MXPA04000806A - Nuevos peptidos cationicos de la familia dermaseptina aislados de la secrecion de piel de phyllomedusa hypochondrialis. - Google Patents

Abstract

Esta invencion se refiere a peptidos anti-microbianos que tienen la misma secuencia de aminoacidos y al menos la misma actividad anti-microbiana que aquellas de Phylloseptinas, los cuales son aislados de la piel de Phyllomedusa Hypochondrialis. Los peptidos no tuvieron ninguna homologia estructural con otro peptido conocido. Los peptidos anti-microbianos de 19 residuos son cationicos y se basan en su estructura primaria, todos los peptidos pueden ser ajustados a una a helice anfifilica. Las masas de peptidos analizadas mediante espectrometria de masa estuvieron en el rango de 1.9 a 2.0 kDa. Estos peptidos pueden ser usados en composiciones para retardar patogenos de plantas y para proteger plantas de patogenos, comprendiendo al menos un peptido antibiotico y un portador agricolamente aceptable. Otra modalidad de la invencion es proporcionar composiciones terapeuticas adecuadas para uso humano, veterinario o farmaceutico, comprendiendo uno o mas de los peptidos liberados en esta invencion y un portador farmacologicamente adecuado.

Description

NUEVOS PEPTIDOS CATIONICOS DE LA FAMILIA DERMASEPTINA AISLADOS DE LA SECRECION DE PIEL DE PHYLLOMEDUSA HYPOCHONDRIALIS Campo de la invención Esta invención se refiere a péptidos anti-microbianos con actividad contra un amplio rango de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas, hongos y protozoarios. Las composiciones farmacéuticas conteniendo los péptidos anti-microbianos aquí descritos son útiles para ser usadas en la profilaxis y tratamiento terapéutico de humanos y animales bajo condiciones las cuales deprimen o compromenten su sistema inmunológico. Las composiciones basadas en los péptidos de la invención también son útiles para retardar el crecimiento de patógenos de plantas.

Antecedentes de la invención Las bacterias y hongos, así como otros organismos, incluyendo patógenos de plantas, coexisten con todos los organismos vivos y además de este hecho, las infecciones patogénicas no son frecuentes debido a la eficiencia de mecanismos de auto defensa. Los microorganismos que invaden el cuerpo humano o animal y plantas son retados por varios mecanismos de defensa. Cuando las defensas del huésped carecen de una barrera eficiente contra la invasión de patógenos, se han usado antibióticos para funcionar como bactericidas y, en general, anti-microbianos. Sin embargo, se han buscado continuamente diferentes antibióticos debido a los severos efectos laterales y el surgimiento de resistencia adquirida de microorganismos mutantes a los antibióticos usados de largo plazo. A este respecto, se han realizado intentos para desarrollar antibióticos novedosos al clasificar metabolitos secundarios de microorganismos, al sintetizar análogos de antibióticos conocidos, tales como quinolonas o al aislar proteínas o péptidos inducidos mediante mecanismos de defensa intracelular de plantas y animales. De hecho, las defensas del huésped incluyen factores mecánicos y químicos. Uno de los mecanismos de defensa química de animales y plantas contra la infección es la producción de péptidos que tengan actividad anti-microbiana. Los péptidos Uticos anfipáticos que ocurren de manera natural juegan un importante, si no es que crítico, papel como agentes inmunologicos y tienen algunas funciones de defensa en un rango de animales. La función de estos péptidos es destruir células procarióticas y otras células no de huésped al romper la membrana ceular y promover la lisis celular. Las características comunes de estos péptidos que ocurren de manera natural incluyen una carga básica global, un tamaño pequeño (23-39 residuos de aminoácidos) y la capacidad para formar a-hélices anfifílicas, Muchas familias diferentes de péptidos anti-microbianos, clasificadas por su secuencia de aminoácidos y estructura secundaria han sido aisladas de insectos (Steiner, H.; Hltmark, D.; Engstrom, A.; Bennich, H. & Boman, H.G., 191. Nature 292, 246-248), plantas (Cammue, B.P.; De Bolle, M.F.; Térras, F.R.; Proost, P.; Van Damme, J.; Rees, S.B.; Vanderleyeden, J. y Broekaert, W.F. 1992, J. Biol. Chem. 267. 2228-2233), mamíferos (Nicolás, P. & Mor, A. 1995, Annue. Rev. Imunol. 49: 277-304) y microorganismos (Boman, H.G. 1995. Annu. Rev. Imunol. 13: 61-92). La cecropina, defensina conteniendo cisteína y sapcin, aisladas de insectos, son ejemplos de péptidos antibacterianos cuyo sitio objetivo es la membrana lipídica de bacterias Gram positivas (Kuzuhara, T. et al. 1990. J. Biochem. 107: 514-518). Estodios han demostrado que la Cecropina B aislada de Bombix mori tiene actividad biológica contra especies bacterianas (Kadono-Okuda, K. Taniai, K., Kato, Y. Kotani, E. & Yamakawa, M. 1995. J. Invertebr. Pathol. 65, 309-310). Además, se reportó que este péptido, cuando se transubica en los espacios intercelulares en plantas transgénicas de arroz es protegido de la degradación por peptidasas de plantas y confiere resistencia intensificada contra infección de Xanthomonas oryzae pv. oryzae (Sharma, A.; Sharma, R.; Imamura, M.; Yamakawa, M. & Machii. H. 2000. FEBS.484: 7-11). Attacina, sarcotoxina, deftericina, coleoptericina, apidaecina y abaecina son otros péptidos antibacterianso cuyo sitio objetivo son membranas lipídicas. Estos péptidos conservan los dominios G y P y tienen una influencia en la diferenciación celular de bacterias Gram negativas. En particular, también se ha reportado que la attacina descompone la membrana exterior de la bacteria enfocada al inhibir la síntesis de las proteínas de membrana exterior. Además de los péptidos antibacterianos citados antes de insectos, también se han aislado varios péptidos antibióticos de anfibios. En realidad, como otros animales, los anfibios son ricos en péptidos antl-microbianos (Zasloff, M. 1987, Proc. Nati. Acad. Sci 89:5449-5453) y muchos de ellos pertenecen al grupo de péptidos de estructura a-helicoidal antipática, tales como magaininas (Daba, H., Pandian, S., Gosselin, J.F. Simard, R.E., Huang, J. y Lacrolx, C. 1991. Appli. Environ. Microbiol, 57, 3450-3455), bombininas (Gibson, B.W., Tang, D., Mandrell, R., Kelly, M. y Spindel, E.R. 1991, J. Biol. Chem. 266, 23103-23111), bufoninas (Park, C.B., Kim, M.S. y Kim, S.C. (1996) Biochem. Biophys. Res. Comm. 218, 408-413), dermaseptinas (Batista, C.V.C., Silva, L.R. Sebben, A., Scaloni, A., Ferrara, L, Paiva, G.R., Olamendi-Portugal, T., Possani, L.D. y Bloch, C.Jr. 1999. Peptides 20, 679-686) y defensinas (Kagan, B.L. et al. 1990. "Anti-microbial defensin peptids form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes" (Péptidos de defensina antimicrobianos de canales permeables a iones, dependientes de voltaje en membranas de bicapas lipídicas planas). Proc Nati Acad Sci. USA, 87(1)210-214). La mayoría de estos péptidos han sido aislados de glándulas y tracto gastrointestinal. Todas estas moléculas han sido temas de investigación intensa con el fin de aclarar sus biosíntesis, mecanismo de acción, actividad hacia microorganismos y aplicaciones clínicas potenciales. Una importante clase de péptidos anti-microbianos son aquéllos conocidos como Magaininas. De acuerdo con Zasloff (1987), al menos cinco proteínas pueden ser aisladas de la piel de la rana garruda africana (Xenopus laevis). Las proteínas naturales son activas contra un amplio rango de microorganismos incluyendo bacterias, hongos y protozoarios. La actividad anti-microbiana de amplio espectro también está presente en péptidos sintéticos y en ciertos análogos truncados de las proteínas naturales. Tal clase de polipéptidos bio-activos de amplio espectro han sido descritos en US 5 643 876. Estos péptidos tienen un peso molecular de aproximadamente 2500 Da o menos, son altamente solubles en agua, anfifílicos y no hemoliticos. También son definidos como una clase de péptido homogéneo, substancialmente puro, compuesto por aproximadamente 25 aminoácidos. La US 5 424 395 describe un péptido sintético con 23 aminoácidos, derivado de magainina II que muestra actividad anti-microbiana en plantas. US 5 912 231 presenta un compuesto que comprende un péptido Magainina I o Magainina II con actividad biológica, en donde al menos una substitución puede hacerse por ciertos residuos de aminoácidos con otros residuos de aminoácidos. Los péptidos resultantes son conocidos como análogos de substitución. Los péptidos preferidos son aquéllos obtenidos por supresión o substitución de al menos un residuo de aminoácido en la posición 15 y/o 23. US 5 424 395 también describe péptidos sintéticos derivados de Magainina I y Magainina II teniendo actividad anti-microbiana. Los péptidos contienen 23 residuos de aminoácidos y son útiles para retardar el crecimiento de patógenos de plantas. US 5 912 230 describe una invención basada en péptidos substancialmente puros, los cuales tienen actividad anti-candidana o antibacteriana, las cuales son equivalentes a aquélla de histatinas que ocurren de manera natural, pero son de menor tamaño. Estos péptidos representan porciones definidas de las secuencias de aminoácidos de proteínas salivales ricas en histidina humana, que ocurren de manera natural, llamadas histatinas. Las defensinas son polipéptidos relativamente pequeños de aproximadamente 3-4 kDa, ricos en cisteína y arginina. Como una clase de péptidos anti-microbianos, las defensinas tienen actividad contra algunas bacterias, hongos y virus. Se cree que las defensinas tienen conformaciones moleculares estabilizadas por enlaces de cisteína, los cuales son esenciales para la actividad biológica Los documentos US 5 861 378 y US 5 610 139 describen péptidos aislados de hemocito de cangrejo de herradura, teniendo una secuencia de aminoácidos similar a aquéllas de defensina y mostrando actividades antimicrobianas fuertes en la fracción 5S, así como composiciones y preparaciones farmacéuticas usándolos. También proporcionan un DNA que codifica uno o más péptidos, los cuales muestran una actividad fisiológica significativa contra bacterias Gram positivas y Gram negativas y hongos. US 5 610 139 también presenta composiciones anti-microbianas, conteniendo los péptidos referidos combinados con uno o más antibióticos de ß-lactol o cloranfenicol, exhibiendo estas composiciones un efecto bactericida sinérgico contra infecciones de S. aureus. En US 5 766 624 se propone un método para tratamiento de infección microbiana en mamíferos usando defensinas; US 5 821 224 también presenta una ß-defensina de 38-42 aminoácidos, con actividad anti-microbiana, obtenida de neutrófilos bovinos. La Catepsina G es una proteína de gránulo con actividad como quimiotripsina siendo también conocida como proteína catiónica similar a quimiotripsina. Algunos polipéptidos mutuamente homólogos a la catepsina G son llamados defensinas. En US 5 798 336, varios péptidos con actividad anti-microbiana son proporcionados, estando relacionada la secuencia de dichos péptidos con secuencias de aminoácidos dentro de la catepsina G. A pesar de que algunos de los péptidos han mostrado especificidad debido a que son más efectivos contra un microorganismo determinado, principalmente son efectivos tanto contra bacterias Gram-negativas como Gram-positivas. Se menciona que las composiciones farmacéuticas conteniendo estos péptidos son útiles en el tratamiento de profilaxis de infecciones. Otro tipo de péptidos anti-microbianos llamado buforina se aisló del tejido del estómago del sapo asiático Bufo bufo garagrizans. Dos moléculas derivadas de histona H2A fueron identificadas, Buforina I y Buforina II, las cuales contienen 39-aa y 21-aa respectivamente. Estas moléculas mostraron diferentes mecanismos de acción, teniendo buforina II una actividad anti-microbiana mucho más fuerte, matando bacterias sin lisar células y presentando alta afinidad por DNA y RNA. Esto sugiere que el objetivo de este péptido es que los ácidos nucleicos y no las membranas celulares (ver Park, C.B.; Yi, K.; Matsuzaki, K.; Kim, M.S.; Kim, S.C. 2000. PNAS 97:8245-8250). US 5 877 274 proporciona una clase novedosa de péptidos catiónicos referidos como bactolisinas, las cuales tienen actividad antimicrobiana y tienen la capacidad para reducir significativamente el nivel de factor de necrosis de tumor (TNF) inducido por lipopolisacárido (LPS). En este documento, también se propone un método para inhibir ya sea el crecimiento de bacterias o una endotoxemia o desorden asociado a sepsis al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del péptido. Cada uno de estos diferentes tipos de péptidos se distingue por características de secuencia y estructura secundaria. Con base únicamente en la secuencia, es difícil predecir ya sea la actividad de un péptido o la estructura secundaria que se formará (Hancock, R.E.W., y Chapple, D.S. 1999. Anti-microbial Agents and Chemotherapy (Agentes anti-microbioanos y quimioterapia), 43, 1317-1323). La mayoría de los péptidos sin puentes disulfuro tienen estructuras aleatorias en el agua, y cuando se unen a una membrana u otro ambiente hidrofóbico, o se auto-agregan, forman una estructura (Bello, J., Bello, H.R. y Granados, E. 1982. Biochemistry 21, 461-465; Falla, T.J., Karunaratne, D.N., y Hancock, R.E.W. 1996. J. Biol. Chem. 271, 19298-19393). Por ejemplo, las cecropinas y mellitina solo adquienen alfa-hélices anfifílicas en ambientes membranosos. Se sabe que tanto la naturaleza catiónica e hidrofóbica dual de los péptidos es imporante para la interacción inicial entre el péptido y que es el carácter catiónico de la membrana bacteriana lo que promueve la interacción con membranas exteriores y citoplásmicas bacterianas (Hancock, R.E.W., Falla, T., y Brown, M.H. 1995. Adv. Microb. Physio. 37, 135-175). Varias hipótesis han sido sugeridas para el mecanismo de acción de los péptidos líticos, la mayoría de ellos relacionados con la destrucción de la membrana. Sin importar el mecanismo de daño de membrana inducido por péptido lítico, se supone que una conformación secundaria ordenada, tal como una hélice anfifílica y densidad de carga positiva, participan en la reacción de lisis promovida por péptido.

La unión de membrana es el primer paso del mecanismo de interacción de péptido-membrana y el conocimiento de sus determinantes y fuerza impulsora son pre-requsitos para entender el mecanismo por sí mismo y las razones moleculares para la especificidad procariótica (Saberwal, G., y Nagaraj, R. 1994. Biochem. Biophys. Acta 1197, 109-131). Se encontró que los péptidos cargados positivamente se unen preferencialmente a membranas cargadas de manera negativa, lo cual es la razón principal para la especificidad procariótica. La afinidad intensificada es provocada por una atracción electrostática de los péptidos a la superficie de membrana cargada de manera negativa, en lugar de una interacción específica de lípidos (Westerhoff, H.V., Juretic, D., Hendler, R.W., y Zasloff, M. (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 86, 6597-6601). La presente invención describe una clase novedosa de péptido antimicrobiano, aislado de la piel de Pyllomedusa hypochondiralis, una clase de rana natural del Amazonas, Brasil. Se llamaron Pylloseptinas y su estructura no mostró ninguna homología con otros péptidos conocidos.

Breve descripción de la invención Esta invención se refiere a péptidos anti-microbianos que tienen la misma secuencia de aminoácidos y al menos la misma actividad antimicrobiana como aquéllas Phylloseptinas, las cuales son aisladas de la piel de Phyllomedusa hypochondrialis. Los péptidos no tuvieron ninguna homología estructural con otro péptido conocido. Los péptidos antimicrobianos de 19 residuos son catiónicos y se basan en su estructura primaria, todos los péptidos pueden ser ajustados a una a-hélice anfifílica.

Las masas de péptidos analizadas por espectrometría de masa estuvieron en el rango de 1.9 a 2.0 kDa. Los péptidos preferidos de la presente invención incluyen los péptidos llamados Phylloseptina-I, Phylloseptina-ll y Phylloseptina-lll, los cuales son definidos por sus secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No.2 y SEQ ID No. 3. La naturaleza anfifílica de estos péptidos subraya presumiblemente sus actividades biológicas, lo cual les permite asociarlas con membranas lipídicas y romper la función de membrana normal. Sin embargo, no se encontró una actividad hemolítica significativa para estos péptidos, los cuales sugieren una selectividad para membranas procarióticas sobre eucarióticas. Una primera modalidad de la presente invención se refiere a un péptido antibiótico con una actividad anti-microbiana de amplio espectro teniendo la misma secuencia de aminoácidos y al menos la misma actividad anti-microbiana como el péptido definido en la fórmula: Phe Leu Ser Leu Me Pro His Ala Me Asn Ala Val Ser Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 His Xaa5, en donde Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 y Xaa5, son cada uno independientemente un aminoácido hidrofóbico, un aminoácido básico hidrofílico o un aminoácido neutral hidrofílico, con las condiciones de que (i) cuando Xaa1, Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos hidrofóbicos, Xaa4 es un aminoácido básico hidrofílico y Xaa5 es un aminoácido neutral hidrofílico; (ii) cuando Xaa2, Xaa3 y Xaa5 son aminoácidos hidrofóbicos, Xaa1 es un aminoácido hidrofóbico o un aminoácido neutral hidrofílico y Xaa4 es un aminoácido básico hidrofílico o un aminoácido neutral hidrofílico. Una segunda modalidad es dirigida a una composición para inhibir el crecimiento de una célula objetivo, por ejemplo, hongos, bacerias, protozoarios, comprendiendo (a) al menos un péptido antibiótico como se define en la reivindicación 1, y (b) un portador farmacéuticamente aceptable. Una tercera modalidad se refiere a una composición para retardar patógenos de plantas y proteger plantas de patógenos, comprendiendo (a) al menos un péptido antibiótico como se define en la reivindicación 1 y (b) un portador agrícolamente aceptable. Una modalidad adicional de la invención es proporcionar composiciones terapéuticas adecuadas para uso humano, veterinario o farmacéutico, comprendiendo uno o más de los péptidos liberados en esta invención y un portador farmacológico adecuado. Los péptidos preferidos de la presente invención incluyen los péptidos llamados Phylloseptina-I (PSI), Phylloseptina-ll (PSII) y Phylloseptina-lll (PSIII), los cuales son definidos por sus secuencias de aminoácidos SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2 y SEQ ID No. 3, respectivamente. SEQ ID No. 1: Phe Leu Ser Leu lie Pro His Ala He Asn Ala Val Ser Ala lie Ala Lys His Asn SEQ ID No. 2 Phe Leu Ser Leu lie Pro His Ala He Asn Ala Val Ser Thr Leu Val His His Phe SEQ ID No. 3 Phe Leu Ser Leu lie Pro His Ala lie Asn Ala Val Ser Ala Leu Ala Asn His Gly Breve descripción de las figuras Figura 1: muestra el despliegue cromatográfico del extracto crudo de secreción de piel de Phyllomedusa hypochondrialis (A) y los péptidos Phylloseptina I (PSA), Phylloseptina II (PS2) después del procedimiento recromatográfico (B). Figura 2: muestra las gráficas de ruedas helicoidales de las Phylloseptinas y sus estructuras anfifilicas. Figura 3: muestra una imagen AFM de estructura morfológica intacta de Pseudomonas aeruginosa. Figura 4: muestra una célula de P. aeruginosa con alteraciones de membrana debidas al tratamiento con el péptido PS I.

Descripción detallada de la invención Para fines de claridad y un completo entendimiento de la invención, se definen los siguientes términos "Anti-microbianos" se refiere a péptidos que inhiben, previenen o destruyen el crecimiento o proliferación de microbios, tales como bacterias, hongos, protozoarios o similares. "Anti-bacterianos" se usa para significar los péptidos que producen efectos adversos para las funciones biológicas normales de bacterias, incluyendo muerte o destrucción y prevención del crecimiento o proliferación de las bacterias cuando se contactan con los péptidos de la presente invención. "Antibióticos" significa los péptidos que son desfavorables a las funciones biológicas normales de la célula, tejido u organismo no huésped cuando entran en contacto con los péptidos de la presente invención. "Aiiti-fungales" significa los péptidos que inhiben, previenen o destruyen el crecimiento o proliferación de hongos. "Anti-parasíticos" se refiere a péptidos que inhiben, previenen o destruyen el crecimiento o proliferación de parásitos. "Cantidad efectiva anti-infección" de una composición farmacéutica significa cualquier cantidad de una composición farmacéutica, la cual es efectiva para inhibir o prevenir el establecimiento, crecimiento o esparcimiento de una infección sensible a los péptidos de la invención. "Patógeno de planta" abarca aquéllos organismos que pueden provocar daño y/o enfermedad a plantas, e incluye hongos, procariotes (bacterias y micoplasma), nemátodos, protozoarios y similares. Las pieles de las ranas sudamericanas Phyllomedusa son una excelente fuente de moléculas de péptidos (Ver Bevins, C.L., Zasloff M. 1990. Annu. Rev. Biochem. 59, 295-414; Batista et al., 1999). Phyllomedusa hypochondrialis (Anura, Hylidae) es una rana arborícola natural del Amazonas, Brasil. La presente invención se refiere a una novedosa clase de péptidos biológicamente activos llamados Phylloseptinas. De manera más particular, esta invención proporciona tres nuevos péptidos llamados Phylloseptina-I (PSI), Phylloseptina-ll (PSII) y Phylloseptina-lll (PSIII), aislados de la piel de adultos de Phyllomedusa Hypochondrialis. Con el fin de identificar y caracterizar PSI, PSII y PSIII, los péptidos fueron aislados mediante fraccionamiento de la secreción de piel total del extracto crudo liofilizado de P. hypochondrialis. Las técnicas usadas para aislar los componentes de tales extractos son bien conocidas para los técnicos expertos y no es una característica crítica de la presente invención. Para ¡lustrar, el aislamiento de de PSI, PSII y PSIII se realizó mediante la aplicación (alícuotas de 5 mg cada vez) del extracto crudo a una columna cromatográfica de fase inversa Vydac semi-preparatoria, Ci8, 10µ (10 x 250 mm) en un sistema HPLC. Los péptidos fueron purificados al usar un gradiente lineal doble, inicialmente 0% a 80% de acetonitrilo conteniendo 0.1% TFA (ácido trifluoroacético) durante 70 min, seguido por 80% a 100% del mismo solvente durante 20 min. El experimento fue monitoreado 216 nm y las fracciones fueron recolectadas manualmente y se liofilizaron. Las fracciones aisladas fueron re-cromatografiadas al usar una Vydac 218 TP 54, C 8, 5µ (0.46 x 25 cm), con gradientes optimizados de aceotnitrilo en 0.1% TFA sobre 60 min y su pureza fue monitoreada mediante espectrometría de masa (MALDI/TOF). La Figura 1 muestra el despliegue cromatográfico del extracto crudo (A) y los péptidos Phylloseptin II (PSII), Phylloseptin III (PSIIUI) después del procedimiento recromatográfico (B). Las gráficas de ruedas helicoidales de las Phylloseptinas que muestran su estructura anfifílica se ilustran en la Figura 2. En esta conformación, la variación periódica en el valor de hidrofobicidad de los residuos a lo largo del esqueleto del péptido con un periodo de 3.6 residuos/ciclo caracterizan una a-hélice (Schiffer, M. y Edmunson, A.B. 1967. "Use of helical wheels to represent the structures of proteins and to identify segments with helical potential" (Uso de ruedas helicoidales para representar las estructuras de proteínas y para identificar los segmentos con potencial helicoidal). Biophys J. 7(2): 121-35). Las moléculas catiónicas de esta invención no son estructuradas en solución y podrían ser atraídas inicialmente a la superficie bacteriana mediante interacciones electrostáticas con especies cargadas negativamente (cabezas de fosfolípidos) en sus superficies. Entonces asumen una estructura a-helicoidal antipática en la superficie de membrana al insertar el sector hidrofóbico en la membrana, en contacto con las cadenas de lípidos, mientras que los residuos polares o cargados en el sector hidrofílico permanecen en contacto con los grupos de cabezas aniónicas de fosfolípidos y el ambiente exterior. Así se acumulan en la hojuela exterior de la membrana con sus ejes paralelos a su superficie, provocando deformación y adelgazamiento. Las secuencias de péptidos antibióticos de la presente invención pueden estar compuestas por ya sea residuos de a-D- y/o a-L-aminoácidos en la cadena de polipéptido completo o partes específicas de ésta (por ejemplo, N-terminal, C-terminal o regiones helicoidales internas). Los péptidos anti-microbianos de 19 residuos son catiónicos y basados en su estructura primaria, los tres péptidos pueden ser ajustados a una a-hélice anfifílica. Las masas de péptidos analizadas por espectrometría de masa estuvieron en el rango de 1.9 a 2.0 kDa. Estos péptidos mosraron actividad efectiva contra un amplio rango de bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. Sin embargo, no se encontró una actividad hemolítica significativa para estos péptidos, lo cual sugiere una selectividad por membranas procarióticas sobre eucarióticas. El término aislado como se usa en la presente, se refiere a un péptido substancialmente libre de proteínas, lípidos, ácido nucleico, por ejemplo. Aquéllos de habilidad en la técnica pueden hacer substituciones similares para lograr péptidos con la misma actividad anti-microbiana que los péptidos de la invención. Los péptidos de esta invención pueden ser producidos mediante técnicas conocidas y obtenidos en forma substancialmente pura. Por ejemplo, los péptidos pueden ser sintetizados manualmente o en un sintetizador de péptidos automático. También es posible producir los péptidos mediante técnicas de ingeniería genética. Los codones ue codifican los aminoácidos específicos son conocidos para aquéllos expertos en la técnica, y por lo tanto el DNA que codifica los péptidos puede ser construido mediante técnicas apropiadas, y uno puede clonar tal DNA en un vehículo de expresión apropiado (por ejemplo, un plásmido o un fago), el cual sea transfectado en un sistema adecuado para expresión de los péptidos. Como se menciona antes, los péptidos de la presente invención tienen un amplio rango de actividad antibiótica potente contra una pluralidad de microorganismos incluyendo bacterias Gram positivas y Gram negativas, hongos, protozoarios y otros parásitos que son útiles para animales, incluyendo humanos, y plantas. Concerniendo al tratamiento terapéutico y profilaxis de animales, los péptidos de la presente invención pueden ser empleados para promover o estimular la curación de una herida de un huésped. La curación de herida involucra varios aspectos, los cuales incluyen, pero no están limitados a, contracción incrementada de la herida, deposición incrementada de tejido conectivo, como es evidenciado por, por ejemplo, la deposición incrementada de colágeno en la herida, y fuerza de tensión incrementada de la herida. En breve, los péptidos de la presente invención trabajan con el fin de invertir la inhibición de la curación de la herida provocada por condiciones que deprimen o compromenten el sistema inmune. Su actividad de curación de herida incluye el tratamiento de quemaduras externas y para tratar y/o prevenir infecciones de la piel y quemaduras. En particular, los péptidos pueden ser usados para tratar infecciones de la piel provocadas por bacterias Gram positivas y/o Gram negativas, tales como P. aeruginosa y S. aureus. Los péptidos de la invención también tienen propiedades profilácticas y terapéuticas que conciernen a infecciones oculares, las cuales pueden ser provocadas por bacterias, tales como, P. aeruginosa, S. aureus y N. gonorrhoeae, por hongos, tales como, P. braziliensis, C. albicans y A. fumigatus, por parásitos, tales como, A. castellani o por protozoarios. Los péptidos de la presente invención o análogos de los mismos, pueden ser administrados en combinación con un portador o vehículo farmacéutico no tóxico, tal como relleno, amortiguador no tóxico o solución salina fisiológica. Tales composiciones farmacéuticas pueden ser usadas tópica o sistémicamente, y pueden estar en cualquier forma adecuada, tal como líquido, sólido, semi-sólido, solución inyectable, tableta, ungüento, loción, pasta, cápsula o similar. Las composiciones de péptidos de la presente invención también pueden ser usadas en combinación con auxiliares, inhibidores de proteasa o medicamentos compatibles, donde tal combinación es vista por ser deseable o ventajosa para controlar la infección provocada por microorganismos patogénicos incluyendo protozoarios y similares, así como por parásitos. Dependiendo del uso, una composición de acuerdo con la invención contendrá una cantidad anti-microbiana efectiva, y/o una cantidad anti-fungal efectiva, y/o una cantidad anti-parasítica efectiva, y/o una cantidad antibiótica efectiva, de uno o más de los péptidos de la presente invención.

Los péptidos descritos en la presente invención pueden ser usados en composiciones conteniendo otros péptidos teniendo actividad anti-microbiana. Ejemplos de estos péptidos son mencionados en Park, C.B. et al. "Structure-activity analysis of buforin II, a histone H2A-derived antimicrobial peptide: The proline hinge is responsible for the cell-penentrating ability of buforin II" (Análisis de estructura-actividad de buforina II, un péptido antimicrobiano derivado de la histona H2A: El gozne de prolina es responsable de la capacidad de penetración celular de buforina II), PNAS. 97(15), pp. 8245-8250. 2000 y aquéllos descritos en las patentes US 5424395, US 5912230, US 5861378, US 5610139, US 5821224 y US 5877247. Haciendo referencia a la forma de administración, las composiciones de péptidos de la presente invención pueden ser administradas mediante aplicación directa de los péptidos a la célula objetivo, o aplicados indirectamente a través de la administración sistémica. Los métodos para administrar composiciones farmacéuticas a animales incluyen administración intravenosa, intra-arterial, intra-ocular, intra-peritoneal, intra-muscular, intra-nasal, intra-vaginal, subcutánea, rectal y tópica. El modo de administración elegido para una composición farmacéutica particular dependerá de una variedad de factores bien conocidos para el técnico ordinariamente experto o bien dentro de su competencia para determinar sin experimentación indebida. Estos incluyen, pero no están limitados al sujeto de tratamiento y su edad, tamaño y condición general; el agente activo siendo administrado; y la enfermedad, desorden o condición siendo tratada. Normalmente, la cantidad efectiva anti-infección de las composiciones farmacéuticas provista en la presente, es una cantidad conteniendo entre aproximadamente 0.1 mg hasta aproximadamente 1000.0 mg de uno o más de los péptidos de la invención por kg del peso corporal del animal al cual se administra la composición. Dentro de este rango, la cantidad o dosis de la composición farmacéutica dada a un animal particular dependerá de una variedad de factores bien conocidos para la persona experta en la técnica. La cantidad particular de la composición farmacéutica administrada para la enfermedad, desorden o condición particular indicada, puede ser determinada mediante métodos bien concidos para el técnico experto, por ejemplo, mediante ensayos que varían la dosis. Los péptidos, cuando se usan en composiciones tópicas, generalmente están presentes en una cantidad de al menos 0.1% en peso. En tales preparaciones farmacéuticas, las cantidades mayores que 2.0% en peso son comunes. Al emplear composiciones administradas sistémicamente, tales como intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, el péptido o péptidos de la invención están presentes en una cantidad para lograr un nivel de suero de péptido(s) de al menos aproximadamente 5 µ?/?t??. En la mayoría de los casos, el nivel de suero no necesita exceder 500 µ9/???. Tales niveles de suero pueden lograrse al incorporar el péptido en una composición a ser administrada sistémica a una dosis desde 1 hasta aproximadamente 100 mg/kg. En otra modalidad, los péptidos de la presente invención son útiles para retardar los patógenos de plantas, y para proteger las plantas de patógenos de plantas. En una aplicación externa, los péptidos pueden ser diluidos en soluciones o suspensiones líquidas, o pueden mezclarse con un diluyente sólido para ser aplicadas como un polvo para dar una composición conteniendo una cantidad de entre aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 µg de uno o más péptidos de la invención. Los métodos detallados para adaptar métodos generales de aplicación a cosechas y patógenos específicos fueron descritos en Methods for evaluating pesticides for control of plant pathogens. (Métodos para evaluar pesticidas para control de patógenos de plantas), Hickey, K.D., Ed., The American Phytopathological Society (St. Paul, Minn), 1986. Los métodos de aplicación que se espera que sean particularmente útiles de acuerdo con este aspecto de la presente invención incluyen atomizadores acuosos y no acuosos intermitentes de la planta completa o partes de la misma, recubrimientos de semillas e inclusión en sistemas de irrigación (por ejemplo, bancos de niebla de invernaderos). Los auxiliares que podrían ser adicionados a la formuación incluirían agentes para ayudar a la solubilización, agentes humectantes y estabilizantes, o agentes que producirían producto microencapsulado. La presente invención se describirá adicionalmente con respecto a los ejemplos como sigue, pero el alcance de la invención no estará limitado por ellos.

Ejemplos Ejemplo 1: Purificación de péptidos La secreción de piel de rana (extracto crudo) fue obtenida de especímenes adultos de Phyllomedusa hypochondríalis capturada en Brasilia, Brasil. La secreción de rana fue obtenida mediante estimulación eléctrica moderada de las glándulas granulares de la piel de P, hypochondríalis y se recolectó fresca en agua destilada como un extracto crudo. El extracto se filtró mediante gravedad a través de papel filtro, se congeló y se liofilizó (Centrivap Concentrador LABCONCO). La separación de péptidos se realizó mediante aplicación (alícuotas de 5 mg cada vez) del extracto crudo a una columna cromatográfica de fase inversa Vydac semí-preparatoria, Ci8, 10µ (10 x 250 mm) en sistema HPLC. Los péptidos fueron purificados al usar un gradiente lineal doble, inicialmente 0% a 80% de acetonitrilo conteniendo 0.1% TFA (ácido trifluoroacético) durante 70 min, seguido por 80% a 100% del mismo solvente durante 20 min. El experimento fue monitoreado 216 nm y las fracciones fueron recolectadas manualmente y liofilizadas. Las fracciones aisladas fueron re-cromatografiadas al usar un Vydac 218 TP 54, C18, 5µ (0.46 x 25 cm), con gradiente optimizados de acetonitrilo en 0.1% TFA sobre 60 min y su pureza fue monitoreada mediante espectrometría de masa (MALDI/TOF).

El perfil cromatográfico correspondiente para la secreción de piel total de P. hypochondrialis después de la purificación de RP-HLPC es mostrado en la Figura 1A. Los picos 1 a 7 corresponden a otras moléculas bioactivas, las cuales no están incluidas en la presente invención. PSI (Phylloseptina I) es asignada directamente en el perfil y el componente marcado con el asterisco (*) corresponde a la mezcla de PSII y PSIII, las cuales fueron separadas individualmente como se muestra en la inserción 1B.

Ejemplo 2: Determinación de peso molecular y secuenciación de aminoácidos N-terminales. La masa molecular de los péptidos anti-microbianos se determinó mediante espectrometría de masa MALDI-TOF (Matrix-Assisted Láser Desorption / lonization - Time Of Flight (desorción / ionización láser asistida por matriz - tiempo de vuelo). Los péptidos individuales fueron analizados por masa en un espectrómetro de masa Voyager DE-STR MALDI-TOF (PerSeptive Biosystems). Aproximadamente 5 pmol de péptido liofilizado disuelto en agua destilada se mezcló con una solución saturada de ácido -ciano-4-hidroxicinámico. El experimento se realizó bajo el modo reflector para una resolución monoisotópica. Los datos fueron procesados usando GRAMS V. 4.30 (Galactic Software). Todos los espectros fueron obtenidos con calibración interna estrecha usando estándares de masa molecular de Sequazyme PerSeptive Biosystems. La secuenciación de aminoácidos se realizó mediante el método de degradación de Edman automatizado en un PPSQ-23 Protein Peptide Sequencer SHIMADZU y la alineación de secuencias en forma de pares y múltiple entre secuencias fueron determinadas al usar un programa de alineación de secuencias múltiple CLUSTAL V.

Tabla 1; Alineaciones de secuencias múltiple y en forma de pares maximizadas de Phylloseptins I, II y III PEPTIDO SIMILITUD PS 1 FLSLIPHAINAVSAIA HN 74% PS II FLSLIPHAINAVSTLVHHF *************** * PS 1 FLSLIPHAINAVSAI AKHN 84% PS III FLSLIPHAINAVSALANHG ***************** * * PS II FLSLIPHAINAVSTLVH HF 79% PS III FLSLIPHAINAVSALANHG *************** * * PS 1 FLSLIPHAINAVSAI AK HN 74% PS II FLSLIPHAINAVSTLVH HF PS III FLSLIPHAINAVSALAN HG *************** * Ejemplo 3: Ensayo de hemolisis Los eritrocitos humanos (sangre tipo O ) de un hombre saludable de 25 años de edad fueron preparados frescos antes de cada experimento. La actividad hemolítica se ensayó como se describe por Aboudy et al (Aboudy, Y., Mendelson, E., Shalit, I., Bessa!le, R., Fridikin, M. 1994. Int. J, Peptide Protein Res. 43, 573-582) con modificaciones menores. Tres mililitros de eritrocitos recién preparados (para metodología ver Gibson, B.W., Tang. D., Mandrell, R., Kelly, M. y Spindel, E.R. 1991. J. Biol. Chem. 266, 23103-23111.21) se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato isotónica (PBS), pH 7.4, hasta que el color del sobrenadante se volvió claro. Los eritrocitos lavados fueron diluidos entonces a un volumen final de 20 mi en un mismo amortiguador. Las alícuotas de muestras (10 µ?) conteniendo suspensiones celulares (190 µ?) fueron diluidas serialmente en PBS, se incubaron a 37°C durante 30 min y entonces se centrifugaron a 4000 Xg durante 5 min; se tomaron 100 µ? de sobrenadante, se diluyeron a 1.0 mi con PBS, y se monitorearon a 567 nm. La densidad óptica relativa, como se compara con aquélla de la suspensión celular tratada con 0.2% Tritón X-100, fue definida como % de hemolisis. La actividad hemolítica de Phylloseptin I y II se probó a diferentes concentraciones. Los resultados son mostrados en la Tabla 2.

Tabla 2: Actividades hemolíticas de Phylloseptina I (PS I) y Phylloseptina II (PS II) Concentraciones % de hemolisis de glóbulos rojos humanos 1 0.496 0.00 0.00 2 0.990 0.00 0.00 4 1.980 0-.00 0.10 8 3.968 0.30 0.28 16 7.937 0.57 0.70 32 15.873 0.60 0.80 64 31.746 0.98 1.05 128 63.492 1.98 2.05 Ejemplo 4: Ensayo anti-microbiano Los microorganismos Escherichia coli ATTC 25922, Pseudomonas aeroginosa ATTC 27853, Staphylococcus aureus ATTC 25923 y Enterococcus faecalis ATTC 29212 y una cepa brasileña de P. aeroginosa se usaron para el ensayo anti-microbiano. Los microorganismos fueron cultivados en cultivo estacionario a 37°C. Las bacterias se cultivaron en caldo de soya tríptico (TSB). Los bioensayos fueron realizados mediante campo de ensayo de inhibición de crecimiento líquido como se describe por Bulet et al (Bulet, P., Dimarcq, J.L., Hetru, C, Lagueux, M., Charlet, M., Hegy, G., VanDorsselaer, A y Hoffmann, J.A. 1993. J. Biol. Chem. 268, 14893-14897). Las moléculas de Phylloseptina I se disolvieron en agua destilada y deionizada estéril y se diluyeron 8 veces en caldo TSB (OXIOD Inglaterra). Varias concentraciones de solución PSI fueron probadas, siendo la más alta 128 µ9/???. El inoculo inicial fue aproximadamente 1 x 105 unidades formadoras de colonias (CFU)/ml y el límite de detección fue 102 CFU/ml. El volumen final fue 250 µ? (25 µ? de la prueba de péptido en agua, 25 µ? del inoculo en TSB y 200 µ? de caldo TSB). La concentración inhibitoria mínima (MIC) fue medida por turbidez (OD a 595 nm) 20 h después de que todos los microorganismos fueron cultivados en cultivo estacionario a 37°C. La concentración más baja del péptido en la cual no ocurrió crecimiento fue definida como la MIC. Las concentraciones inhibitorias mínimas (MICs) de Phylloseptina I aislado contra varias bacterias Gram-positivas y Gram-negativas fueron determinadas como se describe por Park et al (Park, C.B., Kim, M.S. y Kim, S.C 1996, 218 Biochem. Biophys. Res. Commun. 408-413). La concentración más baja de péptido anti-microbíano, la cual mostró una supresión visible de crecimiento fue definida como la MIC. Es decir, la concentración inhibitoria mínima fue definda como la concentración de péptido, la cual produce 100% de inhibición de crecimiento de microorganismo después de 20 h de incubación en medio de cultivo. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3: Actividad antibacteriana de PS I definida por criterios de concentración inhibitoria mínima Concentración inhibitoria mínima Bacteria PS I Cloranfenicol Gentamicina Ampicilina Polimixina B ng/ml Pseudomonas 64 16 aeruginosa wt Staphylococcus aureus 32 ATTC Pseudomonas 64 16 aeruginosa ATTC Escherichia coli ATCC 32 64 64 Enterococcus faecalis 32 128 ATTC (-) no hubo inhibición de proliferación de bacterias en estas concentraciones.

Ejemplo 5: Determinación de alteraciones de membrana inducidas por péptido mediante microscopo de fuerza atómica El microscopio de fuerza atómica (AFM) usado en este experimento fue un TopoMetrix 2000 Explorer (TopoMetrix, Santa Clara, Calif, U.S. A) que opera en el modo de contacto y a temperatura ambiente. Se usó un explorador de tubo híbrido piezoeléctrico con un área de exploración máxima de 50 mieras cuadradas. Se usaron ménsulas de Si3N4 de forma en V de 200 mieras, estándares, con puntas piramidales integradas. La constante de resorte nominal para la fuerza de contacto de la punta en la superficie del espécimen se fijó a 0.00 nA. La velocidad de exploración de línea se fijó a 20 µ?t?/s. Se usó Pseudomonas aeruginosa ATTC 27853 en este experimento. La cepa se cultivó en caldo de nutrientes a 37°C durante aproximadamente 12 horas. La bacteria se recolectó y suspendió en 150 mM KCI / 20 mM MgCI2 / 10 mM Tris-HCI, pH 7.8. La concentración de las bacterias en la suspensión se ajustó a aproximadamente 4 x 108 bacterias/ml de acuerdo con su turbidez. La suspensión bacteriana se colocó en mica recién cortada y se secó en aire. La mica se fijó al soporte de espécimen con una cinta adhesiva de dos lados y se instaló entonces en la parte superior del explorador para observación de AFM. El AFM ha sido usado extensamente para estudiar materiales (Lacava, B.M., Azevedo, R.B., Silva, L.P., Lacava, Z.G.M., Skeff Neto, K., Buske, N., Bakuzis, A.F., y Moráis, P.C. 2000. Applied Physics Letter 77 (12): 1876-1878) y muestras biológicas, siendo considerado una herramienta útil para identificar características de superficie bacteriana. El AFM también ha sido usado para detectar superficies topográficas mientras que opera bajo condiciones fisiológicas determinadas (Braga, P.C. y Ricci, D. 1998. Anti-microbial Agents and Chemotherapy 42 (1): 18-22), El efecto de péptido en la membrana celular de P. aeruginosa se examinó bajo AFM. La Figura 4 muestra una imagen de una bacteria intacta y en la Figura 5 una célula de P aeruginosa tratada por péptidos. El péptido fue adicionado a la bacteria y se incubó durante 4 horas bajo las mismas condiciones que en el ensayo anti-microbiano, A la MIC, las

Claims (9)

REIVINDICACIONES

1. Un péptido antibiótico con actividad anti-microbiana de amplio espectro teniendo la misma secuencia de aminoácidos o una secuencia funcionalmente equivalente y al menos la misma actividad anti-microbiana que el péptido definido en la fórmula: Phe Leu Ser Leu lie Pro His Ala lie Asn Ala Val Ser Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 His Xaa5 en donde Xaa1, Xaa2, Xaa3, Xaa4 y Xaa5, son cada uno independientemente un aminoácido hidrofóbico, un aminoácido básico hidrofílico o un aminoácido neutral hidrofílico, con las condiciones de que (i) cuando Xaa1, Xaa2 y Xaa3 son aminoácidos hidrofóbicos, Xaa4 es un aminoácido básico hidrofílico y Xaa5 es un aminoácido neutral hidrofílico; (ii) cuando Xaa2, Xaa3 y Xaa5 son aminoácidos hidrofóbicos, Xaa1 es aminoácido hidrofóbico o un aminoácido neutral hidrofílico y Xaa4 es un aminoácido básico hidrofílico o un aminoácido neutral hidrofílico.

2. El péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos hidrofóbicos Xaa1, Xaa2 y Xaa3 son Ala, He y Ala, respectivamente; el aminoácido básico hidrofílico Xaa4 es Lys y el aminoácido neutral hidrofílico Xaa5 es Asn.

3. El péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos hidrofóbicos Xaa2, Xaa3 y Xaa5 son Leu y Val y Phe, respectivamente; Xaa1 es Thr; Xaa4 es His.

4. El péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde los aminoácidos hidrofóbicos Xaa2, Xaa3 y Xaa5 son Leu, Ala y Gly, respectivamente; el aminoácido hidrofóbico Xaa es Ala; y el aminoácido neutral hidrof ílico Xaa4 es Asn.

5. La secuencia de péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena de polipéptido completa o partes especificas de ella comprende residuos tanto de -D- como -L-aminoácidos.

6. La secuencia de péptido antibiótico de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la cadena de polipéptido completa o partes específicas de ella comprende ya sea residuos de a-D- o a-L-aminoácidos.

7. Una composición para inhibir el crecimiento de una célula objetivo, que comprende (a) al menos un péptido antibiótico como se define en la reivindicación, (b) opcionalmente uno o más péptidos teniendo actividad anti-microbiana 1 y (c) un portador farmacéuticamente aceptable.

8. Una composición de acuerdo con la reivindicación 7, adecuada para uso humano, veterinario o farmacéutico.

9. Una composición para retardar los patógenos de plantas y para proteger plantas de patógenos, que comprende (a) al menos un péptido antibiótico como se define en la reivindicación 1, y (b) un portador agrícolamente aceptable.