MXPA04005762A - Trombina recombinante de bovino. - Google Patents

Abstract

Se describe metodos para producir trombina recombinante a partir de moleculas precursoras que no requieren de activacion por el factor Xa. La proteina es producida a partir de celulas huesped transformadas o transfectadas con una construccion(es) de ADN conteniendo informacion necesaria para dirigir la expresion de precursores de trombina. Tambien se describen metodos para la purificacion de los precursores de trombina. Los precursores de trombina producidos a partir de celulas huesped transformadas o transfectadas son auto-activados o secretados en una forma activada.

Description

TROMBINA RECOMBINANTE DE BOVINO La presente invención se dirige de manera general hacia métodos para producir proteínas recombinantes, y de manera más específica, hacia métodos que producen trombina recombinante de bovino a partir de células huésped como moléculas precursoras las cuales pueden ser activadas sin el Factor Xa. La trombina es una proteasa de serina específica que es un miembro de la familia de enzimas como tripsina. Juega un papel central en la hemostasis y regula tanto las rutas de procoagulante como de anticoagulante (Fenton, J.W., Ann. N.Y. Acad. Sci., 370: 468-495, 1981). Como un factor en coagulación, la trombina cataliza la formación de fibrina insoluble iniciando por ello la cascada de coagulación de sangre. En el caso de anticoagulación, la trombina interactúa con trombomodulina en la superficie de las células endoteliales y esta interacción resulta en la activación subsecuente de proteína C (Esmon et al., J. Biol. Chem., 257:859-864, 1982). Además de sus papeles reguladores en la hemostasis, la trombina es conocida por interactuar con una amplia variedad de tipos de células. Estas interacciones conducen a un amplio rango de efectos que incluyen agregación de plaquetas, promoción de crecimiento, retracción de neuritas y respuesta quimiotáctica (Bizios, et al., J. Cell. Physiol., 128:485-490, 1986). La trombina es expresada y secretada como un zimógeno y circula como un precursor de protrombina inactivo. La enzima es activada a un estado funcional a través de una cascada que incluye un paso de procesam iento clave q ue involucra el corte de Factor Xa (Fig ura 1 ) . El producto final (?-trombina) de la cascada de activación es una "cadena A" de 36 residuos enlazada covalentemente a una "cadena B" de 256 residuos vía u n puente de disulfuro, (Fig ura 2). La trom bina también es conocida por poseer modificaciones post-traslacionales significativas . La forma activa de la proteína de suero posee un sitio de giicosilación N-enlazado simple, sin embargo la forma de protrombina contiene una porción de gi icosi lación ad icional, as í como, diez sitios para ?-carboxilación . Además de su papel como un regulador fisiológico clave, la trombina se ha vuelto u na enzima de elección para la industria de biotecnología. Esta proteasa es usada en sistemas de expresión microbianos comercialmente disponibles para corte de péptidos de fusión , así como, para remoción de purificación y "etiquetas" de ensayo. Las cualidades atractivas de esta proteasa se basan en su eficiencia catalítica y especificidad de sitio de corte. Esto es u n tanto sorprendente debido a que la trombina está relacionada con la tripsina, una proteasa de serina, la cual es conocida por cortar un amplio rango de substratos de pol ipéptidos. La trom bina es m ucho más específica que la tripsina y otros miem bros de esta fam ilia de proteasas de serina. La enzima reconoce la secuencia de cuatro aminoácidos LVP y otros numerosos sitios . En sistemas comerciales , la secuencia de corte LVPRGS es usada m uy frecuentemente.

La fuente actual de trom bina usada en procesos comerciales es derivada de plasm a bovino. Debido a que la trom bina es una enzima de elección para la industria de biotecnolog ía , se necesita un proceso de fabricación comercial más efectivo para cu mpl ir esta creciente demanda.

De manera importante, una forma recombinante de trombina es necesaria debido a las preocupaciones reguladoras que existen actualmente alrededor del uso de materiales de fuente animal (ASM's) en procesos de fabricación, debido al riesgo de encefalopatías espongiformes transmisibles (TSEs), y en particular, encefalopatía espongiforme bovina (BSE) o así llamada "enfermedad de vacas locas". De esta manera, exise la necesidad de una trombina recombinante producida de manera económica para resolver las preocupaciones reguladoras que rodean el uso de materiales de fuente animal (es decir, trombina bovina glandular) en procesos de fabricación y cumplir las crecientes demandas para esta enzima en la industria de biotecnología. La presente invención cumple estas necesidades al proporcionar dos moléculas precursoras de trombina, protrombina y pretrombina-2, las cuales, sobre activación, son esencialmente idénticas a la trombina derivada de animal en términos de características cinéticas y estabilidad enzimática a través de un rango de valores de temperatura y pH, pero no requieren activación por la proteasa de Factor Xa. De manera inesperada, la protrombina recombinante puede ser purificada y subsecuentemente auto-activada ¡n vitro, mientras que el precursor de pretrombina-2 es secretado y purificado como la enzima completamente activa. La presente invención proporciona un ácido nucleico aislado que codifica una molécula precursora de trombina recombinante de bovino, en donde dicha molécula precursora es una forma diseñada de protrombina y dicho ácido nucleico aislado es expresado en células CHO (SEQ ID NO:5) o células de E. colí (SEQ ID NO:1).

La presente invención proporciona además un ácido nucleico aislado que codifica una molécula precursora de trombina recombinante de bovino, en donde dicha molécula precursora es una forma diseñada de pretrombina-2 y dicho ácido nucleico aislado es expresado en células CHO (SEQ ID NO.7) o células de E. coli (SEQ ID NO:3). La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:6, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino protrombina y dicho polinucleótido es expresado en células CHO. La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:2, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino protrombina y dicho polinucleótido es expresado en células de E. coli. La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO.8, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino pretrombina-2 y dicho polinucleótido es expresado en células CHO. La presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica unpolipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:4, en donde dicho polipéptido es la molécula precusora de trombina recombinante de bovino pretrombina-2 y dicho polinucleótido es expresado en células de E. coli.

La presente invención proporciona además métodos para purificar dichas moléculas precursoras de trombina bovina y métodos para usar las mismas. Figura 1. Esquema de activación de protrombina. La trombina es una proteína de suero que es secretada (forma prepro no mostrada aquí) como una molécula precursora "forma pro" inactiva (protrombina). A través de la acción de trombina pre-existente y que circula libremente, así como Factor Xa, la molécula de protrombina es cortada para generar trombina completamente funcional y activa, la cual consiste de dos cadenas de péptidos (cadena A y cadena B, respectivamente que están enlazadas vía un enlace disulfuro simple. Los sitios de corte proteolítico son designados por r. La pretrombina-2 representa el precursor de cadena simple más pequeño de trombina. Figura 2. Estructura de trobmina recombinante con secuencias de activación tipo natural (Factor Xa). El dibujo muestra la proteína de 2 cadenas. La cadena "A" natural consiste de 36 aminoácidos (aquí mostrados como la "versión recombinante", la cual tiene 55 residuos). La cadena "B" consiste de 259 residuos de aminoácidos. Los enlaces disulfuro, residuos catalíticos y sitio de glicosilación son marcados como se describe en la casilla clave. Además, las estructuras genéricas de tres especies de trombina son mostradas en el lado derecho inferior de esta figura. Figura 3. Iniciadores diseñados para amplificar y modificar las secuencias de cDNA que codifican varios precursores de trombina. Figura 4. Modificaciones de cartucho de expresión de pretrombina-2 para expresión en E. coli. El cartucho de expresión com pleta (mostrado 5' a 3') fue amplificado como un fragmento Ndel a Bam H I . Las modificaciones internas fueron introducidas mediante PCR de mutagénesis de extensión de traslape (OEM) . Los cambios son notados mediante negritas y subrayado . Figura 5. Secuencia de aminoácidos derivada de traslación de la secuencia de n ucleótidos (para preptrotrom bi na) obtenida de la base de datos Genban k, pero q ue contiene cambios de aminoácidos determinados siguiendo la clonación del cDNA. Notar que existen tres cambios de aminoácidos encontrados en el gene clonado a partir de cD NA de hígado bovino comparado con la secuencia de bases de datos de Genbank. Estos cambios son notados en neg ritas en la fig u ra . La secuencia líder de 43 aminoácidos (o péptido de señal) está subrayada. La porción "pro" o péptido de "activación" (residuos #'s 44-314) de la molécula está en itálicas. Los sitios de g licosi lación N-en lazada putativa (residuos de asparagina) están en los residuos 144 y 41 9. Los sitios de corte de Factor Xa (activación natural) están subrayados con caligrafía ondulada. El asterisco ind ica el codón de paro . Los cambios de aminoácidos específicos observados son como sig ue: arginina 95 a lisina, histidina 230 a serina e histidina 248 a ácido aspártico. Figura 6. Construcciones iniciales para confirmar secuencias clonadas a partir de las cuales se derivan las secuencias de la presente invención. Figura 7. Secuencia de aminoácidos de cartuch o de expresión de pretrombina-2 recombinante activada por Factor Xa. Notar que los sitios de corte de Factor Xa están indicados por negritas. Figura 8. Secuencias enlazadoras de DNA de activación alternativas. El nucleótido y productos de traslación resultantes para cada adaptador de oligonucleótido son mostrados. Los adaptadores fueron clonados directamente en el esqueleto pSFH2250 como fragmentos SacI a Stul. Donde fue posible, los cartuchos de corte alternativos fueron distinguidos mediante la introducción de un sitio de restricción único para fines diagnósticos subsecuentes. Figura 9. Plásmidos de expresión - construcciones de expresión de activación alternativas de E. coli. Figura 10. Esqueletos de vectores de expresión y clonación bacterianos. Figura 11. Secuencia de asa de IMAC. Secuencias de asa de "etiqueta" para las adiciones de polihis (6x) de IMAC N-terminal (Ndel) y C-terminal (BamHI), respectivamente. Figura 12. Plásmidos de expresión - construcciones de expresión de células CHO. Figura 13. Secuencia de nucleótidos de protrombina activada con trombina, SEQ ID NO:1, expresada en E. coli. Figura 14. Secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:6, de protrombina diseñada expresada en células CHO (con etiqueta poliHis C-terminal). Figura 15. Secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:2, de protrombina diseñada expresada en E. coli. Figura 16. Secuencia de aminoácidos, SEQ ID NO:4, de pretrombina-2 diseñada expresada en E. coli.

Figura 17. Secuencia de am inoácidos, SEQ ID NO.8, de pretrombina-2 diseñada expresada en células CHO (con etiqueta de poliHis C-terminal). Fig ura 1 8. Secuencia de nucleótidos de cartucho de expresión de pretrombi na-2 diseñada de E. coli (trom bina activada), S EQ I D NO:3. Figura 1 9. Pre-trombina-2 diseñada de m am ífero incluyendo secuencia de n ucleótidos de cartucho de expresión de secuencia líder de preprotrombina natural (trombina activada con etiqueta de secuencia de pol iH is 3' removible de trom bina), S EQ I D NO: 7. Figura 20. Oligonucleótidos/iniciadores de PCR usados en cartuchos de expresión de células de mam ífero . Para fines de la presente invención, como se describe y reclama en la presente, los siguientes térm inos son como se define antes. Secuencia de señal : Un segmento de DNA que codifica un péptido secretorio. Las secuencias de señal también pueden ser llamadas secuencias líder y/o pre secuencias . Un péptido secretorio es una secuencia de aminoácidos q ue actúa para dirigir la secreción de un polipéptido o proteína maduro a partir de una célula. Los péptidos secretorios son caracterizados normalmente por un n úcleo de aminoácidos hidrofóbicos y normalmente (pero no de manera exclusiva) son encontrados en el extremo amino de proteínas recién-sintetizadas. El péptido secretorio es cortado de la proteína m adura durante la secreción. Tales péptidos secretorios contienen sitios de procesam iento q ue permiten el corte del péptido secretorio a partir de la proteína madura conforme pasa a través de la ruta secretoria. Los sitios de procesamiento pueden ser codificados dentro del péptido secretorio o pueden ser adicionados al péptido mediante, por ejemplo, mutagénesis in vitro. Pro secuencia: un segmento de DNA q ue codifica un propéptido y funciona para dirigir o señalar el procesamiento de una proteína o péptido. Las pro secuencias pueden ser preced idas por una pre secuencia y pueden ser removidas de la proteína durante el procesamiento. Un "ácido n ucleico aislado" es una molécula de ácido nucleico que es identificada y separada de a! menos una molécula de ácido nucleico contam i nante con la cual está asociada ordin ariamente en la fuente natural del ácido n ucleico. Tal molécula de ácido nucleico aislada es d iferente en la form a o disposición en la cual se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas son distinguidas de la molécu la de ácido nucleico como existe en cél ulas naturales . Trom bina: Un péptido glicos ilado , unido por disulfuro, de dos cadenas, que corta enlaces específicos en fibrinógeno para producir monómeros de fibrina que se auto-ensamblan para formar un coágulo de fibrina . Vector de expresión: Una molécula de DNA que contiene, una secuencia de DNA que codifica una proteína de interés j unto con un prom otor y otras secuencias , tal como term inador de transcripción y señal de poliadenilación , que facilitan la expresión de la proteína . Los vectores de expresión contienen además información genética q ue proporciona su replicación en una célula huésped, ya sea mediante replicación autónoma o med iante integraciónen el genoma h uésped. Será evidente para alguien experto en la técnica que tal información que proporciona la replicación autónoma de un vector de expresión en una célula huésped abarca orígenes de replicación mamíferos y bacterios conocidos. Como se discute con más detalle en la presente, los vectores de expresión bacterianos y mamíferos generalmente contienen un origen de replicación bacteriano. Ejemplos de vectores de expresión comúnmente usados para DNA recombinante son plásmidos y ciertos virus, aunque pueden contener elementos de ambos. También pueden incluir uno o más marcadores seleccionabas. Transfección o transformación: El proceso de alterar de manera estable y heredable el genotipo de una célula o microorganismo receptor mediante la introducción de DNA purificado. Este es detectado normalmente mediante un cambio en el fenotipo del organismo receptor. El término "transformación" generalmente es aplicado a microorganismos, mientras que la "transfección" es usada para describir este proceso en células derivadas de organismos multicelulares. Construcción de DNA: Una molécula de DNA, o un clon de tal molécula, ya sea de filamento simple o doble, la cual ha sido modificada a través de intervención humana para contener segmentos de DNA combinados y yuxtapuestos en una manera que de otra manera no existiría en la naturaleza. Las construcciones de DNA pueden contener elementos operablemente enlazados, los cuales dirigen la transcripción y traslación de secuencia de DNA que codifica polipéptidos de interés. Tales elementos incluyen promotores, intensificadores y terminadores de transcripción. En virtud de los elementos contenidos dentro de las construcciones de DNA, ciertas construcciones son entendidas por ser capaces de dirigir la expresión y secreción de los polipéptidos codificados. Si una secuencia de DNA que codifica un polipéptido de interés contiene una secuencia de señal secretoria, la construcción de DNA que contiene elementos apropiados será considerada como capaz de dirigir la secreción del polipéptido. Polipéptidos de fusión o proteínas de fusión como se usan en la presente, comprenden polipéptidos, fragmentos de proteínas, variantes o derivados fusionados a una proteína o péptido heterólogo. El sitio de fusión generalmente contiene un sitio de corte que es cortable mediante una enzima específica, tal como trombina. Los péptidos y proteínas heterólogos incluyen, pero no están limitados a: un epitope para permitir la detección y/o aislamiento del péptido de fusión; una proteína receptora de transmembrana o una porción de la misma, tal como un dominio extracelular; o un dominio de transmembrana e intracelular; un ligando o una porción del mismo, él cual se une a una proteína receptora de transmembrana; un ligando o una porción del mismo, el cual es activo catalíticamente; una proteína o péptido, el cual promueve la oligomerización, tal como dominio de cierre de leucina; y una proteína o péptido, el cual aumenta la estabilidad, tal como una región constante de inmunoglobulina (proteína de fusión Fe). El o los derivados de proteína C se refieren a los derivados producidos recombinantemente que difieren de proteína C humana tipo natural, pero cuando son activados retienen las propiedades esenciales, es decir, proteolítica, amidolítica, esterolítica y biológica (actividades anti-coagulante, anti-inflamatoria, pro-fibrinolítica). La definición de derivados de proteína C humanos como se usan en la presente, también incluye la forma activada. Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos para producir trombina usando métodos recombinantes. Una característica de la presente invención es el uso de un vector de expresión comprendiendo una secuencia de DNA que codifica protrombina. Una característica adicional de la presente invención es el uso de un vector de expresión comprendiendo una secuencia de DNA que codifica pretrombina-2. Otra característica de la presente invención es el uso de vectores de expresión dentro de células huésped para producir precursores de trombina diseñados que son ya sea auto-activados in vitro o secretados en una forma activada, sin requerir así de procesamiento de Factor Xa. Células huésped adecuadas para clonar o expresar el ácido nucleico (por ejemplo, DNA) en los vectores aquí incluyen células de procariote, levadura o eucariote superior. Los procariotes adecuados incluyen pero no están limitados a eubacterias, tales como organismos Gram-negativos o Gram-positivos, por ejemplo, Enterobacteriacea, tal como E. coli. Varias cepas de E. coli están públicamente disponibles, tales como E. coli K12 cepa MM294 (ATCC 3 1.446); E. coli X1 776 (ATCC 3 1.537); E. coli cepa W3 110 (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras células huésped procarióticas adecuadas incluyen Enterobacteriaceae, tal como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigelila, así como Bacillus, tal como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 4 1 P descrita en DD266.7 1 0, publicada el 12 de abril de 1 989) , Pseudomonas, tal como, P. aeruginosa y Streptomyces. Estos ejem plos son ilustrativos en lugar de lim itantes . U na modalidad de la presente invención es la clonación y expresión de precursores de trobm ina recom binante de bovino en E. coli para la evaluación de la enzima recombinante como un reempl azo potencial para la enzima derivada de animal actualmente usada en la ind ustria de biotecnolog ía. Las enzimas son producidas en este sistema m icrobiano y subsecuentemente activadas in vitro usando trombina. La proteína es producida como cuerpos de incl usión que requieren redoblamiento para obtener material apropiadamente dobl ado capaz de auto-activación. La secuencia de n ucleótidos es como se muestra en SEQ I D. NO: 1 y la secuencia de am inoácidos es como se m uestra en S EQ I D NO :2. El cDNA de trom bina de bovino codifica un péptido de 625 am inoácidos que consiste de una secuencia líder de 43 residuos (para secreción) y un péptido de protrombina de 582 residuos . La clonación de la secuencia de cDNA que codifica el gene de preprotrom bina de bovino se log ró mediante amplificación de PC R de la secuencia usando cDNA de hígado de bovino. El potencial para cambios de secuencia relacionados con PCR fue resuelto al analizar múltiples secuencias de DNA independientemente amplificadas y clonadas. Los iniciadores presentados en la Figura 3 fueron diseñados para amplificar las secuencias de cD NA que codifican varios precursores para trombina incluyendo las moléculas de preprotrombina , protrom bina y pretrombi na-2. Debido a q ue la secuencia de cDNA de longitud completa (preprotrombina) es aproximadamente 2. 1 Kb de longitud, las secuencias también fueron amplificadas en "frag mentos" más pequeños, con el fin de facilitar las reacciones de am plificación y clonación . Estos "fragmentos" de cDNA también proporcionaron secuencias independientemente amplificadas adicionales para derivación de secuencia de consenso. Los sistemas de expresión de E. coll son diseñados para aceptar cartuchos de genes de Ndel (sitio de restricción 50) a Bam HI (sitio de restricción 3') . Como resultado , los iniciadores de, PCR son diseñados para incorporar estos sitios en los productos am plificados. En alg unos casos, estos sitios son encontrados de manera natural dentro de una secuencia am plificada y así tienen que ser rem ovidos . También es benéfico tener sitios de restricción internos únicos para fines de ingeniería futuros potenciales. Con base en la secuencia publicada (acceso de genban k #J00041 ), había sitios de restricción Bam H i y Bg l l l q ue ocurren de m anera natural en el cDNA, los cuales fueron suprimidos durante el proceso de clonación. Además, un sitio Xhol único fue introducido para ingeniería de la secuencia de señal, si era necesario, para fines de secreción . Debido a q ue estos sitios fueron necesarios para fines de ingeniería y clonación subsecuentes, estos sitios son removidos y/o introducidos (sin alterar la secuencia de am inoácidos) . De esta manera, los i niciadores sintetizados para amplificar el gene en fragmentos más pequeños , son diseñados para introducir estos cambios de nucleótidos "silenciosos". De manera específica, estos cambios incluyeron la introducción del sitio Xhol en la reg ión 5' y la remoción de un sitio Bam HI que ocurre de manera natural y uno de dos sitios Bgll l (reg ión 3') , lo cual facilita la modificación del extremo 3' de la molécula. Las secuencias de cDNA amplificadas independientemente y "fragmentos" son clonados directamente en vectores de clonación Ta y las secuencias clonadas son analizadas. Las secuencias clonadas son alineadas entonces para derivar una secuencia de consenso. La comparación de la secuencia de consenso derivada de los clones amplificados independientemente contra la secuencia de Genbank, muestra que hubo numerosas diferencias de nucleótidos. De estas diferencias de secuencias de nucleótidos, solo resultaron tres cambios de aminoácidos (posiciones mostradas en negritas en la Figura 5) comparados con la secuencia publicada. Los tres residuos que cambiaron estuvieron presentes en la porción "pro" de la proteína y una de las diferencias (R95K) fue un cambio conservador. Los otros dos cambios de aminoácidos representan alteraciones claramente dramáticas en términos de química de aminoácidos. En ambos casos, es un aminoácido básico (histidina) que es alterado y en un caso la alteración resulta en un residuo neutral (polar) (H230S). En el tercer caso, el residuo básico es convertido a un residuo ácido (H248D). Para cada posición de nucleótido en el cDNA, al menos tres (y en la mayoría de los casos cinco o más) fragmentos amplificados independientemente que cubren esa posición, son usados para derivar la secuencia de consenso. Las construcciones resultantes son capturadas en la Figura 6. Otra modalidad de la presente invención es la ingeniería de versiones recombinantes del precursor de trombina de bovino, pretrombina-2. El ácido nucleico es como se muestra en SEQ ID NO:3 y la secuencia de am inoácidos es como se muestra en SEQ I D NO:4. La pretrombina-2 es el precursor de cadena simple m ás pequeña para trom bina. Es una proteína de 314 am inoácidos que es convertida de manera natural en las cadenas "A" y "B" de trombina sobre corte por Factor Xa. Con el fin de versiones diseñadas eficientemente construidas de pretrombina-2 para estudios de expresión, un cartucho de expresión de "base" es construido usando métodos de PCR, Ejemplo 2. La construcción conten ía la secuencia de cDNA natural con las excepciones de que los sitios Bam H I y Bgll l internos son rem ovidos , u n sitio de restricción Stul de región 3' que ocurre de manera natural es removido y un sitio Stul de región 5' y un s itio Sacl son incorporados . Cambios de expresión adicionales, tales como la adición de purificación y detección de "asas" (secuencias polyHis e I MAC) se hacen mediante la incorporación de estas secuencias en los in iciadores de ampl ificación de flanq ueo. La secuencia de cDNA de codificación de protrombina es am plificada, usando los i n iciadores descritos en la Figura 3, para generar el producto de cartucho de expresión de PCR de pretrombina-2 de tipo natural (.859 kb) . La secuencia am plificada independientemente, clonada (intermediarios de vector TA) , confirmada y cartucho de expresión de pretrombina-2 subclonado son colocados en los soportes de huésped de expresión apropiados y son expresados. La proteína de pretrombina-2 se expresó bien por arriba de los n iveles de todas las proteínas de E. coli naturales . Los análisis cuantitativos subsecuentes usando un ensayo de HPLC, muestran que estas cepas produjeron tanto como 4 gramos de pretrombina-2 por litro de cultivo bacteriano.

Modalidades adicionales de la presente invención incluyen modificaciones a la molécula que ayudan principal mente en el proceso de purificación . La adición de "asas" de purificación , tales como los péptidos I MAC y polyHis son incorporadas . Los iniciadores de PCR son usados para introducir las "asas" de purificación específicas mediante am pl ificación, util izando el vector de cartucho de expresión de "base" de pretrombina-2 como la plantilla de ampl ificación . Modalidades ad icionales de la presente invención incluyen la incorporación de un "cartucho de sitio de activación" en la secuencia de codificación, de manera que los cartuchos de corte alternativos puedan ser intercambiados fácil y eficientemente. Esto permite el reemplazo y prueba de alternativas para la secuencia de activación de Factor Xa natural. Es importante notar que aunq ue existen dos secuencias de corte de Factor Xa en el cartucho de expresión de pretrom bina-2 , Fig ura 8, solo el segundo o el sitio de corte "corriente abajo" es req uerido para activar (cortar la cadena "A" de la cadena "B") la molécula. El "cartucho de sitio de activación" es construido al usar m utagénesis de extensión de traslape de PC R para introducir un sitio de restricción Sacl ún ico corriente arriba (5') de la segunda secuencia de corte de Factor Xa (Fig ura 4) . Un sitio de restricción Stu l ún ico es introducido corriente abajo del segundo sitio de corte de Factor Xa, permitiendo q ue los adaptadores de oligonucleótidos sean sintetizados como fragmentos de Sacl a Stul conteniendo las secuencias de corte alternativas. Esto se log ra mediante supresión, usando mutagénesis de PCR, un sitio Stu l que ocurre de manera natural encontrado en la región 3' del cartucho . Todos los cam bios descritos son introd ucidos sin alterar la secuencia de aminoácidos. La Figura 4 m uestra la secuencia de nucleótidos completa y su producto trasladado del cartucho de expresión de pretrom bina-2 modificado. Adicionalmente, los oligon ucleótidos sintéticos que contienen los sitios de restricción Sacl y Stu l únicos en los extremos apropiados, introd ucen los sitios de corte alternativos. Cinco fragmentos que representan cuatro diferentes sitios de corte de proteasa son substituidos en la secuencia. Estos incluyeron dos versiones del sitio de corte de trombina y sitios para las proteasas enterocinasa , rinoviral 2A y rinovira! 3C . (Figura 9) . Los vectores de expresión conteniendo las secuencias modificadas q ue resultan de estos experimentos de substitución son mostrados en la Figura 1 0. Todas las moléculas alternativamente activables son expresadas bien en E. coli. Otra modalidad de la presente invención es un precursor de trombina que podría ser activado por trom bina por sí mism a (auto-activaciónin vitro) . El material expresado en esta cepa fue aislado y tomado a través del proceso de red oblamiento . La enzima apropiadamente doblada es tratada entonces con un"semilla" de trombina de muy bajo nivel y su capacidad para activar la Proteína C recombinante humana es examinada. De esta manera, el precursor de trom bina recombinante de bovino es producido en cél ulas bacterianas, aislado y activado usando trombina como una "semilla" y activa la proteína C recom binante en u na m anera similar a la enzim a derivada de animal . Una observación clave que resultó del trabajo de expresión bacteriana fue que las modificacio nes post-trasl acionales no fueron críticas para la actividad de enzima, debido a que está bien establecido que E. coli no es capaz de estas modificaciones postr-traslacionales complejas. Adicionalmente, la expresión bacteriana de trombina recombinante demuestra la capacidad de los precursores de trombina activables con trombina para ser activados a actividad enzimática. Además de los procariotes, los microbios eucarióticos tales como hongos filamentosos o levaduras son huéspedes de clonación o expresión adecuados para vectores precursores de trombina. La Saccharomyces cerevisiae es un microorganismo huésped eucariótico inferior comúnmente usado. Otros incluyen Shizosaccharomyces pombe [Beach y Nurse, Nature 290: 140-3 (198); EP 139,383 publicado el 2 de mayo de 1995]; huéspedes de uyveromyces [patente estadounidense no. 4,943,529; Fleer et al., Bio/Technology 9(10): 968-75 (1991)], tal como, por ejemplo, K lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574 [de Louvencourt et al., J. Bacteriol. 154(2): 737-42 (1983)]; K. fiagih's (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), K wickeramii (ATCC 24,178), K waltii (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36,906) [Van den Berg et al., Bio/Technology 8(2): 135-9 (1990)]; K. thermotolerans, y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070) [Sreekrishna et al., J. Basic Microbio!. 28(4): 265-78 (1988)]; Candid; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa [Case et al., Proc. Nati. Acad Sci. USA 76(10): 5259-63 (1979)]; Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentulis (EP 394,538 publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos filamentosos, tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicullium, Tolypocladium (WO 91/00357 publicada el 10 de enero de 1991) y huéspedes Aspergillus, tales como, A. nidulans [Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 112(1): 284-9 (1983)]; Tilburn et al., Gene 26(2-3); 205-21 (1983); Yelton et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81(5): 1470-4 (1984)] y A. niger [Kelly y Hynes, EMBO J. 4(2): 475-9 (1985)]. Las levaduras metilotrópicas son seleccionadas de los géneros que consiste de Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y Rhodotoruia. Una lista de especies específicas que son ejemplares de esta clase de levadura pueden encontrarse en C. Antony, The Biochemistry of Methylotrophs (La bioquímica de metilótrofos) 269 (1982). Células huésped adecuadas para la expresión de precursores de trombina glicosilados son derivadas de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen células de insectos, tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sp, Spodoptera high5, así como células vegetales. Ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles incluyen células de ovario de hámster chino (CHO) y COS. Ejemplos más específicos incluyen línea CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano [células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al., J. Gen Virol., 36(1): 59-74 (1977)]; células de ovario de hámster chino/±DHFR (DG44, K , DuxBH) [CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77(7): 4215-20 (1980)]; células sertoli de ratón [TM4, Mather, Biol. Reprod. 23(1):243-52 (1980)]; células de pulmón humano (W138.ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario de ratón (M T 050562, ATCC CCL51). La selección de la célula huésped apropiada es considerada por estar dentro de la habilidad en la técnica. De esta manera, otra modalidad de la presente invención es la expresión de cultivo de células de mamífero de moléculas precursoras de trombina de bovino. El beneficio primario de la expresión en sistemas de mamífero es la capacidad para obtener modificaciones post-traslacionales más complejas. Otro de esos beneficios atribuidos al uso de sistemas de expresión eucarióticos es la formación de productos solubles y doblados apropiadamente. De manera adicional, la proteína expresada en células de mamífero es secretada en el medio de cultivo, proporcionando con ello una purificación eficiente. Una línea de células huésped de mamífero preferida es la línea de células de ovario de hámster chino (CHO). De manera más específica, se utiliza una línea de células mutantes de DHFR designada DXB11 y un sistema de expresión (EASE) que permite la rápida generación de cultivos de expresión a granel con base en la selección de DHFR. Las versiones diseñadas de cartuchos de expresión de protrombina (1.890 Kb) y pretrombina-2 (.983 Kb) son generadas mediante amplificación de PCR usando los iniciadores de PCR mostrados en la Figura 22 y clonados directamente en el vector de expresión EASE (pDC312). La Figura 13 describe los vectores de expresión construidos. Los vectores de expresión de protrombina y pretrombina-2 son transfectados entonces en la línea de células madre DXB11 para generar líneas de células CHO que secreten estos precursores de trombina. La protrombina es purificada usando un proceso de dos pasos que involucra una columna de fenil sefarosa seguida por un paso de I AC.

Esta proteína purificada es más de 85% pura com o es determinado mediante análisis de densítometría de gel. La pretrombina-2 es purificada con u n proceso de purificación de dos pasos q ue involucra el uso de una columna de sefarosa SP seguida por un paso de cromatografía por afinidad de heparina. La proteína resu ltante es más de 85% pura . El precursor de protrombina , es exam inado por su capacidad para ser activado in vitro. De m anera inesperada, el precursor de protrombina purificado es activado en la ausencia de trombina exógena siendo adicionada a la reacción de incubación . De esta manera, la proteína recombinante es a uto-activada. Para el cartucho de expresión de pretrombina-2, la secuencia líder de preprotrombina natural es fusionada a la secuencia de pretrombina-2. De m anera aproximada, 50% del m aterial expresado en las células fue secretado en el medio. Adem ás, la m olécu la precursora de pretrom bina-2 fue activada en el medio de cultivo, no requiriendo así activación in vitro. La secuencia de ácido n ucleico es como se m uestra en SEQ I D NO: 7 y la secuencia de am inoácidos es como se m uestra en SEQ I D NO: 8. Los niveles de expresión son monitoreados usando el ensayo de substrato S2238, as í como , un ELI SA de trombina. De manera sorprendente, la activación de precursor de pretrombina-2 ocurre en el momento de secreción , debido a q ue ning ún precursor completamente intacto podría ser observado en el sobrenadante de cultivo. Se realiza análisis cinético estándar para determinar las características catal íticas de trom bina activada preparada a partir de precursores de protrombina y pretrom bina-2. N o existe diferencia significativa entre los valores de Km o actividad específica en el substrato S2238 para trombina preparada a partir de ya sea una molécu la precursora o trombina natural comercialmente disponible. Adicionalmente, las estabilidades térm ica y de pH individuales son comparadas usando u n substrato cromogén ico. Las enzimas recombi nantes son equivalentes a la enzima derivada de animal a través de un ampl io rango de temperatura y pH. De m anera ad icional, se realizaron experimentos para evaluar la capcidad de las moléculas precursoras de trombina recombinante purificadas para activar la proteína C. La trombina activada derivada de m olécu las precursoras de trombina recom bin a nte activa la proteína C recombi nante en una manera bastante sim ilar a la enzima de fuente animal. Habiendo descrito de manera general la invención, la m isma será entendida más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos , los cuales son provistos a manera de ilustración y no pretenden ser lim itantes.

Ejem plo 1 Expresión de moléculas precursoras de trom bin a en células bacterianas Cepas bacterianas: Los genotipos de las diversas cepas bacterianas que fueron usadas para este trabajo son descritos en la Tabla 1 .

Tabla 1 DH5cc sirvió como el huésped de "clonación" general debido a que se hizo fácilmente competente y es receptivo a paso de DNA sin modificar debido a q ue es una cepa deficiente de restricción aunque positiva para modificación (r-, m+) . De esta manera, el DNA sintetizado in vitro (es decir oligonucleótidos usados para crear adaptadores) podría ser pasado a través de este huésped antes de ser transformado en huéspedes de expresión positivos de restricción . RV308 sirvió como el huésped de elección en estos estudios para uso con el sistema de expresión lambda, el cual es inducible por temperatura . RQ228 representa un h uésped de expresión específicamente para uso con los sistemas de expresión T7 y J7lac. HMS 1 74(D E3) fue un h uésped de expres ión T7 comercialmente dis ponible también usado en estos estudios. Med ios y condiciones de crecimiento : Cultivos bacterianos de m atraz de agitación se cultivaron rutinariamente en medio LB (Miller 1 972). El agar L consistió de medio LB más 1 5 g de Bacto Agar (Difco) por litro. Cuando fue apropiado, se adicionaron antibióticos (Sigma y BRL) a las sig uientes concentraciones: cloranfenicol (25ug/ml) , tetraciclina (1 2.5ug/ml) , ampicilina (100ug/ml), canamicina (50ug/ml) , ácido nalidíxico (20ug/ml) , neomicina (75ug/ml) y estreptom icina (50ug/ml). Para experimentos de inducción de sistema de expresión T7, se hizo IPTG como una solución madre 0.5M en ag ua y se adicionó al medio de cultivo a una concentración final de 0. 1 mM a 1 m M .

Ejem plo 2 Métodos de DNA Se aisló D NA de plásmido usando ya sea el conj unto Wizard Purificaron (Promega Corp. ) o el conjunto Plasm id DNA Spin Column (Qiagen). Se realizaron electroforesis de gel de agarosa de D NA, "llenado" de fragmentos de restricción con extremos 5' sobresalientes por Klenow, ligación de fragmentos de DNA y transformación de E. coli mediante el método de cloruro de calcio, com o se describe por Maniatis et al. y/o de acuerdo con Current Protocols Manual (Man ual de protocolos actuales). Los frag mentos de restricción individuales fueron aislados en agarosa de temperatura de fusión baja med iante el método de Struhl . (Struhl, K. 1 985) o mediante el uso de un conj unto de pu rificación de gel de DNA de Qiagen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Vectores de clonación y expresión : Los diversos esqueletos de vectores de expresión utilizados en este trabajo son presentados en la Fig ura 1 1 . Las características claves de cada u na de estas construcciones también son presentadas en la tabla , incluyendo el sistema promotor específico que poseen, así como el método usado para i nducir la expresión cuando se utilizaron estos esqueletos .

PCR y oligonucleótidos adaptadores: Los oligonucleótidos que fueron diseñados y sintetizados para usarse son listados en la Fig ura 3. La tabla tam bién disting ue entre el o los usos es pecíficos para los oligonucleótidos. Un conjunto de los iniciadores fue diseñado con base en la secuencia conocida para trombina de bovino com o se deriva de la presentación de Genbank original #J00041 . Estos oligon ucleótidos particu lares fueron diseñados para perm itir la amplificación de PC R de m últiples versiones y fragmentos del cD NA de trombina de bovino. Las versiones incluyeron las moléculas precu rsoras de preprotrom bina, protrom bina y pretrom bina-2 de longitud completa. Esto se h izo con el fin de proporcionar secuencias amplificadas independientemente adicionales para comparación con la secuencia esperada, así como para el propósito de hacer ciertas modificaciones a las secuencias , tal como inserción y/o remoción de sitios de restricción específicos. Los iniciadores de PCR fueron usados para generar la secuencia de consenso para el cDNA clo nado y constru ir el m arco de trabajo inicial para trabajo de clonación y expresión subsecuente. A continuación , los iniciadores de PCR fueron usados para hacer modificaciones de ingeniería adicionales a las secuencias (es decir, cambios de sitios de restricción , alteraciones de am inoácidos, asas de purificación, etc) . La Figura 12 muestra las secuencias de nucleótidos específicas que fueron generadas para incorporar el asa en los extremos 5' y 3' del cartucho de expresión , respectivamente. Todos los oligonucleótidos (tanto para clonación de adición de enlazador como parauso como iniciadores de PCR) fueron sintetizados y purificados en escala de 0.2 umol por Genosys, I nc.

Amplificación de PCR y clonación de cDNA: Los iniciadores de PCR fueron diluidos para hacer concentraciones de soluciones madre de 50uM. Las reacciones de PCR fueron corridas en el termocicüzador Perkin Elmer Geneam p PCR System 9600. La amplificación de PCR fue realizada como sig ue: plantillas consistieron de ya sea cél ulas aisladas recientemente tomadas de una colon ia aislada en una placa de agar o DNA de plásmido purificado dil uido (1 ng/ul de concentración final diluida en agua). En el caso de la clonción de cDNA in icial (Clontech) , el cD NA comprado comercialmente (1 ug) se usó directamente como la plantilla de ampl ificación. En el caso donde se usaron directamente las células, las cél ulas fueron Usadas al calentarlas a 99.9°C durante 1 0 m inutos antes de 32 ciclos del sig uiente ciclo: 94°C durante 30 segundos , 58°C durante 30 segundos, 72°C durante 75 seg undos. El program a de cicl ización regular fue seguido por un paso de extensión de 1 0 minutos a 72°C y la muestra fue mantenida entonces a 4°C hasta uso subsecuente. La clonación directa de los productos de PCR se log ró utilizando el conjunto de clonación TA (vectores pCRI l o pCR2. 1 Topo) de acuerdo con las direcciones del fabricante. La integridad de secuencia de todas las construcciones generadas ya sea por PCR o ligación d irecta de oligon ucleótidos de DNA sintéticos (es decir, clonación de adaptador), se confirmó mediante an ál isis de secuencias. En el caso de la clonación inicial del cDNA para trombi na de bovino , se obtuvieron a l menos tres clones amplificados independientemente para representar cada posición de base. Esto proporcionó un medio para identificar una secuencia de consenso para la secuencia de DNA de codificación clonada.

Ejemplo 3 Activación de trombina recombinante usando veneno de serpiente Este procedimiento se realizó esencialmente como se describe por DiBella et al., (J. Biol. Chem., 2709(1): 163-169, 1995). El veneno de serpiente (veneno de serpiente E. carinatus, Sigma # V-8250) fue pretratado con p-APMSF para inactivar proteasas similares a tripsina (Laura et al. 1980). La concentración de proteína de esta preparación de veneno de serpiente tratada fue determinada con un ensayo de BCA. Las activaciones fueron fijadas entonces usando una proporción en peso de pretrombina-2 a veneno de serpiente de 5:1 en una mezcla de reacción conteniendo 25 mM de fosfato de sodio (monobásico), pH 7.4 y 0.4 M NaCI. Las reacciones fueron incubadas a 37°C. Las alícuotas fueron removidas a intervalos de 30 minutos y se ensayaron usando el ensayo espectroscópico S2238 de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Chromogenix Inc.). Las activaciones normales alcanzaron su máxima actividad en 2-3 h bajo estas condiciones.

Ejemplo 4 Ensayo de actividad de substrato S2238 de trombina El substrato cromogénico S2238 fue comprado a Chromogenix, Inc. y se usó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, las muestras de control se hicieron al disolver la trombina de bovino en solución salina amortiguada con Tris (20 mM Tris/150 mM NaCI)/10 mM EDTA pH 8.3 conteniendo 0.1 mg/ml de BSA a una concentración de TBS final de aproximadamente 1 mg/ml. La concentración de proteína se estimó usando E1% = 19.5 a 280 nm (Winzor y Scheraga, 1964). La trombina recombinante o muestras de control fueron diluidas con el amortiguador de TBS/EDTA/BSA a una concentración de proteína final de 1 µg/ml. Aproximadamente 100 µ? de cada muestra fueron adicionados a las probetas de plástico conteniendo 100 µ? S2238 (un substrato de péptido sintético con un grupo que sale de p-nitroanilina) en amortiguador de TBS/EDTA/BSAn pre-equilibrado a 37°C durante 10 minutos en un espectrofotómetro fijado a 405 nm. El aumento en la absorbancia a 405 nm fue medido sobre 5 mintuos con datos adquiridos cada 15 segundos. El cambio en absorbancia por minuto fue dividido por 1.67 para calcular las unidades NIH de actividad. Este número se dividió por la concentración de proteína usada en el ensayo para calcular la actividad específica (en unidades NIH/mg de proteína) de la enzima.

Ejemplo 5 Autoactivación usando trombina La activación usando trombina es similar a las reacciones descritas antes usando veneno de serpiente. Las activaciones iniciales fueron fijadas usando una proporción de pretrombina-2 a trombina de bovino de 100:1 en una mezcla de reacción conteniendo 20 mM Tris pH 8.3, 0.15 M NaCI, 10 mM EDTA. Las reacciones fueron incubadas a 37°C. Las alícuotas fueron removidas a intervalos de 30 minutos y se ensayaron usando el ensayo espectroscópico de S2238. Las activaciones normales alcanzaron su actividad máxima en 1-1.5 h bajo estas condiciones.

Ejemplo 6 Purificación de pretrom bi na-2 de E. coli recombinante El plásm ido/h uésped de expresión deseado se cultivó en volúmenes de matraz de agitación hasta varios litros (matraces de 250 ml/1 litro) agitando (290 rpm) a 37°C. El crecimiento se m onitoreó al seguir OD600 y se tomaron muestras antes de la adición de I PTG (1 00 uM) y sig uiendo crecimiento continuo (4-5 horas) y recolección eventual . La pella celular fue obtenida mediante centrifugación (rotor GSA en centrífuga Sorval) a 6500 rpm durante 1 0 minutos . El medio gastado fue decantado y la pella se volvió a suspender en 7 M gaunidina-HCI/ 0 m M Tris pH 8.0 , con el fin de lisar las células. La fracción insoluble conteniendo ios cuerpos de inclusión de pretrombina-2 se aisló mediante centrifugación de alta velocidad (20k rpm) y se decantó la fracción sol uble. Los cuerpos de inclusión fueron sulfonatados entonces como se describe por Dibella et al. Purificación de pretrombina-2 sulfonatada recombinante: La pretrombina-2 s ulfonatada se disolvió en 7 M guanidina-HCI/10 mM Tris pH 8.0 y se cargó sobre una col umna Vydac C-1 8 sem ipreparatoria (1 .0 x 25 cm) con una velocidad de flujo lineal de 75 cm/h . La columna fue levigada entonces con un g radiente de volumen de col um na (CV) 4 desde 0-70% amortiguador B (amortiguador A = 23% ACN/0.1 % TFA, amortiguador B = 90% ACN/0.1 % TFA). Las fracciones conteniendo la pretrom bina-2 (como se determina medíante H PLC anal ítica) fueron depositadas y liofilizadas.

Ejem plo 7 Ensayo de liberación de dodecapéptico (DDP) Brevemente, las muestras conteniendo actividad similar a trombina fueron incubadas con Proteína C humana a una concentración de proteína final de 2 mg/ml en 20 mM Tris/150 mM NaCI pH 8.0. El volumen de reacción final fue 2 mi. La reacción se ajustó entonces a pH 6.0 con ácido cítrico 1 N y se incubó a 40°C para los tiempos indicados. Una muestra de control de trombina de bovino se fijó en la misma manera usando aproximadamente 180 ug de actividad enzimática previamente disuelta en 20 mM Tris/150 mM NaCI pH 8.0 a una concentración final de 2 mg/ml. Se removieron las alícuotas de reacción (25 µ?) y se extinguieron con 25 µ? de 0.1% TFA. Las muestras fueorn analizadas para la liberación de dodecapéptido usando una columna Shandon Hypercarb (3.2 x 100 mm) unida a un HPLC HP1090 equipado con un detector de Applied Biosystems externo fijado a 216 nm. El dodecapéptido liberado fue cuantificado contra una curva estándar usando dodecapéptido auténtico sintetizado químicamente.

Ejemplo 8 Cultivo de células de mamífero Las células de mamífero usadas en estos experimentos son células de ovario de hámster chino (CHO) y específicamente la línea DXBII. Esta línea celular particular es un muíante de Dihidrofolato reductasa (DHRF). Esta mutación permitió la selección de células conteniendo DHFR usando medio menos hipoxantina/timidina (-HT), con adición de metotrexato aumentando los títulos amplificados.

Las células se hicieron crecer en suspensión en medios de mantenimiento libre de suero, los cuales consistieron de Excell302 (JRH) conteniendo 4mM L-glutamina (BRL) y complemento de 1x HT (BRL). Siguiendo la transfeccion, las células fueron colocadas en medio Excell302 selectivo conteniendo 4-8 mM L-glutamina y 1x sulfato de dextrano (Sigma). En algunos casos, se adicionó MTX (Sgima) a ya sea 50, 150 o 300 nM a partir de una solución madre apropiada hecha en DMSO (Sigma).

Ejemplo 9 Diseño del cartucho de expresión de mamífero El sistema de expresión fue obtenido de Immunex y es llamado el sistema de Elemento de Secuencia de aumento de Expresión o EASE. Se reporta que este sistema permite el desarrollo de un "depósito" de células CHO de alta expresión, estables, en un marco de tiempo rápido (Aldrich et al., Cytotechnology, 28:1-9, 1999). El vector de EASE es propietario y la secuencia completa no está disponible de esta manera. El vector vino con una región de sitio de mult-clonación, la cual contenía sitios de restricción para la subclonación del gene de interés. Debido a que los cartuchos de expresión bacteriana están en el fragmento de restricción Ndel a BamHI, el sitio BamHI en el extremo 3' del gene es utilizado. Un sitio Salí en el extremo 5' del gene es introducido medíante PCR y el cartucho de expresión es subclonado entonces en el vector EASE como un fragmento Salí a BamHI. Los oligonucleótidos usados como iniciadores de PCR en la construcción de construcciones de expresión de protrombina y pretrombina-2 son listados en (Figura 22). Las reacciones de PCR fueron realizadas en el termociclizador Perkin Elmer Cetus GeneAmp 9600 usando los siguientes parámetros: desnaturalización de plantilla inicial a 98°C durante 1 0 mintuso, seguida por 30 ciclos a 94°C durante 30 segundos, 56°C durante 30 segundos y 72°C durante 3 minutos. El ciclo final fue seguido por una extensión de 1 0 minutos a 72°C y entonces las reacciones se mantuvieron a 4°C hasta que podieron ser procesadas adicionalmente. Los cartuchos de expresión de mamífero son construidos utilizando sitios de clonación específicos descritos antes (es decir, cartuchos de Salí a BamHI) y la secuencia kozak. La secuencia kozak es una región corta que es reportada por ser importante en la iniciación translacional en eucariotes. La secuencia de consenso para la región Kozak es como sigue: GCCG/ACC . Ambas regiones de la secuencia Kozak de consenso (Kozak, 1981 ) son incluidas para determinar si existió alguna diferencia significativa en la expresión entre ellas. Se incorpora una secuencia COOH-terminal como una "etiqueta" para fines diagnósticos (análisis de expresión) y para proporcionar una "asa" potencial para fines de purificación.

Ejemplo 10 Transfección (Electroporacion)/Se lección/Amplificación La transfección es lograda usando el equipo GenePulsar II (Biorad) de acuerdo con el siguiente protocolo: Para cada muestra de transfección se linealizaron 1 0 ug de DNA usando una enzima de restricción (Pvul), que corta dentro del gene de resistencia de ampicilina, pero no en porciones del vector que sería esencial para la selección o expresión de células de mamífero. El DNA es digerido durante la noche a 37°C y subsecuentemente es precipitado con etanol y lavado antes de permitir que la pella de DNA se seque en la campana durante 20 minutos. Las células fueron preparadas a partir de un cultivo de células madre que ha sido pasado durante un mínimo de tres veces, pero no más de 30 generaciones de un frasco congelado. Las células son cultivadas a 37°C en 5% CO" en medio Excell 302 (JRH) complementado con L-glutamina a una concentración final de 4 mM y conteniendo 1x complemento HT. 2-3 días antes de la transfección, la línea de células madre es subcultivada y sembrada a una densidad final de .25 x 10e6/ml. En el día de la transfección, las células son recolectadas a una densidad de entre .7-1.0 x 10e6/ml. Las células son recolectadas mediante centrifugación (1500 rpm) y resuspendidas en una cantidad de medio para llevar la densidad celular final a 1 x 10e7 por 800 ul. 800 ul de células son colocadas en una probeta de electroporación de abertura de .4 cm. La probeta es colocada en hielo durante 10 minutos. La unidad Gene Pulsar II es ajustada a 350 volts y 925uF. La muestra es insertada y el pulso eléctrico es entregado de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. La muestra es removida y colocada en hielo durante 10 minutos. Tanto el voltaje real entregado como la constante de tiempo son registradas para proporcionar una indicación de la efectividad del pulso entregado. Siguiendo la incubación post-electroporación en hielo, las muestras son removidas de las probetas y son colocadas en un m atraz T75 e incubadas d urante 48 horas sin alterar a 37°C y 5% C02. Después de la recuperación, las muestras son contadas y la viabilidad es exam inada antes de colocar las muestras bajo selección. Selección inicial: El vector EASe contiene el gene DH FR y así, la selección es basada en este marcador. Se usaron dos esq uemas de selección/ampl ificación en la generación de l íneas de célu las. En am bos esquemas, las células fueron cultivadas en "suspensión a granel" (iniciando a partir de cultivos de 20 m i en matraces de agitración de 250 mi) y no hubo intento de obtener clones de células simples o poblaciones homogéneas de otra manera. U n esq uem a involucró selección inicial al cultivar las células recuperadas en Excell 302 + L-Gl utamina en la ausen cia del complemento de HT. Esta selección es referida como "-HT" o selección "basal". En este caso, las cél ulas son cultivadas a granel (manteniendo una densidad cel u lar viable de .2 x 10e6/m l) en los vol úmenes y recipientes apropiados, hasta que la población alcanza una viabilidad de >90% . En ese tiem po l as líneas son crioconservadas, analizadas para expresión y tomadas en el proceso de amplificación. El segundo esquema de selección involucra colocar la población recuperada post-transfectada directamente en varios n iveles de selección MTX. Estos niveles son 50, 1 50 y 300nM . Las células fueron cultivadas nuevamente como se describe antes h asta q ue alcanzaron una viabilidad cel ular estable , de preferencia >90% , pero en algunos casos se estabilizaron por debajo de este nivel . Protocolo de amplificación: La am plificación se basa en la suposición de que cualquier población de células dada contiene heterogeneidad. Esta heterogeneidad existe en el nivel cromosómico. De esta manera, al colocar una población bajo niveles crecientes de un agente selectivo, las células dentro de la población que posee más copias del marcador de resistencia son aquellas células que son seleccionadas para y eventualmente crecerán de las condiciones de selección. El marcador de resistencia debería estar enlazado genéticamente al gene de interés (en este caso trombina), y de esta manera, la amplificación resulta en mayores copias del cartucho de expresión, el cual a su vez resulta en niveles de expresión mayores. La amplificación no es un proceso general y de esta manera no es posible para cualquier marcador de resistencia. La amplificación basada en el marcador MTX es bien establecida, sin embargo, la resistencia de neomicina no es factible para amplificación. El protocolo para amplificación es realizado en cultivo a granel al sembrar una línea celular "madre" estabilizada a 5 x 10e5 células/ml en un volumen de matraz de agitación de 20 mi usando el medio selectivo apropiado. El cultivo es subcultivado cada 3-4 días, midiendo la viabilidad celular y densidades de células viables en cada paso. El cultivo es mantenido a la densidad de sembrado original y así el volumen de cultivo global puede ser disminuido por la recolección y resuspensión de las células. Eventualmente, la población de células resistentes comenzará a crecer y el volumen será incrementado conforme las células se estabilicen bajo las nuevas condiciones selectivas. Una vez que el cultivo se ha estabilizado, pueden tener lugar los análisis de expresión y muestras pueden ser conservadas para almacenamiento a largo plazo.

Ejemplo Análisis de expresión de matraz de agitación Todo análisis de expresión se realizó en cultivos a granel cultivados en escala de matraz de agitación. La expresión fue seguida principalmente por 4-12% Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen) y análisis de Western blot subsecuente. Se utilizaron tanto trombina como anticuerpos anti-His de acuerdo con lo establecido. En algunos casos, donde estuvo presente la trombina activa, se utilizó un ELISA para determinar los títulos. El medio acondicionado fue usado ya sea directamente o concentrado usando microconcentradores Microcon-30 (Amicon). Para análisis intracelular, las células fueron recolectadas mediante centrifugación (1500 rpm), se lavaron usando 1x PBS y se volvieron a suspender en amortiguador de lisis TPER (Pierce). Los Usados celulares fueron separados entonces del desecho celular mediante centrifugación nuevamente y los Usados se analizaron mediante SDS-PAGE y Western blot como se describe a continuación. Electroforesis de gel de poliacrilamida SDS: Se analizaron muestras mediante geles de 4-12% Bis-Tris NuPAGE usando amortiguador de corrida MOPS. Las muestras fueron diluidas en 4x amortiguador de muestra reductor de NuPAGE LDS (dodecil sulfato de litio). Las muestras fueron calentadas entonces usando un bloque de calor a 85°C durante 10 minutos. Una alícuota medida de cada muestra calentada fue cargada en el o los geles y la electroforesis fue realizada a un voltaje constante de 200 volts. Los geles fueron manchados con mancha de plata o azul coloidal. Se usaron estándares de peso molecular bajo (BioRad): fosforilasa b (97 kDa), BSA (66 kDa), ovalbúmina (45 kDa), anhidrasa carbónica (31 kDa), inhibidor de tripsina (22 kDa) y lisozima (14 kDa).

Ejemplo 12 Purificación de protrombina La protrombina recombinante purificada fue obtenida mediante un proceso de dos pasos que involucra una captura de fenil-sefarosa inicial seguida por cromatografía de afinidad de metal inmovilizado Ni-NTA (IMAC). Esto se logró al recolectar medios acondicionados conteniendo protrombina recombinante de bovino a partir de la línea de células CHO apropiada. Se usó la centrifugación (Sorvall/rotor GSA/8000 rpm/10 minutos) para separar las células del medio gastado. El paso de purificación de fenil sefarosa (Hi sub) fue realizado como sigue: se adicionó NaCI sólido (a una concentración final de 2 M) a 3 I de medios acondicionados, pH 6.4, y se cargó directamente sobre 1 .6 x 16.5 cm (33 mi) de fenil sefarosa (high sub). Después de la carga, la columna fue lavada 3.5 volúmenes de columna con 20 mM fosfato, pH 7, 2 M NaCI seguido por un gradiente de 2 volúmenes de columna de 2-0.5 M NaCI seguido por 5 volúmenes de columna de gradiente 0.5-0 M NaCI. Un lavado de volumen de columna 2 final 0.5 M NaCI también fue realizado. Todos los amortiguadores de levigación contenían 20 mM amortiguador de fosfato a pH 7.0. Las fracciones para ambos pasos de gradiente fueron analizadas mediante Western blotting usando anticuerpos anti-trombina y anti-His. Las fracciones conteniendo protrombina recombinante fueron depositadas entonces para uso en el siguiente paso de purificación.

El paso de cromatografía IMAC fue realizado entonces como sigue: se adicionó imidazol a la corriente principal de fenilo a una concentración final de 17 mM antes de cargar sobre una columna de superflujo Ni-NTA de 4 mi (1.1 x 4 cm) (Qiagen). La velocidad de flujo a lo largo fue 0.8 ml/min. Después de que se completó la carga, la columna fue lavada con 3.5 volúmenes de columna (cv) de 20 mM fosfato, pH 7, 0.5 M NaCI, 15 mM imidazol y 0.1% polietilenglicol (PEG) 8000. La proteína objetivo fue levlgada por un gradiente de imidazol de 15-300 mM de 8 cv en la presencia de 20 mM fosfato, pH 7, 0.05 M NaCI y 0.1% PEG 8000. Se recolectaron fracciones (2 mi) durante el gradiente y se analizaron mediante SDS-PAGE reductora y western blot. Las fracciones fueron depositadas con base en cantidad y pureza de protrombina recombinante etiquetada de IMAC mediante SDS-PAGE. Todos los pasos de cromatografía fueron realizados en una habitación enfriada (4-8C) en un Pharmacia FPLC.

Ejemplo 13 Purificación de pretrombina-2 Las líneas de céluas que expresan pretrombina-2 no secretaron la molécula precursora intacta. En este caso, se usó un proceso de dos pasos que permite el aislamiento de la forma activa de trombina de bovino. Este proceso consiste de una captura de intercambio de iones (por ejemplo, SP Sepharose Fast Flow), seguido por un paso de afinidad por heparina. Como es el caso con la purificación de protrombina, el material es aislado de medio acondiciondo en el cual las células son separadas del medio mediante centrifugación (Sorval/rotor GSA/8000 rpm/10 minutos). El paso de cromatografía de flujo rápido de sefarosa SP es realizado como sigue: se diluyó medio acondicionado clarificado (900 mi) conteniendo trombina activa con 50 mi de 20 m fosfato, pH 6.5. La muestra es diluda entonces a un volumen final de 2000 mi usando agua desiltada para reducir la conductividad (a 20C) a partir de 13.9 mmhos a 6.6 mmhos y un pH final de 6.5. Este material es cargado entonces directamente en una columna SP Sepharose Fast Flow de 1.6 x 13 (26 mi). La velocidad de flujo es 3 ml/m¡n a lo largo de la corrida. Después de que se completa la carga, la columna es lavada con 5 volúmenes de columna de 20 mM fosfato pH 6.5. La proteína objetivo es levigada por un gradiente de 0-0.6M NaCI de 10 volúmenes de columna en la presencia de 20 mM fosfato pH 6.5. Las fracciones (10 mi) son recolectadas durante el gradiente y son analizadas mediante actividad enzimática de S2238 y SDS-PAGE reductora. Las fracciones son depositadas con base en la actividad y pureza. El paso de afinidad de heparina es realizado como sigue: las fracciones depositadas (70 mi) tomadas del paso de sefarosa SP, son diluidas con 86 mi de 20 mM amortiguador de fosfato pH 7.4 y 335 mi de agua destilada, resultando en una conductividad final de 6.9 mmhos y pH 6.9. El material diluido (470 mi) es cargado sobre una Heparin Hi-Trap pre-empacada de 1 mi (Pharmacia) a una velocidad de flujo de 3 ml/min. La columna es lavada con 20 volúmenes de columna de 20 mM fosfato pH 7.4, seguido por un gradiente de levigación de 0-0.7M NaCI de 50 volúmenes de columna. Las fracciones (4 mi) son recolectadas durante el gradiente y son an alizadas med iante actividad enzimática de S2238 así como S DS-PAGE reductora con manchado de plata para vis ualizar el gel. La fracción conteniendo la actividad específica más alta es usada para los estudios cinéticos.

E jem plo 14 Ensayo de actividad de S2238 El ensayo de actividad de S2238 es usado para determinar la actividad de trombina de bovino. El principio de este método es medir la capacid ad de trombina para hidrolizar el substrato S-2238 , dihidrocloruro de H-D-fenilalanil-L-pipecolil-L-argln ina-p-n itroIanalina. De manera más especifica, la trombina cataliza la hidrólisis de p-nitroanalida (pNA) a partir del substrato de péptido S-2238. La velocidad a la cu al pNA se libera es medida en un espectrofotómetro Beckmann DU620 a 405 nm .

Ejem plo 1 5 Ensayo de activación de Proteína C Este método es usado para determi nar la especificidad relativa de trombina de bovino usada en la activación de Proteína C. Se usa un método de HPLC de fase inversa para medir l a formación de dos péptidos de activación , d odecapéptido (residuos #1 58-1 69), octadecapéptido (resid uos #1 52-1 69) y dos péptidos adicionales formados d urante la activación . La especificidad de trom bina es definida como la proporción entre el área de los péptidos de activación y el área total de los péptidos generados durante la activación . La especificidad relativa es definida com o la proporción entre la especificidad de la trom bina probada y la especificidad del estándar de referencia de trom bina de bovino. Activación de Proteína C recombinante: Se prepararon soluciones madre de dodecapéptido (DDP) y octadecapéptido (ODP) a partir de polvos liofilizados a 200 ug/m l usando amortig uador de activación como el diluyente. Estas soluciones madre son combinadas en volumen igual para crear un estándar de 1 00 ug/ml de ODP y 100 ug/ml de DDP que es inyectado en la máquina. El estándar de referencia de hPC es preparado al reconstituir un frasco a 1 ml/ml usando amortig uador de activación. Las muestras de trombina de bovino son prepa radas usando amortiguador de reconstitución para resuspender la enzima de po lvo a 1 -2 mg/ml. La trombina recom binante no necesitó ser reconstituida. La absorbancia de las m uestras de trombina se leyó a OD260 y OD280. Los datos de absorbancia y datos de ensayo de s u bstrato crom ogénico se usaron para confirmar la concentración real de la enzima en la reacción. Se adicionaron 5 un idades de la m uestra de trombin a de bovi no a hPC la reconstituida. Las m uestras fueron incubadas a 37°C d urante 6 horas con agitación . Sig uiendo la incubación, las muestras fueron almacenadas inmediatamente a -70°C hasta que pudieron ser inyectadas sobre el equipo de H PLC. El análisis de HPLC fue logrado usando una columna de fase inversa Zorbex 300SB-C1 8 corrida a 60°C y una velocidad de flujo de 1 .5 m l/min (4.6 mm x 15 cm , tamaño de pa rtícula de 3.5 uM). La detección se midió mediante absorbancia a 216 nm para detectar enlaces de am ida. Se usó un gradiente binario de TFA/ACN para la colum na de levigación. Activación de molécu las de derivados de proteína C recom binante: Alguien experto en la técnica se da cuenta de que las moléculas precursoras de trombina de bovino de la presente invención también pueden ser usadas para activar derivados o análogos de proteína C. Por ejemplo, los derivados de proteína C humana S11 G:Q32E:N33D y H10Q:S11G:Q32E:N33D. El derivado de proteína C humana S11 G:Q32E:N33D contiene un residuo de glicina en la posición 11 en lugar de un residuo de serina normalmente encontrado en esta posición, un residuo de ácido giutámico en la posición 32 en lugar del residuo de glutamina normalmente encontrado en esta posición, un residuo de ácido aspártico en la posición 33, en lugar del residuo de asparagina normalmente encontrado en esta posición. El derivado de proteína C humana H10Q:S11 G:Q32E:N33D contiene un residuo de glutamina en la posición 10, en lugar del residuo de histidina normalmente encontrado en esa posición, un residuo de glicina en la posición 11, en lugar del residuo de serina normalmente encontrado en esta posición, un residuo de ácido giutámico en la posición 32, en lugar del residuo de glutamina normalmente encontrado en esta posición, y un residuo de ácido aspártico en la posición 33 en lugar del residuo de asparagina normalmente encontrado en esta posición.

Claims (21)

REIVINDICACIONES

1. Un ácido nucleico aislado que codifica una molécula precursora de trombina recombinante de bovino, en donde dicha molécula precursora es protrombina y dicho ácido nucleico aislado es como se muestra en SEQ ID NO:5.

2. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:6, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino protrombina.

3. Un ácido nucleico aislado que codifica una molécula precursora de trombina recombinante de bovino, en donde dicha molécula precursora es pretrombina-2 y dicho ácido nucleico aislado es como se muestra en SEQ ID NO:7.

4. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:8, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino pretrombina-2.

5. Un ácido nucleico aislado que codifica una molécula precursora de trombina recombinante de bovino, en donde dicha molécula precursora es protrombina y dicho ácido nucleico aislado es como se muestra en SEQ ID NO:1.

6. Un polinucleótido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:2, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino protrombina.

7. Un ácido nucleico aislado que codifica una molécula precursora de trombina recombinante de bovino, en donde dicha molécula precursora es pretrombina-2 y dicho ácido nucleico aislado es como se muestra en SEQ ID NO:3.

8. Un polinucleotido que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEQ ID NO:4, en donde dicho polipéptido es la molécula precursora de trombina recombinante de bovino pretrombina-2.

9. La molécula precursora de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha molécula precursora es auto-activada.

10. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

11. El vector de la reivindicación 10, en donde dicha molécula de ácido nucleico está enlazada operablemente para controlar las secuencias reconocidas por una célula huésped transformada con dicho vector.

12. Una célula huésped comprendiendo el vector de la reivindicación 11, en donde dicha célula huésped es una célula CHO.

13. Un vector que comprende la molécula de ácido nucleico de cualquiera de las reivindicaciones 5-8.

14. El vector de la reivindicación 13, en donde dicha molécula de ácido nucleico está enlazada operablemente para controlar las secuencias reconocidas por una célula huésped transformada con dicho vector.

15. Una célula huésped que comprende el vector de la reivindicación 14, en donde dicha célula huésped es E. coli.

16. Un proceso para purificar trombina activada, en donde dicho proceso consiste de los pasos: (a) expresar molécula precursora de trombina recombinante de bovino pretrombina-2 como se muestra en SEQ ID NO:8, en una célula huésped; (b) purificar dicha molécula precursora de trombina recombinante de bovino mediante cromatografía de intercambio iónico; (c) purificar adicionalmente dicha molécula precursora de trombina recombinante de bovino mediante cromatografía por afinidad de heparina; y (d) ensayar dicha molécula precursora de trombina recombinante de bovino por pureza y actividad de trombina.

17. El proceso de la reivindicación 16, en donde dicha célula huésped es célula CHO.

18. El proceso de la reivindicación 17, en donde dicha molécula precursora de trombina recombinante de bovino es activada cuando se expresa a partir de dichas células CHO como pretrombina-2.

19. Un método para producir una proteína activada, en donde dicho método usa cualquiera de las moléculas precusoras de trombina recombinante de las reivindicaciones 1 a 8.

20. El método de la reivindicación 19, en donde dicha proteína activada es proteína C o un derivado de la misma.

21. El método de la reivindicación 19, en donde dicha proteína activada contiene una secuencia de activación diferente de la secuencia de factor Xa natural.