) , o (c) ; y (e) un polinucleótido que comprende por lo menos 15 nucleótidos contiguos de un polinucleótido de (a), (b) , (c) o (d) . Los plásmidos que contienen secuencias de polinucleótido de la invención se depositaron con la colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC) , Manassas, Virginia, y se les asignó los números de Acceso PTAS-4738 y PTA-4542. Este depósito será mantenido bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimiento de Patente. Este depósito se hizo simplemente como una conveniencia para aquellos en la técnica y no como una admisión de que un depósito es requerido bajo 35 U.S.C. § 112. Construcción de Acidos Nucleicos Los ácidos nucleicos arslados de la presente invención se pueden hacer usando (a) métodos recombinantes estándares, (b) técnicas sintéticas, o combinaciones de los mismos. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención serán clonados, amplificados, o de otra manera construidos a partir de un hongo o bacteria.
Los ácidos nucleicos convenientemente pueden comprender secuencias además de un polinucleótido de la presente invención. Por ejemplo, un sitio de multi-clonación que comprende uno o más sitios de restricción de endonucleasa puede ser insertado en el ácido nucleico para ayudar en el aislamiento del polinucleótido. También, secuencias traducibles pueden ser insertadas para ayudar en el aislamiento del polinucleótido traducido de la presente invención. Por ejemplo, una secuencia marcadora de hexa-histidina proporciona un medio conveniente para purificar las proteínas de la presente invención. El ácido nucleico de la presente invención - excluyendo la secuencia de polinucleótido - es opcionalmente un vector, adaptador o enlazador para la clonación y/o expresión de un polinucleótido de la presente invención. Se pueden adicionar secuencias adicionales a tales secuencias de clonación y/o expresión para optimizar su función en la clonación y/o expresión; para ayudar en el aislamiento del polinucleótido o para mejorar la introducción del polinucleótido en una célula. Típicamente, la longitud de un ácido nucleico de la presente invención menos la longitud de su polinucleótido de la presente invención es menor que 20 kilopares bases, frecuentemente menor que 15 kb, y frecuentemente menor que 10 kg. El uso de vectores de clonación, vectores de expresión, adaptadores, y enlazadores son bien conocidos en la técnica.
Los ácidos nucleicos ejemplares incluyen tales vectores como: MI3, lambda ZAP Express, lambda ZAP II, lambda gtlO, lambda gtll, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II, lambda DASH II, lambda EMBL 3, lambda EMBL 4, pWE15, SuperCos 1, SurfZap, Uni-ZAP, pBC, pBS+/-, pSG5, PBK, pCR-Script, pET, pSPUTK, p3'SS, pGEM, pSK+/-, pGEX, pSPORTI y II, pOPRSVI CAT, pOP13 CAT, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pOG44, pOG45, FR ßG L/ pNEOpGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415, pRS416, lambda MOSSIox y lambda MOSElox. Vectores opcionales para la presente invención, incluyen pero no están limitados a, lambda ZAP II, y pGEX. Para una descripción de varios ácidos nucleicos ver, por ejemplo, Stratagene Cloning Systems, Catalogs 1995, 1996, 1997 (La Jolla, CA) , y, Amersham Life Sciences, Inc. Catalog '97 (Arlington Heights, IL) . Métodos Sintéticos para Construir Acidos Nucleicos Los ácidos nucleicos aislados de la presente invención también se pueden preparar mediante la síntesis química directa mediante métodos tales como el método de fosfotriéster de Narang y colaboradores, Meth. Enzymol. 68:90-9 (1979); el método de fosfodiéster de Brown y colaboradores, Meth. Enzymol. 68:109-51 (1979); el método de dietilfosforamidita de Beaucage y colaboradores, Tetra. Letts, 22 (29) : 1859-62 (1981); el método de triéster de fosforamidita y fase sólida descrito por Beaucage y colaboradores, supra, por ejemplo, usando un sintetizador automatizado, por ejemplo, como es descrito en Need am-VanDevanter y colaboradores, Nucleic Acids Res. 12:6159-68; y el método de soporte sólido de la patente norteamericana No. 4,458,066. La síntesis química generalmente produce un oligonucleótido de una sola hebra. Este puede ser convertido en DNA de doble hebra mediante hibridación con una secuencia complementaria, o mediante polimerización con una DNA polimerasa usando la hebra individual como el patrón. Un experto reconocerá que mientras que la síntesis química de DNA es limitada a secuencias de aproximadamente 100 bases, se pueden obtener secuencias más largas mediante la ligación de secuencias más cortas. UTRs y Preferencia de Codón En general, la eficiencia de traducción se ha encontrado que es regulada mediante los elementos de secuencia específica en la región de no codificación o no traducida 5' (5'UTR) del RNA. Las porciones de secuencia positivas incluyen secuencias consensúales de iniciación de traducción (Kozak, Nucleic Acids Res. 15:8125 (1987)) y la estructura de terminación 5<G>7 metil GpppG RNA (Drummond y colaboradores, Nucleic Acids Res. 13:7375 (1985)). Los elementos negativos incluyen estructuras de tallo-vuelta de 5'UTR intramoleculares estables (Muesing y colaboradores, Cell 48:691 (1987)) y las secuencias AUG o estructuras de lectura abierta cortas precedidas por un auge apropiado en el 5'UTR (Kozak,- supra, Rao y colaboradores, Mol. And Cell. Biol. 8:284 (1988)). Por consiguiente, la presente invención proporciona las regiones 5' y/o 3'UTR para la modulación de la traducción de secuencias de codificación heterólogas. Además, los segmentos que codifican el polipéptido , de los polinucleotidos de la presente invención pueden ser modificados para alterar la utilización del codón. La utilización del codón alterada puede ser empleada para alterar la eficiencia de traducción y/o optimizar la secuencia de codificación para la expresión en un huésped deseado o para optimizar la utilización de codón en una secuencia heteróloga para la expresión en el maíz. La utilización de codón en las regiones de codificación de los polinucleotidos de la presente invención se puede analizar estadísticamente usando paquetes de software comercialmente disponibles tal como "Codon Preference" disponible de la University of Wisconsin Genetics Computer Group. Ver Deveraux y colaboradores, Nucleic Acids Res. 12:387-395 (1984)); o MacVector 4.1 (Eastman Kodak Co., New Haver, Conn.). Así, la presente invención proporciona una característica de frecuencia de utilización de codón de la región de codificación de por lo menos uno de los polinucleotidos de la presente invención. El número de polinucleotidos (3 nucleótidos por aminoácido) que puede ser utilizado para determinar una frecuencia de utilización de codón puede ser . cualquier número entero de 3 al número de polinucleótidos de la presente invención como es proporcionado en la presente. Opcionalmente, los polinucleótidos serán secuencias de longitud completa. Un número ejemplar de secuencias para el análisis estadístico puede ser de por lo menos 1, 5, 10, 20, 50 o 100. Tergiversación de Secuencia La presente invención proporciona métodos para tergiversar la secuencia usando polinucleótidos de la presente invención, y composiciones que resultan de la misma. La tergiversación de secuencia es descrita en la publicación de PCT No. 96/19256, Ver también, Z ang y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 94:4504-9 (1997); y Zhao y colaboradores, Natuxe Biotech 16:258-61 (1998). Generalmente, la tergiversación de secuencia proporciona un medio para generar bibliotecas de polinucleótidos que tienen una característica deseada, que puede ser seleccionada o clasificada. Las bibliotecas de polinucleótidos recombinantes se generan a partir de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada, que comprenden regiones de secuencia, que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinadas ín vivo o in vitro. La población de polinucleótidos de secuencia recombinada comprende una subpoblación de polinucleótidos que poseen características deseadas o ventajosas y que pueden ser seleccionados por un método de selección o clasificación adecuado. Las características pueden ser cualquier propiedad o atributo capaz de ser seleccionado o detectado en un sistema de clasificación, y pueden incluir propiedades de: una proteína codificada, un elemento de transcripción, una transcripción de control de secuencia, procesamiento de RNA, estabilidad de RNA, conformación de cromatina, traducción u otra propiedad de expresión de un gen o transgen, un elemento replicativo, un elemento de enlace de proteína, o similar, tal como la característica que confiere una propiedad seleccionable o detectable. En algunas modalidades, la característica seleccionada será una m y/o Kcat alterada sobre la proteína de tipo silvestre como es proporcionado en la presente. En otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado de la tergiversación de secuencia tendrá una afinidad de enlace de ligando mayor que el polinucleótido de tipo silvestre no tergiversado. En todavía otras modalidades, una proteína o polinucleótido generado de la tergiversación de secuencia tendrá un pH alterado óptimo comparado con el polinucleótido de tipo silvestre no tergiversado . El incremento en tales propiedades puede ser de por lo menos 110%, 120%, 130%, 140% o mayor que 150% del valor de tipo silvestre. Casetes de Expresión Recombinante La presente invención además proporciona casetes de expresión recombinantes que comprenden un ácido nucleico de la presente invención. Una secuencia de ácido nucleico que codifica para el polinucleótido deseado de la presente invención, por ejemplo un cDNA o una secuencia genómica que codifica un polipéptido bastante largo para codificar una proteina activa de la presente invención, puede ser utilizada para construir un cásete de expresión recombinante que puede ser introducido en la célula hospedera deseada. Un cásete de expresión recombinante típicamente comprenderá un polinucleótido de la presente invención operablemente enlazado a secuencias reguladoras de iniciación de transcripción que dirigirán la transcripción del polinucleótido en la célula hospedera propuesta, tales como tejidos de una planta transformada. Por ejemplo, los vectores de expresión de plantas pueden incluir (1) un gen de planta clonado bajo el control de transcripción de la secuencia reguladora 5' y 3' y (2) un marcador seleccionable dominante. Tales vectores de expresión de plantas también pueden contener, si es deseado, una región reguladora de promotor (por ejemplo, una que confiere expresión inducible o constitutiva, ambientalmente o desarrolladamente regulada o específica/selectiva de célula o tejido) un sitio de inicio de iniciación de transcripción, un sitio de enlace de ribosoma, una señal de procesamiento de RNA, un sitio de terminación de transcripción y/o una señal de poliadenilación. Se puede emplear un fragmento de promotor de planta que dirigirá la expresión de un polinucleótido de la presente invención en todos los tejidos de una planta regenerada. Tales promotores son referidos en la presente como promotores "constitutivos" y son activos bajo las condiciones más ambientales y estado de desarrollo diferenciación celular. Ejemplos de promotores constitutivos incluyen el promotor 1' o 2' derivado de T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, el promotor Sirias, el promotor de alcohol cinamilico deshidrogenasa (patente 'norteamericana No. 5,683,439), el promotor Nos, el promotor rubisco, el promotor GRP1-8, el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV) , como es descrito en Odell y colaboradores, Nature 313:810-2 (1985); actina de arroz (McElroy y colaboradores, Plant Cell 163-171 (1990)); ubicuitin (Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 12:619-632 (1992) y Christensen y colaboradores, Plant Mol. Biol. 18:675-89 (1992)); pEMU (Last y colaboradores, Theor. Appl . Genet. 81:581-8 (1991)); MAS (Velten y colaboradores, EMBO J. 3:2723-30 (1984)); e istona H3 de maíz (Lepetit y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 231:276-85 (1992); y Atanassvoa y colaboradores, Plant Jounal 2(3) :291-300 (1992) ) ; promotor ALS, como es descrito en la solicitud de PCT No. WO 96/30530; y otras regiones de iniciación de transcripción de varios genes de plantas conocidos para aquellos expertos. Para la presente invención ubicuitin es el promotor preferido para la expresión en plantas monocotiledóneas . Alternativamente, el promotor de planta puede dirigir la expresión de un polinucleótido de la presente invención en un tejido especifico o de otra manera puede estar bajo el control ambiental o de desarrollo más preciso. Tales promotores son referidos en la presente como promotores "inducibles". Las condiciones ambientales que pueden afectar la transcripción por los promotores inducibles incluyen el ataque por patógenos, condiciones anaeróbicas o la presencia de luz. Ejemplos de promotores inducibles son el promotor Adhl, que es inducible por hipoxia o estrés por frío, el promotor Hsp70, que es inducible por estrés por calor y el promotor PPDK, que es inducible por la luz. Ejemplos de promotores bajo control del desarrollo incluyen promotores que inician la transcripción solamente p preferencialmente, en ciertos tejidos, tales como hojas, raices, frutos, semillas o flores. La operación de un promotor también puede variar dependiendo de su ubicación en el genoma. Asi, un promotor inducible puede llegar a ser completamente o parcialmente constitutivo en ciertas ubicaciones . Si se desea la expresión de polipéptido, generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en el extremo 3' de la región de codificación del polinucleótido . La región de poliadenilación puede ser derivado de una variedad de genes de plantas, o de T-DNA. La secuencia de extremo 3' a ser adicionada puede ser derivada de, por ejemplo, los genes nopalina sintasa u octopina sintasa, o alternativamente otro gen de planta, o menos de preferencia de cualquier otro gen eucariótico. Ejemplos de tales elementos reguladores incluyen, pero no están limitados, a las regiones de terminación 3' y/o poliadenilación tales como aquellos del gen nopalina sintasa (nos) de Agrobacterium turnefaciens (Bevan y colaboradores, Nucleic Acids Res. 12:369-85 (1983)); el gen inhibidor de proteinasa II (PINII) de papa (Kell y colaboradores, Nucleic Acids Res. 14:5641-50 (1986); y An y colaboradores, Plant Cell 1:115-22 (1989)); y el gen CaMV 19S (Mogen y colaboradores, Plant Cell 21261-72 (1990)). Una secuencia de intrón puede ser adicionada a la región no traducida 5' o la secuencia de codificación de la secuencia de codificación parcial para incrementar la cantidad del mensaje maduro que se acumula en el citosol. La inclusión de un intrón empalmable en la unidad de transcripción en ambas construcciones de expresión de plantas y animales se ha mostrado que incrementa la expresión del gen en los niveles tanto del mRNA como de proteina hasta 1000 veces (Buchman and Berg, Mol. Cell Biol. 8:4395-4405 (1988);
Callis y colaboradores, Genes Dev. 1:1183-200 (1987)). Tal incremento del intrón de la expresión del gen es típicamente más grande cuando se coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de los intrones de maíz Ad l-S intrón 1, 2 y 6, el intrón Bronze-1 son conocidos en la técnica. Ver generalmente, THE MAIZE HANDBOOK, Capitulo 116, Freeling and Walbot, eds., Springer, New York (1994). Las secuencias de señal de plantas, incluyendo, pero no limitadas a, las secuencias de DNA/RNA que codifican el péptido de señal que dirigen las proteínas a la matriz extracelular de la célula de planta (Dratewka-Kos y colaboradores, J. Biol. Chem. 264:4896-900 (1989)), tal como el gen de extensión Wicotiana plubaginifolia (DeLoose y colaboradores, Gene 99:95-100 (1991)·); los péptidos de señal que dirigen las proteínas a la vacuola, tal como el gen esporamina de camote (Matsuka y colaboradores, P_roc. Nati. Acad. Sci. USA 88:834 (1991)) y el gen lectina de cebada (Wilkins y colaboradores, Plant Cell, 2:301-13 (1990)); péptidos de señal que ocasionan que las proteínas sean secretadas, tal como aquel de PRIb (Lind y colaboradores, Plant Mol. Biol. 18:47-53 (1992)) o la alfa amilasa de cebada (BAA) (Rahmatullah y colaboradores, Plant Mol. Biol. 12:119 (1989), e incorporada en la presente por referencia), o péptidos de señal que dirigen las proteínas a las plástidas tal como aquel de enoil-Acp reductasa de colza (Verwaert y colaboradores, Plant Mol. Biol . 26:189-202 (1994)) son útiles en la invención. La secuencia de señal de alfa amilasa de cebada fusionada al polinucleótido ZMNAM es la construcción preferida para la expresión en el maíz para la presente invención. El vector que comprende las secuencias de un polinucleótido de la presente invención típicamente comprenderá un gen marcador, que confiere un fenotipo seleccionable sobre células de plantas. Usualmente, el gen marcador seleccionable codificará la resistencia al antibiótico, con genes adecuados que incluyen genes que codifican para la resistencia al antibiótico espectinomicina (por ejemplo, el gen aada) , el gen estreptomicina fosfotransferasa (SPT) que codifica para la resistencia de la estreptomicina, el gen neomicina fosfotransferasa (NPTII) que codifica para la resistencia a canamicina o geneticina, el gen higromicina fosfotransferasa (HPT) que codifica para la resistencia a la higromicina, genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de acetolactato sintasa (ALS) en particular los herbicidas de tipo sulfonilurea (por ejemplo, el gen acetolactato sintasa (ALS) que contienen mutaciones que conducen a tal resistencia en particular las mutaciones S4 y/o Hra) , genes que codifican para la resistencia a herbicidas que actúan para inhibir la acción de la glutamina sintasa tal como fosfinotricina o basta (por ejemplo, el gen bar), u otros genes conocidos en la técnica. El gen bar codifica la resistencia al herbicida basta, y el gen ALS codifica la resistencia al herbicida clorsulfurón. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados del plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens descrito por Rogers y colaboradores, Meth. Enzymol . 153:253-77 (1987). Estos vectores son vectores de integración en plantas en que en la transformación, los vectores integran una porción del vector DNA en el genoma de la planta hospedera. Los vectores de A. tumefaciens ejemplares útiles en la presente son los plásmidos pKYLX6 y pKYLX7 de Schardi y colaboradores, Gene 61:1-11 (1987), y Berger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 86:8402-6 (1989). Otro vector útil en la presente es plásmido pBI101.2 que es disponible de CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA) . Expresión de Proteínas en Células Hospederas Usando los ácidos nucleicos de la presente invención, se puede expresar una proteína de la presente invención en una célula recombinantemente diseñada tal como células de bacterias, levadura, insectos, mamíferos o de preferencia células de plantas. Las células producen la proteína en una condición no natural. Por ejemplo en cantidad, composición, ubicación y/o tiempo) , debido a que se han alterado genéticamente a través de la intervención humana para hacerlo de esta manera. Se espera que aquellos expertos en la técnica estén conscientes de los numerosos sistemas de expresión disponibles para la expresión de un ácido nucleico que codifica una proteina de la presente invención. Ningún intento se ha hecho para describir en detalle los diversos métodos conocidos para la expresión de proteínas en procariotas o eucariotas . En breve resumen, la expresión de ácidos nucleicos aislados que codifica una proteína de la presente invención típicamente será obtenida al enlazar operablemente, por ejemplo, el DNA o cDNA a un promotor (que es ya sea constitutivo o inducible) , seguido por la incorporación en un vector de expresión. Los vectores pueden ser adecuados para la replicación e integración en ya sea procariotas o eucariotas. Los vectores de expresión típicos contienen terminadores de transcripción y traducción, secuencias de iniciación, y promotores útiles para la regulación de la expresión del DNA que codifica una proteína de la presente invención. Para obtener la expresión de alto nivel de un gen clonado, es deseable construir los vectores de expresión que contienen, a lo mínimo, un promotor fuerte, tal como ubicuitin, para dirigir la transcripción, un sitio de enlace de ribosoma para la iniciación de la traducción y un terminador de transcripción/traducción . Los promotores constitutivos son clasificados en proporcionar un intervalo de expresión constitutiva. Asi, algunos son promotores constitutivos débiles, y otros son promotores constitutivos fuertes. Generalmente, por "promotor débil"' se propone un promotor que induce la expresión de una secuencia de codificación a un bajo nivel. Por "bajo nivel" se propone a niveles de aproximadamente 1/10,000 transcripciones a aproximadamente 1/100,000 transcripciones a aproximadamente 1/500,000 transcripciones. A la inversa, un "promotor fuerte" induce la · expresión de una secuencia de codificación a un "alto nivel" o aproximadamente 1/10 transcripciones a aproximadamente 1/100 transcripciones a aproximadamente 1/1,000 transcripciones. Un experto reconocerá que se podrían hacer modificaciones a una proteina de la presente invención sin disminuir su actividad biológica. Algunas modificaciones se pueden hacer para facilitar la clonación, expresión o incorporación de la molécula objetivo en una proteina de fusión! Tales modificaciones son bien conocidas para aquellos expertos en la técnica e incluyen, por ejemplo, una metionina adicionada al amino terminal para proporcionar un sitio de iniciación, o aminoácidos adicionales (por ejemplo, poli His) colocado en cualquier terminal para crear sitios de restricción convenientemente ubicados o codones de terminación o secuencias de purificación. Expresión en Procariotas Las células procarióticas se pueden utilizar como huéspedes para la expresión. Las procariotas más frecuentemente son representadas por varias cepas de E. coli; sin embargo, también se pueden utilizar otras cepas microbianas. Las secuencias de control procarióticas comúnmente utilizadas que son definidas en la presente, para incluir promotores para iniciación de transcripción, opcionalmente con un operador, junto con las secuencias del sitio de enlace de ribosoma, incluyen tales promotores comúnmente utilizados como los sistemas de promotor de beta lactamasa (penicilinasa) y lactosa (lac) (Chand y colaboradores, Natuxe 198:1058 (1977)), el sistema de promotor de triptofano (trp) (Goeddel y colaboradores, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980)) y el promotor P L derivado lambda y el sitio de enlace de ribosoma N-gen. (Shimatake y colaboradores, Nature 202:128 (1981). La inclusión de marcadores de selección y los vectores de DNA transfectados en E. coli también es útil. Ejemplos de tales marcadores incluyen genes que especifican la resistencia a ampicilina, tetraciclina o cloranfenicol . El vector se selecciona para permitir la introducción del gen de interés en la célula hospedera apropiada. Los vectores bacterianos son típicamente de origen de plásmido o de fago. Las células bacterianas apropiadas se infectan con las partículas del vector de fago o se transfectan con el DNA del vector de fago desnudo. Si se utiliza un vector de plásmido, las células bacterianas se transfectan con el DNA del vector de plásmido. Los sistemas de expresión para expresar una proteina de la presente invención están disponibles usando Bacillus sp. y Salmonella (Palva y colaboradores, Gene 22:229-35 (1983); Mosbach y colaboradores, Nature 302:543-5 (1983)). El vector de plásmido pGEX-4T-l de Pharmacia es el vector de expresión de E. coli preferido para la presente invención. Expresión en Eucariotas Una variedad de sistemas de expresión eucarióticos tales como levadura, líneas de células de insecto, células de plantas y de mamíferos, son conocidos para aquellos expertos en la técnica. Como se explica brevemente enseguida, la presente invención puede ser expresada en estos sistemas eucarióticos. En algunas modalidades, las células de plantas transforinadas/transfectadas, como es discutido infra, se emplean como sistemas de expresión para la producción de las proteínas de la presente invención. La síntesis de proteínas heterólogas en levadura es bien conocida. Sherman y colaboradores, METHODS IN YEAST GENETICS, Cold Spring Harbor Laboratory (1982) es un trabajo bien reconocido que describe los diversos métodos disponibles para producir la proteina en levadura. Dos levaduras ampliamente utilizadas para la producción de proteínas eucarióticas son Saccharomyces cerevisiae y Pichla pastoris . Los vectores, cepas y protocolos para la expresión de Saccharomyces y Pichia son conocidos en la técnica y disponibles de proveedores comerciales (por ejemplo, Invitrogen) . Los vectores adecuados usualmente tienen secuencias de control de expresión, tales como promotores, incluyendo 3-fosfoglicerato quinasa o alcohol oxidasa, y un origen de replicación, secuencias de terminación y similares, como se ha deseado. Una proteína de la presente invención, una vez expresada, puede ser aislada de levadura al lisar las células y al aplicar las técnicas de aislamiento de proteína estándares a los Usados o a las pelotillas. La inspección del proceso de purificación puede ser realizada al usar técnicas de manchado de Western o radioinmunoensayo de otras técnicas de inmunoensayo estándares. Las secuencias que codifican proteínas de la presente invención también pueden ser ligadas a varios vectores de expresión para el uso en la transfección de cultivos de células de, por ejemplo, de origen mamífero, de insecto o de plantas. Los sistemas de células de mamíferos frecuentemente estarán en la forma de monocapas de células aunque también se pueden utilizar suspensiones de células de mamíferos. Un número de líneas de células hospederas adecuadas capaces de expresar proteínas intactas se han desarrollado en la técnica, e incluyen las líneas de células HEK293, BHK21 y CHO. Los vectores de expresión para estas células pueden incluir secuencias de control de expresión, tal como un origen de replicación, un promotor (por ejemplo, el promotor CMV, un promotor HSV tk o promotor pgk (fosfoglicerato quinasa) ) , un mejorador (Queen y colaboradores, Immnunol Rev. 89:49 (1986)), y sitios de información de procesamiento necesarios, tales como los sitios de enlace de ribosoma, sitios de empalme de R A, sitios de poliadenilación (por ejemplo, un sitio de adición de T AG poly A grande SV40) y secuencias terminadoras de transcripción. Otras células animales útiles para la producción de proteínas de la presente invención están disponibles, por ejemplo, de American Type Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybrxdomas (7a ed., 1992). Los vectores apropiados para expresar proteínas de la presente invención en células de insecto son usualmente derivados del vaculovirus SF9. Las líneas de células de insectos adecuadas incluyen líneas de células de larvas de mosquitos, gusano de seda, gusano desvastador, polilla y Drosophila, tal como la línea de células Schneider (ver, por ejemplo, Schneider, J. Embryol. Exp. Morphol . 27:353-65 (1987) ) . Como con la levadura, cuando se emplean células hospederas de animales o plantas superiores, las secuencias terminadoras de poliadenilación o transcripción son típicamente incorporadas en el vector. Un ejemplo de una secuencia terminadora es la secuencia de poliadenilación del gen de hormona de crecimiento bovino. Las secuencias para el empalme preciso de la transcripción también pueden ser incluidas. Un ejemplo de una secuencia de .empalme es el intrón VP1 de SV40 (Sprague y colaboradores, J. Virol . 45:773-81 (1983)). Adicionalmente, . las secuencias de genes para controlar la replicación en la célula hospedera pueden ser incorporada en el vector tal como aquellas encontradas en los vectores del tipo virus papiloma bovino (Saveria-Campo, "Bovine Papilloma Virus DNA a Eukaryotic Clonxng Vector", In DNA CLONING:A PRACTICA!, APPROACH, Vol . II,Glover, ed. , IRL Press, Arlington, VA, pp. 213-38 (1985)). Además, el gen para ZM AM colocado en el vector de expresión de planta apropiado puede ser usado para transformar células de plantas. La enzima luego puede ser aislada del callo de la planta o las células transformadas pueden ser usadas para regenerar plantas transgénicas . Tales plantas transgénicas pueden ser cosechadas, y los tejidos apropiados (semillas u hojas, por ejemplo) pueden ser sometidos a las técnicas de extracción y purificación de proteina a gran escala. Métodos de Transformación de Plantas Numerosos métodos para introducir genes foráneos en plantas son conocidos y 'pueden ser usados para insertar un polinucleótido ZMNAM en un huésped de planta, incluyendo protocolos de transformación de plantas biológicos y físicos. Ver,. Por ejemplo, Miki y colaboradores, "Procedura for ' introducing Foreign DNA intro Plants", in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, Glick and Thompson, eds., CRC Press, Inc., Boca Ratón, pp. 67-88 (1993) . Los métodos elegidos varían con la planta hospedera, e incluyen métodos de transfección químicos tal como la transferencia del gen mediada por microorganismo con fosfato de calcio tal como Agrobacterium (Horsch y colaboradores, Science 227:1229-31 (1985) ) , electroporación, microinyección, y bombardeo biolístico . Los casetes de expresión y vectores y métodos de cultivo in vitxo para la transformación de la célula o tejido de planta en la regeneración de plantan son conocidos y disponibles. Ver, por ejemplo, Gruber y colaboradores, "Vectors for Plant Transformation", in METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY, supra, p . 89-119. Transformación mediada por AgrobaCterium El método, más ampliamente utilizado para introducir. un vector de expresión en plantas está basado en el sistema de transformación natural de Agrobacterium. A. tumefaciens y A. rhizogenes son bacterias de la tierra patogénicos de plantas, que genéticamente transforman las células de plantas. Los plásmidos Ti y Ri de A. tumefaciens y A. rhizogenes, respectivamente, portan genes responsables para la transformación genética de plantas. Ver, por ejemplo, Kado, Crit. Rev. Plant Sci . 10:1 (1991) . Las descripciones de los sistemas y métodos de vector de Agrobacterium para la transferencia del gen mediada por Agrobacterium se -proporcionan en Gruber y colaboradores, supra; Miki y colaboradores, supra; y Moloney y colaboradores, Plant Cell Reports 8 :238 (1989) . De manera similar, el gen puede ser insertado en la región T-DNA de un plásmido Ti o Ri derivado de A. tumefaciens o A. thizogenes, respectivamente. Asi, se pueden construir casetes de expresión como en lo anterior, usando estos plásmidos. Se conocen muchas secuencias de control que cuando se acoplan a una secuencia de codificación heteróloga y se transforman en un organismo hospedero muestran fidelidad en la expresión del gen con respecto a la especificidad del te ido/órgano de la secuencia de codificación original. Ver, por ejemplo, Benfey y Chua, Science 244:174-81 (1989) . Las secuencias de control particularmente adecuadas para el uso en estos plásmidos son promotores para la expresión especifica de la hoja constitutiva del gen en las diversas plantas objetivo. Otras secuencias de control útiles incluyen un promotor y un terminador del gen nopalina sintasa (NOS) . ' El promotor y terminador NOS están presentes en el plásmido pARC2, disponible de la Colección Americana de Cultivo Tipo y designada ATCC 67238. Si se utiliza un sistema de tal clase, el gen de virulencia (vír) de ya sea el plásmido TI o Ri también debe estar presente, ya sea junto con la porción T-DNA, o por medio de un sistema binario en donde un gen vir está presente en un vector separado. Tales sistemas, vectores para el uso en los mismos, y métodos de transformación de células de plantas se describen en la patente norteamericana No. 4,658,082; solicitud de patente norteamericana No. 913,914, presentada el 1 de Octubre de. 1986, como es mencionada en la patente norteamericana No. 5,262,306, expedida el 16 de Noviembre de 1993/ y Simpson y colaboradores, Plant Mol. Biol. 6:403-15 (1986) (también mencionada en la patente ?306) , todas incorporadas por referencia en su totalidad. Una vez construidos, estos plásmidos pueden ser . colocados en A. rhizogenes o A. · turnefaciens, y estos vectores usados para transformar células de especies de plantas, que son ordinariamente susceptibles a la infección por Fusarium o Alternaría. Otras diversas plantas transgénicas también son contempladas por la presente invención, incluyendo pero . no limitado a, soya, maíz, sorgo, alfalfa, arroz, trébol, col, plátano, café, apio, tabaco, caupí, algodón, melón y pimiento. La selección de ya sea A. tumefaciens o A. rhizogenes dependerá de la planta que es transformada de esta manera. En general A. tumefaciens es el órgano preferido para la transformación. La mayoría de plantas dicotiledóneas, algunas gimnospermas y unas cuantas plantas monocotiledóneas (por ejemplo, ciertos miembros de las Liliales y Arales) son susceptibles a infección con A. tumefaciens. A. rhizogenes también tiene un amplio intervalo de huéspedes, que abarcan la mayoría de dicotiledóneas y algunas gimnospermas, que incluyen miembros de la Legumínosae, Compositae y Chenopodiaceae. Las plantas monocotiledóneas ahora pueden ser transformadas con algo de éxito. La solicitud de patente europea No. 604 662 Al describe un método para transformar monocotiledóneas usando Agrobacterium. La publicación eruropea No. 672 752 Al describe un método para transformar monocotiledóneas con Agrobacterium usando el escutelo de embriones inmaduros. Is ida y colaboradores discuten un método para transformar maíz al exponer los embriones inmaduros a A. tumefaciens {Nature Biotechnology 14:745-50 (1996) ) . Una vez transformadas, estas células se pueden utilizar para regenerar plantas transgénicas . Por ejemplo, las plantas completas pueden ser infectadas con estos vectores al romper la planta y luego al introducir el vector del sitio roto. Cualquier parte de la planta puede ser roto, incluyendo hojas, tallos o raices. Alternativamente, el tejido de la planta, en la forma de una explanta, tal como el tejido cotiledonario o discos de hojas, puede ser inoculado con estos vectores, y cultivado bajo condiciones, que promueven la regeneración de la planta. Las raices o retoños transformados mediante la inoculación del tejido de la planta con -A. rhizogenes o A. tumefaciens, que contiene el gen que codifica para la enzima de degradación de fumonisina, pueden ser utilizados como una fuente de tejido de planta para regenerar plantas transgénicas resistentes a fumonisia, ya sea por medio de la embriogénesis somática o la organogénesis. Ejemplos de tales métodos para regenerar tejido de planta son descritos en Shahin, Theor. Appl. Genet. 69:235-40 (1985); patente norteamericana No. 4, 658, 082; Simpson y colaboradores, supra, y la solicitud de patentes norteamericanas Nos. 913,913 y 913,914, ambas presentas el 1 de octubre de 1986, como es mencionado en la patente norteamericana No. 5,262,306, expedido el 16 de Noviembre de 1993, las descripciones completas en las mismas incorporadas en la presente por referencia. Transferencia de Gen Directa A pesar del hecho de que el intervalo de huéspedes para la transformación mediada por Agrobacterium es amplia, algunas especies de cultivo de cereal principales y gimnospermas generalmente han sido recalcitrantes para este modo de transferencia de gen, aunque algo de éxito ha sido obtenido recientemente en el arroz (Hiei y colaboradores, The Plant Journal 6:271-82 (1994)). Varios métodos de transformación de plantas, colectivamente referidos como transferencia de ten directa, se han desarrollado como una alternativa- a la transformación mediada por Agrobacterium. Un método generalmente aplicable de transformación de plantas es la transformación mediada por microproyectiles, donde el DNA es portado en la superficie de microproyectiles que miden aproximadamente 1 a 4 um. El vector de expresión se introduce en los tejidos de plantas como un dispositivo biolistico que acelera los microproyectiles a velocidades de 300 a 600 m/s que es suficiente para penetrar las paredes de la célula de la planta y las membranas (Sanford y colaboradores, Part. Sci. Technol. 5:27 (1987); Sanford, Trends Biotech 6:299 (1988); Sanford, Physiol. Plant 79:206 (1990); y Klein y colaboradores, Biotechnology 10:268 (1992) ) . Otro método para el suministro físico de DNA de las plantas es la sonicación de células objetivo como es descrito en Záng y colaboradores, BioTechnology 9:996 (1991). Alternativamente, las fusiones de liposoma o esteroplastos se han usado para introducir vectores de expresión en plantas. Ver, por ejemplo, Deshayes y colaboradors, EMBO J. 4:2721 (1985); y Christou y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:3962 (1987) . La captación directa de DNA en protoplastos usando la precipitación con CaCl2, alcohol polivinilico o poli-L-ornitina también ha sido reportado: Ver, por ejemplo, Hain y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 199:161 (1985); y Draper y colaboradores, Plant Cell Physiol. 23:451 (1982) . La electroporación de protoplastos y células completas y tejidos también ha sido descrito. Ver, por ejemplo, Donn y colaboradores, en Abstracts of the Vllth Int'l. Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC, A2-38, p. 53 (1990) ; d'Halluin y colaboradores, Plant Cell 4:1495-505 (1992); y Spencer y colaboradores, Plant. Mol. Bíol. 24:51-61 (1994) . Esta invención se puede entender mejor con referencia a los siguientes ejemplos no limitativos. Será apreciado por aquellos expertos en la técnica que otras modalidades de la invención se pueden llevar a la práctica sin apartarte del espíritu y alcance de la invención como es descrito y reivindicado en la presente. EJEMPLO 1 Materiales y métodos Material de Planta Líneas endogámicas de maíz (Zea mays L.) fueron ya sea de las colecciones públicas o de la colección de Pioneer ' Hi-Bred International, Inc. (TABLA 1) . Las cruzas reciprocas entre las lineas endogámicas se hicieron en el campo en 1998 para producir dos conjuntos de híbridos: B73/Mol7 y Mol7/B73; SSS1/NSS1 y NSSl/SSSl. El tejido de endosperma se recolectó en 10, 14 y 21 días después de la polinización (DAP) . Las mazorcas se recolectaron del campo y el tejido del endosperma se disectó de la mazorca en el laboratorio, se congeló inmediatamente en N2 líquido y se almacenó a -80°C. Los materiales para la perfilación de mRNA todos se recolectaron en 1998. Debido al tejido limitado que queda después de la perfilación del mRNA, muestras de tejido adicionales se recolectaron en 2001 para el análisis de expresión de gen específico de alelos. TABLA 1 - Lista de Líneas Endogámicas1 Usadas para Producir Híbridos de Cruzas Recíprocas Línea Endogámica Características B73 Tallo Rígido Sintético de Iowa US Públicas (100%); tipo de diente amarillo (YD) de Reid Mol7 Cultivo Estable de Lancaster US (YD) Público (50%), Krug (50%) SSS1 Línea Pública de Tallo Rígido Sintético de Iowa (100%) . Tipo de diente amarillo (YD) de Reid NSS1 Tipo de tallo no Rígido Medio Maduro (YD) no relacionado con Mol , adaptación Central de US líneas endogámicas se cruzaron recíprocamente para producir los híbridos (B73/Mol7 y Mol7/B73) y (SSS1/NSS1 y NSS1/SSS1) y se autocruzaron para reproducir las líneas endogámicas . Aislamiento y perfilación del RNA El endosperma se molió a polvo fino en N2 líquido. El RNA total se extrajo usando el reactivo TriPure (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Poli-A+RNA se purificó del RNA total usando cuentas magnéticas de oligo (dT) (PerSeptive, Cambridge, MA) y se cuantificó mediante fluorometría . Poli-A+RNA luego se sometió al análisis GeneCalling como es descrito en Shimkets y colaboradores, NAT. Biotech. 17:798-803 (1999) ) . Brevemente, las siguientes etapas se involucraron en el proceso GeneCalling. El cDNA de doble hebra se sintetizó del mRNA y se digirió con 48 pares diferentes de enzimas de restricción (sitios de reconocimiento 6-bp) . Los adaptadores se ligaron con cDNA, luego se amplificó mediante PCR por 20 ciclos usando cebadores específicos del adaptador. Después del fraccionamiento de tamaño sobre un gel de electroforesis, los productos de PCR marcados con fluorescamina " (FAM) se cuantificaron mediante un escáner de láser. La intensidad fluorescente de los fragmentos de cDNA marcados con FAM es proporcionar a la abundancia del mRNA correspondiente expresado en el tejido dado. Los mismos 48 pares de cebadores de PCR se utilizaron para todas las muestras en este estudio, que cubre 80-85% de los genes expresados representados en la agrupación de mRNA del tejido analizado (Shimkets y colaboradores, supra) . Para cada par cebador, tres PCRs independientes se hicieron de una muestra de mRNA individual. Un trazo de compuesto se calcula en base a al altura pico promedio y la varianza de las tres reacciones de PCR de cada muestra (Shimkets y colaboradores, supra) . Una muestra de mRNA de cada genotipo se analizó (tres reacciones de PCR) , excepto para un genotipo en el cual se perfilaron tres replicas experimentales nueve reacciones de PCR) . Procesamiento de Datos Los datos del perfil de mRNA se obtuvieron para orígenes híbridos y endogámicos del endosperma de 10, 12 y 21 DAP. El pérfil de cada muestra consistió de aproximadamente 22,000 fragmentos de cDNA expresados que resultan de 48 pares de cebador de PCR. Un algoritmo primero se diseñó para probar la presencia de variaciones significantes entre las muestras debido al error sistemático en el proceso de perfilación de mRNA. La diferencia del nivel de expresión de cada fragmento de cDNA a través de todas las muestras se calculó y no se encontró error sistemático. Los datos se normalizaron basados en la suposición de que la mayoría de las transcripciones de un tipo de tejido dado permanecen sin cambio entre los genotipos. Puesto que las comparaciones fueron hechas dentro de las mismas etapas de desarrollo de diferentes genotipos, los datos se normalizaron a través de los genotipos de cada etapa del desarrollo. El número promedio de fragmentos de cDNA expresados que resultan de un par de enzimas de restricción fue de 450. La normalización en cada etapa de desarrollo por lo tanto se llevó a cabo con aproximadamente 324,000 puntos de datos de expresión desde cada etapa de desarrollo. Las comparaciones entre las réplicas experimentales del mismo genotipo indicaron que hubo poca variación de escalación después de la normalización. Los datos normalizados se almacenaron en una base de datos ORACLE8, donde varios análisis de datos se analizaron al usar Standard Query Languaje (SQL) . Selección de genes diferencialmente expresados Dos criterios de selección diferentes se utilizaron para seleccionar fragmentos de cDNA. Un método fue basado en el criterio de presente/ausente donde los fragmentos de cDNA estuvieron presentes en un origen pero ausentes en el nivel antecedente en el otro. La segunda selección estuvo basada en un criterio de corte de 2 veces caso en el cual los fragmentos de cDNA estuvieron presentes en ambos orígenes pero diferentes en por lo menos 2 veces en el nivel de expresión. Los perfiles de cuatro genotipos de endosperma se compararon en cada conjunto de híbridos: orígenes endogámicos AA/A y BB/B, e híbridos recíprocos AA/B y BB/A. El criterio de selección de presente/ausente se aplicó a los fragmentos de cDNA que están presentes en AA/A pero ausentes en BB/B, por ejemplo. Tales cDNAs individuales que representan el alelo A se seleccionan si están presentes a través de la transmisión maternal en el híbrido AA/B, pero no en el híbrido recíproco BB/A donde A es paternalmente transmitido. La misma estrategia se utilizó para seleccionar fragmentos de cDNA que representan el alelo paternal. La selección de corte de 2 veces es principalmente la misma como en la selección de presente/ausente excepto que un mínimo de diferencia de 2 veces en el nivel de expresión es usado en lugar del presente/ausente. La primera selección fue para aquellos cDNAs que tienen un mínimo de diferencia de 2 veces en el nivel de expresión entre los orígenes AA/A y BB/B. Además se seleccionaron cDNAs que tiene el mismo nivel de expresión en el híbrido (por ejemplo AA/B) como en el origen maternal (AA/A) , pero son diferentes por al menos 2 veces el híbrido recíproco BB/A donde A fue un alelo paternal . Análisis de expresión de gen específico de alelos El R A total se extrajo y se preparó usando los mismos protocolos como se ha utilizado para GenCalling. El RNA total luego se trató con Dnasa I (Invitrogen, Carlsbad, CA) . El cDNA de primera hebra se sintetizó usando SuperScriptII (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los cebadores específicos de genes se usaron para obtener el cDNA de cada origen endogámico mediante RT-PCR con Pwo polimerasa (Roche, Indianápolis, 1N) . Los productos de PCR luego se secuenciaron para identificar los polimorfismos de secuencia - de alelos entre las líneas endogámicas que permitiría la separación de los dos alelos párenteles en el sistema WAVE dhPLC (Transgenomic, Omaha, NE) . Se diseñaron cebadores en regiones consencuales entre los alelos parentales para eliminar la preferencia de amplificación a ya sea el alelo y para optimizar el amplicón para el análisis en el WAVE . La PCR de treinta ciclos se realizó con el cDNA de cada línea endogámica e híbrida. La PCR de treinta ciclos se eligió debido a que en número de ciclos menores ambos alelos no siempre fueron detectados. Los productos de PCR luego se sometieron al sistema WAVE dhPLC para la separación. Si una diferencia de tamaño mayor que 1% estuvo presente entre los dos alelos parentales para un gen dado, se realizó una separación basado en el tamaño bajo condiciones no desnaturalizantes (50°C) sobre el AVE. Si los productos de PCR de los dos alelos párenteles son del mismo tamaño y contienen polimorfismos de nucleótidos individuales (SNPs), las muestras se corrieron bajo condiciones parcialmente desnaturalizantes (detección de mutación) para permitir la separación de los picos o máximos homodúplex en las muestras híbridas. Cuando se utilizan condiciones parcialmente desnaturalizantes, las reacciones de PCR se calentaron a 25°C durante 5 min y se dejaron enfriar lentamente a 25 °C durante un periodo de 45 min con el fin de permitir el re-templado antes de correr las muestras sobre el WAVE. La temperatura óptima para la detección de mutación debe ser determinada empíricamente para cada secuencia de gen. Los trazos de. cromatograma para cada PCR se generaron mediante la detección de UV y las áreas pico o máximas se calcularon mediante el software WAVEMAKER (Transgenomic, Omaha, NE} . Análisis de expresión específica de tejido del gen de Meristemo No Apical (ZMAM) Tejidos de endosperma y embrión de núcleo de 16 DAP ' y tejido de óvulo de B73 se disectaron cuidadosamente bajo un microscopio para asegurar la contaminación no cruzada del tejido. Los tejidos de raíz, tallo, hoja, mazorca inmadura y espiguilla se colectaron de B73 en la etapa V12. El RNA de cada tejido se purificó y se trató con Dnasa. El tamaño de la- muestra utilizado fue de 1 g de RNA de cada tejido para RT-PCR. RT-PCR de 30 ciclos (protocolo como es descrito en lo anterior) se realizó usando los cebadores específicos del gen ZMNAM con cDNA con cada tipo de tejido. La RT-PCR del gen a-tubulina se realizó usando el mismo cDNA de cada tejido como un control de la calidad de cDNA y la robustés de PCR. Cada muestra de PCR luego se corrió sobre un gel que consiste de LE agarosa Seakem al 1% (BMA, Rockland, ME, USA) , 1 x TBE durante 90 min a 70 voltios y se manchó con bromuro de etidio. El marcador VIII de peso molecular (Roche,' Indianapolis, IN, USA) se utilizó para confirmar el tamaño délos genes amplificados. Calculó de la relación de H/P Con el fin de medir el nivel de expresión del híbrido El en . relación a los niveles parentales de un fragmento de cDNA correspondiente, se desarrolló la métrica con relación al Híbrido/Origen (H/P) . Debido a la naturaleza del endosperma el origen maternal contribuye dos dosis y el origen paternal contribuye a una dosis a la constitución genética. La expresión alelélica aditiva en el híbrido varía a un nivel de expresión promedio de AVE = (2Pfemenino + lPmascuiino) /3. Por lo tanto, para cada fragmento de cDMA que es diferente entre los orígenes, la desviación del nivel de expresión de híbrido real del promedio de los orígenes, como H = Fl - Ave primero se calculó y luego se .calculó la desviación de un origen (masculino) del promedio como P Pmasculino - Ave. La relación del H/P se usa para medir el nivel de expresión del híbrido con relación al promedio del nivel parental. Si el nivel de expresión del híbrido es igual al nivel de expresión promedio, entonces H = Fl — Ave = 0, que resulta en H/P = 0. Por lo tanto, un valor de cero de una relación H/P indica que el nivel de expresión en el híbrido es el mismo como el promedio de los orígenes y ajusta la expresión alélica aditiva predicha. Si la expresión del híbrido se desvía del nivel de expresión promedio y es desviada hacia el nivel de origen masculino, entonces los valores H = Fl - Ave y P = Pmasculino - Ave, serían ambos negativos o ambos positivos, dando por resultado un H/P > 0. Del mismo modo, H/P < 0 será obtenido si la expresión del híbrido es desviada hacia el nivel de origen femenino, donde los valroes H = Fl - Ave y P. = PmaScuiino - Ave, sería opuesto en signo, esto es, uno es negativo y el otro es positivo. Mientras que el signo de la relación H/P indica la dirección de la desviación, maternal o paternal, el valor absoluto de la relación H/P indica el grado de la desviación. Resultados Expresión de gen especifica del origen en el endosperma híbrido Con la tecnología GeneCalling, las diferencias del fragmento de cDNA entre los genotipos podría ser atribuida a dos fuentes: (1) expresión de mRNA diferencial y (2) polimorfismos de secuencia alélica (Shimkets y colaboradors, supra; Bruce y colaboradores, The Plant Cell 12:65-79 (2000) ) . Los híbridos recíprocos tienen la misma constitución genética y por lo tanto permite la identificación de fragmentos de cDNA correspondientes a genes diferencialmente expresados debido a la regulación específica del origen. Si un gen se expresa independiente de su parental de origen, los alelos parentales serían expresados que se expresen igualmente con una manera de dosificación de alelo en el híbrido sin considerar la dirección de la cruza. Por otra parte, si un gen es afectado por la fuente parental, la expresión alélica variaría dependiendo de la transmisión maternal o paternal. Al comparar los híbridos Fl recíprocos y sus orígenes, los fragmentos de cDNA correspondientes a un gen que es diferencialmente expresado cuando se transmiten maternalmente o paternalmente, ya sea presentes/ausentes o diferencia del nivel, fueron identificados. Análisis específico de alelo de la expresión de gen Tres fragmentos de cDNA que mostraron expresión específica del origen a un diferente grado en los perfiles de GeneCalling se aislaron y se secuenciaron para la verificación y caracterización adicional. Basado en la homología de secuencia de los cDNAs aislados con genes en bases de datos, se determinó que estos fragmentos de cDNA corresponden a un homólogo de maíz del Meristemo No-Apical (ZMNAM) (Tablas 2 y 3) . NAM se describió originalmente en Petunia y se mostró que es requerido para la formación de patrón en embriones y flores . Los embriones de Petunia que llevan la mutación NAM no lograron desarrollar un meristemo apical de retoño (Souer y colaboradores, supra) . Este gen aparece para ser un miembro de una familia de genes grande que son sugeridos que son factores transcripcionales importantes para el desarrollo de la planta (Souer y colaboradores, supra; Kikuchi y colaboradores, supra) . La proteina ZMNAM pertenece a una familia de factores de transcripción NAM como es mostrado por la alineación de la secuencia de aminoácidos de ZMNAM con NAM de Petunia y dos homólogos de arroz OSNAC1 y OsNAC2 (Figura 3) . Los dominios NAC son altamente conservados entre los miembros de la familia NAM/NAC (Kikuchi y colaboradores, 2000) . TABLA 2 - Secuencias ds Fragmentos de cDNA que Corresponden a ZMNAM cgzmi0a0309.2 (SEQ ID NO:1): GGTACCATCATGCCCCGGATTACTAAGACCAAACGACACACACATÁTACCAC ACATGCAATGATACAATGCATGTATATACTAGCACATGCATGCACACATATCT TACCGACTAGTTATTGCAGAAATATAGGAACCATGCAAATTTTCACAAAATGC AATGCAGATATAGTAGATATAACATGCATATTCATGCATTTGTCTCCAAACTC CATATCCACTTTTTCAGTACTTGTACTTCCATATGCCATCCATC cgzmi0a0319.2 (SEQ ID NO:2): GGTACCATCATGCCCCGGATTACTAAGACCAAACGACACACACATATACCAC ACATGCAATGATACAATGCATGTATATACTAGCACATGCATGCACACATATCT TACCGACTAGTTATTGCAGAAATATAGGAACCATGCAAATTTTCACAAAATGC AATGCAGATATAGTAGATATAACATGCATATTCATGCGAATTCATGCATTTGT CTCCAAACTCCATTTTCACTTTTTCAGTACTTGTACTTCCATAT
cgzmd0p0125.6 (SEQ ID N0:3): RGATCTCGTCGATGATGTCTGTGACCGGCCCAGGGTCCGCGACCACCACCA TAGAGATGGATGGCATATGGAAGTACAAGTACTGAAAAAGTGAAAATGGAGT TTGGAGACAAATGCATGAATTY
p0029.cdsaf13r.fis1 (SEQ ID 0.-4) CAAGAAGACGGCTGCGCCGGCATACCAGGTGGCCATGGCCGGTCCTGAGA
TGGATCAGAATCAGAACAACATTCCGGCCATCCCCATCCCCATGCCGCTGCA
GCTGCCACTGCCCGTGCCCATGCAGATGCAATTTCCCATCCTGCCAGATTTT
GCCATGGACCCGGTGGCCCCCTACTACCCCAACCCGAATGCCGGCGCGGG
GATGATGCCGCCTATGGCATTGGCAGGTATGGGTGGCGCCGGCGGGCTCC
AGATCAACGGCGCTCTGTTCGGCAATCCGGTGCCCGCGCCGCTGCCGATGA
ACTTCTACCACCACCAGATGGGCATGGGGGCAGCAGCTGGCCAGGTGGACA
TGGGGGCAGCGGCTGGCCAGATGGACATGGGAGCAGCTGGCGCTGGCGCT
GGCGGCTTCGACGTTGCAGCGCCGGAGAGTAGGCCGTCCTCGATGGTGTC
ACAGAAGGACGAACAGGCTAATGCCGCCGAGATCTCGTCGATGATGTCTGT
GACCGGCCCAGGGTCCGCGACCACCACCATAGAGATGGATGGCATATGGAA
GTACAAGTACTGAAAAAGTGGATATGGAGTTTGGAGACAAATGCATGAATAT
GCATGTTATATCTACTATATCTGCATTGCATTTTGTGAAAATTTGCATGGTTCC
TATATTTCTGCAATAACTAGTCGGTAAGATATGTGTGCATGCATGTGCTAGTA
TATACATGCATTGTATCATTGCATGTGTGGTATATGTGTGTGTCGTTTGGTCT
TAGTAATCCGGGGCATGATGGTACCCATACCTGGATTTACATCTGCTTGGTC
GTGCTGATGTTGTGTTGTAATTTGTAAAAAGCAGATTGAAGTTCGGTACAGTA
TATTATCGTGAACCTATAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA TABLA 3 - Resultados de BLAST con la SE ID N :
RESULTADOS DE BLAST DE LA SEQ ID NO: 4 ID Putativo Registro E EST gb|AA 11704.1 |AF345525_1 363 3-153 p0029.cdsafl3r (AF345525) Orfl [virus TT] ref |??_197328.1 |proteina 169 1.00E-41 p0113.cieah48h semejante a NAH (meristemo no apical) [Arabidopsis thaliana] gb|AAK11704.1 |AF345525_1 149 7.00E-36 p0029.cdsafl3r (Af345525) Orfl [virus TT] ref1NP_196385.1 | roteina 45 4.00E-09 cen3n.pk0191. a similar a NAM (meristemo no apical) [Aarabidopsis thaliana] El patrón de expresión de este gen en híbridos se ' verificó al utilizar el sistema WAVE dHPLC, que permite el análisis de expresión del gen especifico de alelos cuando un polimorfismo de secuencia de alelos resolvibles está presente entre los alelos. Ambos alelos parentales pueden ser visualizados simultáneamente y el nivel de expresión 'relativo de los alelos parentales en el híbrido fue medido. El gen en dos híbridos de diferentes antecedentes genéticos se examinó si se podría encontrar el polimorfismo de secuencia alélica resolvible. Las muestras de tejido de diferentes años para la etapa de desarrollo (14 ???) también se incluyeron como controles y en realidad resultados consistentes se observaron entre los años. Los patrones de expresión del gen en GeneCalling para un híbrido se muestra en la FIGURA 1. Los resultados de expresión específica de ¿lelos de la WAVE (FIGURA 2) fueron consistentes con aquel observado en GeneCalling. Puesto que los cebadores específicos de genes y la PCR de 30 ciclos se utilizaron en la RT-PCR para el análisis dHPLC como es comparado con los cebadores no específicos del gen y la PCR 20 ciclos usada en GeneCalling, el análisis de WAVE es más sensible que la perfilación de GeneCalling y el número de ciclos de PCR incrementado en WAVE por lo tanto subestima realmente las diferencias de expresión entre los alelos. Perfil de expresión de ZMNAM durante el desarrollo del endosperma La expresión de ZMNAM durante el desarrollo del núcleo se analizó usando el MPSS (Figura 5) . La técnica proporciona una profundidad y sensibilidad sin precedente de la detección de mRNA, incluyendo mensajes expresados muy bajos. El nivel de expresión (partes por millón, PPM) de un gen se determina por la abundancia de su rúbrica en la agrupación total . El gen ZMNAM se expresó por todo el desarrollo de endosperma, alcanzando un máximo de 25 DAP y no se detectó en el óvulo. Estos resultados también indican que el gen ZMNAM se expresó solamente después de que ocurre la fertilización .
El patrón de expresión confirmado es el patrón de expresión inscrito del homólogo ZMNAM. La relación del nivel de expresión de alelo maternal: alelo paternal se desvió de 2:1 (FIGURA 2 y TABLA 4). Mientras que los alelos maternalmente transmitidos fueron expresados, los alelos paternalmente transmitidos fueron casi silenciados por todas las etapas de desarrollo analizados. Los alelos paternalmente transmitidos se expresaron a un nivel muy bajo que podría ser escasamente detectado o visualizado con la RT-PCR de 30 ciclos y no podría ser detectado con la RT-PCR 20 ciclos. La expresión inscrita del gen ZMNAM se encontró en ambos híbridos examinados de diferentes antecedentes genéticos, sugiriendo la falta de especificidad del alelo. El patrón de expresión de inscripción de este gen se asemeja a los alelos inscritos del gen R, un factor de transcripción en la ruta de antocianina. Cuando R se usa como el origen femenino, la aleurona es coloreada sólidamente, cuando se usa como el origen masculino R es parcialmente silenciado y da origen a la pigmentación de aleurona moteada (Kermicle, supra) . El papel exacto del gen ZMNAM que es inscrito permanece para ser determinado. El significado biológico de la inscripción del gen en el endosperma no es bien entendido. Los genes inscritos conocidos que afectan el desarrollo del endosperma reportados hasta ahora son MEA, FIS2 y FIE en Arabidopsis (Grossniklaus y colaboradores, supra; Luo y colaboradores, supra} Chaudhury y colaboradores, Ann. Rev. Cell . Dev. Biol. 17:677-99 (2001)). Otros genes inscritos caracterizados en plantas no fueron esenciales para el desarrollo de la semilla (Kermicl.e, supra, Kermicle and Alienan, Development Suppl.:9-14 (1990=; Chaudhuri y Messing, supra; Lund y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 246:716-22 (1995); Vielle-Calzada y colaboradores, Genes & Dev. 13:2971-82 (1999)). Los miembros de la familia NAM se muestran que desempeñan papeles importantes en el desarrollo de la planta (Souer y colaboradores, supra; Kiluchi y colaboradores, supra) . La expresión del gen ZMAM apareció que es altamente especifica al tejido del endosperma basado en el análisis de Northern electrónico y la búsqueda de BL7AST en la base de datos EST pública. Los resultados del análisis de RT-PCR también indican que la expresión del gen ZMNAM es especifico del endosperma (FIF. 4) . Se ha sugerido que los representativos ancestrales hipotéticos de familias de genes y su patrón de expresión amplio pueden haber sido coadaptados para funciones especializadas, por ejemplo, los miembros de la familia del cuadro MADS se encuentran expresados en el endosperma y los gametos masculino y femenino en desarrollo en Arabidopsis (Alvarez-Buylla y colaboradores, The Plant J. 24:457-66 (2000); Lohe and Chaudhyry, Curr. Opin. Plant Biol. 5:19-25 (2002)). Resultados similares se reportaron con la familia de proteínas de repetición WD del maíz. Un miembro de los genes ZmRbAp (proteína asociada con retinoblastoma) es expresado durante el desarrollo del endosperma y también se expresa en el meristemo apical de retoño y el primordio de hoja del embrión (Rossi y colaboradores, Mol. Gen. Genomics 265:576-84 (2001) ) . En este estudio un nuevo gen inscrito, ZMNAM, se descubrió el cual no se ha descrito previamente en el maíz. Los resultados indicaron que ZMNAM fue regulado por la inscripción específica de genes en los genotipos examinados. ZMNAM es el segundo gen que se ha caracterizado en el maíz por exhibir inscripción específica de genes, el primero 1 que es FIE. Además, ZMNAM se expresó exclusivamente en el endosperma, por todo el desarrollo del endosperma y alcanzó el pico a 25 DAP . La expresión específica del endosperma de ZMNAM es consistente con la noción de que los genes inscritos son principalmente expresados en el endosperma (Alleman and Doctor, 2000; Haig and Westoby, 1989) . ZMNAM es un miembro de una familia de genes grande que se sugiere que son factores transcripcionales importantes para el desarrollo de la planta (Kikuchi y colaboradores, 2000; Souer y colaboradores, 1996) . Los dominios altamente conservados entre ZMNAM, NAC de arroz y las proteínas NAM de Petunia sugieren que el gen ZMNAM puede funcionar como un factor de transcripción (ver la Figura 3) . La expresión específica de gen del ZMNAM implica su papel importante como, un factor de transcripción putativo en el desarrollo de endosperma.
TABLA 4 - Relación de la Expresión de Alelo Paternal y Maternal en Relación a la Dosificación en el Endos erma1
La relación del alelo maternal a paternal (M/P) se calculó usando las áreas pico de alelos y se comparó con la relación predxcha de 2 maternal:! paternal de acuerdo con la expresión del gen de dosificación alélica. La relación promedio (promedio) y el arroz estándar (SE) basada en tres réplicas de los datos de WAVE dHPLC son mostrados. Todas las muestras se colectaron en 2001 excepto aquellas marcadas con "98" que fueron muestreadas en 1998. 2B=B73; M=Mol7, Sl=SSl, N1=NSS1 Secuencia Genómica del gen ZMNAM y dos islas CpG Para determinar la estructura genómica del gen ZMNAM, una copia genómica se secuenció del clon BAC (cromosoma artificial bacteriano) , identificado por la hibridación de bibliotecas de BAC con la sonda especifica de ZM AM a partir del 3'UTR (SEQ ID N0:1). Los Fragmentos genómicos de 3.8 kb se secuenciaron (SEQ ID NO: 5). Esto corresponde al segundo exón y 3'UTR del gen ZMNAM. La comparación del cDNA de longitud completa del ZMNAM con la secuencia genómica del arroz (cromosoma 1 del arroz, clon BAC:B119A06) sugiere que en monocotiledóneas este gen está compuesto de dos exones y un intrón. El gen ZMNAM está inscrito en el endosperma del maíz. La inscripción es un fenómeno del desarrollo en donde un gen en un gameto o cigoto est modificado de tal manera que la expresión preferencial de un alelo parental individual ocurre en los descendientes. Se ha planteado como teoría que las "islas CpG" presentes dentro del gen son sometidas a metilación, que ocasiona represión de un alelo (Stoger y colaboradores (1993) Cell 73:61-71) . Las islas CpG se definen como secuencias de 200 o más pares de bases con un contenido de GC mayor que 0.5 y un contenido de dinucleótido CpG observado-a-esperado mayor que 0.6 (Gardiner-Garden and Frommer (1987) J. Mol. Biol .196 : 261-282 ) . La regla de dos islas se postuló para los genes inscritos en mamíferos Onyango y colaboradores (2000) Genome Research 10:1697-1710. De acuerdo con esta regla dos o más islas CpG son aspectos característicos de los genes inscritos. El análisis de la estructura genómica del ZMN7AM revela dos islas CpG. La primera isla CpG está ubicada en el segmento 5r del cDNA (SEQ ID NO: 8) . La segunda isla CpG está ubicada corriente abajo de 3' UTR (SEQ ID NO:5) . Así el gen ZM AM sigue la regla de dos islas. Previamente un gen inscrito (Fiel) se identificó en el endosperma de maíz con dos islas CpG (Danilevskaya y colaboradores, (2003) Plant Cell, 15:425-438). El descubrimiento de las dos islas CpG dentro de las secuencias ZMNAM sugiere que los genes inscritos en las plantas están de acuerdo con la regla de dos islas para genes inscritos de mamíferos. Puesto que el ZMNAM es expresado específico al tejido del endosperma y a un alto nivel por todo el desarrollo del endosperma, el promotor de este gen puede ser usado para diseñar un gen que dirige la expresión muy específica en el tejido del endosperma. También, la naturaleza de inscripción específica del gen ZMNAM se puede utilizar para diseñar o modificar una expresión de gen de tal manera que es expresado solamente cuando se transmite del origen maternal. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes en esta especificación son indicativas del nivel de habilidad ordinaria en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patente son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como si . cada publicación o solicitud de patente individual fuera específicamente e individualmente indicada por referencia. La invención se ha descrito con referencia a varias modalidades y técnicas específicas y preferidas. Sin embargo, se debe entender que muchas variaciones y modificaciones se pueden hacer mientras que permanezcan dentro del espíritu y alcance de la invención.