MXPA03004880A - Suspensiones de proteinas >( por ejemplo, insulina, dnase) aerosolizables, estables en etanol. - Google Patents

Abstract

Se describen suspensiones estables de una proteina biologicamente activa que son adecuadas para entrega de aerosol a los pulmones de un paciente en necesidad de tratamiento, las cuales comprenden particulas de proteina biologicamente activa suspendidas en etanol. En una modalidad preferida, la invencion describe una suspension estable de insulina util para entrega de aerosol a los pulmones de un paciente en necesidad de tratamiento, que comprende particulas de una cantidad farmaceuticamente efectiva de insulina suspendidas en etanol. Se describe un metodo para entregar una cantidad terapeuticamente efectiva de una proteina al tracto respiratorio de un paciente, el cual comprende producir un aerosol de una suspension liquida estable de una proteina que usa un medio de atomizacion electrohidrodinamico, en donde la suspension liquida comprende particulas de la proteina suspendidas en etanol. Las suspensiones de etanol estables de la invencion pueden contener, opcionalmente, hasta aproximadamente 20% (v/v) de un aditivo de formulacion farmaceuticamente aceptable, tal como glicerol, propilenglicol y polietilenglicol, asi como cantidades menores (desde aproximadamente 0.05% hasta aproximadamente 5.0% (p/v) de un excipiente farmaceuticamente aceptable.

Description

SUSPENSIONES DE PROTEINAS (POR EJEMPLO, INSULINA, DNASE) AEROSOLIZABLES, ESTABLES EN ETANOL REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS La presente solicitud reclama el beneficio de la solicitud estadounidense provisional no. 60/250,491 [caso del abogado no. 22112(1)P], presentada el 1 de diciembre de 2000.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Esta invención se refiere de manera general a suspensiones de proteínas aerosolizables estables en etanol. Las suspensiones de la invención son particularmente adecuadas para entrega por inhalación usando dispositivos de aerosol electrostáticos o electrohidrodinámicos para producir el aerosol. La entrega pulmonar de agentes terapéuticos por medio de aerosoles inhalados es un área de importancia creciente en las industrias de biotecnología y farmacéutica. Los dispositivos electrostáticos o electrohidrodinámicos que son capaces de generar aerosoles inhalables con ciertas propiedades preferidas, frecuentemente requieren formulaciones líquidas conteniendo uno o más solventes acuosos, tal como agua, un solvente orgánico, tal como un alcohol, o una mezcla de un solvente acuoso y uno orgánico. Las moléculas biológicas, tales como proteínas, frecuentemente son difíciles de formular en ciertos solventes o sistemas de solventes (por ejemplo, mezclas de agua y solventes orgánicos), debido a que los solventes orgánicos tienden a comprometer la estabilidad de la proteína en solución. Las proteínas disueltas o suspendidas en sistemas de solventes líquidos normalmente sufren de degradación química o física, resultando por ello en una formulación con poca o ninguna vida de anaquel. Por lo tanto, la estabilización de la proteína en un sistema de solventes dado es necesaria para sostener la actividad de una proteína dada. Con el fin de ser útil en una aplicación farmacéutica, las proteínas requieren condiciones de procesamiento y almacenamiento, las cuales no disminuyen una función biológica de proteína dada. Para prevenir la pérdida de conformación natural, las proteínas deben ser protegidas de la descomposición química (por ejemplo, mediante desamidación) T inestabilidad física, lo cual resulta de la ruptura de interacciones no covalentes. La agregación, precipitación y adsorción (especialmente en superficies hídrofóbicas) son ejemplos de tal ruptura. Una de las proteínas terapéuticas más importantes y comúnmente usadas es la insulina. La insulina tiende a polimerizar y formar agregados, lo cual evita la entrega de insulina en ciertos sistemas de suministro de medicamentos. Esta insulina agregada puede no tener las propiedades farmacológicas requeridas y puede inducir una respuesta inmune anormal {Chawla et al., Diabetes 34: 420-425, 1985). De esta manera, el mantenimiento de la actividad biológica de la insulina es esencial para una administración de insulina más tradicional, tal como bombas de infusión continua portátiles/implantables y dispositivos y sistemas poliméricos de liberación controlada, Adicionalmente, la agregación de insulina conduce a reducciones significativas en la potencia biológica y obstrucción de rutas de entrega, creando por ello complicaciones serias para los sistemas de entrega de medicamento y disminuyendo las habilidades del paciente para controlar sus niveles de glucosa en sangre. Slyzky et al., Biotechnology and Bioengineering 40: 895-903 (1992). De esta manera, existe la necesidad de un método para estabilizar insulina y otras proteínas en formulaciones liquidas utilizadas en sistemas de entrega de medicamento de aerosol electrostáticos o electrohidrodinámicos. Las metodologías de estabilización para ciertas moléculas biológicas son conocidas en la técnica. Por ejemplo, WO 98/29097 describe composiciones para incrementar la biodisponibilidad a través de la entrega mucosa, lo cual incluye mezclas de agentes bioactivos y carbohidratos hidrofóbicamente derivados en forma de polvo, De manera similar, WO 99/33853 describe carbohidratos derivados, los cuales pueden usarse para formar una variedad de materiales, incluyendo sistemas de entrega sólidos La patente estadounidense 4,439,421 emitida para Hooper et al. (1984) describe un concentrado de gamma globulina estabilizada en forma seca, el cual utiliza polisacáridos incluyendo, polímeros ramificados y no ramificados de azúcares de cinco y/o seis carbonos. La patente estadounidense 5,547,873 emitida para Magneson et al. (1996) describe una composición para estabilizar proteínas para almacenamiento seco a largo plazo, la cual incluye una azúcar formadora de cristal. Aunque es efectiva para estabilizar ciertas biomoléculas bajo ciertas condiciones, la técnica relacionada trata principalmente de polvo seco u otros sistemas sólidos, y no ofrece métodos o composiciones para estabilizar biomoléculas en sistemas de solventes líquidos adecuados para usarse en dispositivos y sistemas de aerosol electrostáticos o electroh id rodiná micos. Estas y otras deficiencias de la técnica anterior son superadas por la presente invención, lo cual proporciona métodos y composiciones para estabilizar proteínas en formulaciones de etanol líquidas que pueden ser dispositivos aerosolizados de entrega de medicamento por aerosol. Estas novedosas formulaciones son estables sobre periodos prolongados, y como tales, proporcionan distintas ventajas sobre otros métodos para formular proteínas en líquidos que son compatibles con dispositivos de entrega de medicamento de aerosol.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención se dirige a una suspensión estable de una proteína biológicamente activa adecuada para entrega de aerosol al tracto respiratorio de un paciente en necesidad de tratamiento que comprende partículas de dicha proteína suspendidas en etanol. En una modalidad preferida, la invención describe una suspensión estable de insulina útil para entrega de aerosol a los pulmones de un paciente en necesidad de tratamiento, que comprende partículas de una cantidad farmacéuticamente efectiva de insulina suspendida en etanol. Las suspensiones de etanol estables de la invención pueden contener opcionalmente hasta aproximadamente 20% (v/v) de un aditivo de formulación farmacéuticamente aceptable, tal como g I i ce rol , propi lenglicol y polietilenglicol, asi como cantidades menores (desde aproximadamente 0.05% hasta aproximadamente 5.0% p/v) de un excipiente farmacéuticamente aceptable La invención se dirige además a un método para entregar una cantidad terapéuticamente efectiva de una protelna al tracto respiratorio de un paciente en necesidad de tratamiento, el cual comprende producir un aerosol de una suspensión líquida estable de dicha proteína usando un medio de atomización electrohidrodinámico, en donde dicha suspensión líquida comprende partículas de dicha proteína suspendidas en etanol. De acuerdo con la presente invención, un método para estabilizar una proteína en etanol incluye el paso de hacer una suspensión de una proteína en etanol por medio de sobre-saturar etanol con la protefna, promoviendo con ello la formación de cristales de la proteína. En un método alternativo, los cristales de proteína son adicionados al etanol a una alta concentración para formar una suspensión, por lo cual la proteína permanece cristalizada y no se disuelve.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION La presente invención se dirige a una suspensión estable de una proteína biológicamente activa adecuada para entrega de aerosol al tracto respiratorio de un paciente en necesidad de tratamiento, que comprende partículas de dicha proteína suspendidas en etanol. En una modalidad preferida, la invención describe una suspensión de insulina estable útil para el suministro de aerosol a los pulmones de un paciente en necesidad de tratamiento que comprende partículas de una cantidad farmacéuticamente efectiva de insulina suspendidas en etanol, Las suspensiones de etanol estables de la invención pueden contener opcionalmente hasta aproximadamente 20% (v/v) de un aditivo de formulación farmacéuticamente aceptable, tal como glicerol, propilengl icol y polietilenglicol, asi como cantidades menores (desde aproximadamente 0.05% hasta aproximadamente 5.0% p/v) de un excipiente farmacéuticamente aceptable. La invención se dirige además a un método para entregar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteina al tracto respiratorio de un paciente en necesidad de tratamiento, el cual comprende producir un aerosol de una suspensión líquida estable de dicha proteina usando un medio de atomización electrohidrodinámico, en donde dicha suspensión líquida comprende partículas de dicha proteína suspendidas en etanol. De acuerdo con la presente invención, un método para estabilizar proteínas en un etanol, acarrea hacer una suspensión de una proteína, tal como insulina, en etanol por medio de sobre-saturar el etanol con la proteína. De preferencia, las moléculas de proteína son disueltas o suspendidas en etanol, a concentraciones, las cuales promueven la formación de cristales de la proteína. En un método alternativo, los cristales de proteína son adicionados a un etanol a una alta concentración para formar una suspensión, por lo cual la proteína permanece cristalizada y no se disuelve. En una modalidad preferida de la presente invención, la molécula biológica es insulina. Como se usa en la presente, el término "estable" o "estabilidad" es usado para significar la conservación de la actividad biológica de una proteína.

El término "suspensión", como se usa en la presente, es otorgado con su significado ordinario y se refiere a partículas de proteína o agregados de partículas de proteína suspendidos en un líquido, Las suspensiones estables de la invención son útiles para preparar aerosoles para la entrega de proteínas terapéuticas al tracto respiratorio. El término "tracto respiratorio" incluye las vías aéreas superiores, incluyendo la orofaringe y laringe, seguida por las vías aéreas inferiores, las cuales incluyen la tráquea seguida por bifurcaciones hacia los bronquios y bronquiolos. Las vías aéreas superiores e inferiores son llamadas las vías aéreas conductoras. Los bronquiolos terminales se dividen entonces en bronquiolos respiratorios, los cuales conducen entonces a la última zona respiratoria, los alveolos o pulmón profundo. Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract" (Aerosoles para entrega de agentes terapéuticos y diagnósticos al tracto respiratorio), en Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313, (1990). Usualmente, el pulmón profundo, o alveolos, es el objetivo principal de aerosoles terapéuticos inhalados para entrega sistémica. El término "proteína biológicamente activa" incluye proteínas y polipéptidos que son usados para fines diagnósticos y reactivos, así como proteínas y polipéptidos que son administrados a pacientes como la substancia de medicamento activa para tratamiento de una enfermedad o condición. Las proteínas y polipéptidos son contemplados para usarse en las composiciones de la invención, tales como enzimas, por ejemplo, ascorbato oxidasa, peroxidasa, catalasa, glucosa oxidasa, quimiotripsina, lactato deshidrogenasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa; anticuerpos, por ejemplo, Herceptin® (trastuzumab), Orthoclone OKT®3 (muromonab -CD3); hormonas, por ejemplo, insulina y hormona de crecimiento humano (HGH); factores de crecimiento, por ejemplo, factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), factor de crecimiento de nervios (NGF), factor de liberación de hormona de crecimiento humano (HGHRF) y citocinas, por ejemplo, factor inhibitorio de leucemia (LIF), factor estimulante de colonias de granulocitos (GM-CSF), interleucina-6 (IL-6), interleucina-11 (IL-11), interleucina-9 (IL-9), ocostatina-M (OSM) y Factor VIII. Además de enzimas y anticuerpos usados en pruebas diagnósticas o en ensayos in vitro, el término "biológicamente activo" incluye proteínas que son administradas a un paciente en una "cantidad farmacéuticamente efectiva" para tratar una enfermedad o condición. Como se reconocería por alguien experto en la técnica, por "cantidad farmacéuticamente efectiva" se quiere decir una cantidad de una proteína farmacéutica que tiene un efecto terapéuticamente relevante en la enfermedad o condición a ser tratada. Un efecto terapéuticamente relevante alivia en algún grado uno o más síntomas de la enfermedad o condición en un paciente, o regresa lo normal ya sea parcial o completamente uno o más parámetros fisiológicos o bioquímicos asociados con o causantes de la enfermedad o condición. Detalles específicos de la dosificación de una proteína activa particular pueden encontrarse en su etiquetado, es decir, la inserción de paquete (ver 21 CFR § 201.56 & 201.57) aprobada por la United States Food and Drug Administration. Las suspensiones de proteína estables de la invención pueden contener opcionalmente hasta aproximadamente 20.0% ( v) de un aditivo de formulación, y de preferencia no más de aproximadamente 10.0% (p/v). El término "aditivo de formulación" se refiere a un líquido orgánico farmacéuticamente aceptable, el cual puede ser adicionado a las suspensiones de etanol de la invención para intensificar la capacidad de atomización de la suspensión de proteína líquida usando un medio de atomización electrostático. Los alcoholes polihtdricos son contemplados para su uso como aditivos de formulación en las suspensiones de proteína estables de la invención, por ejemplo, glicerol y propilenglicol y poliglicoles, tal como polietilenglicol. El aditivo de formulación debería ser farmacéuticamente aceptable, esto es, reconocido por la US Food and Drug Administration por ser seguro para uso en humanos. Como sería reconocido por el técnico experto, las suspensiones de proteína estables de la invención pueden incluir opcionalmente "cantidades menores", esto es desde aproximadamente 0.05% hasta aproximadamente 5.0% p/v, y de preferencia desde aproximadamente 0.05% hasta desde aproximadamente 1.0% de un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los excipientes farmacéuticamente aceptables son aquéllos reconocidos por la FDA por ser seguros para uso en humanos. Aditivos tales como, surfactantes, por ejemplo, alcohol dodecílico etoxilado, antioxidantes, por ejemplo, vitamina E y ácido ascórbico, antimicrobianos, por ejemplo, parabenos y agentes de suspensión, por ejemplo, povidona, son contemplados para usarse en la presente. Aunque la selección de cualquier excipiente particular está dentro de la habilidad de la técnica, como se reconocerá, la decisión con respecto a si adicionar un excipiente y si es así cuál, se hará considerando la finalidad del excipiente en una suspensión de proteína en etanol específica, Con el fin de ser farmacéuticamente aceptable cualquier aditivo o excipiente de formulación usado en una suspensión estable de la invención, debería ser reconocido por la FDA como seguro para uso con humanos. Adicionalmente, un excipiente no deberla tener efecto o efecto mínimo sobre la estabilidad de la proteína en la suspensión de etanol o en la capacidad de atomización de las suspensiones usando un medio de atomización electrostático. Las formulaciones comprendiendo suspensiones de proteína en etanol, pueden prepararse usando técnicas de cristalización estándares, o por medio de simplemente sobre-saturar la formulación con la proteína. Estas formulaciones son útiles para la estabilización de proteínas bajo condiciones de almacenamiento y bajo condiciones usadas para entrega terapéutica de varias proteínas. Las suspensiones cristalinas también son útiles para entregar altas concentraciones (es decir, dosificación) de una proteína particular en la forma de una pasta semi-sólida. En general, el tamaño de partícula de los cristales de proteína y/o aglomerados usado en las suspensiones de la invención, variará desde aproximadamente 0.01 µ?? hasta aproximadamente 10.0 µ de diámetro, Si la entrega de la proteína al pulmón profundo es el objetivo, el tamaño de partícula de la proteina debería variar, de preferencia, desde aproximadamente 0.01 µ hasta aproximadamente 5.0 µ de diámetro y más preferiblemente desde aproximadamente 0,01 µ hasta aproximadamente 3.0 de diámetro. Si la entrega de la proteína al tracto respiratorio superior es el objetivo, el tamaño de partícula de la proteína puede variar desde aproximadamente 5.0 µ hasta aproximadamente 10.0 µ de diámetro.

Aunque se prefiere usar etanol anhidro en las suspensiones de la invención, uno puede usar etanol "substancialmente" anhidro, es decir, etanol conteniendo hasta aproximadamente 5% o menos de agua y de preferencia hasta aproximadamente 3% o menos de agua en el etanol. El método de la invención utiliza un dispositivo dispensador para pulverizar las suspensiones líquidas reclamadas en la presente. Se conocen dispositivos dispensadores, los cuales producen un rocío finamente dividido de gotitas líquidas mediante medio electrostático (algunas veces referido como medio "electrohidrodinámico"). Los atomizadores electrohidrodinámicos ("EHD") son particularmente útiles en medicina para la administración de medicamentos mediante inhalación. Varios dispositivos de EHD son conocidos en la técnica, como por ejemplo, aquéllos descritos en la patente estadounidense no. 6,105,877 y la patente estadounidense no. 6,068,199. La atomización de gotitas en tales dispositivos de EHD es generada al aplicar un campo eléctrico a un líquido ubicado en un cabezal de atomización o borde de atomización. El potencial del campo eléctrico es suficientemente alto para proporcionar la pulverización de gotitas líquidas cargadas eléctricamente desde el cabezal de atomización. La carga eléctrica en las gotitas evita que coagulen vía repulsión mutua, Antes de la inhalación del aerosol al paciente, usualmente es necesario remover parcial o completamente la carga eléctrica de la atomización de gotitas de aerosol producida por el dispositivo pulverizador electrohidrodinámico en una manera controlada. Aunque pueden usarse otros métodos, el método principal usado para efectuar la descarga de pulverización utiliza un electrodo de descarga que tiene un borde agudo o puntiagudo y ubicado corriente abajo del cabezal de atomización del dispositivo de EHD. El electrodo de descarga produce una nube de iones cargados del aire circundante que tiene una carga eléctrica opuesta de magnitud igual a aquélla de la atomización líquida pulverizada (aerosol). En uso, la nube de iones es atraída hacia, choca con y por ello neutraliza la atomización de aerosol liquido. Aunque las suspensiones de proteina/etanol de la invención son particularmente adecuadas para usarse con dispositivos de EHD como sería reconocido por alguien experto en la técnica, tales suspensiones son aerosolizables usando otros dispositivos generadores de aerosol, tal como un nebulizador; ver WO 99/44664, la cual describe un sistema de dosificación pulmonar y un método para suministrar a un paciente una cantidad predeterminada de material respirable terapéuticamente activo. Varias modalidades de la presente invención son ilustradas mediante los siguientes ejemplos, los cuales no deberían pretenderse para limitar el alcance de la invención.

Ejemplo 1 Se usó insulina humana liofilizada, suministrada por Roche Biochemical Co.. Para obtener el pH deseado, 100 mg de insulina fueron disueltos primero en 2.667 mi de amortiguador de PBS 10 mM, pH 7.4 (suministrado por Sigma, P 3813); 356 ul de esta insulina disuelta fueron divididos en alícuotas en tubos cónicos de polipropileno de 15 mi, los cuales fueron usados posteriormente para las muestras de suspensión de 20 mg/ml. Para hacer las muestras de suspensión de insulina a una concentración de 1.5 mg/ml, 26.67 ul de la insulina disuelta se dividieron en alícuotas en tubos cónicos de polipropileno de 15 mi. Los tubos cónicos fueron sellados entonces con parapellcula perforada, y se congelaron durante la noche a ~ -15°C hasta -20°C. El día siguiente, las muestras de insulina congeladas fueron liofilizadas a un polvo fino, que fluye libre, usando un Labconco Freeze Dry System de mostrador con charola taponeada. Este proceso fue iniciado dos o tres días antes del inicio del experimento. Las muestras de insulina 100% etanólicas fueron preparadas por duplicados. Para cada muestra, hubo cuatro (4) puntos en el tiempo preparados. El polvo de insulina liofilizado fue suspendido en 667 ul de etanol de graduación 200, el cual fue suministrado por Spectrum Chemicals. Las muestras del Día "0" fueron diluidas inmediatamente con 9.33 mi de 0.1% TFA, de manera que la concentración final de las muestras de insulina se ajustaría dentro de la curva estándar de HPLC. Las muestras diluidas fueron analizadas entonces mediante el método de HPLC de fase inversa usando técnicas estándares conocidas en la técnica. Los demás puntos en el tiempo fueron sellados con parapellcula. Se probaron cuatro (4) condiciones diferentes: (i) & (ii) las muestras fueron mantenidas a 37°C con o sin agitación; (iii) las muestras se mantuvieron a 40°C con agitación; y (iv) las muestras se mantuvieron a temperatura ambiente sin ninguna agitación. Se usó un incubador/agitador ambiental Labline a 37°C y a 40°C mientras que se agitaban a 220 rpm. Una vez que se alcanzó el siguiente punto en el tiempo, las muestras fueron diluidas nuevamente con 9.33 mi de 0.1% TFA y se analizaron por actividad de insulina. En la preparación de todas las muestras conteniendo insulina, se tuvo cuidado de no sonicar o agitar vigorosamente cualquier preparación de insulina debido a la posibilidad de precipitación. Se usó inversión para mezclar suavemente. La Tabla 1 presenta los datos de estabilización derivados de la utilización de esta modalidad de la presente invención. El porcentaje de actividad retenido fue determinado mediante cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC), TABLA 1 Estabilización de insulina en 100% de etanol Periodo Temp (°C) Actividad Agitación pH retenida (%) (rpm) 2.5 meses 37 36 NA 3.0 2.5 meses 37 92 NA 5.4 2.5 meses 37 93 NA 7.4 14 días 37 82 220 7.4 27 días 40 87 220 7.4 2.0 meses 40 55 220 7.4 2.0 meses 20 90 NA 7.4 Ejemplo 2 A. Se usó desoxirribonucleasa I (DNase I), grado II de páncreas de bovino, suministrada por Roche Molecular Biochemicals. Se preparó inhibidor de proteasa, Sigma P 2714, al disolver 1 frasco con 100 mi de agua MilliQ. CaCI2, suministrado por Sigma, se llevó a una solución madre de 7.5 mg/ml, usando agua MilliQ. Se pesaron tres (3) mg de DNase I en frascos de reacción tipo 1, de vidrio. Se prepararon cuatro puntos en el tiempo para cada muestra. Las muestras se prepararon por duplicado a ya sea 10 mg/ml o 30 mg/ml. Para las muestras de DNase I a 10 mg/ml de insulina, se adicionaron 300 ul de etanol de graduación 200 al frasco de reacción. Las muestras de DNase I de 30 mg/ml fueron suspendidas con 100 ul de etanol de graduación 200, suministrado por Spectrum Chemicals, Para el Día 0 las muestras de 10 mg/ml fueron diluidas con 9,7 mi de Amortiguador A, mientras que las muestras de 30 mg/ml fueron diluidas con 9.9 mi de Amortiguador A. El Amortiguador A consiste de los siguientes químicos a las concentraciones especificadas, 24 mM Hepes (Sigma H 3375), 2.4mM MgCI2 (Sigma M 2670), 2.4mM CaCI2 (Sigma C 3881), 0.06% BSA (Sigma A 9647) y 0.03% Tween 20 (Sigma P 7949) a un pH de 7.7. Estas muestras fueron analizadas entonces usando un método colorimétrico utilizando DNA-Methyl Green (Sigma D 2376) como el substrato, Todos los demás puntos en el tiempo fueron sellados herméticamente y colocados en un cajón protegido de la luz y cualquier agitación hasta que se alcanzó el siguiente punto en el tiempo de ensayo.

Análisis de ensayo de muestras Se hizo una curva estándar con las siguientes concentraciones: 1200 ug/ml, 1000 ug/ml, 800 ug/ml, 600 ug/ml, 400 ug/ml, 200 ug/ml, 100 ug/ml, 50 ug/ml, 25 ug/ml y 12.5 ug/ml. La curva estándar estuvo en cada placa de microtítulo de 96 cavidades. Se adicionaron 50 ul de cada estándar y muestra diluida por triplicado siguiendo un mapa de placa planeado previamente. A los estándares y muestras diluidas se adicionaron 150 ul de 0.05% DMA-Methyl Green. Cada muestra diluida tuvo su propio blanco, el cual contenía toda la muestra excepto la Dnase I. Estos también se pusieron en la placa, sin embargo se adicionaron 150 ul de Amortiguador A a estas cavidades en lugar de DNA-Methyl Green. Después de que todas las cavidades contenían las soluciones apropiadas, se sellaron y se colocaron en un agitador orbital VWR durante 1 hora de incubación. Durante esta hora de incubación se preparó una solución de paro, 50mM H2O2/50mM EDTA se preparó en agua. Después de que se terminó el periodo de incubación de 1 hora, se adicionaron 50 ul de la solución de paro a cada cavidad. Las placas fueron recuperadas y nuevamente se pusieron en el agitador orbital durante unas 2 horas de incubación adicionales. Al final de las 3 horas de incubación totales, la placa se leyó usando un lector de placa de micro-título SpectraMAX 380 de Molecular Devices. Los estándares se ajustaron a una curva de 4 parámetros usando Molecular Devices, Softmax Pro® versión 3.1.2. Este programa de cómputo fue usado entonces para analizar los datos que se correlacionan con las absorbencias de las muestras desconocidas a las absorbencias de los estándares y entonces se encuentran las concentraciones.

Los datos de estabilidad para DNase I son resumidos en la Tabla 2. Por comparación, los datos para DNase I en su amortiguador de almacenamiento estándar (Hepes) y para un producto comercial (Pulmozyme) son incluidos en la Tabla 2. Pulmozime® (dornasa alfa) solución de inhalación, es una solución altamente purificada, incolora, transparente, estéril, de desoxirribonucleasa humana recombinante I (rhDNasa), una enzima que corta DNA selectivamente. Pulmozyme es administrada mediante inhalación de una niebla de aerosol producida por un sistema nebulizador impulsado por aire comprimido. Pulmozyme es comercializado por Genentech, Inc., 1 DNA Way, South San Francisco, CA 94080-4990.

Tabla 2 Datos de estabilidad para DNase I Siendo así descrita la invención, será obvio que la misma puede ser variada en varias formas. Tales variaciones no son para ser consideradas como una separación del espíritu y alcance de la invención, y todas esas modificaciones, como será obvio para alguien experto en la técnica se

Claims (33)

REIVINDICACIONES

1. Una suspensión estable de una proteína biológicamente activa adecuada para entrega de aerosol al tracto respiratorio de un paciente en necesidad de tratamiento, que comprende partículas de dicha proteína suspendidas en etanol.

2. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho etanol es substancialmente anhidro.

3. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho etanol contiene menos de 5% de agua.

4. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicho etanol contiene menos de 3% de agua.

5. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha protelna biológicamente activa es seleccionada del grupo que comprende enzimas, anticuerpos, antígenos, hormonas y citocinas.

6. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha proteína terapéuticamente activa es una hormona.

7. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha proteína terapéuticamente activa es insulina,

8. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha proteína terapéuticamente activa es una citocina.

9. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 5, en donde dicha proteína terapéuticamente activa es el Factor VIII.

10. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el tamaño de partícula de dicha proteína es desde aproximadamente 0,01 µ hasta aproximadamente 10.0 µ.

11. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el tamaño de partícula de dicha protelna es desde aproximadamente 5.0 µ hasta aproximadamente 10.0 µ.

12. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el tamaño de partícula de dicha proteína es desde aproximadamente 0.01 µ hasta aproximadamente 3.0 µ.

13. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha suspensión contiene hasta 20% v/v de un aditivo de formulación.

14. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 13, en donde dicho aditivo de formulación de suspensión es seleccionado del grupo que consiste de glicerol, propilenglicol y polietílenglicol.

15. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 1, en donde dicha suspensión contiene desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 5.0% de un excipiente farmacéuticamente aceptable.

16. Una suspensión estable de insulina útil para entrega de aerosol a los pulmones de un paciente en necesidad de tratamiento, que comprende partículas de una cantidad farmacéuticamente efectiva de insulina suspendidas en etanol.

17. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha insulina está presente en la suspensión a una concentración desde aproximadamente 1.0 mg/ml hasta aproximadamente 200.0 mg/ml de suspensión.

18. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el tamaño de partícula de dicha insulina es desde aproximadamente 0.01 µ hasta aproximadamente 5.0 µ.

19. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha suspensión contiene hasta 20% v/v de un aditivo de formulación.

20. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 19, en donde dicho aditivo de formulación de suspensión es seleccionado del grupo que consiste de glicerol, propilenglicol y polietilenglicol.

21. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 16, en donde dicha suspensión contiene desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 5.0% de un excipiente farmacéuticamente aceptable.

22. Un método para entregar una cantidad terapéuticamente efectiva de una proteína al tracto respiratorio de un paciente en necesidad de tratamiento, el cual comprende producir un aerosol de una suspensión líquida estable de dicha proteína que usa un medio de atomización electrostático, en donde dicha suspensión líquida comprende partículas de dicha proteína suspendidas en etanol.

23. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha proteína es seleccionada del grupo que comprende enzimas, anticuerpos, antígenos, hormonas y citocinas.

24. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicha proteína terapéuticamente activa es una hormona.

25. Un método de acuerdo con la reivindicación 24, en donde dicha hormona es insulina.

26. Un método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde dicha proteína es una citocina.

27. Un método de acuerdo con la reivindicación 26, en donde dicha citocina es el Factor VIII.

28. Un método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el tamaño de partícula de dicha proteína es desde aproximadamente 0.01 µ hasta aproximadamente 10.0 µ,

29. Un método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el tamaño de partícula de dicha proteína es desde aproximadamente 5.0 µ hasta aproximadamente 10.0 µ.

30. Un método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el tamaño de partícula de dicha proteína es desde aproximadamente 0.01 µ hasta aproximadamente 3.0 µ.

31. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha suspensión contiene hasta 20% v/v de un aditivo de formulación.

32. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 31, en donde dicho aditivo de formulación de suspensión es seleccionado del grupo que consiste de glicerol, propilenglicol y polietilenglicol.

33. Una suspensión estable de acuerdo con la reivindicación 22, en donde dicha suspensión contiene desde aproximadamente 0.5% hasta aproximadamente 5.0% de un excipiente farmacéuticamente aceptable.