MXPA01004177A

MXPA01004177A - Novedosa proteina receptora acoplada a la proteina g, adn y su ligando

Info

Publication number: MXPA01004177A
Application number: MXPA/A/2001/004177A
Authority: MX
Inventors: Takuya Watanabe; Yasuko Terao; Yasushi Shintani; Tetsuya Ohtaki; Kimiko Kanehashi; Chieko Kitada
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Priority date: 1998-10-27
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2001-12-13

Abstract

La presente invención se refiere a las proteínas receptoras acopladas a la proteína G derivada de cerebelo de rata y derivada de cerebro humano, o las sales de las mismas, sus péptidos parciales, amidas,ésteres o sales de las mismas, los ligandos para las mismas, un método/equipo para la selección de los compuestos que alteran la propiedad de enlace entre los ligandos y las proteínas receptoras acopladas a la proteína G, los compuestos obtenidos mediante la selección o sales de las mismas, y los anticuerpos para las proteínas receptoras acopladas a la proteína G. Las proteínas receptoras acopladas a la proteína G, derivadas de cerebro humano y derivadas de cerebelo de rata y similares, sonútiles:(1) para la determinación de un ligando para la proteína receptora de la presente invención (péptido ligando de la presente invención) (agonista), (2) como un agente para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades asociadas con la disfunción de la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención, (3) como un agente de diagnóstico genético, (4) para la cuantificación de un ligando para la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención, (5) para la selección de un compuesto (agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención y un ligando (péptido ligando de la presente invención), (6) como un agente para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades, que comprende un compuesto (agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención y un ligando (péptido ligando de la presente invención), (7) para la cuantificación de la proteína receptora, su péptido parcial o sales de la presente invención, (8) para la neutralización por anticuerpos para la proteína receptora, su péptido parcial o las sales de la presente invención y (9) para la preparación de un animal no humano que posee el ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G, de la presente invención.

Description

NOVEDOSA PROTEINA RECEPTORA ACOPLADA A LA PROTEINA G, ADN Y SU LIGANDO CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a una novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata y de cerebro de humanos, o las sales de la misma y el ADN que codifica para la misma, así como los péptidos que tienen una actividad de ligando a la proteína receptora acoplada a la proteína G, o las amidas o esteres de las sales de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Una variedad de hormonas y neurotransmisores regulan las funciones in vivo a través de proteínas receptoras específicas localizadas en una membrana celular. Muchas de estas proteínas receptoras son mediadoras de la transmisión de las señales intracelulares vía la activación de las proteínas que se enlazan al nucleótido guanina (de aquí en adelante algunas veces denominada como proteínas G) con las cuales se acopla el receptor. Estas proteínas receptoras poseen la estructura común, por ejemplo siete dominios transmembranales y son de este modo colectivamente REF: 128087 denominadas como receptores acoplados a la proteína G o receptores transmembranales siete (7TMR) . Las proteínas receptoras acopladas a la proteína G existen sobre cada superficie celular funcional de las células y órganos internos de un organismo viviente y juegan papeles muy importantes como objetivos de las moléculas, por ejemplo, hormonas, neurotransmisores, sustancias fisiológicamente activas y similares, cuyas moléculas controlan, regulan o ajustan las funciones de las células y los órganos internos en el organismo viviente. Estas proteínas receptoras son mediadoras de la transducción de señal en una célula mediante al enlace a sustancias fisiológicamente activas y diversas reacciones tales como la activación o inhibición de células son provocadas por la señal transmitida de este modo. Para aclarar la relación entre las sustancias que regulan las funciones complejas en células y órganos internos de diversos organismos vivientes y sus proteínas receptoras específicas, en particular, las proteínas receptoras acopladas a la proteína G, se podrían elucidar los mecanismos * funcionales de las células y los órganos internos en diversos organismos vivientes, y de este modo proporcionar un medio muy importante para el desarrollo de los fármacos que tienen estrecha relación a tales mecanismos funcionales.

Por ejemplo, en diversos órganos de un organismo viviente, las funciones fisiológicas son controladas a través de la regulación por muchas hormonas, sustancias similares a hormonas, neurotransmisores o sustancias fisiológicamente activas. En particular, las sustancias fisiológicamente activas presentes en varios sitios de un organismo viviente, regulan sus funciones fisiológicas a través de cada una de las proteínas receptoras correspondientes. Todavía más, existen muchas hormonas desconocidas, neurotransmisores u otras sustancias fisiológicamente activas que existen in vivo y únicamente han sido reportadas unas pocas proteínas receptoras sobre sus estructuras. Además, permanece todavía sin aclarar si existirán subtipos de proteínas receptoras conocidas. Es también muy importante para el desarrollo de los productos farmacéuticos aclarar la relación entre las sustancias que regulan las funciones complejas in vivo y sus proteínas receptoras específicas. Además, para la selección eficiente de los agonistas y antagonistas para las proteínas receptoras en el desarrollo de los productos farmacéuticos, era necesario elucidar las funciones de los genes de las proteínas receptoras, expresados in vivo, y expresar los genes en un sistema de expresión apropiado. En años recientes, el análisis aleatorio de las secuencias de ADNc ha sido activamente realizado como un método para analizar los genes expresados in vivo. Las secuencias de los fragmentos de ADNc obtenidos de este modo han sido registrados y publicados en las bases de datos como Marcador Secuencial Expresado (EST) . No obstante, ya que la mayoría de los EST contiene únicamente la información secuencial, la función es predecible únicamente con dificultad. Las sustancias que inhiben el enlace de las proteínas acopladas a la proteína G a sustancias fisiológicamente activas (por ejemplo ligandos) y sustancias que se enlazan a las sustancias fisiológicamente activas para inducir con esto las transducciones de señal similares a aquellas inducidas por las sustancias fisiológicamente activas (por ejemplo ligandos) han sido utilizadas para productos farmacéuticos como antagonistas o agonistas específicos para los receptores, para la regulación de las funciones biológicas. En consecuencia, es muy importante descubrir una nueva proteína receptora acoplada a la proteína G, que no sea solamente importante para la expresión fisiológica in vivo sino que pueda ser un objetivo para el desarrollo de productos farmacéuticos y para clonar los genes (por ejemplo, el ADNc) , en la búsqueda para un ligando específico, agonista, y antagonista del novedoso receptor acoplado a la proteína G.

No obstante, no todos los receptores acoplados a la proteína G han sido encontrados. Incluso ahora, existen muchos receptores acoplados a la proteína G, desconocidos, y aquellos para los cuales los ligandos correspondientes no están identificados, es decir, los receptores huérfanos. Se ha esperado de este modo seriamente el explorar un novedoso receptor acoplado a la proteína G y aclarar su función. Los receptores acoplados a la proteína G son útiles en la búsqueda para una nueva sustancia fisiológicamente activa (por ejemplo, ligando) utilizando la actividad de transducción de señal como un índice y en la búsqueda para agonistas y antagonistas del receptor. Incluso si no se encuentra el ligando fisiológico, los agonistas y antagonistas del receptor pueden ser preparados mediante el análisis de la actividad fisiológica del receptor a través de experimentos de inactivación del receptor (animal suprimido en algún gen) . Se espera que los ligandos, agonistas y antagonistas del receptor sean utilizados como fármacos profilácticos/terapéuticos y diagnósticos para enfermedades asociadas con la disfunción del receptor acoplado a la proteína G. La hipofunción o la hiperfunción del receptor acoplado a la proteína G debido a la variación genética del receptor in vivo, provoca algunos desórdenes en muchos casos. En este caso, el receptor acoplado a la proteína G puede ser utilizado no solamente para la administración de antagonistas o agonistas del receptor, sino también para la terapia por genes mediante transferencia del gen receptor dentro del cuerpo (o ciertos órganos específicos) o mediante la transferencia del ácido nucleico antisentido al gen receptor. En tal terapia génica, la información sobre la secuencia de bases del gen receptor es esencialmente requerida para la búsqueda de la supresión o mutación en el gen. El gen receptor es también aplicable como fármacos profilácticos/terapéuticos y de diagnóstico para enfermedades asociadas con la disfunción del receptor. Además, el hallazgo de un ligando endógeno para el receptor o una sustancia que tenga la actividad de ligando hace posible el construir el sistema para la selección de antagonistas o agonistas para el receptor.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona una novedosa y útil proteína receptora acoplada a la proteína G como se describe anteriormente. Es decir, la presente invención proporciona una novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, sus péptidos parciales y sales de la misma, así como los polinucleótidos (ADN y ARN, y derivados de los mismos) que contienen polinucleótidos (ADN y ARN, y derivados de los mismos) que codifican para la proteína receptora acoplada a la proteína G, y para sus péptidos parciales, los vectores recombinantes que contienen los polinucleótidos, los transformantes que poseen los vectores recombinantes, los métodos para la fabricación de la proteína receptora acoplada a la proteína G, y las sales de la misma, los anticuerpos para la proteína receptora acoplada a la proteína G, sus péptidos parciales y sales de la misma, los compuestos que alteran el nivel de expresión de dicha proteína receptora acoplada a la proteína G, los métodos para la determinación de los ligandos para la proteína receptora acoplada a la proteína G, los métodos para la selección de los compuestos (antagonistas y agonistas) y las sales de los mismos que alteran la propiedad de enlace de los ligandos y la proteína receptora acoplada a la proteína G, los equipos para el uso en el método de selección, los compuestos (antatonistas y agonistas) o las sales de los mismos que alteran la propiedad de enlace de los ligandos obtenibles mediante el método de selección, u obtenibles utilizando el equipo de selección y la proteína receptora acoplada a la proteína G, y las composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos (antagonistas y agonistas) que alteran la propiedad de enlace de los ligandos a la proteína receptora acoplada a la proteína G, o los compuestos o las sales de los mismos que alteran el nivel de expresión de la proteína receptora acoplada a la proteína G. Además, la presente invención proporciona los péptidos que tienen una actividad de ligando a la proteína receptora acoplada a la proteína G. Los inventores realizaron estudios extensos y como resultado, tuvieron éxito en el aislamiento del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G derivada del cerebelo de rata y de cerebro humano, con base en la información de EST preparada por el método de PCR degenerado, dando como resultado el análisis exitoso de la secuencia de bases completa del ADNc. La secuencia de aminoácidos deducida a partir de la secuencia de bases ha apoyado que el primero al séptimo dominios transmembranales fueron observados en el análisis de trazado gráfico hidrofóbico, confirmando que la proteína codificada por el ADNc es una proteína receptora acoplada a la proteína G transmembranal que pasa a través de la membrana siete veces. Los presentes inventores procedieron además a las investigaciones para explorar un péptido que tiene una actividad de incremento de nivel de iones Ca intracelular a las células que expresan la proteína receptora acoplada a la proteína G, utilizando los novedosos péptidos encontrados en algunos péptidos conocidos o en las bases de datos de genes. Como resultado, se ha aclarado que el péptido C-terminal de una proteína codificada por el gen KiSS-1 supresor de la metástasis del cáncer (Genomics, 54, 145-148, 1998) posee una actividad de activación del receptor. KiSS-1 es un gen que codifica para la proteína. Los inventores dirigieron su atención a la secuencia del péptido que consiste de 54 residuos de aminoácidos en KiSS-1 y sintetizaron los péptidos parciales C-terminales. El péptido fue proporcionado para las pruebas de reactividad con el receptor, para confirmar que el péptido tiene la actividad de ligando. Los péptidos obtenidos mediante la extirpación de los productos del gen KiSS-1 se espera que supriman la metástasis tumoral, ya que sus genes son genes supresores de la metástasis tumoral. Además, se espera que los genes jueguen un papel importante en la placenta, tomando en cuenta que el gen es abundantemente expresado en la placenta y hOT7T175, que es un receptor tipo humano de la proteína receptora acoplada a la proteína G, es expresada también abundantemente en la placenta. La expresión del receptor es relativamente abundante en páncreas humano, debido a que se espera que el péptido ejerza cualquier función fisiológica también en el páncreas.

Con base en estos hallazgos, los presentes inventores realizaron estudios extensivos y como resultado, la presente invención ha sido lograda. De este modo, la presente invención se refiere. a: (1) Una proteína y las sales de ella que contienen la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ ID NO: 1; (2) Una proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), en donde la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos es representada por la SEQ ID NO: 5; (3) Un péptido parcial de la proteína de acuerdo al inciso (1) o los esteres de la misma, o amidas de la misma o sales de la misma; (4) Un polinucleótido que contiene un polinucleótido que tiene la secuencia de bases que codifica para la proteína de acuerdo al inciso (1); (5) Un polinucléotido de acuerdo al inciso (4), que es ADN; (6) Un polinucléotido de acuerdo al inciso (4), el cual contiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6; (7) Un vector recombinante que contiene el polinucleótido de acuerdo al inciso (4); (8) Un transformante transformado por el vector recombinante de acuerdo al inciso (7); (9) Un método para fabricar la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1) , que comprende el cultivar el transformante de acuerdo al inciso (8) y producir y acumular la proteína de acuerdo al inciso (1) ; (10) Los anticuerpos para la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1) y al péptido parcial o esteres del mismo o amidas del mismo o sales del mismo, de acuerdo al inciso (3) ; (11) Los anticuerpos de acuerdo al inciso (10) que son anticuerpos neutralizados para inactivar la transducción de señal de la proteína de acuerdo al inciso (1) ; (12) Una composición de diagnóstico que comprende los anticuerpos de acuerdo al inciso (10); (13) Un ligando para la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que es obtenible utilizando la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), o utilizando el péptido parcial, los esteres del mismo, las amidas del mismo, o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) ; (14) Una composición farmacéutica que comprende el ligando de acuerdo al inciso (13) ; (15) Un método para determinar el ligando para la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), en donde la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, amidas del mismo, esteres del mismo o sales del mismo de acuerdo al inciso (3), son utilizados; (16) Un método para seleccionar un compuesto o sales del mismo, que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1) , que comprende el uso de la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1), o el péptido parcial o las amidas del mismo, esteres del mismo o sales del mismo de acuerdo al inciso (3) ; (17) Un equipo para la selección de un compuesto o sales del mismo, que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma, de acuerdo al inciso (1) , que comprende la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), el péptido parcial o esteres del mismo, amidas del mismo o sales del mismo de acuerdo al inciso (3), son utilizados; (18) Un compuesto o sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que es obtenible utilizando el método de selección de acuerdo al inciso (16) o el equipo de selección de acuerdo al inciso (17) ; (19) Una composición farmacéutica que comprende el compuesto o sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma, de acuerdo al inciso (1), que es obtenible utilizando el método de selección de acuerdo al inciso (16) o el equipo de selección de acuerdo al inciso (17); (20) Un método para cuantificar la proteína de conformidad con el inciso (1), que comprende el uso de los anticuerpos de acuerdo al inciso (10); (21) Un péptido, las amidas del mismo, o los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (21) , el cual, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos en el extremo N y comprende 8 a 54 residuos de aminoácidos; (22) Un péptido, las amidas del mismo, el éster del mismo o las sales del mismo, el cual, en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, contiene la secuencia de 47-54 aminoácidos N-terminales en el extremo C, y comprende 8 a 15 residuos de aminoácidos; (23) Las amidas o sales del péptido de acuerdo al inciso (21), que comprenden la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13 o SEQ ID NO: 14; (24) Un método para la selección de acuerdo al inciso (16), en donde el ligando es un péptido, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (21); y, (25) Un equipo para la selección de acuerdo al inciso (16), en donde el ligando es un péptido, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (21) . La presente invención proporciona además: (26) una proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1)' que comprende: (i) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 en la cual uno, dos, o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 9 aminoácidos, lo más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) están suprimidos; (ii) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, a la cual uno, dos o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, lo más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) son agregados;, (iii) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, en la cual uno, dos, o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, y lo más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) están sustituidos por otros aminoácidos; (iv) una combinación de las secuencias de aminoácidos anteriores; (27) Un método para seleccionar de acuerdo al inciso (16), en donde se hace la comparación entre el inciso (i) y el caso donde la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) son puestos en contacto con el ligando y (ii) el caso donde la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) son puestos en contacto con el ligando y un compuesto de prueba ;- (28) Un método para la selección de un compuesto o las sales del mismo, que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que comprende la medición y la comparación de (i) una cantidad de ligando marcado enlazado a la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3), donde el ligando marcado es puesto en contacto con la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) y (ii) una cantidad de ligando marcador enlazado a la proteína o las sales de la misma, de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial o las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) , donde el ligando marcado y un compuesto de prueba son puestos en contacto con la proteína o las sales de la misma, de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo, las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) ; (29) Un método para seleccionar un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma, de acuerdo al inciso (1), que comprende la medición y comparación de (i) una cantidad de ligando marcado enlazado a las células que contienen la proteína de acuerdo al inciso (1), después de poner al ligando marcado en contacto con las células, y (ii) una cantidad de ligando marcado enlazado a las células después de traer el ligando marcado y un compuesto de prueba en contacto con las células; (30) Un método para seleccionar un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que comprende la medición y la comparación de (i) una cantidad de ligando marcado enlazado a una fracción membranal de las células que contienen la proteína de acuerdo al inciso (1), después de poner al ligando marcado en contacto con la fracción membranal celular, y (ii) una cantidad de ligando marcado enlazado a una fracción membranal de las células después de poner el ligando marcado y un compuesto de prueba en contacto con la fracción de la membrana celular; (31) Un método para seleccionar un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre el ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que comprende la medición y comparación de (i) una cantidad de ligando marcado enlazado a una proteína expresada en la membrana celular del transformante del inciso (8) mediante el cultivo del transformante donde el ligando marcado es puesto en contacto con la proteína expresada, y (ii) una cantidad de ligando marcado enlazado a una proteína expresada en la membrana celular del transformante (8) mediante el cultivo del transformante donde el ligando marcado y un compuesto de prueba son puestos en contacto con la proteína expresada; (32) Un método para seleccionar un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) , que comprende la medición y comparación de (i) una actividad estimuladora de las células, mediada por proteína, en donde un compuesto que activa la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) es puesta en contacto con las células que contienen la proteína de acuerdo al inciso (1) y (ii) una actividad estimuladora de células mediada por la proteína, en donde un compuesto que activa la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) y un compuesto de prueba, son puestos en contacto con las células que contienen la proteína de acuerdo al inciso (1) ; (33) Un método para la selección de un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que comprende la medición y comparación de (i) una actividad estimuladora de las células mediada por proteína, en donde el compuesto que activa la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) es puesto en contacto con una proteína expresada en una membrana celular del transformante de acuerdo al inciso (8) mediante el cultivo del transformante y (ii) una actividad estimuladora celular mediada por proteína, en donde un compuesto que activa la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) y un compuesto de prueba, son puestos en contacto con una proteína expresada en una membrana celular del transformante de acuerdo al inciso (8), mediante el cultivo del transformante; (34) Un método para seleccionar de acuerdo al inciso (32) o (33) , en donde el compuesto que activa la proteína de acuerdo al inciso (1) es un péptido, amidas del mismo, esteres del mismo o sales del mismo de acuerdo al inciso (21) ; (35) ün compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína receptora acoplada a la proteína G o las sales de la misma, de acuerdo al inciso (1), que es obtenible mediante el método para la selección de acuerdo al inciso (27) al (34); (36) Una composición farmacéutica que comprende un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que es obtenible mediante el método para la selección de acuerdo a los incisos (27) al (34); (37) Un equipo para selección de acuerdo al inciso (17), que comprende una célula que contiene la proteína de acuerdo al inciso (1); (38) Un equipo para la selección de acuerdo al inciso (17), que comprende una fracción de membrana celular de la célula que contiene la proteína de acuerdo al inciso (1); (39) Un equipo para la selección de acuerdo al inciso (17), que comprende una proteína expresada en una membrana celular del transformante de acuerdo al inciso (8) mediante el cultivo del transformante; (40) Un compuesto o las sales del mismo, que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), que es obtenible utilizando el equipo para la selección de acuerdo a los incisos (37) al (39); (41) Una composición farmacéutica que comprende un compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína receptora acoplada a la proteína G o las sales del mismo de acuerdo al inciso (1) que es obtenible utilizando el equipo para la selección de acuerdo a los incisos (37) al (39); (42) Un método para cuantificar la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3), que comprende el poner los anticuerpos de acuerdo al inciso (10) en contacto con la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales de acuerdo al inciso (3); (43) Un método para cuantificar la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3), en una solución de muestra, que comprende el hacer reaccionar competitivamente los anticuerpos de acuerdo al inciso (10), con una solución de muestra y la proteína marcada o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial marcado, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) y, la medición de la proporción de la proteína marcada o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1) o el péptido parcial marcado, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3) , que se enlazan a los anticuerpos; y (44) Un método para cuantificar la proteína o las sales de la misma de acuerdo al inciso (1), o el péptido parcial, las amidas del mismo, los esteres del mismo o las sales del mismo de acuerdo al inciso (3), en una solución de muestra, que comprende el hacer reaccionar una solución de muestra simultánea o secuencialmente con los anticuerpos del inciso (10) inmovilizados sobre un portador y los anticuerpos marcados de acuerdo al inciso (10) y luego midiendo la actividad de un agente de marcación sobre el portador inmovilizado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra la secuencia de bases del ADN que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7T175 derivada de cerebelo de rata, de la presente invención, obtenida en el Ejemplo 1, y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN (continúa en la Figura 2) . La Figura 2 muestra la secuencia de bases del ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7T175 derivada de cerebelo de rata, de la presente invención, obtenida en el Ejemplo 1, y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN (continúa de la Figura 1, continúa a la Figura 3) . La Figura 3 muestra la secuencia de bases del ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7T175 derivada de cerebelo de rata, de la presente invención, obtenida en el Ejemplo 1, y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN (continúa de la Figura 2) . La Figura 4 muestra el trazado gráfico hidrofóbico de la proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7T175 derivada de cerebelo de rata, de la presente invención, preparada con base en la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 1 a la 3.

La Figura 5 muestra la secuencia de base del ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7T175 derivada de cerebro humano, de la presente invención, obtenida en el Ejemplo 2, y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN (continúa en la Figura 6) . La Figura 6 muestra la secuencia de base del ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7Tl75 derivada de cerebro humano, de la presente invención, obtenida en el Ejemplo 2, y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN (continúa de la Figura 5, continúa a la Figura 7) . La Figura 7 muestra la secuencia de base del ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G rOT7Tl75 derivada de cerebro humano, de la presente invención, obtenida en el Ejemplo 2, y la secuencia de aminoácidos deducida de la secuencia de ADN (continúa de la Figura 6) . La Figura 8 muestra el trazado hidrofóbico de la proteína receptora acoplada a la proteína G, rOT7T175 derivada de cerebro humano, de la presente invención, preparada con base en la secuencia de aminoácidos mostrada en las Figuras 5 a la 7.

La Figura 9 muestra los resultados de la medición de la actividad de incremento de nivel de los iones calcio intracelular, probada en el Ejemplo 3 (1-2) .

MEJOR MODALIDAD DE LA INVENCIÓN La proteína de la presente invención (proteína receptora, proteína receptora acoplada a la proteína G, de aquí en adelante frecuentemente denominada como "proteína receptora de la presente invención") es la proteína que tiene la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos de aquella representada por la SEQ ID NO: 1 (la secuencia de aminoácidos mostrada por las Figuras 1 a la 3). La proteína receptora de la presente invención puede ser cualquier péptido derivado de cualesquiera células de humano y de otro mamífero (por ejemplo, cobayos, ratas, ratones, conejos, cerdos, ovejas, bovinos, monos, etc.), por ejemplo las células del bazo, células nerviosas, células gliales, células ß del páncreas, células de la médula ósea, células mesangiales, células de Langerhans, células epidérmicas, células epiteliales, células endoteliales, fibroblastos, fibrocitos, células musculares, células grasas, inmunocitos (por ejemplo, macrófagos, células T células B, células asesinas naturales, mastocitos, neutrófilos, basófilos, eosinófilos, monocitos, etc.), megacariocitos, células sinoviales, condrocitos, osteocitos, osteoblastos, osteoclastos, células de glándulas mamarias, hepatocitos o células intersticiales, o células precursoras, células totipotenciales o células cancerosas de estas células y similares; células del tipo hemocito; o cualesquiera tejidos que contengan tales células, por ejemplo, cerebro, diversas partes del cerebro, por ejemplo, bulbo olfatorio, amígdalas, ganglios básales cerebrales, hipocampo, tálamo, hipotálamo, núcleo sustanlámico, corteza cerebral, médula oblongada, cerebelo, polo occipital, lóbulo frontal, lóbulo temporal, putamen, núcleo caudato, cuerpo calloso, sustancia nigra) , médula espinal, pituitaria, estómago, páncreas, riñon, hígado, glándulas genitales, glándula tiroides, vesícula biliar, médula ósea, glándulas adrenales, piel, músculo, pulmón, tracto digestivo '(por ejemplo, intestino grueso, intestino delgado) , vasos sanguíneos, corazón, timo, bazo, glándula submandibular, sangre periférica, hemocitos periféricos, próstata, testículos, ovarios, placenta, útero, hueso, articulaciones, músculo esquelético y similares, en particular, cerebro y diversas partes del cerebro. El péptido puede también ser uno sintético. La secuencia de aminoácidos que tiene la misma o sustancialmente la misma que aquella representada por la SEQ ID NO: 1, incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50% de homología, preferentemente al menos aproximadamente 70% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente 80% de homología, lo más preferentemente al menos preferentemente 90% de homología, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95% de homología, a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1. Los ejemplos específicos de la proteína incluyen una proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5 (la secuencia de aminoácidos representada por las Figuras 5-7) . Un ejemplo preferido de la proteína que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que aquella representada por la SEQ ID NO: 1 es una proteína que tiene sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que aquella representada por la SEQ ID NO: 1 y que tiene sustancialmente la misma actividad que aquella de la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1. Los ejemplos de sustancialmente la misma actividad incluyen la actividad de enlace al ligando, la actividad de transducción de la señal y similares. El término "sustancialmente la misma" es utilizada para dar a entender que las naturalezas de sus actividades son iguales una a la otra. Es de este modo preferido que aunque la actividad tal como una actividad de enlace al ligando o la actividad de transducción a la señal sean iguales (por ejemplo aproximadamente 0.01 a 100 veces, preferentemente aproximadamente 0.5 a 20 veces, más preferentemente aproximadamente 0.5 a dos veces), los factores cuantitativos tales como los grados de estas actividades y el peso molecular de las proteínas pueden diferir uno del otro. Las actividades tales como la actividad de enlace al ligando o la actividad de transducción de la señal pueden ser determinadas de acuerdo a un método públicamente conocido, por ejemplo, mediante el método para determinación de los ligandos o el método de selección que serán descritos posteriormente. La proteína receptora de la presente invención la cual puede ser utilizada puede ser una proteína que comprende (i) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, en la cual uno, dos, o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, más preferentemente varios (1 ó 2 aminoácidos) están suprimidos; (ii) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, a la cual uno, dos o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) son agregados; (iii) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, en la cual uno, dos o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, y más preferentemente varios (1 ó 2 aminoácidos) están sustituidos por otros aminoácidos; y (iv) una combinación de la secuencia de aminoácidos anteriores. La proteína receptora de la presente invención, la cual puede ser utilizada, puede también ser una proteína que comprende (i) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5, en la cual uno, dos o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, y más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) están suprimidos; (ii) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5, a la cual uno, dos o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, y más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) son agregados; (iii) una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5, en la cual uno, dos o más aminoácidos (preferentemente 1 a 30 aminoácidos, más preferentemente 1 a 10 aminoácidos, y más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) están sustituidos por otros aminoácidos; y (iv) una combinación de las secuencias de aminoácidos anteriores.

La proteína receptora de la presente invención es designada por la manera reconocida en la técnica de describir los péptidos. Es decir, el extremo izquierdo (amino-terminal) es N-terminal y el extremo derecho (carboxilo terminal) es C-terminal. En la proteína receptora de la presente invención que comprende una secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, el C-terminal es normalmente el grupo carboxilo (-COOH) o carboxilato (-COO") , pero el C-terminal puede ser una amida (-CONH2) o un éster (-COOR) . Los ejemplos del grupo éster mostrados por R incluyen un grupo alquilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, etc.; un grupo cicloalquilo que tiene 3 a 8 átomos de carbono tal como ciclopentilo, ciciohexilo, etc.; un grupo arilo que tiene 6 a 12 átomos de carbono tales como fenilo, a-naftilo, etc. un aralquilo que tiene de 7 a 14 átomos de carbono tal como fenil- (alquilo de 1 a 2 átomos de carbono), por ejemplo, bencilo, fenetilo, etc.; un grupo a-naftilo- (alquilo de 1 a 2 átomos de carbono) por ejemplo a-naftilmetilo, etc.; y similares. Además, el pivaloiloximetilo o similares que son utilizados ampliamente como un éster para la administración oral, pueden también ser utilizados.

Donde la proteína receptora de la presente invención contenga un grupo carboxilo (o carboxilato) en la posición diferente de C-terminal, ésta puede ser amidada o esterificada y tal amida o éster es también incluido dentro de la proteína receptora de la presente invención. El grupo éster puede ser el mismo grupo que aquel descrito con respecto al C-terminal anterior. Además, la proteína receptora de la presente invención incluye los derivados en donde el grupo amino del residuo de metionina N-terminal de la proteína anteriormente mencionada está protegido con un grupo protector (por ejemplo, un grupo acilo que tiene 1 a 6 átomos de carbono, tales como el grupo formilo, el grupo acetilo, etc.); aquellos en donde la región N-terminal es escindida in vivo y el grupo glutamilo formado es piroglutaminado; y aquellos en donde un sustituyente (por ejemplo -OH, -SH, -COOH, grupo amino, grupo imidazol, grupo indol, grupo guanidino, etc.) sobre las cadenas laterales de un aminoácido en la molécula de la proteína está protegido con un grupo protector apropiado (por ejemplo, un grupo acilo que tiene de 1 a 6 átomos de carbono tal como un grupo alcanoilo que tiene 2 a 6 átomos de carbono, por ejemplo el grupo formilo, el grupo acetilo, etc.), o las proteínas conjugadas tales como las glucoproteínas con cadenas de azúcar acopladas a éstas.

Los ejemplos específicos de la proteína receptora de la presente invención que pueden ser utilizados incluyen una proteína receptora derivada de rata, que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 y una proteína receptora derivada de humano que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5. El péptido parcial de la proteína receptora de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces denominado como el péptido parcial) puede ser cualquier péptido parcial, siempre y cuando éste constituya una parte de las porciones peptídicas de la proteína receptora de la presente invención descrita anteriormente. Los ejemplos de tal péptido parcial incluyen el sitio, el cual es las membranas celulares exteriores expuestas entre la molécula de la proteína receptora de la presente invención y conserva la actividad de enlace al receptor. Un ejemplo del péptido parcial de la proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1 es un péptido que contiene la región que es analizada para ser un área extracelular (región o sitio hidrofílico) en un análisis de trazado hidrofóbico mostrado por la Figura 4. Un ejemplo adicional del péptido parcial de la proteína que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5, es un péptido que contiene una región que es analizada para ser un área extracelular (región o sitio hidrofílico) en un análisis de trazado hidrofóbico mostrado por la Figura 8. Un péptido, el cual contiene parcialmente una región hidrofóbica o sitio hidrofóbico, puede ser utilizado también. Además, un péptido, el cual contiene independientemente cada dominio, puede también ser utilizado aunque el péptido parcial, el cual contiene una pluralidad de dominios al mismo tiempo, puede también ser utilizado. El número de aminoácidos en el péptido parcial de la presente invención es al menos 20 o más, preferentemente 50 o más, más preferentemente 100 o más, en términos de la secuencia de aminoácidos constructiva de la proteína receptora de la presente invención, descrita anteriormente. Sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos se refiere a una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente 50% de homología, preferentemente al menos aproximadamente 70% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente 80% de homología, mucho más preferentemente al menos aproximadamente 90% de homología, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95% de homología. En la presente, el término "sustancialmente la misma actividad" tiene la misma definición descrita anteriormente. "Sustancialmente la misma actividad" puede ser evaluada en la manera descrita anteriormente.

En el péptido parcial de la presente invención, uno, dos o más aminoácidos (preferentemente aproximadamente 1 a 10 aminoácidos, más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) pueden ser suprimidos en la secuencia de aminoácidos descrita anteriormente; uno, dos o más aminoácidos (preferentemente aproximadamente 1 a 20 aminoácidos, más preferentemente aproximadamente 1 a 10 aminoácidos, y lo más preferentemente varios (1 ó 2) aminoácidos) pueden ser agregados a la secuencia de aminoácidos; o uno, dos o más aminoácidos (preferentemente aproximadamente 1 a 10 aminoácidos, más preferentemente varios aminoácidos (1 ó 2) pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en la secuencia de aminoácidos. En el péptido parcial de la presente invención, el C-terminal es normalmente el grupo carboxilo (-COOH) o carboxilato (-COO") pero el C-terminal puede ser una amida (-CONH2) o un éster (-COOR) , como se ha descrito con la proteína receptora de la presente invención. Como la proteína receptora de la presente invención descrita anteriormente, el péptido parcial de la presente invención también incluye los péptidos conjugados tales como aquellos en los cuales el grupo amino del residuo de metionina N-terminal está protegido por un grupo protector, aquellos en los cuales el residuo N-terminal es escindido in vivo y la Gln producida es convertida a piroglutamato, aquellos en los cuales los sustituyentes sobre las cadenas laterales de los aminoácidos en la molécula están protegidos por grupos protectores apropiados y aquellos a los cuales se enlazan cadenas de azúcar, es decir, glucopéptidos. La proteína receptora de la presente invención o el péptido parcial de la misma pueden ser utilizados en la forma de sales con bases o ácidos fisiológicamente aceptables, preferentemente en la forma sales por adición de ácidos fisiológicamente aceptables, de los mismos. Los ejemplos de tales sales son sales con ácidos inorgánicos (por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico) , sales con ácidos orgánicos (por ejemplo ácido acético, ácido fórmico, ácido propiónico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido succínico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido málico, ácido oxálico, ácido benzoico, ácido metansulfónico, ácido bencensulfónico) y similares. La proteína receptora de la presente invención o las sales de la misma pueden ser fabricadas de acuerdo con un método públicamente conocido para la purificación de una proteína receptora a partir de células de humano o de otros mamíferos, o tejidos de los mismos, como se describe anteriormente. Alternativamente, la proteína receptora de la presente invención o las sales de la misma pueden también ser fabricadas mediante el cultivo de un transformante que contiene ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención como se describirá posteriormente. Además, la proteína receptora de la presente invención o las sales de la misma pueden también ser fabricadas mediante los métodos para la síntesis de proteínas, los cuales también serán expuestos posteriormente en la presente, o mediante métodos modificados. Donde la proteína receptora o las sales de la misma son fabricadas a partir de tejidos o células de humano o mamífero, los tejidos o células de humanos o mamífero son homogeneizados, luego extraídos con un ácido o similar, y el extracto se aisla y se purifica mediante una combinación de técnicas de cromatografía tales como la cromatografía de fase inversa, cromatografía de intercambio iónico, y similares. Para sintetizar la proteína receptora, el péptido parcial o sus sales o amidas de la presente invención, las resinas comercialmente disponibles que se utilizan para la síntesis de la proteína, pueden ser utilizadas. Los ejemplos de tales resinas incluyen resina de clorometilo, resina de hidroximetilo, resina de benzhidrilamina, resina de aminometilo, resina de alcohol 4-benciloxibencílico, resina de 4-metilbenzhidrilamina, resina PAM, resina de 4- hidroximetilmetilfenilacetamidometilo, resina de poliacrilamida, resina de 4- (2' , 4' -dimetoxifenil- hidrixometil) fenoxi y resina de 4- (2 ' , 4' -dimetoxifenil- Fmoc-aminoetil) -fenoxi. Utilizando estas resinas, los aminoácidos en los cuales los grupos a-amino y los grupos funcionales sobre las cadenas laterales están apropiadamente protegidos, son condensados sobre la resina en el orden de la secuencia de la proteína objetivo de acuerdo a los diversos métodos de condensación públicamente conocidos en la técnica. Al final de la reacción, la proteína es extirpada de la resina y al mismo tiempo, los grupos protectores son removidos. Posteriormente, la reacción formadora del enlace disulfuro intramolecular es realizada en una solución altamente diluida para obtener la proteína objetivo o amidas de la misma. Para la condensación de los aminoácidos protegidos descritos anteriormente, se pueden utilizar una variedad de reactivos de activación para síntesis de proteína, pero las carbodiimidas son particularmente preferentemente empleadas. Los ejemplos de tales carbodiimidas incluyen DCC, N, N' -diisopropilcarbodiimida, y N-etill-N' - (3-dimetilaminopropil) carbodiimida. Para la activación por estos reactivos, los aminoácidos protegidos en combinación con un inhibidor de la recemización (por ejemplo, HOBt, HOOBt) son agregados directamente a la resina, o los aminoácidos protegidos son previamente activados en la forma de anhídridos de ácidos simétricos, esteres de HOBt o esteres de HOOBt, seguidos por la adición de los aminoácidos protegidos activados de este modo, a la resina. Los solventes adecuados para el uso en la activación de los aminoácidos protegidos o la condensación con la resina pueden ser seleccionados de solventes que son conocidos por ser utilizables para las reacciones de condensación de proteínas. Los ejemplos de tales solventes son amidas de ácidos tales como N, N-dimetilformamida, N,N-dimetilacetamida y N-metilpirrolidona; los hidrocarburos halogenados tales como clorhidrato de metileno y cloroformo; alcoholes tales como trifluoroetanol; sulfóxidos tales como sulfóxido de dimetilo; éteres tales como piridina, dioxano y tetrahidrofurano; nitrilos tales como acetonitrilo y propionitrilo; esteres tales como acetato de metilo y acetato de etilo; y mezclas apropiadas de estos solventes. La temperatura de reacción es apropiadamente elegida del intervalo conocido, para ser aplicable a las reacciones de enlace de proteína y su selección está usualmente en el intervalo de aproximadamente -20°C a 50°C. Los derivados de aminoácido activados son utilizados en general en un exceso de 1.5 a 4 veces. La condensación es examinada utilizando la reacción de ninhidrina; cuando la condensación es insuficiente, la condensación puede ser completada al repetir la reacción de condensación sin eliminación de los grupos protectores. Cuando la condensación es todavía insuficiente incluso después de repetir la reacción, los aminoácidos sin reaccionar son acetilados con anhídrido acético o acetilimidazol, para cancelar cualquier efecto adverso posible sobre la reacción subsecuente. Los ejemplos de grupos protectores utilizados para proteger los grupos amino iniciales incluyen Z, Boc, t-pentiloxicarbonilo, isoborniloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, Cl-Z, Br-Z, adamantiloxicarbonilo, trifluoroacetilo, ftaloilo, formilo, 2-nitrofenilsulfenilo, difenilfosfinotioilo, y Fmoc. Un grupo carboxilo puede ser protegido mediante, por ejemplo, la esterificación del alquilo (en la forma de esteres de alquilo lineal, ramificado o cíclicos de la porción alquilo tales como metilo, etilo, propilo, butilo, t-butilo, ciclopentilo, ciciohexilo, cicioheptilo, ciclooctilo, y 2-adamantilo) , esterificación de aralquilo (por ejemplo, éster bencílico, éster 4-nitrobencílico, éster 4-metoxibencílico, éster 4-clorobencílico y éster benzhidrílico) , la esterificación de fenacilo, hidrazidación de benciloxicarbonilo, hidrazidación de t-butoxicarbonilo e hidrazidación de tritilo.

El grupo hidroxilo de la serina puede ser protegido a través, por ejemplo, de su esterificación o eterificación. Los ejemplos de grupos apropiadamente utilizados para la esterificación incluyen un grupo alcanoilo inferior tal como el grupo acetilo, un grupo aroilo, tal como el grupo benzoilo, y un grupo derivado de ácido carbónico tal como el grupo bencilocarbonilo y el grupo etoxicarbonilo. Los ejemplos de un grupo apropiado utilizado para la eterificación incluyen el grupo bencilo, el grupo tetrahidropiranilo y el grupo t-butilo. Los ejemplos de grupos para la protección del grupo hidroxilo fenólico de la tirosina incluyen Bzl, Cl2-Bzl, 2-nitrobencilo, Br-Z y t-butilo. Los ejemplos de grupos utilizados para proteger la porción imidazol de la histidina incluye Tos, 4-metoxi-2, 3, 6-trimetilbencensulfonilo, NDP, benciloximetilo, Bum, boc, Trt y Fmoc. Los ejemplos de los grupos carboxilo activados en los aminoácidos iniciales incluyen los anhídridos de ácidos correspondientes, las azidas, esteres activados (esteres con alcoholes (por ejemplo, pentaclorofenol, 2,4,5-triclorofenol, 2, 4-dinitrofenol, alcohol cianometílico, p-nitrofenol, HONB, N-hidroxisuccinimida, N-hidroxiftalimida, HOBt) . Como los aminoácidos activados en los cuales son activados los grupos amino en el material inicial, las amidas fosfóricas correspondientes son empleadas. Para elimina'r los grupos protectores (división) , se utiliza la reducción catalítica bajo flujo de gas hidrógeno en presencia de un catalizador tal como negro de paladio o Pd-carbono; un tratamiento con ácido con fluoruro de hidrógeno anhidro, ácido metansulfónico, ácido trifluorometansuifónico o ácido trifluoroacético, o una mezcla en solución de estos ácidos; un tratamiento con una base tal como diisopropiletilamina, trietilamina, piperidina o piperazina; y la reducción con sodio en amoniaco líquido. La reacción de eliminación del grupo protector por el tratamiento con ácido descrito anteriormente se lleva a cabo en general a una temperatura de aproximadamente -20°C a 40°C. En el tratamiento con ácido, es eficiente agregar un depurador de cationes tal como el anisol, fenol, tioanisol, m-cresol, p-cresol, sulfuro de dimetilo 1, 4-butanditiol o 1, 2-etanditiol . Además, el grupo 2, 4-dinitrofenilo conocido como el grupo protector para el imidazol de la histidina es removido mediante un tratamiento con tiofenol. El grupo formilo utilizado como el grupo protector del indol del triptofano es eliminado mediante el tratamiento con ácido anteriormente mencionado en presencia de 1, 2-etanditiol o 1, 4-butanditiol, así como mediante un tratamiento con un álcali tal como solución diluida de hidróxido de sodio y amoniaco diluido. La protección de los grupos funcionales que no deben estar involucrados en la reacción de los materiales iniciales, los grupos protectores, la eliminación de los grupos protectores y la activación de los grupos funcionales involucrados en la reacción, pueden ser apropiadamente seleccionados de los grupos públicamente conocidos y de los medios públicamente conocidos. En otro método más para la obtención de proteínas amidadas, por ejemplo el grupo a-carboxilo del aminoácido carboxilo-terminal es primeramente protegido mediante amidación; la cadena peptídica (proteína) es luego extendida del lado del grupo amino hasta una longitud deseada. Después de esto, una proteína en la cual únicamente el grupo protector del grupo alfa-amino N-terminal ha sido eliminado del péptido y una proteína en la cual únicamente el grupo protector del grupo carboxilo C-terminal ha sido eliminado, son fabricadas. Las dos proteínas son condensadas en una mezcla de los solventes descritos anteriormente. Los detalles de la reacción de condensación son los mismos que se describen anteriormente. Después de que se purifica la proteína protegida obtenida mediante la condensación, todos los grupos protectores son eliminados mediante el método descrito anteriormente para dar la proteína cruda deseada. Esta proteína cruda es purificada mediante diversos medios de purificación conocidos. La liofilización de la fracción mayor da la amida de la proteína deseada. * Para preparar la proteína esterificada, por ejemplo, el grupo a-carboxilo del aminoácido carboxilo-terminal se condensa con un alcohol deseado para preparar el éster de aminoácido, lo cual es seguido por el procedimiento similar a la preparación de la proteína amidada anteriormente mencionada para dar la proteína esterificada, deseada. El péptido parcial de la proteína receptora de la presente invención puede ser fabricado mediante métodos públicamente conocidos para la síntesis de péptidos, o mediante escisión de la proteína protectora de la presente invención con una peptidasa apropiada. Para los métodos para la síntesis de péptidos, por ejemplo, puede ser utilizada ya sea la síntesis en fase sólida o la síntesis de fase líquida. Es decir, el péptido parcial o los aminoácidos que pueden construir la proteína receptora de la presente invención son condensados con la parte remanente de la proteína receptora de la presente invención. Donde los productos contienen grupos protectores, estos grupos protectores son eliminados para dar el péptido deseado. Los métodos públicamente conocidos para la condensación y eliminación de los grupos protectores son descritos en las referencias 1) 5) siguientes . 1) M. Bodanszky & M.A. Ondetti: Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York (1996) 2) Schroeder & Luebke: The Peptide, Academic Press, New York (1995) 3) Nobuo Izumiya, y colaboradores.: Peptide Gosei-no-Kiso to Jikken (Basics and experiments of peptide síntesis), published by Maruzen Co. (1975) 4) Haruaki Yajima & Shunpei Sakakibara: Seikagaku Jikken Koza (Biochemical Experimental) 1, Tanpakushitsu no Kagaku (Chemistry of Proteins) IV, 205 (1977) 5) Haruaki Yajima ed. : Zoku Iyakuhin no Kaihatsu (A sequel to Development of Pharmaceuticals), Vol. 14, Peptide Synthesis, published by Hirokawa Shoten. Después' de la terminación de la reacción, el producto puede ser purificado y aislado mediante una combinación de métodos de purificación convencionales tales como extracción con solventes, destilación, cromatografía en columna, cromatografía líquida y recristalización para dar el péptido parcial de la presente invención. Cuando el péptido parcial obtenido mediante los métodos anteriores está en la forma libre, el péptido puede ser convertido a una sal apropiada mediante un método públicamente conocido; cuando la proteína es obtenida en una forma de sal, ésta puede ser convertida a una forma libre mediante un método públicamente conocido. El polinucleótido que codifica para la proteína receptora de la presente invención puede ser cualquier polinucleótido siempre y cuando se contenga la secuencia de base (ADN o ARN, preferentemente ADN) que codifique para la proteína receptora de la presente invención, descrita anteriormente. Tal polinucleótido puede ser ADN y ARN, incluyendo ARNm que codifica para la proteína receptora de la presente invención. El polinucleótido puede ser ya sea de doble hebra o de hebra simple. Cuando el polinucleótido es de doble hebra, éste puede ser ADN de doble hebra o un híbrido de ADN: RN. Cuando el polinucleótido es de una sola hebra, éste puede ser una hebra en sentido (por ejemplo, la hebra de codificación) o una hebra antisentido (por ejemplo, la hebra de no codificación) . Utilizando el polinucleótido que codifica para la proteína receptora de la presente invención, el ARNm de la proteína receptora de la presente invención puede ser cuantificado por ejemplo mediante el método publicado en el volumen separado de Jikken Igaku (Experimental Medical Science), 15(7), "Nuevo PCR y su aplicación" (1997) o mediante modificación del método.

El ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención puede ser cualquiera de un ADN genómico, biblioteca de ADN genómico, ADNc derivado de las células y tejidos descritos anteriormente, la biblioteca de ADNc derivada de las células y tejidos descritos anteriormente y el ADN sintético. El vector que va a ser utilizado para la biblioteca puede ser cualquiera de un bacteriófago, plásmido, cósmido y fagémido. El ADN puede ser directamente amplificado mediante la reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (de aquí en adelante abreviada como RT-RCR) utilizando la fracción de ARN total o ARNm preparada a partir de las células o tejidos anteriormente descritos. Específicamente, el ADN que codifica para el péptido parcial de la proteína receptora de la presente invención puede ser cualquier ADN, siempre y cuando éste tenga, por ejemplo, el ADN que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6 o tiene una secuencia de base que se puede hibridar a la secuencia de base representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6 bajo condiciones de alta exigencia, y codifica para una proteína que tiene sustancialmente las mismas actividades (por ejemplo, la actividad de enlace al ligando, la actividad de transducción de la señal y similares) como aquella de la proteína receptora de la presente invención. Los ejemplos del ADN que se puede hibridar a la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6 incluyen el ADN que tiene al menos aproximadamente 70% de homología, preferentemente al menos aproximadamente 80% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente 90% de homología, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95% de homología, a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6. La hibridación se puede llevar a cabo mediante métodos públicamente conocidos o mediante una modificación de los mismos, por ejemplo de acuerdo al método descrito en Molecular Cloning, 2a Ed.; J. Sambrok y colaboradores, Cold Spring Harbor Lab. Press, (1989) . Una biblioteca comercialmente disponible puede también ser utilizada de acuerdo a las instrucciones del protocolo del fabricante, anexo. La hibridación puede ser llevada a cabo preferentemente bajo condiciones de alta exigencia. Las condiciones de alta exigencia utilizadas en la presente son, por ejemplo, aquellas en una concentración de sodio de aproximadamente 19 mM hasta aproximadamente 40 mM, preferentemente de aproximadamente 19 mM a aproximadamente 20 mM, y a una temperatura de aproximadamente 50 °C a aproximadamente 70 C, preferentemente de aproximadamente 60°C a aproximadamente 65°C. En particular, las condiciones de hibridación en una concentración de sodio de aproximadamente 19 mM y a una temperatura de aproximadamente 65°C son más preferidas. Más específicamente, para el ADN que codifica para la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 1, se puede emplear el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 y, el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 6 puede ser utilizada para el ADN que codifica para la proteína que tiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 5. El polinucleótido que comprende una parte de la secuencia de bases del ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención o una parte de la secuencia de bases complementaria al ADN, se pretende que incluya no solamente el ADN que codifica para el polipéptido parcial de la presente invención descrito más adelante sino también para el ARN. De acuerdo a la presente invención, los polinucleótidos antisentido (ácidos nucleicos) que pueden inhibir la replicación o expresión del gen de la proteína receptora de la presente invención, pueden ser diseñados y sintetizados con base en la información de la secuencia de bases clonada o determinada, del ADN que codifica para la proteína receptora. Tales polinucleótidos (ácidos nucleicos) pueden hibridarse al ARN del gen de la proteína e inhibir la síntesis de ARN o la función del ARN, o pueden regular/controlar la expresión del gen de la proteína receptora vía la interacción con los ARNs asociados con la proteína receptora. Los polinucleótidos complementarios a las secuencias especificadas del ARN asociado con la proteína receptora y los polinucleótidos que pueden específicamente hibridarse al ARN asociado con la proteína receptora, son útiles para regular la expresión del gen de la proteína receptora in vivo e in vitro. Estos polinucleótidos son también útiles para el tratamiento y diagnóstico de las enfermedades. El término "corresponde" se utiliza para referirse a los homólogos o complementarios a una secuencia específica de los nucleótidos, las secuencias de bases o los ácidos nucleicos que incluyen el gen. Entre los nucleótidos, las secuencias de bases o los ácidos nucleicos y péptidos (proteínas), el término "correspondiente" usualmente se refiere a los aminoácidos de un péptido (proteína) que son instruidos para ser derivados de la secuencia de los nucleótidos (ácidos nucleicos) o sus complementos. El rizo en forma de horquilla del extremo 5' , las repeticiones de 6 pares de bases en el extremo 5' la región no traducida en el extremo ' el codón de inicio de la traducción del polipéptido, la región de codificación de la proteína, el codón de inicio de la traducción de ORF, la región no traducida 3', la región palindrómica en el extremo 3', y el rizo de horquilla en el extremo 3' del gen de la proteína receptora pueden ser seleccionados como regiones objetivo preferidas, aunque cualquier región puede ser un objetivo dentro de los genes de la proteína receptora. La relación entre los ácidos nucleicos dirigidos y polinucleótidos complementarios al menos a una porción del objetivo, específicamente la relación entre el objetivo y los polinucleótidos que se pueden hibridar al objetivo, es denotada como "antisentido" . Los polinucleótidos antisentido pueden ser polidesoxinucleótidos que contienen 2-desoxi-D-ribosa, polidesoxinucleótidos que contienen D-ribosa, cualquier otro tipo de polinucleótidos que son N-glucósidos de una base de purina o pirimidina u otros polímeros que contienen columnas vertebrales no nucleotídicas (por ejemplo, los ácidos nucleicos de proteína y los polímeros de ácido nucleico específicos de la secuencia, sintéticos, comercialmente disponibles) u otros polímeros que contienen enlaces no estándares (con la condición de que los polímeros contengan nucleótidos con una configuración que les permita el apareamiento de bases o el apilamiento de bases, como es encontrado en el ADN y el ARN) . Los polinucleótidos antisentido pueden ser ADN de doble hebra, ADN de una sola hebra, ARN de una sola hebra o un híbrido de ADN:ARN, e incluyen además los polinucleótidos no modificados (o los oligonucleótidos no modificados) , aquellos con tipos de modificaciones públicamente conocidas, por ejemplo, aquellos con marcadores conocidos en la técnica, aquellos con casquetes, polinucleótidos metilados, aquellos con sustitución de uno o más nucleótidos de origen natural con su análogo, aquellos con modificaciones intramoleculares de los nucleótidos tales como aquellos con enlaces no cargados (por ejemplo, fosfonatos de metilo, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.) y aquellos con enlaces cargados o enlaces que contienen azufre (por ejemplo, fosoforotioatos, fosoforoditioatos, etc.), aquellos que tienen grupos de cadena lateral tales como proteínas (incluyendo nucleasas, inhibidores de nucleasa, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-L-lisina, etc.) y sacáridos (por ejemplo, monosacáridos, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radiactivos, boro, metales oxidantes, etc.), y aquellos que contienen agentes alquilantes, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos a-anoméricos, etc.). En la presente, los términos "nucleósido", "nucleótido" y "ácido nucleico" se utilizan para referirse a las porciones que contienen no solamente las bases de purina y de pirimidina, sino también a otras bases heterocíclicas, las cuales han sido modificadas. Tales modificaciones incluyen purinas metiladas y pirimidinas, purinas aciladas y pirimidinas y otros anillos heterocíclicos. Los nucleósidos o nucleótidos modificados también incluyen modificaciones sobre la porción azúcar, por ejemplo, en donde uno o más grupos hidroxilo pueden ser opcionalmente reemplazados con un halógeno, grupos alifáticos, o pueden ser convertidos a los grupos funcionales correspondientes tales como éteres, aminas, o similares. El polinucleótido antisentido (ácido nucleico) de la presente invención es ARN, ADN o un ácido nucleico modificado (ARN, ADN) . Los ejemplos específicos del ácido nucleico modificados son, pero no están limitados a, derivados sulfurados y de tiofosfato de los ácidos nucleicos, y aquellos resistentes a la degradación de las amidas de polinucleósido o de oligonucleósido. Los ácidos nucleicos antisentido de la presente invención pueden ser modificados preferentemente con base en el siguiente diseño, es decir, mediante el incremento de la estabilidad intracelular del ácido nucleico antisentido, incrementando la permeabilidad celular del ácido nucleico antisentido, incrementando la afinidad del ácido nucleico a la hebra en el sentido objetivo, a un nivel más alto, o minimizando la toxicidad, si la hay, del ácido nucleico antisentido. Muchas de tales modificaciones son conocidas en la técnica, como se describe en J. Kawakami y colaboradores, Pharm, Tech. Japón, Vol. 8, pp. 247, 1992; Vol. 8 pp. 395, 1992; ' S. T. Crooke y colaboradores, Antisense Research and Applications CRC Press, 1993; etc. El ácido nucleico antisentido de la presente invención puede contener azúcares, bases o enlaces, alterados o modificados. El ácido nucleico antisentido puede también ser proporcionado en una forma especializada tales como liposomas, microesferas o puede ser aplicado a la terapia génica o puede ser proporcionado en combinación con las porciones acopladas. Tales porciones acopladas incluyen policationes tales como polilisina que actúan como neutralizadores de la carga de la cadena principal de fosfato, o porciones hidrofóbicas tales como lípidos (por ejemplo, fosfolípidos, colesteroles, etc.) que aumentan la interacción con las membranas celulares o incrementan la captación del ácido nucleico. Los ejemplos preferidos de los lípidos que van a ser acoplados son colesteroles o derivados de los mismos (por ejemplo, cloroformiato de colesterilo, ácido cólico, etc.). Estas porciones pueden ser acopladas en los extremos 3' ó 5' del ácido nucleico y pueden también ser acopladas a través de una base, o un enlace de nucleósido intramolecular. Otras porciones pueden ser grupos de encasquetamiento específicamente colocados en los extremos 3' ó 5' del ácido nucleico, para prevenir la degradación por una nucleasa tal como la exonucleasa, ARNasa, etc. Tales grupos de encasquetamiento incluyen, pero no están limitados a, grupos protectores de hidroxilo conocidos en la técnica, incluyendo glicoles tales como polietilenglicol, tetraetilenglicol y similares. La actividad inhibitoria del ácido nucleico antisentido puede ser examinada utilizando el transformante de la presente invención, el sistema de expresión del gen de la presente invención in vitro, e in vivo, o el sistema de traducción de la proteína receptora de la presente invención in vitro e in vivo. El ácido nucleico puede ser aplicado a las células mediante una variedad de métodos públicamente conocidos. El ADN que codifica para el péptido parcial de la presente invención puede ser cualquier ADN siempre y cuando éste contenga la secuencia de bases que codifica para el péptido parcial de la presente invención descrito anteriormente. El ADN puede también ser cualquiera del ADN genómico, biblioteca de ADN genómico, ADNc derivado de las células y tejidos descritos anteriormente, biblioteca de ADNc derivada de las células y tejidos descritos anteriormente, y ADN sintético. El vector que va a ser utilizado para la biblioteca puede ser cualquiera de los bacteriófagos, plásmidos, cósmidos y fagémidos. El ADN puede ser directamente modificado mediante la reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (de aquí en adelante referida simplemente como RT-RCR) utilizando la fracción de ARNm preparada 'a partir de las células y tejidos descritos anteriormente. Los ejemplos específicos del ADN que codifica para el péptido parcial de la presente invención incluyen (1) el ADN que tiene una parte de la secuencia de bases del ADN que contiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6 y (2) el ADN que tiene una secuencia de bases que se puede hibridar a la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6, bajo condiciones de alta exigencia y que contiene una parte de la secuencia de bases del ADN que codifica para una proteína receptora que tiene sustancialmente las mismas actividades (por ejemplo, la actividad de enlace al ligando, la actividad de transducción de la señal y similares) como aquellas de la proteína receptora de la presente invención. Los ejemplos del ADN que se puede hibridar a la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6 incluyen el ADN que contienen la secuencia de bases que tiene al menos aproximadamente 70% de homología, preferentemente al menos aproximadamente 80% de homología, más preferentemente al menos aproximadamente 90% de homología, lo más preferentemente al menos aproximadamente 95% de homología, a la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 6. Para la clonación del ADN que codifica completamente para la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces denominada como la proteína receptora de la presente invención) , el ADN puede ser amplificado mediante PCR utilizando cebadores de ADN sintéticos que contienen una parte de la secuencia de bases de la proteína receptora de la presente invención, o el ADN insertado dentro de un vector apropiado puede ser seleccionado mediante hibridación con un fragmento de ADN marcado o ADN sintético que codifica para una parte o la región completa de la proteína receptora de la presente invención. La hibridación puede ser llevada a cabo, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en Molecular Cloning, 2a (J. Sambrook y colaboradores, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989) . La hibridación puede también ser realizada utilizando la biblioteca comercialmente disponible de acuerdo con el protocolo descrito en las instrucciones anexas.

La conversión de las secuencias de bases del ADN puede ser llevada a cabo de acuerdo a los métodos públicamente conocidos tales como el método de Gupped o el método de Kunkel o su modificación mediante el uso de un equipo públicamente conocido, disponible como MutanMR-G o MutanMR-K (ambos fabricados por Takara Shuzo Co., Ltd., Marca registrada) . El ADN clonado que codifica para la proteína receptora de la presente invención puede ser utilizado como tal, dependiendo del propósito, o si se desea, después de la digestión con una enzima de restricción después de la adición de un ligador a éste. El ADN puede contener ATG como un codón de inicio de la traducción en el extremo 5' del mismo y TAA, TGA o TAG como un codón de terminación de la traducción en el extremo 3' del mismo. Estos codones de inicio y terminación de la traducción pueden también ser agregados mediante el uso de un adaptador de ADN sintético, apropiado. El vector de expresión de la proteína receptora de la presente invención puede ser fabricado, por ejemplo, mediante (a) la extirpación del fragmento de ADN deseado del ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención, (b) seguido por la ligadura del fragmento de ADN con un vector de expresión apropiado corriente debajo de un promotor en el vector.

Los ejemplos del vector que pueden ser utilizados incluyen los plásmidos derivados de E. coli (por ejemplo pBR322, pBR325, pUC12, pUC13) , los plásmidos derivados de Bacillus subtilis (por ejemplo pUBUO, pTP5, pC194), los plásmidos derivados de levaduras (por ejemplo pSH19, pSH15), los bacteriófagos tales como fago ?, etc., virus de animales tales como retrovirus, virus de la vaccinia, baculovirus, etc. así como pAl-11, pXTl, pRc/CMV, pRC/RSV, pcDNAI/Neo, etc. El promotor utilizado en la presente invención puede ser cualquier promotor si éste se acopla perfectamente con un huésped que va a ser utilizado para la expresión del gen. En el caso del uso de células animales como el huésped, los ejemplos del promotor incluyen el promotor SRa, el promotor SV40, el promotor LTR, el promotor CMV, el promotor HSV-TK, etc. Entre ellos, el promotor CMV o el promotor SRa son preferentemente utilizados. Donde el huésped es una bacteria del género Escherichia , los ejemplos preferidos del promotor incluyen el promotor trp, el promotor lac, el promotor recA, el promotor ?PL, el promotor lpp, etc. En el caso del uso de bacterias del género Bacillus como el huésped, los ejemplos preferidos del promotor son el promotor SPOl, el promotor SP02, y el promotor penP. En el caso del uso de levadura como el huésped, los ejemplos preferidos del promotor son el promotor PH05, el promotor PGK, el promotor GAP, el promotor ADH. En el caso del uso de células de insecto como el huésped, los ejemplos preferidos del promotor incluyen el promotor de la polihedrina y el promotor PÍO. Además de los ejemplos anteriores, el vector de expresión puede además contener opcionalmente un aumentador, una señal de empalme, una señal de adición poli A, un marcador de selección, un origen de replicación SV40 (de aquí en adelante algunas veces abreviado como SV40ori), etc. Los ejemplos de selección del marcador incluyen con el gen de la dihidrofolato-reductasa (de aquí en adelante algunas veces abreviada como dhfr) [la resistencia al metotrexato (MTX) ] , el gen de resistencia a la ampicilina (de aquí en adelante algunas veces denominado como Ampr) , el gen de resistencia a la neomicina (de aquí en adelante algunas veces abreviado como Neo, resistencia a G418), etc. En particular, cuando la célula CHO (dhfr") es utilizada conjuntamente con el gen dhfr como el marcador de selección, la selección puede también ser realizada mediante el uso de un medio libre de timidina. Si es necesario y deseado, una señal de secuencia que se acopla con un huésped es agregada al extremo N de la proteína receptora de la presente invención. Los ejemplos de la secuencia de señal que pueden ser utilizados son la secuencia de señal Pho A, la secuencia de señal OmpA, etc., en el caso del uso de bacterias del género Escherichia como el huésped; la secuencia de señal de la a-amilasa, la secuencia de señal de la subtilisina, en el caso del uso de bacterias del género Bacillus como el huésped; la secuencia de señal de MFa, la secuencia de señal SUC2, etc. en el caso del uso de levaduras como el huésped, y la secuencia de señal de la insulina, la secuencia de señal del a-interferón, la secuencia de señal de la molécula de anticuerpo, etc., en el caso del uso de células animales, el huésped, respectivamente. Utilizando el vector que comprende el ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención construida de este modo, pueden ser fabricados los transformantes. Los ejemplos del huésped, que pueden ser empleados, son bacterias que pertenecen al género Escherichia, bacterias que pertenecen al género Bacillus, levaduras, células de insectos, células de insectos y animales, etc. Los ejemplos específicos de bacterias que pertenecen al género Escherichia incluyen Escherichia coli K12 DH1 (Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 60, 160 (1968)), JM103 (Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)), JA221 (Journal of Molecular Biology, 120, 517 (1978)), HB101 (Journal of Molecular Biology, 41, 459 (1969)), C600 (Genetics, 39, 440, (1954)) etc. Los ejemplos de bacterias que pertenecen al género Bacillus incluyen Bacillus subtilis MI114 (Gene, 24, 255 (1983)), 207-21 (Journal of Biochemistry, 95, 87 (1984)) etc. Los ejemplos de levaduras incluyen Saccharomyces cereviseae AH22, AH22R, NA87-11A, DKD-5D, 20B-12, Schizosaccharomyces pombe NCYC1913, NCYC2036, Pichia pastoris, etc. Los ejemplos de células de insecto incluyen, para los virus AcNPV, las células de Spodoptera frugiperda (células Cf) , las células MG1 derivadas del intestino medio de Trichoplusia ni , células High FiveMR derivadas de huevo de Trichoplusia ni , células derivadas de Mamestra brassicae, células derivadas de Estigmena aerea, etc.; y para el virus BmNPV, célula N de Bombyx mor i (células BmN) , etc. Los ejemplos de células Sf que pueden ser utilizadas son las células Sf9 (ATCC CRL1711) y las células Sf21 (ambas células son descritas en Vaughn, J. L. y colaboradores In vivo, 13, 213-217 (1977). Como el insecto, por ejemplo, se puede utilizar una larva de Bombyx mor i (Maeda y colaboradores, Nature 315, 592 (1985) ) .

Los ejemplos de células animales incluyen células de mono C0S-7, células Vero, células CHO de ovario de hámster chino (de aquí en adelante denominadas como células CHO) , las células de hámster chino CHO deficientes en el gen dhfr (de aquí en adelante simplemente denominadas como células CHO (dhfr)"), las células L de ratón, células AtT-20 de ratón, células de mieloma de ratón, células GH de rata, células FL humanas, etc. Las bacterias que pertenecen al género Escherichia pueden ser transformadas, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en Proc. Nati. Acad. Sci, U.S.A., 69, 2110 (1972) o Gene 17, 107 (1982). Las bacterias que pertenecen al género Bacillus pueden ser transformadas, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979) . Las levaduras pueden ser transformadas, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en Methods in Enzymology, 194, 182-187 (1991) o Proc. Nati, Acad. Sci. U.S.A. 75, 1929) (1978). Las células de insectos o los insectos pueden ser transformados, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en Bio/Technology, 6, 47-55 (1988). Las células animales pueden ser transformadas, por ejemplo, de acuerdo al método descrito en Saibó Kogaku (Cell Engineering) , emisión extra 8, Shin Saibó Kogaku Jikken Protocol (New Cell Engineering Experimental Protocol), 263-267 (1995), publicado por Shujunsha, o Virology 52, 456 (1973) . De este modo, el transformante transformado con el vector de expresión que contiene el ADN que codifica para la proteína receptora o el péptido parcial de la presente invención, puede ser también obtenido. Donde el huésped es una bacteria que pertenece al género Escherichia o al género Bacillus, el transformante puede ser apropiadamente incubado con un medio líquido el cual contiene materiales requeridos para el crecimiento del transformante tales como fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, materiales inorgánicos, etc. Los ejemplos de las fuentes de carbono incluyen glucosa, dextrina, almidón soluble, sucrosa, etc. Los ejemplos de la fuente de nitrógeno incluyen materiales inorgánicos u orgánicos tales como sales de amonio, sales de nitrato, licor de infusión de maíz, peptona, caseína, extracto de carne, torta de soya, extracto de papa, etc. Los ejemplos de los materiales inorgánicos son cloruro de calcio, fosfato diácido de sodio, cloruro de magnesio, etc. Además, las levaduras, vitaminas, factores promotores de crecimiento, etc., pueden también ser agregados al medio. Preferentemente, el pH del medio es ajustado a aproximadamente 5 hasta aproximadamente 8.

Un ejemplo preferido del medio para la incubación de las bacterias que pertenecen al género Escherichia es el medio M9 suplementado con glucosa y casaminoácidos (Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1972) . Si es necesario y deseado, puede ser también agregado un producto químico tal como el ácido 3ß-indolilacrílico al medio, con lo cual se activa el promotor eficientemente. Donde las bacterias que pertenecen al género Escherichia son utilizadas como el huésped, el transformante es usualmente cultivado aproximadamente a 15°C hasta aproximadamente 43°C por aproximadamente 3 horas hasta aproximadamente 24 horas. Si es necesario y deseado, el cultivo puede ser aireado o agitado. Donde las bacterias que pertenecen al género bacillus son utilizadas como el huésped, el transformante es cultivado en general aproximadamente de 30°C a aproximadamente 40°C por aproximadamente 6 horas hasta aproximadamente 24 horas. Si es necesario y deseable, el cultivo puede ser aireado o agitado. Donde se utiliza la levadura como el huésped, el transformante es cultivado en, por ejemplo, medio mínimo de Burkholder (Bostian, K. L. y colaboradores Proc Nati. Acad. Sci. U.S.A. 77 4505 (1980)) o en el medio SD suplementado con 0.5% de Casaminoácidos (Bitter, G. A., y colaboradores Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 81 5330 (1984)). Preferentemente, el pH del medio es ajustado de aproximadamente 5 a aproximadamente 8. En general, el transformante es cultivado de aproximadamente 20°C hasta aproximadamente 35°C por aproximadamente 24 horas hasta aproximadamente 72 horas. Si es necesario y deseado, el cultivo puede ser aireado o agitado. Donde se utilizan células de insecto, o insectos como el huésped, el transformante es cultivado por ejemplo en Medio para Insectos de Grace (Grace, T. C. C. Nature 195, 788 (1962)) al cual se agrega un aditivo apropiado tal como suero bovino al 10% inmovilizado. Preferentemente, el pH del medio es ajustado aproximadamente de 6.2 a aproximadamente 6.4. Normalmente, el transformante es cultivado a aproximadamente 27 °C por aproximadamente 3 días hasta aproximadamente 5 días y, si es necesario y deseado, el cultivo puede ser aireado o agitado. Donde se emplean células animales como el huésped, el transformante es cultivado en, por ejemplo, medio MEM que contiene aproximadamente 5% a aproximadamente % de suero fetal bovino (Science, 122, 501 (1952)), el medio DMEM (Virology, 8, 396 (1959)), el medio RPMI 1640 (The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)), el medio 199 (Proceeding of the Society for the Biologicl Medicine, 73, 1 (1950)), etc. Preferentemente, el pH del medio es ajustado de aproximadamente 6 a aproximadamente 8. El transformante es usualmente cultivado de aproximadamente 30°C hasta aproximadamente 40°C por aproximadamente 15 horas hasta aproximadamente 60 horas y, si es necesario y deseado, el cultivo puede ser aireado o agitado. Como se describe anteriormente, la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención pueden ser producidos en la membrana celular del transformante. La proteína receptora o el péptido parcial de la presente invención pueden ser separados y purificados del cultivo descrito anteriormente mediante los siguientes procedimientos . Cuando la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención es extraído del cultivo o de las células, después del cultivo, el transformante o la célula es recolectado mediante un método públicamente conocido y suspendido en un amortiguador apropiado. El transformante o la célula se desintegra luego mediante métodos públicamente conocidos tales como la ultrasonicación, un tratamiento con lisozima y/o ciclos de congelamiento-descongelamiento, seguido por centrifugación, filtración, etc. De este modo, el extracto crudo de la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención pueden ser obtenidos. El amortiguador utilizado para los procedimientos puede contener un modificador de proteínas tal como urea o clorhidrato de guanidina, o un surfactante tal como Tritón X-100MR, etc. Cuando la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención es secretado en el caldo de cultivo, después de la terminación del cultivo el sobrenadante puede ser separado del transformante o de la célula, para recolectar el sobrenadante mediante un método públicamente conocido. El sobrenadante o la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención, contenido en el extracto obtenido de este modo, pueden ser purificados al combinar apropiadamente los métodos públicamente conocidos para la separación y purificación. Tales métodos públicamente conocidos por separación y purificación incluyen un método que utiliza la diferencia en la solubilidad tal como el desplazamiento salino, la precipitación con solvente, etc.; un método que utiliza principalmente la diferencia en peso molecular tal como la diálisis, ultrafiltración, filtración en gel, electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida, etc.; un método que utiliza la diferencia en la carga eléctrica tal como la cromatografía de intercambio iónico, etc.; un método que utiliza la diferencia en la afinidad específica tal como la cromatografía de afinidad, etc.; un método que utiliza la diferencia en la hidrofobicidad tal como la cromatografía líquida de alta resolución, de fase inversa, etc.; un método que utiliza la diferencia en el punto isoeléctrico tal como la electroforesis de enfoque isoeléctrco; y similares. Cuando la proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención obtenido de este modo está en una forma libre, éste puede ser convertido a una sal mediante métodos públicamente conocidos o modificaciones de los mismos. Por otra parte, cuando la proteína receptora es obtenida en la forma de una sal, ésta puede ser convertida a la forma libre o en la forma de una sal diferente mediante los métodos públicamente conocidos o modificaciones de los mismos. La proteína receptora o su péptido parcial de la presente invención producido por el recombinante, pueden ser tratados, antes de o después de la purificación, con una enzima modificadora de proteínas, apropiada de modo que la proteína o el péptido parcial pueden ser apropiadamente modificados para eliminar parcialmente un polipéptido. Los ejemplos de la enzima modificadora de proteína incluyen tripsina, quimotripsina, arginil-endopeptidasa, cinasa de proteína, glucosidasa y similares. La actividad de la proteína receptora producida de este modo, de la presente invención o las sales de la misma, el péptido parcial o sus esteres, las amidas o las sales de la presente invención pueden ser determinadas mediante una prueba de enlace a un ligando marcado, y mediante un inmunoensayo enzimático utilizando un anticuerpo específico. Los anticuerpos para la proteína receptora o sus sales, el péptido parcial o sus esteres, las amidas o sus sales de acuerdo a la presente invención . (de aquí en adelante algunas veces colectivamente denominadas como la proteína receptora o similares de la presente invención) o el péptido ligando de la presente invención (el cual será posteriormente descrito) pueden ser cualquiera de los anticuerpos policlonales y monoclonales, siempre y cuando éstos puedan reconocer la proteína receptora o similares de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención. El anticuerpo para la proteína receptora o similares de la presente invención o para el péptido ligando de la presente invención, puede ser fabricado mediante los métodos públicamente conocidos para la fabricación de anticuerpos o antisueros, utilizando como un antígeno la proteína receptora o similares de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención.

Preparación del Anticuerpo Monoclonal (a) Preparación de las células productoras de anticuerpos monoclonales .

La proteína receptora o similares de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención se administra a un mamífero, ya sea solo o conjuntamente con portadores o diluyentes al sitio que puede producir el anticuerpo mediante la administración. Con el fin de potenciar la productividad del anticuerpo después de la administración, se puede administrar adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund. La administración es efectuada usualmente una vez cada 2 a 6 semanas y aproximadamente 2 a 10 veces en total. Los mamíferos que van a ser utilizados incluyen mono, conejos, perros, cobayos, ratones, ratas, ovejas, cabras y similares, con el ratón y la rata que son los preferidos, En la preparación de las células productoras de anticuerpos monoclonales, un animal en donde el título de anticuerpo es notado, se selecciona de los animales de sangre caliente inmunizados con antígenos, por ejemplo ratones, luego se recolectan el bazo o los nodulos linfáticos después de dos a cinco días a partir de la inmunización final y las células productoras de anticuerpos contenidas en éstos se fusionan con células de mieloma para dar los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales. El título de anticuerpo en los antisueros puede ser determinado por ejemplo, mediante la reacción de la proteína receptora marcada o similares de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención, los cuales serán descritos posteriormente, con el antisuero seguido por la medición de la actividad de enlace del agente de marcación enlazado al anticuerpo. La fusión puede ser llevada a cabo, por ejemplo, de acuerdo al método de Koehler y Milstein (Nature, 256, 495, 1975) . Los ejemplos del acelerador de fusión son polietilenglicol (PEG), el virus Sendai, etc., se utiliza preferentemente PEG. Los ejemplos de células de mieloma incluyen NS-1, P3U1 y SP2/0, con P3U1 que es el preferido. La proporción del número de células productoras de anticuerpos (células del bazo) al número de células de mieloma que van a ser utilizadas es preferentemente de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 20:1 y PEG (preferentemente PEG 1000 a PEG 6000) es agregada en una concentración de aproximadamente 10% a aproximadamente 80%. La fusión celular puede ser eficientemente llevada a cabo mediante la incubación de ambas células aproximadamente a 20°C hasta aproximadamente 40°C, preferentemente aproximadamente 30°C a aproximadamente 37°C por aproximadamente 1 minuto a aproximadamente 10 minutos. Pueden ser utilizados diversos métodos para la selección de un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales. Los ejemplos de tales métodos incluyen un método que comprende el sobrenadante de hibridoma a una fase sólida (por ejemplo, microplacas) adsorbida con la proteína receptora o similares de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención como el antígeno directamente o conjuntamente con un portador, agregando un anticuerpo anti-inmunoglobulina (donde las células de ratón son utilizadas para la fusión celular, se utiliza el anticuerpo anti-inmunoglobulina de ratón) marcado con una sustancia radiactiva o una enzima o proteína A, y detectando el anticuerpo monoclonal enlazado a la fase sólida y un método que comprende la adición del sobrenadante de hibridoma a una fase sólida adsorbida con un anticuerpo anti-inmunoglobulina o proteína A, agregando la proteína receptora similar de la presente invención del péptido ligando de la presente invención, marcado con una sustancia radioactiva o una enzima y detectando el anticuerpo monoclonal enlazado a la fase sólida. El anticuerpo monoclonal puede ser seleccionado de acuerdo a los métodos públicamente conocidos o sus modificaciones. En general, la selección puede ser efectuada en un medio para células animales, suplementado con HAT (hipoxantina, aminopterina y timidina) . Cualquier medio de selección y crecimiento puede ser empleado siempre y cuando el hibridoma pueda desarrollarse en éste. Por ejemplo, el medio RPMI 1640 que contiene 1% a 20%, preferentemente 10% a 20% de suero fetal bovino, medio GIT ( ako Puré Chemical Industries, Ltd.) que contiene 1% a 10% de suero fetal bovino, un medio libre de suero para el cultivo de un hibridoma (SFM-101, Nissui Seiyaku Co., Ltd.) y similares, puede ser utilizado para el medio de selección y crecimiento. El cultivo se lleva a cabo en general de 20°C a 40°C, preferentemente 37°C, por aproximadamente 5 días a aproximadamente 3 semanas, preferentemente 1 a 2 semanas, normalmente en 5% de C02. El título de anticuerpo del sobrenadante de cultivo de un hibridoma puede ser determinado como en la determinación del título de anticuerpo en los antisueros anteriormente descritos. (b) Purificación del anticuerpo monoclonal La separación y purificación de un anticuerpo monoclonal se puede llevar a cabo de acuerdo a la misma manera que se aplica a la separación y purificación convencionales para anticuerpos policlonales tales como la separación y purificación de inmunoglobulina (por ejemplo desplazamiento salino, precipitación con alcohol, precipitación por punto isoeléctrico, electroforesis, adsorción y desorción con intercambiadores iónicos (por ejemplo, DEAE), ultracentrifugación, filtración en gel, o un método de purificación específico el cual comprende la recolección únicamente de un anticuerpo con un adsorbente activado tal como una fase sólida de enlace al antígeno, la proteína A o la proteína G y la disociación del enlace para obtener el anticuerpo.

Preparación del anticuerpo policlonal El anticuerpo policlonal de la presente invención puede ser fabricado mediante los métodos públicamente conocidos o modificaciones de los mismos. Por ejemplo, es formado un complejo de inmunógeno (antígeno de la proteína receptora o similar) y una proteína portadora, y un mamífero es inmunizado con el complejo de una manera similar al método descrito anteriormente para la fabricación del anticuerpo monoclonal. Conteniendo el producto el anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención, o el péptido ligando de la presente invención, se recolecta a partir del animal inmunizado, seguido por la separación y purificación del anticuerpo.

En el complejo del inmunógeno y la proteína portadora para la inmunización de mamíferos, el tipo de proteína portadora y la proporción del mezclado del portador al hapteno puede ser cualquier tipo y cualquier proporción, siempre y cuando el anticuerpo sea eficientemente producido para el hapteno inmunizado por reticulación al portador. Por ejemplo, la albúmina sérica bovina, la tiroglobulina bovina o la hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, es acoplada al hapteno en una proporción en peso de portador a hapteno de aproximadamente 0.1 a 20, preferentemente 1 a 5. Se puede utilizar una variedad de agentes de condensación para el acoplamiento del acoplador al hapteno. Se utilizan para el acoplamiento el glutaraldehído, carbodiimida, éster activado con maleimida y reactivos éster activados que contienen el grupo tiol o el grupo ditiopiridilo. El producto de condensación se administra a animales de sangre caliente ya sea solo o conjuntamente con portadores o diluyentes al sitio que puede producir el anticuerpo mediante la administración. Con el fin de potenciar la productividad del anticuerpo después de la administración, se puede administrar adyuvante completo de Freund o adyuvante incompleto de Freund. La administración se lleva a cabo usualmente una vez cada 2 a 6 semanas y 3 a 10 veces en total. El anticuerpo policlonal recolectado de la sangre, fluido de ascitis, etc., preferentemente de la sangre de mamíferos inmunizados por el método descrito anteriormente . El título del anticuerpo policlonal en el antisuero puede ser determinado mediante el mismo procedimiento que en el título de anticuerpo en suero descrito anteriormente. El anticuerpo policlonal puede ser separado y purificado de acuerdo al mismo método para la separación y purificación de la inmunoglobulina como se utiliza para el anticuerpo monoclonal anteriormente descrito. Pueden ser utilizados la proteína receptora de la presente invención o las sales de la misma, el péptido parcial o los esteres, las amidas o sales de la misma y el ADN que codifica para los mismos: (1) para la determinación del ligando (agonista) a la proteína receptora de la presente invención o sales de la misma, (2) como un agente para la prevención y/o tratamiento de enfermedad asociada con la disfunción de la proteína receptora de la presente invención, (3) como un agente de diagnóstico genético, (4) para la cuantificación del ligando a la proteína receptora de la presente invención, (5) para la selección de un compuesto (agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora de la presente invención y un ligando, (6) como el agente para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades, que comprende un compuesto (agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora de la presente invención y un ligando, (7) para la cuantificación de la proteína receptora o similar de la presente invención, (8) para la neutralización por anticuerpos a la proteína receptora similar de la presente invención y (9) para la preparación de un animal no humano que lleva el ADN que codifica para la proteína receptora o similar, de la presente invención. En particular, un compuesto (por ejemplo agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína receptora de la presente invención, específica para humanos u otros mamíferos, puede ser seleccionado utilizando el sistema de ensayo de enlace ligando-receptor, posteriormente descrito, mediante la aplicación a éste del sistema de expresión de la proteína receptora recombinante de la presente invención. El agonista o el antagonista puede ser utilizado como un agente profiláctico/terapéutico para diversas enfermedades, que se describirán más adelante.

De aquí en adelante la proteína receptora o similar de la presente invención, el ADN que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces colectivamente denominados como el ADN de la presente invención) y los anticuerpos para la proteína receptora o similares de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces denominados el anticuerpo de la presente invención) son específicamente descritos con su uso. (1) Determinación de un ligando (agonista) para la proteína receptora de la presente invención.

La proteína receptora o similar de la presente invención es útil como un reactivo para buscar y determinar un ligando (agonista) para la proteína receptora de la presente invención y sales de la misma. Es decir, la presente invención proporciona un método para la determinación de un ligando para la proteína receptora de la presente invención o sales de la misma, que comprende el poner la proteína receptora de la presente invención o sales de la misma, en contacto con un compuesto de prueba. Los ejemplos de compuestos que van a ser probados incluyen ligandos públicamente conocidos (por ejemplo angiotensina, bombesina, canavinoide, colescistoquinina, glutamina, serotonina, melatonina, neuropéptido Y, opioide, purinas, vasopresina, oxitocina, PACAP, secretina, glucagón, calcitonina, adrenomedulina, somatostatina, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, polipéptido intestinal vasoactivo y polipéptido relacionado (VIP) , somatostatina, dopamina, motilina, amilina, bradiquinina, péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP), leucotrienos, pancreastatina, prostaglandinas, tromboxano, adenosina, adrenalina, a y ß-quimiocinas (por ejemplo IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, 1-309, MIP-la, MlP-lß, RANTES, etc.), endotelina, enterogastrina, histamina, neurotensina, TRH, polipéptido pancreático, galanina, etc.) así como otras sustancias, por ejemplo, extractos tisulares y sobrenadantes de cultivo de células de humanos y mamíferos (por ejemplo ratones, ratas, cerdos, bovinos, ovejas, monos) . Por ejemplo, el extracto tisular o el sobrenadante del cultivo celular (específicamente los fragmentos peptídicos particulares de KiSS-1 descritos en Welch D. R. J. Nati. Cáncer Inst . , 88, 1731 (1996) (por ejemplo, un péptido compuesto de' 8 a 54 residuos de aminoácidos y que contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos del extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, o las amidas, esteres o sales del mismo) se agrega a la proteína receptora o similar de la presente invención, y se fracciona mientras que se evalúan las actividades de estimulación celular para dar finalmente un ligando simple. Con más detalle, el método para la determinación de un ligando de la presente invención comprende la determinación de los compuestos (por ejemplo, péptidos, proteínas, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos, productos de fermentación) o sales de los mismos que se enlazan a la proteína receptora o similares de la presente invención para proporcionar las actividades de estimulación celular (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción de cAMP intracelular, la producción de cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y la reducción del pH) , utilizando el receptor o similar de la presente invención, o utilizando el sistema de expresión de la proteína receptora recombinante, construido, en el ensayo de enlace al receptor. El método para la determinación de un ligando de la presente invención está caracterizado, por ejemplo, por la medición de la cantidad del compuesto de prueba enlazado a la proteína receptora o similar de la presente invención, o la actividad de estimulación celular cuando el compuesto de prueba es puesto en contacto con el receptor o similar de la presente invención. Más específicamente, la presente invención proporciona lo siguiente: (1) Un método para determinar un ligando para la proteína receptora de la presente invención, y las sales de la misma, que comprende el poner en contacto un compuesto de prueba marcado con la proteína receptora o similar de la presente invención, y midiendo la cantidad del compuesto de prueba marcado enlazado a la proteína receptora o similar; (2) Un método para determinar un ligando para la proteína receptora de la presente invención y las sales de la misma, que comprende el poner un compuesto de prueba marcado en contacto con las células que contienen la proteína receptora de la presente invención o con una fracción membranal de las células y midiendo la cantidad del compuesto de prueba marcado, enlazado a las células o a la fracción membranal; (3) Un método para determinar un ligando para la proteína receptora de la presente invención y las sales de la misma, que comprende el cultivar un transformante que contiene ADN que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención, poniendo un compuesto de prueba marcado en contacto con la proteína receptora o similar, expresado sobre la membrana celular mediante cultivo, y midiendo la cantidad del compuesto de prueba marcado enlazado a la proteína receptora expresada o similar; (4) Un método para determinar un ligando para la proteína receptora de la presente invención, y las sales de la misma, que comprende el poner un compuesto de prueba en contacto con las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención y midiendo las actividades de estimulación celular mediadas por la proteína receptora (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de acetilcolina, la liberación de Ca2+ intracelular, la producción de cAMP intracelular, la producción de cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y la reducción del pH) ; y (5) Un método para determinar un ligando para la proteína receptora de la presente invención y las sales de la misma, que comprende el cultivar un transformante que contiene el ADN que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención, poniendo un compuesto de prueba marcado en contacto con la proteína receptora o similar expresada sobre la membrana celular, mediante cultivo, y midiendo las actividades de estimulación celular mediadas por la proteína receptora, (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción de cAMP intracelular, la producción de cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y la reducción del pH) . En particular, se prefiere realizar los métodos (1) al (3) con lo cual se confirma que un compuesto de prueba puede enlazarse a la proteína receptora o similar de la presente invención seguido por los métodos (4) y (5). Cualquier proteína ejemplificada para ser utilizable como la proteína receptora o similar de la presente invención, puede ser utilizada para el método de la presente invención para la determinación de los ligandos. Sin embargo, la proteína receptora o similar de la presente invención que es abundantemente expresada utilizando células animales, es apropiada para la presente invención. La proteína receptora o similar de la presente invención puede ser fabricada mediante el método para la expresión descrita anteriormente, preferentemente mediante la expresión del ADN que codifica para la proteína receptora o similar en células de mamífero o insecto. Los fragmentos de ADN que codifican para la porción deseada de la proteína incluyen pero no están limitados al ADN complementario. Por ejemplo, los fragmentos génicos o de ADN sintéticos pueden también ser utilizados. Para la introducción de un fragmento de ADN que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención dentro de células animales huésped y expresar eficientemente la misma, se prefiere insertar un fragmento de ADN corriente abajo (3') del promotor de polihedrina del virus de la polihedrosis nuclear (NPV) , que es un baculovirus que tiene huéspedes de insecto, un promotor derivado de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de la metalotioneína, un promotor de choque térmico humano, un promotor de citomegalovirus, un promotor SRa o similares. La cantidad y calidad del receptor expresado puede ser determinada por un método públicamente conocido. Por ejemplo, esta determinación puede ser realizada mediante el método descrito en la literatura (Nambi, P. y colaboradores, J. Biol.. Chem. Vol. 267, pp. 19555-19559 (1992) ) . En consecuencia, el sujeto que contiene la proteína receptora o similar en el método de la presente invención para la determinación del ligando puede ser la proteína receptora o similar purificado mediante métodos públicamente conocidos, las células que contienen la proteína receptora o la fracción membranal de tales células. Donde las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención se utilizan para el método para la presente invención, para la determinación de los ligandos, las células pueden ser fijadas utilizando glutaraldehído, formalina, etc. La fijación se puede realizar mediante un método públicamente conocido. Las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención son células huésped que han expresado la proteína receptora o similar de la presente invención, cuyas células huésped incluyen Escherichia coli, Bacillus, subtilis, células de levadura, de insecto y células animales. La fracción de la membrana celular es una fracción abundante en la membrana celular, obtenida mediante destrucción de la célula y fraccionamiento subsecuente mediante un método públicamente conocido. Los métodos de destrucción celular útiles incluyen el aplastamiento celular utilizando un homogeneizador de Potter-Elvehjem, destrucción utilizando un mezclador Waring o Polytron (fabricado por Kinematica Inc.), la destrucción por ultrasonido, y la destrucción por rociado vía una boquilla delgada bajo compresión incrementada utilizando una prensa French o similar. El fraccionamiento de la membrana celular se efectúa principalmente mediante fraccionamiento utilizando una fuerza centrífuga, tal como la centrifugación para el fraccionamiento y la centrifugación por gradiente de densidad. Por ejemplo, el fluido para la destrucción o desintegración de la célula es centrifugado a una baja velocidad (500 a 3000 rpm) por un periodo corto de tiempo (normalmente aproximadamente 1 a 10 minutos) , el sobrenadante resultante es luego centrifugado a una más alta velocidad (15,000 a 30,000 rpm) normalmente por 30 minutos a 2 horas. El precipitado obtenido de este modo es utilizado como la fracción membranal. La fracción membranal es rica en la proteína receptora o similar, expresada, y los ' componentes membranales tales como los fosfolípidos derivados de células y las proteínas membranales . La cantidad de la proteína receptora o similar en las células que contienen la proteína receptora o similar, y en la fracción membranal, es preferentemente de 103 a 108 moléculas por célula, más preferentemente 105 a 107 moléculas por célula. Conforme se incrementa la cantidad de expresión, la actividad de enlace al ligando por unidad de fracción membranal (actividad específica) se incrementa de modo que no solamente el sistema de selección altamente sensible puede ser construido sino también grandes cantidades de muestras pueden ser evaluadas con el mismo lote. Para realizar los métodos (1) al (3) para la determinación de un ligando a la proteína receptora de la presente invención o sales de la misma, se requieren una fracción receptora apropiada y un compuesto de prueba marcado. La fracción de proteína receptora es preferentemente una fracción de proteína receptora de origen natural o una fracción receptora recombinante que tiene una actividad equivalente a aquella de la proteína natural. En la presente, el término "actividad equivalente" se pretende que signifique una actividad de enlace al ligando o una actividad de transducción de la señal que es equivalente a aquella poseída por las proteínas receptoras de origen natural. Los ejemplos preferidos de los compuestos de prueba marcados incluyen angiotensina, bombesina, canavinoide, colescistoquinina, glutamina, serotonina, melatonina, neuropéptido Y, opioide, purinas, vasopresina, oxitocina, PACAP, secretina, glucagón, calcitonina, adrenomedulina, somatostatina, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, polipéptido intestinal vasoactivo y polipéptido relacionado (VIP) , somatostatina, dopamina, motilina, amilina, bradiquinina, péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) , leucotrienos, pancreastatina, prostaglandinas, tromboxano, adenosina, adrenalina, a y ß-quimiocinas (por ejemplo IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2, ENA-78, PF4, IPÍO, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, 1-309, MlP-la, MlP-lß, RANTES, etc.), endotelina, enterogastrina, histamina, neurotensina, TRH, polipéptido pancreático, galanina, etc. así como los fragmentos peptídicos particulares de KiSS-1 descritos en Welch D.R. J. Nati. Cáncer Inst. 88, 1731 (1996) (por ejemplo un péptido de 8-54 residuos de aminoácidos que contiene la secuencia de 47-54 aminoácidos desde el extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, o amidas, esteres o sales de la misma), que están marcadas con [3H], [125I], [14C], [35S], etc. Más específicamente, el ligando para la proteína receptora o similar de la presente invención es determinado mediante los siguientes procedimientos. Primeramente, se lleva a cabo una preparación del receptor estándar mediante la suspensión de las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención o la fracción membranal de la misma en un amortiguador apropiado para el uso en el método de determinación. Puede ser utilizado cualquier amortiguador, siempre y cuando éste no interfiera con el enlace ligando-receptor, tales amortiguadores incluyen un amortiguador de fosfato o un amortiguador de Tris-HCl que tienen un pH de aproximadamente 4 a 10 (preferentemente pH de aproximadamente 6 a aproximadamente 8) . Para fines de minimizar el enlace no específico, un surfactante tal como CHAPS, Tween-80MR (fabricado por Kao-Atlas Inc.), la digitonina y el desoxicolato, y diversas proteínas tales como la albúmina sérica bovina, o la gelatina, pueden ser opcionalmente agregados al amortiguador. Además para fines de suprimir la degradación del receptor o el ligando por la proteasa, el inhibidor de proteasa tal como PMSF, leupeptina, E-64 (fabricado por Peptide Institut, Inc.) y la pepstatina pueden ser agregados. Una cantidad dada (5,000 a 500,000 cpm) del compuesto de prueba marcado con [3H], [125I], [14C], [35S] o similar, se agregan a 0.01-10 ml de la solución del receptor. Para determinar la cantidad del enlace específico (NSB) , un tubo de reacción que contiene un compuesto de prueba no marcado en un gran exceso es también proporcionado. La reacción se lleva a cabo aproximadamente a 0 a 50°C, preferentemente a aproximadamente 4 a 37°C por aproximadamente 20 minutos a aproximadamente 24 horas, preferentemente aproximadamente 30 minutos a 3 horas. Después de la terminación de la reacción, la mezcla de reacción se filtra a través de papel filtro de fibra de vidrio, etc., y .se lava con una cantidad apropiada del mismo amortiguador. La radioactividad residual en el papel filtro de fibra de vidrio es luego medida por medio de un contador de cintilación líquida o contador ?. Un compuesto de prueba que excede 0 cpm en la cuenta obtenida al sustraer el enlace no específico (NSB) del enlace total (B) (B menos NSB) puede ser seleccionado como el ligando (agonista) para la proteína receptora de la presente invención o sales de la misma. El método (4) ó (5) anterior para la determinación de un ligando para la proteína receptora de la presente invención o sales de la misma se puede realizar como sigue. Las actividades de estimulación celular mediadas por la proteína receptora (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción de cAMP intracelular, la producción de cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y la reducción del pH) , pueden ser determinadas por un método públicamente conocido o utilizando un equipo de ensayo comercialmente disponible. Específicamente, las células que contienen la proteína receptora son primeramente cultivadas en una placa de pozos múltiples, etc. Antes de la determinación del ligando, el medio es reemplazado con medio fresco o con un amortiguador no citotóxico apropiado, seguido por la incubación por un periodo de tiempo dado en presencia de un compuesto de prueba, etc. Subsecuentemente, las células son extraídas o el sobrenadante es recuperado y el producto resultante es cuantificado mediante procedimientos apropiados. Donde es difícil de detectar la producción de la sustancia del índice para la actividad de estimulación celular (por ejemplo ácido araquidónico) debido a una enzima de degradación contenida en las células, puede ser agregado antes del ensayo un inhibidor contra tal enzima de degradación. Para la detección de las actividades tales como la actividad de supresión de la producción de cAMP (AMP cíclico) , la producción en línea base en las células es incrementada por la forscolina o similares y el efecto supresor sobre la producción incrementada de línea base puede ser detectada luego. El equipo de la presente invención para la determinación de un ligando que se enlaza a la proteína receptora o similar de la presente invención comprende la proteína receptora o similar de la presente invención, las células que contiene la proteína receptora o similar de la presente invención, o la fracción membranal de las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención. Los ejemplos del equipo de determinación del ligando de la presente invención se dan más adelante. 1. Reactivos para la determinación de los ligandos (1) Amortiguadores para ensayo y Lavado Solución Salina Balanceada de Hanks (fabricada por Gibco Co.) suplementada con 0.05% de albúmina de suero bovino (Sigma Co.). La solución se esteriliza mediante filtración a través de un filtro de 0.45 µm y se almacena a 4°C. Alternativamente, la solución puede ser preparada al momento de la utilización. (2) Proteína receptora estándar Las células CHO sobre las cuales ha sido expresada la proteína receptora de la presente invención, son sujetas a cultivo en pases en una placa de 12 pozos en una densidad de 5 x 105 células/pozo, seguido por el cultivo a 37°C bajo 5% de C02 y 95% de aire por dos días. (3) Compuestos de prueba marcados Los compuestos marcados con [3H], [125I], [14C] o [35S] comercialmente disponibles o los compuestos marcados mediante los métodos apropiados. Una solución acuosa del compuesto es almacenada a 4°C o -20°C. La solución se diluye a 1 µm con un amortiguador de ensayo en el momento de la utilización. Un compuesto de prueba escasamente soluble en agua se disuelve en dimetilformamida, DMSO o metanol. (4) Compuestos no marcados Una forma no marcada del mismo compuesto que el compuesto marcado se prepara en una concentración de 100 a 1,000 veces mayor que aquella del compuesto marcado. 2. Método para el ensayo (1) las células CHO que expresan la proteína receptora de la presente invención se cultivan en una placa de cultivo de 12 pozos. Después de lavar dos veces con 1 ml de un amortiguador de ensayo, se agregan a cada pozo 490 µl del amortiguador de ensayo. (2) Después de agregar 5 µl del compuesto de prueba marcado, la mezcla resultante se incuba a temperatura ambiente por una hora. Para determinar el enlace no específico, se agregan al sistema 5 µl del compuesto no marcado. (3) La mezcla de reacción es removida y los pozos son lavados 3 Veces con 1 ml de amortiguador de lavado. El compuesto de prueba marcado enlazado a las células se disuelve en NaOH 0.2N-SDS al 1% y luego se mezcla con 4 ml de cintilador líquido A (fabricado por Wako Puré Chemical Industries, Ltd.). (4) La radiactividad se mide utilizando un contador de cintilación líquida (fabricado por Beckman, Co.). Los ligandos que se enlazan a la proteína receptora o similar de la presente invención, incluyen sustancias específicamente presentes en el cerebro, en la glándula pituitaria y el páncreas. Los ejemplos de tales ligandos son angiotensina, bombesina, canavinoide, colescistoquinina, glutamina, serotonina, melatonina, neuropéptido Y, opioides, purinas, vasopresina, oxitocina, PACAP, secretina, glucagón, calcitonina, adrenomedulina, somatostatina, GHRH, CRF, ACTH, GRP, PTH, polipéptido intestinal vasoactivo (VIP) , somatostatina, dopamina, motilina, amilina, bradiquinina, péptido relacionado al gen de la calcitonina (CGRP) , leucotrienos, pancreastatina, prostaglandinas, tromboxano, adenosina, adrenalina, a y ß-quimiocinas (por ejemplo IL-8, GROa, GROß, GRO?, NAP-2, ENA-78, PF4, IP10, GCP-2, MCP-1, HC14, MCP-3, 1-309, MIP- la, MlP-lß, y RANTES), endotelina, enterogastrina, histamina, neurotensina, TRH, polipéptido pancreático y galanina así como los fragmentos peptídicos particulares de KiSS-1 descritos en Welch D. R. J. Nati. Cáncer Inst., 88, 1731 (1996) (por ejemplo un péptido compuesto de 8 a 54 residuos de aminoácidos y que contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos desde el extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, o amidas, esteres o sales de la misma) . En particular, como se describirá posteriormente en el Ejemplo 3, los fragmentos peptídicos particulares de KiSS-1 descrito en Welch D. R. J. Nati. Cáncer Inst., 88, 1731 (1996) (por ejemplo un péptido compuesto de 8 a 54 residuos de aminoácidos y que contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos desde el extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, o amidas, esteres o sales de la misma) es ejemplificado como el ligando que se enlaza a la proteína receptora o similar de la presente invención. El término "péptido compuesto de 8 a 54 aminoácidos y que contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos del extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10" se refiere a cualquier péptido siempre y cuando éste sea un péptido de 8 a 54 residuos de aminoácidos y que contenga una secuencia de 47 a 54 aminoácidos desde el extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10. Tales péptidos tienen sustancialmente las mismas actividades peptídicas que aquellos de la proteína receptora o similar de la presente invención (por ejemplo, una propiedad de enlace al ligando-receptor, una actividad de estimulación celular de la célula que expresa el receptor, inducida por un ligando) . Un ejemplo preferido del péptido del ligando en la presente invención es un péptido compuesto de 8 a 15 residuos de aminoácidos que contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos contados desde el extremo N en el extremo C en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10. Más preferentemente, el ligando de la presente invención incluye un péptido (especialmente amidas del mismo) representado por la SEQ ID NO: 11, 12, 13 ó 14. Más preferentemente, el péptido ligando de la presente invención incluye un péptido en el cual el grupo carboxilo en el aminoácido en el extremo C está amidado. Con respecto a las amidas o esteres de estos péptidos y sales de los mismos, aplica la misma descripción que en las sales de la proteína receptora de la presente invención y las amidas o esteres de los fragmentos peptídicos.

Para el polinucleótido que codifica para el péptido ligando de la presente invención, cualquier polinucleótido puede ser utilizado siempre y cuando éste contenga la secuencia base (ADN o ARN, preferentemente ADN) que codifica para el péptido ligando de la presente invención. Tal polinucleótido puede ser un ADN y ARN que incluye ARNm que codifica para el péptido ligando de la presente invención. El polinucleótido puede ser de doble hebra o de una sola hebra. Donde el polinucleótido es de doble hebra, éste puede ser ADN de doble hebra o el híbrido de ADN:ARN. Donde el polinucleótido es de una sola hebra, éste puede ser una hebra en sentido (por ejemplo una hebra de codificación) o una hebra antisentido (por ejemplo, una hebra de no codificación) . El ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención puede ser cualquiera del ADN genómico, biblioteca del ADN genómico, ADNc derivado de las células y tejidos descritos anteriormente, biblioteca de ADNc derivada de las células y tejidos descritos anteriormente y ADN sintético. El vector que va a ser utilizado para la biblioteca puede ser cualquiera de un bacteriófago, plásmido, cósmido y fagémido. El ADN puede también ser directamente amplificado mediante la reacción en cadena de polimerasa de transcriptasa inversa (RT-RCR) utilizando la fracción total de ARN o ARNm, proveniente de las células y tejidos descritos anteriormente. Específicamente, el ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención puede ser cualquier ADN, siempre y cuando éste tenga una secuencia de 47 a 54 aminoácidos contados a partir del extremo N en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10 y contenga el ADN que tiene la secuencia base que codifica para un péptido compuesto de 8 a 54 residuos de aminoácidos. Ejemplos más específicos del ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención incluyen el ADN que contiene el ADN que tiene la secuencia base que codifica para el péptido que tiene la secuencia 47-54 aminoácidos desde el extremo N en el extremo C de la secuencia de aminoácido representada por la SEQ ID NO: 10, y comprende 8 a 15 residuos de aminoácidos. Más específicamente, el ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención incluye el ADN que contiene un ADN que tiene la secuencia de bases que codifica para el péptido que contiene la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11, 12, 13 ó 14 y comprende 8 a 15 residuos de aminoácidos. El ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención es, por ejemplo, el ADN que contiene la secuencia de 139-162 bases desde el extremo 5' en la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 15, y que comprende 24 a 162 bases, o similar. Más específicamente, el ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención incluye el ADN que contiene la secuencia de 139-162 bases desde el extremo 5' en el extremo 3' de la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 15 y que comprende 24 a 45 bases. Los ejemplos típicos del ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención incluyen los ADNs que contienen los ADNs que poseen las secuencias de bases respectivas representadas por la SEQ ID NO: 16, 17, 18 y 19. En la presente, los ejemplos específicos del ADN que codifica para cada secuencia correspondiente a la SEQ ID NO. son: (1) para el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 10, el ADN que contiene el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 15; (2) para el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 11, el ADN que contiene el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 16; (3) para el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 12, el ADN que contiene el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 17; (4) para el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 13, el ADN que contiene el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 18; y (5) para el ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 14, el ADN que contiene el ADN que tiene la secuencia de bases representada por la SEQ ID NO: 19. El péptido ligando de la presente invención o los esteres, amidas o sales del mismo, así como el polinucleótido que codifica para el péptido ligando puede ser fabricado de una manera similar a los métodos para fabricar la proteína receptora o similar de la presente invención, y el polinucleótido que codifica para el mismo. El péptido ligando de la presente invención, los esteres o amidas o sales del mismo (de aquí en adelante algunas veces denominados como el péptido ligando o similar de la presente invención) así como el polinucleótido que codifica para el péptido ligando son útiles como un fármaco seguro y de baja toxicidad dependiendo de la actividad del ligando.

El péptido ligando o similar de la presente invención y el AND que codifica para el mismo posee una actividad supresora de la metástasis del cáncer y son de este modo útiles para el fármaco profiláctico o terapéutico de todos los cánceres (por ejemplo cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer de intestino grueso, cáncer rectal, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer uterocervical, cáncer de mama, etc. ) . El péptido ligando o similar de la presente invención y el ADN que codifica para el mismo también poseen una actividad regulatoria de la función placentaria, y son de este modo útiles para el fármaco profiláctico o terapéutico del cáncer de los cilios, mola hidatiforme, mola invasora, aborto, hipoplasia fetal, disbolismo del azúcar, disbolismo de lípidos o inducción de parto. Donde el péptido ligando o similar de la presente invención es utilizado como un agente profiláctico/terapéutico como se describe anteriormente, el péptido ligando o similar puede ser preparado en una preparación farmacéutica mediante un método públicamente conocido. Cuando el ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces denominado como el ADN ligando de la presente invención) es utilizado como un agente profiláctico/terapéutico como se describe anteriormente, el ADN ligando de la presente invención puede ser utilizado solo o después de la inserción de éste dentro de un vector apropiado tal como el vector retroviral, vector adenoviral o de virus asociado al adenovirus, seguido por un medio convencional para la administración del fármaco. El ADN ligando de la presente invención puede ser también administrado como ADN desnudo, o con adyuvantes para ayudar a su captación por la pistola de genes o a través de un catéter, tal como un catéter con un hidrogel. Por ejemplo, (1) el péptido ligando o similar de la presente invención o (2) el ADN que codifica para el péptido ligando, pueden ser utilizados oralmente en la forma de tabletas que pueden estar recubiertas con azúcar, si es necesario y deseado, cápsulas, elíxires, microcápsulas, etc., o parenteralmente en la forma de preparaciones inyectables tales como una solución estéril y una suspensión en agua o con otro líquido farmacéuticamente aceptable. Estas preparaciones pueden ser fabricadas mediante el mezclado (1) del péptido ligando o similar de la presente invención o (2) el ADN que codifica para el péptido ligando con un portador fisiológicamente aceptable, conocido, agente saborizante, excipiente, vehículo, antiséptico, estabilizador, aglutinante, etc., en una forma de dosis unitaria requerida de una manera en general aceptada, aplicada, a la elaboración de preparaciones farmacéuticas. El ingrediente activo en la preparación es controlado en una dosis tal que es obtenida una dosis apropiada dentro del intervalo específico dado. Los aditivos miscibles con tabletas, cápsulas, etc., incluyen un aglutinante tal como gelatina, almidón de maíz, tragacanto y goma arábiga, un excipiente tal como celulosa cristalina, un agente de hinchamiento tal como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico, un lubricante tal como estearato de magnesio, un agente endulzante tal como sucrosa, lactosa, y sacarina, y un agente saborizante tal como menta, aceite de akamono, y cereza. Cuando la dosis unitaria está en la forma de cápsulas, portadores líquidos, tales como aceites y grasas, pueden ser utilizados conjuntamente con los aditivos descritos anteriormente. Una composición estéril para la inyección puede ser formulada de acuerdo á una manera convencional utilizada para fabricar composiciones farmacéuticas, por ejemplo, mediante la disolución o suspensión de los ingredientes activos en un vehículo tal como agua para inyección con un aceite vegetal de origen natural tal como aceite de ajonjolí y aceite de coco, etc., para preparar la composición farmacéutica. Los ejemplos de un medio acuoso' pare inyección incluyen solución salina fisiológica y una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares (por ejemplo, D-sorbitol, D-manitol, y cloruro de sodio) y pueden ser utilizados en combinación con un auxiliar apropiado de la disolución, tal como un alcohol (por ejemplo etanol) , un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol) , un surfactante no iónico (por ejemplo, polisorbato 80MR y HCO-50) , etc. Como un medio aceitoso, por ejemplo, aceite de ajonjolí y aceite de soya, pueden también ser utilizados los cuales pueden ser utilizados en combinación con un auxiliar de la disolución tal como benzoato de bencilo y alcohol bencílico. Además, el agente profiláctico/terapéutico descrito anteriormente puede también ser formulado con un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de fosfato y amortiguador de fosfato de sodio) , un agente calmante (por ejemplo, cloruro de benzalconio, clorhidrato de procaína) un estabilizador (por ejemplo, albúmina sérica humana, polietilenglicol), un conservador (por ejemplo, alcohol bencílico, fenol) un antioxidante, etc. El líquido preparado de este modo para inyección es normalmente llenado en una ampolleta apropiada. Ya que la preparación farmacéutica obtenida de este modo es segura y de baja toxicidad, la preparación puede ser administrada a humanos o mamíferos (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, ovejas, cerdos, bovinos, gatos, perros, monos, etc.). La dosis del péptido ligando o similar de la presente invención, varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc.; en la administración oral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 50 mg, y más preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg por día para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . En la administración parenteral, la dosis simple varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc., pero es ventajoso administrar el ingrediente activo intravenosamente a una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, preferentemente aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg, y más preferentemente aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . Para otra especie animal, puede ser administrada la dosis correspondiente convertida por peso de 60 kg. La dosis del ADN ligando de la presente invención varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc.; en la administración oral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 50 mg, y más preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg por día para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . En la administración parenteral, la dosis simple varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc., pero puede ser ventajoso el administrar el ingrediente activo intravenosamente a una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, preferentemente aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg, y más preferentemente aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . Para otras especies animales, la dosis correspondiente convertida por peso de 60 kg, puede también ser administrada. (2) Agentes profilácticos y/o terapéuticos para las enfermedades asociadas con la disfunción de la proteína receptora de la presente invención. La proteína receptora o similar de la presente invención o el ADN que codifica para la proteína receptora o similar, pueden ser utilizados como un agente profiláctico y/o terapéutico para enfermedades asociadas con la disfunción del péptido ligando de la presente invención. Por ejemplo, cuando cualquier actividad fisiológica de la proteína receptora de la presente invención no puede ser esperada debido a un nivel reducido de la proteína receptora en un paciente (deficiencia en la proteína receptora) , la actividad del ligando puede ser exhibida por los siguientes métodos: (1) la proteína receptora o similar de la presente invención se administra al paciente para suplementar la cantidad de la proteína receptora o similar; (2) la cantidad de la proteína receptora de la presente invención es incrementada en el paciente por: a) la administración del ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención al paciente, para la expresión, o mediante b) la inserción del ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención en las células objetivo para la expresión, y las células expresadas de este modo son luego transplantadas al paciente. De este modo, la cantidad de la proteína receptora de la presente invención puede ser incrementada en el paciente, con lo cual la actividad del ligando puede ser mostrada suficientemente. Por lo tanto, la proteína receptora o similar de la presente invención o el ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención es útil como un fármaco profiláctico y/o terapéutico seguro y de baja toxicidad, para enfermedades asociadas con la disfunción de la proteína receptora de la presente invención. La proteína receptora o similar de la presente invención y el ADN que codifica para la proteína receptora o similar, posee una actividad supresora de la metástasis del cáncer, y son de este modo útiles para el fármaco profiláctico o terapéutico de todos los cánceres (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer de hígado, cáncer de páncreas, cáncer del intestino grueso, cáncer rectal, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de ovario, cáncer uterocervical, cáncer de mama, etc.). La proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención y el ADN que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención, también posee una actividad reguladora de la función placentaria, y son de este modo útiles para el fármaco profiláctico o terapéutico de cáncer de los cilios, mola hidatiforme, mola invasora, aborto, hipoplasia fetal, disbolismo del azúcar, disbolismo de lípidos o inducción de parto. Donde la proteína receptora o similar de la presente invención es utilizado como un agente profiláctico/terapéutico como se describe anteriormente, la proteína receptora o similar puede ser preparada en una preparación farmacéutica mediante un método públicamente conocido. Cuando el ADN que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces denominado como el ADN de la presente invención) se utiliza como un agente profiláctico/terapéutico como se describe anteriormente, el ADN de la presente invención puede ser utilizado solo o después de insertarlo en un vector apropiado tal como el vector retroviral, vector adenoviral o el vector de virus asociado al adenovirus, seguido por un medio convencional para la administración del fármaco. El ADN de la presente invención puede también ser administrado como ADN desnudo, o con adyuvantes para ayudar a su captación por la pistola del gen a través de un catéter tal como un catéter con un hidrogel . Por ejemplo, (1) la proteína receptora o similar de la presente invención o (2) el ADN que codifica para la proteína receptora o similar se puede utilizar oralmente o en la forma de tabletas que pueden estar recubiertas con azúcar si es necesario y deseado, cápsulas, elíxires, microcápsulas, etc., o parenteralmente en la forma de preparaciones inyectables tales como una solución estéril y una suspensión en agua o con otro líquido farmacéuticamente aceptable. Estas preparaciones pueden ser fabricadas mediante la mezcla de (1) la proteína receptora o similar de la presente invención o (2) el ADN que codifica para la proteína receptora o similar con un portador conocido fisiológicamente aceptable, agente saborizante, excipiente, vehículo, antiséptico, estabilizador, aglutinante, etc., en una forma de dosis unitaria, requerida, de una manera en general aceptada aplicada a la elaboración de preparaciones farmacéuticas. El ingrediente activo en la preparación es controlado en una dosis tal que se obtenga una dosis apropiada dentro del intervalo específico dado. Los aditivos miscibles con tabletas, cápsulas, etc. incluyen un aglutinante tal como gelatina, almidón de maíz, tragacanto y goma arábiga, un excipiente tal como celulosa cristalina, un agente de hinchamiento tal como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico, un lubricante tal como estearato de magnesio, un agente endulzante tal como sucrosa, lactosa y sacarina, y un agente saborizante tal como menta, aceite de akamono y cereza. Cuando la dosis unitaria está en la forma de cápsulas, los portadores líquidos tales como aceites y grasas pueden además ser utilizados junto con los aditivos anteriormente descritos. Una composición estéril para la inyección puede ser formulada de acuerdo a una manera convencional utilizada para elaborar composiciones farmacéuticas, por ejemplo, mediante la disolución o suspensión de los ingredientes activos en un vehículo tal como agua para inyección con un aceite vegetal de origen natural tal como aceite de ajonjolí y aceite de coco, etc., para preparar la composición farmacéutica. Los ejemplos de un medio acuoso para la inyección incluyen solución salina fisiológica y una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares (por ejemplo, D-sorbitol, D-mannitol y cloruro de sodio) y pueden ser utilizados en combinación con un auxiliar de la disolución, apropiado tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol), un surfactante no iónico (por ejemplo, polisorbato 80MR y HCO-50) , etc. Como un medio aceitoso, por ejemplo, puede ser utilizado el aceite de ajonjolí y el aceite de soya, los cuales pueden ser utilizados en combinación con un auxiliar de la disolución tal como benzoato de bencilo y alcohol bencílico. Además, el agente profiláctico/terapéutico descrito anteriormente puede también ser formulado con un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de fosfato y amortiguador de acetato de sodio) un agente calmante (por ejemplo, cloruro de benzalconio, clorhidrato de procaína) , un estabilizador (por ejemplo, albúmina sérica humana, polietilenglicol) , un conservador (por ejemplo, alcohol bencílico, fenol), un antioxidante, etc. El líquido preparado de este modo para la inyección es normalmente rellenado en una ampolleta apropiada. Ya que la preparación farmacéutica obtenida de este modo es segura y de baja toxicidad, la preparación puede ser administrada a humanos o mamíferos (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, ovejas, cerdos, bovinos, gatos, perros, monos, etc.). La dosis de la proteína receptora o similar de la presente invención varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc.; en la administración oral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 50 mg, y más preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg por día para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . En la administración parenteral, la dosis simple varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc., pero es ventajoso administrar el ingrediente activo intravenosamente a una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg, y más preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . Para otra especie animal, puede ser administrada la dosis correspondiente como sea convertida por 60 kg de peso corporal. La dosis del ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc.; en la administración oral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 50 mg, y más preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg por día para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . En la administración parenteral, la dosis simple varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, de la ruta de administración, etc., pero es ventajoso administrar el ingrediente activo intravenosamente a una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg, y más preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . Para otra especie animal, puede ser administrada la dosis correspondiente como sea convertida por 60 kg de peso corporal. (3) Agente de diagnóstico de gen Utilizando como una sonda el ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención o el ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención, puede ser detectada una anormalidad (anormalidad génica) del ADN o el ARNm que codifica para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención en humanos o animales (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, ovejas, cerdos, bovinos, gatos, perros, monos, etc.). Por lo tanto, el ADN de la presente invención es útil como un agente de diagnóstico de genes para el daño al ADN o al ARNm, la mutación del mismo, o la expresión disminuida del mismo, o la expresión incrementada o sobre-expresión del ADN o ARNm. El diagnóstico del gen descrito anteriormente utilizando el ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención o el ADN que codifica para el péptido ligando de la presente invención, se puede realizar mediante, por ejemplo, el ensayo de hibridación de Northern públicamente conocido, o el ensayo de PCR-SSCP (Genomics, 5, 874-879 (1989); Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 86, 2766-2770 (1989) ) . (4) Cuantificación del ligando para la proteína receptora o similar de la presente invención Ya que la proteína receptora o similar de la presente invención tiene una propiedad de enlace al ligando, la actividad del ligando puede ser cuantificada in vivo con alta sensibilidad. El método para la cuantificación de la presente invención puede ser efectuado, por ejemplo, en combinación con un método competitivo. De este modo, una muestra que va a ser determinada es puesta en contacto con la proteína receptora o similar de la presente invención, con lo cual la concentración del ligando en la muestra puede ser determinada. Específicamente, la cuantificación puede ser realizada mediante el siguiente método (1) ó (2) siguientes o su modificación: (1) Hiroshi Irie (ed.): "Radioinmmunoassay" (1974, publicado por Kodansha, Japón); y (2) Hiroshi Irie (ed. ) : "Radioimmunoassay, Second Series" (1979, publicado por Kodansha, Japón) . (5) Un método para la selección del compuesto (agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora, las sales de la misma y el ligando de la presente invención (péptido ligando de la presente invención) Mediante el uso de la proteína receptora de la presente invención o las sales de la misma, o mediante la construcción del sistema de expresión del sistema de expresión de la proteína receptora recombinante o similar, y utilizando el sistema de ensayo de enlace al receptor vía el sistema de expresión, se puede realizar la selección eficientemente sobre el compuesto (por ejemplo, péptido, proteína, un compuesto no peptídico, un compuesto sintético, el producto de fermentación, etc.) o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención. Los ejemplos de los compuestos anteriores incluyen (a) un compuesto que muestra actividades de estimulación celular mediadas por el receptor acoplado a la proteína G (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción del cAMP intracelular, la producción del cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y reducción del pH) (los denominados agonistas para la proteína receptora o similar de la presente invención) , (b) un compuesto libre de tal actividad de estimulación celular (llamados antagonistas para la proteína receptora o similar de la presente invención) ; o (c) un compuesto que disminuye la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención (el compuesto (a) es seleccionado preferentemente mediante el método para la determinación del ligando descrito anteriormente) . De este modo, la presente invención también proporciona un método para seleccionar un compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora o similar de la presente invención y el ligando (péptido ligando de la presente invención) , que comprende el comparar los siguientes dos casos: (i) el caso en donde la proteína receptora o similar de la presente invención es puesto en contacto con el ligando (péptido ligando de la presente invención) ; y (ii) el caso en donde la proteína receptora o similar de la presente invención es puesto en contacto con el ligando (péptido ligando de la presente invención) y un compuesto de prueba.

En el método de selección para la presente invención, se realiza la comparación entre los casos (i) y (ii) en términos de, por ejemplo, la cantidad del ligando (péptido ligando de la presente invención) que se enlaza a la proteína receptora o similar, o las actividades de estimulación celular. Más específicamente, la presente invención proporciona los siguientes métodos. (1) Un método para seleccionar un compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre un ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, que comprende el medir la cantidad de un ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) enlazado a la proteína receptora o similar de la presente invención en el caso en donde el ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) es puesto en contacto con la proteína receptora o similar de la presente invención y en el caso en donde el ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) y un compuesto de prueba son puestos en contacto con la proteína receptora o similar, y se compara la cantidad de enlace del ligando marcado entre los dos casos. (2) Un método para seleccionar un compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre un ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, que comprende el medir la cantidad de un ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) enlazado a las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención o una fracción celular de la misma, en el caso donde el ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) se pone en contacto con las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención o la membrana celular, y en el caso en donde el ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) y un compuesto de prueba son puestos en contacto con las células que contienen la proteína receptora o similar o la membrana celular, y comparando la cantidad de enlace del ligando marcado entre los dos casos. (3) Un método para seleccionar un compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre un ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, que comprende el medir la cantidad de un ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) enlazado a la proteína receptora o similar de la presente invención, en el caso en donde el ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) es puesto en contacto con la proteína receptora o similar expresada en la membrana celular, mediante cultivo de un transformante que contiene el ADN de la presente invención y en el caso en donde el ligando marcado (péptido ligando de la presente invención) y un compuesto de prueba son puestos en contacto con la proteína receptora o similar, expresada en la membrana celular mediante cultivo de un transformante que contiene el ADN de la presente invención, y comparando la cantidad de enlace del ligando marcado entre los dos casos. (4) Un método para seleccionar un compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre un ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, que comprende el medir las actividades de estimulación celular mediadas por el receptor (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción del cAMP intracelular, la producción del cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y reducción del pH) en el caso en donde un compuesto (por ejemplo, un ligando a la proteína receptora o similar de la presente invención) que activa la proteína receptora o similar de la presente invención se pone en contacto con las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención y en el caso en donde el compuesto que activa la proteína receptora o similar de la presente invención y un compuesto de prueba se ponen en contacto con las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención, y comparar las actividades de estimulación celular entre los dos casos. (5) Un método para seleccionar un compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre un ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, que comprende el medir las actividades de estimulación celular mediadas por el receptor (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción del cAMP intracelular, la producción del cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y reducción del pH) en el caso en donde un compuesto que activa el péptido ligando o similar de la presente invención (por ejemplo, un ligando (ligando de la presente invención) a la proteína receptora o similar de la presente invención) se pone en contacto con la proteína receptora o similar de la presente invención, expresada en una membrana celular mediante el cultivo de un transformante que contiene el ADN de la presente invención y en el caso en donde el compuesto que activa la proteína receptora o similar de la presente invención y un compuesto de prueba, son puestos en contacto con la proteína receptora o similar de la presente invención expresada en una membrana celular, mediante el cultivo de un transformante que contiene el ADN de la presente invención, y comparando las actividades de estimulación celular entre los dos casos. Antes de que se obtenga la proteína receptora o similar de la presente invención, la selección del agonista o antagonista del receptor acoplado a la proteína G, debe haber sido realizada en términos de si un compuesto candidato pudiera inhibir o no el enlace entre las proteínas receptoras acopladas a la proteína G y los ligandos, utilizando células, tejidos o fracciones de la membrana celular que contienen las proteínas receptoras acopladas a la proteína G. Cuando las células, tejidos o las fracciones de membrana celular se utilizan como tales, no obstante, existen inevitablemente otras proteínas receptoras. Fue de este modo difícil seleccionar los agonistas o antagonistas para las proteínas receptoras deseadas . No obstante, el uso de la proteína receptora o similar de la presente invención hace posible el seleccionar eficientemente el compuesto que inhibe el enlace entre un ligando y la proteína receptora acoplada a la proteína G. Además, se puede evaluar simplemente si el compuesto seleccionado es o no ya sea un agonista o un antagonista. De aquí en adelante, el método de selección para la presente invención será descrito más específicamente. Primeramente, la proteína receptora o similar de la presente invención, que se utiliza para el método de selección de la presente invención, puede ser cualquier proteína siempre y cuanto ésta contenga la proteína receptora o similar de la presente invención descrita anteriormente, aunque una fracción membranal de los órganos de mamífero es preferentemente empleada. Para la selección que requiere grandes cantidades de la proteína receptora, es ventajoso utilizar las proteínas receptoras expresadas abundantemente por un recombinante. En la fabricación dé la proteína receptora o similar de la presente invención, los métodos descritos anteriormente pueden ser utilizados, aunque el ADN de la presente invención es preferentemente expresado en células de mamífero o en células de insecto. Como el fragmento de ADN que codifica para la región proteica objetivo, puede ser utilizado el ADN complementario, pero éste no se limita al mismo. Por ejemplo, los fragmentos de genes o ADN sintéticos pueden también ser utilizados como el fragmento de ADN. Con el fin de introducir el fragmento de ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención dentro de células animales huésped y expresarlo eficientemente, el fragmento de ADN es preferentemente incorporado en un promotor poliédrico del virus de la polihedrosis nuclear (NPV) que pertenece al baculovirus, un promotor derivado de SV40, un promotor de retrovirus, un promotor de metalotioneína, un promotor de choque térmico humano, un promotor de citomegalovirus, el promotor SRa, etc. en la parte corriente abajo (3') del mismo. La cantidad y calidad de los receptores expresados de este modo puede ser examinada mediante un método públicamente conocido, por ejemplo, mediante el método descrito en Nambi, P. et al., J. Biol. Chem., 267, 19555-19559 (1992). En consecuencia, en el método de selección para la presente invención, la sustancia que contiene la proteína receptora o similar de la presente invención puede ser la proteína receptora o similar que es purificada mediante métodos públicamente conocidos. Alternativamente, las células que contienen la proteína receptora o similar o una fracción de la membrana celular de las células que contienen la proteína receptora o similar, pueden también ser utilizadas.

Donde las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención son utilizadas en el método de selección para la presente invención, estas células pueden ser fijadas con glutaraldehído, formalina, etc. La fijación puede ser llevada a cabo mediante un método públicamente conocido. Las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención se refieren a las células huésped que expresan la proteína receptora o similar. Los ejemplos de tales células huésped incluyen Escheri chia coli , Bacillus subtilis, levadura, células de insecto y células animales. La fracción de la membrana celular se refiere a una fracción que contiene abundantemente las membranas celulares preparadas mediante un método públicamente conocido después de desintegrar las células. Los ejemplos de desintegración o destrucción celular incluyen la trituración celular utilizando un homogeneizador Potter- Elvehjem, la desintegración utilizando un mezclador Waring o Polytron (fabricado por Kinematica Inc.), la desintegración mediante ultrasonicación, y desintegración mediante rociado celular vía una boquilla delgada bajo presión incrementada utilizando una prensa French o similar. El fraccionamiento de la membrana similar es efectuado principalmente mediante el fraccionamiento utilizando una fuerza centrífuga, tal como centrifugación para el fraccionamiento y centrifugación por gradiente de densidad. Por ejemplo, el fluido de desintegración celular es centrifugado a una baja velocidad (500 rpm a 3,000 rpm) por un periodo corto de tiempo (normalmente aproximadamente 1 a aproximadamente 10 minutos), y el sobrenadante resultante es luego centrifugado a una velocidad mayor (15,000 rpm a 30,000 rpm) normalmente por 30 minutos a 2 horas. El precipitado obtenido de este modo es utilizado como la fracción membranal. La fracción membranal es rica en la proteína receptora o similar expresada, y los componentes membranales tales como los fosfolípidos derivados de la célula y las proteínas membranales. La cantidad de la proteína receptora contenida en las células que contienen la proteína receptora o similar o en la fracción membranal, es preferentemente de 103 a 108 moléculas por células, más preferentemente 105 a 107 moléculas por células. Conforme se incrementa la cantidad de expresión, la actividad de enlace al ligando por unidad de fracción membranal (actividad específica) se incrementa de modo que no solamente puede ser construido el sistema de selección altamente sensible, sino también se pueden evaluar grandes cantidades de muestras con el mismo lote. Para realizar los métodos (1) al (3) para la selección del compuesto que altera la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, una fracción proteica receptora apropiada y un ligando marcado son requeridos. La fracción de proteína receptora es preferentemente una fracción de la proteína receptora de origen natural o una fracción de proteína receptora recombinante que tiene una actividad equivalente a aquella de la proteína de origen natural. En la presente, el término "actividad equivalente" se pretende que signifique una actividad de enlace al ligando o una actividad de transducción de señal que es equivalente a aquella poseída por las proteínas receptoras de origen natural. Los ejemplos del ligando marcado incluyen ligandos que están marcados con [3H] , [125I] , [14C] o [35S] . Más específicamente, el compuesto que altera la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención, se seleccionan mediante los siguientes procedimientos. Primeramente, una preparación estándar del receptor es preparada mediante la suspensión de las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención o la fracción membranal de la misma en un amortiguador apropiado para el uso en el método de' selección. Cualquier amortiguador puede ser utilizado, siempre y cuando éste no interfiera con el enlace ligando-receptor. Los ejemplos de tales amortiguadores son un amortiguador de fosfato o un amortiguador de Tris-HCl, que tiene pH de aproximadamente 4 a 10 (preferentemente pH de aproximadamente 6 a 8) . Para fines de minimizar el enlace no específico, se puede agregar a los amortiguadores un surfactante tal como CHAPS, Tween-80mR (Kao-Atlas Inc.), digitonina o desoxicolato. Además, para fines de suprimir la degradación del receptor o ligando (péptido ligando de la presente invención) por la proteasa, se puede agregar también un inhibidor de proteasa tal como PMSF, leupeptina, E-64 (fabricado por Peptide Institute, Inc.) y pepstatina. Una cantidad dada (5,000 a 500,000 cpm) del ligando (péptido ligando de la presente invención) marcado, es agregado a 0.01 a 10 ml de la solución receptora, en la cual 10"4 M a 10"10 M del compuesto de prueba está también presente. Para determinar la cantidad del enlace no específico (NSB) , se proporciona también un tubo de reacción que contiene un ligando no marcado (péptido ligando de la presente invención) en un gran exceso. La reacción se lleva a cabo aproximadamente de 0 a 50 °C, preferentemente aproximadamente de 4 a 37 °C por aproximadamente 20 minutos hasta aproximadamente 24 horas, preferentemente aproximadamente 30 minutos a 3 horas. Después de la terminación de la reacción, la mezcla de reacción se filtra a través de papel filtro de fibra de vidrio, etc., y se lava con una cantidad apropiada del mismo amortiguador. La radioactividad residual en el papel filtro de fibra de vidrio, es luego medida por medio de un contador de cintilación líquida o contador ?. Cuando el enlace no específico (NSB) es sustraído de la cuenta (B0) donde cualquier sustancia antagonista está ausente y la cuenta resultante (B0 menos NSB) es hecha al 100%, un compuesto de prueba que muestra la cantidad de enlace específico (B menos NSB) por ejemplo del 50% o menos puede ser seleccionado como un compuesto candidato. El método (4) ó (5) anterior para la selección del compuesto que altera la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención se puede realizar como sigue. En una modalidad, las actividades de estimulación celular mediadas por la proteína receptora (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción del cAMP intracelular, la producción del cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y reducción del pH) se pueden determinar mediante un método públicamente conocido, o utilizando un equipo de ensayo comercialmente disponible. Específicamente, las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención son primeramente cultivadas en una placa de pozos múltiples, etc. Antes de la selección, el medio es reemplazado con medio fresco o con un amortiguador no citotóxico apropiado, seguido por la incubación por un periodo dado de tiempo en presencia de un compuesto de prueba, etc. Subsecuentemente, las células son extraídas o el sobrenadante es recuperado y el producto resultante es cuantificado mediante procedimientos apropiados. Donde es difícil detectar la producción de la sustancia con índice de actividad estimuladora de células (por ejemplo, ácido araquidónico) debido a una enzima de degradación contenida en las células, puede ser agregado antes del ensayo un inhibidor contra tal enzima degradadora. Para la detección de las actividades tales como la actividad de supresión de la producción de cAMP, la producción de línea base en las células es incrementada por forscolina o similar y el efecto de supresión sobre la producción de línea base incrementada puede ser luego detectado. Para la selección a través de la medición de las actividades de estimulación celular, las células en las cuales es expresada una proteína receptora apropiada, son necesarias. Las células preferidas en las cuales la proteína receptora o similar de la presente invención es expresada, son una línea celular de origen natural que contiene la proteína receptora o similar de la presente invención y la línea celular anteriormente mencionada en la cual la proteína receptora tipo recombinante o similar es expresada . Los ejemplos del compuesto de prueba incluyen péptidos, proteínas, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos, productos de fermentación, extractos celulares, extractos vegetales y extractos de tejido animal. Estos compuestos de prueba pueden ser novedosos o bien públicamente conocidos. Un equipo para la selección del compuesto o una sal del mismo que altera la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención comprende la proteína receptora o similar de la presente invención, las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención, o una fracción membranal de las células que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención. Los ejemplos del equipo de selección incluyen lo siguiente : 1. Reactivo para la selección (1) Amortiguadores para ensayo y lavado Solución Salina Balanceada de Hanks (fabricada por Gibco) suplementada con 0.05% de albúmina de suero bovino (fabricada por Sigma). Los amortiguadores pueden ser esterilizados mediante filtración a través de un filtro de membrana con un tamaño de poro de 0.45 µm y almacenados a 4°C, o pueden ser preparados en el momento del uso. (2) Preparación de proteína receptora acoplada a la proteína G Las células CHO en las cuales la proteína receptora de la presente invención es expresada, son subcultivadas a 5 x 105 células/pozo en una placa de 12 pozos seguido por el cultivo a 37°C bajo 5% de C02 y 95% de aire por 2 días. (3) Ligando marcado El ligando que es marcado con [3H] , [125I], [14C] , [35S] , etc. comercialmente disponibles. El producto en la forma de una solución acuosa es almacenado a 4°C ó a -20°C y diluido a 1 µM con un amortiguador para el ensayo en el momento de la utilización. (4) Solución de ligando estándar El ligando se disuelve en PBS que contiene 0.1% de albúmina sérica bovina (fabricada por Sigma) para hacerla 1 mM y se almacena a -20°C. 2. Método para el ensayo (1) Las células CHO son cultivadas en una placa de cultivo de tejido de 12 pozos para expresar la proteína receptora de la presente invención. Después del lavado de las células CHO que expresan la proteína receptora, dos veces con 1 ml de amortiguador para el ensayo, se agregan a cada pozo 490 µl del amortiguador para el ensayo. (2) Después se agregan 5 µl de una solución del compuesto de prueba de 10"3 a 10"10 M, se agregan 5 µl del ligando marcado al sistema, seguido por la incubación a temperatura ambiente por una hora. Para determinar la cantidad del enlace no específico, se agregan al sistema 5 µl del ligando de 10~3 M, en vez del compuesto de prueba. (3) La mezcla de reacción es removida del pozo, el cual se lava tres veces con 1 ml cada vez del amortiguador de ensayo. El ligando marcado enlazado a las células se disuelve en NaOH 0.2 N-SDS al 1% y se mezcla con 4 ml de un cintilador líquido A (fabricado por Wako Puré Chemical, Japón) . (4) La radioactividad se mide utilizando un contador de cintilación líquida (fabricado por Beckmann) y PMB (por ciento de enlace máximo) es calculada de acuerdo con la siguiente ecuación: PMB = [ (B-NSB)/(B0-NSB) ] X 100 en donde: PMB: por ciento del enlace máximo B: valor cuando es agregada una muestra NSB: enlace no específico Bo: enlace máximo El compuesto o una sal del mismo, obtenible mediante el método de selección o por el equipo de selección de la presente invención es un compuesto que funciona para alterar la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora o similar de la presente invención. Más específicamente, el compuesto incluye (a) un compuesto que muestra actividades de estimulación celular mediadas por el receptor acoplado a la proteína G (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la • liberación del Ca2+ intracelular, la producción del cAMP intracelular, la producción del cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y reducción del pH) (los denominados agonistas para la proteína receptora de la presente invención) , (b) un compuesto libre de tal actividad de estimulación celular (denominados antagonistas para la proteína receptora de la presente invención) ; y (c) un compuesto que disminuye la propiedad de enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora de la presente invención. Los ejemplos de tales compuestos incluyen péptidos, proteínas, compuestos no peptídicos, compuestos sintéticos y productos de fermentación. Estos compuestos pueden ser novedosos o bien públicamente conocidos. El agonista para la proteína receptora o similar de la presente invención tiene la misma actividad fisiológica que aquella del ligando (péptido ligando de la presente invención) para la proteína receptora o similar de la presente invención. Por lo tanto, el agonista es útil como un producto farmacéutico seguro y de baja toxicidad, dependiendo de la actividad del ligando. Con mayor detalle, el agonista para la proteína receptora o similar de la presente invención posee una actividad supresora de la metástasis del cáncer y son de este modo útiles para la profilaxis o terapia de todos los cánceres (por ejemplo, cáncer de pulmón, cáncer gástrico, cáncer del hígado, cáncer del páncreas, cáncer del intestino grueso, cáncer rectal, cáncer del colon, cáncer de la próstata, cáncer de ovario, cáncer uterocervical, cáncer de mama, etc.). El agonista para la proteína receptora o similar de la presente invención también posee una actividad reguladora de la función placentaria, y son de este modo útiles para el fármaco profiláctico o terapéutico de cáncer de los cilios, mola hidatiforme, mola invasora, aborto, hipoplasia fetal, disbolismo de azúcar, disbolismo de lípidos o inducción de parto. El antagonista para la proteína receptora o similar de la presente invención puede suprimir la actividad fisiológica que el ligando tiene (péptido ligando de la presente invención) para la proteína receptora o similar de la presente invención. Por lo tanto, el antagonista es útil como un producto farmacéutico seguro y de baja toxicidad para suprimir la actividad del ligando. El compuesto que disminuye el enlace entre el ligando (péptido ligando de la presente invención) y la proteína receptora de la presente invención es útil como un grupo farmacéutico seguro y de baja toxicidad para disminuir la actividad fisiológica que el ligando tiene (péptido ligando de la presente invención) para la proteína receptora o similar de la presente invención. Cuando el compuesto o una sal del mismo obtenible mediante el método de selección o mediante el equipo de selección de la presente invención, es utilizado como la composición farmacéutica descrita anteriormente, puede ser aplicado un medio convencional para elaborar la composición. Por ejemplo, el compuesto o una sal del mismo puede ser preparado en tabletas, cápsulas, elíxires, microcápsulas, soluciones estériles, suspensiones, etc. Ya que la preparación obtenida de este modo es segura y de baja toxicidad, ésta puede ser administrada a humanos o mamíferos (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, ovejas, cerdos, bovinos, gatos, perros, monos, etc.). La dosis del compuesto o una sal del mismo (en el cado de agonista) varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, del método de administración, etc.; en la administración oral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 50 mg, más preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg por día para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . En la administración parenteral, la dosis simple varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, del método para la administración, etc. pero es ventajoso administrar el ingrediente activo intravenosamente a una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg, más preferentemente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . Para otra especie animal, puede ser administrada la dosis correspondiente como es convertida por 60 kg de peso corporal. (6) Una composición para la profilaxis y/o terapia para diversas enfermedades, que comprende el compuesto (agonista, antagonista) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora o similar de la presente invención y el ligando (péptido ligando de la presente invención) Como se estableció anteriormente en la presente, la proteína receptora o similar de la presente invención juega algún papel importante in vivo, tal como la actividad supresora de la metástasis del cáncer. Por lo tanto, el compuesto (agonista, antagonista) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora o similar de la presente invención y el ligando (péptido ligando de la presente invención) puede ser utilizado para el agente profiláctico y/o terapéutico de las enfermedades asociadas con la disfunción de proteína receptora o similar de la presente invención. Cuando el compuesto anterior es utilizado como la composición farmacéutica para la prevención y/o tratamiento de enfermedades asociadas con la disfunción de la proteína receptora o similar de la presente invención, se puede aplicar un medio convencional para elaborar la composición. Por ejemplo, el compuesto puede ser preparado en una tableta recubierta con azúcar, una cápsula, un elíxir o una microcápsula para la administración oral y para la administración parenteral en la forma de preparaciones inyectables tales como una solución estéril y una suspensión en agua o con otro líquido farmacéuticamente aceptable. Estas preparaciones pueden ser fabricadas mediante el mezclado del compuesto con un portador conocido fisiológicamente aceptable, agente saborizante, excipiente, vehículo, antiséptico, estabilizador, aglutinante, etc. en una forma de dosis unitaria requerida de una manera en general aceptada, para elaborar preparaciones farmacéuticas. El ingrediente activo en la preparación es controlado en una dosis tal que es obtenida una dosis apropiada dentro del intervalo específico dado. Los aditivos miscibles con tabletas o cápsulas incluyen un aglutinante tal como gelatina, almidón de maíz, tragacanto y goma arábiga, un excipiente tal como celulosa cristalina, un agente de hinchamiento tal como almidón de maíz, gelatina y ácido algínico, un lubricante tal como estearato de magnesio, un agente endulzante tal como sucrosa, lactosa y sacarina, y un agente saborizante tal como menta, aceite de akamono y cereza. Cuando la dosis unitaria está en la forma de cápsulas, pueden además ser utilizados portadores líquidos tales como aceites y grasas conjuntamente con los aditivos descritos anteriormente. Una composición estéril para la inyección puede ser formulada mediante un método públicamente conocido utilizado para la elaboración de composiciones farmacéuticas, por ejemplo, mediante la disolución o suspensión de los ingredientes activos en un vehículo tal como agua para la inyección con un aceite vegetal origen natural tal como aceite de ajonjolí y aceite de coco, etc., para preparar la composición farmacéutica. Los ejemplos de un medio acuoso para la inyección incluyen solución salina fisiológica y una solución isotónica que contiene glucosa y otros agentes auxiliares (por ejemplo, D-sorbitol, D-manitol y cloruro de sodio) y pueden ser utilizados en combinación con un auxiliar apropiado de la disolución tal como un alcohol (por ejemplo, etanol), un polialcohol (por ejemplo, propilenglicol y polietilenglicol), un surfactante no iónico (por ejemplo, polisorbato 80R y HCO-50), etc. Como un medio aceitoso, por ejemplo, se puede utilizar el aceite de ajonjolí y aceite de soya, que pueden ser utilizados en combinación con un auxiliar de la disolución tal como benzoato de bencilo y alcohol bencílico. Además, el agente profiláctico/terapéutico descrito anteriormente puede también ser formulado con un amortiguador (por ejemplo, amortiguador de fosfato y amortiguador de acetato de sodio) un agente calmante (por ejemplo, clouro de benzalconio, clorhidrato de procaína) , un estabilizador (por ejemplo, albúmina sérica humana, polietilenglicol) , un conservador (por ejemplo, alcohol bencílico, fenol), un antioxidante, etc. El líquido preparado de este modo para la inyección es normalmente rellenado en una ampolleta apropiada. Ya que la preparación obtenida de este modo es segura y de baja toxicidad, ésta puede ser administrada a humanos o mamíferos (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, ovejas, cerdos, bovinos, gatos, perros, monos, etc.). La dosis del compuesto o una sal del mismo (en el caso del agonista) varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, del método para la administración, etc.; en la administración oral, la dosis es normalmente de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 100 mg, preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 50 mg, más preferentemente de aproximadamente 1.0 a aproximadamente 20 mg por día para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . En la administración parenteral, la dosis simple varía dependiendo del sujeto que va a ser administrado, del órgano objetivo, del síntoma, del método de la administración, etc., pero es ventajoso administrar el ingrediente activo intravenosamente a una dosis diaria de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 30 mg, preferentemente aproximadamente 0.1 a aproximadamente 20 mg, más preferentemente aproximadamente 0.1 a aproximadamente 10 mg para un paciente con cáncer (que pesa 60 kg) . Para otra especie animal, puede ser administrada la dosis correspondiente como es convertida por 60 kg de peso corporal. (7) Cuantificación de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención El anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención es capaz de reconocer específicamente la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención y en consecuencia, puede ser utilizado para una cuantificación de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención en una solución de muestra de prueba, en particular, para una cuantificación mediante inmunoensayo de emparedado. De este modo, la presente invención proporciona, por ejemplo, los siguientes métodos para la cuantificación. (i) un método para la cuantificación de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención en una muestra líquida de prueba, que comprende el hacer reaccionar competitivamente el anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención, una muestra líquida de prueba y una proteína receptora marcada o similar de la presente invención o un péptido ligando marcado de la presente invención, y midiendo la proporción de la proteína marcada receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando marcado de la presente invención enlazado a dicho anticuerpo; y (ii) un método para la cuantificación de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención en una muestra líquida de prueba, que comprende el hacer reaccionar simultánea o continuamente la muestra líquida de prueba con un anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención inmovilizado sobre un portador insoluble y un anticuerpo marcado para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención, y midiendo la actividad del agente de marcación sobre el portador insoluble. En el método (ii) descrito anteriormente, se prefiere que un anticuerpo sea capaz de reconocer la región N-terminal de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención, mientras que otro anticuerpo más es capaz de reconocer la región C-terminal de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención. El anticuerpo monoclonal para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención (de aquí en adelante algunas veces denominado como el anticuerpo monoclonal de la presente invención) se puede utilizar para evaluar la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención. Además, la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención pueden ser detectados por medio de una tinción tisular también. Para estos fines, la molécula de anticuerpo per se puede ser utilizada o se pueden utilizar también las fracciones F(ab')2, Fab' o Fab de la molécula de anticuerpo. No existe limitación particular para el método de ensayo o evaluación utilizando el anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención; cualquier método puede ser utilizado, siempre y cuando éste se relacione a un método en el cual la cantidad de anticuerpo, de antígeno o de complejo anticuerpo-antígeno pueda ser detectada por un medio químico o un medio físico, dependiendo de o correspondiendo a la cantidad de antígeno (por ejemplo, la cantidad de proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención) en una muestra líquida de prueba que va a ser evaluada, y luego calculada utilizando una curva estándar preparada mediante una solución estándar que contiene la cantidad conocida del antígeno. Ventajosamente se usan por ejemplo, nefrometría, el método competitivo, el método inmunométrico y el método del emparedado; en términos de sensibilidad y de especificidad, es particularmente preferido el método del emparedado, el cual se describirá más adelante. Los ejemplos del agente de marcación utilizados en el método de ensayo que utiliza la sustancia de marcación, son radioisótopos, enzimas, sustancias fluorescentes y sustancias luminiscentes, etc. Los ejemplos del radioisótopo son [3H] , [125I], [131I], [3H] , [1C] , etc. Los ejemplos preferidos de la enzima son' aquellos que son estables y tienen una alta actividad específica, que incluyen ß-galactosidasa, ß-glucosidasa, fosfatasa alcalina, peroxidasa y malato-deshidrogenasa . Los ejemplos de las sustancias fluorescentes son fluorescamina, isotiocianato de fluoresceína, etc. Los ejemplos de las sustancias luminiscentes son luminol, un derivado de luminol, luciferina, lucigenina, etc. Además, puede también ser utilizado un sistema de biotina-avidina para el enlace de un anticuerpo o antígeno a un agente de marcación. En la inmovilización de los antígenos o anticuerpos, puede ser utilizada la adsorción física. Alternativamente, el enlace químico que es convencionalmente utilizado para la inmovilización de proteínas o enzimas puede ser utilizado también. Los ejemplos del portador incluyen polisacáridos insolubles tales como agarosa, dextrano y celulosa; resinas sintéticas tales como poliestireno, poliacrilamida y silicona; vidrio; etc. En el método del emparedado, un líquido de muestra de prueba se hace reaccionar con un anticuerpo monoclonal inmovilizado de la presente invención (primera reacción) , luego se hace reaccionar con un anticuerpo monoclonal marcado de la presente invención (segunda reacción) y se evalúa la actividad del agente de marcación sobre el portador insoluble, con lo cual se puede determinar la cantidad de la proteína receptora o el péptido ligando de la presente invención en el líquido de muestra de prueba. La primera y segunda reacciones pueden ser llevadas a cabo en un orden inverso, simultánea o secuencialmente con un intervalo. El tipo del agente de marcación y el método para la inmovilización pueden ser los mismos que aquellos descritos anteriormente en la presente. En el inmunoensayo mediante el método del emparedado, no es siempre necesario que el anticuerpo utilizado para el anticuerpo marcado y para la fase sólida deba ser de un tipo o una especie, sino puede también ser utilizada una mezcla de dos o más anticuerpos, para fines de mejorar la sensibilidad de la medición, etc. En el método para evaluar o ensayar la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención mediante el método del emparedado de acuerdo a la presente invención, los anticuerpos monoclonales preferidos de la presente invención, utilizados para la primera y segunda reacciones son anticuerpos, cuyos sitios de enlace a la proteína receptora o similar de la presente invención son diferentes uno del otro. De este modo, los anticuerpos utilizados en la primera y segunda reacciones son aquellos en donde, cuando el anticuerpo utilizado en la segunda reacción reconoce la región C-terminal de la proteína receptora o similar, el anticuerpo que reconoce el sitio diferente de las regiones C-terminales, por ejemplo, que reconoce la región N-terminal, es preferentemente utilizado en la primera reacción. El anticuerpo monoclonal para proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención se puede utilizar en un sistema de ensayo diferente del método del emparedado, tal como un método competitivo, un método inmunométrico y nefrometría. En el método competitivo, un anticuerpo en una solución de prueba y un antígeno marcado se hacen reaccionar competitivamente con un anticuerpo, luego se separan un antígeno marcado (F) sin reaccionar y un antígeno marcado enlazado al anticuerpo (B) (por ejemplo, separación B/F) y la cantidad marcada ya sea B o F se mide para determinar la cantidad del antígeno en la solución de prueba. En las reacciones para tal método, existe un método de fase líquida en el cual se utiliza un anticuerpo soluble como el anticuerpo y la separación B/F se efectúa mediante polietilenglicol mientras que se utiliza un segundo anticuerpo para el anticuerpo, y un método en fase sólida en el cual se utiliza un anticuerpo inmovilizado como el primer anticuerpo o un anticuerpo soluble se utiliza como el primer anticuerpo, mientras que se utiliza un anticuerpo inmovilizado como el segundo anticuerpo.

En el método inmunométrico, un antígeno en una solución de prueba y un antígeno inmovilizado se hacen reaccionar competitivamente con una cantidad dada de un anticuerpo marcado, seguido por la separación de la fase sólida de la fase líquida; o un antígeno en una solución de prueba y una cantidad en exceso del anticuerpo marcado se hacen reaccionar, luego se agrega un antígeno inmovilizado para enlazarse a un anticuerpo marcado, sin reaccionar, a la fase sólida, y la fase sólida se separa de la fase líquida. Después de esto, la cantidad marcada de cualquiera de las fases es medida para determinar la cantidad de antígeno en la solución de prueba. En la nefrometría, la cantidad de sedimento insoluble, que es producida como resultado de la reacción antígeno-anticuerpo en un gel o en una solución, es medida. Incluso cuando la cantidad de un antígeno en una solución de prueba es pequeña y únicamente es obtenida una pequeña cantidad del sedimento, puede ser adecuadamente utilizada la nefrometría láser, utilizando dispersión de láser. En la aplicación de cada uno de esos inmunoensayos al método de ensayo para la presente invención, no se requiere describir ninguna condición u operaciones especiales. El sistema de ensayo para proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención puede ser construido además de las condiciones u operaciones convencionalmente utilizados para cada uno de los métodos, tomando en cuenta la consideración técnica de una persona de experiencia en la materia. Para los detalles de tales medios técnicos convencionales, se puede hacer referencia a una variedad de revisiones, libros de referencia, etc. (por ejemplo, Hiroshi Irie (ed.): "Radioimmunoassay" (publicado por Kodansha, 1974); Hiroshi Irie (ed. ) : "Radioimmunoassay; Second Series" (ed.): "Enzyme Immunoassay" (publicado por Igaku Shoin, 1978); Eiji Ishikawa, et al. (ed.): "Enzyme Immunoassay" (Segunda Edición) (publicado por Igaku Shoin, 1982); Eiji Ishikawa, et al. (ed.): "Enzyme Immunoassay" (Tercera Edición) (publicado por Igaku Shoin, 1987); "Methods in Enzymology" Vol. 70 (Immunochemical Techniques (Parte A)); ibid., Vol. 73 (Immunochemical Techniques (Parte B) ) ; ibid., Vol 74 (Immunochemical Techniques (Parte C) ) ; ibid., Vol. 84 (Immunochemical Techniques (Parte D: ?elected Immunoassays) ) ; ibid., Vol 92 (Immunochemical Techniques (Parte E: Monoclonal antibodies and General Immunoassay Methods)); ibid, Vol. 121 (Imunochemical Techniques (Parte I: Hybridoma Technology and Monoclonal Antibodies)) (publicados por Academic Press); etc.). Como se describe anteriormente, la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención pueden ser cuantificados con alta sensibilidad, utilizando el anticuerpo de la presente invención. Además, la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención pueden ser cuantificados con alta sensibilidad, utilizando el anticuerpo de la presente invención, con lo cual se diagnostican diversas enfermedades asociadas con la disfunción de la proteína receptora de la presente invención. El anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención puede ser empleado para detectar específicamente la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención que pueden estar presentes en una solución de muestra de prueba tal como un fluido corporal, un tejido, etc. El anticuerpo puede también ser utilizado para la preparación de una columna de anticuerpo para la purificación de la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención, la detección de la proteína receptora o similar de la presente invención en las fracciones después de la purificación, y el análisis del comportamiento de la proteína receptora o similar de la presente invención o el' péptido ligando de la presente invención en las células bajo investigación. (8) Neutralización con el anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención La actividad del anticuerpo para la proteína receptora o similar de la presente invención o el péptido ligando de la presente invención que neutraliza la proteína receptora o similar o el péptido ligando, significa al actividad de inactivación de la función de la transducción de señal en la cual participa la proteína receptora o similar o el péptido ligando. Por lo tanto, cuando el anticuerpo tiene la actividad de neutralización, el anticuerpo puede inactivar la transducción de la señal en la cual participan la proteína receptora o similar o el péptido ligando, por ejemplo, las actividades de estimulación celular mediadas por la proteína receptora (por ejemplo, las actividades que promueven o suprimen la liberación del ácido araquidónico, la liberación de la acetilcolina, la liberación del Ca2+ intracelular, la producción del cAMP intracelular, la producción del cGMP intracelular, la producción de fosfato de inositol, el cambio en el potencial de la membrana celular, la fosforilación de las proteínas intracelulares, la activación de c-fos y reducción del pH) . De este modo, el anticuerpo puede ser utilizado para la prevención y/o tratamiento de enfermedades provocadas por sobre-expresión de la proteína receptora o el péptido ligando. (9) Preparación de animales que contiene el ADN que codifica para la proteína receptora de la presente invención Utilizando el ADN de la presente invención, pueden ser preparados los animales transgénicos que expresan la proteína receptora o similar de la presente invención. Los ejemplos de los animales son mamíferos (por ejemplo, ratas, ratones, conejos, ovejas, cerdos, bovinos, gatos, perros, monos) siendo particularmente preferidos los ratones y los conejos. Para transferir el ADN de la presente invención a un animal objetivo, es en general ventajoso utilizar el ADN en una construcción génica ligada corriente abajo (3') de un promotor capaz de expresar el ADN en una célula animal. Por ejemplo, cuando el ADN derivado de conejo de la presente invención es transferido, por ejemplo, la construcción del gen, en la cual el ADN es ligado corriente abajo (3') de un promotor que puede expresar el ADN de la presente invención derivado de un animal que es altamente homólogo al ADN de la presente invención, es microinyectado al huevo fertilizado del conejo. De este modo, el animal transferido con el ADN capaz de producir un alto nivel de proteína receptora o similar de la presente invención puede ser preparado. Los ejemplos del promotor que pueden ser utilizados son un promotor derivado de virus y un promotor de expresión ubicua tal como la metalotioneína, que puede ser utilizado, pero un promotor del gen NGF y un promotor del gen de la enolasa que son específicamente expresados en el cerebro, son utilizados preferentemente. La transferencia del ADN de la presente invención en la etapa celular del huevo fertilizado, asegura la presencia del ADN en todas células germinales y somáticas en el animal objetivo. La presencia de la proteína receptora o similar de la presente invención en las células germinales en los animales transferidos con el ADN, significa que todas las células germinales y somáticas contienen, la proteína receptora o similar de la presente invención en todas las progenies del animal. Las progenies del animal que poseen el gen contienen la proteína receptora o similar de la presente invención en todas las células germinales y somáticas. El animal transgénico al cual se transfiere el ADN de la presente invención, puede ser sujeto a una cruza o copulación y a una reproducción para generaciones bajo circunstancias de reproducción comunes, como el animal que lleva el ADN, después de confirmar que el gen puede ser establemente retenido. Además, los animales macho y hembra que tienen el ADN deseado son cruzados para dar un homocigoto que tiene el gen transducido en ambos cromosomas homólogos, y luego los animales macho y hembra son cruzados de modo que puede ser realizada tal reproducción para las generaciones que contienen el ADN. El animal transgénico al cual es transferido el ADN de la presente invención es útil como el animal para la selección del agonista o antagonista para la proteína receptora o similar de la presente invención, ya que la proteína receptora o similar de la presente invención es abundantemente expresada. El animal transgénico al cual es transferido el ADN de la presente invención puede también ser utilizado para las fuentes celulares para el cultivo de tejidos. La proteína receptora o similar de la presente invención puede ser analizada mediante, por ejemplo, análisis directo del ADN o el ARN en tejidos de los ratones transferidos con el ADN de la presente invención, o mediante análisis de los tejidos que contienen la proteína receptora expresada desde el gen. Las células provenientes de los tejidos que contienen la proteína receptora o similar de la presente invención son cultivadas por la técnica estándar de cultivo de tejidos. Utilizando estas células, puede ser estudiada la función de las células provenientes de los tejidos que son en general difíciles de cultivar, por ejemplo, las células derivadas del cerebro y tejidos periféricos. Utilizando estas células es posible seleccionar los productos farmacéuticos, por ejemplo, que incrementan la función de diversos tejidos. Donde es disponible una línea celular de alta expresión, la proteína receptora o similar de la presente invención puede ser aislada y purificada de la línea celular. En la especificación y los dibujos, los códigos de bases y de aminoácidos son denotados de acuerdo con la Comisión de la IUPAC-IUB sobre Nomenclatura Bioquímica o mediante los códigos comunes en la técnica, los ejemplos de los cuales se muestran enseguida. Para los aminoácidos que pueden tener el isómero óptico, la forma L es presentada, a no ser que se indique de otro modo. ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNc: Ácido desoxirribonucleico complementario A: Adenina T: Timina G: Guanina C: Citosina ARN: Ácido ribonucleico ARNm: Ácido ribonucleico mensajero dATP: trifosfato de desoxiadenosina dTTP: trifosfato de desoxitimidina dGTP: trifosfato de desoxiguanosina dCTP: trifosfato de desoxicitidina ATP: trifosfato de adenosina EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético SDS: dodecilsulfato de sodio Gly: glicina Ala: alanina Val: valina Leu: leucina He: isoleucina Ser: serina Thr: treonina Cys: cisteína Met: metionina Glu: ácido glutámico Asp: ácido aspártico Lys : Lisina Arg: arginina His: histidina Phe: fenilalanina Tyr: tirosina Trp: triptofano Pro: prolina Asn: asparagina Gln: glutamina pGlu: ácido piroglutámico Me: grupo metilo Et: grupo etilo Bu: grupo butilo Ph: grupo fenilo TC: grupo tiazolidin-4 (R) -carboxamida Los sustituyentes, grupos protectores, y reactivos utilizados en general en la especificación son denotados por los códigos siguientes. Tos: p-toluensulfonilo CHO: formilo Bzl: bencilo Cl2Bzl: 2, 6-diclorobencilo Bom: benciloximetilo Z: benciloxicarbonilo Cl-Z: 2-clorobeniloxicarbonilo Br-Z: 2-bromobenciloxicarbonilo Boc: t-butoxicarbonilo DNP: dinitrofenol Trt: tritilo Bum: t-butoximetilo Fmoc : N-9-fluorenilmetoxicarbonilo HOBt: 1-hidroxibenzotriazol HOOBt: 3, -dihidro-3-hiroxi-4-oxo-l, 2, 3-benzotriazina HONB: l-hidroxi-5-norborneno-2, 3;-dicarboximida DCC : N, N' -diclorohexilcarbodiimida BHA: benzhidrilamina MeBzl: 4-metilbencilo OcHex: éster ciclohexílico NMP: N-metilpirrolidona TFA: ácido trifluoroacético Los números de identificación de secuencia (SEQ. ID. NO:) en el listado de secuencias de la especificación indican las siguientes secuencias, respectivamente.

[SEQ. ID. NO: 1] La secuencia de aminoácidos de la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata, rOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 2] La secuencia de bases del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata, rOT7T175 de la presente invención, que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ. ID. NO: 1.

[SEQ. ID. NO: 3] La secuencia de bases del cebador 1 utilizado para la clonación del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata, rOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 4] La secuencia de bases del cebador 2 utilizado para la clonación del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata, rOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 5] La secuencia de aminoácidos de la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebro humano, hOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 6] La secuencia de bases del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebro humano, hOT7T175 de la presente invención que contiene la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 5.

[SEQ. ID. NO: 7] La secuencia de bases de la sonda utilizada para la clonación del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebro humano, hOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 8] La secuencia de bases del cebador 1 utilizada para la clonación del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebro humano, hOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 9] La secuencia de bases del cebador 2 utilizada para la clonación del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebro humano, hOT7T175 de la presente invención.

[SEQ. ID. NO: 10] La secuencia de aminoácidos del PEPTIDO (1-54) descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 11] La secuencia de aminoácidos del PEPTIDO (40-54) descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 12] La secuencia de aminoácidos del PEPTIDO (45-54) descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 13] La secuencia de aminoácidos del PEPTIDO (46-54) descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 14] La secuencia de aminoácidos del PEPTIDO (47-54) descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 15] La secuencia de bases del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 10.

[SEQ. ID. NO: 16] La secuencia de bases del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada poar la SEQ. ID. NO: 11.

[SEQ. ID. NO: 17] La secuencia de bases del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 12.

[SEQ. ID. NO: 18] La secuencia de bases del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 13.

[SEQ. ID. NO: 19] La secuencia de bases del ADN que codifica para la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 14.

[SEQ. ID. NO: 20] La secuencia de aminoácidos del producto KiSS-1 descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 21] La secuencia de aminoácidos del PEPTIDO (48-54) descrito en el Ejemplo 3.

[SEQ. ID. NO: 22] La secuencia de bases del ADN que codifica para lá secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 21. El transformante DH10B/pAK-rOT175 de Escherichia coli obtenido en el Ejemplo 1, posteriormente descrito, estuvo en depósito con el Ministerio de Comercio e Industria Internacional, de la Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, del Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH) como el Número de Acceso FERM BP-6553 el 21 de octubre de 1998 y con el Instituto para la Fermentación, Osaka (IFO) como el Número de Acceso IFO 16209 el 1 de octubre de 1998. El transformante DH10B/pCMV-h0T175 de Escherichia coli obtenido en el Ejemplo 2, posteriormente descrito, estuvo en depósito con el Ministerio de Comercio e Industria Internacional, de la Agencia de Ciencia y Tecnología Industrial, del Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana (NIBH) como el Número de Acceso FERM BP-6648 el 17 de febrero de 1999 y con el Instituto para la Fermentación, Osaka (IFO) como el Número de Acceso IFO 16258 el 9 de febrero de 1999.

EJEMPLOS La presente invención es descrita con detalle más adelante con referencia a los Ejemplos, pero no se pretende que limiten el alcance de la presente invención a éstos. Los procedimientos de manipulación de genes que utilizan Escherichia coli fueron realizados de acuerdo a los métodos descritos en la Clonación Molecular.

Ejemplo 1. Clonación del ADNc que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata y la determinación de la secuencia de bases .

Utilizando el ADNc de cerebelo de rata como la plantilla y dos cebadores, a saber, cebador 1 (SEQ. ID. NO: 3) y el cebador 2 (SEQ. ID. NO: 4), se realizó la reacción de PCR. La solución de reacción en la reacción anterior comprendida de 1/10 de volumen del ADNc para la plantilla, 1/50 en volumen de la ADNc-polimerasa Mix Advantage (CLONTEC, Inc.), 0.2 µM de cebador 1 (SEQ. ID. NO: 3), 0.2 µM de cebador 2 (SEQ. ID. NO: 4), 200 µM de dNTPs y el amortiguador acoplado a la enzima para hacer el volumen final de 50 µl . En la reacción de PCR, (1) la solución de reacción se calentó a 94°C por 2 minutos, (2) un ciclo de calentamiento a 94 °C por 30 segundos seguido por 72 °C por 2 minutos, se repitió 3 veces, (3) un ciclo de calentamiento a 94 °C por 30 segundos seguido por 68 °C por 2 minutos se repitió 3 veces, (4) un ciclo de 94°C por 30 segundos seguido por 64 °C por 30 segundos y 68 °C por 2 minutos se repitió 30 veces, y (5) finalmente, la reacción de extensión fue realizada a 68°C por 8 minutos. Después de la terminación de la reacción de PCR, el producto se subclonó al vector plasmídico pCR2.1 (Invitrogen, Inc.) siguiendo las instrucciones anexas al equipo de clonación TA (Invitrogen, Inc.), que fue luego introducido en Escherichia coli DH5a, y los clones que contenían el ADNc se seleccionaron sobre placas de agar LB que contenían ampicilina. La secuencia de cada clon fue analizada para dar la secuencia de ADNc (SEQ. ID. NO: 2), que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G. La novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G que contiene la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID. NO: 1) deducida del ADNc fue designada rOT7T175. El plásmido pAK-rOT7T175 en el cual el ADNc (SEQ.

ID. NO: 2) que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebelo de rata, rOT7T175 de la presente invención, se subclonó y se introdujo dentro de Escherichia coli DH10B de acuerdo a un método conocido públicamente para dar el transformante Escherichia coli DH10B/pAK-rOT7T175.

Ejemplo 2. Clonación del ADNc que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, derivada de cerebro humano, hOT7T175 y determinación de la secuencia de bases.

La clonación del ADNc se realizó siguiendo el protocolo de GENE TRAPPER (Life Technologies, Inc.). Después de la biotinilación de la sonda (SEQ. ID. NO: 7), la sonda se hibridó con la biblioteca de ADNc de cerebro humano, de una sola hebra (Biblioteca Superscript de ADNc, Life Technologies, Inc.). El gen de una sola hebra obtenido de este modo fue convertido a la doble hebra utilizando el cebador 1 (SEQ. ID. NO: 8). Después de que se introdujo el gen en Escherichia coli DH10B mediante la electroporación, el gen fue desarrollado sobre una placa de selección suplementada con ampicilina para obtener los transformantes. La electroporación se condujo a un voltaje de 1.8 kV utilizando E. coli Pulser (BIORAD, Inc.). Los transformantes obtenidos de este modo fueron seleccionados mediante PCR colonial utilizando la sonda (SEQ. ID. NO: 7) y el cebador 2 ' (SEQ. ID. NO: 9) para obtener el transformante de E. coli DH10B/pCMF-hOT175. La novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G, que contiene la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID. NO: 5) deducida del ADNc fue denotada hOT7T175. En el PCR colonial, la solución de reacción comprendió de 1/50 en volumen de la ADNc-polimerasa Mix Advantage (CLONTEC, Inc.), 0.2 µm del cebador 1 (SEQ. ID. NO: 1 ) , 0.2 µM del cebador 2 (SEQ. ID. NO: 9), 200 µm de dNTPs, 1/25 en volumen de DMSO y el amortiguador acoplado a la enzima, para hacer el volumen final de 10 µl. En la reacción de PCR, (1) la solución de reacción fue calentada a 94°C por 10 minutos y (2) un ciclo de calentamiento a 94°C por 10 segundos seguido por 60°C por 10 segundos y 68 °C por 1 minuto se repitió 25 veces. Después de la terminación de la reacción de PCR, el producto se subclonó al vector plasmídico pCR2.1 (Invitrogen, Inc.) siguiendo las instrucciones anexas al equipo de clonación TA (Invitrogen, Inc.), que se introdujo luego dentro de Escherichia coli DH10B. Los clones que contenían el ADNc fueron luego seleccionados sobre medio de agar LB que contenía ampicilina. La secuencia de cada clon fue analizada para dar la secuencia de ADNc (SEQ. ID. NO: 6) que codifica para la novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G. La novedosa proteína receptora acoplada a la proteína G que contiene la secuencia de aminoácidos (SEQ. ID. NO: 5) deducida del ADNc fue designada hOT175.

Ejemplo 3. Selección del péptido de activación rOT7T175 (receptor huérfano) (1-1) Síntesis del Péptido El péptido que tiene la secuencia (SEQ. ID. NO: ) de 54 residuos de aminoácidos desde 68 (Gly) a 121 (Phe) en el producto del gen supresor de la metástasis del cáncer (KiSS-1) (SEQ. ID. NO: 20) encontrado en la base de datos de genes puede ser sintetizado mediante el siguiente procedimiento (en donde el péptido es de aquí en adelante denominado el PEPTIDO (1-54) . Además, los péptidos C-terminales del PEPTIDO (1- 54) (SEQ. ID. NO: 10), a saber, PEPTIDO (40-54) (SEQ. ID.

NO: 11), PEPTIDO (45-54) (SEQ. ID. NO: 12), PEPTIDO (46-54) (SEQ. ID. NO: 13), PEPTIDO (47-54) (SEQ. ID. NO: 14) y PEPTIDO (48-54) (SEQ. ID. NO: 21) fueron sintetizados por el siguiente procedimiento. (1) Preparación del PEPTIDO (40-54) La resina de p-metil-BHA comercialmente disponible (0.77 mmol/g de resina) se cargó en un tanque de reacción del sintetizador peptídico ABl 430A. Después de esto, se introdujeron Boc-Phe, Boc-Arg (Tos) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Asn, Boc-Trp (CHO) , Boc-Asn, ' Boc-Tyr (Br-Z) , Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp (OcHex) y Boc-Lys (CI-Z) dentro de la resina en este orden, de acuerdo a la síntesis de péptidos de estrategia Boc (NMP-HOBt) para dar la resina peptídica protegida deseada. La resina, 0.12 g se agitó a 0°C por 60 minutos en 10 mi de fluoruro de hidrógeno anhidro que contenía 1 mi de p-cresol y 1.2 mi de 1, 4-butanodioI . Después de esto el fluoruro de hidrógeno se destiló a vacío. Se agregó éter dietílico al residuo y el precipitado se filtró. Se agregó una solución acuosa de ácido acético al 50% al precipitado por extracción y los materiales insolubles se eliminaron. Después el extracto se concentró suficientemente, después de esto fue aplicado a la columna de Sephadex (nombre comercial) G-25 (2.0 x 80 cm) rellena con solución acuosa al 50% de ácido acético seguida por el desarrollo con el mismo solvente. Las fracciones principales fueron recolectadas y Iiofilizadas para dar 40 mg de polvos blancos. Medio volumen de los polvos se aplicó a la columna de cromatografía de fase inversa (2.6 x 60 cm) empaquetada con LiChroprep (nombre comercial) RP-18 seguido por el lavado con 200 mi de agua que contenía 0.1% de TFA. Posteriormente se realizó la elución en gradiente de densidad lineal con 300 mi de TFA al 0.1% y 300 mi de TFA al 0.1% que contenía 33% de acetonitrilo. Las fracciones principales fueron recolectadas y Iiofilizadas para dar 4.1 mg del péptido deseado. Espectro de masa (M+H)+ 1869.9 (calculado 1969.9) . Tiempo de elución sobre HPLC: 18.6 minutos. Condiciones de la columna: Columna: Wakosil 5C18T, 4.6 x 100 mm Eluyente: elución en gradiente de densidad lineal con los eluyentes A/B = 95/5-45/55, utilizando TFA acuoso al 0.1% como eluyente A y acetonitrilo que contiene TFA al 0.1% (25 minutos) . Velocidad de flujo: 1.0 ml/minuto. (2) Preparación del PEPTIDO (45-54) La resina p-metil-BHA comercialmente disponible (0.77 mmol/g de resina) se cargó en un tanque de reacción del sintetizador peptídico ABl 430A. Posteriormente, se introdujeron Boc-Phe, Boc-Arg (Tos) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Asn, Boc-Trp (CHO) , Boc-Asn y Boc-Tyr(Br-Z) dentro de la resina en este orden, de acuerdo a la síntesis de péptidos de estrategia Boc (NMP-HOBt) para dar la resina peptídica protegida deseada. La resina, 0.11 g, se trató de una manera similar al procedimiento (1) anterior para eliminar los grupos protectores, para dar 2.2 mg del péptido deseado. Espectro de masa (M+H)+ 1302.5 (calculado 1302.6) Tiempo de elución sobre HPLC: 18.7 minutos.

Condiciones de la columna: Columna: Wakosil 5C18T, 4.6 x 100 mm Eluyente: elución en gradiente de densidad lineal con los eluyentes A/B = 95/5-45/55, utilizando TFA acuoso al 0.1% como eluyente A y acetonitrilo que contiene TFA al 0.1% (25 minutos) . Velocidad de flujo: 1.0 ml/minuto. (3) Preparación del PEPTIDO (46-54) La resina p-metil-BHA comercialmente disponible (0.77 mmol/g de resina) se cargó en un tanque de reacción del sintetizador peptídico ABl 430A. Luego, se introdujeron Boc-Phe, Boc-Arg (Tos) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc- Phe, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Asn, Boc-Trp(CHO) y Boc-Asn en este orden de acuerdo a la síntesis de péptidos de estrategia Boc (NMP-HOBt) para dar la resina peptídica protegida, deseada. La resina, 0.11 g, se .trató de una manera similar al procedimiento (1) anteriormente mencionado, para eliminar los grupos protectores, para dar 3.4 mg del ' péptido deseado. Espectro de masa (M+H)+ 1139.6 (calculado 1139.6) Tiempo de elución sobre HPLC: 18.1 minutos. Condiciones de la columna: Columna: Wakosil 5C18T, 4.6 x 100 mm Eluyente: elución en gradiente de densidad lineal con los eluyentes A/B = 95/5-45/55, utilizando TFA acuoso al 0.1% como eluyente A y acetonitrilo que contiene TFA al 0.1% (25 minutos) . Velocidad de flujo: 1.0 ml/minuto. (4) Preparación del PEPTIDO (47-54) La resina p-metil-BHA comercialmente disponible (0.77 mmol/g de resina) se cargó en un tanque de reacción del sintetizador peptídico ABl 430A. Luego se introdujeron Boc-Phe, Boc-Arg (Tos) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser (Bzl), Boc-Asn y Boc-Trp(CHO) en este orden de acuerdo a la síntesis de péptidos de estrategia Boc (NMP-HOBt) para dar la resina peptídica protegida, deseada. La resina, 0.12 g, se trató de una manera similar al procedimiento (1) anteriormente mencionado para la eliminación de los grupos protectores para dar 13.0 g del péptido deseado. Espectro de masa (M+H)+ 1025.5 (calculado 1025.5) Tiempo de elución sobre HPLC: 17.6 minutos. Condiciones de la columna: Columna: Wakosil 5C18T, 4.6 x 100 mm Eluyente: elución en gradiente de densidad lineal con los eluyentes A/B = 95/5-45/55, utilizando TFA acuoso al 0.1% como eluyente A y acetonitrilo que contiene TFA al 0.1% (25 minutos) .

Velocidad de flujo: 1.0 ml/minuto. (5) Preparación del PEPTIDO (48-54) La resina p-metil-BHA comercialmente disponible (0.77 mmol/g de resina) se cargó en un tanque de reacción del sintetizador peptídico ABl 430A. Posteriormente se introdujeron Boc-Phe, Boc-Arg (Tos) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser (Bzl) y Boc-Asn en este orden de acuerdo a la síntesis de péptidos de estrategia Boc (NMP-HOBt) para dar la resina peptídica protegida, deseada. La resina, 0.16 g, se agitó en 10 ml de fluoruro de hidrógeno anhidro junto con 1 ml de de p-cresol a 0°C por 60 minutos. La mezcla de reacción se trató luego de una manera similar al procedimiento (1) anteriormente mencionado para dar 29.0 mg del péptido deseado. Espectro de masa (M+H)+ 839.5 (calculado 839.5) Tiempo de elución sobre HPLC: 15.6 minutos. Condiciones de la columna: Columna: Wakosil 5C18T, 4.6 x 100 mm Eluyente: elución en gradiente de densidad lineal con los eluyentes A/B = 95/5-45/55, utilizando TFA acuoso al 0.1% como eluyente A y acetonitrilo que contiene TFA al 0.1% (25 minutos) . Velocidad de flujo: 1.0 ml/minuto. (6) Preparación del PEPTIDO (1-54) El PEPTIDO (1-54) se preparó mediante la carga de la resina p-metil-BHA comercialmente disponible (0.77 mmol/g de resina) en un tanque de reacción del sintetizador peptídico Bl 430A. introduciendo, en el siguiente orden, Boc-Phe, Boc-Arg (Tos) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Phe, Boc-Ser (Bzl), Boc-Asn, Boc-Trp(CHO) , Boc-Asn, Boc-Tyr (Br-Z) , Boc-Asn, Boc-Pro, Boc-Leu, Boc-Asp (OcHex) , Boc-Lys (Cl-Z) , Boc-Glu (OcHex) , Boc-Arg (Tos) , Boc-Gln, Boc-Val, Boc-Leu, Boc-Val, Boc-Ala, Boc-Gly, Boc-Gln, Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Pro, Boc-Ile, Boc-Gln, Boc-Arg (Tos) , Boc-Ser (Bzl) , Boc-His(Bom), Boc-Pro, Boc-Ala, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Leu, Boc-Gly, Boc-Pro, Boc-Gln, Boc-Gln, Boc-Arg (Tos) , Boc-Ser (Bzl) , Boc-Gly, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Ser (Bzl) , Boc-Glu (OcHex) , Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Pro, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Leu, Boc-Ser (Bzl) , Boc-Thr(Bzl) y Boc-Gly para obtener la resina peptídica protegida, deseada, y luego eliminando los grupos protectores de la resina peptídica protegida, como en el Ejemplo (1) del método, para preparar el PEPTIDO (40-54) anterior. (1-2) Medición de la actividad incrementadora de la concentración de iones calcio, intracelular, utilizando FLIPR La linea celular de expresión estable rOT7T175 se obtuvo mediante la transducción del plásmido de expresión pAK-rOT175 para células animales dentro de las células CHO/dhfr, utilizando el Equipo de Transfección CellPhect (Amersham Pharmacia Biotech, Inc.). Primeramente, se agregaron 240 ml del Amortiguador A (acoplado al Equipo de Transfección CellPhect) a 9.6 mg del ADN plasmídico disuelto en 240 ml de agua destilada, seguida por agitación. Después la mezcla se asentó por 10 minutos, se agregaron 480 ml de Amortiguador B (acoplada al Equipo de Transfección CellPhect) a la mezcla, la cual se agitó vigorosamente para formar liposomas que contenían el ADN.

Posteriormente 4 x 105 células CHO/dhfr (obtenidas de la ATCC) fueron inoculadas en una caja de Petri de 60 mm.

Después del cultivo de las células en el medio F-12 de Ham (Nissui Seiyaku, Co., Ltd.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (BIO WHITTAKER, Inc.) a 37°C por 2 días en 5% de gas dióxido de carbono, se agregaron gota a gota 480 ml de los liposomas a las células en la caja de Petri. Después del cultivo de las células a 37 °C por 6 horas en 5% de gas dióxido de carbono, las células se lavaron dos veces con medio F-12 de Ham libre de suero y 3 ml de glicerol al % se agregaron a las células en la caja de Petri, seguido por el tratamiento por 2 minutos. Las células se lavaron nuevamente dos veces con el medio F-12 de Ham libre de suero, seguido por la incubación en medio F-12 de Ham suplementado con 10% de suero fetal bovino a 37 °C por 15 horas en 5% de gas dióxido de carbono. Las células se dispersaron mediante tratamiento con tripsina para recuperarse de la caja de Petri. Las células recuperadas fueron inoculadas sobre una placa de 6 pozos en 1.25 x 104 células/pozo y comenzaron a incubarse a 37°C por 15 horas en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) (Nissui Seiyadu Co., Ltd.) que contenía 10% de suero fetal bovino liofilizado (JRH BIOSCIENCE, Inc.) en 5% de gas dióxido de carbono. Los transformantes transducidos con el plásmido de las células CHO se desarrollaron en el medio pero las células no transducidas murieron gradualmente. El medio fue intercambiado en los días 1 y 2 para eliminar las células muertas. Aproximadamente 20 colonias de los transformantes de las células CHO que mantuvieron el desarrollo en los días 8 al 10 después de la incubación, fueron seleccionadas. El ADN se recuperó de las células seleccionadas, respectivamente, utilizando un equipo comercialmente disponible para el aislamiento del ARN. Mediante la aplicación del método RT-PCR públicamente conocido a los siguientes pasos, se seleccionó el 23° clon de las células CHO que expresan rOT7T175 (de aqui en adelante abreviadas como rOT7T175-23) que expresan el gen receptor rOT7T175 en un alto nivel. Para el control, el 24° clon de las células CHO que expresan ETA (de aquí en adelante abreviado como ETA24; ver Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 279, pp. 675-685, 1996) fue empleado. La actividad incrementadora de la concentración de iones calcio intracelulares de los péptidos sintéticos obtenidos en (1-1) descrita anteriormente en rOT7T175-23 y ETA24 se determinó utilizando FLIPR (Molecular Devices, Inc. ) . Las células rOT7T175-23 y las células ETA24 fueron utilizadas después del subcultivo de estas células en DMEM suplementado con 10% de suero fetal bovino, dializado (de aquí en adelante abreviado como dFBS) . Las células rOT7T175-23 y ETA24 se suspendieron en un medio (10% de dFBS-DMEM) , respectivamente, en 15 x 104 células/ml. Cada 200 µl (3.0 x 104 células/200 Ul) de la suspensión se inocularon sobre una placa de 96 pozos para FLIPR (fondo claro de placa negra, Coster, Inc.) a través de un surtidor, seguido por la incubación a 37 °C toda la noche en una incubadora con 5% de C02. Las células incubadas de este modo fueron utilizadas (de aquí en adelante denominadas como la placa celular) . Luego, se mezclaron 21 ml de HANKS/HBSS (9.8 g de HANKS', 0.35 g de carbonato ácido de sodio, 20 ml de HEPES 1 M, después de ajustó el pH a 7.4 con hidróxido de sodio 1 N, la mezcla se sujetó a esterilización a través de un filtro) , 210 µl de Probenecid 250 mM y 210 µl de suero fetal bovino (FBS) (HANKS/HBSS-Probenecid-FBS) . Además, 2 frascos de Fluo3-AM (50 µg/frasco) se disolvieron en 42 µl de sulfóxido de dimetilo y 42 µl de ácido Pluronic al 20%. La solución resultante se agregó a 20 ml de HANKS/HBSS-Probenecid-FBS descrito anteriormente y luego se mezclaron. Después del cultivo la solución se retiró, se surtieron 100 µl por cada pozo de la mezcla a la placa celular utilizando una pipeta de ocho puntas seguida por incubación a 37 °C por una hora en una incubadora con 5% de C02 (carga de pigmento) . El péptido se disolvió en sulfóxido de dimetilo en 1 x 10"3 M. A 0.002 ml (1 x 10"3 M) de la solución peptídica en sulfóxido de dimetilo, se agregaron 0.066 ml de Probenecid 2.5 mM que contenía HANKS' /HBSS y 0.2% de BSA, para la dilución (concentración final de 1 x 10"5 M en el ensayo de actividad). Después de esto, se agregaron 0.009 ml de sulfóxido de dimetilo a 0.001 ml (1 x 10"3 M) de la solución peptídica en sulfóxido de dimetilo para la dilución. Después de surtir 0.002 ml de la dilución, se agregaron al sistema, para la dilución, 0.066 ml de HANK'S/HBSS que contenía 2.5 mM de Probenecid y 0.2% de BSA (concentración final de 1 x 10"6 M) . De igual modo, la dilución se continuó hasta la concentración final de 1 x 10~10 M y luego se transfirió a una placa de 96 pozos para FLIPR (placa de fondo en V, Coster, Inc.) (de aquí en adelante denominada como la placa de muestra) . Después de la terminación de la carga del pigmento sobre la placa celular, la placa celular se lavó 4 veces con un amortiguador de lavado, el cual se obtuvo mediante la adición de Probenecid 2.5 mM a HANKS' /HBSS, utilizando un lavador de placas para dejar 100 µl del amortiguador de lavado después del lavado. La placa celular y la placa de muestra se ajustaron en el FLIPR y 0.05 ml de una muestra proveniente de la placa de muestra fueron automáticamente transferidos a la placa celular con el dispositivo FLIPR para promover la respuesta celular. Un cambio en la concentración de iones calcio intracelular para 180 segundos fue medido con el paso del tiempo. Los resultados revelan que los péptidos sintetizados en (1-1) descritos anteriormente indujeron un incremento en la concentración intracelular de iones calcio, específicamente para las células que expresan rOT7T175. Mediante comparación de las curvas de dosis-respuesta (Figura 9), es claro que el PEPTIDO (40-54) y el PEPTIDO (45-54) muestran la más alta actividad.

Posibilidad de Aplicación Industrial La proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención, su péptido parcial o sales de la misma, así como el polinucleótido que codifica para la misma (por ejemplo, ADN, ARN y derivados de la misma) pueden ser utilizados: (1) para la determinación del ligando (péptido ligando de la presente invención) (agonista) , (2) para la preparación de anticuerpos y antisueros para éstos, (3) para la construcción del sistema de expresión de una proteína receptora recombinante, (4) para el desarrollo del sistema de ensayo de enlace al receptor utilizando el sistema de expresión y la selección de un compuesto farmacéutico candidato, (5) para el diseño de fármacos con base en la comparación con el ligando-receptor estructuralmente similar, (6) como un reactivo para la preparación de una sonda o un cebador de PCR en el diagnóstico de genes, (7) para la preparación de un animal transgénico, o (8) como un agente profiláctico/terapéutico en terapia génica.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> TAKEDA Chemical Industries. Ltd. <120> Novedosa Proteína Receptora Acoplada a la Proteína G, ADN y su ligando <130> 256200P <150> JP 10-305949 <151> 1998-10-27 <150> JP 11-027710 <151> 1999-02-04 <150> JP 11-057207 <151> 1999-03-04 <150> JP 11-276225 <151> 1999-09-29 <160> 22 <210> 1 <211> 396 <212> PRT <213> Rata <400> 1 Met Ala Ala Glu Ala Thr Leu Gly Pro Asn Val Ser Trp Trp Ala Pro 5 10 15 Ser Asn Ala Ser Gly Cys Pro Gly Cys Gly Val Asn Ala Ser Asp Gly 20 25 30 Pro Gly Ser Ala Pro Arg Pro Leu Asp Ala Trp Leu Val Pro Leu Phe 35 40 45 Phe Ala Ala Leu Met Leu Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val He 50 55 60 Phe Val He Cys Arg His Lys His Met Gln Thr Val Thr Asp Phe Tyr 65 70 75 80 He Ala Asn Leu Ala Ala Thr Asp Val Thr Phe Leu Leu Cys Cys Val 85 90 95 Pro Phe Thr Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Pro Thr Trp Val Leu Gly Asp 100 105 110 Phe Met Cys Lys Phe Val Asn Tyr He Gln Gln Val Ser Val Gln Ala 115 120 125 Thr Cys Ala Thr Leu Thr Ala Met Ser Val Asp Arg Trp Tyr Val Thr 130 135 140 Val Phe Pro Leu Arg Ala Leu His Arg Arg Thr Pro Arg Leu Ala Leu 145 150 155 160 Thr Val Ser Leu Ser He Trp Val Gly Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro 165 170 175 Val Leu Ala Leu His Arg Leu Ser Pro Gly Pro His Thr Tyr Cys Ser 180 185 190 Glu Ala Phe Pro Ser Arg Ala Leu Glu Arg Ala Phe Ala Leu Tyr Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala Thr Cys Ala Cys Tyr 210 215 220 Gly Ala Met Leu Arg His Leu Gly Arg Ala Ala Val Arg Pro Ala Pro 225 230 235 240 Thr Asp Gly Ala Leu Gln Gly Gln Leu Leu Ala Gln Arg Ala Gly Ala 245 250 255 Val Arg Thr Lys Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Val Val Leu Leu Phe 260 265 270 3 Ala Ala Cys Trp Gly Pro He Gln Leu Phe Leu Val Leu Gln Ala Leu 275 280 285 Gly Pro Ser Gly Ala Trp His Pro Arg Ser Tyr Ala Ala Tyr Ala Leu 290 295 300 Lys He Trp Ala His Cys Met Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Asn Pro 305 310 315 320 Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser His Phe Arg Gln Ala Phe Cys Arg 325 330 335 Val Cys Pro Cys Gly Pro Gln Arg Gln Arg Arg Pro His Ala Ser Ala 340 345 350 His Ser Asp Arg Ala Ala Pro His Ser Val Pro His Ser Arg Ala Ala 355 360 365 His Pro Val Arg Val Arg Thr Pro Glu Pro Gly Asn Pro Val Val Arg 370 375 380 Ser Pro Ser Val Gln Asp Glu His Thr Ala Pro Leu 385 390 395 396 <210> 2 <211> 1191 <212> ADN <213> Rata <400> 2 ATGGCCGCAG AGGCGACGTT GGGTCCGAAC GTGAGCTGGT GGGCTCCGTC CAACGCTTCG 60 GGATGCCCGG GCTGCGGTGT CAATGCCTCG GATGGCCCAG GCTCCGCGCC AAGGCCCCTG 120 GATGCCTGGC TGGTGCCCCT GTTTTTCGCT GCCCTAATGT TGCTGGGGCT AGTCGGGAAC 180 TCACTGGTCA TCTTCGTTAT CTGCCGCCAC AAGCACATGC AGACCGTCAC CAATTTCTAC 240 ATCGCTAACC TGGCGGCCAC AGATGTCACT TTCCTTCTGT GCTGCGTACC CTTCACCGCG 300 CTCCTCTATC CGCTGCCCAC CTGGGTGCTG GGAGACTTCA TGTGCAAATT CGTCAACTAC 360 ATCCAGCAGG TCTCGGTGCA AGCCACATGT GCCACTTTGA CAGCCATGAG TGTGGACCGC 420 TGGTACGTGA CTGTGTTCCC GCTGCGTGCA CTTCACCGCC GCACTCCGCG CCTGGCCCTG 480 ACTGTCAGCC TTAGCATCTG GGTGGGTTCC GCAGCTGTTT CCGCCCCGGT GCTGGCTCTG 540 CACCGCCTGT CGCCCGGGCC TCACACCTAC TGCAGTGAGG CGTTTCCCAG CCGTGCCCTG 600 GAGCGCGCTT TCGCGCTCTA CAACCTGCTG GCCCTATACC TGCTGCCGCT GCTCGCCACC 660 TGCGCCTGCT ACGGTGCCAT GCTGCGCCAC CTGGGCCGCG CCGCTGTACG CCCCGCACCC 720 ACTGATGGCG CCCTGCAGGG GCAGCTGCTA GCACAGCGCG CTGGAGCAGT GCGCACCAAG 780 GTCTCCCGGC TGGTGGCCGC TGTCGTCCTG CTCTTCGCCG CCTGCTGGGG CCCGATCCAG 840 CTGTTCCTGG TGCTTCAAGC CCTGGGCCCC TCGGGGGCCT GGCACCCTCG AAGCTATGCC 900 GCCTACGCGC TCAAGATCTG GGCTCACTGC ATGTCCTACA GCAATTCTGC GCTCAACCCG 960 CTGCTCTATG CCTTCCTGGG TTCCCACTTC AGACAGGCCT TCTGCCGCGT GTGCCCCTGC 1020 GGCCCGCAAC GCCAGCGTCG GCCCCACGCG TCAGCGCACT CGGACCGAGC CGCACCCCAT 1 080 AGTGTGCCGC ACAGCCGGGC TGCGCACCCT GTCCGGGTCA GGACCCCCGA GCCTGGGAAC 1 140 CCTGTGGTGC GCTCGCCCTC TGTTCAGGAT GAACACACTG CCCCACTCTG A 1 191 <210> 3 <21 1> 30 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> <400> 3 GTCGACATGG CCGCAGAGGC GACGTTGGGT 30 <210> 4 <21 1> 30 <2 1 2> A DN (213) Secuencia Artificial <220> <223> <400> 4 ACTAGTTCAG AGTGGGGCAG TGTGTTCATC 30 <210> 5 <211> 398 <212> PRT <213> Humana <400> 5 Met His Thr Val Ala Thr Ser Gly Pro Asn Ala Ser Trp Gly Ala Pro 5 10 15 Ala Asn Ala Ser Gly Cys Pro Gly Cys Gly Ala Asp Ala Ser Asp Gly 20 25 30 Pro Val Pro Ser Pro Arg Ala Val Asp Ala Trp Leu Val Pro Leu Phe 35 40 45 Phe Ala Ala Leu Met Leu Leu Gly Leu Val Gly Asn Ser Leu Val He 50 55 60 Tyr Val He Cys Arg His Lys Pro Met Arg Thr Val Thr Asn Phe Tyr 65 70 75 80 He Ala Asn Leu Ala Ala Thr Asp Val Thr Phe Leu Leu Cys Cys Val 85 90 95 Pro Phe Thr Ala Leu Leu Tyr Pro Leu Pro Gly Trp Val Leu Gly Asp 100 105 110 Phe Met Cys Lys Phe Val Asn Tyr He Gln Gln Val Ser Val Gln Ala 115 120 125 6 Thr Cys Ala Thr Leu Thr Ala Meí Ser Val Asp Arg Trp Tyr Val Thr 130 135 140 Val Phe Pro Leu Arg Ala Leu His Arg Arg Thr Pro Arg Leu Ala Leu 145 150 155 160 Ala Val Ser Leu Ser He Trp Val Gly Ser Ala Ala Val Ser Ala Pro 165 170 175 Val Leu Ala Leu His Arg Leu Ser Pro Gly Pro Arg Ala Tyr Cys Ser 180 185 190 Glu Ala Phe Pro Ser Arg Ala Leu Glu Arg Ala Phe Ala Leu Tyr Asn 195 200 205 Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Leu Pro Leu Leu Ala Thr Cys Ala Cys Tyr 210 215 220 Ala Ala Met Leu Arg His Leu Gly Arg Val Ala Val Arg Pro Ala Pro 225 230 235 240 Ala Asp Ser Ala Leu Gln Gly Gln Val Leu Ala Glu Arg Ala Gly Ala 245 250 255 Val Arg Ala Lys Val Ser Arg Leu Val Ala Ala Val Val Leu Leu Phe 260 265 270 Ala Ala Cys Trp Gly Pro He Gln Leu Phe Leu Val Leu Gln Ala Leu 275 280 285 Gly Pro Ala Gly Ser Trp His Pro Arg Ser Tyr Ala Al? Tyr Ala Leu 290 295 300 Lys Thr Trp Ala His Cys Met Ser Tyr Ser Asn Ser Ala Leu Asn Pro 305 310 315 320 Leu Leu Tyr Ala Phe Leu Gly Ser His Phe Arg Gln Ala Phe Arg Arg 325 330 335 Val Cys Pro Cys Ala Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Arg Arg Pro Gly 340 345 350 Pro Ser Asp Pro Ala Ala Pro His Ala Glu Leu His Arg Leu Gly Ser 355 360 365 His Pro Ala Pro Ala Arg Ala Gln Lys Pro Gly Ser Ser Gly Leu Ala 370 375 380 Ala Arg Gly Leu Cys Val Leu Gly Glu Asp Asn Ala Pro Leu 385 390 395 398 <210> 6 <211> 1197 <212> ADN <213> Humana <400> 6 ATGCACACCG TGGCTACGTC CGGACCCAAC GCGTCCTGGG GGGCACCGGC CAACGCCTCC 60 GGCTGCCCGG GCTGTGGCGC CAACGCCTCG GACGGCCCAG TCCCTTCGCC GCGGGCCGTG 120 GACGCCTGGC TCGTGCCGCT CTTCTTCGCG GCGCTGATGC TGCTGGGCCT GGTGGGGAAC 180 TCGCTGGTCA TCTACGTCAT CTGCCGCCAC AAGCCGATGC GGACCGTGAC CAACTTCTAC 240 ATCGCCAACC TGGCGGCCAC GGACGTGACC TTCCTCCTGT GCTGCGTCCC CTTCACGGCC 300 CTGCTGTACC CGCTGCCCGG CTGGGTGCTG GGCGACTTCA TGTGCAAGTT CGTCAACTAC 360 ATCCAGCAGG TCTCGGTGCA GGCCACGTGT GCCACTCTGA CCGCCATGAG TGTGGACCGC 420 TGGTACGTGA CGGTGTTCCC GTTGCGCGCC CTGCACCGCC GCACGCCCCG CCTGGCGCTG 480 GCTGTCAGCC TCAGCATCTG GGTAGGCTCT GCGGCGGTGT CTGCGCCGGT GCTCGCCCTG 540 CACCGCCTGT CACCCGGGCC GCGCGCCTAC TGCAGTGAGG CCTTCCCCAG CCGCGCCCTG 600 GAGCGCGCCT TCGCACTGTA CAACCTGCTG GCGCTGTACC TGCTGCCGCT GCTCGCCACC 660 TGCGCCTGCT ATGCGGCCAT GCTGCGCCAC CTGGGCCGGG TCGCCGTGCG CCCCGCGCCC 720 GCCGATAGCG CCCTGCAGGG GCAGGTGCTG GCAGAGCGCG CAGGCGCCGT GCGGGCCAAG 780 GTCTCGCGGC TGGTGGCGGC CGTGGTCCTG CTCTTCGCCG CCTGCTGGGG CCCCATCCAG 840 CTGTTCCTGG TGCTGCAGGC GCTGGGCCCC GCGGGCTCCT GGCACCCACG CAGCTACGCC 900 -GCCTACGCGC TTAAGACCTG GGCTCACTGC ATGTCCTACA GCAACTCCGC GCTGAACCCG 960 CTGCTCTACG CCTTCCTGGG CTCGCACTTC CGACAGGCCT TCCGCCGCGT CTGCCCCTGC 1020 GCGCCGCGCC GCCCCCGCCG CCCCCGCCGG CCCGGACCCT CGGACCCCGC AGCCCCACAC 1080 GCGGAGCTGC ACCGCCTGGG GTCCCACCCG GCCCCCGCCA GGGCGCAGAA GCCAGGGAGC 1140 AGTGGGCTGG CCGCGCGCGG GCTGTGCGTC CTGGGGGAGG ACAACGCCCC TCTCTGA 1197 <210> 7 <211> 26 <212> ADN /o13> Secuencia Artificial <220> <223> <400> 7 GACCGTGACC AACTTCTACA TCGCCA 26 <210> 8 <211> 22 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> <400> 8 ATGCACACCG TGGCTACGTC CG 22 <210> 9 <211> 21 <212> ADN 013) Secuencia Artificial <220> <223> <400> 9 CCTGTCGGAA GTGCGAGCCC A 21 <210> 10 <211> 54 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> El extremo C del polipeptido. es la forma amida (-CONH2) <400> 10 Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser Arg Gln Gln 1 5 10 15 Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln He Pro Ala Pro Gln Gly 20 25 30 Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys As'p Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn 35 40 45 Ser Phe Gly Leu Arg Phe 50 54 <210> 11 <211> 15 <212> PRT 213) Secuencia Artificial <220> 223> El extremo C del polipéptido es la forma amida (-CONH2) <400> 11 Lys Asp Leu Pro Asn Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 10 15 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> El extremo C del polipéptido es la forma amida (-CONH2) <400> 12 Tyr Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Secuencia Artificial <220> <223> El extremo C del polipéptido es la forma amida (-CONH2) <400> 13 Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 9 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <2l 3> Secuencia Artificial <220> y??Z El extremo C del polipépti do es la f orma ami da ( -CONH2 ) <400> 14 Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 8 <210> 15 <211> 162 <212>ADN <21 Z Secuencia Artificial <220> <223> <400> 15 GGGACCTCGC TGTCCCCGCC CCCCGAGAGC TCCGGGAGCC GCCAGCAGCC GGGCCTGTCC 60 GCCCCCCACA GCCGCCAGAT CCCCGCACCC CAGGGCGCGG TGCTGGTGCA GCGGGAGAAG 120 GACCTGCCGA ACTACAACTG GAACTCCTTC GGCCTGCGCT TC 162 <210> 16 <211> 45 <212> ADN <213 Secuencia Artificial <220> <223> <400> 16 AAGGACCTGC CGAACTACAA CTGGAACTCC TTCGGCCTGC GCTTC 45 <210> 17 <211> 30 <212> ADN (213) Secuencia Artificial <220> <223> <400> 17 TACAACTGGA ACTCCTTCGG CCTGCGCTTC 30 <210> 18 <21I> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> <400> 18 AACTGGAACT CCTTCGGCCT GCGCTTC 27 <210> 19 <211> 24 <212>A N ^ 13* Secuencia Artificial <220> <223> <400> 19 TGGAACTCCT TCGGCCTGCG CTTC 24 <210> 20 <211> 145 <212> PRT <^213!) Humana <400> 20 Met Asn Ser Leu Val Ser Trp Gln Leu Leu Leu Phe Leu Cys Ala Thr 1 5 10 15 His Phe Gly Glu Pro Leu Glu Lys Val Ala Ser Val Gly Asn Ser Arg 20 25 30 Pro Thr Gly Gln Gln Leu Glu Ser Leu Gly Leu Leu Ala Pro Gly Glu 35 40 45 Gln Ser Leu Pro Cys Thr Glu Arg Lys Pro Ala Ala Thr Ala Arg Leu 50 55 60 Ser Arg Arg Gly Thr Ser Leu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Ser Gly Ser 65 70 75 80 Arg Gln Gln Pro Gly Leu Ser Ala Pro His Ser Arg Gln He Pro Ala 85 90 95 Pro Gln Gly Ala Val Leu Val Gln Arg Glu Lys Asp Leu Pro Asn Tyr 100 105 110 Asn Trp Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe Gly Lys Arg Glu Ala Ala Pro 115 120 125 Gly Asn His Gly Arg Ser Ala Gly Arg Gly Trp Gly Ala Gly Ala Gly 130 135 140 Gln 145 <210> 21 <211> 7 <212> PRT (213> Secuencia Artificial <220> (223) El extremo C del polipéptido es la forma amida (-CONH2 <400> 21 4 Asn Ser Phe Gly Leu Arg Phe 1 5 7 (210> 22 (211> 21 (212>ADN (213) Secuencia Artificial (220> (223> (400> 22 AACTCCTTCG GCCTGCGCTT C 21

Claims

182 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Una proteína y sales de la misma, caracterizada porque comprende la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la secuencia de aminoácidos mostrada por la SEQ. ID. NO: 1.

2. Una proteína y las sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la misma o sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos es representada por la SEQ. ID. NO: 5.

3. Un péptido parcial de la proteína de conformidad con la reivindicación 1, o esteres de la misma o amidas de la misma o sales de la misma.

4. Un polinucleótido, caracterizado porque contiene un polinucleótido que tiene la secuencia de bases que codifica para la proteína de conformidad con la reivindicación 1.

5. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque es ADN. 6. Un polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque contiene la 183 secuencia de base representada por la SEQ. ID. NO: 2 o la SEQ. ID. NO:

6.

7. Un vector recombinante, caracterizado porque contiene el polinucleótido de conformidad con la reivindicación 4.

8. Un transformante transformado por el vector recombinante de conformidad con la reivindicación 7.

9. Un método para fabricar -la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el cultivo del transformante de conformidad con la reivindicación 8, y la producción y acumulación de la proteína de conformidad con la reivindicación 1.

10. Un anticuerpo para la proteína o sales de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, y para el péptido parcial o esteres del mismo o amidas del mismo o sales del mismo de conformidad con la reivindicación 3.

11. Un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque es un anticuerpo neutralizador para inactivar la transducción de señal de la proteína de conformidad con la reivindicación 1.

12. Una composición de diagnóstico, caracterizada porque comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10. 184

13. Un ligando para la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es obtenible utilizando la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, o utilizando el péptido parcial, esteres del mismo, amidas del mismo o sales del mismo, de conformidad con la reivindicación 3.

14. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el ligando de conformidad con la reivindicación 13.

15. Un método para la determinación del ligando para la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque son utilizados la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1 o el péptido parcial, amidas del mismo, esteres del mismo o sales del mismo de conformidad con la reivindicación 3.

16. Un método para seleccionar un compuesto o sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado el método porque comprende el uso de la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, o, el péptido parcial o amidas del mismo, esteres del mismo o sales del mismo de conformidad con la reivindicación 3. 185

17. Un equipo para la selección de un compuesto o sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y una proteína o sales de la misma, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado el equipo porque comprende la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, o un péptido parcial o esteres del mismo, amidas del mismo o sales del mismo, de conformidad con la reivindicación 3.

18. Un compuesto o sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es obtenible utilizando el método de selección de conformidad con la reivindicación 16 o el equipo de selección de conformidad con la reivindicación 17.

19. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el compuesto o las sales del mismo que alteran la propiedad de enlace entre un ligando y la proteína o sales de la misma de conformidad con la reivindicación 1, que es obtenible utilizando el método de selección de conformidad con la reivindicación 16 o el equipo de selección de conformidad con la reivindicación 17.

20. Un método para cuantificar la proteína de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque 186 comprende el uso del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 10.

21. Un péptido, una amida del mismo, un éster del mismo o una sal del mismo, caracterizado porque en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ. ID. NO: 10, éste contiene una secuencia de 47 a 54 aminoácidos desde el extremo N y comprende 8 a 54 residuos de aminoácidos .

22. Un péptido, una amida del mismo, un éster del mismo o una sal del mismo de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque en la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ. ID. NO: 10, éste contiene la secuencia de 47-54 aminoácidos N-terminales en el extremo C y comprende 8 a 15 residuos de aminoácidos.

23. Una amida o sal del péptido de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque comprende la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ. ID. NO: 11, SEQ. ID. NO: 12, SEQ. ID. NO: 13 o SEQ. ID. NO: 14.

24. Un método para la selección de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando es un péptido o una amida del mismo, un éster del mismo, o una sal del mismo de conformidad con la reivindicación 21. 187

25. Un equipo para la selección de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el ligando es un péptido o una amida del mismo, un éster del mismo, o una sal del mismo de conformidad con la reivindicación 21. 188 RESUMEN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a las proteínas receptoras acopladas a la proteína G derivada de cerebelo de rata y derivada de cerebro humano, o las sales de las mismas, sus péptidos parciales, amidas, esteres o sales de las mismas, los ligandos para las mismas, un método/equipo para la selección de los compuestos que alteran la propiedad de enlace entre los ligandos y las proteínas receptoras acopladas a la proteína G, los compuestos obtenidos mediante la selección o sales de las mismas, y los anticuerpos para las proteínas receptoras acopladas a la proteína G. Las proteínas receptoras acopladas a la proteína G, derivadas de cerebro humano y derivadas de cerebelo de rata y similares, son útiles: (1) para la determinación de un ligando para la proteína receptora de la presente invención (péptido ligando de la presente invención) (agonista), (2) como un agente para la prevención y/o tratamiento de las enfermedades asociadas con la disfunción de la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención, (3) como un agente de diagnóstico genético, (4) para la cuantificación de un ligando para la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención, (5) para la selección de un compuesto (agonista, 189 antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención y un ligando (péptido ligando de la presente invención), (6) como un agente para la prevención y/o tratamiento de diversas enfermedades, que comprende un compuesto (agonista, antagonista, etc.) que altera la propiedad de enlace entre la proteína receptora acoplada a la proteína G de la presente invención y un ligando (péptido ligando de la presente invención), (7) para la cuantificación de la proteína receptora, su péptido parcial o sales de la presente invención, (8) para la neutralización por anticuerpos para la proteína receptora, su péptido parcial o las sales de la presente invención y (9) para la preparación de un animal no humano que posee el ADN que codifica para la proteína receptora acoplada a la proteína G, de la presente invención.