FENIL-ALQUENOILGUANIDINAS SUBSTITUIDAS DEL ACIDO BILIAR, PROCESOS PARA SU PREPARACIÓN, SU USO COMO MEDICAMENTOS O AGENTES DE DIAGNOSTICO, Y MEDICAMENTOS QUE CONTIENEN LAS MISMAS
Las acilguanidinas substituidas, procesos para su preparación, su uso como medicamentos o agentes de diagnóstico, y medicamentos que las contienen. La invención se refiere a las acilguanidinas substituidas y sus sales tolerables farmacéuticamente y sus derivados funcionales fisiológicamente. Junto con un número de factores, la formación de cálculos biliares se determina esencialmente por la composición de la bilis, en particular por la concentración y la proporción del colesterol, los fosfolípidos y las sales biliares. Un pre-requisito para la formación de cálculos biliares de colesterol, es la presencia de la bilis supersaturada con colesterol (ref. Carey, M. C. y Small, D.M.
(1978) The physical chemistry of cholesterol solubility in bile. Relationship to gallstone formation and dissolution in man, J. Clin. Invest. 61: 998-1026). Hasta ahora, los cálculos biliares principalmente se han removido quirúrgicamente, de manera que existe la gran necesidad terapéutica de la disolución médica de los cálculos biliares y de la prevención de la formación de cálculos biliares . La invención está basada en la finalidad de hacer compuestos disponibles que sean capaces de prevenir la formación de cálculos biliares previniendo la supersaturación de la bilis con colesterol, o retardando la formación de cristales de colesterol a partir de la bilis supersaturada . La invención por lo tanto se refiere a los compuestos de la fórmula I
en la cual: TI y T2 independientemente entre sí son
o hidrógeno, en donde TI y T2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno;
A es un enlace, alquilo- (C1-C4) , alquilo- (C0-C4) -X; X es -0-, -C0-, -CH[0H]-, -CH[0CH]3-, -SO(0-2)- ó -NH-, -N(CH3)-; D es fenileno, el cual no está substituido o está substituido por 1 - 3 substituyentes seleccionados del grupo que consiste de F, Cl, -CF3, alquilo- (C?~C ) , hidroxilo, metoxi, -NH2, NHCH3, N(CH3)2, CH3S02- y H2N02S-; R(A), R(B), R(C), R(D), R(E), R(F) independientemente entre sí son hidrógeno, F, Cl, Br, I, CN, OH, 0R(6), NR(7)R(8), alquilo- (C?-C8) , 0-alquilo- (C?-C?2) , cicloalquilo- (C3- Cg) , es posible en los radicales alquilo que uno, dos o más o todos los hidrógenos sean reemplazados por flúor; R(6) es alquenilo- (C3-C6) , cicloalquilo- (C -C8) , fenilo o bencilo, en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi, NR(9)R(10) ;
R(9), R(10) independientemente entre sí son H, alquilo- (C1-C4) o perfluoro-alquilo- (C1-C4) ; R(7) y R(8) independientemente entre sí son alquilo- (C1-C4) , alquenilo- (C3-d) , cicloalquilo- (C3-C8) , fenilo o bencilo, en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi, NR(9)R(10) ; o R(7) y R(8) conjuntamente forman una cadena de 4 ó 5 grupos metiieno, de los cuales un grupo CH2 se puede reemplazar por oxígeno, azufre, NH, N-CH3 o N-bencilo; s es cero ó 1, x es cero, 1 ó 2; y es cero, 1 ó 2; R(l), R(2), R(3) independientemente entre sí son hidrógeno, F, Cl, Br, I, CN, -(C=0) -N=C(NH2)2, -SO (0-1) -alquilo- (Ci- C8) , O-alquilfenilo- (C0-C4) , alquilfenilo- (C0-C4) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi, alquilo- (C0-C4) - NR(21)R(22); alquilo- (C?-C8) , O-alquilo- (C?~C?2) , cicloalquilo- (C3- C8) , es posible en los radicales alquilo que uno, dos o más o todos los hidrógenos se puedan reemplazar por flúor;
R(21), R(22) independientemente entre sí son H, alquilo- (C1-C4) ; L es alquilo- (C1-C15) , es posible que uno o dos o más grupos (CH2) sean reemplazados por -CH=CH-, -C=C-, -0-, NR(47)-, -NR(48)-, -CO-, -S02-; R(47) es hidrógeno, alquilo- (C?-C8) , R(48)-CO-, fenilo, bencilo; R(48) es hidrógeno, alquilo- (C?-C8) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; R(40) a R(45) independientemente entre sí son H, -0 R(50), -S
R(50), NH R(50), -N R(50)2, -0- (CO) - R(50), -S- (CO) - R(50), -NH-(CO)- R(50), -0-P0- (0 R(50))-O R(50), -0- (S02)-0 R(50), - R(50), un enlace a L; o R(40) y R(41), R(42) y R(43), R(44) y R(45) en cada caso conjuntamente son el oxígeno de un grupo carbonilo; en donde siempre exactamente uno de los radicales tiene el significado de un enlace a L; R(50) es hidrógeno, alquilo- (C1-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; K es -0R(51), -NH(R51), -N(R51)2, -HN-CH2-CH2-C02H, -HN-CH2-CH2- S03H, -N(CH3) -CH2C02H, -HN-CH (R46) C02H, -OCat, en donde Cat es un catión, tal como, por ejemplo, un ion de metal alcalino o metal alcalinotérreo o un ion de amonio cuaternario; R(46) es hidrógeno, alquilo-C?-C4, bencilo, -CH2-OH,
H3CSCH2CH2-, H02CCH2-, H02CCH2CH2-; R(51) es H, alquilo- (C1-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el radical fenilo puede ser hasta trisubstituido por
F, Cl, CF3, metilo, metoxi; y sus sales tolerables farmacéuticamente y derivados funcionales fisiológicamente. Los compuestos preferidos son aquéllos de la fórmula I,
en los cuales uno o más radical (es) tiene o tienen el siguiente significado: TI y T2 independientemente entre sí son
o hidrógeno, en donde Ti y T2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno, L-Z es
A es un enlace, -CH2-, CH2-X-; X es -0-, -CO-, -CH[0H]-, -CH[0CH]3-, -SO(0-2)- ó -NH-,
N(CH3)-; s es cero ó 1; D es fenileno, el cual puede ser hasta disubstituido por F, Cl, -CF3, alquilo- (C?-C4) , hidroxilo, metoxi, -NH2,
NHCH3, N(CH3)2, CH2S02- y H2N02S-; R(E) es F, Cl, CN, 0R(12), alquilo- (C1-C4) , 0-alquilo- (CL-CI) , cicloalquilo- (C3~Cg) , es posible en los radicales alquilo que uno, dos o más o todos los hidrógenos sean reemplazados por flúor; R(6) es alquenilo- (C3-C6) , cicloalquilo- (C3-C8) , fenilo o bencilo, en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi, NR(9)R(10); R(9), R(10) independientemente entre sí son H, alquilo- (C1-C4) o perfluoroalquilo- (C?-C4) ; R(F) es hidrógeno; R(l), R(2), R(3) independientemente entre sí son hidrógeno, F, Cl, Br, I, CN, (C=0) N=C (NH2) 2, SO(0-?. -alquilo- (C?-C8) ,
O-alquilfenilo- (C0-C4) , alquilfenilo- (C0-C ) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F,
Cl, CF3, metilo, metoxi; L es alquilo- (C?-C8) , en donde uno o más grupos (CH2) pueden ser reemplazados por -CH=CH-, -C=C-, -O-,
-NR(47)-, -NR(48)-, -CO-, -S02-; R(47) es hidrógeno, alquilo- (C1-C4) , R(48)-CO-, fenilo, fenilo- (CH2) ; R(48) es hidrógeno, alquilo- (C1-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; R(41), R(42), R(45) independientemente entre sí son H,
-O R(50), -S R(50), NH R(50), -N R(50)2, -O- (CO) - R(50), -S-(CO)- R(50), -NH-(CO)- R(50), -O-PO- (O R(50))-O R(50), -0-(S02)-0 R(50), - R(50); R(50) es hidrógeno, alquilo- (C?-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trísubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; K es -OR(51), -NH(R51), -N(R51)2, -HN-CH2-CH2-C02H, -HN- CH2-CH2-S03H, N(CH3)CH2C02H, -HN-CH (R46) C02H, -OCat, en donde Cat es un catión, tal como, por ejemplo, un ion de metal alcalino o metal alcalinotérreo o un ion de amonio cuaternario; R(46) es H, alquilo-C?-C4, bencilo, -CH2-OH, H3CSCH2CH2-, H02CCH2-, H02CCH2CH2-; R(51) es H, alquilo- (C1-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el radical fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; y sus sales tolerables farmacéuticamente. Particularmente los compuestos preferidos son aquéllos de la fórmula I
en la cual uno o más radical (es) tiene o tienen el siguiente significado:
TI y T2 independientemente entre sí son
o hidrógeno, en donde TI y T2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno, L-Z es
A es un enlace, -CH2-, CH2-X-, -X-; X es -O-, -CO-, SO(0-2)-; es cero ó 1; D es fenileno, el cual puede ser hasta disubstituido por
F, Cl, -CF3, alquilo- (C?-C ) , hidroxilo, metoxi, -NH2,
NHCH3, N(CH3)2, CH2S02-, H2N02S-; R(E¡ es F, alquilo- (C1-C4) , es posible en los radicales alquilo que uno, dos o más o todos los hidrógenos sean reemplazados por flúor; R(F) es hidrógeno;
R(l), R(2), R(3) independientemente entre sí son hidrógeno, F,
Cl, CN, -S02-CH3, O-alquilfenilo- (C0-C?) , alquilfenilo- (C0-C?) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; L es alquilo- (C?~C8) , en donde uno o más grupos (CH2) pueden ser reemplazados por -CH=CH-, -C=C-; -0-,
-NR(47)-, -NR(48)-, -CO-, -S02-; R(47) es hidrógeno, alquilo- (C1-C4) , R(48)-CO-, fenilo, fenilo- (CH2) ; R(48) es hidrógeno, alquilo- (C?-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; R(41) es hidrógeno, -OH; K es -0R(51), -NH(R51), -N(R51)2, -HN-CH2-C02H, -HN-CH2- CH2-C02H, -HN- CH2-CH2-S03H, -N (CH3) CH2C02H, -OCat, en donde Cat es un catión, tal como, por ejemplo, un ion de metal alcalino o metal alcalinotérreo o un ion de amonio cuaternario; R(51) es H, alquilo- (C?-C4) , fenilo, fenilo- (CH2) , en donde el radical fenilo puede ser hasta trisubstituido por
F, Cl, CF3, metilo, metoxi; y sus sales tolerables farmacéuticamente. Muy particularmente los compuestos preferidos son aquéllos de la fórmula I
en la cual uno o más radical (es) tiene o tienen el siguiente significado : TI y T2 independientemente entre sí son
o hidrógeno, en donde TI y T2 no pueden ser simultáneamente hidrógeno, L-Z es
A es un enlace, -O-; es cero ó 1;
D es fenileno, el cual puede ser hasta disubstituido por F, Cl, -CF3, alquilo- (C?-C4) , hidroxilo, metoxi, N(CH3)2, CH2S02-, H2N02S-; R(E) es alquilo- (C1-C4) ; R(F) es hidrógeno; R(l), R(2), R(3) independientemente entre sí son hidrógeno, F, Cl, CN, -S02-CH3, O-alquílfenilo- (Co-Cx) , alquilfenílo- (C0-C1) , en donde el núcleo fenilo puede ser hasta trisubstituido por F, Cl, CF3, metilo, metoxi; L es alquilo- (C?-C6) , en donde uno o más grupos (CH2) pueden ser reemplazados por -CH=CH-, -C=C-; -O-, -NR(47)-, -CO-, -SO2-; R(47) es hidrógeno, alquilo- (C1-C4) ; R(41) es hidrógeno, -OH; K es -OH, -HN-CH2-C02H, -HN-CH2-CH2-C02H, -HN-CH2-CH2-SO3H, -N (CH3) -CH2C02H, -OCat, en donde Cat es un catión, tal como, por ejemplo, un ion de metal alcalino o metal alcalinotérreo o un ion de amonio cuaternario; y sus sales tolerables farmacéuticamente. Si el compuesto de la fórmula I contiene uno o más centros de asimetría, estos pueden tener ya sea la configuración S o la configuración R. Los compuestos se pueden presentar como isómeros ópticos, como diastereómeros, como racematos o como mezclas de los mismos. La geometría de doble enlace de los compuestos de la fórmula I, puede ser ya sea E o Z. Los compuestos se pueden presentar en la mezcla como isómeros de doble enlace. Los radicales designados de alcohol pueden ser ya sea ramificados o de cadena recta. La invención se refiere además a un proceso para la preparación del compuesto I (L-Z = acetileno-derivado de ácido biliar), caracterizado en que el compuesto de la fórmula II,
en donde TI, T2, R(l), R(2) y R(3) tiene el significado indicado anteriormente y G es reemplazable funcionalmente por L-Z, se hace reaccionar con un compuesto de la fórmula III de una manera conocida para la persona experta en la técnica. La funcionalidad G del compuesto I de la fórmula II puede tener, por ejemplo, el significado de bromo o yodo, puesto que por medio de la catálisis de Pd(0) de la manera conocida por la persona experta en la técnica se logra el enlace de unión C-C, deseado .
Catalizador Pd(0) base auxiliar solvente aprot., dipolar
Los derivados de acetileno-ácido biliar de la fórmula
III, se preparan a partir de las cetonas IV adecuadas, de ácido biliar, de acuerdo al esquema 1. Estos, a su vez, se pueden preparar a partir de los ácidos biliares V mediante los procesos conocidos de la literatura o se pueden obtener comercialmente. Con este fin, el acetiluro de litio se agrega a los ácidos ceto biliares del tipo IV de manera análoga a los procesos conocidos (US 5,641,767). Los derivados Illa de acetileno-ácido biliar, así obtenidos se desprotegen, dependiendo del tipo de grupos protectores utilizados, en un proceso de un recipiente, por ejemplo si X3, X4 = Oacilo, o en dos etapas, por ejemplo si X3, X4 = THP, para dar los compuestos Illb. La función del ácido carboxílico de b se puede convertir de acuerdo a los diferentes procesos conocidos en los esteres adecuados tales como, por ejemplo, bencilo, p-metoxibencilo, trimetilsililo o esteres t-butílicos del tipo IIIc.
Esquema 1
.JCtí?: IV
Despratección Acetileno Hidrólisis Base, p e , n-BuLi Ill a
III b» ni c En general, las alquenoilguanidinas I son bases débiles y se pueden enlazar al ácido con la formación de las sales. Las sales adecuadas de adición acida son sales de todos los ácidos tolerables farmacológicamente, por ejemplo haluros, en particular clorhidratos, lactatos, sulfatos, citratos, tartratos, acetatos, fosfatos, metilsulfonatos, p-toluensulfonatos . Los compuestos de la fórmula I son las acilguanidinas substituidas. Los compuestos de la fórmula (I) de acuerdo a la invención también pasan hacia el sistema hepatobiliar y por lo tanto actúan en estos tejidos. Por consiguiente la absorción de agua, por ejemplo, de la bilis se inhibe por la inhibición del antipuerto NHE típico del subtipo 3 del epitelio de la bilis, lo cual da como resultado un fluido biliar, diluido. El término "derivado funcional fisiológicamente" designa cualquier derivado tolerable fisiológicamente de un compuesto de la fórmula I de acuerdo a la invención, por ejemplo un éster que es capaz de administrarse a un mamífero, tal como, por ejemplo, un humano, (directa o indirectamente) de formar un compuesto de la fórmula I o un metabolito activo del mismo. Los derivados funcionales fisiológicamente también incluyen los profármacos de los compuestos de acuerdo a la invención. Tales profármacos se pueden metabolizar in vivo para dar un compuesto de acuerdo a la invención. Estos profármacos pueden en sí mismos ser activos o inactivos. Los compuestos de acuerdo a la invención también pueden estar presentes en varias formas polimórficas, por ejemplo como formas polimórficas cristalinas y amorfas. Todas las formas polimórficas de los compuestos de acuerdo a la invención, se incluyen en el alcance de la invención y son un aspecto adicional de la invención. A continuación, todas las referencias a "compuesto ( s) de acuerdo a la fórmula (I)", se refieren al (los) compuesto (s) de la fórmula (I) como se describe anteriormente, y sus sales, sulfatos y derivados funcionales fisiológicamente como se describe en la presente. La cantidad de un compuesto de acuerdo a la fórmula (I) que es necesaria para lograr el efecto biológico, deseado, depende de un número de factores, por ejemplo el compuesto específico elegido, el uso pretendido, la manera de administración y la condición clínica del paciente. En general, la dosis diaria está en el rango de 0.1 mg a 100 mg (típicamente de 0.1 mg a 50 mg) por día por kilogramo de peso del cuerpo, por ejemplo 0.1-10 mg/kg/día. Las tabletas o cápsulas pueden contener, por ejemplo, de 0.01 a 100 mg, típicamente de 0.02 a 50 mg. En el caso de las sales tolerables farmacéuticamente, los datos cuantitativos, antes mencionados, se refieren al peso del ion de aminopropanol derivado de las sales. Para la profilaxis o terapia de las condiciones antes mencionadas, los compuestos de acuerdo a la fórmula (I) se pueden utilizar como el compuesto mismo, pero preferiblemente los mismos están presentes con un portador tolerable en la forma de una composición farmacéutica. El portador debe, por supuesto, ser tolerable en el sentido que sea compatible con los otros constituyentes de la composición y no sea nocivo a la salud del paciente. El portador puede ser un sólido o un líquido o ambos y se formula preferiblemente con el compuesto como una dosis individual, por ejemplo como una tableta la cual puede contener desde 0.05% hasta 95% en peso del compuesto activo. Además las substancias activas farmacéuticamente de igual manera pueden estar presentes, incluyendo los compuestos adicionales de acuerdo a la fórmula (I). Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención se pueden preparar de acuerdo a uno de los métodos farmacéuticos, conocidos, el cual esencialmente consiste en mezclar los constituyentes con vehículos y/o excipientes tolerables farmacológicamente. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la invención son aquéllas que son adecuadas para administración oral y peroral (por ejemplo sublingual), aunque la manera más adecuada de administración en cada caso individual depende de la naturaleza y severidad de la condición a tratar y del tipo del compuesto de acuerdo a la fórmula I, utilizado en cada caso. Las formulaciones revestidas y las formulaciones revestidas de liberación retardada, también se incluyen en el alcance de la invención. Se prefieren las formulaciones entéricas y resistentes al ácido. Los revestimientos entéricos, adecuados, incluyen ftalato de celulosa-acetato, ftalato de polivinil-acetato, ftalato de hidroxipropilmetilcelulosa y polímeros iónicos de ácido metacrílico y metacrilato metílico. Los compuestos farmacéuticos, adecuados, para administración oral pueden estar presentes en unidades separadas, tales como, por ejemplo, cápsulas, capsuletas, grageas o tabletas, las cuales en cada caso contienen una cantidad específica del compuesto de acuerdo a la fórmula (I); como polvos o granulos; como una solución o suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o de agua en aceite. Como ya se ha mencionado, estas composiciones se pueden preparar mediante cualquier método farmacéutico, adecuado, el cual incluye una etapa en la cual el compuesto activo y el portador (que puede consistir de uno o más constituyentes adicionales) se ponen en contacto. En general, las composiciones se preparan por el mezclado uniforme y homogéneo del compuesto activo con un portador líquido y/o sólido finalmente dividido, después de lo cual el producto, si es necesario, se conforma. Por consiguiente, una tableta, por ejemplo, se puede preparar comprimiendo o conformando un polvo o granulos del compuesto, si es apropiado con uno o más constituyentes adicionales. Las tabletas comprimidas se pueden producir formando tabletas con el compuesto de forma libre, tal como, por ejemplo, un polvo o granulos, si es apropiado se mezcla con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte y/o uno (un número de) agentes de superficie activa/dispersantes en una máquina adecuada. Las tabletas conformadas se pueden producir conformando el compuesto pulverulento humedecido con un diluyente líquido, inerte, en una máquina adecuada. Las composiciones farmacéuticas que son adecuadas para administración oral (sublingual) incluyen grageas que contienen un compuesto de acuerdo a la fórmula (I) con un saborizante, usualmente sacarosa y goma arábiga o tragacanto, que incluye el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerol o sacarosa y goma arábiga.
Sección experimental Lista de abreviaturas: CH2C12 Diclorometano DCC Diciclohexilcarbodiimida DC1 Desorpción-ionización química DIP Éter di-i-propílico DME Dimetoxietano DMF N, N-Dimetilformamida EA Acetato de etilo (EtOAc) El impacto de electrones eq. Equivalente ES Rocío de electrones FAB Bombardeo acelerado de átomos HEP n-Heptano HOBT Benzotriazol-1-ol KOtBu 2-Metilpropan-2-olato de potasio
MeOH Metanol mp Punto de fusión MTB Éter t-butil-metílico RT Temperatura ambiente THF Tetrahidrofurano TOTU Tetrafluoroborato de 0-[(ciano- (etoxicarbonil) metilen) amino] -1,1,3,3- tetrametiluronio
Ejemplo 1 Acido 4-{3-[2-(2-{4-[2, 6-difluoro-4- ( 3-guanidino- 2-metil-3-oxopropenil) fenoxi] fenil } acetilamino) - etoxi] -7, 12-dihidroxi-10, 13-dimetil- hexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il}- pentanoico
a) Ácido 4- (7 , 12-dihidroxi-3-metansulfoniloxi-10, 13- dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il) - pentanoico Se disuelven 100 g de ácido cólico en 500 mi de piridina y 23.1 mi de cloruro de mesilo se agregan gota a gota a 0°C durante un periodo de 30 minutos. La mezcla se agita a RT durante 3 horas, luego se vierte a 0°C en una solución de 400 mi de H2S04 en 3 L de agua y se extrae 4 veces con 750 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S04 y el solvente se substrae in vacuo. El residuo se cristaliza utilizando éter diisopropílico y se obtienen 117.1 g; mp 121°C (con descomposición) . Rf (EA/HEP/ácido acético 5:5:1) = 0.31 MS (FAB): 487
b) 4- [7, 12-Dihidroxi-3- (2-hidroxietoxi) -10, 13- dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il] - pentanoato de metilo 116 g del ácido 4- (7, 12-dihidroxi-3-metansulfoniloxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il) -pentanoico y 130 mi de trietilamina se disuelven en 650 mi de glicol y la mezcla se agita durante 3 horas a 100°C y durante 7.5 horas a 115°C. La mezcla de reacción se verte en una solución ó 400 mi de H2S04 en 3 L de agua a 0°C y se extrae 7 veces con 750 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S0 y el solvente se substrae in vacuo. Se obtiene el intermediario ZWP. 130 mi de cloruro de acetilo se agregan gota a gota a 0°C a 900 mi de metanol. Una solución de ZWP en 400 mi se agregan entonces y la mezcla se agita durante 6 horas a RT . La mezcla se deja reposar durante 60 horas a RT, luego se verte en 2.6 L de agua y se extrae 8 veces con 500 mi de éter diisopropílico (DIP) cada vez. La fase orgánica se lava entonces unas 6 veces adicionales con 600 mi de una solución de NaHC03 acuoso, semisaturado . Se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando EA da 32 g de un sólido resinoso. Rf(EA) = 0.19 MS (FAB): 467 (M+H)+
c) 4-{ 3- [2- (1, 3-Dioxo-1, 3-dihidroisoindol-2-il) etoxi] - 7, 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclo- penta [a] fenantren-17-il }pentanoato de metilo 1.5 g de 4-{ 7, 12-Dihidroxi-3- (2-hidroxietoxi) -10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il] pentanoato de metilo, 950 mg de trifenilfosfina y 550 mg de ftalimida se calientan a 45°C en 26 mi de THF y 1.14 mi de azodicarboxilato de dietilo se agregan gota a gota a esta temperatura. La mezcla de reacción se agita durante 2 horas a 45°C, luego se verte en 200 mi de una solución de NaHC03 acuosa, semiconcentrada, y se extrae 3 veces con 200 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando éter t-butil-metílico (MTB) da 1.76 g de un aceite viscoso. Rf(EA) = 0.60 MS (FAB): 602 (M+Li)+ d) 4-{3- (2-Aminoetoxi) -7, 12-dihidroxi-10, 13- dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il] - pentanoato de metilo 1.7 g de 4- { 3- [2- ( 1, 3-dioxo-l, 3-dihidroisoindol-2-il) etoxi] -7 , 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclo-penta [a] fenantren-17-il }pentanoato de metilo y 0.52 mi de hidrato de hidrazina (80%) se disuelven en 14 mi de metanol y se hierven durante 3 horas bajo reflujo. La mezcla de reacción se enfría entonces a 40°C y se trata con 8.7 mi de una solución de HCl acuoso 2N. Se agita durante 30 minutos a 40°C, luego se substraen los constituyentes volátiles in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando acetona/agua 10:1 da 540 mg de un sólido resinoso. Rf (acetona/agua 10:1) = 0.06 MS (FAB): 466 (M+H) +
e) 4- (7, 12-Dihidroxi-3-{2- [2- (4-hidroxifenil) - acetilamino] etoxi } -10, 13-dimetilhexadecahidrociclo- penta [a] fenantren-17-il Jpentanoato de metilo 700 mg de 4- [3- (2-aminoetoxi) -7 , 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il] pentanoato de metilo, 230 mg de ácido 4-hidroxi-fenilacético y 305 mg de
HOBT se disuelven en 10 mi de THF y una solución de 342 mg de
DCC en 10 mi de THF se inyecta a 0°C. La mezcla se agita durante una hora a 0°C y luego durante 25 horas a RT . El 7
precipitado se filtra, el filtrado se diluye con 150 mi de una solución de NaHC03 acuoso al 10% y se extrae tres veces con 100 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando EA/MeOH 10:1 da 660 mg de un aceite incoloro . Rf(EA/MeOH 10:1) = 0.38 MS (FAB) : 600 (M+H)+
f) Acido 4- (7, 12-dihidroxi-3-{2-[2- ( 4-hidroxifenil) - acetilamino] etoxi }-10, 13-dimetilhexadecahidrociclo- penta [a] fenantren-17-il jpentanoico 620 mg del ácido 4- (7 , 12-dihidroxi-3- { 2- [2- ( 4-hidroxi fenil) acetilamino] etoxi} -10, 13-dimetilhexadecahidro-ciclopenta [a] fenantren-17-il }pentanoico se disuelven en 10 mi de MeOH y 3.1 mi de una solución de NaOH acuoso ÍN se agregan a RT . La mezcla se agita durante 25 horas a RT, se trata con 150 mi de una solución de HCl acuoso 2N y se extrae 3 veces con 100 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S0 y el solvente se substrae in vacuo. Se obtienen 630 mg de un producto contaminado con pequeñas cantidades de ácido acético, el cual se hace reaccionar sin purificación adicional. Rf (EA/MeOH 5:1) = 0.30 MS (ES): 586 (M+H) +
g) 2-Metil-3- (3, 4, 5-trifluorofenil) acrilato de etilo 4.3 mi de 2-fosfonopropionato de trietilo se disuelven en 30 mi de THF anhidro y 12.5 mi de una solución 1.6 N de n-butil-litio en hexano se agregan gota a gota a 0°C. La mezcla se agita durante 15 minutos a RT y una solución de 3.2 g de 3, 4, 5-trifluorobenzaldehído en 8 mi de THF anhidro se agrega entonces gota a gota. La mezcla se agita durante una hora a RT y se deja reposar durante 16 horas. La mezcla de reacción se diluye con 300 mi de agua, 30 mi de una solución de Na2C03 acuoso, saturado, se agregan y se extrae 3 veces con 100 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando EA/HEP 1:8 da 3.8 g de cristales incoloros; mp 54°C. Rf(EA/HEP 1:8) = 0.35 MS (DCI): 245 (M+H)+
h) 3-{4-[4-({2-[17-(3-Carboxi-l-metilpropil)-7,12- dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] - fenantren-3-iloxi] etilcarbamoil }metil) fenoxi] -3,5- difluorofenil } -2-metilacrilato de etilo 610 mg de Acido 4- (7 , 12-dihidroxi-3- { 2- [2- ( -hidroxifenil) acetilamino] etoxi} -10, 13-dimetilhexadecahidro-ciclopenta [a] fenantren-17-il) pentanoico, 232 mg de 2-metil-3- (3, 4 , 5-trifluorofenil) acrilato y 393 mg de K2CO3 se suspenden en 5 mi de DMF (anhidro) y la mezcla se agita durante 160 minutos a 150°C. Después de enfriar, la mezcla de reacción se toma utilizando 150 mi de una solución de HCl acuoso 2N y se extrae tres veces con 100 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S?4 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando EA/MeOH 10:1 da 480 mg de un producto resinoso. Rf (EA/MeOH 10:1) = 0.27 MS (ES): 810 (M+H) +
i) Acido 4-{3-[2- (2-{4-[2, 6-difluoro-4- (3-guanidino-2- metil-3-oxopropenil) fenoxi] -fenil }acetilamino) etoxi] - 7, 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta- [a] fenantren-17-il }pentanoico 311 mg de clorhidrato de guanidino se disuelven en 3 mi de DMF (anhidro) y una solución de 332 mg de KOtBu en 3 mi de DMF (anhidro) se agrega a RT . La mezcla se agita durante una hora a RT, luego se agrega una solución de 480 mg de 3-{4- [4- ( {2- [17- (3-carboxi-l-metilpropil) -7, 12-dihidroxi-10, 13-di etilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-3-iloxi] -etilcarbamoil }metil) fenoxi] -3,5-difluorofenil} -2-metil-acrilato de etilo en 3 mi de DMF (anhidro) . La mezcla de reacción se agita a 65 horas a RT y luego se diluye con 200 mi de agua. Se ajusta a pH = 7 utilizando una solución de HCl acuoso 4 N y se extrae tres veces con 150 mi de EA cada vez. El extracto se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo . La cromatografía sobre gel de sílice utilizando CH2Cl2/MeOH/acetona/agua/ácido acético 64:8:8:1:1 da 230 mg de un sólido amorfo. Rf (CH2Cl2/MeOH/acetona/agua/ácido acético 64:8:8:1:1) = 0.27 MS (ES) : 823 (M+H)+ El compuesto del Ejemplo 2 se prepara de manera a análoga a la del Ejemplo 1 a partir del ácido 4- (3-amino-7 , 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-ilpentanoico :
Ejemplo 2 Acido 4- [3- (2- { 4- [2, 6-difluoro-4- (3-guanidino-l- metil-3-oxopropenil) fenoxi] -fenil } acetilamino) - 7, 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclo- penta [a] fenantren-17-il] pentanoico
mp 190°C (con descomposición) Rf (CH2Cl2/MeOH/agua/ácido acético 32:8:1:1) = 0.36 MS (ES) : 779 (M+H) Ejemplo 3 Acido 4- (3- { 2- [ ( 4' -guanidinocarbonilbifenil-3- carbonil) amino] etoxi } -7 , 12-dihidroxi-10, 13- dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17- il Jpentanoico
a) 4-{ 3- [2- ( 3-Bromobenzoilamino) etoxi] -7, 12-dihidroxi- 10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17- il Jpentanoato de metilo 932 mg del 4- [3- (2-aminoetoxi) -7 , 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il] pentanoato de metilo (Ejemplo 1 d) y 402 mg del ácido 3-bromobenzoico se disuelven en 20 mi de DMF anhidro y primero 656 mg de tetrafluoro-borato de O- [ (ciano (etoxicarbonil) metilen) amino] -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio (TOTU) (Proceedmgs of the 21st European Peptide Symposium, Peptides 1990, Editors E. Giralt y D. Andreu, Escom, Leiden, 1991) y luego 760 µl de N-etilmorfolina se agrega a 0°C. La mezcla de reacción se agita durante 20.5 horas a RT y luego se verte en 100 mi de una solución de NaHC03 acuoso al 10%. La mezcla se extrae 3 veces con 150 mi de EA cada vez. Se seca sobre Na2S0 y el solvente se substrae in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando EA da 610 mg de un aceite viscoso.
b) Acido 4-{ 3- [2- (3-Bromobenzoilamino) etoxi] -7, 12- dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] - fenantren-17-il } pentanoico 600 mg de 4- { 3- [2- (3-bromobenzoilamino) etoxi] -7 , 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17-il }pentanoato de metilo se disuelven en 19 mi de metanol y se agregan 4.6 mi de una solución de NaOH acuoso ÍN. La mezcla se agita durante 6 horas a RT, luego se verte en 150 mi de una solución de HCl acuoso 2N y se extrae 4 veces con 150 mi de MTB cada vez. El extracto se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. Se obtienen 550 mg de un aceite viscoso, el cual se emplea además tal cual. Rf (EA/MeOH 5:1) = 0.46 MS (ES): 635 (M+H) +
c) { 3' - [2- [17- (3-Carboxi-l-metilpropil) -7 , 12-dihidroxi- 10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-3- iloxi } etilcarbamoil }bifenil-4-carboxilato de etilo 540 mg del ácido 4- { 3- [2- (3-bromobenzoilamino) etoxi^ 7, 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] -fenantren-17-il }pentanoico, 4-dihidroxi-borilbenzoato de etilo, 9.6 mg de acetato de Pd(II) y 22.3 mg de trifenilfosfina se disuelven en 5.1 mi de tolueno y 1.4 mi de etanol y se agregan 425 µl de una solución de NaC03 acuoso 2N. La mezcla se somete a reflujo durante 3 horas, luego se agregan 33.8 mg adicionales de 4-dihidroxiborilbenzoato y se agregan 425 µl de una solución de Na2C03 acuoso 2 N y se somete a reflujo de nuevo durante 1 hora 35 minutos, se agregan 33.8 mg de 4-dihidroxilbenzoato y 425 µl de una solución de a2C03 acuoso 2N de nuevo y la mezcla se somete a reflujo durante unas 4 horas 40 minutos adicionales. Después de enfriamiento, la mezcla de reacción se toma con 150 mi de una solución de HCl acuoso 2N y se extrae 4 veces con 100 mi de EA cada vez. Se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando MTB/ácido acético al 2% da 510 mg de una espuma incolora. Rf (MTB/ácido acético al 2%) = 0.21 MS (ES): 635 (M+H) +
d) Acido 4- (3-{2- [ (4' -guanidinocarbonilbifenil-3- carbonilamino) etoxi] -7, 12-dihidroxi-10, 13- dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-17- il Jpentanoico 115 mg de clorhidrato de guanidino se disuelven en 2 mi de DMF anhidro y se agrega una solución de 122 mg de t-butóxido de potasio en 2 mi de DMF anhidro a RT . La mezcla se agita a RT durante 1 hora y luego se agrega una solución de 150 mg de { 3' - [2- [17- (3-carboxi-l-metilpropil) -7 , 12-dihidroxi-10, 13-dimetilhexadecahidrociclopenta [a] fenantren-3-iloxi } etilcarbamoil }bifenil-4-carboxilato de etilo en 3 mi de DMF anhidro. La mezcla de reacción se agita durante 4 días y 2 horas a RT, luego se trata con 35 mi de agua y se ajusta a pH = 6.5 utilizando una solución de HCl acuosa. La mezcla se agita durante 1 hora y luego se precipita la parte principal del producto. El filtrado se extrae 3 veces con 100 mi de EA cada vez. Se seca sobre Na2S04 y se substrae el solvente in vacuo. La cromatografía sobre gel de sílice utilizando CH2Cl /MeOH/acetona/agua/ácido acético 64:8:8:1:1 da 60 mg de un sólido amorfo. Rf (CH2Cl2/MeOH/acetona/agua/ácido acético 64:8:8:1:1) = 0.13 MS (ES): 635 (M+H)+ La absorción de agua de la bilis se inhibe mediante la inhibición del antepuerto NHE apical del subtipo 3 del epitelio de la bilis, el cual da como resultado un fluido biliar, diluido. El fluido biliar, diluido, previene la formación de cálculos biliares y en el caso de los cálculos biliares que ya están presentes lleva casi a su disolución. La inhibición del antepuerto NHE del subtipo 3 mediante los compuestos de la fórmula I de acuerdo a la invención, se determina por medio de la siguiente prueba. La mayoría de las técnicas de biología molecular, siguen los protocolos de los trabajos "Current Protocols in Molecular Biology (eds. Ausubel, F.M., Brent, R., Kingston, R.E., Moore, D.D., Seidman, J.G., Smith J.A., y Struhl, K. , John Wiley & Sons)" y: "Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook, J. , Fritsch, E.F. y Maniatis, T.; Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))". En el transcurso de nuestros estudios, se produjeron líneas celulares, transíectadas establemente, las cuales en cada caso expresaron uno de los siguientes subtipos NHE: NHE 1 de humano (Sardet et al., Cell 56, 271-280 (1989), NHE 2 de conejo (Tse et al.; J. Biol. Chem. 268, 11917 - 11924 ó (1993)) o NHE 3 de rata (Orlowski et al.; J. Biol. Chem. 267, 9331-9339 (1992)), NHE 3 de humano (Braut et al; Am. J. Physiol. 269, 198-206 (1995)). Después de la adición de las secuencias de enlace, adecuadas, los clones ADNc de los subtipos NHE respectivos, obtenidos por el Prof. Pouysségur, se clonaron en el plásmido de expresión pMAMneo (obtenible, por ejemplo, a través de CLONTECH, Heidelberg) tal como la secuencia de reconocimiento del NHE 1 del plásmido de aproximadamente 20 - 100 pares base, delante del codón de inicio del subtipo NHE respectivo y la secuencia de codificación completa está presente en el constructo . Utilizando el "método de fosfato de calcio" (descrito en el capítulo 9.1 de "Current Protocols in Molecular Biology") , la línea celular LAP 1 deficiente en NHE (Franchi et al.; Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83, 9388-9392 (1986)), se transfecta con los plásmidos que contienen las secuencias de codificación, respectivas, de los subtipos NHE. Después de la selección de las células transfectadas por medio del crecimiento en el medio que contiene G 4/8 (solamente las células que han recibido un gen neo por medio de la transfección, pueden sobrevivir bajo estas condiciones), la selección se hace para la expresión del NHE funcional. Para esto, se utiliza la técnica de "Carga de ácido" descrita por Sardet (Sardet et al., Cell 56, 271-280 (1989)). Las células que expresan un subtipo NHE funcional pueden compensar la acidificación que toma lugar en esta prueba aún en la ausencia de C02 y HC0-, sin embargo esto no se puede con las células LAP1, no transfectadas. Después de repetir un número de veces la selección de la "Carga de Acido", las células sobrevivientes se inoculan en las placas microtituladoras tal como estadísticamente se presenta una célula por pozo. Las poblaciones celulares de las colonias individuales se investigan entonces con respecto a su capacidad de sobrevivencia después de la "Carga de Acido", utilizando el equipo de proliferación XTT (Boehringer Mannheim). Las mejores líneas celulares se utilizan para las pruebas adicionales y, para evitar una pérdida de la secuencia transfectada, se cultivan bajo presión de selección, continua, en el medio que contiene G418. Para la determinación de los valores IC50 para la inhibición de los subtipos NHE individuales por las substancias específicas, se modifica ligeramente una prueba desarrollada por S. Faber (Faber et al.; Cell. Physiol. Biochem. 6, 39-39 (1996)), que está basada en la técnica de "Carga de Acido". En esta prueba, la recuperación del pH intracelular (pHi) se determina después de una acidificación que comienza en el caso del NHE funcional aún bajo condiciones libres de bicarbonato. Para esto, el pHi se determina utilizando el tinte fluorescente BCECF sensible al pH (Calbiochem, se emplea el precursor BCECF-AM) . Las células primero se cargan con BCECF. La fluorescencia BCECF se determina en un espectrómetro de índice de fluorescencia" (Photon Technology International, South Brunswick, N. J. , USA) en longitudes de onda de excitación de 505 y 440 nm y una longitud de onda de emisión de 535 nm y se convierte en el pHi por medio de las curvas de calibración. Desviándose del protocolo descrito, las células se incuban en un amortiguador NH4C1 (pH 7.4) aún durante la carga de BCECF (amortiguador NH4C1 : NaCl 115 mM, NH4C1 20 mM, KC1 5 mM, CaCl2 1 mM, MgS04 1 mM, Hepes 20 mM, glucosa 5 mM, 1 mg/ml de BSA; un pH de 7.4 se ajusta utilizando NaOH 1 M) . La acidificación intracelular se induce por la adición de 975 µl de un amortiguador libre de NH4CI a alícuotas de 25 µl de las células incubadas en el amortiguador NH4C1. Se registra la subsecuente velocidad de la recuperación del pH, 2 minutos en el caso del NHE1, 5 minutos en el caso del NHE2 y 3 minutos en el caso del NHE3. Para el cálculo de la potencia inhibidora de la substancia probada, primero se investigan las células en los amortiguadores en los que toma lugar o no una recuperación completa del pH en absoluto. Para la recuperación completa del pH (100%), se incuban las células en el amortiguador que contiene Na+ (NaCl 133.8 mM, KC1 4.7 mM, CaCl2 1.25 mM, MgCl2 1.25 mM, K2HP02 0.97 mM, KH2P04 0.23 mM, Hepes 5 mM, glucosa 5 M, se ajusta un pH de 7.0 utilizando NaOH 1 M) . Para la determinación del valor de 0%, las células se incuban en un amortiguador libre de Na+ (cloruro de colina 133.8 mM, KC1 4.7 mM, CaCl2 1.25 mM, MgCl2 1.25 mM, K2HP02 0.97 mM, KH2P04 0.23 mM, Hepes 5 mM, glucosa 5 mM, se ajusta un pH de 7.0 utilizando NaOH 1 M) . Las substancias a probarse se preparan en el amortiguador que contiene Na+. La recuperación del pH intracelular en cada concentración probada de una substancia, se expresa en el porcentaje de la recuperación máxima. El valor IC50 de las substancias respectivas para los subtipos NHE individuales, se calcula a partir de los valores porcentuales de la recuperación del pH por medio del programa SigmaPlot. Los resultados de la inhibición del intercambiador de Na+/H+ humano (subtipo 3; NHE-3) :
Ejemplo (ver sección exp.) Actividad residual a 30 uM
1 17% 2 10% 3 65% Es evidente a partir de los datos medidos que los compuestos de la fórmula I de acuerdo a la invención, inhiben el antepuerto NHE hasta un 65%.