BR112013026661B1 - composição de vacina, usos da mesma e método para produzir a referida composição - Google Patents

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Rafaella Queiroz
Lisa Mcewen
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Abstract

COMPOSIÇÃO DE VACINA, USOS DA MESMA E MÉTODO PARA PRODUZIR A REFERIDA COMPOSIÇÃO. A presente invenção refere-se a uma composição que inclui, como um componente, a uma matriz de pasta fluida que é líquida em temperatura ambiente e a um gel em concentrações de sal fisiológicas e/ou temperaturas fisiológicas e, como um segundo componente, um ou mais antígenos. Também estão incluídos métodos para induzir um a resposta imunológica em um indivíduo e para vacinar um indivíduo por meio da administração de tais composições.

Description

[0001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório no de Série US 61/476.431, depositado em 18 de abril de 2011, que é incorporado a título de referência no presente documento.
FINANCIAMENTO DO GOVERNO
[0002] Esta invenção foi produzida com o apoio do governo sob as concessões Nos. AI071883 e AI036657, concedidas pelos Institutos Nacionais de Saúde. O governo tem certos direitos sobre a invenção. ANTECEDENTES
[0003] As vacinas continuam a ser o maior bem de saúde pública para combater doenças infecciosas. O objetivo da entrega de vacina é apresentar antígenos de vacina de uma maneira que melhore a ativação de célula de apresentação de antígeno, a absorção de antígeno e processamento. Um objetivo adicional é reduzir o número de vacinas necessárias para induzir uma resposta específica de vacina e eficaz se uma única dose eficaz de uma vacina estiver disponível. Métodos de entrega de vacina convencionais e tais usam alúmen. Sais de alumínio, tal como alúmen, foram primeiro autorizados para uso como adjuvantes em vacinas para humanos nos anos 1920. Há uma necessidade para modos de entrega aprimorados e adjuvantes que sejam seguros para uso em formulações de vacina.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0004] A presente invenção inclui uma composição que inclui, co mo um componente, uma matriz de pasta fluida que é um liquido em temperatura ambiente e um gel em concentrações de sal fisiológicas e/ou temperaturas fisiológicas e, como outro componente, um ou mais antígenos. Em alguns aspectos da composição, a matriz de pasta flui- da é um hidrogel de peptídeo. Em alguns aspectos, o hidrogel de pep- tídeo inclui PURAMATRIX ou um derivado do mesmo. Em alguns aspectos, o hidrogel de peptídeo inclui o arcabouço de peptídeo RADA- RADARADARADA ou um derivado do mesmo. Em alguns aspectos da composição, a matriz de pasta fluida inclui MATRIGEL ou um derivado do mesmo.
[0005] Em alguns aspectos da composição, a composição inclui adicionalmente um ou mais adjuvantes. Em alguns aspectos, um adjuvante inclui um agonista de Receptor do tipo Toll (TLR) e/ou uma cito- cina. Em alguns aspectos, um agonista de TLR inclui um agonista de TLR4. Em alguns aspectos, um agonista de TLR inclui um agonista de TLR9. Em alguns aspectos, um agonista de TLR9 inclui um oligo- deoxinucleotídeo CpG (ODN).
[0006] Em alguns aspectos da composição, a composição inclui adicionalmente um agonista Receptor do tipo Toll (TLR) e/ou uma cito- cina. Em alguns aspectos, um agonista de TLR inclui um agonista de TLR4. Em alguns aspectos, um agonista de TLR inclui um agonista de TLR9. Em alguns aspectos, um agonista de TLR9 inclui um oligo- deoxinucleotídeo CpG (ODN).
[0007] Em alguns aspectos da composição, o antígeno inclui um antígeno de hepatite, um antígeno de influenza, um antígeno de es-quistossomose e/ou um antígeno de burkholderia ou um fragmento antigênico dos mesmos.
[0008] A presente invenção inclui um método de produção de uma resposta imunológica em um indivíduo, sendo que o método inclui administrar uma composição, conforme descrito no presente documento, ao indivíduo.
[0009] A presente invenção inclui um método de imunizar um indi víduo, sendo que o método inclui administrar uma composição, conforme descrito no presente documento, ao indivíduo.
[00010] A presente invenção inclui um método de entrega de um ou mais antígenos imunogênicos a um indivíduo, sendo que o método inclui administrar uma composição, conforme descrito no presente documento, ao indivíduo.
[00011] A presente invenção inclui um método de entrega de um ou mais antígenos terapêuticos a um indivíduo, sendo que o método inclui administrar uma composição, conforme descrito no presente documento, ao indivíduo.
[00012] Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, o indivíduo é uma criação doméstica ou um animal de estimação. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, o indivíduo é ave doméstica. Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, o indivíduo é humano.
[00013] Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a administração da composição inclui injeção subcutânea (sc) ou injeção intramuscular (im).
[00014] Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a administração da composição inclui a administração como uma vacina primária e/ou de reforço.
[00015] Em alguns aspectos dos métodos da presente invenção, a administração da composição inclui administração como uma vacina de reforço após uma vacina primária com uma vacina de polipeptídeo ou uma vacina de DNA de plasmídeo.
[00016] A presente invenção inclui um método de produção de uma resposta imunológica antiesquistossomo em um bovino, sendo que o método inclui administrar uma composição que inclui, como um componente, uma matriz de pasta fluida que é um líquido em temperatura ambiente e é um gel em condições fisiológicas e, como outro componente, um ou mais antígenos de esquistossomo ao bovino.
[00017] A presente invenção inclui um método de produção de uma resposta imunológica antiesquistossomo em um bovino, sendo que o método inclui administrar uma composição, conforme descrito no presente documento, ao bovino, em que um ou mais antígenos incluem um antígeno de esquistossomo.
[00018] A presente invenção inclui um método de vacina de esquistossomose em um bovino, sendo que o método inclui administrar uma composição que inclui, como um componente, uma matriz de pasta fluida que é um líquido em temperatura ambiente e é um gel em condições fisiológicas e, como outro componente, um ou mais antígenos de esquistossomo.
[00019] A presente invenção inclui um método de vacina de esquistossomose em um bovino, sendo que o método inclui administrar uma composição, conforme descrito no presente documento, ao bovino, em que um ou mais antígenos incluem um antígeno de esquistossomo.
[00020] Em alguns aspectos dos métodos, a composição inclui adicionalmente um ou mais adjuvantes. Em alguns aspectos, um adjuvante inclui um agonista de receptor do tipo Toll (TLR) e/ou uma citocina. Em alguns aspectos, um agonista TLR inclui um agonista TLR4 e/ou TLR9. Em alguns aspectos, um agonista TLR9 inclui um oligodessoxi- nucleotídeo (ODN) CpG. Em alguns aspectos, um ODN CpG inclui CpG bovino. Em alguns aspectos, o adjuvante inclui a citocina IL-12.
[00021] Em alguns aspectos dos métodos, a composição inclui adicionalmente um agonista de receptor do tipo Toll (TLR) e/ou uma cito- cina. Em alguns aspectos, um agonista TLR inclui um agonista TLR4 e/ou TLR9. Em alguns aspectos, um agonista TLR9 inclui um oligo- dessoxinucleotídeo (ODN) CpG. Em alguns aspectos dos métodos, um ODN CpG inclui CpG bovino.
[00022] Em alguns aspectos dos métodos, o antígeno de esquistos- somo inclui um antígeno de Schistosoma japonicum ou um fragmento antigênico do mesmo.
[00023] Em alguns aspectos dos métodos, o antígeno de esquistos- somo inclui um polipeptídeo SjCTPI, um polipeptídeo SjCTPI-Hsp70, um polipeptídeo SjC23 e/ou um polipeptídeo SjC23-Hsp70, ou um fragmento antigênico dos mesmos.
[00024] Em alguns aspectos dos métodos, uma administração da composição inclui uma administração como uma vacinação de reforço e/ou primária.
[00025] Em alguns aspectos dos métodos, uma administração da composição inclui uma administração como uma vacinação de reforço após uma vacinação primária com uma vacina de DNA de plasmídeo SjCTPI-Hsp70.
[00026] Em alguns aspectos dos métodos, o método inclui adicionalmente uma administração de um ou mais agentes quimioterápicos antiesquistossomo.
[00027] Em alguns aspectos dos métodos, o método demonstra pelo menos 45% de eficácia na prevenção de uma infecção com um parasita esquistossomo.
[00028] A presente invenção inclui métodos para fazer a composição descrita no presente documento.
[00029] O termo "e/ou" significa um ou todos dentre os elementos listados ou uma combinação de quaisquer dois ou mais dentre os elementos listados.
[00030] As palavras "preferencial" e "preferencialmente" referem-se às modalidades da invenção que pode proporcionar certos benefícios, mediante certas circunstâncias. No entanto, outras modalidades podem também ser preferenciais, mediante a mesma ou outras circunstâncias. Além do mais, a recitação de uma ou mais modalidades preferenciais não implica que outras modalidades não sejam úteis e não se destina a excluir outras modalidades do escopo da invenção.
[00031] Os termos "compreende" e variações do mesmo não têm um sentido limitante em que esses termos aparecem na descrição e nas reivindicações.
[00032] A menos que seja especificado de outra maneira, "um", "uma", "o" e "pelo menos um" são usados de modo intercambiável e significam um ou mais do que um.
[00033] Também no presente documento, as recitações de faixas numéricas por pontos finais incluem todos os números subsomados dentro dessa faixa (por exemplo, 1 a 5 inclui 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
[00034] Quando uma faixa de valores é fornecida, é entendido que cada valor de intervenção, até um décimo da unidade do limite inferior a menos que o contexto dite claramente de outra maneira, entre os limites superior e inferior dessa faixa e qualquer outro valor de intervenção ou declarado nessa faixa declarada, é abrangido na invenção. Os limites superior e inferior dessas faixas menores podem ser incluídos independentemente nas faixas menores e são também abrangidas na invenção, sujeitas a qualquer limite especificamente excluído na faixa declarada. No local onde a faixa declarada inclui um ou ambos dentre os limites, as faixas que excluem um dos limites incluídos ou ambos são também incluídas na invenção.
[00035] Para qualquer método revelado no presente documento que inclui etapas distintas, as etapas podem ser conduzidas em qualquer ordem praticável. E, conforme apropriado, qualquer combinação de duas ou mais etapas pode ser conduzida simultaneamente.
[00036] O sumário acima da presente invenção não se destina a descrever cada modalidade revelada ou toda implantação da presente invenção. A descrição a seguir exemplifica mais particularmente as modalidades exemplificativas. Em muitos locais no decorrer do pedido de patente, uma direção é fornecida através de listas de exemplos, cujos exemplos podem ser usados em várias combinações. Em cada caso, a lista citada serve apenas como um grupo representativo e não deve ser interpretado como uma lista exclusiva.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[00037] A Figura 1 mostra as cinéticas de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgA. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total n=10.
[00038] A Figura 2 mostra as cinéticas de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgM. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total n=10.
[00039] A Figura 3 mostra as cinéticas de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgG. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total n=10.
[00040] A Figura 4 mostra as cinéticas títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgG1. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total n=10.
[00041] A Figura 5 mostra as cinéticas de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgG2a. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total n=10.
[00042] A Figura 6 mostra títulos de anticorpo anti-HBsAg maiores após uma única vacinação (21 dias). Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total n=10; *p<0,05, **p<0,01, **p<0,001, ****p<0,0001 em comparação a um antígeno sozinho com o uso de um ANOVA de duas vias com pós- teste Bonferroni.
[00043] A Figura 7 mostra títulos superiores de anticorpo anti- HBsAg após vacinação única (35 dias). Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total de n=10; *p<0,05 em comparação com antígeno sozinho com o uso de ANOVA de duas vias com pós-teste Bonferroni.
[00044] A Figura 8 mostra perfil de citocina vinte e quatro horas após reestimulação de HBsAg de esplenócitos. Os dados mostrados são representativos de um experimento, n=5; *p<0,05, ****p<0,0001 em comparação com antígeno sozinho com o uso de ANOVA de duas vias com pós-teste Bonferroni.
[00045] A Figura 9 mostra perfil de citocina quarenta e oito horas após reestimulação de HBsAg de esplenócitos. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total de n=10 (n=5 apenas para adjuvantes); nenhuma diferença estatística (p<0,05) em comparação com antígeno sozinho com o uso de ANOVA de duas vias com pós-teste Bonferroni.
[00046] A Figura 10 mostra perfil de citocina setenta e duas horas após reestimulação de HBsAg de esplenócitos. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total de n=10 (n=5 apenas para adjuvantes); **p<0,01 em comparação com antígeno sozinho com o uso de ANOVA de duas vias com pós- teste Bonferroni.
[00047] A Figura 11 mostra imunidade mediada por célula específica de HBsAg aumentada por ELISpot em respostas de célula T específicas de HbsAg. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total de n=10; *p<0,05 em comparação com antígeno sozinho com o uso de ANOVA de duas vias com pós-teste Bonferroni.
[00048] A Figura 12 mostra imunidade mediada por célula T específica de HBsAg por citometria de fluxo. Os dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para um total de n=10; **p<0,01 em comparação com antígeno sozinho com o uso de ANOVA de duas vias com pós-teste Bonferroni.
[00049] A Figura 13 é um gráfico de radar que representa a prevalência de equilíbrio de citocina ex vivo em uma faixa de subconjuntos de célula de camundongos imunizados (n=10/grupo) com 24 horas de inoculação pós-primária. Os valores do eixo geométrico podem ser unidos para formar a área poligonal central que representa o equilíbrio de citocina geral. A análise dos eixos geométricos do gráfico de radar destaca a contribuição de leucócito para o equilíbrio de citocina total.
[00050] As Figuras 14A e 14B são gráficos de radar que representam a prevalência de equilíbrio de citocina ex vivo em uma faixa de subconjuntos de célula de camundongos imunizados (n=10/grupo) com 48 horas de inoculação pós-primária. A Figura 14A apresenta TNF e IFN gama. A Figura 14B apresenta IL-5 e IlL-4. Cada eixo geométrico exibe a proporção de cada categoria de equilíbrio de citocina. Os valores de cada eixo geométrico podem ser unidos para formar a área poligonal central que representa o equilíbrio de citocina geral. O aumento ou a diminuição das áreas poligonais centrais refletem contribuição superior ou inferior de equilíbrio de citocina regulatório ou inflamatório em cada grupo.
[00051] A Figura 15 é um gráfico de radar que representa a prevalência de equilíbrio de citocina ex vivo em uma faixa de subconjuntos de célula de camundongos imunizados (n=10/grupo) com 72 horas de inoculação pós-primária. Os valores do eixo geométrico podem ser unidos para formar a área poligonal central que representa o equilíbrio de citocina geral. A análise dos eixos geométricos do gráfico de radar destaca a contribuição de leucócito para o equilíbrio de citocina total.
[00052] As Figuras 16A a 16D são comparações de anticorpos específicos de rHepBag induzidos em camundongos imunizados (n=10/grupo) entre 14 e 35 dias inoculação pós-iniciação. O reforço foi executado 28 dias após a imunização de iniciação e os níveis de anticorpos específicos de rHepBag foram determinados através do ensaio ELISA. A Figura 16A apresenta dados de 14 dias, a Figura 16B apresenta dados de 21 dias, a Figura 16C apresenta dados de 28 dias e a Figura 16D apresenta dados de 35 dias. A significância estatística em P < 0,05 é representada pelas letras sobrescritas 'a', 'b' e 'c' para comparações com rHepBag, rHepBag em Alhydrogel ® e rHepBag em Freund, respectivamente.
[00053] As Figuras 17A a 17D mostram a razão IgG1:IgG2a após a imunização de camundongos (n=10/grupo) com rHepBag mais adjuvantes entre 14 e 35 dias. O reforço foi executado 28 dias após a imunização de iniciação e os níveis de anticorpos específicos de rHepBag foram determinados por ensaio ELISA. A Figura 17A apresenta dados de 14 dias, a Figura 17B apresenta dados de 21 dias, a Figura 17C apresenta dados de 28 dias e a Figura 17D apresenta dados de 35 dias.
[00054] As Figuras 18A e 18B mostra títulos de IgG anti-NP aumentadas em duas cepas de camundongos vacinadas com rNP. A Figura 18A mostra títulos em camundongos C57BL/6. A Figura 18B mostra títulos em camundongos Balb/c. Os soros foram coletados quatro semanas após a última vacinação (4wplv).
[00055] As Figuras 19A e 19B mostram títulos de IgG anti-influenza aumentadas em camundongos C57Bl/6 vacinados com PR8 WIV. A Figura 19A e a Figura 19B representam resultados de dois experimentos independentes. Os soros foram coletados quatro semanas após a última vacinação (4wplv).
[00056] As Figuras 20A e 20B mostram proteção aumentada de estímulo letal em camundongos C57Bl/6 vacinados com PR8 WIV. A Figura 20A mostra os resultados de um experimento independente com estímulo letal a 30 LD50. A Figura 20B mostra os resultados de um experimento independente com estímulo letal a 1.000 LD50.
[00057] As Figuras 21A a 21C mostram títulos de IgG antiburkhol- deria aumentadas em camundongos imunizados com um coquetel de três antígenos de proteína de burkholderia recombinante com três adjuvantes diferentes (gel de alúmen, CFA ou PURAMTRIX). A Figura 21A mostra títulos de IgG de proteína 4 a 9 antiburkholderia em camundongos imunizados. A Figura 21B mostra títulos de IgG de proteína 22 a 11 antiburkholderia em camundongos imunizados. A Figura 21C mostra títulos de IgG de proteína 42 antiburkholderia em camundongos imunizados.
[00058] As Figuras 22A e 22B mostram títulos de anticorpo de proteína CCA antiesquistossoma de IgG em camundongos imunizados com CCA em adjuvante de Freund completo (Figura 22A) e CCA em MATRIGEL mais CpG (Figura 22B).
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES ILUSTRATIVAS DA PRESENTE INVENÇÃO
[00059] A presente invenção fornece composições e métodos que fornecem a entrega de vacina melhorada, fornecem a entrega focal e prolongada melhorada de antígeno no sítio de administração de vacina; aperfeiçoamento de ativação de célula que apresenta o antígeno e absorção e processamento de antígeno. Com a presente invenção, um ou mais agentes imunogênicos são adadministrados em uma composição que incluem um componente de matriz de pasta fluida que é um líquido na temperatura ambiente e/ou concentrações de baixo sal e um gel nas concentrações de sal fisiológicas e/ou temperaturas fisiológicas. A gelação pode ser induzida pela temperatura corpórea fisiológica de um vertebrado como um mamífero ou pássaro. Tal temperatura pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 25° Celsius (C), pelo menos cerca de 30° Celsius, pelo menos cerca de 32° Celsius, pelo menos cerca de 35° Celsius, pelo menos cerca de 37° Celsius, pelo menos cerca de 39° Celsius ou pelo menos cerca de 40°. A gelação pode ser induzida pelas concentrações de sal fisiológicas. Em algumas modalidades, a gelação pode ser na presença de concentrações milimolares de sal, por exemplo, por uma concentração de sal maior que cerca de 0,05 molar (M).
[00060] Portanto, a composição de vacina gelifica ou polimeriza após a administração a um indivíduo que localiza os antígenos da vacina para um único sítio onde células que apresentam antígeno inato podem se alojar e começar a capturar antígenos da vacina. Idealmente, a matriz de pasta fluida ser um material biocompatível não irá induzir reações indesejáveis no corpo como um resultado do contato com fluidos ou tecidos corpóreos como morte de tecido, formação de tumor, reação alérgica, reação a corpo estranho (rejeição), reação inflamatória, resposta de anticorpo ou coagulação de sangue, por exemplo. Uma matriz de pasta fluida também pode ser referida no presente documento como um "hidrogel de polímero biomédico", um "hidrogel bi- omédico", "polímero biomédico", um "hidrogel de polímero", um "hidro- gel de polímero biocompatível", um "hidrogel biocompatível", um "polímero biocompatível" ou um "hidrogel". Conforme usado no presente documento, um "hidrogel" é uma rede tridimensional de macromolécu- las hidrofílicas ligadas de forma cruzada que podem ser engolidas e que incorporam cerca de 20 por cento a cerca de 95 por cento de água por peso. Um hidrogel é um gel no qual o líquido constituinte é água. Conforme usado no presente documento, um gel é um material similar à geleia sólido que pode ter propriedades que vão de macio e fraco a rígido e forte. Um gel é um sistema com ligação cruzada substancialmente diluído que não exibe fluxo quando está no estado de repouso. Por peso, géis são principalmente líquidos, ainda assim, os mesmos se comportam como sólidos devido a uma rede com ligação cruzada tridimensional dentro do líquido. São as ligações cruzadas dentro do fluido que dão a um gel a estrutura do mesmo (rigidez). Dessa maneira, os géis são uma dispersão de moléculas de um líquido dentro de um sólido no qual o sólido é a fase contínua e o líquido é a fase descontínua. O hidrogel é uma rede de cadeias de polímero que são hi- drofílicas, algumas vezes encontradas como gel coloidal no qual a água é o meio de dispersão. Os hidrogéis são polímeros naturais ou sintéticos altamente absorventes (os mesmos podem conter até 99,9% de água). Os hidrogéis também possuem um grau de flexibilidade muito similar a um tecido natural devido ao teor significativo de água dos mesmos.
[00061] Qualquer um dentre uma ampla variedade de hidrogéis de polímero biomédicos disponíveis para uso em tecnologias médicas pode ser usado com os métodos e composições descritos no presente documento.
[00062] Em algumas modalidades, a matriz de pasta fluida é de ocorrência natural como, por exemplo, fibrina, colágeno, elastina, agarose, metilcelulose, ácido hialurônico e outros polímeros derivados naturalmente. Em algumas modalidades, a matriz de pasta fluida é MA- TRIGEL ou um derivado da mesma. A MATRIGEL é um extrato de membrana basal de células de rato e inclui laminina, colágeno IV, en- tactina, nidogena e proteoglicanos. A invasão de células de tumor no MATRIGEL foi usada para estudar o envolvimento de receptores de matriz extracelular e enzimas de degradação de matriz em progressão de tumor e invasão e MATRIGEL também foi usado como um modelo de angiogênese in vitro e in vivo (ensaio de tampão MATRIGEL) para estudar a atividade de citocinas angiogênicas e antiangiogênicas e outras substâncias. O MATRIGEL está disponível comercialmente como BD Matrigel™ Matrix. Ver na rede mundial no bdbioscien- ces.com/cellculture/ecm/ecmtypes/index.jsp.
[00063] Em algumas modalidades, uma matriz de pasta fluida é sintética como, por exemplo, um hidrogel de peptídeo sintético ou um arcabouço de peptídeo de autoconstrução (sapeptídeo). Os arcabouços de sapeptídeo são formados pela construção espontânea de oligopep- tídeos de lâmina beta autocomplementares pela construção espontânea de oligopeptídeos de lâmina beta autocomplementares iônicos sob condições fisiológicas, o que produz um material de hidrogel. Esses peptídeos curtos (normalmente cerca de 8, cerca de 12, cerca de 16, cerca de 24 ou cerca de 32 resíduos de aminoácido com sequências com repetição interna) autoconstroem uma solução de sal aquosa em matrizes tridimensionais. Os peptídeos são caracterizados por serem anfifílicos que têm resíduos de aminoácido hidrofóbicos e hidrofílicos alternados; maiores que 12 aminoácidos e preferencialmente pelo menos 16 aminoácidos; complementares e compatíveis estruturalmente. O complementar se refere à habilidade dos peptídeos de interagir através de pares ionizados e/ou ligações de hidrogênio que se formam entre as cadeias laterais hidrofílicas dos mesmos e compatível estruturalmente se refere à habilidade de peptídeos complementares manterem uma distância constante entre as cadeias principais peptídicas dos mesmos. Os peptídeos que têm essas propriedades participam em interações intermoleculares que resultam na formação e estabilização de lâminas beta no nível de estrutura secundário e filamentos entrelaçados no nível de estrutura terciário. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, membros da família de peptídeos RAD16-I ((RA- DA)(4)), RAD16-II ((RARADADA)(2)), KFE-8 ((FKFE)(2)) ou KLD-12 ((KLDL)(3)). Ver, por exemplo, Patente US 5.670.483; Holmes et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA; 97(12):6728 a 33; Yokoi et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA; 102(24):8414-9; Liu et al., 2012, Nanoscale; 4(8):2720-7, e Hidrogel de Peptídeo BD PuraMatrix TM, Rotina de condutas para Uso, Número de Catálogo 354250 (SPC-354250-G rev 2.0; BD Biosciences, Bedford, MA). Em alguns aspectos, um hidrogel de peptídeo inclui os blocos de montagem de arcabouço de peptídeo de autoconstrução de arginina-alanina-aspartato-alanina (RADA). Em alguns aspectos, um hidrogel de peptídeo inclui RADARADARADARA- DA ou um derivado do mesmo. Em alguns aspectos, o hidrogel de peptídeo inclui PURAMATRIX ou um derivado do mesmo. Ver, por exemplo, Patente US 5.670.483; Holmes et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA; 97(12):6728 a 33; Yokoi et al., 2005, Proc Natl Acad Sci USA; 102(24):8414 a 9; Liu et al., 2012, Nanoscale; 4(8):2720 a 7, e Hidrogel de peptídeo BD PuraMatrix TM, Rotina de condutas para Uso, Número de Catálogo 354250 (SPC-354250-G rev 2.0; BD Biosciences, Bedford, MA), cada um dos quais sendo incorporado inteiramente ao presente documento a título de referência.
[00064] Em algumas modalidades, um hidrogel de polímero biomé- dico pode ser um hidrogel de polietileno glicol (PEG) que polimeriza espontaneamente in vivo.
[00065] Em algumas modalidades, uma matriz de pasta fluida, além de gelação em temperatura corporal de mamífero ou vertebrado e/ou concentrações de sal fisiológicas, é um polímero sintético bioreabsor- vível que se degrada e se dissolve com o tempo. Tais compostos são degradados naturalmente no corpo por hidrólise e absorvidos como monômeros solúveis em água. Os exemplos incluem, ácido poliláctico, polilactídeo (PLA), poli(ácido L-láctico), poli-D-lactídeo, ácido poliglicó- lico (PGA), poliglicolídeo e seus copolímeros (poli(ácido láctico-co- glicólico) com ácido láctico, homo e copolímeros de ácido láctico e ácido glicólico, poli (ácido DL-láctico/glicina) copolímeros, poli (ácido DL- lactico-glicólico) (PLGA), poli (ácido DL-lacticco-glicólico) (PLGA), espumas de poli(ácido-co-glicólico DL-láctico) porosas, poli(aminoácidos) poliox(1-oxo-1,2-etanodiil)] ((C2H2O2)n; Biovek), poli(glicolídeo-co- caprolactona), poli(carbonato de glicolídeo-co-trimetileno), polidioxa- nona (PDO, PDS), poli-p-dioxanona, caprolactona (também denomi-nado 2-oxepanona), épsilon-caprolactona, 6-hexanolactona, hexano-6- lactona, 1-oxa-2-oxociclo-heptano poliglactina 910, polianidretos e filmes de poliortoéster formados a partir de poli (ácido-co-glicólico D,L- láctico, 88:12) (PLGA) ou a partir de uma mescla 50/50 (p/p) de PLGA e poli (ácido L-láctico) (PLLA). Consulte, por exemplo, Schakenraad and Dijkstra, 1991, Clin Mater; 7(3):253 a 69; Mooney et al., 1997, J Biomed Mater Res; 37(3):413 a 20; and Lu et al., 2000, Biomaterials; 21(18):1837 a 45.
[00066] As composições da presente invenção incluem um ou mais agentes antigênicos (também denominados no presente documento como imunógeno). Um agente antigênico pode ser qualquer um dentre a grande variedade de agentes que são adadministrados a um indivíduo para eliciar uma resposta imunológica no indivíduo. Um agente antigênico pode ser um imunógeno derivado de um patógeno. O agente antigênico pode ser, por exemplo, um antígeno de proteína ou pep- tídeo, um antígeno viral ou polipeptídeo, um vírus inativo, um vírus re- combinante, um antígeno parasítico ou bacteriano, um parasita ou bactéria inativa, um célula completa, uma célula geneticamente modificada, um antígeno associado a tumor ou célula de tumor ou um antí- geno de carboidrato. Em algumas aplicações um antígeno não é uma célula viva. Em algumas modalidades, um agente antigênico é um an- tígeno solúvel.
[00067] Uma composição conforme descrito no presente documento pode incluir como um agente antigênico qualquer um da grande variedade de agentes imunogênicos disponíveis como componentes de vacina. Tais vacinas podem incluir, sem limitação, componentes de vacina antigênicos direcionados contra várias doenças parasíticas, virais e infecciosas e componentes de vacina antitumor. As vacinas antitumor incluem, sem limitações, vacinas de peptídeo, vacinas de célula completa, vacinas de célula completa modificada geneticamente, vacinas de proteína recombinante ou vacinas com base na expressão de antígenos associados ao tumor por vetores virais recombinantes. Em algumas modalidades, um agente antigênico é um antígeno solúvel.
[00068] Um agente antigênico inclui um antígeno bacteriano de, por exemplo, Haemopholis influenza, vírus influenza dos tipos A ou B, an- tígeno de Streptococcus pneumonia, Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis (tal como, por exemplo, PA).
[00069] Um agente antigênico inclui um parasita de, por exemplo, um parasita de malária ou um parasita de esquistossomo. Os antíge- nos de malária incluem, sem limitação, antígenos da espécie Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum e Plasmodium knowlesi, Plasmodium ovaleand e Plasmodium malariae. Os parasitas de esquistosso- mo incluem, sem limitação, Schistosoma japonicum, Schistosoma mansoni e Schistosoma haematobium. A antígeno de esquistossomo pode ser uma proteína de a esquistossomo triose fosfato isomerase (CTPI) ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo, incluindo, sem limitação, uma proteína de CTPI de S. japonicum, S. monsoni ou S. haematobium ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo. Um an- tígeno de esquistossomo pode ser uma proteína de membrana integral de 23 kDa de tetraspin de esquistossomo (C23) ou fragmento antigê- nico ou derivado do mesmo, incluindo, sem limitação, uma proteína de C23 de S. japonicum, S. monsoni ou S. haematobium ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo. Tal antígeno de esquistossomo pode ser um polipeptídeo quimérico, fundido a um ou mais determinantes antigênicos adicionais, tal como por exemplo, uma proteína de choque de calor ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo, incluindo, sem limitação, proteína de choque de calor bovina 70 (Hsp70). Os an- tígenos de esquistossomo incluem, por exemplo, polipeptídeos de SjCTPI, SjCTPI-Hsp70, SjC23 e SjC23-Hsp70. Os antígenos podem estar na forma de qualquer um dentre a variedade de outros parasitas, incluindo, sem limitação, protozoários de quiinetoplastídeo, tal como, por exemplo, protozoários dos gêneros Blastocrithidia, Crithidia, Endo- trypanum, Herpetomonas, Leishmania, Leptomonas, Phytomonas, Trypanosoma e Wallaceina. Em modalidades preferenciais, o protozoário é do gênero Trypanosoma, incluindo, sem limitação, T. cruzi, T. brucei, T.b. gambiense e T.b. rhodesiense. Em algumas modalidades, o protozoário é do gênero Leishmania, incluindo, por exemplo, Leish- mania major. As doenças de tripanossomal notáveis incluem tripanos- somíase (Doença de Sono africano e Doenças de Chagas Sul- Americana, causada pela espécie de Trypanosoma) e leishmaniose (causada pela espécie de Leishmania).
[00070] Um agente antigênico inclui um antígeno viral de, por exemplo, hepatite, tal como, por exemplo, hepatite C, hepatite B, ou hepatite UM, influenza, por exemplo, o M2, hemaglutinina, e/ou proteínas de neuraminidase de um vírus de influenza, que inclui, por exemplo, influenza A (que inclui, porém sem limitação, os subtipos H5N1 e H1N1), influenza B, e influenza C, vírus sincicial respiratório (RSV), raiva, vírus de papiloma, sarampo, rubéola, varicela, rotavírus, pólio, vírus de varicela zoster (VZV), e de RNA de cadeia negativa, tais como, por exemplo, um vírus da família Paramixoviridae. Exemplos de um vírus da família Paramixoviridae incluem, porém sem limitação, vírus de parainfluenza humana 1, vírus de parainfluenza humana 2, vírus de parainfluenza humana 3, vírus de parainfluenza humana 4, vírus de parainfluenza 5, vírus da papeira, vírus do sarampo, metap- neumovírus humano, vírus sincicial respiratório humano, vírus da peste bovina de vírus sincicial respiratório bovino, vírus da cinomose canina, vírus da cinomose das focas, vírus da doença de Newcastle, pneumovírus aviário, vírus de peste de pequenos ruminantes (PPRV), vírus Sendai, vírus Menangle, Tupaiaparamixovirus, vírus Tioman, Tu- hokovirus 1, Tuhokovirus 2, Tuhokovirus 3, Hendravírus, Nipahvirus, vírus Fer-de-Lance, vírus de Nariva, vírus de Salem, vírus J, vírus de Mossman, e vírus de Beilong.
[00071] Um agente antigênico pode incluir um ou mais antígenos derivados de patógenos infecciosos para aves domésticas. Tais antí- genos podem ser derivados de, por exemplo, vírus da bronquite infec- ciosa (IBV), vírus da doença de Newcastle (NDV), doença de Marek (MDV), vírus doença infecciosa bursal (IBD), laringotraqueíte infecciosa (ILT), reovirus aviário, cólera, varíola aviária, micoplasmose, Coriza de peru e galinha, influenza aviária, encefalomielite aviária (AE), rino- traqueíte aviária (ART), vírus de hepatite de pato, enterite hemorrágicas, parvovirus de ganso, Paramixovirus 3, vírus de anemia de galinha (CAV), E. coli, Erysipelas, Reimerella, Mycoplasma gallisepticum, Pas- teurellamultocida, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, coc- cidiosis, vírus de síndrome de queda de postura (EDS), vírus de rino- traqueíte de peru (TRTV), e poxvírus.
[00072] Um agente antigênico pode incluir um ou mais antígenos derivados de patógenos infecciosos para bovídeos, que inclui, porém sem limitação, gado doméstico, búfalo de água, búfalo africano, bisão, e bois tibetanos. Tais antígenos podem ser derivados de, por exemplo, vacina contra doença respiratória bovina (BRD), que inclui, porém sem limitação, BVDV tipos I e II, vacina contra vírus de herpes bovina 1 (BHV-1), que inclui, porém sem limitação, vacinas de subunidade que não resultariam em vírus latente, vacina contra Haemophilussomnus, vacina contra Mannheimiahaemolytica, vacina contra Mycoplasma bovis, vacina contra rotavírus bovino, vacina contra Escherichia coli K99, vacina contra coronavírus bovino (BCV), vacina contra Clostridium chauvoei (perna negra), vacina contra Clostridium septicum, vacina contra Clostridium sordelli (edema maligno), vacina contra Clostridium novyi (doença negra), vacina contra Clostridium perfringens (enterotoxemia), vacina contra ceratoconjuntivite bovina infecciosa (olho rosa), que inclui, porém sem limitação, Moraxella bovis, clamídia, micoplas- ma, acholeplasma, ou vacinas de vírus de rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), vacina contra mastite, que inclui, porém sem limitação, vacina J5 contra Escherichia coli.
[00073] Um agente antigênico pode incluir um ou mais antígenos derivados de patógenos infecciosos para suínos, que inclui, porém sem limitação, circovirose porcina tipo 2 (PCV2), síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRSV), micoplasma respiratório, Streptococcus suis, coronavírus porcino, rotavírus, Escherichia coli (K88) entero- toxigênico, Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), e influenza suína.
[00074] Um agente antigênico pode incluir um ou mais antígenos derivados do gênero Burkholderia, um grupo de bactérias virtualmente ubíquas gram-negativas, dotado de mobilidade, aeróbicas obrigatórias com formato de haste que inclui ambos patógenos de animal/humano e de planta assim como algumas espécies ambientalmente importantes. Burkholderia é mais bem conhecida por seus membros patogênicos. Burkholderia mallei é responsável por mormo, uma doença que ocorre em maior parte em cavalos e animais relacionados. Burkholde- ria pseudomallei é o agente causador de melioidose (também chamado doença de Whitmore), uma doença infecciosa predominantemente de climas tropicais que pode infectar humanos ou animais, especialmente no sudeste da Ásia e norte da Austrália. Burkholderia cepacia é um patógeno importante de infecções pulmonares em pessoas com fibrose cística. Devido a sua resistência a antibiótico e a taxa de mortalidade alta a partir de suas doenças associadas Burkholderia mallei e Burkholderia pseudomallei são considerados como agentes de guerra biológica em potencial, voltado para pecuária e para humanos. Antíge- nos de Burkholderia incluem, por exemplo, qualquer uma das três pro-teínas recombinantes de burkholderia (a proteína 4-9 de burkholderia, a proteína 22-11 de burkholderia, e a proteína 42 de burkholderia). Tais antígenos de burkolderia podem ser adadministrados separadamente ou como um coquetel de quaisquer dois ou três antígenos.
[00075] Um agente antigênico pode ser um ou mais daqueles atualmente usados na combinação de vacinas de sarampo-caxumba- rubéola (MMR) e sarampo-caxumba-rubéola-varicela (MMRV).
[00076] Em algumas modalidades, o agente antigênico é uma vacina contra polinucleotídeo, isso é, o agente antigênico é entregue como uma construção de vetor, tal como um plasmídeo, que resulta na expressão de um antígeno de polipeptídeo mediante entrega a um sujeito. Conforme usado no presente documento, o termo "polinucleotídeo" refere-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, ou ribonucleotídeos ou desoxinucleotídeos, e inclui ambos RNA e DNA de cadeia dupla e única. Um polinucleotídeo pode ser obtido diretamente a partir de uma fonte natural, ou pode ser preparado com o auxílio de técnicas químicas, recombinantes ou enzimáticas. Um polinucleotídeo pode ser linear ou circular em topologia. Um poli- nucleotídeo pode ser, por exemplo, uma porção de um vetor, tal como uma expressão ou vetor de clonagem, ou um fragmento. Um polinu- cleotídeo pode incluir sequências de nucleotídeo que têm funções diferentes, que inclui, por exemplo, regiões codificantes, e regiões não co- dificantes tais como regiões regulatórias. Qualquer vetor ou veículo de entrega adequado pode ser utilizado. Vários vetores são publicamente disponíveis. O vetor pode estar na forma, por exemplo, de um plasmí- deo, cosmídeo, partícula viral, ou fago. Um vetor pode ser um vetor de expressão. A sequência de ácido nucleico apropriada pode ser inserida no vetor por uma variedade de procedimentos. Em geral, DNA é inserido em sítio(s) de endonuclease de restrição apropriado(s) com o uso de técnicas conhecidas na técnica. Componentes de vetor geralmente incluem, porém sem limitação, um ou mais de uma sequência de sinal, uma origem de réplica, um ou mais genes marcadores, um elemento intensificador, um promotor, e uma sequência de terminação de transcrição. Construção de vetores adequados que contêm um ou mais desses componentes emprega técnicas de ligação padrões que são conhecidas àqueles versados na técnica.
[00077] Uma composição, conforme descrito no presente documen- to, pode ser útil como uma vacina. A vacina pode ser uma vacina profilática ou protetora.
[00078] Uma composição da presente invenção pode incluir um ou mais compostos com atividade adjuvante. Tal adjuvante estimula o sistema imunológico e aumenta a resposta a um antígeno de vacina, sem ter nenhum efeito antigênico específico em si. Um adjuvante atua para acelerar, prolongar ou acentuar respostas imunológicas específicas de antígeno quando usado em combinação com antígenos de vacina específicos. Compostos ou composições adequados para este fim incluem, mas sem limitação, um adjuvante à base de alumínio, como, por exemplo, fosfato de alumínio, hidróxido de alumínio (também chamado de alúmen), hidroxila-fosfato de alumínio e hidroxila-fosfato-sulfato de alumínio e adjuvantes de não alumínio, como, por exemplo, QS21, MF59, Lipídio-A, lipossomas neutros, micropartículas, uma citocina como, por exemplo, IL-12, óleos vegetais, óleos de origem animal, emulsão de óleo em água ou água em óleo com base em, por exemplo, um óleo mineral, como Bayol F™ ou Marcol 52™, adjuvante de Freund completo, adjuvante de Freund incompleto, um óleo vegetal como, por exemplo, acetato de vitamina E, uma saponina, esqualeno, um aminoácido lipidado ("LAA") e/ou um agonista TLR.
[00079] Em algumas modalidades, um componente de adjuvante é um ligante de receptor do tipo Toll (TLR). TLRs em mamíferos foram primeiramente identificados em 1997. Os mesmos constituem a primeira linha de defesa contra muitos patógenos e tem um papel crucial na função do sistema imunológico inato. Há muitas subclasses conhecidas de receptores do tipo Toll, incluindo TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR9, TLR10, TLR11, TLR12, TLR13, TLR14, TLR15 e TLR16, e seus ligantes exibem uma variação estrutural significativa. Um agonista de TLR é um ligante molecular para um dos vários receptores do tipo Toll (TLRs). TLRs conhecidos incluem: TLR1 (ligantes de TLR1 incluem lipoproteínas de triacila); TLR2 (ligan- tes de TLR2 incluem lipoproteínas, peptídoflicano Gram-positivo, ácidos lipoteicoicos, fungos e glicoproteínas virais); TLR3 (ligantes de TLR3 incluem RNA de filamento duplo, conforme encontrado em certos vírus, e poli I:C); TLR4 (ligantes de TLR4 incluem lipopolissacarí- deo e glicoproteínas virais); TLR5 (ligantes de TLR5 incluem flagelina); TLR6 (ligantes de TLR6 incluem lipoproteínas de diacila); TLR7 (ligan- tes de TLR7 incluem pequenos modificadores imunológicos sintéticos (como imiquimode, R-848, loxoribina e bropirimina) e RNA de filamento único); TLR8 (ligantes de TLR8 incluem pequenos compostos sintéticos e RNA de filamento único); e TLR9 (ligantes de TLR9 incluem motivos de DNA de CpG não metilados). Alguns ligantes de TLR são descritos no presente documento, mas deve-se compreender que tais listagens não são limitadoras de qualquer forma. Ligantes de TLR são amplamente disponíveis comercialmente.
[00080] Agonistas de TLR preferidos incluem agonistas de TLR2, agonistas de TLR4, agonistas de TLR7, agonistas de TLR8 e agonis- tas de TLR9. LR2 está envolvido no reconhecimento de uma ampla variedade de moléculas microbianas dentre bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, assim como micoplasma e levedura. Ligantes de TLR2 incluem lipoglicanos, lipopolisscarídeos, ácidos lipoteicoicos e peptideoglicanos.
[00081] TLR4 reconhece lipopolissacarídeo Gram-negativo (LPS) e lipídio A, sua porção tóxica. Agonistas de TLR4 incluem, mas sem limitação, lipopolissacarídeo (LPS), glicoproteínas virais, lipídio A de mo- nofosforila (MPL) (Anderson et al., 2010, Colloids Surf B Biointerfaces; 75(1):123 a 32), Emulsão estável de adjuvante de lipídio de glucopira- nosila (GLA-SE) (Coler et al., 2010, PLoS One; 5(10):e13677), e o derivado de lipídio A hexa-acilado sintético, denotado como adjuvante de lipídio de glucopiranosila (GLA) (Coler et al., 2011, PLoS One; 6(1):e16333).
[00082] TLR9 é ativado por sequências que contêm CpG não meti- lado, incluindo aquelas encontradas em DNA bacteriano ou em oligo- nucleotídeos sintéticos (ODNs). Tais sequências que contêm CpG não metilado estão presentes a uma alta frequência em DNA bacteriano, mas são raras em DNA mamífero. Portanto, sequências de CpG não metiladas distinguem DNA microbiano de DNA mamífero. Um agonista de TLR9 pode ser uma preparação de DNA microbiano, incluindo, mas sem limitação, DNA de E. coli, DNA de E. coli livre de endotoxina ou DNA bacteriano livre de endotoxina de E. coli K12. Um agonista de TLR9 pode ser um oligonucleotídeo sintético que contém motivos de CpG não metilados, também chamados, aqui, de "um oligonucleotídeo de CpG", "CpGODNs", "ODN" ou "CpG". CpG ODNs são moléculas de DNA curtas, de filamento único que contêm uma citosina (nucleotídeo "C") seguido por uma guanina (nucleotídeo "G"). O "p" refere-se, tipicamente, à cadeia principal de fosfodiéster de DNA. Um agonista de TLR9 da presente invenção pode incluir qualquer um dentre pelo menos três tipos de ODNs estimulantes que foram descritos, tipo A, tipo B e tipo C. oligodesoxinucleotídeos de CpG podem ser produzidos por métodos padrão para síntese química de polinucleotídeos ou adquiridos comercialmente. Por exemplo, CPG ODNs podem ser adquiridos através da InvitroGen (San Diego, CA, EUA).
[00083] As composições, conforme descritas no presente documento, podem incluir uma ou mais citocinas. As citocinas podem incluir, mas sem limitação, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-19, IL-20, IFN-α, IFN-β, IFN-Y, fator de necrose de tumor (TNF), fator de crescimento transformador β (TGF-β), fator estimulante de colônia de granulócito (G-CSF), fator estimulante de colônia de macrófago (M-CSF), fator estimulante de colônia de gra- nulócito-macrófago (GM-CSF) e/ou ligante Flt-3. Em algumas aplica- ções, uma ou mais citocinas podem servir como um adjuvante.
[00084] A presente invenção também inclui métodos para induzir uma resposta imunológica em um indivíduo ministrando-se uma composição como descrito neste ao indivíduo. Uma resposta imunológica pode conferir imunidade protetora ou não. Uma resposta imunológica pode incluir, por exemplo, uma resposta humoral e/ou uma resposta imunológica mediada por células. Uma resposta humoral imune pode incluir uma resposta IgG (que inclui IgG1, IgG2 (que inclui IgG2a e/ou IgG2b), IgG3, e/ou IgG4), IgM, IgA, IgD, IgE e/ou IgY. Uma resposta imunológica celular pode incluir ativação de Célula T e/ou produção de citocina. A determinação de uma resposta imunológica humoral ou celular pode ser determinada por uma variedade de métodos conhecidos na técnica imunológica, que inclui, porém sem limitação, qualquer um dos descritos no presente no documento. A indução de uma resposta imunológica pode incluir a iniciação e/ou o estímulo do sistema imuno- lógico a um estímulo futuro com um agente infectante, que fornece imunidade a infecções futuras. A indução de tal resposta imunológica pode servir como uma resposta de proteção, que geralmente resulta em uma redução dos sintomas. A resposta imunológica pode aprimorar uma resposta imunológica inata e/ou adaptativa. A resposta imuno- lógica pode demonstrar concentrações maiores de anticorpos com uma única, imunização primária. A resposta imunológica pode mostrar razões alteradas de imunoglobulina e/ou indução alterada de citocinas inflamatórias, Interferonas do tipo I e/ou quimiocinas, comparadas à imunização sem a matriz de pasta aquosa. Tal alteração pode ser um aumento ou decréscimo. Por exemplo, uma razão maior de um isótipo de imunoglobulina compara a outro isótipo de imunoglobulina (por exemplo, qualquer um dentre IgM, IgA, IgD, IgG, ou IgE comparado a qualquer um dentre IgM, IgA, IgD, IgG, ou IgE) ou uma razão maio de uma subclasse de IgG comparada a outra subclasse de IgG (por exemplo, qualquer um dentre IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, ou IgG4 comparado a qualquer um dentre IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, ou IgG4) pode ser obtida.
[00085] A presente invenção também inclui métodos de vacinar um indivíduo ministrando-se uma composição como descrito no presente no documento ao indivíduo. Tal vacinação pode resultar em uma redução ou mitigação dos sintomas de infecção futura e pode prevenir uma infecção futura. As composições descritas no presente no documento podem ter aplicações terapêuticas e/ou profiláticas como composições imunogênicas na prevenção e/ou melhoramento de infecção, tal qual resistência a novas infecções será aprimorada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Tal proteção pode ser demonstrada por uma redução ou falta dos sintomas associados a RSS, que inclui, porém sem limitação, qualquer um dos descritos no presente no documento. Qualquer um de uma ampla variedade de ensaios disponíveis pode ser usado para determinar a efetividade do método de vacinação da presente invenção, incluindo-se, porém sem limitação, qualquer um dos descritos no presente no documento.
[00086] Em algumas aplicações, uma quantidade imunologicamente efetiva de pelo menos um imunógeno é empregada em tal quantidade de forma a causar uma redução substancial no curso da infecção normal. Imunogenicidade e efetividade podem ser ensaiadas em qualquer um dentre uma variedade de sistemas experimentais conhecidos, que incluem, porém sem limitação, qualquer um dos descritos no presente no documento.
[00087] As composições e os métodos descritos no presente no documento podem ser administradadministrados a um indivíduo para o tratamento e/ou prevenção de doenças virais, doenças infecciosas, que incluem, porém sem limitação, infecções bacterianas, fúngicas e parasitárias, câncer, e outras doenças nas quais a administração de um ou mais imunógenos seja terapeuticamente desejada. Com os métodos da presente descoberta, a eficácia da administração de um ou mais agentes pode ser endereçada por qualquer um dentre uma variedade de parâmetros conhecidos na técnica, incluindo-se, porém sem limitação, qualquer um dos descritos no presente no documento. Isso inclui, por exemplo, determinações de um aumento na reação de hi- persensibilidade do tipo retardada a antígeno tumoral, determinações de um atraso no tempo de recaída da malignidade pós-tratamento, determinações de um aumento em tempo de sobrevivência livre de relapso, determinações de um aumento em sobrevivência de pós- tratamento, determinação de tamanho de tumor, determinação do número de células T reativas que são ativadas quando expostas aos an- tígenos da vacinação por um número de métodos que incluem análises ELISPOT, FACS, liberação de citocina, ou ensaios de proliferação de célula T.
[00088] Por exemplo, as composições e métodos descritos no presente no documento podem ser administrados a um paciente para o tratamento de câncer. Determinações antitumorais incluem, porém sem limitação, determinações peptídicas, vacinas de células inteiras, vacinas de células inteiras geneticamente modificadas, vacinas re- combinantes de proteína ou vacinas baseadas em expressão de antí- genos associados a tumor por vetores virais recombinantes. Cancros a serem tratados incluem, mas não são limitados a, melanoma, carcinoma basocelular, câncer de colo retal, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de pulmão (que inclui carcinoma de pulmão de pequenas células e - carcinoma de pequenas células), leucemia, linfoma, sarcoma, câncer de ovário, sarcoma de Kaposi, Doença de Hodgkin, Linfoma Não-Hodgkin, mieloma múltiplo, neuroblastoma, rabdomiossarcoma, trombocitose primária, macroglobulinemia primária, tumores de pulmão de pequenas células, tumores cerebrais primários, câncer de estômago, insulinoma maligno no pâncreas, car- cinoide maligno, câncer de bexiga urinária, lesões cutâneas pré- malignas, câncer testicular, linfomas, câncer de tiroide, neuroblastoma, câncer de esôfago, câncer do trato geniturinário, hipercalcemia maligna, câncer do colo do útero, câncer endometrial, glioblastoma, e cancro adrenal cortical. Em alguns aspectos, o câncer é um câncer primário. Em alguns aspectos, o câncer é metastático. Como usado no presente no documento, "tumor" refere-se a todos os tipos de cancros, neoplasmas, ou tumores malignos encontrados em mamíferos.
[00089] A eficácia de tratamento de um câncer pode ser analisada por quaisquer dos vários parâmetros conhecidos na técnica. Isso inclui, porém, sem limitação, determinações de uma redução no tamanho do tumor, determinações da inibição do crescimento, dispersão, invasão, vascularização, angiogênese, e/ou metástase de um tumor, determinações da inibição do crescimento, dispersão, invasão e/ou vascularização de quaisquer lesões metastáticas, determinações de infiltrações de tumor por células imunes de sistema, e/ou determinações de uma reação de hipersensibilidade de tipo atrasado ao antíge- no de tumor. A eficácia de tratamento também pode ser analisada pela determinação de um atraso da recaída ou um atraso na progressão do tumor no paciente ou por uma determinação de taxa de sobrevivência do paciente, por exemplo, uma taxa elevada de sobrevivência em um ou cinco anos após o tratamento. Conforme usado no presente docu-mento, uma recaída é o retorno de um tumor ou neoplasma após sua aparente cessação.
[00090] Conforme usado no presente documento, a menos que o contexto torne claro de outro modo, "tratamento", e palavra similar tal como "tratado", "tratar", etc., é uma abordagem para obter resultados benéficos ou desejados, incluindo e preferencialmente resultados clínicos. Um tratamento pode incluir tratamentos terapêuticos e/ou profilá- ticos. Os efeitos desejáveis de tratamento incluem evitar a ocorrência ou recorrência de doença, alívio de sintomas, diminuição de uma ou mais consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, reduzindo a taxa de progressão de doença, melhoria ou paliação do estado da doença, e remissão ou prognose aprimorada. Em algumas aplicações, uma composição conforme descrito pode demonstrar um aprimoramento em um ou mais resultados desejados de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo me-nos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%.
[00091] Conforme usado no presente documento, uma "quantidade eficaz" ou uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de uma substância é aquela quantidade suficiente para afetar um efeito biológico desejado, tal como resultados benéficos, incluindo resultados clínicos. As concentrações e quantidades terapeuticamente eficazes podem ser determinadas para cada aplicação no presente documento de forma empírica testando os compostos em sistemas conhecidos in vitro ou in vivo, incluindo quaisquer daqueles descritos no presente documento. As dosagens para humanos ou outros animais podem ser então extrapoladas a partir dos mesmos. Com os métodos da presente invenção, a eficácia da administração de uma ou mais intervenções pode ser analisada por quaisquer dentre uma variedade de parâmetros conhecidos na técnica.
[00092] Em algumas modalidades, uma "quantidade eficaz" é uma quantidade que resulta em uma redução de pelo menos um parâmetro patológico. Desse modo, por exemplo, uma quantidade que é eficaz para alcançar uma redução de pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 15%, pelo menos cerca de 20%, ou pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 30%, pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 40%, pelo menos cerca de 45%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 55%, pelo menos cerca de 60%, pelo menos cerca de 65%, pelo menos cerca de 70%, pelo menos cerca de 75%, pelo menos cerca de 80%, pelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, em comparação à redução esperada no parâmetro em um indivíduo que não recebe tratamento.
[00093] A presente invenção também inclui métodos de criação e uso das composições de vacina descritas no presente documento. As composições da presente descoberta podem ser formuladas em preparações farmacêuticas em uma variedade de formas adaptadas à rota escolhida de administração. Quaisquer dentre uma variedade de modos de administração podem ser usados. Por exemplo, a administração pode ser intravenosa, topical, oral, intranasal, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular ou intratumor.
[00094] Uma composição de vacina, conforme descrita no presente documento pode tomar a forma de um implante. Tal um implante pode ser implantado dentro do tumor. A entrega pode ser concluída por quaisquer dentre uma variedade de tecnologias disponíveis, incluindo, por exemplo, injeção, infusão, instalação, aplicação tópica, entrega por uma agulha, e/ou entrega por um cateter. A entrega pode ser por meio de uso de um dispositivo ou utensílio de entrega, tal como uma agulha ou cateter. Tais dispositivos de entrega estão incluídos na presente invenção.
[00095] Uma composição da presente invenção pode ser administrada com uma ou mais intervenções terapêuticas adicionais. Os tratamentos terapêuticos adicionais incluem, porém, sem limitação, res- seção cirúrgica, terapia de radiação, quimioterapia, terapia hormonal, vacinas antitumor, terapias à base de anticorpos, irradiação de corpo inteiro, transplante de medula óssea, transplante de célula tronco de sangue periférico, a administração de citocinas, antibióticos, agentes antimicrobianos, agentes antivirais, tais como AZT, ddI ou ddC, a administração de agentes antiterapêuticos, tais como, por exemplo, ciclo- fosfamídeo, metotrexato, 5-fluorouracila, doxorubicina, vincristina, ifos- famida, cisplatina, gemcitabina, busulfano, ara-C, adriamicina, mitomi- cina, citoxano, metotrexato, e combinações dos mesmos. Tal administração pode ocorrer antes, durante, e/ou depois da administração de uma composição de vacina conforme descrito.
[00096] Como usado no presente documento, o termo "sujeito" inclui, mas não se limita a, vertebrados humanos e não humanos. Em algumas modalidades, o sujeito é um mamífero, particularmente um humano. Um sujeito pode ser um "individuo", "paciente" ou "hospedeiro". Um sujeito pode incluir, por exemplo, um humano, um primata superior, um primata não humano, animais de pecuária domésticos e animais de estimação domésticos (tais como cachorros, gatos, gado, cavalos, porcos, ovelhas, cabras, mulas, porcos, e aves domésticas), animais de laboratório (tais como, por exemplo, camundongo, ratos, ratos da índia, porquinhos da índia e coelhos), e vida selvagem. Em algumas modalidades, uma composição de vacina, como descrito no presente documento, é administrada para um bovino, que inclui, mas não se limita a, gado doméstico, búfalo asiático, búfalo africano, bisão e boi tibetano.
[00097] As composições de vacina descritas no presente documento podem ser administradas a aves de capoeira, que incluem, por exemplo, galinhas, perus, galinha d'angola, perdizes, e aves aquáticas, tais como, por exemplo, patos e gansos. As galinhas incluem, mas não se limitam a, galinhas domésticas, galos, frangos de corte, grelhas, criadouro de frango, os ovos de criadouro de frango galinhas domésticas, e as aves que põe ovos. A vacina da presente invenção pode ser administrada para a ave de capoeira antes ou depois de chocar. Ave de capoeira pode receber uma vacina em idades variadas. Por exemplo, frangos de corte podem ser vacinados no ovo, de um dia de idade, no ovo, ou de 2 a 3 semanas de idade. Estoques de ovos postos ou estoques de reprodução podem ser vacinados, por exemplo, a cerca de 6 a 12 semanas de idade e reforçado a cerca de 16 a 20 semanas de idade. Tais estoque de ovos postos ou estoque de reprodução pode ser vacinado a cerca de 6, a cerca de 7, a cerca de 8, a cerca de 9, a cerca de 10, a cerca de 11, ou a cerca de 12 semanas de idade. Tal estoque de ovos postos ou estoque de reprodução podem ser reforçados a cerca de 16, a cerca de 17, a cerca de 18, a cerca de 19, ou a cerca de 20 semanas de idade. Os ovos de tal estoque de ovos postos ou estoques de reprodução podem demonstrar um título de anticorpos para o(s) antígeno(s) administrado, que pode impedir ou suavizar os sintomas de uma infecção nos ovos.
[00098] As composições da presente invenção podem ser formuladas, de acordo com os métodos conhecidos e usados na técnica. Uma composição de vacina da presente invenção pode incluir sais, tampões, conservantes, ou outras substâncias designadas para melhorar ou estabilizar a composição. Uma composição de vacina pode incluir um excipiente aceitável farmaceuticamente ou carregador. Como usado no presente documento, o termo "carregador aceitável farmaceuti- camente" se refere a uma substância adequada para administração em um humano ou outro animal vertebrado. Para administração, uma composição, como descrita no presente documento, pode ser adequadamente tamponada, se necessário, e o isotônico pode ser prestamente composto com salino suficiente ou glicose. Nessa conexão, meio aquoso estéril, que pode ser empregado, será conhecido por aqueles versados na técnica. Além disso, para administração humana, preparações devem ser estilizadas adequadamente, pirogenicidade, e segurança geral e padrões de pureza são requeridos pelo FDA. Tais preparações podem ser livres de pirogênio, pode ser estéril, e/ou livre de endotoxinas.
[00099] Uma composição da presente invenção pode também conter um ou mais estabilizadores. Qualquer estabilizador adequado pode ser usado incluindo carboidratos, tais como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrinas, ou glicose; proteínas, tais como albumina ou caseína; e tampões, tais como fosfato de metal alcalino e similares. Um estabilizador é particularmente vantajoso quando uma preparação de vacina seca é preparado por liofilização. Similar composição pode incluir carregadores aceitáveis farmaceuticamente ou diluentes. Carregadores incluem, por exemplo, estabilizadores, conservantes e tampões. Estabilizadores apropriados incluem, por exemplo, SPGA, carboidratos (tais como sorbitol, manitol, amido, sacarose, dextrano, glu- tamato monossódico ou glicose), proteínas (tais como soro de leite seco, albumina ou caseína) ou produtos de degradação dos mesmos. Tampões adequados incluem, por exemplo, fosfatos de metal alcalino. Conservantes adequados incluem, por exemplo, timerosal, mertiolate e gentamicina. Os diluentes, incluem, mas não se limitam a, água, tampão aquoso (tal como salino de tampão), álcoois, e polióis (tal como glicerol).
[000100] Qualquer um dentre uma ampla variedade de agentes mo- duladores pode ser incluído nos métodos e composições descritos no presente documento. Como usado no presente documento, um "agente modulador" é um agente que tem um efeito terapêutico sobre o tecido vivo. Agentes modulatórios incluem, por exemplo, agentes terapêuticos que são efetivos para impedir e/ou superar doenças e/ou promover a recuperação.
[000101] A vacina da presente invenção pode ser administrada por um sujeito por qualquer das muitas rotas diferentes. Por exemplo, a vacina pode ser administrada de modo intravenoso, dentro do peritô- nio, de forma subcutânea, oral, transdérmica e/ou intramuscular. Regimes de dosagens adequadas podem ser determinados tendo em conta fatores bem conhecidos na técnica que incluem, por exemplo, a idade, o peso, o sexo, condições médicas do sujeito; a rota de administração; o efeito desejado; e a conjugação particular e formulação empregada. A vacina pode ser administrada tanto por uma simples dose, como por doses múltiplas. Quando administrado em um formato de vacina de dose múltipla, o tempo da dose pode seguir a programação conhecida na técnica. Por exemplo, depois de uma administração inicial, uma ou mais doses de reforço podem subsequentemente ser administrada para manter títulos de anticorpos e/ou memória imunoló- gica.
[000102] Os métodos da presente invenção podem incluir métodos in vitro, ex vivo ou in vivo. Conforme usado no presente documento "in vitro" está em cultura de célula e "in vivo" está dentro do corpo de um indivíduo. Com a presente invenção, um imunógeno isolado ou agente pode ser entregue. Conforme usado no presente documento, "isolado" refere-se ao material que foi ou removido do ambiente natural do mesmo, produzido através do uso de técnicas recombinantes, sintetizados química ou enzimaticamente e, portanto, é alterado "mediante a mão de um homem" do estado natural do mesmo.
[000103] A presente invenção inclui kits que empregam uma ou mais composições descritas no presente documento. Tais kits podem fornecer para a administração de um imunógeno para um indivíduo a fim de evocar uma resposta imunológica. Os kits da presente invenção podem incluir outros reagentes tais como tampões e soluções necessárias para praticar a invenção também são incluídos. Associados de forma opcional, com tal(s) contentor(s) podem ser um aviso ou instruções impressas. Conforme usado no presente documento, a frase "material de empacotamento" refere-se a uma ou mais estruturas físicas usadas para alojar os conteúdos do kit. O material de empacotamento é construído através de métodos conhecidos para fornecer, preferencialmente, um ambiente esterilizado livre de contaminantes. Conforme usado no presente documento, o termo "empacotamento" refere-se a uma matriz sólida ou a um material tal como vidro, plástico, papel, folha, e similares, capazes de segurar, dentro de limites fixos, um polipeptídio. Os kits da presente invenção também podem incluir instruções para uso. Instruções para uso incluem, tipicamente, uma expressão tangível que descreve a concentração de reagente ou pelo menos um parâmetro de método de teste, tal como as quantidades relativas de reagente e amostras a serem misturadas por adição, períodos de tempo de manutenção para misturas por adição de reagen- tes/amostras, temperatura, condições de tampão e similares.
[000104] A menos que indicado em contrário, todas as quantidades expressastes de número de componentes, pesos moleculares e assim por diante usadas neste relatório descritivo e reivindicações devem ser entendidas conforme são modificadas em todas as instâncias mediante o termo "sobre." Em conformidade, a menos que indicado do contrário, os parâmetros numéricos apresentados no relatório descritivo, e as reivindicações, são aproximações que podem variar em dependência das propriedades desejadas procuradas a serem obtidas através da presente invenção. No mínimo, e não como uma tentativa de limitar a doutrina dos equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser, pelo menos construído, à luz do número dos dígitos significativos reportados e através da aplicação de técnicas de arredondamento comuns.
[000105] Embora as faixas numéricas e parâmetros que apresentam o amplo escopo da invenção sejam aproximações, os valores numéricos apresentados nos exemplos específicos são reportados quanto mais preciso possível. Todos os valores numéricos, no entanto, contêm, de forma inerente, uma faixa que resulta, necessariamente, a partir da divergência padrão encontrada nas respectivas medições de testes dos mesmos.
[000106] A descrição exemplifica modalidades ilustrativas. Em diversos lugares em todo o pedido, guiamento é fornecido através das listas de exemplo, os quais exemplos podem ser usados em várias combinações. Em cada ocorrência, a lista citada serve apenas como um grupo representativo e não deve ser interpretado como uma lista exclusiva.
[000107] A presente invenção é ilustrada através dos seguintes exemplos. Deve ser entendido que os exemplos particulares, materiais, quantidades e procedimentos devem ser interpretados, de forma ampla, em conformidade com o escopo e espírito da invenção apresentada no presente documento. Todos os cabeçalhos são para conveniência do leitor e não devem ser usados para limitar o significado do texto que segue o cabeçalho, a menos que assim especificado.
EXEMPLOS Exemplo 1
[000108] Novos acionadores de regime de entrega de vacinação in-tensificados, respostas imunológicas de vacina específica
[000109] Para intensificar a entrega de vacina sobre que visto quando os métodos de entrega convencionais são usados, esse exemplo focado em fornecer antígeno, adjuvantes CpG positivos ou negativos, junto de um componente que está em estado líquido em temperatura ambiente, mas que forma um depósito de gel sob afecções fisiológicas, após injeção em 35°C. Isso permite que o antígeno e o adjuvante sejam entregues em uma forma concentrada, em que se amplia a ati- vidade de célula que apresenta antígeno e leva a respostas, de vacinas específicas, pró-inflamatórias. Antígeno de Hepatite B recombi- nante (rHepBag) foi usado como antígeno para vacinação e o método de entrega avaliado junto de sete esquemas de vacina diferentes para a habilidade de induzir específicos anticorpos e citocinas de Hepatite B. Camundongos foram vacinados com rHepBag em dois tipos diferentes de pastas aquosas de gel (PURAMATRIZ, também referida no presente documento como "P1" e MATRIGEL, também referida no presente documento como "P2"), ou com rHepBag em ALHYDROGEL (sal de alumínio) ou rHepBAg misturado com adjuvante de Freund Completo (CFA). Pastas aquosas de gel e ALHYDROGEL foram misturados +/- com a murina de CpG ODN 1826.
[000110] Resultados mostraram que os camundongos vacinados com ou a pasta aquosa de gel positiva ODN tiveram um produção de TFn, significativamente, maior de 24 a 48 horas após inoculação primária, embora o P1 tenha sido, significativamente, superior ao ALHYDROGEL em 24 horas. O adjuvante P2 apresentou uma inibição promitente de Th2 após 48 horas com a redução de níveis de IL-4, IL-5 e IL-10 coincidentes com a produção aumentada do antígeno específico IgG2a em soro.
[000111] A análise de anticorpos específicos de vacina mostrou que P1 acionou títulos altas de IgA, IgM e IgG específicas de vacina 14 dias após a inicialização com ou sem o uso de ODN e as títulos altas de IgA e IgG foram mantidos por 35 dias. Como ambos os sistemas de pasta aquosa em gel testados nesse estudo foi superior aos adjuvantes convencionais, esse sistema inovador de entrega de vacina em pasta aquosa em gel terá ampla utilidade para acentuar respostas a numerosas vacinas atuais que são hoje em dia marginalmente funcionais. O uso desse sistema inovador de entrega de vacina será adicionalmente investigado no desenvolvimento de vacinas para qualquer um de uma ampla variedade de doenças infecciosas, de infecção pa- rasítica a viral.
Material e métodos
[000112] Vacinas e Rota de Administração. A vacina experimental usada nesse estudo foi produzida a partir de um antígeno de Hepatite B recombinante, nomeadamente, rHepBag (Fitzgerald Industries, Inc. Massachusetts, EUA). 90 camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade foram igualmente divididas em 9 grupos e respectivamente receberam uma injeção subcutânea de inicialização (sc) na parte posterior, e um reforço 4 semanas depois, de 0,1 ml de solução que contém 5 μg de rHepBag, 0,1 ml de 50 μg de ODN 1826 (Invivo- Gen, Inc. Califórnia, EUA) com 5 μg de rHepBag, 0,4 ml de solução de PURAMATRIX (P1) e 5 μg de rHepBag com ou sem ODN 1826, 0,4 ml de MATRIGEL (P2) e 5 μg de rHepBag com ou sem ODN 1826, 0,1 ml de solução de 250 μg de alúmen (Thermo Fisher Scientific, Inc. Pensil- vânia, EUA) e 5 μg de rHepBag com ou sem ODN 1826 e, 0,1 ml de Adjuvante de Freund Completo (Sigma-Aldrich Co. Missouri, EUA) com 5 μg de rHepBag (1:2). Para preparar uma dose da pasta aquosa, 5 μg de antígeno rHBsAg, com ou sem mistura prévia com 50 ug de CpG, foi trazido para um volume final de 400 μl com MATRIGEL ou PURAMATRIX e misturado por completo antes da injeção subcutânea. Quantidades tiveram aumento de escala dependendo do número de doses necessárias. MATRIGEL e PURAMATRIX foram adquiridos junto à BD (Franklin Lakes, NJ).
[000113] Avaliação de citocinas e de anticorpo. Esplenócitos foram isolados uma semana após o reforço para avaliação de citocinas. Suspensões de única célula (1,5 x iθ6/mi) foram preparadas e suspensas em meio 1640 (RPMI 1640 Thermo Scientific Hyclone, Utah, EUA) com penicilina-estreptomicina (concentrações finais de 100 U/ml e 100 μg/ml, respectivamente) (Sigma-Aldrich. St. Louis, MO, EUA). 0,5 ml da suspensão de única célula foi adicionado em placas com 48 cavidades (Sigma-Aldrich. St. Louis, MO, EUA) com 0,5 ml de meio, 0,5 ml de 1 μg/ml de Concanavalina A (ConA) ou 0,5 ml de 5 μg/ml de rHepBag e tiveram sua cultura realizada a 37°C com 5% de CO2. Os níveis de TNF foram quantificados após 24 e 48 horas de cultura, IL-4 e IL-5 após 48 horas, IL-4 e IL-10 após 72 horas, cada um em triplicado. As porcentagens de camundongos positivos em citocina foram adicionalmente transformadas com o uso de uma plataforma em duas etapas que consistiu em (1) calcular a mediana global para cada cito- cina considerando toda a faixa de valores obtida para cada grupo; e (2) estabelecer para cada grupo o conceito de produtores de citocina 'baixa' e 'alta' com o uso da porcentagem de mediana global de células positivas em citocina como a borda limite para segregar os indivíduos em duas categorias denominadas produtores de citocina 'baixa' e 'alta'. É importante destacar que o perfil de citocina geral para cada grupo foi montado ao fornecer o mesmo peso a todas as citocinas e populações de célula produtora.
[000114] ELISpot de gama IFN também foi desempenhado com 3 x 105 e 1,5 x 105 de esplenócitos após 24 horas de cultura, conforme descrito pelo fabricante (BD Biosciences (São Francisco, CA, EUA) com o uso de 1 μg/ml de ConA como controle positivo. O valor de unidade de formação de mancha (SFU) foi expresso como média das culturas triplicadas menos o valor médio de seu fundo individual.
[000115] Amostras de sangue de camundongos foram coletadas se-manalmente de 1 a 6 semanas, incluindo o dia antes da imunização primária. Soro coletado dessas amostras de sangue foi usado em ensaios de ULISA para a detecção e quantificação de anticorpos.
[000116] Peptídeos sintéticos para análise de célula T para citome- tria de fluxo. Peptídeos sintéticos foram sintetizados por Biosynthesis, Inc., e foram selecionados com base na literatura relevante. O peptí- deo S 228-39 (IPQSLDSWWTSL) é restrito de H2-Ld e o epítopo dominante em camundongos Balb/c. Os esplenócitos de cinco camundongos per grupo foram individualmente estimulados com 5 μM de peptídeo e 40 U/ml de IL-2 para citometria de fluxo.
[000117] Análises estatísticas. Para avaliação de anticorpo, comparações foram analisadas por Mann-Whitney ou teste t de Student com o uso de software de GraphPad PRISM, versão 4.0 (Software GraphPad, Califórnia, EUA), após-teste de normalidade de Kolmogorov- Smirnov. Uma diferença foi considerada como estatisticamente significativa quando um valor P foi < 0,05. Teste qui-quadrado foi usado para comparações de frequências produtoras de citocina "baixa" e "alta" entre grupos e significância considerada em P < 0,05. A comparação de eixos geométricos de gráficos de radar e áreas de polígono foi considerada significativa para razões duas vezes menores em magnitude. A análise de dados para os resultados apresentados no formato de gráfico de radar foi desempenhada ao comparar as áreas de polígono centrais entre grupos intra e inter de categorias de produtores de cito- cina. Diferenças significativas foram consideradas para razões que indicam eixos geométricos e áreas de polígono duas vezes menores ou maiores em tamanho.
Resultados
[000118] Os resultados iniciais mostraram que camundongos vacinados com pasta fluida em gel mais CpGs tiveram IgG2a específico de vacina significativamente mais elevado 14 dias após a iniciação e IgA, IgM em 28 dias após a inoculação em relação aos camundongos vacinados com alúmen ou CFA. Uma entrega de pasta fluida em gel levou a títulos de IgG específico de vacina significativamente mais elevadas 14 dias após a iniciação em relação ao que outros métodos de aplicação realizaram após o reforço, sugerindo que o reforço foi desnecessário. Os ensaios de retorno mostraram IL-10 e IL-4 regulados de ma- neira ascendente a partir de esplenócitos de camundongos vacinados com ALHYDROGEL ou CFA em comparação com células de camundongos vacinados com pasta fluida + CpG. CpG usa níveis reduzidos de IL-5 para fundo em todos os grupos em comparação com níveis elevados em CFA. Nenhuma diferença em níveis de IFN ou TNF foi percebida.
[000119] A Figura 1 mostra a cinética de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgA. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10.
[000120] A Figura 2 mostra a cinética de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgM. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10.
[000121] A Figura 3 mostra a cinética de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgG. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10.
[000122] A Figura 4 mostra a cinética de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgG1. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10.
[000123] A Figura 5 mostra a cinética de títulos de anticorpo anti- HBsAg de IgG2a. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10.
[000124] A Figura 6 mostra títulos de anticorpo anti-HBsAg de IgG2a mais elevadas após vacinação única (21 dias). Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10; *p<0,05, **p<0,01, **p<0,001, ****p<0,0001 em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós-teste de Bon- ferroni.
[000125] A Figura 7 mostra títulos de anticorpo de anti-HBsAg mais elevados após única vacinação (35 dias). Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10; *p<0,05 em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós-teste de Bonferroni.
[000126] A Figura 8 mostra o perfil de citocina vinte e quatro horas após novo estímulo com HBsAg de esplenócitos. Dados mostrados são representativos de um experimento, n=5; *p<0.05, ****p<0,0001 em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós-teste de Bonferroni.
[000127] A Figura 9 mostra perfil de citocina quarenta e oito horas após novo estímulo com HBsAg de esplenócitos. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10 (n=5 para adjuvantes, apenas); nenhuma diferença estatística vista (p<0,05) em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós-teste de Bonferroni.
[000128] A Figura 10 mostra perfil de citocina setenta e duas horas após novo estímulo com HBsAg de esplenócitos. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10 (n=5 para adjuvantes, apenas); **p<0,01 em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós-teste de Bon- ferroni.
[000129] A Figura 11 mostra imunidade mediada por célula de HBsAg específico aumentada por ELISpot em resposta de célula T de HbsAg específico. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10; *p<0,05 em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós- teste de Bonferroni.
[000130] A Figura 12 mostra imunidade mediada por célula T de HBsAg específico aumentada por citometria de fluxo. Dados mostrados são agrupados a partir de dois experimentos independentes para total de n=10; **p<0.01 em comparação com antígeno sozinho que usa ANOVA de duas vias com pós-teste de Bonferroni.
[000131] Aumento de secreção de citocinas por esplenócitos com estímulo de rHepBag. A fim de medir a resposta imunológica celular induzida pelas vacinas, camundongos foram sacrificados uma semana após o reforço e esplenócitos foram cultivados com ou sem 5 μg/ml de concentração final de rHepBag. Os níveis de citocinas foram medidos por ELISA. O conceito de baixos e altos produtores foi aplicado para investigar uma ampla faixa de citocinas e avaliar perfis de citocina ex vivo de circulação de leucócitos. Para esse propósito, a mediana global para cada subconjunto de célula de citocina positiva foi calculada, obtendo toda a faixa de valores obtidos para cada grupo, conforme descrito em outro lugar (Vitelli-Avelar et al., 2008, Scand J Immunol; 68(5):516 a 525). A porcentagem mediana global de cada população de célula de citocina positiva foi usada como a borda limite para se-gregar os indivíduos em duas categorias chamadas "baixos" e "altos" produtores de citocina, conforme mostrado na Tabela 1.
[000132] Os dados demonstraram que nenhum dos camundongos inoculados com ODN 1826 mostrou produção de TNF em 24 horas, mas quando ODN 1826 foi associado a adjuvantes P1 ou P2, uma proporção significativa de camundongos exibiu valores de TNF acima da borda limite, conforme mostrado na Figura 13 (P < 0,011). Embora ALHYDROGEL, quando associado ou não a ODN 1826, induza uma quantidade significativa de "altos" produtores de TNF, todos os camundongos inoculados com adjuvante P1 sem CpG exibiram valores acima do limite, e esse valor foi significativamente maior do que em todos os grupos de Alhydrogel (P < 0,001). Esse mesmo resultado não foi observado após 48 horas quando os adjuvantes P1, P2, ALHYDROGEL e Freund mostrara um número comparável de "altos" produtores de TNF (Figuras 14A e 14B) (P < 0,001).
[000133] Além disso, dados interessantes foram revelados para produção de IL-4 e IL-5 após 48 horas, quando a maior parte dos camun- dongos imunizados com adjuvante P2 caiu para uma região de "baixos" produtores de IL-4 e IL-5 (P < 0,05). De modo diferente, a maior parte dos camundongos inoculados com adjuvante P1 apresentou uma alta produção de ambas as citocinas (P < 0,002). Conforme mostrado na Figura 15, o adjuvante P1 continuou a apresentar "altos" produtores de IL-4 após 72 horas, em associação ou não com ODN 1826 e esse mesmo resultado não foi revelado após imunização com ALHYDRO- GEL ou Freund (P < 0,001). Também, os dados demonstraram que a maior parte dos camundongos imunizados previamente com adjuvante P2 ou adjuvante P2 mais ODN 1826 exibiu valores de IL-10 abaixo da borda limite, significativamente inferiores aos dos camundongos imunizados com rHepBag, associado ou não com ODN 1826 (P < 0,05). Tabela 1 - Frequência de indivíduos altos produtores de citocina com base no corte de citocina mediano global detectado em cultura de esplenócitos estimulada com rHepBag*
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[000134] Resposta humoral sustentada em camundongos vacinados com rHepBag e adjuvantes P1 e P2. Os soros foram coletados semanalmente antes e após a imunização para testar título de anticorpo de isótipos específicos através de ELISA. Os camundongos vacinados com ambos os adjuvantes P1 e P2 desenvolveram um anticorpo anti- rHepBag IgG em 2 semanas após a inoculação de iniciação (P < 0,002). As títulos de anticorpo anti-rHepBag mais elevadas foram alcançadas em camundongos vacinados com P1 associado ou não a ODN, e essas respostas foram significativamente superiores à imunização com adjuvantes de ODN, de Alúmen ou de Freund (P < 0,001). A razão IgG1:IgG2a obtida in vivo representa padrões diferentes para ambos os adjuvantes. O adjuvante P1 conduz para uma resposta Th2 com níveis elevados de IgG1 em 14 a 35 dias pós inoculação de iniciação. Considerando que, a resposta obtida através de P2 mais ODN é um sistema misturado ao invés de uma resposta Th1 ou Th2 pura, em que os níveis de IgG1 e IgG2a foram regulados de modo ascendente durante todo o tempo. Consulte as Figuras 17A a 17D.
[000135] A combinação de adjuvante P1 +/- ODN induziu a regulação de modo ascendente de títulos de IgA e IgM tão logo quanto 14 dias pós inoculação de iniciação e essa resposta humoral foi mantida até 35 e 21 dias, respectivamente (P < 0,04). Esse adjuvante foi superior ao de Freund durante 14 e 35 dias e ao ALHYDROGEL pelas primeiras 3 semanas para a produção de IgA, IgM e IgG (P < 0,02). Adicionalmente, ambos os adjuvantes P1 e P2 demonstraram ser superiores ao adjuvante de Freund para a produção de todo Ig após o impulso (P < 0,02). Consulte as Figuras16A a 16D.
Discussão
[000136] Esse exemplo mostrou que os camundongos vacinados com uma pasta fluida em gel P1 ou P2 mais ODN tiveram produção de TNF significativamente superior em 24 a 48 horas após a inoculação primária, enquanto P1 foi significativamente superior ao ALHYDRO- GEL em 24 horas. O adjuvante P2 apresentou uma inibição de Th2 promissora após 48 horas com a redução de níveis de IL-4, IL-5 e IL- 10 coincidente com produção de IgG2a específico de antígeno em soro.
[000137] A análise de anticorpos específicos de vacina mostrou que P1 conduziu títulos de IgA, IgM e IgG de vacina específica elevadas em 14 dias pós iniciação com ou sem o uso de ODN e as títulos de IgA e IgG elevadas foram mantidas por 35 dias. Como ambos dos sistemas de pasta fluida em gel testados nesse estudo foram superiores aos adjuvantes convencionais, esse novo sistema de entrega de vacina de pasta fluida em gel terá utilidade ampla para intensificar as respostas às inúmeras vacinas atuais que são atualmente funcionais de modo marginal. O uso desse novo sistema de entrega de vacina será investigado adicionalmente no desenvolvimento de vacinas para qualquer tipo de doenças infeciosas, de infecção parasitária a viral.
Exemplo 2 Vacinação contra Influenza
[000138] Seguindo os métodos descritos em mais detalhes nos exemplos anteriores, camundongos C57/BL e Balb/c foram imunizados com o antígeno de vírus influenza de nucleoproteína recombinante (rNP) administrado com alúmen, CpG, ou uma pasta fluida de PURA- MATRIX e CpG. Para preparar uma dose da pasta fluida, 10 ug de an- tígeno de rNP, com ou sem mistura anterior com 50 ug de CpG, foram trazidos para um volume final de 200 ul com PURAMATRIX e misturados completamente antes de injeção subcutânea. As quantidades foram aumentadas em escala dependendo do número de doses necessárias. Conforme mostrado na Figura 18B, as títulos de IgG antiinfluenza foram aumentadas em camundongos Balb/c vacinados com rNP administrado como uma pasta fluida com PURAMATRIX e CpG, em comparação com camundongos vacinados com rNP administrado com o adjuvante alúmen ou CpG. A Figura 18A mostra títulos de IgG anti-influenza em camundongos C57BL/6. As títulos de IgG antiinfluenza foram determinadas em quatro semanas pós-última vacinação (wplv).
[000139] Novamente, seguindo os métodos descritos em mais detalhes nos exemplos anteriores, os camundongos C57Bl/6 foram imunizados com PR8 de cepa de vírus de influenza A completamente inati- vado (H1N1) administrado com alúmen, como uma pasta fluida de PURAMATRIX, ou como uma pasta fluida de PURAMATRIX e CpG. Como controle, camundongos adicionais foram imunizados com vírus completamente inativado de PR8 (WIV) apenas. Para preparar uma dose da pasta fluida, 15 ug de antígeno de PR8, com ou sem uma mistura anterior com 50 ug de CpG, foram trazidos para um volume final de 200 ul com PURAMATRIX e misturados completamente antes de injeção subcutânea. As quantidades foram aumentadas em escala dependendo do número de doses necessárias. O PR8 (WIV) é influenza inativada por formalina A/PR/8/34 (H1N1) de Charles River, rNP é proteína nuclear NP de Influenza A humana recombinante (A/PR/8/34/Mount Sinai (H1N1) segmento 5) de Imgenex.
[000140] Conforme mostrado na Figura 19, as títulos de IgG de soro anti-influenza foram aumentadas em camundongos C57Bl/6 vacinados com PR8 WIV administrada como uma pasta fluida de PURAMATRIX e CpG, em comparação com camundongos vacinados com PR8 WIV administrada com o alúmen adjuvante ou como uma pasta fluida com PURAMATRIX apenas, sem CpG. As títulos de IgG anti-influenza foram determinadas quatro semanas após a última vacinação (wplv). A Figura 19 mostra os resultados de dois experimentos independentes.
[000141] Conforme mostrado na Figura 20, uma proteção acentuada de estímulo letal foi observada em camundongos C57Bl/6 vacinados com PR8 WIV. A Figura 20A mostra os resultados de um experimento independente com estímulo letal em 30 LD50 e a Figura 20B mostra os resultados de um experimento independente com estímulo letal em 1000 LD50.
Exemplo 3 Vacinação contra Burkholderia
[000142] Seguindo métodos descritos em mais detalhes no exemplo anterior, os camundongos foram imunizados com um coquetel de três proteínas recombinantes de burkholderia diferentes (proteína 4 a 9 de burkholderia, a proteína 22 a 11 de burkholderia, e a proteína 42 de burkholderia) administradas com uma dentre três preparações de ad-juvantes diferentes, alúmen, Adjuvante de Freund Completo (CFA), ou pasta fluida de PURAMATRIX e CpG. Para preparar uma dose da pasta fluida de PURAMATRIX + CpG, 75 ug de antígeno de proteínas de Burkholderia, com ou sem misturação anterior com 50 ug de CpG, foi levada a um volume final de 200 ul de PURAMATRIX e misturada completamente antes de injeção subcutânea. As quantidades sofreram um aumento de escala dependendo do número de doses necessárias. Como controles, camundongos adicionais foram imunizados com alúmen apenas, CFA apenas ou pasta fluida de PURAMATRIX + CpG, sem antígeno.
[000143] O nome de gênero Burkholderia (anteriormente parte de Pseudomonas) se refere a um grupo de bactérias aeróbicas obrigató-rias com formato de barra, móveis, gram-negativas e virtualmente ubí-quas que incluem tanto patógenos vegetais quanto animais/humanos bem como algumas espécies ambientalmente importantes. A Burkhol- deria é mais bem conhecida por seus membros patogênicos. A Burkholderia mallei é responsável por mormo, uma doença que ocorre majoritariamente em cavalos e animais relacionados. A Burkholderia pseudomallei é o agente causativo de melioidose (também chamada de doença de Whitmore), uma doença infecciosa predominantemente de climas tropicais que pode infetar humanos ou animais, especialmente no Sul da Ásia no nordeste da Austrália. A Burkholderia cepacia é um patógeno importante de infecções pulmonares em pessoas com fibrose cística. Devido à resistência a antibióticos da mesma e à alta taxa de mortalidade de doenças associadas da mesma a Burkholderia mallei e a Burkholderia pseudomallei são consideradas agentes potenciais de guerra biológicas, direcionados a humanos e gados.
[000144] A Figura 21 mostra as títulos de IgG antiburkholderia em camundongos imunizados com um coquetel de três proteínas recom- binantes de burkholderia (proteína 4 a 9 de burkholderia, a proteína 2 a 11 de burkholderia e a proteína 42 de burkholderia). A Figura 21B mostra as títulos de IgG de proteína 4 a 9 antiburkholderia em camundongos imunizados. A Figura 21A mostra as títulos de IgG de proteína 22 a 11 antiburkholderia em camundongos imunizados. A Figura 21C mostra as títulos de IgG de proteína 42 antiburkholderia em camundongos imunizados. As títulos de anticorpo após a imunização com alúmen apenas, coquetel de alúmen + proteína, adjuvante de Freund completo (CFA) apenas, coquetel de CFA + proteína, pasta fluida de PURAMATRIX + CpG apenas, e coquetel de gel PURAMATRIX + proteína são mostradas. Uma resposta imunológica aumentada conforme medida através de níveis de anticorpo de soro específicos foi observada contra duas das três proteínas administradas como uma composição de vacina em gel com puramatrix em comparação com a vacinação com alúmen ou CFA. Especificamente, as títulos de IgG anti- burkholderia foram observadas contra a proteína 4 a 9 de burkholderia (Figura 21B) e a proteína 2 a 11 de burkholderia (Figura 21AB) quando administradas como uma vacina em gel com PURAMATRIX, em comparação com a vacinação com alúmen ou CFA. Dados de estímulos estão sendo analisados.
Exemplo 4 Vacinas Veterinárias
[000145] Seguindo os procedimentos descritos em mais detalhes nos exemplos anteriores, a presente invenção pode ser usada com qualquer uma dentre uma variedade de vacinas veterinárias. As composições de vacina, métodos de entrega e sistema de entrega da presente invenção fornecerão muitas vantagens e um valor melhor par a indústria de gado comercial, incluindo, mas sem se limitar, eficácia aprimorada, entrega prematura no ciclo de produção e eficácia com a administração de apenas uma única dose para fornecer proteção ao longo do ciclo de produção.
[000146] As composições, métodos de entrega e sistemas de entrega da presente invenção podem ser usados na imunização de suíno. As vacinas que podem ser administradas a um suíno com o uso das composições, métodos e sistemas da presente invenção incluem, mas sem se limitar, a vacina contra circovírus porcino tipo 2 (PCV2), vacina contra síndrome respiratória e reprodutiva porcina (PRRSV), vacina contra micoplasma respiratório, vacina contra Streptococcus suis, vacina contra coronavírus porcino, vacina contra rotavírus, vacina contra Escherichia coli (K88) enterotoxigênico, vacina contra Actinorepsira- tbacillus pleuropneumonia (APP) vacina contra influenza suína. Con- suite, por exemplo, a rede ampla mundial em merck-animal- health.com/species/pigs/vaccines.aspx, "Vaccinations for the Swine Herd", Alabama Cooperative Extension System Publication ANR-902, Alabama A&M e Auburn Universities (disponível na rede ampla mundial em aces.edu/pubs/docs/A/ANR-0902/ ANR-0902.pdf), e "Pig vaccination programs", PRIME FACT publication 944, setembro de 2009 (disponível na rede ampla mundial em dpi.nsw.gov.au/__data/assets/pdf_file/0009 /301500/Pig-vaccination- programs.pdf) para informações mais detalhadas sobre vacinas dispo- níveis e a administração de tais vacinas a suínos.
[000147] As composições, métodos de entrega e sistemas de entrega da presente invenção podem ser usados na imunização de bovino, incluindo, mas sem se limitar, gado bovino doméstico, búfalo asiático, búfalo africano, bisão e bois tibetanos. As vacinas que podem ser administradas a bovinos, que usam as composições, métodos e sistemas da presente invenção, incluem, mas sem se limitar, a vacina contra doença respiratória bovina (BRD), incluindo, mas sem se limitar, a BVDV de tipos I e II, a vacina contra vírus de herpes bovino 1 (BHV-1), incluindo, mas sem se limitar, vacinas de subunidade que não resultariam em vírus latente, vacina contra Haemophilus somnus, vacina contra Mannheimia haemolytica, vacina contra Mycoplasma bovis, vacina contra rotavírus bovino, vacina contra Escherichia coli K99, vacina contra coronavírus bovino (BCV), vacina contra Clostridium chauvoei (perna negra), vacina contra Clostridium septicum, vacina contra Clostridium sordelli (edema maligno), vacina contra Clostridium novyi (peste negra), vacina contra Clostridium perfringens (enterotoxemia), vacina contra ceratoconjuntivite bovina infecciosa (olho rosa), incluindo, mas sem se limitar, vacinas contra os vírus de Moraxella bovis, clamí- dia, micoplasma, acoleplasma ou de rinotraqueíte bovina infecciosa (IBR), vacinas contra mastite, incluindo, mas sem se limitar, vacina contra Escherichia coli J5.
[000148] Em algumas aplicações, as composições, métodos de entrega e sistemas de entrega da presente invenção podem ser usados para a administração de um ou mais antígenos de esquistossomose a um bovino. Tal antígeno de esquistossomo pode ser derivado de, por exemplo, Schistosoma japonicum, Schistosoma monsoni ou Schistosoma haematobium. Um antígeno de esquistossomo pode ser uma proteína de isomerase de fosfato de triose de esquistossomo (CTPI) ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo, incluindo, mas sem limitação uma proteína CTPI S. japonicum, S. monsoni ou S. haematobium ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo. Um antígeno de esquistossomo pode ser uma proteína de membrana integral de 23 kDa de Tetraspanina de esquistossomo (C23), ou fragmento antigêni- co ou derivado do mesmo, incluindo, mas sem limitação uma proteína C23 S. japonicum, S. monsoni ou S. haematobium ou fragmento anti- gênico ou derivado do mesmo. Tal antígeno de esquistossomo pode ser um polipeptídeo quimérico, fundido com um ou mais determinantes antigênicos adicionais, tal como, por exemplo, uma proteína de choque térmico ou fragmento antigênico ou derivado do mesmo, incluindo, mas sem limitação, proteína de choque térmico em bovino 70 (Hsp70).
[000149] Veja, por exemplo, "Beef Cattle Herd Health Vaccination Schedule" Powell et al., Universidade de Arkansas, Divisão de Agricultura, publicação de Agricultura e Recursos Naturais, FSA3009 (disponível na rede mundial de computadores em uaex.edu/Other_Areas/publications/PDF/FSA-3009.pdf), "How to Vac-cinate", Serviço de Extensão de Cooperativa de Oklahoma, Divisão de Ciências Agriculturais e Recursos Naturais, Publicação n° 350 (dispo-nível na rede mundial de computadores em ans- ci.colostate.edu/pdf_files/YLE/Dairy7_vaccinate.pdf), e "Cattle Vaccines and Their Use", Publicação de Livro sobre Carne Bovina, BCH- 3015 (disponível na rede mundial de computadores em iowabeefcen- ter.org/Beef%20Cattle%20Handbook/Vaccines_Cattle.pdf) para infor-mações mais detalhadas em vacinas disponíveis e na administração de tais vacinas em gado.
[000150] As composições da vacina, métodos de entrega e sistema de entrega da presente invenção podem também ser usados na vacinação de animais de companhia, incluindo, mas sem limitação, gatos e cães, tal como, por exemplo, para a imunização de cães com vacina contra parvovírus para a transferência de imunidade maternal.
[000151] Rotas de administração incluem, mas não estão limitas, injeção subcutânea (sc) ou intramuscular (im). A vacinação com a composição, métodos e sistemas de entrega da presente invenção irá render rápida proteção com duração maior após a administração de uma única dose.
Exemplo 5 Vacinas para Aves Domésticas
[000152] Seguindo os procedimentos descritos com mais detalhes nos exemplos anteriores, a presente invenção pode ser usada como um sistema de entrega para qualquer uma de uma variedade de vacinas para aves domésticas, incluindo, mas sem limitação, vacinas para bronquite infecciosa (IB), doença de Newcastle (ND), doenças de Marek, vírus da doença infecciosa da bursa (IBD), laringotraqueíte infecciosa (ILT), reovírus aviário, cólera, vírus da bouba aviária, micoplas- mose, Coriza de peru e galinha, influenza aviária, encefalomielite aviária (AE), rinotraqueeíte aviária (ART), hepatite do vírus de pato, enterite hemorrágica, parvovírus de ganso, Paramixovírus 3, vírus de anemia de galinha (CAV), E. coli, Erysipelas, Reimerella, Mycoplasma gal- lisepticum, Pasteurella multocida, Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium, e coccidiose.
[000153] As rotas de administração incluem, mas não são limitados a, injeção subcutânea (sc) ou intramuscular (im). Com a injeção subcu-tânea, a vacina é injetada no espaço entre a pele e tecidos subjacentes. Tipicamente o local da aplicação usado em aves domésticas na pele frouxa na parte posterior do pescoço. Com injeção intramuscular, a preparação da vacina é depositada dentro de uma massa de músculo. Tipicamente, tanto o músculo do peito quanto o músculo da coxa é usado para esse propósito. A vacinação pode incluir a vacinação após um dia da eclosão, frango, poedeiras, animais reprodutores, aves de abate, e/ou aves de exposição. Tipicamente poedeiras e animais re- produtores são vacinados antes do período de postura e depois a cada 6 a 8 semanas com vacinas inativadas durante o período de postura. Isso não só protege os mesmos de doenças, mas passa nos anticorpos maternos ao progênie. Aves domésticas que podem ser vacinadas incluem, mas sem limitação, galinhas, perus e aves aquáticas, tal como, por exemplo, patos e gansos.
Exemplo 6 Imunização contra esquistossomose
[000154] Os camundongos foram imunizados com o antígeno de proteína de esquistossomo CCA em tanto adjuvante de Freund completo ou em MATRIGEL mais CpGs. As títulos de anticorpo IgG anti-CCA foram determinadas através do ELISA. Os dados são mostrados na Figura 22A (CCA em adjuvante de Freund completo) e na Figura 22B (CCA em MATRIGEL mais CpGs). Dois camundongos foram imunizados para cada preparação de antígeno. Amostras de soro foram coletadas em 0, 8, 16 e 19 dias após a imunização para camundongos imunizados com CCA em adjuvante de Freund completo e em 0, 8, 16, 24, 32 e 40 dias após a imunização para camundongos imunizados com CCA in MATRIGEL mais CpGs. Os dados ELISA claramente mostram títulos maiores de anticorpos específicos de CCA em camundongo imunizado com MATRIGEL mais CpGs.
Exemplo 7 Vacinação contra esquistossomose de Búfalo Asiático
[000155] A esquistossomose é uma doença parasítica que afeta mais do que 200 milhões de pessoas no mundo. A reavaliação da deficiência relacionada à esquistossomose, combinada com informações recentes na prevalência global de infecção de esquistossomose indica que a verdadeira carga de esquistossomose é substancialmente maior do que previamente verificado. Na Ásia, particularmente na China, o agente causador é Schistosoma japonicum. Diferente das espécies africanas, S. mansoni e S. haematobium, S. japonicum é um parasita zoonótico, com bovinos, particularmente búfalos asiáticos responsável por cerca de 75% da transmissão de esquistossomo a humanos na China. Intervenções que reduzem a infecção de esquistossomo em búfalos asiáticos aprimorarão a saúde dos mesmos simultaneamente reduzindo transmissão de doença a humanos. Programas de controle usuais em diversas áreas da China incluem tratamento simultâneo com praziquantel (PZQ) a humanos e búfalos asiáticos; enquanto isso mostrou uma redução na prevalência total, o mesmo exige tratamentos de massa continuado que são demorados e caros. Uma opção mais sustentável seria o desenvolvimento de uma vacina que reduza a transmissão de S. japonicum de bovinos para substituir quimioterapia bovina. De fato modelo matemático (Williams et al., 2002, Acta Trop; 82(2):253-262) demonstrou que a redução de infecção S. japonicum em reservatórios bovinos com o uso de vacinas profiláticas com 45% de eficácia sozinho ou em combinação com PZQ deve, ao longo do tempo, reduzir a prevalência de equilíbrio e potencialmente levar ao controle de esquistossomose sustentável a longo prazo. Essa intervenção com base em duas pontas reduziria significativamente a transmissão de esquistossomose para um longo prazo, aumentaria a saúde bovina e crescimento e provavelmente reduziria morbidade total em populações de povoados. Ver Da'Dara et al., 2008, Vaccine; 26(29- 30):3617-3625, a qual é incorporada no presente documento a título de referência em sua totalidade.
[000156] As composições de antígeno-PURAMATRIX conforme descrito no presente documento serão usadas para a imunização de gado com antígenos de S. japonicum. Para esses experimentos, será aplicada, a todos os animais, uma vacinação primária com uma vacina de DNA plasmidial de SjCTPI-Hsp70 (conforme descrito mais detalhadamente em Da'Dara et al., 2008, Vaccine; 26(29-30):3617 a 3625). O búfalo da Índia foi reforçado com uma composição de proteína SjCTPI recombinante, PURAMATRIX e CpG de bovino. Especificamente, 100 ug de SjCTPI recombinante mais CpG de bovino serão misturados em PURAMATRIX para um volume de injeção total de aproximadamente 0,50 ml/animal. Isso será injetado no ombro do búfalo /e do gado. Apenas uma única vacinação de reforço será administrada a um animal.
[000157] A descoberta de resposta imunocelular e humoral, incluindo resposta de anticorpo de IgG anti-SjCTPI, será determinada. Após o reforço, os animais foram estimulados com cercária e a eficácia da va-cina determinada mediando-se a redução no número de ovos por grama de fezes, a redução Nos. ovos em tecidos do fígado, a redução na eclosão miracidiana e a redução na carga de vermes. Os métodos para essas determinações são descritos mais detalhadamente em Da'Dara et al., 2008, Vaccine; 26(29-30):3617 a 3625.
[000158] Um primeiro experimento nas Filipinas já está no Ano 2, com 400 búfalo da Índia ou gados reforçados, conforme descrito acima. Um segundo experimento em Samar, Filipinas, incluirá 1.500 búfalos da Índia ou gado. Um terceiro experimento na China incluirá 600 búfalos da Índia ou gado.
[000159] A imunização de búfalos da Índia e gado com composições de polipeptídeos de esquistossomo, como, por exemplo, polipeptídeos SjCTPI, SjCTPI-Hsp70, SjC23 ou SjC23-Hsp70, em uma composição puramatrix, com ou sem adjuvantes, como, por exemplo, CpG ou IL- 12, pode servir como a base para novos programas de controle para esquistossomose na Ásia. Tal programa, além do tratamento com pra-ziquantel (PZQ), incluiria vacinação de búfalos da Índia com vacinas de proteção parcial como SjC23-Hsp70 e SjCTPI-Hsp70 como um meio para reduzir o número de parasitas ovíparos no gado, levando a declínios mensuráveis na prevalência, intensidade e transmissão de S. japonicum.
[000160] A descoberta completa de todas as patentes, pedidos e pu-blicações de patente, e material eletronicamente disponível (incluindo, por exemplo, submissões de sequência de nucleotídeos em, por exemplo, GenBank e RefSeq, e submissões de sequência de aminoá- cidos em, por exemplo, SwissProt, PIR, PRF, PDB e translações de regiões de codificação anotadas em GenBank e RefSeq) citados no presente documento estão incorporados a título de referência. No caso onde existe qualquer inconsistência entre a descoberta do presente pedido e a(s) descoberta(s) de qualquer um dos documentos incorporados ao presente documento a título de referência, a descoberta do presente pedido prevalecerá. A descrição detalhada a seguir e os exemplos foram dados apenas por razões de clareza de compreensão. Não deve ser entendida nenhuma limitação desnecessária a partir da mesma. A invenção não se limita aos detalhes exatos mostrados e descritos, para variações óbvias para o versado na técnica serão incluídas na invenção definida pelas reivindicações. Todos os cabeçalhos são para conveniência do leitor e não deveriam ser usadas para limitar o significado do texto que segue o cabeçalho, exceto se assim especificado.

Claims (18)

1. Composição de vacina, caracterizada pelo fato de que compreende: (i) um hidrogel de peptídeo que é um líquido em temperatura ambiente e um gel a concentrações de sal fisiológicas e/ou temperaturas fisiológicas; e (ii) um ou mais antígenos; em que o hidrogel de peptídeo compreende o peptídeo de montagem automática RADARADARADARADA (SEQ ID NO: 2).
2. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende um antígeno de influenza, um antígeno de hepatite, um antígeno de burkholderia e/ou um antígeno de esquistossomose, ou um fragmento antigênico dos mesmos.
3. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende um antígeno associado a tumor.
4. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o antígeno compreende: (i) um antígeno de Schistosoma japonicum, ou um fragmento antigênico do mesmo, ou (ii) um polipeptídeo SjCTPI, um polipeptídeo SjCTPI-Hsp70, um polipeptídeo SjC23 e/ou um polipeptídeo SjC23-Hsp70, ou um fragmento antigênico do mesmo.
5. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a composição de vacina compreende ainda um ou mais adjuvantes.
6. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que o um ou mais adjuvantes compreende um agonista de Receptor do tipo Toll (TLR).
7. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que o agonista TLR compreende um agonista TLR4 e/ou TLR9.
8. Composição de vacina de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o agonista TLR9 compreende um oligodeoxinucleotídeo CpG (ODN).
9. Composição de vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que a composição de vacina é liofilizada.
10. Uso de uma composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que é na preparação de uma composição para a produção de uma resposta imunológica em um indivíduo, para imunizar um indivíduo, distribuir um ou mais antígenos imunogênicos a um indivíduo ou distribuir um ou mais antígenos terapêuticos a um indivíduo.
11. Uso de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um gado doméstico ou um animal de companhia, ave doméstica ou humano.
12. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 11, caracterizado pelo fato de que a composição é aplicada por injeção subcutânea (sc) e/ou injeção intramuscular (im) e/ou como uma vacinação de reforço, preferivelmente após uma vacinação primária com uma vacina de polipeptídeo ou uma vacina de DNA de plasmídeo.
13. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 12, caracterizado pelo fato de que a resposta imunológica produzida no indivíduo é uma resposta imune antiesquistossomo em um bovídeo ou em que imunizar um indivíduo é vacinação contra esquistossomose em um bovídeo, e em que um ou mais antígenos compreendem um antígeno de esquistossomo.
14. Uso de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o antígeno de esquistossomo compreende um antígeno de Schistosoma japonicum, ou um fragmento antigênico do mesmo ou um polipeptídeo SjCTPI, um polipeptídeo SjCTPI-Hsp70, um polipeptídeo SjC23 e/ou um polipeptídeo SjC23-Hsp70, ou um fragmento antigênico do mesmo.
15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 14, caracterizado pelo fato de que a composição é para ser administrada como um reforço administrado após uma vacinação primária com uma vacina de DNA de plasmídeo SjCTPI-Hsp70.
16. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, caracterizado pelo fato de que ainda um ou mais agentes quimioterapêuticos antiesquistossomo é para ser administrado.
17. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, caracterizado pelo fato de que demonstra pelo menos 45% de eficácia na prevenção de infecção com um parasita esquistossomo.
18. Método, caracterizado pelo fato de que é para produzir a composição de vacina como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 9.
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