MXPA01004987A - Plantas que metabolizan fosfonato - Google Patents

Abstract

La invención se refiere en general a resistencia a herbicidas en las plantas y muy particularmente a una nueva clase de genes que metabolizan fosfonato, y a métodos para usar estos genes a fin de mejorar la tolerancia de la planta a herbicidas de fosfonato.

Description

c. / PLANTAS QUE ETABQLIZAN FOSFONATO REFERENCIA A SOLICITUDES ANTERIORES Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad para la Solicitud Provisional de E.U.A. No. de Serie 60/108,763, presentada el 17 de noviembre de 1998.

CAMPO DE LA INVENCIÓN En general, la presente invención se refiere a resistencia a herbicidas en las plantas, y más particularmente a una nueva clase de genes de metabolismo de fosfonato y a métodos para usar estos genes para mejorar la tolerancia de una planta a los herbicidas de fosfonato.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA ANTERIOR Las moléculas orgánicas que contienen fósforo pueden ser naturales o derivadas sintéticamente. Las moléculas orgánicas que contienen enlaces fósforo-carbono (C-P) también se encuentran naturalmente o como compuestos sintéticos, y con frecuencia no son degradadas rápidamente por medio de las rutas enzimáticas naturales, si es que son degradadas. Es así como organofosfonatos y fosfinatos sintéticos, compuestos que contienen un enlace directo carbono-fósforo (C-P), en lugar del enlace carbono-oxígeno-fósforo, mejor conocido, de los esteres de fosfato (Metcalf y otros, Gene 129:27-32, 1993), se han usado ampliamente como insecticidas, antibióticos y herbicidas (Chen y otros, J. Biol. Chem. 265:4461-4471 , 1990; Hildebrand y otros "The role of phosphonates in living systems", Hildebrand R.L., ed. páginas 5-29, CRC Press Inc., Boca Ratón Florida, 1983). Los fosfonatos son ubicuos en la naturaleza, y se encuentran solos y en una diversidad de estructuras macromoleculares en una variedad de organismos (Jiang y otros, J. Bacteriol. 177:6411-6421, 1995). La degradación de moléculas de fosfonato procede a través de varias rutas conocidas, una ruta de C-P Nasa, una ruta de fosfonatasa, y una ruta de hidrólisis C-N (Wanner, Biodegradation 5:175-184, 1994; Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,463,175, 1995). Se han caracterizado aislados bacterianos capaces de llevar a cabo estos pasos (Shinabarger y otros, J. Bacteriol. 168:702-707, 1986; Kishore y otros, J. Biol. Chem. 262:12,164-12,168, 1987; Pipke y otros, Appl. Environ. Microbiol. 54:1293-1296, 1987; Jacob y otros, Appl. Environ. Microbiol. 54:2953-2958, 1988; Lee y otros, J. Bacteriol. 174:2501-2510, 1992; Dumora y otros, Biochim. Biophys. Acta 997:193-198, 1989; Lacoste y otros, J. Gen. Microbiol. 138:1283-1287, 1992). Sin embargo, con la excepción de fosfonatasa y glifosato oxidasa (GOX), no se han caracterizado otras enzimas capaces de llevar a cabo estas reacciones. Se han enfocado varios estudios en la identificación de los genes requeridos para la degradación de fosfonatos por C-P Nasa. Wackett y otros (J. Bacteriol. 169:710-717, 1987), describieron amplia especificidad de substrato hacia degradación de fosfonato por Agrobacterium radiobacter, y utilización específica de glifosato como única fuente de fosfato. Shinabarger y otros, y Kishore y otros, describieron degradación del herbicida de fosfonato glifosato, a glicina y fosfato inorgánico en especies de Pseudomonas, por medio de C-P Nasa a través de un intermediario de sarcosina. Se había mostrado anteriormente que cepas B de E. coli eran capaces de utilizar fosfonato (Chen y otros), mientras que las cepas K-12 de E. coli fueron incapaces de degradar fosfonato. Sin embargo, después se observó que las cepas K-12 contienen una serie completa, aunque oculta, de genes capaces de utilizar fosfonato (ps/D o phn) (Makino y otros); como mutantes fueron seleccionados fácilmente por crecimiento en medio bajo en fosfato conteniendo metil- o etilfosfonato como única fuente de fósforo. Después se mostró que estas cepas K-12 adaptadas para crecer sobre metil- o etilfosfonato, eran capaces de utilizar otros fosfonatos como fuentes únicas de fósforo (Wackett y otros, J. Bacteriol. 169:1753-1756, 1987). Avila y otros (J. Am. Chem. Soc. 109:6758-6754, 1987) se interesaron en la evaluación mecanística de los procesos de biodegradación y destoxificación relacionados con aminometilfosfonatos, incluyendo la elucidación de los intermediarios, productos y mecanismos de los procesos de desfosforilación degradativa. Avila y otros estudiaron la formación de productos desfosforilados de la biodegradación de una variedad de substratos de aminofosfonato en cultivos de E. coli K-12 adaptados previamente a crecer sobre etilfosfonato. Además, Avila y otros utilizaron N-acetil-AMPA (N-acetil-amino-metil-fosfonato) como única fuente de fosfato en algunos de sus estudios para mostrar que el AMPA acetilado no era inhibidor de la degradación del enlace C-P. Además, Avila y otros notaron que el N-acetil-AMPA podía servir como la única fuente de fosfato durante el crecimiento de E. coli K-12; sin embargo, no observaron formación de N-acetil-AMPA cuando usaron AMPA como la única fuente de fosfato. Sus estudios indicaron que el AMPA no era un substrato para acetilación en E. coli. Chen y otros identificaron un locus funcional ps/D de E. coli B por clonación de complementación en una cepa K-12 de E. coli deficiente de utilización de fosfonato, lo cual permitió que la cepa K-12 utilizara fosfonato como la única fuente de fosfato (J. Biol. Chem. 265:4461-4471 , 1990). Chen y otros describieron así la secuencia de ADN del locus de complementación ps/'D, identificado en un fragmento ßamHI de 15.5 kb que contenía 17 marcos de lectura abiertos designados phnA-phnQ, que comprenden el operón phn de E. coli. Posteriormente se encontró que el operón oculto phn (ps/D) de E. coli contenía una inserción de 8 pares de bases en phnE. La desviación de marco resultante en phnE no sólo da como resultado el producto defectuoso del gen phnE, sino que también ocasiona aparentemente efectos polares sobre la expresión de genes en el extremo 3' dentro del operón, lo que impide la utilización de fosfonato (Makino y otros, J. Bacteriol. 173:2665-2672, 1991 ). Más precisamente, en el trabajo de Makino y otros se ha descrito que el operón contiene los genes phnC-phnP. Se ha dirigido investigación adicional para comprender la naturaleza de la función de cada uno de los genes dentro de este operón (Chen y otros, J. Biol. Chem. 265:4461-4471 , 1990; Makino y otros, J. Bacteriol. 173:2665-2672, 1991 ; Wanner y otros, FEMS Microbiol. Lett. 100:133-140, 1992; Metcalf y otros Gene 129:27-32, 1993; Ohtaki y otros, Actinomyceteol. 8:66-68, 1994). En todos estos esfuerzos, el gen phnO ha sido implicado como una proteína reguladora basada en su similitud con otras proteínas de unión de nucleótido que contienen motivos estructurales hélice-vuelta-hélice. Además, la mutagénesis de genes en el operón phn demostró que phnO no fue requerido para la utilización de fosfonato, sosteniendo adicionalnnente la función reguladora propuesta para este gen (Metcalf y otros, J. Bacteriol. 173:587-600, 1991 ), por lo menos para los fosfonatos probados. Se han identificado secuencias homologas a phn de otras bacterias, incluyendo un gen sustancialmente similar a phnO de E. coli, aislado de S. griseus usando secuencias de nucleótidos deducidas de las del gen phnO de E. col? (Jiang y otros, J. Bacteriol. 177:6411-6421 , 1991 ; McGrath y otros, Eur. J. Biochem. 234:225-230 (1995); Ohtaki y otros, Actinomycetol. 8:66-68 (1994)). Sin embargo, no se ha propuesto para phnO otra función diferente a la de un factor regulador. Una función de regulador para phnO en el operón de CP Nasa se ha citado nuevamente en una revisión reciente (Berlyn, Microbiol. Molec. Biol. Rev. 62:814-984, 1998). Los avances en biología molecular, y en particular en las ciencias de las plantas, en combinación con tecnología de ADN recombinante, han permitido la construcción de plantas recombinantes que contienen genes no nativos de importancia agrícola. Además, cuando se incorporan y expresan en una planta, dichos genes confieren convenientemente algún rasgo o característica benéfica a la planta recombinante. Uno de estos rasgos es la resistencia a herbicidas. Una planta recombinante capaz de crecer en presencia de un herbicida tiene una enorme ventaja sobre las especies susceptibles al herbicida. Además, las plantas tolerantes a herbicidas proveen un medio más efectivo en costo para la producción agrícola, reduciendo la necesidad de labranza para controlar malezas y plantas espontáneas. Por décadas se han usado herbicidas químicos para inhibir el metabolismo de plantas, particularmente para fines agrícolas, como un medio para controlar malezas o plantas espontáneas en campos de plantas de cultivo. Una clase de herbicidas que se ha visto particularmente efectiva para estos propósitos, es la de los conocidos como fosfonatos, o herbicidas de ácido fosfónico. El glifosato (N-fosfono-metil-glicina) es quizás el herbicida de fosfonato más satisfactorio desde el punto de vista agrícola. Se han construido plantas recombinantes que son tolerantes al herbicida de fosfonato, glifosato. Cuando se aplica a las plantas, el glifosato es absorbido en los tejidos vegetales e inhibe la formación de aminoácidos aromáticos por medio de una inhibición de la actividad de la enzima ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintetasa, localizada en plástidos, también conocida como EPSP sintetasa o EPSPS, una enzima que se considera generalmente como única de plantas, bacterias y hongos. Se han transformado plantas recombinantes con una enzima EPSPS bacteriana que es mucho menos sensible a inhibición de glifosato. Por lo tanto, las plantas que expresan esta EPSPS bacteriana son menos sensibles al glifosato, y frecuentemente son caracterizadas como tolerantes a glifosato. Por lo tanto, se pueden aplicar cantidades más grandes de glifosato a tales plantas recombinantes, asegurando la muerte de plantas que son susceptibles o sensibles al herbicida. Sin embargo, se han identificado otros genes que, cuando son transformados en el genoma de una planta, codifican enzimas que también proveen tolerancia a glifosato. Una de tales enzimas se ha descrito como GOX, o glifosato oxidorreductasa. GOX funciona para proveer protección a plantas del herbicida de fosfonato glifosato, catalizando la degradación de glifosato en ácido aminometilfosfónico (AMPA) y glioxilato. El AMPA producido como resultado de la degradación de glifosato puede ocasionar blanqueo y crecimiento achaparrado o disminuido de la planta, entre otras características indeseables. Muchas especies de plantas también son sensibles a AM^ aplicado de manera exógena, así como a AMPA endógeno producido como resultado de la degradación del herbicida glifosato mediada por GOX. No se ha descrito método que mencione la protección de plantas de aplicaciones de herbicidas de fosfonato tales como AMPA. Barry y otros (patente de E.U.A. No. 5,633,435) describen genes que codifican enzimas EPSP sintetasa que son útiles para producir bacterias y plantas transformadas que son tolerantes a glifosato como herbicida, así como el uso de tales genes como un método para controlar selectivamente malezas en un campo de cultivo transgénico plantado. Barry y otros (patente de E.U.A. No. 5,463,175) describen genes que codifican enzimas glifosato oxidorreductasa (GOX) útiles en la producción de bacterias y plantas transformadas que degradan herbicida de glifosato, así como también plantas de cultivo que son tolerantes a glifosato como herbicida. Barry y otros (patente de E.U.A. No. 5,463,175) describen la formación de AMPA como un producto de metabolismo de glifosato mediado por GOX. Se ha reportado que AMPA es mucho menos fitotóxico que el glifosato para la mayoría de especies vegetales (Franz, 1985), pero no para todas las especies vegetales (Maier, 1983; Tanaka y otros, 1986). La coexpresión de un gen que codifica una proteína capaz de neutralizar o metabolizar AMPA producido por degradación de glifosato, produciría un mejoramiento sustancial sobre el uso de GOX sola. Así, un método para superar la sensibilidad a la formación de AMPA como resultado de degradación de glífosato, o un método para resistencia a AMPA cuando se usa como un herbicida o como un agente selectivo en métodos de transformación de plantas, sería útil para proveer tolerancia incrementada o mejorada en plantas transgénicas y en otros organismos sensibles a dichos compuestos. Se ha descrito el uso de glifosato como un gametocida químico (patente de E.U.A. No. 4,735,649). Ahí se describe que el glifosato, bajo condiciones óptimas, puede destruir alrededor de 95% de gametos masculinos, dejando aproximadamente 40-60% de los gametos hembra susceptibles de fertilización. Además, se observó típicamente un efecto de achaparramiento a los niveles de aplicación descritos, mostrado por una reducción del tamaño de-te planta y por una cantidad menor de clorosis. De esta manera, una desventaja principal del uso de glifosato como un gametocida, como es generalmente válido para la mayoría de gametocidas, es el efecto secundario fitotóxico que se origina de la falta de selectividad suficiente para gametos masculinos. Estas manifestaciones fitotóxicas pueden ser efectuadas por producción de AMPA en plantas transgénicas que expresan GOX después de tratamiento con glifosato. Por lo tanto, sería conveniente proveer un método para prevenir el efecto de achaparramiento y clorosis como efectos secundarios del uso de glifosato como gametocida en plantas transgénicas que expresan GOX. Además, un método más efectivo destruiría óptimamente más de 95% de gametos masculinos, o impediría que los gametos masculinos maduren, y dejaría más de 60% de gametos hembra sustancialmente sin afectar. Se considera que la coexpresión de GOX específica de tejido con un gen de transacilasa que codifica una enzima capaz de N-acilación de AMPA, lograría este objetivo. Se ha descubierto ahora que el gen phnO de E. coli codifica una enzima que tiene actividad transacilasa, aciltransferasa o Acil-CoA transacilasa en donde un substrato preferido es un fosfonato que exhibe una amina terminal, y en particular ácido amino-metil-fosfónico (AMPA). La transferencia de un grupo acilo de una Acil-CoA a la amina terminal libre de AMPA, da como resultado la formación de AMPA N-acilada. No se sabe que las plantas acilen AMPA en cantidad mayor, y se ha visto que algunas plantas son sensibles a AMPA e insensibles a acil-AMPA. Así, la expresión de phnO en plantas sería de utilidad para incrementar la tolerancia al herbicida de fosfonato, particularmente cuando se usa AMPA como herbicida o agente selectivo en la transformación de la planta, y más particularmente cuando se usa glifosato como herbicida en combinación con plantas recombinantes que expresan un gen de GOX.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Por lo tanto, brevemente, la presente invención está dirigida a una composición de material que comprende una clase novedosa de genes que codifican proteínas capaces de N-acilar compuestos de fosfonato, y a métodos de uso de estos genes y proteínas codificadas para mejorar la tolerancia de las plantas a herbicidas de fosfonato. La presente invención también está dirigida a un método para seleccionar plantas recombinantes y microbios transformados con genes que codifican proteínas que son capaces de N-acilar compuestos de fosfonato, y a péptidos que son capaces de N-acilar el compuesto ácido N-amino-metil-fosfónico (N-AMPA) y otros compuestos de fosfonato relacionados. Además, la presente invención también está dirigida a un método de uso de plantas transformadas con genes transacilasa para impedir autofertilización, o a un método para incrementar la heterofertilización en plantas.

Entre las varias ventajas logradas por la presente invención, por lo tanto, se puede notar la provisión de plantas recombinantes tolerantes a herbicida, transformadas establemente, que tienen en sus genomas una secuencia de polinucleótido insertada que codifica un producto de gen deseado, preferiblemente una enzima N-aciltransferasa. La secuencia de polinucleótido está compuesta preferiblemente de un cassette que contiene una secuencia de promotor que es funcional en plantas y que está ligada operativamente en 5' a una secuencia de ADN estructural que, cuando se transcribe a una secuencia de ARN, codifica un péptido de enzima N-aciltransferasa. La secuencia promotora puede ser heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural, y causa suficiente expresión de la enzima transferasa en tejido vegetal para proveer tolerancia a herbicida a la planta transformada con la secuencia de polinucleótido. De preferencia, la secuencia estructural está ligada operativamente en 3' a una secuencia de poliadenilación no traducida en 3' que funciona en plantas, y que cuando se transcribe en ARN junto con la secuencia estructural, causa la adición de una secuencia de nucleótido poliadenilado en el extremo 3' del ARN transcrito. La expresión de la secuencia de ADN estructural produce suficientes niveles de la enzima aciltransferasa en el tejido de la planta para incrementar la tolerancia de la planta transformada al herbicida. Como una modalidad adicional, la secuencia de ADN estructural puede contener también una secuencia 5' adicional que codifica una secuencia de péptido amino terminal que funciona en plantas para dirigir el péptido producido de la traducción de la secuencia estructural, hacia un organelo intracelular. Preferiblemente, esta secuencia codificadora adicional está ligada en marco a la secuencia estructural que codifica la enzima aciltransferasa. La secuencia de péptido amino terminal puede ser un péptido de señal o un péptido de tránsito. El organelo ¡ntracelular puede ser un cloroplasto, una mitocondria, una vacuola, retículo endoplásmico u otra de tales estructuras. La secuencia de ADN estructural también puede estar ligada a secuencias 5' tales como las secuencias guía no traducidas (UTL's), secuencias de intrón o combinaciones de estas secuencias, y similares, lo cual puede servir para incrementar la expresión del producto de gen deseado. También se pueden introducir secuencias de intrón dentro de la secuencia de ADN estructural que codifica la enzima aciltransferasa. Alternativamente, la transformación de cloroplasto o plástido puede dar como resultado la localización de una secuencia codificadora de aciltransferasa y enzima al cloroplasto o plástido, eliminando la necesidad de transformación del genoma nuclear, la expresión del genoma nuclear y la dirección subsecuente del producto del gen hacia un organelo subcelular. Preferiblemente, la planta recombinante expresa un gen que codifica una enzima que cataliza la formación de AMPA. La formación de AMPA se puede originar del metabolismo de un precursor de ocurrencia natural, de un precursor tal como glifosato provisto a la planta, o se puede originar de la formación de AMPA a través de alguna ruta catabólica. La coexpresión de GOX junto con la expresión de AMPA aciltransferasa provee una planta que es sorprendentemente más resistente a ciertos herbicidas de fosfonato. Sin embargo, una modalidad que permita que las plantas transformadas con solo una N-aciltransferasa crezcan en presencia de AMPA o similar, o compuestos relacionados, proveería un método selectivo útil para identificar plantas, callos o tejidos embriogénicos transformados genéticamente. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para incrementar o mejorar selectivamente la tolerancia a un herbicida de una planta recombinante que tiene insertado en su genoma de núcleo, cloroplasto, plástido o mitocondria, un cassette comprendido de una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima N-acil-transferasa. Una modalidad adicional abarca el mejoramiento de un método para incrementar selectivamente la tolerancia a herbicida en una planta transformada que expresa un gen GOX que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa expresada en las mismas plantas en las cuales se produce una enzima aciltransferasa. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un método para producir una planta transformada genéticamente, tolerante a herbicida, insertando en el genoma de una célula de una planta un cassette que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una enzima N-acil-transferasa. Una modalidad adicional abarca el mejoramiento de un método para producir una planta transformada genéticamente, tolerante a herbicida, a partir de una célula de una planta que expresa un gen GOX que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa expresada en la misma célula de la planta en la cual se produce una enzima aciltransferasa. En cualquiera de las modalidades anteriores, la planta o la célula de la planta tolerante a herbicida, se puede seleccionar del grupo que consiste de maíz, trigo, algodón, arroz, soya, remolacha, cañóla, lino, cebada, colza oleaginosa, girasol, papa, tabaco, tomate, alfalfa, lechuga, manzana, álamo, pino, eucalipto, acacia, liquidámbar, ocozol, pino radiata, pino del incienso, abeto rojo, teca, alfalfa, trébol y otros cultivos de forraje, pastos, palma de aceite, caña de azúcar, plátano, café, te, cacao, manzana, nuez, almendra, uva, cacahuate, legumbres, petunia, caléndula, vinca, begonia, geranio, pensamiento, impaciente, avena, sorgo y mijo. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se provee un péptido capaz de N-acilar el compuesto ácido N-aminometilfosfónico (N-AMPA o AMPA) u otro compuesto semejante capaz de causar efectos fitotóxicos cuando se aplica o introduce al metabolismo de la planta, o cuando es producido por el metabolismo de la planta. Uno de tales péptidos es ácido N-aminometilfosfónico transacilasa (AAT) derivado de la expresión de una secuencia del gen estructural phnO de E. coli. También se contemplan otros péptidos de estructura y función similares a las del producto del gen phnO de E. coli. Otro aspecto de la presente ¡nvención es la provisión de un método para seleccionar células transformadas con un vector que contiene un gen de aciltransferasa que expresa una enzima capaz de N-acilar AMPA y compuestos semejantes. El método incluye los pasos de transformar una población de células con el vector y aislar y purificar las células transformadas de las células no transformadas en la población, después de seleccionar las células transformadas por medio de incubación en presencia de cantidades de AMPA suficientes para ser inhibidoras del crecimiento o viabilidad de cualquier célula no transformada. Las células transformadas pueden ser bacterianas, vegetales o fúngicas. Las células bacterianas pueden ser miembros de cualquiera de las familias abarcadas por Enterobacteriaceae, Mycobacteraceae, Agrobacteraceae y Actinobacteraceae, entre otras. Las células fúngicas pueden ser miembros de Ascomycota, Basidiomycota, etc. Las células vegetales pueden derivar de cualquier miembro de la familia Plantae. Una modalidad adicional de la presente invención provee un método para producir una planta a partir de un tejido, una célula u otra parte de una planta derivada de una planta transformada con un gen de aciltransferasa, un gen phnO, un gen gox, un gen con el cual son producidos péptidos de GOX y aciltransferasa de una fusión de traducción o una fusión de transcripción, o un gen policistrónico que codifica péptidos de GOX y aciltransferasa. Una modalidad adicional de la presente invención provee un método para producir plantas que expresan todo o parte de un gen phnO o un gen de aciltransferasa similar, o un gen de GOX, como un gen de antisentido, de una manera específica de tejido. Otros aspectos también incluyen reactivos como anticuerpos, dirigidos contra AMPA aciltransferasa, y polinucleótidos, para usar en la identificación de secuencias de genes de aciltransferasa. Estos reactivos se pueden incluir en equipos que contienen AMPA aciltransferasa, polinucleótidos que son complementarios a una secuencia de gen de AMPA aciltransferasa, polinucleótidos para usar en ampliación térmica de una secuencia de gen de AMPA aciltransferasa, anticuerpos dirigidos contra AMPA aciltransferasa para la detección de AMPA aciltransferasa en el laboratorio o en el campo, y cualquier otro reactivo necesario para usar en el equipo, y para usar en otras pruebas contempladas en la presente. Un objeto adicional de la presente ¡nvención es proveer un método para usar herbicidas de fosfonato como agentes de hibridación química. El método permite efectos gametocidas efectivos y la producción de plantas masculinas estériles. Dichas plantas se pueden construir por ingeniería para que gox o phnO, o gox y phnO, sean expresados deficientemente en tejidos de planta requeridos para la reproducción, causando sensibilidad a compuestos fitotóxicos aplicados que inhiben la formación de estructuras maduras de gametos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra un cromatograma de HPLC de detección del isótopo [14C] que representa una muestra de una solución de dosificación que contiene solo [14C]glifosato (1 1.3 minutos, 98.8%), y vestigios de [UC]AMPA (5.8 minutos, 0.16%) y un material [14C] no identificado (10.2 minutos, 1 %). La figura 2 ilustra un perfil de HPLC de una mezcla de estándares de los metabolitos radioactivos observados [14C]AMPA, [14C]glifosato y N-acetil-[14C]-AMPA, así como la impureza identificada como N-acetil-N-metil-[14C]-AMPA. La figura 3 ilustra un perfil representativo de HPLC de un extracto de un tejido de callo de maíz transformado con GOX y AMPA acetiltransferasa, y tratado con [14C]glifosato. Los picos indican [14C]glifosato (10.8 minutos, 92.5% del total observado de [14C]), [14C]-AMPA, generado principalmente por degradación de glifosato mediada por GOX (5.98 minutos, 1.71 % del total observado de [14C]), y N-acetil-[14C]-AMPA, producido de la acetilación de [14C]-AMPA mediada por AMPA aciltransferasa recombinante expresada dentro del tejido del callo (13.29 minutos, 4.54% del total observado de [14C]). La figura 4 ¡lustra el plásmido pMON17261. La figura 5 ¡lustra el plásmido pMON32571. La figura 6 ¡lustra el plásmido pMON32936. La figura 7 ¡lustra el plásmido pMON32946.

La figura 8 ilustra el plásmido pMON32948.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La siguiente descripción detallada de la invención se provee para ayudar al experto en la materia en la práctica de la presente ¡nvención. A pesar de ello, no se debe considerar que la siguiente descripción detallada limita la presente invención, ya que las personas con conocimientos medios en la materia pueden hacer modificaciones y variaciones de las modalidades aquí descritas, sin apartarse del espíritu y alcance de la presente invención. Muchas palabras y frases son bien conocidas en la técnica de biología molecular, microbiología, química de proteínas y ciencias de las plantas, y tienen generalmente su significado simple y ordinariamente entendido, de otra forma se toma del contexto. Sin embargo, las siguientes palabras y frases, como se usan aquí, tienen los significados señalados generalmente a continuación. AMPA aciltransferasa. Como se usa aquí, AMPA aciltransferasa se refiere a una enzima que funciona en la transferencia de un grupo químico acilo de un compuesto portador de acilo tal como coenzima A, que es bien conocido y abreviado en los campos de la biología y la química como CoA. En particular, una AMPA aciltransferasa transfiere un grupo químico acilo de un portador de acilo al grupo amino libre de aminometilfosfonato, muy conocido por ser un subproducto del metabolismo de glifosato mediado por glifosato oxidorreductasa. Se ha mostrado aquí que la AMPA aciltransferasa (AAT), que aquí puede ser referida también como AMPA acetiltransferasa, AMPA transacilasa o acetil-AMPA sintetasa (AAS), puede tener actividad de acetiltransferasa, actividad de propionil transferasa, actividad de malonil transferasa y actividad de succinil transferasa. De esta manera, cualquier equivalente biológicamente funcional de estos compuestos (acetilo, propionilo, malonilo o succinilo) que sirve como una forma de substrato portadora de acilo capaz de funcionar con una enzima AMPA aciltransferasa, está dentro del alcance de la presente invención. Una AMPA aciltransferasa que ha sido identificada, y que se ha mostrado como ejemplo aquí que funciona de acuerdo con la descripción contenida en la presente, ha sido referida previamente en la técnica como PhnO, una proteína codificada por el gen phnO dentro del operón phn de E. coli. Equivalentes biológicamente funcionales. Como se usa aquí, tales equivalentes con respecto a las proteínas AMPA-aciltransferasa de la presente invención, son péptidos, polipéptidos y proteínas que contienen una secuencia o porción que exhibe similitud de secuencia con los péptidos novedosos de la presente invención, tales como PhnO, y que exhiben propiedades funcionales iguales o similares a las de los polipéptidos descritos en la presente, incluyendo actividad transacilasa. Los equivalentes biológicos también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas que reaccionan, esto es, se unen específicamente, con anticuerpos desarrollados contra PhnO, y que exhiben la misma actividad transacilasa, o similar, incluyendo anticuerpos tanto monoclonales como policlonales. Equivalentes biológicamente funcionales, como se usa aquí con respecto a los genes que codifican aciltransferasas, son polinucleótidos que reaccionan con las secuencias de polinucleótido contempladas y descritas en la presente, es decir, que son capaces de hibridar con una secuencia que es un polinucleótido (o que es complementaria a dicho polinucleótido) que codifica una aciltransferasa que funciona en la transacilación de AMPA, o que codifica proteínas aciltransferasa sustancialmente similares a las contempladas y descritas en la presente. Una proteína que es sustancialmente similar a las proteínas descritas en la presente es un equivalente biológicamente funcional que exhibe propiedades funcionales ¡guales o similares a las de los polipéptidos descritos en la presente, incluyendo tolerancia a herbicida mejorada o resistencia a herbicida mejorada. Los péptidos biológicamente equivalentes contienen una secuencia o porción tal como uno o más sitios activos, que exhiben similitud de secuencia con los péptidos novedosos de la presente invención, tales como PhnO. Los equivalentes biológicos también incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas que reaccionan, es decir, que se unen específicamente, con anticuerpos desarrollados contra PhnO y secuencias de péptido semejantes a PhnO, y que exhiben un mejoramiento igual o similar de tolerancia o resistencia a herbicida, incluyendo anticuerpos tanto monoclonales como policlonales.

Localizado en cloroplasto o plástido. Como se usa aquí, se refiere a una molécula biológica, ya sea polinucleótido o polipéptido, que está ubicada dentro del cloroplasto o plástido de tal manera que la molécula está aislada del medio citoplásmico celular, y funciona dentro del cloroplasto o citoplasma de plástido para proveer los efectos reclamados en la presente invención. La localización de una molécula biológica hacia el cloroplasto o plástido puede ocurrir, para los polinucleótidos, por medios mecánicos artificiales tales como electroporación, microinyección mecánica o por medio de bombardeo de microproyectil recubierto con polinucleótido; o para los polipéptidos, por medios secretores o de importación, en donde se usa una secuencia de péptido natural, no natural o heteróloga de dirección a plástido o cloroplasto, la cual funciona para dirigir, insertar, ayudar o localizar un polipéptido enlazado hacia un cloroplasto o plástido. Evento. Se refiere a una planta o tejido vegetal transgénico derivado de la inserción de ADN ajeno en uno o más sitios únicos en el ADN nuclear, de mitocondria, plástido o cloroplasto. Expresión. La combinación de procesos ¡ntracelulares, incluyendo transcripción, traducción, y otras funciones de procesamiento y estabilización de proteína intracelular y ARN, a los que es sometida una molécula de ADN de codificación tal como un gen estructural, para producir un producto de gen. Gen no natural. Un gen de aciltransferasa no natural de la presente invención contiene información genética que codifica una secuencia de ARN funcional de una planta, pero es preferiblemente un gen que codifica una proteína aciltransferasa, ya sea natural o una variante de una proteína natural, preparado de una manera que incluye cualquier clase de aislamiento o purificación genética. Esto incluye aislamiento del gen de su estado de ocurrencia natural, manipulación del gen por ejemplo por modificación de codón, mutagénesis específica de sitio, truncado, introducción o remoción de sitios de corte de endonucleasas de restricción; síntesis o resíntesis de una secuencia natural que codifica una aciltransferasa de la presente invención por medio de metodologías in vitro tales como métodos de síntesis química de fosforamidita, etc., métodos de ampliación térmica tales como reacción en cadena de polimerasa, reacción en cadena de ligasa, reacción inversa de polimerasa y semejantes, etc., y cualquier otro método de manipulación o aislamiento. Ligado operativamente. Segmentos de ácido nucleico unidos en marco de tal manera que las propiedades de uno afectan la expresión de otro. Por ejemplo, una secuencia de promotor que tiene propiedades de carga de polimerasa, unión e inicio de funciones de transcripción, influye en la expresión de secuencias que están ligadas al promotor. Regiones codificadoras expresables en planta. Regiones codificadoras que se pueden expresar en una planta, esto es, se pueden transcribir y/o traducir en una planta, porque contienen elementos reguladores de planta típicos para facilitar la expresión de un gen de interés.

Péptido de tránsito de plástido. Cualquier secuencia de aminoácidos útil para dirigir o localizar un aminoácido ligado, tal como una proteína de fusión, hacia un compartimiento u organelo subcelular tal como un plástido o cloroplasto. Las secuencias de aminoácidos que facilitan la entrada hacia una mitocondria, no son completamente diferentes de los péptidos de tránsito de plástido, y también se describen como péptidos de tránsito, pero no funcionan adecuadamente para dirigir secuencias de péptido hacia organelos de plástido o cloroplasto. Progenie de una planta transgénica incluye cualquier vastago o descendiente de la planta transgénica que contiene por lo menos un gen heterólogo o transgen, o cualquier planta subsecuente derivada de la planta transgénica que tiene el transgen en su linaje. La progenie no está limitada a una generación, sino que abarca los descendientes de la planta transgénica siempre que contengan o expresen el transgen deseado. Las semillas que contienen embriones transgénicos así como también las semillas de las plantas transgénicas y sus vastagos o descendientes, son también partes importantes de la invención. Las células, tejidos, semillas o plantas transgénicas que contienen un transgen deseado, son la progenie de las células, tejido o planta originales. Promotor. Un sitio de reconocimiento sobre una secuencia de ADN o grupo de secuencias de ADN que provee un elemento de control de expresión para un gen estructural, y al cual se une específicamente ARN polimerasa e inicia la síntesis de ARN (transcripción) de ese gen.

Ro es la planta regenerante primaria derivada de la transformación de tejido o células vegetales en cultivo. La progenie o generaciones subsecuentes derivadas de Ro son referidas como Ri (primera generación), R2 (segunda generación), etc. Regeneración. El proceso de producción de una planta completa desarrollando una planta a partir de una célula de planta o tejido de planta (por ejemplo, protoplasto o explante vegetal). Secuencia codificadora estructural. Se refiere a una secuencia de ADN que codifica un péptido, polipéptido o proteína, que es producida después de la transcripción de la secuencia codificadora estructural a ARN mensajero (ARNm), seguido por traducción del ARNm para producir el péptido, polipéptido o producto de proteína deseado. Gen estructural. Un gen que es expresado para producir un polipéptido. Homología sustancial. Como se usa aquí, homología sustancial se refiere a secuencias de ácido nucleico que son de aproximadamente 40 a aproximadamente 65 por ciento homologas, de aproximadamente 66 por ciento homologas a aproximadamente 75 por ciento homologas, de aproximadamente 76 por ciento homologas a aproximadamente 86 por ciento homologas, de aproximadamente 87 por ciento homologas a aproximadamente 90 por ciento homologas, aproximadamente de 91 por ciento homologas a aproximadamente 95 por ciento homologas, y aproximadamente de 96 por ciento homologas a aproximadamente 99 por ciento homologas, a una secuencia de polinucleótido de referencia, tal como una secuencia del gen phnO de E. coli. Una primera molécula de polinucleótido que es sustancialmente homologa a una segunda molécula de polinucleótido, es el segundo polinucleótido, o es complementaria al segundo polinucleótido, de tal manera que la primera molécula de polinucleótido hibrida con la segunda molécula de polinucleótido o su secuencia complementaria bajo condiciones severas de hibridación, siendo definida la severidad como la concentración óptima de sal y la temperatura requerida para llevar a cabo la hibridación de un primer polinucleótido con un segundo polinucleótido. Los métodos para variar la severidad son bien conocidos en la técnica, pero se puede tener una referencia en Sambrook y otros, Eds., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición, 1989, Cold Spring Harbor Press; o Ausubel y otros, Eds. "Short Protocols in Molecular Biology", Tercera edición, 1995, John Wiley & Sons, Inc. Los polipéptidos que se consideran dentro del alcance de la presente invención, son los que son aproximadamente de 40 a aproximadamente 65 por ciento similares, de aproximadamente 66 por ciento similares a aproximadamente 75 por ciento similares, de aproximadamente 76 por ciento similares a aproximadamente 86 por ciento similares, de aproximadamente 87 por ciento similares a aproximadamente 90 por ciento similares, de aproximadamente 91 por ciento a aproximadamente 95 por ciento similares, y de aproximadamente 96 por ciento similares a aproximadamente 99 por ciento similares, a una secuencia de polipéptido de referencia, preferiblemente a una secuencia de péptido PhnO de E. coli.

Terminador. Como se usa aquí con respecto a secuencias específicas de planta destinadas a expresión en planta, la secuencia del extremo 3' de terminación de transcripción y poliadenilación. Transformación. Es un proceso de introducción de una secuencia exógena de polinucleótido, tal como un plásmido o vector viral o una molécula de polinucleótido recombinante, en una célula, protoplasto, plástido o cloroplasto, o mitocondria, en donde la secuencia de polinucleótido exógeno es incorporada en una secuencia de polinucleótido endógeno contenida dentro de la célula, o es capaz de replicación autónoma. Una célula transformada es una célula que ha sido alterada por la introducción de una o más moléculas endógenas de polinucleótido en esa célula. Una célula transformada establemente es una célula transformada en la que se ha incorporado todo o parte del polinucleótido exógeno en el material genómico del núcleo, mitocondria, plástido o cloroplasto de la célula, de tal manera que el polinucleótido exógeno confiere algún rasgo o rasgos genotípicos o fenotípicos a esa célula y a la progenie de la célula transformada, medida mediante la detección del polinucleótido introducido exógenamente, el ARNm o el producto de proteína del polinucleótido exógeno, un metabolito no producido o encontrado normalmente dentro de la célula en ausencia del polinucleótido exógeno, o una inspección visual de la célula, tejido vegetal o plantas derivadas de la célula transformada. Transgen. Un transgen es una secuencia de polinucleótido que ha sido transferido a una célula, y que comprende un cassette de expresión que contiene una secuencia de gen estructural que codifica un polipéptido deseado. El transgen es capaz de expresarse cuando está en una célula, tejido u organismo transformado receptor. Este puede incluir un plásmido completo u otro vector, o puede incluir simplemente la secuencia codificadora funcional de la planta del polinucleótido transferido. Una célula transgénica es cualquier célula derivada o regenerada de una célula transformada, incluyendo la célula transformada inicial. Células transgénicas ejemplares incluyen tejido de callo de plantas derivados de una célula de planta transformada y células particulares tales como células de hoja, raíz, tallo, meristemo y otras células de tejido somáticas, o células de línea reproductora o germinal o células tapétales, obtenidas de una planta transgénica transformada establemente. Un evento transgénico es una planta o progenie de la misma derivada de la inserción de por lo menos un polinucleótido exógeno en el genoma nuclear, plastídico o mitocondrial de una célula o protoplasto vegetal. Una planta transgénica es una planta o una progenie de la misma que ha sido modificada genéticamente para contener y expresar secuencias de polinucleótido heterólogas como proteínas o como moléculas de ARN o ADN que no eran previamente parte de la composición de la planta. Como se ejemplifica aquí específicamente, una planta transgénica de algodón, por ejemplo, es modificada genéticamente para contener y expresar por lo menos una secuencia de ADN heterólogo ligada operativamente a, y bajo el control regulador de, secuencias de control de transcripción y traducción que funcionan en células o tejido de plantas, o en plantas completas. Una planta transgénica también puede ser referida como una planta transformada. Una planta transgénica también se refiere a la progenie de la planta transgénica inicial en donde esa progenie contiene, y es capaz de expresar, la secuencia codificadora heteróloga bajo el control regulador de las secuencias de control de transcripción y traducción expresables en planta que se describen en la presente. Una planta transgénica puede producir flores, semillas, bulbos, raíces, tubérculos, fruta, polen y similares transgénicos, y se puede cruzar por medios reproductores convencionales con líneas compatibles de plantas para producir plantas transgénicas híbridas. Vector. Una molécula de ADN u otro polinucleótido capaz de replicarse en una célula hospedera y/o a la cual se puede ligar operativamente otro ADN u otra secuencia de polinucleótido para llevar a cabo replicación de la secuencia ligada. Un plásmido es un vector ejemplar. De acuerdo con la presente invención, se ha descubierto que las plantas pueden producir un compuesto fitotóxico cuando se transforman con ciertos genes que codifican enzimas capaces de degradar glifosato. En particular, el metabolismo de glifosato mediado por glifosato oxidorreductasa (GOX) produce un compuesto fitotóxico identificado como N-aminometil-fosfonato (AMPA). Otros estudios han mostrado que un derivado N-acilado de AMPA, N-acil-aminometil-fosfonato (N-acil-AMPA o acil-AMPA) es mucho menos fitotóxico para la mayoría de las especies de plantas. Se han identificado enzimas que son capaces de modificar covalentemente AMPA mediante un mecanismo de acilación, dando como resultado la formación de N-acil-AMPA. Una enzima en particular ocasiona que el AMPA aplicado exógenamente sea N-acetilado. En plantas que expresan esta enzima junto con GOX, no se observan los efectos fitotóxicos de AMPA. Las invenciones contempladas en la presente toman ventaja de cassettes de polinucleótido recombinante comprendidos de elementos para regular la expresión de genes, en los cuales se pueden insertar secuencias tales como genes estructurales que codifican proteínas útiles. La inserción de tales secuencias en un cassette de expresión se realiza preferiblemente usando endonucleasas de restricción bien conocidas en la técnica; sin embargo se conocen otros métodos para inserción. Por ejemplo, los métodos de recombinación específica de sitio son efectivos para insertar las secuencias deseadas en tales cassettes de expresión. Los cassettes de expresión contienen por lo menos un promotor operable en planta para usar en el comienzo de la producción de una molécula de ARN mensajero del cual se traduce la proteína útil. Los cassettes también contienen secuencias operables en planta, identificadas como secuencias 3', que funcionan en la terminación de la transcripción y proveen secuencias no traducidas que son 3'-poliadeniladas. Así, un cassette de expresión destinado a usarse en plantas, contendría por lo menos una secuencia de promotor ligada en su extremo 3' con una secuencia de terminación de transcripción y poliadenilación 3'. Probablemente, está presente una secuencia de policlonación o secuencia enlazadora que contiene uno o más sitios únicos de corte de endonucleasa de restricción, haciendo puente entre el promotor y la secuencia 3' para la inserción conveniente de secuencias de gen estructural y otros elementos. Un cassette de expresión destinado a usar en plantas también contiene, de preferencia, una secuencia 5' no traducida insertada entre el promotor y la secuencia 3'. Se ha visto que las secuencias 5' no traducidas (UTL's) incrementan la expresión de genes en plantas. También se contemplan los intrones como secuencias que pueden estar presentes en los cassettes de expresión de la presente invención. También se ha mostrado que la presencia de intrones operables en planta, en particular en el maíz, incrementa la expresión de genes en ciertas especies de plantas. Los intrones pueden estar presentes en un cassette de expresión en varias posiciones a lo largo de la secuencia del cassette. Esto puede incluir posiciones entre el promotor y la secuencia de terminación 3' y/o dentro de un gen estructural. Puede haber más de un intrón presente en un cassette de expresión; sin embargo, para los fines de las invenciones contempladas aquí, se prefiere que los intrones estén presentes cuando los cassettes de expresión sean usados en plantas monocotiledóneas y tejidos vegetales. Las secuencias ¡ncrementadoras son también muy conocidas en la técnica y pueden estar presentes, aunque no necesariamente, como una parte de un cassette de expresión, ya que se sabe que las secuencias incrementadoras funcionan cuando están presentes en el extremo 3' o en el extremo 5', o incluso a grandes distancias de un promotor que maneja la expresión de un gen de interés. La expresión de un gen localizado en el genoma nuclear de la planta y que existe en forma de ADN de doble cadena, incluye transcripción para producir un transcrito primario de ARN mensajero (ARNm) de una cadena del ADN, por medio de la enzima ARN polimerasa, y el procesamiento posterior del transcrito primario de ARNm dentro del núcleo. Este procesamiento incluye una secuencia de polinucleótido 3' no traducida, que añade nucleótidos de poliadenilato al extremo 3' del ARN. La transcripción de ADN en ARNm es regulada por una secuencia de ADN referida usualmente como el "promotor". El promotor comprende una secuencia de bases que señaliza a ARN polimerasa a asociarse con el ADN e iniciar la transcripción de ARNm usando la cadena de ADN molde para hacer una cadena correspondiente complementaria de ARN. Los expertos en la materia reconocerán que hay varios promotores que son activos en células de planta, y se han descrito en la literatura. Tales promotores se pueden obtener de plantas, virus de plantas o microbios que son connensales, saprofíticos, simbióticos o patógenos de las plantas, e ¡ncluyen sin limitación, los promotores nopalina sintetasa (NOS) y octopina sintetasa (OCS) (que son portados en plásmidos inductores de tumor de Agrobacterium tumefaciens), los promotores 19S y 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bifosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido de planta muy abundante), el promotor Act 1 de arroz, el promotor 35S de virus de mosaico de escrofularia (FMV), el promotor de virus de ADN baciliforme de caña de azúcar, el promotor de ubiquitina, el promotor de virus de rayas cloróticas de cacahuate, el promotor de virus de mancha amarilla de cornalina, el promotor de proteína de unión de clorofila a/b, y los promotores de incremento de meristemo Act2, Actd, Act11 y EF1a, y similares. Todos estos promotores se han usado para crear varios tipos de construcciones de ADN que han sido expresadas en plantas (véase, por ejemplo, McEIroy y otros, 1990; Barry y Kishore, patente de E.U.A. No. 5,463,175) y que están dentro del alcance de la presente invención. También se contemplan promotores específicos de cloroplasto y plástido o promotores funcionales de plástido, y promotores operables en cloroplasto o plástido. Se prefiere que el promotor particular seleccionado sea capaz de ocasionar suficiente expresión en planta para producir una cantidad efectiva de aciltransferasa y hacer a una planta sustancialmente tolerante a herbicidas de fosfonato y a productos del metabolismo del herbicida de fosfonato. La cantidad de aciltransferasa requerida para proveer la tolerancia deseada puede variar con las especies de la planta. Un grupo de promotores preferidos es el de los promotores constitutivos tales como los promotores CaMV35S o FMV35S que producen altos niveles de expresión en la mayoría de los órganos vegetales. Versiones incrementadas o duplicadas de los promotores CaMV35S y FMV35S son particularmente útiles en la práctica de esta invención (Kay y otros, 1987; Rogers, patente de E.U.A. No. 5,378,619). Además puede ser preferible llevar a cabo la expresión del gen de aciltransferasa en tejidos específicos de la planta, tales como hoja, tallo, raíz, tubérculo, semilla, fruto, etc., y el promotor elegido debe tener la especificidad deseada de tejido y desarrollo. Por lo tanto, se debe optimizar la función del promotor seleccionando el promotor con las capacidades de expresión en tejido deseadas y fuerza de promotor aproximada, y seleccionar un transformante que produzca la tolerancia deseada al herbicida en los tejidos objetivo. Este enfoque de selección de la reserva de transformantes se emplea rutinariamente en la expresión de genes estructurales heterólogos en plantas, ya que hay variación entre los transformantes que contienen el mismo gen heterólogo debido al sitio de inserción del gen dentro del genoma de la planta (comúnmente referido como "efecto de posición"). Además de los promotores que se sabe causan transcripción (constitutiva o específica de tejido) de ADN en células de planta, se pueden identificar otros promotores para usar en la presente invención, escudriñando una colección de ADNc de plantas para seleccionar genes que sean expresados de manera selectiva o preferible en los tejidos objetivo, y después determinar las regiones promotoras. Se prefiere que los promotores utilizados tengan expresión relativamente alta en todos los tejidos meristemáticos, además de otros tejidos, puesto que ahora se sabe que los herbicidas de fosfonato pueden ser translocalizados y acumulados en este tipo de tejido vegetal. Alternativamente, se puede usar una combinación de genes quiméricos para ocasionar acumulativamente el nivel de expresión global necesario de enzima aciltransferasa y producir así el fenotipo de tolerancia a herbicida. Un promotor que provee niveles relativamente altos de expresión puede ocasionar la producción de una proteína deseada a niveles en planta que varían de 0.1 miligramo por gramo de peso fresco de tejido vegetal, a 0.5 miligramos por gramo de peso fresco de tejido vegetal, a 1.0 miligramo por gramo de peso fresco de tejido vegetal, hasta 2.0 miligramos por gramo de 5 peso fresco de tejido vegetal. Los niveles en planta de una proteína deseada en cultivos genéticamente isogénicos en un campo, pueden variar a través de un amplio espectro, pero generalmente los niveles están dentro de 70% de una media, de preferencia dentro de 50% de una media, y de preferencia dentro de 25% de una media para todas las plantas analizadas en una l-o muestra dada. Los promotores usados en las construcciones de ADN de la presente invención (esto es, genes de planta quiméricos), se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. Por ejemplo, se puede ligar el promotor CaMV35S con la porción del gen de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa de subunidad pequeña (ssRUBISCO) de Arabidopsis thaliana que reprime la expresión de ssRUBISCO en ausencia de luz, para crear un promotor que sea activo en hojas pero no en raíces. El promotor quimérico resultante se puede usar como se describe aquí. Para los propósitos de esta descripción, la frase promotor "CaMV35S" incluye así 0 variaciones del promotor CaMV35S, por ejemplo, promotores derivados por medios de ligación con regiones de operador, mutagénesis al azar o controlada, etc. Además, los promotores se pueden alterar para contener "secuencias incremetadoras" múltiples para ayudar a elevar la expresión de los genes. Ejemplos de tales secuencias incrementadoras han sido reportados por Kay y otros (1987). Un ARN producido por una construcción de ADN de la presente invención también contiene una secuencia guía 5' no traducida. Esta secuencia se puede derivar del promotor seleccionado para expresar el gen, y se puede modificar específicamente para aumentar la traducción del ARNm. La secuencia guía 5' no traducida o secuencia no traducida (UTR o NTR) se puede derivar de un promotor o secuencia codificadora no relacionada. Por ejemplo, las regiones 5' no traducidas también se pueden obtener de ARN's virales, de genes eucarióticos adecuados, o de una secuencia genética sintética. La presente ¡nvención no está limitada a construcciones, como se presentan en uno de los siguientes ejemplos, en las cuales la región no traducida deriva de la secuencia 5' no traducida que acompaña la secuencia promotora. Ejemplos de secuencias guía de genes de plantas que son útiles en la presente invención, son la guía de proteína de unión de clorofila a/b (cab) de trigo y la guía de proteína 70 de choque térmico (hsp70) de petunia (Winter y otros, 1988). Para una óptima expresión en plantas monocotiledóneas, también se debe incluir un intrón en la construcción de expresión de ADN. Este intrón típicamente sería colocado cerca del extremo 5' del ARNm en la secuencia no traducida. Este intrón se podría obtener, sin limitación, de un grupo de intrones que consisten del intrón de hsp70 de maíz (Brown y otros, patente de E.U.A. No. 5,424,412, 1995) o el intrón de Act1 de arroz (McEIroy y otros, 1990). Cuando se puede incluir más de un cassette de expresión dentro de un plásmido u otra construcción de polinucleótido, un primer cassette de expresión que comprende una molécula de ADN, contiene regularmente un promotor constitutivo, una secuencia de ADN estructural que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa (GOX) y una región 3' no traducida. Un segundo cassette de expresión que comprende una molécula de ADN contiene típicamente un promotor constitutivo, una secuencia de ADN estructural que codifica una enzima N-acil-transferasa que es capaz de reaccionar con AMPA para producir N-acil-AMPA, y una región 3' no traducida. También se contemplan cassettes de expresión adicionales que comprenden una molécula de ADN. Por ejemplo, junto con los genes que proveen tolerancia a herbicida incrementada, también pueden ser expresados en las plantas contempladas por la presente invención, genes que codifican actividades insecticidas o fungicidas, tolerancia a la sequía o el calor, compuestos antibióticos, compuestos o reactivos farmacéuticos tales como proteínas supresoras de tumor o componentes de anticuerpo, biopolímeros u otros compuestos comercialmente útiles y similares. Se han descrito varios promotores constitutivos que son activos en células de plantas. Promotores adecuados para la expresión constitutiva de GOX o N-acil-transferasa incluyen, sin limitación, el promotor 35S de virus de mosaico de coliflor (CaMV) (Odell y otros, 1985), el promotor 35S de virus de mosaico de escrofularia (FMV) (Sanger y otros, 1990), el promotor de virus de ADN baciliforme de caña de azúcar (Bouhida y otros, 1993), el promotor de virus de mota amarilla de cornelina (Medberry y Olszewski, 1993), el promotor inducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bifosfato carboxilasa (ssRUBISCO) (Coruzzi y otros, 1984), el promotor de triosafosfato isomerasa (TPI) citosólico de arroz (Xu y otros, 1994), el promotor de adenina fosforribosil transferasa (APRT) de Arabidopsis (Moffatt y otros, 1994), el promotor del gen de actina 1 de arroz (Zhong y otros, 1996) y los promotores manopina sintetasa y octopina sintetasa (Ni y otros, 1995). Todos estos promotores se han usado para crear varios tipos de construcciones de ADN recombinante expresables en planta. Se ha realizado análisis comparativo de promotores constitutivos mediante la expresión de genes reporteros tales como el gen uid ( -glucuronidasa) de E. coli con muchos de estos y otros promotores (Li y otros, 1997; Wen y otros, 1993). Se pueden seleccionar los promotores usados en el segundo cassette que comprende una molécula de ADN, para controlar o limitar la expresión específica en donde se desea letalidad celular. En una modalidad preferida, el promotor será capaz de dirigir la expresión exclusivamente o principalmente a tejidos críticos para la supervivencia o viabilidad de la planta, mientras se limita la expresión del segundo cassette que comprende una molécula de ADN en otros tejidos no esenciales. Por ejemplo, tejidos que se diferencian hacia el desarrollo de polen o tejidos terminales tales como el polen mismo, la capa de células tapétales de la antera o los tejidos de la antera. Alternativamente, son bien conocidos los promotores de planta capaces de regular la expresión de genes en tipos particulares de células y tejidos. Los que son muy preferidos en las modalidades de esta invención, son los promotores que se expresan específicamente durante el desarrollo de tejido reproductor masculino o en polen, a niveles suficientes para producir moléculas de ARN inhibidoras, complementarias al ARN de sentido transcrito por el promotor constitutivo del primer cassette de expresión que comprende una molécula de ADN. Ejemplos de estos tipos de promotores incluyen el promotor específico de células tapétales de tabaco TA29 (Mariani y otros, 1990), los promotores de chalcona flavona isomerasa PA1 y PA2 de petunia (van Tunen y otros, 1990), el promotor del gen SLG de Brassica olerácea (Heizmann y otros, 1991 ), y los promotores del gen LAT de tomate (Twell y otros, 1991 ). Se han aislado promotores específicos de antera y polen de arroz. Los ejemplos incluyen el promotor Osg6B, que se mostró que maneja la expresión del gen de -glucuronidasa en arroz transgénico en anteras inmaduras. No se detectó actividad en otros tejidos de espiguillas, hojas ni raíces (Yokoi y otros, 1997). Se ha mostrado que el promotor específico de polen PSI de arroz, expresa específicamente el gen de -glucuronidasa en polen de arroz (Zou y otros, 1994). Se han identificado genes adicionales de arroz que se expresan específicamente en la capa de células tapétales de la antera del arroz (Tsuchiya y otros, 1994, Tsuchiya y otros, 1997). El aislamiento de genes adicionales que se expresan predominantemente durante el desarrollo de la antera en el arroz, se puede realizar, por ejemplo, mediante la construcción de una colección de ADNc para identificar clonas específicas de antera (Qu y otros). Los expertos en la materia conocen los enfoques usados en el aislamiento de promotores que funcionan en plantas, y de genes o miembros de familias de genes que son altamente expresados en tejidos particulares de plantas tales como raíz, meristemo, hoja, flor, fruto, polen, o en tipos de células vegetales implicadas en la producción de polen (Stinson y otros, 1987; Brown y Crouch, 1990; McCormick y otros, 1989). Ejemplos adicionales de promotores específicos de tejido incluyen el promotor para el gen de exopoligalacturonasa de maíz (Dubald y otros, 1993), y el promotor para el ARNm de Zmc13 (Hanson y otros, 1989). Se ha mostrado que los promotores LAT52 y LAT59 son promotores que se expresan preferentemente en polen de tomate (Twell y otros, 1991 ). Una porción de la secuencia promotora pZtap de maíz (psgB6-1 ) se describe en la patente de E.U.A. No. 5,470,359. Una molécula de ADN recombinante de la presente invención comprende regularmente un promotor ligado operativamente a una secuencia de ADN que codifica una región 5' no traducida, una secuencia de ADN de un intrón de planta, una secuencia estructural que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP), una secuencia codificadora de ADN para un gen que codifica la tolerancia mejorada a herbicida, y una región 3' no traducida. La secuencia guía 5' no traducida puede derivar del promotor seleccionado para expresar la secuencia de ADN heterólogo, y se puede modificar específicamente, si se desea, para aumentar la traducción de ARNm. También se puede obtener una región 5' no traducida de ARNs virales de genes eucarióticos adecuados, o de una secuencia genética sintética. La presente invención no está limitada a construcciones en las cuales la región no traducida deriva de la secuencia 5' no traducida que acompaña la secuencia promotora. La secuencia guía también podría derivar de un promotor o secuencia codificadora no relacionada. La región 3' no traducida de una molécula de ADN recombinante operable en planta, contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para ocasionar la adición de nucleótidos de adenilato en el extremo 3' del ARN. La región 3' no traducida se puede obtener de varios genes que son expresados en células de planta. En esta capacidad, son usados comúnmente la región 3' no traducida de nopalina sintetasa (Frakey y otros, 1983), la región 3' no traducida de ssRUBISCO de chícharo (Coruzzi y otros, 1994), la región 3' no traducida del gen de proteína de almacenamiento de semilla 7S de soya (Schuler y otros, 1982) y la subunidad pequeña del gen ssRUBISCO de chícharo. También son adecuadas las regiones 3' transcritas no traducidas que contienen la señal de poliadenilato de genes plasmídicos de inducción de tumor (Ti) de Agrobacterium. Ejemplos de intrones de planta adecuados para expresión en monocotiledóneas ¡ncluyen, por ejemplo, intrón hsp70 de maíz, intrón de actina 1 de arroz, intrón de ADH 1 de maíz, intrón SSU de Arabidopsis, intrón EPSPS de Arabidopsis, intrón EPSPS de petunia, y otros conocidos de los expertos en la materia.

Puede ser particularmente ventajoso dirigir la localización de proteínas que confieren tolerancia a herbicida, hacia un compartimiento subcelular, a la mitocondria, retículo endoplásmico, vacuolas, cloroplasto u otro compartimiento plastídico. Las proteínas se pueden dirigir hacia el cloroplasto incluyendo en su extremo amino un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP). Se han identificado previamente y son bien conocidas en la materia proteínas naturales dirigidas a cloroplastos, sintetizadas como proteínas precursoras más grandes que contienen un péptido amino terminal de dirección a cloroplasto que dirige el precursor hacia la maquinaria de importación de cloroplasto. Los péptidos de dirección de cloroplasto por lo general son cortados por endoproteasas específicas localizadas dentro del organelo del cloroplasto, liberando así la enzima dirigida madura y preferiblemente activa del precursor en el medio del cloroplasto. Ejemplos de secuencias que codifican péptidos que son adecuados para dirigir el gen de tolerancia a herbicida, o el producto del gen de transacilasa, hacia el cloroplasto o plástido de la célula de planta, incluyen CTP EPSPS de petunia, el CTP2 EPSPS e intrón de Arabidopsis, y otros conocidos para el experto en la materia. Tales secuencias de dirección proveen la proteína expresada deseada transferida hacia la estructura celular en la cual funciona más efectivamente, o transfieren la proteína expresada deseada a áreas de la célula en las cuales se concentran los procesos celulares necesarios para la función fenotípica des€iada. Se ha encontrado que los péptidos de dirección de cloroplasto son particularmente útiles en la selección de plantas resistentes a glifosato (Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,463,175; Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,633,435). El glifosato funciona para matar la célula inhibiendo la biosíntesis de aminoácidos aromáticos que tiene lugar dentro del cloroplasto. Para esto, la concentración del producto del gen de resistencia dentro del cloroplasto, provee resistencia incrementada al herbicida. Los ejemplos aquí proveen una transacilasa que también es dirigida o localizada hacia el cloroplasto y concentrada dentro del mismo. Ejemplos específicos de péptidos de dirección de cloroplasto son bien conocidos en la técnica, e incluyen el péptido de tránsito atslA de la subunidad pequeña de ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana, un péptido de tránsito EPSPS de Arabidopsis thaliana, y un péptido de tránsito de la subunidad pequeña de ribulosa bifosfato carboxilasa de Zea maize. Un CTP que ha funcionado aquí para localizar proteínas heterólogas hacia el cloroplasto, se derivó del péptido de tránsito astIA de la subunidad pequeña de ribulosa bifosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana. Una secuencia de polinucleótido que codifica una variante de este péptido de tránsito usado en la presente, provee la secuencia de aminoácidos del péptido de tránsito nativo más una reiteración del sitio de corte del péptido de tránsito, y se ha mostrado aquí que es útil para desplegar enzima transacilasa activa recombinante hacia el cloroplasto (SEQ ID NO:9). Un medio alternativo para localizar genes de tolerancia a herbicida o de resistencia a herbicida operables en planta, hacia un cloroplasto o plástido, incluye la transformación de cloroplasto o plástido. Se pueden producir plantas recombinantes en las cuales se ha alterado solo el ADN mitocondrial o de cloroplasto para incorporar las moléculas contempladas en esta solicitud. Los promotores que funcionan en cloroplastos son conocidos en la técnica (Hanley-Bowden y otros, Trends in Biochemical Sciences 12:67-70, 1987). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los cuales se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo Daniell y otros (patente de E.U.A. No. 5,693,507; 1997) y Maliga y otros (patente de E.U.A. No. 5,451 ,513; 1995). La acumulación de AMPA en plantas puede ocasionar síntomas fitotóxicos que son manifestados fenotípicamente como clorosis de las hojas, crecimiento achaparrado, infertilidad y muerte, aunque no todos estos síntomas son evidentes en todas las especies de la planta. Se ha descubierto aquí que la modificación enzimática de la molécula de AMPA por transacilación para producir N-acil-AMPA, provee un medio para superar los efectos fitotóxicos de AMPA. Un método para probar la conversión de AMPA en N-acil-AMPA incluye proveer AMPA marcado con [14C] como un substrato para la enzima transacilasa, y acil-CoA como otro substrato para la enzima en un volumen de reacción acuosa, y separando el substrato de AMPA marcado con [14C] del producto N-acil-[14C]-AMPA por medio de HPLC sobre una columna de intercambio aniónico como se describe en los presentes ejemplos. Sorprendentemente, se ha mostrado que la enzima transacilasa es capaz de utilizar otros compuestos de CoA acilados como substratos para transacilar el substrato AMPA. En particular, se ha mostrado que la propionil-CoA es un substrato particularmente reactivo para la reacción de transacilación in vitro, produciendo N-propionil-[14C]-AMPA. Compuestos de CoA acilados más grandes, esto es, butiril-CoA o metilmalonil-CoA, y otras moléculas orgánicas unidas covalentemente a CoA que tienen una longitud de cadena de carbono mayor de C3, se vieron menos efectivos en la reacción de transacilación cuando se usa AMPA como el substrato receptor del grupo acilo. No obstante esta información, el experto en la materia reconocería que otras transacilasas que están sustancialmente relacionadas por homología de secuencia de aminoácidos con una enzima PhnO o semejante a PhnO como se le caracteriza aquí, tendría una especificidad de substrato similar en la reacción de AMPA transacilasa en comparación con la abarcada por PhnO. Estas otras enzimas también están conceptualmente dentro del alcance y espíritu de la invención aquí descrita. Por ejemplo, la biosíntesis de ácido graso es mediada por una amplia gama de compuestos de proteína de acil-CoA y portadores de acilo que pueden ser de utilidad como substratos en la transacilación de compuestos fitotóxicos tales como AMPA. Una transacilasa capaz de transacilar AMPA usando un intermediario de ácido graso, podría proveer concebiblemente protección vegetal eliminando la fitotoxicidad de AMPA. Una enzima tal como PhnO, que es capaz de transacilar, puede ser útil en la destoxificación de una amplia gama de compuestos tóxicos que contienen enlaces CP y que adicionalmente contienen un enlace CN. Métodos y composiciones para transformar una bacteria, una célula de levadura o de hongo, una célula de planta, o toda una planta, con uno o más vectores ele expresión que comprenden una secuencia de gen phnO- o semejante a phnO-, son aspectos adicionales de esta descripción. Una bacteria, célula de levadura o de hongo, célula de planta o planta derivada de dicho proceso de transformación, o la progenie y semillas de dicha planta transgénica, también son modalidades adicionales de esta invención. Los métodos para transformar bacterias y células de levaduras u hongos son bien conocidos en la técnica. Típicamente, los medios de transformación son similares a los medios bien conocidos usados para transformar otras bacterias o levaduras tales como E. coli o Saccharomyces cerevisiae. Los métodos para transformar ADN de células vegetales incluyen, sin limitación, transformación de plantas mediada por Agrobacterium, transformación de protoplasto, transferencia genética en polen, inyección en órganos reproductores, inyección en embriones inmaduros, transformación de plástido o cloroplasto, y bombardeo de partículas. Cada uno de estos métodos tiene distintas ventajas y desventajas. Así, un método particular de introducción de genes en una especie vegetal particular puede no ser el más efectivo para otra especie vegetal, pero es bien conocido del experto en la materia cuales métodos son útiles para una especie vegetal particular. Existen muchos métodos para introducir en las células segmentos de ADN de transformación, pero no todos ellos son adecuados para suministrar ADN en las células vegetales. Se considera que los métodos adecuados incluyen virtualmente cualquier método mediante el cual se pueda introducir ADN en una célula, por ejemplo por infección por Agrobacterium; vectores de cromosoma artificial bacteriano binario (BIBAC) (Hamilton y otros, 1996), suministro directo de ADN, por ejemplo por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh y otros, 1993); incorporación de ADN mediada por desecación/inhibición; electroporación; agitación con fibras de carburo de silicio; aceleración de partículas recubiertas con ADN, etc. En ciertas modalidades, se prefieren los métodos de aceleración, e incluyen por ejemplo bombardeo de microproyectiles y similares. La tecnología para introducir ADN en las células, es bien conocida para el experto en la materia. Se han descrito cuatro métodos generales para suministrar un gen en las células: (1 ) métodos químicos (Graham y van der Eb, 1973; Zatloukal y otros, 1992); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, 1980), electroporación (Wong y Neuman, 1982; Fromm y otros, 1985; patente de E.U.A. No. 5,384,253) y la pistola de genes (Johnston y Tang, 1994; Fynan y otros, 1993; Luthra y otros, 1997); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu y otros, 1993; Eglitis y Anderson, 1988a; 1988b); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel y otros, 1991 ; 1992; Wagner y otros, 1992). Se han publicado métodos para transformar dicotiledóneas, principalmente usando Agrobacterium tumefaciens y obteniendo plantas transgénicas de algodón (patente de E.U.A. No. 5,004,863; patente de E.U.A. No.5,159,135; patente de E.U.A. No. 5,518,908), soya (patente de E.U.A. No. 5,569,834; patente de E.U.A. No. 5,416,011 ; McCabe y otros (1988); Christou y otros (1988)), Brassica (patente de E.U.A. No. 5,463,174), cacahuate (Cheng y otros 81996); De Kathen y Jabobsen (1990)). También se ha reportado la transformación de monocotiledóneas usando electroporación, bombardeo de partículas y Agrobacterium. Se ha logrado transformación y regeneración de plantas en espárrago (Bytebier y otros (1987)), cebada (Wan y lemaux (1994)), maíz (Rhodes y otros (1988); Ishida y otros (1996); Gordon-Kamm y otros (1990); Fromm y otros (1990); Koziel y otros (1993); Armstrong y otros (1995)), avena (Somers y otros (1992)), pasto ovillo (Horn y otros (1988)), arroz (Toriyama y otros (1988); Park y otros (1996); Abedinia y otros (1997); Zhang y Wu (1988); Zhang y otros (1988); Battraw y Hall (1990); Christou y otros (1991 ); Park y otros (1996)); centeno (De la Pena y otros (1987)), caña de azúcar (Bower y Birch (1992)), cañuela alta (Wang y otros (1992)) y trigo (Vasil y otros (1992), Weeks y otros (1993)). Las técnicas para transformación de monocotiledóneas y regeneración de planta también las describen Davey y otros (1986). También se pueden producir plantas recombinantes en las cuales solo se ha alterado el ADN mitocondrial o de cloroplasto para incorporar las moléculas contempladas en esta solicitud. Se conocen en la técnica promotores que funcionan en cloroplastos (Handley-Bowden y otros, Trends in Biochemical Sciences 12:67-70, 1987). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los cuales se ha insertado ADN heterólogo, por Daniell y otros (patente de E.U.A. No. ,693,507 (1997) y Maliga y otros (patente de E.U.A. No. 5,451 ,513; 1995). También están dentro del alcance de esta invención plantas recombinantes que se han transformado usando ADN heterólogo, alterando tanto genomas nucleares como plastídicos o de cloroplasto. La presente ¡nvención describe construcciones de ADN que comprenden secuencias de polinucleótido que codifican AMPA-transacilasa. Se describen aquí métodos para identificar y aislar genes heterólogos que codifican péptidos que funcionan en la N-acilación de AMPA. Los métodos para la construcción y expresión de genes sintéticos en plantas son bien conocidos por los expertos en la materia y se describen en detalle en la patente de E.U.A. No. 5,500,365, y en particular en plantas monocotiledóneas, en la patente de E.U.A. No. 5,689,052. La presente invención contempla el uso de genes de AMPA aciltransferasa solos o en combinación con genes que codifican enzimas de degradación de glifosato mediada por GOX, en la transformación de plantas tanto monocotiledóneas como dicotiledóneas. Para potenciar la expresión de estos genes, la presente invención provee construcciones de ADN que comprenden secuencias de polinucleótido que codifican estos tipos de proteínas que son localizadas hacia el citoplasma de la célula de la planta, así como secuencias que codifican péptidos de dirección de plástido, colocadas hacia el extremo 5' de las secuencias de polinucleótido que codifican las proteínas AMPA transacilasa y/o GOX. En un aspecto, la información de secuencia de nucleótidos provista por la invención, permite la preparación de secuencias de ADN relativamente cortas que tienen la capacidad de hibridar específicamente con secuencias de gen de los polinucleótidos seleccionados descritos en la presente. En estos aspectos, se preparan sondas de ácido nucleico de una longitud apropiada en base a una consideración de secuencias de polinucleótido seleccionadas que codifican polipéptidos de AMPA transacilasa, por ejemplo secuencias tales como las que se muestran en SEQ ID NO? , SEQ ID NO:2 y SEQ ID N0:3. Tales sondas de ácido nucleico también se pueden preparar en base a una consideración de secuencias de polinucleótido seleccionadas que codifican un péptido de dirección de plástido tal como los mostrados en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14. La capacidad de tales sondas de ácido nucleico para hibridar específicamente con una secuencia de gen que codifica un polipéptido de AMPA transacilasa o una secuencia de péptido de dirección a plástido, les da utilidad particular en una variedad de modalidades. De manera muy importante, las sondas se pueden usar en una variedad de pruebas para detectar la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. En ciertas modalidades, es ventajoso usar iniciadores de oligonucleótido. La secuencia de dichos iniciadores se diseña usando un polinucleótido de la presente invención para usar en la detección, ampliación o mutación de una secuencia definida de un gen de AMPA transacilasa de cualquier organismo adecuado, usando tecnología PCR^M. El procedimiento también se puede usar para detectar, ampliar o mutar una secuencia definida del polinucleótido que codifica un péptido de dirección a plástido. Los segmentos de genes relacionados con los polinucleótidos que codifican polipéptidos de AMA transacilasa y péptidos de dirección a plástido de la presente ¡nvención, también se pueden ampliar por PCR^ usando dichos iniciadores. Para proveer algunas de las ventajas de acuerdo con la presente ¡nvención, una secuencia de ácidos nucleicos preferida para estudios o pruebas de hibridación, incluye las secuencias que son sustancialmente complementarias por lo menos a una longitud como de 14 a 30 nucleótidos consecutivos de una secuencia de polinucleótido de flanqueo, en cis, con, o que codifica AMPA transacilasa, tal como la que se muestra en SEQ ID No.5 o SEQ ID NO:6, o secuencias que son sustancialmente complementarias por lo menos a una longitud como de 14 a 30 nucleótidos consecutivos de una secuencia que codifica un péptido de dirección a plástido. Por "sustancialmente complementario" se entiende que el polinucleótido es de preferencia alrededor ele 70% complementario, o de preferencia alrededor de 80% complementario, o preferiblemente alrededor de 90% complementario, o muy preferiblemente alrededor de 99-100% complementario en secuencia a una secuencia de polinucleótido objetivo. Un tamaño de por lo menos 14 nucleótidos de longitud ayuda a asegurar que el fragmento sea de suficiente longitud para formar una molécula dúplex que sea tanto estable como selectiva. Por lo general, se prefieren moléculas que tienen secuencias complementarias sobre segmentos mayores de 14 bases de longitud. Para aumentar la estabilidad y la selectividad del híbrido, y con ello mejorar la calidad y el grado de especificidad de las moléculas híbridas obtenidas, generalmente será preferido diseñar moléculas de ácido nucleico que tengan secuencias complementarias de gen de 14 a 20 nucleótidos, o incluso más largos cuando sea necesario. Dichos fragmentos se pueden preparar con facilidad, por ejemplo sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, tal como por ejemplo química de fosforamidita; por aplicación de tecnología de reproducción de ácido nucleico, tal como la tecnología PCR^ de las patentes de E.U.A. Nos. 4,683,195 y 4,683,202 (cada una incorporada aquí específicamente como referencia), o cortando fragmentos de ADN seleccionados de plásmidos recombinantes que contienen insertos apropiados y sitios de restricción adecuados. La presente invención también contempla un vector de expresión que comprende un polinucleótido de la presente invención. De esta manera, en una modalidad, un vector de expresión es una molécula de ADN aislada y purificada que comprende un promotor ligado operativamente a una región codificadora que codifica un polipéptido de la presente invención; dicha región codificadora está ligada operativamente a una región de terminación de transcripción, con lo cual el promotor maneja la transcripción de la región codificadora. La región codificadora puede incluir un segmento o secuencia que codifica una AMPA transacilasa y un segmento o secuencia que codifica un péptido de dirección de plástido. La molécula de ADN que comprende el vector de expresión puede contener también un intrón funcional en planta, y también puede contener otros elementos funcionales en planta tales como secuencias que codifican secuencias no traducidas (UTL's) y secuencias que actúan como incrementadores de transcripción o traducción. Como se usan aquí, los términos "ligado operativamente" o "ligado en operación" significan que una secuencia que funciona como un promotor está conectado o ligado a una región codificadora, de tal manera que la transcripción de esa región codificadora queda controlada y regulada por ese promotor. Los medios para ligar operativamente un promotor a una región codificadora para regular del extremo 5' al extremo 3', son bien conocidos en la técnica. Los vectores de transformación de plantas preferidos incluyen los derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como los descritos por ejemplo por Herrera-Estrella (1983), Bevan (1983), Klee (1985) y la solicitud de patente Europea No. EP0120516 (cada una incorporada aquí específicamente como referencia). Además, los vectores de transformación de planta preferidos dirigidos a transformación de cloroplasto o plástido, incluyen los que se describen en la patente de E.U.A. No. 5,693,507 (1997), patente de E.U.A. No. 5,451 ,513 (1995), McBride y otros (1995), Staub y otros (1995a), Staub y otros (1995b), y WO 95/24492 (cada una incorporada aquí específicamente como referencia). Cuando se usa un vector de expresión de la presente invención para transformar una planta, se selecciona un promotor que tenga la capacidad de manejar la expresión en esa especie particular de planta. Los promotores que funcionan en especies diferentes de plantas también son conocidos en la técnica. Promotores útiles en la expresión del polipéptido en plantas, son aquellos que son inducibles, virales, sintéticos o constitutivos como se describen (Odell y otros, 1985), y/o regulados temporalmente, regulados espacialmente y regulados espacio-temporalmente. Los promotores preferidos incluyen los promotores incrementados CaMV35S y el promotor FMV35S. La expresión de un gen que existe en forma de ADN de doble cadena localizado hacia el genoma nuclear de una planta, implica la transcripción de ARN mensajero (ARNm) de la cadena codificadora del ADN por medio de una enzima ARN polimerasa, y el procesamiento subsecuente del transcrito primario de ARNm dentro del núcleo. Los genes expresados desde dentro de un cloroplasto o plástido también producen un transcrito de ARNm que no es procesado adicionalmente antes de la traducción. En cualquier caso, la transcripción de ADN en ARNm está regulada por una región de ADN referidla como el "promotor". El ADN que comprende el promotor está representado por una secuencia de bases que da la señal a la ARN polimerasa para asociarse con el ADN e iniciar la transcripción de ARNm usando una de las cadenas de ADN como molde para hacer una cadena correspondiente de ARN. El promotor particular seleccionado debe ser capaz de causar expresión suficiente de una secuencia codificadora de enzima AMPA aciltransferasa para producir una cantidad efectiva de resistencia a herbicida, o una cantidad efectiva de tolerancia a herbicida, de la proteína transacilasa localizada hacia el sitio intracelular deseado. Los genes estructurales pueden ser manejados por una variedad de promotores en tejidos de planta. Los promotores pueden ser casi constitutivos (esto es, manejan la transcripción del transgen en todo el tejido), tales como el promotor CaMV35S, o promotores específicos de tejido o específicos de desarrollo que afectan dicotiledóneas o monocotiledóneas. Cuando el promotor es un promotor casi constitutivo tal como CaMV35S o FMV35S, se encuentran incrementos en la expresión del polípéptido en una variedad de tejidos vegetales transformados y en la mayoría de los órganos de la planta (por ejemplo callo, hoja, semilla, tallo, meristemo, flor y raíz). Versiones incrementadas o duplicadas de los promotores CaMV35S y FMV35S, son particularmente útiles en la práctica de esta invención (Kay y otros, 1987; Rogers, patente de E.U.A. No. 5,378,619). Los expertos en la materia reconocerán que hay varios promotores que son activos en células de planta, y se han descrito en la literatura. Tales promotores se pueden obtener de plantas o virus de plantas, e incluyen, sin limitación, los promotores nopalina sintetasa (NOS) y octopina sintetasa (OCS) (que son portados en plásmidos inductores de tumor de A. tumefaciens), los promotores 19S y 35S del virus de mosaico de coliflor (CaMV), el promotor i ducible por luz de la subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bifosfato carboxilasa (ssRUBISCO, un polipéptido de planta muy abundante), el promotor Act1 de arroz, y el promotor 35S de virus de mosaico de escrofularia (FMV). Todos estos promotores se han usado para crear varios tipos de construcciones de ADN que han sido expresadas en plantas (véase, por ejemplo, McEIroy y otros, 1990; patente de E.U.A. No. 5,463,175). Además, puede ser preferible llevar a cabo la expresión de genes tales como los de AMPA aciltransferasa, que mejoran la tolerancia o resistencia a herbicida en tejidos específicos de una planta, usando vectores de integración de planta que contienen un promotor específico de tejido. Los tejidos objetivo específicos pueden incluir los de hoja, tallo, raíz, tubérculo, semilla, fruto, etc., y el promotor elegido debe tener la especificidad de tejido y desarrollo deseada. Por lo tanto, la función del promotor se debe optimizar seleccionando un promotor con las capacidades deseadas de expresión de tejido y la fuerza de promotor aproximada, y seleccionar un transformante que produzca la actividad transacilasa deseada en los tejidos objetivo. Este enfoque de selección de la reserva de transformantes se emplea rutinariamente en la expresión de genes estructurales heterólogos en plantas, ya que hay variación entre transformantes que contienen el mismo gen heterólogo debido al sitio de la inserción del gen dentro del genoma de la planta (referido comúnmente como "efecto de posición"). Además de los promotores que se sabe causan transcripción (constitutivos o específicos de tejido) de ADN en células de planta, se pueden identificar otros promotores para usar en la presente invención, escudriñando una colección de ADNc vegetal para seleccionar genes que sean expresados selectiva o preferiblemente en los tejidos objetivo, determinando después las regiones promotoras. Los promotores funcionales de cloroplasto o plástido son conocidos en la técnica (Hanley-Bowden y otros; Daniell y otros; Maliga y otros). Otros promotores específicos de tejido ejemplares son los promotores sacarosa sintetasa 1 de maíz (Yang y otros., 1990), alcohol deshidrogenasa 1 de maíz (Vogel y otros, 1989), complejo ligero de cosecha de maíz (Simpson, 1986), proteína de choque térmico de maíz (Odell y otros, 1985), subunidad pequeña de RuBP carboxilasa de chícharo (Poulsen y otros, 1986; Cashmore y otros, 1983), manopina sintetasa de plásmido Ti (McBride y Summerfelt, 1989), nopalina sintetasa de plásmido Ti (Langridge y otros, 1989), chalcona ¡someirasa de petunia (van Tunen y otros, 1988), proteína 1 de frijol rica en glicina (Keller y otros, 1989), transcrito de CaMV 35S (Odell y otros, 1985) y patatina de papa (Wenzler y otros, 1989). Los promotores preferidos son el promotor del virus del mosaico de coliflor (CaMV 35S) y el promotor de la subunidad pequeña S-E9 de RuBP carboxilasa. Los promotores usados en las construcciones de ADN de la presente ¡nvención, se pueden modificar, si se desea, para afectar sus características de control. Por ejemplo, se puede ligar el promotor CaMV35S con la porción del gen de ssRUBISCO que reprime la expresión de ssRUBISCO en ausencia de luz, para crear un promotor que sea activo en hojas pero no en raíces. Para los propósitos de esta descripción, la frase promotor "CaMV35S" incluye así variaciones del promotor CaMV35S, por ejemplo, promotores derivados por medios de ligación con regiones de operador, mutagénesis aleatoria o controlada, etc. Además, los promotores se pueden alterar para contener "secuencias incremetadoras" múltiples para ayudar a elevar la expresión de los genes. Ejemplos de tales secuencias incrementadoras han sido reportados por Kay y otros (1987). Los promotores específicos de cloroplasto o plástido son conocidos en la técnica (Daniell y otros, patente de E.U, A. No. 5,693,507, incorporada en la presente como referencia). Promotores obtenibles de genes de cloroplasto, por ejemplo el gen psbA de espinaca o chícharo, las regiones promotoras rbc y aípB de maíz, y los promotores rRNA. Cualquier promotor operable en cloroplasto o plástido está dentro del alcance de la presente invención. Una planta transgénica de la presente ¡nvención producida de una célula vegetal transformada con un promotor específico de tejido, se puede cruzar con una segunda planta transgénica desarrollada de una célula vegetal transformada con un promotor específico de tejido diferente, para producir una planta transgénica híbrida que muestra los efectos de la transformación en más de un tejido específico. El ARN producido por una construcción de ADN de la presente ¡nvención puede contener también una secuencia guía 5' no traducida (5'UTL). Esta secuencia puede derivar del promotor seleccionado para expresar el gen, y se puede modificar específicamente para aumentar la traducción del ARNm. Las regiones 5' no traducidas se pueden obtener también de ARNs virales, de genes eucarióticos adecuados, o de una secuencia de genes sintéticos. La presente invención no está limitada a construcciones en las cuales la región no traducida deriva de la secuencia 5' no traducida que acompaña la secuencia promotora. Una secuencia guía de gen vegetal para usar en la presente invención, es la guía de proteína de choque térmico 70 (hsp70) de petunia (Winter y otros, 1988). Las 5' UTL's son capaces de regular la expresión de genes cuando se localizan en la secuencia de ADN entre el sitio de iniciación de transcripción y el comienzo de la secuencia codificadora. Se han hecho compilaciones de secuencias guía para predecir las secuencias óptimas o subóptimas y generar "consensos" y secuencias guía preferidas (Joshi, 1987). Se contempla que las secuencias guía preferidas incluyen aquellas que comprenden las secuencias que se pronosticó que dirigen la expresión óptima del gen estructural enlazado, esto es, incluyen una secuencia guía de consenso preferida que puede aumentar o mantener la estabilidad del ARNm e impedir una iniciación inapropiada de la traducción. La elección de tales secuencias será conocida del experto en la materia a la luz de la presente descripción. Las secuencias que derivan de genes que son altamente expresados en plantas, y en particular en maíz, serán las más preferidas. Una guía particularmente útil puede ser la guía HSP70 de petunia. De acuerdo con la presente invención, los vectores de expresión diseñados para potenciar específicamente la expresión del polipéptido en la planta transformada, pueden incluir ciertas regiones que codifican péptidos de dirección de plástido o cloroplasto, abreviados aquí en varias formas tales como CTP, CTP1 , CTP2, etc., representando cada uno una secuencia de péptido de dirección diferente o variante. Estas regiones permiten que los procesos celulares implicados en la transcripción, traducción y expresión de la proteína codificada, sean aprovechados completamente cuando están asociados con ciertas secuencias de proteína GOX o AMPA transacilasa. Tales péptidos de dirección funcionan en una variedad de formas, tales como por ejemplo transfiriendo la proteína expresada a la estructura celular en la cual opera más efectivamente, o transfiriendo la proteína expresada a áreas de la célula en las cuales se concentran los procesos celulares necesarios para la expresión. El uso de CTP's también puede aumentar la frecuencia de recuperación de las plantas morfológicamente normales, y la frecuencia a la cual se pueden recuperar las plantas transgénicas. Los péptidos de dirección a cloroplasto se han visto particularmente útiles en el sistema de marcador seleccionable resistente a glifosato. En este sistema, las plantas transformadas para expresar una proteína que confiere resistencia a glifosato, son transformadas junto con un CTP que dirige los péptidos hacia los cloroplastos de las células de las plantas. El glifosato inhibe la ruta del ácido shiquímico, la cual conlleva a la biosíntesis de compuestos aromáticos incluyendo aminoácidos y vitaminas. Específicamente, el glifosato inhibe la conversión de ácido fosfoenolpirúvico y ácido 3-fosfoshiquímico a ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico, inhibiendo la enzima ácido 5-enolpiruvil-3-fosfoshiquímico sintetasa (EPSP sintetasa o EPSPS). La introducción de un transgen que codifica EPSPS permite que la célula vegetal resista los efectos del glifosato, especialmente cuando el transgen codifica una enzima EPSPS insensible a glifosato. Así, como el herbicida glifosato funciona para matar a la célula interrumpiendo la biosíntesis de aminoácidos aromáticos, particularmente en el cloroplasto de la célula, el CTP permite mayor resistencia al herbicida concentrando en el cloroplasto la enzima de resistencia a glifosato que la célula expresa, esto es, en el organelo objetivo de la célula. Enzimas de resistencia a herbicida ejemplares incluyen EPSPS y glifosato oxidorreductasa (GOX) (véase Comai, 1985, patente de E.U.A. No. 4,535,060, incorporada específicamente en la presente como referencia en su totalidad). Los CTPs pueden dirigir proteínas a los cloroplastos y otros plástidos. Por ejemplo, el organelo objetivo puede ser el amiloplasto. CTP's preferidos de la presente invención incluyen los que dirigen hacia cloroplastos y también hacia otros plástidos. Ejemplos específicos de CTP's preferidos incluyen CTP de proteína RUBISCO SSU de maíz, y péptidos funcionalmente relacionados tales como CTP de subunidad pequeña de RUBISCO de Arabidopsis thaliana y CTP de EPSPS de Arabidopsis thaliana. Estos CTP's son ejemplificados por las secuencias de polinucleótido y aminoácidos mostradas en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14, respectivamente. Se pueden producir plantas, células, semillas y otros tejidos vegetales recombinantes en los cuales se ha alterado solo el ADN mitocondrial o de cloroplasto para incorporar las moléculas contempladas en esta solicitud. Los promotores que funcionan en cloroplastos son conocidos en la técnica (Hanley-Bowden y otros, Trends in Biochemical Sciences 12:67- 70, 1987). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los cuales se ha insertado ADN heterólogo, en la patente de E.U.A. No. 5,693,507 (1997). Me Bride y otros (WO 95/24492) describen la localización y expresión de genes que codifican proteína endotoxina CrylA en genoma de cloroplasto de la planta de tabaco. Una modalidad ejemplar de la invención incluye la localización a plástido o cloroplasto, o la dirección a plástido o cloroplasto, de genes que codifican enzimas o proteínas que confieren tolerancia o resistencia a herbicida en las plantas. Se han aislado secuencias de dirección a plástido o cloroplasto de muchos genes de plantas codificados en el núcleo, y se ha mostrado que dirigen la importación de proteínas sintetizadas citoplásmicamente hacía plástidos o cloroplastos (revisado por Keegstra y Olsen, 1989). En la práctica de esta invención se puede utilizar una variedad de secuencias de dirección a plástido, bien conocidas en la técnica y que ¡ncluyen, sin limitación, ADPGPP, EPSP sintetasa o ssRUBISCO. Además, las secuencias de dirección a plástidos (de péptido y ácido nucleico) para cultivos de monocotiledóneas, pueden consistir de un fragmento de codificación genómico que contiene una secuencia de intrón y también un sitio de corte proteolítico duplicado en las secuencias codificadas de dirección a plástido. La secuencia de CTP preferida para cultivos de dicotiledóneas es referido aquí como SEQ ID NO:9, y consiste de un fragmento genómico codificador que contiene la secuencia de péptido de dirección a cloroplasto del gen EPSP sintetasa de Arabidopsis thaliana, en el cual el sitio de corte de péptido de tránsito del CTP ssRUBISCO de chícharo, reemplaza el sitio de corte de CTP de EPSP sintetasa nativo (Klee y otros, 1987). Para una expresión óptima en plantas monocotiledóneas, se puede incluir un intrón en la construcción de expresión de ADN. Dicho intrón se coloca regularmente cerca del extremo 5' del ARNm en la secuencia no traducida. Este intrón se puede obtener, sin limitación, de un grupo de intrones que consisten del intrón de proteína de choque térmico (HSP) 70 de maíz (patente de E.U.A. No. 5,424,412; 1995), en intrón Ac de arroz (McEIroy y otros, 1990), el intrón 1 de Adh (Callis y otros, 1987) o el ¡ntrón de sacarosa sintetasa (Vasil y otros, 1989). La región 3' no traducida de los genes de la presente invención que está localizada en el genoma nuclear de la planta, también contiene una señal de poliadenilación que funciona en plantas para ocasionar la adición de nucleótidos de adenilato en el extremo 3' del ARNm. La ARN polimerasa transcribe una secuencia de ADN de codificación del genoma nuclear a través de un sitio en donde ocurre la poliadenilación. Típicamente, las secuencias de ADN localizadas unos pocos cientos de pares de bases del sitio de poliadenilación, sirven para terminar la transcripción. Tales secuencias de ADN son referidas aquí como regiones terminadoras de transcripción. Estas regiones son requeridas para una poliadenilación eficiente del ARN mensajero (ARNm) transcrito. Ejemplos de regiones 3' preferidas son (1 ) las regiones 3' transcritas no traducidas que contienen la señal de poliadenilación de genes plasmídicos de inducción de tumor (Ti) de Agrobacterium, tales como el gen de nopalina sintetasa (NOS); y (2) los extremos 3' de genes de plantas tales como el gen de la subunidad pequeña de ribulosa-1 ,5-bifosfato carboxilasa de chícharo, designados aquí como E9 (Fischhoff y otros, 1987). Las construcciones incluirán regularmente el gen de interés junto con una secuencia de ADN de extremo 3' que actúa como una señal para terminar la transcripción y, en construcciones destinadas a expresión en el genoma nuclear, permitir la poliadenilación del ARNm resultante. Se contempla que los elementos 3' preferidos son los del gen de nopalina sintetasa de A. tumefaciens (extremo 3' nos) (Bevan y otros, 1983), el terminador para el transcrito T7 del gen de octopina sintetasa de A. tumefaciens, y el extremo 3' de los genes de inhibidor de proteasa I o II de papa o tomate. Cuando se desee, se pueden incluir además elementos reguladores tales como el elemento TMV O (Gallie y otros, 1989). De acuerdo con la presente invención y como se señaló arriba, los genes localizados en cloroplasto o plástido que codifican enzimas que confieren características de tolerancia a herbicida o resistencia a herbicida a las plantas, no requieren secuencias que confieren terminación de traducción y señales de poliadenilación, pero en su lugar pueden requerir solo información de terminación de transcripción en el extremo 3' del gen. Para secuencias codificadoras introducidas en un cloroplasto o plástido, o en un genoma de cloroplasto o plástido, la terminación de transcripción de ARNm es similar a los métodos bien conocidos en la técnica de expresión de genes bacterianos. Por ejemplo, en una secuencia policistrónica o monocistrónica, la transcripción puede ser terminada por estructuras de tallo y burbuja o por estructuras similares a las secuencias dependientes de rho. Se podrían usar incrementadores de transcripción o duplicaciones de incrementadores para aumentar la expresión. Estos incrementadores frecuentemente se encuentran en 5' del inicio de transcripción en un promotor que funciona en células eucarióticas, pero a menudo se pueden insertar en la orientación delantera o inversa 5' a 3' a la secuencia codificadora. Ejemplos de incrementadores incluyen elementos del promotor CaMV 35S, genes de octopina sintetasa (Ellis y otros, 1987), el gen de actina de arroz, y un promotor de eucariotes no vegetales (por ejemplo levadura; Ma y otros, 1988). En ciertas modalidades de la invención, el uso de elementos de sitios de unión de ribosoma internos (IRES) crea mensajes de multigenes o policistrónicos. Los elementos IRES son capaces de evadir el modelo de barrido de ribosoma de traducción dependiente de Cap metilada 5', y comienzan la traducción en sitios internos (Pelletier y Sonenberg, 1988). Se han descrito elementos IRES de dos miembros de la familia de picornavirus (polio y encefalomiocarditis) (Pelletier y Sonenberg, 1988), y también un IRES de un mensaje de mamífero (Macejak y Sarnow, 1991 ). Elementos IRES se pueden enlazar a marcos de lectura abiertos heterólogos. Marcos de lectura abiertos múltiples pueden ser transcritos juntos, cada uno separado por un IRES, creando mensajes policistrónicos. En virtud del elemento IRES, cada marco de lectura abierto es accesible a los ribosomas para traducción eficiente. Los genes múltiples pueden ser expresados eficientemente usando un solo promotor/incrementador para transcribir un solo mensaje. Cualquier marco de lectura abierto heterólogo se puede enlazar a elementos IRES. Esto incluye genes para proteínas secretadas, proteínas de subunidades múltiples codificadas por genes independientes, proteínas intracelulares o ligadas a membrana y marcadores seleccionables. De esta manera, se puede diseñar por ingeniería la expresión de varias proteínas en una célula, con una sola construcción y un solo marcador seleccionable. Las construcciones destinadas a expresión desde adentro de un cloroplasto o plástido, que utilizan maquinaria de transcripción y traducción específica de cloroplasto o plástido, pueden contener secuencias mono- o policistrónicas. La elección de qué vector de expresión, y finalmente a qué promotor se liga operativamente una región codificadora de polipéptido, depende directamente de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo la localización y el tiempo de expresión de la proteína, y de la célula hospedera a ser transformada. Estas son limitaciones bien conocidas inherentes en la técnica de construcción de moléculas de ADN recombinante. Sin embargo, un vector útil en la práctica de la presente invención es capaz de dirigir la expresión de la región codificadora de polipéptido a la cual está ligado operativamente. Los vectores típicos útiles para la expresión de genes en plantas superiores son bien conocidos en la técnica e incluyen vectores derivados de plásmido inductor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens (descrito por Rogers y otros, 1987). Sin embargo, se sabe que otros varios sistemas de vector de integración en plantas funcionan en los vegetales, incluyendo el vector de control de transferencia pCaMVCN (descrito por Fromm y otros, 1985). El plásmido pCaMVCN (disponible de Pharmacia, Piscataway, New Jersey E.U.A.) incluye el promotor CaMV35S. En modalidades preferidas, el vector usado para expresar el polipéptido incluye un marcador de selección que es efectivo en una célula vegetal, preferiblemente un marcador de selección de resistencia a fármaco. Un marcador de resistencia a fármaco preferido es el gen cuya expresión da como resultado resistencia a kanamicina; esto es, el gen quimérico que contiene el promotor de nopalina sintetasa, neomicina fosfotransferasa II Tn5 (ppfll) y la región 3" no traducida de nopalina sintetasa (descrita por Rogers y otros, 1988). Los medios para preparar vectores de expresión son bien conocidos en la técnica. Los vectores de expresión (transformación) usados para transformar plantas, y los métodos de preparación de estos vectores, se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 4,971,908, 4,940,835, 4,769,061 y 4,757,011 (cada una de las cuales se incorpora específicamente en la presente como referencia). Tales vectores se pueden modificar para incluir una secuencia codificadora de acuerdo con la presente ¡nvención. Se ha desarrollado una variedad de métodos para ligar operativamente ADN en vectores, por medio de extremos complementarios cohesivos o extremos rasurados. Por ejemplo, se pueden agregar tractos de homopolímero complementarios al segmento de ADN a insertar y al ADN del vector. El vector y el segmento de ADN se unen entonces mediante enlace de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante. Una región codificadora que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de conferir a una célula actividad enzimática incrementada de resistencia a herbicida, es preferiblemente un polinucleótido que codifica una AMPA transacilasa o un equivalente funcional, solo o en combinación con un gen que codifica una enzima GOX o un equivalente funcional de GOX. De acuerdo con estas modalidades, también se prefiere una región codificadora que comprende la secuencia de ADN de SEQ ID No.3, SEQ ID NO:7 o SEQ ID N0.19. Los genes específicos que codifican AMPA transacilasa que se ha visto que tranforman plantas con éxito, en conjunto con genes codificadores de péptido de dirección a plástido, para expresar la AMPA transacilasa a niveles suficientes herbicidamente protectores, son aquellos genes comprendidos dentro de los vectores plasmídicos. Los plásmidos preferidos que contienen secuencias de dirección a plástido incluyen PMON17261, pMON10151 , pMON10149, pMON32570, pMON32571 , pMON32572, pMON32573, pMON32926, pMON32931 , pMON32932, pMON32936, pMON32938, pMON32946, pMON32947, pMON32948 y pMON32950. Estos plásmidos contienen secuencias de polinucleótido que codifican secuencias de dirección como se muestran en SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14. Se describen cassettes de expresión que comprenden promotores operables en planta ligados a secuencias codificadoras, algunas con secuencias 5' no traducidas y/o secuencias de intrón, y algunas otras sin dichas secuencias, en donde las secuencias codificadoras contienen por lo menos una AMPA transacilasa o transacetilasa, ligada a secuencias de terminación operables en planta, en particular como se señalan en SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:29 y SEQ ID NO:31. El trabajo descrito en la presente ha identificado métodos para potenciar la expresión en planta de una AMPA transacilasa, que confiere a las plantas protección contra glifosato y herbicidas relacionados cuando se incorpora en el genoma nuclear, de plástido o de cloroplasto de las plantas susceptibles que también expresan un gen de GOX o similar. La patente de E.U.A. No. 5,500,365 (incorporada aquí específicamente como referencia) describe un método para sintetizar genes de planta para optimizar el nivel de expresión de la proteína para la cual codifica el gen sintetizado. Este método se refiere a la modificación de las secuencias de gen estructural del transgen exógeno, para hacerlas más "parecidas a la planta" y por lo tanto para que sea más probable que sean traducidas y expresadas por la planta. Un método similar para expresión incrementada de transgenes, preferiblemente en plantas monocotiledóneas, se describe en la patente de E.U.A. No. ,689,052 (incorporada específicamente aquí como referencia). De acuerdo con los métodos descritos en la presente se pueden hacer plantas agrícolas, hortícolas, de ornato, y otras plantas económicamente o comercialmente útiles. Dichas plantas pueden coexpresar el gen de AMPA transacilasa y/o un gen de GOX junto con otros péptidos, polipéptidos o proteínas antifúngicos, antibacterianos o antivirales de patogénesis relacionada; proteínas insecticidas; otras proteínas que confieren resistencia a herbicida; y proteínas implicadas en la calidad de los productos de la planta o rendimiento agrícola de las plantas. La coexpresión simultánea de proteínas heterólogas múltiples en plantas es ventajosa, ya que puede aprovechar más de un modo de acción para controlar el daño a la planta o mejorar la calidad de la planta o los productos producidos por el metabolismo de las plantas. Se contempla que puede ser conveniente la introducción de secuencias grandes de ADN que comprenden más de un gen. La introducción de tales secuencias se puede facilitar mediante el uso de cromosomas artificiales bacterianos o de levadura (BACs o YAcs, respectivamente), o incluso cromosomas artificiales de planta. Por ejemplo, el uso de BACs para transformación mediada por Agrobacterium, fue descrito por Hamilton y otros (1996). Finalmente, las secuencias de ADN más convenientes para su introducción en un genoma de monocotiledónea, pueden ser genes o familias de genes homólogos que codifican un rasgo deseado (por ejemplo, mayor rendimiento), y que se introducen bajo el control de promotores o incrementadores novedosos, etc., o quizá incluso promotores o elementos de control homólogos o específicos de tejido (por ejemplo, específicos de raíz-cuello/vaina, verticilo, tallo, grano u hoja). En realidad, se contempla que un uso particular de la presente invención puede ser la producción de transformantes que comprenden un transgen que es dirigido de una manera específica de tejido. Por ejemplo, la resistencia a herbicida o tolerancia a herbicida puede ser expresada o regulada específicamente de manera negativa en los tejidos reproductores de las plantas, que puede proveer un medio para incrementar la tolerancia a herbicida o la sensibilidad en esos tejidos. Tales medios de control reguladores pueden proveer métodos para regular el escape de transgenes hacia el medio ambiente o para controlar el uso ilícito de propiedad intelectual o comercial patentada o autorizada. Los vectores para usar en la dirección específica de tejido de la expresión de genes en plantas transgénicas, incluirán típicamente promotores específicos de tejido; y también pueden ¡ncluir otros elementos de control específicos de tejido tales como secuencias incrementadoras. Los promotores que dirigen la expresión específica o incrementada en ciertos tejidos vegetales, serán conocidos para los expertos en la materia a la luz de la presente descripción. También se contempla que se puede realizar funcionalmente expresión específica de tejido introduciendo un gen expresado constitutivamente (todos los tejidos) en combinación con un gen de antisentido que es expresado solamente en aquellos tejidos en donde no se desea el producto del gen. Por ejemplo, se puede introducir un gen que codifica para la AMPA transacilasa de E. coli para que sea expresado en todos los tejidos, usando el promotor 35S del virus de mosaico de coliflor. Alternativamente, también se podría usar un promotor de actina de arroz o un promotor de histona de una especie de dicotiledónea o monocotiledónea para la expresión constitutiva de un gen. Además, se contempla que los promotores que - combinan elementos de más de un promotor pueden ser de utilidad. Por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,491 ,288 describe un promotor de virus de mosaico de coliflor con un promotor de histona. Por lo tanto, la expresión de un transcrito de antisentido del gen de AMPA transacilasa en un grano de maíz, usando por ejemplo un promotor de zeína, impediría la acumulación de la transacilasa en semilla. De esta manera, en una planta que expresa tanto GOX como la transacilasa, la aplicación de herbicida de glifosato daría como resultado que los tejidos de semilla no maduren. Recíprocamente, la supresión de antisenlido del gen GOX daría el mismo resultado. De preferencia, sería ventajosa la supresión de la transacilasa en tejidos específicos, en particular en donde dichos tejidos han mostrado una intolerancia a AMPA o a compuestos relacionados. Los inventores contemplan específicamente que se podría usar una estrategia similar con la presente invención para dirigir la expresión de un marcador escudriñable o seleccionable en tejido de semilla. Alternativamente, se puede buscar la obtención de secuencias promotoras específicas de tejido para usar de acuerdo con la presente invención. Para lograr esto, se puede primero aislar clonas de ADNc del tejido en cuestión e identificar aquellas clonas que son expresadas específicamente en ese tejido, por ejemplo, usando Northern blotting. Idealmente, sería bueno identificar un gen que no está presente en un número alto de copias, pero cuyo producto es relativamente abundante en tejidos específicos. El promotor y los elementos de control de clonas genómicas correspondientes pueden así ser localizados usando las técnicas de biología molecular conocidas para el experto en la materia. Se contempla que la expresión de algunos genes en plantas transgénicas se buscará solo bajo condiciones específicas. Por ejemplo, se propone que la expresión de ciertos genes que confieren resistencia a factores de tensión del medio ambiente tales como la sequía, se buscaría solo bajo condiciones de tensión reales. Se contempla además que la expresión de tales genes durante todo el desarrollo de una planta, puede tener efectos nocivos. Se sabe que existe un gran número de genes que responden al medio ambiente. Por ejemplo, la expresión de algunos genes tales como rbcS, que codifica la subunidad pequeña de ribulosabifosfato carboxilasa, está regulada por la luz, ya que es mediada por fitocromos. Otros genes son inducidos por estímulos secundarios. Por ejemplo, la síntesis de ácido abscísico (ABA) es inducida por ciertos factores del medio ambiente que incluyen, sin limitación, tensión de agua. Se ha visto que varios genes son inducidos por ABA (Skriver y Mundy, 1990). También se espera que la expresión de genes que confieren resistencia a aplicaciones de herbicidas se buscaría solo bajo condiciones en las cuales el herbicida esté realmente presente. Por lo tanto, para algunos rasgos deseados, se buscará la expresión inducible de genes en plantas transgénicas. Se propone que, en algunas modalidades de la presente invención, la expresión de un gen en una planta transgénica se buscará solo durante cierto período durante el desarrollo de la planta. Los tiempos de desarrollo frecuentemente se correlacionan con una expresión genética específica de tejido. Por ejemplo, la expresión de proteínas de almacenamiento de zeína inicia en el endosperma aproximadamente 15 días después de la polinización. También se contempla que puede ser de utilidad dirigir específicamente la inserción de ADN dentro de una célula. Por ejemplo, puede ser de utilidad dirigir el ADN introducido hacia el núcleo, y en particular en una posición precisa dentro de uno de los cromosomas de la planta para lograr una integración específica de sitio. Por ejemplo, sería de utilidad tener un gen introducido mediante transformación que actúa para reemplazar un gen existente en la célula, o para complementar un gen que no es funcional o no está presente. También se contempla una planta transformada con un vector de expresión de la presente invención. También se contempla una planta transgénica derivada de una célula transformada o transgénica. Los expertos en la materia reconocerán se puede insertar en el genoma de una planta un gen de planta quimérico que contiene una secuencia codificadora estructural de la presente invención, por medio de métodos bien conocidos en la técnica. Tales métodos para transformación de ADN en células vegetales incluyen transformación de planta mediada por Agrobacterium, el uso de liposomas, transformación usando virus o polen, electroporación, transformación de protoplasto, transferencia de genes en polen, inyección en órganos reproductores, inyección en embriones inmaduros y bombardeo de partículas. Cada uno de estos métodos tiene distintas ventajas y desventajas. Así, un método particular de introducción de genes en una raza vegetal particular, puede no ser necesariamente el más efectivo para otra raza vegetal, pero es bien conocido qué métodos son útiles para una raza vegetal particular. Existen muchos métodos para introducir en las células segmentos de ADN de transformación, pero no todos ellos son adecuados para suministrar ADN en las células vegetales. Se considera que los métodos adecuados incluyen virtualmente cualquier método mediante el cual se pueda introducir ADN en una célula, por ejemplo por medio de infección por A. tumefaciens y cepas de Agrobacterium relacionadas; suministro directo de ADN, por ejemplo por transformación de protoplastos mediada por PEG (Omirulleh y otros, 1993); incorporación de ADN mediada por desecación/inhibición; electroporación; agitación con fibras de carburo de silicio; aceleración de partículas recubiertas con ADN, etc. En ciertas modalidades, se prefieren los métodos de aceleración, e incluyen por ejemplo bombardeo de microproyectiles y similares.

La tecnología para introducir ADN en las células, es bien conocida para el experto en la materia. Se han descrito cuatro métodos generales para suministrar un gen en las células: (1 ) métodos químicos (Graham y van der Eb, 1973); (2) métodos físicos tales como microinyección (Capecchi, 1980), electroporación (Wong y Neuman, 1982; Fromm y otros, 1985) y la pistola de genes (Johnston y Tang, 1994; Fynan y otros, 1993); (3) vectores virales (Clapp, 1993; Lu y otros, 1993; Eglitis y Anderson, 1988a; 1988b); y (4) mecanismos mediados por receptor (Curiel y otros, 1991 ; 1992; Wagner y otros, 1992). La aplicación de breves impulsos eléctricos de alto voltaje a una variedad de células animales y vegetales conduce a la formación de poros de tamaño nanométrico en la membrana plasmática. El ADN es incorporado directamente al citoplasma celular a través de estos poros, o como consecuencia de la redistribución de los componentes de membrana que acompaña al cierre de los poros. La electroporación puede ser muy eficiente y se puede usar tanto para expresión transitoria de genes clonados como para establecimiento de líneas celulares que llevan copias integradas del gen de interés. La electroporación, a diferencia de la transfección mediada por fosfato de calcio y la fusión de protoplasto, frecuentemente origina líneas celulares que llevan una, o cuando mucho unas cuantas, copias integradas del ADN ajeno. La introducción de ADN por medio de electroporación es bien conocida para el experto en la materia. Para realizar transformación por medio de electroporación, se puede emplear cualquier tejido friable tal como un cultivo de células en suspensión, o callo embriogénico, o alternativamente se pueden transformar directamente embriones inmaduros u otros tejidos organizados. Se pueden degradar parcialmente las paredes celulares de las células elegidas exponiéndolas a enzimas que degradan la pectina (pectoliasas) o lesionando mecánicamente de una manera controlada, haciendo a las células más susceptibles de transformación. Dichas células serían entonces receptoras a la transferencia de ADN por electroporación, que puede llevarse a cabo en esta etapa, y después las células transformadas se pueden identificar mediante un protocolo de selección o escudriñamiento adecuado dependiendo de la naturaleza del ADN recién incorporado. Un método adicional ventajoso para suministrar segmentos de ADN de transformación en células vegetales, es el bombardeo de microproyectiles. En este método se pueden recubrir partículas con ácidos nucleicos para liberarlos en las células mediante una fuerza impulsora. Las partículas ejemplares incluyen las comprendidas de tungsteno, oro, platino y similares. Usando estas partículas, el ADN es transportado a través de la pared celular y hacia el citoplasma, sobre una superficie de partículas metálicas pequeñas como se ha descrito (Klein y otros, 1987; Klein y otros, 1988; Kawara y otros, 1988). Las partículas metálicas penetran a través de varias capas de células y así permiten la transformación de células dentro de explantes de tejido. El método de bombardeo de microproyectil se prefiere para identificar los eventos de transformación dirigida a cloroplasto o plástido.

Una ventaja del bombardeo de microproyectiles, además de que es un medio efectivo de transformación reproducible y estable de células vegetales, es que no se requiere ni el aislamiento de protoplastos (Cristou y otros, 1988) ni la susceptibilidad a infección por Agrobacterium. Una modalidad ilustrativa de un método para suministrar ADN en células vegetales por medio de aceleración, es un Sistema de Suministro de Partículas Biolístico, que se puede usar para impulsar partículas recubiertas con ADN o células, a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o Nytex, sobre una superficie de filtro cubierta con las células vegetales cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de manera tal que estas no son liberadas en las células receptoras en grandes agregados. Se piensa que un tamiz que interviene entre el aparato del proyectil y las células por bombardear, reduce el tamaño del agregado de proyectiles y puede contribuir a una frecuencia mayor de transformación al reducir el daño ocasionado sobre las células receptoras por proyectiles que son muy grandes. Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran preferiblemente sobre filtros o sobre un medio de cultivo sólido. Alternativamente, se pueden disponer embriones inmaduros u otras células objetivo sobre el medio de cultivo sólido. Las células a bombardear se colocan a una distancia apropiada debajo de la placa de detención del microproyectil. Si se desea, también se colocan uno o más tamices entre el dispositivo de aceleración y las células por bombardear. Mediante el uso de las técnicas aquí indicadas se pueden obtener hasta 1000 o más focos de células que expresan transitoriamente un gen marcador. El número de células en un foco que expresan el producto del gen exógeno 48 horas después del bombardeo, frecuentemente varía de 1 a 10, y tiene un promedio de 1 a 3. En la transformación de bombardeo, se pueden optimizar las condiciones de cultivo previas al bombardeo y los parámetros del bombardeo para producir el número máximo de transformantes estables. En esta tecnología son importantes los parámetros tanto físicos como biológicos del bombardeo. Los factores físicos son aquellos que implican la manipulación del precipitado de ADN/microproyectil o aquellos que afectan el vuelo y la velocidad de los macro- o microproyectiles. Los factores biológicos incluyen todos los pasos incluidos en la manipulación de células antes e inmediatamente después del bombardeo, el ajuste osmótico de células objetivo para ayudar a aliviar el trauma asociado con el bombardeo, y también la naturaleza del ADN transformante, tal como ADN linealizado o plásmidos super-enrollados intactos. Se piensa que las manipulaciones previas al bombardeo son especialmente importantes para la transformación exitosa de embriones inmaduros de planta. Consecuentemente, se contempla que se puede buscar el ajuste de varios de los parámetros de bombardeo en estudios a escala menor para optimizar completamente las condiciones. Se puede buscar particularmente ajustar los parámetros físicos tales como distancia de abertura, distancia de vuelo, distancia del tejido y presión de helio. También, se pueden reducir los factores de reducción de trauma (TRFs) modificando las condiciones que afectan el estado fisiológico de las células receptoras y que por lo tanto pueden afectar las eficiencias de transformación e integración. Por ejemplo, el estado osmótico, hidlratación de tejido y la etapa de subcultivo o ciclo celular de las células receptoras, pueden ser ajustados para una transformación óptima. La ejecución de otros ajustes de rutina será conocida para el experto en la técnica a la luz de la presente descripción. Los métodos de transformación mediada por partículas son bien conocidos de los expertos en la materia. La patente de E.U.A. No. 5,015,580 (incorporada específicamente en la presente como referencia) describe la transformación de soyas usando dicha técnica. La transferencia mediada por Agrobacterium es un sistema ampliamente aplicable para introducir genes en células vegetales, ya que el ADN se puede introducir en tejidos de plantas completas, eliminando con ello la necesidad de regeneración de una planta intacta a partir de un protoplasto. El uso de vectores de integración de vegetales mediada por Agrobacterium para introducir ADN en las células vegetales, es bien conocido en la técnica. Véase por ejemplo los métodos descritos (Fraley y otros, 1985; Rogers y otros, 1987). La ingeniería genética de plantas de algodón usando transferencia mediada por Agrobacterium, se describe en la patente de E.U.A. No. 5,004,863 (incorporada específicamente en la presente como referencia); igualmente, la transformación de plantas de lechuga se describe en la patente de E.U.A. No. 5,349,124 (incorporada específicamente en la presente como referencia); y la transformación mediada por Agrobacterium de soya se describe en la patente de E.U.A. No. 5,416,011 (incorporada específicamente en la presente como referencia). Además, la integración del ADN-Ti es un proceso relativamente preciso que produce pocas transposiciones. La región de ADN a ser transferida es definida por las secuencias limítrofes, y el ADN de intervención se inserta usualmente en el genoma de la planta como se describe (Spielmann y otros, 1986; Jorgensen y otros, 1987). Los vectores modernos de transformación de Agrobacterium son capaces de replicación en E. coli así como también en Agrobacterium, permitiendo las manipulaciones convenientes que se describen (Klee y otros, 1985). Además, los avances tecnológicos recientes en vectores para transferencia de genes mediada por Agrobacterium, han mejorado la disposición de genes y sitios de restricción en los vectores para facilitar la construcción de vectores capaces de expresar varios genes que codifican polipéptídos. Los vectores descritos (Rogers y otros, 1987), tienen regiones enlazadoras múltiples convenientes flanqueadas por un promotor y un sitio de poliadenilación para la expresión directa de los genes insertados que codifican el polipéptido, y son adecuados para los propósitos presentes. Además, para las transformaciones, se puede usar Agrobacterium que contiene genes Ti tanto armados como desarmados. En aquellas variedades de plantas en donde es eficiente la transformación mediada por Agrobacterium, es el método de elección debido a la naturaleza fácil y definida de la transferencia de genes. La transformación mediada por Agrobacterium de discos de hoja y otros tejidos tales como cotiledones e hipocotilos, parece estar limitada a las plantas que Agrobacterium infecta naturalmente. La transformación mediada por Agrobacterium es más eficiente en plantas dicotiledóneas. Pocas monocotiledóneas parecen ser hospederos naturales de Agrobacterium, aunque se han producido plantas transgénicas en espárragos usando vectores de Agrobacterium como se describe (Bytebier y otros, 1987). Recientemente, también se han transformado con Agrobacterium otras monocotiledóneas. Incluidos en este grupo están el maíz (Ishida y otros) y el arroz (Cheng y otros). Una planta transgénica formada usando métodos de transformación con Agrobacterium contiene típicamente un solo gen sobre un cromosoma. Dichas plantas transgénicas pueden ser referidas como heterocigóticas para el gen agregado. Sin embargo, como el uso de la palabra "heterocigótico" implica usualmente la presencia de un gen complementario en el mismo locus del segundo cromosoma de un par de cromosomas, y no hay tal gen en una planta que contiene un gen agregado como aquí, se considera que un nombre más exacto para dicha planta es el de un segregante independiente, debido a que el gen exógeno agregado se segrega independientemente durante mitosis y meiosis. Se puede preferir un segregante independiente cuando la planta se comercializa como un híbrido, tal como maíz. En este caso, un segregante independiente que contiene el gen, se cruza con otra planta, para formar una planta híbrida que es heterocigótica para el gen de interés.

Una preferencia alternativa es una planta transgénica que sea homocigótica para el gen estructural agregado; es decir, una planta transgénica que contiene dos genes agregados, un gen en el mismo locus sobre cada cromosoma de un par de cromosomas. Se puede obtener una planta transgénica homocigótica apareando sexualmente (autogamia) una planta transgénica segregante independiente que contiene un solo gen agregado, germinando algunas de las semillas producidas y analizando las plantas resultantes producidas para determinar la actividad del gen de interés y la herencia mendeliana que indica que son homocigóticas con respecto a una planta de control (natural, no transgénica) o una planta -transgénica segregante independiente. Se puede aparear a dos plantas transgénicas diferentes para producir descendencia que contenga dos genes exógenos agregados de segregación independiente. La autogamia de la progenie apropiada puede producir plantas que sean homocigóticas para ambos genes exógenos agregados que codifican un polipéptido de interés. También se contempla retrocruzamiento con una planta paternal y cruzamiento externo con una planta no transgénica. Se puede lograr transformación de protoplastos vegetales usando métodos basados en la precipitación con fosfato de calcio, tratamiento con polietilenglicol, electroporación y combinaciones de estos tratamientos (véanse por ejemplo, Portrykus y otros, 1985; Lorz y otros, 1985; Fromm y otros, 1985; Uchimiya y otros, 1986; Callis y otros, 1987; Marcotte y otros, 1988). La aplicación de estos sistemas a diferente germoplasma de plantas depende de la capacidad para regenerar esa variedad vegetal particular a partir de protoplastos. Se describen métodos ilustrativos para la regeneración de cereales a partir de protoplastos (véase, por ejemplo, Fujimura y otros, 1985, Toriyama y otros, 1986; Yamada y otros, 1986; Abdullah y otros, 1986). Para transformar germoplasma vegetal que no pueden ser regenerado exitosamente a partir de protoplastos, se pueden utilizar otras formas para introducir ADN en células o tejidos intactos. Por ejemplo, se puede efectuar regeneración de cereales a partir de embriones inmaduros o explantes como se describe (Vasil, 1988). Los genes bacterianos no modificados por lo regular se expresan de manera deficiente en células de plantas transgénicas. El uso de codón en las plantas se asemeja más al de humanos y otros organismos superiores que al de organismos unicelulares como bacterias. Varios reportes han descrito métodos para mejorar la expresión de genes recombinantes en plantas (Murray y otros, 1989; Diehn y otros, 1996; lannacone y otros, 1997; Rouwendal y otros, 1997; Futterer y otros, 1997; y Futterer y Hohn, 1996). Estos reportes describen varios métodos para construir por ingeniería secuencias codificadoras para representar secuencias que son traducidas más eficientemente en base a tablas de frecuencia de codón en plantas, mejoramientos en desviación de posición de la tercera base del codón, usando secuencias recombinantes que evitan presuntas secuencias de poliadenilación o dominios ricos en A/T o secuencias de consenso de empalme de intrón. La patente de E.U.A. No. 5,500,365 (incorporada aquí específicamente como referencia) describe el método preferido para sintetizar genes de planta para optimizar el nivel de expresión de la proteína para la cual codifica el gen sintetizado. Este método se refiere a la modificación de las secuencias de gen estructural del transgen exógeno, para hacerlas más "parecidas a la planta" y por lo tanto para que sea más probable que sean traducidas y expresadas por la planta, monocotiledónea o dicotiledónea. Sin embargo, el método descrito en la patente de E.U.A. No. 5,689,052 provee expresión incrementada de transgenes, preferiblemente en plantas monocotiledóneas, que se incorpora aquí en su totalidad como referencia. Brevemente, de acuerdo con Brown y otros, se reduce la frecuencia de codones raros y semi-raros de monocotiledóneas en una secuencia de polinucleótido que codifica una proteína deseada; dichos codones son reemplazados con codones más preferidos de monocotiledóneas. El incremento en la acumulación de un polipéptido deseado codificado por una secuencia de polinucleótido modificada en una planta monocotiledónea, es el resultado de aumentar la frecuencia de codones preferidos, analizando la secuencia de codificación en fragmentos de seis nucleótidos sucesivos, y alterando la secuencia en base a la frecuencia de aparición de los seis-ómeros con respecto a la frecuencia de aparición de los seis-ómeros más raros 284, 484 y 664 en plantas monocotiledóneas. Además, Brown y otros describen el incremento de expresión de un gen recombinante aplicando el método de reducción de la frecuencia de codones raros con métodos de reducción de la ocurrencia de señales de poliadenilación y sitios de empalme de intrón en la secuencia de nucleótidos, removiendo secuencias autocomplementarias en la secuencia de nucleótidos y reemplazando tales secuencias con nucleótidos no autocomplementarios, pero manteniendo un gen estructural que codifica el polipéptido, y reduciendo la frecuencia de la ocurrencia de los pares de dinucleótido 5'-CG-3' en la secuencia de nucleótidos. Estos pasos se realizan secuencialmente y tienen un efecto acumulativo que da como resultado una secuencia de nucleótidos que contiene una utilización preferencial de los codones más preferidos de monocotiledóneas para las plantas monocotiledóneas, para la mayoría de los aminoácidos presentes en el polipéptido deseado. Así, se puede aumentar la cantidad de un gen que codifica un polipéptido de interés en las plantas, transformando dichas plantas usando métodos de transformación tales como los que aquí se describen. En particular, la transformación de cloroplasto o plástido puede originar que las secuencias codificadoras deseadas están presentes en hasta aproximadamente 10,000 copias por célula en tejidos que contienen estas estructuras de organelo subcelular (McBride y otros Bio/Technology 13:362-365, 1995).

También se puede introducir ADN en las plantas por transferencia directa de ADN en el polen, como se describe (Zhou y otros, 1983; Hess, 1987). La expresión de genes que codifican polipéptido se puede obtener por inyección del ADN en órganos reproductores de una planta como se describe (Pena y otros, 1987). También se puede inyectar directamente ADN en las células de embriones inmaduros e introducirse en células por rehidratación de embriones desecados como se describe (Neuhaus y otros, 1987; Benbrook y otros, 1986). Después de efectuar el suministro de ADN exógeno a las células receptoras, el siguiente paso es obtener una planta transgénica, que generalmente implica identificar las células transformadas para cultivarlas adicionalmente y regenerar la planta. Como se menciona en la presente, para mejorar la capacidad de identificación transformantes, se puede emplear un gen marcador seleccionable o escudriñable como el gen expresable de interés, o además del mismo. En este caso, después se probaría la población de células potencialmente transformadas exponiendo las células a un agente o agentes selectivos, o se escudriñarían las células para seleccionar las que tienen el rasgo del gen marcador deseado. Una modalidad ejemplar de los métodos para identificar células transformadas, incluye exponer los cultivos transformados a un agente selectivo tal como un inhibidor metabólico, un antibiótico, herbicida o similar. Las células que han sido transformadas y que tienen un gen marcador integrado establemente que confiere resistencia al agente selectivo usado, crecerán y se dividirán en cultivo. Las células sensibles no serán susceptibles de más cultivo. Un ejemplo de un gen marcador preferido confiere resistencia a glifosato. Cuando este gen se usa como un marcador seleccionable, el cultivo celular transformado putativamente, se trata con glifosato. Después del tratamiento, las células transgénicas estarán disponibles para cultivo posterior, mientras que las células sensibles o no transformadas no lo estarán. Este método se describe en detalle en la patente de E.U.A. No. 5,569,834, que se incorpora específicamente en la presente como referencia. Otro ejemplo de un sistema marcador seleccionable preferido, es el sistema de resistencia de neomicina fosfotransferasa (npfll) por medio del cual se confiere resistencia al antibiótico kanamicina, como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,569,834 (incorporada aquí específicamente como referencia). Nuevamente, después de la transformación con este sistema, las células transformadas estarán disponibles para cultivo posterior después de tratamiento con kanamicina, mientras que las células no transformadas no lo estarán. Otro sistema marcador seleccionable preferido incluye el uso de una construcción de gen que confiere resistencia a paromomicina. Un uso de este tipo de sistema marcador seleccionable se describe en la patente de E.U.A. No. 5,424,412 (incorporada específicamente en la presente como referencia). Otro sistema marcador seleccionable preferido incluye el uso de los genes contemplados por esta invención. En particular, se puede utilizar un gen phnO, o un gen sustancialmente similar que codifica una AMPA transacilasa, como un marcador seleccionable. Células vegetales que tienen una molécula de ADN recombinante introducida en su genoma, se pueden seleccionar de una población de células que no pudieron incorporar una molécula recombinante, haciendo crecer las células en presencia de AMPA. El experto en la materia reconocerá las ventajas particulares que tiene este sistema marcador seleccionable sobre los sistemas marcadores seleccionables previos. El marcador seleccionable usado en el ADN recombinante integrado en un genoma de planta, reduce la cantidad de ADN destinado a integración porque el marcador seleccionable también será usado para mejorar la tolerancia a herbicida o para mejorar la resistencia a herbicida en plantas generadas de células de planta transformadas. Este marcador seleccionable también provee un sistema marcador adicional no conocido anteriormente, particularmente en un campo en el cual regularmente solo hay disponible un número limitado de marcadores seleccionables. La selección transplastonómica (selección de eventos de transformación de plástido o cloroplasto) es simplificada tomando ventaja de la sensibilidad de cloroplastos o plástidos a la espectinomicina, un inhibidor de la síntesis de proteínas de plástidos o cloroplastos, pero no de la síntesis de proteínas de los ribosomas citoplásmicos codificadas por el genoma nuclear. La espectinomicina impide la acumulación de proteínas de cloroplasto requeridas para la fotosíntesis, y por lo tanto las células vegetales transformadas resistentes a espectinomicina se pueden distinguir en base a su diferencia de color: las células transformadas resistentes son verdes, mientras que las células sensibles son blancas debido a la inhibición de la síntesis de proteína de los plástídos. La transformación de cloroplastos o plástidos con un gen aad bacteriano adecuado, o con un gen que codifica un ARN ribosomal funcional de plástido o cloroplasto resistente a espectinomicina, provee un medio para la selección y mantenimiento de eventos transplastonómicos (Maliga, Trends in Biotechnology 11 :101-106, 1993). Se contempla además que combinaciones de marcadores escudriñables y seleccionables serán de utilidad para la identificación de células transformadas. En algunos tipos de células o tejidos, un agente de selección tal como glifosato o kanamicina, puede no proveer suficiente actividad destructiva para reconocer claramente las células transformadas, o puede ocasionar inhibición sustancialmente no selectiva tanto de transformantes como de no transformantes, ocasionando así que la técnica de selección no sea efectiva. Se propone que la selección con un compuesto inhibidor de crecimiento, tal como glifosato, a concentraciones por abajo de las que ocasionan 100% de inhibición, seguida por escudriñamiento del tejido desarrollado para determinar la expresión de un gen marcador escudriñable tal como kanamicina, permitiría recuperar transformantes de tipos de células o tejidos que no son susceptibles de selección por si solos. Se propone que combinaciones de selección y escudriñamiento pueden permitir identificar transformantes en una variedad más amplia de tipos de células y tejidos. La disponibilidad de las transacilasas de la presente invención puede eliminar la necesidad de combinar selección y escudriñamiento, proveyendo un medio de selección adicional. El desarrollo o regeneración de plantas a partir de protoplastos vegetales individuales, o de varios explantes, es bien conocida en la técnica (Weissbach y Weissbach, 1988). Este proceso de regeneración y crecimiento incluye típicamente los pasos de selección de células transformadas y cultivo de las células individualizadas mediante las etapas usuales de desarrollo embriónico en toda la etapa de plantilla enraizada. Embriones y semillas transgénicas se regeneran de forma similar. Los vastagos enraizados transgénicos resultantes se siembran después en un medio apropiado de crecimiento de plantas, tal como tierra. Puede lograrse el desarrollo o regeneración de plantas que contienen el gen ajeno exógeno que codifica un polipéptido de interés introducido por Agrobacterium, de explantes de hoja, por medio de métodos bien conocidos en la técnica como los que se describen (Horsch y otros, 1985). En este procedimiento, se cultivan transformantes en presencia de un agente de selección y en un medio que induce la regeneración de vastagos en la raza de planta que se transforma, como lo describen (Fraley y otros, 1983). En particular, la patente de E.U.A. No. 5,349,124 (especificación incorporada aquí como referencia) detalla la creación de células de lechuga transformadas genéticamente y plantas que se originan de las mismas, que expresan proteínas cristalinas híbridas que confieren actividad insecticida contra larvas de lepidópteros a tales plantas.

Este procedimiento produce típicamente vastagos en el transcurso de dos a cuatro meses, y estos vastagos se transfieren entonces a un medio inductor de raíz apropiado que contiene el agente selectivo y un antibiótico para evitar el crecimiento bacteriano. Los vastagos que echan raíz en presencia del agente selectivo para formar plantillas, se transplantan después al suelo u otro medio para permitir la producción de raíces. Estos procedimientos varían dependiendo de la raza vegetal particular empleada, siendo tales variaciones bien conocidas en la técnica. Preferiblemente, las plantas regeneradas son autopolinizadas para proveer plantas transgénicas homocigóticas, o el polen obtenido de las plantas regeneradas se cruza con plantas desarrolladas por semilla de líneas agronómicamente importantes, preferiblemente endogámicas.

Recíprocamente, el polen de las plantas de estas líneas importantes se usa para polinizar plantas regeneradas. Una planta transgénica de la presente invención que contiene un polipéptido deseado, se cultiva usando los métodos bien conocidos para el experto en la materia. En una modalidad, una planta transgénica de esta invención tiene por tanto una cantidad incrementada de una región codificadora que codifica un polipéptido de AMPA transacilasa que también puede ser expresado junto con un péptido de dirección a plástido. Una planta transgénica preferida es un segregante independiente, y puede transmitir ese gen y su actividad a su progenie. Una planta transgénica muy preferida es homocigótica para ese gen, y transmite ese gen a toda su descendencia por apareamiento sexual. La semilla de una planta transgénica se puede desarrollar en un campo o invernadero, y las plantas transgénicas sexualmente maduras resultantes son autopolinizadas para generar plantas de reproducción verdadera. La progenie de estas plantas se convierte en líneas de reproducción verdadera que son evaluadas para determinar su expresión del transgen de transacilasa y también para determinar su tolerancia mejorada a herbicida, particularmente cuando el transgen de transacilasa es coexpresado junto con un gen que codifica una enzima GOX. Los genes y las aciltransferasas de acuerdo con la presente invención, incluyen no solo las secuencias de longitud completa descritas en la presente, sino también los fragmentos de estas secuencias o proteínas de fusión que retienen las características de actividad protectora mejorada contra herbicida de las secuencias que se ejemplifican aquí específicamente. Sería evidente para una persona experta en este campo, que los genes y péptidos de AMPA transacilasa se pueden identificar y obtener por varios medios. Los genes específicos, o porciones de los mismos, se pueden obtener de un depósito de cultivos, o se pueden construir sintéticamente, por ejemplo, usando una máquina de genes. Se pueden construir fácilmente variaciones de estos genes usando las técnicas estándares para hacer mutaciones de punto. También los fragmentos de estos genes se pueden hacer usando las exonucleasas o endonucleasas disponibles comercialmente, de acuerdo con procedimientos estándares. Por ejemplo, se pueden usar enzimas tales como fía 31 o mutagénesis dirigida de sitio, para cortar sistemáticamente nucleótidos de los extremos de estos genes. También, los genes que codifican para fragmentos activos se pueden obtener usando una variedad de otras enzimas de restricción. Se pueden usar proteasas para obtener directamente fragmentos activos de tales transacilasas. También se pueden aislar AMPA transacilasas y/o genes equivalentes que codifican estas transacilasas, de cepas de E. coli y/o de colecciones de ADN, usando las enseñanzas aquí provistas. Por ejemplo, se pueden usar anticuerpos para las transacilasas descritas y reclamadas en la presente, para identificar y aislar otras transacilasas de una mezcla de proteínas. Específicamente, se pueden desarrollar anticuerpos para las transacilasas aquí descritas, y usarse para identificar específicamente AMPA transacilasas equivalentes por inmunoprecipitación, inmunopurificación en columna, inmunoensayo de unión a enzima (ELISA), o Western blotting. Un método adicional para identificar los péptidos y genes de la presente invención, es mediante el uso de sondas de oligonucleótido. Estas sondas son secuencias de nucleótidos que tienen una marca detectable. Como es bien conocido en la técnica, si hibrida la molécula de sonda con las secuencias en una muestra de ácido nucleico objetivo, formando un fuerte enlace entre las dos moléculas, se puede suponer razonablemente que la sonda y la muestra objetivo contienen secuencias de polinucleótido esencialmente idénticas. La marca detectable de la sonda provee un medio para determinar de una manera conocida si ha ocurrido hibridación. Este análisis de sonda provee un método rápido para identificar genes de AMPA transacilasa de la presente invención. Los segmentos de nucleótído que se usan como sondas de acuerdo con la invención se pueden sintetizar usando sintetizadores de ADN mediante procedimientos estándares. En el uso de los segmentos de nucleótido como sondas, la sonda particular se marca con cualquier marca adecuada conocida para el técnico en la materia, incluyendo marcas radioactivas y no radioactivas. Las marcas radioactivas típicas incluyen 32p 125^ 35S, o similares. Se puede construir una sonda marcada con un isótopo radioactivo partiendo de una secuencia de nucleótidos complementaria a la muestra de ADN, por medio de una reacción de traducción nick, usando una ADNasa y ADN polimerasa. La sonda y la muestra se pueden combinar entonces en una solución amortiguadora de hibridación y mantenerse a una temperatura apropiada hasta que ocurre apareamiento. Después, se lava la membrana para dejarla libre de materiales extraños, dejando la muestra, y las moléculas unidas a la sonda se detectan y cuantifican típicamente por autorradiografía y/o conteo de escintilación de líquidos. Las marcas no radioactivas incluyen, por ejemplo, ligandos como biotina o tiroxina, así como también enzimas como hidrolasas o peroxidasas, o los varios quimioluminiscentes como lucíferina, o compuestos fluorescentes como fluoresceína, rodamina, Rojo de Texas, derivados y similares. También se puede marcar la sonda en ambos extremos con diferentes tipos de marcas para facilitar la separación, como por ejemplo usando una marca isotópica en el extremo mencionado arriba, y una marca de biotina en el otro extremo, o con diferentes emisores fluorescentes que tienen espectros de absorción y emisión superpuestos. La formación del dúplex y la estabilidad dependen de la complementariedad sustancial entre las dos cadenas de un híbrido y, como se indicó arriba, se puede tolerar un cierto grado de desapareamiento. Por lo tanto, las sondas de la presente invención incluyen mutaciones (tanto simples como múltiples), supresiones, inserciones de las secuencias descritas y combinaciones de las mismas, en donde dichas mutaciones, inserciones y supresiones permiten la formación de híbridos estables con el polínucleótido objetivo de interés. Se pueden producir de muchas maneras mutaciones, inserciones y supresiones en una secuencia dada de polinucleótido, con los métodos actualmente conocidos para el técnico con conocimientos medios en la materia, y quizás con otros métodos que se lleguen a conocer en el futuro. Las variaciones potenciales en las sondas listadas se deben, en parte, a la redundancia del código genético. Debido a la redundancia del código genético, puede ser usado más de un triplete (codón) de nucleótidos de codificación para la mayoría de los aminoácidos usados para hacer proteínas. Por lo tanto, diferentes secuencias de nucleótidos pueden codificar para un aminoácido particular. De esta manera, la secuencia de aminoácidos de la AMPA transacilasa y péptido de E. coli, y los péptidos de dirección a plástido, y los polinucleótidos que los codifican, se pueden preparar por medio de secuencias de nucleótido equivalentes que codifican la misma secuencia de aminoácidos de la proteína o péptido. Consecuentemente, la presente invención incluye dichas secuencias de nucleótido equivalentes. También, secuencias inversas o complementarias son un aspecto de la presente invención y pueden ser usadas fácilmente por un técnico experto en la materia. Además, se ha mostrado que se pueden construir proteínas de estructura y función identificadas cambiando la secuencia de aminoácidos, si tales cambios no alteran la estructura secundaria de la proteína (Kaiser y Kezdy, 1984). Así, la presente invención incluye mutantes de la secuencia de aminoácidos aquí representada que no alteran la estructura secundaria de la proteína, o si se altera la estructura, se retiene sustancialmente la actividad biológica. Además, la invención también incluye mutantes de organismos que hospedan todo o parte de un gen que codifica una AMPA aciltransferasa y/o un gen que codifica un péptido de dirección a plástido, como se describen en la presente invención. Dichos mutantes se pueden preparar mediante técnicas bien conocidas para el experto en la materia. Por ejemplo, se puede usar radiación UV para preparar mutantes de organismos hospederos. Asimismo, dichos mutantes pueden ¡ncluir células hospederas esporógenas que también se pueden preparar por procedimientos bien conocidos en la técnica. La mutagénesis específica de sitio o dirigida a sitio, es una técnica útil en la preparación de péptidos útiles individuales, novedosos y únicos, o proteínas o péptidos funcionales biológicamente equivalentes, por medio de mutagénesis específica de genes estructurales que codifican tales péptidos. La técnica provee además una rápida capacidad para preparar y probar variantes de secuencia, alterando la secuencia codificadora de un gen, por ejemplo, introduciendo uno o más cambios de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos en el ADN con el fin de crear una nueva secuencia útil de reconocimiento de corte de endonucleasa de restricción, o con el fin de alterar la secuencia codificadora para que los codones de un gen y el porcentaje de G/C representen los usados más comúnmente por un género o especie particular. La mutagénesis específica de sitio permite la producción de mutaciones de supresión, inserción o reemplazo usando secuencias de oligonucleótido de mutagénesis específicas que comprenden la secuencia de ADN de la mutación deseada. Los oligonucleótidos de mutagénesis proveen típicamente una secuencia iniciadora de tamaño y complejidad de secuencia suficientes para formar un dúplex estable en ambos lados del sitio objetivo de la mutación deseada. Típicamente, se prefiere un iniciador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de longitud, con aproximadamente de 5 a 10 residuos superpuestos en cualquier lado del sitio objetivo de la mutación deseada. En general, la técnica de la mutagénesis específica de sitio es bien conocida en la técnica, como es ejemplificado en varias publicaciones. Como será apreciado, la técnica emplea regularmente un vector de fago que existe en una forma tanto de una sola cadena como de doble cadena. Típicamente, los vectores útiles en la mutagénesis dirigida a sitio incluyen vectores tales como el fago M13. Estos fagos se tienen fácilmente disponibles en forma comercial y su uso es generalmente bien conocido por los expertos en la materia. También se emplean rutinariamente plásmidos de doble cadena en mutagénesis dirigida a sitio, y a menudo contienen un origen de replicación de fago filamentoso que, en presencia de un fago auxiliador, permite la síntesis de ADN de doble cadena del vector plasmídico. En general, la mutagénesis dirigida a sitio de acuerdo con la presente se realiza obteniendo primero un vector de una sola cadena o fusionando aparte dos cadenas de un vector de doble cadena que incluye dentro de su secuencia un sitio objetivo de mutación. Se prepara un oligonucleótido iniciador que lleva la secuencia mutada deseada, por lo general sintéticamente. Este iniciador de mutagénesis se aparea después con el vector de una sola cadena en el sitio objetivo de mutación, y se somete a enzimas de polimerización de ADN tales como fragmento Klenow de polimerasa I de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Así, se forma un heterodúplex en el cual una cadena codifica la secuencia no mutada original y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodúplex se usa después para transformar células apropiadas tales como células de E. coli, y se seleccionan las clonas que incluyen los vectores recombinantes que contienen la mutación representada por la secuencia de iniciador de mutagénesis. La preparación de variantes de secuencia de los segmentos de ADN codificadores de péptido seleccionados, usando mutagénesis dirigida a sitio, se provee como un medio para producir especies potencialmente útiles, y no significa que sea limitativo, ya que hay otras maneras mediante las cuales se pueden obtener variantes de secuencia de péptidos y secuencias de ADN que los codifican. Por ejemplo, los vectores recombinantes que codifican la secuencia de péptido deseada se pueden tratar con agentes mutagénicos, tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Dichos procedimientos cambian favorablemente las características bioquímicas y biofísicas de la proteína o su modo de acción. Estas incluyen, sin limitación, (1 ) formación mejorada de AMPA transacilasa; (2) estabilidad mejorada de la proteína o degradación reducida por proteasa; (3) reconocimiento y unión mejoradas de substrato; (4) cinética enzimática mejorada; y (5) formación mejorada de N-acil-AMPA debido a cualquiera de las razones señaladas arriba, o a todas ellas. Se pueden hacer modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y los segmentos de ADN que los codifican, y obtener todavía una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con características deseables. Los péptidos, polipéptidos y proteínas funcionales biológicamente equivalentes que se contemplan en la presente, deben tener por lo menos de aproximadamente 40% a aproximadamente 65% de similitud de secuencia, de preferencia de aproximadamente 66% a aproximadamente 75% de similitud de secuencia, de preferencia de aproximadamente 76% a aproximadamente 85% de similitud, y es preferido de aproximadamente 86% a aproximadamente 90% o más de similitud de secuencia con las secuencias de aminoácidos de AMPA aciltransferasa que se describen en la presente, o con una porción correspondiente dentro de las mismas. La siguiente es una descripción basada en el cambio de aminoácidos de una proteína para crear una molécula equivalente, o incluso una molécula mejorada, de segunda generación. En modalidades particulares de la invención, se contemplan proteínas AMPA transacilasa mutadas que son útiles para mejorar o aumentar la expresión de la proteína en planta, y consecuentemente incrementar o mejorar la actividad AMPA transacilasa y/o la expresión del transgen recombinante en una célula vegetal. Los cambios de los aminoácidos se pueden lograr cambiando los codones de la secuencia de ADN, de acuerdo con los codones dados en el cuadro 1, en plantas dicotiledóneas, y más particularmente en monocotiledóneas.

CUADRO 1 Aminoácido Codones Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisteína Cys C UGC UGU Acido aspártico Asp D GAC GAU Acido glutámico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC UUU Glicina Gly G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina lle 1 AUA AUC AUU Lisina Lys K AAA AAG CUADRO 1 (Continuación) Aminoácido Codones Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Mel: M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gln Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACÁ ACC ACG ACU Valina Val V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp w UGG Tirosina Tyr Y UAC UAU Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura de proteína, sin pérdida apreciable de la capacidad de unión interactiva con estructuras tales como por ejemplo regiones de unión de antígeno de anticuefos, o sitios de unión sobre moléculas de substrato. Puesto que es la capacidad interactiva y la naturaleza de una proteína la que define la actividad biológica funcional de esa proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de la secuencia de aminoácidos en una secuencia de proteína y desde luego su secuencia codificadora de ADN fundamental, y no obstante obtener una proteína con propiedades similares. Se contempla así por parte de los inventores que se pueden hacer varios cambios en las secuencias de péptidos de las composiciones descritas, o de las secuencias correspondientes de ADN que codifican dichos péptidos, sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica. Al hacer tales cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático del aminoácido para conferir la función biológica interactiva sobre una proteína, es entendida por lo general en la técnica (Kyte y Doolittle, 1982, incorporado aquí como referencia). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, substratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos y similares. Se ha asignado a cada aminoácido un índice hidropático en base a sus características hidrófobas y de carga (Kyte y Doolittle, 1982), estos son: isoleucina (+4.5); valina (+4.2); leucina (+3.8); fenilalanina (+2.8); cisteína/cistina (+2.5); metionina (+1.9); alanina (+1.8); glicina (-0.4); treonina (-0.7); serina (-0.8); triptofano (-0.9); tirosina (-1.3); prolina (-1.6); histidina (-3.2); glutamato (-3.5); glutamina (-3.5); aspartato (-3.5); asparagina (-3.5); lisina (-3.9); y arginina (-4.5). Es conocido en la técnica que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice o calificación hidropática similar, y que dan origen a una proteína con actividad biológica similar, esto es, se obtiene todavía una proteína funcional biológicamente equivalente. Al hacer tales cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de ± 2; aquellos que estén dentro de ± 1 son particularmente preferidos, y son aún más preferidos dentro de ± 0.5. También se entiende en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer efectivamente en base a la hidrofilicidad. La patente de los E.U.A. No. 4,554,101 , incorporada aquí como referencia, indica que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, gobernada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Como se describe en la patente de los E.U.A. No. 4,554,101 , se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a los residuos de aminoácidos: arginina (+3.0); Nsina (+3.0); aspartato (+3.0 ± 1 ); glutamato (+3.0 ± 1 ); serina (+0.3); asparagina (+0.2); glutamina (+0.2); glicina (0); treonina (-0.4); prolina (-0.5 ± 1 ); alanina (-0.5); histidina (-0.5); cisteína (-1.0); metionina (-1.3); valina (-1.5); leucina (-1.8); isoleucina (-1.8); tirosina (-2.3); fenilalanina (-2.5); triptofano (-3.4). Se entiende que un aminoácido puede ser reemplazado con otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar, y obtenerse todavía una proteína biológicamente equivalente y, en particular, inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad estén dentro de ±2; se prefieren particularmente los que estén dentro de ±1 , y son más preferidos aquellos dentro de ±0.5.

Por lo tanto, como se señaló anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan por lo general en la similitud relativa de los sustituyentes de cadena lateral del aminoácido, por ejemplo su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Sustituciones ejemplares que toman en consideración varias de las características anteriores, son bien conocidas para el experto en la materia e ¡ncluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. El experto en la materia sabe que los polinucleótidos que codifican proteínas heterólogas generalmente se expresan de manera deficiente cuando se incorporan en el ADN nuclear de plantas transgénicas (revisado por Diehn y otros, 1996). Preferiblemente, una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína heteróloga de interés, se diseña esencialmente como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,500,365 y en la patente de E.U.A. No. 5,689,052 (cada una incorporada específicamente en la presente como referencia). Ejemplos de secuencias de nucleótidos útiles para expresión incluyen, sin limitación, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:19. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia de polipéptido fundamental se pueden seleccionar de otros miembros de la clase a la cual pertenece el aminoácido natural. Los aminoácidos se pueden dividir en los siguientes cuatro grupos: (1) aminoácidos ácidos; (2) aminoácidos básicos; (3) aminoácidos polares neutros; y (4) aminoácidos no polares neutros. Aminoácidos representativos dentro de estos varios grupos ¡ncluyen, sin limitación, (1) aminoácidos ácidos (cargados negativamente) tales como ácido aspártico y ácido glutámico; (2) aminoácidos básicos (cargados positivamente) tales como arginina, histidina y lisina; (3) aminoácidos polares neutros tales como glicina, serina, treonina, cisteína, cistina, tirosina, asparagina y glutamina; (4) aminoácidos no polares (hidrófobos) neutros tales como alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Se pueden hacer cambios conservativos de aminoácidos dentro de una secuencia de polipéptido fundamental, sustituyendo un aminoácido dentro de estos grupos con otro aminoácido dentro del mismo grupo. La secuencia de nucleótidos codificadora (gen, ADN plasmídico, ADNc o ADN sintético) tendrá así sustituciones de bases correspondientes, permitiéndole codificar formas funcionales biológicamente equivalentes de una AMPA transacilasa. Los siguientes ejemplos describen modalidades preferidas de la invención. Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones presentes serán evidentes para el experto en la materia, de la consideración de la especificación o práctica de la invención como se describe en la presente. Se pretende que la especificación, junto con los ejemplos, sea considerada solo como ejemplar, siendo indicado el espíritu y alcance de la invención por las revi nclicacio nes que siguen a los ejemplos. En los ejemplos, todos los porcentajes se dan en base al peso, a menos que se indique de otra forma.

EJEMPLOS EJEMPL0 1 Este ejemplo ilustra los efectos inhibidores de crecimiento de ácido N-aminometilfosfónico (AMPA) sobre tejido de callo de planta, y la ausencia de inhibición de ácido N-acetil-aminometilfosfónico sobre tejido de callo de planta en condiciones de cultivo in vitro. Ciertas especies de plantas recombinantes que expresan un gen GOX bacteriano, y que también se expusieron a glifosato, pueden exhibir efectos fitotóxicos, manifestados mediante síntomas tales como clorosis, abscisión de flor y fertilidad reducida. La base para estos síntomas no se había determinado previamente. Estudios previos habían indicado que plantas que expresan GOX metabolizaron glifosato a AMPA y glioxilato (patente de E.U.A. No. 5,463,175). El glioxilato es metabolizado rápidamente en plantas; sin embargo, persiste el AMPA en los tejidos vegetales y puede ser la causa de efectos fitotóxicos tales como clorosis, achaparramiento u otros efectos indeseables. Se había mostrado previamente que las especies LBAA de Achromobacter eran capaces de modificar enzimáticamente AMPA a N-acetil-AMPA (patente de E.U.A. No. 5,463,175). Los datos sobre Achromobacter, en conjunto con los datos de fitotoxicidad vegetal, indicaron que la N-acilación de AMPA en la planta puede proveer una solución efectiva a la clorosis y otros efectos indeseables. De esta manera, tejido de callo de tabaco se expuso a AMPA y a N-acetil-AMPA para determinar si cualquiera de estos compuestos exhibía efectos citotóxicos similares a los observados en plantas que expresan GOX y se exponen a glifosato. Se generaron callos de tabaco de piezas de hoja de tabaco Nicotiana tabacum tipo silvestre cv. "Samsun" en placas MS104 (sales MS 4.3 g/l, sacarosa 30 g/l, vitaminas B5 500 x 2ml/l, NAA 0.1 mg/l, y Bacto Agar 1.0 mg/ml). Se aplicó tejido de callo a placas con o sin AMPA, y con o sin N-acetil-AMPA. Las placas contenían AMPA o N-acetil-AMPA a concentraciones de 0.1 mM o 0.4 mM. Las placas se incubaron por hasta tres semanas y se monitorearon periódicamente. El tejido de callo en las placas de control que no contenían AMPA ni N-acetil-AMPA, creció a velocidad normal, regenerándose raíces y vastagos como se esperaba. El tejido de callo en presencia de AMPA fue inhibido severamente. No se observó crecimiento, mostrando el efecto fitotóxico de AMPA a estas concentraciones. El tejido de callo en las placas que contenían N-acetil-AMPA no fue inhibido, y formó raíces y vastagos similares a los del tejido desarrollado de callo de control. Este resultado indicó que el AMPA, como un subproducto de metabolismo de glifosato mediado por GOX, podría ser el responsable de la fitotoxicidad observada en las plantas. Este resultado también indicó la posibilidad de un método mejorado para seleccionar plantas de tejido de callo transformado genéticamente, así como también un posible método para incrementar la resistencia al herbicida glifosato.

EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra que la degradación de glifosato por hidrólisis con enzima GOX en la bacteria Achromobacter sp., cepa LBAA, da como resultado la producción de AMPA y N-acetil-AMPA. Se había mostrado previamente que la degradación de glifosato mediada por GOX, producía glioxilato y AMPA (Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,463,175). También se mostró que la cepa LBAA de Achromobacter sp., producía AMPA y glioxilato como resultado de la degradación de glifosato. De acuerdo con el siguiente procedimiento, se caracterizó la ruta de degradación de glifosato en células en reposo de la cepa LBAA de Achromobacter sp. desarrollada en glifosato. Se cultivaron células de un cultivo de 100 ml de LBAA, desarrolladas en medio DF3S conteniendo glucosa, gluconato y citrato como las fuentes de carbono, con tiamina y extracto de levadura (0.01 %) para suministrar los requerimientos de vestigios, y con glifosato a 0.2 mM como una fuente de fósforo; a una densidad celular de 200 unidades Klett; se lavaron dos veces con 20 ml de medio DF3S, y el equivalente de 20 ml de células se resuspendieron en 100 I del mismo medio conteniendo [14C]glifosato (2.5 ml de 52 mCi/mmol, Amersham; CFA.745). La mezcla celular se incubó a 30°C con agitación, y se tomaron muestras de 20 ml a varios intervalos. La muestras se centrifugaron para separar las células del sobrenadante del caldo. Se analizaron tanto el sobrenadante como las pellas de las células por medio de HPLC. Las muestras preparadas de esta manera se analizaron por medio de HPLC de intercambio de aniones fuertes (SAX) con detección de marca de radioisótopo para determinar sus niveles de [14C]-AMPA y N-acetil-[14C]-AMPA. Se inyectaron muestras usando un autoinyector Waters WISP. Se recolectaron perfiles cromatográficos y datos cuantitativos usando MACS2, un sistema automático de recolección de datos cromatográficos de Monsanto. Para los análisis se usó una columna SAX Spherisorb S5 de 250 mm x 10 mm, o una columna SAX Alltech de 5 mieras, 250 mm x 10 mm. Los solventes usados se designaron como solución A y solución B. La solución A contenía KH2P04 0.005M ajustada a pH 2.0 con H3P04 en metanol al 4%. La solución B contenía KH2P0 0.10 M ajustada a pH 2.0 con H3PO4 en metanol al 4%. Cada tiempo de corrida de la muestra consistió de un programa de gradiente en pasos con una velocidad de flujo de eluyente de 3 ml por minuto y una velocidad de flujo de fluido de escintilación (marca ATOMFLOW No. NEN-995, obtenido de Packard Instruments) de 9 ml por minuto. El perfil de solvente oe HPLC para distinguir [14C]-AMPA de N-acetil-[14C]-AMPA en cada muestra analizada, fue representada por 100% de solvente A a los tiempos cero a 5 minutos, después el solvente B al 100% al tiempo 5 minutos hasta 15 minutos, después 100% del solvente A hasta 20 minutos, al cabo de los cuales la columna se prepara para recibir otra muestra.

Las pellas celulares primero se resuspendieron en medio DF3S, que se hizo ácido con la adición de HCl 0.65 N, se hirvieron 5 minutos, y después se centrifugó brevemente para proveer una fase en solución para análisis de HPLC. Los sobrenadantes se trataron de manera similar antes del análisis de HPLC. Un control de glifosato acidificado también se sometió a análisis de HPLC, y se determinó que el tiempo de retención de glifosato (RT) era de 10.8 minutos. La cantidad de radioactividad en el pico de glifosato que permaneció en el sobrenadante después de dos horas de incubación, había disminuido hasta cerca de 33% de los niveles iniciales, indicando que el glifosato fue ampliamente metabolizado. Se encontró que cerca del 3% del glifosato estaba dentro de la célula. El material coeluido con el estándar de metilamina con un RT de 6 minutos, representó aproximadamente 5% de la cantidad inicial de radioactividad en el sobrenadante, y aproximadamente 1.5% de la cantidad inicial de radioactividad identificada en los contenidos celulares. La ruta de degradación de glifosato mediada por GOX se elucidó más en un experimento subsecuente en donde se comparó el metabolismo de [14C]-AMPA con el de [14C]-glifosato, como se indicó arriba, en células en reposo cultivadas a 165 unidades Klett y resuspendidas en el equivalente de 15 ml de células por 100 ml de medio DF3S. Las muestras se analizaron por HPLC y consistieron de cultivos completos acidificados y tratados según se describió arriba. Se encontró que los cultivos expuestos a [1 C]-glifosato durante dos horas, tenían 25% de la marca en el pico de metilamina/N-acetil- metilamina, con un tiempo de retención de 14.7 minutos; 12.5% como AMPA, con un tiempo de retención de 6 minutos; 30% en un pico con un tiempo de retención de 13.2 minutos; y 30% como glifosato con un tiempo de retención de 10.8 minutos. El análisis de cultivos expuestos a [14C]-AMPA por dos horas, indicó que 15% de la marca se encontró como N-acetil-metilamina/metilamina, 59% como AMPA y 18% en el pico de 13.2 minutos. El material eluido a los 13.2 minutos fue identificado como N-acetil-AMPA por medio de espectrometría de masa de electroaspersión de iones negativos. El resultado mostró iones fuertes a m/e 152 y m/e 154, como se esperaba para este compuesto, que tenía un peso molecular de 153 Daltons. El ion con m/e 154 fue debido al átomo isotópico 14C. El N-acetil-metil-[i C]-AMPA se produce de N-metil-[14C]-AMPA, que es una impureza conocida en preparaciones de [14C]-AMPA. Estos datos indican que la ruta de degradación de glifosato en la cepa LBAA de Achromobacter procede de la hidrólisis de glifosato a AMPA, el cual es convertido después en los productos de metilamina, presumiblemente a través de un paso de desfosforilación, y N-acetil-AMPA, presumiblemente a través de algún paso de transacilación previamente desconocido. Una pequeña cantidad de N-acetil-AMPA es convertida entonces en N-acetil-metilamina. Se ha inferido un paso de acilación similar de los productos identificados en E. coli cuando son utilizados aminometilfosfonatos como las únicas fuentes de fosfato (Avila y otros, 1987).

EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra la identificación de una actividad de AMPA aciltransferasa en E. coli. Avila y otros (1987) identificaron productos de biodegradación desfosforilados del metabolismo de una variedad de substratos de aminofosfonato usados como la única fuente de fosfato in vivo en E. coli, mientras estudiaban la escisión del enlace C-P. Sus estudios indicaron que el AMPA no era un substrato para acilación en E. coli K-12. Además, Avila y otros estuvieron interesados en el efecto de sustituciones químicas N-enlazadas sobre la escisión del enlace C-P de fosfonatos en E. coli e identificaron productos N-acetilados derivados del metabolismo de algunos aminofosfonatos. Avila y otros también demostraron que las cepas K12 de E. coli de "tipo silvestre", a diferencia de las cepas B de E. coli de tipo silvestre, son incapaces de usar fosfonatos como una fuente de fosfato. De esta manera, al considerar los efectos fitotóxicos de AMPA sobre tejido de callo como se muestra en el ejemplo 1 , y la generación de AMPA de la degradación de glifosato mediada por GOX como se muestra en el ejemplo 2, los datos en E. coli de Avila y otros, indicaron que puede haber una enzima o ruta presente en algunas especies bacterianas, que es capaz de convertir aminometilfosfonato (AMPA) en N-acetil-AMPA. Una enzima o ruta con esas características, si se expresa en plantas, conferiría una ventaja significativa a las plantas que expresan GOX cuando se tratan con glifosato.

Para probar esto, una cepa K-12 de E. coli adaptada para crecer sobre AMPA, se desarrolló en un medio que contenía poco fosfato para obtener lisados celulares para probar la presencia de una enzima capaz de N-acilar AMPA. El operón phn (mpu) está oculto en E. coli K-12 debido a una inserción de 8 pares de bases que ocasiona una mutación de desviación de marco en el gen phnE. La desviación de marco inactiva PhnE y crea un efecto polar en la traducción de otros genes hacia el extremo 3' de phnE dentro del operón, dando como resultado la incapacidad de dichos mutantes para usar fosfonatos como las fuentes de fosfato (Makino y otros, J. Bacteriol. 173.2665-2672, 1991 ). La selección de una mutación derivada espontáneamente, restaura la función del operón phn (phn+ o mpu+). Así, las cepas K-12, adaptadas para crecer sobre AMPA, metilfosfonato o etilfosfonato, contienen dichas mutaciones efectivas derivadas espontáneamente. Brevemente, se sembró en placa una alícuota de un cultivo fresco de caldo L de E. coli K-12 cepa JM101 (mpu-) sobre medio de agar completo MOPS (Neidhardt y otros, 1974) conteniendo aminoácidos a 25 mg/ml, vitamina B1 [tiamina] a 10 mg/ml, glucosa 0.2% y agar "purificado" DIFCO 1.5%, junto con aminometilfosfonato (AMPA; 0.2 mM; Sigma Chemical Co., St. Louis Missouri) como la única fuente de fosfato, y se incubó a 37°C durante tres días. Las colonias que surgen sobre este medio se tomaron y sembraron en estría sobre agar completo MOPS conteniendo AMPA o metilfosfonato (Alfa) co o la única fuente de fosfato. Una colonia, designada como E. coli JM101 mpu+, se escogió de las que crecieron igualmente y uniformemente sobre los dos medios que contenían fosfonato, y se designó después como la cepa GB993 de £. coli. El operón phn es inducido cuando E. coli se desarrolla en medio que carece o está limitado de una fuente de fosfato. Por lo tanto, se comparó E. coli GB993 con la cepa paternal JM101 cuando se desarrolla en medio mínimo MOPS. GB993 y su cepa paternal mpu-, JM101, se desarrollaron bajo condiciones idénticas, variando solo la cantidad de fosfato disponible o suplementado con AMPA. Se desarrollaron cultivos de 50 ml por duplicado en matraces Kitasato de 250 ml con agitación continua a 37°C en medio MOPS (5 ml de sales MOPS lOx, 0.5 ml tiamina 1 mg/ml, 0.5 ml glucosa 20%, a 50 ml con H20 d) conteniendo fosfato 0.1 o 5 mM, o fosfato 0.1 mM suplementado con aproximadamente AMPA 0.2 mM, pH 7.0. Los cultivos se desarrollaron generalmente hasta aproximadamente 220 unidades Klett y las células se hicieron pella por centrifugación; se resuspendieron en 1.5 ml de Tris 10 mM/DTT 1 mM, y se usaron con dos pases a través de una prensa French a 70 kg/cm2. Los lisados se centrifugaron para remover desechos y el sobrenadante se pasó a través de una columna G-50 equilibrada con Tris 50 mM pH 7.0. El cuadro 2 muestra los resultados de cultivos celulares desarrollados de esta manera.

CUADRO 2 Efectos del substrato de fosfato sobre el desarrollo de las células - indica que no hubo crecimiento medible Se usó una prueba de HPLC para determinar la presencia o ausencia de cualquier actividad de AMPA aciltransferasa en el medio y los lisados celulares. La prueba monitorea la conversión de [1 C]AMPA en N-acetil-[14C]AMPA. Generalmente, 100 µl de una solución de prueba 2X que consiste de 16.5 mg de acetil-CoA, 250 µl de Tris 2M, pH 7.5, 4.5 ml de H2O d y [14C]AMPA (30 mM), se mezclaron con 25-75 µl de lisado y 1 µl de MgCI2 y de MnCI2 0.5M, y esto se llevó a 200 µl con H20 d. La prueba se incubó 30 minutos a 37°C y se inactivo con 200 µl de NaOAc 90-100 mM (acetato de sodio) pH 4.4 en etanol, y después se analizó inmediatamente por HPLC como se describió arriba, o se guardó a -20°C. Solo las muestras del lisado GB993 derivado de cultivos desarrollados en presencia de AMPA o medio suplementado con fosfato 0.1 mM, mostraron actividad AMPA aciltransferasa apreciable. Este resultado indicó que un gen que codifica una enzima aciltransferasa capaz de N-acilación de AMPA estaba presente en GB993, y que fue regulado para su expresión cuando se desarrolló bajo condiciones de baja concentración de fosfato. Así, la secuencia codificadora para la actividad enzimática parece ser parte del reguión pho y puede residir en el operón phn.

EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra la identificación de un gen operón phn de E. coli que codifica una enzima capaz acilar AMPA. El ejemplo 3 indicó que la actividad AMPA aciltransferasa observada en lisados de E. coli, puede ser codificada por un gen en el operón phn. Todo el operón phn en E. coli B y E. coli K-12 se había clonado y secuenciado previamente la B (Wanner y otros, Chen y otros). Se ha mostrado que la secuencia de ADN del operón phn de E. coli K-12 es idéntica a la secuencia de ADN publicada del operón phn de E. coli B, con la excepción de una inserción de ocho pares de bases en el gen phnE (Wanner y otros). Las clonas que contienen varias cantidades de los genes del operón phn de cualquier base genética bacteriana, están disponibles fácilmente (Wanner y otros, Chen y otros, Dr. J.W. Frost en la Purdue University). Se usaron plásmidos que contienen diferentes cantidades del ADN del operón phn de JM101 para transformar JM101 (mpu-) para probar que cuando se expresa un gen phn localizado en plásmido, confiere sobre JM101 la capacidad de utilizar AMPA como la única fuente de fosfato. Un plásmido obtenido de J. Frost (Dr. J.W. Frost, Departamento de Química, Purdue University, West Lafayette, Indiana 47907), designado aquí como pF, contiene un fragmento EcoRI de 8 kb de E. coli K-12 que codifica los genes del operón phn phnG hasta phnQ. Un solo sitio Ncol está presente en el extremo 5' de la región codificadora de phnG. El plásmido pF fue digerido con EcoRI y Ncol, liberando un fragmento Ncol-EcoRl de 2 kb que contenía los genes phnG hasta phnl, y un segundo fragmento ?/col-EcoRI de aproximadamente 6 kb de longitud que contenía los genes phnJ a phnQ. Cada fragmento se purificó en gel y se ligó en un vector de clonación y expresión en una orientación que permitiría la expresión de los genes del operón phn presentes dentro de cada uno de los fragmentos ?/col-EcoRI desde un promotor inducible llevado por plásmido. El fragmento de 2 kb se insertó en los sitios ?/col-EcoRI dentro del vector pMON7258, un vector de clonación se selección positiva idéntico a pUC118, con la excepción del dominio de polienlazador (Viera y otros, Methods Enzymol. 153:3, 1987), siendo designado el plásmido resultante como p58-1. La orientación del fragmento de 2 kb en p58-1 permite la expresión de los genes phnG-phnl desde el promotor lac dentro del vector. El fragmento EcoRI-?/col de 6 kb se insertó en los sitios Ncol y EcoRI en un vector de selección positivo similar, pMON7259, produciendo el plásmido designado como pMON17195. El pMON7259 es idéntico a pUC119, excepto por el dominio de polienlazador, que contiene un sitio de clonación múltiple en orientación opuesta al de dentro de pMON7258, y que también permite la expresión de los genes phnJ-phnQ desde un promotor lac. Se transformaron p58-1 y pMON7259 en E. coli K-12 (mpu-) cepa JM101 , y se mantuvieron con selección de resistencia al antibiótico ampicilina. También se transformaron pMON7259 y pF en JM101 como controles negativo y positivo, respectivamente. Cultivos de cada transformante se desarrollaron durante la noche en medio de caldo líquido M9 suplementado con cas aminoácidos 2%, y 0.2% de glucosa, con agitación a 37°C, y después se diluyeron 1 :50 en 50 ml de medio nuevo de la misma composición precalentado, en un matraz Kitasato de 250 ml. Los cultivos se incubaron con agitación a 37°C hasta alcanzar una densidad celular de aproximadamente 80-100 unidades Klett, medida en un espectrofotómetro Klett-Summerson a través de un filtro verde #2. Se indujo expresión del promotor lac del plásmido mediante la adición de 100 microlitros de IPTG 500 mM, de tal forma que la concentración final de IPTG era de aproximadamente 1 mM. El período de crecimiento de la fase de inducción se dejó avanzar durante os horas. El cuadro 3 muestra el perfil de densidad celular de cada cultivo de la dilución 1 :50 durante el período de inducción de dos horas.

CUADRO 3 Perfil de inducción die cultivos JM101 que alojan varios plásmidos phn lo indica la densidad del cultivo celular en el punto de tiempo de la dilución 1 :50; l-i indica la densidad del cultivo celular en el momento de la adición de IPTG; y l2 indica la densidad del cultivo celular en el momento de la cosecha.

Las células en cada cultivo se cosecharon por centrifugación a 10,000 rpm durante 10 minutos a 4°C en una centrífuga Beckman J2. La pella de células se lavó una vez en solución de NaCI 154 mM enfriada con hielo, y después se resuspendió en 1.5 ml de amortiguador de extracción (Tris-HCl 50 mM pH 7.5, DTT 1 mM, Tris-HCl 50 mM pH 7.5). Las suspensiones de células se usaron con dos pases a través de una prensa French a 70 kg/cm2. El lisado resultante se centrifugó durante 15 minutos a 14,000 rpm a 4°C en una microcentrífuga EPPENDORF™ modelo 5402 para remover los desechos. Cada lisado depurado se transfirió a un tubo nuevo preenfriado y el volumen del extracto se ajustó a 2.5 ml con Tris-HCl 50 mM pH 7.5. Se equilibró una columna PD10 con 25 ml de Tris-HCl 50 mM, pH7.5, y después cada muestra se aplicó a la columna de desalación. Cada muestra eluida se ajustó a 3.5 ml con Tris-HCl 50 mM, pH 7.5. Cada muestra se distribuyó en tubos de ensayo y se mezcló con reactivos para probar la presencia de la actividad de AMPA aciltransferasa como se muestra en el cuadro 4.

CUADRO 4 Condiciones de prueba para lisados bacterianos que expresan genes phn * Todos los volúmenes son en microlitros. Composición de las mezclas de cada muestra, designada por contenido de plásmido, preparada para la prueba de AMPA aciltransferasa Cada mezcla se incubó a 37°C durante 30 minutos, y se inactivo con un volumen igual (200 microlitros) de NaOAc (acetato de sodio) 90-100 mM, pH 4.4 en etanol, y si no se analizó inmediatamente por medio de HPLC como se describió arriba, entonces se guardó durante la noche a -20°C. Las porciones no usadas de cada lisado se guardaron a 4°C o se mezclaron con glicerol al 10% en volumen, y se guardaron a -20°C. Las muestras de cada lisado que se sometieron a la prueba de AMPA transacilasa se analizaron por medio de HPLC para detectar la presencia de [14C]AMPA y [14C]AMPA a iada, como se describió arriba. Los resultados se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5 Análisis de HPLC de lisado bacteriano de la conversión de AMPA en Acetil-AMPA Los resultados del análisis de HPLC de cada muestra, indicando la cantidad relativa de [14C]AMPA o acetil-[14]AMPA como un porcentaje de la cantidad total de [14C] en ambos picos combinados.

Estos datos indicaron que el plásmido que contenía el fragmento ?/col-EcoRI de 6 kb aislado de pF en pMON17195, contenía uno o más genes que, por inducción I PTG del promotor lac en una cepa mpu- de E. coli, provocó la producción de una actividad de aciltransferasa capaz de convertir todo el [14C]AMPA disponible en la mezcla de prueba a acetil-[1 C]AMPA. El gen o genes requeridos para N-acilación de AMPA se definieron adicionalmente por análisis de eliminación de restricción. Se construyeron plásmidos que contenían varios segmentos del operón phn de E. coli B o E. coli K-12 para delinear adicionalmente la naturaleza del gen o genes de operón phn implicados en conferir actividad AMPA aciltransferasa cuando se expresan en una E. coli JM101 mpu-. El pMON7333 contiene la inserción de ADN de E. coli equivalente de pMON17195, pero en pUC119, y es un solo fragmento Hindlll de la cepa B de E. coli que contiene los genes de operón phn de tipo silvestre phnG hasta phnQ. Se construyó pMON15020 clonando un fragmento de ADN de E. coli B Ncol a EcoRI de 5,713 pares de bases de pMON7333 en pMON7259, y contiene los genes phnó a phnQ. Se construyó pMON15022 insertando un fragmento EcoRI a San de 1 ,686 pares de bases de pMON17195 en el vector de expresión y clonadón de selección positiva pBlueScriptSP (Invitrogen) que contiene los genes phnO, P y Q de E. coli K-12. Se construyó pMON 15023 suprimiendo un fragmento San de 1,820 pares de bases de pMON17195, dejando atrás los genes phnJ y phnK del operón phn de E. coli K-12, el extremo 5' de phnL y todos phnO, P y Q.

Los plásmidos pMON17195, pMON15020, pMON15022, pMON15023 y pMON7259 se transformaron en la cepa JM101 de E. coli K-12 mpu- y se mantuvieron por selección con el antibiótico ampicilina. Se desarrollaron cultivos durante la noche de cada uno de estos transformantes con selección de antibiótico y se diluyeron 1 :50 en medio M9 nuevo como se describió arriba, y se incubó a 37°C con agitación en matraces Kitasato de 250 ml, a una densidad celular de aproximadamente 100 unidades Klett. Cada cultivo se indujo con IPTG como en el ejemplo 3, y se incubó durante dos horas adicionales con agitación. Las células se cosecharon por centrifugación en una centrífuga Beckman J2 a 4,000 rpm durante 10 minutos a 4°C. Las pellas de células se lavaron una vez con 50 ml de NaCI 154 mM, y se guardaron a -20°C. Las pellas de células se resuspendieron en 1.5 ml de amortiguador de extracción como en el ejemplo 3, y se usaron con dos pases a través de una prensa French a 70 kg/cm2. Las suspensiones de células usadas se centrifugaron en una microcentrífuga Eppindorf Modelo 5402 durante 15 minutos a 14,000 rpm y a 4°C. Los lisados depurados se decantaron en tubos nuevos preenfriados sobre hielo, y el volumen total se ajustó a 2.5 ml con la adición de amortiguador de extracción. Estas muestras se desalaron sobre una columna PD10 preequilibrada con 25 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 7.5, y se eluyeron con 3.5 ml de Tris HCl 50 mM pH 7.5. Después, las muestras se sometieron a una prueba de acilación de AMPA como se describió arriba, se incubó 30 minutos a 37°C, y se inactivo con 200 microlitros de NaOAc 90.0 mM pH 4.4. Los volúmenes de cada muestra usada en la prueba se indican en el cuadro 6. Todos los volúmenes representan microlitros de cada solución usada.

CUADRO 6 Condiciones de prueba para lisados bacterianos que expresan genes phn de plásmidos Composición de mezclas de cada muestra, designada por contenido de plásmido, preparadas para la prueba de AMPA aciltransferasa.

Las muestras inactivadas se sometieron a análisis de HPLC como se describió arriba. El cuadro 7 ilustra los resultados del análisis de HPLC de cada muestra, indicando la cantidad relativa de [14C]AMPA o acetil- r [14 CjAMPA como un porcentaje de la cantidad total de [ 14/ C] en ambos picos combinados.

CUADRO 7 Análisis de HPLC de la conversión de T14C1AMPA en acetil-r14C1AMPA en lisados bacterianos Análisis de HPLC de cada muestra, indicando la cantidad relativa de [14C]AMPA o acetil-[,4]AMPA como un porcentaje de la cantidad total de [14C] en ambos picos combinados.

Los datos del cuadro 7 indican que la actividad de acilación de AMPA deriva de los marcos de lectura abiertos del operón phn que consisten de phnO, phnP y phnQ, que son los únicos genes phn presentes en pMON 15022. Otros plásmidos que confieren actividad de acilación de AMPA por inducción, también contenían por los menos los genes phnO, P y Q, dando una fuerte evidencia de que la actividad observada fue el resultado de uno o más de estos productos de gen. Por lo tanto, se construyeron plásmidos adicionales en base a las secuencias de los genes phnO, P y Q, para determinar qué gen o genes eran necesarios para la función de acilación. Los genes bacterianos de acilasa, transacilasa y aciltransferasa, se conocen de la literatura desde hace algún tiempo. La mayoría son proteínas pequeñas de 15-25 KDa. Por lo tanto, en base a comparación de tamaño, solo los productos de los genes phnO y phnQ estarían dentro de esta categoría. Sin embargo, en base a comparaciones de similitud con otras proteínas en las bases de datos GENBANK, SWISSPROT y EMBL, el producto predicho del gel phnO pareció asemejarse más de cerca a otras proteínas que tienen actividad acilasa. Por ejemplo, la proteína PhnO de E. coli, se alineó bien con una gentamicina acetiltransferasa-3-l, descrita por Wohlleben y otros (Mol. Gen. Genet. 217:202-208, 1989). Se digirió pMON15020 que contenía los genes phnJ a phnP del operón phn de E. coli B en un solo fragmento ?/col-EcoRI de 6.0 kb, con Salí y EcoRI para liberar un fragmento de 2.0 kb que contenía los genes phnQ, P y Q. Este fragmento de 2 kb se cortó y purificó de un gel de agarosa TAE 0.7%, se trató con ADN polimerasa T4 para cortar los extremos 3' colgantes, después con Klenow y desoxinucleótido trifosfatos (dXTP's) para dar extremos rasurados, y después se ligó en el sitio EcoRV de pBlueScriptSP para producir el plásmido pMON15024. El pMON15024 se digirió con Ndel y EcoRI, suprimiendo un fragmento de 1200 pares de bases que contenía la mayor parte de phnP y toda la secuencia codificadora de phnQ. El fragmento restante del plásmido pMON15024 que contenía todavía el gen phnQ, se trató con ADN polimerasa fragmento Klenow en presencia de didesoxinucleótidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para rellenar los extremos 3' expuestos por digestión con enzima de restricción, y después se ligaron juntos para producir el plásmido pMON15027. El pMON15027 contiene solo el gen phnQ flanqueado en 3' por una pequeña porción de phnP. El fragmento Ndel a EcoRI de 1200 pares de bases obtenido de pMON 15024, se clonó en pMON2123 para producir pMON15026, que contiene los dos tercios de 3' del gen phnP flanqueado en 3' por phnQ. Los plásmidos pMON 15024, 15026 y 15027 se introdujeron en JM101 mpu-, y se analizaron los lisados celulares de los transformantes corno arriba, después de crecimiento e inducción, para determinar la presencia de actividad de AMPA aciltransferasa. Solo pMON15024 y pMON15027 exhibieron actividad aciltransferasa, indicando que el producto del gen phnQ era el responsable de la acilación de AMPA. Usando métodos de cíclización térmica se produjo un fragmento de ADN que contenía solo el gen phnQ, con sitios de endonucleasa de restricción de flanqueo convenientes para usar en manipulaciones de clonación posteriores. Se sintetizaron oligonucleótidos iniciadores por parte de Midland Certified Reagents Co. (Midland, Texas) en base al gen publicado de phnQ y una secuencia flanqueadora, para ampliar el gen phnQ (Chen y otros, J. Biol. Chem., 256: 4461-4471 , 1990). La secuencia AAACACCATGGCTGCTTGTG (SEQ ID NO:5), designada AATPCR6, representa un oligonucleótido sintético que es homólogo a la cadena de molde del gen phnQ. El residuo 5' adenosina de SEQ ID NO:5 corresponde al par de bases 13,955 de la secuencia publicada del operón phn, inmediatamente en 5' del codón de iniciación ATG de phnQ en la posición 13,962-13,964 (Chen y otros, J. Biol. Chem., 256:4461-4471 , 1990). SEQ ID NO: 5 incorpora un desapareamiento de un solo par de bases de la secuencia publicada de phnQ en la posición 13,965, representada por una inversión de C a G, que genera un codón de alanina en lugar de un codón de prolina en la posición 2, y también crea un sitio de restricción Ncol único que abarca el codón de iniciación ATG. La secuencia GTGACGAATTCGAGCTCATTACAGCGCCTTGGTGA (SEQ ID NO:6), designada AATPCR7, representa un oligonucleótido sintético que es homólogo a la cadena codificadora del gen phnQ. El residuo 3' adenosina de SEQ ID NO:6 corresponde al par de bases 14,380 del operón phn publicado (Chen y otros, J. Biol. Chem., 256: 4461-4471 , 1990). La timidina en la posición número 19 de SEQ ID NO:6 corresponde a la adenosina en la posición 14,396 de la secuencia de phnQ publicada (Chen y otros). Una porción de SEQ ID NO:6 se traslapa con el codón de terminación de phnQ nativo, introduce un segundo codón de terminación en marco inmediatamente hacia 3' de, y adyacente a, el codón de terminación nativo, y también introduce sitios de restricción únicos EcoRI y Sacl en 3' de estos codones de terminación. Se usó pMON15024 como un molde para la ampliación del gen phnQ en una reacción de ampliación térmica estándar. Brevemente, se preparó una muestra de reacción de 100 microlitros que contenía 0.1 ng de ADN molde, amortiguador de reacción, 200 pM de cada iniciador, 200 mM dNTP, 1.25U ADN polimerasa Taq, y se extendió con aceite mineral. Esta muestra de reacción se sometió a treinta y cinco ciclos a 94°C durante un minuto, 50°C durante dos minutos, y 72°C durante tres minutos, lo cual originó la ampliación de un producto de ADN de 459 pares de bases, según se determinó por análisis de cinco mililitros de la muestra de reacción sobre un gel de agarosa TAE 0.7% marcado con bromuro de etidio. Usando métodos estándares, se purificó un producto de 444 pares de bases de un gel de agarosa TAE 1%, después de digestión de una muestra del producto de ampliación de 459 pares de bases con endonucleasas de restricción Ncol y EcoRI. El producto de 444 pares de bases se ligó en sitios compatibles en pMON7259 para generar pMON15028. Lisados celulares preparados como arriba, de cultivos de JM101 inducidos con IPTG conteniendo pMON15028, se analizaron para detectar la presencia de actividad de AMPA aciltransferasa y se compararon con cultivos que contenían pMON15027. Los resultados fueron indistinguibles, confirmando así que phnQ codifica una enzima capaz de acilar AMPA. Además, este resultado indicó que la mutación P2A en la proteína, que fue introducida en el gen que codifica la secuencia como un resultado de ampliación térmica usando el oligonucleótido iniciador AATPCR6 (SEQ ID NO:5), no tuvo efecto sobre la actividad de aciltransferasa de la proteína PhnO resultante cuando se expresó en E. coli.

EJEMPLO 5 Este ejemplo ilustra la producción de anticuerpos policlonales dirigidos al péptido PhnO. Estudios adicionales del producto del gen phnQ requirieron el uso de anticuerpos dirigidos a la proteína PhnO. Por lo tanto, PhnO fue sobreproducida en E. coli JM101 para usar como un inmunógeno para estimular la producción de anticuerpos después de inyección en una cabra. El gen phnQ que contenía la mutación P2A en el plásmido pMON15028, se introdujo en el plásmido pMON 17061 sobre un fragmento de ADN Ncol a EcoRI, produciendo pMION15032. La expresión de phnQ en pMON15032 está bajo el control del promotor recA de E. coli adyacente a la secuencia de unión de ribosoma 10L del gen T7. Las células se desarrollaron hasta fase logarítmica media mediante la adición de ácido nalidíxico al cultivo hasta aproximadamente 50 partes por millón, de una solución de abastecimiento de 50 mg de ácido nalidíxico en polvo disuelto en NaOH 0.1 N. El cultivo se mantuvo bajo condiciones de inducción durante doce horas a 37°C. Las células se cosecharon como se describe en el ejemplo 3, y se sometieron a sonicación en solución salina amortiguadora de fosfato. Se determinó que alrededor de 23% de la proteína soluble total en los lisados de E. coli inducidos, era PhnO, y aproximadamente 60% de la proteína total PhnO era liberada en la fase soluble según PAGE-SDS y tinción con azul de Coomassie. La proteína se purificó adicionalmente por medio de PAGE-SDS preparativa proveyendo una cantidad suficiente de PhnO para usar en la producción de anticuerpo que se une o reacciona antigénicamente con PhnO o proteínas AMPA transacilasa relacionadas. Brevemente, la proteína PhnO se separó por tamaño de otras proteínas en un gel PAGE-SDS 15%. Se cortó un trozo de gel que contenía la proteína PhnO, se pesó y se homogeneizó usando un polytron en un volumen de solución salina amortiguadora de fosfato (PBS, pH 7.0) igual a la masa del trozo de gel. El producto homogeneizado se mezcló con un volumen ¡gual de medio de Freund completo hasta obtener una mezcla coloidal. Se usó un inoculo de 8 ml de esta mezcla para la primera inyección en una cabra. Dos semanas después de la inyección, se extrajeron 50 ml de sangre, y el suero se separó de los sólidos sanguíneos por centrifugación. Se administró una inyección de refuerzo de proteína PhnO purificada en gel, en una mezcla coloidal de adyuvante incompleto de Freund al 50% a las cuatro semanas, y a las seis semanas se obtuvo una segunda muestra de sangre. El suero de la segunda muestra de sangre se usó para escudriñar la presencia de títulos suficientes de anticuerpo específico para proteína PhnO. Extractos de células JM101 que contenían pMON 15032 se sometieron a análisis Western blot. Se determinó que la concentración de proteína en el extracto era de aproximadamente 55 mg/ml por análisis de Bradford, y un gel previo teñido con Coomasie usando este mismo extracto, se sometió a un barrido en densitómetro, que indicó que aproximadamente 23% del total de la proteína celular era PhnO. El extracto se desaló sobre una columna PD10, se eluyó con Tris 10 mM pH 7.5, y se diluyó con un volumen igual de solución reguladora de pH de muestra de SDS 2X. Se prepararon diluciones en serie usando un amortiguador de muestra 1X y se cargaron en pozos de un gel PAGE SDS 15%. Se mezclaron muestras adicionales con un extracto de proteína de hoja de tabaco conteniendo 10 microgramos adicionales de proteína por carril, además de los extractos de PhnO de E. coli. Los extractos de proteína de hoja de tabaco se usaron para escudriñar la presencia de anticuerpo de reactividad cruzada hacia proteínas de la planta. Las proteínas se separaron de acuerdo a su tamaño por electroforesis a 7.5 mA constantes durante catorce horas a 4°C, y el gel se sometió a electroblot sobre un filtro de nitrocelulosa MSI de 0.45 mieras, a 0.5 amperes, en solución reguladora de pH de transferencia de Tris-glicina durante una hora. Después, la membrana se bloqueó con TBST (Tris, BSA, NaCI, Tween 20, "Short Protocols in Molecular Biology", 3a. edición, Wiley & Sons, Pub.) durante dos horas a temperatura ambiente; se incubó 45 minutos con una dilución 1 :500 del segundo suero sanguíneo a temperatura ambiente, se lavó dos veces en TBST, se incubó otros 45 minutos con anti-lgG de cabra de conejo conjugada con fosfatasa alcalina (Boehringer Mannheim Biochemicals, Inc.), se lavó tres veces con TBST y una vez con solución reguladora de pH de fosfatasa alcalina, y finalmente se incubó durante dos y medio minutos con una solución estándar de color conteniendo NBT y BCIP. La reacción se terminó lavando la membrana con grandes cantidades de agua destilada. El anticuerpo pudo detectar proteína PhnO en una cantidad tan baja como 50 nanogramos del extracto de E. coli, independientemente de la presencia de proteínas vegetales adicionales en una mitad de las muestras. Además, se detectaron muy pocas bandas de reactividad cruzada en cualquier grupo de muestras, indicando que la muestra de suero contiene muy poca IgG que reacciona cruzadamente con cualquier proteína de E. coli o de planta de tabaco cuando se probó usando este método de Western blot. También se utilizó una fuente alternativa para generar anticuefo capaz de unirse específicamente, o reaccionar antigénicamente, con proteína PhnO. Se colocó up gen phnQ en un vector comercial (Invitrogen) que contenía una secuencia codificadora de aminoácidos de unión de metal (His6) hacia el extremo 5' de una secuencia codificadora de phnO y en marco con la misma. La secuencia de ADN H'\s6-phnO se insertó en el vector de expresión pMON6235 de E. coli sobre un fragmento Ncol a EcoRI, bajo el control de un promotor araBAD del operón de arabinosa de E. coli, produciendo el plásmido pMON32909. La proteína His6-PhnO se produjo por inducción de arabinosa de células de E. coli W3110 que contenían pMON32909, y se purificó sobre una columna de afinidad de metal de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se inyectó proteína estándar His6-PhnO purificada, marcada con His, en 6 conejos blancos de Nueva Zelandia, usando un procedimiento de inmunización similar al usado para la cabra, descrito arriba. También se observó que el antisuero desarrollado en estos conejos era específico para la unión de proteína PhnO, y no era cruzadamente reactivo con otras proteínas bacterianas de E. coli ni de planta de tabaco.

EJEMPLO 6 Este ejemplo ilustra las propiedades de una enzima AMPA transacilasa usando aminometilfosfonato y acetil-CoA como substratos, en una prueba de enzima medida por análisis cinético de punto final. La Km (Km) y Vmax (Vmax) aparentes de la enzima PhnO se determinaron para los substratos aminometilfosfonato y acetil-CoA. La determinación de Km y Vmax de PhnO se hizo por medio de análisis cinético de punto final, determinando la velocidad de la enzima para consumir cada substrato a concentraciones variables de substrato, y graficando el inverso de la velocidad de la enzima contra la inversa de la concentración de substrato, para producir una gráfica Lineweaver-Burk de cinética enzimática. La conversión de [ 4]-AMPA a N-acetil-[14C]-AMPA, se monitoreó como en el ejemplo 2, usando enzima en un lisado crudo desalado de E. coli que expresa phnQ de pMON15032, producido como en el ejemplo 4. Se determinó la proteína total por ml de extracto por medio del método de Bradford, que indicó aproximadamente 22.5 mg/ml. El barrido densitométrico de geles de poliacrilamida-SDS teñido con Coomassie que resolvieron la proteína PhnO de estos lisados, indicó que PhnO representa aproximadamente 23% de la proteína total, y así se determinó que el extracto celular contenía aproximadamente 5.2 mg de proteína PhnO por ml. En una primera prueba para determinar Km y Vmax aparentes de PhnO para AMPA, las concentraciones de [14C]-AMPA variaron de 2 a 38 mM. Las reacciones de enzima se incubaron a 37°C durante 5 minutos y se inactivaron con 1 volumen de acetato de sodio (NaOAc) 100 mM, pH 4.4, en etanol. Las muestras se analizaron por HPLC para determinar la cantidad de [14C]-AMPA convertido en N-acetil-[14C]-AMPA. Las condiciones de prueba y resultado para cada grupo de reacciones se muestran en el cuadro 8.

CUADRO 8 Cinética de la enzima PhnO para substrato AMPA CUADRO 8 (Continuación) 1- Concentración de substrato AMPA en la reacción, en nm (nanomoles). 2- Porcentaje de conversión medida como el por ciento de N-acetil-[14C]AMPA formado en relación con la cantidad de [14C]-AMPA remanente en la muestra. 3- Velocidad enzimática en unidades de AMPA (nm) convertido en N-acetil- AMPA por minuto por gramo de proteína.

Una gráfica Linweaver-Burk de los datos 1/V contra 1/S del cuadro 8, indica que la Km aparente de PhnO para AMPA como substrato es de aproximadamente 9 mM, y la Vmax aparente es de aproximadamente 824 U/mg de proteína. La Km aparente de PhnO para el substrato acetil-CoA, se determinó en experimentos similares. Después de varios intentos para obtener cinética de punto final, se determinó que el número de conversión fue demasiado bajo para ser confiable a las concentraciones de AMPA de aproximadamente 30 rnM y cantidades de enzima de aproximadamente 1-10 ng. Se intentó un enfoque alternativo usando acetil-CoA marcada con tritio. La actividad específica de la marca fue aproximadamente 40 veces mayor que con [14C], dando una ganancia de sensibilidad que permitió la determinación de la Km aparente de PhnO para acetil-CoA. La actividad específica de [3H]-acetil-CoA (Amersham Inc.) fue de 360 mCi/mg o 250 DCi/ml. Se monitoreó la transacilación mediada por PhnO de [3H]-acetil-CoA a [3H]-acetil-AMPA mediante cromatografía de HPLC de intercambio de aniones débiles, con los tiempos de retención de acetil-CoA y acetil-AMPA ajustados de modo que estos compuestos fueran separados por aproximadamente 3 minutos. Esto se logró ajustando la concentración del regulador de pH de KH2PO4 (pH 5.5) a 40 mM con una velocidad de flujo de 1 ml por minuto sobre una columna de intercambio de aniones débiles AX100. Cada muestra se hizo reaccionar con PhnO y AMPA a 30 mM durante 5 minutos a 37°C, y se extinguió con NaOAc a 100 mM, pH 4.4 en etanol, y se analizó entonces mediante HPLC. El substrato de [3H]-acetil-CoA varió de 25 micromolar a 1.3 mM en cada reacción junto con aproximadamente 5 ng de PhnO, Tris a 50 mM, pH 7.5, MnCI2 a 1 mM, MgCI2 y AMPA a 30 mM. Las muestras se analizaron mediante HPLC para determinar las cantidades de N-[3H]-acetil-AMPA producida y [3H]-acetil-CoA restante. Las condiciones de prueba y los resultados para estas reacciones se muestran en el cuadro 9.

CUADRO 9 1 - Concentración de substrato en unidades micromolares. 2- Velocidad de la enzima medida por la cantidad de [3H] incorporado en [3H]-acetil-AMPA por unidad de tiempo. 3- Concentración inversa del substrato. 4- Velocidad inversa. 5- Relación de velocidad: concentración de substrato.

Una gráfica de Linweaver-Burk de los datos de 1/V contra 1/S del cuadro 9, indica que la Km aparente de PhnO para acetil-CoA como substrato está entre 375-390 micromolar, y la Vmáx aparente es de aproximadamente 824 U/mg de proteína.

Se determinó una escala de pH aproximada de actividad para la enzima PhnO usando enzima en un lisado crudo de E. coli que expresa phnO de ?MON15032. Se determinó la capacidad de la enzima para producir N-acetil AMPA a partir de una mezcla que contenía acetil-CoA y AMPA a través de una escala de valores de pH. Las reacciones se llevaron a cabo en regulador de pH MES/MOPS/Tricina equilibrado a un valor de pH de 4.5 a 9.0, variando los valores reales de pH de 5.2 a 9.0. En resumen, se mezclaron 95 microlitros de un regulador de pH apropiado con 100 microlitros de 2X mezcla de prueba como se describe en el ejemplo 4, y 5 microlitros de lisado de E. coli desalado que contenía aproximadamente 400 ng/microlitro de proteína PhnO. La reacción se incubó a 37°C durante 5 minutos, y se extinguió con NaOAc a 100 mM, pH 4.4 en etanol, y se analizó mediante HPLC como se describe en el ejemplo 4. Los resultados se muestran en el cuadro 10.

CUADRO 10 Perfil de pH de la enzima PhnO 1- Indica el valor real del pH después de combinar todos los reactivos para cada valor de pH inicial determinado. 2- Determinado en el cuadro 9 para Km y Vmáx. 3- Determinado en el cuadro 9 para Vmáx.

Los resultados indican que la actividad óptima de PhnO transacilasa usando AMPA y acetil-CoA como substratos, es a pH de aproximadamente 8.0. Sin embargo, PhnO convierte eficientemente AMPA a N-acetil-AMPA usando acetil-CoA como donador de acetilo a través de una escala de pH de aproximadamente 6.5 a por lo menos 9.0. Se llevaron a cabo otros experimentos con proteína PhnO purificada para caracterizar mejor el alcance de la preferencia del substrato de la enzima por compuestos donadores de acilo de acil-CoA. Se ha establecido en la presente que por lo menos un grupo saliente o donador de acilo del substrato puede ser un compuesto ácido de dos carbonos tales como la porción acetilo en el compuesto Acetil-CoA. No se sabía qué gama de moléculas de acilo formadas de diferentes longitudes de cadena de carbonos funcionaría o podría funcionar como un grupo saliente del donador de acilo de acil-CoA cuando se hi?:o reaccionar con PhnO transacilasa y AMPA como la molécula receptora de acilo. Para esto, se desarrolló una prueba de HPLC similar a la descrita en el ejemplo 2 para determinar el alcance de la capacidad de la enzima para transferir un grupo acilo de un donador de acilo de acil-CoA a [1 C]-AMPA. Se purificó PhnO a partir de un litro de caldo de cultivo de Luria Bertani de JM101 de E. coli que expresa un gen phnO recombinante de pMON15032 después de inducción por ácido nalidíxico por 3 horas a 37°C. Las células se cosecharon mediante centrifugación, y se resuspendieron en 40 ml de regulador de pH Tris frío (Tris-HCl a 0.1 M, pH 8), y se colocaron en hielo. La suspensión de células se llevó a DTT a 1 mM y PMSF a 0.5 mM. La suspensión fue lisada mediante 2 pasajes a través de una celda de presión French pre-enfriada a 77.33 Kg/cm2, centrifugada a 12,000 g (10,000 rpm en un rotor SA600 Sorvall) durante 40 minutos a 4°C, y colocada entonces sobre hielo. Los sobrenadantes depurados fueron vertidos en tubos de polipropileno nuevos de 15 ml. Las muestras fueron separadas de nuevo en dos porciones iguales, y mantenidas a -80°C hasta que se usaran después para purificación de la proteína PhnO. Se pusieron a prueba 20 microlitros de la fracción soluble para actividad de la enzima usando el método de HPLC descrito anteriormente en el ejemplo 2, excepto que después de terminar la prueba con la adición de ácido, la muestra se almacenó a -80°C. Se preparó una columna S200 Sefacryl de conformidad con las instrucciones del fabricante, y se equilibró con una solución que contenía Tris a 20 mM, pH 8.0, y MgCI2 a 0.5 mM. El extracto soluble total entero fue estratificado sobre la parte superior del lecho de la columna después de descongelación sobre hielo. Se recogieron 40 fracciones de 9 ml del producto eluido de la columna y se analizaron 30 microlitros de cada fracción mediante western blot usando antisuero anti-PhnO después de resolución en un gel de SDS-PAGE a 15%. Asimismo, se analizaron 30 microlitros de cada fracción para actividad de AMPA aciltransferasa usando el método descrito en el ejemplo 2. Se agruparon las muestras que exhibían actividad de acil transferasa y que correspondían a datos positivos de western blot. Estas se representaron mediante las fracciones 7 a 19 en este ejemplo, se combinaron en un volumen de 100 ml, se distribuyeron en 10 tubos que contenían volúmenes de 10 ml, y se almacenaron a -80°C para uso posterior. Se usó cromatografía de intercambio aniónico para determinar el patrón de elución de PhnO aparte de otras proteínas contaminantes que co-eluían durante el fraccionamiento con S200 Sephacryl. Un tubo de las fracciones PhnO positivas combinadas fue descongelado en hielo, e inyectado en una columna 5/5 Mono-Q pre-equilibrada con regulador de pH A (un litro de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, agua desionizada destilada Mili-Q) y B (un litro de Tris-HCl a 20 mM, pH 8.0, NaCI a 1 M). La muestra que contenía la proteína PhnO activa fue inyectada en la columna, y se recogieron fracciones de un mililitro. La columna fue lavada durante 5 minutos con una velocidad de flujo de 1.8 ml por minuto de amortiguador A después de cargar la muestra que contenía PhnO. A los 5 minutos, se añadió regulador de pH B al volumen de flujo a 0.5 ml por minuto durante 4 minutos. Se aumentó el regulador de pH B hasta 22% del volumen de flujo a 10 minutos, 30% a 12 minutos, 36% a 13 minutos, 41% a 14 minutos, 46% a 15 minutos, 74% a 16 minutos y 100% de 16 minutos a 22 minutos, en cuyo punto concluyó el flujo del regulador de pH B, y se reinició el flujo del regulador de pH A a 100% para equilibrar la columna. Se analizaron volúmenes de 10 microlitros de fracciones individuales obtenidas de la columna Mono-Q mediante western blot, y para actividad de transacilasa como se describe en el ejemplo 2. Las fracciones que exhibieron actividad positiva de AMPA aciltransferasa, y que se correlacionaron con los datos de Western blot, fueron agrupadas y mantenidas como una muestra de proteína purificada. Las muestras de esta proteína PhnO purificada se usaron para determinar el carácter específico del substrato donador de acilo de la enzima. Se prepararon reacciones enzimáticas de la manera siguiente: las reacciones de 100 microlitros consistieron de Tris-HCl a 50 mM, pH 8.0, MgCI2 a 1 mM, 3 microlitros de [1 C]-AMPA a 1.3 mM (115,392 dpm por microlitro), donador de acilo de adl-CoA a 0.1 M o 1 mM, y 2.5 microlitros de muestra de enzima purificada. Se preparó una premezcla de prueba de la cual se usaron 45 microlitros en cada reacción de 100 microlitros. Esta muestra de premezcla de 45 microlitros consistía de 40 microlitros de agua destilada y desionizada, 2 microlitros de MgCb a 50 mM, y 3 microlitros de [14C]-AMPA a 1.3 mM (115,392 dpm por microlitro). Las reacciones se iniciaron mezclando 40 microlitros de Tris-HCl a 125 mM, pH 8.0, 2.5 microlitros de muestra de proteína y 10 microlitros de compuesto donador de acilo de acil-CoA en un tubo de microcentrífuga a temperatura ambiente. Cada compuesto donador de acilo de acil-CoA se preparó como una solución de abastecimiento de materiales de abastecimiento a 1 mM, 5 mM o 10 mM. Cada tubo se mezcló entonces con 45 microlitros de la premezcla de prueba que contenía el substrato receptor de [14C]-AMPA, y fue mezclado suavemente y transferido a un baño de agua a 30°C durante 5 minutos. Cada reacción concluyó con la adición de 4 microlitros de HCl a 1 M, mezclada mediante acción de remolino, y colocada sobre hielo o almacenada a -20°C hasta que se pusiera a prueba para determinar la presencia de [14C]-AMPA o compuestos relacionados mediante HPLC. Se llevó a cabo el análisis de HPLC usando un sistema de HPLC de bomba doble 510 Waters con un detector de luz UV máxima de longitud de onda 481 y una bomba de escintilación, una columna de HPLC de SAX-sílice a 80A de 5 micrómetros PHENOSPHERE Phenomenex (250 X 4.6 mm, presión máxima de 246 kg/cm2), regulador de pH A que consistía de KH2PO4 a 200 mM, metanol a 4%, ajustado a pH 2.0 con H3PO4, regulador de pH B, que consistía de KH2,P04, metanol 4% ajustado a pH 2 con H3PO4 y flujo de átomos HAZARD (Packard) que contenía 1 ,2, 4-trimetil benceno a 64%, dicotilsulfosuccinato de sodio a 7.5%, diamilsuifosuccinato de sodio a 3.5% y éter laurílico de polioxietileno (4) a 6%. Las condiciones del gradiente de HPLC para el análisis de cada muestra fueron similares a las descritas en el ejemplo 2, con variaciones menores. Las velocidades de flujo se dan en el cuadro 11. CUADRO 11 1- Velocidad de flujo del fluido de escintilación en mililitros por minuto.

Se prepararon soluciones de abastecimiento de compuestos donadores de acilo de Acetil-CoA como se describió anteriormente. Estas soluciones son las siguientes: Acetil-CoA de Na, n-propionil-CoA de Li, glutaril-CoA de Li, metilmalonil-CoA de Li, crotonil-CoA de Li, isobutiril-CoA de Li, succinil-CoA de Na, tiglil-CoA de Li, n-valeril-CoA de Li y desulfo-CoA de Li. Todos los compuestos se obtuvieron de Sigma Chemical Company, St. Louis, MO. El porcentaje de actividad de la enzima purificada para la transferencia de la porción acilo asociada a CoA para [14C]-AMPA, se determinó midiendo el porcentaje del área máxima del cromatograma de HPLC de [14C]-AMPA convertido a algún otro compuesto [14C], tal como N-acetil-[14C]-AMPA, siendo establecida la cantidad de N-acetil-[14C]-AMPA producida durante la reacdón en la cual [14C]-AMPA y acetil-CoA a 1 mM son substratos para PhnO, como la referencia de 100%. Los resultados se muestran en el cuadro 12.

CUADRO 12 Eficiencia de la enzima AMPA transacilasa por el substrato donador de acilo de Acil-CoA Donador de acilo de Acil- % de conversión de [14C]- % de actividad CoA AMPA1 Acetil-CoA 0.1 mM 79.2 79.2 Acetil-CoA 0.5 mM 98.7 98.7 Acetil-CoA 1 mM 100.00 100.00 Propionil-CoA 0.1 mM 78.2 78.2 Propionil-CoA 0.5 mM 97.8 97.8 Propionil-CoA 1 mM 100.00 100.00 Glutaril-CoA O.1 mM 0.81 0.81 Glutaril-CoA 0.5 mM 0.00 0.00 Glutaril-CoA 1 mM 0.57 0.57 Metilmalonil-CoA O.1 mM 1.11 1.11 Metilmalonil-CoA 0.5 miM 2.08 2.08 Metilmalonil-CoA 1 mM! 2.21 2.21 Crotonil-CoA O.1 mM 0.80 0.80 Crotonil-CoA 0.5 mM 0.00 0.00 Crotonil-CoA 1 mM 0.00 0.00 lsobutiril-CoA O.1 mM 2.10 2.10 Isobutiril-CoA 0.5 mM 0.20 0.20 Isobutiril-CoA 1 mM 0.00 0.00 Succinil-CoA O.1 mM 5.06 5.06 Succinil-CoA 0.5 mM 3.38 3.38 Succinil-CoA 1 mM 1.56 1.56 Tiglil-CoA 0.1 mM 0.00 0.00 Tiglil-CoA 0.5 mM 0.00 0.00 Tiglil-CoA 1 mM 0.99 0.99 Valeril-CoA O.1 mM 0.24 0.24 Valeril-CoA 0.5 mM 0.00 0.00 Valeril-CoA 1 mM . 0.33 0.33 Desulfo-CoA 0.1 mM 0.95 0.95 Desulfo-CoA 0.5 mM 1.25 1.25 Desulfo-CoA 1 mM 0.52 0.52 1- Porcentaje del área pico del cromatograma de HPLC de [14C]-AMPA convertido a algún otro compuesto [14C], tal como N-acetil-[14C]-AMPA, siendo establecida la cantidad de N-acetil-[14C]-AMPA producida durante la reacción en la cual [14C]-AMPA y acetil-CoA a 1 mM son substratos para PhnO, como la referencia de 100%.

Estos resultados indican que la enzima PhnO es capaz de utilizar eficazmente compuestos asociados a acil-CoA que tienen un grupo acilo con una longitud de cadena de carbonos no mayor de tres para transacilar a AMPA. Otros compuestos que tienen una longitud de cadena de carbonos más grande que propionil-, y los cuales no son amplios o voluminosos, tales como los compuestos metilmalonlil-, isobutiril- y succinil-CoA, son también donadores efectivos de acilo de acil-CoA, pero a una eficiencia enzimática menor.

EJEMPLO 7 Este ejemplo ilustra la expresión in vitro y dirección de una proteína AMPA aciltransferasa hacia cloroplastos aislados. Muchas proteínas localizadas en cloroplastos se expresan a partir de genes nucleares como precursores, y son dirigidas al cloroplasto mediante un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP). El CTP es removido durante los pasos que intervienen en la incorporación de la proteína dirigida al cloroplasto. Ejemplos de dichas proteínas de cloroplastos incluyen la subunidad pequeña (SSU) de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa (RUBISCO), 5-enol-piruvilshikimato-3-fosfato (EPSPS), ferredoxina, ferredoxina oxidorreductasa, la proteína I y la proteína II del complejo ligero de cosecha, y tiorredoxina F. Se ha demostrado in vivo e in vitro que proteínas no de cloroplastos pueden ser dirigidas al cloroplasto mediante el uso de fusiones con un CTP, y que una secuencia de CTP es suficiente para dirigir una proteína hacia el cloroplasto (Della-Cioppa y otros, 1987). La enzima 5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintetasa (EPSPS) se localiza en el cloroplasto, y es el objetivo del glifosato en plantas. Se ha encontrado que la dirección de la glifosato oxidorreductasa hacia el cloroplasto provee tolerancia de las plantas al glifosato, aunque la GOX localizada hacia el citoplasma es también capaz de proveer dicha tolerancia. Por lo general, la enzima GOX recombinante se localiza hacia el cloroplasto. El metabolismo de glifosato mediado por GOX produce AMPA, que se ha demostrado es fitotóxica. Se ha mostrado en la presente que PhnO es capaz de mostrar N-acilación de AMPA, y que la N-acetil-AMPA no es fitotóxica. Por lo tanto, puede ser necesario inactivar a AMPA en plantas. Esto supone que la AMPA aciltransferasa puede ser expresada en plantas como una enzima activa, y que dichas aciltransferasas son capaces de ser introducidas en el cloroplasto y retener su actividad enzimática. En vista de la fitotoxicidad de AMPA como se describió en el ejemplo 1 , un gen de AMPA aciltransferasa fue introducido en vectores de expresión en plantas para poner a prueba la expresión en plantas. Además, se puso a prueba también la incorporación de aciltransferasa en cloroplastos. Una secuencia de ADN que codifica para un péptido de dirección a cloroplastos fue enlazada en 5' y en el marco con una secuencia de ADN que codifica para una AMPA aciltransferasa. Una secuencia de ADN que codifica para un péptido de tránsito de cloroplasto (CTP, SEQ ID NO: 9) de la subunidad pequeña de ri bu losa- 1 -bisfosfato carboxilasa de Arabidopsis, fue separada de pMON17058 usando endonucleasas de restricción BgAl y Ncol, e insertada en sitios de restricción complementarios en pMON15028 para producir pMON 15029, de modo que la secuencia de codificación de CTP fuera enlazada 5' hacia y en el marco con la secuencia de codificación de phnO en pMON15028. El gen phnO quimérico resultante en pMON15029 es capaz de producir una proteína PhnO dirigida a cloroplastos. Un cassette de ADN EcoRI para BgAl que contiene la secuencia de codificación CTP-PhnO, SEQ ID NO: 11 de pMOM15029, fue insertado en sitios EcoRI y BamHl en pBlueScript KS(-) para producir pMON15036. La secuencia de codificación CTP-PhnO en pMON15036 puede ser expresada en un sistema de transcripción/traducción in vitro a partir de un promotor de fagos T3. Se construyó un plásmido de expresión transitoria en plantas similar, PMON15035, pero sin la secuencia de dirección a cloroplastos. Un fragmento de ADN EcoRI para BgAl que contiene únicamente la secuencia de codificación phnO fue separado de pMON15028, e insertado en sitios EcoRI y BamHl en pBluesScript KS(+), de modo que se pudiera producir PhnO a partir de un promotor de fagos T7 en un sistema de transcripción/traducción in vitro. Una secuencia de ADN Ncol para EcoRI que codifica para PhnO fue separada de pMON 15028, e insertada en pMON 17061 , produciendo pMON 15032. pMON 15032 provee la expresión de phnO a partir de un promotor recA de E. coli. Un fragmento de ADN BgAl para EcoRI que codifica para PhnO fue separado de pMON15028, e insertado en pBlueScript SK(-) para producir pMON15033. pMON15033 provee la expresión de phnO a partir de un promotor lac de E. coli., Un fragmento de ADN BgAl para EcoRI que codifica para CTP-PhnO fue separado de pMON 15029, e insertado en sitios compatibles en pBlueScript SK(-), proveyendo la expresión de la proteína PhnO dirigida a cloroplastos a partir de un promotor lac de E. coli de pMON15034. pMON 15032, pMON 15033 y pMON 15034 fueron introducidos en JM101 de E. coli. Los cultivos fueron desarrollados e inducidos como se describió anteriormente, excepto que la expresión de células que contenían pMON15032 fue inducida con la adición de 50 partes por millón de ácido nalidíxico en NaOH a 0.1 M. Se prepararon lisados depurados de cada cultivo, y se sometieron a una prueba de AMPA acriltransferasa como se describió anteriormente, para determinar la presencia de actividad de AMPA aciltransferasa. Todos los lisados contenían cantidades sustanciales de actividad de aciltransferasa arriba de los niveles control. Lo más importante, el péptido CTP-PhnO (SEQ ID NO: 12) expresado a partir de pMON15034, pareció retener su actividad total enzimática de aciltransferasa. Se usaron pMON15035 (PhnO) y pMON15036 (CTP-PhnO) in vitro para generar la proteína PhnO marcada con [35S]-metionina para su uso en una prueba de incorporación de cloroplasto. En resumen, el procedimiento usado para la transcripción y traducción in vitro fue como se describe en "Short Protocols In Molecular Biology", tercera edición, Ed. Ausubel y otros, Wiley & Sons Pub. (1995), cita que se incorpora en la presente como referencia. Aproximadamente 20 microgramos de ADN de plásmido fueron digeridos hasta término con endonucleasa de restricción Hindlll en una reacción de 100 microlitros. Se usaron 20 microlitros de la digestión del plásmido, o aproximadamente 4 microgramos de ADN de plásmido linealizado, en una reacción de transcripción in vitro para generar ARN mensajero para producir PhnO o el producto de proteína CTP-PhnO en reacciones de traducción posteriores. Las reacciones de transcripción consistieron de 20 microlitros de ADN de plásmido Nnealizado, 20 microlitros de amortiguador de transcripción 5X (Tris-HCl a 200 mM, pH 8.0, MgCI2 a 40 mM, espermidina a 10 mM y NaCI a 250 mM), 20 microlitros de mezcla de ribonucleósido trifosfato 5X (cada uno de ATP, CTP, UTP a 5 mM, diguanosina trifosfato (G-5'ppp5'G)TP a 5 mM, GTP a 5 mM), 10 microlitros de ditiotreitol (DTT) a 0.1 M, 10 microlitros de RNasin™ (una mezcla inhibidora de ribonucleasa pancreática de Promega), 4 microlitros de ARN polimerasa (T7 o T3, New England Biolabs, Inc), y agua destilada y desionizada hasta 100 miocrolitros. Cada reacción se incubó a 37°C durante 1 hora. Se analizaron 4.5 microlitros de cada reacción en un gel de formaldehído-agarosa a 1.4% para asegurar que cada reacción produjera un molde adecuado de ARN para el siguiente paso de traducción. Se usaron 20 microlitros de las reacciones de transcripción para producir proteínas PhnO marcadas con [35S]-metionina para su uso en una prueba de incorporación en cloroplastos. En resumen, se mezcló ARN con 6 microlitros de una mezcla acuosa de aminoácidos sin metionina, 15 microlitros de [^Sj-metionina (1400 Ci/mmol, Amersham), y 200 microlitros de un lisado de reticulocitos de conejo. Estas reacciones se incubaron a 37°C durante 2 horas, y se colocaron en hielo seco para su almacenamiento. Se analizó una muestra de 10 microlitros de cada reacción en un gel de SDS-PAGE a 15%. Los geles se secaron en vacío, y se colocaron directamente sobre el lado de la emulsión de película KODAK™ X-O-MAT™ para su autorradiografía. Los resultados indicaron que cada plásmido produjo péptidos respectivos de la masa molecular predicha para PhnO (pMON15035) y CTP-PhnO (pMON15036) en cantidad suficiente para realizar la prueba de captación en cloroplastos en una prueba de incorporación. Se aislaron cloroplastos intactos de una cabeza de lechuga romana sin nervaduras de conformidad con Edelman y otros, "Methods in Chioroplast Molecular Biology", Elsevier Biomedical Press, Cap. 86, 1982. Se preparó un litro de material de abastecimiento de regulador de pH para trituración (regulador de pH GR) (EDTA de sodio a 2 mM, MgCI2 a 1 mM, MnCI2 a 1 mM, Hepes-KOH a 50 mM, pH 7.5, y sorbitol a 0.33 mM). Poco antes del uso, se añadieron 890 mg de ácido ascórbico a 900 ml de la solución de abastecimiento de regulador de pH GR. Se mezcló una cabeza de lechuga romana sin nervaduras y rasgada, con 900 ml de regulador de pH GR, y se maceró mezclándola en un mezclador Waring tres veces durante 3 segundos cada vez, a alta velocidad. La suspensión se filtró a través de cuatro capas de Miracloth, y el producto filtrado se centrifugó a 5,000 RPM durante 10 minutos a 4°C en un rotor GS-3 SORVALL™. El sobrenadante fue decantado y la pella resuspendida con una varilla de vidrio en 4 ml de amortiguador GR. Los cloroplastos fueron aislados mediante centrifugación a través de un gradiente de Percoll. Se preparó un gradiente de Percoll a 80% f mezclando 16 ml de PBF-Percoll con 4 ml de amortiguador 5X (EDTA a 10 mM, MgC a 5 mM, MnCfe a 5 mM, Hepes-KOH a 250 mM, 30 gramos de sorbitol, 490 mg de ascorbato de sodio, 85.5 mg de glutatión a 100 ml con ddH2O). Se preparó una solución de Percoll a 40% combinando 8 ml de PBF- Percoll con 4 ml de 5X amortiguador y 8 ml de ddH20. Se preparó un gradiente de Percoll en un tubo de Corex de 30 ml estratificando 10 ml de ío Percoll a 40% sobre 10 ml de Percoll a 80%. Los cloroplastos fueron aislados estratificando los cloroplastos resuspendidos sobre el gradiente de Percoll, centrifugando a 9,500 RPM durante 10 minutos en un rotor de cubo oscilante SS-34 SORVALL™ a 4°C durante 10 minutos con el freno puesto. Los cloroplastos fraccionados permanecen en la capa superior, y fueron 15 pipeteados. Los cloroplastos intactos se localizaron en la interfaz del gradiente de Percoll 40/80%, y fueron removidos a un nuevo tubo de A COREX™ de 30 ml. Los cloroplastos aislados fueron lavados dos veces con regulador de pH GR, y centrifugados para colecta después de cada lavado en un rotor SS-34 a 6,000 RPM durante 10 minutos a 4°C sin el freno puesto. 20 Los cloroplastos lavados y aislados fueron resuspendidos en 1 ml de Hepes- KOH estéril a 50 mM, pH 7.7 y sorbitol a 330 mM, agitando suavemente con una varilla de vidrio, y se determinó la concentración de clorofila de la suspensión. Se añadieron 5 mililitros de una solución de acetona a 80% a 20 microlitros de la suspensión de cloroplastos, y se sometieron suavemente a acción de remolino. La mezcla resultante fue filtrada a través de un papel filtro No. 1 Whatman™ en un tubo de cultivo. La absorbancia del filtrado se determinó a 645 nm y 663 nm contra un blanco de acetona a 80%. Se determinó la concentración de clorofila en microgramos por mililitro de acuerdo con la ecuación No. 1 como [µg/ml de clorofila] = [Aß45-[A663 * (8.02)]. La masa de la clorofila en microgramos se calcula tomando la cantidad de clorofila medida en µg/ml, y multiplicando por el volumen en el cual los cloroplastos fueron resuspendidos (ecuación # 2), el cual es 5 ml en este ejemplo. De esta manera, la concentración de clorofila en µg/µl en la muestra medida, equivale al valor determinado en la ecuación No. 2 divido entre el volumen de la muestra medida, el cual en este ejemplo es 20 µl. En este ejemplo, se determinó que A645 es de 0.496, y que Aera es de 1.0814. De esta manera, la concentración de clorofila en la muestra medida fue de 4.67 µg/µl. La concentración de clorofila en la suspensión de cloroplastos se ajustó a 4.0 µg/µl con Hepes-KOH pH 7.7 y solución de sorbitol a 330 mM, y la suspensión de cloroplastos resultante fue almacenada sobre hielo en la oscuridad. Un experimento típico de absorción de 300 microlitros contenía ATP a 5 mM, metionina no marcada a 8.3 mM, sorbitol a 322 mM, Hepes-KOH a 58.3 mM (pH 8.0), 50 microlitros de productos de traducción de lisado de reticulocitos y cloroplastos intactos (aproximadamente 200 microgramos de clorofila). Las mezclas de captación fueron balanceadas suavemente a temperatura ambiente en tubos de vidrio de 10 X 75 mm, directamente enfrente de un juego de iluminador de fibra óptica a intensidad de luz máxima usando un foco de 150 Watts. Dos muestras separadas de 70 microlitros de cada mezcla de captación fueron removidas a 0, 5, 10 y 15 minutos. Una muestra fue centrifugada sobre gradientes de aceite de silicón de 100 microlitros en tubos de polietileno de 150 microlitros mediante centrifugación a 11 ,000 X g durante 30 segundos, y congelada de inmediato en hielo seco. Bajo estas condiciones, los cloroplastos intactos forman una pella bajo la capa de aceite de silicón, y el medio de incubación que contiene al lisado de reticulocitos queda flotando sobre la superficie de la interfaz. La otra muestra f ío se trató con proteasa (volumen de un décimo o 7 microlitros de 0.25 mg/ml de cada mezcla de proteasas tripsina y quimotripsina) durante 30 minutos sobre hielo, se sometió entonces a separación en aceite de silicón, y se congeló sobre hielo seco. Las pellas de cloroplastos fueron entonces resuspendidas en 50-100 microlitros de un amortiguador de lisis (Hepes-KOH a 10 mM, pH 15 7.5, PMSF a 1 mM, benzamidina a 1 mM, ácido e-amino-n-caproico a 5 mM, y 30 microgramos por ml de aprotinina), y se centrifugaron a 15,000 X g durante A 20 minutos para transformar a pellas las membranas de los tilacoides. El sobrenadante depurado (proteínas del estroma) de esta centrifugación, y una alícuota del medio de incubación del lisado de reticulocitos de cada 20 experimento de captación, se mezclaron con un volumen igual de 2X amortiguador de muestra SDS-PAGE, y se analizaron en un gel de SDS- PAGE a 15%, se secaron y se expusieron a una película como se describió anteriormente. Los cloroplastos expuestos a CTP-PhnO marcados con [35S]- metionina contenían proteína marcada con [35S] de un tamaño consistente con la forma predicha de PhnO procesada con CTP, mientras que los cloroplastos expuestos a PhnO marcada con metionina, carecieron de proteína marcada. La proteína marcada incorporada en los cloroplastos fue también resistente a la proteasa. Estos resultados indicaron que PhnO podría ser dirigida a cloroplastos cuando se fusiona a una secuencia de péptido de dirección a plástidos.

EJEMPLO 8 Este ejemplo ilustra la identificación y caracterización de plantas transformadas con una AMPA aciltransferasa. Una amplia variedad de especies vegetales ha sido transformada con éxito usando cualquier número de metodologías de transformación de plantas bien conocidas en la técnica. En particular, la transformación de plantas mediada por Agrobacterium tumefaciens es el método preferido que se usa actualmente; sin embargo, métodos balísticos que aumentan el suministro de ADN simple directamente a células vegetales mediante bormbardeo de microproyectiles, son también muy efectivos para producir plantas transformadas en forma recombinante. Además, métodos que implican el uso de liposomas, electroporación, químicos que aumentan la captación de ADN libre, y transformación usando virus o polen, son alternativas que se pueden usar para insertar construcciones de ADN de esta invención en células vegetales. Las plantas que pueden ser transformadas mediante la práctica de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, maíz, trigo, algodón, arroz, soya, remolacha, cañóla, lino, cebada, colza f oleaginosa, girasol, papa, tabaco, tomate, alfalfa, lechuga, manzana, álamo, pino, eucalipto, acacia, liquidámbar, ocozol, pino radiata, pino del incienso, abeto rojo, teca, alfalfa, trébol y otros cultivos forrajeros, pastos para céspedes, palma de aceite, caña de azúcar, plátano, café, té, cacao, manzana, nogal, almendro, uva, cacahuate, leguminosas, petunia, caléndula, vinca, begonia, geranio, pensamiento, impaciente, avenas, sorgo y mijo. Las f 10 moléculas de ADN para su uso en la presente invención pueden ser genes nativos o que ocurren naturalmente, o genes quiméricos construidos a partir de secuencias de polinucleótidos útiles incluyendo promotores, intensificadores, secuencias guía traducidas o no traducidas, secuencias que codifican para péptidos de señal, secuencias que codifican para péptidos de 15 tránsito, genes estructurales, fusiones de genes estructurales, terminadores, intrones, repeticiones invertidas o repeticiones directas, enlazadores y ^ secuencias de poliadenilación. Las secuencias de ADN contempladas en esta invención incluyen secuencias de polinucleótidos de cadena sencilla o doble, secuencias lineales, secuencias de polinucleótidos circulares cerradas en 20 forma covalente, plásmidos, bácmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC's), cromosomas artificiales de levaduras (YAC's) y secuencias de ARN y ADN viral. En cuanto a la transformación de plantas mediada por Agrobacterium, vectores adecuados de transformación de plantas incluyen aquellos derivados de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefaciens, así como también aquellos descritos, por ejemplo, por Herrera-Estrella (1983), Bevari (1984), Klee (1985) y la publicación EPO 120,516 (Schilperoort y otros). Además de vectores de transformación de plantas derivados de plásmiclos Ti o plásmidos inductores de raíces (Ri) de Agrobacterium, se pueden usar métodos alternativos como los descritos anteriormente para insertar las construcciones de ADN de esta invención en células vegetales. Los plásmidos usados para la transformación de plantas fueron construidos generalmente a partir de vectores los cuales han sido descritos en otras partes, particularmente en la patente de E.U.A. No. 5,463,175 (Barry y otros, 1995), la cual se incorpora en la presente como referencia. Se construyeron y mantuvieron plásmidos en E. coli usando resistencia a aminoglucósido adenililtransferasa de Tnl (gen aad, referido comúnmente como gen de resistencia a estreptomicina/espectinomicina o gen de resistencia a Spc/Str), lo cual es también un determinante para selección y mantenimiento en Agrobacterium. Se usaron también otros marcadores seleccionables y de mantenimiento de plásmidos bien conoddos en la técnica para su uso en E. coli, consistiendo esencialmente de genes de neomicina fosfotransferasa, gentamicina acetiltransferasa y beta lactamasa solos o presentes en combinación, en un solo replicón o vector. Los plásmidos contienen generalmente oriV, un origen de replicación derivado del plásmido RK2 de amplio intervalo de hospederos, y secuencias op322 y bom (origen de replicación para mantenimiento en E. coli, y base de movilidad para transferencia por conjugación, respectivamente,) derivadas del plásmido pBR322. Un gen phnO que codifica para una AMPA aciltransferasa fue insertado en cassettes de expresión en vectores de transformación de plantas. Estos cassettes contienen generalmente los siguientes elementos en orden secuencial 5' a 3': una secuencia que comprende un promotor operable en plantas, una secuencia que codifica para un péptido de tránsito de plástidos o cloroplastos, un sitio o sitios de clonación contenidos dentro de un polienlazador, y una región no traducida 3' funcional en plantas. Se construyen con frecuencia cassettes de expresión que contienen sitios de restricción únicos que flanquean el dominio del cassette, de modo que el cassette completo puede ser separado de un plásmido, y colocado en otros vectores de plásmido construidos en forma similar. Se prefieren sitios de restricción formados de secuencias de reconocimiento de 8 pares de bases, y la mayoría de los cassettes en la presente invención es flanqueada cuando menos en un extremo por un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción Notl. Los promotores preferidos son el promotor del virus del mosaico de la escrofularia, P-FMV (Gowda y otros, 1989), el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor CaMV 35S (Odell y otros, 1985), o el promotor mejorado 35S del CaMV (véase patente de E.U.A. No. 5,196,525; Kay y otros, 1987). Muchos otros promotores que son activos en células vegetales han sido descritos en la literatura. Dichos promotores se pueden obtener de plantas o virus de plantas e incluyen, pero no están limitados a, los promotores de nopalina sintasa (NOS) y octopina sintasa (OCS) que son portados en plásmidos inductores de tumores presentes generalmente dentro f de cepas virulentas y no virulentas de Agrobacterium tumefaciens, el promotor 19S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV), el promotor del virus del moteado amarillo de la cornalina, el promotor del virus de ADN baciliforme de la caña de azúcar, el promotor del virus del estriado clorótico del cacahuate, el promotor de actina del arroz y el promotor de la subunidad pequeña de ribulosa 1 ,5-bisfosfato carboxilasa (ssRUBISCO) inducible por la luz. Estos f ío promotores se pueden usar para crear varios tipos de construcciones de ADN útiles para expresión génica en plantas (véase, por ejemplo, Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,463,175). Promotores particularmente deseables que se contemplan debido a su naturaleza constitutiva, son los promotores 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV35S) y 35S del virus del mosaico de la 15 escrofularia (FMV35S), los cuales se ha mostrado producen altos niveles de expresión en la mayoría de los órganos de las plantas. Se contemplan A también otros promotores que dirigirían la expresión dirigida o específica en tejidos, por ejemplo, en tejidos tales como hojas, meristemo, flor, fruto y órganos de carácter reproductor. Además, se contemplan también vectores 20 quiméricos. Se usaron también secuencias de poliadenilación y de terminación no traducidas 3' del gen E9 (E9 3') de ribulosa bisfosfato carboxilasa sintasa del chícharo y el gen de nopalina sintasa (NOS 3').

Cassettes de expresión que consisten de un gen estructural de AMPA aciltransferasa insertado hacia el extremo 3' de un promotor y entre una secuencia que codifica para un péptido dirigido a cloroplastos y secuencia 3' no traducida, estuvieron presentes generalmente en un vector de transformación de plantas. Los cassettes de expresión estuvieron flanqueados generalmente en cualquier extremo del cassette por una región de borde derecho de ADN T de tipo nopalina en un extremo, y una región de borde izquierdo en el otro extremo, ambas regiones de borde derivadas de pTiT37 (Fraley y otros, 1985). Algunos vectores de transformación de plantas contenían únicamente la región de borde derecho, que se requiere para el inicio de la transferencia de ADN T de Agrobacterium a la célula hospedera. La mayoría de los vectores de transformación de plantas contenían también un gen de GOX (glifosato oxidorreductasa), como se describió anteriormente y como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,463,175. La enzima GOX expresada de estos vectores fue dirigida generalmente al cloroplasto cuando fue insertada en el genoma de la planta. Vectores de transformación de plantas fueron movilizados en la cepa A208 ABl de Agrobacterium que posee el plásmido Ti desarmado pTiC58 (pMP90RK) (Koncz y Schell, 1986). El plásmido Ti no posee los genes de fitohormona de ADN T que inducen la formación de agallas de la corona. El apareamiento del vector de plantas en ABl se llevó a cabo mediante un sistema de conjugación triparental usando el plásmido auxiliar pRK2013 (Ditta y otros, 1980). En forma alternativa, el plásmido de transformación de plantas puede ser introducido en la cepa ABl mediante electroporación como es descrito por Mattanovich y otros (Efficient transformation of Agrobacterium spp. by electroporation., Nucleic Acids Res. (1989), 17(16), 6747), cita que se incorpora en la presente como referencia. Cuando tejido vegetal es incubado con el conjugado de ABl:: vector de plantas, el vector recombinante es transferido a las células vegetales por las funciones vir codificadas por el plásmido pTiC58 desarmado. Idealmente, el vector recombinante se abre en la región de borde derecho de ADN T, y el ADN entre las secuencias de borde derecho e izquierdo es transferido direccionalmente e insertado en el genoma de la planta hospedera, aunque la secuencia recombinante completa del vector de transformación de plantas puede ser transferida e insertada. El plásmido Ti pTiC58 no es transferido a las células vegetales, sino permanece en el donador Agrobacterium. Se pueden regenerar plantas recombinantes a partir de células vegetales o tejido vegetal que hayan sido transformados con un gen estructural funcional de AMPA aciltransferasa. La elección de la metodología para el paso de regeneración no es crítica, habiendo protocolos adecuados para hospederos de las familias Leguminosae (alfalfa, soya, trébol, etc.), Umbelliferae (zanahoria, apio, pastinaca), Cruciferae (col, rábano picante, colza, etc.), Cucurbitaceae (melón y pepino), Gramineae (trigo, arroz, maíz, etc.), Solanaceae (papa, tabaco, tomate, pimiento), y varios cultivos florales. Véase, por ejemplo, Amrnirato, 1984; Shimamoto, 1989; Fromm, 1990; y Vasil, 1990). Plantas recombinantes que hayan sido transformadas con una AMPA aciltransferasa se pueden seleccionar también en medio que contenga AMPA. La concentración inhibidora apropiada de AMPA puede ser determinada fácilmente por el experto en la técnica para cualquier hospedero en particular, mediante selección para toxicidad de AMPA como se describe en el ejemplo 1. En forma alternativa, cuando la AMPA aciltransferasa es transformada en plantas previamente transformadas con GOX y seleccionadas para crecimiento en glifosato, se puede usar AMPA o glifosato como el ingrediente selectivo para seleccionar para eventos de transformación que expresen niveles suficientes de enzima AMPA aciltransferasa. El glifosato se debe aplicar a niveles que de otra manera serían inhibidores para una planta recombinante que expresa GOX y seleccionada para crecimiento sobre glifosato, debido al nivel incrementado de AMPA el cual se puede producir como resultado de degradación de glifosato mediada por GOX. En plantas que expresan la enzima GOX recombinante, se ha mostrado que la exposición a niveles crecientes de glifosato induce amarillamiento o clororis de las hojas, características de crecimiento achaparrado, e infertilidad. La AMPA aciltransferasa expresada coordinadamente o en combinación con la expresión de GOX, puede superar estos efectos perjudiciales. También es posible usar AMPA como marcador seleccionable de transformación de plantas como alternativa a la selección por glifosato.

Tabaco Plantas de tabaco fueron transformadas con un gen phnO. En un procedimiento de transformación de discos foliares de tabaco, se utilizó tejido sano de una hoja de aproximadamente 1 mes de vida. Después de un paso de esterilización de superficie durante 15 a 20 minutos con CLOROX™ a 10% más un agente tensioactivo, las hojas fueron enjuagadas 3 veces en agua estéril. Los discos foliares fueron pinchados con un punzón sobre papel estéril, colocados de cabeza sobre medios MS104 (4.3 g/l de sales de MS, 30 g/l de sacarosa, 2 ml/l ele 500 X vitaminas B5, 0.1 mg/l de NAA y 1.0 mg/l de BA), y pre-cultivados por un día. Los discos fueron inoculados entonces con un cultivo diluido 1 :5 de ABl desarmado de Agrobacterium que contenía al vector en cuestión (densidad de cultivo final con DO de aproximadamente 0.6, determinada a 550 nm). La inoculación se llevó a cabo colocando los discos en tubos de centrífuga estériles junto con el cultivo. Después de 30 a 60 segundos, el líquido fue drenado, y los discos fueron secados entre papel filtro estéril. Los discos fueron colocados entonces de cabeza sobre un disco de filtración sobre placas de alimentación MS104, e incubados durante 2 a 3 días. Después de este período de co-cultivo, los discos fueron transferidos, aún de cabeza, a placas de selección que contenían medios MS104. Después de 2 a 3 semanas se formaron callos, y se separaron grupos individuales de los discos foliares. Los brotes fueron cortados limpiamente del callo cuando eran suficientemente grandes para distinguirlos de los tallos. Los brotes se colocaron sobre medios de enraizamiento libres de hormona (MSO: 4.3 g/l de sales de MS, 30 g/l de sacarosa y 2 ml/1 de 500X vitaminas B5) con selección. Se formaron raíces en una a dos semanas. Cualquier prueba en callos foliares se llevó a cabo de preferencia en brotes enraizados mientras aún eran estériles. Los brotes enraizados se colocaron en suelo y se mantuvieron en un ambiente de alto contenido de humedad (es decir, contenedores o bolsas de plástico). Los brotes fueron reblandecidos exponiéndolos gradualmente a condiciones de humedad ambiental. Tres eventos de transformación del tabaco, designados como líneas 33476, 36779 y 37235, se seleccionaron para análisis posterior. Se usó pMON17226 (Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,463,175, 1995) para producir la línea de plantas 33476, la cual contiene una construcción del gen de FMV-CTP-GOX. Se produjeron las líneas 36779 y 37235 usando pMON17261 , el cual es un plásmido derivado de pMON17226 que contiene el cassette de Not\ que contiene una secuencia de genes de FMV-CTP-PhnO (SEQ ID NO: 11) además de FMV-CTP-GOX. El cassette de Notl se construyó de la manera siguiente: La secuencia que codifica para CTP, representada por SEQ ID NO: 9, fue separada de pMON 17058 como un fragmento BgAl para Ncol, e insertada en pMON15028, formando una secuencia representada por SEQ ID NO: 11 , en la cual la secuencia de codificación de CTP estaba hacia el extremo 5' y en el marco con la secuencia de codificación de PhnO representada dentro de SEQ ID NO: 7. La construcción resultante fue designada como pMON 15029. La secuencia de codificación de CTP-PhnO fue separada de pMON 15029 en un fragmento BgAl para Sacl, y combinada con fragmentos de pMON 17063 para producir pMON15038. pMON17063 fue desarmado usando digestión por restricción para proveer partes necesarias para la construcción de pMON15038. pMON17063 fue digerido con Sacl y Hindlll para producir una estructura de base del vector en la cual un fragmento de promotor y la secuencia de CTP-PhnO fueron insertados. pMON17063 fue digerido también en una reacción separada con Hindlll y BgAl para producir un fragmento que contenía una secuencia de promotor de FMV. El fragmento de promotor y el fragmento de CTP-PhnO fueron ligados entre sí en una reacción junto con el fragmento de la estructura de base del vector para producir pMON15038, conteniendo un cassette Notl que aloja una secuencia que codifica para un péptido PhnO dirigido a cloroplastos expresado a partir de un promotor de FMV, y flanqueado hacia el extremo 3' por una secuencia de poliadenilación y de término de la transcripción NOS E9 3'. Esta secuencia de Notl fue separada de pMON15038 e insertada en el sitio Notl único en pMON17241 para producir pMON17261 , conteniendo una secuencia de codificación de GOX dirigida a cloroplastos expresada a partir de un promotor de FMV, y flanqueada hacia el extremo 3' por una secuencia E9 3', junto con la secuencia de codificación de CTP-PhnO y el cassette de expresión. Se espera que los eventos de transformación derivados de este vector no sólo sean resistentes al glifosato, sino provean también resistencia a la fitotoxicidad de la AMPA. Se analizaron las líneas 36779 y 37235 derivadas de pMON17261 para detectar la presencia de genes que codifican para glifosato oxidorreductasa y AMPA aciltransferasa, mediante PCR, para detectar la presencia de GOX y enzimas PhnO mediante western blot, y para detectar la presencia de metabolitos producidos como resultado de f degradación de [14C]-glifosato mediada por GOX mediante HPLC. 5 Se seleccionó la línea 33476, obtenida como un evento de transformación derivado de pMON17226, como un control de "sólo GOX". Las líneas 36779 y 37235 demostraron diferentes fenotipos después de exposición a glifosato, y se seleccionaron como eventos resistentes a glifosato que surgen después de transformación con pMON17261. La línea 37235 se f ío blanqueó o amarillent después de su exposición a glifosato, similar en fenotipo a la línea 33476 de sólo GOX. Sin embargo, la línea 36779 no exhibió dicho efecto de blanqueo. Se extrajo ADN de tejido foliar para cada uno de estos eventos, así como también de hojas de tabaco Samsun de tipo silvestre, y se sometió a PCR para determinar la presencia o ausencia del gen 15 de phnO transformante. Se usó ADN genómico aislado de líneas de tabaco A transformadas como el ADN molde en una reacción de PCR, y se compararon los productos de reacción con tabaco Samsum de tipo silvestre. Las reacciones de PCR consistieron de un volumen total de 50 microlitros que 20 contenían regulador de pH de amplificación 10X, MgCI2 a 1.5 mM, mezcla de desoxinucleótidos con cada uno a 1 mM, 50-100 ng de ADN genómico, iniciadores cada uno a una concentración final de 16.8 pM, y 1.5 unidades de ADN polmerasa AmpliTaq (Cetus/Perkin Elmer). Los iniciadores (sintetizados por orden de GENOSYS) consistieron de las secuencias descritas en SEQ ID NO: 21 y SEQ ID NO: 22. SEQ ID NO: 21 es una secuencia de 20 pares de bases capaz de iniciar la síntesis de la secuencia del gen phnO de P2A (SEQ ID NO: 7), e hibrida con los primeros 20 nucleótidos de la secuencia de codificación en ese gen. SEQ ID NO: 22 es también una secuencia de 20 pares de bases, pero es capaz de iniciar la síntesis de un gen phnO a partir de la secuencia de codificación terminal en la región de codificación estructural, e hibrida con los 20 nucleótidos terminales de la secuencia que codifica para PhnO. Las condiciones de amplificación consistieron de 3 ciclos de 97°C durante 1 minuto, 60°C durante 2 minutos y 72°C durante 2 minutos, seguido de 37 ciclos de 94°C durante 1 minuto, 60°C durante 2 minutos y 72°C durante 2 minutos, seguido generalmente por un remojo a 4°C. Muestras de 10 microlitros se analizaron generalmente mediante electroforesis en gel de agarosa TAE a 1 % para resolver las bandas relevantes a partir de iniciadores residuales. Después de la tinción de los geles producto con bromuro de etidio, un producto de amplificación del gen phnO de aproximadamente 432 pares de bases, juzgado por la posición de migración contra marcadores lambda digeridos con Hindlll, apareció únicamente en los extractos de la línea 33779, indicando la presencia del gen phnO en esa línea. Se obtuvo semilla de eventos de transformación Ro después de autopolinización bajo condiciones de cámara de crecimiento. Las semillas Ro fueron curadas y sembradas para generar la progenie Rl. Hojas de la progenie Rl en la etapa de 5 hojas fueron expuestas a [14C]-glifosato aplicando por punto una muestra de 2 microlitros en cada nervadura (50 microlitros de sal de sodio de [14C]-glifosato, 517,000 dpm/microgramo, 0.42 microgramos/microlitro mezclados con 10 microlitros de glicerol). Cada hoja recibió varios puntos, dependiendo del número de nervaduras en esa hoja. Tres días después, se aplicaron otros 15 puntos de 2 microlitros a cada hoja. Dos semanas después, se aplicaron 5 puntos de 2 microlitros a cada una de dos hojas en cada planta. Estas eran hojas nuevas, y no eran las hojas primarias a las cuales se aplicó inicialmente glifosato. Cinco días después de esta última aplicación, se muestrearon aproximadamente 300 miligramos de tejido de dos hojas de cada planta. Las muestras de cada planta fueron homogeneizadas en volúmenes separados de 1 ml de agua desionizada, centrifugadas a 9,000 RPM en una microcentrífuga, y los volúmenes acuosos fueron colectados y almacenados en hielo. Los extractos se analizaron mediante HPLC para determinar la presencia de metabolitos marcados con [14C] como en el ejemplo 2. El extracto obtenido de la línea 33476 (GOX) contenía únicamente [14C]-AMPA. El extracto obtenido de la línea 37235 contenía [14C]-glifosato no metabolizado, así como también una cantidad traza, pero medible, de [14C]-AMPA. Únicamente se observó N-acetil-[1 C]-AMPA en el extracto obtenido de la línea 36779. Estos resultados son consistentes con los datos de PCR que indicaban que la línea 36779 contenía por lo menos una copia del gen phnO. Además, la falta de un efecto de blanqueo en la línea 36779 después de exposición a glifosato, es consistente con la presencia de GOX y enzimas PhnO funcionales, y la ausencia de [14C]-AMPA detectable.

Algodón Un gen phnO recombinante fue transformado en la variedad de algodón Coker 312 (Gossypium hirsutum LJ. Se obtuvieron líneas de algodón tolerantes a glifosato mediante transformación de plantas mediada por Agrobacterium usando vectores de plásmido binarios de borde doble que contenían (1 ) gox, un gen de la cepa LBAA de Achromobacter sp. que codifica para una enzima que metaboliza el glifosato, glifosato oxidorreductasa (GOX), (2) el gen gox y un gen phnO de E. coli que codifica para PhnO, o (3) la construcción del gen doble gox/phnO junto con un gen de la cepa CP4 de Agrobacterium que codifica para 5-enolpiruvilshik¡mato-3-fosfato sintasa (EPSPS). Todos los vectores son capaces de mostrar replicación en los hospederos Agrobacterium tumefaciens y E. coli, y contienen un gen de aminoglucósido adenililtransferasa (aad) que confiere resistencia a aminoglucósidos tales como espectinomicina o estreptomicina y provee un método para el mantenimiento de plásmidos. pMON17241 contiene un gen recombinante que consiste de un promotor 35S de FMV enlazado 5' a una secuencia de genes de la subunidad pequeña (SSUIA) de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa de Arabidopsis thaliana que codifica para un péptido dirigido a plástidos o cloroplastos (Timko y otros, 1988), la cual es fusionada mediante traducción a una secuencia de codificación del gen gox, la cual está enlazada 3' a una región 3' no traducida, designada como E9, de un gen de ribulosa-1 ,5-bisfosfato carboxilasa de chícharo. PMON 17213 es un vector de transformación de plantas de genes dobles que contiene cassettes de expresión que comprende (1 ) un promotor 35S de FMV enlazado a una secuencia que codifica para un péptido dirigido a cloroplastos de EPSPS de Arabidopsis thaliana enlazada en el marco a una secuencia de codificación de EPSPS de la cepa CP4, la cual está enlazada 3' a una región no traducida E9 3', y (2) un promotor 35S de FMV enlazado a una secuencia de genes de SSUIA que codifica para un péptido dirigido a plástidos enlazada en el marco a una secuencia de codificación de GOX, la cual está enlazada 3' a una secuencia de terminación NOS 3'. PMON17261 , descrito arriba, es un vector de transformación de plantas de genes dobles que contiene cassettes de expresión que comprende (1 ) un promotor 35S de FMV enlazado a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos enlazada en el marco a una secuencia de codificación de GOX, la cual es flanqueada hacia el extremo 3' por la región no traducida E9 3'; y (2) un promotor 35S de FMV enlazado a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos (SEQ ID NO: 9) enlazada en el marco a una secuencia de codificación de PhnO (SEQ ID NO: 7), la cual está enlazada 3' a una secuencia NOS 3'. pMON10151 es un vector de transformación de plantas de genes dobles que contiene cassettes de expresión que comprende (1 ) un promotor 35S de FMV enlazado a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos (SEQ ID NO: 9) enlazada en el marco a una secuencia de codificación de PhnO (SEQ ID NO: 7), la cual es flanqueada hacia el extremo 3' por una secuencia NOS 3'; y (2) un promotor 35S mejorado enlazado a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos enlazada en el marco a una secuencia de codificación de GOX la cual está flanqueada hacia el extremo 3' por una secuencia NOS 3'. pMON 10149 es un vector de transformación de plantas de genes triples que contiene cassettes de expresión que comprende (1 ) un promotor 35S de FMV y una secuencia guía no traducida HSP70 5' de petunia enlazada a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos enlazada en el marco a una secuencia de codificación de EPSPS, la cual es flanqueada hacia el extremo 3' por la secuencia de poliadenilación y terminación E9 3'; (2) un promotor 35S de FMV enlazado a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos (SEQ ID NO: 9), enlazada en el marco a una secuencia de codificación de PhnO (SEQ ID NO: 7), la cual es flanqueada hacia el extremo 3' por una secuencia NOS 3'; y (3) un promotor 35S mejorado del CaMV enlazado a una secuencia de codificación de péptidos de SSUIA dirigida a cloroplastos enlazada en el marco a una secuencia de codificación de GOX, la cual es flanqueada hacia el extremo 3' por una secuencia de poliadenilación 3' de nopalina sintasa (NOS 3'). Los vectores de plásmido fueron ensamblados en cepas K12 de E. coli, y apareados en una cepa ABl desarmada de Agrobacterium. Se usaron cepas de Agrobacterium resistentes a aminoglucósido para transformar secciones de hipocotilo derivadas de Coker 312 con modificaciones como es descrito por Umbeck y otros (1987) y Umbeck (véase patente de E.U.A. No. 5,159,135 (1992), incorporada en la presente como referencia), excepto que las plantas fueron regeneradas con modificaciones como es descrito por Trolinder y Goodin (1987). La selección para resistencia a glifosato produjo varias líneas de callos de algodón, las cuales se determinó subsecuentemente mediante PCR de ADN genómico, que contienen los genes respectivos que codifican para EPSPS, GOX o PhnO transferidos de Agrobacterium. Además, se determinó mediante análisis Western blot que estas mismas líneas de callos expresan los genes deseados. Después de lograr la regeneración de las plantas, se recuperaron plantas de algodón intactas que contenían las secuencias de codificación indicadas. Se determinó que plantas previamente identificadas transformadas con un cassette de resistencia a glifosato de genes dobles formado de genes de codificación de EPSPS y GOX eran resistentes a glifosato, cuando se aplicaron a 1360.8 g por acre a través de la etapa de 6 a 7 hojas; sin embargo, se observó blanqueo severo de las hojas. Se piensa que este efecto fitotóxico se debe a la formación de AMPA como resultado de degradación de glifosato mediado por GOX. Para probar esto, se asperjó AMPA a tres regímenes diferentes en plantas Coker 312 de tipo silvestre. Se observó clorosis foliar y crecimiento achaparrado en las plantas a los cuatro días después de la aplicación de glifosato a 18144 g por acre y a ocho días después de la aplicación de 1814.4 g por acre. Estos resultados sugirieron que el efecto fitotóxico observado en líneas de plantas de algodón transformadas en EPSPS/GOX era resultado de la producción de AMPA mediada por GOX en plantas, y que el efecto fitotóxico se puede evitar mediante coexpresión de una AMPA aciltransferasa junto con GOX. Para probar esto, plantas de algodón que expresan GOX o GOX más EPSPS solas o en combinación con la expresión de PhnO, fueron tratadas con [14C]-glifosato, y el metabolismo del glifosato marcado con isótopos fue monitoreado en tejido foliar después de siete días de aplicación. Se seleccionó la línea de algodón 4416 recombinante Coker 312 resistente a glifosato, como una línea de algodón resistente a glifosato después de transformación con pMON10149, un vector de transformación de plantas de borde doble de genes triples mediada por Agrobacterium tumefaciens que contiene EPSPS, GOX y PhnO dirigidas a cloroplastos, cada una expresada independientemente de promotores 35S separados. Se obtuvieron varias plantas R3 4416 a partir de semilla R2. Una hoja de cada planteto en la etapa de tres o cuatro hojas fue tratada con una mezcla del herbicida comercial ROUNDUP ULTRA™ (No. de lote GLP-9701-7428-F), la cual había sido fortificada con [14C]-glifosato (No. de código C-2251 ). Se mostró que ROUNDUP ULTRA™ es 30.25% en peso ácido de glifosato, y que el [14C]-glifosato tenía una pureza radioquímica de 97.3% y una actividad específica de 36.36 mCi/mmoles. La solución de tratamiento consistió de aproximadamente 38 µl que contenía 1.60 x 106 dpm con una actividad específica de [14C]-glifosato de 1.713 x 103 dpm/µg de ácido de glifosato. Tres o siete días después de la aplicación tópica, las hojas tratadas fueron enjuagadas con agua, congeladas en nitrógeno líquido, fracturadas con una espátula, y molidas entonces usando un mezclador de tejidos TEKMAR™ en 10 ml de agua. Los extractos de hojas fueron ajustados a pH 3.5 - 4.0 con HCl a 1 N, y se analizaron aproximadamente 4-8000 dpm para detectar la presencia de [14C]-metabolitos mediante HPLC con escintilación de líquidos y colecta y detección (HPLC/LSC) como se describe en el ejemplo 2. El nuevo crecimiento que incluía el meristemo y nuevas hojas que emergían después de la aplicación tópica, fue extraído también y analizado para detectar la presencia de [14C]-metabolitos. Los resultados se muestran en el cuadro 13.

CUADRO 13 Metabolismo de I C] -glifosato en algodón resistente a lifosato [ 4C]-Glífosato, [14C]-AMPA y N-Acetil-[ 4C]-AMPa como porcentaje del total de isótopos 1 [- 4 C] observados mediante HPLC/LSC en cada muestra, nd indica que el metabolito no fue detectado mediante HPLC/LSC.

El análisis de las hojas tratadas con glifosato y enjuagadas con agua indica la presencia de niveles significativos de N-acetil-[14C]-AMPA en ocho de las diez plantas puestas a prueba. Estos niveles presentaron 27-24% del isótopo extraído de las hojas tratadas. La actividad restante fue casi enteramente [14C]-glifosato. Muy poca cantidad del isótopo [14C] estuvo presente como [14C]-AMPA. Las dos plantas restantes tenían capacidad muy limitada para metabolizar el glifosato, como es indicado por los altos niveles de [14C]-glifosato que quedan sobre las hojas. Una de estas plantas mostró también signos de achaparramiento siete días después del tratamiento, indicando fitotoxicidad del glifosato.

El análisis de crecimiento nuevo en las diez plantas puestas a prueba mostró que la forma predominante de metabolito marcado con [14C] presente era N-acetil-['l4C]-AMPA a más del 90% de los radioisótopos totales en las muestras. En contraste, más del 90% de los isótopos en las dos plantas restantes estaba en forma de [14C]-glifosato, lo cual es consistente con el análisis del extracto de las hojas tratadas para estas dos plantas. Se estudió el metabolismo de [14C]-glifosato en líneas de algodón recombinantes 4268 (GOX/PhnO) y 3753 (EPSPS/GOX). Las plantas de este estudio fueron tratadas como se indicó anteriormente para la línea de algodón 4416, aplicando gotas de ROUNDUP ULTRA fortificado con [14C]-glifosato a una sola hoja en cada planta en la etapa de tres o cuatro hojas. Las hojas tratadas fueron cosechadas y enjuagadas con agua, y entonces molidas y extraídas, y los extractos se analizaron mediante HPLC como se describió anteriormente para detectar la presencia de [14C]-glifosato, [14C]-AMPA y N-acetil-[14C]-AMPA. El nuevo crecimiento, incluyendo el meristemo y las nuevas hojas que emergieron después de la aplicación, fue también extraído y analizado. Los resultados se muestran en el cuadro 14.

CUADRO 14 Metabolismo de f ?r1 , Cl-glifosato en algodón resistente a glifosato % de [14C] metabolito en extracto de % de [14C] metabolito en extracto de hojas tratado con glifosato ...* nuevo crecimiento N-acetil- N-acetil- Planta Glifosato AMPA Glifosato AMPA AMPA AMPA Plantas con GOX/PhnO Plantas con EPSPS/GOX * [14C]-Glifosato, [14C]-AMPA y N-acetil-[14C]-AMPA como porcentaje del total de metabolitos marcados con el isótopo [14C] observado después de análisis HPLC/LSC en cada muestra. ** nd indica que el metabolito no fue detectado mediante HPLC/LSC Niveles significativos de N-acetil-[14C]-AMPA estuvieron presentes en las hojas tratadas de las cuatro plantas de la línea 4268 (GOX/PhnO; B01-B04). En contraste, N-acetil-[14C]-AMPA no fue detectable en extractos obtenidos de plantas de la línea 3753 (EPSPS/GOX; C01 -C04). Tres de estas plantas contenían niveles significativos de [14C]-AMPA en extractos de hojas tratadas, variando de 6 a 27%. Una planta de la línea 3753 fue deficiente en la conversión de [14C]-glifosato a N-acetil-[14C]-AMPA, y esta planta pareció también estar achaparrada. Se determinó que 90-95% del isótopo [14C] en extractos del nuevo crecimiento de las plantas de la línea 4268 está en forma de N-acetil-[14C]-AMPA. Sin embargo, se determinó que 72-86% del isótopo [14C] en extractos del nuevo crecimiento de tres plantas de la línea 3753 es [14C]-AMPA, representando [14C]-glifosato el resto del isótopo en estos tejidos. Se determinó que 93% del isótopo obtenido de plantas de la línea 3753 número C02 es [14C]-glifosato, lo cual es consistente con la falta de metabolismo del glifosato en la aplicación, así como también el achaparramiento observado. Además, las regiones de crecimiento de todas las plantas de la línea 3753 mostraron decoloración y amarillamiento después del tratamiento, pero mejoraron con el tiempo. Alrededor del período de la cosecha, las hojas del nuevo crecimiento mostraron moteado. Estos resultados son consistentes con la presencia de productos activos de genes gox y phnO en las plantas indicadas. Las proteínas GOX y PhnO metabolizan el glifosato a AMPA y N-acetil-AMPA en la forma predicha, y los extractos de plantas de la línea 4268 proveen un patrón metabólico similar al observado con los extractos de plantas de la línea 4416, según se determina mediante HPLC y mediante observación fenotípica. En ambas líneas, el producto predominante de [14C] en los extractos de tejido del nuevo crecimiento después de la aplicación de [14C]-glifosato es N-acetil-[1 C]-AMPA. La fitotoxicidad observada por la decoloración de las hojas de las plantas en la línea 3753 después de la aplicación de glifosato está asociada con la falta de actividad de AMPA N-aciltransferasa. En contraste, la presencia de actividad de AMPA N-aciltransferasa en las líneas de plantas 4416 y 4268 dio como resultado falta de efectos fitotóxicos observados en las plantas de la línea 3753.

Cañóla Plantas de cañóla fueron transformadas con los vectores pMON17138 y pMON17261 , y se obtuvo un número de líneas de plantas de la cañóla transformada que exhibía tolerancia a glifosato. Las plantas fueron transformadas de acuerdo al método descrito en Barry y otros (véase patente de E.U.A. No. 5,663,435). En resumen, se cultivaron plantas de Brassica napus variedad cultivada Westar en condiciones controladas de cámara de crecimiento, según se describe. Cuatro entrenudos terminales de plantas poco antes del cernido o plantas en el proceso de cernido, pero antes de la floración, fueron removidos y esterilizados en su superficie en etanol a 70% en v/v durante 1 minuto, y entonces en hipoclorito de sodio a 2% en p/v durante 20 minutos, y enjuagados entonces tres veces con agua desionizada destilada estéril. Tallos con hojas unidas podrían ser refrigerados en bolsas de plástico húmedas hasta por tres días antes de la esterilización. Seis a siete segmentos de tallo fueron cortados en discos de 5 mm con un rebanador de hortalizas Redco 200 manteniendo la orientación del extremo basal. Discos del tallo (explantes) fueron inoculados con 1 mililitro de la cepa A208 ABl de Agrobacterium tumefaciens que contenía un plásmido de transformación de plantas recombinante preparado como se describió anteriormente. Los explantes fueron colocados con el lado basal hacia abajo en cajas de Petri que contenían 0.1X de sales de MS estándar, vitaminas B5, sacarosa a 3%, agar a 0.8%, pH 5.7 y 1 mg/l de BA (6-benciladenina). Las placas fueron estratificadas con 1.5 ml de medios que contenían sales de MS, vitaminas B5, sacarosa 3%, pH 5.7, 4 mg/l de ácido p-clorofenoxiacético, 0.005 mg/l de cinetina, y cubiertas con papel filtro estéril. Después de un período de co-cultivo de dos a tres días, los explantes fueron transferidos a cajas de Petri ondas (siete explantes por placa) conteniendo sales de MS, vitaminas B5, sacarosa a 3%, agar a 0.8%, pH 5.7, 1mg/l de BA, 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de cefotaxima, 200 mg/l de kanamicina o 175 mg/l de gentamicina para selección, y transferidos después de tres semanas a medios frescos, cinco explantes por placa. Los explantes fueron cultivados en un área de crecimiento a 25°C con luz continua (luz blanca fría). Después de otras tres semanas, los brotes fueron separados de los explantes, y se iniciaron pruebas de reinducción de callos foliares para confirmar la modificación de los brotes de R0. Tres piezas diminutas de tejido foliar fueron colocadas en medios de reinducción de callos que contenían sales de MS, vitaminas B5, sacarosa a 3%, agar a 0.8%, pH 5.7, 5 mg/l de BA, 0.5 mg/l de ácido naftalenacético (NAA), 500 mg/l de carbenicilina, 50 mg/l de cefotaxima, 200 mg/l de kanamicina o gentamicina o glifosato a 0.5 mM. Las pruebas foliares fueron incubadas en un área de crecimiento bajo las mismas condiciones que el cultivo de explantes. Después de otras tres semanas, las pruebas de reinducción de callos fueron evaluadas para tolerancia a herbicidas (callo o tejido foliar verde) o sensibilidad (blanqueo). Cada tallo con brotes fue sumergido en ROOTONE al momento de la excisión, colocado en una maceta de 5.08 cm que contenía Metro-MIX 350, y mantenido en un ambiente húmedo cerrado en una cámara de crecimiento a 24°C, fotoperíodo de 16/8 horas, 400 uE por metro cuadrado por segundo (lámparas de HID) para un período de reblandecimiento de aproximadamente tres semanas. El plásmido pMON 17138 es un vector de transformación de plantas de borde individual mediado por Agrobacterium mantenido en la bacteria mediante selección en estreptomicina o espectinomicina. PMON 17138 contiene un borde Ti derecho individual que flanquea el extremo 3' de los elementos genéticos que se desea transferir en el genoma de la planta. Este vector contiene dos cassettes de expresión operables en plantas. Un cassette está formado de un promotor 35S de caulimovirus que dirige la expresión de un gen de neomicina fosfotransferasa (nptll), flanqueado hacia el extremo 3' por una secuencia de poliadenilación y término de la transcripción 3' de nopalina sintasa (NOS 3'). El otro cassette está formado de un promotor del virus del mosaico de la escrofularia (descrito en Rogers, patente de E.U.A. No. 5,678,319) hacia el extremo 5' de una secuencia de poliadenilación y de término de la transcripción de la subunidad pequeña de ribulosa bisfosfato carboxilasa del chícharo. Una secuencia de codificación de glifosato oxidorreductasa (GOX) dirigida a cloroplastos es insertada entre el promotor y la secuencia 3' del chícharo. El plásmido pMON17261 es un vector de transformación de plantas de borde doble mediado por Agrobacterium similar a pMON17138. Un cassette que codifica para GOX dirigido a cloroplastos idéntico al presente en pMON17138 está presente hacia el extremo 3' a partir de un borde derecho de Ti, y hacia el extremo 5' de un cassette de expresión operable en plantas adicional formado de un promotor del virus del mosaico de la escrofularia (P-FMV) enlazado a una secuencia NOS 3'. Una secuencia de codificación de PhnO dirigida a cloroplastos es insertada entre el segundo P-FMV y secuencias NOS 3'. Se evaluaron plantas Ri derivadas de eventos de transformación usando pMON17261 y pMON17138, usando una prueba de aspersión de glifosato descrita en Barry y otros (véase patente de E.U.A. No. 5,633,435).

Maíz Se ha introducido también un gen de AMPA aciltransferasa en células del maíz dulce negro mexicano con expresión del gen y resistencia a glifosato detectadas en callos. Tejido calloso fue transformado de acuerdo al método descrito en Barry y otros (véase patente de E.U.A. No. 5,463,175). Se usaron varios plásmidos para introducir genes de resistencia a glifosato que codifican para GOX y EPSPS en combinación con un gen de AMPA aciltransferasa en células de maíz. Estos plásmidos variaban entre sí en cuanto a los promotores usados, las secuencias peptídicas usadas dirigidas a cloroplastos o plástidos, las secuencias guía no traducidas usadas, la presencia o ausencia de un intrón, y el tipo de terminador 3' usado; sin embargo, todos los plásmidos contenían un gen de AMPA aciltransferasa derivado sintéticamente que codifica para PhnO que contiene la mutación P2A. Se construyó el gen sintético a partir de tres secuencias de polinucleótidos más pequeñas sintetizadas por Monsanto, y caracterizadas por la presencia de la secuencia de codificación de ADN deseada y la traducción de la secuencia de aminoácidos por Stratagene. Inc., La Jolla, CA. El gen de ocurrencia no natural fue ensamblado a partir de tres secuencias más pequeñas formadas de SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18, en donde el gen completamente ensamblado es representado por SEQ ID NO: 19, y está presente en cada uno de los plásmidos usados para la transformación de callos del maíz. Se estableció la secuencia de codificación del gen de ocurrencia no natural con base en el método descrito por Fishhoff y otros en la patente de E.U.A. No. 5,500,365, en el cual se usaron codones preferidos de monocotiledóneas en lugar de aquellos preferidos por E. coli. El gen completamente ensamblado codifica para una proteína PhnO de longitud total idéntica a la secuencia de la proteína nativa, con excepción de la mutación P2A introducida mediante PCR usando SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6 para diseñar sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción apropiados en los extremos de flanqueo de la secuencia de codificación. Los plásmidos que se usaron en la generación de datos de callos del maíz se muestran en el cuadro 15, junto con diferencias con respecto a los elementos genéticos que flanquean la secuencia de codificación de AMPA aciltransferasa.

CUADRO 15 Plásmidos de transformación de callos del maíz y elementos genéticos relevantes Plásmido Elementos genéticos relevantes* PMON32926 [Pe35S/l-Zm.Hsp70/CTP/phnO/T-At.Nos]? GOX? EPSPS PMON32931 [Pe35S/l-Zm.Hsp70/ phnO/T-At.Nos] ? GOX ? EPSPS pM0N32932 [Pe35S/l-Zm.Hsp70/CTP/phnG7T-At.Nos] ? GOX ? EPSPS pM0N32936 [P-Os.Actl/l-Os.Actl/CTP/phnO/T-At. os] ? GOX ? EPSPS pMON32938 [P-Os.Act/l-Os.Actl/CTP/phnO/T-At.Nos] ? GOX ? EPSPS pMON32946 [Pe35S/L-Ta.Cab/CTP/phnO/T-Ta.Hsp70]] ? GOX ? EPSPS pMON32947 [Pe35S/L-Ta.Hsp70/CTP/phnO/T-Ta.Hsp70] ? GOX ? EPSPS pMON32948 EPSPS ? [Pe35S/l-Zm.Hsp70/CTP/phnO/T-At.Nos] ? GOX pMON32950 EPSPS ? [Pe35S/l-Zm.Hsp70/CTP/phnO/T-At.Nos] ? GOX pMON32570 EPSPS ? [Pe35S/L-Ta.Cab/l-Os.Actl/CTP/phnO/T-Ta.Hsp70] ? GOX pMON32571 EPSPS ? [Pe35S/L-Ta.Cab/l-Os.Actl/CTP/phnO/T-Ta.Hsp70] ? GOX pMON32572 EPSPS ? [Pe35S/L-Zm.Hsp70/l-Os.Actl/CTP/phnO/T-Ta.Hsp70]?GOX pM0N32573 EPSPS-» rPe32S/L-Ta.Cab/l-Os.Actl/CTP/phnO/T-Ta.Hsp70] ? GOX * Elementos genéticos contenidos dentro de los cassettes de expresión de PhnO indicados en cada plásmido. Los elementos se muestran en el orden en el cual aparecen en el plásmido,, junto con la presencia de otros genes que codifican resistencia a herbicidas, si están presentes, flanqueando el cassette de expresión de PhnO. -» indica la dirección de la transcripción de cada gen o genes que flanquean el cassette de expresión de PhnO. Los elementos individuales se describen en el texto.

Los promotores que se usaron incluyeron el promotor e35 S del CaMV y el promotor de actina del arroz (P-Os.Actl). Los intrones que se usaron incluyeron aquellos obtenidos de genes de plantas, tales como Hsp70 del maíz (l-Zm.Hsp70) y actina del arroz (l-Os.Actl). Las secuencias guía no traducidas que se usaron incluyeron la proteína de unión a clorofila a/b del trigo (L-Ta.Cab) y Hsp70 del maíz (L-Zm.Hsp70). Las secuencias de poliadenilación y de término de la transcripción que se usaron incluyeron NOS 3' de Agrobacterium tumefaciens (T-At.Nos) y Hsp70 del trigo (T-Ta.Hsp70). Se usó la misma secuencia dirigida a cloroplastos en todos los cassettes de expresión de PhnO, representada por SEQ ID NO: 9. Se usó una prueba de metabolismo de [14C]-glifosato para determinar si los tejidos callosos transformados del maíz contienen formas funcionales de estas enzimas. La prueba se desarrolló para seleccionar grandes números de muestras de callos del maíz. Los callos se obtuvieron de Monsanto Company y de grupos de transformación de maíz de Dekalb Seed Company. Las muestras de callos de Monsanto, designadas individualmente como líneas de callo "19nn-nn-nn" en el cuadro 16, se produjeron de embriones de maíz Hl II X B73. Se bombardearon muestras de callos con ADN plasmídico circular completo, cerrado covalentemente, de vector de transformación de planta recombinante, o con fragmentos de ADN lineales aislados de tales plásmidos 25-50 días después del aislamiento del embrión. Las líneas transformadas se identificaron 8-14 semanas después del bombardeo. Estas líneas se subcultivaron en medio nuevo cada 2 semanas, y cuando se usaron en la prueba de metabolismo tenían 5-7 meses. Las líneas de callos Dekalb OO, OR, OW, OX y OY, se obtuvieron de embriones Hl II x AW. Todas las designaciones de línea corresponden al plásmido recombinante o fragmento lineal usados para transformación balística de tejido de callo como se indicó en la leyenda del cuadro 16. Se obtuvieron 4.5 mCi de N-fosfono-[14C]-metilglicina ([14C]-glifosato) del grupo Monsanto Radiosynthesis en una solución acuosa 1.5 mM, que tenía una radioactividad específica de 39.4 mCi/mM (5.2 X 105 dpm/microgramo). La muestra se identificó con número de código C-2182.2. Se preparó una solución de abastecimiento esterilizada por filtración a través de un Acrodisk de 0.2 mieras (Gelman no. 4192), combinando 2.5 ml de [14C]-glifosato (3.3 x 108 dpm) con 2.5 ml de medio de crecimiento de callo de maíz (medio N6) y 5.0 mg de agente tensioactivo Mon 0818. El [14C]-glifosato en la solución de dosis resultante fue de 0.75 mM. El medio N6 fue descrito por Chu y otros (1975) y se preparó usando sales y vitaminas obtenidas de Sigma Chemical Company, St. Louis Missouri. El tensioactivo Mon 0818 es seboamina etoxilada, el agente tensioactivo usado en el herbicida Roundup. La solución de dosis se sometió a análisis de HPLC como se describió en el ejemplo 2. Los resultados se muestran en un cromatograma ¡lustrado en la figura 1. Se resolvieron los picos radioactivos, el más grande de los cuales correspondió a glifosato (11.3 minutos, 98.8%). Los picos de impureza que corresponden a [14C]-AMPA (5.8 minutos, 0.16%) y un material no identificado (10.2 minutos, 1.0%), también estuvieron presentes en la solución de dosis. Los picos correspondientes a N-acetil-[14C]-AMPA no estuvieron presentes en la solución de dosis. Se prepararon dos soluciones de dosis adicionales usando estos reactivos, cada uno de los cuales se escaló tres veces hasta volúmenes de 15 ml en base al método de preparación descrito arriba. Se sintetizó N-acetil-[14C]-AMPA para usar como un estándar de tiempo de retención de HPLC. Se agregaron 1 ml de piridina y 2 ml de anhídrido acético a un tubo de cultivo de tapón de rosca de 20 ml y se enfrió sobre hielo. Se agregó a la solución fría 0.1 ml de una solución acuosa de [14C]-AMPA (6.2 x 106 dpm, código C-2127.2). Después, el tubo se removió del baño de hielo y se calentó hasta aproximadamente 50-60°C. Se removió una muestra de 10 I después de aproximadamente 30 minutos, y se combinó con 0.5 ml de agua; se analizó de acuerdo con el método de HPLC descrito arriba. No se detectó [14C]-AMPA, sin embargo, se identificaron dos picos radioactivos nuevos; un pico a los 13.9 minutos (68%) y el otro a los 15.4 minutos (32%). Se aisló una muestra del material eluido a los 13.9 minutos y se analizó por medio de espectrometría de masas de electroaspersión de iones negativos. El resultado mostró iones fuertes a m/e 152 y 154, como se esperaba para este compuesto, que tiene un peso molecular de 153 Daltons; el ¡on de m/z 154 se debió al átomo isotópico [14C]. El pico radioactivo que eluyó a los 15.4 minutos no se aisló. Sin embargo, en un experimento separado de HPLC, se mostró que se co-eluye con N-acetil-N-metil-AMPA sintético. Se había mostrado previamente que N-metil-[1 C]-AMPA era una impureza del material [14C]-AMPA inicial. Bajo condiciones asépticas, se transfirieron muestras de callos de maíz a pozos individuales de grupos de cultivo de células COSTAR™ de 48 pozos (cat. No. 3548). No se pesaron las muestras individuales de callos. Sin embargo, en varios casos se determinó el peso total de las muestras de callos en una placa de 48 pozos. Típicamente, el peso promedio de muestras individuales de callos fue de aproximadamente 200-250 mg. En cada prueba, una prueba de callo no transformado, Hl II X B73, se incluyó como un control.

Se agregaron 50 µl de solución de dosis conteniendo 3.3 x106 dpm de [14C]-glifosato a cada muestra de callo. Se sellaron placas de 48 pozos con parafilm y se colocaron en una bolsa de plástico que contenía una toalla de papel húmedo para proveer una atmósfera húmeda. Las bolsas se cerraron y se colocaron en un cajón oscuro a 25°C durante 10 días. Subsecuentemente, cada muestra de callo se transfirió a un tubo de microcentrífuga marcado (VWR, 1.7 ml, cat. No. 20170-620). Se agregó 1.0 ml de agua desionizada a cada tubo, y los tubos se cerraron y colocaron en soportes circulares de flotación de microcentrífuga para 20 tubos (Nalge cat. no. 5974-1015). Estos tubos de la microcentrífuga se hicieron flotar en agua en ebullición durante 30 minutos, se agitaron usando un mezclador de vórtice y después se centrifugaron 5 minutos usando una microcentrífuga marca Fisher. Se removieron muestras de 120 µl de sobrenadante para análisis por HPLC como se describe más abajo. Las muestras se inyectaron usando un autoinyector Waters WISP. Se obtuvieron perfiles cromatográficos para cada muestra analizada, y se obtuvo información cuantitativa extrapolando el área bajo los picos de elución radioactiva con [14C] total en cada muestra. La figura 2 muestra un perfil de HPLC de una mezcla de estándares de los metabolitos radioactivos observados, [14C]-AMPA, [14C]-glifosato y N-acetil-[14C]-AMPA, y la impureza se identificó como N-acetil-N-metil-[14C]-AMPA. El análisis de HPLC se completó típicamente usando una columna SAX SPHERISORB™ S5 250 mm x 10 mm para la mayoría de los análisis. Algunas muestras se analizaron en una columna SAX ALLTECH™ 5 mieras, 250 x 10 mm, que dio un rendimiento similar. Se prepararon dos solventes. El solvente A consistía de KH2P0 0.005M, ajustado a pH 2.0 con H3PO4 y contenía 4% de metanol. El solvente B consistía de KH2PO40.10 M, ajustado a pH 2.0 con H3PO4 y también contenía 4% de metanol. La velocidad de flujo del eluyente se fijó en 3 ml/min, y la velocidad de flujo del fluido de escintilación se fijó en 9 ml/min usando un fluido de escintilación ATOMFLOW™ (No. NEN-995 de Packard Instruments). Todos los pasos de solvente de la columna fueron lineales, con las velocidades de flujo del solvente de inyección y la columna como se indica en el ejemplo 2. La columna se prepara para una inyección adicional a los 20 minutos. Se combinaron muestras de callos de 359 líneas de maíz transformados, con alícuotas de 50 µl de solución de dosis de [14C]-glifosato, y se incubaron 10 días en la oscuridad. Cada muestra de callo después de la incubación, junto con su material de dosis adherido, se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1.7 ml junto con 1 ml de agua, y cada tubo se colocó en agua hirviendo. Este paso ocasiona lisis celular, liberando compuestos insolubles intracelulares, incluyendo cualquier compuesto marcado con isótopo tal como glifosato, AMPA y N-acetil-AMPA. Se determinó durante el desarrollo del método que, después de la incubación, si los callos se enjuagaban completamente con agua, 85-95% de la radioactividad era arrastrada por el agua, y el análisis de HPLC mostró que virtualmente toda la radioactividad en los enjuagues se debía a [14C]-glifosato y ninguna se atribuyó a [14C]-metabolitos. En estos experimentos, los callos enjuagados dieron extractos que contenían [14C]-metabolitos además de [14C]-glifosato. Esto indicó que la radioactividad en los enjuagues se debió principalmente, si no exclusivamente, a [14C]-glifosato no absorbido de la superficie. Es importante tomar esto en cuenta cuando se consideran porcentajes más bien bajos de la dosis convertida en metabolitos, ya que el cálculo de porcentaje incluye grandes cantidades de radioactividad no absorbida de superficie. El trabajo de desarrollo del método también mostró que simplemente hirviendo los callos incubados en agua, se libera tanta radioactividad como la que se podría liberar con un procedimiento convencional de trituración/extracción. También se realizaron experimentos para mostrar que la ebullición no altera los perfiles metabólicos. Los procedimientos simplificados hicieron posible analizar grandes números de muestras (por ejemplo 96) a un mismo tiempo. El cuadro 16 muestra datos representativos de las muestras de callo que producen los más altos niveles de N-acetil-[14C]-AMPA o [14C]-AMPA obtenidos después del análisis de HPLC. En la figura 3 se muestra un cromatograma representativo de una muestra de extracto de callo tratado con glifosato, transformado con GOX más AMPA aciltransferasa.

CUADRO 16 Líneas de callos de maíz transformados gue producen cantidades de AMPA o N-acetil-AMPA CUADRO 16 (Continuación) * Todas las líneas se transformaron usando métodos de balística. Las líneas designadas como 19xx-yy-zz se transformaron con fragmentos lineales o plásmidos aislados. Los fragmentos lineales se aislaron a fin de separarlos de la estructura base del plásmido. ** Porcentaje de radioactividad detectada para picos de N-acetil-[14C]-AMPA o [14C]-AMPA, determinada como una fracción de la cantidad total de radioactividad en la muestra, incluyendo [14C]-glifosato residual, como se describe en el texto.

De las 359 muestras de callos probadas, 19 de ellas produjeron extractos que contenían N-acetil-[14C]-AMPA a un nivel distintamente más alto que las otras muestras de callo. El callo OR516 fue el más fuerte en ese sentido, y se analizó cinco veces durante un período de dos meses, dando valores que varían de 0.50 a 4.54% (promedio 1.91 %). La base para la extensión relativamente grande en el porcentaje de N-acetil-[14C]-AMPA formado a varios tiempos, es desconocida. En cuatro de los cinco análisis de OR516, el porcentaje de N-acetil-[14C]-AMPA presente, fue más alto que el de [14C]-AMPA, indicando una conversión eficiente de [14C]-AMPA en N-acetil-[14C]-AMPA. El siguiente callo más eficiente en la producción de N-acetil-[14C]-AMPA fue 1978-24-02, que fue el único otro callo además de OR516 que contenía más N-acetil-[l4C]-AMPA que [14C]-AMPA en su extracto. De las 359 muestras de callo probadas, 100 de ellas produjeron extractos que contenían [14C]-AMPA a un nivel distintamente más alto que las otras muestras de callo. 0X556 fue un productor superlativo de [14C]-AMPA, produciendo más del doble del metabolito que cualquier otro callo en el estudio. El callo de control, Hl II X B73, que no contenía genes insertados, no produjo niveles detectables de N-acetil-[14C]-AMPA, y solo niveles básales de [14C]-AMPA. Este resultado indica que la expresión de una AMPA aciltransferasa en el maíz es efectiva en la conversión de AMPA producido como resultado de degradación de glifosato a N-acetil-AMPA mediada por GOX.

Trigo Se ha mostrado que la degradación de glifosato mediada por GOX produce AMPA, y se había mostrado previamente que el AMPA es la fuente de los efectos fitotóxicos. Por ello, se determinaron los efectos de la exposición de la planta de trigo a los compuestos AMPA o N-acetil-AMPA, como en el ejemplo 2, para observar cualquier sensibilidad o insensibilidad del trigo a cualquiera de estos compuestos. La observación de cualquier efecto fitotóxico indicaría que el metabolismo de glifosato mediado por GOX, sería nocivo para las especies de Triticum. Se expusieron embriones inmaduros de trigo a diferentes concentraciones de AMPA y N-acetil-AMPA en una prueba de germinación de embriones de trigo. Se preparó medio MMSO que contenía 40 gramos por litro de maltosa, 2 gramos por litro de GELRITE™, sales MS y vitaminas. Las sales, vitaminas y la maltosa se disolvieron en 3500 ml de agua y el pH se ajustó a 5.8. Se dispensaron 500 ml en una botella separada junto con 1 gramo de GELRITE™, y se sometió al autoclave durante 17 minutos. Después de enfriar el medio a aproximadamente 45°C, se agregó AMPA o N- acetil-AMPA a una concentración definida. La mezcla se vació en seis copas cuadradas Sundae bajo condiciones estériles y se dejó solidificar. Se aislaron embriones inmaduros de trigo de plántulas de veinte días (después de la formación de antera) y se inocularon en cada medio MMSO. Cada copa Sundae contenía nueve embriones inmaduros. Se usaron tres placas separadas para cada concentración de AMPA (0, 0.1 , 0.15, 0.2, 0.25, 0.3 y 1.0 mM) o N-acetil-AMPA (0, 0.1 , 0.3, 1.0 y 3.0 mM). Se incubaron las copas Sundae durante diez días y después se determinó y comparó la longitud de raíces y vastagos. Los resultados se muestran el cuadro 17.

CUADRO 17 Comparación de AMPA y N-acetil-AMPA en la longitud de vastagos y raíces en germinación CUADRO 17 (Continuación) El AMPA no fue sustancialmente inhibidor para el crecimiento y alargamiento de embriones inmaduros a concentraciones por abajo de 0.2 mM. Sin embargo, concentraciones por arriba de 0.2 mM fueron severamente inhibidoras del alargamiento de vastago y raíz, indicando que el AMPA también puede ser fitotóxico para el trigo, y que, considerando la naturaleza de las especies de los cultivos de monocotiledóneas en su conjunto, puede ser fitotóxico para otros cultivos de monocotiledóneas y pastos. la germinación de embriones inmaduros fue afectada significativamente cuando el nivel de AMPA fue superior a 0.20 mM. Con AMPA 1.00 mM se eliminó la germinación de embriones inmaduros en trigo. En cambio, el N-acetil-AMPA no fue inhibidor para los vastagos y solo ligeramente inhibidor para el alargamiento de raíces en cualquiera de las concentraciones probadas en este experimento. La concentración de N-acetil-AMPA más alta probada fue mayor de 10 veces la concentración no inhibidora mínima determinada para AMPA. No hay efectos significativos para la germinación de embriones inmaduros cuando la concentración de N-acetil-AMPA fue menor de 3.0 mM. Este resultado indica que la N-acetilación del AMPA en el trigo impediría la fitotoxicidad del AMPA que se produce como resultado del metabolismo del herbicida glifosato mediada por GOX. Se generaron plantas de trigo recombinantes tolerantes a glifosato de acuerdo con el método de Zhou y otros (Plant Cell Reports 15:159-163, 1995). Brevemente, se usó trigo de primavera, Triticum aestivum cv Bobwhite como la línea de transformación objetivo. Se desarrollaron plantas de reserva en una cámara de crecimiento con medio ambiente controlado con un fotoperíodo de 16 horas a 800 microJoules por metro cuadrado por segundo, provista con luces de descarga de alta intensidad (Sylvania, GTE Products Corp., Manchester, New Hampshire). Las temperaturas de día/noche fueron de 18/16°C. Se recolectaron de las plantas cariópsides inmaduros 14 días después de antesis. Los embriones inmaduros se disectaron asépticamente y se cultivaron sobre medio MMS2, un medio basal de Murashige y Skoog (Physiol. Plant 15:473-497, 1962) suplementado con 40 gramos por litro de maltosa y 2 miligramos por litro de 2,4-D. En algunos experimentos, se usó medio CM4. El medio CM4 es medio MMS2, pero contiene solo 0.5 miligramos por litro de 2,4-D e incluye 2.2 miligramos por litro de picloram. Los embriones inmaduros se cultivaron a 26°C en la oscuridad. Los embriones inmaduros se transfirieron cinco días después del inicio del cultivo a un medio de tratamiento osmótico CM4 que contenía manitol 0.35M, durante 4 horas antes del bombardeo de acuerdo con el método de Russell y otros (In Vitro Cell Devel. Biol., 28P:97-105, 1992). Se colocaron de treinta a cuarenta embriones en el centro de cada placa y se bombardearon en un aparato DuPont PDS1000. Se adsorbió ADN plasmídico sobre partículas de tungsteno de 1 m de acuerdo con el método de Sanford y otros (Particle Sci. Technol., 5:27-37, 1987). Los embriones se bombardearon dos veces a una distancia de 13 mm de la placa de detención. Se colocó una reja de acero inoxidable inmediatamente debajo de la placa de detención. Después de 16 horas del tratamiento de bombardeo sobre el medio osmótico, los embriones se transfirieron a medio MMS2 o CM4. Después de una demora de una semana, los embriones se transfirieron al medio MMS2 o CM4 que contenía glifosato 2 mM. Después de 9-12 semanas de proliferación del callo sobre el medio de selección, los callos se transfirieron a un medio de regeneración MMS0.2 que contenía 0.2 mg/l de 2,4-D y 0.1 mM de glifosato. Los vastagos obtenidos del medio de regeneración se transfirieron a MMSO sin 2,4-D, pero conteniendo glifosato 0.02 mM. Las plantas Ro tolerantes a glifosato y su progenie Ri se transfirieron a macetas de 15 centímetros de diámetro en una cámara de medio ambiente controlado como se describió arriba. Dos semanas después, las plantas se rociaron con 3 ml/litro de ROUNDUP (41 % de ingrediente activo, Monsanto Company) en una cámara de aspersión, que fue diseñada para imitar una aplicación de dosis de campo de 0.6 kilogramos de glifosato por hectárea. Los síntomas de los daños se observaron y se registraron en diferentes etapas después de la aspersión. Se aisló ADN genómico de tejido de hoja de Ro y la progenie Ri siguiendo el método de Shure y otros (Cell 35:225-233, 1983). Se digirieron 15 microgramos de ADN genómico con endonucleasa de restricción Bglll y se fraccionaron sobre un gel de agarosa 0.8%. El ADN se transfirió a membranas Hybond N (Amersham) de acuerdo con el procedimiento estándar descrito en Sambrook y otros ("Molecular Cloning: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Las membranas se sondearon independientemente para detectar la presencia de genes que codifican EPSPS y GOX. Un fragmento de ADN que contenía el gen EPSPS y un fragmento de ADN de 4.8 kb que contenía el gen GOX, fueron liberados de pMON 19574 mediante digestión con endonucleasa de restricción Bglll, se aislaron mediante electroforesis en gel de agarosa 0.7% y se marcaron con [32P]-dCTP usando un equipo de marcación de iniciador aleatorio PRIME-IT II de Stratagene. Las sondas se marcaron a una actividad específica de 3 x109 cuentas por minuto por microgramo y 1.3 x 109 cuentas por minuto por microgramo, respectivamente. Las membranas se hibridaron durante 14 horas a 42°C en una solución que contenía formamida 50%, SSC 5X, Denhardt 5X, SDS 0.5% y 100 microgramos por mililitro de ARNt. La condición del lavado final fue de SSC 0.1 % y SDS 0.1% a 60°C durante quince minutos.

Se realizaron análisis de proteínas EPSPS y GOX usando extractos de proteína cruda de tejido de hoja de plantas Ro, y se cuantificaron proteínas totales siguiendo el método de Bradford (Anal. Biochem., 72:248-256, 1976). Usando un método ELISA, se cuantificó el porcentaje de proteínas EPSPS y GOX representado en los extractos, y se calculó como por ciento de proteína extraible total. Veinte días después de antesis, se aislaron embriones inmaduros de las plantas Ro transgénica y Bobwhite de control, y se cultivaron sobre el medio MMSO con glifosato 0.02 mM para una prueba de germinación. Diez días después se registraron los embriones germinados y no germinados, y los datos se analizaron mediante prueba 2 para segregación 3:1. Las plantas tolerantes de la prueba de germinación se transfirieron al suelo y se rociaron con tres mililitros por litro de ROUNDUP como se describió arriba. Se usaron cinco plásmidos que alojaban genes de resistencia a glifosato para transformar embriones inmaduros de trigo como se describió arriba. El pMON 19338 contiene un cassette de nucleótido que codifica un péptido de tránsito de cloroplasto de EPSPS de petunia en marco con una secuencia de la enzima EPSPS de Agrobacterium cepa CP4. El cassette de nucleótido se inserta hacia el extremo 3' de un promotor 35S incrementado de virus de mosaico de coliflor, enlazado en 3' con una secuencia de intrón HPS70 de maíz, y hacia el extremo 5' de una secuencia 3' de terminación de transcripción y poliadenilación de nopalina sintetasa. Se colocan sitios convenientes de restricción entre la secuencia de intrón y la secuencia de terminación 3' para la inserción de elementos genéticos. El pMON 19643 es idéntico a pMON19338, excepto que se usa una secuencia codificadora de la enzima GOX en lugar de la secuencia codificadora de la enzima EPSPS de Agrobacterium. El pMON 19574 es idéntico al pMON 19338, pero contiene adicionalmente un cassette de expresión de glifosato oxidorreductasa dirigido a cloroplasto idéntico al de pMON 19643 hacia el extremo 3' del cassette de expresión de EPSPS, e inmediatamente adyacente al mismo. El pMON32570 es similar al pMON19574, ya que están presentes cassettes de expresión que codifican una EPSPS dirigida a cloroplasto y GOX dirigida a cloroplasto; sin embargo, también está presente un cassette de expresión que codifica una enzima AMPA aciltransferasa dirigida a cloroplasto entre los cassettes de expresióin de EPSPS y GOX. Otros elementos que están presentes en pMON19574 y no en los otros plásmidos, también son dignos de atención. Por ejemplo, una guía no traducida de 5' del gen de proteína de unión a clorofila a/b de trigo, está presente entre el promotor 35S incrementado y el intrón, tanto en el cassette de expresión de EPSPS como en el de AMPA aciltransferasa (McEIroy y otros, Plant Cell 2:163-171 , 1990). También, está presente una secuencia 3' de terminación de transcripción y poliadenilación del gen hsp17 de trigo en lugar de la secuencia 3' de nopalina sintetasa para los cassettes de expresión de EPSPS y AMPA aciltransferasa. Todos los plásmidos produjeron plantas de trigo recombinantes tolerantes a glifosato usando el método de transformación balística descrito arriba. Sin embargo, los plásmidos que pudieron expresar GOX solo o GOX junto con una AMPA aciltransferasa, no produjeron plantas de trigo recombinantes tolerantes a glifosato ni produjeron plantas que experimentaran problemas con crecimiento achaparrado, segregación aberrante de fenotipos ni infertilidad, y no se analizaron adicionalmente. En el cuadro 18 se muestran los datos obtenidos después de la transformación biolística usando los plásmidos descritos.

CUADRO 18 Datos de transformación biolística de trigo 1- Eficiencia de transformación basada en el porcentaje de eventos transgénicos identificados de una población total de explantes que se originan de una combinación de experimentos en los cuales se han bombardeado embriones inmaduros con una construcción de vector particular.

Las plantas transformadas tolerantes a glifosato que se originaron de estas transformaciones se autocruzaron y se dejó que produjeran semillas R-i, que se usaron para generar plantas R-i. La tolerancia a glifosato se segregó generalmente en la proporción esperada de 3:1 en las plantas R-i, según las sensibilidades de la planta Ri después de rociarlas con glifosato en la etapa de tres hojas. Las plantas Ri tolerantes a glifosato se autocruzaron y se dejó que produjeran semillas R2. Se germinaron semillas de R2 de varias líneas diferentes tolerantes a glifosato para producir plantas R2 tolerantes a glifosato a las cuales se les aplicó [?4C]-glifosato como se describió arriba. Se cosecharon tejidos de hoja y tallo de la planta 48 horas después de la aplicación de glifosato, y los compuestos solubles en agua se extrajeron como se describió arriba y se analizaron por HPLC como en el ejemplo 2 para determinar la presencia de metabolitos de [14C]-glifosato. Se sumó el área total bajo los picos de marcación de isótopo [14C] que eluyeron de la columna, para proveer una línea basal de 100% de identificación de compuesto de [14C] para cada muestra analizada. Los resultados se muestran en el cuadro 19.

CUADRO 19 Metabolismo de glifosato en extractos de planta de trigo 1 Los extractos de tejido de planta se analizaron por HPLC después de la aplicación de [14C]-glifosato como en el ejemplo 1 , y se sumó el área bajo las curvas para cada pico para dar una base de 100% de identificación de [14C]-compuesto para cada muestra. 2 Solución estándar que contenía proporciones molares de [14C] aproximadamente iguales de cada compuesto conocido relacionado con el metabolismo de glifosato. 3 Medio de crecimiento que incluía [14C]-glifosato; se había mostrado previamente que el glifosato era degradado por un proceso fotolítico a AMPA, el cual puede ser auto-acilado en presencia de ciertos compuestos acilo (MSL-0598). 4 Compuestos marcados con [14C] no caracterizados que son resueltos usando el método cromatográfico descrito. El tiempo de retención del glifosato es de aproximadamente 9.6 minutos, de AMPA aproximadamente 5.4 minutos, de N-acetil-AMPA aproximadamente 12.5 minutos, y de la mayor impureza marcada con [14C] en la muestra de [14C]-glifosato, de aproximadamente 4.7 minutos.

La solución estándar contiene proporciones molares aproximadamente iguales de cada uno de los compuestos, glifosato, AMPA y N-acetil-AMPA, así como también varias impurezas que están presentes como resultado de la síntesis química de estos compuestos marcados con el isótopo. El medio de crecimiento al cual se agregó [14C]-glifosato, se trató a las mismas condiciones que las plantas de trigo, esto es, el medio se expuso a las intensidades de luz incidente que recibieron las plantas. Como se esperaba, se observó fotodegradación de glifosato a AMPA, y parece que un porcentaje pequeño de AMPA fue convertido en acetil-AMPA, probablemente como resultado de su exposición en el medio de crecimiento con otros compuestos acilados. Se había observado previamente la fotodegradación de glifosato por exposición a luz visible en AMPA como el mayor producto de degradación (Lund-Hoeie y otros, "Photodegradation of the herbicide glyphosate ¡n water" Bull. Environ. Contam. Toxicol. 36:723-729, 1986). Las plantas recombinantes de trigo transformadas con un plásmido de EPSPS solo, no produjeron [14C]-AMPA ni acetil-[14C]-AMPA de [14C]-glifosato. El [14C]-AMPA y las cantidades vestigios de acetil-[14C]-AMPA que fueron observados, estaban dentro de los límites observados como resultado de fotodegradación en el medio de crecimiento de control. Plantas de control Bobwhite no recombinantes tratadas con [14C]-glifosato tampoco produjeron AMPA ni acetil-AMPA. Las plantas transformadas con el triple de plásmido de la construcción de gen que contenían genes capaces de expresar EPSPS, PhnO y GOX, produjeron resultados variables. Cerca de un tercio de estas plantas pareció convertir eficientemente glifosato en acetil-AMPA, indicando que las enzimas GOX y PhnO estaban presentes y funcionales. Análisis de Southern blot demostró que los transgenes se integraron en los genomas del trigo y se transmitieron a las siguientes generaciones. Análisis de Western blot usando antisuero anti-EPSPS, anti-GOX o anti-PhnO para detectar estas proteínas en los extractos de plantas transformadas con triple gen, dieron comprensión adicional en la base para la observación del metabolismo variable de [14C]-glifosato. Análisis de Western blot indicó que todas las líneas estuvieron produciendo EPSPS, sin embargo, solo la línea 27249 produjo proteína GOX y PhnO. Este resultado es consistente con los datos del cuadro 19, que muestra que la línea 27249 metaboliza eficientemente [14C]-glifosato en acetil-[14C]-AMPA. Esta línea de planta tampoco mostró achaparramiento, fertilidad parcial ni segregación de fenotipos, lo cual estuvo asociado con las otras líneas. Estos resultados indican que la coexpresión de GOX y AMPA aciltransferasa en plantas de trigo que expresan EPSPS recombinante, provee tolerancia a herbicida mejorada.

EJEMPLO 9 Este ejemplo ilustra la transformación de cloroplastos de tabaco con un gen phnQ. Se pueden producir plantas recombinantes en las cuales solo el ADN mitocondrial o de cloroplasto ha sido alterado para incorporar las moléculas contempladas en esta solicitud. Se conocen en la técnica promotores que funcionan en cloroplastos (Hanley-Bowden y otros, Trends in Biochemical Sciences, 12:67-70, 1987). Se han descrito métodos y composiciones para obtener células que contienen cloroplastos en los cuales se ha insertado ADN heterólogo, por ejemplo en Daniell y otros (patente de E.U.A. No. 5,693,507) y Maliga y otros (patente de E.U.A. No. 5,451 ,513, 1995). Se puede construir un vector que contenga un cassette de expresión del cual se puede producir una proteína aciltransferasa. Un cassette podría contener una secuencia de promotor operable en cloroplasto que manejara la expresión, por ejemplo, de un gen phnQ, construido de la misma manera que otros polinucleótidos de la presente, usando metodologías de PCR, digestión con endonucleasa de restricción, y ligación, etc. Un gen expresable en cloroplasto proveería un promotor y una región 5' no traducida de un gen heterólogo o gen de cloroplasto tal como psbA, que proveería la transcripción y traducción de una secuencia de ADN que codifica una proteína aciltransefrasa en el cloroplasto; una secuencia de ADN que codifica una proteína aciltransferasa; y una región de terminación de transcripción y traducción tal como una región de repetición 3' invertida de un gen de cloroplasto que podría estabilizar un ARNm expresado que codifica para una proteína aciltransferasa. La expresión desde dentro del cloroplasto aumentaría la acumulación del producto del gen. Se puede transformar una célula hospedera que contiene cloroplastos o plástidos con el cassette de expresión, y después la célula resultante que contiene los cloroplastos transformados se puede desarrollar para expresar la proteína aciltransferasa. Un cassette también puede incluir un gen de antibiótico, de tolerancia a herbicida u otro gen marcador seleccionable, además del gen de aciltransferasa. El cassette de expresión puede estar flanqueado por secuencias de ADN obtenidas de un ADN de cloroplasto que facilite la integración estable del cassette de expresión en el genoma del cloroplasto, particularmente por recombinación homologa. Alternativamente, el cassette de expresión puede no integrarse, pero incluyendo un origen de replicación obtenido de un ADN de cloroplasto, sería capaz de proveer replicación, por ejemplo, de un phnQ heterólogo u otro gen de aciltransferasa dentro del cloroplasto. Se pueden generar plantas de células que contienen cloroplastos transformados y después se pueden desarrollar para producir semillas de las cuales se pueden generar más plantas. Tales métodos de transformación son ventajosos sobre la transformación del genoma nuclear, en particular cuando la transformación de cloroplasto es efectuada por integración en el genoma de cloroplasto, porque los genes de cloroplasto en general son heredados matemalmente. Esto provee plantas transgénicas "más seguras" desde el punto de vista del medio ambiente, eliminando virtualmente la posibilidad de escapes hacia el medio ambiente. Además, los cloroplastos se pueden transformar múltiples veces para producir genomas de cloroplastos funcionales que expresan múltiples proteínas recombinantes deseadas, mientras que se ha visto que la transformación genómica nuclear es más bien limitada cuando se desean genes múltiples. De esta manera son evitados los eventos segregacionales usando transformación de cloroplasto o plástido. A diferencia de la expresión del genoma nuclear de planta, la expresión en cloroplastos o plástidos se puede iniciar de solo un promotor y continuar a través de una región policistrónica para producir péptidos múltiples de un solo ARNm.

El cassette de expresión sería producido por mucho de la misma forma que se construyen otros vectores de transformación de planta. Se pueden insertar secuencias de ADN operables en cloroplastos de planta en un plásmido bacteriano, y se pueden ligar a secuencias de ADN que expresan productos de gen deseados, tales como proteínas PhnO u otras aciltransferasas similares, a fin de producir la proteína aciltransferasa dentro del cloroplasto, eliminando la necesidad de regulación genética nuclear, bloqueo, empalme o poliadenilación de genes regulados nuclearmente, o secuencias de dirección a cloroplasto o plástido. Un cassette de expresión que. comprende un gen phnQ o un gen de aciltransferasa similar, que sea un gen construido sintéticamente o un gen nativo derivado directamente de un genoma de E. coli, se podría insertar en un sitio de restricción en un vector construido con la finalidad de transformar cloroplasto o plástido. El cassette estaría flanqueado en el extremo 5' por un promotor funcional en cloroplasto o plástido, y en el extremo 3' por una secuencia de terminación de transcripción y traducción, funcional en cloroplasto o plástido. El cassette resultante sería incorporado en el genoma del cloroplasto o plástido usando métodos de recombinación homologa bien conocidos. Alternativamente, se podría obtener transformación de cloroplasto o plástido usando un plásmido de replicación autónoma u otro vector capaz de propagación dentro del cloroplasto o plástido. Un medio para realizar este método sería utilizar una porción del genoma de cloroplasto o plástido requerida para iniciar la replicación del cloroplasto o plástido como un medio para mantener el plásmido o vector en el cloroplasto o plástido transformado. Una secuencia que permitiera la replicación estable de un elemento epigenético de cloroplasto o plástido, sería identificada fácilmente de la clonación aleatoria de un genoma de cloroplasto o plástido en un vector bacteriano estándar que también contiene un gen marcador seleccionable de cloroplasto o plástido, seguido por transformación de cloroplastos o plástidos y selección de las células transformadas en un medio de selección apropiado. La introducción de un cassette de expresión como se describe aquí en un elemento epigenético replicable de cloroplasto o plástido, proveería un medio efectivo para confinar un gen y proteína aciltransferasa en el cloroplasto o plástido. En vista de lo anterior, se observará que se han logrado las diversas ventajas de la invención, y otras ventajas se hacen alcanzables. Como se pueden hacer varios cambios en los métodos y composiciones descritos arriba, sin apartarse del espíritu y alcance de la invención, se pretende que toda la materia contenida en la anterior descripción, y mostrada en los dibujos y secuencias anexas, se debe considerar en un sentido ilustrativo y no limitativo.

REFERENCIAS Avila y otros, J. Am. Chem. Soc. 109:6758-6764, 1987. Berlyn, Microbiol. Molec. Biol. Rev., 62:814-984, 1998. Chen y otros, J. Biol. Chem. 265:4461-4471 , 1990. Dumora y otros, Biochem. Biophys. Acta 997:193-198, 1989. Franz, "Discovery, development and chemistry of glyphosate" en "The Herbicide Gyphosate" Eds. E. Grossbard y D. Atkinson, Butterworths, p. 3-17, 1985. Hanley-Bowden y otros, Trends in Biochemical Sciences 12:67- 70, 1987. Hildebrand y otros "The role of phosphonates in living systems", Hildebrand R.L., Ed., p. 29, CRC Press, Inc., Boca Ratón, Florida, 1983. Jacob y otros, Appl. Environ. Microbiol. 54:2953-2958, 1988. Jiang y otros, J. Bacteriol. 177:641 1 -6421 , 1995. Kishore y otros, J. Biol. Chem. 262:12,164-12,168, 1987. Lacoste y otros, J. Gen. Microbiol. 138:1283-1287, 1992. Lee y otros, J. Bacterio!. 174:2501-2510, 1992. Maier, Phosphorous Sulfur 14:295, 1983. Makino y otros, J. Bacteriol. 173:2665-2672, 1991 . McGrath y otros, Eur. J. Biochem. 234:225-230, 1995. Metcalf y otros J. Bacteriol. 173:587-600, 1991. Ohtaki y otros, Actinomyceteol. 8:66-68, 1994.

Pipke y otros, yApp/. Environ. Microbiol. 54:1293-1296, 1987. Shinabarger y otros, J. Bacteriol. 168:702-707, 1986. Tanaka y otros, J. Fac. Agr. Kyushu Univ. 30:209-223, 1986. Wackett y otros, J. Bacteriol. 169:710-717, 1987a. Wackett y otros, J. Bacteriol. 169:1753-1756, 1987b. Wanner y otros, FEMS Microbiol. Lett., 100:133-140, 1992. Wanner y otros, Biodegradation 5:175-184, 1994. Wohlleben y otros, Mol. Gen. Genet., 217:202-208, 1989.

Documentos de patente: Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,463,175, 1995. Barry y otros, patente de E.U.A. No. 5,633,435, 1997. Comai, patente de E.U.A. No. 4,535,060, 1985. Daniell y otros, patente de E.U.A. No. 5,693,507, 1997. Maliga y otros, patente de E.U.A. No. 5,451 ,513, 1995. McBride y otros, WO 95/24492.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> Barry, Gerard F. <120> Plantas que metabolizan fosfonato <130> 38-21(15303) PhnO <140> desconocido <141> 1999-11-16 <150> 60/108,763 <151> 1998-11-17 <160> 32 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 15611 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 1 ggatccagca tcgacgccag tttttccacc attgtcagtc gcaggctaag cggcgcattt 60 aacatgccgc cgttcgtcca tgtctgaagc tgcacacgcg aaagaagttc ctgcatcagt 120 cgttcacgaa actgctgctg atgggcttgt ggaaggcggg catcatcgcc ctgcgccaga 180 tccactaaaa agcggggata aaccgactcc agcacgcgac cggggccgtc cagtaacgtc 240 ttggtcaata tcgttctgcc gtgaaaagtg tttgaatatc atcgcgtaac agctgggcgt 300 cggtgtaaat ccagccgtga gtcatcacag tctgctgcaa ttgctgctgc atcagcctga 360 ccaccgattc attttgttga cgcagagcca ggctttcgcg taaacgcgtc tgtaattccg 420 tcaaacatga agcgaactca gcgaaaaaag tattcatgcc tgccgtaaca gattcatcga 480 cctgctctgc cagaacttta gccatttgtt ggcaataaag atcgacttct gcgcttaatg 540 ctcgttgcaa cacactgtaa tcaaccgttt ctgtcgggga tttctcattt ccccgtcccc 600 agtcgggctg attcaaccag cgcgaaaaag tctcacgcac aacgcctaaa cgcgtgctct 660 gctcgtccgt tgcatcctgg cgcgaaatga ctgcactgaa cagctggcga gtgttgaagt 720 ggggaactac gccgtgaaaa acaggaaaat gaaacccagg acgaaaccct gactcgctca 780 attccatttt gacttgttgc tcaatggggc gaataacatc ggttaacact cggcaaaggg 840 tggattccag ctcggcaaaa cgcagcgtaa agtcgcgact gatggtgttc tgcgccgtct 900 gtaacagtgt ctcacagcgg gtacgcatct cgcttaacgg ctccgaatca tcctgaaaca 960 aggcggctaa ctgcgcattc agcgcatctt gttgttgacg cagaaagtgg ttggcggagg 1020 tcagggccag ctcgatttca tgtttaatct cgccgctcac ctgcgcctga ttgagttgca 1080 atagctgcaa actttcttcg acctgatgga tattttgccg caattgttca caagcgacgt 1140 ttaacccgtg cgcacgaaaa tccaggtatt cccgcgcctg ctgcgcgtaa ttcaacagtt 1200 tatgcgcagc agatcgcaaa gcatacaacg aggcgttagc gtaagcggca tgaagcaacg 1260 cctgaattgg ctgggcgaac agcgaatctt cccacaactg atcggcagca tgacgaatat 1320 gttcgaggtc cgccagatcg gcatgacgcc agcgcctgcc gagcgcggca tgggcaaaat 1380 cttccaccca gcgttgttgc tctggcgctg gtaacttacc gttgttggct aactcatggc 1440 gcgcccgatt cgccaggtag ccccacatcg acgacaccgg aaatatctgc tgtggcgtaa 1500 tacagccttt catcagcgtc ccggaaatca gtgcccgcac ctggtcggcg tcgtcactgt 1560 tacgatcctg ttgatcgaac ttattgacca gcacatacag cggcaccgat tgccccaccg 1620 ccaaaatcgc ctcacggacc tcttcatcgg agatcgattt cagttgcgta taatccagca 1680 ccgccagtac cgccgaggcg cgtgccagct gctggttaag cattttttgc agatgcggtt 1740 gcccggcttc atttggcccg ggggtatcca gtaacgtcaa ctgaccggga taactctcca 1800 gccccgccag atggacaaac tccacttcaa tcacgggaat atgctcaatg gcggcgtaag 1860 cagaaaaagg aaaatcgacg tccagcgcct tcgccagtcg cactaaatca ttcaaacttt 1920 tcagacaatg aaaaataggc tgggcaccca gataatattt ttcgaaagcg acgccatttt 1980 cgatccgctg cataagcgca cgcatatctt tatctatttc cagcacatcg gtcagatgct 2040 taatatcgca atcacgcagg cgctgttgta attgttgaat taaacaatcg attggcgcga 2100 catgtgaaaa atgcagtacc ggttcctttt gcccgggcgt atggcgaata agcgtcggca 2160 gcgcagtcat tgggcgatta cgattaggca gaacctccgt accaacaatg gcattaatgg 2220 tggttgattt ccctgctttc atggtaccga caattgcaag caccatttcc agtcgggaaa 2280 ttttacgcaa ctcattattc agcatcgcgt gacgttcggc gatattaggc tgactccagg 2340 gtaaagccag ttgtggcgcg tcgtctccgg gtacagagag aggcattttt tccagtaact 2400 gcaactgttg gcgagaaagc tgtaacaggc gttcagcctc ctgacttaac tcatacaggg 2460 tctgtgtgta catagaaaat tcttccttaa agcaaatttt gttattttat ttagccagat 2520 tgtttttgag ttctgttttc ggcttttata attactgcaa gaaataattt tatatttagt 2580 gtgttgtttt ttatcagaat aaataacgtc ttctgatacg tttaaaacgt cagaaagata 2640 aaaatatcat gtgaattaaa aaaagaacaa gtagagcatt aacattatct taaataataa 2700 atagaggcaa aaagattatt ttctttttgc gtttcctttc aaatgaaaac gatcgtcgtc 2760 taaaatcagc agtacccccg acaaactcag ggattttgtg tataattgcg gcctttttcg 2820 gcaatctgcc gttttttggc gcttttgccc tgctgacttt tgaggaaatc cacatgtcat 2880 taccacactg cccaaaatgc aactccgaat acacttacga agataacggc atgtacatct 2940 gcccggaatg tgcctacgaa tggaacgacg cagaacctgc acaggaaagc gacgagctga 3000 tcgttaaaga tgctaacggc aatctgctgg ctgacggcga cagcgttacc atcattaaag 3060 atctgaaggt gaaaggtagc tcttcgatgc tgaaaattgg caccaaagtg aaaaacatcc 3120 gcctggttga aggcgaccat aacatcgatt gcaaaatcga cggttttggt ccgatgaaac 3180 tgaaatctga gtttgtgaaa aagaactgat tgtattgtga tcggtaagcc ggataaggcg 3240 ctcgcgccgc atccggcaac ggtgccagat gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag 3300 gcctacaaat tcccgcaccc tccgtaggcc ggataaggcg tttacgccgc atccggcaac 3360 ggtgccgact gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag gcctacaaat tcccgcaccc 3420 tccgtaggcc ggataaggcg tttacgccgc atccggcaac agtgccaact gcctgatgcg 3480 acgcttgcgc gtcttatcag gcctacaaat tcccgcaccc tccgtaggcc ggataaggcg 3540 tttacgccgc atccggcaat ggtgccgact gcctgatgcg acgcttgcgc gtcttatcag 3600 gcctacaaat tcccgcaccc tccgtaggcc ggataaggcg tttacgccgc atccggcaac 3660 agtgccgact gcctgatgcg acgctcgcgc gtcttatcag gccgcctctc atctgtataa 3720 atttcgaact acacttaact ggcttctctt aactgaggtc accatcatgc cgttaagtcc 3780 ctacctctct tttgccggta actgttccga cgcgattgcc tattatcaac gtacgttggg 3840 cgcggaactg ctctataaaa tcagcttcgg cgaaatgcca aaatcagcgc aggacagcgc 3900 cgagaactgc ccttccggaa tgcaatttcc cgataccgcc atcgctcatg ccaacgtgcg 3960 cattgccgga agcgacatca tgatgagcga tgccatgccg tcaggaaaag ccagctactc 4020 cggctttacg ctggtgctcg attcgcaaca ggtcgaagaa ggaaaacgct ggtttgacaa 4080 tcttgccgct aacggaaaaa tcgaaatggc ctggcaggaa actttctggg cgcatggctt 4140 tggcaaagtc accgataaat ttggcgtacc gtggatgatt aatgtcgtca aacaacaacc 4200 aacgcaataa cccgccggga ggcccgccct cccgcactgt catcgaattc ccgttaactc 4260 ttcatctgtt agtcactttt aattaaccaa atcgtcacaa taatccgcca cgatggagcc 4320 acttttttag ggaggctgca tcatgcaaac gattatccgt gtcgagaagc tcgccaaaac 4380 cttcaatcag catcaggcgc tgcatgcggt tgatctgaac attcatcacg gtgaaatggt 4440 ggctctgctt gggccgtcgg gttccggcaa atccaccctt ttacgtcact taagcggttt 4500 gattaccggc gataaatccg ccggcagcca tatcgagctg ctgggccgca cagtccagcg 4560 cgaaggccgt ctggcgcgcg atatccgcaa aagccgcgcc aacaccggct acatcttcca 4620 acaattcaac ctggtgaacc gcctgagcgt actggagaac gtgctgattg gcgcgctcgg 4680 cagcacgccg ttctggcgca cctgttttag ctggtttacc cgcgagcaga aacaacgcgc 4740 gttacaggcg ctgacccgcg ttggcatggt gcattttgcc catcaacgcg tttccaccct 4800 ctccggcgga cagcagcagc gtgtggcgat tgcccgcgcg ctgatgcagc aggcgaaggt 4860 gattctggcc gatgaaccca tcgcctcgct ggacccggaa tccgcccgca tcgtgatgga 4920 caccctgcgc gacatcaatc agaacgacgg catcaccgtg gtcgtcacgc tgcatcaggt 4980 ggattacgcc ctgcgctact gcgaacgcat cgtcgccctg cgccaggggc acgttttcta 5040 cgacggcagc agccaacagt ttgataacga acgttttgac catctctacc gcagcattaa 5100 tcgcatcgaa gagaacgcga aagctgcctg acatccccat cattgaggaa aacgaatgaa 5160 cgctaagata attgcctcgc tggccttcac cagcatgttc agcctcagca ccctgttaag 5220 cccggcacac gccgaagagc aggaaaaggc gctgaatttc ggcattattt caacggaatc 5280 acagcaaaac ctgaaaccgc aatggacgcc attcttacag gatatggaga agaagctggg 5340 cgtgaaggtg aacgccttct ttgccccaga ctacgcaggc attatccagg gaatgcgctt 5400 caataaagtg gatatcgcct ggtacggcaa cctgtcggca atggaagcgg tggatcgcgc 5460 caacggccag gtcttcgccc agacggtcgc ggcggatgga tcgccaggtt actggagcgt 5520 gttgatcgtc aacaaagata gtccgatcaa caacctgaac gatctgctgg cgaagcggaa 5580 agatctcacc ttcggcaatg gcgatcctaa ctccacctct ggcttcctcg tccccggtta 5640 ctacgtcttc gccaaaaaca atatctccgc cagcgacttc aagcgcaccg tcaacgccgg 5700 gcatgaaacc aacgcgctgg ccgtcgccaa caagcaggtg gatgtggcga ccaacaacac 5760 cgaaaacctc gacaagctga aaacctccgc gccggagaag ctgaaagaac tgaaagtgat 5820 ctggaaatcg ccgctgatcc caggcgatcc gatcgtctgg cgtaaaaatc tttccgaaac 5880 caccaaagac aagatctacg acttctttat gaattacggc aaaacgccgg aagagaaagc 5940 ggtgctggaa cgcctgggct gggcgccgtt ccgcgcctcc agcgacctgc aactggtgcc 6000 gattcgccag ctcgcactgt ttaaagagat gcagggcgtg aaaagcaata aaggactgaa 6060 tgagcaggac aagctggcaa aaaccaccgc gattcaggcg caactggatg acctggaccg 6120 cctgaacaac gcgctaagcg cgatgagttc ggtgagtaaa gcggtgcagt aaatcgtagg 6180 tcggataaga cgccccggcg tcgcatccga caatgtgcag gcgttgatgc cggatgcggt 6240 gcaagcacct tatccggcct acagaccgga gccaaacatg caaaccatca ccatcgcccc 6300 acccaagcgc agctggttct cgcttctgag ctgggccgtt gttctcgccg tgctggtcgt 6360 ctcgtggcag ggcgcggaaa tggccccgct cacgctgatt aaagacggcg gcaacatggc 6420 aaccttcgct gccgacttct tcccgcccga tttcagccag tggcaggatt acctcaccga 6480 aatggccgtc acgctgcaaa tcgccgtctg gggcaccgcg ctggcggtgg ttctctccat 6540 cccctttggc ctgatgagcg ccgaaaacct ggtgccgtgg tgggtttacc agcccgttcg 6600 ccgcctgatg gacgcctgcc gcgccattaa cgaaatggtc ttcgccatgc tgttcgtggt 6660 cgccgtcggt ctcggaccgt tcgctggcgt gctggcgcta tttatccaca ccaccggcgt 6720 gctctccaag ctgctttccg aagcggtaga agcaattgaa cctggcccgg tggaaggcat 6780 tcgcgccacc ggtgccaaca agctcgaaga gatcctctac ggcgtgctgc cgcaggtgat 6840 gccgctgctg atctcctact ccctctatcg cttcgaatcc aacgtccgct cggcgaccgt 6900 cgtcggcatg gtcggcgcgg gcgggatcgg cgtcaccctg tgggaagcga ttcgcggttt 6960 ccagttccaa caaacctgcg ccctgatggt gcttatcatc gtcacggtca gcctgctgga 7020 tttcctctct caacggttgc gtaagcactt tatctgataa gcgaggcatt gatatctatg 7080 cacttgtcta cacatccgac cagctaccca acacgctatc aagagatagc cgcaaaactt 7140 gagcaggagc ttcgtcaaca ctaccgctgc ggcgactatc ttcccgccga gcagcaactg 7200 gcagcgcgct ttgaggtgaa tcgccacacc ctgcgccgcg ccatcgacca actggtggaa 7260 aaaggctggg tacagcgccg tcagggcgtc ggcgtgctgg tgctgatgcg cccgttcgat 7320 tacccgctca acgcccaggc gcgttttagc cagaatctgc tggatcaggg cagccatccc 7380 accagcgaaa aactgctttc ggtattgcgc cccgcgtccg gccacgtcgc tgacgcactg 7440 gggattaccg agggggagaa cgtcatccac ctgcgcaccc tgcgtcgggt caacggcgtc 7500 gcgctctgtt taatcgacca ctacttcgcg gacctcaccc tctggccgac gctgcaacgc 7560 ttcgacagcg gctcgctgca cgattttctg cgcgagcaaa ccggaattgc gctgcgccgc 7620 agccagacgc ggatcagcgc ccgccgcgcc caggccaaag agtgccagcg tcttgaaatc 7680 ccgaatatgt cgccgctgct gtgcgtgcgc acccttaacc accgtgacgg tgaaagcagc 7740 ccggcggagt actccgtcag cctgacgcgc gccgacatga ttgaattcac tatggagcac 7800 tgaatgcacg cagataccgc gacccgccag cactggatgt ccgtgctggc gcacagccaa 7860 ccggctgaac tggcagcacg cctgaacgcg ctaaacatca ccgccgacta tgaggtgatc 7920 cgcgccgctg aaactggcct ggtacagatt caggcgcgga tgggcggcac cggcgaacgt 7980 ttttttgccg gcgacgccac gctgacccgc gccgccgtgc gcctgactga cggcacgctc 8040 ggctacagct gggtgctggg gcgtgataaa cagcacgccg aacgctgcgc gctgattgac 8100 gcgctgatgc agcaatctcg ccactttcaa aacttatcag aaacccttat tgccccgctg 8160 gacgctgacc gtatggcacg cattgccgca cgccaggccg aagtgaacgc cagccgggtc 8220 gacttcttta cgatggttcg cggagacaac gcatgaccct ggaaaccgct tttatgcttc 8280 ccgtgcagga tgcccagcac agttttcgtc gcctgttaaa ggccatgagc gagccgggcg 8340 tgattgtcgc cctgcatcag ctcaaacgcg gctggcaacc gctgaatatc gccaccacca 8400 gcgtgctgct gacgctggcc gataacgaca cgccggtgtg gctttctacc ccattaaata 8460 acgatatcgt caaccagagc ctgcgttttc ataccaacgc gccgctggtc agccagccgg 8520 aacaggcgac cttcgcggtg acggatgagg cgatttccag cgaacagctc aacgcccttt 8580 ccaccggcac cgccgttgcg ccggaagcgg gcgcgacgct gattttacag gtcgccagcc 8640 tgagcggcgg gcgcatgttg cgtctcaccg gcgcgggtat tgccgaagaa cgaatgatcg 8700 ctccgcagct gccggagtgc attctgcacg aactcaccga gcgcccgcac ccgttcccgc 8760 tcggcatcga cctgatcctg acctgcggcg aacgcctgct ggctattccg cgaaccacgc 8820 atgtggaggt gtgctgatgt acgttgccgt aaaagggggc gaaaaggcga tcgacgccgc 8880 ccacgccctg caagagagcc gacgccgggg cgataccgat ttgcctgaac tgagcgtcgc 8940 ccagattgaa cagcagctta acctcgcggt agatcgcgtg atgaccgaag gcggcattgc 9000 cgaccgcgaa ctggcggcgc tggcgctgaa acaggccagc ggcgataacg ttgaagcgat 9060 tttcctgctg cgcgcctacc gcaccacgtt ggcgaagctg gcggtaagcg agccgctcga 9120 caccaccggg atgcgtctcg aacgccgtat ctccgccgtt tataaagaca ttcccggcgg 9180 ccagctgctt ggcccaacct acgactacac ccatcgcctg ctcgatttta ccctgctggc 9240 aaacggcgaa gcgccgacgc tgaccaccgc cgacagcgaa caacagccgt cgccgcacgt 9300 tttcagcctg ctggcgcgtc aggggctggc gaagtttgaa gaggatagcg gcgcacagcc 9360 ggatgacatc acccgcacgc cgccggttta cccctgctca cgttcttccc gtttgcagca 9420 gttgatgcgc ggcgacgaag gctatttgct ggcgctggcc tactccaccc agcgtggtta 9480 cggacgcaat cacccgttcg cgggcgagat ccgcagtggt tacatcgacg tgtcgattgt 9540 gccggaagag ctgggatttg cggtaaacgt cggcgaacta ctgatgaccg agtgtgaaat 9600 ggtcaacggt tttatcgacc cgccggatga gccgccgcac ttcacgcgcg gctacgggct 9660 ggtattcggc atgagcgagc gcaaagcgat ggcaatggcg ctggtcgatc gtgcgttgca 9720 ggctccggaa tacggcgagc acgcgacagg cccggcgcag gatgaagagt ttgtgctggc 9780 acatgccgac aacgtcga.ag ccgcaggctt tgtctcgcac ctcaaactcc cccactacgt 9840 cgatttccag gccgaactgg agctactcaa acgtctgcaa caggagaaga accatggcta 9900 atctgagcgg ctacaacttt gcctacctcg acgagcagac caaacgcatg atccgccgcg 9960 ccatcttaaa agcggtggcg atccccggtt atcaggtgcc gtttggcggg cgcgagatgc 10020 cgatgccata cggctgggga accggcggca tacagctcac cgccagcgtg attggcgaaa 10080 gcgacgtgct aaaggtgatt gaccagggtg cggatgacac caccaacgcc gtgtcgattc 10140 gcaacttctt taagcgcgtg accggggtaa acaccactga acgtacggac gatgcgacgc 10200 ttatccagac gcgtcaccgc atccccgaaa cgccgctgac cgaagatcag atcattatct 10260 tccaggtgcc aatcccggaa ccgctgcgct ttatcgagcc gcgcgaaacg gaaacccgca 10320 ccatgcacgc gctggaagag tacggcgtga tgcaggtgaa actgtatgaa gatatcgccc 10380 gcttcggtca tatcgccact acctacgcct atccggtgaa ggtgaacggg cgctacgtaa 10440 tggacccgtc gccgatcccg aaattcgata acccaaaaat ggacatgatg cccgccctgc 10500 aactgttcgg cgcggggcgc gagaagcgca tctatgcggt gccgccgttt acccgcgtgg 10560 aaagtctcga tttcgacgat cacccgttca ccgttcagca gtgggatgag ccatgcgcca 10620 tctgcggatc gacccacagc tatcttgatg aagtggtgct ggatgacgcc ggaaaccgca 10680 tgtttgtctg ctccgatacc gattattgcc gccaacagag cgaggcaaaa aaccaatgaa 10740 tcaaccgtta ctttcggtca ataacctgac ccacctttac gcgccgggca aaggctttag 10800 cgatgtctct tttgatttat ggccggggga agtgctgggc attgtcgggg aatccggctc 10860 cgggaagacc acgctgctga agtcgatctc cgcgcgcctg acgccgcagc agggggaaat 10920 tcactacgag aaccgttcgc tgtatgcaat gagcgaggcc gaccgccgtc gcctgctgcg 10980 taccgaatgg ggcgtggtgc atcagcatcc actcgacggc ctgcgccgcc aggtgtcggc 11040 aggcggcaat atcggcgagc ggctgatggc gaccggggca cgtcattacg gcgatattcg 11100 tgccaccgcg cagaagtggc tggaagaggt ggagattccc gccaaccgga tcgacgacct 11160 gccgaccacc ttttccggcg gtatgcagca gcgtttgcag attgcccgca acctggtgac 11220 gcatccgaag ctggtgttta tggatgaacc gaccggcggg ctggatgtgt cggtgcaggc 11280 ccgcctgctc gacctgctgc gcggcctggt ggtggagctg aacctcgcgg tggtgattgt 11340 cacccatgat ttaggcgtcg cccgcctgct ggcggaccgt ttgctggtga tgaagcaggg 11400 gcaagtggtg gagagtgggt taaccgaccg cgtgctcgac gacccgcatc atccgtatac 11460 acagctgctg gtgtcatcgg ttttgcagaa ttgagccggt gccggatgcg gcgtaaacgc 11520 cttatccggc ctacaaatgc gctccccgta ggtcggataa gacgcgtcag cgtcgcatcc 11580 gacacccgaa ccacgaggcg aaaaatgatt aacgtacaaa acgtcagtaa aaccttcatc 11640 ctgcaccagc aaaacggcgt gcgcctgccc gtcctcaatc gcgcctcgct caccgtcaac 11700 gcgggcgaat gcgtggtgct ccacggccat tccggcagcg gcaaatcaac tctgctacgc 11760 tcgctgtacg ccaactatct acccgacgaa ggtcaaatcc agatcaaaca cggtgacgag 11820 tgggtagacc tggtcaccgc gccagcgcgc aaagtggtgg aaatccgcaa aaccaccgtc 11880 ggctgggtga gccagtttct gcgcgtcatc ccgcgtatct cagcactgga agtggtgatg 11940 cagccgctgc tcgataccgg cgttccgcgt gaagcctgcg ccgctaaagc cgcgcgtctt 12000 ctcacccgcc tgaacgtgcc ggaacgcctg tggcacctgg caccatcgac attttccggt 12060 ggcgaacagc agcgcgtcaa catcgcccgc ggctttatcg tcgactaccc cattctgctg 12120 cttgacgaac ctaccgcctc gctggacgcc aaaaacagcg ccgcggtggt ggaactgatt 12180 cgcgaagcca aaacccgtgg cgcagccatc gtaggcatct tccatgacga agctgtacgt 12240 aatgacgtcg ccgaccgcct gcacccaatg ggagcctctt catgattatc aataacgtta 12300 agctggtgct ggaaaacgag gtggtaagcg gttcgctgga ggtgcagaac ggcgaaatcc 12360 gcgcctttgc cgaaagccag agccgcctgc cggaggcgat ggacggcgaa ggcggctggc 12420 tgctgccggg gctgattgag ctgcataccg ataatctgga taaattcttc accccgcgcc 12480 cgaaagttga ctggcctgcc cactcggcga tgagcagcca cgacgcgctg atggtggcga 12540 gcggcatcac caccgtactg gatgccgtgg caattggcga cgtgcgcgac ggcggcgatc 12600 ggctggagaa tctggagaag atgatcaacg ccatcgaaga gacgcagaaa cgcggcgtca 12660 accgcgccga gcaccgtctg catctgcgct gcgaactgcc gcatcacacc acgctgccgc 12720 tgtttgaaaa actggtgcag cgcgagccgg tgacgctggt gtcgctgatg gaccactcgc 12780 cgggccagcg ccagttcgcc aaccgcgaga agtatcgcga atattatcag ggcaaatact- 12840 ccctcactga tgcgcagatg cagcagtacg aagaagagca actggcgctc gccgcacgct 12900 ggtcgcagcc gaatcgcgaa tccatcgccg ccctgtgccg cgcgcgaaaa attgcgcttg 12960 ccagccacga tgacgccacc cacgcccacg ttgctgaatc tcaccagctt ggcagcgtga 13020 tcgccgaatt tcccaccacg ttcgaagcgg cggaagcctc gcgcaagcat ggcatgaacg 13080 tgctgatggg cgcgccgaat attgtgcgcg gcggctcgca ctccggcaac gtggcggcca 13140 gtgaactggc gcagcttggc ctgctggata tcctctcttc cgactactac cccgccagcc 13200 tgctcgatgc ggcatttcgc gtcgccgatg acgagagcaa ccgctttacg ctgccgcagg 13260 cggtgaagct ggtgactaaa aatccagcgc aggcgcttaa tctccaggat cgcggggtga 13320 ttggcgaggg caaacgcgcc gacctggtgc tggcgcatcg caaggacaat catattcata 13380 tcgaccacgt ctggcgtcag ggtaaaaggg tgttctgatg atgggaaaac tgatttggtt 13440 aatggggccg tccggctccg ggaaagacag cctgctggcg gaactccgcc tgcgggaaca 13500 aactcagtta ctggtggcgc atcgctacat cacgcgcgat gccagcgccg gaagtgaaaa 13560 ccatatcgcc ctgagcgagc aggagttttt tacccgcgcg gggcaaaatc tgttggcctt 13620 aagctggcac gctaacggtc tgtattatgg cgtcggcgtc gagattgatc tctggctgca 13680 cgccggattc gacgtgctgg tcaacggctc acgcgcccat ctgccgcagg cgcgggcgcg 13740 ctatcaatcg gcgctgctgc ccgtctgttt acaggtttcg ccggagatcc tccgccagcg 13800 cctggaaaac cgtggccgtg aaaacgccag tgaaattaac gcccgcctgg cgcgcgccgc 13860 ccgctatact ccacaggatt gccatacgct caacaatgac ggcagcctgc gccagtcggt 13920 cgacacgctg ctgacgctga tccatcagaa ggagaaacac catgcctgct tgtgagcttc 13980 gcccggccac gcagtacgac accgacgcgg tttacgcgct gatttgtgag ctaaaacagg 14040 cggagtttga ccaccacgcg tttcgcgtgg gttttaacgc caatctgcgc gacccaaaca 14100 tgcgctacca tctggcgctg cttgatggcg aagttgtcgg catgatcggc ctgcatttgc 14160 agtttcatct gcatcatgtc aactggatcg gcgaaattca ggagttggtg gtaatgccgc 14220 aggcgcgcgg tctgaacgtc ggcagtaagt tactggcgtg ggcagaagaa gaagcccgcc 14280 aggccggggc cgaaatgacc gaactttcga ccaacgtgaa gcgccacgac gcgcaccgtt 14340 tctatctgcg cgaaggctac gagcagagcc acttccgctt caccaaggcg ctgtaacatg 14400 agcctgaccc tcacgctcac cggcaccggc ggcgcacagg gcgttccggc atggggctgc 14460 gagtgtgcgg cctgcgccag agcgcggcgc tcgccgcagt atcgccgcca accgtgcagc 14520 ggcgtagtga agtttaacga cgcaatcacc ctgatcgacg ccgggctgca cgatctcgcc 14580 gatcgctggt cgcccggatc gttccagcag tttttgctga cgcattatca tatggatcac 14640 gtccaggggc tgtttccgct gcgctggggc gttggcgatc cgatcccggt ttacggcccg 14700 ccggatgaac agggctgcga cgatctgttt aaacatccgg gcctgcttga tttcagccac 14760 acggtggaac cgtttgtggt gtttgatttg caggggttac aggtcacgcc cctgccgctc 14820 aaccactcaa aactgacctt cggttatctg ctggaaacgg cacacagccg ggtggcgtgg 14880 ctgtctgaca ccgcaggctt gccggaaaaa acgctgaaat ttttacgcaa taatcagccg 14940 caggtaatgg tgatggattg cagtcacccg ccgcgcgcgg atgcaccgcg taatcactgt 15000 gatttaaata ccgtgcttgc gctgaatcag gttatccgct cgccacgggt gattctgacc 15060 catatcagcc accagtttga tgcgtggctg atggaaaacg cactaccgtc agggtttgag 15120 gtggggtttg atgggatgga gattggggtg gcgtgatgag agggaatgtg cgcgctggcc 15180 ccctcaccct aaccctctcc ccagaggggc gaggggaccg attgtgctcg atattgaata 15240 ttgcgctcgt tttctccctc tccccattgg ggtgaggggc gatgcctgct ccatacccaa 15300 cctcatcgcc catactcatc ttccattctc cgctcttcat cctccagttg ccgacgctcc 15360 tgatcaagct ggcgctggcg atcgtccagc tgcctgcggc gatcttcaaa ctggcggcgg 15420 cggtcgtcat attgtctgcg ccgatcgtcg ctcacttcac gctgccagcc gtggtcgcgc 15480 gaatcttcat agttgaagcg gcgcacgaaa aacgcgaaag cgtttcacga taaatgcgaa 15540 aactttagct ttcgcgcttc aaatgaaaca gatgtattaa ttactgcttt ttattcatta 15600 catggggatc c 15611 <210>2 <211> 11672 <212>ADN <213> Escherichia coli <400> 2 gaattcccgt taactcttca tctgttagtc acttttaatt aaccaaatcg tcacaataat 60 ccgccacgat ggagccactt ttttagggag gctgcatcat gcaaacgatt atccgtgtcg 120 agaagctcgc caaaaccttc aatcagcatc aggcgctgca tgcggttgat ctgaacattc 180 atcacggtga aatggtggct ctgcttgggc cgtcgggttc cggaaaatcc acccttttac 240 gtcacttaag cggtttgatt accggcgata aatctgtcgg tagccatatc gagctgctgg 300 gccgcacagt ccagcgcgaa ggccgcctgg cccgcgatat ccgcaaaagc cgcgcccata 360 ccggctacat attccaacaa ttcaacctgg tgaaccgcct gagcgtactg gagaacgtgc 420 tgattggcgc gctcggcagc acgccgttct ggcgcacctg ttttagctgg ttcaccggcg 480 agcagaaaca gcgcgcgtta caggcgctga cccgcgttgg catggtgcat tttgcccatc 540 agcgcgtttc caccctctcc ggcggccagc agcaacgtgt ggcgattgcc cgtgcgctga 600 tgcagcaggc gaaagtgatt ctggccgatg aacccatcgc ctcgctggac ccagaatcag 660 cgcgcatcgt gatggacacc ctgcgcgaca tcaaccagaa cgacggcatc accgtggtcg 720 tcacgctgca tcaggtggat tacgccctgc gctactgcga acgcatcgtc gccctgcgcc 780 aggggcacgt cttctacgac ggcagcagcc aacagtttga taacgaacgt tttgaccatc 840 tctaccgcag cattaaccgc gtcgaagaga acgcgaaagc tgcctgacat ccccatcatt 900 gaggaaaacg aatgaacgct aagataattg cctcgctggc cttcaccagc atgttcagcc 960 tcagcaccct gttaagcccg gcgcacgccg aagagcagga aaaggcgttg aatttcggca 1020 ttatttcaac ggaatcacag caaaacctga aaccgcaatg gacgccgttc ttgcaggata 1080 tggagaagaa gctgggcgtg aaggtcaacg ccttctttgc cccggactac gcgggcatta 1140 tccaggggat gcgcttcaat aaagtggata tcgcctggta cggcaatctg tcggcgatgg 1200 aagcggtgga tcgcgccaat ggccaggtct tcgcccagac ggtcgcggcg gatggatcgc 1260 cgggttactg gagcgtgttg atcgtcaaca aagacagtcc gatcaacaac ctgaacgatc 1320 tgctggcgaa gcggaaag,at ctcacctttg gcaatggcga tcctaactcc acctctggct 1380 tcctcgtccc cggctactac gtcttcgcca aaaacaatat ctccgccagc gacttcaagc 1440 gcaccgtcaa cgccgggcat gaaaccaacg cgctggccgt cgccaacaag caggtggatg 1500 ttgccaccaa caacaccg,aa aacctcgaca agctgaaaac ctccgcgcca gagaagctga 1560 aagaactgaa ggtgatctgg aagtcgccgc tgatcccagg cgatccgatc gtctggcgca 1620 agaatctttc cgaaaccacc aaagacaaga tctacgactt ctttatgaac tacggcaaaa 1680 cgccggaaga aaaagcggtg ctggaacgcc tgggctgggc gccattccgc gcttccagcg 1740 acctgcaact ggtgccgatt cgccagctcg cgctgtttaa agagatgcag ggcgtgaaaa 1800 gcaataaagg actgaatgag caggacaagc tggcaaaaac caccgagatt caggcgcagc 1860 tggatgacct ggaccgcctg aacaacgcgc taagcgcgat gagttcggtg agtaaagcgg 1920 tgcagtaaat cgtaggtcgg ataagacgcc ccggcgtcgc atccgacaat gtgcaggcgt 1980 tgatgccgga tgcggtgcaa gcaccttatc cggcctacag accggagcca aacatgcaaa 2040 ccatcaccat cgccccaccc aagcgcagct ggttctcgct tctgagctgg gccgttgtac 2100 tcgccgtgtt ggtcgtctcg tggcagggcg cggaaatggc cccgcttacg ctgatcaaag 2160 acggcggcaa catggcgacg ttcgccgccg acttcttccc gcccgatttc agccagtggc 2220 aggattacct caccgaaatg gccgtcacgc tgcaaatcgc cgtctggggc accgcgctgg 2280 cggtggttct ctccatcccc tttggcctga tgagcgccga aaacctggtg ccgtggtggg 2340 tttaccagcc cgttcgccgc ctgatggacg cctgccgcgc cattaacgaa atggtcttcg 2400 ccatgctgtt cgtggtcgcc gtcggcctcg gcccgttcgc tggcgtgctg gcgtgctggc 2460 gctgtttatc cacaccaccg gcgtgctctc caagctgctt tccgaagcgg tggaagcgat 2520 tgagcccggc ccggtggaag gcattcgcgc caccggtgcc aacaagctcg aagagatcct 2580 ctacggcgtg ctgccacagg tgatgccact gctgatctcc tactccctct atcgcttcga 2640 atccaacgtc cgctcggcga ccgtcgtcgg catggtcggc gcaggcggga tcggcgtcac 2700 cctgtgggaa gcgattcgcg gtttccagtt ccaacaaacc tgcgccctga tggtgcttat 2760 catcgtcacg gtcagcctgc tggatttcct ctctcaacgg ttgcgtaagc actttatctg 2820 ataagcgagg cattgatatc tatgcacttg tctacacatc cgaccagcta cccaacacgc 2880 tatcaagaga tagccgcaaa acttgagcag gagcttcgtc aacactaccg ctgcggcgac 2940 tatcttcccg ccgagcagca actggcagcg cgctttgagg tgaatcgcca caccctgcgc 3000 cgcgccatcg accaactggt ggaaaaaggc tgggtacagc gccgtcaggg cgtcggcgtg 3060 ctggtgctga tgcgcccgtt cgattacccg ctcaacgccc aggcgcgttt tagccagaat 3120 ctgctggatc agggcagcca tcccaccagc gaaaaactgc tttcggtatt gcgccccgcg 3180 tccggccacg tcgctgacgc actggggatt accgaggggg agaacgtcat ccacctgcgc 3240 accctgcgtc gtgtcaacgg cgtcgcgctc tgtttaatcg accactactt cgcggacctc 3300 accctctggc cgacgctgca acgcttcgac agcggctcgc tgcacgattt tctgcgcgag 3360 caaaccggaa ttgcgctgcg ccgcagccag acgcggatca gcgcccgccg cgcccaggcc 3420 aaagagtgcc agcgtcttga aatcccgaat atgtcgccgc tgctgtgcgt gcgcaccctt 3480 aaccaccgtg acggtgaaag cagcccggcg gagtactccg tcagcctgac gcgcgccgac 3540 atgattgaat tcactatgga gcactgaatg cacgcagata ccgcgacccg ccagcactgg 3600 atgtccgtgc tggcgcacag ccaaccggct gaactggcag cacgcctgaa cgcgctaaac 3660 atcaccgccg actatgaggt gatccgcgcc gctgaaactg gcctggtaca gattcaggcg 3720 cggatgggcg gcaccggcga acgttttttt gccggcgacg ccacgctgac ccgcgccgcc 3780 gtgcgcctga ctgacggcac gctcggctac agctgggtgc aggggcgtga taaacagcac 3840 gccgaacgct gcgcgctgat tgacgcgctg atgcagcaat ctcgccactt tcaaaactta 3900 tcagaaaccc ttattgcccc gctggacgct gaccgtatgg cacgcattgc cgcacgccag 3960 gccgaagtga acgccagccg ggtcgacttc tttacgatgg ttcgcggaga caacgcatga 4020 ccctggaaac cgcttttatg cttcccgtgc aggatgccca gcacagtttt cgtcgcctgt 4080 taaaggccat gagcgagccg ggcgtgattg tcgccctgca tcagctcaaa cgcggctggc 4140 aaccgctgaa tatcgccacc accagcgtgc tgctgacgct ggccgataac gacacgccgg 4200 tgtggctttc taccccatta aataacgata tcgtcaacca gagcctgcgt tttcatacca 4260 acgcgccgct ggtcagccag ccggaacagg cgaccttcgc ggtgacggat gaggcgattt 4320 ccagcgaaca gctcaacgcc ctttccaccg gcaccgccgt tgcgccggaa gcgggtgcga 4380 cgctgatttt acaggtcgcc agcctgagcg gcggacgcat gttgcgcctt actggtgcgg 4440 gtattgccga agaacgaatg atcgctccgc agctgccgga gtgcattctg cacgaactca 4500 ccgagcgccc gcatccgttc ccgctcggca tcgacctgat cctgacctgt ggcgagcgcc 4560 tgctggctat tccgcgaacc actcatgtgg aggtgtgctg atgtacgttg ccgtgaaagg 4620 gggcgagaag gcgatcgacg ccgcccacgc cctgcaagag agccgacgcc gaggcgatac 4680 cgatttgccc gaactgagcg tcgcccagat tgaacagcag cttaacctcg cggtagatcg 4740 cgtgatgacc gaaggcggca ttgccgaccg cgaactggcg gcgctggcgc tgaaacaggc 4800 cagcggcgat aacgttgaag cgattttcct gctgcgcgcc taccgcacca cgttggcgaa 4860 gctggcggta agcgagccgc tcgacaccac cgggatgcgt ctcgaacgcc gtatctccgc 4920 cgtttataaa gacattcccg gcggccagct gcttggccca acctacgact acacccatcg 4980 cctgctcgat tttaccctgc tggcaaacgg cgaagcgccg acgctgacca ccgccgacag 5040 cgaacagcag ccgtcgccgc acgttttcag cctgctggcg cgtcaggggc tggcgaagtt 5100 tgaagaggat agcggcgcac agccggatga catcacccgc acgccgccgg tttacccctg 5160 ctcacgctcc tcccgtttgc agcagttgat gcgcggcgac gaaggctatt tgctggcgct 5220 ggcctactcc acccaacgcg gttacgggcg caatcacccg ttcgcaggcg agatccgcag 5280 cggctatatc gacgtgtcga ttgtgccgga agagctggga tttgcggtga acgtcggcga 5340 actgctgatg actgagtgtg aaatggttaa cggttttatc gacccgccgg gtgagccgcc 5400 gcacttcacg cgcggctacg ggctggtgtt cggcatgagc gagcgcaaag cgatggcgat 5460 ggcgctggtc gaccgcgctc tgcaagcccc ggagtacggc gagcacgcga caggcccggc 5520 gcaggatgaa gagttcgtgc tggcacatgc cgacaacgtc gaagccgcag gctttgtctc 5580 acacctcaaa ctcccccact acgtcgattt ccaggccgaa ctggagctac tcaaacgtct 5640 gcaacaggag cagaaccatg gctaatctga gcggctacaa ctttgcctac ctcgacgagc 5700 agaccaaacg catgatccgc cgcgccatct taaaagcggt ggcgatcccc ggttatcagg 5760 tgccgtttgg cgggcgcgag atgccgatgc cgtacggctg gggaaccggc ggcattcagc 5820 ttaccgccag cgtgattggc gaaagcgacg tgctgaaggt gattgaccag ggcgcggatg 5880 acaccaccaa cgccgtgtcg attcgcaact tcttcaagcg cgtgaccggg gtaaacacca 5940 cggaacgtac ggacgatgcg acggttatcc agacgcgtca ccgcatcccc gaaacgccgc 6000 tgaccgaaga tcagataatt atcttccagg tgccaatccc cgagccgctg cgctttatcg 6060 agccgcgcga aacggaaacc cgcaccatgc acgcgctgga agagtacggc gtgatgcagg 6120 tgaaactgta tgaagatatc gcccgcttcg gtcatatcgc caccacctac gcctatccgg 6180 tgaaggtaaa tgggcgctac gtgatggacc cgtcgccgat cccgaaattc gataacccaa 6240 aaatggacat gatgcccgcc ctgcaactgt tcggcgcggg gcgcgagaag cgcatctatg 6300 cggtgccgcc gtttacccgc gtggaaagtc tcgatttcga cgatcacccg ttcaccgttc 6360 agcagtggga tgagccatgc gccatctgcg gatcgaccca cagctatctt gatgaagtgg 6420 tgctggatga cgccggaaac cgcatgtttg tctgctccga taccgattat tgccgccaac 6480 agagcgaggc aaaaaaccaa tgaatcaacc gttactttcg gtcaataacc tgacccacct 6540 ttacgcgccg ggcaaaggct ttagcgatgt ctcttttgat ttatggccgg gggaagtgct 6600 gggcattgtc ggggaatccg gctccgggaa gaccacgctg ctgaagtcga tctccgcgcg 6660 cctgacgccg cagcaggggg aaattcacta cgagaaccgt tcgctgtatg caatgagcga 6720 ggccgaccgc cgtcgcctgc tgcgtaccga atggggcgtg gtgcatcagc atccactcga 6780 cggcctgcgc cgccaggtgt cggcaggcgg caatatcggc gagcggctga tggcgaccgg 6840 ggcacgtcat tacggcgata ttcgtgccac cgcgcagaag tggctggaag aggtggagat 6900 tcccgccaac cggatcgacg acctgccgac caccttttcc ggcggtatgc agcagcgttt 6960 gcagattgcc cgcaacctgg tgacgcatcc gaagctggtg tttatggatg aaccgaccgg 7020 cgggctggat gtgtcggtgc aggcccgcct gctcgacctg ctgcgcggcc tggtggtgga 7080 gctgaacctc gcggtggtga ttgtcaccca tgatttaggc gtcgcccgcc tgctggcgga 7140 ccgtttgctg gtgatgaagc aggggcaagt ggtggagagt gggttaaccg accgcgtgct 7200 cgacgacccg catcatccg atacacagct gctggtgtca tcggttttgc agaattgagc 7260 cggtgccgga tgcggcgtaa acgccttatc cggcctacaa atgcgctccc cgtaggtcgg 7320 ataagacgcg tcagcgtcgc atccgacacc cgaaccacga ggcgaaaaat gattaacgta 7380 caaaacgtca gtaaaacctt catcctgcac cagcaaaacg gcgtgcgcct gcccgtcctc 7440 aatcgcgcct cgctcaccgt caacgcgggc gaatgcgtgg tgctccacgg ccattccggc 7500 agcggcaaat caactctgct acgctcgctg tacgccaact atctgcccga cgaaggtcaa 7560 atccagatca aacacggtga cgagtgggta gacctggtca ccgcgccagc gcgcaaagtg 7620 gtggaaatcc gcaaaaccac cgtcggctgg gtgagccagt ttctgcgcgt catcccgcgt 7680 atctcagcac tggaagtggt gatgcagccg ctgctcgata ccggcgttcc gcgtgaagcc 7740 tgcgccgcta aagccgcgcg tcttctcacc cgcctgaacg tgccggaacg cctgtggcac 7800 ctggcaccat cgacattttc cggtggcgaa cagcagcgcg tcaacatcgc ccgcggcttt 7860 atcgtcgact accccattct gctgcttgac gaacctaccg cctcgctgga cgccaaaaac 7920 agcgccgcgg tggtggaact gattcgcgaa gccaaaaccc gtggcgcagc catcgtaggc 7980 atcttccatg acgaagctgt acgtaatgac gtcgccgacc gcctgcaccc aatgggagcc 8040 tcttcatgat tatcaataac gttaagctgg tgctggaaaa cgaggtggta agcggttcgc 8100 tggaggtgca gaacggcgaa atccgcgcct ttgccgaaag ccagagccgc ctgccggagg 8160 cgatggacgg cgaaggcggc tggctgctgc cggggctgat tgagctgcat accgataatc 8220 tggataaatt cttcaccccg cgcccgaaag ttgactggcc tgcccactcg gcgatgagca 8280 gccacgacgc gctgatggtg gcgagcggca tcaccaccgt actggatgcc gtggcaattg 8340 gcgacgtgcg cgacggcggc gatcggctgg agaatctgga gaagatgatc aacgccatcg 8400 aagagacgca gaaacgcggc gtcaaccgcg ccgagcaccg tctgcatctg cgctgcgaac 8460 tgccgcatca caccacgctg ccgctgtttg aaaaactggt gcagcgcgag ccggtgacgc 8520 tggtgtcgct gatggaccac tcgccgggcc ágcgccagtt cgccaaccgc gagaagtatc 8580 gcgaatatta tcagggcaaa tactccctca ctgatgcgca gatgcagcag tacgaagaag 8640 agcaactggc gctcgccgca cgctggtcgc agccgaatcg cgaatccatc gccgccctgt 8700 gccgcgcgcg aaaaattgcg cttgccagcc acgatgacgc cacccacgcc cacgttgctg 8760 aatctcacca gcttggcagc gtgatcgccg aatttcccac cacgttcgaa gcggcggaag 8820 cctcgcgcaa gcatggcatg aacgtgctga tgggcgcgcc gaatattgtg cgcggcggct 8880 cgcactccgg caacgtggcg gccagtgaac tggcgcagct tggcctgctg gatatcctct 8940 cttccgacta ctaccccgcc agcctgctcg atgcggcatt tcgcgtcgcc gatgaccaga 9000 gcaaccgctt tacgctgccg caggcggtga agctggtgac taaaaatcca gcgcaggcgc 9060 ttaatctcca ggatcgcggg gtgattggcg agggcaaacg cgccgacctg gtgctggcgc 9120 atcgcaagga caatcatatt catatcgacc acgtctggcg tcagggtaaa agggtgttct 9180 gatgatggga aaactgattt ggttaatggg gccgtccggc tccgggaaag acagcctgct 9240 ggcggaactc cgcctgcggg aacaaactca gttactggtg gcgcatcgct acatcacgcg 9300 cgatgccagc gccggaagtg aaaaccatat cgccctgagc gagcaggagt tttttacccg 9360 cgcggggcaa aatctgttgg ccttaagctg gcacgctaac ggtctgtatt atggcgtcgg 9420 cgtcgagatt gatctctggc tgcacgccgg attcgacgtg ctggtcaacg gctcacgcgc 9480 ccatctgccg caggcgcggg cgcgctatca atcggcgctg ctgcccgtct gtttacaggt 9540 ttcgccggag atcctccgcc agcgcctgga aaaccgtggc cgtgaaaacg ccagtgaaat 9600 taacgcccgc ctggcgcgcg ccgcccgcta tactccacag gattgccata cgctcaacaa 9660 tgacggcagc ctgcgccagt cggtcgacac gctgctgacg ctgatccatc agaaggagaa 9720 acaccatgcc tgcttgtgag cttcgcccgg ccacgcagta cgacaccgac gcggtttacg 9780 cgctgatttg tgagctaaaa caggcggagt ttgaccacca cgcgtttcgc gtgggtttta 9840 acgccaatct gcgcgaccca aacatgcgct accatctggc gctgcttgat ggcgaagttg 9900 tcggcatgat cggcctgcat ttgcagtttc atctgcatca tgtcaactgg atcggcgaaa 9960 ttcaggagtt ggtggtaatg ccgcaggcgc gcggtctgaa cgtcggcagt aagttactgg 10020 cgtgggcaga agaagaagcc cgccaggccg gggccgaaat gaccgaactt tcgaccaacg 10080 tgaagcgcca cgacgcgcac cgtttctatc tgcgcgaagg ctacgagcag agccacttcc 10140 gcttcaccaa ggcgctgtaa catgagcctg accctcacgc tcaccggcac cggcggcgca 10200 cagggcgttc cggcatgggg ctgcgagtgt gcggcctgcg ccagagcgcg gcgctcgccg 10260 cagtatcgcc gccaaccgtg cagcggcgta gtgaagttta acgacgcaat caccctgatc 10320 gacgccgggc tgcacgatct cgccgatcgc tggtcgcccg gatcgttcca gcagtttttg 10380 ctgacgcatt atcatatgga tcacgtccag gggctgtttc cgctgcgctg gggcgttggc 10440 gatccgatcc cggtttacgg cccgccggat gaacagggct gcgacgatct gtttaaacat 10500 ccgggcctgc ttgatttcag ccacacggtg gaaccgtttg tggtgtttga tttgcagggg 10560 ttacaggtca cgcccctgcc gctcaaccac tcaaaactga ccttcggtta tctgctggaa 10620 acggcacaca gccgggtggc gtggctgtct gacaccgcag gtttgccgga aaaaacgctg 10680 aaatttttac gcaataatca gccgcaggta atggtgatgg attgcagtca cccgccgcgc 10740 gcggatgcac cgcgtaatca ctgtgattta aataccgtgc ttgcgctgaa tcaggttatc 10800 cgctcgccac gggtgattct gacccatatc agccaccagt ttgatgcgtg gctgatggaa 10860 aacgcactac cgtcagggtt tgaggtgggg tttgatggga tggagattgg ggtggcgtga 10920 tgagagggaa tgtgcgcgct ggccccctca ccctaaccct ctccccagag gggcgagggg 10980 accgattgtg ctcgatattg aatattgcgc tcgttttctc cctctcccca ttggggtgag 11040 gggcgatgcc tgctccatac ccaacctcat cgcccatact catcttccat tctccgctct 11100 tcatcctcca gttgccgacg ctcctgatca agctggcgct ggcgatcgtc cagctgcctg 11160 cggcgatctt caaactggcg gcggcggtcg tcatattgtc tgcgccgatc gtcgctcact 11220 tcacgctgcc agccgtcgtc gcgcgaatct tcatagtctc gcccacggtc agggttataa 11280 gcgtcattaa tcgcctgctg aatattgcca atggtgtcgt cgataatatc ggcctgggcc 11340 ggaacgtgga cagcgtgagc agggtgaata aaagaaatag cggaaagcgt ttcattagcc 11400 aacctcaaaa agaaactcta tccacattaa tcattactca tccatgcaag tagtggatga 11460 atctcaattt ctccgctgct ctattgccgt aatcgcctcc acgcgttgtt gatgacgacc 11520 gccttcgtac tgtgcgccca gccacgcatc cacaatcatt tttgccagtt cgaggccaac 11580 cactcgtgaa ccaaaagcca gcacgttggt gtcgttatgc tgccgcgaaa gttgcgcgga 11640 ataaggttcg ctacagacga ccgcgcgaat te 11672 <211>435 <212>ADN <213> Escherichia coli <400> 3 atgcctgctt gtgagcttcg cccggccacg cagtaegaca ccgacgcggt ttacgcgctg 60 atttgtgagc taaaacaggc ggagtttgac caccacgcgt ttcgcgtggg ttttaacgcc 120 aatctgcgcg acccaaacat gcgctaccat ctggcgctgc ttgatggcga agttgtcggc 180 atgatcggcc tgcatttgca gtttcatctg catcatgtca actggatcgg cgaaattcag 240 gagttggtgg taatgccgcei ggcgcgcggt ctgaacgtcg gcagtaagtt actggcgtgg 300 gcagaagaag aagcccgcca ggccggggcc gaaatgaccg aactttcgac caacgtgaag 360 cgccacgacg cgcaccgttt ctatctgcgc gaaggctacg ageagageca cttccgcttc 420 accaaggcgc tgtaa 435 <210>4 <211> 144 <212>PRT <213> Escherichia coli <400> 4 Met Pro Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu lie Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp lie Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210>5 <211>20 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético <400> 5 aaacaccatg gctgcttgtg <210> 6 <211 > 35 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido sintético <400> 6 gtgacgaatt cgagctcat acagcgcctt ggtga 35 <210> 7 <211> 435 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de la secuencia artificial: secuencia de nucleótidos no natural que codifica proteína PhnO P2A; g-c en la posición de nucleotido 4 <220> <221 > CDS <222> (1 )..(432) <400> 7 atg gct gct tgt gag ctt cgc ccg gcc acg cag tac gac acc gac gcg 48 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 gtt tac gcg ctg att tgt gag cta aaa cag gcg gag ttt gac cae cae 96 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 gcg ttt cgc gtg ggt ttt aac gcc aat ctg cgc gac cca aac atg cgc 144 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 tac cat ctg gcg ctg ctt gat ggc gaa gtt gtc ggc atg ate ggc ctg 192 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 cat ttg cag ttt cat ctg cat cat gtc aac tgg ate ggc gaa att cag 240 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 gag ttg gtg gta atg ccg cag gcg cgc ggt ctg aac gtc ggc agt aag 288 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 tta ctg gcg tgg gca gaa gaa gaa gcc cgc cag gcc ggg gcc gaa atg 336 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 acc gaa ctt tcg acc aac gtg aag cgc cae gac gcg cae cgt ttc tat 384 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 ctg cgc gaa ggc tac gag cag age cae ttc cgc ttc acc aag gcg ctg 432 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 taa 435 <210> 8 <211 > 144 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 8 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210>9 <211>264 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> J O <223> Descripción de secuencia artificial: secuencia codificadora de péptido de tránsito <220> <221 > CDS <222> (1 )..(264) <400> 9 atg gct tcc tct atg etc tct tcc gct act atg gtt gcc tct ccg gct 48 Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 1 5 10 15 cag gcc act atg gtc gct ect ttc aac gga ctt aag tcc tcc gct gcc 96 Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala 20 25 30 ttc cca gcc acc cgc aag gct aac aac gac att act tcc ate acá age 144 Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp He Thr Ser He Thr Ser 35 40 45 aac ggc gga aga gtt aac tgc atg cag gtg tgg ect ccg att gga aag 192 Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro He Gly Lys 50 55 60 aag aag ttt gag act etc tct tac ctt ect gac ctt acc gat tcc ggt 240 0 Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly 65 70 75 80 ggt cgc gtc aac tgc atg cag gcc 264 Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala 85 <210>10 <211> 88 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 10 Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 1 5 10 15 Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp He Thr Ser He Thr Ser 35 40 45 Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro He Gly Lys 50 55 60 Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly 65 70 75 80 Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala 85 <210> 11 <21 1 > 696 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: secuencia codificadora de CTP-AMPA acetiltransferasa y traducción de secuencia de aminoácidos <220> <221> CDS <222> (1 )..(696) <400> 11 atg gct tcc tct atg etc tct tcc gct act atg gtt gcc tct ccg gct 48 Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 1 5 10 15 cag gcc act atg gtc gct ect ttc aac gga ctt aag tcc tcc gct gcc 96 Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala 20 25 30 ttc cca gcc acc cgc aag gct aac aac gac att act tcc ate acá age 144 Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp He Thr Ser He Thr Ser 35 40 45 aac ggc gga aga gtt aac tgc atg cag gtg tgg ect ccg att gga aag 192 Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro He Gly Lys 50 55 60 aag aag ttt gag act etc tct tac ctt ect gac ctt acc gat tcc ggt 240 Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly 65 70 75 80 ggt cgc gtc aac tgc atg cag gcc atg gct gct tgt gag ctt cgc ccg 288 Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro 85 90 95 gcc acg cag tac gac acc gac gcg gtt tac gcg ctg att tgt gag cta 336 Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu 100 105 110 aaa cag gcg gag ttt gac cae cae gcg ttt cgc gtg ggt ttt aac gcc 384 Lys Gln Ala Glu Phe Asp His. His Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala 115 120 125 aat ctg cgc gac cca aac atg cgc tac cat ctg gcg ctg ctt gat ggc 432 Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly 130 135 140 gaa gtt gtc ggc atg ate ggc ctg cat ttg cag ttt cat ctg cat cat 480 Glu Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu Gln Phe His Leu His His 145 150 155 160 gtc aac tgg ate ggc gaa att cag gag ttg gtg gta atg ccg cag gcg 528 Val Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala 165 170 175 cgc ggt ctg aac gtc ggc agt aag tta ctg gcg tgg gca gaa gaa gaa 576 Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu 180 185 190 gcc cgc cag gcc ggg gcc gaa atg acc gaa ctt tcg acc aac gtg aag 624 Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys 195 200 205 cgc cae gac gcg cae cgt ttc tat ctg cgc gaa ggc tac gag cag age 672 Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser 210 215 220 cae ttc cgc ttc acc aag gcg ctg 696 His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 225 230 <210> 12 <211> 232 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 12 Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 1 5 10 15 Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp He Thr Ser He Thr Ser 35 40 45 Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Val Trp Pro Pro He Gly Lys 50 55 60 Lys Lys Phe Glu Thr Leu Ser Tyr Leu Pro Asp Leu Thr Asp Ser Gly 65 70 75 80 Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro 85 90 95 Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu 100 105 110 Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala 115 120 125 Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly 130 135 140 Glu Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu Gln Phe His Leu His His 145 150 155 160 Val Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala 165 170 175 Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu 180 185 190 Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys 195 200 205 Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser 210 215 220 His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 225 230 <210> 13 <211 > 415 <212> ADN <213> Zea mays <220> <221> N_region <222> (15)..(163) <220> <221 > intron <222> (164)..(322) <220 > <221> C_region <222> (323) .. (411) <400> 13 tctagaggat cagcatggcg cccaccgtga tgatggcctc gtcggccacc gccgtcgctc 60 cgttcctggg gctcaagtcc accgccagcc tccccgtcgc ccgccgctcc tccagaagcc 120 tcggcaacgt cagcaacggc ggaaggatcc ggtgcatgca ggtaacaaat gcatcctagc 180 tagtagttct ttgcattgca gcagctgcag ctagcgagtt agtaatagga agggaactga 240 tgatccatgc atggactgat: gtgtgttgcc catcccatcc catcccattt cccaaacgaa 300 ccgaaaacac cgtactacgt: gcaggtgtgg ccctacggca acaagaagtt cgagacgctg 360 tcgtacctgc cgccgctgtc gaccggcggg cgcatccgct gcatgcaggc catgg 415 <210> 14 <211> 174 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: secuencia codificadora de péptido de tránsito a cloroplasto o plástido y traducción de secuencia de aminoácidos <220> <221> CDS <222> (1 )..(174) <400> 14 atg gct tcc tct atg etc tct tcc gct act atg gtt gcc tct ccg gct 48 Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 1 5 10 15 cag gcc act atg gtc gct ect ttc aac gga ctt aag tcc tcc gct gcc 96 Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala 20 25 30 ttc cca gcc acc cgc aag gct aac aac gac att act tcc ate acá age 144 Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp He Thr Ser He Thr Ser 35 40 45 aac ggc gga aga gtt atac tgc atg cag gcc 174 Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala 50 55 <210> 15 <211> 58 <212>PRT <213> Secuencia Artificial <400> 15 Met Ala Ser Ser Met Leu Ser Ser Ala Thr Met Val Ala Ser Pro Ala 1 5 10 15 Gln Ala Thr Met Val Ala Pro Phe Asn Gly Leu Lys Ser Ser Ala Ala 20 25 30 Phe Pro Ala Thr Arg Lys Ala Asn Asn Asp He Thr Ser He Thr Ser 35 40 45 Asn Gly Gly Arg Val Asn Cys Met Gln Ala 50 55 <210> 16 <211 > 157 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético que representa los pares de bases 1 a 157 de un gen de AMPA aciltransferasa de 432 pares de bases <400> 16 atggccgctt gcgagcttcg cccagccacg cagtacgaca ccgacgccgt gtacgcgctg 60 atctgcgagc tcaagcaggc ggagttcgac caccacgcct tccgcgtggg cttcaacgcc 120 aacctgcgcg accccaacat gcgctaccat ctggcgc 157 <210> 17 <211> 187 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: secuencia de oligonucleótido sintético que representa los pares de bases 158 a 344 de un gen de AMPA aciltransferasa de 432 pares de bases <400 > 17 tgcttgatgg cgaagtggtc ggcatgatcg gcctgcacct ccagttccac ctgcatcatg 60 tcaactggat cggcgagatc caggagctgg tcgtgatgcc acaggcgagg ggtctgaacg 120 tcggcagcaa gctcctggcg tgggccgagg aggaagccag gcaggccgga gccgagatga 180 ccgagct 187 <210> 18 <21 1 > 88 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: secuencia de oligonucleótido sintético que representa los pares de bases 345 a 432 de un gen de AMPA aciltransferasa de 432 pares de bases <400> 18 cagcaccaac gtgaagcgcc acgacgcgca ccgcttctac ctgcgcgaag gctacgagca 60 gagccacttc cgcttcacca aggcgctg 88 <210> 19 <211>432 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético que provee secuencia codificadora optimizada de monocotiledónea para una AMPA acetiltransferasa <220> <221> CDS <222> (1) .. (432) <400> 19 atg gcc gct tgc gag ctt cgc cca gcc acg cag tac gac acc gac gcc 48 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 9fc9 tac 9C9 ct9 atc 19c 9a9 ctc aa9 ca9 9C9 9a9 ttc 9ac cac cac 96 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 gcc ttc cgc gtg ggc ttc aac gcc aac ctg cgc gac ccc aac atg cgc 144 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 tac cat ctg gcg ctg ctt gat ggc gaa gtg gtc ggc atg atc ggc ctg 192 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 cac ctc cag ttc cac ctg cat cat gtc aac tgg atc ggc gag atc cag 240 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 gag ctg gtc gtg atg cca cag gcg agg ggt ctg aac gtc ggc age aag 288 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 ctc ctg gcg tgg gcc gag gag gaa gcc agg cag gcc gga gcc gag atg 336 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 acc gag ctc age acc aac gtg aag cgc cac gac gcg cac cgc ttc tac 384 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 ctg cgc gaa ggc tac gag cag age cac ttc cgc ttc acc aag gcg ctg 432 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210> 20 <211> 144 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 20 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210> 21 <211 > 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético PHN1 para usar como un iniciador de ampliación <400> 21 atggctgctt gtgagcttcg <210> 22 <21 1 > 20 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: oligonucleótido sintético PHN2 para usar como un iniciador de ampliación <400> 22 cagcgccttg gtgaagcgga <210> 23 <21 1 > 1630 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cassette de expresión que comprende promotor operable en planta ligado a una secuencia codificadora que codifica una AMPA acetiltransferasa, ligada a una secuencia de terminación de transcripción <220> <221 > promotor <222> (33)..(605) <220> <221> péptido de tránsito <222> (627)..(892) <220> <221 > CDS <222> (893)..(1324) <220> <221 > terminador <222> (1350).. (1605) <400> 23 gcggccgcgt tcaagcttga gctcaggatt tagcagcatt ccagattggg ttcaatcaac 60 aaggtacgag ccatatcact ttattcaaat tggtatcgcc aaaaccaaga aggaactccc 120 atcctcaaag gtttgtaagg aagaattctc agtccaaagc ctcaacaagg tcagggtaca 180 gagtctccaa accattagcc aaaagctaca ggagatcaat gaagaatctt caatcaaagt 240 aaactactgt tccagcacat gcatcatggt cagtaagttt cagaaaaaga catccaccga 300 agacttaaag ttagtgggca tctttgaaag taatcttgtc aacatcgagc agctggcttg 360 tggggaccag acaaaaaagg aatggtgcag aattgttagg cgcacctacc aaaagcatct 420 ttgcctttat tgcaaagatct aagcagattc ctctagtaca agtggggaac aaaataacgt 480 ggaaaagagc tgtcctgaca gcccactcac taatgcgtat gacgaacgca gtgacgacca 540 caaaagaatt ccctctatat aagaaggcat tcattcccat ttgaaggatc atcagatact 600 gaaccaatcc ttctagaaga tctccacaat ggcttcctct atgctctctt ccgctactat 660 ggttgcctct ccggctcagcj ccactatggt cgctcctttc aacggactta agtcctccgc 720 tgccttccca gccacccgca aggctaacaa cgacattact tccatcacaa gcaacggcgg 780 aagagttaac tgcatgcagg tgtggcctcc gattggaaag aagaagtttg agactctctc 840 ttaccttcct gaccttaccg attccggtgg tcgcgtcaac tgcatgcagg ce atg gct 898 Met Ala gct tgt gag ctt cgc ccg gcc acg cag tac gac acc gac gcg gtt tac 946 Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr 5 10 15 gcg ctg att tgt gag cta aaa cag gcg gag ttt gac cac cac gcg ttt 994 Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe 20 25 30 cgc gtg ggt ttt aac gcc aat ctg cgc gac cca aac atg cgc tac cat 1042 Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His 35 40 45 50 ctg gcg ctg ctt gat ggc gaa gtt gtc ggc atg atc ggc ctg cat ttg 1090 Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu 55 60 65 cag ttt cat ctg cat cat gtc aac tgg atc ggc gaa att cag gag ttg 1138 Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu 70 75 80 gtg gta atg ccg cag gcg cgc ggt ctg aac gtc ggc agt aag tta ctg 1186 Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu 85 90 95 gcg tgg gca gaa gaa gaa gcc cgc cag gcc ggg gcc gaa atg acc gaa 1234 Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu 100 105 110 ctt tcg acc aac gtg aag cgc cac gac gcg cac cgt ttc tat ctg cgc 1282 Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg 115 120 125 130 gaa ggc tac gag cag age cac ttc cgc ttc acc aag gcg ctg 1324 Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 135 140 taatgagctc ggtaccggat ccaattcccg atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct 1384 taagattgaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg 1444 ttaagcatgt aataattaac: atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gtttttatga 1504 ttagagtccc gcaattatac atttaatacg cgatagaaaa caaaatatag cgcgcaaact 1564 aggataaatt atcgcgcgcg gtgtcatcta tgttactaga tcggggatcg atccccgggc 1624 ggccgc 1630 <210> 24 <211> 144 <212 > PRT <2i3 > Secuencia Artificial <400> 24 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210>25 <211> 2122 <212>ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cassette de expresión que comprende promotor de planta ligado a secuencia que codifica AMPA acetil transferasa ligada a secuencia de terminación <220> <221 > promotor <222> (6)..(620) <220> <221 > 5'UTR <222> (645)..(715) <220> <221 > intron <222> (729)..(1 178) <220> <221> péptido de tránsito <222> (1179)..(1406) <220> <221>CDS <222>(1407)..(1838) <220> <221> terminador <222>(1849)..(2082) <400> 25 ctgcaggtcc gatgtgagac ttttcaacaa agggtaatat ccggaaacct cctcggattc 60 cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg aaaaggaagg tggctcctac 120 aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag atgcctctgc cgacagtggt 180 cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa aagaagacgt tccaaccacg 240 tcttcaaagc aagtggattg atgtgatggt ccgatgtgag acttttcaac aaagggtaat 300 atccggaaac ctcctcggat; tccattgccc agctatctgt cactttattg tgaagatagt 360 ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat aaaggaaagg ccatcgttga 420 agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca cccacgagga gcatcgtgga 480 aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat tgatgtgata tctccactga 540 cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac ccttcctcta tataaggaag 600 ttcatttcat ttggagagga cacgctgaca agctgactct agcagatcct ctagaaccat 660 cttccacaca ctcaagccac actattggag aacacacagg gacaacacac cataagatcc 720 aagggaggcc tccgccgccg ccggtaacca ccccgcccct ctcctctttc tttctccgtt 780 tttttttccg tctcggtctc gatctttggc cttggtagtt tgggtgggcg agaggcggct 840 tcgtgcgcgc ccagatcggt gcgcgggagg ggcgggatct cgcggggaat ggggctctcg 900 gatgtagatc tgcgatccgc cgttgttggg ggagatgatg gggcgtttaa aatttcgccg 960 tgctaaacaa gatcaggaacj aggggaaaag ggcactatgg tttatatttt tatatatttc 1020 tgctgcttcg tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc ttctttttgt gggtagaatt 1080 taatccctca gcattgttca tcggtagttt ttcttttcat gatttcgtga caaatgcagc 1140 ctcgtgcgga gcttttttg aggtagaagt gatcaaccat ggcgcaagtt agcagaatct 1200 gcaatggtgt gcagaaccca tctcttatct ccaatctctc gaaatccagt caacgcaaat 1260 ctcccttatc ggtttctctg aagacgcagc agcatccacg agcttatccg atttcgtcgt 1320 cgtggggatt gaagaagagt. gggatgacgt taattggctc tgagcttcgt cctcttaagg 1380 tcatgtcttc tgtttccacg gcgtgc atg gcc gct tgc gag ctt cgc cca gcc 1433 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala acg cag tac gac acc gac gcc gtg tac gcg ctg atc tgc gag ctc aag 1481 Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys 10 15 20 25 cag gcg gag ttc gac cac cac gcc ttc cgc gtg ggc ttc aac gcc aac 1529 Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn 30 35 40 ctg cgc gac ccc aac atg cgc tac cat ctg gcg ctg ctt gat ggc gaa 1577 Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu 45 50 55 gtg gtc ggc atg atc ggc ctg cac ctc cag ttc cac ctg cat cat gtc 1625 Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu Gln Phe His Leu His His Val 60 65 70 aac tgg atc ggc gag atc cag gag ctg gtc gtg atg cca cag gcg agg 1673 Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg 75 80 85 ggt ctg aac gtc ggc age aag ctc ctg gcg tgg gcc gag gag gaa gcc 1721 Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala 90 95 100 105 agg cag gcc gga gcc gag atg acc gag ctc age acc aac gtg aag cgc 1769 Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg 110 115 120 cae gac gcg cac cgc ttc tac ctg cgc gaa ggc tac gag cag age cac 1817 His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His 125 130 135 ttc cgc ttc acc aag gcg ctg taaagatctg aattctgcat gcgtttggac 1868 Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 140 gtatgctcat tcaggttgga gccaatttgg ttgatgtgtg tgcgagttct tgcgagtctg 1928 atgagacatc tctgtattgt gtttctttcc ccagtgtttt ctgtacttgt gtaatcggct 1988 aatcgccaac agattcggcg atgaataaat gagaaataaa ttgttctgat tttgagtgca 2048 aaaaaaaagg aattagatct gtgtgtgttt tttggatccc cggggcggcc gccccgggtg 2108 gtgagcttct gcag <210> 26 <211 > 144 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 26 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210> 27 <21 1 > 2378 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cassette de expresión que comprende un promotor de planta ligado a un intron, una secuencia que codifica una AMPA acetiltransferasa, y una secuencia de terminación <220> <221> promotor <222> (28).. (965) <220> <221 > intron <222> (966)..(1423) <220> <221> péptido de tránsito <222> (1440)..(1667) <220> <221> CDS <222> (1668)..(2099) <220> <221> terminador <222> (2114) .. (2369) <400> 27 gatatcccta gggcggccgc gttaacaagc ttactcgagg tcattcatat gcttgagaag 60 agagtcggga tagtccaaaa taaaacaaag gtaagattac ctggtcaaaa gtgaaaacat 120 cagttaaaag gtggtataaa gtaaaatatc ggtaataaaa ggtggcccaa agtgaaattt 180 actcttttct actattataa aaattgagga tgtttttgtc ggtactttga tacgtcattt 240 ttgtatgaat tggtttttaa gtttattcgc ttttggaaat gcatatctgt atttgagtcg 300 ggttttaagt tcgtttgct; ttgtaaatac agagggattt gtataagaaa tatctttaga 360 aaaacccata tgctaatttg acataatttt tgagaaaaat atatattcag gcgaattctc 420 acaatgaaca ataataagat taaaatagct ttcccccgtt gcagcgcatg ggtatttttt 480 ctagtaaaaa taaaagataa acttagactc aaaacattta caaaaacaac ccctaaagtt 540 cctaaagccc aaagtgctat ccacgatcca tagcaagccc agcccaaccc aacccaaccc 600 agcccacccc agtccagcca actggacaat agtctccaca cccccccact atcaccgtga 660 gttgtccgca cgcaccgcac gtctcgcagc caaaaaaaaa aagaaagaaa aaaaagaaaa 720 agaaaaaaca gcaggtgggt ccgggtcgtg ggggccggaa acgcgaggag gatcgcgagc 780 cagcgacgag gccggccctc cctccgcttc caaagaaacg ccccccatcg ccactatata 840 catacccccc cctctcctcc catcccccca accctaccac caccaccacc accacctcca 900 cctcctcccc cctcgctgcc ggacgacgag ctcctccccc ctccccctcc gccgccgccg 960 cgccggtaac caccccgccc ctctcctctt tctttctccg tttttttttc cgtctcggtc 1020 tcgatctttg gccttggtag tttgggtggg cgagaggcgg cttcgtgccg cccagatcgg 1080 tgcgcgggag gggcgggatc tcgcggctgg ctctcgcccc cgtggatccg gcccggatct 1140 cgcggggaat ggggctctcg gatgtagatc tgcgatccgc cgttgttggg gccgatgatg 1200 gggcccttaa aatttccgcc gtgctaaaca agatcaggaa gaggggaaaa gggcactatg 1260 gtttatattt ttatatattt ctgctgcttc gtcaggctta gatgtgctag atctttcttt 1320 cttctttttg tgggtagaat ttaatccctc agcattgttc atcggtagtt tttcttttca 1380 tgattcgtga caaatgcagc ctcgtgcgga cgtttttttg taggtagaag tgatcaacca 1440 tggcgcaagt tagcagaatc tgcaatggtg tgcagaaccc atctcttatc tccaatctct 1500 cgaaatccag tcaacgcaaa tctcccttat cggtttctct gaagacgcag cagcatccac 1560 gagcttatcc gatttcgtcg tcgtggggat tgaagaagag tgggatgacg ttaattggct 1620 ctgagcttcg tcctcttaag gtcatgtctt ctgtttccac ggcgtgc atg gcc gct 1676 Met Ala Ala tgc gag ctt cgc cca gcc acg cag tac gac acc gac gcc gtg tac gcg 1724 Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr Ala 5 10 15 ctg atc tgc gag ctc aag cag gcg gag ttc gac cac cac gcc ttc cgc 1772 Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe Arg 20 25 30 35 gtg ggc ttc aac gcc aac ctg cgc gac ccc aac atg cgc tac cat ctg 1820 Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His Leu 40 45 50 gcg ctg ctt gat ggc gaa gtg gtc ggc atg atc ggc ctg cac ctc cag 1868 Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu Gln 55 60 65 ttc cac ctg cat cat gtc aac tgg atc ggc gag atc cag gag ctg gtc 1916 Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu Val 70 75 80 gtg atg cca cag gcg agg ggt ctg aac gtc ggc age aag ctc ctg gcg 1964 Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu Ala 85 90 95 tgg gcc gag gag gaa gcc agg cag gcc gga gcc gag atg acc gag ctc 2012 Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu Leu 100 105 110 115 age acc aac gtg aag cgc cac gac gcg cac cgc ttc tac ctg cgc gaa 2060 Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg Glu 120 125 130 ggc tac gag cag age cac ttc cgc ttc acc aag gcg ctg taaagatctg 2109 Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 135 140 aattcccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 2169 tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 2229 gtaatgcatg acgttatttai tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 2289 ttaatacgcg atagaaaacaí aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 2349 gtcatctatg ttactagatc ggggatatc 2378 <210>28 <211> 144 <212>PRT <213> Secuencia Artificial <400> 28 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210> 29 <21 1 > 2107 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cassette de expresión que comprende promotor operable en planta ligado a una guía, intron, una secuencia que codifica una AMPA acetiltransferasa, y una secuencia de terminación <220> <221 > promotor <222> (26)..(590) <220> <221> 5'UTR <222> (615)..(685) <220> <221> intron <222> (699).. (1148) <220> <221> péptido de tránsito <222> (1149).. (1426) <220> <221 > CDS <222>(1427)..(1858) <220> <221> terminador <222>(1869)..(2102) <400> 29 .gcggccgcgt taacaagctt. ctgcaggtcc gatgtgagac ttttcaacaa agggtaatat 60 -ccggaaacct cctcggattc cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 120 aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 180 atgcctctgc cgacagtggt cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 240 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatggt ccgatgtgag 300 acttttcaac aaagggtaat atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 360 cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 420 aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 480 cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 540 tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac 600 ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaca agctgactct 660 agcagatcct ctagaaccat cttccacaca ctcaagccac actattggag aacacacagg 720 gacaacacac cataagatcc aagggaggcc tccgccgccg ccggtaacca ccccgcccct 780 ctcctctttc tttctccgtt tttttttccg tctcggtctc gatctttggc cttggtagtt 840 tgggtgggcg agaggcggct tcgtgcgcgc ccagatcggt gcgcgggagg ggcgggatct 900 cgcggggaat ggggctctcg gatgtagatc tgcgatccgc cgttgttggg ggagatgatg 960 gggcgtttaa aatttcgccg tgctaaacaa gatcaggaag aggggaaaag ggcactatgg 1020 tttatatttt tatatatttc tgctgcttcg tcaggcttag atgtgctaga tctttctttc 1080 ttctttttgt gggtagaatt taatccctca gcattgttca tcggtagttt ttcttttcat 1140 gatttcgtga caaatgcagc ctcgtgcgga gcttttttgt aggtagaagt gatcaaccat 1200 ggcgcaagtt agcagaatct gcaatggtgt gcagaaccca tctcttatct ccaatctctc 1260 gaaatccagt caacgcaaat ctcccttatc ggtttctctg aagacgcagc agcatccacg 1320 agcttatccg atttcgtcgt cgtggggatt gaagaagagt gggatgacgt taattggctc 1380 tgagcttcgt cctcttaagg tcatgtcttc tgtttccacg gcgtgc atg gcc gct 1435 Met Ala Ala tgc gag ctt cgc cca gcc acg cag tac gac acc gac gcc gtg tac gcg 1483 Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr Ala 5 10 15 ctg atc tgc gag ctc aag cag gcg gag ttc gac cac cac gcc ttc cgc 1531 Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe Arg 20 25 30 35 gtg ggc ttc aac gcc aac ctg cgc gac ccc aac atg cgc tac cat ctg 1579 Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His Leu 40 45 50 gcg ctg ctt gat ggc gaa gtg gtc ggc atg atc ggc ctg cac ctc cag 1627 Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu Gln 55 60 65 ttc cac ctg cat cat gtc aac tgg atc ggc gag atc cag gag ctg gtc 1675 Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu Val 70 75 80 gtg atg cca cag gcg agg ggt ctg aac gtc ggc age aag ctc ctg gcg 1723 Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu Ala 85 90 95 tgg gcc gag gag gaa gcc agg cag gcc gga gcc gag atg acc gag ctc 1771 Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu Leu 100 105 110 115 age acc aac gtg aag cgc cac gac gcg cac cgc ttc tac ctg cgc gaa 1819 Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg Glu 120 125 130 ggc tac gag cag age cac ttc cgc ttc acc aag gcg ctg taaagatctg 1868 Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 135 140 aattctgcat gcgtttggac gtatgctcat tcaggttgga gccaatttgg ttgatgtgtg 1928 tgcgagttct tgcgagtctg atgagacatc tctgtattgt gtttctttcc ccagtgtttt 1988 ctgtacttgt gtaatcggct aatcgccaac agattcggcg atgaataaat gagaaataaa 2048 ttgttctgat tttgagtgca aaaaaaaagg aattagatct gtgtgtgttt tttggatcc 2107 <210>30 <211> 144 <212>PRT <213> Secuencia Artificial <400> 30 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140 <210> 31 <211> 2436 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de secuencia artificial: cassette de expresión de monocotiledónea que comprende promotor operable en planta ligado a un intron, una secuencia codificadora para una AMPA acetiltransferasa, y una secuencia de terminación <220> <221> promotor <222> (26)..(640) <220> <221> intron <222> (670).. (1473) <220> <221> péptido de tránsito <222> (1498)..(1725) <220> <221> CDS <222> (1726)..(2157) <220> <221 > terminador <222> (2172)..(2427) <400> 31 gcggccgcgt taacaagctt ctgcaggtcc gatgtgagac ttttcaacaa agggtaatat 60 ccggaaacct cctcggatt cattgcccag ctatctgtca ctttattgtg aagatagtgg 120 aaaaggaagg tggctcctac aaatgccatc attgcgataa aggaaaggcc atcgttgaag 180 atgcctctgc cgacagtggt. cccaaagatg gacccccacc cacgaggagc atcgtggaaa 240 aagaagacgt tccaaccacg tcttcaaagc aagtggattg atgtgatggt ccgatgtgag 300 acttttcaac aaagggtaat. atccggaaac ctcctcggat tccattgccc agctatctgt 360 cactttattg tgaagatagt ggaaaaggaa ggtggctcct acaaatgcca tcattgcgat 420 aaaggaaagg ccatcgttga agatgcctct gccgacagtg gtcccaaaga tggaccccca 480 cccacgagga gcatcgtgga aaaagaagac gttccaacca cgtcttcaaa gcaagtggat 540 tgatgtgata tctccactga cgtaagggat gacgcacaat cccactatcc ttcgcaagac 600 ccttcctcta tataaggaag ttcatttcat ttggagagga cacgctgaca agctgactct 660 agcagatcta ccgtcttcgg tacgcgctca ctccgccctc tgcctttgtt actgccacgt 720 ttctctgaat gctctcttgt gtggtgattg ctgagagtgg tttagctgga tctagaatta 780 cactctgaaa tcgtgttctg cctgtgctga ttacttgccg tcctttgtag cagcaaaata 840 tagggacatg gtagtacgaa acgaagatag aacctacaca gcaatacgag aaatgtgtaa 900 tttggtgctt agcggtattt atttaagcac atgttggtgt tatagggcac ttggattcag 960 aagtttgctg ttaatttagg cacaggcttc atactacatg ggtcaatagt atagggattc 1020 atattatagg cgatactata ataatttgtt cgtctgcaga gcttattatt tgccaaaatt 1080 agatattcct attctgtttt tgtttgtgtg ctgttaaatt gttaacgcct gaaggaataa 1140 atataaatga cgaaattttg atgtttatct ctgctccttt attgtgacca taagtcaaga 1200 tcagatgcac ttgttttaaa tattgttgtc tgaagaaata agtactgaca gtattttgat 1260 gcattgatct gcttgtttgt tgtaacaaaa tttaaaaata aagagtttcc tttttgttgc 1320 tctccttacc tcctgatggt atctagtatc taccaactga cactatattg cttctcttta 1380 catacgtatc ttgctcgatg ccttctccct agtgttgacc agtgttactc acatagtctt 1440 tgctcatttc attgtaatgc agataccaag cggcctctag aggatccagg agcaaccatg 1500 gcgcaagtta gcagaatctg caatggtgtg cagaacccat ctcttatctc caatctctcg 1560 aaatccagtc aacgcaaatc tcccttatcg gtttctctga agacgcagca gcatccacga 1620 gcttatccga tttcgtcgtc gtggggattg aagaagagtg ggatgacgtt aattggctct 1680 gagcttcgtc ctcttaaggt catgtcttct gtttccacgg cgtgc atg gcc gct tgc 1737 Met Ala Ala Cys gag ctt cgc cca gcc acg cag tac gac acc gac gcc gtg tac gcg ctg 1785 Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala Val Tyr Ala Leu 5 10 15 20 atc tgc gag ctc aag cag gcg gag ttc gac cac cac gcc ttc cgc gtg 1833 He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His Ala Phe Arg Val 25 30 35 ggc ttc aac gcc aac ctg cgc gac ccc aac atg cgc tac cat ctg gcg 1881 Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg Tyr His Leu Ala 5 40 45 50 ctg ctt gat ggc gaa gtg gtc ggc atg atc ggc ctg cac ctc cag ttc 1929 Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu His Leu Gln Phe 55 60 65 cac ctg cat cat gtc aac tgg atc ggc gag atc cag gag ctg gtc gtg 1977 His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln Glu Leu Val Val 70 75 80 atg cca cag gcg agg ggt ctg aac gtc ggc age aag ctc ctg gcg tgg 2025 Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys Leu Leu Ala Trp Q 85 90 95 100 gcc gag gag gaa gcc agg cag gcc gga gcc gag atg acc gag ctc age 2073 Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met Thr Glu Leu Ser 105 110 115 acc aac gtg aag cgc cac gac gcg cac cgc ttc tac ctg cgc gaa ggc 2121 Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr Leu Arg Glu Gly 120 125 130 tac gag cag age cac ttc cgc ttc acc aag gcg ctg taaagatctg 2167 Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 135 140 5 aattcccgat cgttcaaaca tttggcaata aagtttctta agattgaatc ctgttgccgg 2227 tcttgcgatg attatcatat aatttctgtt gaattacgtt aagcatgtaa taattaacat 2287 gtaatgcatg acgttattta tgagatgggt ttttatgatt agagtcccgc aattatacat 2347 ttaatacgcg atagaaaaca aaatatagcg cgcaaactag gataaattat cgcgcgcggt 2407 gtcatctatg ttactagatc ggggatatc 2436 <210> 32 <211> 144 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <400> 32 Met Ala Ala Cys Glu Leu Arg Pro Ala Thr Gln Tyr Asp Thr Asp Ala 1 5 10 15 Val Tyr Ala Leu He Cys Glu Leu Lys Gln Ala Glu Phe Asp His His 20 25 30 Ala Phe Arg Val Gly Phe Asn Ala Asn Leu Arg Asp Pro Asn Met Arg 35 40 45 Tyr His Leu Ala Leu Leu Asp Gly Glu Val Val Gly Met He Gly Leu 50 55 60 His Leu Gln Phe His Leu His His Val Asn Trp He Gly Glu He Gln 65 70 75 80 Glu Leu Val Val Met Pro Gln Ala Arg Gly Leu Asn Val Gly Ser Lys 85 90 95 Leu Leu Ala Trp Ala Glu Glu Glu Ala Arg Gln Ala Gly Ala Glu Met 100 105 110 Thr Glu Leu Ser Thr Asn Val Lys Arg His Asp Ala His Arg Phe Tyr 115 120 125 Leu Arg Glu Gly Tyr Glu Gln Ser His Phe Arg Phe Thr Lys Ala Leu 130 135 140

Claims (36)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES 1.- Una planta recombinante que comprende una secuencia de polinucleótido que codifica una AMPA-N-acetiltransferasa que comprende: (a) una secuencia de promotor que es funcional en plantas, ligada operativamente a: (b) una secuencia de ADN estructural que codifica dicha acetiltransferasa, ligada operativamente a: (c) una secuencia 3' que funciona en plantas para ocasionar terminación de transcripción; en donde la expresión de dicha acetiltransferasa en tejido de planta confiere tolerancia a AMPA a dicha planta. 2.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha acetiltransferasa está localizada en plástidos o cloroplastos de dicha planta. 3.- La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha secuencia de ADN comprende una secuencia 5' que codifica un péptido amino-terminal de tránsito de cloroplasto, ligado operativamente en 5' a dicha secuencia de ADN, en donde la expresión de dicha secuencia de ADN produce un péptido de fusión que hace que dicha acetiltransferasa sea localizada hacia los cloroplastos o plástidos de dicha planta. 4.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque dicha acetiltransferasa transfiere un grupo acilo de un compuesto donador acetilado hacia la amina terminal de AMPA. 5.- La planta de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque dicho donador acetilado es una acil-coenzima A, siendo seleccionada dicha acil-coenzima A del grupo que consiste de acetil-coenzima A, propionil-coenzima A, malonil-coenzima A, succinil-coenzima A y metilmalonil-coenzima A. 6.- La planta de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada además porque dicha acil-coenzima A es acetil-coenzima A. 7.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque se selecciona del grupo que consiste de maíz, trigo, algodón, arroz, soya, remolacha, cañóla, lino, cebada, colza oleaginosa, girasol, papa, tabaco, tomate, alfalfa, lechuga, manzana, álamo, pino, eucalipto, acacia, liquidámbar, ocozol, pino radiata, pino del incienso, abeto rojo, teca, alfalfa, trébol y otros cultivos de forraje, pastos para césped, palma de aceite, caña de azúcar, plátano, café, te, cacao, manzana, nuez, almendra, uva, cacahuate, legumbres, petunia, caléndula, vinca, begonia, geranio, pensamiento, impaciente, avena, sorgo y mijo. 8.- La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque la secuencia de promotor deriva de una secuencia de promotor de ADN viral de planta. 9.- La planta de conformidad con la reivindicación 8, caracterizada además porque dicha secuencia de promotor se selecciona del grupo que consiste de CaMV35S, FMV35S, CaMV35S incrementado, FMV35S incrementado, promotor del virus de mota amarilla de cornelina, y el promotor del virus de ADN baciliforme de caña de azúcar. 10.- La planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque la secuencia de ADN estructural es una secuencia del gen phnQ de E. coli como la que se describe en SEQ ID NO:3, o es una secuencia complementaria de la misma. 1 1.- La planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada además porque dicha secuencia de ADN estructural codifica un péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO:4 y SEQ ID NO:8. 12.- La planta de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizada además porque la secuencia de ADN estructural deriva de un microbio, en donde dicha secuencia de gen es una secuencia de polinucleótido capaz de hibridar con una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:1 1 , SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18 y SEQ ID NO:19, o es una secuencia complementaria de la misma. 13.- La planta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque la acetiltransferasa es sustancialmente similar a un péptido PhnO de E. coli, que funciona en plantas para transferir un grupo acilo de un compuesto donador acetilado a la amina terminal de un herbicida de fosfonato. 14.- La planta de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque dicho herbicida de fosfonato se selecciona del grupo que consiste de glifosato y AMPA. 15.- La planta de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada además porque la secuencia 5' que codifica un péptido aminoterminal de tránsito de cloroplasto, se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:11 , SEQ ID NO:13 y SEQ ID NO:14. 16.- La planta de conformidad con la reivindicación 2, caracterizada además porque dicha planta exhibe tolerancia a AMPA. 17.- Una semilla producida de la planta que se reclama en la reivindicación 1, en donde dicha semilla comprende dicha secuencia de polinucleótido. 18.- Una planta desarrollada de la semilla como la que se reclama en la reivindicación 17. 19.- Una planta recombinante transformada establemente, tolerante a herbicida, que contiene una secuencia de polinucleótido que comprende: (a) una secuencia de promotor funcional en plantas, ligada operativamente a: (b) una secuencia de ADN estructural que codifica una enzima aciltransferasa, ligada operativamente a: (c) una secuencia 3' que funciona en plantas para ocasionar terminación de transcripción; en donde la secuencia de promotor es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural y ocasiona suficiente expresión de dicha enzima en tejido de planta para incrementar la tolerancia a herbicida de fosfonato de una planta transformada con dicha secuencia de polinucleótido; en donde dicha enzima transfiere un grupo acilo de un compuesto donador acilado a la amina terminal de un herbicida de fosfonato, y en donde dicha planta expresa un gen de GOX que codifica una enzima glifosato oxidoirreductasa funcional en planta. 20.- Un método para incrementar selectivamente la tolerancia a herbicida en una planta recombinante, que comprende los pasos de: (a) transformar dicha planta con una secuencia de polinucleótido que comprende: (i) una secuencia de promotor que funciona en plantas para ocasionar la producción de una secuencia de ARN, ligada operativamente a: (ii) una secuencia de ADN estructural que codifica para una secuencia de ARN que codifica una enzima aciltransferasa, ligada operativamente a: (iii) una secuencia 3' no traducida que funciona en plantas para ocasionar la adición de una secuencia de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de dicha secuencia de ARN; en donde la expresión de dicha enzima en tejido de planta confiere tolerancia a herbicida de fosfonato a dicha planta; en donde dicha enzima transfiere un grupo acilo de un substrato donador acilado a la amina terminal de un substrato herbicida de fosfonato, y en donde dicha planta expresa un gen de GOX que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa funcional en planta; y (b) expresar una cantidad efectiva tolerante a herbicida de dicha enzima aciltransferasa en dicha planta. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde dicha aciltransferasa es expresada de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:19. 22.- Un método para producir una planta tolerante a herbicida, transformada genéticamente, que comprende los pasos de: (a) insertar en el genoma de una célula de planta una secuencia de polinucleótido que comprende: (i) una secuencia de promotor que funciona en células de planta para ocasionar la producción de una secuencia de ARN, ligada operativamente a: (ii) una secuencia de ADN estructural que codifica para una secuencia de ARN que codifica una enzima aciltransferasa, que transfiere un grupo acilo de un donador acilado a la amina terminal de un substrato herbicida de fosfonato, ligada operativamente a: (iii) una secuencia 3' no traducida que funciona en células de planta para ocasionar la adición de una secuencia de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de dicha secuencia de ARN; en donde la expresión de dicha enzima en dicha célula de planta confíere tolerancia a herbicida de fosfonato a dicha célula de planta; (b) seleccionar una célula de planta transformada en presencia de una cantidad selectiva de células de planta, de un herbicida de fosfonato; y (c) regenerar una planta transformada genéticamente de la célula transformada. 23.- Un método para producir una planta tolerante a herbicida, transformada genéticamente, que comprende los pasos de: (a) insertar en el genoma de una célula de planta una secuencia de polinucleótido que comprende: (i) una secuencia de promotor que funciona en células de planta para ocasionar la producción de una secuencia de ARN, ligada operativamente a: (ii) una secuencia de ADN estructural que codifica para una secuencia de ARN que codifica una enzima aciltransferasa, que transfiere un grupo acilo de un donador acilado a la amina terminal de un substrato herbicida de fosfonato, ligada operativamente a: (iii) una secuencia 3' no traducida que funciona en células de planta para ocasionar la adición de una secuencia de nucleótidos poliadenilados al extremo 3' de dicha secuencia de ARN; en donde la secuencia de promotor es heteróloga con respecto a la secuencia de ADN estructural, y ocasiona suficiente expresión de dicha enzima en una célula de planta para incrementar la tolerancia a herbicida de una célula de planta transformada con dicha secuencia de polinucleótido, y en donde dicha célula de planta expresa un gen de GOX que codifica una enzima glifosato oxidorreductasa; (b) seleccionar una célula de planta transformada; y (c) regenerar de la célula de planta transformada una planta transformada genéticamente que exhibe tolerancia mejorada a herbicida de fosfonato. 24.- El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado además porque una célula de planta transformada se selecciona por medio de su capacidad para crecer en presencia de un agente selectivo, en donde dicho agente se selecciona del grupo que consiste de glifosato y AMPA. 25.- Un péptido aislado que comprende una enzima AMPA-N-aciltransferasa que cataliza la transferencia de un grupo acilo de un compuesto donador acilado a la amina terminal de AMPA. 26.- El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la enzima aciltransferasa está comprendida de una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:20. 27.- El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la enzima aciltransferasa se expresa en una célula partiendo de una secuencia de ADN seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:19. 28.- El péptido aislado de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado además porque la secuencia de ADN deriva de un microbio, siendo dicho microbio un miembro del género seleccionado del grupo que consiste de Enterobacteriaceae, Streptomyces, Bacillus, Actinobacillus, Ascomycota y Basidiomycota. 29.- Un método para seleccionar una o más células transformadas con un vector que contiene un gen que expresa una enzima AMPA-N-aciltransferasa que funciona para N-acilar un compuesto herbicida AMPA, que comprende los pasos de: (a) transformar una población de células con dicho vector; (b) incubar dichas células transformadas en presencia de una cantidad inhibidora de compuesto herbicida de fosfonato; (c) identificar una o más células que crecen en presencia de dicha cantidad inhibidora de dicho compuesto; y (d) aislar y purificar dichas células (una o más) que crecen en presencia de dicha cantidad inhibidora de dicho compuesto. 30.- El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde dicha enzima funciona en dichas células (una o más) para transferir un grupo acilo de un substrato donador acilado a la amina terminal de AMPA. 31.- El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el vector comprende un gen expresado en una célula hospedera. 32.- El método de conformidad con la reivindicación 31 , en donde la célula hospedera no es inhibida por la presencia de AMPA en una cantidad que sea inhibidora para una célula hospedera que carece de un gen que codifica una enzima AMPA-N-aciltransferasa funcional. 33.- El método de conformidad con la reivindicación 32, en donde dicha célula hospedera se selecciona del grupo que consiste de células de bacteria, células de hongo, células de animal y células de planta. 34.- El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde dicha célula hospedera es una célula de bacteria seleccionada de las especies bacterianas que consisten de Enterobacteriaceae, Mycobacteriaceae, Agrobacteriaceae, Actinobacteriaceae, Streptomyces y Bacillus. 35.- El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde dicha célula hospedera es una célula de hongo seleccionada de las especies de hongo que consisten de Ascomycota, Basidiomycota y Deuteromycota. 36.- El método de conformidad con la reivindicación 33, en donde la célula hospedera es una célula de planta seleccionada de las especies de planta que consisten de Glycine max, Zea mays, Nicotiana tabacum, Gossypium gossypia, Triticum aestivum y Brassica napus. 37.- Un anticuerpo aislado que se une a una secuencia de proteína aciltransferasa, en donde dicha aciltransferasa se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:8, SEQ ID NO:12 y SEQ ID NO:20. 38.- Un método para identificar un gen recombinante de AMPA-N-aciltransferasa en una muestra, que comprende, (a) proveer una o más secuencias de polinucleótido distintas capaces de hibridar con dicho gen; (b) proveer una muestra de referencia que comprende una o más secuencias de polinucleótido complementarias a dichas secuencias de polinucleótido distintas; y (c) proveer instrucciones para combinar dichas secuencias distintas, dicha muestra de referencia, y dicho gen recombinante de aciltransferasa, en una muestra, y (d) detectar el gen recombinante en dicha muestra; en donde dichas secuencias de polinucleótido distintas están comprendidas de secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:1 1 y SEQ ID NO:19. 39.- Un equipo para detectar la presencia de un gen recombinante de AMPA-N-aciltransferasa en una muestra, que comprende: (a) una o más secuencias de polinucleótido distintas capaces de hibridar con dicho gen; (b) una muestra de referencia que comprende una o más secuencias de polinucleótido complementarias a dichas secuencias de polinucleótido distintas; y (c) proveer instrucciones para combinar dichas secuencias distintas, dicha muestra de referencia, y dicho gen recombinante de aciltransferasa, en una muestra; empacados juntos en un equipo, en donde dichas secuencias de polinucleótido distintas están comprendidas de secuencias seleccionadas de SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:11 y SEQ ID NO:19. 40.- Una planta que comprende una secuencia de polinucleótido que contiene un gen que codifica una proteína AMPA-N-acetiltransferasa, en donde la expresión de dicho gen en dicha planta, estimula el crecimiento de dicha planta en comparación con el crecimiento de una planta de control.