MXPA01010886A - Metodo para detectar y eliminar celulas cancerosas epiteliales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion describe un metodo de diagnostico para detectar celulas epiteliales cancerosas marcando selectivamente la mitocondria de las celulas cancerosas mediante la liberacion al epitelio de un agente marcador mitocondrial supravital cationico, La eliminacion selectiva de celulas epiteliales cancerosas en presencia de celulas normales se efectua mediante la liberacion de un agente marcador mitocondrial supravital cationico, a las celulas de cancer epitelial. El agente de eliminacion puede comprender tambie1n del producto de reaccion del agente marcador y un medicamente quimioterapeutico contra el cancer o en mezcla con el medicamento.

Description

MÉTODO PARA DETECTAR Y ELIMINAR CÉLULAS DE CÁNCER EPITELIALES Solicitud Relacionada Esta solicitud es una continuación en parte de la Solicitud Internacional copendiente, PCT /US00/05387 presentada eJ 28 9 febrero de 2000, titulada "Método para Detectar y Eliminar Células de Cáncer Epiteliales" 10 Campo de la Invención Eeta invención se relaciona con métodos para detectar cáncer epitelial En otro aspecto, la invención pertenece a métodos para eliminar selectivamente células epiteliales 15 de cáncer En un aspecto adicional, la invención se relaciona con métodos para detectar células de cáncer • epiteliales en presencia de células normales yo para eliminar selectivamente dichas células, en donde la 20 mitocondria de células de cáncer retiene un agente de marcado mitocondpal durante un tiempo suficiente para permitir la identificación y/o eliminación de dichas célul s 25 Def íp iciones ?t_?_?__i_i-nr^*-•"^^- Como ST utilizan en la presente, los siguientes términos tienen los significados indicados "Células de cáncer" o "cancerosas se utilizan en el sentido amplio para incluir células de cáncer mvasoras células de cáncer m situ y células severamente cisplasticas 'Agente de marcado mi tocondrial " significa un compuesto que se absorbe selectivamente por la mitocondria de células de cáncer v?-.as y se retiene selecti amente en las células de cáncer durante un tiempo suficiente para permitir la identificación y/o eliminación o mcapací tación de las mismas "Eliminación" de células significa ya sea ocasionar Ja muerte de célula apoptosis o cambios de célula que hacen a una célula incapaz de reproducción y metastacion "Aducto" significa el producto de reacción, ya sea covalente o no covalente de un agente de marcado mi tocondrial y un agente quimioterapeuti co de cáncer "Adyuvante" significa un agente de marcado mitocondpal que en combinación con otro agente quimioterapéutico ocasiona eliminación mejorada de células de cáncer ya sea sinergisticamente o mediante efectivos aditivos con el otro agente Antecedentes de la Invención Los procedimientos de diagnóstico en vivo para detectar lesiones epiteliales malignas y premalignas o carcinomas, que emplean composiciones de tinte que "colorean" selectivamente los tejidos que son anormales debido a displasia hiperplasia tumopgenesis y otras lesiones de superficie activas se conocen en el ramo Estos métodos de diagnóstico emplean un tinta que imparte color a un substrato canceroso que luego es detectable bajo luz a longitudes de onda visibles o un tinte fluorescente que imparte colocar al substrato que luego es detectable cuando se ilumina por luz a longitudes de onda fuera del espectro visible Por ejemplo los procedimientos que emplean fluoresceíra y derivados de fluoresceína se describen en Chenz Chínese Journal of Stomatology (2? 4 4 -4 '' (1992)) y Fiiupr f Stomatologna írusaj 72 4 4 - 47 ( 1 y'j 3 ) j Estos procedimientos involucran aplicación del colorante seguido por examen bajo luz ultravioleta para detectar el tejido canceroso/'precanceroso , que es selectivamente fluorescente Otro procedimiento del ramo anterior involucra enjuagar el epitelio con azul de toluidina I.J. seguido por examen visual normal para detectar cualquier • tejido selectivamente manchado Estos procedimientos se describen por ejemplo en las Patentes a Burkett (E U A 6 036 852) Tucci (E U A 5,372 301) y Mashberg (E U A 4 321 251) El uso de otros tintes de tiazina y colorantes de oxazina en una manera análoga se describe en la Patente de E U A 5 882 62 ^ a Pomerantz Hasta ahora se había hecho teoría de que dicho te ido canceroso selectivamente "marcado" con colorantes 10 se debe que el colorante se retenía en los espacios intersticiales relativamente mayores entre las células de tejido canceroso y no penetraban eficientemente las juntas mtracelulares más estrechas de tejido normal ni se retenían selectivamente en dichos espacios -*--> relativamente menores Contrario a la creencia de que el azul de mk, toluidma marca selectivamente tejido epitelial canceroso debido a que se retiene selectivamente en los espacios intersticiales relativamente mayores entre células de 20 cáncer el mecanismo de dicho manchado selectivo de tejido epitelial por colorantes cationicos, v gr , colorantes tales como rodamma, fluoresceina oxazina y colorantes de tiazma (incluyendo azul de toluidnaj y otros agentes marcadores supraví ales catiónicos es la 25 admisión selectiva v retención selectiva del agente en la mitocondria de células de cáncer. Esta admisión y retención mitocondrial selectiva se debe aparentemente al potencial eléctrico superior (carga negativa en el interior de la membrana) de mito'condria de células cancerosas en comparación con mitocondria de células normales Ver, por ejemplo, Chen y col., Cáncer Cells 1/The Transformed Phenotype, 75-85 (Cold Spring Harbor Laboratory, 1984); Lampidis, y col.. Cáncer Research 43, 716-720 (1983) De hecho. el marcado selectivo de células de cáncer por, y la retención en la mitocondria de células de cáncer, de colorantes catiónicos supravitales y otros agentes marcadores catiónicos supravi tale , están relacionados a 'una de las mismas características de las células de cáncer que parece ser responsable por su rápido crecimiento de clonación y capacidad de hacer metástasis, a decir, el potencial eléctrico superior de la mitocondria de células de cáncer es la fuente de energía celular y es la fuerza de impulsión para producción de ATP (trifosfato de adenosina) por las células Compendio de la Invención Hemos descubierto ahora un método para detección en vivo de células cancerosas epiteliales mediante el marcado selectivo de la mitocondria de las mismas • En otro aspecto, hemos descubierto un método terapéutico para eliminar selectivamente células ce cáncer en presencia de células normales Nuestros métodos de detección comprenden los pasos de entregar un agente de marcado mitocondpal supravital catiomco a tejido en la ubicación del sitio canceroso sospechoso en el epitelio (que contiene células • tanto normales como cancerosas i ocasionando de esta 10 manera que el agente sea absorbido y retenido selectivamente en la mitocondpa de las células de cáncer Las células cancerosas son entonces detectables mediante cualquier método apropiado, por ejemplo examen instrumental o visual ba o luz visible o bajo luz de 15 longitudes de onda invisibles seleccionadas En una modalidad adicional después de que el agente de marcado se absorbe por la mitocondpa se aplica un reactivo de enjuague a la ubicación del sitio canceroso sospechoso, mejorando de esta manera el régimen 20 de liberación del agente a partir de la mitocondria de las c lulas normales y aumentando adicionalmente la selectividad de los métodos de diagnostico De conformidad con otra modalidad importante de la invención proporciona os un método para eliminar 25 selectivamente células cancerosas epiteliales que comprende el paso de poner en contacto las células • cancerosas en la ubicación de un sitio que se sospecha canceroso con un agente de marcado mitocondrial supravital catiónico, para ocasionar l a muerte de la célula o hacer a las células de cáncer substancialmen te incapaces de multiplicación El agente de marcado se puede entregar a las células de cáncer en una sola dosis discreta o continuamente, o en dosis discretas • repetidas, con o sin el uso de un reactivo de enjuague 10 después de cada dosis En una modalidad adicional de la invención proporcionamos un método para mejorar la selectividad y capacidad de eliminación de célula de cáncer de agentes quimioterapéut icos de cáncer que comprende los pasos de 15 (1) formar un producto de reacción de un agente supravitai cationico y un agente quimioterapéut ico y entregar el producto de reacción de células epiteliales cancerosas o bien (2) combinar el agente supravital cat iónico con un agente qui ioterapéutico de cáncer para 20 mejorar la selectividad o capacidad de eliminación del agente quimioterapeut ico , ya sea mediante efectos aditivos o smergist icos , o ambos Estas otras y modalidades adicionales de la invención se harán evidentes a aquellos experimentados en 25 el ramo y un mejor entendimiento de la invención se obtendrá de los siguientes ejemplos que se proporcionan • para ilustrar la invención y no como indicaciones del alcance de la misma que se define solamente mediante las reivindicaciones anexas En la práctica de la invención y en los siguientes ejemplos de trabajo, los agentes de marcado mi tocondr íales supravitales catiónicos. incluyen colorantes, incluyendo azul de toluidma O, ^ azul alciano verde malaquita, fenosa franina 10 acri flavina, pi ónina gamma azul de tolulleno y verde brillante y compuestos "sin tinte", que incluyen peonidma oxitiamma yoduro de tiemomo, acetato de 15 eliptinio y cloruro de furasolio De conformidad con la modalidad actualmente ^ preferida de la invención, los agentes de marcado mitocondriales preferidos son coiorantes o tintes de la clase de oxazina y tiazina Los tintes de tiazina son 20 especialmente preferidos particularmente azul de foluidma O Acurre A, Azufre B y análogos de substitución de anillo y -substitución de los mismos A fin de ser selectivamente absorbidos y retenidos en la mitocondria de célula de cáncer el 25 agente de marcado o producto de reacción de agente de marcado + agente quimio terapéutico deben tener un peso • molecular de menos de aproximadamente 5 000 Además debido a las marcadas diferencias en el marcado selectivo y actividad terapéutica de diversos análogos estrechamente relacionados parece que la estructura molecular del agente de marcado afecta significativamente su capacidad de marcar selectivamente y/o eliminar las células de cáncer vivas en presencia de células vivas • normales Estas diferencias en el marcado de célula y capacidad de eliminación están relacionadas par 11 cu laricades estructurales v gr ubicación y tipo de subst i uyentes de anillo y N-substi tuyentes de las moléculas de agente de marcado que implican uno o mas o todos de los siguientes mecanismos de acción 15 1 - La estructura de la molécula de agente de marcado v gr posición y naturaleza de los • substi tuyentes de anillo y 1. en la molécula catiónica afecta la disponibilidad de la carga positiva e impide la capacidad del agente de marcado o grupos 'apilados' de 20 los mismos que sean atraídos por las cargas negativas en las membranas mi tocondpales o dentro de la mitocondria 2 - La estructura de la mol?cula de agente de marcado le permite intercalarse hacia o 'apilarse" a lo largo del exterior del DMA mitocondnal de células de 25 c ncer 3 - La estructura de la molécula de agente de • marcado le permite o a grupos apilados de los mismos ligarse a sitios actives específicos, v gr , cuatro proteínas especificas, en la mitocondria, y/o precipitarse con cardiolipina en la superficie interna de la membrana mitocondpal 4 - La estructura del agente de marcado afecta su potencial de reducción y su tendencia a cambiar a la • forma "leuco" no cargada 10 5 - La estructura del agente de marcado afecta su acidez ( p ) y, a su vez, la capacidad del agente de marcado cationico de desprotonar a pH fisiológico De esta manera la forma catiónica del colorante se puede atraer a la superficie externa de la membrana 15 mitoeondpal después de lo cual el catión de tinte puecte perder un protón y perder concomitantemente su carga • positiva liberando de esta manera la forma neutral del colorante, que puede penetrar más fácilmente en la matriz no polar de la membrana y ganar acceso al interior del 20 mi tocondno Las interacciones mtermoleculares de los mecanismos 2 (colorante-membrana), 2 (par a base de colorante o colorante-colorante), y 3 (protema de colorante o lipido de colorante) dependen de la 25 h?drofob?c?dad-1 ipof ilicidad del colorante, que se puede determinar por varios medios uno de los cuales es el • coeficiente de división entre la solución acuosa y un solvente orgánico de baja polaridad, tal como 1-octanol (es decir, valores log P) Los mecanismos 4 y 5 dependen de la hidrofob?c?dad-1 ipof ílicidad debido al efecto de la solvatación diferencial de reactivo y producto en la reducción potencial (formas oxidada vs reducida) y pK (formas neutra vs cargadas) Por ejemplo, la hidrofobicidad impide la solvatacion de aminas alifáticas 10 terciarias protonadas (R3NH) disminuyendo de esta manera su acidez relativa a aminas secundarias (R2NH- j De conformidad con la modalidad actualmente preferida de la invención se emplea un agente de marcado supravital cationico que tiene un log P de alrededor de 15 -1 0 a aproximadamente 5 Los siguientes ejemplos se presentan para • permitir a aquellos experimentados en el ramo entender y practicar l a invención e identificar la modalidad actualmente preferida Estos ejemplos son para 20 propósitos ilustrativos solamente y no se pretenden para limitar el alcance de la invención, que se define solamente por las reivindicaciones anexas Ejemplo 1 25 Absorción y Retención de Agentes de Marcado Mi tocondpales en Células Vivas de Carcinoma • Diferentes concentraciones de los diversos agentes de marcado catiónicos, se preparan a 100, 50, 10 y 1 ug/ml en medio PPMI completo con 20% de suero de becerro fetal 1 mM de glutamina hidroco tisona insulina tran ferpna , estradiol selecio y hormona del crecimiento Las células de carcinoma se incuban a 37EC en incubadoras de cultivo de tejido con 50% de CQ2 y 95% de 10 humedad relativa durante 5 minutos con cada agente y concentración ahí y luego se enjuagan dos veces utilizando incubaciones de 2 minutos con 1% de ácido acético Después de la incubación y enjuague, las células se cosechan, a 30 mm 1 hora, 2 horas, 4 horas 15 y 8 horas Las células se extraen luego con 2-butanol y se analizan mediante espectrofotometría y cuanti f icación (Q < del agente de marcado Los resultados muestran que existe una dependencia en concentración en el régimen de acumulación 20 de agente de marcado en la mitocondpa de ambas, células de carcinoma y normales y en la selectividad de liberación del agente de marcado de las células de cáncer pero esta dependencia en concentración empieza a hacerse menos pronunciada La concentración de 25 saturación para azul de toluidma O ocurre a • -*»»-'***"" concentración de 10 ug/ml y superiores. Las concentraciones de saturación para los otros agentes de marcado se determinan de manera similar, Los experimentos restantes se conducen con una concentración de 10 ug/ml para azul de toluidina O y a las concentraciones de saturación para los otros agentes de marcado así determinados, a menos que se especifique de otra manera, • Ejemplo 2 10 Localización Mitocondriaí de los Agentes en Células Vivas Después de la incubación y enjuague de diversas líneas de célula utilizando los diferentes agentes de marcado catiónicos, la localización itocondpal de los agentes se analiza utilizando microscopía de resolución 15 elevada confocal y microscopía de contraste de fase. Las células vivas, se cultivan en medio de • crecimiento completo con 20% de suero ele becerro fetal y factores de crecimiento y se mantienen a 37EC. Estas células se acumulan y retienen los agentes de marcado en 20 la mitocondpa Cuando estas células se mantienen luego en un medio libre de agente, las células de carcinoma retienen el agente durante más tiempo de aproximadamente 1 hora, pero las células epiteliales liberan el agente dentro de aproximadamente 15 minutos. 25 En contraste con las células vivas, las células ^^?i^^^gfegg^^^^^ muertas o células tratadas con agentes que disipan el • potencial de membrana mitocondpal pierden el manchado mitocondpai y acumulan los agentes en el núcleo E emplo _• Liberación de los Agentes de Mitocondpa con Disipación del Potencial de membrana Mitocondrial Los agentes conocidos que alteran el potencial • eléctrico mitocondrial se utilizan para tratar 10 previamente células de cáncer epiteliales, seguido por tratamiento con los agentes de marcado mi tocondriales supravitales catiónicos Estos agentes de tratamiento previo incluyen preparaciones de azida y cianuro y dini t rofenol 15 Las células de cáncer epiteliales también se manchan previamente con los diversos colorantes y luego ^ se tratan posteriormente con estos agentes conocidos La liberación de los colorantes de las células o la transferenci de los colorantes a otros compartimentos 20 subcelulares incluyendo el núcleo se analiza Las células previamente tratadas con estos agentes no acumulan colorantes en la mitocondpa y la mitDcondpa de las células previamente manchada libera el colorante durante el tratamiento posterior con estos 25 agentes Ejemplo 4 Explantes de Tejido de Carcinomas Escuamosas Explantas frescas de carcinomas epiteliales resectados se analizan para absorción y retención de agente de marcado Después de la resección, los carcinomas se microd ísectan del tejido circundante, se cortan en secciones de _ mm y se mantienen como cultivos de tejido de explanta a 37aC Estas explantas luego se incuban con los diversos agentes y luego se extraen para cuanti f icacion del agente Los carcinomas orales (SqCHN) tienen absorción rápida y retención prolongada de estos agentes Los agentes empiezan a ser liberados de las células después de aproximadamente una hora de cultivo en medio libre de agente Sin embargo los agentes se liberan más rápidamente cuando las células se incuban en medio que no contiene factores de crecimiento suero de becerro fetal y otros aditivos de medio Los agentes también se liberan mas rápido cuando las c lulas se desarrollan en condiciones adversas tales como las temperaturas ín ferlores Ejemplo 5 Explantas ae Tejido de Células Normales Epiteliales Células obtenidas quirúrgicamente de áreas normales del epitelio oral se cultivan como cultivos • epiteliales normales Estos cultivos luego se incuban con los agentes de mercado para análisis de la absorción y retención de agente A diferencia de las células de carcinoma, las células epiteliales normales liberan rápidamente los agentes de su mitocondpa y de la célula mucho más rápido En 10-15 minutos, la mayor parte del agente se • libera de la mitocondpa 10 Ejemplo 6 Aductos de Agente Marcador-Agente Quimioterapóutico En lugar de los agentes de los Ejemplos 1-5. los siguientes aductos de agentes marcadores 15 mi tocondr íales catiónicos y diversos agentes quimioterapeut icos conocidos se emplean con resultados • substancialmente similares, excepto que el régimen de exterminio de célula de cáncer y selectividad del agente qumuoterapeut ico se mejoran substancialmente 20 Agente Marcador Agente Quimioterapéut ico azul de toluidma O metot exato rodamina 123 mostaza de nitrógeno 25 Ejemplo !_>-_."__________ Composiciones Adyuvantes Las siguientes combinaciones de quimioterapeuticos de cáncer con agentes marcadores mi tocondriales exhiben efectos sinergisticos o cuando menos efectos de eliminación de célula de cáncer de aditivo Quimioterapeutico Agente Marcador Catiónico taxol azul de toluidma taxo tere azure A vincpstina azul alciano Efectos Terapéuticos Selectivos En los siguientes ejemplos se prepara una substancia de droga de azul e toluidina de conformidad con los procedimientos de fabricación descritos en la Patente de E U A 6 086 352 expedida a Bur ett el 11 de julio de 2000 Los componentes de la substancia ae droga luego se fraccionan y separan mediante FPLC de semí preparación proporcionando los análogos identificados en la patente 6 086 852 como se representan mediante las Crestas 5 _ 7 y 8 Los compuestos representados por 13S crestas 7 y 8 son regioisómeros de azul de toluidma que tienen el grupo de metilo de anillo en la posición -2 (cresta 8) \ la posición -4 (cresta 7) El compuesto representado por la cresta 5 es el derivado N-demetilado de la cresta 7 y el compuesto representado por la cresta 6 es el derivado N-demetilado de la cresta 8 E emplo 8 Los compuestos representados por las crestas 5 6 7 y 8. obtenidos durante la f raccionación del azul de toluidma O, se analizan para su toxicidad selectiva hacia células de carcinoma oral vivas (SqCHN) comparadas con células epiteliales orales normales vivas Cultivos separados de células de carcino escuamosa y células epiteliales normales se incuban con las diferentes fracciones de colorante y luego se lavan con medio libre de colorante Las células luego se remcuban en medio de crecimiento y se observan durante un período de 8 días para determinar la extensión de eliminación de célula El compuesto de la cresta 6 resulta en 95% de muerte ae célula de células de carcinoma comparado con sólo aproximadamente 20% de eliminación de células normales El compuesto de la cresta 8 muestra 89% de muerte de célula de células de carcinoma mientras que solamente ocasiona alrededor de 20% de eliminación de células normales De esta manera, la retención selectiva de los compuestos de las crestas 6 y 8 es selectivamente tóxica hacia las células de carcinoma La introducción selectiva hacia la mitocondria de colorantes catiónicos conduce a disrupción del potencial eléctrico mitocondrial que es la fuente de energía celular y la fuerza de impulsión de producción de 5 ATP (trifosfato de adenosina) de las células, La capacidad de las células de carcinoma de dividirse rápidamente y de someter a metástasis depende de la disponibilidad de esta fuente de energía más elevada. Sin embargo, los efectos en la carga eléctrica 10 no parecen ser el único mecanismo involucrado, debido a que los compuestos representados por la cresta 5 y la cresta 7 también son colorantes • catiónicos y, sin embargo, no exhiben la misma toxicidad selectiva hacia carcinomas que demuestran la Cresta 6 y la Cresta 8. De 15 esta manera, los compuestos de las crestas 6 y 8 parecen tener otras propiedades moleculares que conducen a su toxicidad selectiva hacia células de carcinoma.

Ejemplo 9 20 Las características terapéuticas de los compuestos de las crestas 6 y 8 se determina mediante pruebas in vitro adicionales, conducidas en la forma del Ejemplo 8, utilizando otros aislados de células de carcinoma y células epiteliales normales. El perfil de 25 prueba incluye otros carcinomas escuamosos de la cabeza y _,_^^É__*. cuello esófago, pulmón cerviz y piel, así como otros tipos de canceres, incluyendo adenocarcinomas , lmfomas y sarcomas El "retraso de crecimiento de tumor" en vivo y las pruebas de "ensayo de regresión de tumor" que utilizan animales que contienen tumor, incluyendo carcinomas de cabeza y cuello y pulmón implantadas en ratones Balb-C se hacen para analizar el beneficio terapéutico en vivo de estos compuestos Estas pruebas adicionales m vitro y en vivo confirmar la toxicidad selectiva de los compuestos de las crestas 6 y 8 a la variedad mas amplia de tipos de célula de cáncer Habiendo descrito la invención de tal manera como para permitir a los expertos en el ramo entenderla y practicarla y, habiendo identificado las modalidades actualmente preferidas de la misma, reivindicamos

Claims (1)

REIVINDICACIONES

1 - Un método de diagnóstico para detección en vivo de células cancerosas epiteliales mediante el marcado selectivo de la mitocondria de las mismas, que comprende el paso de entregar aL epitelio un agente de marcado mi tocondnal supravital catiónico 2.- Un método para la eliminación selectiva de células de cáncer epiteliales que comprende el paso de 10 entregar a las células de cáncer epiteliales un agente marcador mitocondrial supravital catiónico. 3 - El método de conformidad con la reivindicación 1, en el que el agente es el producto de reacción de un agente marcador mitocondrial supravital 15 catiónico y una droga quimioterapéutica de cáncer 4 - El m todo de conformidad con la reivindicación 2, en el que el agente se entrega a células de cáncer epiteliales en combinación con otra dora quimioterapéutica de cáncer que elimina 20 selectivamente las células de cáncer mediante un mecanismo diferente al mecanismo mediante el que el agente elimina las células de cáncer. 5 - Los métodos de l s reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente marcador mi toconclnai supravital 25 catiónico se selecciona para proporcionar una estructura ^^ft^*___a___ «___.... . I.b, molecular que no impide la atracción de la carga positiva de la molécula de agente marcador medíante las cargas negativas en las membranas mitocondriales. 6 - Los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente marcador mitocondrial supravital catiónico se selecciona para proporcionar una estructura molecular que permite al agente marcador enlazarse a un sitio específico en la mi tocondria . 10 7,- Los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente marcador mitocondrial supravital catiónico se selecciona para proporcionar una estructura que se intercalará hacia o se apilará a lo largo del DNA mitocondrial. 15 8 - Los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente marcador mitocondrial supravital catiónico se selecciona para proporcionar una estructura molecular que afecta su potencial de reducción para permitirle cambiar a la forma 20 leuco no cargada antes de, durante, o después de la entrada a la mí tocondria. 9.- Los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente marcador mitocondrial supravital catiónico se selecciona para 5 proporcionar una estructura molecular que se desprotonará ^^^j^^ a pH fisiológico 10 - Los métodos de conformidad con las reivindicaciones 1 o 2, en donde el agente marcador mitocondrial supravital catiónico tiene un log P de 0-5 ^Hj^g