FORMULACIONES DE DERIVADOS DE ANTRAQUINONA
Descripción de la invención La invención se refiere a nuevas formulaciones de derivados de antraquinona tales como AQ4N un agente bis-biorreductor con valor en el tratamiento del cáncer El mismo incluye las formas novedosas de sales de los derivados ae antraquinona WO-A- 91/05824 (National Research Development Corporation) describe un compuesto de la formula
en la cual Ri R2 R3 y R4 son cada uno seleccionados separadamente de hidrógeno X NH-A-NHR y NH-A-N (O) R ' " en donde X es hidroxi halógeno amino alcoxi de C% 4 o alcanoiloxi de C2 B A es un grupo alquileno de C con una longitud de cadena entre NH y NHR o N(0)R'R" de al menos 2 átomos de carbono y R R1 y R" son seleccionados cada uno separadamente de grupos de alquilo de Ci 4 y grupos ae hidroxialquilo de C2 4 y dihidroxialquilo de C2 4 en los cuales el átomo de carbono fijado al átomo de nitrógeno no lleva un grupo hidroxi y ningún átomo de carbono está substituido por dos grupos hidroxi o R1 y R" conjuntamente son un grupo
Reí 158213 alquileno de C2 e el cual con el átomo de nitrógeno al cual Dl y R" están fiados forma un grupo heterocíclico que tiene 3 a 7 átomos en el anillo el compuesto opcionalmence está en la forma de una sal aceptable fisiológicamente Un compuesto preferido dentro de esta formula general es el N-óxido AQ4N el cual normalmente poaría ser sintetizado por la oxidación de AQ4
AQ4 AQ4N AQ4N es en efecto un profármaco y la reacción inversa ocurre m vivo el metabolismo reduccor en las células del cáncer hipóxicas que dan el agente activo AQ¿ en su forma protonada El profármaco es relativamente no tóxico cuando se compara con el agente activo AQ4 haciéndolo particularmente atractivo para la administración como una substancia farmacéutica Sin embargo no proporciona fácilmente una forma cristalina y por lo tanto es deseable prepararlo y formularlo para la administración en la forma ae una sal El AQ4N hasta ahora ha sido reportado en la forma de una sal de diclorhidrato AQ4N 2HC1 Véase por e emplo J" Che Soc, Perkm Trans I, 1999 2755-2758 (Lee et al ) y WO-A-00/05194 (BTG International Limited) Sin embargo las investigaciones de la materia prima de AQ4N 2^C1 han demostrado cantidades significativas de una impureza de 1- amino-4-{[2- (dimetilamino) etiljamino} -5 8- dihidroxiantraquinona, denotada AQ la cual ha siao caracterizada por LCMS (por sus siglas en inglés)
Esta impureza puede ser formada por degradación de AQ4N y más significativamente muestra un nivel indeseable de citotoxicidad generalmente que es más elevada que aquella de la propia AQ4N Este nivel de citotoxicidad va a ser evitado en un compuesto el cual está propuesto para ser administrado en la forma de un profármaco relativamente no tóxico Aunque la degradación de AQMN es la ruca predominante un producto de degradación adicional de AQ*N bajo condiciones de solución ácida y acuosa neutral es el mono-N-óxido AQ4M
Se ha determinado que la sal de diclorhidraco AQ4N en solución acuosa típicamente proporciona un pH de alreaeaor de 2 a 3 Por ejemplo una solución 1 4 milimolar tiene un pH de 2 4 Se ha encontrado ahora que el problema anterior con la formación de la impureza puede ser reducido o evitado preparando formulando y administrando el compuesto de moao que durante la disolución en solución el pH de la solución esté en el intervalo de 5 a 9 Así de acuerdo con la presente invención se proporciona un compuesto de la fórmula (I)
en la cual A es un grupo alquileno de C con una longitud ae cadena entre NH y N(0)R'R" de al menos 2 átomos de carbono y R' y R" son cada uno seleccionados separadamente de grupos ae alquilo de Ci y grupos de hidroxialquilo ae C2 4 y dihidroxiLalquilo de C2 en los cuales el átomo ae carbono f i j ado al átomo de nitrógeno no lleva un grupo hiaroxi y ningún átomo de carbono está substituido por dos grupos hidroxi o R' y R" conjuntamente son un grupo alquileno de C2 6 el cual con el átomo de nitrógeno al cual R' y R" están fijados forma un grupo heterociclico que tiene 3 a 7 átomos en el anillo caracterizado porque el compuesto está formulaao de modo que durante la disolución en una solución acuosa el p1-de la solución esté en el intervalo de 5 a 9 Preferentemente , el compuesto es formulado de moao que durante la disolución en una solución acuosa el pH ae la solución esté en el intervalo de 6 a 8 Preferentemente el compuesto es formulado de moao que durante la disolución en una solución acuosa a una concentración de entre 0 1 y 100 mg/ml el pH de la solución esté en el intervalo especif icado Los compuestos ( I ) pueden ser utilizados en la forma de una sal aceptable fisiológicamente la cual será una sal de adición ácida con un ácido orgánico o inorgánico Preferentemente , el ácido aceptable fisiológicamente tiene una „ en el intervalo de -3 0 (menos 3 0) a 9 0 y más preferentemente en el intervalo de 2 0 a 9 0 Más preferentemente el ácido aceptable fisiológicamente tiene una pKi en el intervalo de 2 0 a 6 0 Preferentemente, el ácido aceptable f isiológicamente es seleccionado del grupo que consiste de acido tartárico ácido malomco ácido dicloroacét ico ac.ao cí trico ácido maleico cido bencenosul fónico áciao pimél ico y ácido acét ico Más preferentemente , el ácido aceptable fi siológicamente t iene una pK¾ en el intervalo de 3 0 hasta 6 0 El acido aceptable fisiológicamente puede ser especialmente un acido orgánico particularmente un mono- di- o tn -ácido orgánico y especialmente uno seleccionado del grupo que consiste de ácido tartárico ácido cítrico acido pimélico y acido acético A en la fórmula ( I ) puede ser rami f icado pero es convenientemente un grupo de alqui leno de cadena recta es decir tetramet ileno especialmente trimet i leno o particularmente et ileno R ' y R" también puede tener una cadena de careónos ramificada pero son convenientemente cadenas rectas si los mismos son grupos alquilo o grupos alqui lo substituidos cor hidroxi Cuando R ' o R" es un grupo ironohidroxialquilo este esta substituido terminalmente de manera conveniente y cuando R' o R" es un grupo dihidroxialquilo éste está substituido terminalmente ae manera conveniente por uno de los grupos hidroxi Cuando R1 y R" son alqu_lo la preferencia es para un grupo de tres o especialmente dos o un átomo de carbono y cuando R ' y R" son alquilo substituido con hidroxi la preferencia es para el grupo alqui lo que va a ser de tres átomos de carbono o en el caso de un grupo de monohidroxialquilo alternat ivamente de dos átomos ae carbono Los ejemplos de los grupos individuales preferíaos de R' y R" son CH3 CH2CH3 CH2CH2CH3 CH2CH2OH CH2O2Cr20n CH(CH3)CH2OH y CH2CHOHCH2OH R' y R" mas usualmente serán idénticos Al ernativamente, como está indicado R' y °" junco con el átomo de nitrógeno al cual los mismos están fijaaos p eae representar un grupo heterocíclico -N(CH2)n en donde n es 2 a 6 es decir aziridin-1-ilo azetidin-1-ilo pirrolidin-1-ilo piDeridin-i-ílo y perhidroazepin-1-ilo los grupos más pequeños tales co o azetidin-l-ilo y especialmente aziridin-1-ilo son de más ínteres Los grupos H-A- (O) R 1 R" específicos de ínteres particular son H- (CH2) 2-N (O) (CH3)C2H5 NH- (CH2) 2-N (O) (C2-a) 2 NH- (CH2) 2-N(0) (CH2CH2OH) 2 NH- (CH2) 2-N (O) (CH2CH2CH20ri) 2 N>- (CH2)2-N(0) (CH(CH3)CH2OH)2/ NH- (CH2) 2-N (O) (CH2CHOHCH2O 2 y especialmente NH- (CH2) 2-N (O) (CH3) 2 La sal fisiológicamente aceptable cuando es disuelca simplemente en la solución acuosa dará normalmente una solución que tiene un pH inferior que el intervalo deseado Por ejemplo la sal ae acetato de AQ4N en una solución acuosa de la solución 1 4 mili olar tiene un pH de 3 8 Así preferentemente el compuesto es formulaao en una mezcla que contiene componentes adicionales de modo que atirante la disolución en una solución acuosa el pH de la solución sea amortiguado para que esté en el intervalo de 5 a 9 Un amortiguador es una mezcla solvatada de la sal y el ácido el cual se opone a los cambios en el pH cuanao son agregadas cantidades pequeñas de ácidos y bases a la solución Los amortiguadores adecuados incluyen el amortiguador de acetato de sodio y el amortiguador ae ortofosfato de sodio De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención se proporciona una solución acuosa de un compuesto de la fórmula (I) , caracterizado porque el pH ae la solución está en el intervalo de 5 a 9 Ciertas nuevas formas de sal pueden ser uc_l-zadas en la presente invención Si las mismas son sales ae un áciao que tiene una pKa más elevada que aquella ael acido clorhídrico (aproximadamente -6 es decir menos 6) enconces las mismas serán más fáciles de formular como una mezcla sólida que contiene componentes adicionales los cuales amortiguan el ?*< cuanoo están en solución acuosa cuando se compara con la sal de diclorhidrato puesto que las mismas son menos acidas Así, de acuerdo con un aspecto adicional ae la presente invención se proporciona un compuesto de la formula
en la cual A es un grupo alquileno de C con una longitua de cadena entre H y N(0)R'R" de al menos 2 átomos de carbono y R 1 y R" son cada uno seleccionados separadamente de grupos alquilo de Ci 4 y grupos hidroxialqui lo de C2 4 Y dihidroxialquilo de C2 4 en los cuales el átomo de carbono f i j ado al átomo de nitrógeno no lleva un grupo hidroxi y ningún átomo de carbono está substituido por dos grupos hidroxi o R 1 y R" conjuntamente son un grupo alguileno de C2 s el cual con el átomo ae nitrógeno al cual R1 y R" están fijados forma un grupo heterocíclico que tiene 3 a 7 átomos en el ani l lo caracterizado porque el compuesto está en la forma de una sal con un ácido aceptable fi siológicamente que t iene una pKa en el intervalo de -3 0 (menos 3 0 ) hasta 9 0 Preferentemente el ácido aceptable f i siológicamente t iene una pKa en el intervalo de 2 0 nasta 9 0 Más preferentemente , el ácido aceptable f isiológicamente tiene una pKa en el intervalo de 2 0 hasta 6 0 Las sales en general podrían ser capaces ae ser formadas como sales anhidras y pueden ser mas estables como sól idos cristal inos que con respecto a la sal ae diclorhidrato que podría tener agua de cristalización presente Las sales podrían ser fáciles de obtener en la forma pura Los compuestos ( I ) serán ut il i zados en la forma ae una sal f isiológicamente aceptable la cual será una sal ae adición ácida con un ácido orgánico o inorgánico Los ácidos fisiológicamente aceptables que tienen una pKa en el intervalo de -3 0 hasta 9 0 pueden ser distinguidos de la siguiente Tabla 1 Tabla 1 valores de pKa de algunos ácidos comunes
Preferentemente el ácido acepcaole fisiológicamente es seleccionado del grupo que consiste ae acido tartárico ácido malónico ácido dicloroacetico áciao cítrico ácido maleico ácido bencenosulfónico ácido pimélico y ácido acético Más preferentemente el acido acepcaole fisiológicamente tiene una pKa en el intervalo de 3 0 a 6 0 El ácido aceptable fisiológicamente puede ser especialmente un acido orgánico particularmente un mono- di- o cri-áciao orgánico y especialmente uno seleccionado del grupo crue consiste de ácido tartárico ácido cítrico ácido p_mélico y acido acético A en la fórmula (I) puede ser ramificado pero es convenientemente un grupo alquileno de cadena recta es aecir tetrametileno especialmente trimetileno o particularmente etileno R' y R" también puede tener una cadena de carbonos ramificada pero son convenientemente cadenas rectas si los mismos son grupos alquilo o grupos alquilo substituíaos con hidroxi Cuando R' o R" es un grupo monohidroxialquilo este está substituido termmalmente de manera conveniente y cuando R' o R" es un grupo dihidroxialquilo este está substituido termmalmente de manera conveniente por uno de los grupos hidroxi Cuando R' y R" son alquilo la preferencia es para un grupo de tres o especialmente dos o un átomo de carbono y cuando R 1 y R" son alquilo substituido con hidroxi la preferencia es para el grupo alquilo que va a ser de eres átomos de carbono o en el caso de un grupo de monohidroxialquilo alternativamente de dos átomos de carbono Los ejemplos de los grupos individuales preferíaos R' y R" son CH3 CH2CH3 CH2CH2CH3 CH2CH2OH Ch2Cn2Ch2Oh CH(CH3)CH2OH y CH2CHOHCH2OH R1 y R" mas usualmente serán idénticos Alternativamente como está indicado R' y R" junco con el átomo de nitrógeno al cual los mismos están fijados puede representar un grupo heterocíclico -N(CH2)n en donde n es 2 a 6 es decir aziridin-1-ilo azetiain-i-ilo pirrolidm-l-ilo piperidm-l-ilo y perhidroazepm-l-ilo los grupos más pequeños tales como azetidm-l-ilo y especialmente aziridin-1-ilo son de más interés Los grupos NH-A-N(0)R'R" específicos de ínteres particular son NH- (CH2) 2-N (O) (CH3) C2H5 NH- (CH2) 2-N (O) (C2H3) 2 H- (CH2) 2-N(0) (CH2CH2OH) 2 NH- (CH2) 2-N (O) (CH2CH2CH2OH) 2 NH- (CH2)2-N(0) (CH(CH3)CH2OH)2 NH- (CH2) 2-N (O) (CH2CH0HCH20ri) 2 y especialmente NH- (CH2) 2-N (O) (CH3) 2 La sal con un ácido aceptable fisiológicamente puede ser preparada por cualquier medio convencional por ejemplo por reacción de la base orgánica (I) con el ácido orgánico o inorgánico apropiado usualmente por mezcla simple en solución Las sales de adición acida son generalmente sólidos cristalinos los cuales son relativamente solubles en agua metanol etanol y solventes semejantes Una forma ae sal también puede ser convertida en otra por cromatografía utilizando una columna la cual ha sido pre-trataaa con el ácido aceptable fisiológicamente Los compuestos (I) pueden ser formulados con un diluyente o portador aceptable fisiológicamente para su uso como substancias farmacéuticas para uso tanto veterinario como humano particularmente por una variedad de métoaos Por ejemplo los mismos pueden ser aplicados como una composición que incorpora un diluyente o portador líquido por ejemplo una solución suspensión o emulsión acuosa la cual pueae ser empleada frecuentemente en una forma inyectable para administración parenteral y por lo tanto puede ser convenientemente estéril y libre de pirógenos La administración oral también puede ser utilizada y aunque las composiciones para este propósito pueden incorporar un diluyente o portador líquido es más usual utilizar un sólido por ejemplo un material portador sólido convencional tal como almidón lactosa dextrina o estearato de magnesio Tales composiciones sólidas pueden tomar la forma de pol-zos pero son más convenientemente de un tipo formado por ejemplo como tabletas sellos o cápsulas Alternativamente los tipos más especializados de la formulación incluyen los liposomas y nanoparticulas Otros tipos de administración además del conociao por inyección o a través de la ruta oral que son de uso tanto en los contextos humano como veterinario, incluyen el uso ae supositorios o pésanos Otra forma de comoosicion farmacéutica es una para administración bucal o nasal o alternativamente gotas para administración en el 030 las cuales pueden contener convenientemente un diluyence o portador líquido estéril Otras formulaciones para administración tópica incluyen lociones ungüentos cremas geles y soluciones para rociado Las composiciones pueden ser formuladas en la forma de dosificación unitaria es decir en la forma de porciones discretas que contienen una dosis unitaria o un múltiplo o sub-unidad de una dosis unitaria Aunque la dosificación del compuesto utilizado variará de acuerdo con la actividad del compuesto particular y la condición que es tratada se puede establecer a manera de guía que una dosificación seleccionada en el intervalo desde 25-500 mg/m2 por día particularmente en el intervalo desde 50-300 mg/m2 por día frecuentemente será aaecuaaa aunque dosis más elevadas que esta por ejemplo en el intervalo desde 25-750 mg/m2 por día o aún dosis hasta 1200 mg/m2 pueden ser consideradas en vista del nivel inferior de los efectos laterales tóxicos obtenidos con los compuestos (I) Este régimen de dosificación podría ser continuado sin embargo durante muchos días si es apropiado para el paciente en cuestión y las dosificaciones diarias son divididas en varias administraciones separadas si se desea Así por ejemplo en el caso de las condiciones tales como cáncer de pecho avanzaoo el linfoma no Hodgkin y hepatoma el tratamiento durante un día seguido por una dosis repetida después de un intervalo tal como 21 días puede ser apropiado mientras que para el tratamiento ae la leucemia no linfocítica aguda, el tratamiento durarte 5 días consecutivos puede ser más adecuado Alternativamente las administraciones únicas espaciadas por varios días por ejemplo una dosis cada dos o tres semanas, pueden ser utilizadas Los compuestos (I) son de valor particular para el tratamiento del cáncer en animales de sangre caliente incluyendo los seres humanos Los compuestos son de interés con relación al tratamiento de tumores sólidos tales como varias formas de sarcoma y carcinoma y también para tumores diseminados tales como leucemias Las áreas de interés particular son el tratamiento del cáncer de pecho cáncer de pulmón cáncer de próstata cáncer pancreático y cáncer esofágico y el tratamiento del linfoma no Hoagkin y la leucemia no linfocítica aguda En el tratamiento del cáncer la administración parenteral y algunas veces tópica es frecuentemente de interés particular Sin embargo pueae ser ventajoso utilizar los compuestos (I) en un tratamiento combinado dado de manera separada o conjunta en la misma composición con otros agentes anticáncer tales como inhibidores mitoticos por ejemplo vinblastina agentes alquilantes por ejemplo cisplatma carboplatina y ciclofosf amida otros antimetabolitos por ej emplo 5 -f luorouracilo citosina arabinosida e hidroxiurea antibióticos de intercalación por e errólo adriamicina y bleomicina, enzimas por ejemplo asparagmasa inhibidores de topoisomerasa por ejemplo etoposiaa y modif icadores de la respuesta biológica por ejemplo mterferón Los compuestos (I) también pueden ser utilizaaos en el tratamiento combinado con terapia de radiación del tumor La presente invención incluye así un metoao para ayudar a la regresión y alivio del cáncer que comprende administrar a un paciente una cantidaa efectiva terapéuticamente de un compuesto ( I ) como se definió aquí anteriormente Además de su uso anti-cáncer los compuestos ( I ) son de interés para varias otras aplicaciones f armaceut.cas en vista de su actividad como agentes quelantes La invención es ilustrada por las sigúierces Figuras en las cuales - la Figura 1 muestra el primer derivado ael pH contra el pH en una solución de diclorhidrato de AQ4N la Figura 2 muestra el primer derivado ael pH contra la equivalencia molar de NaOH baj o las mismas condiciones la Figura 3 muestra el incremento en AQM sobre el tiempo de incubación en soluciones de 5 mg/ml incubadas a 40 °C durante 14 días la Figura 4 muestra el incremento en AQMN sobre el tiempo de incubación en soluciones de 5 mg/ml incubadas a 40 °C durante 63 días la Figura 5 muestra la reducción en AQ4N sobre el tiempo de incubación en soluciones de 5 mg/ml incubadas a 40 °C durante 14 días la Figura 6 muestra la reducción en AQ4N sobre el tiempo de incubación en soluciones de 5 mg/ml incubadas a A0 °C durante 63 días la Figura 7 muestra el método formal utilizado para preparar las sales de AQ4N y la Figura 8 muestra los ácidos orgánicos utilizados para preparar las sales de AQ4N Ejemplos Ejemplo 1 Demostración de la inestabilidad del diclorhidrato de AQ4N - propiedades físico-químicas de AQ4N Los cambios en el pH de una solución de diclorhidrato de AQ4N fueron verificadas para demostrar la degradación de AQ4N en AQMN Las curvas de pH son mostradas en las Figuras 1 y 2 La Figura 1 muestra una disociación clara entre pH 7 7 y pH 9 4 y esto iguala a los eventos de disociación mostrados en la Figura 2 en una equivalencia molar oe aproximadamente 2 Un evento de disociación de ph bajo Dueae ser observado, especulativamente asignado a un ph entre £ i y 4 6 en donde la equivalencia molar esta entre 0 95 v 1 i5 Ejemplo 2 Demostración de la citotoxicj-dad de ¾QMN i La toxicidad de una muestra pura (99 3%) en el sistema P388 de AQ4N y AQMN fue determinada y los resultaaos obtenidos son presentados en la Tabla 2 Tabla 2 Valores de citotoxicidad de AQ4N y QMN
Basado en estos datos, AQMN tiene una citoxicaad la cual es al menos 5 veces mayor que aquella de AQ¿N en el I} mismo sistema El modificador 'mayor que" es reoueriao Duesco que todas las muestras de AQ4N contienen porcentajes substanciales de AQMN, que afectaran el resultaao ae toxicidad Ejemplo 3 Demostración de la inestabilidad ael diclorn_Qrato 0 de AQ4N en solución - acumulación de AQMN La degradación de AQ4N fue investigada utilizanao soluciones de 5 mg/ml de AQ4N a un pH de 2 , 4 5 y 6 8, las cuales se igualaron con el agua, amortiguador de acetato de sooio 20 mM y amortiguador de ortofosfato de sodio 20 mM, respectivamente La 5 ruta de degradación primaria de AQ4N es su conversión a ¾QMN El incremento en la concentración de AQMN en soluciones ae 5 mg/ml incubadas a 40 °C durante un periodo ae t.enroo intermedio (14 días) es mostrado en la Figura 3 Las velocidades de degradación son iguales a los incrementos de 0 84 (w r t AQ4N) , 0 19% (w r t ¾Q£i*i) y 0 02% (w r t AQ4N) en el contenido de AQMN por día bajo estas condiciones Utilizando la regresión lineal y la correlación cruzada con la cantidad conocida de AQMN en el mater_al utilizado como un estándar, estos datos indican las velocidades de acumulación de AQMN presentadas en la TaDla 3 Tabla 3 Acumulación de AQMN
Se observo una tendencia semejante en los aatos después de 63 días, como se muestra en la Figura ¿ La velocidad de acumulación (calculada de la misma manera oue anteriormente) muestra que en el amortiguador de fosfato el AQMN se incrementa en 0 6% por mes Ejemplo 4 Demostración de la inestabilidad del diclomidraco de AQ4N en solución - degradación de AQ¿N El efecto del pH sobre la estabilidad de AQ¿N fue determinado investigando la degradación de AQ4N en deferentes soluciones Las soluciones elegidas fueron nuevamente agua destilada amortiguador de acetato de sodio 20 mM (ph = ¿) y amortiguador de fosfato de sodio 20 mM (pH = 7) Después ae la preparación de las soluciones amortiguadas de AQ4N ae 5 mg/ml el pH fue corregido al pH requerido del amortiguador Los pHs finales fueron 2 4 4 5 y 6 8 para el agua destilada amortiguador de acetato de sodio 20 mM y amortiguador ae fosfato de sodio 20 mM, respectivamente Las muestras fueron incubadas a 40 °C y se muestrearon a intervalos regulares El ensayo fue llevado a cabo por dilución ae la muestra seguido por el análisis de CLAR Después de 14 días se llevó a cabo un análisis interno con los datos que son mostrados en la Figura 5 Las soluciones fueron incubadas adicionalmente a ?0 °C durante un total de 63 días La gráfica final es mostrada en la Figura 6 Los valores obtenidos para los conteníaos ae AQ4N son consistentes con las cantidades de AQ4N pesadas en las muestras originales {dentro del error experimental) Ejemplo 5 Síntesis de algunas sales de ácidos orgá icos ae AQ4N Una serie de sales de adición ácida orgánicas de
AQ4N fue preparada como se muestra formalmente en la Figura 7 y su estabilidad con respecto a la formación de AQM fue determinada La elección del método para la síntesis ae las sales de AQ4N estuvo limitada por la alta solubilidad ae la base libre de AQ4N en los solventes polares La síntesis ae sales de adición del ácido malonico cítrico tartárico ae AQ4N fue intentada ínicialmente agregando una solución acuosa (1M) del ácido orgánico seleccionado a una solución de la base libre de AQ4N en una mezcla acuosa/solvente polar tal como H20/CH3CN (1 1) o H20 con una cantidad mínima de DMSO Después de agitación durante 2 horas las mezclas de reacción fueron enfriadas a 4 °C para facilitar la precipitación Sin embargo ningún sólido fue observado después de 7 aías El trabajo subsiguiente utilizó MeOH como un solvente que disuelve fácilmente tanto el AQ4N como todos los aciaos orgánicos En todos los casos excepto en la preparación ael ácido bencenosulfónico, el AQ4N fue agregado a un exceso ae 20 veces del ácido orgánico y estas mezclas fueron dejadas durante 14-24 horas a temperatura ambiente y luego a -10 °C para ayudar a la preparación Si se observa muy poco o nada de material sólido se agrega éter dietílico a la mezcla para facilitar la precipitación Ejemplo 6 di -bencenosulfonato de AQ4N El AQ4N (36 mg 0 081 mmol) fue disuelto en MeOr- (5 mi) y se agitó durante 5 minutos Se agregó ácido bencenosulfónico (25 66 mg, 0 162 mmol) disuelto en 1 mi ae MeOH a la solución agitada de AQ4N La mezcla de reacción fue agitada durante media hora y el sólido precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacío en un desecador durante 16 horas Rendimiento 45 mg 76 % Anál Cale para C^ON-JOI^S C 560* h 5 53 N 7 69 Encontrado C 55 80, H 5 35 N 9 30 Ejemplo 7 di-cloroacetato de AQ4N El AQ4N (10 mg 0 023 mmol) se disuelve en MeOn (i mi) y se agita durante 5 minutos Se agrega áciao dicloroacético (38 µ?, 0 46 mmol) a la solución agitada ae AQ4N La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 16 horas -10 °C El sóliao precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacío en un desecador durante 16 horas Rendimiento 46 % Anal Cale para C26H32 4O10CI4 C 44 46 H 4 59 N 7 98 Encontrado C 44 58 H 4 61 N 7 91 Ejemplo 8 di-maleato de AQ4N El AQ4N (10 mg 0 023 mmol) se disuelve en MeOh (1 mi) y se agita durante 5 minutos El ácido maléico (53 ¿ mg 0 46 mmol) en MeOH (1 mi) fue agregado a la solución agitaaa de AQ4N La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 16 horas a -10 °C El sólido precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacío er un desecador durante 16 horas Rendimiento 7 mg 47% Anal Cale para C3oH36N4014 C 53 24 H, 5 32 N 8 28 Encontrado C 53 11 H 5 46 N 8 20 Ejemplo 9 di-malonato de AQ4N El AQ4N (10 mg 0 023 mmol) se disuelve en MeOn (1 mi) y se agita durante 5 minutos El ácido malónico (47 9 mg 0 46 mmol) en MeOH (1 mi) fue agregado a la solución agicaaa de AQ4N La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 24 horas a -10 °C El solado precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacío en un desecador durante 16 horas Rendimiento 8 2 mg 55 % Anal Cale para C28H36N4Oi4 C 51 53 H 5 56 N 8 59 Encontrado C 51 67 H 5 56 N 8 74 Ejemplo 10 di-tartrato de AQ4N El AQ4N (10 mg 0 023 mmol) se disuelve en MeOH (i mi) y se agita durante 5 minutos El ácido tartárico (69 1 mg 0 46 mmol) en MeOH (1 mi) fue agregado a la solución agitada de AQ4N La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 16 horas a -10 °C El sólido precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacio en un desecador durante 24 horas Rendimiento 8 5 mg 50 < Anal Cale para C3oH40 4018 C, 48 39 H 5 41 N 7 52 Encontrado C 48 34 H 5 41, N 7 67 E emplo 11 di -citrato de AQ4N El AQ4N (10 mg 0 023 mmol) se disuelve en MeO1- (1 mi) y se agita durante 5 minutos El ácido cítrico (88 ? mg, O 46 mmol) en MeOH (1 mi) fue agregado a la solución agitaaa de AQ4N La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 16 horas a -10 °C Se agrega éter (2 mi) a la mezcla de reacción y se deja reposar a -10 °C durante otras 3 horas El sólido precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secaao soore pentoxido fosforoso bajo vacío en un desecador durante 2¿ horas Rendimiento 7 1 mg 37 - Anal Cale para C^ ^ o C 49 28 H 5 10 N 6 65 Encontrado C 49 59 H 5 09 N 6 6¿ Ejemplo 12 di-lactato de AQ4N El AQ4N (10 mg 0 023 mmol) se disuelve en MeOb (1 mi) y se agita durante 5 minutos El ácido láctico (35 µ? 0 46 mmol) fue agregado a la solución agitada de AQ*N La mezcla de reacción se agita durante 1 hora a temperatura ambiente seguido por 16 horas a -10 °C Se agrega éter (2 mi) a la mezcla de reacción y se deja reposar a -10 °C durante otras 3 horas El sólido precipitado fue aislaao Dor filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentoxido fosforoso bajo vacío en un desecador durante 24 horas Rendimiento 4 5 mg 31 * Anal Cale para C28H40N O12 C 53 8¿ ri 6 45 N 8 97 Encontrado C 51 54 H 6 24, N 8 89 Ejemplo 13 di-pimelato de AQ4N El AQ4N (10 mg, 0 023 mmol) se disuelve en MeOI- (1 mi) y se agita durante 5 minutos El ácido pimélico (73 7 mg 0 46 mmol) en MeOH (1 mi) fue agregado a la solución agitada de AQ4N La mezcla de reacción se agita durante i ñora a temperatura ambiente seguido por 14 horas a -10 °C El sóliao precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacxo en un desecador durante 24 horas Rendimiento 8 2 mg ¿7 % Anal Cale para C36H52N4Oi4 C 56 80 H 6 80 N 7 34 Encontrado C 56 49 H 6 41, N 8 46 Ejemplo 14 di -acetato de AQ4N El AQ4N (70 mg 0 158 mmol) se disuelve en eC (1 mi) y se agita durante 5 minutos El acido acético (183 ul 3 16 mmol) en eOH (1 mi) fue agregado a la solución agicaaa de AQ4N La mezcla de reacción se agita durante i hora a temperatura ambiente seguido por 18 horas a -10 °C Se agrega éter (3 mi) a la mezcla de reacción y se deja reposar a -10 °C durante otras 3 horas El sólido precipitado fue aislado por filtración El sólido azul oscuro fue secado sobre pentóxido fosforoso bajo vacío en un desecador durante 24 horas Rendimiento 68 mg 76 - Anal Cale para C26H36 4Oio C, 55 31 H 643 1M 9 92 Encontrado C 55 28 H 6 57 N 9 91 Ejemplo 15 Determinación del pH de la sales de áciaos orgánicos de AQ4N en solución acuosa a 37 °C Las soluciones en almacenamiento de las sales de AQ4N individuales fueron preparadas transíirienao aproximadamente 1 mg pesado exactamente y diluyendo con agua para obtener las soluciones de 1 4 mM La solución fue agitada en forma de remolino durante 3 minutos utilizando un aparato Fisons WhirlMixer™ (Loughborough, Leicescers~>ire, U ) Todas las soluciones de la sal de AQ4 N fueron preDaradas el mismo día que la determinación del valor del p1- de las soluciones, la cual se hizo utilizando un medidor oe pl· digital (calibrado a 2 1 + 1 CC con amortiguadores estancares de pH 7 00 y 4 00 de BDH (UK) ) La Tabla 4 y la Figura 7 muestran los nueve acioos orgánicos utilizados para preparar las sales de ¾Q¿N en orae" creciente de valores de p ai Tabla 4 pKaÍ de los ácidos utilizados para preparar las sales de AQ4 N y el pH resultante de las soluciones acuosas
pH medido de las soluciones de di sal de AQ4N (1 4 mM)
Los datos de pKa son de IUPAC Hanaoook of Pharmaceutical Salts, Properties, selection and Use , Hemrich Stahl, Camille G Wermuth (Eds ) V4CA verlag Helvitica Chimica Acta, Zurich & Wiley-VCH, Wemheim (DUDI adjunta) 2 002 Para comparación, la pKa para el acido clornidrico también esta incluida Los ácidos orgánicos utilizados para preparar las sales de AQ4N en este estudio fueron • Mono-ácido bencenosulfónico dicloroacé ico láctico acético • Di -ácido maleico malonico tartárico pimélico o Tn-ácido cítrico Las pKaS de estos ácidos son una medida del graao de ionización de cada porción ácida y por consiguiente reflejará su acidez como se mide por el pH La tabla ? muestra que el pH medido de las soluciones de la sal de AQ4N (1 mM) fue tan bajo como pH 2 4 y 2 5 para las sales ae bencenosulfonato y dicloroacetato respectivamente y pH 3 8 para las sales de acetato y pimelato Ejemplo 16 Determinación de la pureza de las sales ae ácidos orgánicos de AQ4N en solución acuosa a 37 °C La separación cromatográfica de las soluciones de la sal de AQ4N fue efectuada utilizando una fase móvil de gradiente y una columna HiChrom HIRPB (250 mm x 4 6 mm 5 µp (HiChrom Agilent Readmg UK P/N HIRPB-6294) alojado en un sistema de Calentador de Columna Flatron a 24 °C La fase móvil utilizada para la separación de gradiente de las sales de AQ4N consistió del sistema de solventes A (amortiguaaor de 5- de acetonitrilo 95s- de formiato de amonio (0 05M pH 3 6) y el sistema de solventes B (50* de acetonitrilo 50% de formiato de amonio (0 05M pH 3 6) El pH fue ajustado a 3 6 con ácido fórmico El gradiente fue extendido desde 20% ae la fase móvil A hasta 95^ de la fase móvil B durante 55 migú os Una velocidad de flujo de 1 3 mi min 1 fue utilizada para todas las separaciones Los datos fueron colectados utilizando ? = 612 nm y los datos fueron procesados utilizando el programa Waters Millennium32™ Las soluciones preparadas recientemente de las sales de AQ4N preparadas (1 4 mM) fueron sometidas a cromatografía dentro del intervalo de 30 mímicos de disolución Todas las sales de AQ4N se mostró que van a ser predominantemente AQ4N (mayor que 99s-) con menos del 1-6 del mono-N-óxido de AQ4M o AQMN Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención es el que resulta claro de la presente descripción de la invención