MXPA01005689A - Metodo para el tratamiento del sindrome purpura trombocitopenico y hemolitico uremico - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona un método para el tratamiento del síndrome trombótico púrpura trombocitopénico (TTP) y urémico hemolítico (HUS) con proteína C. La invención reivindicada proporciona una terapia necesaria para un desorden potencialmente serio y debilitante mientras evita complicaciones tales como tendencia a la hemorragia, toxicidad y efectos colaterales generales de los agentes anti-coagulantes de intercambio de plasma o actualmente disponibles.

Description

MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DEL SÍNDROME PURPURA TROMBOCITOPÉNICO Y HEMOLITICO UREMICO Campo de la Invención.

Esta invención se refiere a una ciencia medica, particularmente al tratamiento del síndrome trombótico púrpura t romboci topénico y hemolitico urémico con proteina C.

Antecedentes de la Invención.

La proteina C es una vitamina K dependiente de la proteasa de serina y anticoagulantes que ocurren naturalmente que juegan un papel en la regulación de la hemostasis inactivando los Factores Va y Villa en la cascada de la coagulación. La proteina C humana circula como' un zimógeno de 2 cadenas, pero funciona en la superficie endotelial y de trombocitos después de la conversión a la proteina C activada (aPC) por proteólisis limitada con trombina en complejo con la proteina de membrana de superficie de célula, t rombomodulina . REF. 128393 En conjunción con otras proteínas, la aPC funcional quizás como el más importante regulador reductor de la coagulación de la sangre resultando en una protección contra la trombosis. Adicionalmente, a estas funciones de anticoagulación, la aPC tiene efectos antiinflamatorios a través de su inhibición de la generación de citocina (por ejemplo TNF e IL-1) y también ejerce propiedades pro fibrinol i t icas , tales como la inhibición de PAI-1, que facilita la lisis del coagulo. De esta manera, el sistema de enzima de proteina C representa un mecanismo fisiológico mejor de ant i-coagulación, antiinflamación, y fibrinólisis.

El síndrome trombótico púrpura tromboci topénico (TTP) y hemolitico urémico (HUS) son definidos como microangiopat i as trombóticas caracterizadas por la oclusión de arteriolas y capilares por microtrombos , tromboci topénia , deterioro de función neurológica y falla renal progresiva. El TTP habia sido definido como una enfermedad multisistema caracterizada por fiebre, anormalidades del sistema nervioso central variables, falla renal, anemia hemolitica microangiopática y trombocitopénia. El HUS se caracterizó por anemia hemolitica intravascular asociada con células rojas fragmentadas; trombocitopénia; y daño terminal al órgano con ya sea (a) evidencia histológica de un proceso microangiopát ico trombótico (más comúnmente en los riñones), o (b) evidencia clínica de tales daños en ausencia de cualquier otra enfermedad o causa probable [Neild, G., Kidney International 53(Suppl. 64): S-45-S-49, 1998].

Los factores que contribuyen a la patofisiologia de TTP/HUS se consideran que son el daño a la célula endotelial y la agregación de trombocitos primarios [Moa e, Seminars in Hematology, 34(2): 83-89, 1997]. El daño endotelial conduce a la liberación de multi eros de factor von Willebrand inusualmente largos (UL vWF) , que conducen nuevamente a la agregación del trombocito. El trombo de fibrina se acumula en la plaqueta del trombo como un resultado de la depresión de los sistemas fibrinoliticos del cuerpo. En los HUS y TTP, se han encontrado niveles elevados del inhibidor activador del plasminógeno (PAI-1) y niveles reducidos de actividad de Proteina C.

El TTP se asocia con infecciones bacteriales de la Ba r t on el l a sp., asi como con VIH y sarcoma de Kaposi visceral [Avery et al, American Journal of Hematoloqy, 58:148-149, 1998]. El TTP también se asocia con el uso de numerosos fármacos, por ejemplo, ticlopidina, FK506, cort icos teróides de alta dosis, tamoxifen, o ciclosporin A [Gordon y colaboradores, Seminars in Hematology, 34(2): 140-147, 1997] .

El HUS se asocia con numerosas infecciones bacteriales, por ejemplo, cepa E. coli 0157:H7, Shigella, Pneumococci, Streptococci hemolitico, o Yersinia. El HUS también se asocia con infecciones virales, por ejemplo, VIH, Coxsackie, o adenovirus. Adicionalmente, el HUS se asocia con el uso de numerosos fármacos similares a aquellos enlistados anteriormente para el TTP [Gordon y colaboradores, 1997]. Tanto el TTP y el HUS se asocian con complicaciones durante el embarazo [Eger an y colaboradores, Am J Obstet Gynecol, 175: 950-956, 1996].

Los hallazgos clínicos de microangiopat ias trombóticas incluyen la anemia hemolitica microangiopática (MAHA), falla renal aguda, trombocitopénia y en el TTP, cambios neurológicos agudos. Los TTP y HUS que salen sin tratar, tienen una pobre prognosis con rangos de mortalidad que alcanzan el 90%. Los pacientes sobrevivientes desarrollan frecuentemente una enfermedad renal de etapa terminal. El único método de tratamiento con un resultado favorable ha sido el intercambio de plasma [PE] con plasma congelado fresco [Hollenbeck y colaboradores, Nephrol Dial Transplant 13: 76-81, 1998]. Sin embargo, ocurren todavía decesos y muchos pacientes sufren de complicaciones a largo plazo aún si se tratan con PE. Por lo consiguiente, existe la necesidad de un tratamiento más efectivo de TTP y/o HUS.

La presente invención es la primera en describir el tratamiento de TTP y/o HUS con proteina C. La proteina C, con sus actividades anticoagulantes y profibrinol iticas junto con su habilidad para inactivar el PAI-1, es útil para el tratamiento de la oclusión de arteriolas y capilares por microtrombos que ocurren en pacientes con TTP y HUS.

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método de tratamiento para un paciente que sufre del trombótico púrpura tromboci topénico (TTP) el cual comprende, administrar a dicho paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un método de tratamiento a un paciente que sufre del síndrome hemolitico uré ico (HUS) el cual comprende, administrar a dicho paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C.

En otra forma de realización, la presente invención proporciona un método para el tratamiento del trombótico púrpura tromboci topénico (TTP) en un paciente que necesite del mismo, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C activada de tal manera que se ejecuta un nivel de plasma de proteina C activada de alrededor de 2 ng/ml hasta alrededor de 300 ng/ml .

Todavía en otra forma de realización, la presente invención proporciona un método de tratamiento del síndrome hemolitico urémico (HUS) en un paciente que necesite del mismo, el cual comprende administrar a dicho paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C activada de tal manera que se ejecuta un nivel de plasma de proteina C activada de alrededor de 2 ng/ml hasta alrededor de 300 ng/ml.

Descripción Detallada de la Invención.

Para propósitos de la presente invención, como se describe y se reivindica en la presente, los siguientes términos son como se define a continuación .

La proteina C se refiere a una vitamina K dependiente de la proteasa de serina con propiedades anticoagulantes, ant i-inflamatorias , y prof ibr inol i ticas las cuales incluyen, pero no se limitan a, proteina C producida de derivado de plasma y recombinante. La proteina C incluye y es preferiblemente proteina C humana no obstante que la proteina C puede también incluir otras especies o derivados que tienen actividades de proteina C proteolit ica , amidolitica, esterolit ica , y biológica (anticoagulante, profibrinolit ico, y ant i-inflamatorio ) . Ejemplos de derivados de proteina C son descritos por Gerlitz y colaboradores, Patente U.S. No. 5,453,373, y Foster y colaboradores, Patente U.S. No. 5,516,650, de las cuales las enseñanzas completas son incluidas por la presente para referencia.

El zimógeno es un precursor enzimat icamente inactivo de una enzima proteolitica . El zimógeno de proteina C, como se usa en la presente, se refiere a un segregado, formas inactivas, si son de una cadena o dos cadenas, de proteina C.

La proteina C activada o aPC se refiere a un zimógeno de proteina C el cual se convierte por proteólisis limitada para su forma activada. La aPC incluye, y es preferiblemente, proteina C humana, no obstante que la aPC puede también incluir otras especies o derivados que tienen actividades de proteina C proteol it ica , amidólitica, esterol it ica , y biológica (anticoagulante o profibrinolit ica ) . Ejemplos de derivados de proteina C son notados anteriormente en la descripción de la proteina C.

HPC - zimógeno de proteina C humana. r-hPC zimógeno de proteina C humana recombinante r-aPC - proteina C activada humana recombinante producida por activación de r-hPC in vitro o por secreción directa de la forma activada de proteina C a partir de células procarióticas, células eucarióticas, y animales o plantas transgénicos, incluyendo, por ejemplo, secreción de las células del riñon humano 293 como un zimógeno entonces purificado y activado por técnicas bien conocidas por los artesanos hábiles y demostradas en Yan, Patente U.S. No. 4,981,952, y Cottingham, O97/20043, las enseñanzas enteras de estas se incorporan en la presente para referencia .

La proteina C activada derivada del plasma es la proteina C activada producida activando el plasma HPC como se describie en Eibl, Patente U.S. No. 5,478,558, la enseñanza entera de esta se incorpora en la presente para referencia.

Infusión continua - continúa substancialmente sin interrupción la introducción de una solución dentro de una vena por un periodo especifico de tiempo .

Inyección de bolos - la inyección de un fármaco en una medida definida (llamada bolos) durante un periodo de tiempo hasta alrededor de 120 minutos .

Apropiado para la administración - una formulación o solución liofilizada que es apropiada para darse como un agente terapéutico.

Forma de dosis unitaria - se refiere a unidades discretas físicamente apropiadas como dosis unitarias para sujetos humano, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéuticamente apropiado.

Cantidad farmacéuticamente efectiva representa una cantidad de un compuesto de la invención que es capaz de inhibir la sepsis en humanos. La dosis particular del compuesto administrado de conformidad con esta invención, por supuesto, se determina por el medico evaluador que atiende las circunstancias circundantes al caso .

La presente invención proporciona para el tratamiento del síndrome trombótico púrpura trombocitopénico (TTP) y hemolitico urémico (HUS) con proteina C. El TTP se define como una enfermedad muí t is is tema caracterizada por fiebre, anormalidades del sistema nervioso central variables, falla renal, anemia hemolitica microangiopática y trombocitopenia. El HUS se caracteriza por anemia hemolitica int ravascul ar asociada con células rojas fragmentadas; trombocitopénia; y daño terminal al órgano con ya sea (a) evidencia histológica de un proceso microangiopát ico trombótico (más comúnmente en los riñones), o (b) evidencia clínica de tales daños en ausencia de cualquier otra enfermedad o probable causa. La proteina C, con sus actividades anticoagulantes y profibrinol iticas junto con su habilidad para inactivar el PAI-1, es útil para el tratamiento de la oclusión de arteriolas y capilares por microtrombos que ocurren en pacientes con TTP y HUS.

La proteina C administrada de conformidad con esta invención puede ser generada y/o aislada por cualquier medio conocido en la técnica, o como se describe en la Patente U.S. No. 4,981,952, y la Patente U.S. No. 5,550,036, incorporadas en la presente para referencia. Por ejemplo, la invención proporciona un método para producir y segregar la proteina C soluble, de longitud completa, o variantes de polipéptido biológicamente activo de proteina C a partir de una célula que comprende (a) construir un vector que comprende ADN que codifica la proteina C; (b) transfectar la célula con el vector; y (c) cultivar la célula de esta manera transfectada en un medio de cultivo bajo condiciones tales que la proteina C soluble de longitud completa o variantes de polipéptido biológicamente activo de proteina C, se secreta. Adicionalmente, la célula es una célula eucariótica, por ejemplo, célula de mamífero tal como célula AV12 de hámster Sirio, célula 293 embriónica humana, o célula de riñon de hámster bebe .

La proteina C usada en el tratamiento de TTP/HUS pueden formularse de conformidad con los métodos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Por Ejemplo, una formulación deseada podría ser una que es un producto liofilizado estable de alta pureza que comprende un agente de volumen tal como sacarosa, una sal tal como cloruro de sodio, una solución amortiguadora tal como citrato de sodio y proteina C ó aPC.

La proteina C se administra parenteralmente para asegurar su liberación dentro del torrente sanguíneo en una forma efectiva inyectando la dosis apropiada como una infusión continua desde alrededor de 1 hora hasta alrededor de 240 horas.

Aquellos hábiles en la técnica pueden optimizar fácilmente las dosis farmacéuticamente efectivas y regímenes de administración para composiciones terapéuticas que comprenden proteina C, como se determina por buena practica medica y la condición clínica del paciente individual. Generalmente, la cantidad de proteina C administrada puede ser desde alrededor de 5.0 µg/kg/hora hasta alrededor de 250 µg/kg/hora. Preferiblemente, la proteina C que se usó en el tratamiento de TTP/HUS es proteina C activada. La cantidad de aPC administrada puede ser desde alrededor de 1.0 µg/kg/hora hasta alrededor de 96 µg/kg/hora. Más preferiblemente la cantidad de aPC administrada puede ser puede ser desde alrededor de 1.0 µg/kg/hora hasta alrededor de 50 µg/kg/hora. Mientras más preferiblemente la cantidad de aPC administrada puede ser de alrededor de 1.0 µg/kg/hora hasta alrededor de 35 µg/kg/hora. Aún más preferiblemente la cantidad de aPC administrada puede ser de alrededor de 5.0 µg/kg/hora hasta alrededor de 30 µg/kg/hora. Todavía aún más preferiblemente la cantidad de aPC administrada puede ser alrededor de 15 µg/kg/hora hasta alrededor de 30 µg/kg/hora. Todavía aún más preferiblemente la cantidad de aPC administrada puede ser alrededor de 20 µg/kg/hora hasta alrededor de 30 µg/kg/hora. La cantidad más preferible de aPC administrada será de alrededor de 24 µg/kg/hora. La dosis apropiada de aPC puede resultar en una reducción de las oclusiones de arteriolas y capilares por un microtrombo que ocurre en pacientes con TTP y HUS .

Los rangos de plasma obtenidos de la cantidad de aPC administrada serán de alrededor de 2 ng/ml hasta alrededor de 300 ng/ml. Los rangos de plasma preferidos son desde alrededor de 2 ng/ml hasta alrededor de 200 ng/ml. Más preferiblemente, los rangos de plasma son desde alrededor de 30 ng/ml hasta alrededor de 150 ng/ml y todavía más preferiblemente de alrededor de 100 ng/ml.

Alternativamente, la aPC puede administrarse inyectando un tercio de la dosis apropiada por hora como una inyección de bolos, seguido por los dos tercios restantes de la dosis por hora como infusión continua por una hora seguido por la infusión continua de la dosis apropiada por veintitrés horas resultanDO en la dosis apropiada administrada durante 24 horas. Adicionalmente, la inyección de bolos puede administrase por medio de una bomba de goteo de bolsa intravenosa o bomba de jeringa a alrededor de 2 veces la relación normal por alrededor de 10 hasta 20 minutos, seguido por alrededor de 1.5 veces la relación normal por alrededor de 40 hasta 50 minutos. La relación normal, es decir, la relación a la cual se determina administrar el nivel de dosis apropiada del agente terapéutico por un periodo de tiempo, se continua entonces por hasta 240 horas.

El uso de la proteina C en el tratamiento de TTP/HUS como se presenta en la presente invención, puede proporcionar una terapia requerida por desordenes debilitantes y potencialmente serios. El uso de la proteina C es eficaz y evita las complicaciones tales como toxicidad y efectos colaterales generales de la terapia actualmente disponible de intercambio de plasma [PE] con plasma congelado fresco u otros agentes anticoagulantes actualmente disponibles.

Los siguientes ejemplos se proporcionaron para ilustrar adicionalmente la presente invención. El alcance de la invención no se construye como que únicamente consiste de los siguientes ejemplos.

Preparación 1 Preparación de la proteina C humana La proteina C humana recombinante (r-hPC) se produjo en células 293 de riñon humano por técnicas bien conocidas por los artesanos hábiles, tales como aquellas publicados en Yan, Patente U.S. No. 4,981,952, la enseñanza completa de la cual se incorpora en la presente para referencia. El gen que codifica la proteina C humana se describe y se reivindica en Bang, y colaboradores, Patente U.S. No. 4,775,624, la enseñanza completa de la cual se incorpora en la presente para referencia. El plásmido usado para expresar la proteina C humana en células 293 es el plásmido pLPC el cual se describe en Band, y colaboradores, Patente U.S. No. 4,992,373, la enseñanza completa de esta se incorpora en la presente para referencia. La construcción del plásmido pLPC también se describe en la Publicación de Patente Europea No. 0 445 939, y en Grinnell y colaboradores, 1987, Bio/Technology 5:1189-1192, las enseñanzas de la cual se incorporan en la presente para referencia. Brevemente, el plásmido se transfectó dentro de las células 293, entonces se identificaron los transformantes estables, subcul tivados y crecidos en medios libres de suero. Después de la fermentación, el medio libre de célula se obtuvo por microf iltración .

La proteina C humana se separó del fluido de cultivo por una adaptación de las técnicas de Yan, Patente U.S. No. 4,981,952. El medio clarificado se elaboro en 4 M de EDTA antes de absorberse en una resina de intercambio aniónico (Fast-Flo Q, Pharmacia) . Después de lavar con 4 volúmenes de columna de 20 mM de Tris, 200 M de NaCl, pH de 7.4 y 2 volúmenes de columna de 20 mM de Tris, 150 M de NaCl, pH de 7.4, el zimógeno de la proteina C humana recombinante unido se eluyó con 20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 10 M de CaCl2, pH de 7.4. La proteina eluida fue mayor que el 95% de pureza después de la elución como se juzgó por la electroforesis en gel de SDS-poliacri lamida .

La purificación adicional de la proteina se completó elaborando la proteina 3 M en NaCl seguido por la absorción a una resina de interacción hidrofóbica (Toyopearl Phenyl 650 M, TosoHaas) equilibrada en 20 mM de Tris, 3 M de NaCl, 10 mM de CaCl2, pH de 7.4. Después de lavar en 2 volúmenes de columna equilibradas en solución amortiguadora sin CaCl2, la proteina C humana recombinante se eluyó con 20 mM de Tris, pH de 7.4.

La proteina eluida se preparó para su activación por la remoción de residuos de calcio. La proteina C humana recombinante se pasó sobre una columna de afinidad metálica (Chelex-100, bioRad) para remover calcio y nuevamente unir a un anión de intercambio (Fast-Flow Q, Pharmacia). Ambas de estas columnas se prepararon en serie y se equilibraron en 20 mM de Tris, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, pH de 7.4. Después de cargar la proteina, la columna Chelex-100 se lavó con un volumen de columna de la misma solución amortiguadora antes de desconectarla de las series. La columna de intercambio de aniónico se lavó con 3 volúmenes de columna de solución amortiguadora equilibrante antes de eluir la proteina con 0.4 M de NaCl, 20 mM de Tris-acetato, pH de 6.5. Las concentraciones de proteina de la proteina C humana recombinante y soluciones de proteina C activada recombinante se midieron por extinción UV 280 nm E°-1%=1 1.85, respectivamente .

Preparación 2 Activación de Proteina C humana recombinante Se acopló trombina de bovino a CH-sefarosa 4Bactivada (Pharmacia) en presencia de 50 mM de HEPES, pH 7.5 a 4°C. La reacción de acoplamiento se completó en resina ya empaquetada dentro de una columna usando aproximadamente 5000 unidades de trombina/ml de resina. La solución de trombina se circuló a través de la columna por aproximadamente 3 horas antes de agregar 2-aminoetanol (MEA) a una concentración de 0.6 mL/L de solución circulada. La solución que contenia MEA se circuló por 10-12 horas adicionales para asegurar la obstrucción completa de las aminas no reactivas en la resina. Después del bloqueo, la resina acoplada a la trombina se lavó con 10 volúmenes de columna de 1 M de NaCl, 20 mM de Tris, pH 6.5 para remover todas las proteínas no unidas específicamente, y se usó en reacciones de activación después de equilibrar en solución amortiguadora de activación .

La r-hPC purificada se elaboró con 5 mM en EDTA (para quelatar cualquier residuo de calcio) y se diluyó hasta una concentración de 2 mg/mL con 20 mM de Tris, pH de 7.4 ó 20 mM de Tris-acetato, pH de 6.5. Este material se pasó a través de una columna de trombina equilibrada a 37°C con 50 mM de NaCl y ya sea 20 mM de Tris pH de 7.4 ó 20 mM de Tris-acetato pH de 6.5. La relación de flujo se ajustó para permitir por aproximadamente 20 minutos un tiempo de contacto entre el r-hPC y la resina de trombina. El efluente se colectó y se ensayó inmediatamente para su actividad amidolitica. Si el material no tiene una actividad especifica (amidolitica) comparable a un estándar establecido de la proteina C, esta se recicla sobre la columna de trombina para activar el r-hPC hasta finalizar. Esto se siguió por una dilución 1:1 del material con 20 mM de solución amortiguadora como anteriormente, con un pH de ya sea 7.4 ó 6.5 para mantener la proteina C a concentraciones bajas, mientras esperaba el próximo paso de procesamiento.

La remoción de la trombina lixiviada del material de la proteina C se ejecutó enlazando la proteina C a una resina de intercambio aniónico (Flast Flow Q, Pharmacia) equilibrada en solución amortiguadora de activación (ya sea 20 mM de Tris, pH 7.4 ó 20 mM de Tris-acetato, pH 6.5) con 150 mM de NaCl. La trombina no interactúa con la resina de intercambio iónico bajo estas condiciones, pero se pasa a través de la columna en la muestra de efluente de aplicación, una vez que la proteina C se ha cargado en la columna, de 2-6 volúmenes de columna se lavan con 20 mM de solución de equilibrio dada antes de eluir la proteina C enlazada con un paso de elusión usando 0.4 M de NaCl en ya sea 5 M de Tris -acet ato , pH 6.5 ó 20 mM de Tris, pH 7.4. Volúmenes de lavado mayores de la columna facilitan una remoción más completa del dodecapépt ido . El material eluido de esta columna se almacena ya sea en una solución congelada (-20°C) o como un polvo liofilizado.

La actividad anticoagulante de la proteina C activada se determinó midiendo la prolongación del tiempo de coagulación en el ensayo de coagulación de tiempo de tromboplas t ina parcial activada (APTT) . Se preparó una curva estándar en solución amortiguadora de dilución (1 mg/mL de albúmina de suero bovino de grado radioinmumoensayo [BSA], 20 mM Tris, pH de 7.4, 150 M de NaCl, 0.02% NaN3) con un rango en la concentración de proteina C desde 125-1000 ng/mL, mientras se prepararon muestras a varias diluciones en este rango de concentración. A cada una de las cubetas de muestra, se les agregó 50 µL de plasma de caballo congelado y 50 µL de reactivo de tiempo de tromboplas tina parcial activada reconstituido (reactivo APTT, Sigma) y se incubaron a 37°C por 5 minutos. Después de la incubación, se agregó 50 µL de las muestras apropiadas o estándares a cada una de las cubetas. La solución amortiguadora de disolución se usó en espacios de la muestra o el estándar para determinar el tiempo de coagulación de base. El tiempo del fibrometro (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) se inició inmediatamente después de la adición de 50 µL a 37°C de 30 M de CaCl2 para cada una de las muestras o estándares. La concentración de proteina C activada en las muestras se calculó a partir de la ecuación de regresión lineal de la curva estándar. Los tiempos de coagulación reportados en la presente son el promedio de un minimo de tres replicas, incluyendo muestras de curva estándar.

Las descripciones anteriores permiten a alguien con habilidad apropiada en la técnica, preparar la proteina C para utilizarla en el tratamiento del síndrome trombótico t rombocitopénico púrpura y urémico hemolitico.

Preparación 3 Formulación de la Proteina C activada Una formulación liofilizada estable de proteina C activada se preparó por un proceso el cual comprende liofilizar una solución que comprende alrededor de 2.5 mg/mL de proteina C activada, alrededor de 15 mg/mL de sacarosa, alrededor de 20 mg/mL de NaCl, y una solución amortiguadora de citrato de sodio que tiene un pH mayor que 5.5 pero menor que 6.5. Adicionalmente, la formulación liofilizada estable de proteina C activada comprende liofilizar una solución que comprende alrededor de 5 mg/mL de proteina C activada, alrededor de 30 mg/mL de sacarosa, alrededor de 38 mg/mL de NaCl, y una solución amortiguadora de citrato que tiene un pH mayor que 5.5 pero menor que 6.5.

La relación de proteina C:sal:agente de volumen (p:p:p) es un factor importante en una formulación adecuada para el proceso de secado por congelamiento. Las diferentes relaciones dependen en la concentración de proteina C, selección de sal y concentración y selección y concentración del agente de volumen. Particularmente, se prefiere una relación de alrededor de 1 parte de proteina C activada para alrededor de 7.6 partes de sal para alrededor de 6 partes de agente de volumen .

Una formulación de dosis unitaria de proteina C activada apropiada para la administración por infusión continua se prepara mezclando proteina C activada, NaCl, sacarosa, y solución amortiguadora de citrato de sodio. Después de mezclar, 4 mL de solución se transfiere a un receptáculo de dosis unitaria y se liofiliza. El receptáculo de dosis unitaria contiene alrededor de 5 mg hasta alrededor de 20 mg de proteina C activada, apropiada para administrar una dosis de alrededor de 0.01 mg/kg/hora hasta alrededor de 0.05 mg/kg/hora a pacientes que necesiten del mismo, se sella y se almacena hasta usarse.

Ejemplo 1 Una prueba aleatoria controlada por placebo de doble ciego de proteina C activada recombinante (r-aPC) en el tratamiento de microangiopat ia trombótica .

El síndrome hemolitico urémico y trombótico troboci topénico púrpura (TTP) son dos tipos de microangiopat ia trombótica que tiene daño endotelial como el evento incitante. En estos estados de enfermedad, la endotelia es por ya sea verotoxinas de- organismos infecciosos tal como E. coli 0157:H7 y Shigella, fármacos tales como FK506 y t riclopidina , o autoant icuerpos . El daño endotelial conduce a la liberación de multimeros del factor von Willebrand inusualmente largos, y llevan de vuelta a la agregación de trombocitos. El trombo de fibrina se acumula en la plaqueta del trombo como resultado de la depresión del sistema fibr inolitico del cuerpo.

En los HUS y TTP, se encuentran elevados niveles de inhibidor del activador de plasminógeno (PAI-1) y niveles reducidos de actividad de proteina C. Los hallazgos clínicos de microangiopatias trombóticas incluyen anemia hemolitica microangiopática (MAHA) , falla renal aguda, trombocitopenia, y en TTP, cambios neurológicos agudos.

El objetivo primario de este experimento es el mostrar que la infusión de r-aPC lleva a una reducción estadísticamente significante en el tiempo de disminución de la enfermedad comparado con el placebo. Los objetivos secundarios están para mostrar que la infusión de r-aPC lleva a reducciones estadísticamente significativas en el número de dias con falla renal, número de transfusiones requeridas, y número de episodios convulsivos. El objetivo de seguridad primario de este experimento está para mostrar que r-aPC no lleva a un incremento estadísticamente significante en el número de eventos de hemorragias clínicamente significantes cuando se compara al placebo.

Los criterios de inclusión para los pacientes considerados para entrar en el experimentos es evidencia de una microangiopat ia trombótica como se define por la presencia de: 1) Trombocitopenia definida como un recuento de trombocitos <80X 106 células /Litro ; 2) anemia microangiopática hemolitica (MAHA) definida que tiene >2 esquiocitos por campo visual en la extensión de sangre periférica, una prueba de Coomb negativa directa e indirecta, y un Hgb de <10g/dl; 3 ) insuficiencia renal aguda definida como una duplicación en la creatinina de suero de linea base en el paciente o la presencia de oliguria definida como una salida de orina <0.5 ml/kg/hora; y 4) tiempos de coagulación normal (PT, PTT y fibrinógeno) . Los pacientes se excluyen del experimentos si estos han recibido un anticoagulante o un agente de investigación. Los pacientes con hemorragia activa del tracto respiratorio o gastrointestinal se excluyen del estudio .

Los pacientes que reúnen todos los criterios de inclusión y ningún criterio de exclusión se sortean para recibir ya sea placebo o una infusión de 96 horas de r-aPC a una dosis de hasta 48 µg/kg/hora, que se ha mostrado previamente para alcanzar el aPTT hasta 2X de linea base. Los siguientes datos se recolectan durante el estudio: Hgb, recuento de trombocitos, creatinina del suero, salida de orina 24, número de episodios de convulsión, y número de paquetes de células de glóbulos rojos en transfusión. El punto final analizado, esto es, el tiempo para la disminución de la enfermedad, se define por un recuento de trombocitos persistentes por 2 dias en ausencia de transfusiones de trombocitos de >100 X 109 células/Litro .

Por lo tanto, la terapia con r-aPC, con sus actividades anticoagulantes y profibrinolit icas junto con sus habilidades para inactivar la PAI-1, es útiles para el tratamiento de la microangiopat ia trombótica que ocurre en pacientes con TTP y HUS.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención .

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. El uso de un medicamento parar el tratamiento de un paciente que sufra de púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) caracterizado porque comprende, administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C.

2. El uso de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina C es el zimógeno de la proteina C humana.

3. El uso de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina C es la proteina C activada, humana.

4. El uso de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque la cantidad de la proteina C activada, humana (ilegible) .

5. El uso de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque la cantidad de proteina C activada, humana, es de 24 µg/kg/hora.

6. El uso de la reivindicación 4 o de la reivindicación 5, caracterizado porque la proteina C activada, humana, se administra mediante la infusión continua por un tiempo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 horas.

7. El uso de un medicamento para el tratamiento de un paciente que sufra de púrpura trombocitopénica trombótica y el síndrome hemolitico urémico en un paciente que necesite del mismo, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C activada, de manera tal que se consiga un nivel plasmático (en el plasma) de la proteina C activa de aproximadamente (ilegible) .

8. El uso de la reivindicación 7, caracterizado porque la proteina C activada se administra en una inyección de bolo.

9. El uso de la reivindicación 7, caracterizado porque la proteina C activada se administra mediante infusión continua por un tiempo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 horas.

10. El uso de la reivindicación 7, caracterizado porque la proteina C activada se administra primero como un bolo y luego como una infusión continua.

11. El uso de la reivindicación 10, caracterizado porque una tercera parte de la proteina C activada, requerida para conseguir niveles plasmáticos de la proteina C activada, en el intervalo desde aproximadamente 2 ng/ml hasta aproximadamente 300 ng/ml, se administra en una inyección de bolo seguida de la infusión continua de las dos terceras partes restantes de la proteina C activada.

12. El uso de un medicamento para el tratamiento de un paciente que sufra del síndrome hemolitico urémico (HUS) , caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C.

13. El uso de la reivindicación 12, caracterizado porque la proteina C es el zimógeno de la proteina C humana.

14. El uso de la reivindicación 12, caracterizado porque la proteina C es la proteina C activada, humana.

15. El uso de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la cantidad de proteina C activada, humana, es desde aproximadamente 1 µg/kg/hora hasta aproximadamente 50 µg/kg/hora.

16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la cantidad de proteina C activada, humana, es de 24 µg/kg/hora.

17. El uso de la reivindicación 15 o reivindicación 16, caracterizado porque la proteina C activada, humana, se administra mediante la infusión continua por un tiempo de aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 horas.

18. Un uso de tratamiento del síndrome hemolitico urémico, en un paciente que necesite del mismo, caracterizado porque comprende administrar al paciente una cantidad farmacéuticamente efectiva de proteina C activada, de manera tal que se consiga un nivel plasmático de proteina C activada, desde aproximadamente 2 ng/ml hasta aproximadamente 300 ng/ml.

19. El uso de la reivindicación 18, caracterizado porque la proteina C activada se administra en una inyección de bolo.

20. El uso de la reivindicación 18, caracterizado porque la proteina C activada se administra mediante la infusión continua por un tiempo desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 240 horas.

21. El uso de la reivindicación 18, caracterizado porque la proteina C activada se administra primero como un bolo y luego como una infusión continua.

22. El uso de la reivindicación 21, caracterizado porque una tercera parte de la proteina C activada, requerida para conseguir niveles plasmáticos de la proteina C activada, en el intervalo desde aproximadamente 2 ng/ml hasta aproximadamente 300 ng/ml, se administra en una inyección de bolo seguida de la infusión continua de las dos terceras partes restantes de la proteina C activada.