MXPA02002453A - Metodos y composiciones para reducir la respuesta inmune. - Google Patents

Abstract

La presente intencion provee un aparato y el metodo para disminuir la respuesta inmune pre-existente a la administracion de un virus terapeutico mediante la eliminacion selectiva de anticuerpos antivirales a partir del suero; la presente invencion provee un material cromatografico para la eliminacion de dichos anticuerpos; a la intencion ademas provee un aparato para aferesis del plasma que comprende este material; la invencion ademas provee metodos para el empleo de dicho aparato como parte de un regimen de tratamiento terapeutico.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA REDUCIR LA RESPUESTA INMUNE ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La utilidad terapéutica de virus de tipo silvestre o modificados recombinantemente es bien conocida en la técnica. Los reportes tempranos sobre el uso terapéutico de los virus datan desde 1950. Por ejemplo, en 1952, Southam y Moore reportaron el uso de virus de Vaccinia, enfermedad de Newcastle, West Nile, llheus y Bunyamwera, y Egypt 101 para el tratamiento de una variedad de cánceres. Cáncer 5: 1025-1034 (1952). En 1956, Newman y Moore resumieron los resultados del tratamiento de cincuenta y siete pacientes con cáncer con una variedad de virus. Cáncer J: 106-118. En 1956, Smith et al. reportaron sobre el uso terapéutico del adenovirus para el tratamiento de cáncer cervical. Cáncer 9:1211-1218. Southam presentó un resumen de la experiencia clínica obtenida en el instituto Sloan-Kettering sobre la eficiencia de los virus como agentes anti-neoplásicos en 1960. Transactions of the New York Academy of Sciences 22: 657-673. Los reportes más recientes demuestran un interés continuo del uso terapéutico de los virus. Taylor, et al. presentaron resultados que sugerían el uso terapéutico de enterovirus-1 de bovino para el tratamiento de tumores sólidos y ascitos basándose en experimentos conducidos en ratones. PNAS (USA) 68:836-840 (1971). Ensayos clínicos adicionales en humanos continuaron demostrándose feifci&AArffelf***- ' *»*** - ^como promisorios en este campo como se ¡lustra por el uso de los virus Mumps para tratar una variedad de cánceres. Asada, T. (1974) Cáncer 34: 1907-1928. El entendimiento incrementado en el genoma viral y la llegada de técnicas de ADN recombinante permitieron la manipulación de virus que poseen características deseables particulares. Por ejemplo, un adenovirus recombinante que contiene una modificación en la región E1 B-55K es habitual en los ensayos clínicos de Fase II en los seres humanos. Adicionalmente, los vectores vírales recombinantes se han empleado para la administración de una variedad de sustancias terapéuticas. Más notablemente, los vectores adenovirales recombinantes se han empleado en terapias anti-cáncer en donde el genoma viral se ha modificado para que codifiquen un gen supresor del tumor. En particular, los virus deficiente en replicación expresa el gen p53 supresor del tumor ha completado exitosamente la Fase 1 y es habitual en el desarrollo de la Fase clínica ll/lll. Sin embargo, la experiencia clínica con dichos vectores ha demostrado que una fracción significativa del virus terapéutico que se administra a un paciente se capacita por la presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero y el sistema endotelial reticular (RES). Este obstáculo es particularmente grave cuando un adenovirus se utiliza como el vehículo para administrar transgén puesto que una porción significativa de la población humana ha sido expuesta naturalmente a vectores adenovirales y posee inmunidad pre-existente. Consecuentemente, la administración de un exceso significativo de vector adenoviral recombinante se administra al paciente para "dosificar" la respuesta pre-existente. Adicionalmente, incluso si la respuesta inmune pre-existente no está presente, después de la administración virus terapéutico el mamífero generalmente producirá una respuesta inmune al virus. Esta respuesta inmune antiviral "inducida" complica el transcurso adicional de la terapia con el virus terapéutico de manera similar a la respuesta inmune pre-existente inducida por la exposición al virus en el ambiente. Esto no se desea para un punto de partida clínico puesto que presenta complicaciones al paciente ya enfermo. Además, desde un punto de vista comercial una gran cantidad de material se desperdicia en un intento de dosificar la respuesta inmune pre-existente. Consecuentemente, ayuda necesidad en la técnica para reducir la respuesta inmune pre-existente a vectores virales terapéuticos. Una variedad de métodos se han empleado para intentar hacer frente a este problema. En un método, el virus se reviste con agentes enmascaradores tales como polietilenglicol (denominada "polietilenglicosilación") para revestir los virus y enmascarar los determinantes inmunológicos de los virus. Este es un procedimiento molesto que requiere que el virus se revista con un agente y la estabilidad a largo plazo del virus polietilenglicosilado aún tiene que demostrar se como comercialmente posible. Otras sendas ¡ncluyen la co-administración de agentes inmunosupresores. Sin embargo, la administración de un amplio espectro de agentes inmunosupresores no se desea. En particular, hay una evidencia importante ?*m .?.&¿áí&ki?..M^:& ?á ¿sLtíst^*t^?«t que sugiere que un complemento significativo de la terapia anti-cáncer es que la respuesta inmune aumente la actividad anti-tumor del virus terapéutico. Este fenómeno se ha observado por algún tiempo y muchos individuos han sugerido que la amplificación de la respuesta inmune para los antígenos tumorales puede ser de beneficio terapéutico. Consecuentemente, generalmente no es deseable suprimir ampliamente el sistema inmune en un paciente con cáncer. Consecuentemente permanece una necesidad en la técnica para reducir la respuesta inmune humoral pre-existente a un vector viral terapéutico. La presente invención se dirige a esta necesidad.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee composiciones, dispositivos y métodos para remover anticuerpos antivirales a partir de la sangre de mamíferos. Las composiciones y métodos de la presente invención pueden ser practicadas en conjunto con la administración de un virus terapéutico. La invención además provee un material de inmunoafinidad que comprende un material cromatográfico de soporte derivado con determinantes antigénicos de la cubierta viral. La invención además provee un aparato de aféresis mejorado para remover anticuerpos antivirales a partir de la sangre y, en particular a partir del plasma. La presente invención además provee métodos terapéuticos que implican el uso de dichos aparatos. l?ÉS?í BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es un histograma que representa valores ID50 de anticuerpos neutralizantes anti-adenovirales después de la administración subcutánea del adenovirus. La primera columna (negro sólido) representa el título de anticuerpos observados a los 7-10 días después de una única inyección de adenovirus. La segunda columna (blanco) representa el título de anticuerpos observados a los 14 días después de una única inyección de adenovirus. La tercera columna (gris) representa el título de anticuerpos a los 70 días después de dos inyecciones subcutáneas de adenovirus recombinantes. El panel A representa el título de anticuerpos del suero no purificado. El panel B representa el título de anticuerpos de suero purificado sobre una columna que contenía epítopes de cápside adenoviral. El panel C representa un control PBSv. Como se puede observar a partir de los datos presentados, el título de anticuerpos es significativamente mayor después de la re-dosificación (inyecciones, 70 días). La figura 2 es una representación gráfica de los datos que demuestra que la remoción de anticuerpos anti-adenovirales resulta en un incremento de la eficiencia de la traducción del adenovirus in vitro. El eje vertical es una medida de la eficiencia de la transducción con rAd/GFP en relación con las células HeLa control no traducidas. Los círculos sólidos representan suero a partir de animales rAd cebados. Los triángulos muestran la eficiencia de la transducción de los virus mezclados con suero a partir de animales infectados con PBSv. Los círculos abiertos implican suero a partir de animales rAd cebados a los que se eliminaron los anticuerpos anti-Ad y los cuadrados muestran la eficiencia de la transducción de virus mezclados con anticuerpos anti-Ad, los cuales se diluyeron una partir de la columna utilizada para agotar los anticuerpos anti-Ad a partir de los animales rAd cebados. La figura 3 es una gráfica de líneas que muestran que el procedimiento de inmunización pasiva no resulta en anticuerpos neutralizantes en suero en el animal hospedero recipiente. El eje vertical representa el título de anticuerpos. El eje horizontal representa el tiempo (horas) después de la inmunización pasiva. Como se puede observar a partir de los datos presentados, la presencia de anticuerpos neutralizantes en suero se observó en las siguientes tres horas después de la inmunización pasiva y permanece estable durante un período de tiempo de al menos 72 horas. Nótese que el material inyectado (0.5 ml) se diluye esencialmente al volumen sanguíneo normal del ratón y entonces permanece estable por al menos 72 horas. La figura 4, es una representación gráfica de la capacidad del anticuerpo neutralizante en suero (ID-50) después de la inmunización pasiva y de la dosificación subsecuente con un adenovirus que expresa ß-galactosidasa (BGCG). El eje vertical representa el título de anticuerpos y el eje horizontal representa el tiempo en horas después de la administración del virus. Cada panel representa el material que se utilizó para la inmunización pasiva (es decir, control PBSv, suero sin anticuerpo Ad, suero sin Ad-Ab: Ad- Ab). Las barras en negro muestran el título de neutralización una hora después de la inmunización pasiva. Las barras en gris muestran el título de anticuerpos neutralizantes dos horas después de la dosificación del virus después de la inmunización pasiva. Las columnas cuadriculadas muestran el título de anticuerpos neutralizantes tres días después de la dosificación del virus después de inmunización pasiva. Las barras en blanco reflejan el título de anticuerpos neutralizantes de los materiales utilizados para inmunización pasiva. Los datos muestran que una respuesta de anticuerpos por el hospedero se realiza dentro de los primeros tres días. Además, los datos muestran que la inyección de rAd mediante la ruta intravenosa depleta adicionalmente los anticuerpos neutralizantes a partir del suero dentro de las siguientes 2 horas. Los datos también sugieren que casi todo el anticuerpo de alta afinidad en las proteínas principales de cubierta se depletan después de inyección de rAd mediante la ruta intravenosa, eluído a partir de la columna. (Véase los datos con respecto al anticuerpo Ad a 40 µl). La figura 5 son fotografías de secciones transversales del hígado teñidas con x-gal de ratones BALB/c después de la administración de 1 x 1010 PN de BGCG. Como se puede observar con el control PBSv (A), hay una tinción sustancial del hígado debido a la ausencia de respuesta inmune preexistente en los ratones. El panel B representa la tinción del hígado con x- gal de aquellos animales que recibieron inmunización pasiva de suero depletado de anticuerpos al pasar sobre una columna de proteína de la cápside Ad. El panel C representa la tinción con ß-galactosidasa de ratones que recibieron la inmunización pasiva de suero PRIMED de Ad no purificado. Como se puede observar a partir de los datos presentados, un incremento sustancial en la expresión de ß-galactosidasa (indicando una eficiencia incrementada de la transducción) se observó en aquellos animales que recibieron inmunización pasiva de suero purificado (B) en relación a aquellos que recibieron suero no purificado (C). La figura 6 es una representación gráfica de los resultados de los experimentos realizados para comparar la eficiencia de diferentes columnas para remover anticuerpos adenovirales neutralizantes obtenidos a partir del exposición de suero humano agrupado que exhibe un alto título de antí- adenovirus neutralizante (ID50>1280). El eje vertical es el porcentaje de transducción el cual está inversamente correlacionado con el porcentaje de capacidad neutralizante. El eje horizontal representa el título de antisuero neutralizante. Los cuadrados llenos representan suero cebado; los círculos sombreados representan suero depletado en una columna de proteína A Prosorba(R); los debate representa suero depletado en una columna SAVID de cápside adenoviral; los triángulos llenos representan anticuerpos unidos eluídos a partir de una columna Prosorba(R); los círculos abiertos representan células HeLa transducidas con un adenovirus recombinante que codifica la proteína fluorescente verde (rAd-GFP) en la ausencia del antisuero; los cuadrados abiertos representan anticuerpos eluídos a partir de una columna SAVID de cápside; y los ángulos abiertos representan células HeLa como un control de fondo (sin virus, ni anticuerpos).

La figura 7 es una representación gráfica de los resultados de los experimentos realizados para comparar la eficiencia de diferentes columnas para remover anticuerpos adenovirales neutralizantes obtenidos a partir de la exposición de suero de humano agrupado que exhibe un título bajo de anti- adenoviral neutralizante (ID50<320). El eje vertical es el porcentaje de transducción el cual está correlacionado de manera inversa con el porcentaje de capacidad de neutralización. El eje horizontal representa el título de antisuero neutralizante. Los cuadrados sombreados representan el suero cebado; los círculos sombreados representan el suero depletado sobre una columna de proteína A Prosorba(R); los diamantes sombreados representan suero depletado sobre una columna SAVID de cápside adenoviral; los triángulos sombreados representan anticuerpos unidos eluídos partir de una columna Prosorba(R); los círculos abiertos representan células HeLa transducidas con rAd-GFP en la ausencia de antisuero; los cuadrados abiertos representan anticuerpos unidos eluídos a partir de la columna SAVID de cápside adenoviral; y los triángulos abiertos representan células HeLa como un control de fondo (sin virus rAd-GFP, ni anticuerpos). La figura 8 es una representación gráfica de los resultados de los experimentos realizados para comparar la eficiencia de una columna de proteína G con relación a la columna SAVID de cápside para la remoción de anticuerpos adenovirales neutralizantes obtenidos a partir del exposición del suero de humano agrupado que exhibe un título alto de anti-adenoviral neutralizante (ID50>1280) o un título bajo de anticuerpo neutralizante (ID50<320). El eje vertical es el porcentaje de transducción. El eje horizontal representa el título neutralizante. Los cuadrados sombreados representan anticuerpos eluídos a partir de una columna SAVID de cápside adenovirales utilizando un antisuero con título alto; los círculos sombreados representan anticuerpos eluídos a partir de una columna SAVID de cápside adenovirales utilizando un antisuero con título bajo; los triángulos sombreados representan anticuerpos eluídos a partir de una columna G utilizando un antisuero con título alto; los diamantes sombreados representan anticuerpos eluídos a partir de una columna G utilizando un antisuero con título bajo; los círculos abiertos representan células HeLa transducidas con un rAd-GFP en la ausencia de anti-suero; los cuadrados abiertos representan células HeLa transducidas con un rAd-GFP en la presencia de anti-suero y los triángulos abiertos representan células HeLa control con suero normal; y los diamantes abiertos representan células HeLa control de fondo sin suero. La figura 9 es una representación esquemática de una orientación del aparato utilizado en la práctica de la presente invención. Las flechas representa la dirección de flujo de los materiales sanguíneos a través del aparato. El artículo 1 representa un aparato para aféresis de plasma. El artículo 2 representa un material cromatográfico de inmunoafinidad en el formato de columna. El artículo tres representa una válvula de 3 sentidos. El artículo 4 representa una vasija de almacenamiento para plasma purificado. El artículo 5 representa un aparato de flitro para remover microagregados a partir del plasma purificado antes de su reintroducción. El artículo 6 representa una cámara de DRIP.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención provee un método para reducir la concentración de anticuerpos antivirales en una muestra de plasma al poner en contacto dicho plasma aislado con un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende un material de inmunoafinidad acoplado a un soporte cromatográfico de tal manera que los anticuerpos retienen sobre el material de inmunoafinidad. La invención además provee un método para reducir la concertación de anticuerpos antivirales en un organismo mamífero, dicho método comprendiendo los pasos de: a) obtener una muestra de sangre a partir de dicho organismo mamífero; b) aislar el plasma a partir de los componentes celulares a partir de dicha muestra de sangre; c) poner en contacto dicho plasma aislado con un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende un material de inmunoafinidad acoplado a un soporte cromatográfico de tal manera que los anticuerpos se retienen sobre el material de inmunoafinidad; d) reintroducir los componentes celulares aislados a partir del paso (b) y el plasma purificado a partir del paso (c) al mamífero. Se entenderá fácilmente por los expertos en la técnica que el procedimiento del paso (d), es decir, la reintroducción de los componentes celulares y el plasma purificado, puede ocurrir simultáneamente o separarse por algún período de tiempo. Sin embargo, se prefiere que estos procedimiento se lleven a cabo contemporáneamente. La invención además provee un método mejorado para tratar un mamífero con un virus terapéutico en donde la mejoría comprende reducir la concentración de anticuerpos antivirales en dicho mamífero antes de la administración de dicho virus terapéutico mediante: a) obtener una muestra de sangre a partir de dicho organismo mamífero; b) aislar el plasma a partir de los componentes celulares a partir de dicha muestra de sangre; c) poner en contacto dicho plasma aislado con un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende un material de inmunoafinidad acoplado a un soporte cromatográfico de tal manera que los anticuerpos se retienen sobre el material de inmunoafinidad; d) reintroducir los componentes celulares aislados a partir del paso (b) y el plasma purificado a partir del paso (c) al mamífero. La invención además provee materiales cromatográficos de inmunoafinidad que comprenden componentes de la cubierta viral.

? J y La invención además provee un aparato útil en la práctica de la presente invención. La invención además provee una mejoría a un método de tratar a un mamífero con un virus terapéutico en donde el procedimiento precedente 5 se lleva a cabo antes de la administración de un virus terapéutico.

Anticuerpos antivirales: El término anticuerpos antivirales se utiliza para describir anticuerpos que se unen a virus. Estos anticuerpos generalmente se producen 10 por el sistema inmune humoral del mamífero mediante la exposición del mamífero a un virus, ya sea en el medioambiente o terapéuticamente (por ejemplo, vacunación o administración de un virus terapéutico). Los anticuerpos antivirales comprenden tanto anticuerpos neutralizantes como no- neutralizantes. El término anticuerpos neutralizantes se utiliza en su sentido 15 convencional para referirse a anticuerpos que previenen la proliferación de virus infecciosos. Cuando el método se utiliza en conjunción con administración de un virus terapéutico, la remoción de anticuerpos antivirales neutralizantes es de gran importancia puesto que tanto la remoción de anticuerpos no-neutralizantes como de anticuerpos neutralizantes son 20 principalmente responsables para la inactivación del virus terapéutico a ser administrado.

Sangre: El término "sangre" se utiliza en su sentido convencional para referirse a la sangre de un mamífero. Una muestra de sangre puede obtenerse a partir un mamífero vivo mediante procedimientos convencionales de toma de sangre a tales como venopunción o técnicas de punción arterial. Los riesgos más bajos y facilidad de acceso asociados con los procedimientos de toma venosa hacen a la sangre venosa la fuente preferida de sangre para uso en el presente procedimiento. La sangre venosa puede colectarse mediante jeringa o vasos de recolección al vacío tales como el sistema de recolección de sangre marca Vacutainer (R) (comercialmente disponible a partir de Becton-Dickinson Corporation, Franklin Lakes, NJ) para tratamiento en lote de conformidad con el método de la presente invención. Sin embargo, las cantidades de sangre generalmente tratadas para proveer disminución de la respuesta de anticuerpos antivirales en un mamífero vivo, en la práctica preferida de la invención la sangre se colecta en un procedimiento continuo para la introducción a un aparato de aféresis de plasma mediante catéter venoso. El extremo proximal de un catéter se inserta dentro de la vena del mamífero utilizando técnicas de venopunción convencionales y el extremo distal del catéter se conecta al puerto de entrada de un aparato de aféresis de plasma. Un aparato de aféresis de plasma generalmente comprende un mecanismo de bomba para dirigir la sangre aislada a través de modos para aislar el plasma a partir de los componentes sanguíneos celulares, en donde ItA -i. Jb?.±imi.*., la sangre rica en células se regresa al mamífero mientras que el plasma se dirige para almacenamiento o para procesamiento adicional. El intervalo de mamíferos que se someten a terapia de virus terapéutico varía y ciertas fuentes se prefieren para el aislamiento de sangre venosa. En el ganado o en ovejas, la cateterización de la yugular se prefiere. En los conejos, la arteria media de la oreja, vena de la oreja, o arteria carotídea se prefieren. En cerdos, la vena de la oreja se prefiere. En primates no-humanos, las venas safena, cefálica, y femoral son fuentes preferidas de sangre venosa. En los gatos, las venas cefálica, femoral, yugular y safena se prefieren. En los perros, las venas cefálica, yugular, y safena se prefieren. En los seres humanos, las venas cefálica y safena son fuentes preferidas de sangre venosa, las cefálica siendo la más preferida.

Aislamiento de plasma: aféresis de plasma La sangre es una mezcla completa de componentes celulares y solubilizados en fluido. La porción de fluido de la sangre (plasma) comprende una variedad de nutrientes disueltos, productos de desecho y proteínas solubilizadas tales como anticuerpos. El término "aféresis de plasma" se refiere a un procedimiento de aféresis en donde sangre se remueve a partir de un mamífero y se separa a en plasma y componentes celulares sanguíneos, el plasma siendo aislado para procesamiento adicional. Los principios y práctica de la aféresis son bien conocidos en la técnica. Los procedimientos estándares para la aféresis se describen en Apheresis: Principies and Practice comercialmente disponible a partir de la American Association of Blood Bancks, 8101 Glenbrook Road, Bethesda, MD 20814-2749 como almacenamiento #PC98-972003. La aféresis de plasma se lleva a cabo de manera habitual en la arena clínica utilizando separadores mediante centrifugación de flujo continuo, los cuales separan células por densidad; los dispositivos con membrana de fibra con láminas planas y orificios intra-luminales, que operan mediante microfiltración por flujo tangencial; y dispositivos con membranas de rotación, los cuales mejoran el flujo de microfiltración al inducir el vórtice Taylor. Dichas dispositivos están comercialmente disponibles y se conocen bien en la literatura, véase, por ejemplo, Plasmapheresis: Therapeutic Applications and New Techniques, Nose Y, et al., Raven Press, New York (1983); Kessler, S. B., Blood Purif., 11 : 150-157 (1993); véase también, Fischel, patente de Estados Unidos 5,783,085 expedida el 21 de julio de 1998; Kessler, et al., patente de Estados Unidos 5,846,427 expedida el 8 de diciembre de 1998; Ash, patente de Estados Unidos 5,919,369 expedida el 6 de julio de 1999; Ball, et al., patente de Estados Unidos 5,914,042 expedida el 22 de junio de 1999; Fischel, patente de Estados Unidos 5,464,534 expedida el 7 de noviembre de 1995; Bensinger, patente de Estados Unidos 4,614,513 expedida el 30 de septiembre de 1986; Terman, et al., patente de Estados Unidos 4,215,688 expedida el 5 de agosto de 1980; y Pollard, patente de Estados Unidos 4,464,165 expedida el 7 de agosto de 1984; las enseñanzas de las cuales se incorporan en la presente como referencias.

Material inmunoadsorbente/de inmunoafinidad: Los términos "material de ¡nmunoafinidad" o "material inmunoadsorbente" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a material que se une a anticuerpos. Una variedad de materiales inmunoadsorbentes se conocen bien en la técnica tales como proteína A de Staphylococcus aureus, proteína recombinante A y G, KappaLock TM (Zymed). El uso generalizado de materiales inmunoadsorbentes (tales como proteína A) o proteína G resulta en la eliminación general de anticuerpos circulantes y no es necesariamente específica con relación al virus potencialmente terapéutico antigénico a ser administrado. La proteína A se une preferiblemente a los anticuerpos clase IgG (y en cierto grado a anticuerpos IgA e IgM) y no es selectiva para ningún tipo de anticuerpo particular. Aunque estos materiales inmunoadsorbentes generales no son necesariamente específicos a un tipo particular de anticuerpo, estos son sin duda materiales inmunoadsorbente útiles que pueden emplearse en la práctica de la presente invención como se muestra en los datos presentados en las figuras 6, 7, y 8 de los dibujos anexos. En la práctica preferida de la invención de material inmunoadsorbente se prepara con respecto al virus terapéutico particular a ser empleado con el objeto de lograr eliminación selectiva de anticuerpos antivirales específicos para ese virus mediante la unión de un epítope o epítopes virales al soporte cromatográfico. Como previamente se discutió, la eliminación general de los anticuerpos de suero tiene el potencial para eliminar cualesquiera anticuerpos anti-tumorales circulantes los cuales son un aditamento potencialmente importante para el éxito de la quimioterapia y potencialmente deja a uno más susceptible a las infecciones oportunistas. Consecuentemente, se prefiere la remoción selectiva de los anticuerpos al virus terapéutico particular a ser empleado. En particular, la presente invención provee un material cromatográfico selectivo para depresión inmunoantiviral ("SAVID") que comprende un epítope viral conjugado a un soporte cromatográfico. El acrónimo SAVID se emplea de primera mano para depleción selectiva inmunoantiviral. Selectiva, enfatizando la naturaleza del procedimiento en donde los anticuerpos en contra del virus terapéutico a ser utilizado se eliminan selectivamente a partir del plasma. Antivíral, enfatizando que los métodos y dispositivos se diseñan para eliminar la respuesta inmune pre-existente o inducida a los virus terapéuticos. Inmuno-depleción, enfatizando la característica de la invención puesto que la respuesta inmune, particularmente al nivel de anticuerpos antivírales plasmáticos, se reduce transitoriamente. A través del uso de un epítope viral como en material inmunoadsorbente, la reducción selectiva de anticuerpos antivirales a partir del plasma se logra, a los anticuerpos antivirales presentes en el flujo sanguíneo se retienen sobre el material cromatográfico SAVID. Como resultado este procedimiento, la respuesta inmune humoral pre-existente o inducida a un tipo(s) particular de vector(es) viral terapéutico disminuye selectivamente resultado en eficiencia incrementada de la transducción a partir de una dosis dada del vector viral. Concomitantemente, esto permite una dosis viral más baja para lograr una respuesta terapéutica equivalente en la ausencia de este procedimiento. El término "epítope" se utiliza en la presente en su sentido convencional para referirse a la estructura de un antígeno que ¡nteractúa con el sitio de combinación de un anticuerpo o receptor de célula T como un resultado de la complementariedad molecular. El término "epítope viral" se utiliza para referirse a epítopes de proteínas de superficie viral. Los epítopes pueden ser miméticos que ocurren de manera natural o sintéticos. El epítope empleado puede representar la proteína de cubierta viral completa o una fracción del determinante antigénico de la misma. Por ejemplo, con el objeto de presentar el epítope viral, una proteína de cubierta viral puede conjugarse a la columna. Alternativamente, un fragmento de la proteína de cubierta viral puede emplearse la cual retenga el sitio de unión principal del anticuerpo. El epítope también puede ser un péptido sintético o proteína y se utiliza para referirse colectivamente a los péptidos que ocurren de manera natural o sintéticos los cuales comprenden los determinantes antigénicos de las proteínas de superficie viral. La determinación de esas regiones de una proteína más responsable para la unión del anticuerpo pueden determinarse mediante procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, la metodología DIRECT TM, instrumentación y procedimientos comercializados por Argonex, Inc., 2044 India Road, Charlottesville VA 22901 provee medios para identificar a los péptidos individuales que estimulan una respuesta CTL. Estos péptidos pueden modelarse utilizado software de modelamiento molecular convencional para generar epítopes miméticos de molécula pequeña tipo no peptidil. Estos péptidos individuales o mimético de molécula pequeña que representan un epítope particular de una proteína pueden conjugarse con un soporte cromatográfico en lugar de utilizar la proteína completa de superficie viral. En la modalidad preferida como se ejemplifica en la presente, las porciones antigénicas de la superficie viral comprenden las proteínas de la cubierta viral del adenovirus. Estos puede obtenerse fácilmente como subproductos de la producción de virus recombinante o producirse mediante técnicas de ADN recombinante para la producción de proteínas en conocidas por los expertos en la técnica. Los métodos para la producción de títulos altos de virus se provee en Giroux, et al., patente de Estados Unidos 5,994,134 expedida el 30 de noviembre de 1999, la enseñanza completa de la cual se incorpora en la presente como referencia. Por ejemplo, la preparación de un adenovirus recombinante se sometió a cromatografía en columna como se describe en Shabram, et al. (patente de Estados Unidos No. 5,837,520 expedida el 17 de noviembre de 1998, la enseñanza completa de la cual se incorpora en la presente como referencia). El eluído de la cromatografía provee el adenovirus purificado con una variedad de contaminantes que comprende proteínas de cubierta viral tales como penton, hexon, 3A, proteínas de fibra de los adenovirus. Estos "contaminantes" adicionales que representan epítopes útiles pueden purificarse hasta homogeneidad a partir del eluído de la columna mediante procedimientos cromatográficos convencionales. Las identidades de estas proteínas pueden confirmarse fácilmente mediante el uso de anticuerpos comercialmente disponibles específicos en contra de la cápside adenoviral. Dichos anticuerpos están comercialmente disponibles a partir de una variedad de fuentes Chemicon y Lee BioMolecular. Alternativamente, los anticuerpos monoclonales a dichas proteínas pueden generarse mediante técnicas en conocidas por los expertos en la técnica.

Unida El término "unida" se utilizan la presente para describir una asociación cinéticamente estable y se utiliza de manera intercambiable con los términos conjugada o entrecruzada. Una interacción estable entre el material inmunoadsorbente y soporte cromatográfico puede lograrse mediante uniones iónicas, por afinidad, entrecruzadas covalentemente, covalentes coordinadas cinéticamente lábiles (Smith, et al. patente de Estados Unidos No. 4, 569, 794), o uniones covalentes coordinadas cinéticamente inertes como se describe en Anderson, et al. (patente de Estados Unidos No. 5, 439, 829 expedida el 8 de agosto de 1995). En una modalidad de la invención como se ejemplifica en la presente, los epítopes virales se adsorben sobre la superficie de un gel de afinidad (Affi-Gel (R)). El producto Affi-Gel (R) está disponible en dos versiones diferentes:Affi-Gel (R) 10 (catálogo BioRad No. 153, 6046) y Affi-Gel (R) 15 (catálogo BioRad No. # 153-6052). El uso adecuado de cualquier producto (o una mezcla de los dos) se determina por el pl del epítope a ser acoplado. La columna Affi-Gel se acopla a los grupos alquilo o amino libres. Un amortiguador comúnmente empleado, Tris, se acoplará a la columna efectivamente. Consecuentemente, es importante cuando se utiliza dichas columnas el evitar el uso de amortiguadores Tris. Alternativamente al uso de Tris, la lisis celular, lavado, carga/lavado en columna y elución se llevan a cabo utilizando los amortiguadores hechos con MOPS o HEPES más que con Tris. Las instrucciones detalladas para llevar a cabo el acoplamiento de la proteína en MOPS 0.1 M a la matriz están disponibles a partir del fabricante. Aproximadamente 0.5 ml (volumen empaquetado) de matriz se une aproximadamente a 20 mg de proteína. El acoplamiento se logra al mezclar y dejar que la reacción proceda por aproximadamente 4 horas a 4°C. La eficiencia del acoplamiento se determina al comparar la concentración de proteína libre antes y después de la reacción de acoplamiento. Después de la reacción de acoplamiento, se prefiere bloquear cualquier éster que no ha reaccionado. Esto puede lograrse fácilmente al remover el exceso de proteína y al añadir etanolamina 1 M pH 8.0, con mezclado a 4°C por una hora. El exceso de etanolamina se enjuaga a partir de la columna con TBS. La columna puede almacenarse por períodos largos a 4°C en TBS más azida de sodio al 0.2%. Alternativamente a la unión a través de los grupos amino libres, uno puede también unir el epítope a la matriz de la columna mediante residuos de cisteína libres. Por ejemplo, un residuo de cisteína puede proveer un enlace estable tio-éter a Epoxy-Sepharose(R)-6B (comercialmente disponible a partir de Pharmacia). Esto puede emplearse para unir el C- terminal del epítope mediante la adición de un residuo de cisteína C-terminal. La reacción de acoplamiento puede lograrse mediante la adición del epítope a 1.0 ml de Epoxy-Sepharose-6B (R) en NaHCO3 0.1 M pH 9.0 en un pequeño volumen de reacción con mezcla lo constante 37°C por 24 horas. Lavado con 50 ml de NaHCO3 0.1 M pH 9.0, luego bloqueo de los grupos que no ha reaccionado en la matriz al incubar 1.0 ml de resina en 5.0 ml de mercaptoetanol 0.1 M con agitación suave.

Soporte cromatoqráfico: El término "soporte cromatográfico" se utiliza en su definición comúnmente aceptada como elemento básico de una matriz de cromatografía de afinidad. Los principios de la cromatografía de inmunoafinidad se conocen bien en la técnica. Véase, por ejemplo, Mohr, et al. (1992) Immunosorption Techniques: Fundamentáis and Applications, ISBN# 3055013506. Los soportes cromatográficos más comunes incluyen polímeros naturales o sintéticos en la forma de una membrana, glóbulo (micropartícula), resinas, o tubo. Los materiales comunes incluyen agarosa (un polímero de D-galactosa y 3,6-anhidro-L-galactosa), poliestireno, polietileno, etc. y son bien conocidos por los expertos en la técnica. En la práctica preferida de la invención, el soporte cromatográfico es un gel de agarosa entrecruzada activada tal como los soportes Affi-Gel (R) 10 o Affi-Gel (R) 15 comercialmente disponibles a partir de Bio-Rad.

Contacto: El suero aislado se ponen contacto con el material cromatográfico de inmunoafinidad en una variedad de contextos. El material cromatográfico de inmunoafinidad puede utilizarse en preparaciones de lote en donde la sangre se expone a una cantidad del material, pero generalmente estará en la forma de una columna para uso con un aparato convencional de aféresis de plasma. La columna puede ya sea ser una columna empaquetada de glóbulos que comprende una fase estacionaria en una forma granular interpretada de manera que forme un glóbulo homogéneo en donde la fase estacionaria llena completamente la columna. Alternativamente, las columnas tubulares abiertas pueden emplearse en donde la fase estacionaria que comprende el epítope viral se deposita como una película delgada una capa sobre la pared de la columna y posee un paso central para permitir el paso de la fase móvil. En dichos casos, una pluralidad de materiales tubulares de diámetro pequeño se emplean para maximizar la exposición de los epítopes virales a la fase móvil. Alternativamente, el material cromatográfico de inmunoafinidad puede estar en forma líquida pero poseyendo una mayor o menor densidad que los productos sanguíneos de tal manera que los productos sanguíneos pueden exponerse al material cromatográf icos y separarse fácilmente. Por ejemplo, las proteínas de la cápside pueden unirse a un material denso conjugado con un polímero líquido cuya densidad puede ser, por ejemplo, 1.35. Los materiales pueden mezclarse en forma de lote con el producto sanguíneo aislado. Los componentes sanguíneos unidos al material pueden entonces separarse por centrifugación. Alternativamente, el material cromatográfico de inmunoafinidad capaz de realizar separación de fase puede mezclarse con la sangre y separarse en un dispositivo de cromatografía 5 centrífuga de partición. Los dispositivos de cromatografía centrífuga concurrentes y los procedimientos se conocen en la técnica. Ya sea el material cromatográfico de inmunoafínidad o la sangre o el plasma pueden emplearse como la fase móvil en dichos procedimientos. Los anticuerpos retenidos sobre el soporte cromatográfico de 10 inmunoafinidad pueden recuperarse para regenerar la columna para uso repetido. Sin embargo, el material cromatográficos de inmunoafinidad preferiblemente se hace a partir de materiales de desecho y se desecha después del uso para asegurarse que el material aislado a partir de un paciente y retenido sobre la columna mediante procedimientos de lavado no 15 efectivos no se extraen a partir de la columna e introducido dentro del torrente sanguíneo de un segundo paciente. Será fácilmente aparente a los expertos en la técnica que el plasma producido después de pasar por el material inmunoadsorbente puede almacenarse para uso posterior. Sin embargo, en la práctica preferida de la 20 invención, el plasma purificado se reintroduce dentro del sistema circulatorio del sujeto contemporáneamente con el procedimiento de purificación. El término "contemporáneamente" generalmente significa menos de aproximadamente tres horas, preferiblemente menos de una hora. En la ;Sg¡>'"J?.r~. práctica más preferida de la invención, para evitar las complicaciones asociadas con la pérdida en volumen sanguíneo en los mamíferos vivos, el procedimiento precedente se corre de manera continua utilizando un aparato tal como el aparato esquemáticamente representado en la figura 9 de los dibujos anexos. Con el objeto de demostrar que el presente método es útil en la reducción de anticuerpos antivirales neutralizantes en suero, el suero de ratones expuestos a adenovirus de humano se sometió purificación sobre una columna de Proteína A y una columna de sepharose KappaLock TM (comercialmente disponible a partir de Zymed Laboratories, Inc., Sur de San Francisco, CA como número de catálogo 10-1841 ) el cual retiene principalmente inmunoglobulinas de la clase IgG, IgM, e IgA y se ensaya para anticuerpos anti-Ad neutralizantes. En particular, la sangre de ratones que poseen anticuerpos pre-existentes y anti-adenovirales se aisla, el suero se separa y se expone a la resina cromatográfica de Proteína A. Los niveles de anticuerpos neutralizantes anti-adenovirales del suero antes y después de procedimiento se determina en conformidad substancial con las enseñanzas del ejemplo 3 en la presente. Además, el anticuerpos neutralizantes puede depletarse efectivamente in vitro con una columna que consiste de proteínas rAd unidas a una columna de afinidad de glóbulos rAd. En este experimento, el suero purificado sobre una columna de Proteína A o columna de sepharose KappaLock TM muestra una reducción en el título de anticuerpos neutralizantes del suero. Í¿'? .,?,. í,. :i J»-, ^ . - ^ ,.¿-. .á A¿& 1 , ¿ La utilidad del material inmunoadsorbente SAVID se ve más tradicionalmente en un modelo de inmunización pasiva de ratón ¡n vivo. Puesto que los procedimientos de aféresis de plasma convencionales no son practicables en los ratones y los ratones no poseen de manera innata anticuerpos adenovirales anti-humano, el procedimiento de "inmunización pasiva" se utilizó para crear un sistema modelo para imitar la remoción por aféresis de plasma de anticuerpos anti-adenovirales. La inmunización pasiva se refiere a un procedimiento en donde el suero de un animal se introduce dentro un segundo animal. En este caso, un grupo de ratones BALB/6 se inyectaron con adenovirus recombinante de humano (hAd) con el objeto de desarrollar anticuerpos anti-hAd. Estos ratones se sacrificaron y el suero se colectó. Este suero se inyectó entonces intraperitonealmente dentro de un segundo grupo de ratones BALB/6. Con el objeto de asegurarse que este procedimiento de inmunización pasiva fue efectivo para transmitir los anticuerpos hAd al suero de los ratones intraperitonealmente inyectados en el segundo grupo, un estudio piloto se condujo para mostrar que 10 µg de anticuerpo anti-adenoviral eluído a partir de la columna rAd, o una cantidad equivalente de suero (en un volumen total de 500 µl) inyectado intraperitonealmente puede detectarse en el suero de ratones BALB/6 sin afección. Los resultados de estos experimentos se presentan en la figura 3 de los dibujos anexos. Como se puede observar a partir de los datos presentados, los anticuerpos anti-hAd estuvieron presentes en el suero tan rápido como 3 horas post-administración IP y aún fueron detectables 72 horas después de la inyección IP. El suero (500 µl) se diluyó mediante el volumen de suero normal en el ratón y luego permaneció estable por el menos 72 horas. Esto resultados indican que los ratones inyectados intraperitonealmente con suero que contiene anticuerpos anti-adenovirales transfiere efectivamente la inmunidad humoral (es decir, anticuerpos neutralizantes a adenovirus) y proveen un sistema modelo válido para demostrar la efectividad de la presente invención. Un adenovirus recombinante (ZZCB) se utilizó para cebar los ratones con un adenovirus recombinante de humano para generar una respuesta inmune "pre-existente" para evaluación posterior. El método de preparación del vector ZZCB y BGCG se describe en Gregory, et al., anteriormente mencionado, y se refieren en esa referencia como virus A C y A/C/ß-gal respectivamente. Los ratones BALB/6 se inyectaron con 5 x 1010 partículas 28 días después de la primera inyección. Los ratones se sacrificaron 14 días después de la segunda inyección y el suero se aisló y se agrupó. Una columna de agarosa entrecruzadas se preparó en substancial conformidad con la enseñanza del ejemplo 1 en la presente utilizando múltiples proteínas de cápside adenoviral de humano entrecruzadas a la columna como una fuente de epítopes. Una fracción del suero agrupado se dejó equilibrar con el material de columna y se diluyó (referida en la presente como "suero purificado") y la fracción remanente del suero agrupado se retuvo como un control (en adelante referida como "suero no purificado").

Cinco ratones se inyectaron cada uno intraperitonealmente con 40 µg de anticuerpos anti-hAd eluídos a partir de la columna de proteína-rAD, 80 µg de anticuerpos anti-hAd eluídos a partir de la columna de proteína-rAd, columna-suero depletado, suero no tratado a partir de animales cebados y suero partir de animales inyectados con PBSv (solución salina amortiguada con fosfato que adicionalmente contiene MgCI2 2 mM, sucrosa al 3%) y una muestra de sangre obtenida una hora después inmunización pasiva (para utilizarla como estándar) y que se deja reposar durante toda la noche. Al siguiente día (aproximadamente 12 horas después de la inmunización pasiva), los ratones se inyectaron por la vena de la cola con 5 x 1010 partículas de adenovirus recombinante humano BGCG. El suero se colectó dos horas después de la inyección y el suero se analizó para la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-adenovirales de suero. Los ratones se sacrificaron a los 3 días después de inyección de BGCG y el suero se analizó para la presencia de anticuerpos neutralizantes anti-adenovirales de suero y el tejido hepático se analizó para la expresión de B-gal. Los resultados de estos experimentos pueden observarse en la figura 4 de los dibujos anexos. Los animales que recibieron inmunización pasiva con suero no purificado de 40 µg u 80 µg de anticuerpos anti-hAd eluídos a partir de la columna demostraron un título alto de anticuerpos neutralizantes anti-hAd en suero una hora después de la inyección IP. Sin embargo, aquellos animales que se inmunizaron pasivamente con suero depletado por la columna, no tuvieron anticuerpos neutralizantes en suero detectables una hora después de la inyección. Sin iHLA& t?id-!, f jh¡Hf - > .' ^«?*-» -»-—*. embargo aquellos animales que se inmunizaron pasivamente con suero depletado en la columna, no tuvieron anticuerpos neutralizantes de suero detectables una hora después de la inyección. La presencia de anticuerpos neutralizantes en los cinco grupos de ratones al tercer día después de la inyección con BGCG es debido a una respuesta humoral primaria a BGCG por el mismo. Consecuentemente, el nivel de anticuerpos neutralizantes anti-hAd en suero en aquellos animales pasivamente inmunizados con suero purificado disminuyó sustancialmente en relación aquellos animales que recibieron suero no purificado indicando que la remoción de anticuerpos antivirales es útil in vivo para minimizar la respuesta inmune pre-existente a dichos virus: El suero purificado sobre una columna SAVID tiene una reducción mejorada en anticuerpos neutralizantes anti-hAd en suero con relación a la Proteína A y las columnas KappaLock TM de Sepharose in vivo. También es evidente a partir de los datos en la figura 4 de la inyección intravenosa de BGCG resultó en una disminución adicional de anti rAd puede promover adicionalmente la redosificación de anticuerpos neutralizantes en el suero (véase suero no depletado dos horas después de la introducción del virus). Además, en el grupo que recibió anticuerpo rAd eluído a partir de las columnas, virtualmente todo el anticuerpo neutralizante se depletó a partir del suero después de la inyección de BGCG mediante ruta intravenosa. Esta administración sistémica de rAd depleta los anticuerpos neutralizantes de suero y sugiere que los anticuerpos de alta afinidad se depletan muy eficientemente. Por lo tanto la readministración una hora o un día después de la inyección de rAd puede promover adicionalmente la redosificación. Tal vez más importante a la clínica y desde un punto de vista comercial es el hecho de que la disminución de la respuesta inmune humoral pre-existente o inducida permite el uso de una dosis más baja del virus para lograr el mismo nivel de expresión del transgén terapéutico. Esto se demostró a examinar la expresión de ß-galactosidasa en los hígados utilizando los animales a partir del experimento previo. Se sabe de experimentos previos que la mayoría de la expresión de los adenovirus deficientes en replicación sistemáticamente administrados resulta en la transducción de las células del hígado. Consecuentemente, después de sacrificio de los animales a partir del experimento previo, los hígados se removieron y se evaluaron para actividad de ß-galactosidasa, un indicador de la eficiencia de la transducción de BGCG. Los resultados se presentan en las fotomicrografías en la figura 5 de los dibujos anexos. Estos datos proveen eficiencia para los niveles relativos de expresión de ß-galactosidasa en hígados a partir de animales que recibieron inmunización pasiva de suero depletado por columna, suero no depletado, anticuerpos anti-hAd eluídos a partir de suero de la columna de proteína rAd a partir de animales prueba con PBSv. El dato demuestra que el nivel de expresión de la expresión de ß-galactosidasa en la ratones que recibieron suero depletado por columna es sustancialmente mayor que aquellos ratones que recibieron suero no depletado. Al evaluar a éstos ratones inmunizados pasivamente con una dosis de virus se mostró que la transducción del virus no fue detectable en los hígados de ratones pasivamente inmunizados con suero no adsorbido Ad, sin embargo la transducción del virus se detectó fácilmente en los hígados de ratones pasivamente inmunizados con suero preadsorbido Ad. Consecuentemente, estos resultados experimentales demuestran que la presente invención es útil in vivo para incrementar la eficiencia de la transducción a partir de vectores adenovirales recombinantes en sistemas de mamíferos que poseen anticuerpos neutralizantes de suero pre-existentes. En particular, estos dato demuestran que la inmunodepleción efectiva de anticuerpos anti-adenovirales puede reducir la dosis de administración del virus para la transducción para lograr niveles equivalentes de expresión del transgén en los tejidos blanco. Con el objeto de determinar los efectos de este procedimiento en la población humana, una serie de experimentos se condujeron utilizando sangre de humano que contenían anticuerpos anti-adenovirales. El suero de humano a partir de donantes normales se obtuvo a partir del banco de sangre de San Diego. La capacidad neutralizante de cada muestra se determinó mediante el ensayo GFP descrito en el ejemplo 3 en la presente. El suero se caracterizó, que tenía una alta o una baja capacidad neutralizante. La capacidad neutralizante baja se definió como un título de 1 : 320 o menor. Una capacidad neutralizante alta se definió como un título de 1 : 2500 o mayor. Las muestras de suero que exhibieron ya sea capacidad neutralizante "alta" o "baja" se agruparon y se sometieron a cromatografía en columna sobre una columna de Proteína G (comercialmente disponible a partir de Zymed) y - i#» columna de cápside adenoviral SAVID (preparada en sustancial conformidad con la enseñanza del ejemplo 2 en la presente). Pero resultados se presentan en las figuras 6, 7, 8 de los dibujos anexos. Los resultados demuestran una reducción significativa en la capacidad neutralizante del suero después del paso por una columna SAVID. Además, los resultados demuestran que los anticuerpos eluídos a partir de la columna de proteína G exhiben el mismo título que el anticuerpo eliminado a partir de la columna de cápside sugiriendo que la eficiencia de la columna de proteína G y la columna de la cápside fue similar para remover anticuerpos adenovirales. Será fácilmente aparente a los expertos en la técnica que una combinación de los materiales inmunoadsorbente anteriormente mencionados también puede emplearse. Dichos materiales pueden utilizarse juntos en una mezcla heterogénea o secuencialmente para lograr una reducción mejorada en anticuerpos a partir del suero o para remover anticuerpos de varios tipos en un solo procedimiento de aféresis del plasma.

Aparatos: La presente invención además provee un aparato para aféresis del plasma en donde el elemento de filtración del plasma de dicho aparato comprende un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende un epítope viral conjugado con un soporte cromatográfico. Los elementos de filtración del plasma de dichos dispositivos se modifican para incorporar un material cromatográfico de inmunoafinidad en formato de columna el cual se utiliza para eliminar anticuerpos antivirales a partir del plasma sanguíneo. Dicho aparato se provee en forma esquemática en la figura 9 de los dibujos anexos. El material inmunoadsorbente unido al soporte cromatográfico generalmente se abastece en un equipo o en partes que comprenden el material inmunoadsorbente unido al soporte cromatográfico con instrucciones para el uso apropiado del material. En la modalidad preferida, el material inmunoadsorbente unido al soporte cromatográfico se contiene en un recipiente aséptico elaborado para que sea capaz de esterilización tal como vidrio o plástico (por ejemplo policarbonato plástico). Preferiblemente, el recipiente es sustancialmente cilindrico en forma definiendo una superficie superior y una superficie inferior, cada una de las cuales superior e inferior se proveen con una saliente localizada centralmente para adaptar el tubo flexible convencionalmente utilizado en procedimientos de aféresis para permitir el paso del plasma a través del recipiente. El recipiente comprende opcionalmente un elemento de membrana con un diámetro de poro suficiente para permitir el flujo libre del plasma pero insuficiente para permitir el paso de material inmunoadsorbente. Recipiente que contiene el material cromatográfico inmunoadsorbente generalmente se provee en materiales de empaquetamiento estéril que facilitan su esterilidad inmediatamente antes de su uso. El equipo de partes puede comprender adicionalmente medios para adaptar el recipiente a medios de soporte para mantener el recipiente en una posición sustancialmente vertical durante su uso. Los ejemplos de dichos medios de unión se conocen bien en la técnica tales como la pinza con 3 prolongaciones ajustable número de catálogo 05-769 comercialmente disponible a partir de Fisher Scientific. El equipo de partes puede incluir opcionalmente tubos estériles flexibles que facilitan la conexión al aparato de aféresis convencional. El equipo de partes puede opcionalmente incluir válvulas de 3 sentidos con seguro luer heparinizadas y estériles para facilitar el interinato de material no deseado a partir del aparato con alzas esencialmente cerradas. El equipo de partes puede incluir opcionalmente un filtro para leucocito (por ejemplo, filtro Pall PL100(R) comercialmente disponible a partir de Pall Corporation, 2200 Northern Boulevard, East Hills, NY 11548) para facilitar la remoción de microagentes. El equipo de partes puede incluir opcionalmente una cámara de DRIP para evitar la introducción de aire a la línea de regreso al abastecimiento venoso del paciente.

Aplicaciones: Como previamente se describió, el método y aparato de la presente invención puede utilizarse en combinación con administración de virus terapéuticos a un mamífero en donde el procedimiento para la remoción de anticuerpos antivirales a partir del sujeto se lleva a cabo antes del administración de un virus terapéutico. Debe evidenciarse en la presente invención puede utilizarse para remover anticuerpos antivirales pre-existentes (es decir, anticuerpos en un paciente sin afección que no ha sido expuesto al virus terapéutico) o anticuerpos antivirales inducidos a través de la exposición • » Ith? .*tA?JI**?.J..; previa al virus terapéutico. El método de la presente invención y los materiales provistos son adecuados para uso en el ambiente clínico, particularmente en conjunción con la administración de productos terapéuticos que comprenden virus terapéuticos biodiseñados. Si o no un individuo posee anticuerpos neutralizantes preexistentes para un virus dado puede determinarse fácilmente mediante procedimientos de ensayo convencionales. El ejemplo 2 en la presente provee un ejemplo de dicho ensayo el cual puede emplearse fácilmente en el ambiente clínico. Los ensayos similares que se refieren a la detección de otros anticuerpos antivirales que se conocen en la literatura científica pueden emplearse fácilmente. A pesar de que un sujeto puede no poseer anticuerpos a un virus terapéutico dado, después del administración de la primera dosis de dicho virus, el sistema inmune del mamífero montará una respuesta inmune en contra del vector. Consecuentemente, el método de la presente invención es particularmente útil en el contexto en donde dosis múltiples del virus se administran el sujeto durante un periodo de tiempo prolongado. El hecho de que la presente invención facilite la re-dosificación de un individuo que con un virus terapéutico dado es de particular valor. Los procedimientos de aféresis comúnmente se practican en el ambiente clínico y los ajustes al siguiente procedimiento general para el paciente individual serán fácilmente aparentes al médico experto. La técnica aséptica convencional debe emplearse durante todo el procedimiento. Ciertas precauciones comúnmente evaluadas en la práctica de procedimientos de aféresis deben observarse. Por ejemplo, los pacientes que reciben medicamentos inhibidores de la enzima que convierte angiotensina (ACE) no deben utilizar dichos medicamentos por un periodo de aproximadamente 72 horas antes del inicio del procedimiento de aféresis. Adicionalmente, los pacientes que exhiben enfermedades vasculares o intracraneales significativas en donde el flujo menor o cambios de la presión pueden resultar en efectos dañinos, pacientes con función renal alterada, anemia severa o infecciones sistémicas deben evaluarse cuidadosamente por el médico para su posibilidad para realizarles procedimientos de aféresis. El volumen sanguíneo que un ser humano típico es de 69 ml/kg de peso corporal para humanos de sexo masculino y de 65 ml/kg para humanos de sexo femenino. De este volumen 39 ml/kg (varones) y 40 ml/kg (hembras) se atribuye al volumen del plasma. Consecuentemente un paciente humano varón típico que pesa 75 kg posee un volumen plasmático de aproximadamente 3 litros. No es esencial que el volumen de plasma completo del paciente se aisle y se someta al procedimiento de columna con el objeto de lograr una reducción terapéuticamente significativa en la inmunidad preexistente. Una reducción del título neutralizantes del suero de aproximadamente un log resulten un incremento significativo en la eficiencia de la transducción de construcciones adenovirales recombinantes. Una reducción en el título de aproximadamente dos log es más preferida. Las reducciones adicionales en el título neutralizante del suero son preferibles, pero no se cree que sean cínicamente necesarias. Sin embargo, se prefiere que una fracción substancial del volumen plasmático (1 litro o más) se aisle a partir del tratamiento. Este volumen de suero rutinariamente se aisla mediante técnicas convencionales de aféresis. El suero humano contiene una variedad de anticuerpos de los cuales solamente una fracción está relacionada con la actividad neutralizante. Por ejemplo el plasma de humano contiene aproximadamente 10 mg/ml de IgG, solamente una fracción de la cual está asociada con actividad neutralizante anti-adenoviral. Consecuentemente, la columna de cromatografía de ¡nmunoafinidad preferiblemente comprende aproximadamente 100-500 mg de proteína de cápside adenoviral o proteína G (más preferiblemente 200-400 mg) unido al soporte cromatográfico por cada litro de plasma a ser tratado. Las proteínas de la cápside adenoviral pueden obtenerse mediante el cultivo de adenovirus de conformidad con procedimientos conocidos. Los soportes de la columna de inmunoadsorción comprenden proteínas G entrecruzadas que están disponibles a partir de fuentes comerciales tales como Zymed Laboratories, Inc., 458 Carlton Court, sur de San Francisco, CA 94080. Antes del uso clínico, el material cromatográfico de ¡nmunoafinidad debe lavarse extensivamente al pasar aproximadamente tres volúmenes de los glóbulos de solución salina estéril clínica amortiguada con fosfato a través de la columna. Después de procedimiento de lavado, un volumen de los glóbulos de sulfato de heparina (aproximadamente 5000 tt %. . . fc«*fe*«.». ._>,. . * „ ? ..^. .-* », . unidades en un volumen de 500 ml) debe introducirse dentro de la columna. La columna entonces se coloca hacia arriba y no debe agitarse o se permitirá la entrada del aire en los glóbulos de la columna o en las líneas de alimentación. Un arreglo convencional del aparato utilizado en la práctica del método de la presente invención se presente esquemáticamente la figura 9 de los dibujos anexos. El acceso venoso al paciente se establece y la sangre venosa completa a entrar al aparato de aféresis en donde los componentes del plasma se aisla a partir de otros componentes que no pertenecen al plasma. Los componentes que no pertenecen al plasma se regresan al torrente sanguíneo del paciente. Los componentes del plasma se dirigen a la columna cromatográfica de inmunoafinidad. El suero aislado debe pasarse a través de la columna cromatográflca de inmunoafinidad a una velocidad de flujo de aproximadamente cinco ml/min a aproximadamente 25 ml/min. Más preferiblemente, una velocidad de flujo de 10-20 ml/min se mantiene a lo largo del transcurso del procedimiento. El primer equivalente en volumen de al menos el volumen de la heparina debe descartarse para evitar la introducción de heparina al paciente. El suero remanente purificado en la columna se dirige al recipiente para recibir plasma tratado. Antes de la re-introducción al paciente, se prefiere que los componentes del plasma tratado puedan pasarse a través de un filtro de leucocito (por ejemplo, filtro Pall PL100(R) comercialmente disponible a partir de Pall Corporation, 2200 Northern Boulevard, East Hills, NY 11548) para remover microagregados.

- A S- - * •» -«ai- iu?i i Adicionalmente, con el objeto de evitar que ningún volumen de aire entre a la línea de regreso al abastecimiento venoso del paciente, una cámara de DRIP debe emplearse. La reducción de la capacidad neutralizante del suero resultante a partir de los procedimientos presentados resulta en una reducción de la capacidad neutralizante del suero que persiste por al menos cinco días. Consecuentemente, con el objeto de maximizar el beneficio terapéutico del procedimiento precedente, se prefiere que la administración del virus deba ocurrir dentro de este periodo de tiempo que sigue al procedimiento. Puesto que la depleción de anticuerpos antivirales se observó de manera relativamente rápida después de procedimiento de aféresis del plasma y el sistema inmune inmediatamente intentó regenerar esta respuesta, se prefiere que el procedimiento de aféresis del plasma se lleve a cabo relativamente pronto (preferiblemente horas) antes de la administración(es) del virus terapéutico. Adicionalmente, puesto que la inyección del virus terapéutico resulta en un anticuerpo neutralizante del suero adicionalmente depletado, las administraciones adicionales del virus (inyecciones seriales) pueden llevarse a cabo a partir de una hora a aproximadamente un día después de la dosis inicial para realizar un efecto máximo de esta depleción del anticuerpo secundario. Aunque el procedimiento de aféresis del plasma se tolera bien por pacientes humanos no hay limitación técnica para llevar a cabo todos los días este procedimiento para lograr el efecto máximo. Sin embargo, como previamente se estableció, el efecto producido es de duración suficiente que la repetición diaria del procedimiento no se requiere generalmente. Debe evidenciarse que no es esencial depletar completamente los anticuerpos antivirales a partir de la circulación con el objeto de proveer un efecto benéfico. Consecuentemente, no es necesario que el volumen plasmático total del individuo se someta al presente procedimiento cromatográfico. Aunque el efecto del procedimiento en minimizar la respuesta inmune a un virus terapéutico se mejora con la disminución incrementada de los niveles de anticuerpos antivirales, incluso una reducción relativamente modesta de la concentración de anticuerpos antivirales puede proveer un efecto terapéutico significativo. En la práctica preferida de la invención, de conformidad con el procedimiento convencional de aféresis, aproximadamente un litro de suero se aisla mediante purificación sobre la columna de inmunoafinidad en un único procedimiento. Si una reducción mayor de anticuerpos antivirales se requiere, el procedimiento puede expandirse para tratar con volúmenes más grandes o debe llevarse a cabo repetidamente. Los términos "virus terapéutico" y "vector viral terapéutico" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a los virus utilizados como agentes terapéuticos (por ejemplo, virus de tipo-silvestre, virus atenuados), vectores de vaccinia o virus recombinantes que contienen modificaciones al genoma para mejorar los efectos terapéuticos. El uso de virus o "vectores virales" como agentes terapéuticos se conoce bien en la técnica como previamente se describió. Adicionalmente, varios virus se utilizan comúnmente como vectores para la administración de genes exógenos. Los vectores comúnmente empleados incluyen virus de ADN o de ARN con cubierta o sin cubierta recombinantemente modificados, preferiblemente seleccionados a partir de baculoviridiae, parvoviridiae, picomoviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviridiae, o picomnaviridiae. Los vectores quiméricos también pueden emplearse los cuales explotan elementos ventajosos de cada una de las propiedades de vectores parentales (véase por ejemplo, Feng, et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 866-870). Dichos vectores virales pueden ser de tipo-silvestre o pueden modificarse mediante técnicas de ADN recombinante para que sean deficientes en replicación, condicionalmente replicantes o de replicación competente. Los virus terapéuticos se administran habitualmente a los sujetos mamíferos mediante una variedad de rutas de administración incluyendo administración local (por ejemplo, inyección intratumoral), administración regional (por ejemplo, intraperitonealmente, intravesicularmente, o intraarterialmente intrahepáticamente) y administración sistémica (por ejemplo, intramuscular e intravenosa). Los vectores preferidos se derivan a partir de genomas adenovirales, virales adeno-asociados y retrovirales. En la práctica más preferida de la invención, los vectores se derivan a partir del genoma de adenovirus de humano. Los vectores particularmente preferidos se derivan a partir de los serotipos 2 o 5 de adenovirus de humano. La capacidad replicante de dichos vectores puede atenuarse (hasta el punto de ser considerado "deficiente en replicación") mediante modificaciones o deleciones en las regiones codificantes E1a y/o E1 b. Otras modificaciones al genoma viral para lograr características de expresión particular o que permitan la expresión repetida o respuesta inmune inferior se prefieren. Más preferibles son los vectores tipo 5 adenovirales de humano que contienen una secuencia de ADN que codifica el gen supresor del tumor p53. En la práctica más preferida de la invención como se ejemplifica en la presente, el vector es un vector adenoviral deficiente en replicación que codifica el gen supresor del tumor p53 A/C/N/53 como se describe en Gregory, et al., patente de Estados Unidos No. 5,932,210 expedida el 3 de agosto de 1999 (la enseñanza total del cual se incorpora en la presente como referencia). Alternativamente, los vectores virales pueden replicarse de manera condicional o replicarse de manera competitiva. Los vectores virales que se replican de manera condicionalmente se utilizan para lograr la expresión selectiva en tipos celulares particulares mientras que se evita la infección de espectro amplio desfavorable. Los ejemplos de vectores de replicación de manera condicional se describen en Pennisi, E. (1996) Science 274: 342-343; Russell, y S.J. (1994) Eur. J. of Cáncer 30A (8): 1165-1171. Los ejemplos adicionales de vectores de replicación de manera selectiva incluyen aquellos vectores en donde un gen esencial para la replicación del virus está bajo control de un promotor el cual está activo solamente en un tipo particular de célula o estado celular tal como en la ausencia de la expresión de dicho gen, el virus no se replicará. Los ejemplos de dichos vectores se describen en Henderson, et al., patente de Estados Unidos No. 5,698,443 expedida el 16 de diciembre de 1997 y Henderson, et al., patente de Estados Unidos No. 5, 871 ,726 expedida el 16 de febrero de 1999 las enseñanzas totales de las cuales se incorporan en la presente como referencias. Adicionalmente, el genoma viral puede modificarse para incluir promotores inducibles que logran la replicación o expresión solamente bajo ciertas condiciones. Los ejemplos de promotores inducibles se conocen en la literatura científica (véase, por ejemplo, Yoshida y Hamada (1997) Biochem.

Biophys. Res. Commun. 230:426-430; lida, et al. (1996) J. Virol. 70 (9): 6054-6059; Hwang, et al. (1997) J. Virol. 71 (9): 7128-7131 ; Lee, et al. (1997) Mol.

Cell. Biol. 17 (9): 5097-5105; y Dreher, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272 (46): 29364-29371. Los virus también pueden diseñarse para que sean virus que se replican de manera selectiva. Los virus que se replican de manera selectiva particularmente preferidos se describen en Ramachandra, et al. Publicación Internacional PCT No. WO 00/22137, Solicitud Internacional No.

PCT/EUA99/21452 publicada el 20 de abril de 2000 y Howe, J., Publicación Internacional PCT No. WO WO0022136, Solicitud Internacional No.

PCT/EUA99/21451 publicada el 20 de abril de 2000. Un adenovirus recombinante selectivamente replicante particularmente preferido es el virus d101/07/309 como se describe más completamente en Howe, J. Se ha demostrado que los virus que están atenuados para la replicación también son útiles en la arena terapéutica. Por ejemplo el adenovirus dl1520 que contiene una deleción específica en el gen E1 b55K (Barker y Beck (1987) Virology 156: 107) se ha utilizado con efecto terapéutico en los seres humanos. Dichos vectores también se describen en McCormick, patente de Estados Unidos No. 5,846,945 expedida el 8 de diciembre de 1998. El método de la presente invención también puede utilizarse en combinación con la administración de dichos vectores para minimizar la respuesta inmune humoral pre-existente o inducida a dichos vectores. Adicionalmente, los virus terapéuticos pueden incorporar un transgén terapéutico para la expresión en una célula infectada. El término "transgén terapéutico" se refiere a una secuencia nucleotídíca la expresión de la cual en la célula blanco produce un efecto terapéutico. El término transgén terapéutico incluye pero no se limita a genes supresores del tumor, genes antigénicos, genes citotóxicos, genes citostáticos, genes activadores de profármacos, genes apoptóticos, genes farmacéuticos o genes anti-angiogénicos. Los vectores de la presente invención pueden utilizarse para producir uno o más transgenes terapéuticos, ya se a en tándem a través del uso de elementos IRES o a través de promotores regulados de manera independiente. El término "gen supresor del tumor" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en la célula blanco es capaz de suprimir el fenotipo neoplásico y/o inducir apoptosis. Los ejemplos de genes supresores de tumores útiles en la práctica de la presente invención incluyen en gen p53, el gen APC, el gen DPC-4, el gen BRCA-1 , el gen BRCA-2, el gen . ..^ .«*a¿^? *„ ._^_ WT-1 , el gen de retinoblastoma (Lee, et al. (1987) Nature 329: 642), el gen MMAC-1 , la proteína coli de poliposis adenomatosa (Albertsen, et al., patente de Estados Unidos 5,783,666 expedida el 21 de julio de 1998), el gen de carcinoma de colon deletado (DCC), el gen MMSC-2, el gen NF-1 , el gen supresor del tumor de carcinoma nasofaríngeo que mapea en el cromosoma 3p21.3. (Cheng, et al. 998. Proc. Nati. Acad. Sci. 95: 3042-3047), el gen MTS1 , el gen CDK4, el gen NF-1 , el gen NF-2, y el gen VHL. Un adenovirus particularmente preferido para uso terapéutico es el vector ACN53 que codifica el gen supresor del tumor p53 como se describe más completamente en Gregory, et al., patente de Estados Unidos No. 5,932,210 expedida el 3 de agosto de 1999 la enseñanza total del cual se incorpora en la presente como referencia. El término "genes antigénicos" se refiere a las secuencias nucleotídicas, la expresión de las cuales en las células blanco resulta en la producción de una proteína antigénica de superficie celular capaz de ser reconocida por el sistema inmune. Los ejemplos de genes antigénicos incluyen antígeno carcinoembrionario (CEA), p53 (como se describió por Levine, A. Publicación Internacional PCT No. WO94/02167 publicada el 3 febrero de 1994). Con el objeto de facilitar el reconocimiento inmune, el gen antigénico puede fusionarse al antígeno MCH clase I. El término "gen citotóxico" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce un efecto tóxico. Los ejemplos de dichos genes citotóxicos incluyen secuencias nucleotídicas que codifica exotoxina de pseudomonas, toxina de ricino, toxina de difteria, y similares. El término "gen citostático" se refiere a una secuencia nucleotídicas, la expresión de la cual en una célula produce un arresto en el ciclo celular. Los ejemplos de dichos genes citostáticos incluyen p21 , el gen de retinoblastoma, el gen E2F-Rb, genes que codifica el inhibidores de la cinasa dependiente de ciclina tales como P16, p15, p18 y p19, el gen del homeobox específico del arresto del crecimiento (GAX) como se describen en Branellec, et al. (publicación PCT W097/16459 publicado el 9 de mayo de 1997 y publicación PCT WO96/30385 publicado ei 3 de octubre de 1996). El término "gen de citocina" se refiere una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce una citocina. Los ejemplos de dichas citocinas incluyen GM-CSF, las interleucinas, especialmente IL-1 , IL-2, IL-4, IL-12, IL-10, IL-19, IL-20, interferones de los subtipos a, ß y ?, interferones consenso y especialmente interferón a-2b y fusiones tales como ¡nterferón a-2a-1. El término "gen de quimocina" se refiere una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual en una célula produce una citocina. El término citocina se refiere un grupo de actores con un bajo peso molecular de citocina relacionadas estructuralmente secretadas por las células que están relacionadas estructuralmente teniendo actividades mitogénicas, quimostáticas o inflamatorias. Estas son proteínas principalmente catiónicas de 70 a 100 residuos de aminoácidos que comparten cuatro cisteínas conservadas. Estas proteínas pueden clasificarse en dos grupos basándose en el espacio de las dos cisteínas amino terminales. En el primer grupo, las dos cisteínas están separadas por un solo residuo (C-x-C), mientras que en el segundo grupo, estas son adyacentes (C-C). Los ejemplos de los miembros de las quimocinas "C-x-C" incluye pero no se limitan al factor plaquetario 4 (PF4), proteínas plaquetaria básica (PBP), interleucina-8 (IL-8), proteína de actividad estimulante del crecimiento del melanoma (MGSA), proteína 2 inflamatoria del macrófago (MIP-2), Mig de ratón (m119), 9E3 de pollo (o pCEF-4), factores quimiotácticos de macrófago alveolar de cerdo I y II (AMCF-I y II), factor estimulante del crecimiento de célula pre-B (PBSF), e IP10. Los ejemplos de miembros del grupo "C-C" incluye pero no se limitan a proteína quimotáctica de monocito 1 (MCP-1 ), proteína quimotáctica de monocito 2 (MCP-2), proteína quimotáctica de monocito 3 (MCP-3), proteína quimotáctica de monocito 4 (MCP-4), proteína inflamatoria del macrófago 1 ALFA (MIP-1-ALFA), proteína inflamatoria del macrófago 1 ß (MIP-1-ß), proteína inflamatoria del macrófago 1 ? (MIP-1-?), proteína inflamatoria del macrófago 3 a (MIP-3-a), proteína inflamatoria del macrófago 3 ß (MIP-3-ß), quimocina (ELC), proteína inflamatoria del macrófago 4(MIP-4), proteína inflamatoria del macrófago 5 (MIP-5), LD78 ß, rantes, SIS-epsilon (p500), quimocina regulada por timo y por activación (TARC), exotoxina, I-309, proteína humana HCC-NCC-2, proteína humana HCC-3, proteína de ratón C10. El término "gen para proteína farmacéutica" se refiere a una secuencia nucleotídica, la expresión de la cual resulta en la producción de una proteína que tiene efecto farmacéutico en las células blanco. Los ejemplos de dichos genes farmacéuticos incluyen el gen de pro-insulina y análogos (como se describe en la solicitud de patente internacional PCT No. W098/31397, gen de la hormona del crecimiento, dopamina, serotonina, factor de crecimiento epidémico, GABA, ACTH, NGF, VEGF (para incrementar la perfusión de sangre al tejido blanco, inducir angiogénesis, publicación PCT W098/32859 publicada el 30 de julio de 1998), trombospondina, etc. El término "gen pro-apoptótico" se refiere una secuencia nucleotídica, la expresión de la misma resulta en la inducción de la ruta de muerte celular programada de la célula. Los ejemplos de genes pro- apoptótícos incluyen p53, adenovirus E3-11.6K (10.5K), el adenovirus E4orf4, genes de la ruta p53, y genes que codifican las caspasas. El término "genes activadores de pro-fármacos" se refiere a secuencias nucleotídicas, la expresión de las cuales, resulta en la producción de proteína capaz de convertir un compuesto no terapéutico hacia un compuesto terapéutico, el cual vuelve a la célula susceptible de ser eliminada por factores externos o causa una condición tóxica en la célula. Un ejemplo de un gen activador de profármaco es el gen de la citosindesaminasa. La citosindesaminasa convierte 5-fluorocitosina a 5 fluorouracilo, un potente inhibidor del tumor). La lisis de la célula tumoral provee un estallido localizado de la citosindesaminasa capaz de convertir 5FC a 5FU en el punto localizado del tumor resultando en la eliminación de muchas células tumorales en los alrededores. Esto resulta en la eliminación de un gran número de células tumorales sin la necesidad de infectar estas células con un adenovirus (el denominado "efecto mirón"). Adicionalmente, el gen de la timidincinasa (TK) (véase, por ejemplo, Woo, et al. patente de Estados Unidos No. 5,631 ,236 expedida el 20 de mayo de 1997 y Freeman, et al. patente de Estados Unidos No. 5,601 ,818 expedida el 11 de febrero en 1997). En la cual las células que expresan el productor gen TK son susceptibles para eliminarse selectivamente mediante administración de ganciclovir que puede ser empleado. El término genes "anti-angiogénicos" se refieren a la secuencia nucleotídica, la expresión de la cual resulta en la secreción extracelular de factores anti-angiogénicos. Los factores anti-angiogénicos incluyen angiostatina, inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) tal como Tie 2 (como se describe en PNAS (USA) (1998) 95:8795-8800), endostatina. Será aparente fácilmente a los expertos en la técnica que las modificaciones y/o deleciones a los genes anteriormente mencionados de manera que codifiquen subfragmentos funcionales de la proteína de tipo silvestre pueden adaptarse fácilmente para uso en la práctica de la presente invención. Por ejemplo, la referencia al gen p53 incluyendo solamente la proteína de tipo silvestre sino también las proteínas p53 modificadas. Los ejemplos de dichas proteínas p53 modificadas ¡ncluyen modificaciones a la p53 para incrementar la retención nuclear, deleciones tales como en los aminoácidos ?13-19 para eliminar el sitio de rompimiento consenso para calpaína (Kubbutat y Vousden (1997) Mol. Cell. Biol. 17:460-468, modificaciones a los dominios de oligomerización (como los descritos en Braceo, et al. solicitud PCT publicada WO97/0492 o patente de los Estados Unidos No. 5,573,925, etc.). Será fácilmente aparente a los expertos en la técnica que los genes terapéuticos anteriormente mencionados pueden secretarse hacia el medio o localizarse en ubicaciones intracelulares particulares mediante la inclusión de una porción direccionadora tal como un péptido señal o una señal de localización nuclear (NLS). También incluidas en la definición de transgén terapéutico están las proteínas de fusión del transgén terapéutico con la proteína estructural del virus de herpes simplex tipo 1 (HSV-1 ), VP22. Las proteínas de fusión que contienen la señal VP22, cuando se sintetizan en la célula infectada, se exportan fuera de las células infectadas y entran eficientemente a las células no infectadas que se encuentran a los alrededores hasta un diámetro de aproximadamente 16 células de ancho. Este sistema es particularmente útil en conjunción con proteínas transcripcionalmente activas (por ejemplo, p53) puesto que las proteínas de fusión se transportan eficientemente al núcleo de las células vecinas. Véase, por ejemplo, Elliot, G. & O?are, P. Cell. 88: 223-233, 1997; Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nature Biotechnology. 15:205, 1997; O?are, et al. publicación PCT WO97/05265 publicada el 13 de febrero de 1997. Una porción direccionadora similar derivada a partir de la proteína HIV Tat también se describe en Vives, et al. (1997) J. Biol. Chem. 272: 16010- 16017.

Puede ser valioso en algunos casos utilizar o diseñar vectores para lograr la introducción del transgén exógeno en tipo celular particular. Ciertos vectores exhiben un tropismo natural para ciertos tipos de tejidos. Por ejemplo los vectores derivados a partir del género hesperviridiae se ha mostrado que tienen una infección preferencial de células neuronales. Los ejemplos de vectores herpesviridiae recombinantemente modificados se describe en la patente de Estados Unidos No. 5, 328, 688 expedida el 12 de julio de 1994. La especificidad de tipo celular o de direccionamiento de tipo celular también puede lograrse en vectores derivados a partir de virus que tienen infecciones característicamente amplias mediante la modificación de las proteínas de la cubierta viral. Por ejemplo, las células direccionadoras se ha logrado con vectores adenovirales mediante la modificación selectiva de secuencias codificantes de prominencia y fibra del genoma viral que tienen una interacción específica con receptores únicos de superficie celular. Los ejemplos de dichas modificaciones se describen en Wickham, et al. (1997) J. Virol. 71 (11 ): 8221-8229 (incorporación de péptidos RGD dentro de las proteínas de fibra adenovirales); Amberg, et al. (1997) Virology 227: 239-244 (modificación de genes de fibra adenoviral para lograr tropismo hacia el ojo y el tracto genital); Harris y Lemoine (1996) TIG 12 (10): 400-405; Stevenson, et al., (1997) J. Virol. 71 (6): 4782-4790; Michael, et al. (1995) Gene Therapy 2: 660-668 (incorporación del fragmento del péptido liberador de gastrina hacia las proteína de fibra adenoviral); y Ohno, et al. (1997) Nature Biotechnology 15: 763-767 (incorporación del dominio de unión de la Proteína A-lgG dentro del virus Sindbis). Otros métodos de direccionamiento especificó a las células se han logrado mediante la conjunción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos a las proteínas de cubierta (véase, por ejemplo, Michael, et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 6866-6869, Watkins, et al. (1997) Gene Therapy 4: 1004-1012; Douglas, et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 1574-1578. Alternativamente, particularmente las porciones pueden conjugarse a la superficie viral para lograr el direccionamiento (véase, por ejemplo, Nilson, et al. (1996) Gene Therapy 3: 280-286 (conjugación del EGF a las proteínas retrovirales)). Adicionalmente, el transgén terapéutico viralmente codificado también está bajo el control de una región promotora específica del tejido que permite la expresión del transgén preferencialmente en tipos celulares particulares. En la práctica preferida de la invención, este procedimiento se emplea en conjunción con terapia adenoviral recombinante para el tratamiento de cánceres humanos. De conformidad con la práctica oncológica convencional, los pacientes se dosifican a una dosis máxima tolerada del agente terapéutico. En el transcurso de investigación clínica, una dosis de 1.5 x 1013 de partículas adenovirales recombinantes se toleran bien en los sujetos humanos. La experiencia clínica con adenovirus recombinantes deficientes en replicación que expresan p53 ha indicado que el transcurso de terapia de inyección de aproximadamente 1 x 1013 de partículas virales recombinantes por un periodo de cinco días repetida cada semana es efectiva en el tratamiento de cáncer de ovario en seres humanos. El régimen de tratamiento terapéutico preferido en la presente invención podría implicar la remoción de anticuerpos antivirales utilizando la técnica que aféresis plasma descrita anteriormente seguida por este transcurso de terapia. Además, la inyección de adenovirus recombinantes en dichas cantidades pueden depletar adicionalmente los anticuerpos a mejorando así la transducción subsecuente. La siguiente es una descripción de procedimientos y parámetros para la aplicación convencional a este procedimiento en conjunción con la administración de un adenovirus recombinante deficiente en replicación que codifica a p53 ACN53 para el tratamiento de cáncer de ovario. Un curso de terapia típico con este agente implica la administración de 1.5 x 1013 a partículas virales cada día por un periodo de cinco días. Una fase FDA lll aprobó el protocolo clínico para el tratamiento de cáncer de ovario utilizando el virus ACN53 que implica un curso típico de cinco días de terapia descrita anteriormente en conjunción con los agentes quimoterapéuticos cisplatina y paclitaxel. Los presentes recibieron tres cursos de terapia con periodos de reposo entre éstos. Las modificaciones a éste procedimiento para virus terapéuticos diferentes a los adenovirus serán fácilmente aparentes a los expertos en la técnica. Antes de iniciar el tratamiento con el virus terapéutico, el paciente puede opcionalmente evaluarse para la presencia de anticuerpos antivirales pre-existentes de conformidad con los procedimientos de ensayo estándares bien conocidos en la técnica. Un ensayo para la determinación de anticuerpos anti-adenovirales se provee en ejemplos 3 en la presente. Esta ?ÉM-éH ú-FítXm- m****--**- -*¡fafe-^" -*- - -»~ t»»^íafaifa»'» ^..A».^,, ...»^ ÍS^JAL pre-elección puede ser más indicada en el paciente sin afección puesto que el paciente que ha sido previamente expuesto al virus terapéutico en los transcursos precios de la terapia puede asumirse generalmente que poseen dichos anticuerpos. El evento en el que el paciente poseen a anticuerpos neutralizantes pre-existentes o inducidos, un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende 250 mg de proteínas de cápside adenoviral en un formato de columna es un recipiente de 300 ml de volumen que se prepara de conformidad substancial a la enseñanza del ejemplo 2 en la presente y se esteriliza para su uso. El recipiente que contiene el material cromatográfico se fija a un soporte de manera elevada. Un aparato como se describió anteriormente se prepara y se dispone de conformidad substancial con la representación esquemática en la figura 9 de los dibujos anexos. La columna se lava con tres volúmenes de los glóbulos de solución salina amortiguada con fosfato estéril. 500 ml de heparina se introducen dentro del recipiente y el exceso se desecha. El abastecimiento de sangre venosa al aparato de aféresis se establece mediante cateterización de la vena cefálica. El puerto de salida de plasma del aparato de aféresis se conecta mediante tubos flexibles a la entrada del puerto inferior del recipiente que contiene el material cromatográfico. El plasma se deja entrar al recipiente que contiene el material cromatográfico. El flujo de plasma debe establecerse inicialmente aproximadamente 10 ml/min. Los primeros 400 ml de suero que emana a partir de la parte superior de la columna deben descartarse puesto que substancialmente están contaminados con heparina. El volumen remanente se dirige al recipiente de contención para la re-introducción al paciente. Si es posible, el flujo de plasma de incrementarse a aproximadamente 15-20 ml/min. Después del tratamiento de aproximadamente 1-1.5 litros de suero, el procedimiento debe descontinuarse. Si volúmenes adicionales se tratan, debe emplearse una nueva resina cromatográfica.

Uso de epítope virales La presente invención además provee un método mejorado para tratar un sujeto mamífero con un virus terapéutico, el método comprende administrar ha dicho mamífero un epítope viral o un mimético de epítope viral seguido por la administración de una dosis terapéuticamente efectiva de un virus terapéutico. Alternativamente al procedimiento de aféresis de plasma descrito anteriormente para remover los anticuerpos, uno también puede administrar una cantidad de epítope antiviral dentro de la corriente sanguínea del mamífero a ser tratado. En algunos casos, estas proteínas de cubierta viral son tóxicas (tales como hexon adenoviral o proteína de fibra) en cuyo caso se preside administrar una cantidad de un mimético de epítope (ya sea peptidil o compuesto orgánico de molécula pequeña). Estos agentes son entonces capaces de unirse a los anticuerpos antivirales pre-existentes en circulación. Como se describió anteriormente, la inyección del vector rAd también depletará el anticuerpo neutralizante a partir del suero, y por lo tanto es útil para la depleción de anticuerpo in vivo y re-dosificación. Los datos presentados en la figura 4 demuestran que los anticuerpos de alta afinidad se ^JtoaiAi^^ depletan esencialmente de manera completa mediante la administración del virus. Esto indica que el pre-tratamiento de un individuo con el virus depletará la respuesta inmune pre-existente o inducida a un virus de ese tipo. Por lo tanto la administración de un virus o subfragmentos inmunológicos del mismo pueden reducir la respuesta inmune pre-existente o inducida a un virus terapéutico. Este procedimiento entonces puede seguirse por la administración del virus terapéutico. Como se muestra a partir de los datos previos, la duración de la inmunodepleción es limitada. Consecuentemente, se preferirá administrar este epítope o mimético del epítope relativamente pronto (dentro de horas) antes del virus terapéutico para maximizar la eficiencia de la administración viral.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos proveen la metodología y resultados de experimentos que demuestran la construcción de vectores híbridos ejemplares de la invención. Será aparente a aquellos expertos en la técnica a quienes la invención pertenece, que la presente invención puede tener modalidades en formas diferentes a las descritas específicamente en éstos ejemplos, sin apartarse del espíritu o características esenciales de la invención. Las modalidades particulares de la invención se describen a continuación, y por lo tanto se consideran como ilustrativas y no restrictivas de alcance de la invención. En los siguientes ejemplos, "g" significa gramos, "ml" significa mililitros, "°C" significa grados centígrados, "min" significa minutos, "FBS" significa suero bovino fetal.

EJEMPLO 1 Animales PRIMED para la inducción de anticuerpos neutralizantes in vivo: 15 ratones BALB/6 se inyectaron subcutáneamente con 5 x 1010 partículas de ZZCB. Después de 28 días, los ratones recibieron una inyección de refuerzo de 5 x 1010 partículas subcutáneamente. 2 semanas después de la segunda inyección, los ratones se sacrificaron y el suero se aisló. El suero (referido como suero no depletado de Ad) a partir de 15 ratones se agrupó para experimentos subsecuentes. Los datos se presentan en la figura 1 de los dibujos anexos. Se mostró que este suero tenía un título mucho más alto que el suero a partir de animales que se dosificaron una vez con el adenovirus. Los ratones se inyectaron dos veces con el adenovirus para producir una fuerte respuesta de anticuerpo e imitar un escenario en gente pre-expuesta al virus y que se someten a terapia con el adenovirus. *Í . i -l 4kSlí-V ... ..... .ÍÍ.M.-?. Í . < 3? ...... j . . .t. ... , ^- ..^:,^.. „^. -,J ^, ..„ .«t.;ai,aa,:,á j.fcá tj.¿j EJEMPLO 2 Preparación de la columna de proteína de cápside adenoviral Con el objeto de purificar los anticuerpos a partir del suero agrupado, una columna de cromatografía se preparó en la cual las proteínas de cápside adenovirales se acoplaron a Affi-Gel (R) 15 (comercialmente disponible a partir de BioRad como el # de catálogo 1536051 ). Las proteínas de cápside adenoviral (hexon, penton, fibra y 3A) se purificaron mediante cromatografía de conformidad con las enseñanzas de Shabram, et al. anteriormente mencionado y se purificaron hasta la homogeneicidad utilizando cantidades conocidas de hexon (210 µg), penton (522 µg), fibra (146 µg) y 3A (105 µg) que se acoplaron al Affi-Gel (R) 15 de conformidad substancial con las instrucciones provistas por el fabricante. La eficiencia de acoplamiento se determinó como del 71 % aproximadamente mediante en ensayo de Bradford, (como se determinó por el usuario). El ensayo de Bradford se basa en colorante azul (Azul brillante de Coomassie) que se une a los grupos amino libres en la cadena lateral de los aminoácidos, especialmente de lisina y se llevó a cabo utilizando un equipo de ensayo para proteína Bio-Rad (comercialmente disponible a partir de Bio-Rad) que está substancialmente de conformidad con las instrucciones del fabricante.

EJEMPLO 3 Purificación de anticuerpos anti-adenovirales a partir de suero de animales PRIMED 200-1500 µl de suero obtenido a partir de animales cebados ZZCB preparado de manera substancialmente de conformidad con la enseñanza del ejemplo 1 anteriormente mencionado se introdujeron en la columna preparada a partir del ejemplo 2. El suero se dejó unirse a la columna de proteína de cápside adenoviral a cuatro grados por 2-4 horas con agitación suave. Si menos de 1000 µl de suero se utilizaba sobre la columna, el suero se diluía a 1000 µl con PBSv. El suero adsorbido a la columna Ad (referido como suero depletado de la columna) se recolectó a partir de la columna y los anticuerpos de cápside anti-adenoviral (referidos como Ad-Ab) se eluyeron a partir de la columna con glicina 0.2 M pH 2. Los anticuerpos obtenidos a partir de la columna se neutralizaron en 1/3 de volumen de Tris 1 M pH 8 y luego se dializaron subsecuentemente en PBS y se almacenaron. La concentración de anticuerpos depletados a partir del suero se cuantificó al utilizar el ensayo de Bradford. El ensayo neutralizante in vitro se llevó a cabo para mostrar que la remoción de anticuerpos anti-adenovirales disminuyó la actividad neutralizante del suero (figura 2). Los ensayos neutralizantes se llevaron a cabo mediante diluciones seriales del suero de interés (iniciando a una dilución de 1 :20 e incrementando en incrementos de 2, es decir, 1 :40, 1 :80, etc.) en un formato de 96 pozos. El suero diluido apropiadamente se deja incubar con un adenovirus recombinante (GFCB) que expresa la Proteína Verde Fluorescente (GFP) a una concentración final de 4 x 108 partículas /ml por 1 hora a 37°C. El suero, mezcla del virus se transfiere sobre células HeLa sembradas a 9 x 103/pozo en un formato de 96 pozos y el virus se deja que infecte las células durante toda la noche. La lectura fluorescente para GFP se evaluó aproximadamente 12 horas después utilizando un fluorómetro para evaluar la capacidad neutralizante.

EJEMPLO 4 Transducción del gen en la ausencia de anticuerpos neutralizantes: Para el procedimiento experimental para evaluar si la remoción de los anticuerpos anti-adenovirales incrementó la eficiencia de la transducción de los virus, 6 ratones se inmunizaron pasivamente con ya sea 40 µg de anticuerpos anti-adenovirales eluídos a partir de la columna de proteína rAd, o de cantidades equivalentes de la columna depletada o del suero no depletado. 5 ratones adicionales se inmunizaron pasivamente con suero inyectado con PBSv y dos ratones extra se inmunizaron pasivamente con 80 µg de anticuerpos anti-adenovirales eluídos a partir de la columna de proteína rAd. Pequeñas cantidades de suero se recolectaron individualmente a partir de cada ratón de 1-3 horas después de la inyección IP para determinar • *«» si la inmunización pasiva fue efectiva para cada ratón particular. Los ratones se dejaron descansar durante toda la noche. Al siguiente día, los ratones se inyectaron mediante una inyección en la vena de la cola con 5 x 1010 partículas de virus (BGCG). 5 BCGC se utilizó para la eficiencia de la transducción del virus que pudo monitorearse mediante la tinción para actividad ß-gal en los hígados. Dos horas después de la inyección del virus, los ratones se sangraron una segunda vez para recolectar suero para observar los niveles de anticuerpo neutralizante. Los ratones se sacrificaron 3 días después de la inyección del ío virus y tanto el suero como los hígados se hicieron a partir de cada ratón. El suero se analizó para actividad neutralizante (figura 4) y los hígados se ensayaron para actividad ß-gal como un indicador de la transducción exitosa del virus (figura 5). á?iJ A iJi^?SfcA ¿«J,t-*?fe.,

Claims (26)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN) REIVINDICACIONES

1.- Un método para reducir la concentración de anticuerpos antivirales en una muestra de plasma al poner en contacto dicho plasma aislado con un material cromatográfico de ¡nmunoafinidad que comprende un material de inmunoafinidad unido a un soporte cromatográfico de tal manera que los anticuerpos se retienen sobre el material de inmunoafinidad.

2.- El método de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el material de inmunoafinidad se selecciona a partir del grupo que consiste de Proteína A, Proteína G y una proteína de cubierta viral.

3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad es una proteína de cubierta viral de un adenovirus seleccionado a partir del grupo que consiste de hexon, penton, proteína IX, proteína IIIA de fibra, prominencia y base penton.

4.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad es Proteína A.

5.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad es Proteína G.

6.- Un método para reducir la concentración de anticuerpos antivirales en un organismo mamífero, dicho método comprende los pasos de: a) obtener una muestra de sangre a partir de dicho organismo mamífero; b) aislar el plasma a partir de los componentes celulares a partir de dicha muestra de sangre; c) poner en contacto dicho plasma aislado con un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende un material de inmunoafinidad acoplado a un soporte cromatográfico de tal manera que los anticuerpos se retienen sobre el material de inmunoafinidad; d) reintroducir los componentes celulares aislados a partir del paso (b) y el plasma purificado a partir del paso (c) al mamífero.

7.-EI método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad se selecciona partir del grupo que consiste de Proteína A, Proteína G y una proteína de cubierta viral.

8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad es una proteína de cubierta viral de un adenovirus seleccionado a partir del grupo que consiste de hexon, penton, proteína IX, proteína IIIA de fibra, prominencia y base penton.

9.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad es Proteína A.

10.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad es Proteína G. M? ¿¡ k. Jtit **?..AJaUÉhaMatA bÁÁa

1 1.- Un método mejorado para tratar un mamífero con un virus terapéutico, la mejoría comprendiendo reducir la concentración de anticuerpos antivirales en dicho mamífero antes de o en conjunción con la administración dicho virus terapéutico mediante: a) obtener una muestra de sangre a partir de dicho organismo mamífero; b) aislar el plasma a partir de los componentes celulares a partir de dicha muestra de sangre; c) poner en contacto dicho plasma aislado con un material cromatográfico de inmunoafinidad que comprende un material de inmunoafinidad acoplado a un soporte cromatográfico de tal manera que los anticuerpos se retienen sobre el material de inmunoafinidad; d) reintroducir los componentes celulares aislados a partir del paso (b) y el plasma purificado a partir del paso (c) al mamífero.

12.- El método de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque el virus terapéutico es un adenovirus.

13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el material de inmunoafinidad se selecciona a partir del grupo que consiste de Proteína A, Proteína G y un material SAVID.

14.- El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el adenovirus es un adenovirus con replicación deficiente.

15.- El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el virus expresa el gen supresor de tumor p53.

16.- El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado además porque el virus es A/C/N/53.

17.- El método de conformidad con la reivindicación 12» * «^^ caracterizado además porque el adenovirus es un adenovirus de replicación competente.

18.- El método de conformidad con la reivindicación 17, 5 caracterizado además porque dicho virus de replicación competente es un adenovirus de replicación condicionada.

19.- El método de conformidad con la reivindicación 19, « caracterizado además porque dicho virus de replicación condicionada comprende un promotor específico de tumor que dirige la expresión de un gen ío de adenovirus de reacción temprana.

20.-EI método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque dicho promotor específico de tumor es el promotor del antígeno específico de próstata.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 17, 15 caracterizado además porque dicho adenovirus de replicación competente contiene una deleción en el gen E1b-55K de manera que altera la capacidad ^ del producto del gen E1 B-55K para unir a p53. •

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque dicho virus es dl1520. 20

23.- Una composición de materia que comprende material cromatográfico de inmunoafinidad SAVID. "

24.- La composición de conformidad con la reivindicación 23, , & caracterizada además porque el material SAVID comprende una proteína de cubierta viral unida a un soporte cromatográfico.

25.- La composición de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque la proteína de cubierta viral es una proteína de cubierta viral de un adenovirus.

26.- La composición de conformidad con la reivindicación 25, caracterizada además porque la proteína de cubierta viral es una proteína que cubierta viral de un adenovirus seleccionada a partir del grupo que consiste de hexon, pento, proteína IX, proteína IIIA de fibra, prominencia y base penton. '-" - "*-**-* ' "llaMlTit l ll ^m^