MXPA02003820A - Microparticulas biodegradables con proteina novedosa estimuladora de la eritropoyetina. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una composición para la liberación sostenida de una proteína novedosa estimulante de la eritropoyetina, biológicamente activa (NESP), y métodos mejorados para formar la composición. La composición comprende micropartículas poliméricas dentro de cuyas partículas esta dispersa la NESP. El método mejorado utiliza una mezcla co-solvente para efectuar una eliminación más eficiente y rápida de los polímeros solventes residuales durante cualquier proceso de seca

Description

MICROPARTÍCULAS BIODEGRADABLES CON PROTEINA NOVEDOSA ESTIMULADORA DE LA ERITROPOYETINA Campo de la Invención. La presente invención se refiere a una composición para la liberación sostenida de una proteina novedosa estimuladora de la eritropoyetina biológicamente activa (NESP) , y métodos mejorados para la formación de la composición. La composición comprende microparticulas poliméricas dentro de las cuales se han dispersado partículas de NESP. El método mejorado utiliza una mezcla co-solvente para efectuar una eliminación más eficiente y rápida de los solventes de polímeros residuales durante algún proceso de secado. Antecedentes de la Invención. En los años anteriores, se han dirigido amplios esfuerzos para el desarrollo de formulaciones efectivas de liberación sostenida que pueden proporcionar un medio de control de los niveles en la sangre del ingrediente activo y también proporcionar una mayor eficacia, seguridad, conveniencia al paciente y cumplimiento por el paciente. Desafortunadamente, la inestabilidad de la mayoría de las proteínas (por ejemplo, desnaturalización y pérdida de la bioactividad al exponerse al calor, solventes orgánicos, etc.) ha limitado ampliamente el Ref: 137839 desarrollo y evaluación de formulaciones de liberación sostenida . Se han descrito en el arte previo métodos de preparación de partículas tanto en la literatura de patentes como en la científica. En particular, se describen diversos métodos para la preparación de micropartículas biodegradables de ácido poliláctico (PLA) y ácido poli ( láctico-co-glicólico) (PLGA) para la liberación controlada de fármacos solubles en agua. Ver por ejemplo, Wise y colaboradores, Contraception, 8:227-234 (1973); Hutchinson y colaboradores, Biochem. Soc. Trans., 13: 520-523 (1985); y Jalil y colaboradores, J. Microencapsul. , 7: 297-325 (1990); Putney y colaboradores, Nature Biotech., 16: 153-157 (1998); Burke, P., Handbook of Pharmaceutical Controlled Reléase Technology, Klibanov, y colaboradores, (editores) (en prensa) . Estos métodos incluyen aquellos que involucran emulsiones (separación de fases, extracción por solventes y evaporación de solventes) y aquellos que involucran atomización (secado por rocío, congelado por rocío) . Las principales desventajas asociadas con los métodos arriba referenciados pueden incluir, bajo ciertas circunstancias: 1) altas temperaturas que provocan la inactivación de la proteína; 2) exposición a solventes orgánicos que provocan la inactivación de proteínas; 3) incapacidad para encapsular los fármacos hidrofilicos debido a la pérdida de fármacos en la fase acuosa que se usa para extraer el solvente orgánico; 4) la gran cantidad de solventes orgánicos normalmente requeridos durante los procesos, y que no se pueden separar adecuadamente del producto final, esto es, altos niveles de solvente residual en el producto final; 5) eficiencias pobres de cargas de proteínas; 6) rendimientos globales pobres; 7) problemas con fuga de fármacos y/o la liberación inicial elevada del fármaco al administrarse; y 8) costosas y complejas de escalarse. En cuanto a lo que se refiere específicamente al apartado 4) , se han descrito los problemas asociados con los altos niveles de solventes en los procesos de secado por rocío; ver por ejemplo, Clarke y colaboradores, Drug Devel. and Industrial Pharmacy, 24: 169-175 (1998); Bitz and Doelker, Inter. Journal of Pharm. , 131:171-181 (1996); y Takada y colaboradores, Journ. Of Controlled Reléase, 32 : 79-85 (1994) . Hay numerosos reportes tanto en la literatura de patentes como en la científica referente a procesos mejorados para la preparación de micropartículas . Por ejemplo, en Gombotz y colaboradores, Patente U.S. No. 5,019,400, se describe un proceso para la preparación de micropartículas en donde se usan temperaturas muy frías para congelar mezclas de agente biológicamente activo- polímero en microesferas poliméricas con una alta retención de la actividad biológica y el material. En Ramstack y colaboradores, Patente U.S. No. 5,650,173, se describe un proceso para la preparación de micropartículas en donde una mezcla de al menos 2 solventes no tóxicos, libres de hidrocarburos halogenados, se usa para disolver el polímero y el ingrediente activo. Las micropartículas resultantes, aunque están libres de solventes tóxicos residuales, tienen todavía cantidades residuales de alcohol bencílico y acetato de etilo lo que tiene un efecto negativo en la integridad del producto. En Rickey y colaboradores, Patente U.S. No. 5,792,477, se describe un proceso que mejora el problema del solvente residual reportado en Ramstack y colaboradores, al incluir etapas de lavado adicionales en el proceso para efectuar la separación adecuada de los solventes. Aunque estos y otros esfuerzos de investigación han promovido claramente la tecnología, existe todavía la necesidad de un proceso de preparación de micropartículas ampliamente aplicable, más eficiente, económico, para su uso con proteínas, péptidos y moléculas pequeñas, que sea receptivo al procesamiento aséptico y que sea escalable.

Entre las diversas proteínas para las cuales se ha reportado una composición efectiva de liberación sostenida está la eritropoyetina. La eritropoyetina (EPO) es una hormona de glicoproteína involucrada en la maduración de células prcgenitoras .de eritroides en eritrocitos. Se produce en el riñon y es esencial en la regulación de los niveles de células de glóbulos rojos en la circulación. Las condiciones marcadas por niveles bajos de señales de oxígeno en los tejidos, incrementan la producción de eritropoyetina que a su vez estimula la eritropoyesis . Por ejemplo, una pérdida de la función del riñon como se observa en la falla renal crónica (CRF) , resulta típicamente en una producción disminuida de eritropoyetina y una reducción concomitante en las células de glóbulos rojos. La administración de eritropoyetina recombinante humana (rHuEPO) es efectiva en la elevación de los niveles de células de glóbulos rojos en pacientes anémicos con enfermedad renal de etapa terminal; Eschbach y colaboradores, New Eng. J. ed. , 316:73-38 (1987). Los estudios posteriores han demostrado que el tratamiento con rHuEPO puede corregir la anemia asociada con una diversidad de otras condiciones; Fischl y colaDoradores, New Eng. J. Med., 322:1488-1493 (1990); Laupacis, Lancet, 341: 1228-1232 (1993). Se han otorgado aprobaciones regulatorias para el uso de la eritropoyetina humana recombinante en el tratamiento de la anemia asociada con CRF, anemia relacionada con la terapia con AZT (zidovudina) en pacientes infectados con VIH, anemia en pacientes con malignidades no mieloides que reciben quimioterapia, y anemia en pacientes que se someten a cirugía para reducir la necesidad de transfusiones sanguíneas alogénicas. La terapia actual para todas las indicaciones aprobadas (excepto la indicación de cirugías) involucra una dosis de partida de entre 50-150 Unidades/kg tres veces por semana (TI ) administrada por una inyección intravenosa (IV) o subcutánea (SC) para alcanzar un rango sugerido de hematocritos objetivo de 30% a 36%. Para la indicación de cirugía, la rHuEPO se administra cada día 10 días antes de la cirugía, el día de la cirugía, y cuatro días posteriormente (EPOGEN® Package Insert, 12/23/96) . En general, las dosis actuales de partida recomendadas para la rHuEPO elevan el hematocrito dentro del rango objetivo en alrededor de seis hasta ocho semanas. Una vez que se ha alcanzado el objetivo del rango de hematocrito, se establece un programa de dosificación de mantenimiento que variará dependiendo del paciente, pero que es típicamente tres veces por semana para pacientes anémicos con CRF. La administración de rHuEPO arriba descrita es un régimen efectivo y bien tolerado para el tratamiento de la anemia . En Zale'y colaboradores, Patente U.S. No. 5,674,534, se describen composiciones de liberación sostenida de EPO biológicamente activa no agregada. Las composiciones comprenden una matriz polimérica de un polímero biocompatible y partículas de una EPO estabilizada por agregación, biológicamente activa, en donde las partículas se dispersan dentro del polímero biocompatible, y en donde las micropartículas se preparan usando los procesos descritos en la Patente U.S. 5,019,400. El método descrito y reivindicado utiliza un excipiente desalado para estabilizar la EPO. Se dice que la formulación tiene ventajas, incluyendo niveles de sangre in vivo de la EPO más consistentes, más duraderos, disparos iniciales inferiores de EPO y . beneficios terapéuticos crecientes al eliminar las fluctuaciones en los niveles de EPO en suero. La eritropoyetina humana recombinante expresada en células de mamíferos, contiene tres cadenas de oligosacáridos ligadas en N y una ligada en O, que juntas comprenden alrededor del 40% del peso molecular total de la glicoproteína . La glicosilación ligada en N se presenta en los residuos de asparagina ubicados en las posiciones 24, 38 y 83, mientras que la glicosilación ligada en O se presenta en un residuo de serina ubicado en la posición 126; Lai y colaboradores, J. Biol. Chem., 261:3116 (1986); Broudy y colaboradores, Arch. Biochem. Biophys., 265:329 (1988). Las cadenas de oligosacáridos han demostrado modificarse con residuos de ácidos siálicos terminales. El tratamiento enzimático de la eritropoyetina glicosilada para eliminar los residuos de ácido siálico resultan en una pérdida de la actividad in vivo, pero no afecta la actividad in vitro; Lowy y colaboradores, Nature, 185:102 (1960); Goldwasser y colaboradores, J. Biol. Chem., 249:4202 (1974). Este comportamiento ha sido explicado por la depuración rápida de la asialo-eritropoyetina de la circulación con la interacción con la proteina de enlace hepática de asialoglicoproteina; Morell y colaboradores, J. Biol. Chem., 243:155 (1968); Briggs, y colaboradores, Am. J. Physiol., 227:1385 (1974); Ashwell y colaboradores, Methods Enzymol., 50:287 (1978). La proteina estimuladora de la eritropoyetina novedosa (NESP) es un análogo de eritropoyetina hiperglicosilado que tiene cinco cambios en la secuencia de aminoácido de la rHuEPO, que proporciona dos cadenas adicionales de carbohidrato. Más específicamente, la NESP contiene dos cadenas de carbohidrato ligadas en N adicionales en los residuos de aminoácidos 30 y 88 (número correspondiente a la secuencia de la EPO humana) (ver solicitud PCT No. US94/02957, incorporada en la presente como referencia en su totalidad) . La NESP es bioquímicamente diferente de la EPO, que tiene una actividad biológica in vivo superior y una vida media de suero más extensa; Egrie y colaboradores, ASH 97, Blood, 90:56a (1997). Se ha demostrado que la NESP tiene un incremento de alrededor de 3 veces en la vida media del suero en ratones, ratas, perros y en el hombre; Id. En los ratones, la actividad in vivo superior y la vida media más prolongada del suero, permiten una dosis menos frecuente (una vez semanalmente o una vez cada tercera semana) en comparación con la rHuEPO, para obtener la misma respuesta biológica; Id. Un estudio farmacocinético demostró que consistente con los estudios animales, la NESP tiene significativamente una vida media de suero más extensa que la rHuEPO en pacientes con falla renal crónica, sugiriendo que un programa de dosificación menos frecuente puede también emplearse en humanos; acDougall , y colaboradores, J American Society of Nephrology, 8: 268A (1997) . Seria más conveniente un programa de dosificación menos frecuente para los médicos y para los pacientes, y seria particularmente útil para aquellos pacientes involucrados en la auto-administración. Otras ventajas para la dosificación menos frecuente, pueden incluir menos fármaco introducido a los pacientes, una reducción en la naturaleza o severidad de algunos efectos laterales observados con la administración de rHuEPO y un cumplimiento mayor. La presente invención se basa en el descubrimiento de que la NESP, se puede encapsular en microparticulas y proporcionar una composición farmacéutica con un perfil de liberación sostenida aun más dramático, permitiendo una dosificación de una vez cada 4-6 semanas para elevar los hernatocritos y tratar la anemia, y proporcionar asi una tremenda ventaja terapéutica. Adicionalmente, el sistema NESP/PLGA es tal que el componente PLGA se depura (biodegrada) hasta al menos una semana antes de la terminación del efecto terapéutico, y permite asi una dosis repetida con menos preocupación del polímero y de la acumulación de fármacos de dosis a dosis. Tal sistema puede no ser posible con, por ejemplo, microparticulas EPO/PLGA. Adicionalmente, la presente invención proporciona un método escalable económico mejorado, para la preparación de microparticulas que es ampliamente aplicable a agentes biológicamente activos diferentes al NESP, incluyendo péptidos y moléculas pequeñas.

Breve Descripción de la Invención. En consecuencia, un aspecto de la presente invención es una composición farmacéutica para la liberación sostenida de un ingrediente activo, que comprende un ingrediente biológicamente activo contenido dentro de las partículas poliméricas. De manera importante, las composiciones de liberación sostenida de la presente invención mantienen la actividad, integridad y seguridad del ingrediente activo durante la encapsulación y liberación, lo que ayuda a proporcionar periodos más prolongados de liberación consistente. Un segundo aspecto de la presente invención, se refiere a un proceso nuevo y mejorado para la preparación de una composición de liberación sostenida, que comprende un ingrediente activo contenido dentro de microparticulas poliméricas. El proceso es económico, receptivo al procesamiento aséptico, escalable y ampliamente aplicable para proteínas, péptidos y moléculas pequeñas. El proceso mejorado se puede describir generalmente como que comprende las etapas de (a) obtener un polvo seco de un ingrediente activo específico o ingrediente activo formulado; (b) preparar una solución de polímero que comprende un polímero disuelto en una mezcla de co-solvente; (c) dispersar el polvo seco en la solución de polímero para producir una mezcla de polímero/ingrediente activo; (d) preparar las microparticulás que contienen el ingrediente activo de la mezcla; (e) recolectar las microparticulas y (f) terminar las microparticulas por secado secundario. De forma importante, los tiempos de secado asociados con este proceso se reducen significativamente en comparación con los métodos del arte previo. Breve Descripción de las Figuras . La Figura 1 es una representación esquemática del proceso de la presente invención para la elaboración del ingrediente activo que contiene microparticulas. La Figura 2, muestra cromatogramas que detallan la cromatografía de exclusión por tamaño que resulta de una preparación NESP previo al secado por rocío ( . . . ) , un polvo de proteína NESP secado por rocío ( ) , y un resultado típico para la NESP después de la ' encapsulación de microparticulas ( ) . La Figura 3 es una gráfica que detalla los niveles de suero NESP para diversas preparaciones de microparticulas que se han inyectado subcutáneamente (360 g/k;g de dosis de péptido NESP) dentro de ratas. Se gráfica la concentración del suero contra tiempo (días) . La Figura 4 es una gráfica que detalla el hematocrito para ratas inyectadas subcutáneamente (360 µg/kg de dosis de péptido NESP) con diversas preparaciones con micropartículas . Se gráfica el hematocrito (%) contra el tiempo (días) . La Figura 5 es una gráfica que detalla los niveles de suero NESP para diversas preparaciones de micropartículas que se han inyectado subcutáneamente (360 µg/kg de dosis de péptido NESP) dentro de ratas. Se gráfica la concentración de suero contra el tiempo (días) . La Figura 6 es una gráfica que detalla los niveles de suero NESP para diversas preparaciones de micropartículas que se han inyectado subcutáneamente (360 µg/kg de dosis de péptido NESP) dentro de ratas. Se gráfica la concentración de suero contra el tiempo (días ) . La Figura 7 es una gráfica que detalla los niveles de hemoglobina para ratas inyectadas subcutáneamente con una inyección de bolo de 10,000 µg/kg de NESP contra una inyección de 100 µg/kg (20 mg de micropartícula) de una preparación de micropartícula NESP (50:50, viscosidad inherente 0.4 dL/g) . Se grafican los niveles de hemoglobina (g/dL) contra el tiempo (días) . La Figura 8 es una gráfica- que detalla los niveles de suero NESP para diversas preparaciones de micropartículas que se han inyectado subcutáneamente (360 µg/kg dosis de péptido NESP) dentro de ratas. Se gráfica la concentración del suero contra el tiempo (días) . La Figura 9 es una gráfica que detalla los niveles de suero de leptina para ratas inyectadas con diversas preparaciones de leptina. Se grafican la concentración contra el tiempo (horas) . La Figura 10 es una gráfica que detalla el porcentaje de pérdida de peso para ratas inyectadas con diversas preparaciones de leptina. Se gráfica el peso corporal (mg) contra el tiempo (días) . La Figura 11 es una gráfica que detalla los niveles de suero NESP para preparaciones de microparticulas que se han inyectado subcutáneamente (360 µg/kg dosis de péptidos NESP) dentro de ratas. Se gráfica la concentración de suero contra tiempo (días). La Figura 12 es una gráfica que detalla el hematocrito para ratas inyectadas subcutáneamente (360 µg/kg dosis de péptido NESP) con preparaciones de microparticulas. Se gráfica el hematocrito (%) contra el tiempo (días) . La Figura 13 es una gráfica que detalla los niveles de suero NESP para preparaciones de microparticulas que se han inyectado subcutáneamente (360 µg/kg dosis de péptido NESP) dentro de ratas. La concentración de suero se gráfica contra tiempo (días).

La Figura 14 es una gráfica que detalla el hematocrito para ratas inyectadas subcutáneamente (360 µg/kg dosis de péptido NESP) con preparaciones de micropartículas. Se gráfica el hematocrito (%) contra el tiempo (días ) . ' Descripción Detallada de la Invención. A menos que se señale de otra forma, el término micropartículas se puede usar para abarcar micropartículas, microesferas, y microcápsulas . Como se describe completamente a continuación, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la liberación sostenida de un ingrediente activo, que comprende un ingrediente biológicamente activo contenido dentro de micropartículas poliméricas. Se define una composición de liberación sostenida como una liberación de agente biológicamente activo que resulta en niveles medibles de suero del agente por un periodo de tiempo más prolongado que aquel que se obtiene siguiendo la administración directa de un agente acuoso biológicamente activo. La liberación sostenida puede ser continua o discontinua, lineal o no lineal, y esto se puede lograr usando una o más composiciones de polímero, cargas de fármaco, selección de excipientes u otras modificaciones. En una modalidad de la presente invención, la composición de liberación sostenida comprenderá el ingrediente biológicamente activo, NESP. El NESP de la presente invención es un análogo hiperglicosilado de EPO que comprende dos sitios adicionales de glicosilación con una cadena de carbohidrato adicional colocada en cada sitio. Se construye el NESP usando la mutagénesis dirigida al sitio y expresada en células huésped mamiferas. Los detalles de la producción de NESP se proporcionan en la Solicitud PCT de co-propiedad No. US94/02957. Los sitios de glicosilación nuevos, ligados en N para la rHuEPO, se introducen por alteraciones en la secuencia de ADN para codificar los aminoácidos Asn-X-Ser/Thr en la cadena de polipéptidos . El ADN que codifica la NESP se transfecta dentro de células huésped de ovario de hámster chino (CHO) y el polipéptido expresado se analiza para la presencia de cadenas adicionales de carbohidrato. En una modalidad preferida, la NESP tendrá dos cadenas adicionales de carbohidrato ligadas en N en los residuos 30 y 88. La numeración de la secuencia de aminoácidos es aquella de la eritropoyetina humana (EPO) . La secuencia de aminoácidos de EPO es aquella detallada en la SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de NESP es aquella detallada en la SEQ ID NO: 2. Se entiende que la NESP tendrá el complemento normal de los sitios de glicosilación ligados en 0 y ligados en N además de los nuevos sitios. La NESP de la presente invención puede también incluir cambios conservadores de aminoácidos en uno o más residuos en la SEQ ID NO: 2. Estos cambios no resultan además de una cadena de carbohidratos y tendrán poco efecto en la actividad biológica del análogo. Otros ingredientes activos a incorporarse dentro de las microparticulas de la presente invención son compuestos naturales o sintéticos que demuestran un efecto biológico cuando se introducen dentro de una criatura viviente. Los agentes activos contemplados incluyen péptidos, moléculas pequeñas, carbohidratos, ácidos nucleicos, lipidos, proteínas y análogos de los mismos. Las proteínas contempladas para su uso incluyen citocinas potentes incluyendo diversos factores hematopoyéticos tales como G-CSF, G -CSF, M-CSF, MGDF, los interferones (alfa, beta, y gamma) , interferones de consenso, las interleucinas (1-12) eritropoyetina (EPO) , factor de crecimiento de fibroblastos, KGF, TNF, TNFbp, IL-lra, factor de células madre, factor de crecimiento de los nervios, GDNF, BDNF, NT3, factor de crecimiento derivado de plaquetas y factor de crecimiento de tumor (alfa, beta), osteoprotegerina (OPG) , NESP, y proteína OB. La proteína OB se referirá también como leptina.

También se contempla para la incorporación dentro de las composiciones de la presente invención, derivados, proteínas de fusión, conjugados, análogos o formas modificadas de los ingredientes activos naturales. La modificación química de proteínas biológicamente activas se ha encontrado que proporciona ventajas adicionales bajo ciertas circunstancias tales como el incremento de la estabilidad y el tiempo de circulación de la proteína terapéutica y la inmunogenicidad disminuida. Por ejemplo, Davis y colaboradores, Patente U.S. No. 4,179,337, describe la conjugación de polipéptidos solubles en agua tales como enzimas e insulina al polietilenglicol (PEG) ; ver también Kinstler y colaboradores, Patente U.S. No. 5, 824, 784. En general, se encuentran comprendidas por la presente invención, composiciones farmacéuticas que comprenden cantidades efectivas de proteínas o productos derivados de esta invención junto con diluyentes, estabilizadores, conservadores, solubilizadores , emulsificantes, adyuvantes y/o portadores farmacéuticamente aceptables. Tales composiciones incluyen diluyentes de diverso contenido amortiguador (por ejemplo, clorohidrato de Tris, fosfato), pH y resistencia iónica; aditivos tales como detergentes y agentes solubilizantes (por ejemplo, polisorbato 20, polisorbato 80), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito de sodio) , conservadores (por ejemplo, timerosol, alcohol bencílico) y substancias que incrementan el volumen (por ejemplo, lactosa, manitol), ver por ejemplo, Remington' s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042) páginas 1435-1712 que se incorporan en la presente como referencia. Una cantidad efectiva de ingrediente activo es una cantidad diagnósticamente, terapéuticamente o profilácticamente efectiva que se puede determinar fácilmente por una persona habilitada en el arte al tomar en cuenta factores tales como el peso corporal, edad, meta diagnóstica o profiláctica o terapéutica y la rapidez de liberación deseada. Como se usa en la presente, y cuando se contemplan micropartículas que contienen NESP, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad que proporciona un incremento en el hematocrito que otorga beneficio a un paciente. La cantidad variará de un individuo al otro y dependerá de diversos factores incluyendo la condición física global del paciente y la causa subyacente de anemia. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente efectiva de rHuEPO para un paciente que padece falla renal crónica es desde 50 hasta 150 unidades/kg tres veces por semana. La cantidad de rHuEPO usada para la terapia da una rapidez aceptable de incremento en el hematocrito y conserva el hematocrito a un nivel benéfico (usualmente al menos alrededor de 30% y típicamente en un intervalo de 30 a 36%) . Una cantidad terapéuticamente efectiva de la presente composición se puede asegurar fácilmente por alguien con habilidad en el arte usando materiales y procedimientos públicamente disponibles . La invención proporciona la administración de micropartículas que contienen NESP menos frecuentemente que la NESP y/o EPO. La frecuencia de dosificación variará dependiendo de la condición a tratarse pero en general será de una vez por 4-6 semanas. Se entiende que las frecuencias de dosificación actualmente usadas pueden variar de alguna forma de las frecuencias descritas en la presente, debido a variaciones en respuestas por diferentes individuos a las micropartículas que contienen NESP; el término "alrededor" pretende reflejar tales variaciones . La presente invención se puede así usar para estimular la producción de células de glóbulos rojos y corregir los niveles deprimidos de células rojas. Más comúnmente, los niveles de células rojas se disminuyen debido a la anemia. Entre las condiciones que se tratan por la presente invención incluyen anemia asociada con una disminución o pérdida de la función del riñon (falla crónica renal) , anemia asociada con terapia mielodepresora tal como fármacos quimioterapéuticos o antivirales (tal como AZT) , anemia asociada con la progresión de cánceres no mieloides y anemia asociada con infecciones virales (tal como VIH) . También se tratan condiciones que pueden conducir a anemia en un individuo que está saludable de otra manera, tal como pérdidas anticipadas de sangre durante la cirugía. En general, cualquier condición tratable por la rHuEPO se puede también tratar con las micropartículas que contienen NESP de la invención. La invención también proporciona la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva de hierro con objeto de mantener la eritropoyesis creciente durante la terapia. La cantidad a darse se determinará fácilmente por alguien con habilidad en el arte con base en la terapia con rHuEPO. La presente invención también proporciona un método mejorado para la preparación de micropartículas poliméricas que contienen un ingrediente activo, que comprende la utilización de una mezcla co-solvente para efectuar la eliminación más rápida de solventes orgánicos durante el secado. La presencia residual de componentes secundarios de solventes orgánicos en la mezcla durante el secado, resulta en la aceleración de la eliminación del solvente del polímero residual durante algún proceso de secado. Este método mejorado proporciona diversas ventajas importantes sobre los procesos descritos en el arte incluyendo por ejemplo, 1) reducción de los niveles de solventes residuales en el sistema de polímeros después de la etapa de formación inicial de micropartículas; 2) reducción en los tiempos del ciclo de secado para los sistemas de polímeros; y 3) permitir la eliminación de solventes tóxicos hasta niveles aceptables para su uso en productos farmacéuticos humanos. De forma importante, estas ventajas ayudan a hacer tales procesos comercialmente prácticos. La modalidad principal del método mejorado para hacer las micropartículas cargadas con proteínas comprende: (a) obtener un polvo seco de un ingrediente activo o un ingrediente activo formulado, (b) disolver un polímero en una mezcla co-solvente para producir una solución polimérica; (c) agregar el polvo seco a la solución polimérica para producir una mezcla de polímero/ingrediente activo (d) secar por atomización la mezcla para producir micropartículas cargadas con el ingrediente activo deseado; (e) recolectar las micropartículas y (f) terminar las micropartículas por secado secundario. El proceso se muestra en la Figura 1.

En una modalidad de la presente invención, el ingrediente activo o ingrediente activo formulado estará en forma de un polvo secado por rocío. El secado por rociado es un proceso en donde se atomiza una solución para formar una niebla fina y se seca por contacto directo con gases portadores calientes. Para una revisión detallada del secado por rociado ver por ejemplo Masters, K., "Spray Drying Handbook" (John Wiley & Sons, eds . , New York 1984). Se proporciona en la presente un método de preparación de un polvo de proteína secado por rociado a escala comercial mejorado, que resulta en rendimientos significativamente superiores y en una recolección mejorada de las micropartículas . Los solventes de polímeros contemplados para su uso en . la etapa de los procesos actuales incluyen por ejemplo cloroformo, acetato de etilo, acetona, cloruro de metileno y dimetilsulfóxido . En una modalidad de la presente invención, el solvente del polímero a usarse es cloruro de metileno. Los no solventes contemplados para uso incluyen etanol, formiato de etilo y heptano. La etapa de preparación de micropartículas (d) puede involucrar alternativamente una emulsión basada en la preparación o en congelación por rociado. Para las emulsiones producidas en los procesos de la presente invención, las relaciones orgánica : acuosa contempladas para su uso. son 1:1 hasta 12:1. En general, las micropartículas preparadas por los métodos de la presente invención comprenderán generalmente 0.001-60% en peso de proteína . Los procesos de secado secundario contemplados para su uso en la etapa (f) incluyen secado con muestreo de gas, secado en lecho fluidizado, liofilización, secado al vacío, y secado en charola. En una modalidad de la presente invención, el secado por muestreo de gas se utiliza en la etapa (f) . Los polímeros contemplados para uso pueden seleccionarse del grupo que consiste de polímeros biocompatibles y/o biodegradables . Como se define en la presente, biodegradables significa que la composición se erosionará o degradará in vivo para formar especies químicas biocompatibles más pequeñas. La degradación puede suceder por ejemplo por procesos enzimáticos, químicos o físicos. Los polímeros biodegradables apropiados contemplados para su uso en la presente invención incluyen polilacturos, poliglicoluros , poli ácidos lácticos, poli ácidos glicólicos, polianhídridos, poliortoésteres , polieterésteres , policaprolactona, poliesteramidas , polifosfaceno, polifosfoésteres, ácidos pseudopoliaminos ; Langer, Nature, 392:5-10 (1998), mezclas de copolímeros de los mismos.

El intervalo de pesos moleculares contemplados para los polímeros a usarse en los procesos actuales se puede determinar fácilmente por una persona habilitada en el arte con base en factores tales como la rapidez de degradación del polímero deseado. Típicamente, El intervalo de peso molecular estará de 2000 a 2,000,000 de daltones. Casi cualquier tipo de polímero se puede usar con tal de que se encuentre el solvente adecuado o sistema co-solvente. El término "PLGA" como se usa en la presente, se pretende para referir a un polímero de ácido láctico solamente, un polímero de ácido glicólico solamente, una mezcla de tales polímeros, un co-polímero de ácido glicólico y ácido láctico, una mezcla de tales co-polímeros o una mezcla de tales polímeros y co-polímeros . El PLGA usado puede estar en forma de ácido libre (sin cubrir) o en el éster en forma de éster terminal (cubierto) . Preferiblemente, el polímero biodegradable será polilacturo-coglicoluro (PLGA) . Las concentraciones de polímero contempladas para su uso en los procesos de la presente invención están en el intervalo de 5-70 g/lOOmL (g%) . En general, una solución acuosa una suspensión o una forma sólida del agente activo se puede mezclar con el solvente orgánico que contiene el polímero. Cuando se usa una solución acuosa de ingrediente activo, se forma una solución acuosa de ingrediente activo en emulsión de solución de polímero, o emulsión agua en aceite (que contiene al ingrediente activo en la fase acuosa y el polímero en la fase orgánica) y se usa para preparar micropartículas . Cuando una suspensión o forma sólida de ingrediente activo se usa, se forman suspensiones del ingrediente activo sólido en la solución de polímero y se usan para preparar las micropartículas. Alternativamente, se puede usar una solución monofásica de ingrediente activo y polímero. En una modalidad de la presente invención, el ingrediente activo estará en forma de un polvo secado por rociado, el tamaño de partícula del polvo de proteína estará en el intervalo de <10 µ??. Las concentraciones de proteína contempladas para su uso en los procesos de la presente invención están en el intervalo de 0.001-500 mg/mL en la emulsión o suspensión.

La solución del ingrediente activo, suspensión, emulsión o forma sólida se puede también formular, esto es incluye una solución amortiguadora, un tensoactivo o un excipiente que sirve para estabilizar al ingrediente activo durante el secado, por ejemplo, trehalosa, sulfato de amonio, 2-hidroxi propil ß-ciclodextrina, sacarosa, u otros azúcares o excipientes estabilizadores de proteínas .

Una suspensión de microparticulas cargadas con proteína preparadas de conformidad con la presente invención se administra preferiblemente por inyección intraperitonealmente, subcutáneamente o intramuscularmente . Sin embargo, sería claro para alguien con habilidad en el arte que se pueden también usar efectivamente otras formas de entrega usando las composiciones de la presente invención. Se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar más completamente la invención, pero no se constituyen como limitantes del alcance de la misma. El Ejemplo 1 describe un método para la preparación de microparticulas cargadas con proteínas usando secado por rociado para la preparación de microparticulas. Se usa la NESP (en forma de un polvo de proteínas secado por rociado) como una proteína de ejemplo. El Ejemplo 2 describe diversos experimentos de caracterización llevados a cabo en microparticulas que contienen NESP del Ejemplo 1. El Ejemplo 3 demuestra la capacidad de las microparticulas que contienen NESP del Ejemplo 1 para proporcionar la liberación sostenida de NESP in vivo. El Ejemplo 4 describe un método novedoso para la preparación de microparticulas poliméricas en donde se utiliza un co-solvente para efectuar la eliminación más rápida y efectiva del solvente residual. El Ejemplo 5 describe un método para la preparación de micropartículas que contienen NESP usando congelación por rociado para la etapa de preparación de micropartículas. El Ejemplo 6 describe diversos experimentos de caracterización llevados a cabo en las micropartículas que contienen NESP del Ejemplo 5. El Ejemplo 7 demuestra la capacidad de las micropartículas que contienen NESP del Ejemplo 5 para proporcionar la liberación sostenida de NESP in vivo. El Ejemplo 8 describe el método de evaporación y extracción doble de solvente/emulsión para preparar micropartículas PLGA que contienen NESP y demuestra la capacidad para suministrar la liberación sostenida de NESP in vivo. El Ejemplo 9 describe la preparación de micropartículas que contienen leptina usando el proceso del Ejemplo 1 y demuestra la capacidad de las micropartículas que contienen leptina para proporcionar la liberación sostenida de la leptina in vivo. El Ejemplo 10 describe un método para la preparación de micropartículas cargadas de proteína usando secado por rociado para la preparación de micropartículas. El Ejemplo 11 describe diversos experimentos de caracterización llevados a cabo sobre las micropartículas que contienen NESP del Ejemplo 10. El Ejemplo 12 demuestra la capacidad de las micropartículas que contienen NESP del Ejemplo 10 para suministrar la liberación sostenida del NESP in vivo. El Ejemplo 13 demuestra la capacidad de la microparticulas que contienen NESP del Ejemplo 10 para proporcionar la liberación sostenida del NESP in vivo. EJEMPLO 1. Este ejemplo describe un método para preparar microparti ulas cargadas de proteina; específicamente, la preparación de microesferas de poli ( D, L-lacturo-co-glucólido) que contienen NESP, usando secado por rociado para la etapa de preparación de la micropartícula . La NESP se formula a 46% de NESP, 29% de sales de fosfato de sodio, 25% de trehalosa (p/p/p) y secado por rociado en un secador de rocío de escala de laboratorio (BUCHI 190) usando las siguientes condiciones: velocidad de alimentación 2.0 ml/min, atomización 500 NL/hora, temperatura interna 135°C, temperatura externa 99°C, velocidad de flujo de gas de secado 800 SLPM. La proteína en polvo se colectó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 2 de abajo. La proteína en polvo se agregó a PLGA en diclorometano (viscosidad inherente 0.18, llkD) solución de polímero (40% p/v) , y la suspensión resultante se secó por rociado en un secador de rocío de escala de planta piloto (Niro Mobile Minor®) usando las siguientes condiciones: velocidad de alimentación 50 ml/min, velocidad de flujo de atomización (dos boquillas de fluido) 3.0 kg/hora, temperatura del gas de entrada 50 °C, temperatura de salida 30°C, velocidad de flujo de gas de secado 93 kg/hora. Las microparticulas resultantes que contienen NESP (0.53% de NESP) se colectaron después y se caracterizaron después de tamizar (tamaño de malla 125 um) . Las microparticulas que contienen NESP de diferentes composiciones PLGA, se producen usando este proceso. Las composiciones de PLGA difieren en la relación del copolimero de lacturo : glicoluro desde 50:50 hasta 100% de lacturo. Los polímeros de PLGA usados, tienen grupos terminales de cadena de polímero libre de ácido. EJEMPLO 2. Este ejemplo describe diferentes experimentos de caracterizaciones realizadas en el polvo de proteína NESP/trehalosa secado por rociado y las microparticulas que contienen NESP descritas en el Ejemplo 1. El polvo de proteína NESP/trehalosa se caracteriza por cromatografía de exclusión de tamaño bajo condiciones nativas; el porcentaje del monómero queda sin cambios después del secado por rociado (>99.8%) (ver Figura 2). No se observa agregado adicional por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil de sodio (SDS-PAGE) , usando tinción de plata. El polvo de proteína se analiza por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (CLAR-FI); no se observa cambio de la NESP sin procesar. El polvo de proteína también se caracteriza por un ensayo glicoforme CLAR y electroforesis en gel enfocado isoeléctrico (IEF por sus siglas en inglés) y manchado western IEF; no se observó cambio en la distribución glicoforme. El radioinmunoensayo del polvo reconstituido demuestra el reconocimiento del anticuerpo completo, y el mapeo tríptico no demuestra cambio en la oxidación del material no procesado. La distribución del tamaño de partícula del polvo de proteína se determina por difracción Fraunhoffer para tener un volumen medio de distribución de 4.7µ??. El tamaño de partícula de las micropartículas que contienen NESP fue de 58 ± 8 µp? para la media del volumen de distribución determinado por la difracción Fraunhoffer, promediado sobre 5 lotes. La integridad posterior a la encapsulación de la NESP dentro de estas micropartículas fue evaluada por la extracción de la proteína, y analizando los extractos por medio de CLAR de intercambio de aniones y de exclusión de tamaño bajo condiciones nativas. Para extraer el NESP de las micropartículas, se colocaron aproximadamente 20 mg de micropartículas en un tubo con 1 mL de acetonitrilo . Las muestras se colocaron en un vórtice durante 10-20 segundos y se centrifugaron a 14,000 rpm durante 2 minutos a 4°C para peletizar la proteina y los excipientes. Se removió el sobrenadante y el peletizado se volvió a suspender en 1 mL de acetonitrilo . Las etapas anteriores se realizaron tres veces más. Después de la remoción final del sobrenadante, las muestras se secaron en un horno al vacio durante 2-3 horas a temperatura ambiente. El NESP peletizado se reconstituyó en fosfato de sodio 20mM, pH 6.0, con o sin Tween 80 al 0.005%. Después de un golpeteo suave del tubo, la muestra se incubó a temperatura ambiente durante 2 horas para realizar la disolución completa. La proteina se cuantificó y se determinó la integridad por intercambio de aniones en serie con CLAR de exclusión de tamaño. La recuperación de la proteina fue cuantitativa (>99%) y la integridad de la proteina fue de 98.2 ± 1.0% monomérico por CLAR de exclusión de tamaño promediado sobre los 5 lotes, cada lote caracterizado en triplicado (ver Figura 2) . El extracto de la formulación de lacturo al 75% se caracterizó adicionalmente por radioinmunoensayo, electroforesis capilar, y mapeo de péptidos. El RIA resultó en recuperaciones de proteina consistente con los resultados SEC, lo que demuestra un anticuerpo reconocible por la proteina. La electroforesis capilar confirmó que la distribución glicoforme estuvo sin cambio de la NESP no procesada. La extensión de la oxidación como se determina por el mapeo de péptido, fue equivalente a la NESP no procesada. EJEMPLO 3. Este ejemplo demuestra la capacidad de las micropartículas ¦ que contienen NESP, preparadas como se describe en el Ejemplo 1, para proporcionar la liberación sostenida de la NESP in vivo. Se inyectaron micropartículas que contienen NESP (360 µg/kg de dosis de péptido NESP) subcutáneamente a la nuca del cuello de ratas macho Sprague Dawley (385 ± 14 g) . Se incluyó como control una inyección sencilla en bolo, subcutánea, de NESP en una dosis equivalente a las micropartículas. Las muestras de sangre se tomaron de la vena de la cola al momento posterior a la inyección hasta 8 semanas. La concentración de NESP en el suero de la rata se determinó por ELISA durante 2 y 4 semanas. Se analizó sangre entera para cuentas de hematocritos, hemoglobina, y reticulocitos . Los niveles de suero NESP de una inyección sencilla de micropartículas que contienen NESP fabricadas de polímero de lacturo : glicoluro 50:50, fue de > 1 ng/mL durante 15 días para todos los tres lotes estudiados (ver Figura 3) . La NESP sola dada como un bolo sencillo tuvo niveles de suero elevados por 11 días (ver Figura 3) . Las micropartículas que contienen NESP elevan la hemoglobina y hematocritos arriba de la linea base por 25 y 28 días, respectivamente (ver Figura 4). El bolo de NESP tuvo hemoglobina y hematocritos elevados por 25 días (ver Figura 4 ) . Los niveles de suero NESP de una inyección sencilla de micropartículas que contienen NESP fabricada de polímero de lacturo : glicoluro 75:25 fueron de > 1 ng/mL por 20 días (ver Figura 3) . Las micropartículas que contienen NESP elevan la hemoglobina y hematocritos arriba de la línea base por > 40 días (ver Figura 4). Los niveles de suero NESP de una inyección sencilla de micropartículas que contienen NESP fabricada usando una mezcla de solución de 50:50 y 10% de polímeros de lacturo para crear un promedio general de 75% de polímero de lacturo, fue de > 1 ng/mL por 18 días (ver Figura 3) . Las micropartículas que contienen NESP elevan la hemoglobina y hematocritos arriba de la línea base por 35 días (ver Figura 4). EJEMPLO . Este ejemplo describe el método novedoso para preparar micropartículas en donde se utiliza un co-solvente para efectuar una remoción más rápida y efectiva del solvente residual; específicamente, la preparación de microesferas de poli (D, L-lacturo-co-glicoluro) utilizando una mezcla de co-solvente de etanol/cloruro de metileno.

Dos lotes de 50:50 de microparticulas de PLGA (11 kD) se produjeron por secado atomizado. Para el lote 1, se usó cloruro de metileno puro para disolver una masa de PLGA igual a 26% de la masa del solvente. Para el lote 2, se usó un co-solvente de cloruro de metileno (86.4% por masa) y etanol (13.6% por masa) para disolver una masa de PLGA igual a 26% de la masa co-solvente) . Las soluciones resultantes se secaron por rociado en una secador de rocío de escala de planta piloto (Niro obile Minor®) usando las siguientes condiciones: velocidad de alimentación 50 ± 5 ml/minuto, velocidad de flujo de atomización (boquilla de dos fluidos) 60 SLPM, temperatura del gas interno 55 °C, temperatura externa 33-36°C, velocidad de flujo del gas de secado 2.1 lbs/minuto. Las microparticulas resultantes se colectan y se caracterizan. La concentración de solvente residual en el lote 1 después del secado por rociado, fue de 18550 ppm de cloruro de metilo. Las concentraciones de solvente residual en el Lote 2 después del secado por rociado, fueron de 6190 ppm de cloruro de metileno, 3330 ppm de etanol. Se realizó como sigue el secado secundario en ambos lotes: las microparticulas se colocaron en un secador de 1.5" de diámetro en una pantalla de retención. El secador se selló y se hizo fluir nitrógeno a través del lecho a 4.4 L/minuto. El secador se sumergió en un baño calentado para controlar la temperatura. Después, el lote 1 se secó durante 73 horas, iniciando a 20°C y finalizando a 41°C, el nivel de cloruro de metileno residual fue de 750 ppm. El lote 2 se secó durante 40 horas, iniciando a 18°C y finalizando a 30°C. Estas microparticulas alcanzaron niveles de solvente residual de 487 ppm de cloruro de metileno y 455 ppm de etanol. El uso del co-solvente reduce asi la cantidad de tiempo de secado necesario, y mejora los niveles de solvente residual general en las microparticulas finales, haciendo de esta manera a los procesos que utilizan tales solventes más prácticos comercialmente . EJEMPLO 5. Este ejemplo describe un método para preparar microparticulas cargadas de proteína; específicamente, la preparación de microesferas de poli ( D, L-lacturo-co-glicoluro) que contienen NESP, usando congelado por rociado para la etapa de preparación de las microparticulas. Se secaron por rociado dos formulaciones de NESP (formulación de trehalosa del Ejemplo 1, y una formulación de sulfato de amonio) en un secador de rocío de escala de laboratorio usando las condiciones descritas en el Ejemplo 1. La formulación de sulfato de amonio para NESP fue de: 11% NESP, 10% sales de fosfato, 79% de sulfato de amonio (p/p/p) . Las micropartículas que contienen la proteína en polvo NESP/trehalosa se preparan de PLGA desbloqueado, ya sea de Alkermes/Medisorb Wilmington, Ohio, o de Boehringer Ingelheim Chemicals, Inc., Monvale, N.J. o de PLGA bloqueado de Boehringer Ingelheim. Las viscosidades inherentes del polímero están en el rango desde 0.14 dL/g hasta 0.5 dK/g (11-47 kD de peso molecular), y los contenidos de lacturo son desde 50% hasta 100%. La proteína en polvo de NESP/sulfato de amonio se encapsula en PLGA desbloqueado (50:50) con una viscosidad inherente de 0.18 dL/g (11 kD) . El método descrito por Gombotz y colaboradores, (Pat. U.S. No. 5,019,400) se usó para encapsular el polvo de NESP secado por rociado en PLGA. La proteína en polvo se agregó a una solución de polímero de PLGA en diclorometano (5-20% p/v) para realizar un contenido de proteína sólida en las micropartículas en el rango desde 1-5% (p/p) · Se congeló un recipiente de etanol por inmersión en nitrógeno líquido, y se recubrió con una capa de nitrógeno líquido antes de la etapa de congelado por rociado. La suspensión de proteína en polvo en solución de polímero se bombeó por medio de una bomba de jeringa a una boquilla ultrasónica colocada arriba del baño de congelación con etanol. La suspensión se atomizó en gotas que se congelaron al contacto con el nitrógeno liquido y se quedaron en la superficie del etanol congelado, formando microparticulas . El lote congelado se transfirió a -80°C durante 72 horas para permitir que el etanol se fundiera y se extrajo el solvente de polímero de las microparticulas. La mezcla espesa resultante de microparticulas en etanol se filtró en frío (0.65 um PTFE) y las microparticulas colectadas se liofilizaron. Después de la liofilización, las microparticulas (contenido de péptido NESP 0.53%) se tamizaron (tamaño de malla 125 µp?) antes de la caracterización. EJEMPLO 6. Este ejemplo describe varios experimentos de caracterización realizados en las microparticulas que contienen NESP congeladas por rociado, descritas en el Ejemplo 5. Las proteínas en polvo de NESP se caracterizan como se describe en el Ejemplo 2, con los resultados para el NESP/trehalosa ya presentados aquí. El NESP/sulfato de amonio (AS) se caracteriza por cromatografía de exclusión por tamaño bajo condiciones nativas; el porcentaje de monómero se reduce significativamente después del secado por rociado, por 2.5%. Esto es un dímero confirmado por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sodio (SDS-PAGE), y demuestra que no es reducible, usando tinción de plata. La distribución del tamaño de partícula de la proteína en polvo NESP/AS se determina por la difracción Fraunhoffer para tener un volumen medio de distribución de' 4.3 um. El tamaño de partícula de las micropartículas que contienen NESP fabricadas por congelado por rociado para 28 lotes únicos de diferentes formulaciones está en el rango desde 20 hasta 45 µ?? para la media del volumen de distribución. Los niveles residuales de cloruro de metileno fueron todos de < 500 ppm para los 10 lotes evaluados. La integridad posterior a la encapsulación del NESP dentro de estas micropartículas, se evaluó por extracción de la proteína y por analizado de los extractos como se describe en el Ejemplo 2. La proteína recuperada se cuantificó y la integridad (% de monómero) fue de 97.2 ± 2%, cada lote se caracterizó en al menos duplicado. Los extractos de 9 formulaciones seleccionados se caracterizaron adicionalmente por radioinmunoensayo, electroforesis capilar, y mapeo de péptidos. El RIA resultante en las proteínas recuperadas consistentes con los resultados SEC, demuestra una proteína que reconoce el anticuerpo. La electroforesis capilar confirma que la distribución glicoforme está sin cambio de la NESP no procesada. La extensión de la oxidación de la proteína se determina del mapeo péptido en el rango desde 7 - 12%, el material no procesado típicamente es 8 ± 2%. EJEMPLO 7. Este ejemplo demuestra la capacidad de las micropartículas que contienen NESP preparadas en el Ejemplo 5, para proporcionar una liberación sostenida de la NESP in vivo. Se trataron ratas macho Sprague Dawley como se describe en el Ejemplo 3, con diferentes formulaciones de micropartículas que contienen NESP fabricadas por el proceso de congelado por rociado como se describe en Ejemplo 6. La concentración de NESP en el suero y los análisis de sangre entera, se realizaron a través de 4-6 semanas como se describe en el Ejemplo 3. La Figura 5 muestra los resultados obtenidos para los niveles de suero NESP usando diferentes formulaciones de copolímero del Ejemplo 5. Todas las formulaciones de copolímero demuestran una fase de disparo seguida por una fase de liberación de orden cero, y después una caída para bajar el límite de cuantificación de ensayo. Incrementando el contenido de lacturo se reduce el nivel de suero NESP a través de la fase de orden cero por sobre 100 veces. Incrementando la viscosidad inherente (peso molecular) se reduce igualmente este nivel de suero NESP, pero solo por 4 veces (ver Figura 6) . Ambos incrementos de la viscosidad inherente y el incremento del contenido de lacturo, por composición de copolimero o mezcla de solución de polímero, incrementan la duración de las concentraciones de NESP en el suero cuantificable desde 18 días hasta tanto como 35 días. El efecto farmacodinámico, como se mide por el hematocrito elevado arriba de los niveles de línea base, colocan en paralelo las tendencias observadas con la concentración de NESP en el suero. Los datos preliminares en las concentraciones de suero NESP y la elevación de las cuentas de reticulocitos , sugieren un nivel de suero eficaz en las ratas cercano a 0.4 ng/mL para el tratamiento con micropartículas de NESP. En un estudio farmacodinámico de ratón, se trataron ratones BDF1 machos (peso corporal 22 g) con micropartículas de NESP/PLGA (50:50, viscosidad inherente 0.4 dL/g) , en una inyección de bolo subcutánea, sencilla, en la nuca del cuello, a dosis NESP de 6, 30 y 100 µg/kg. Los grupos de prueba de solución NESP se dosificaron en una inyección de bolo subcutánea, sencilla, en la nuca del cuello, a dosis NESP de 100, 1,000 y 10,000 µg/kg. El diseño del estudio fue tal que se colectó la sangre cada 2-4 días para análisis de sangre entera durante un periodo de 35 días, pero cualesquiera de cada uno de los animales no sangró más de dos veces en un periodo de 7 días . Se observó una respuesta a la dosis de los grupos tratados con microparticulas. Los niveles de hemoglobina se elevaron arriba de la linea base por > 4 semanas para la dosis de microparticulas de 100 µg/kg. La duración del efecto después del tratamiento con el bolo de solución NESP solo fue equivalente al que se observa con las microparticulas cuando se dan a una dosis mayor a 100 veces que las microparticulas (ver Figura 7). EJEMPLO 8. Este ejemplo describe la extracción doble de emulsión/solvente y el método de evaporación para preparar microparticulas PLGA que contienen NESP, y demuestra la capacidad para proporcionar liberación sostenida del NESP in vivo. Se prepararon dos formulaciones acuosas de NESP: formulación 1 = 5.5 mg/mL de NESP (concentración de péptido) formulada con 20 mM de fosfato de sodio, pH 6.0; formulación 2 = 5.2 mg/mL de NESP (concentración de péptido) formulada con 20 mM de fosfato de sodio, 105 mg/mL de 2-hidroxipropil ß-ciclodextrina, pH 6.0. Las microparticulas que contenían las formulaciones de NESP anteriores, se preparan de PLGA desbloqueado (50:50, viscosidad inherente 0.2, llkD) obtenido de Boehringer Ingelheim Chemicals, Inc., Montvale, N.J. Se usó la emulsión doble seguida por la extracción del solvente y el método de evaporación como se describe a continuación . Se disolvieron aproximadamente 2 g de polímero en 6 mL de diclorometano, y se homogenizó a 25 krpm en un tubo de ensayo de vidrio de 18 x 150 mm en hielo. Se agregó la solución de proteína (1.0 mL) durante la homogenización, que se continuó durante 30 segundos adicionales en el hielo para formar la emulsión primaria. Para la emulsión secundaria, se enfrió previamente hasta 15°C 40 mL de la fase externa acuosa (fosfato de sodio 18 mM, alcohol de polivinilo al 0.5%, pH 6.0) en una cubeta de 100 mL de 4.5 cm de diámetro interno, en un baño de agua. Se sumergió una navaja impulsora Rushton de 1" en la fase externa enfriada, y el mezclado fue inicialmente a 1480 rpm. La emulsión primaria se agregó rápidamente para formar la emulsión secundaria, y el mezclado continuó a la misma velocidad durante un total de 40 minutos. La emulsión curada se lavó con agua dos veces transfiriendo la solución a dos tubos de 50 mL, centrifugando a una fuerza de 500 g durante 30 segundos, se vació hasta un volumen de 10 mL, y se repitió. La suspensión final se transfirió en viales y se liofilizó. El polvo seco final se tamizó (tamaño de malla de 180 µ?t\) antes de la caracterización por los métodos descritos en el Ejemplo 2. El proceso proporciona una eficiencia de encapsulación cuantitativa, una pobre producción de producto (50%), tamaño de partícula grande (120 µt?) , y niveles aceptables de cloruro de metileno residual (cercano a 500 ppm) . La integridad posterior a la encapsulación de la NESP con estas micropartículas , se evaluó por extracción de la proteína y analizando los extractos como se describe en el Ejemplo 2. La recuperación de la proteína fue cuantitativa y la integridad (% de monómero) fue de 97.5% ± 0.01% para la formulación (1), y 96.7 ± 0.3% para la formulación (2); cada uno de los lotes se caracterizó por triplicado. Se trataron ratas macho Sprague Dawley como se describe en el Ejemplo 3 con las dos formulaciones de micropartículas que contienen NESP fabricadas por el proceso de emulsión doble. Los niveles de suero NESP demuestran una fase de disparo seguida por una fase de liberación del orden cero, y después una caída para bajar el límite de cuantificación de ensayo después de 18 días para la formulación 1 y después de 22 días para la formulación 2. El efecto farmacodinámico como se mide por la hemoglobina elevada arriba de la línea base, finalmente por 25 y >28 días (fin del estudio) para las formulaciones (1) y (2), respectivamente (ver Figura 8). EJEMPLO 9 . Este ejemplo describe la preparación de microparticulas que contienen leptina y demuestra la capacidad de las microparticulas que contienen leptina para proporcionar una liberación sostenida de leptina in vivo . Las microparticulas que contienen leptina se preparan usando el procedimiento descrito en el Ejemplo 1, y después se caracterizan como se describe en el Ejemplo 2. Se determina que la recuperación de la proteina fue de >95% y la integridad fue de >98%. El proceso proporciona una alta eficiencia de encapsulación (85-95%), buen rendimiento de producto (75-85%), bajo disparo (<15%), tamaño de partícula aceptable (~35 um) , y niveles de solvente residual aceptable. Se demuestra, además, que la formulación exhibe una buena estabilidad al almacenamiento. Se evaluaron las microparticulas que contienen leptina para bioactividad "in vivo" en ratas normales. Se administró una dosis total de leptina de 50 mg/kg (correspondiente a ~150 mg de micropartículas/kg) como una inyección sencilla al día 0. Además, se incluyen los siguientes grupos de control: bolo de leptina diario (5 mg/kg/día x 10 días) ; control de dosis vaciada (50 mg/kg al día 0); micropartículas de placebo administradas al día 9; y control de inyección de placebo diario. Los animales se pesaron diariamente, y se colectaron muestras de suero periódicamente para evaluar la concentración de leptina en el suero. Los niveles de leptina en el suero se muestran en la Figura 9. La concentración de leptina en el suero queda arriba de la línea base por aproximadamente 5 días. Se presenta la pérdida de peso en la Figura 10. Se determina el % de pérdida de peso corporal con relación a la solución amortiguadora de control por un periodo de 30 días. La inyección diaria de una solución de leptina resulta en una pérdida de peso de 4-6% con relación a los controles de placebo. Una inyección sencilla de micropartículas que contienen leptina resulta en una pérdida de peso del 9-10% con relación a las micropartículas de placebo, y resulta en una pérdida de peso sostenida en las ratas por un periodo de 25 días. Después del día 10, algunos animales se sacrificaron para un examen histológico del sitio de inyección. El examen histológico del sitio de inyección reveló un mínimo localizado para una reacción inflamatoria benigna, que fue completamente reversible con la biodegradacion de las micropartículas con el tiempo.

EJEMPLO 10. Este ejemplo describe un método para preparar micropartículas cargadas de proteína; específicamente, la preparación de microesferas de poli ( D, L-lacturo-co-glicoluro) que contienen NESP, usando secado por rociado para la etapa de preparación de las micropartículas. Se formó la NESP a 46% NESP, 29% de sales de fosfato de sodio, 25% de trehalosa (p/p/p) y se secó por rociado en un secador de rocío de escala de planta piloto (Niro Mobile Minor®) usando las siguientes condiciones: velocidad de alimentación 8.0 mi /minuto, gas de atomización 0.33 lbs/minuto (0.150 kg/min) (boquillas de dos fluidos), temperatura interna 200°C, temperatura externa 100°C, velocidad de flujo de gas de secado 2.0 lbs/minuto (0.908 kg/min). La proteína en polvo se colectó y se caracterizó como se describe en el Ejemplo 11 siguiente. La proteína en polvo se agregó a un PLGA (alto peso molecular, (viscosidad inherente 0.49 dL/g), lacturo al 50%) en solución de polímero de diclorometano/etanol (10% ?/?) , y la suspensión resultante se secó por rociado en un secador de rocío de escala de planta piloto (Niro Mobile Minor®) usando las siguientes condiciones: velocidad de alimentación 12 ml/minuto, atomización (boquilla ultrasónica) 1.3 vatios, temperatura del gas de entrada 55°C, temperatura de salida 28°C, velocidad de flujo del gas de secado 1.2 lbs/minuto (0.545 kg/min) . Las micropartículas resultantes que contienen NESP (0.53% NESP) se colectaron después y el secado secundario se realizó como se describe en el Ejemplo 4 para reducir las concentraciones de solvente residual hasta menos de 1000 rpm. Las micropartículas resultante se caracterizaron después del tamizado (tamaño de malla 125 µ??) . EJEMPLO 11. Este ejemplo describe varios experimentos de caracterización realizados en la proteína en polvo de NESP/trehalosa secada por rociado y las micropartículas que contienen NESP descritas en el Ejemplo 10. La proteína en polvo de NESP/trehalosa se caracteriza por cromatografía de exclusión de tamaño bajo condiciones nativas; el porcentaje de monómero fue de 99.8% posterior al secado (100% para un material no procesado) . No se observa agregado adicional por electroforesis en gel de poliacrilamida de dodeqil sodio (SDS-PAGE) , usando tinción de plata. La proteína en polvo se analizó por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (CLAR-FI); no se observa cambio de la NESP no procesado. La proteína en polvo también se caracteriza por un ensayo glicoforme CLAR y la electroforesis en gel enfocado isoeléctrico (IEF), no se observó cambio en la distribución glicoforme. La distribución del tamaño de partícula de la proteína en polvo se determinó por difracción Fraunhoffer para tener un tamaño medio de 2.5 µt? (distribución del volumen) . Las micropartículas que contienen NESP se determinan por difracción Fraunhoffer para tener un tamaño medio de 45 + 1 µp? (distribución del volumen) . Las concentraciones del solvente residual .de diclorometano y etanol, se determinan por cromatografía en gas de espacio superior para ser de 638 ppm y <100 ppm, respectivamente. La integridad posterior a la encapsulación de la NESP con estas micropartículas se evaluó extrayendo la proteína como se describe en el Ejemplo 2 y se analizaron los extractos por medio de intercambio de aniones y la CLAR de exclusión de tamaño bajo condiciones nativas. La proteína se cuantificó y se determinó la integridad por intercambio de aniones en serie con CLAR de exclusión de tamaño. La proteína recuperada se cuantificó (>99%) y la integridad de la proteína fue de 98.6 ± 0.3% monomérica por CLAR de exclusión de tamaño. No se observaron agregados adicionales por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sodio (SDS-PAGE) , usando tinción de plata. El extracto de proteína de micropartículas NESP se analizó por cromatografía líquida de alta resolución de fase inversa (CLAR-FI); no se observó cambio de la proteína en polvo NESP. El extracto de proteína de las microparticulas NESP también se caracterizó por un ensayo glicoforme CLAR y electroforesis en gel enfocado isoeléctrico (IEF) , no se observó cambio en la distribución glicoforme. EJEMPLO 12. Este ejemplo demuestra la capacidad de las microparticulas que contienen NESP preparadas en el Ejemplo 10 para proporcionar la liberación sostenida de NESP in vivo. Se trataron ratas macho Sprague Dawley como se describe en el Ejemplo 3 con microparticulas que contienen NESP fabricadas como se describe en el Ejemplo 10. Se realizaron los análisis de la concentración de NESP en el suero y de sangre entera durante 4-8 semanas como se describe en el Ejemplo 3. Los niveles de suero NESP de una inyección sencilla de microparticulas que contienen NESP fueron de > 1 ng/mL por 20 días (ver Figura 11) . La NESP sola, dada como un bolo sencillo, tiene niveles de suero elevados por 11 días (ver Figura 11). Las microparticulas que contienen NESP elevan el hematocrito arriba de la línea base por 34 días (ver Figura 12). El bolo NESP tiene hemetocritos elevados por 20 días (ver Figura 12) . EJEMPLO 13.

Este ejemplo demuestra la capacidad de las microparticulas que contienen NESP preparadas en el Ejemplo 10 para proporcionar una liberación sostenida del NESP in vivo. Se trataron ratas macho NIHRNU-M desnudas como se describe en el Ejemplo 3 con microparticulas que contienen NESP fabricada como se describe en el Ejemplo 10. Se realizaron ensayos de la concentración de NESP en el suero y de sangre entera durante 4-8 semanas como se describe en el Ejemplo 3. Los niveles de suero NESP de una inyección sencilla de microparticulas que contienen NESP fueron > 1 ng/mL por 21 días (ver Figuras 13) . La NESP sola, dada como un bolo sencillo, tiene niveles de suero elevado por menos de 11 días (ver Figura 13). Las microparticulas que contienen NESP elevan los hematocritos arriba de la linea base por 44 días (ver Figura 14). El bolo de NESP tiene hematocritos elevados por 18 días (ver Figura 14). MATERIALES Y METODOS. La presente NESP puede prepararse de conformidad con la Solicitud PCT No. US94/02957 incorporada para referencia . La presente proteina metionil-humana-OB recombinante (leptina) puede prepararse de conformidad con la publicación PCT incorporada para referencia, O 96/05309 en las páginas 151-159. Para los presentes ejemplos de trabajo, se usó una proteína OB humana que tiene (como se compara con la secuencia de aminoácido en la página 158) una lisina en la posición 35 en lugar de una arginina, y una isoleucina en la posición 74 en lugar de una isoleucina. Otras proteínas OB humanas recombinantes pueden prepararse de conformidad con métodos conocidos generalmente en el arte de la expresión de proteínas usando tecnología ADN recombinante . Aunque la presente invención se ha descrito en términos de ciertas modalidades preferidas, se entenderá que variaciones y modificaciones podrán ocurrir por aquellos con habilidad en el arte. Por lo tanto, se entenderá que las reivindicaciones adjuntas cubren todas las variaciones equivalentes que están dentro del alcance de la invención como se reivindica.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> AMGEN INC. <120> MICROPARTICULAS BIODEGRADABLES PARA LA ENTREGA SOSTENIDA DE LA PROTEINA NOVEDOSA ESTIMULANTE DE LA ERITROPOYETINA <130> A-626 <1 0> A SER ASIGNADA <141> 1999-10-22 <160> 2 <170> Pacentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 165 <212> PRT <213> HUMANO <400> 1 Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Ala Glu His 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 <210> 2 <211> 165 <212> PRT <213> HUMANO <400> 2 Ala Pro Pro Arg Leu lie Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu 1 5 10 15 Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn lie Thr Thr Gly Cys Asn Glu Thr 20 25 30 Cys Ser Leu Asn Glu Asn lie Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe 35 40 45 Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp 50 55 60 Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu 65 70 75 80 Leu Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu Gln Leu His Val Asp 85 90 95 Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu 100 105 110 Gly Ala Gln Lys Glu Ala lie Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala 115 120 125 Pro Leu Arg Thr lie Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val 130 135 140 Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala 145 150 155 160 Cys Arg Thr Gly Asp 165 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (12)

1. Reivindicaciones . Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones . 1. Una composición farmacéutica para la liberación sostenida de un ingrediente activo, caracterizada porque comprende un ingrediente biológicamente activo contenido dentro de micropartículas poliméricas, la composición preparada por un método que comprende: (a) obtener un polvo seco del ingrediente activo o formular el ingrediente activo; (b) preparar una solución de polímero que comprende un polímero disuelto en una mezcla co-solvente; (c) dispersar el polvo seco en la solución de polímero para producir una mezcla ingrediente acti o/polimero; (d) preparar las micropartículas que contienen el ingrediente activo de la mezcla; (e) colectar las micropartículas; y (f) terminar las micropartículas por secado secundario .
2. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ingrediente activo se selecciona del grupo que consiste de péptidos, moléculas pequeñas, carbohidratos, ácidos nucleicos, lípidos, proteínas, y análogos de los mismos.
3. 3. La composición de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada porque el ingrediente activo es una proteína.
4. 4. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la proteína es NESP o una forma químicamente modificada de la misma.
5. 5. La composición de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la NESP tiene una secuencia de aminoácidos como se describe en la SEQ ID NO: 2.
6. 6. La composición de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la proteína es leptina o una forma químicamente modificada de la misma.
7. 7. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el polímero se selecciona del grupo que consiste de poli (lacturos) , poli (glicoluros) , poli (ácidos lácticos), poli (ácidos glicólicos), polianhídridos, poliortoésteres, polieteresteres , policaprolactona, poliésteramidas, polifosfacenos, polifosfoésteres , ácidos pseudo-poliamino, mezclas' y copolimeros de los mismos.
8. 8. Un método para elaborar una composición farmacéutica de liberación sostenida, caracterizada porque comprende un ingrediente activo contenido dentro de micropartículas poliméricas, el método comprende: (a) obtener un polvo seco del ingrediente activo o formular el ingrediente activo; (b) preparar una solución de polímero que comprende un polímero disuelto en una mezcla co-solvente; (c) dispersar el polvo seco en la solución de polímero para producir una mezcla ingrediente activo/polímero ; (d) preparar las micropartículas que contienen el ingrediente activo de la mezcla; (e) colectar las micropartículas; y (f) terminar las micropartículas por secado secundario .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polímero se selecciona del grupo que consiste de poli ( lacturos ) , poli (glicoluros ) , poli (ácidos lácticos), poli (ácidos glicólicos), polianhídridos, poliortoésteres, polieteresteres , policaprolactona, poliésteramidas, polifosfacenos, polifosfoésteres, ácidos pseudo-poliamino, mezclas y copolímeros de los mismos.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la mezcla co-solvente comprende un polímero solvente y uno no solvente.
11. 11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el polímero solvente es cloruro de metileno y en donde el no solvente es etanol.
12. 12. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende NESP o NESP formulada contenida dentro de microesferas poliméricas biocompatibles, biodegradables, la composición proporciona una liberación de la NESP durante un periodo de al menos un mes después de la administración al paciente.