MXPA01008858A - Metodo para tratar asma inducido por ejercicio - Google Patents

Abstract

Se describen los métodos para tratar asma inducido usando un inhibidor de PDE4.

Description

MÉTODO PARA TRATAR ASMA INDUCIDO POR EJERCICIO ALCANCE DE LA INVENCIÓN Esta invención abarca compuestos que preferiblemente inhiben, o se unen, a una forma de fosfodiesterasa isoenzima denominada 4 (de aquí en adelante PDE4) mientras exhibe igual o, preferiblemente menos unión o inhibición para una segunda forma de la enzima y por lo tanto son útiles para tratar la broncoconstricción inducida por ejercicio en los pacientes con asma. Se cree que estas formas de isoenzimas, son formas diferentes de conformaciones no inter-convertibles de la misma enzima, y se distinguen por su afinidad de unión para rolipram, un inhibidor arquetípico de PDE 4. El rolipram se une con alta afinidad a los sitios de una forma pero con baja afinidad al sitio catalítico de la otra. Por lo tanto una forma se denomina el sitio de unión a rolipram de alta afinidad y la otra forma se identifica como el sitio de unión a rolipram de baja afinidad. También se describe un método para tratar selectivamente el asma inducido por ejercicio (EIA) mediante la inhibición preferiblemente de la forma de baja afinidad del sitio catalítico en la isoenzima PDE 4. También se describe un método para tratar (EIA) mediante la administración de un compuesto que preferiblemente se une a un sitio de unión de baja afinidad.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las nucleótidos cíclicos fosfodiesterasas (PDE) representan una familia de enzimas que hidrolizan los segundos mensajeros intracelulares ubicuos, adenosina 3',5'-monofosfato (AMPc) y guanosina 3',5'-monofosfato (GMPc) a sus metabolitos inactivos correspondientes 5'-monofosfato. Se cree que existen al menos nueve clases distintas de isoenzimas PDE, cada una poseyendo características físicas y químicas únicas y cada una representando un producto de una familia génica diferente. Estas se han distinguido usando los numerales 1 hasta 9. La enzima blanco en esta invención es la isoenzima PDE 4 en todas sus diversas formas y en el dominio completo de sus distribuciones en todas las células. Esta es una enzima selectiva a AMPc de bajo Km (AMPc Km=1.5 µM) que tiene una actividad my pequeña contra GMPc (KM>100µM). los miembros de esta clase de ¡soenzima tienen las interesantes características de existir en dos o más formas no inter-convertibles o lentamente inter-convertibles que se unen a rolipram y a otros inhibidores de PDE 4 con distintos rangos en el orden de potencias. Por lo tanto del mismo producto génico puede existir en más de un estado conformacional catalíticamente activo. De manera importante, las proporciones relativas de las diferentes formas de unión pueden variar dependiendo del tipo de célula tisular. Por ejemplo, las células inflamatorias pueden contener una proporción relativamente alta de la forma que une a rolipram con una baja afinidad mientras que las células de cerebro y células parietales pueden contener una proporción relativamente alta de la forma que une a rolipram con una alta afinidad. De particular interés en esta invención es el papel que esta clase de isoenzimas desempeña en la inflamación y en el músculo liso de vías aéreas. Los estudios indican que ésta desempeña un papel prominente para la regulación de AMPc en una amplia variedad de células inflamatorias (es decir, células cebadas, basófilos, eosinófilos, neutrófilos, y monocitos) y en el músculo liso de vías aéreas. El trabajo de esta invención se aplica particularmente a las células inflamatorias y al músculo liso de vías aéreas; el tipo de isoenzima expresado en los monocitos humanos es de particular interés. Esto es debido a que el AMP cíclico sirve como un segundo mensajero para inhibir la quimotaxis y activación de las células inflamatorias. Además, el AMPc media la relajación del músculo liso de vías aéreas. Esto se acopla con un papel principal de PDE 4 en el metabolismo de AMPc que ha provisto las bases para investigar los inhibidores de PDE 4: en virtud de su capacidad para elevar el contenido de AMPc en los leucocitos y en el músculo liso de vías aéreas, los inhibidores de PDE 4 pueden poseer actividades antiinflamatorias y broncodilatadoras. Los inhibidores de PDE actualmente utilizados para tratar la inflamación y usados como broncodilatadores, fármacos semejantes a treofilina y pentoxifilina, inhiben las isoenzimas PDE indiscriminadamente en todos los tejidos. Estos compuestos exhiben efectos laterales, aparentemente debido a que estos inhiben de manera no selectiva todas las clases o la mayoría de las clases de isoenzimas PDE en todos los tejidos. Esto es una consideración para evaluar el perfil terapéutico de estos compuestos. El estado de la enfermedad blanco puede efectivamente tratarse mediante dichos compuestos, pero no se desean que se exhiban efectos secundarios los cuales, si pueden ser evitados o minimizados, podrían incrementar el efecto terapéutico general de este método para tratar ciertos estados de enfermedad. Tomándolas colectivamente, esta información sugiere que los efectos laterales asociados con el uso de inhibidores de PDE estándar no selectivos pueden reducirse al dirigir los inhibidores selectivos de isoenzimas novedosos a partir del PDE predominante en el tejido o célula de interés. Aunque en la teoría los inhibidores de PDE selectivos a isoenzima debería presentar una mejoría sobre los inhibidores no selectivos, los inhibidores selectivos probados hasta la fecha no han evitado producir efectos laterales como una extensión de la inhibición de la isoenzima de interés en un tejido inapropiado o no blanco. Por ejemplo, los estudios clínicos con el inhibidor rolipram selectivo a PDE4, el cual ha sido desarrollado como un antidepresivo, indica que éste tiene actividad psicotrópica y que produce efectos gastrointestinales, por ejemplo, pirosis, náusea y emesis. Las indicaciones son que los efectos laterales de la denbufilina, otro inhibidor de PDE 4 dirigido para el tratamiento de la demencia multi-infarto, puede incluir también pirosis, náusea y emesis. Se piensa que estos efectos laterales ocurren como un resultado de la inhibición de PDE4 en áreas específicas del sistema SNC y gastrointestinal. En 1986, Schneider y colegas describieron la presencia y características de los sitios de unión a [3H]-rolipram estereoselectivos, de alta afinidad en los homogenados de cerebro de rata. Aunque se asumió que estos sitios de unión representaban el sitio catalítico de la "fosfodiesterasa de AMPc, no dependiente de calmodulina" del cerebro de rata (es decir PDE4), una gran anormalidad fue aparente en los datos. Bajo condiciones experimentales similares aunque no idénticas, los datos mostraron que rolipram tiene una K =1nM, mientras que éste inhibe la actividad de PDE4 del cerebro de rata con una K¡=1µM. Por lo tanto, hubo una diferencia de 1000 veces en la afinidad de rolipram para el sitio de unión contra su efecto sobre la actividad catalítica. Aunque las relaciones comprensivas de actividad estructura (SAR - por sus siglas en inglés) para la inhibición de PDE y competencia para la unión de [3H]-rolipram no se establecieron, la diferencia sustancial de la potencia de rolipram como un inhibidor de PDE 4 se comparó con su potencia en el sitio de unión que parecía cuestionar la validez de la suposición de que ambas actividades estaban contenidas dentro del mismo locus molecular. Debido a este acertijo, varios estudios se iniciaron. Uno debía determinar si el sitio de unión de alta afinidad para rolipram existía sobre la misma proteína como el sitio catalítico a AMPc. Otro estudio debía determinar si o no la SAR para la inhibición de PDE4 era la mismo que la SAR para la competencia con el sitio de unión a rolipram de alta afinidad. Un tercer estudio se llevó a cabo para tratar y elucidar qué significado biológico, si tenía alguno, había en estos hallazgos, particularmente si se podía relacionar al desarrollo de terapias con fármacos novedosos. Puesto que los datos se recolectaron a partir de varios ensayos, se volvió aparente que hay al menos dos formas de unión de PDE 4 recombinante de monocitos humanos (hPDE4) al cual se une el inhibidor. Una explicación de estas observaciones es que hPDE4 existe en dos formas distintas. Una se une a formas similares de rolipram y denbufilina con una alta afinidad mientras que la otra se une a estos compuestos con una baja afinidad. Se pueden distinguir estas formas al referirse a ellas como la forma de unión a rolipram de alta afinidad (HPDE 4) y la forma de unión a rolipram de baja afinidad (LPDE 4). La importancia de estos hallazgos recae en el descubrimiento de que los compuestos que potencialmente compiten para las formas de unión a rolipram de alta afinidad (HPDE 4) tiene más efectos laterales o efectos laterales más intensos que aquellas que compiten más potencialmente con el HPDE 4 (forma de unión a rolipram de baja afinidad). Los datos posteriores indican que los compuestos pueden dirigirse a la forma de unión de baja afinidad de PDE4 y que esta forma es una forma distinta de la forma de unión para rolipram el cual funciona como unión de alta afinidad. Se ha encontrado que existen distintas SAR para inhibidores que actúan en la forma de unión a rolipram de alta afinidad en contra de la forma de unión a rolipram de baja afinidad. Además, estas dos formas parecen tener papeles funcionales diferentes. Estos compuestos que interaccionan con la forma de unión a rolipram de baja afinidad parecen tener actividad anti-inflamatoria, mientras que aquellas que interactúan con la forma de unión a rolipram de alta afinidad producen efectos laterales o exhiben esos efectos laterales más intensamente. No hay una explicación clara de estos hallazgos. Sin embargo, se ha propuesto que PDE 4 puede existir en dos estados distintos terciario o cuartanario. Se cree que ambas formas son catalíticamente activas. El rolipram se une a un sitio catalítico de una forma con una alta afinidad, definida aquí como que tiene un K¡ menor que 10 nanomolar, y la otra forma con una baja afinidad, definida aquí como que tiene un K¡ mayor que 100 nanomolar. Una consecuencia útil de estos hallazgos es que ahora es posible identificar compuestos que preferiblemente inhiben la actividad catalítica de AMPc mientras que la enzima está en la forma que se une a rolipram con una baja afinidad, por lo tanto reduciendo los efectos laterales los cuales aparentemente están unidos a la inhibición de la forma que se une a rolipram con una alta afinidad. Esta invención así provee un índice terapéutico superior vis-á-vis EIA contra los efectos laterales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Esta invención se refiere a un método para tratar asma inducido por ejercicio mientras que se minimizan los efectos gastrointestinales y psicotrópicos, cuyo método comprende administrar a un sujeto que lo necesite una cantidad efectiva de un compuesto que tiene una relación IC5o de aproximadamente 0.1 o mayor al considerar el IC50 para PDE 4 de forma catalítica el cual se une a rolipram con una alta afinidad dividido por el IC50 de la forma que se une a rolipram con una baja afinidad.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN El asma es una enfermedad compleja, multifactorial caracterizada por obstrucción reversible de vías aéreas, inflamación de vías aéreas e hiperactividad no específica de vías aéreas a una variedad de cambios farmacológicos y ambientales. Varios mediadores, liberados a partir de las células inflamatorias activadas y de las células inmunes, producen edema pulmonar, broncoconstricción e hipersecreción mucosa que lleva a cambios en la morfología de las vías aéreas. Hay evidencia en la que se implica a la inflamación de vías aéreas como el proceso patológico principal que subyace como responsable de la manifestación del asma. El asma inducido por ejercicio (EIA) se define como un incremento temporal en la resistencia de las vías aéreas que ocurre varios minutos después de un ejercicio extenuante. El EIA afecta al 80% de los asmáticos, y 35-40% de pacientes con rinitis alérgica experimenta EIA. En los pacientes con EIA el ejercicio lleva a hiperventilación, perdida de agua a nivel respiratorio, y enfriamiento de vías aéreas las cuales, a su vez, pueden disparar a las células cebadas de las vías aéreas y a los basófilos circulantes para que liberen químicos que median la inflamación, secreción mucosa, contracción del músculo liso, y vasodilatación durante el ejercicio. Además del ejercicio, otros factores pueden disparar un incremento temporal en la resistencia de las vías aéreas. Estos factores incluyen, pero no se limitan a, contaminantes, por ejemplo SO2 y cambios de temperatura, especialmente debido al aire frío. Por lo tanto, el tratamiento del asma inducido por contaminación (PÍA) y del asma inducido por aire frío (CÍA) están también dentro del alcance de esta invención. La exposición racionada para los inhibidores de PDE 4 en esta enfermedad se basa en el papel del adenosín monofosfato cíclico (AMPc) como un segundo mensajero que media una amplia supresión de actividad celular inmune e inflamatoria, junto con el conocimiento de que PDE 4 es la isoenzima principal que hidroliza AMPc en estas células de músculo liso, aunque este parece ser menos dominante aquí que en las células inflamatorias. Para los propósitos de esta invención, el sitio catalítico de AMPc el cual une rolipram con una baja afinidad se denominó el sitio de unión "de baja afinidad" (LPDE 4) y la otra forma de este sitio catalítico el cual se une a rolipram con alta afinidad se denominó el sitio de unión "de alta afinidad" (HPDE 4). Se llevaron a cabo los experimentos iniciales para establecer y validar un ensayo de unión a [3H]-rolipram. Los detalles de este trabajo se dan en el ejemplo 1 a continuación. Para determinar si tanto la actividad de unión de alta afinidad como la actividad de unión a baja afinidad residía en el mismo producto del gen, una levadura se transformó por métodos conocidos y la expresión de PDE 4 recombinante se siguió en un periodo de 6 horas de fermentación. Los análisis Western blot usando un anticuerpo dirigido contra PDE 4 indicaron que la cantidad de PDE 4 expresado se incrementaba con el tiempo, alcanzando un máximo después de 3 horas de crecimiento. Además, más del 90% dei producto de inmunoactividad estuvo en el sobrenadante obtenido a alta velocidad (100,000 x g) de los usados de levadura. La unión a [3H]R-(-)-rolipram y la actividad PDE se monitorearon junto con la expresión de la proteína. La actividad PDE 4 se co-expresó con la actividad de unión a rolipram, indicando que ambas funciones existen sobre el mismo producto génico. Similares a los resultados con el análisis gráfico de Western, donde más del 85% de la actividad PDE que se encuentra en rolipram y de la actividad de unión a [3H]-rolipram se encontró presente en la fracción del sobrenadante de levadura. La mayoría de los PDE 4 recombinantes expresados en este sistema existen como LPDE 4 y solamente una pequeña fracción como HPDE 4. Consecuentemente, la inhibición de PDE 4 recombinante en actividad catalítica principalmente refleja la acción de compuestos a LPDE 4. La inhibición de la actividad catalítica PDE 4 puede usarse así como un índice para la potencia de los compuestos en LPD 4. La potencia de los compuestos como HPDE 4 puede evaluarse al examinar su capacidad para competir por [3H]R-rolipram. Para desarrollar la relaciones estructura-actividad (SAR) para ambos sitios de unión a rolipram de baja afinidad y de alta afinidad, se determinaron las potencias de los compuestos seleccionados en dos sistemas de ensayo. Los resultados a partir de los experimentos usando los compuestos estándar se tabularon. Como se esperó, ciertos compuestos fueron claramente más potentes en la competencia con [3H]-rol¡pram por el sitio para el cual el rolipram demostró alta afinidad de unión en comparación con el otro sitio, aquel en el cual el rolipram es una agente de unión de baja afinidad. La correlación SAR entre la unión de alta afinidad y la unión de baja afinidad fue escasa y se concluyó que la SAR para la inhibición de alta afinidad por unión de [3H]-rolipram era distinta a partir de la SAR para la unión del sitio de unión de rolipram de baja actividad. El cuadro I provee resultados para este trabajo SAR.

CUADRO l Denbufilina es 7-acetonil, 1 ,3-dibutilxanthina hecha por SmithKIine Beecham. Papaverina es 1-[(3,4-dimetoxifenil)metil]-6,7-dimetoxiisoquinolina. Trenquinsina es 2,3,6,7-tetrahido-2-(metilimino)-9,10-dimetoxi-3-metoxi-4H-primido[6,1-a]isoquinolina-4-ona. Dipirimadol es el nombre genérico para 2,2',2",2"-[(4,8-dipiperidinopirimido[5,4-d]pirimidina-2-6-diil)dinitr¡lo]tetraetanol. Estos resultados ilustran que algunos compuestos pueden inhibir selectivamente las formas denominadas de baja afinidad en comparación con las formas de alta afinidad, y viceversa. El significado de este hallazgo es que es capaz de minimizar los efectos laterales al diseñar o escoger compuestos que selectivamente (preferiblemente) inhiben un sitio por lo tanto afectando la respuesta deseable de la exclusión de otra respuesta, no deseada, o de al menos minimizar el responsable no dirigido a un grado donde éste no interfiere con la terapia que se pretende hasta un grado no aceptable. No obstante este trabajo, los inventores no han definido la base de la respuesta SAR para la unión de rolipram de alta afinidad y la unión rolipram de baja afinidad de la isoenzima PDE4. Sin embargo se ha descubierto que si un compuesto exhibe una relación IC50 de aproximadamente 0.1 o mayor, calculado como la relación del IC50 para la unión de rolipram de alta afinidad y dividiendo por el IC50 de la forma que une a rolipram con una baja afinidad, este tendrá un índice terapéutico aceptable. Esto es, uno puede ahora tratar exitosamente una variedad de enfermedades inmunes e inflamatorias mientras que no se afecta otros fenómenos fisiológicos del todo o hasta un grado no aceptable. Por lo tanto, la modalidad más preferida es inhibir el sitio de unión a rolipram de baja afinidad como un modo para tratar las enfermedades inflamatorias y alérgicas.

Compuestos Esta invención abarca aquellos compuestos que tiene una relación IC50 (unión alta/baja) de aproximadamente 0.1 o mayor. Este incluye cualquiera y todos los compuestos que son inhibidores de PDE 4 así como el grupo establecido aquí, y los cuales demuestran en este, o en similares ensayos, una relación dentro del rango definido; de particular interés son aquellos compuestos los cuales no son del dominio público y/o no se han ensayado o no se conocen que sean inhibidores de PDE 4 antes de la fecha de presentación de esta aplicación. Los ejemplos de los compuestos que alcanzan a la relación estándar IC50 se dan en el cuadro 1 anteriormente mencionado así como en las patentes de E.U.A. 5,448,686; patente de E.U.A. 5,605,923; y patente de E.U.A. 5,552,438. Cada una de estas solicitudes se incorpora aquí como referencia en su totalidad como así se publicara en este documento. Una técnica preferida para seleccionar los compuestos útiles es aquella que determina uno que tenga una relación IC50 de aproximadamente 0.1 o mayor a una relación del valor IC50 para la competencia con la unión de InM de [3H]R-rolipram para una forma de PDE 4 la cual se une a rolipram con una alta afinidad sobre el valor IC50 para inhibir la actividad catalítica de PDE 4 de una forma que une al rolipram con una actividad baja usando 1 µM[3H]-AMPc como el substrato. Los compuestos preferidos de esta invención son aquellos que tiene una relación IC50 mayor que 0.5, y que particularmente son aquellos compuestos que tienen una relación mayor que 1.0. Los compuestos tales como c/s-[4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1 -carboxilato], 2-carbometoxi-4-ciano-4-(3-ciclopropilmetox¡-4-difluorometoxifenil)cicloohexan-1 -ona, y c/s-[4-ciano-4-(3-ciclopropilmetoxi-4-difluorometox¡fenil)ciclohexano-1-ol] son ejemplos de estructuras las cuales se unen preferiblemente a los sitios de unión de baja afinidad y los cuales tienen una relación de IC50 de 0.1 o mayor. Los compuestos presentes y las sales farmacéuticamente aceptables pueden administrarse de una manera estándar para el tratamiento de las enfermedades indicadas, por ejemplo oralmente, parenteralmente, sublingualmente, dermalmente, transdermalmente, rectalmente, vía inhalación o vía administración bucal. También puede utilizarse una preparación de liberación controlada. Los compuestos presentes y las sales farmacéuticamente aceptables, las cuales se activan cuando se dan oralmente, pueden formularse como jarabes, tabletas, cápsulas, preparaciones de liberación controlada, o tabletas. Una formulación en jarabe generalmente consistirá de una suspensión o solución del compuesto o sal en un vehículo liquido por ejemplo, etanol, aceite de cacahuate, aceite de oliva, glicerina o agua con un agente saborizante o colorante. Donde la composición está en la forma de una tableta, cualquier vehículo farmacéutico rutinariamente usado para preparar formulaciones sólidas puede utilizarse. Los ejemplos de dichos vehículos incluyen estearato de magnesio, térra alba, talco, gelatina, acacia, ácido esteárico, almidón, lactosa y sacarosa. Donde la composición está en la forma de una cápsula, cualquier encapsulación rutinaria es adecuada, por ejemplo usando los vehículos anteriormente mencionados en una cápsula con cubierta dura de gelatina. Donde la composición está en la forma de una cápsula con cubierta suave de gelatina cualquier vehículo farmacéutico rutinariamente usado para preparar dispersiones o suspensiones pueden considerarse, por ejemplo gomas acuosas, celulosas, silicatos y aceites, y se incorporan en una cápsula con cubierta de gelatina suave. Las composiciones parenterales típicas consisten de una solución o suspención de un compuesto o sal en un vehículo estéril acuoso o no acuoso que opcionalmente contiene un aceite parenteralmente aceptable, por ejemplo polietilenglicol, polivinilpirrolidona, lecitina, aceite de aráquida o aceite de ajonjolí. Las composiciones típicas para la inhalación están en la forma de una solución, suspención o emulsión que pueden administrarse como polvo seco o en la forma de un aerosol usando un propelente convencional tal como diclorodiflorometano o triclorofiorometano. Una formulación típica en supositorio que comprende el compuesto de la presente o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma la cual está activa cuando se administra de esta manera, con un agente aglutinante y/o lubricante, por ejemplo glicoles poliméricos, gelatina, mantequilla de cocoa y otras ceras vegetales de bajo punto de fusión o grasas o sus análogos sintéticos. Las formulaciones típicas para administración dermal y transdermal comprenden un vehículo acuoso o no acuoso convencional, por ejemplo una crema, ungüento, loción o pasta o están en la forma de un emplasto, parche o membrana. Preferiblemente la composición esta en una forma de dosis única, por ejemplo una tableta, cápsula o dosis de aerosol calibrada de manera que el paciente pueda administrar una única dosis. Cada unidad de dosis para administración oral contiene adecuadamente de 0.3 mg a 60 mg/Kg, y preferiblemente de 1 mg a 30 mg/kg de un compuesto o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Las dosis preferidas incluyen 10 mg y 15 mg/kg. Cada unidad de dosis para administración parenteral contiene adecuadamente de 0.1 mg a 100 mg/Kg, del compuesto o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Cada unidad de dosis para administración intranasal contiene adecuadamente 1-400 mg y preferiblemente 10 a 200 mg por persona. Una formulación tópica contiene adecuadamente 0.01 a 5.0% de un compuesto presente. El ingrediente activo puede administrarse a partir de 1 a 6 veces al día, suficiente para exhibir la actividad deseada. Preferiblemente, el ingrediente activo se administra alrededor de una o dos veces al día, más preferiblemente dos veces al día. Los compuestos de la presente invención son útiles para la profilaxis o tratamiento de EIA, PÍA, y CÍA, tanto en condiciones crónicas también como intermitentes, en anticipación del estímulo en cuestión.

Preferiblemente, los presentes compuestos se utilizan para terapia a largo plazo. No se espera ningún efecto toxicológico aceptable cuando los compuestos de la presente invención se administran de acuerdo con la presente invención. Los siguientes ejemplos se proveen para ilustrar como hacer y utilizar ia invención. Esto no se pretende que limiten el alcance de la invención de ninguna manera o a ningún grado.

EJEMPLOS Los siguientes ensayos abarcan cinco especies diferentes que se utilizaron para desarrollar los datos que apoyan la selección de una relación IC50 de alrededor de 0.1 o mayor. Los ensayos fueron: estimulación de la producción de ácido a partir de la glándula parietal aislada de conejo; inhibición de degranulación inducida por FMLP (liberación de mileoperoxidasa) en neutrófilos humanos; inhibición de FMLP - incluida la formación de O2- en los eosinófilos de cuyo; inhibición de la producción de TNFa inducido por LPS en los monocitos humanos; producción de emesis en perros; inhibición de la broncoconstricción inducida por antígeno en los cuyos; disminución de la hipoterapia inducida por reserpina en el ratón; e inhibición de la producción de TNFa inducida por LPS de los monocitos de humano transferidos adaptativa mente a ratones. Estos ensayos y datos se presentan a continuación.

Análisis estadístico Para examinar la hipótesis de que la inhibición del sitio de baja afinidad PDE 4 se asocia con las acciones antinflamatorias de esta clase de compuestos, mientras que la inhibición del sitio de alta afinidad se asocia con la producción de ciertos efectos laterales los inventores determinaron la capacidad de varios inhibidores de PDE 4 para bloquear la función celular inflamatoria tanto in vitro como in vivo y la capacidad de estos compuestos para producir efectos laterales en modelos in vitro e in vivo. Para comparar la capacidad de los inhibidores de PDE 4 para producir un efecto terapéutico dado o efecto lateral con su capacidad para inhibir el sitio de unión de baja afinidad en contra de su capacidad para inhibir el sitio de alta afinidad de PDE 4, los inventores compararon la potencia de estos compuestos en los ensayos in vitro o in vivo, con la potencia contra la actividad catalítica de la enzima aislada o el sitio de alta afinidad mediante una correlación lineal de (r2) o un intervalo del orden de correlación (Rho de Spearman). La correlación lineal describe si la potencial de un compuesto para inhibir ya sea el sitio de baja afinidad o el sitio de alta afinidad puede usarse para pronosticar la capacidad para producir un efecto antiinflamatorio dado o efecto lateral. El intervalo del orden de correlación en las pruebas donde el intervalo del orden de la potencia para producir un efecto dado antiinflamatorio o efecto lateral es similar al intervalo del orden de potencial para inhibir la baja afinidad o la alta afinidad de ese sitio. Tanto r2 como Rho de Spearman se calcularon usando el programa de computadora STAT View II para Macintosh.

PDE IV Rolipram unión de alta afinidad EJEMPLO 1 Ensayo de unión de fosfodiesterasa y rolipram EJEMPLO 1A Los monocitos humanos aislados PDE 4 y PDEhr 4 se determinaron para que existieran principalmente en la forma de baja afinidad. Por lo tanto, la actividad de los compuestos prueba en contra de la forma de baja afinidad de PDE 4 puede evaluarse usando ensayos estándar para la actividad catalítica de PDE 4 empleando 1µM de [3H] AMPc como un substrato (Torfi et al., 1992). Los sobrenadantes obtenidos mediante alta velocidad del cerebro de rata se utilizaron como una fuente de proteína. Los enantiómeros de [3H]-rolipram se prepararon a una actividad específica de 25.6 Ci/mmol. Las condiciones de ensayo estándar se modificaron a partir del procedimiento publicado para que fueran idénticas al ensayo de PDE en cuanto a condiciones, excepto para el último de AMPc; Tris HCl 50 mM (pH 7.5), MgC 5 mM, y 1 nM de [3H]-rolipram (Torphiet et ai., The J. of Biol. Chem., Vol 267, No. 3, pp 1798-1804, 1992). El ensayo se corrió por una hora a 30°C. la reacción se detuvo y el ligando unido se separó a partir de ligando libre usando un cosechador de célula Brandel. La competencia para el sitio de alta afinidad se evaluó bajo condiciones que fueron idénticas aquellas bajo la actividad PDE medida para baja afinidad, esperándose que [3H]- AMPc no estuviera presente. Los datos presentes en el cuadro 1 , página 8 se generaron utilizando el protocolo descrito en el ejemplo 1A.

EJEMPLO 1B Medición de actividad fosfodiesterasa La actividad PDE se evaluó usando un ensayo de proximidad por centelleo de [3H] AMPc (SPA) o ensayo enzimático [3H] GMPc SPA como se describió por el fabricante (Amersham Life Sciences). Las reacciones se condujeron en cajas de 96 pozos a temperatura ambiente, en 0.1 ml de regulador de pH de la reacción que contenía (concentraciones finales): Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, MgCI2 8.3 mM, EGTA 1.7 mM, [3H] AMPc o [3H] GMPc (aproximadamente 2000 cpm/pmol), enzima y varias concentraciones de los inhibidores. El ensayo se permitió que procediera durante 1 hr y se detuvo al añadir 50 ul de glóbulos de silicato de itrio SPA en la presencia de sulfato de zinc. Las cajas se agitaron y se dejaron en reposo a temperatura ambiente por 20 min. La formación del producto radiomarcado se evaluó mediante espectrometría por centelleo. Las actividades de PDE3 y PDE7 se evaluaron usando 0.05 uM [3H] AMPc, mientras que PDE4 se evaluó usando 1 uM [3H] AMPc como un sustrato. La actividad de PDE1 B, PDE1 C, PDE2 y la actividad de PDE5 se evaluaron usando 1 uM [3H] GMPc como un sustrato.

Ensayo de unión a [3H]R-rolipram El ensayo de unión a [3H]R-rolipram se llevó a cabo al modificar el método de Schneider y colaboradores, véase Nicholson, et al., Trends Pharmacol. Sci., Vol. 12, pp. 19-27 (1991) y McHaie et al., Mol. Pharmacol., Vol. 39, 109-113 (1991). El R-rolipram se une al sitio catalítico de PDE4 véase Torphy et al., Mol. Pharmacol., Vol. 39, pp. 376.384 (1991 ). Consecuentemente, la competencia para la unión a [3H]R-rolipram provee una confirmación independiente de que el inhibidor de PDE4 potencia a los competidores no marcados. El ensayo se llevó a cabo a 30°C durante 1 hr en 0.5 ul de regulador de pH que contenía (concentraciones finales): Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, MgCI2 5 mM, albúmina de suero de bovino al 0.05%, [3H]R-rolipram 2 nM (5.7 x 104 cpm/pmol) y varias concentraciones de inhibidores no radiomarcados. La reacción se detuvo mediante la adición de 2.5 ml de regulador de pH de reacción enfriado en hielo (sin[3H]R-rolipram) y filtración rápida en el vacío (cosechador de célula Brandel) a través de filtros Whatman GF/B que habían sido empapados en polietilenimida al 0.3%. Los filtros se lavaron con 7.5 ml adicionales de regulador de pH frío, se secaron, y se contaron mediante espectrometría de centelleo en líquido.

EJEMPLO 2 Acumualción de aminopirina Ciertas metilxantina y otros inhibidores no selectivos de PDE incrementaron la secreción de ácido en una variedad de especies. Ciertos inhibidores selectivos a PDE4, por ejemplo, rolipram y Ro 20-1724, mejoran la secreción de ácido en las ratas, particularmente cuando se les da en combinación con un activador de la adenilatociclasa tal como histamina. Este incremento en la secreción de ácido se acompaña por una elevación en la acumulación de AMPc inducida por histamina. Esta información divulgada se evaluó para determinar si el fenómeno existía. La capacidad de los compuestos para inducir la secreción de ácido se correlacionó con su capacidad contra el sitio de baja afinidad o el sitio de alta afinidad. El ensayo usado en este trabajo fue la acumulación de una base débil, aminopirina radiomarcada la cual se ha reportado que sirve como marcador bioquímico para la secreción incrementada de ácido. El ensayo sigue: Preparación de glándula gástrica Los conejos de cualquier sexo se eutanizaron mediante dislocación cervical y se removió el estomago. La mucosa se disecó a partir del cuerpo; el cráneo y las porciones antrales del estomago se descartaron. Las glándulas gástricas se aislaron mediante una modificación de los métodos descritos por Berlindh y Obrink (1976) y Sack y Spenney (1982). La mucosa se cortó y se digirió con colagenasa para aislar las glándulas gástricas. Las glándulas digeridas se filtraron, lavaron, y resuspendieron 1 :15 (vol:voI) en medio de incubación de la siguiente composición: NaCI, 132.4 mM; KCI, 5.4 mM; Na2HP04, 5.0 mM; NaH2P04, 1.0 mM; MgS04, 1.2 mM; CaCI2, 1.0 mM; NaHCO3, 12.0 mM; albúmina de suero de conejo, 2 mg/ml; dextrosa, 2 mg/ml; a un pH 7.4.

Acumulación de aminopirina Para determinar la secreción de ácido, las glándulas gástricas en combinación con [3H]-aminopirina, varias concentraciones de inhibidores de PDE4 selectivos, y una concentración umbral de histamina (0.3-1.0 µM) se incubaron a 37°C sobre un agitador horizontal (110 ciclos/min.) por 20 minutos de acuerdo con el procedimiento de Sack y Spinney (1982). Las muestras entonces se centrifugaron y radioactivaron en alícuotas de la fracción sobrenadante y se determinaron los concentrados. Las relaciones de aminopirina se calcularon como se describe por Sack y Spenney (1982). Los datos se expresaron como un porcentaje de la respuesta producida por una concentración máxima de histamina (100 µM). Los valores EC50 se determinaron mediante interpolación lineal usando la respuesta máxima obtenida de cada compuesto.

EJEMPLO 3 Evaluación del potencial emético de los inhibidores selectivos a PDE en perros Los perros de raza indefinida (n=5, para cada estudio) de cualquier sexo se obtuvieron a partir de la colonia animal. Después de la media noche, los perros se alimentaron con ? lata de comida para perro (Big Bet) al menos 30 minutos antes del estudio. Una cánula se colocó en la vena cefálica de la pata anterior para administrar los fármacos. La cánula se lavó con 1 ml de solución salina isotónica (0.9%) antes de la administración del compuesto experimental. Los compuestos se disolvieron ya sea en una mezcla de poletilenglicol y solución salina o polietilenglicol al 100% y se les dio a un volumen de 1.0-2.0 ml/10kg. Para asegurar que la dosis entera estaba en la circulación, la cánula se lavó con 0.5-1.0 ml de solución salina adicional. El animal se regresó a una caja por un periodo de observación de una hora. Cada perro se observó en búsqueda de señales de náusea o de vómito y se anotó el tiempo después de la administración del compuesto hasta la ocurrencia de esta conducta. Al final del periodo de observación, el animal se regresó a su caja. Cada estudio por día se separó por 7 días. Cada compuesto se administró en dosis ascendentes a cada perro en los días de estudios sucesivos hasta que se observó un efecto hermético. En este periodo, el perro individual se sacó del estudio y se evaluaron dosis mayores solamente en aquellos perros que no habían respondido aún. Los datos se expresan como el porcentaje acumulativo de perros que responden a cada dosis como se describe en la literatura para curvas de respuesta de dosis cuantificadas. Se calculó un valor ED50 usando el análisis de Probit.

EJEMPLO 4 Ensayo de eosinófilos en cuyo Aislamiento y purificación de eosinófilos Los cuyos machos (Hartley, Hazelton Labs) se inyectaron con 1 mi de suero de caballo semanalmente por 4-6 semanas antes de su uso. Los animales fueron anestesiados con una mezcla de cetamina/xilazina (88 mg; 12 mg/ml; 0.4 ml/kg al menos 24 horas después de una inyección de suero de caballo. Después de la inducción de la anestesia la cavidad peritoneal se lavó con 50 ml de solución salina estéril calentada (0.9%). El fluido de lavado se colectó usando un catéter 14 G conectado hacia tubos de plástico cónicos de 50 ml para centrifuga. A los cuyos se les permitió recuperarse a partir de la anestesia y pudieron usarse nuevamente después de un periodo de reposo de dos semanas.

Las células se aislaron a partir del fluido de lavado mediante centrifugación (400 x g, 10 min) y fueron resuspendidas en 35 mi de regulador de pH de fosfato salino (PBS) y se concentraron con 10 ml de Percoll (1.075 g/ml) isotónico. Esta suspensión se centrifugó por 30 min a 300 x g. El concentrado que contenía principalmente eosinófilos y eritrocitos se lavó con PBS y los eritrocitos se usaron. Estas células se resuspendieron en medio RPMI 1640 con PBS al 20%y se incubaron durante toda la noche a 37°C en un incubador humidificado con CO2 al 5%. Los siguientes días las células se lavaron y se resuspendieron en PBS para la determinación de la viabilidad celular (exclusión de azul tripán) y pureza.

Producción del anión superóxido (Q2") Los eosinófilos purificados (viabilidad >95% y pureza >90%) se resuspendieron en PBS con regulador de pH HEPES 20 mM (pH 7.4) y gelatina al 0.1% a una concentración de 1-2 x 106 células/ml. Los eosinófilos (1 x 105) se añadieron a cajas de 96 pozos y se incubaron por aproximadamente 1 hora a 37°C. Los inhibidores de PDE4 se añadieron 10 minutos antes del inicio de la reacción. La reacción se inició mediante la adición del citocromo C (160 µM) y formilMet-Leu-Phe (FMLP) (30 nM) en la ausencia o presencia de 60 unidades de superóxido dismutasa (SOD). La reducción del citocromo C se monitoreó sobre un lector de placas Dynatech MR 7000 a 550 nm con una referencia a 630 nm durante varios periodos de tiempo. La velocidad de la producción de 02" se determinó mediante análisis de regresión lineal usando la absorbancia neta de los pozos en la ausencia o presencia de SOD a varios puntos. Los resultados se expresaron como un porcentaje del control en la producción de 02" correlacionado para la liberación basal. Puesto que la inhibición máxima observada fue de 60%, log ÍC30 se calculó usando la interpolación lineal de la concentración y de la unión al 30%.

EJEMPLO 5 Broncoconstricción en los cuyos Los cuyos machos Hartley (200-250 g/4 semanas, Hazelton Research. Denver, Pa) fueron sensibilizados mediante inyecciones I.M. de 0.35 ml de una solución de ovoalbúmina/solución salina al 5% (p/v) dentro de cada muslo (0.7 ml total) a los días 1 y 4. Los cuyos estuvieron disponibles para uso después del día 25.

Procedimiento experimental Los cuyos machos Hartley (600-800 g Hazelton), sensibilizados activamente a la ovoalbúmina, fueron anestesiados con pentobarbital sódico (40 mg/kg l.P) aproximadamente 10-15 minutos antes de la cirugía. A la vena yugular, arteria carotídea, y tráquea se les colocaron cánulas (Deseret Intracath® Vialon® catéteres radioopacos de resina de polímero (Deseret Medical, Inc., Sandy, UT), 22 GA y 19 GA, y PE tubos 260, respectivamente) para la administración del fármaco, se monitoreó la presión sanguínea y la ventilación. La vagotomía bilateral se llevó a cabo para minimizar la interferencia colinérgica. Los animales fueron paralizados (bromuro de pancuronio, 0.1 mg/kg i.v.) y se ventilaron (45 aspiraciones/minuto) vía un Harvard Rodent Respirator (modelo 683, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Los cambios de presión en la vía aérea se midieron vía un brazo lateral de la cánula traqueal con un transductor Elcomatic (Buxco Electronics, Sharon, CT). El volumen de choque del ventilador se estableció para que produjera una presión en el brazo lateral de 8 cm de H2O (cerca de 5cc de aire de la cámara). La presión sanguínea se midió con un transductor de presión física Statham P23XL (Viggo-spectramed, Oxnard, CA). Las presiones se registraron sobre un polígrafo Grass Model 7D (Grass Instrument Co., Quincy, MA). Los animales se mantuvieron calientes sobre una tabla de calentamiento durante el experimento para mantener la temperatura corporal. Los compuestos prueba o los vehículos se administraron vía la ruta i.v. 10 minutos antes de la prueba del antígeno. En el punto de tiempo 0, se administró 0.1 mg/kg de ovoalbúmina vía la ruta i.v. En el pico de la respuesta antigénica, se administró una dosis adicional de antígeno, 0.2 mg/kg de ovoalbúmina, i.v. Después de que se alcanzó la respuesta pico acumulada del antígeno a la ovoalbúmina a 0.3 mg/kg, se administró una solución de KCI saturada, de 1 cc/kg, i.v., la cual produjo máxima broncoconstricción.

EJEMPLO 6 Inhibición de TNF inducida por LPS en los monocitos humanos Estudios in vitro Para determinar si la inhibición TNFa está liberada de la inhibición de LPDE 4 o HPDE 4, se seleccionó una serie de inhibidores PDE 4 que tenían un intervalo de potencias para el LPDE 4 y HPDE4 por su capacidad para inhibir la producción de TNFa en los monocitos humanos estimulados con lipopolisacáridos (LPS) in vitro. Se consideró que el uso de las células humanas primarias para esta selección era extremadamente importante dado las diferentes especies que aparecieron que diferían dramáticamente en su contribución relativa de LPDE 4 y HPDE4 a la hidrólisis de AMPc en las células inflamatorias.

Métodos La inhibición de TNFa se evaluó en los monocitos de sangre periférica de humano, los cuales fueron, purificados (Collata) a partir de residuos de foresis de plasma o de cubiertas amarillas obtenidas de manera reciente a partir de sangre de donantes humanos normales. Los monocitos se colocaron a una densidad de 1 X 106 células/ml medio/pozo en cajas de 24 pozos. A las células se les permitió adherirse por una hora, después de este tiempo el sobrenadante se aspiró y se añadió 1 mi de medio fresco (RPMI-1640 que contenía suero de camero fetal al 1% y penicilina/estreptomicina a 10 U/ml). Las células se incubaron por 45 minutos en la presencia o ausencia de compuestos prueba a unas concentraciones que tenían un intervalo de 1 nM a 1 mM antes de la adición de LPS (E. Coli. 055:B5, Sigma Chemicals) para producir una concentración final de 100 ng/ml. Los compuestos prueba se solubilizaron y diluyeron a una concentración de 50:50 en dimetilsulfóxido/etanol, de tal manera que la concentración final de solvente en el medio de cultivo de monocitos fue de dimetilsulfóxido al 0.5% y etanol al 0.5%. Los sobrenadantes de cultivo se removieron a partir de los monocitos después de 14-16 horas de incubación a 37°C/CO2 al 5%, y se centrifugaron a 100 x G para remover los restos celulares. Los ensayos de citocina se llevaron a cabo ya sea inmediatamente o los sobrenadantes del cultivo se almacenaron a -70°C hasta que se evaluaron. Se midieron los niveles de TNFa usando un ELISA (Winston) empleando un anticuerpo monoclonal de murino anti TNFa de humano (ver a continuación) como el anticuerpo de captura y un anticuerpo policlonal TNFa de conejo anti-humano como anticuerpo secundario. Para la detección, se añadió un anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con peroxidasa (Boehringer Mannheim, Cat. #605222) seguido por un substrato para peroxidasas (1 mg/ml ortofenilened ¡amina con 0.1 % de peróxido de urea). Los niveles de TNFa en las muestras se calcularon a partir de una curva estándar generada con TNFa recombinante humano producido en E. coli. Los anticuerpos monoclonales para TNFa de humano se prepararon a partir del bazo de ratones BALB/c inmunizados con TNFa recombinante humano mediante la modificación del método de Kohler y Millstein (Nature, vol. 256, p495-497, 1975). Los anticuerpos TNFa policlonales de conejo anti-humano se prepararon mediante inmunización repetida de conejos blancos de Nueva Zelanda con TNFa humano recombinante emulsificado en adyuvante completo de Freund.

Supresión in vivo de la producción de TNFa de humano en un modelo adoptivo de peritonitis Métodos Una mitad de unidad de sangre venosa completa heparinizada se tomo de empleados sanos que no estaban tomando ningún tipo de medicamento. Los leucocitos polimorfonucleares se separaron al poner en capas la sangre sobre Histopaque-1077 con centrifugación a 800 x g por 30 minutos a 25°C. La porción de linfocitos/monocitos se cosechó y se lavó dos veces con DPBS (regulador de pH de fosfato salino de Dulbecco) sin Ca2+ y Mg2+ a 1000 rpm por 10 minutos a 25°C. El concentrado se resuspendió en 5 mi de DPBS sin Ca2+ y Mg2+, se dejó en capas sobre 5 mi de solución de Percoll preparado en medio RPMI 1640 el cual carecía de suero a 25°C, y se centrifugó a 550 X G por 30 minutos a 25°C. La capa llena de monocitos se removió y se lavó dos veces con DPBS sin Ca2+ y Mg2+ a 1000 rpm por 10 min a 25°C. El aislado de monocitos se lavó finalmente y se resuspendió a 6-10 x 106 célula/ml en DPBS sin Ca2+ y Mg2+ a 25°C. Los monocitos se aislaron también mediante el mismo procedimiento a partir de paquetes de Fuente de Leucocitos. Las preparaciones de monocitos tuvieron un intervalo a partir de 65 a 90% de monocitos y la viabilidad de las células fue de >97% (exclusión por azul tripán). Los machos BALB/c (Charles River Laboratories, Wilmington, MA) en grupos de 4 ó 5, se mantuvieron en instalaciones con barreras. Los ratones pesaron entre 18-25 g y los de la misma edad se inyectaron con 0.5 ml de 6-10x106 monocitos/ml dentro del peritoneo usando presión ligera sobre una jeringa de 23 ga de manera que los monocitos se expusieron a mínimas fuerzas de agitación y de estrés. Dentro de los 2 minutos en que los monocitos fueron recibidos, los ratones se trataron con un vehículo o con el compuesto mediante dosificación oral por 15 minutos. Los animales fueron inyectados intraperitonealmente (i.p.) con 0.2 ml de 125 mg/ml de endotoxina (E. coli., tipo S. Difco) disuelta en DPBS sin Ca2+ y Mg2+. Dos horas después, los animales fueron eutanizados mediante asfixia por dióxido de carbono y se inyectaron i.p. 1.5 ml de DPBS sin Ca2+ y Mg2+ (4°C). El peritoneo fue masajeado suavemente y el lavado se removió y se colocó en tubos de polipropileno en un baño de hielo. Las muestras se clarificaron mediante centrifugación (12,500xg por 5 minutos a 4°C). Los sobrenadantes se decantaron en tubos nuevos (se almacenaron a -20°C) y se evaluaron para TNFa de humano y de ratón mediante ELISA. Los valores ED50 se calcularon mediante los procedimientos estándar.

EJEMPLO 7 Métodos de aislamiento y purificación de neutrófilos humanos Los neutrófilos (PMN) se aislaron a partir de sangre heparinizada mediante centrifugación por gradientes usando Ficoll (Histopaque 1077) seguido por sedimentación en dextrán para remover los eritrocitos. Cualesquiera eritrocitos remanentes fueron usados con agua por 30 segundos y la isotonicidad se restableció usando DB-PBS 10X (c/s Ca2+ ó Mg2+). Los PMN fueron aislados mediante centrifugación y se lavaron una vez más de manera adicional con DB-PBS 1X antes de determinar el número celular y viabilidad (exclusión de colorante de azul tripán). El número de células se ajustó a 0.75-1.5x106 células/ml dependiendo del donante individual.

Degranulación (liberación de mieloperoxidasa') Una alícuota (0.1 ml) de la suspensión celular anteriormente mencionada se incubó en solución salina balanceada de Earle que contenía regulador de pH HEPES 20 mM (pH=7.4) y gelatina al 0.1 % en la presencia de 5 µg/ml de citocalasina B por 5 minutos a 37°C en un baño de agua en agitación. Las células se pre-trataron por 5 minutos adicionales con varias concentraciones de inhibidores selectivos de PDE 4 y PGE2 (3-10 nM) antes de la adición de fMLP (30 nM). Se añadió fMLP y la incubación continuó por 30 minutos adicionales. La reacción se detuvo mediante colocar las muestras sobre hielo seguido por centrifugación. La fracción sobrenadante se removió y se almacenó en refrigeración (-30°C) hasta que se realizara el ensayo para la actividad de mieloperoxidasa.

Determinación de la actividad de mieloperoxidasa La actividad mieloperoxidas se determinó usando o-diasinidina como sustrato y peroxidasa de rábano como un estándar. Una alícuota (50 µl) del sobrenadante se incubó con 100 µl de sustrato (o-dianisidina, 0.53 mM; H202, 0.147 mM; concentración final) en regulador de pH de fosfato de Na 50 mM (pH 6.0). La reacción se terminó mediante la adición de 50 µL de 4 M H2SO . La formación del producto se determinó al medir la absorbancia a 410 nm y la actividad se determinó mediante la comparación de la curva estándar usando peroxidasa de rábano. Los datos se expresaron como porcentaje de control (cantidad de mieloperoxidasa liberada en la presencia de PGE2 solo). Puesto que la inhibición máxima observada para la mayoría de los compuestos fue de 30%, los valores (IC15) se calcularon usando interpolación lineal de las concentraciones de la categoría al 15%.

EJEMPLO 8 Inversión de la hipotermia inducida por reserpina en los ratones Los ratones CF-1 o BALB/c machos se aislaron individualmente en cajas de alambre. La temperatura rectal de cada ratón se registró previamente al pretratamiento con reserpina (10 mg/kg, i.p.). Cuatro horas después de que la reserpina la temperatura rectal se registró y los animales individuales fueron recetados con varias dosis (oralmente) de cualquiera de los compuestos, vehículo, o rolipram (10 mg/kg). Las temperaturas rectales fueron registradas entonces cada 30 min por 2 hr. Los datos expresan como el cambio en la temperatura a partir de la observada a las cuatro horas por reserpina (la temperatura cayó aproximadamente 10-15° C por debajo de los niveles básales). Las curvas de respuesta a dosis se construyeron usando cambios de temperatura registrados a 90 ó 120 min después del tratamiento. Los valores ED50 se determinaron mediante análisis ED50 o regresión lineal de las medias de 6-9 animales. Para comparar la capacidad de los compuestos para inhibir la hipotermia inducida por reserpina con la capacidad para inhibir la unión de baja afinidad o la unión de alta afinidad, los valores de IC50 y ED50 se expresan como -log (valor).

EJEMPLO 9 Relación entre función biológica e inhibición de PDE4 Para determinar si ciertos efectos biológicos de la inhibición por PDE4 se asociaban con la inhibición de ya sea LPDE 4 o de HPDE 4 se determinó una comparación entre la capacidad de los compuestos para producir un efecto y la capacidad de los compuestos para inhibir LPDE 4 y HPDE 4 usando una correlación lineal y de orden en rango. Estas correlaciones pueden influirse por varios factores: 1 ) la estabilidad de los compuestos; 2) capacidad de compuestos para entrar a las células; 3) estudios in vivo, la biodisponibilidad de los compuestos; 4) los valores de correlación, especialmente la correlación lineal que son sensibles a las diferencias en potencias, el mayor intervalo de valores de potencia que son más fáciles para medir como correlaciones significantes lineales. Estas inscripciones previas se tomaron en consideración cuando se analizó y resumió la correlación entre la inhibición de LPDE 4 o HPDE 4 y la función biológica de varios sistemas de ensayo. Usando células inflamatorias aisladas, la supresión de la producción de TNFa por el monocito y la inhibición de la producción de superóxido en el cuyo en cuanto a eosinófilos se correlacionó mejor con la inhibición de LPDE 4 y no de HPDE 4. Además, la prevención de la broncoconstricción inducida por antígenos in vivo se correlacionó mejor con la inhibición de LPDE 4 que con HPDE 4. En este modelo in vivo, el inhibidor LPDE 4 parece accionar al prevenir la célula cebada de la degranuiación (Underwood et al., en prensa). Sin embargo, la inhibición de la función de la célula inflamatoria no siempre se asocia con la inhibición de LPDE 4 debido a que se encontró que la inhibición de la degranulación de neutrófilo se correlacionó mejor con la inhibición de HPDE 4 que con LPDE 4. Por lo tanto parece que en algunas pero no en todas las actividades celulares de inflamación o de supresión se asociaron con la inhibición de LPDE 4. En contraste, la mejoría de la secreción de ácido, producción de emesis y retroceso de hipotermia inducida por reserpina (una medida del potencial " psicotrópico de los inhibidores PDE 4) se relacionó mejor con la inhibición de HPDE 4 y no con LPDE 4. Por lo tanto la mayoría de los efectos laterales potenciales de esta clase de compuestos se asocian con la inhibición de HPDE 4. Por lo tanto estos hallazgos sugieren que los compuestos que preferiblemente inhiben LPDE 4 producirán efectos anti-inflamatorios benéficos con potencial reducido para producir efectos laterales no deseados. Por lo tanto los compuestos seleccionados con una relación IC50 de aproximadamente 0.1 o mayor como para el IC50 para la forma catalítica de PDE 4 la cual se une a rolipram con una afinidad mayor dividido por el IC50 para la forma catalítica de PDE 4 la cual se une a rolipram con una afinidad baja (HPDE 4/LPDE 4) debe resultar en un incremento en su índice terapéutico, es decir, el efecto saludable se maximiza y el efecto deletéreo se minimiza. Para determinar si esta guía de selección podría de hecho identificar compuestos con un índice terapéutico mejorado, se evaluaron tres modelos que comparaban un efecto terapéutico con un efecto lateral. Esto incluyó una comparación in vitro entre la capacidad de compuestos para suprimir la producción de TNFa a partir de monocitos humanos aislados con su capacidad para estimular la secreción de ácido en glándulas parietales de conejo aisladas y de dos comparaciones in vivo que examina la capacidad de los compuestos para prevenir la broncoconstricción inducida por antígeno en los cuyos y la capacidad para producir emesis en perros y ia capacidad de los compuestos para suprimir la producción de TNFa en un modelo de transferencia adoptivo en los ratones y su capacidad para revertir la hipotermia inducida por reserpina en ratones. Los inhibidores PDE 4 con una relación de selectividad (HPDE 4/LPDE 4) igual o mayor que 0.1 mostraron una mejoría marcada en su índice terapéutico. Por ejemplo, cis-[4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1 -carboxilato], 2-carboximetoxi-4-ciano-4-(3-coiclopropilmetox¡-4-difIuorometoxifenil)ciclohexano-1 -ona, y cis-[4-ciano-4-(3-c?clopropilmetoxi-4-difluorometoxifenil)ciclohexan-1-ol] todos los cuales tienen una relación de selectividad de >0.1 demuestran una mejoría de 100 veces en su índice terapéutico en comparación con el inhibidor arquetípico de PDE 4, R-rolipram. Por lo tanto, esto demuestra que usando la guía de selección de HPDE 4 IC50/LPDE 4 ICso=O.1 se identifican los compuestos con un índice de comparación terapéutico incrementado in vitro. En consideración para tratar EIA, el compuesto cis-[4-ciano-4-(3-ciclopentiloxÍ-4-metoxifenil)ciclohexan-1 -carboxilato] se administró a los humanos que padecen de EIA. Estos sujetos experimentaron inflamación reducida, broncodilatación y neumomodulación pulmonar.

Estudio de reto por ejercicio Un estudio al azar, de doble ciego, con placebo controlado, de doble período se condujo para evaluar la eficiencia, seguridad y tolerabilidad de cis-[4-ciano-4-(3-ciclopentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1 -carboxilato] en los pacientes con EIA. 27 pacientes con EIA recibieron el compuesto al azar, una tableta o placebo con 10 mg de BID de liberación inmediata, durante siete días seguido por siete días sin y con el tratamiento alternativo de siete días. La prueba de reto por ejercicio se llevó a cabo después de una sola dosis en el día 1, y de nuevo en el día 7 (predosis y postdosis a tres horas). La población de pacientes consistió de hombres o mujeres no fumadores de edades entre 18 y 60 años con EIA tales como: a) su volumen expiratorio forzado en un segundo (FEV-i) fue mayor que o igual al 70% de los sujetos pronosticados como normales, b) la caída documentada en FEVi fue mayor que o igual a 15% en la respuesta a la prueba de ejercicio en una visita de selección, y c) estos no estaban tomando corticoesteroides inhalados u otros medicamentos para controlar el asma. El protocolo de cambio de ejercicio fue como sigue. Los pacientes se ejercitaron sobre una caminadora motorizada durante seis minutos a una velocidad de corazón determinada. La velocidad y la inclinación se ajustaron para lograr una velocidad de corazón determinada para cada paciente de 85% del pronóstico máximo ajustado a la edad. Los pacientes tomaron aire comprimido (humedad al 0% a temperatura ambiente) durante la prueba a través de una mascara facial. La prueba de función pulmonar (KoKo pneumotach) se llevó a cabo a 1 , 5, 10, 15, 20, 30 y 45 minutos después de completar la prueba y se continuó después si el FEVi no había regresado a la línea basal de 10%.

La variable primaria de eficiencia fue el porcentaje máximo de decremento (MPD) en el FEVi en respuesta al ejercicio. Los resultados indicaron mejoría significante en MPD FEVi después de una dosis del compuesto, para una media de MPD de 32.88 a 23.57%. Hubo un efecto de incremento de los compuestos después de 7 días de dosis con mejoría adicional en una medía de MPD FEV-i a 21.8%. Después de una semana de tratamiento, 40% de los pacientes que recibían el compuesto tuvieron una caída en FEVi o menos que o igual que 15% después del ejercicio. El compuesto fue seguro y bien tolerado, sin experiencias adversas y serias relacionadas con el tratamiento o desventajas. Véase también, Am. J. Resp. Crit Med. 1998: 157;A413, incorporado aquí en su totalidad como referencia. Todas las publicaciones, incluyendo pero no limitadas a las patentes y solicitudes de patentes citadas en esta especificación se incorporan aquí como referencia como si cada publicación individual fuera indicada específicamente e individualmente a ser incorporada como referencia como se ha indicado ampliamente.

Claims (4)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un inhibidor específico de PDE4 en la fabricación de un medicamento para uso para prevenir o tratar asma inducido por ejercicio, asma inducido por aire frío o asma inducido por contaminación en un mamífero que puede padecer o que está padeciendo en donde el inhibidor es uno capaz de inhibir ta forma catalítica de PDE4 que se une a R-rolipram con una baja afinidad, y donde el inhibidor tiene una relación IC50 de alrededor de 0.1 o mayor en relación con IC50 de la forma PDE4 la cual se une a R-rolipram con una alta afinidad dividida por el IC50 de la forma catalítica el cual se une a R-rolipram con una baja afinidad.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la relación de IC50 es 0.5 o mayor.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde la relación de IC50 es 1.0 o mayor. ,

4.- El uso como el que se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el compuesto usado es c/s-[4-ciano-4-(3-ciclofentiloxi-4-metoxifenil)ciclohexan-1 -carboxilato] y este se fabrica como una preparación de liberación inmediata oral o como una preparación oral para liberación controlada.