MXPA01005441A - Metodos inmunomodulatorios que emplean antigenos de carbohidrato. - Google Patents

Metodos inmunomodulatorios que emplean antigenos de carbohidrato.

Info

Publication number
MXPA01005441A
MXPA01005441A MXPA01005441A MXPA01005441A MXPA01005441A MX PA01005441 A MXPA01005441 A MX PA01005441A MX PA01005441 A MXPA01005441 A MX PA01005441A MX PA01005441 A MXPA01005441 A MX PA01005441A MX PA01005441 A MXPA01005441 A MX PA01005441A
Authority
MX
Mexico
Prior art keywords
lnnt
ige
hsa
agent
mice
Prior art date
Application number
MXPA01005441A
Other languages
English (en)
Inventor
Donald A Harn
Original Assignee
Harvard College
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Harvard College filed Critical Harvard College
Publication of MXPA01005441A publication Critical patent/MXPA01005441A/es

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0003—Invertebrate antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/62—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being a protein, peptide or polyamino acid
    • A61K47/64—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent
    • A61K47/646—Drug-peptide, drug-protein or drug-polyamino acid conjugates, i.e. the modifying agent being a peptide, protein or polyamino acid which is covalently bonded or complexed to a therapeutically active agent the entire peptide or protein drug conjugate elicits an immune response, e.g. conjugate vaccines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
    • A61K2039/6031—Proteins
    • A61K2039/6081—Albumin; Keyhole limpet haemocyanin [KLH]

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Se proporcionan metodos para modular respuestas inmunes, particularmente respuestas de tipo IgE. Los metodos incluyen la puesta en contacto de una celula con un agente que comprende lacto-N-neotetraosa (LNnT) multivalente, que modula una respuesta inmune. Los metodos son utiles para incrementar la produccion de IgE policlonal no especifica, inhibir la produccion de respuestas de IgE especifica para antigeno, inducir la produccion de citocinas, y estimular la proliferacion de esplenocitos. En una modalidad preferida, la invencion ofrece metodos para modular una respuesta inmune a un antigeno (por ejemplo, un alergeno) in vivo. Se proporcionan tambien composiciones farmaceuticas para modular respuestas inmunes, dichas composiciones farmaceuticas comprenden los agentes de la invencion.

Description

MÉTODOS INMUNOMODULATORIOS QUE EMPLEAN ANTÍGENOS DE CARBOHIDRATO. f ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La infección por helmintos se relaciona fuertemente ccn la 5 producción de grandes cantidades de Ig? sérica en seres humanos y auimales de experimentos (King, CL. Et al., (1993), J. Immunol. vol. 150 páginas 1873-1880; Ogilvie BM, Nature 1964-204. 91-95; Sadun, EH. et al. (1970) Exp . Parasi tol . vol. 28 páginas 435-449) . La mayoría de la I gE sérica en '™10 huésped infectado es no-específica y policlonal (Dessaint, JP. et al. (1975) Clin . Exp. Immunol . vol. 20 páginas 427- 436; Jarret, et al. (1976) Clin . Exp . Iinmunol . vol. 24 páginas 346-351). Dicha IgE tiene varias funciones en la inmunidad contra parásitos de tipo helmintos. La IgE 15 específica para Ag, especialmente contra Ag de gusano acuito, está involucrada con la resistencia a la reinfección (Hagan, P. et al. (1991) Na t ure vol. 349 páginas 243-245; Viana, IRC. » et al (1995) Parasi te Immunol . vol. 17 páginas 297-304} , y con la citotoxidad mediada por células contra parásitos 20 (Capron, A. et al. (1980) Am. J. Trop. Med. Hyg. vcl. 29 páginas 849-857; Gounni, AS. et al. (1994) Na ture vol. 367, páginas 183-186; Cutts, L. et al. (1997) Parasi te Imm?nol . vol. 19, páginas 91-102). Por otra parte, una IgE policlonal no específica parece ser benéfica tanto para el huésped como 25 para los parásitos con el objeto de reducir el riesgo de una reacción anafiláctica potencialmente letal a antígenos parásitos mediante la saturación de los FceRs disponibles en |A células efectoras, aún cuando la IgE desempeña una función negativa ara el huésped en infección primaria de 5 esquistosomiasis (Hagan, P. (1993) Parasi te Immunol . vol. 15 página 14; Pritchard, DI. (1993) Parasi te Ipununol . vol. 15 páginas 5-9; A iri, P. et al. (1993) J. Exp . Med. vol. 190 páginas 43-51) . Varios componentes alérgicos en Ag esquistosomal han sido f? 10 reportados como reaccionando con IgE de seres humanes y roedores en varias etapas de infecciones (Damonneville, M. et al. (1984) Int . Arch . All ergy appl . Iinmunol . vol. 73 páginas 248-255; Owhashi, M. et al. (1986) Int . Arch . Al l ergy appl . Immunol. vol. 81 páginas 129-135). Sin embargo, se sabe poco 15 en cuanto a las moléculas que inducen la producción de IgE policlonal a partir de un huésped. Un antígeno de gusano adulto Toxocara canis tiene una actividad mitogénica de » célula B para inducir la proliferación, producción de IgG y IgE, aún cuando la molécula alergénica sigue sin definirse 20 (Wang. MQ. Et al. (1995) Parasi te Immunol . vol. 17 páginas 609-615. Yamashita, U. et al. (1993) Jap. J. Parasi tol . vol. 42, páginas 211-219) . El fluido corporal de Ascari s contiene también un mitógeno de célula B, sin embargo, este mitógeno requiere de la ayuda de IL4 suministrada por otros factores 25 para inducir la producción de IgE policlonal (McGibbon, AM. et al. (1990) Mol . Biochem Parasi tol . vol. 39, páginas 163- 172; Lee, TDG. et al. (1995) J. All ergy Immunol . vol. 95 A páginas 124-1254. Lee, TDG. et al. (1993) Int. Arch . Allergy Immunol . vol. 102 páginas 185-190). Dos proteínas filáricas 5 recombinantes pueden inducir la producción de IgE policlonal in vi tro, sin embargo, inducen también IgE específica para Ag (Garrud, O. et al. (1995) J. Immunol . vol. 155 páginas 131- 1325) . Schi stosoma mansoni sintetizan glicoproteínas que contienen (fc 10 azucares de polilactosamina (Srivastan, J. et al. (1992) J. Biol . Chem. vol. 267, páginas 14730-14737; Van Dam, GJ. et al., (1994) Eur. J. Biochem . vol. 225 páginas 467-482). Lacto-N-fucopentaosa III (LNFIII) que se encuentra en gusanos adultos y huevos de S. mansoni es un determinante antigénico 15 (KO, AI. et al. (1990) Proc . Nati . Acad. Sci . USA vol. 87 páginas 4159-4163) . LNFIII estimula las células B esplénicas provenientes de ratones infectados con parásitos para <» proliferar y producir IL-10, una citocina que regula de manera descendente respuestas inmunes de Thl (W. Velupillai 20 P. et al. Proc . Na ti . Acad. Sci . USA vol. 91 páginas 18-22; Palanivel, V. et al. (1996) Exp. Parasi tol . vol. 84 páginas 168-177; Velupillai, P. et al. (1997) J. Immunol . vol. 158 páginas 338-344) . Además, se ha encontrado que este azúcar tiene un efecto adyuvante en la inducción de una reacción 25 inmune de Th2 tanto en la producción de Ab como de citocinas contra proteína con la cual el azúcar se encuentra físicamente conjugado. (^ Un conocimiento adicional de las moléculas que dirigen la respuesta inmune hacia perfiles de citocinas específicos es 5 importante para desarrollar métodos de respuestas inmunes reguladores. Particularmente, la identificación de moléculas que inducen la síntesis de IgE policlonal es de un beneficio extremadamente importante para el trabamiento de las alergias . || iü - COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La presente invención ofrece métodos novedosos para regular la respuesta inmune. La invención se basa, por lo mencs en parte, en el descubrimiento de las características funcionales de LNnT, un homologo no fucosilado de LNFIII, que 15 es convertido en LNFIII por al-3 fucosiltransferasa en gusanos adultos. LNnT multivalente induce la producción de IgE policlonal y la producción de citccinas a partir de ratones a partir de inoculación IP. ?sta molécula puede emplearse para modular la respuesta de IgE, no solamente a 20 antígenos parásitos, sino también a alérgenos ambientales mediante la saturación de FceRs en las células efectoras. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figuras la-lc: producción de Ig sérica en ratones BALB/C después de inmunización IP. Figura l(a) : ratones BALB/C 25 hembras fueron inmunizados IP con solución salina HSA, Ley- HSA, LNnT-HSA o bien HSA-Alumbre. Todos los antígenos fueron inoculados en la dosis de 10 µg de peso de proteína de HSA. 6 1^ y 5 días después de la primera inmunización de refuerzo (barra con puntos) y segunda inmunización de refuerzo (barra 5 negra) , respectivamente, se tomaron muestras' de sangre y se midió la IgE total sérica. Los resultados mostrados con la media más i 1 error estándar del suero de cuatro individuos. Figura 1 (b) : evolución de IgE sérica total después de inmunización IP. Ratones BALB/C fueron inmunizados IP con una ifc 10 solución salina (cuadrados vacíos), HSA (10 µg; triángulos vacíos) o bien LNnT-HSA (10 µg de HSA; círculo lleno) el día 0. Dos semanas después, la inmunización de refuerzo fue seguida de la misma manera. Se tomo sangre los días 10, 20, 27, 41 y 69, y se determinó la IgE sérica total. Los 15 resultados mostrados son la media ± 1 Error Estándar del suero de cuatro individuos. Figura 1 (c) : Isotipos de IgG sérica 5 días después de una tercera inmunización IP, con f¡ solución salina (barra con puntos) , HSA (barra vacía) o bien LNnT-HSA (barra negra) . Los resultados mostrados son la media 20 ± 1 Error Estándar de suero de cuatro individuos. Todos los resultados son representativos de los tres experimentos. Figuras 2a-2d: producción de Ab específica para antígeno después de una inmunización IP con azúcares multivalentes. Ratones BALB/C hembras fueron inmunizados y sangrados de 25 conformidad con lo descrito en la Figura 1. Después de una primera inmunización (barra con puntos) y segunda inmunización (barra negra) , se midieron por ELISA de conformidad con lo descrito en materiales y métodos la IgE • específica para HSA (Figura 2a) la IgG específica para HSA 5 (Figura 2b), la IgE específica para LNnT-HSA (Figura 2c), y la IgG específica para LNnT-HSA (Figura 2d) . Se determinaron IgE específicas en la absorbencia a 450 nm de sueros diluidos cuatro veces. Las IgG específicas fueron determinadas como el título de punto final. Los resultados mostrados con la media 10 ± 1 Error Estándar de suero de cuatro individuos. Los • resultados son representativos de tres experimentos. Figuras 3a-3d: IgE sérica total en ratones CBA/J (Figura 3a) y C57BL/6 (Figura 3b) después de inmunización IP con solución salina, HSA o LNnT-HSA. 6 y 5 días después de la primera 15 inmunización de refuerzo (barra con puntos) y segunda inmunización de refuerzo (barra negra) , respectivamente, se tomaron muestras de sangre y se determinaron las IgE séricas » totales. Los resultados mostrados son la media más ± 1 Error Estándar de suero de cuatro individuos. Figura 3c: evolución 20 de IgE sérica total después de inmunización SC. Ratones BALB/C fueron inmunizados SC con solución salina (cuadrado vacío), HSA (10 µg; triángulo vacío) o LNnT-HSA (10 µg de HSA; círculo lleno) el día 0. Dos semanas después, la inmunización de refuerzo fue seguida de la misma manera. Se 25 tomo sangre los días 10, 20, 27, 41 y 69, y se determinó la IgE sérica total. Los resultados mostrados son la media ± 1 Error Estándar de suero de cuatro individuos. Figura 3D: IgE (fc sérica total en CBA/CaJ (barra vacía) y CBA/CaJ xid (barra sombreada) después de ia segunda inmunización IP de refuerzo 5 con solución salina, HSA o LNnT-HSA. Los resultados mostrados son la media ± 1 Error Estándar de suero de cuatro individuos. Los resultados son representativos de dos experimentos . Figura 4 : Respuestas proliferativas de esplenocitos. Ratones áfc 10 BALB/C fueron inmunizados IP con solución salina HSA (10 µg) LNnT-HSA (10 µg de peso de HSA) . 2 y 3 semanas se efectuó una inmunización de refuerzo de la misma manera. 5 días después de la inmunización final, se removieron bazos. 2.5 x 10° esplenocitos fueron estimulados con ConA (2 µg/ml; barra con 15 puntos), HSA (10 µg/ml; barra sombreada), LNnT-HSA (10 µg/ml de HSA; barra negra) o bien sin reestimulación (barra vacía) . Los resultados mostrados son la cp media (control de medio O experimental) ± 1 Error Estándar de cuatro ratones individuales por grupo. Los resultados son representativos de 20 los tres experimentos. Figura 5a-5h: Expresión de B7-1 y B7-2 sobre células B220+. Esplenocitos de ratones inmunizados IP con solución salina (Figuras 5a, 5d) , HSA (Figuras 5b, 5e) o LNnT-HSA (Figuras 5c, 5f) fueron incubados durante 24 horas sin estimulantes 25 adicionales. Pellas de células fueron teñidas con mAb conjugada con PE contra ya sea B7-1 (Figuras 5a, 5b, 5c) o bien B7-2 (Figuras 5d, 5e, 5f) . Los números expresados en el |^ cuadrante derecho superior muestran la media ± 1 Error Estándar de porcentaje de células que expresan moléculas 5 tanto B220 como B7 de muestras de seis individuos. Figuras 5g, 5h: Efecto de la duración de incubación de cultivo sobre la expresión de B7 en ratones inmunizados IP con una solución salina (cuadrado vacío) , HSA (triángulo vacío) o bien LNnT- HSA (círculo lleno) . Porcentajes de células B220+ que (fc 10 expresan B7-1 (Figura 5g) o B7-2 (Figura 5h) fueron monitoreados al momento de la preincubación, 24, 72 y 120 horas después de la incubación sin nuevo estimulo. Los resultados fueron representativos de dos experimentos. Figura 6: Niveles de IgE total (mg/ml) en ratones tratados 15 dos (barras vacías) o tres (barras llenadas) intraperitoneales con el conjugado de LNnT-dextrano, LNnT35. Figura 7: Niveles de IgE total (mg/ml) en ratones tratados » primero con RMPI (solución salina) , ovalbúmina, el conjugado de LNnT-dextrano, LNnT45, o bien dextrano seguido por un 20 tratamiento de refuerzo con ovalbúmina. Figura 8: Niveles de IgE específica para ovalbúmina en ratones tratados primero con RMPI (solución salina), ovalbúmina, el conjugado de LNnT-dextrano, LNnT45, o bien dextrano seguido por un tratamiento de refuerzo con 25 ovalbúmina.
Figura 9: Niveles de IgE total (mg/ml) con el paso del tiempo (hasta 70 días después de la inmunización) en ratones |B tratados con solución salina, HSA o bien LNnT-HSA. Figura lOa-lOc: Niveles de producción de citocina de tipo Th2 5 por células de bazo totales de ratones inmunizados con vehículo (dextrano) o bien conjugado LNnT-dextrano. La Figura 10a muestra los niveles de IL-13 (pg/ml) . La Figura 10b muestra los niveles de IL-4 (pg/ml) . La Figura 10c muestra los niveles de IL-10 (pg/ml) . (fc 10 Figura 11: Nivel de producción de interferón-gamma de citocina de tipo Thl (pg/ml) por células de bazo total de ratones inmunizados con vehículo (dextrano) o bien conjugado LNnT-dextrano. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 15 La invención ofrece métodos de immunomodulación en donde una célula (por ejemplo, una célula inmune humana) está en contacto con un agente que modula una respuesta inmune (por » ejemplo, producción de IgE policlonal no específica, mitogenésis de céluias inmunes, o bien producción por la 20 célula de una o varias citocinas) . La invención se basa, por lo menos en parte, en el descubrimiento que cuando se inmunizan animales con lacto-N-neotetraosa multivalente (LNnT) , un carbohidrato putativamente expresado en un parásito de helminto Schistosoma mansosi , ratones BALB/C y 25 CBA/J produjeron cantidades significativamente más elevadas de IgE sérica total después de dos inmunizaciones intraperitoneales (IP) con LNnT multivalente conjugada con |fc albúmina sérica humana (LNnT-HSA) en comparación con grupos inmunizados con solución salina o HSA sola. Es interesante 5 observar que ninguna IgE específica contra carbohidrato o la proteína portadora fue detectada en ELISA, lo que sugiere una inducción de producción de IgE no específica policlonal in vi vo por LNnT multivalente. Además, esta neo-glicoproteína no promovió una producción significativa de IgG contra el (fc 10 carbohidrato o contra la proteína portadora. Ratones C57BL/6 mostraron solamente la elevación de IgE sérica total después de una triple inmunización con LNnT-HSA, lo que refleja reacciones dependientes de la cepa contra LNnT-HSA. Células de bazo provenientes de ratones inmunizados IP con LNnT-HSA 15 produjeron in vi tro una cantidad significativa de IL-4, IL-5 e IL-10 así como IL-2 e IFN-? en comparación con los controles. Además, células B220+ cultivadas presentaron <» una expresión incrementada de B7-2(CD86) pero no de B7-1 (CD80), lo que sugiere que la expresión de B7-2 se relaciona 20 fuertemente con la producción policlonal de IgE. Además, ratones BALB/C deficientes en cuanto a gen de IL-4 no produjeron IgE policlonal después de inmunización IP con LNnT-HSA. Células de bazo de estos ratones produjeron cantidades menores pero significativas de IL-5 e IL-10, y las mismas 25 cantidades de IFN-? en comparación con el tipo silvestre, lo que demuestra que IL-4 es un elemento critico para promover la producción de IgE policlonal inducido por el carbohidrato |H multivalente expresado naturalmente en parásito de helminto. Experimentos adicionales demostraron que LNnT conjugada con 5 dextrano estimula también las respuestas de IgE policlonal y que el pretratamiento con LNnT multivalente (por ejemplo, LNnT conjugada con dextrano) antes de la inmunización con un antígeno, inhibe la producción de respuestas de IgE específicas para antígeno. Los niveles incrementados de IgE (fc 10 policlonal estimulados por LNnT multivalente son persistentes (por ejemplo, sostenidos durante por lo menos 70 días) . Además de IL-4, la producción de citocinas de tipo Th2, IL-10 e IL-13 es estimulada por tratamiento con LNnT conjugada con dextrano, mientras que niveles de la citocina de tipo Thl, 15 interferón gamma, son inhibidos por tratamiento con LNnT conjugada con dextrano. Así, los métodos de la invención permiten la modulación de la producción de IgE (por ejemplo, estimulación de IgE no específica y/o inhibición de IgE específica para antígenos) , 20 así como permite la modulación de producción de citocina. Por consiguiente, los métodos de in unomodulación de la invención permiten dlirigir una respuesta inmune hacia un perfil de secreción de citocina específica, por ejemplo, una respuesta Th2. La capacidad de influenciar la producción de IgE 25 policlonal no específica empleando los métodos de inmunomodulación de la invención puede emplearse para la prevención reacción perjudicial de huésped contra infección if por parásitos y por consiguiente puede aplicarse para la protección contra alérgenos ambientales mediante la 5 saturación de FceRs en células efectoras. Además, la capacidad de influenciar el desarrollo, por ejemplo de una respuesta de Th2 empleando los métodos de inmunomodulación de la invención se aplica a la tratamiento de una amplia gama de trastornos incluyendo cáncer, enfermedades infecciosas (por (fc 10 ejemplo VIH y tuberculosis), alergias y enfermedades autoinmunes . Para que la presente invención pueda entenderse de manera más fácil, se definen, primero, algunos términos. Es este documento se emplean las abreviaturas estándares para los 15 azucares. Como se emplea aquí, el término "lacto-N-neotetraosa" ("LNnT") se refiere a un azúcar de polilactosamina que es un homólogo no fucosilado de lacto-N-fucopentaosa III, que se encuentra por lo menos en el parásito Schistosoma mansoni . 20 Como se emplea aquí, el término "lacto-N-neotetraosa miltivalente" (LNnT multivalente) se refiere a una forma de LNnT que abarca porciones múltiples del carbohidrato, como por ejemplo una forma en la cual carbohidratos de LNnT múltiples son conjugados con una molécula portadora. 25 Como se emplea aquí, el término "agente que comprende LNnT" se refiere a una molécula o a varias moléculas que incluyen la porción carbohidrato de LNnT. En ciertas modalidades, el {fc agente comprende LNnT a condición que el agente no sea un antígeno de S. mansoni , ni un antígeno de Toxocara canis, o 5 bien no sea fluido corporal de Ascaris, o bien no es una proteína filárica capaz de inducir IgE policlonal. Como se emplea aquí, el término "oligosácarido de Lewis-"" se refiere a un lacto carbohidrato de tipo II que comprende la estructura: { Fue (al-2) Gal (ßl-4) [Fue (al-3) ] GlcNac} . (fc 10 Se emplea aquí, el término "célula inmune humana" abarca células del sistema inmune humano que pueden producir citocinas. Ejemplos de células inmunes humanas incluyen células T humanas, macrófagos humanos y células B humanas. Como se emplea aquí, el término "célula T" (es decir, 15 linfocito T) incluye todas las células dentro del linaje de célula T, incluyendo timocitos, células T inmaduras, células T maduras, y similares, de un mamífero (por ejemplo, ser humano o ratón) . Como se emplea aquí, una "respuesta de T auxiliar de tipo 2" 20 (respuesta Th2) se refiera a una respuesta por células CD4+T que se caracteriza por la producción de una o varias citocinas seleccionadas entre IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10, y que se relaciona con una "ayuda" de células B eficiente proporcionada por las células Th2 (por ejemplo, producción 25 incrementada de IgGl y/o IgE) .
Como se emplea aquí, el término "una citocina que regula el desarrollo de una respuesta de Th2" tiene el propósito de (^fc incluir citocinas que tienen un efecto sobre el inicio y/o la progresión de una respuesta Th2, particularmente citocinas 5 que promueven el desarrollo de una respuesta Th2. Citocinas preferidas producidas por los métodos de la invención son IL- 4, IL-5 e IL-10. Como se emplea aquí, las varias formas del término "modulación" incluyen la estimulación (por ejemplo, (fc 10 incremento o regulación ascendente de una respuesta o actividad particular) y la inhibición (es decir, disminución o regulación descendente de una respuesta o actividad particular) . Como se emplea aquí, el término "poner en contacto" (es 15 decir, poner en contacto un agente con una célula) abarca la incubación del agente y de la célula juntos in vi tro (por ejemplo, agregando el agente a las células en cultivo) y la administración del agente a un sujeto de tal manera que el agente y las células del sujeto estén en contacto in vivo. 20 Varios aspectos de la invención se describen con detalles adicionales en las subsecciones siguientes. I . Agentes de inmunomodulación En los métodos de inmunomodulación de la invención, una célula (por ejemplo, una célula inmune humana, macrófago o 25 célula T) entra en contacto ya sea in vi tro o in vi vo con un agente de tal manera que se module una respuesta inmune. De preferencia, el agente mismo comprende LNnT, de conformidad j^ con lo descrito con detalles adicionales abajo. En una modalidad el agente estimula la producción por la célula de 5 por lo menos una citocina (por ejemplo, una citocina que regula el desarrollo de una respuesta de Th2) . En otra modalidad, el agente estimula la producción de IL-4. En otra modalidad, el agente estimula la proliferación celular (por ejemplo, proliferación de células B) . En otra modalidad, el (fc 10 agente estimula la producción de IgE policlonal no específica. A. Agentes Los agentes de la invención estimulan la producción de citocinas por células, estimulan la producción de IgE 15 policlonal no específica por células, y/o estimula la proliferación de células. Por consiguiente, en una modalidad, el agente es una forma estimuladora de un compuesto que » comprende LNnT. Una "forma estimuladora de un compuesto que comprende LNnT" típicamente es una forma en la cual la 20 estructura de carbohidrato (por ejemplo, la LNnT) está presente en una forma reticulada, multivalente. En una modalidad preferida, la forma estimuladora de un compuesto que comprende LNnT es un conjugado de una molécula vehículo y múltiples moléculas carbohidrato (por ejemplo, la LNnT). Por 25 ejemplo, moléculas carbohidrato pueden ser conjugadas con un vehículo de proteína, como por ejemplo un conjugado de albúmina sérica humana (HSA) . Cuando un conjugado de azúcar-proteína vehículo debe ser administrada a un sujeto, la proteína vehículo debe seleccionarse de tal manera que no se estimule en el sujeto una reacción inmunológica a la proteína vehículo (por ejemplo, una proteína vehículo humana debe emplearse con un sujeto humano, etc.). Alternativamente, en una proteína vehículo, LNnT multivalente puede ser conjugada con otras moléculas vehículo, por ejemplo, vehículos que protegen el compuesto contra una eliminación rápida del cuerpo, como por ejemplo una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biocompatibles, biodegradables pueden emplearse, como por ejemplo etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicolico, colágena, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Métodos para la preparación de tales formulaciones serán aparentes de los expertos en la materia. Los materiales pueden también obtenerse comercialmente en Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos hacia células infectadas con anticuerpos monoclonales para antígenos virales) pueden emplearse también como vehículos farmacéuticamente aceptables. Pueden prepararse de conformidad con métodos conocidos por parte de los expertos en la materia, por ejemplo, de conformidad con lo descrito en la Patente Norteamericana 4,522,811. Otros vehículos preferidos incluyen polímeros, como por I^ ejemplo polímeros de polisacárido o carbohidrato. Un polímero de carbohidrato preferido es el dextrano. 5 El grado de capacidad de estimulación del conjugado es influenciado por la diversidad de los azúcares conjugados con el vehículo. De preferencia, las moléculas de azúcar comprenden por lo menos 10% del conjugado en peso, con mayor preferencia por lo menos 15% del conjugado en peso, y con (fc 10 preferencia todavía mayor por lo menos 20% del conjugado en peso y con preferencia todavía mayor por io menos 25% del conjugado en peso, o por lo menos 30% del conjugado en peso o por lo menos 35% de conjugado en peso o por lo menos 40% de conjugado en peso o por lo menos 45% del conjugado en peso. 15 En ciertas modalidades, las moléculas de azúcar conforman de aproximadamente 10 a 25% del conjugado en peso, de aproximadamente 15 a 25% del conjugado en peso o de aproximadamente 20 a 25% del conjugado en peso o de aproximadamente 30 a 35% del conjugado en pese o 20 aproximadamente 35 a 40% del conjugado en peso o aproximadamente 40 a 45% del conjugado en peso. En una modalidad preferida, la forma estimuladora de un compuesto que comprende LNnT es un conjugado de múltiples moléculas de carbohidrato. Con mayor preferencia los conjugados comprenden 25 10-11, 12-13, 14-15, 16-17, 18-19, o 20 o más azúcares/conjugado. Agentes para emplearse en los métodos de la invención pueden adquirirse comercialmente o bien pueden l'flfc ser purificados o sintetizados por métodos estándares. Conjugados de LNnT y una proteína vehículo (por ejemplo, HSA) 5 están disponibles en Achúrate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY. Además de conjugados que contienen LNnT descritos arriba, otra forma de un agente estimulatorio que contiene LNnT es una proteína aislada que expresa naturalmente LNnT en una (fc 10 forma adecuada para una actividad estimuladora. La capacidad de un agente de la invención para estimular la producción por células inmunes de una citocina puede evaluarse empleando un sistema de cultivo in vi tro como por ejemplo descrito en los ejemplos. Las células son cultivadas 15 en presencia del agente a evaluar en un medio adecuado para cultivo de las células seleccionadas. Después de un periodo de tiempo (por ejemplo, 24, 48, 72, o 120 horas) , la producción de la citocina es evaluada mediante la determinación del nivel de la citocina en el sobrenadante de 20 cultivo. De preferencia, la citocina ensayada es IL-4. Adicionalmente o alternativamente, se pueden ensayar niveles de IL-2, IL-5, IL-10, IL-13 y/o IFN-?. Los niveles de citocina en el sobrenadante de cultivo pueden medirse por métodos estándares como por ejemplo a través del ensayo 25 inmunosorbente enlazado con enzima (ELISA) que emplea un anticuerpo monoclonal que se une específicamente con la citocina. La capacidad del agente para estimular la producción de citocina es evidenciado por un nivel más alto de citocina (por ejemplo, IL-4) en los sobrenadantes de las células cultivadas en presencia del agente en comparación con el nivel de citocina en el sobrenadante de células cultivas en ausencia del agente. La capacidad de un agente de la invención para estimular la producción de IgE policlonal no específica por células (por ejemplo, células inmunes) puede ser evaluada in vi tro empleando métodos tales como los descritos en los ejemplos. Por ejemplo, suero aislado de un sujeto puede ser analizado por ELISA de emparedado para determinar la presencia de IgE total así como de IgE específica para antígeno. En resumen, placas con revestidas con anticuerpos anti-IgE lavadas de manera extensiva, bloqueadas para evitar la adsorción no específica de reactivos sobre la placa, y después incubadas con muestras séricas aisladas de los sujetos. Se puede emplear anticuerpo marcado (por ejemplo, anticuerpo anti-IgE biotinilado) para detectar antígeno, por ejemplo, mediante la detección con estrepavidina conjugado con peroxidasa. Las reacciones pueden ser desarrolladas subsecuentemente empleando, por ejemplo, sustrato de tetrametil-benzidina. Tales métodos son útiles adicionalmente para detectar, por ejemplo, IgG específica para Ag, IgE específica para HSA, IgE específica para LNnT-HSA, así como subtipos de IgG específicos, mediante la alteración de la especificidad del (M anticuerpo primario (por ejemplo, usado en revestimiento inicial de la placa) . 5 La capacidad de un agente de la invención para estimular la proliferación de células (por ejemplo, respuestas de proliferación) puede ser evaluada in vi tro empleando métodos tales como los descritos en los ejemplos. Por ejemplo, células de bazo pueden ser aisladas de ratones sacrificados, (fc 10 cultivadas in vi tro en medio de cultivo apropiado, y marcadas con 3H timidina como indicador de replicación de ADN. II . Composiciones farmacéuticas Otro aspecto de la invención se refiere a composiciones farmacéuticas de los agentes (por ejemplo, agentes 15 estimulatorios) de la invención. Las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen típicamente un agente de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se emplea aquí, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los solventes, medios 20 de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y de retardo de absorción, y similares, fisiológicamente compatibles. El tipo de vehículo puede seleccionarse con base en la vía de administración prevista. En varias modalidades, el vehículo 25 es adecuado para administración intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, transdérmica u oral. En una modalidad preferida, la composición es formulada de tal manera que sea adecuada para su administración intraperitoneal. Vehículos farmacéuticamente aceptables 5 incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en la medida en que un agente (^ 10 o medio convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla su uso en las composiciones farmacéuticas de la invención. Compuestos complementarios activos pueden también ser incorporados en las composiciones. Las composiciones terapéuticas deben típicamente ser 15 estériles y establecen las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como solución, microemulsión, liposoma, o bien otra estructura ordenada adecuada para alta concentración farmacológica. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que 20 contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, así como polietilenglicol líquido y similares), y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez apropiada, por ejemplo, a través del uso de un revestimiento, por ejemplo lecitina, a través del 25 mantenimiento del tamaño requerido de partículas en el caso de dispersión y a través del uso de surfactantes. En muchos casos, es preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede proporcionarse incluyendo la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Además, los moduladores pueden ser administrados en una formulación de liberación prolongada, por ejemplo, en una composición que incluye un polímero de liberación lenta. Se pueden preparar compuestos activos cor. vehículos que tiene la capacidad de proteger el compuesto contra una liberación rápida, como en el caso de formulación de liberación controlada, que incluyen implantes y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biocompatibles, biodegradables pueden emplearse, tales como etileno acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicolico, colágena, poliortoésteres, ácido poliláctico y copolímeros polilácticos, poliglicolicos (PLG) . Muchos métodos para la preparación de estas formulaciones con patentados o bien generalmente conocidos por parte de los expertos en la materia. Soluciones inyectables estériles pueden ser preparadas mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes mencionados arriba, según lo requerido, seguido por esterilización filtrada. En general, se preparan dispersiones mediante la incorporación del ifl) compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos 5 entre los mencionados arriba. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son: secado en vacío y liofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una 10 solución previamente filtrada estéril. Según la vía de administración, el agente puede ser revestido en un material para protegerlo contra la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden desactivar al agente. Por ejemplo, el agente puede ser administrado a un 15 sujeto en un vehículo apropiado o coadministrado con un diluyente con inhibidores de enzima o en un vehículo apropiado como por ejemplo liposomas. Diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones salinas y soluciones amortiguadoras acuosas. Los inhibidores de enzima 20 incluyen inhibidor de tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Liposomas incluyen emulsiones de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales (Strejan, et al . , (1984) J. Neuroimmunol 1_ : 21 ) . Se pueden preparar también dispersiones en glicerol, 25 polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y uso, estas preparaciones pueden contener un conservador para prevenir el crecimiento de microorganismos. El agente activo en la composición (es decir, un agente 5 estimulatorio de la invención) se formula de preferencia en la composición en una cantidad terapéuticamente efectiva. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones, y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico (fc 10 deseado, como por ejemplo la producción de niveles suficientes de IgE policlonal no específica con el objeto de influenciar de esta forma el curso terapéutico de un estado de enfermedad particular. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente activo puede variar de conformidad con 15 factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, sexo, y el peso del individuo, y la capacidad del agente para provocar la respuesta deseada en el individuo. Regímenes de dosificación pueden ser ajustados con el objeto de proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Una cantidad 20 terapéuticamente efectiva es también una cantidad en la cual los efectos tóxicos o perjudiciales eventuales del agente son sobrecompensados por loe efectos terapéuticamente benéficos. En otra modalidad, el agente activo es formulado en la composición en una cantidad profilácticamente efectiva. Una 25 "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, en dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico ( deseado, por ejemplo, influenciar la producción de niveles suficientes de IgE policlonal no específica para propósitos 5 profilácticos. Típicamente, puesto que una dosis profiláctica es empleada en sujetos antes de una enfermedad o en una etapa inicial de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantidad terapéuticamente efectiva. (fc 10 Un rango no limitativo para una cantidad terapéutica o profilácticamente efectiva de un agente de estimulación o inhibición de la invención es de 0.01 nM a 20 mM. Se observará que los valores de dosificación pueden variar con la severidad de la condición a mitigar. Se entenderá a además 15 que para cualquier sujeto particular, regímenes de dosificación específicos deben ser ajustados con el paso del tiempo de conformidad con la necesidad del individuo y de conformidad con el juicio profesional de la persona que administra, o supervisa la administración de las composiciones 20 y que rangos de dosificaciones establecidos aquí son solamente ejemplares y no pretenden limitar el alcance ni la práctica de la composición reclamada. La cantidad de compuesto activo en la composición puede variar de conformidad con factores tales como estado de 25 enfermedad, edad, sexo y peso del individuo. Regímenes de dosificación pueden ser ajustados con el objeto de proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, un iH bolo único puede ser administrado, se pueden administrar varias dosis individuos en el tiempo o bien la dosis puede 5 ser reducida o incrementada proporcionalmente de conformidad con lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente provechoso formular composiciones parentérales en forma de unidad de dosificación para facilidad de administración y uniformidad de (fc 10 dosificación. La forma de unidad de dosificación como se emplea aquí se refiera a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos a tratar; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto de activo que se calcula para 15 producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas unitarias de dosificación de la invención son dictadas y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efector terapéutico 20 particular a lograr y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la formación de compuestos con un compuesto activo de este tipo para el tratamiento de la sensibilidad en los individuos . Un agente de la presente invención puede ser formulado en la 25 composición farmacéutica en donde el agente es el único compuesto activo ahí. Alternativamente, la composición farmacéutica puede contener compuestos activos adicionales. l^ Por ejemplo, dos o más agentes pueden ser empleados en combinación. Además, un agente de la invención puede ser 5 combinado con uno o varios otros agentes que tienen propiedades inmunomodulatorias . Por ejemplo, un agente estimulatorio puede ser combinado con una o varias citocinas o con adyuvantes. Una composición farmacéutica de la invención que comprende un (fc 10 agente estimulatorio o inhibitorio de la invención, puede ser administrada a un sujeto para modular respuestas inmunes (por ejemplo, la producción de IgE policlonal no específica) en el sujeto. Como se emplea aquí, el término "sujeto" incluye organismos vivos en los cuales una respuesta inmune puede ser 15 provocada, por ejemplo, mamíferos. Ejemplos de sujetos incluyen seres humanos, perros, gatos, ratones, ratas, así como especies transgénicas de los mismos. Una composición farmacéutica de la invención puede ser formulada de tal manera que sea adecuada para una vía de 20 administración particular. Por ejemplo, en varias modalidades, una composición farmacéutica de la presente invención puede ser adecuada para inyección, inhalación o bien insuflación (ya sea a través de la boca o de la nariz) o bien para administración intranasal, mucosal, oral, bucal, 25 parenteral, rectal, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal y subcutánea. En ciertas modalidades, una composición farmacéutica de la l^fc invención puede ser empacada con instrucciones para el uso de la composición farmacéutica para un propósito particular, 5 como por ejemplo para modular una respuesta inmune, para su uso como adyuvante, para modular una respuesta alérgica o bien para modular una enfermedad autoinmune. III. Modulación de respuestas inmunes La invención ofrece métodos inmunomoduladores que pueden (fc 10 emplearse para modular varias respuestas inmunes. En los métodos de la invención, una célula entra en contacto con un agente (por ejemplo, un agente que comprende LNnT) con la célula de tal manera que la respuesta inmune es modulada (es decir, estimulada) . Los métodos de la invención pueden 15 practicarse ya sea in vi tro o in vivo . Para practicar el método de la invención in vi tro, las células pueden obtenerse a partir de un sujeto por métodos estándares e incubarse (es O decir, cultivarse) in vi tro con un agente de la invención para modular, por ejemplo, la producción de una citocina, la 20 producción de una IgE policlonal no específica, la proliferación de una célula inmune (por ejemplo, un esplenocito) , o bien el desarrollo de una respuesta Th2. Por ejemplo, células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) pueden obtenerse a partir de un sujeto y aislarse por 25 centrifugación de gradiente de densidad, por ejemplo, con Ficoll/Hypaque . Poblaciones específicas de células pueden ser menguadas o enriquecidas empleando métodos estándares. Por l^ ejemplo, se pueden aislar monocitos/macrófagos por adherencia en plástico. Células T o células B pueden ser enriquecidas o 5 menguadas, por ejemplo, por selección positiva y/o negativa empleando anticuerpos para marcadores superficiales de células T o células B, por ejemplo, mediante incubación de célula con un anticuerpo monoclonal de ratón específico (mAb) , seguido por aislamiento de células que se unen con el (fc 10 mAb empleando perlas magnéticas revestidas con anti-lg de ratón. Anticuerpos monoclonales para marcadores de superficie celular están comercialmente disponibles. Para la práctica de los métodos de la invención in vi vo, se administra un agente a un sujeto en un vehículo 15 farmacológicamente aceptable (de conformidad con lo descrito en la sección previa) en cantidades suficientes para logra el efecto deseado, con el objeto de modular, por ejemplo, la producción de una citocina, la producción de IgE policlonal no específica, la proliferación de una célula inmune, o bien 20 el desarrollo de una respuesta Th2 en el sujeto o bien para evitar una reacción perjudicial del huésped contra una infección por parásitos o bien para proteger contra alérgenos ambientales por saturación de FceRs en células efectoras en el sujeto o bien para inhibir una enfermedad o un trastorno 25 (por ejemplo, una alergia o una enfermedad autoinmune) en el sujeto. Cualquier vía de administración adecuada para logra el efecto inmunomodulador deseado se contempla dentro del Í marco de la invención. Una vía preferida de administración para el agente es la vía intraperitoneal. Otra vía preferida 5 de administración es la vía oral. Otra vía preferida de administración es la vía intravenosa. La aplicación de los métodos de la invención al tratamiento de condiciones de enfermedad puede resultar en la curación de la condición, una disminución del tipo o número de síntomas asociados con la (fc 10 condición, ya sea a largo plazo o a corto plazo (es decir, mejora de la condición) o bien simplemente un efecto benéfico transiente para el sujeto. Numerosas condiciones de enfermedad asociadas con una respuesta de tipo Tn2 predominante han sido identificadas y 15 podrían beneficiarse de la modulación del tipo de respuesta montado en el individuo que padece de la enfermedad. La aplicación de los métodos de inmunomodulación de la invención a enfermedades tales como cáncer, enfermedad infecciosa, alergias, enfermedad autoinmune y enfermedad de inflamación 20 intestinal se contemplan. Además de las situaciones antes mencionadas, los métodos inmunomoduladores de la presente invención son también útiles para otros propósitos. Por ejemplo, los métodos de la invención (es decir, métodos que emplean un agente de estimulación) pueden emplearse para 25 estimular la producción de citocinas (como por ejemplo IL-4) in vi tro para la producción comercial de estas citocinas (por ejemplo células que pueden ser cultivadas con un agente de fc estimulación in vi tro con el objeto de estimular la producción de IL-4 y la IL-4 puede ser recuperada del 5 sobrenadante de cultivo, purificada adicionalmente en caso necesario, y empacada para uso comercial) . Esta invención es ilustrada adicionalmente a través de los siguientes ejemplos que no deben considerarse como limitativos. El contenido de todas las referencias, patentes, (fc 10 y solicitudes de patente publicadas mencionadas en esta solicitud se incorporan por referencia. EJEMPLOS Materiales y métodos empleados en los ejemplos Animales 15 Se compraron ratones hembras de las cepas CBA/J, BALB/C y C57BL/6 adultos jóvenes (de 7 a 9 semanas de edad) en Harían (Indianápolis, IN) . Se compraron ratones CBA/CaJ hembras de control de una edad correspondiente y xid CBA/CaJ hembras en The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) . Ratones BALB/C 20 deficientes en IL-4 fueron generados de conformidad con lo descrito (). Estos ratones deficientes fueron criados y mantenidos en la Harvard School of Public Health de conformidad con los lineamientos establecidos por el Comité de Investigación del Área Médica de Harvard. 25 Antígenos e inoculaciones Se seleccionó albúmina sérica humana (HSA) como proteína vehículo para carbohidrato multivalente puesto que HSA es una (A molécula sencilla y no contiene motivo carbohidrato. Se conjugaron LNnT o Lewis? multivalentes con HSA (LNnT-HSA y 5 Le?-HSA) por Achúrate Chemical and Scientific Corporation (NY) . En ambas neoglicoproteínas, 13 moléculas de azúcar se conjugaron con 1 molécula de HSA. Como controles, se prepararon HSA (Sigma Chemical Co . , MO) . HSA absorbido en alumbre (Intergen Company, NY; HSA-alumbre) , o bien PBS de (fc 10 Dulbeccos (Gibco BRL, NY) para inmunización. Grupos de cuatro a seis ratones fueron inmunizados de manera intraperitoneal o subcutánea con Ags (10 µg de HSA) o bien solución salina. Se efectuaron una primera y una segunda inmunizaciones de refuerzo de la misma manera 2 y 3 semanas después, 15 respectivamente. Se determinó la concentración de proteína por ensayo de ácido biciconinico (BCA) (Pierce, IL) . Determinación de títulos de Ab séricos ^ Ratones inmunizados fueron sangrados a partir de la cola 10, 6 y 5 días después de la inmunización primaria, primera 20 inmunización de refuerzo y segunda inmunización de refuerzo, respectivamente. Se determinaron las IgE totales y específicas para HSA por ELISA de emparedado. En resumen, placas ELISA (Corning Inc. NY) fueron revestidas durante la noche a una temperatura de 4°C con 100 µl de 5 µg/ml de mAb 25 de IgE de anti-ratón de rata (Biosource, CA) en amortiguador de carbonato-bicarbonato, pH 9.6. Después de lavar cuatro veces con PBS que contiene 0.05% Tween20 (PBS-T), placas ( fueron bloqueadas con 200 µl de PBS que contenía 10% de FCS y 0.3% de Tween20 durante 2 horas a una temperatura de 37°C. 5 Después del lavado de conformidad con lo indicado arriba se agregaron muestras de 100 µl de suero diluido en serie o IgEmAb de ratón estándar (Pharmingen, CA) en pozos por duplicado y se llevó a cabo una incubación durante 2 horas a una temperatura de 37°C. Después, se agregaron 100 µl de (^ 10 IgEmAb de anti-ratón biotinilada (0.5 µg/ml, Pharmingen) o bien HSA biotinilida (1 µg/ml) para detectar IgE total e IgE específica para HSA respectivamente. Después de una incubación de 2 horas a una temperatura de 37°C, se lavaron las placas y se agregaron 100 µl de estreptavidina conjugada 15 con peroxidasa (Sigma) diluida 1/1000 a cada pozo y se llevó a cabo una incubación durante una hora a una temperatura de 37°C. Finalmente las placas fueron lavadas ocho veces, las reacciones fueron desarrolladas por adición de sustrato de tetrametil-benzidina (Kirkegaard y Perry Laboratories, 20 Gaithersburg, MD) y detenidas por adición de ácido fosfórico (0.4 M) . La absorbencia fue medida a 450 nm en un lector de placas automatizado UVMax (Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) . Para la biotinilación, se incubó HSA (2 mg/ml) en amortiguador de bicarbonato de sodio pH 8.5 con éster de N- 25 hidroxi succinimida de biotina (brazo largo) (Vector Lab., CA) durante 2 horas a temperatura ambiente, se suspendió la reacción a través de la adición de 5 µl de etanolamina, y se j^fc sometió a diálisis durante la noche con PBS/azida sódica al 0.05%. 5 Se determinaron ELISA de IgG específica para Ag. En resumen, placas ELISA fueron revestidas con 100 µl de Ag ( 2 µg/ml) durante la noche a una temperatura de 4°C en amortiguador de carbonato-bicarbonato, y bloqueadas de conformidad con lo descrito arriba. Después las placas fueron incubadas con (fc 10 muestras de suero de inhibidor en dilución en serie doble de 100 durante 2 horas a 37°C seguido por un conjugado de mAb de IgG de anti-ratón de cabra-peroxidasa (Boehringer-Mannheim, IN) durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Después, las placas fueron desarrolladas y terminadas de conformidad con 15 lo descrito arriba. Finalmente, se midió la absorbencia a 450 nm empleando un lector de microplacas automático UVMax. Los resultados fueron expresados en títulos de punto final en » donde el punto final fue determinado como la dilución sérica final que proporciona una absorbencia más alta que dos veces 20 la absorbencia de fondo. Diluciones óptimas de conjugados de mAb de IgG de anti-ratón marcados con peroxidasa de rábano agrio fueron determinadas como 1/1000. IgE plasmática específica para LNnT-HSA fue también probada de la misma manera que en el caso del método empleando LNnT-HSA (2 µg/ml) 25 como una IgEmAb de anti-ratón biotinilada y revestimiento de Ag (1 µg/ml, Pharmingen) seguido por conjugado de avidina-peroxidosa (Sigma) como una Ab de detección. Isotipos de IgG sérica total fueron también determinados por ELISA. Las placas fueron revestidas con 100 µl de 2 µg/ml de mAb de IgGl, IgG2a, IgG2b, e IgG3 de anti-ratón de rata (Pharmingen) durante la noche a una temperatura de 4°C. Después de la operación de lavado y de la operación de bloqueo de conformidad con lo descrito arriba, se agregaron muestras de 100 µl de isotipos de IgG de ratón estándares (Pharmingen) o bien de suero diluido en serie fueron agregados en pozos por duplicado e incubados durante 2 horas a una temperatura de 37°C. Después se agregaron 100 µl de Ig de anti-ratón de cabra policlonal conjugada con peroxidasa (Pharmingen) diluida en 1/1000 y se llevó a cabo una incubación durante 1 hora a una temperatura de 37°C. Después del lavado, las reacciones fueron desarrolladas y suspendidas de conformidad con lo descrito arriba, y se midió la absorbencia a 450 nm. Respuestas proliferativas de los esplenocitos Se sacrificaron grupos de ratones mediante dióxido de carbono 5 días después de la segunda inmunización de refuerzo. Se removieron los bazos de manera séptica y se efectuaron ensayos de proliferación de conformidad con lo descrito previamente (Velupillai, P. et al. (1997) J. Immunol . vol. 158 páginas 338-344). En resumen, se prepararon suspensiones de células en RPMI 1640 complementado con 10% de FCS (Gibco), 2 mM de L-glutamina, 5 x 10"5 M 2-mercaptoetanol, 100 unidades/ml de penicilina, y 100 µl de estreptomicina (Sigma). Se removieron células sanguíneas rojas mediante incubación en solución de Boyle, y se agregaron 2.5 x 10 células por ml a placas de cultivo de tejido de fondo plano de 96 pozos (Corning) por triplicado durante 72 horas a una temperatura de 37°C, 5% de C02 en el aire, con 2 µg/ml de ConA (Vector) , 10 µg/ml HSA o bien LNnT-HSA. Durante las 8 horas finales, las células fueron incubadas con 1 µCiJH timidina (Amersham Life Science Inc., IL) y después las células fueron cosechadas en un papel filtro para conteo de centelleo . Ensayos de citocina En placas de cultivo de 24 pozos de fondo plano (Corning) , se cultivaron suspensiones de 2.5 x 10° células por ml con ConA (2 µg/ml) o bien sin reestimulación a una temperatura de 37 °C en un medio RPMI 1640 complementado de conformidad con lo descrito arriba. 24, 72 y 120 horas después los cultivos de células fueron después centrifugados, y los sobrenadantes de cultivo fueron cosechados y mantenidos congelados (-80°C) hasta la realización del ensayo. Células en pellas fueron resuspendidas y después teñidas con mAbs acoplado con FITC o PE para tinción inmunofluorescente . Se midieron los niveles de IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, e IFN-? en sobrenadantes provenientes de esplenocitos estimulados con ConA o bien no estimulados mediante ELISA de captura. En resumen, placas de ? microtitulación Maxisorp (Nunc Laboratories Ltd., Dinamarca) fueron revestidas con 50 µl de Ab de captura a 2.0 µg/ml (IL- 5 5, IL-10 e IFN-? de anti-ratón de rata de Pharmingen e IL-4 de anti-ratón de rata de Endogen, MA) en amortiguador de carbonato-bicarbonato mediante incubación durante la noche a una temperatura de 4°C. Los pozos fueron después lavados con PBS-T cuatro veces y bloqueados por adición de 10% de FCS en 10 PBS (2 horas, 37°C) . Se agregaron después 50 µl de sobrenadantes de cultivo y estándares recombinantes apropiados a pozo individual por duplicado. Para curvas estándares, se emplearon por duplicado IL-5 recombinante (de 0 a 5,000 pg/ml), IL-10 (de 0 a 25,000 pg/ml), IFN-? (de 0 a 15 20,000 pg/ml) (Pharmingen, CA) e IL-4 (de 0 a 1,500 pg/ml) (Endogen, MA) . Después de una incubación durante la noche a una temperatura de 4°C, los pozos fueron lavados y se agregaron 50 µl/pozo apropiados de Ab de detección biotinilada a razón de 1 µg/ml (IL-5, IL-10 o IFN-? de anti- 20 ratón de rata de Pharmingen e IL-4 de anti-ratón de rata de Endogen, MA) . Para la detección de Ab biotinilada unida, se agregaron 50 µl de conjugado de estreptavidina-fosfatasa alcalina (1/2000, Pharmingen) a cada pozo durante 45 minutos, y después se efectúo un lavado. El nivel de citocina en los 25 pozos fue visualizado por adición de fosfato de p-nitrofenilo (Sigma) en amortiguador de glicina. La absorbencia fue medida a 405 nm empleando un lector de microplacas automático UVMax . Tinción inmunofluorescente Después de un cultivo in vi tro sin reestimulación, esplenocitos fueron resuspendidos e incubados en hielo durante 15 minutos con mAbs de la siguiente manera: anti-CD45R/B220 (RA3-6B2), anti-B7-l (16-10A1), y anti-B7-2 (GL-1) o bien controles correspondientes a los isotipos. Todas las mAbs estaban conjugadas ya sea con FITC o PE (Pharmingen) . Después del lavado con una solución de sal equilibrada de Hank (Gibco) que contenía 0.05% de azida de sodio, se efectúo un análisis de citometría de flujo mediante el uso de un citometro de flujo FACSCalibur y una programática Cell Quest (Becton Dickinson, CA) . Las células muertas fueron excluidas del análisis con base en tinción de yoduro de propidio (Molecular Probes, OR) . Linfocitos fueron controlados de conformidad con las características físicas de dispersión directa y lateral y por lo menos 10,000 eventos fueron adquiridos . Estadísticas Se efectúo un análisis estadístico empleando la prueba t no apareada de Student. Un valor de p < 0.05 fue considerado significativo . EJEMPLO 1: Inducción de IgE policlonal por LNnT multivalente in vi vo Después de la primera inmunización IP de refuerzo con LNnT- HSA, ratones BALB/C produjeron cantidades significativamente más altas de IgE sérica total que ratones inmunizados IP con solución salina, HSA, Le-'-HSA, y HSA-Alumbre (Figura la) . El 5 nivel de IgE sérica fue significativamente elevado después de la segunda inmunización IP. Esta elevación no se observó después de la primera inoculación. Sin embargo, una elevación importante de la IgE sérica duró por lo menos 8 semanas después de la segunda inmunización IP con LNnT (Figura lb) . (fc 10 La IgGl sérica fue también significativamente incrementada en ratones inmunizados IP con LNnT multivalente en comparación con los ratones inmunizados con solución salina o HSA sola, mientras que la cantidad de los demás isotipos no fuera significativamente diferente (Figura lc) . 15 Se determinaron IgE e IgG específicas para HSA en sueros en ratones inmunizados IP con HSA-Alumbre. Al contrario, estas señales en ratones inmunizados IP con LNnT-HSA no fueron detectadas y no fueron estadísticamente diferentes de los grupos de control inmunizados con HSA sola, LEy-HSA, o 20 solución salina (Figura 2a, b) . Hallazgos similares fueron observados en títulos de Ab contra LNnT-HSA. Ratones inmunizados IP con LNnT-HSA no produjeron cantidades significativas de IgG o IgE específica para LNnT-HSA en comparación con los controles (Figura 2c, d) . Además, señales 25 específicas contra Gal (ßl-4)GlcNac y Gal (ßl-4)Glc, los componentes de LNnT, tampoco fueron detectadas cuando se emplearon Gal (ßl-4)GlcNac biotimliada y Gal (ßl-4)Glc i^ (Glycotech,, MD) , respectivamente, en vez de HSA biotinilada en ELISA para IgE específica. Estos resultados sugieren que 5 la LNnT multivalente indujo una producción policlonal no específica de IgE en ratones BALB/C después de una inmunización de refuerzo. Especificidad de la inducción de IgE policlonal por LNnT multivalente (fc 10 Como en el caso de la sepa BALB/C, ratones CBA/J mostraron un incremento significativo de la IgE sérica después de la primera inmunización IP de refuerzo con LNnT-HSA en comparación con los grupos de control (Figura 3a) . Por otro lado, ratones C57BL/6 no presentaron el incremento de la IgE 15 sérica después de una primera inmunización IP con LNnT-HSA. Sin embargo, esta cepa indujo el incremento de la IgE sérica después de una segunda inmunización IP (Figura 3b) . Ninguno de las cepas provoco la producción de IgE ni de IgG contra HSA. Estos resultados indican que la inducción de IgE 20 policlonal por LNnT multivalente fue afectada genéticamente. La elevación de la IgE sérica total no se observó en inmunización SC con LNnT-HSA aún después del refuerzo (Figura 3c) . Se ha sugerido previamente que LNnT-HSA no induce dicha elevación de la IgE sérica después de sensibilización 25 intranasal, lo que implica que la vía de inoculación de LNnT multivalente es crítica para la inducción de IgE no específica. Ratones CBA/CaJ xid, que sen deficientes en <|fc células CD5+B-1 mostraron cantidades significativamente más elevadas de IgE después de inmunización I? con LNnT-HSA en 5 comparación con los ratones inmunizados IP con solución salina o HSA, aún cuando las cantidades fueron significativamente menores que los ratones CBA/Caj de control (Figura 3d) . Este resultado indica que las células B-l, que son uno de los componentes específicos de la cavidad (fc 10 peritoneal, parecen estar involucradas parcialmente pero no de manera critica en la inducción de IgE policlonal por LNnT multivalente . Respuestas proliferativas contra LNnT multivalente Esplenocitos de ratones BALB/C fueron preparados 5 días 15 después de una segunda inmunización IP de refuerzo con solución salina, HSA o LNnT-HSA. Ratones inmunizados IP con HSA o solución salina mostraron unas respuestas proliferativas moderadas pero significativas in vi tro a LNnT- HSA en comparación con HSA o bien no reestimulación, lo que 20 sugiere que LNnT induce las respuestas proliferativas en esplenocitos naturales. Ratones inmunizados IP con LNnT-HSA mostraron las respuestas significativas aún sin reestimulación en comparación con los ratones de control (Figura 4). Además, la respuesta fue significativamente 25 mejorada con reestimulación de LNnT-HSA. En estimulación con ConA, ratones inoculados con LNnT respondieron también de manera significativamente mayor que los controles. Estos ?fc| resultados sugieren que esplenocitos específicos para LNnT- HSA fueron activados espontáneamente después de una 5 inmunización IP con LNnT multivalente. Producción de citocina por ratones inoculados con LNnT Esplenocitos de ratones inmunizados IP con LNnT-HSA produjeron también citocinas sin reestimulación. Cantidades significativas de 11-2, 11-4 e IL-5 fueron detectadas desde (fc 10 las 24 horas de incubación en sobrenadantes de cultivo sin reestimulación. IL-10 e IFN-? fueron detectadas desde las 72 horas de incubación. Los resultados se resumen a continuación en la Tabla 1. Es interesante observar que, en respuesta a ConA, los esplenocitos de ratones inmunizados IP con LNnT-HSA 15 produjeron cantidades significativamente mayores de IL-4, II- 5 e IL-10, pero no de IFN-? en comparación con los ratones inmunizados IP con solución salina o HSA, lo que sugiere que LNnT induce los esplenocitos a respuestas Th2 polarizadas en respuesta a una estimulación con ConA. 20 Tabla 1 Estimulación in vitro (hrs) Citocina Inmunización Ninguna Ninguna Ninguna Con A (24 hrs) (72 hrs) (120hrs) (72hrs) IL- solución ND ND ND ND 25 (pg/ml) salina HSA ND ND ND ND LNnT-HAS 209+68* 2,060+ 63+1* ND 286* IL-4 Solución ND ND ND 76.56+ (pg/ml) salina 18.28 HSA ND ND ND 31.81+ 3.64 LNnT-HAS 63.74+ 479.07+ 1,363.33+ 234.00+ 24.11* 86.80* 259.70* 28.15* I» 10 IL-5 Solución 48+ 4 48+2 49+1 81+2 (pg/ml) salina HSA 43+2 42+1 45+6 78+6 LNnT-HSA 178+5* 808+93* 3,018+ 604* 671+34* IL-10 solución ND ND ND ND 15 (pg/ml) salina HSA ND ND ND ND LNnT-HAS ND 1,068+ 7,1 364+ 1,529+ 223* i,: 381* 361* IFN-g solución ND ND ND 3.577+ 20 (pg/mi; salina 510 HSA ND ND ND 3, 358+ 471 LNnT-HAS ND 2,090+ 12, .220+ 5,917+ 891* 1,251* 1,132 25 Expresión de B7-2 (CD86) selectiva in vi tro en células B220 + en ratones inoculados con LNnT La expresión de las moléculas coestimuladoras B7-1 y B7-2 en esplenocitos B220 positivos fue también investigado. En esplenocitos recién aislados, el porcentaje de las células 5 positivas para moléculas B7-1 y para moléculas B 220 fueron 1.02+0.08. 0.95+0.07, y 0.88+0.06 en ratones inmunizados IP con solución salina HSA, y LNnT-HSA, respectivamente (n=6) . El porcentaje de las células positivas para moléculas B7-2 y para moléculas B220 fueron 0.59+0.04, 0.59+0.05, y 0.56+0.04 ( 10 en ratos inmunizados IP con solución salina, HSA, y LNnT-HSA, respectivamente, lo que sugiere la ausencia de diferencias en cuanto a la expresión de estas moléculas en esplenocitos recién aislados. La expresión de B7-1 no fue alterada en esplenocitos cultivados (figura 5a, c,e.) sin embargo después 15 de 24 horas de incubación de cultivo sin reestimulación in vi tro, células B220 positivas que expresan la molécula B7-2 fueron incrementadas en ratones inmunizados IP con LNnT-HSA en comparación con los ratones de control inmunizados con solución salina o HSA (figura 5b, d.f). Este incremento se 20 encontró después de 6 horas de incubación, y duro por lo menos 120 horas, aún cuando la expresión B7-1 en células B220 positivas no fue alterada durante el periodo observado (figura 5g, h) . IL-4 se requiere para la inducción de la producción IgE 25 policlonal por NLnT multivalente Puesto que las citocinas Th2, especialmente IL-4, están involucradas con la producción IgE, la función de IL-4 para 'f la inducción de la producción de IgE policlonal por LNnT multivalente in vivo fue investigada empleando ratones 5 deficientes en cuanto al gen IL-4. Ratones deficientes en cuanto al gen IL-4 no indujeron la producción de IgE policlonal después de inmunización IP repetida LNnT_HS . En este experimento, ratones deficientes para IL-4 o bien para ratones BALB/C. de tipo silvestre fueron inmunizados con iy 10 solución salina, HSA o bien LNnT-HSA. Después de la segunda inmunización de refuerzo, se tomaron muestras de suero y se midió la IgE sérica total. Después de la segunda inmunización de refuerzo, 2.5 x 106/ml de esplenocitos de ratones de tipo silvestre o ratones deficientes en IL-4 fueron cultivados 15 sin estimulantes adicionales y la producción de IL-4, 5, IL- 10, y IFN- gama fueron medidas 24, 72, y 120 horas después d la incubación. Es interesante observar que esplenocitos de ratones deficientes para IL-4 con la inmunización LNnT-HSA produjeron IL-5, IL-6, y INF-gama sin reestimulación sin 20 embargo, las cantidades de IL-5 y de IL-6 fueron significativamente menores que en el caso de los ratos BALB/C de tipo silvestre (figura 6b, c, d, e) . Estas citocinas no fueron detectadas en ratones deficientes para IL-4 inmunizados IP con solución salina o HSA, lo indica que se 25 requiere IL-4 para la inducción de IgE policlonal por LNnT multivalente. EJEMPLO 2: (^fc Experimentos adicionales que demuestran la inducción de IgE policlonal por LNnT multivalente fueron efectuados, de 5 conformidad, con lo descrito a continuación. En una primera serie de experimentos, ratones recibieron inyecciones intraperitoneales ya sea dos o tres veces con o bien dextrano solo, medio RPMI o bien LNnT conjuga con dextrano en solución salina (LNnT-dextrano) . El conjugado de ifc 10 azúcar fue conocido como LNnT 35, en donde 35 es refiere al grado de sustitución de LNnT en cada molécula de dextrano. Se determinó la cantidad total de IgE inducida en los ratones. Los resultados aparecen en la figura 6, en donde los números después de LNnT (es decir, 200, 100 o bien 50) se refieren a 15 la cantidad inyectada (peso de dextrano) . Los resultados demuestran que el constructo LNnT-dextrano puede inducir grandes cantidades de IgE total in vivo. Ó En otra serie de experimentos, se investigó el efecto de un tratamiento previo con LNnT multivalente sobre la producción 20 de IgE específica para antígeno. Ratones fueron inyectados ya sea con ovalbumina (como antígeno específico) seguido por una segunda inyección de ovalbumina, o bien con el conjugado de dextrano LNnT 45 seguido por ovalbumina. Los controles en ratones que recibieron RPMI o dextrano, seguido por 25 ovalbumina. La figura 7 muestra la IgE total de los ratones y la figura 8 muestra la IgE específica para ovalbumina en los ratones. La figura 7 demuestra que no hubo diferencias notables en cuanto a niveles de IgE total en los ratones. La figura 8 demuestra, sin embargo, que un tratamiento previo 5 con el conjugado de LNnT-dextrano de hecho reduce la cantidad de IgE específica para OVA en un 40-50%. Así, el conjugado de LNnT funciona para reducir la IgE específica para alérgeno in vivo . En otro experimento, el período de tiempo durante el cual los (fc 10 niveles de IgE no específica permanecen elevados después del tratamiento con LNnT multivalente fue investigado. Se empleó LNnT-HSA como conjugado, con solución salina y HSA sola sirviendo como controles. Los resultados aparecen en la figura 9, lo que demuestra que ratone tratados con LNnT-HSA 15 presentaron niveles altos de IgE no específica durante por lo menos 70 días (el punto temporal más largo en el estudio) . Así, el tratamiento con LNnT multivalente lleva a una IgE no « específica persistente. En otro experimento, se examinó el efecto del tratamiento con 20 LNnT-dextrano sobre la producción de citocinas de tipo Th-2 o bien de citocinas de tipo Th-1. Ratones fueron inmunizados de manera intraperitoneal con LNnT-dextrano, los esplenocitos totales fueron cosechados y estimulados con ConA, seguido por la medición de niveles de citocina a las 48 horas o 72 horas 25 de cultivo. Los resultados para la citocina de tipo Th-2 aparecen en la figura 10, lo que demuestra que tratamiento con LNnT-dextrano llevan a niveles significativamer.te (fc elevados de IL-10, IL-4, y IL-13 a 72 horas de cultivo en comparación con controles inmunizados con vehículo 5 (dextrano) . Los resultados para la citocina de tipo Th-1, interferón-gama, aparecen en la figura 11, y se puede observar que el tratamiento con LNnT-dextrano reduce el nivel de interferón-gama tanto a las 48 horas como a las 72 horas. Comentarios (fc 10 Estos ejemplos muestran que LNnT multivalente induce la producción de IgE policlonal en ratones mediante inmunización Ip repetida in vivo. A pesar del hecho que varios reportes han demostrado la producción de IgE policlonal en ratones y seres humanos in vivo e in vitro a través de los extractos de 15 los parásitos, el mecanismo de promoción de producción de IgE policlonal por parásitos sigue siendo sin aclararse (Wang, MQ. et al. (1995) Parasite Immunol. vol. 17 páginas 609-615; <» McGibbon, AM. et al. (1990) Mol. Biochem. Parasitol. vol. 39 páginas 163-172; Lee, TDG et al. (1995) J. Allergy Clin. 20 Immunol. vol. 95, páginas 124-1254. Yarnashita, T. et al. (1993) Immunology vol. 79 páginas 185-195. Yamashita, U. et al. (1993) Jap. J. Parasitol. vol. 42 páginas 211-219). De hecho, las células B son activadas de manera no específica en un huésped infectado por parásitos (Fisher, E. et al. (1931) 25 Clin. Exp. Immunol. vol. 46, páginas 89-97). Una porción carbohidrato en antígeno de huevo de schi stosoma japoni cum activan, según se reporta, no solamente células B preparadas con esquistosoma sino también células B naturales (Yarnashita, T. et al. (1993) Immunology vol. 79 páginas 185- 5 195) . Por consiguiente, parece que antígenos esquistosomales, especialmente porciones carbohidrato tienen un efecto mitogénico contra las células B para inducir una activación no específica. De hecho, existen reportes en el sentido que los extractos de nematodos contienen in mitógeno de célula B 0 10 que regula la activación de células B no específicas para inducir la producción de IgE policlonal (Wang, MQ. et al. (1995) Parasite Immunol. vol. 17 páginas 609-615; Lee, TDG et al. (1995) J. Allergy Clin. Im unol. vol. 95, páginas 124- 1254). Sin embargo, la actividad mitogénica de células B no 15 es suficiente para promover la producción de IgE policlonal. Se sabe que IL-4 induce las células B para que desarrollen células que producen IgE policlonal en ratones in vivo e in i vitro (Coffman, RL . et al. (1990) J. Immunol . vol. 136 páginas 949-954; Finkelman. FD et al. (1990) Annu. Rev. 20 Im unol. vol. 8 páginas 303-333; Tepper, Rl . et al. (1990) Cell vol. 62 página 457; Snapper, CM. et al. (1991) J. Immunol. vol. 147 páginas 1163-1170; Nakanishi, K. et al. (1995) Int. Immunol. vol. 7 páginas 259-268). Por consiguiente la ayuda de IL-4 derivada de células que 25 producen IL-4 como por ejemplo células T (incluyendo células NK1+CD4~T), eosinófilos, y células del linaje de célula de mástil/basófilo puede requerirse (Coffman, RL. et al. (1997) J. Exp. Med. Vol. 185 páginas 373-375 ; Sabin, EA. et al. 1996) J. Exp. Med. Vol. 184 páginas 1871-1878). Así, por lc menos dos factores en antígenos de parásito pueden ser requeridos para inducir la producción de IgE policlonal: una actividad mitogénica de células T y la inducción de la producción de IL-a. Lee et al mostr aron que el fluido corporal de Ascari s puede incrementar los niveles totales de IgE en ratones a través de una inyección subcutánea única (McGibbon, AM. et al. (1990) Mol. Biocheit. Parasitol. vol. 39 páginas 163-172; Lee, TDG et al. (1995) J. Allergy Clin. Immunol. vol. 95, páginas 124-1254; Lee, TDG et al 1993! Allergy Clin. Immunol. vol. 102, páginas 185-190). Sin embargo, no aislaron la molécula que induce la producción de IgE, sino que mostraron que ABA-1, e L alérgeno principal purificado de Ascaris no induce el inc: ::emento de IgE total. Por consiguiente, sugirieron el modelo de inducción de IgE policlonal por nematodo que contienen un mitógeno de célula B que activa de manera policlonal las células B, que se convierte en una respuesta IgE policclonal cuando estas células B estimuladas llegan bajo la influencia de IL-4 o bien una molécula de tipo IL-4 activada por otros factores Esplenocitos de ratones inmunizados IP con LNnT produjeron IL-4, IL-5 y IL-10 sin re-estimulación in vitro, aún cuando produjeron también una cantidad detectable de IL-2 y IFN-?. Además, ratones deficientes en IL-4 no indujeron la ifc producción de IgE policlonal después de inmunización IP con este carbohidrato aun cuando produjeron una cantidad 5 significativa de IL-5, IL-10, y IFN-?. El desarrollo de la producción de IL-5 y IL-10 después de infección por S. mansoni se observó también en ratones deficientes en IL-4 (Pearce, EJ. et al. (1996) Int. Immunol. vol. 8 páginas 435- 444; King., CL. et al. (1996) Exp. Parasitol. vol. 84 páginas (fc 10 245-252) . Estos resultados indican que IL-4 se requiere para inducir la producción de IgE policlonal por LNnT multivalente in vivo. Además, esplenocitos de ratones inmunizados IP con LNnT multivalente producen, según se encontró, significativamente más IL-4 en respuesta a ConA, el mitógeno 15 de célula T. Este resultado es consistente con los reportes en el sentido que un huésped infectado con esquistosoma muestra una producción de IL-4 impulsada por mitógeno y la O producción se correlaciona con la IgE sérica total (King., CL. et al. (1993) J. Immunol . vol. 150 páginas 1873-1880; 20 Ogilvie BM Nature 1964 204, 91-92; Zwingenberger, K. et al. (1991) Scand. J. Iimmunol. vol. 34 páginas 243-251). Por consiguiente, LNnT multivalente induce probablemente un huésped susceptible a producir IL-4. La fuente de IL-4 fue analizada por tinción intracelular en cultivo in vitro, y se 25 demostró que células CD4+T son responsables de la producción IL-4. Recopilando estos hallazgos, LNnT multivalente puede poseer flfc por lo menos dos funciones, actividad mitogénica de célula B e inducción de producción de IL-4 para inducir la producción 5 de IgE policlonal. De hecho, un esplenocito proveniente de ratone sde control inmunizados IP con solución salina mostró también las respuestas proliferativas significativas contra LNnT, lo que sugiere que este carbohidrato posee la actividad mitogénica. (fc 10 Ratones CB.A/J y BALB/C producen la IgE policlonal después de la segunda inmunización, por otra parte, los ratones C57BL/6 producen dicha IgE policlonal después de la tercera inmunización. Se sabe que la respuesta del huésped contra una infección por 5. mansoni depende de la cepa. Ratones CBA/j, 15 C3H/HeJ, Y BALB/C desarrollaron granulomas hepáticos más grandes e hipertensión portal más elevada mientras que ratones C57BL/6 desarrollaron granulomas relativamente más i pequeños e hipertensión portal más baja (Fanning, MM. et al. (1981) J. Inf. Dis. vol. 144 148-153; Hernández, NJ. et al. 20 (1997) Eur. J. Immunol. vol. 27 páginas 666-670). La inmunización con LNnT parece tener una misma característica que la infección por S. mansoni en términos de la cepa de ratones susceptinble, lo que sugiere que este carbohidrato puede ser un antígeno putativo dominante en S. mansoni . Amiri 25 et al demostraron que la supresión completa de la respuesta de IgE total resultó en disminuciones en cuanto a la carga de gusano y producción de huevos en ratones normales infectados '^P por S . mansoni y ratones noqueados para IFL-? (Amiri, P. et al. (1993) J. Exp. Med. vol. 180 páginas 43-51). El presente 5 resultado puede relacionarse con estos resportes en la medida en que en infección primaria por S . mansoni , los ratones C57BL/6 producen una cantidad relativamente más baja de producción de IgE policlonal en respuesta a antígeno de carbohidrato en S. mansoni, lo que resulta en una producción i 10 disminuida de huevos y de carga de gusano (Amiri, P. et al. (1992) Nature vol. 356 página 604). Además, se ha demostrado previamente que el sobrecrecimiento de células B-l peritoneales provocado por infección S . mansoni dependía de la cepa, lo que ocurre en ratones CBA/J, 15 C3H/HcJ, y BALB/C pero no en ratones C57BL/6 (Palanivel, V. et al. (1996) Exp. Parasitol. vol. 84 páginas 168-177) . Un subconjunto de células B-l es una fuente mayor de IL-10 de células B que regula de manera descendente las respuestas de Thl (Amiri, P. et al. (1992) Nature vol. 356 página 604). El 20 presente resultado en el sentido que las células B-l peritoneales parecen estar involucradas en parte en la inducción de la IgE policlonal por LNnT multivalente (figura 2d) es consistente con el reporte. La producción de IgE policlonal en respuesta a LNnT 25 multivalente no se debe a contaminación de LPS, puesto que los ratones inmunizados IP con LNnT-HSA produjeron la misma cantidad de IgG3 sérica en comparación con los controles. Se ' P sabe que LPS indujo la producción de IgG3 tanto in vivo como in vitro (Coffman, RL. et al. (1986) J. Immunol . vol. 136 5 páginas 949-954; Finkelman, FD et al. (1990) Annu. Rev. Immunol . vol. 8 páginas 303-333) . Y LPS en sí no indujo la producción de IL-4 in vitro mientras que esplenocitos de ratones inmunizados de IP con LNnT-HSA sí produjeron IL-4. Después de incubación en cultivo in vitro sin reestimulación, 0 10 células positivas para B7-2 fueron incrementadas en población de células B220+ en ratones inmunizados IP con LNnT-HSA en comparación con los ratones de control inmunizados con solución salina o HSA. Moléculas co-estimuladoras B7-1 y B7-2 son ligandos para CD28/CTLA-4 e están involucradas en una 15 activación de células T producción de citocinas, así como regulación de la tolerancia (McKnight, AJ. et al. (1994) J. Immunol. vol. 152 páginas 5220-5225; Pérez, VL . et al. (1997) Immunity vol. 6 páginas 411-417). La co-estimulación por B7-1 y B7-2 puede regular de manera diferencial la diferenciación 20 de células Thl aún cuando el efecto de estas moléculas depende del estado de la reacción inmune, dosis y vías de inoculación de antígenos, tipos de APC y del modelo experimental de enfermedades (Thompson, CB. (1995). Cell vol. 81 páginas 979-982) . Por ejemplo, en estudios de 25 encefalomielitis alérgica experimental (EAE) en ratones, la administración con anti-B7-l disminuyó la severidad de la enfermedad neurológica, que es mediada por células Thl, I.B mientras que la administración de anti-B7-2 incremento la severidad (Kuchroo, VK. et al. (1995) Cell vol. 80 páginas 5 707-718). Reportes recientes sugieren que B7-2 puede desempeñar una función crítica en la capacidad de iniciar una respuesta Th2 (Thompson, CB. (1995). Cell vol. 81 páginas 979-982); McArthur, JG. et al. (1993) J. Exp. Med. vol. 178 páginas 1645-1653) . Los resultados presentes con consistentes 0 10 con estos reportes y sugieren que la expresión de B7-2 se relaciona estrechamente con la producción de IgE policlonal por LNnT multivalente. Sin embargo, células B220+ recién aisladas de ratones inmunizados IP con LNnT multivalente no expresan los niveles significativos de B7-2 en comparación 15 con las de ratones de control. Este resultado significa que LNnT induce indirectamente la expresión de B7-2 en células B220+. Esto puede deberse a la IL-4 secretada por las células Th2, puesto que ratones deficientes en IL-4 no indujeron la expresión de B7-2. Stack et al demostraron que el tratamiento 20 con IL-4 de pequeñas células B esplénicas indujo tanto B7-2 como moléculas de B7-2 (Stack, RM. et al. (1994) J. Immunol. vol. 152 páginas 5723-5733). Reportaron también que la expresión de B7-2 fue detectada a las 6 horas y pareció llegar su pico a las 24 horas, mientras que B7-1 no se 25 observó sino hasta las 48 horas y llegó a su pico a las 72 horas. La expresión de B7-1 no pudo ser detectada hasta las 120 horas. Esta diferencia puede deberse al estado de las 'JP células B. Este resultado representa la expresión de células B220+ preparadas por LNnT multivalente, al contrario, los 5 autores investigaron las células B en reposo. Los hallazgos actuales sugieren que la inducción in vivo de la producción de IgE policlonal por LNnT puede ser útikl para una inmunoterapia o bien para la profilaxis de una reacción alérgica y anafiláctica en donde mediadores químicos w 1° perjudiciales son liberados de las células efectoras por la reticulación de IgE específica para antígenos en la superficie de la célula. Además, estos resultados nos alientan a promover la reducción de la reacción anafiláctica no solamente en infección con parásitos sino también en 15 alergia ambiental (Hagel. I. et al. (1993) Parasite Immunol. vol. 15 paginas 311-315). EQUIVALENTES Los expertos en la materia reconocerán o bien podrán determinar empleando solamente experimentos de rutina muchos 20 equivalentes a las modalidades específicas de la invención descrita aquí. Tales equivalentes están abarcados por las siguientes reivindicaciones. 25

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES Un método para modular una respuesta inmune en un sujeto, que comprende: administrar al sujeto un agente que comprende lacto-N-neotetraosa (LNnT) multivalente, de tal manera que se module una respuesta inmune en el sujeto. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un vehículo de proteína. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el agente comprende LNnT conjugada con albúmina sérica humana. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un polímero de carbohidrato. El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el agente comprende LNnT conjugada con dextrano. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente se administra de manera intraperitoneal. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente se administra de manera intravenosa. El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde la respuesta inmune modulada es una respuesta de IgE. 9. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde la respuesta de IgE policlonal es estimulada. 10. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el método comprende la administración del agente 5 al sujeto antes de la exposición del sujeto a un alérgeno y en donde la producción de una respuesta de IgE específica para alérgeno en el sujeto es inhibida. 11. Un método para estimular la producción de una citocina de tipo Th-2 que comprende la puesta en contacto de una 10 célula capaz de producir una citocina de tipo Th-2 con un agente que comprende lacto-N-neotetraosa multivalente (LNnT) de tal manera que se produzca una citocina de tipo Th-2 por parte de la célula. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11, en 15 donde la citocina es IL-4. 13. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde la citocina es IL-10 o IL-13. 14. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un 20 vehículo de proteína. 15. El método de conformidad con la reivindicación 14, en donde el agente comprende LNnT conjugada con albúmina sérica humana. 16. El método de conformidad con la reivindicación 11, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un polímero de carbohidrato. <B 17. El método de conformidad con la reivindicación 16, en donde el agente comprende LNnT conjugada con dextrano. 5 18. Un método para estimular la proliferación de esplenocitos, que comprende la puesta en contacto de esplenocitos con un agente que comprende lacto-N- neotetraosa multivalente (LNnT) de tal manera que se estimule la proliferación de los esplenocitos. (0 10 19. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un vehículo de proteína. 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, en donde el agente comprende LNnT conjugada con albúmina 15 sérica humana. 21. El método de conformidad con la reivindicación 18, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un polímero de carbohidrato. 22. El método de conformidad con la reivindicación 21, en 20 donde el- agente comprende LNnT conjugada con dextrano. 23. Una composición farmacéutica que comprende un agente que comprende lacto-N-neotetraosa multivalente (LNnT) y un vehículo farmacéutico, en un empaque con instrucciones de uso de la composición farmacéutica 25 como modulador de respuesta de IgE en un sujeto. 24. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un vehículo de proteína. 25. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 24, en donde el agente comprende LNnT conjugada con albúmina sérica humana. 26. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 23, en donde el agente comprende LNnT conjugada con un polímero de carbohidrato. 27. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 26, en donde el agente comprende LNnT conjugada con dextrano.
MXPA01005441A 1998-12-01 1999-12-01 Metodos inmunomodulatorios que emplean antigenos de carbohidrato. MXPA01005441A (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11049698P 1998-12-01 1998-12-01
US45174599A 1999-11-30 1999-11-30
PCT/US1999/028308 WO2000032205A1 (en) 1998-12-01 1999-12-01 Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens

Publications (1)

Publication Number Publication Date
MXPA01005441A true MXPA01005441A (es) 2002-03-14

Family

ID=26808075

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
MXPA01005441A MXPA01005441A (es) 1998-12-01 1999-12-01 Metodos inmunomodulatorios que emplean antigenos de carbohidrato.

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20020142945A1 (es)
EP (1) EP1135143A1 (es)
JP (1) JP2003524612A (es)
CA (1) CA2353502A1 (es)
MX (1) MXPA01005441A (es)
WO (1) WO2000032205A1 (es)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2001259077A1 (en) * 2000-04-14 2001-10-30 President And Fellows Of Harvard College Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
US6946451B2 (en) 2002-02-04 2005-09-20 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Insulin secretion promoter
BR112013026661B1 (pt) 2011-04-18 2020-12-01 University Of Georgia Research Foundation, Inc. composição de vacina, usos da mesma e método para produzir a referida composição

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6841543B1 (en) * 1996-01-31 2005-01-11 President And Fellows Of Harvard College Methods of inhibiting production of T helper type 2 cytokines in human immune cells

Also Published As

Publication number Publication date
EP1135143A1 (en) 2001-09-26
WO2000032205A8 (en) 2000-08-24
US20020142945A1 (en) 2002-10-03
JP2003524612A (ja) 2003-08-19
WO2000032205A9 (en) 2001-07-12
CA2353502A1 (en) 2000-06-08
WO2000032205A1 (en) 2000-06-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pearce et al. Downregulation of Th1 cytokine production accompanies induction of Th2 responses by a parasitic helminth, Schistosoma mansoni.
Hunter et al. Production of gamma interferon by natural killer cells from Toxoplasma gondii-infected SCID mice: regulation by interleukin-10, interleukin-12, and tumor necrosis factor alpha
Dullforce et al. Enhancement of T cell-independent immune responses in vivo by CD40 antibodies
Trembleau et al. Deviation of pancreas‐infiltrating cells to Th2 by interleukin‐12 antagonist administration inhibits autoimmune diabetes
KR20070094662A (ko) 비침습성 경피 예방접종
US7799755B2 (en) Immunomodulatory methods using oligosaccharides
Rotman et al. IL‐12 eliminates the Th‐2 dependent protective immune response of mice to larval Strongyloides stercoralis
US20140322274A1 (en) Therapeutic Agents
Ishizaka Regulation of immunoglobulin E biosynthesis
Germann et al. Administration of IL-12 during ongoing immune responses fails to permanently suppress and can even enhance the synthesis of antigen-specific IgE
WO2013044419A1 (en) Combined facilitator, antigen and dna vaccine for preventing and treating autoimmune diseases
JP2006182787A (ja) アレルギー性疾患の予防法
Sedlik et al. Lack of Th1 or Th2 polarization of CD4+ T cell response induced by particulate antigen targeted to phagocytic cells.
EP1684803B1 (en) Immune modulator comprising whole cell tsukamurella bacteria
US20040047866A1 (en) Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
CN101094685B (zh) 鞭毛蛋白在鼠疫耶尔森氏菌的免疫疗法中的用途
WO2001078748A2 (en) Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
MXPA01005441A (es) Metodos inmunomodulatorios que emplean antigenos de carbohidrato.
AU3106300A (en) Immunomodulatory methods using carbohydrate antigens
Kato et al. The influence of initial exposure timing to β-lactoglobulin on oral tolerance induction
Van Mechelen et al. Induction of Th2 responses to soluble proteins is independent of B cell tolerance status
Sehra et al. Role of liposomes in selective proliferation of splenic lymphocytes
Akdis Immunologic responses to sublingual allergen immunotherapy
Thiele et al. Modulation of Immunity and Viral‐Host Interactions by Alcohol
WO1998006434A1 (en) METHOD OF AUGMENTING T CELL-MEDIATED IMMUNITY AGAINST $i(TOXOPLASMA GONDII)