MXPA01001687A - Anticuerpos antifactor ix/ixa humanos - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere al aislamiento, identificación, síntesis, expresión y purificación de anticuerpos reactivos con el factor IX (FIX)/factor IXa (IXa). En aspectos particulares, la invención proporciona anticuerpos humanos reactivos con el dominio de Gla del FIX humano. La invención además proporciona composiciones, especialmente composiciones farmacéuticas, artículos de manufactura, y métodos para inhibir la actividad del FIX y para inhibir la coagulación dependiente del FIX / IXa.

Description

ANTICUERPOS ANTIFACTOR IX/IXa HUMANOS Antecedentes de la Invención Campo de la Invención La presente invención se refiere al aislamiento, identificación, síntesis, expresión y purificación de anticuerpos reactivos con el factor IX (FIX) /factor IXa (FlXa) y especialmente el dominio de Gla del FIX/FIXa. En aspectos particulares, la invención proporciona anticuerpos humanos reactivos con el dominio de Gla del FIX/FIXa humano. La invención además se refiere a composiciones, especialmente composiciones farmacéuticas, artículos de manufactura, y métodos para inhibir la activación del FIX/FIXa e inhibir la coagulación dependiente del FIX/FIXa.

Descripción de los Descubrimientos Relacionados El factor IXa es una serina proteasa plasmática dependiente de la vitamina K gue participa tanto en las vías intrínseca y extrínseca de coagulación sanguínea. Los 43 aminoácidos de extremo NH2 (dominio de Gla) del factor IXa y su factor IX de zimogeno contienen 12 residuos de Gla formados por la carboxilación dependiente de la vitamina K de los residuos de Ref. 0126720 Glu. El dominio de Gla se sigue por dos dominios del tipo factor de crecimiento epidérmico (EGF) , seguido por un dominio de serina proteasa de extremo carboxi .

El dominio de Gla del FIX/FIXa contiene determinantes estructurales importantes para la interacción con sitios de enlace de alta afinidad en células endoteliales vasculares y plaguetas (Heimark et al., (1983) Biochem. Biophys. Res. Commun. 111:723-731; Ahmad et al., (1994) Biochem. 33:12048-12055; Ryan et al., (1989) J. Biol. Chem. 264:20283-20287; Toomey et al., (1992) Biochemistry 31:1806-1808; Cheung et al., (1992) J. Bio. Chem. 267:20529-20531; Ra ala-Sheikh et al., (1992) Blood 79:398-405; Cheung et al., (1996) Proc. Nati Acad. Sci. USA 93:11068-11073; Prokok et al., (1996) Int. J. Pept . Res. 48:281-285; Ahmad et al., (1998) Biochemistry 37:1671-1679). En la presencia de Ca++ y Mg++, el dominio de Gla del FIX/FIXa adopta diferentes conformaciones. Las reacciones de coagulación, tales como la activación mediada por el FIX/FIXa del FX procede con alta eficiencia en la superficie de las plaquetas activadas (Ahmad and alsh (1994) Trends Cardiovasc. Med., 4:271-277).

Se ha mostrado que los anticuerpos que enlazan el dominio de Gla del FIX/FIXa inhiben la función del FIX/FIXa, tal como el enlace celular (Cheung et al., (1996) supra; actividad de coagulación (Sugo et al., (1990) Thromb. Res. 58:603-614) y activación del FIX/FIXa por el FIX (Sugo et al., (1990) supra; Leibman et al., (1987) J. Bio. Chem. 262:7605-7612). Se ha mostrado que los anticuerpos de conejo y murino para el FIX/FIXa se enlazan a la región de extremo N del dominio de Gla (Leibman et al., (1993) Eur. J. Biochem. 212:339-345 y Sugo et al., (1990) Thromb. Res 58:603-614). Se ha mostrado que los anticuerpos reactivos con el FlX/IXa inhiben la activación del FIX hasta el FlXa e inhibir la coagulación en un ensayo dependiente del FlXa (Blackburn et al., (1997) Blood 90:Suppl. 1 : 424a-425a) . El FlXa inhibido por el sitio activo reduce la trombosis in vivo ( ong et al., (1997) Thromb. Haemost. 77:1143-1147; Benedict et al., (1991) J. Clin. Invest. 88:1760-1765; Spanier et al., (1998) Am. J. Thoracic Cardiovasc. Surgery 115:1179-1188) .

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona anticuerpos aislados, fragmentos de anticuerpo, especialmente anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpo, reactivos con el dominio de Gla del factor IX o el factor IXa. En aspectos preferidos, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo inhiben una actividad asociada con el factor IX o IXa de coagulación sanguínea. Ventajosamente, los anticuerpos de la presente invención se proporcionan para la preparación de composiciones farmacéuticas potentes que comprenden los anticuerpos. Las composiciones farmacéuticas se proporcionan para formulaciones farmacéuticas de baja dosis para el tratamiento de desordenes trombóticos agudos y crónicos sin comprometer la hemostasis normal.

En una modalidad, la invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que reacciona con el factor FIX/FIXa humano y especialmente el dominio de Gla del FIX/FIXa humano.

Los fragmentos de anticuerpo representativos incluyen los fragmentos Fv, scFv, Fab, F(ab')2, así como los diacuerpos y anticuerpos lineales. Estos fragmentos se pueden fundir a otras secuencias que incluyen, por ejemplo, un "zíper de leucina" u otra secuencia e incluyen secuencias pegiladas o variantes de Fe usados para mejorar o modular la vida media. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo representativos comprenden tres regiones que determinan la complementariedad (CDRs) referidas aquí como CDR1, CDR2 y CDR3. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de CDR se seleccionan a partir de aquellos de los fragmentos de anticuerpo ejemplares 10C12, 11C5, 11G9, 13D1, 13H6 y 14H9 y variantes de los mismos. Los anticuerpos preferidos se seleccionan del grupo que consiste de Abl, Ab2, Ab3, Ab4, Ab5, y Ab6, en donde las CDRs del Abl-Ab6 corresponden a aquellos del 10C12, 11C5, 11G9, 13D1, 13H6 y 14H9, respectivamente .

En una modalidad, la composición de la presente invención es un polipéptido de anticuerpo y la invención incluye una composición de la materia que comprende un ácido nucleico aislado, de manera preferible DNA, que codifica el polipéptido de la invención. De acuerdo a este aspecto, la invención además comprende una secuencia de control de expresión enlazada de manera operable a la molécula de DNA, un vector de expresión, de manera preferible un plasmido, que comprende la molécula de DNA, donde la secuencia de control se reconoce por una célula huésped que comprende el vector, así como una célula huésped que comprende el vector.

La presente invención además abarca a las aplicaciones terapéuticas para las composiciones de anticuerpo descritas aquí. De este modo la invención incluye una composición farmacéutica que comprende un excipiente aceptable farmacéuticamente y un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención. La invención incluye equipos y artículos de manufactura que comprenden las composiciones de anticuerpo de la invención. Los equipos y artículos de manufactura de manera preferible incluyen: (a) un recipiente; (b) una etiqueta en el recipiente; y (c) una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención contenida dentro del recipiente; en donde la composición es efectiva para tratar un desorden de coagulación y la etiqueta opcional en el recipiente indica que la composición se puede usar para tratar un desorden coagulopático. Los equipos opcionalmente incluyen componentes de accesorios, tales como un segundo recipiente que comprende un amortiguador aceptable farmacéuticamente e instrucciones para usar la composición para tratar un desorden relacionado a la coagulación.

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se pueden usar en el tratamiento o profilaxis de enfermedades o desordenes trombóticos o coagulopáticos e incluyen, por ejemplo, métodos para tratar un mamífero para el cual se recomienda inhibir un evento mediado por el FIX/FIXa. Los métodos comprenden administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición farmacéutica de la invención al mamífero. Tales indicaciones incluyen, trombosis venosa profunda, trombosis arterial, angina inestable, infarto postmiocardio, trombosis postcirugía, injerto de derivación de la arteria coronaria (CABG) , angioplastia coronaria transluminal percutánea (PTCA) , ataque de parálisis, crecimiento tumoral, invasión o metástasis, inflamación, choque séptico, hipotensión, ARDS, fibrilación atrial y DIC. Las composiciones de la presente invención también se pueden usar como un adjunto en la terapia trombolítica .

Breve Descripción de los Dibujos Figuras 1A y IB: secuencias de dominio de Gla. La homología de secuencias entre los dominios de Gla del FIX de varias especies: humano, SEC ID NO: 5; canino, SEC ID NO: 2; murino, SEC ID NO: 3 y conejo, SEC ID NO: 4 (Figura 1A) y dominios de Gla de varias proteínas de coagulación humanas: factor IX, SEC ID NO: 5; factor X, SEC ID NO: 6; factor VII, SEC ID NO: 7; proteína C, SEC ID NO: 8 y protrombina, SEC ID NO: 9 (Figura IB). Los residuos no homólogos se indican en negrilla.

Figura 2: uso del segmento de gen V y secuencias de CDR del scFv seleccionado. Los residuos diferentes de aquellos del 10C12 se indican en negrilla. Cadena pesada del 10C12: CDRl, SEC ID NO: 10; CDR2, SEC ID NO: 11; CDR3, SEC ID NO: 12. Cadena ligera del 10C12: CDRl, SEC ID NO: 13; CDR2, SEC ID NO: 14; CDR3, SEC ID NO: 15. Cadena pesada del 11C5: CDRl, SEC ID NO: 10; CDR2, SEC ID NO: 16; CDR3, SEC ID NO: 17. Cadena ligera del 11C5: CDRl, SEC ID NO: 13; CDR2, SEC ID NO: 14; CDR3, SEC ID NO: 15. Cadena pesada del 11G9: CDRl, SEC ID NO: 10; CDR2, SEC ID NO: 18; CDR3, SEC ID NO: 19. Cadena ligera del 11G9: CDRl, SEC ID NO: 13; CDR2, SEC ID NO: 14; CDR3, SEC ID NO: 15. Cadena pesada del 13D1: CDRl, SEC ID NO: 10; CDR2, SEC ID NO: 20; CDR3, SEC ID NO: 12. Cadena ligera del 13D1: CDRl, SEC ID NO: 13; CDR2, SEC ID NO: 14;, CDR3, SEC ID NO: 15. Cadena pesada del 13H6: CDRl, SEC ID NO: 21; CDR2, SEC ID NO: 22, CDR3, SEC ID NO: 23. Cadena ligera del 13H6: CDRl, SEC ID NO: 24; CDR2, SEC ID NO: 25; CDR3, SEC ID NO: 26. Cadena pesada del 14H9: CDRl, SEC ID NO: 27; CDR2, SEC ID NO: 28; CDR3, SEC ID NO: 29. Cadena ligera del 14H9: CDRl, SEC ID NO: 30; CDR2, SEC ID NO: 31; CDR3, SEC ID NO: 32.

Figura 3: Afinidades del F(ab')2 antiFIX seleccionado para el FIX/FIXa humano: el FIX humano se acopla a un chip biosensor de acuerdo a la descripción del proveedor (BIAcore Inc., Piscataway NJ) . Las afinidades se calcularon a partir de las constantes de asociación y disociación medidas usando un sistema de resonancia de plasmón superficial de BIAcore-2000™ (Pharmacia Biosensor) .

Figura 4: Enlace del scFv al FIX de longitud completa. Las Placas se recubrieron con 10 µg/ml de mAb anti-C-myc 9E10.

Las diluciones consecutivas del scFv (10 µg/ml hasta 5 ng/ml) se adicionaron a cada pozo durante una hora, seguido por el factor IX biotinilado (1 µg/ml) y estreptavidina-HRP.

Figuras 5A y 5B: Efecto del scFv sobre el enlace del FIX a las células endoteliales aórticas de bovino y sobre la coagulación dependiente de las plaquetas. En la Figura 5A, los ensayos se llevaron a cabo a 4°C en 100 µl de Hepes 10 mM, NaCl 137 mM, KCl 4 mM, glucosa 11 mM, CaCl2 2 mM, albúmina de suero de bovino pH 7.5 (amortiguador de ensayo). Las monocapas de las células endoteliales aórticas de bovino (BAE) se lavaron una vez con amortiguador de ensayo sin CaCl2 antes de usarse. Los scFvs se preincubaron con FIX humano biotinilado en 100 µl de amortiguador durante 1 hora, luego se adicionó a las células endoteliales aórticas de bovino durante dos horas, se lavaron e incubaron con 100 µl de substrato de 3, 3', 5,5'-tetrametilbenzimina/H202 (Kirkgaard & Perry) durante 10 minutos. La reacción se enfrió rápidamente con 100 µl de H3P04 1M y la densidad óptica se leyó a 450 nm. Figura 5B - Las plaquetas humanas lavadas se activaron por difosfato de adenosina (ADP) y se dejaron adherirse al colágeno tipo III antes de que el scFv y el plasma pobre en plaquetas recalcificado se adicionaron. El efecto sobre la coagulación se verificó durante 90 minutos midiendo el incremento de la densidad óptica a 405 nm. Están mostrados los efectos del scFv a una concentración plasmática de 500 nM.

Figuras 6A y 6B: Especificidad de enlace del scFv antiFIX y F(ab')2. Las placas Elisa se recubrieron con factor IX, factor X, factor VII, protrombina, o proteína C a l µg/ml. El scFv (Figura 6A) y el F(ab')2 (Figura 6B) se adicionaron a 5 µg/ml y 0.02 µg/ml, respectivamente, durante una hora. Este paso se siguió por adición del mAb anti-C-myc de 9E10 biotinilado (2 µg/ml) y luego estreptavidina-HRP. Factor IX + suero: los scFvs se preincubaron durante 1 hora en hielo con suero deficiente de FIX (menor que 1% de actividad residual del factor IX) antes de la incubación con el FIX recubierto en la placa.

Todos los amortiguadores ELISA contienen CaCl2 2mM.

Figuras 7A y 7B. Comparación de dos fragmentos de zíper de F(ab')2_leu antiFIX en el ensayo de coagulación dependiente de plaquetas. Las plaquetas humanas activadas adherentes al colágeno se incubaron con diferentes concentraciones del zíper de F(ab')2-leu del 10C12 (Figura 7A) y zíper de F(ab')2-leu del 13H6 (Figura 7B) y se adicionó plasma humano recalcificado al inicio del proceso de coagulación. Se probaron seis diferentes concentraciones por anticuerpo, tres de las cuales se mostraron en cada gráfica. Cada valor representa la media ± SD de 3 experimentos independientes. Los valores de IC50 se calcularon a partir de las curvas de inhibición, usando los valores de OD en el punto de tiempo de 100 minutos con el valor de control (coagulación no inhibida) fijada a 100%. 10C12, IC50 = 59±3nM; 13H6, IC50 = 173±43nM. Círculos abiertos: lOOOnM, cuadrados abiertos: 250 nM, rombos: 62.5nM, triángulos llenos: 15.6nM, círculos llenos: control.

Figura 8. Inhibición de la activación dependiente del FlXa del FX por el zíper de F(ab')2-leu antiFIX. Los anticuerpos se incubaron con FlXa, FVIIIa y fosfolípidos durante 20 minutos, después de lo cual se adicionó FX. La velocidad de generación de FXa se calculó después de medir la concentración del FXa a diferentes puntos de tiempo usando el substrato cromogénico S2765. La inhibición por anticuerpos se expresa como velocidades relativas (velocidades inhibidas divididas por velocidades no inhibidas de generación de FXa) . Las concentraciones de los anticuerpos 10C12 (cuadrados) , 13H6 (rombos) y un anticuerpo de control no pertinente antiNeurturina (círculos) son agüellas en la mezcla de reacción final con FX.

Figuras 9A y 9B. Efectos del zíper de F(ab')2-leu del 10C12 sobre el tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) y tiempo de protrombina (PT) . En la Figura 9A, los anticuerpos se incubaron con plasma humano durante 10 minutos a 37°C y el APTT y PTT se midieron en un ACL 300. Están mostrados el APTT (símbolos llenos) y PT (símbolos abiertos) por el zíper de F(ab')2-leu del 10C12 (cuadrados) y zíper de F(ab')2~leu del 13H6 (círculos). En la Figura 9B, el zíper de F(ab')2-leu del 10C12 se incubó durante 10 minutos a 37°C con plasma de diferentes especies y el APTT y PT se midieron en un ACL 300. Están mostrados el APTT (símbolos llenos) y PT (símbolos abiertos) de humano (círculos), rata (rombos), perro (cuadrados) y plasma de conejo (triángulos invertidos) .

Figura 10A y 10B: activación del FIX por el FlXa y por el complejo de factor de tejido: factor Vlla (TF:FVIIa). El FIX (400 nM) se incubó con 10C12 (símbolos llenos) o un anticuerpo de control (NTN: antineurturina) (símbolos abiertos) en HBSA-CaCl2 5mM. Figura 10A: el FlXa InM se adicionó al inicio de la reacción. Figura 10B: TF:FVIIa relipidado (4nM:lnM) (círculos) o TF de membrana : FVIla (150 µg/ml: InM) (cuadrados) se adicionó al inicio de la reacción. A intervalos de tiempo definidos, las alícuotas de reacción se enfriaron rápidamente en EDTA-etilenglicol y actividad amdiolítica del FlXa en cada muestra se determinó después de adicionar el substrato #299 de FlXa. La inhibición de las velocidades de generación del FlXa se expresaron como velocidades relativas (vi/vo) ± SD de 3-4 experimentos independientes.

Figura 11: Medición del tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) y tiempo de protrombina (PT) en plasma de conejillo de Indias y rata. El 10C12 se diluyó en plasma cifrado de conejillo de Indias y rata. Después de una incubación de 10 minutos, el factor de tejido relipidado (Innovin) o Actin FS se adicionaron al inicio de la reacción del PT (símbolos abiertos) y APTT (símbolos llenos), respectivamente. Los efectos sobre la coagulación se expresaron como prolongación en determinado número de partes de los tiempos de coagulación de plasma de control. Rombos=conejillo de Indias; círculos=rata.

Figura 12: Efectos del 10C12 sobre las variaciones de flujo cíclicas (CFVs) en un modelo de trombosis arterial de conejillo de Indias. El 10C12 y los controles se dieron por administración de bolo intravenosa 15 minutos antes de la iniciación de las CFVs en la arteria carótida. El número de CFVs durante un periodo de 40 minutos se registró y el índice de trombosis se calculó como la proporción de las CFVs dividida por el número de estrechamientos aplicados. **p<0.01, ***p<0.001 contra el control por la prueba U de Mann-Whitney después de la determinación de diferencias significantes entre los grupos múltiples en la prueba de Kruskal-Wallis .

Figura 13. Efecto del tratamiento con FeCl3 sobre el flujo de sangre de la arteria carótida en la rata. El flujo de sangre de la arteria carótida representativos en ratas se traza en ratas tratadas con ya sea solución salina o 10C12 antes de la colocación de un disco saturado de FeCl3. La trombosis oclusiva se indujo en 10 de 10 ratas tratadas con control y 0 de 5 ratas tratadas con un bolo i.v. de 2 mg/kg de 10C12.

Figuras 14A y 14B: Efectos del 10C12 y heparina sobre la formación de trombo en el modelo de trombosis arterial inducido por el FeCl3 en la rata. El 10C12 y los controles se dieron como bolo y heparina como un bolo de lOOU/kg, seguido por la infusión a una velocidad de lU/kg/minuto, 5 minutos antes de la colocación del disco de FeCl3 sobre la arteria expuesta. Figura 14A: Los efectos sobre el peso del coágulo se cuantificaron eliminando y pesando el trombo 65 minutos después de que se inició la administración del fármaco. Figura 14B: Efectos sobre la duración de la oclusión de vasos se determinaron midiendo los periodos de tiempo durante los cuales se presenta el flujo cero siguiendo la colocación del disco de FeCl3. **p20.01 contra control por la prueba U de Mann-Whitney después de la determinación de las diferencias significantes entre los grupos múltiples en la prueba de Kruskal- allis .

Breve Descripción de las Modalidades Preferidas Definiciones Los términos usados en las reivindicaciones y especificación se definen como se menciona a continuación salvo especificación contraria.

Las abreviaturas usadas en toda la descripción incluyen: FIX para el factor IX; FlXa para el factor IXa; FlXa para el factor Xla; FXa para el factor Xa; TF para el factor de tejido; FVII para el factor VII de zimogeno; FVIIa para el factor Vlla; PT para el tiempo de protrombina; APTT para el tiempo de tromboplastina parcial activado.

El término aminoácido o residuo de aminoácido, como se usa aguí, se refiere a aminoácidos L que se presentan naturalmente o a aminoiácidos D como se describen además a continuación con respecto a los variantes. Las abreviaturas de 1 y 3 letras para los aminoácidos se usan aquí (Bruce Alberts et al., Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing, Inc., New York (3d ed. 1994) .

Un proceso o evento mediado o asociado por el FIX/FIXa, o equivalentemente, una actividad asociada con el FIX/FIXa plasmático, de acuerdo a la presente invención es cualquier evento el cual requiere la presencia del FlX/IXa. El mecanismo general de la formación de coágulos de sangre se reexamina por Ganong, en Review of Medical Physiology, 13th ed., Lange, Los Altos CA, pp411-414 (1987); Bach (1988) CRC Crit. Rev. Biochem. 23(4): 359-368 y Davie et al., (1991) Biochemistry 30:10363; y la velocidad del FIX en Limentoni et al., (1994) Hemostasis and Thrombosis Basic Principies and Clinical Practice, Third Edition, Coleman et al. Eds., Lippincott Company, Philadelphia . La coagulación requiere la concurrencia de dos procesos, la producción de la trombina, la cual induce la agregación de plaquetas y la formación de fibrina, la cual hace al tapón de plaqueta estable. El proceso comprende varias etapas, cada una requiere la presencia de proenzimas discretas y procofactores . El proceso finaliza en la degradación de la fibrina y la formación de trombo. El fibrinogeno se convierte a la fibrina por la acción de la trombina. La trombina, a su vez, se forma por la segmentación proteolítica de la protrombina. Esta proteolisis se efectúa por el FXa, el cual se une a la superficie de las plaquetas activadas y en la presencia del Fva y calcio, se divide la protrombina. El TF-FVIIa se requiere para la activación proteolítica del FX por la vía extrínseca de coagulación. El FIX se activa por dos diferentes enzimas, FXIa (Fujekawa et al., (1974) Biochemistry, 13:4508-4516; Di Scipio et al., (1978) J. Clin. Invest., 61:1526-1538; Osterud et al., (1978) J. Biol. Chem. 253:5946-5951) y el complejo de factor de tejido:factor Vlla (TF:FVIIa) (Osterud and Papaport (1977) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 74:5260-5264). El FlXa formado en el complejo con su cofactor FVIIIa se junta en el complejo Xase intrínseco sobre la superficies celulares, tales como las plaquetas y células endoteliales, y convierte el FX de substrato en FXa (Mann et al., (1992) Semin. Hematol. 29:213-226). La trombina generada por la actividad enzimática del FXa, divide el fibrinogeno que lleva a la formación de la fibrina y también activa las plaquetas que da por resultado la agregación de plaquetas. Por lo tanto, un proceso mediado por o asociado con el FlX/IXa, o una actividad asociada con el FlXa incluye cualquier paso en la cascada de coagulación a partir de la introducción del FIX en la vía extrínseca o intrínseca para la formación de un coágulo de plaqueta de fibrina y la cual inicialmente comprende la presencia del FlX/IXa. El proceso mediado o asociado por la FIX/FIXa, o actividad del FlXa, se puede medir convenientemente empleando los ensayos estándar, tales como aquellos descritos aquí.

La enfermedad o desorden relacionado al FIX/FIXa significa que incluye enfermedades o desordenes tromboembólicos crónicos asociados con la formación de fibrina, que incluyen desordenes vasculares, tales como trombosis venosa profunda, trombosis arterial, ataque de parálisis, metástasis tumoral, trombolisis, arteriesclerosis y restenosis después de la angioplastia, indicaciones agudas y crónicas, tales como inflamación, chogue séptico, septicemia, hipotensión, síndrome de angustia respiratoria en adulto (ARDS), coagulopatia intravascular diseminada (DIC) y otras enfermedades.

El término "FIX" se usa para referirse a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un factor IX de mamífero que se presenta naturalmente o un IX recombinante descrito a continuación. El FIX que se presenta naturalmente incluye especies humanas, así como otras especies animales, tales como FIX de conejo, rata, porcino, primate no humano, equino, murino, y bovino (véase, por ejemplo, Yoshitake et al., (1985) Biochemistry 24:3736 (human)). La secuencia de aminoácidos de las proteínas de factor IX/IXa de mamífero son conocidos generalmente u obtenibles a través de técnicas convencionales. Los dominios de ácido ?-carboxiglutámico (Gla) de 43 aminoácidos del FIX de humano, canino, murino y conejo se indican en la Figura 1.

El término "tratamiento" como se usa dentro del contexto de la presente invención significa que incluye el tratamiento terapéutico, así como las medidas profilácticas o supresoras para la enfermedad o desorden. De este modo, por ejemplo, el término tratamiento incluye la administración de un agente antes de o después del ataque de una enfermedad o desorden con lo cual se previene o elimina todos los síntomas de la enfermedad o desorden. Como otro ejemplo, la administración del agente después de la manifestación clínica de la enfermedad para combatir los síntomas de la enfermedad comprende el "tratamiento" de la enfermedad. Además, la administración del agente después del ataque y después de que se han desarrollado los síntomas clínicos donde la administración afecta los parámetros clínicos de la enfermedad o desorden y tal ves el mejoramiento de la enfermedad, comprende el "tratamiento" de la enfermedad.

Aquellos "en necesidad del tratamiento" incluyen mamíferos, tales como humanos, que ya tienen la enfermedad o desorden, incluyendo aquellos en los cuales se previene la enfermedad o desorden.

Los anticuerpos o inmunoglobulinas son, más comúnmente, glucoproteínas heterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera se enlaza a una cadena pesada por un enlace de disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes de disulfuro intracadena regularmente espaciados. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por un número de dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera se alinea con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera se alinea con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácido particulares forman una interface entre los dominios variables de cadena ligera y pesada (Clothia et al. (1985), J. Mol. Biol. 186:651; Novotny and Haber (1985), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S. A. 82:4592) .

El término "variable" se refiere al hecho que ciertas porciones de los dominios variables difieren extensivamente en secuencia entre los anticuerpos y se usan en el enlace y especificidad de cada anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye igualmente en todos los dominios variables de los anticuerpos. Se concentran en tres segmentos llamados regiones que determinan la complementariedad (CDRs) o regiones hipervariables tanto en los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. Las porciones conservadas más altamente de dominios variables son llamadas la estructura (FR) . Los dominios variables de cadenas pesada y ligera nativas cada una comprende cuatro regiones de FR, adoptan en gran parte una configuración de hoja en ß, conectada por tres CDRs, las cuales forman bucles que conectan, y en ciertos casos forman parte de, la estructura de hoja en ß. Las CDRs en cada cadena se mantienen juntas en proximidad cercana por las regiones de FR y, con las CDRs de la otra cadena, contribuyen a la formación del sitio de enlace de antígeno de los anticuerpos (véase Kabat et al. (1991), Seguences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, MD) . Los dominios constantes no están comprendidos directamente en el enlace de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones de efector, tal como la participación del anticuerpo en la toxicidad celular dependiente del anticuerpo.

La digestión de papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de enlace de antígeno idénticos, llamados fragmentos Fab, cada uno con un sitio de enlace de antígeno único, y un fragmento Fe residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de combinación de antígeno y es todavía capaz de degradar el antígeno.

El Fv es el fragmento de anticuerpo mínimo el cual contiene un reconocimiento de antígeno completo y un sitio de enlace. En una especie de Fv de dos cadenas, esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera en asociación no covalente ajustada. En una especie de Fv de cadena única (scFv) , un dominio variable de cadena pesada y cadena ligera se puede enlazar covalentemente por un enlazador de péptido flexible, tal gue las cadena ligera y pesada pueden asociarse en una estructura "dimérica" análoga a aquella en una especie de Fv de dos cadenas. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interactúa para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs otorgan especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un dominio variable único (o la mitad de un Fv que comprende solamente tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y enlazar el antígeno, aunque en una afinidad más baja que el sitio de enlace completo. Para una reexaminación del scFv véase Pluckthun, en The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).

El fragmento de Fab también contiene el dominio constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Los fragmentos Fab' difieren de los fragmentos Fab por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxi del dominio de CH1 de cadena pesada que incluye uno o más cisteinas de la región de eje del anticuerpo. El Fab'-SH es la designación aquí para el Fab' en la cual el residuo (s) de cisteina de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre.

Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 se producen originalmente como pares de fragmentos Fab', los cuales tienen cisteinas de eje entre ellos. Otros acoplamientos químicos de los fragmentos de anticuerpo también son conocidos.

Las cadenas ligeras de los anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquiera de las especies de vertebrados se pueden asignar a uno de los dos tipos distintos claramente, llamados kappa (k) y lambda (?) , basado en las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos se pueden asignar a diferentes clases. Hay cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, y IgM, y varios de estos se pueden además dividir en subclases (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG2, IgG3, IgG4, IgAi, y IgA2. Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas son llamados a, d, e, ?, y µ, respectivamente. Las estructuras de subunidades y configuraciones de tres dimensiones de diferentes clases de inmunoglobulinas son bien conocidas.

El término "anticuerpo" se usa en el sentido más amplio y especialmente cubre los anticuerpos monoclonales únicos (incluyendo los anticuerpos agonistas y antagonistas) y composiciones de anticuerpo con especificidad poliepitópica .

Los "fragmentos de anticuerpo" comprenden una porción de un anticuerpo intacto, generalmente el sitio de enlace de antígeno o región variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluyen los fragmentos Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 y Fv; anticuerpos; cualquier fragmento de anticuerpo que es un polipéptido que tiene una estructura primaria que consiste de una secuencia no interrumpida de residuos de aminoácido contiguos (referido aquí como un "fragmento de anticuerpo de cadena única" o "polipéptido de cadena única"), incluyendo sin limitación (1) Fv de cadena única (scFv) , (2) polipéptidos de cadena única que contienen solamente un dominio variable de cadena ligera, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDRs del dominio variable de cadena ligera, sin una parte de cadena pesada asociada, (3) polipéptidos de cadena única que contiene solamente una región variable de cadena pesada, o un fragmento del mismo que contiene las tres CDRs de la región variable de cadena pesada, sin una parte de cadena ligera asociada; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de los fragmentos de anticuerpo.

El término "anticuerpo monoclonal" (mAb) como se usa aguí se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos homogéneos substancialmente, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, excepto para mutaciones que se presentan naturalmente posibles que se pueden presentar en cantidades menores.

Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, se dirigen contra un sitio antigénico único. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales) , las cuales incluyen típicamente diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epitopos), cada Mab se dirige contra un determinante único en el antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales son ventajosos, ya se pueden sintetizar por un cultivo de hibridoma, no contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como se obtiene a partir de una población homogénea substancialmente de anticuerpos, y no se construye como requiere la producción del anticuerpo por cualquier método particular.

El término "diacuerpos" se refiere a fragmentos de anticuerpo pequeños con dos sitios de enlace de antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH y VL) . Usando un enlazador que sea demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios en la misma cadena, los dominios son forzados a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crean dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente en, por ejemplo, documento EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al. (1993), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:6444-6448.

La expresión "anticuerpos lineales" cuando se usan en toda esta solicitud se refiere a los anticuerpos descritos en Zapata et al. (1995) Protein Eng 8(19): 1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos comprenden un par de segmentos Fd uno tras otro (VH-CH1-VH-CH1) , los cuales forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser específicos o monoespecíficos .

Un anticuerpo o fragmento de anticuerpo "variante", se refiere a una molécula la cual difiere en secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de "origen" en virtud de la adición, supresión y/o substitución de uno o más residuo (s) de aminoácido en la secuencia de anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen. Por ejemplo, el variante puede comprender uno o más substitución (es) en una o más CDR's del anticuerpo o fragmento de origen. Por ejemplo, el variante puede comprender al menos uno, desde aproximadamente uno hasta diez, o de manera preferible desde aproximadamente dos hasta aproximadamente cinco, substituciones de aminoácido en una o más CDR' s del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen. Ordinariamente, el variante tendrá una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 75% de identidad de secuencia de aminoácidos con las secuencias de dominio variable de cadena pesada o ligera de anticuerpo de origen, de manera preferible al menos 80%, de manea más preferible al menos 85%, de manera más preferible al menos 90%, y de manera preferible al menos 95%. La identidad o homología con respecto a esta secuencia se define aquí como el porcentaje de residuos de aminoácido en la secuencia candidata que son idénticos con los residuos de anticuerpo de origen, después de alinear las secuencias e introducir las aberturas, sí es necesario, para lograr el % máximo de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, supresiones o inserciones de extremo N, de extremo C, o interna en la secuencia de anticuerpo debe ser construida, ya que afecta la identidad o homología de secuencia. El variante mantiene la capacidad para enlazar el dominio de Gla del FIX humano y de manera preferible tiene propiedades las cuales son superiores a aquellas del anticuerpo de origen. Por ejemplo, el variante puede tener una afinidad de enlace mayor para el dominio de Gla del FIX humano cuando se compara con el anticuerpo de origen o anticuerpo a partir del cual se deriva. Analizando tales propiedades, un anticuerpo o fragmento de anticuerpo vasriante, tal como una forma Fab del variante, se compara al mismo fragmento, por ejemplo la forma Fab, del anticuerpo de origen o fragmento de anticuerpo. Como un ejemplo adicional, una forma de anticuerpo de longitud completa del variante debería compararse a una forma de longitud completa del anticuerpo de origen, ya que se ha encontrado que el formato del anticuerpo o fragmento de anticuerpo tiene impacto sobre su actividad en los ensayos de actividad biológica descritos aquí. El anticuerpo o fragmento de anticuerpo variante de interés particular aquí es uno el cual muestra entre dos y diez partes, de manera preferible, al menos aproximadamente 10 partes, de manera preferible al menos 20 partes, y de manera más preferible al menos 50 partes, un aumento en la actividad biológica cuando se compara al anticuerpo de origen. El término variante significa que incluye un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que tiene al menos una actividad biológica cualitativa en común con un anticuerpo de origen o fragmento de anticuerpo y el cual tiene al menos una substitución de aminoácido en al menos una CDR de las CDRs ejemplares en la Figura 2. La actividad biológica cualitativa referida que se selecciona, sin limitación a una actividad única, del grupo que consiste de (i) reactividad con el dominio de Gla del FIX/FIXa humano, (ii) inhibición de la activación del FIX por el FlXa; (iii) inhibición de la activación del FIX por el complejo de factor de tejido: factor Vlla; y (iv) inhibición de la activación del FX. Los sistemas de ensayo para la medición de la inhibición de la activación del FIX y FX son conocidos en la técnica. En modalidades preferidas, el variante de la presente invención compite con un anticuerpo o fragmentos de anticuerpo de origen para enlazar un dominio de Gla del FlX/IXa humano. Por lo tanto, sin limitación a cualquier teoría, la actividad biológica cualitativa se puede definir como la capacidad para competir con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen y en modalidades preferidas por lo mismo inhibe una actividad asociada con el FIX, tal como su activación o el FX de activación. Como será apreciado de lo mencionado anteriormente, el término "competir" y "capacidad para competir" son términos relativos. De este modo los términos, cuando se usan para describir la actividad del variante, significan un variante que cuando se adiciona en un exceso molar de 10 partes a un anticuerpo o fragmento de origen en un ensayo de enlace estándar produce al menos una inhibición de 50% de enlace del anticuerpo o fragmento de origen. De manera preferible el variante producirá al menos una inhibición de 50% de enlace en un exceso molar de 5 partes y de manera más preferible al menos un exceso molar de 2 partes. Un variante preferido de la presente invención producirá al menos una inhibición de 50% de enlace cuando se presenta en una proporción estequiométrica 1:1 con el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen.

El anticuerpo o fragmento de anticuerpo de "origen" aquí es uno el cual se codifica por una secuencia de aminoácidos usada para la preparación del variante. De manera preferible, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen tiene una región de estructura humana y tiene una región (s) constante de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo de origen o anticuerpo es de manera preferible un anticuerpo o fragmento humano aislado del mismo.

Un anticuerpo "aislado" es uno el cual se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural. Los componentes contaminantes de su ambiente natural son materiales los cuales interferirían con los usos de diagnóstico y terapéuticos para el anticuerpo y pueden incluir enzimas, hormonas, y otras substancias disueltas proteínicas y no proteínicas. En modalidades preferidas, el anticuerpo será purificado (1) hasta más de 95% por peso de anticuerpo como se determina por el método Lowry, y de manera más preferible más de 99% por peso, (2) hasta un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de la secuencia de aminoácidos de extremo N o interna por uso de un generador de secuencias de cubeta de hiladura química, o (3) hasta la homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones de reducción o no reducción usando azul de Coomassie o, de manera preferible, tinte de plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes, ya que al menos un componente del medio natural del anticuerpo no estará presente. Ordinariamente, sin embargo, el anticuerpo aislado será preparado por al menos un paso de purificación.

El término "epitopo marcado" cuando se usa aquí se refiere a un anticuerpo fundido a una "marca de epitopo". El polipéptido de marca de epitopo tiene bastantes residuos para proporcionar un epitopo contra el cual un anticuerpo contra el mismo se puede hacer, todavía es bastante corto tal que no interfiere con la actividad del anticuerpo. La marca de epitopo de manera preferible es única suficientemente de modo que el anticuerpo contra el mismo no reacciona de manera transversal substancialmente con otro epitopos. Los polipéptidos de marca adecuados generalmente tienen al menos 6 residuos de aminoácidos y usualmente entre aproximadamente 8-50 residuos de aminoácido (de manera preferible entre aproximadamente 9-30 residuos) . Los ejemplos incluyen el polipéptido de marca de flu HA y su anticuerpo 12CA5 (Field et al. (1988), Mol. Cell. Biol. 8:2159-2165); la marca de c-myc y los anticuerpos de 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 para la misma (Evan et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5 (12 ): 3610-3616) ; y la marca de glucoproteína D (gD) del virus del Herpes Simple y su anticuerpo (Paborsky et al. (1990), Protein Engineering 3(6):547-553 (1990)). En ciertas modalidades, la marca de epitopo es un "epitopo de enlace de receptor de salvamento". Como se usa aquí, el término "epitopo de enlace de receptor de salvamento" se refiere a un epitopo de la región de Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la vida media in vivo de la molécula de IgG.

Modos para Llevar a Cabo la Invención La invención proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo gue comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de CDR de cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR de polipéptido de cadena pesada de la Figura 2. La invención incluye un fragmento de anticuerpo de cadena única que comprende cualquiera de las secuencias de CDR de cadena pesada, con o sin cualquier secuencia de aminoácidos adicional. A manera de ejemplo, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo de cadena única gue comprende una cadena pesada que comprende una CDRl, una CDR2 y una CDR3 sin cualquier secuencia de aminoácidos de dominio variable de cadena ligera asociada, es decir, una especie de cadena única que produce un medio de un fragmento de Fv.

Además se proporciona aquí un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende cualquiera de las secuencias de CDR de cadena pesada como se describe anteriormente, y además comprende una secuencia de aminoácidos de CDR de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de CDR de cadena ligera de la Figura 2. A manera de ejemplo, en una modalidad, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo de cadena única en donde cualguier cadena pesada que comprende una CDRl, una CDR2 y una CDR3, y una cadena ligera (?c) que comprende una ?c-CDRl, una ?c-CDR2 y una ?c-CDR3 están contenidas en una especie de polipéptido de cadena pesada. A manera de ejemplo y no de limitación, el fragmento de anticuerpo de cadena única es, una modalidad particular, una especie de scFv que comprende la cadena pesada unida a la cadena ligera mediante una secuencia de enlazador de péptido flexible, en donde los dominios variables de cadena pesada y ligera pueden asociarse en una estructura "dimérica" • análoga a aquella formada en una especie de Fv de dos cadenas. En otra modalidad, el fragmento de anticuerpo de cadena única es una especie que comprende la cadena pesada unida a la cadena ligera por un enlazador gue es demasiado corto para permitir la formación de pares intramoleculres de los dos dominios variables, es decir, un monómero de polipéptido de cadena única que forma un diacuerpo con la dimerización con otro monómero.

En todavía otra modalidad, la invención proporciona un fragmento de anticuerpo que comprende una pluralidad de cadenas de polipéptido, en donde una cadena de polipéptido comprende cualquiera de las CDRs de cadena pesada de la Figura 2 y una segunda cadena de polipéptido comprende cualquiera de las CDRs de cadena ligera de la Figura 2 y las dos cadenas de polipéptido se enlazan covalentemente por uno o más enlaces de disulfuro intracadena. En una modalidad preferida, el fragmento de anticuerpo de dos cadenas mencionado anteriormente se selecciona del grupo que consiste de Fab, Fab', Fab'-SH, Fv, y F(ab')2.

La invención también proporciona un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que comprende un dominio variable de cadena pesada que contiene cualquiera de las CDRs de la Figura 2 y opcionalmente además que comprende un dominio variable de cadena ligera que contiene cualquiera de las CDRs de cadena ligera de la Figura 2, en donde el dominio variable de cadena pesada, y opcionalmente el dominio variable de cadena ligera, es (son) fundidos a una parte adicional, tal como un dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante se puede adicionar a la secuencia (s) de cadena pesada y/o cadena ligera para formar especies con cadena (s) pesada y/o ligera completa o parcial. Será apreciado que las regiones constantes de cualquier isotipo se puede usar para este propósito, incluyendo las regiones constantes de IgG, IgM, IgA, IgD, y IgE, y que tales regiones constantes se pueden obtener de cualquier especie humano o animal. De manera preferible, la secuencia de dominio constante es de origen humano. Las secuencias de dominio constante humano adecuadas se pueden obtener de Kabat et al. (supra) .

En una modalidad preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CDR de cadena pesada de la Figura 2 en un dominio variable que se funde a un dominio constante de cadena pesada que contiene una secuencia de zíper de leucina. El zíper de leucina puede incrementar la afinidad y/o eficiencia de producción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de interés. Las secuencias de zíper de leucina adecuadas incluyen los zíperes de leucina jun y fos enseñados por Kostelney et al. (1992), J. Immunol . , 148:1547-1553, y el zíper de leucina GCN4 descrito en los Ejemplos a continuación. En una modalidad preferida, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo comprende el dominio variable fundido en su extremo C al zíper de leucina GCN4.

La invención adicionalmente incluye un anticuerpo y fragmentos de anticuerpo que comprenden un anticuerpo o fragmento de anticuerpo variante. Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo variantes incluyen cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo descritos anteriormente, en donde al menos un aminoácido de una CDR descrito en la Figura 2 se ha substituido con otro aminoácido. El artesano experto reconocerá que ciertos de los aminoácidos de las CDR' s descritos en la Figura 2 se pueden substituir, modificar y en ciertos casos borrar, para proporcionar un anticuerpo o fragmento de anticuerpo con una actividad biológica mejorada o alterada. Los variantes de las regiones que determinan la complementariedad o variantes de los dominios variables que comprenden las CDR' s de la Figura 2 las cuales muestran mayor afinidad para el dominio de Gla del FIX y/o poseen propiedades que producen mayor eficiencia en procesos de producción recombinantes que aquellos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen se prefieren en el contexto de la presente invención.

Métodos de Fabricación El ácido nucleico que codifica los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden preparar a partir de una librería de anticuerpos de cadena única representados en un bacteriófago. La preparación de tal librería es bien conocida para un experto en esta técnica. Las librerías adecuadas se pueden preparar por los métodos descritos en el documento WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438 y WO 95/15388. En una modalidad preferida, una librería de anticuerpos de cadena única (scFv) se puede generar a partir de una población diversa de células B humanas de donadores humanos. El mRNA correspondiente a las cadenas de anticuerpo VH y VL se aislan y purifican usando técnicas estándar y se transcribe de manera inversa para generar una población de cDNA. Después de la amplificación de PCR, la codificación de DNA para anticuerpos de cadena única se une usando un enlazador, tal como Gly4Ser (SEC ID N0:1), y se clona en vectores de expresión adecuados. Luego se prepara una librería de fagos en la cual la población de anticuerpos de cadena única se representa en la superficie del fago. Los métodos adecuados para preparar las librerías de fagos se han reexaminado y se describen en Winter et al. (1994), Annu. Rev. Immunol. 12:433-55; Soderlind et al. (1992), Immunological Reviews 130:109-123; Hoogenboom, Tibtech (February 1997), Vol. 15; Neri et al. (1995), Cell Biophysics 27:47-61, y las referencias descritas aquí.

Los anticuerpos de la invención se pueden seleccionar inmovilizando un dominio de Gla del FIX y luego panoramizando una librería de scFvs humanos preparada como se describe anteriormente usando el dominio de Gla del FIX inmovilizado para unir el anticuerpo. Griffiths et al. (1993), EMBO-J 12:725-734. La especificidad y la actividad de clones específicos se puede valorar usando ensayos conocidos. Griffiths et al.; Clarkson et al. (1991), Nature 352:642-648. Después de un primer paso de panoramización, uno obtiene una librería de fagos que contiene una pluralidad de diferentes anticuerpos de cadena única representados en fagos que tienen un enlace mejorado al dominio de Gla del FIX. Los pasos de panoramización subsecuente proporcionan librerías adicionales con afinidades de enlace mayores. Cuando los efectos de afinidad son un problema, las librerías de representación de fagos monovalentes se pueden usar en las cuales menos de 20%, de manera preferible menos de 10%, y de manera más preferible menos de 1% del fago representa más de una copia de un anticuerpo en la superficie del fago. La representación monovalente se puede llevar a cabo con el uso de fagemido y fago ayudante como se describe, por ejemplo, en Lowman et al. (1991), Methods: A Companion to Methods in Enzymology 3(3): 205-216. Un fago preferido es M13 y la representación es de manera preferible como una proteína de fusión con una proteína de recubrimiento 3 como se describe en Lowman et al., supra. Otro fago adecuado incluye el fago filamentoso fl y fd . La representación de proteína de fusión con otras proteínas de recubrimiento de virus también se conoce y se puede usar en esta invención. Véase el documento U.S. 5,223, 409.

Los variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios de nucleótidos adecuados en el DNA de anticuerpo, o por síntesis de péptidos. Tales variantes incluyen, por ejemplo, supresiones de, y/o inserciones en y/o substituciones de, residuos dentro de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos de los ejemplos aquí. Cualquier combinación de supresión, inserción, y substitución se hace para alcanzar la construcción final, con la condición que la construcción final posee las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos de postranslación del anticuerpo variante, tal como cambiando el número o posición de sitios de glucosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son sitios preferidos para la mutagénesis es llamado "mutagénesis de exploración de alanina" como se describe por Cunningham y Wells (1989), Science 244:1081-1085 (1989). Aquí, un residuo o grupo de residuos objetivo se identifican (por ejemplo, residuos cargados, tales como arg, asp, his, lys, y glu) y se reemplazan por un aminoácido cargado negativamente o neutro (de manera más preferible alanina o polialanina) para efectuar la interacción de los aminoácidos con el dominio de Gla del FIX. Luego aquellos sitios de aminoácidos que muestran sensibilidad funcional a las substituciones se refinan introduciendo variantes adicionales u oros variantes en, o para, los sitios de substitución. De este modo, mientras que se predetermina el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos, la naturaleza de la mutación per se no necesita predeterminarse. Por ejemplo, para analizar el funcionamiento de una mutación en un sitio dado, la mutagénesis d exploración o aleatoria de ala se lleva a cabo en el codón o región objetivo y los variantes de anticuerpo expresados se clasifican por la actividad deseada.

Las inserciones de secuencia de aminoácidos incluyen fusiones de extremo amino y/o carboxilo que fluctúan en longitud desde un residuo hasta polipéptidos que contienen un centenar de residuos, así como inserciones de intrasecuencia de residuos de aminoácido únicos o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo de metionilo de extremo N o el anticuerpo fundido a una marca de epitopo. Otros variantes de inserción de la molécula de anticuerpo incluye la fusión al extremo N o C del anticuerpo de una enzima o un polipéptido o PEG, el cual incrementa la vida media del suero del anticuerpo.

Otro tipo de variante es un variante de substitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo eliminada y un residuo diferente insertado en su sitio. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de substitución incluyen las regiones hipervariables, pero también se contemplan la alteraciones de FR. Las substituciones conservativas se muestran en la Tabla 1 bajo el título "substituciones preferidas". Sí tales substituciones dan por resultado un cambio en la actividad biológica, entonces más cambios substanciales, denominadas "substituciones ejemplares" en la Tabla A, o como además se describe a continuación con referencia a las clases de aminoácidos, se puede introducir y se clasifican los productos.

TABLA A Las modificaciones substanciales en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo seleccionando substituciones que difieren significativamente en su efecto sobre mantener (a) la estructura de la cadena principal del polipéptido en el área de la substitución, por ejemplo, como una hoja o conformación helicoidal, (b) el cambio o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo, o (c) la mayor parte de la cadena lateral. Los residuos que se presentan naturalmente se dividen en grupos basados en las propiedades de la cadena lateral comunes: (1) hidrofóbicos : norleucina, met, ala, val, leu, ile; (2) hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; (3) ácidos: asp, glu; (4) básicos: asn, gln, his, lys, arg; (5) residuos que influyen en la orientación de la cadena: gly, pro; y (6) aromáticos: trp, tyr, phe.

Las substituciones no conservativas se producirán cambiando un miembro de uno de estas clases por otras clases.

Cualguier residuo de cisteina no comprendido en mantener la conformación adecuada del anticuerpo variante también se puede substituir, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la degradación aberrante. A la inversa, el enlace (s) de cisteina se puede adicionar al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente donde el anticuerpo un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento de Fv) .

Un tipo de variante de substitución preferido particularmente comprende substituir uno o más residuos de región hipervariable de un anticuerpo de origen (por ejemplo, un anticuerpo humano). Generalmente, el variante (s) resultante seleccionado para el desarrollo adicional tendrá propiedades biológicas mejoradas en relación al anticuerpo de origen a partir del cual se generan. Una manera conveniente para generar tales variantes de substitución es la maduración de afinidad que usa un fago usando métodos conocidos en la técnica. Brevemente, varios sitios de región hipervariables (por ejemplo, 3-7 sitios) se mutan para generar todas las substituciones de amino posibles en cada sitio. Los variantes de anticuerpo de este modo generados se representan de una manera monovalente a partir de partículas de fago filamentosas como fusiones al producto de gen III del M13 empaquetado dentro de cada partícula. Luego los variantes representados en fagos se clasifican por su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de enlace) como se describe aguí. En orden para identificar los sitios de región hipervariables candidatos para la modificación, la mutagénesis de exploración de alanina se puede llevar a cabo para identificar los residuos de región hipervariables que contribuyen significativamente al enlace de antígeno. Alternativamente, o además, puede ser benéfico analizar una estructura de cristal del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el dominio de Gla del FIX. Tales residuos de contacto y residuos cercanos son candidatos para la substitución de acuerdo a las técnicas elaboradas aquí. Una vez que tales variantes se generan, el panel de variantes se someten a clasificación como se describe aquí y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes se pueden seleccionar para el desarrollo adicional.

Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón de glucosilación original del anticuerpo. El término alteración significa borrar una o más partes de carbohidrato encontradas en el anticuerpo, y/o adicionar uno o más sitios de glucosilación que no se presentan en el anticuerpo.

La glucosilación de anticuerpos es típicamente N-enlazado u O-enlazado. El término N-enlazado se refiere a la unión de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido, excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la parte de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De este modo, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido crea un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación O-enlazado se refiere a la unió de uno de los azucares N-acetilgalactosamina, galactosa, o xilosa a un ácido de hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también ser puede usar -hidroxiprolina o 5-hidroxilisina .

La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se lleva a cabo convenientemente alterando la secuencia de aminoácidos, tal que contiene una o más secuencias de tripéptido descritas anteriormente (para sitios de glucosilación N-enlazado) . La alteración también se puede hacer por la adición de, o substitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación O-enlazado) .

Las moléculas de ácido nucleico que codifican los variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan por una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos incluyen, pero no se limitan a, aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencia de aminoácidos que se presentan naturalmente) o preparación por mutagénesis mediada por el oligonucleótido (o dirigido en sitio) , mutagénesis de PCR, y mutagénesis de cassette de un variante preparado anteriormente o una versión no variante del anticuerpo.

De manera preferible, los anticuerpos se preparan por procedimientos recombinantes estándar, los cuales comprenden la producción de los anticuerpos cultivando las células transfectadas para expresar el ácido nucleico de anticuerpo (típicamente transformando las células con un vector de expresión) y recuperando el anticuerpo de las células del cultivo celular.

El ácido nucleico (por ejemplo, cDNA o DNA genómico) que codifica el anticuerpo seleccionado como se describe anteriormente se inserta en un vector duplicable para la clonación adicional (amplificación del DNA) o para la expresión.

Muchos vectores están disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá de (1) sí se usa para la amplificación de DNA o para la expresión de DNA, (2) el tamaño del ácido nucleico que se inserta en el vector, y (3) la célula huésped que se transforma con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (amplificación de DNA o expresión de DNA) y la célula huésped con la cual es compatible. Los componentes de vector generalmente incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento intensificador, un promotor, y una secuencia de terminación de transcripción. (i) Componente de Secuencia de Señal El anticuerpo de esta invención se puede expresar no solamente directamente, sino también como una fusión con un polipéptido heterólogo, de manera preferible una secuencia de señal u otro polipéptido que tiene un sitio de partición específico en la extremo N de la proteína madura o polipéptido. En general, la secuencia de señal puede ser un componente del vector, o puede ser parte del DNA de anticuerpo que se inserta en el vector. La secuencia de señal heteróloga seleccionada debería ser una gue se reconozca y se procese (es decir, se divida por una peptidasa de señal) por la célula huésped. Para células huésped procarioticas, una secuencia de señal procariotica seleccionada, por ejemplo, del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp> o guiadores de enterotoxina II estables al calor. Para la secreción de levadura, la secuencia de señal nativa se puede substituir por, por ejemplo, la invertasa de levadura, factor alfa, o guiadores de fosfatasa acida, el guiador de glucoamilasa C. albicans (documento EP 362, 179 publicado el 4 de Abril de 1990), o la señal descrita en el documento WO 90/13646 publicado el 15 de Noviembre de 1990. En la expresión celular de mamífero, la secuencia de señal nativa es satisfactoria, aunque otras secuencias de señal de mamífero pueden ser adecuadas, tales como secuencias de señal de otros polipéptidos de ligando o del mismo ligando de una especie animal diferente, secuencias de señal de un ligando, y secuencias de señal de polipéptidos secretados de las mismas especies o especies relacionadas, así como guiadores secretorios virales, ' por ejemplo, la señal de gD del herpes simple. (ii) Origen del Componente de Replicación Ambos vectores de expresión y clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas.

Generalmente, en vectores de clonación esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del DNA cromosómico huésped, e incluye orígenes de replicación o secuencias de replicación de manera autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levadura, y virus. El origen de replicación del plasmido pBR322 es adecuado para la mayor parte de bacterias gramnegativas, el origen del plasmido 2 µ es adecuado para la levadura, y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen del componente de replicación no es necesario para los vectores de expresión de mamífero (el origen del SV40 se puede usar típicamente solamente porque contiene el primer promotor) .

La mayor parte de los vectores de expresión son vectores de "lanzadera", es decir, son capaces de la replicación en al menos una clase de organismos, pero se pueden transfectar en otro organismo para la expresión. Por ejemplo, un vector se clona en E. Coli y luego el mismo vector se transfecta en levadura o células de mamífero para la expresión incluso aunque no sea capaz de la replicación independientemente del cromosoma de la célula huésped.

El DNA también se puede amplificar por la inserción en el genoma huésped. Esto se lleva a cabo fácilmente usando especies Bacillus como huéspedes, por ejemplo, incluyendo en el vector una secuencia de DNA que es complementaria a una secuencia encontrada en el DNA genómico de Bacillus. La transfección de Bacillus con este vector da por resultado la recombinación homologa con el genoma e inserción del DNA de anticuerpo. Sin embargo, la recuperación del ADN genómico que codifica el anticuerpo es más complejo que aquel de un vector replicado de manera exógena, porque se requiere la digestión de enzima de restricción para extirpar el DNA de anticuerpo. (iii) Componente del Gen de Selección Los vectores de expresión y clonación contienen un gen de selección, también llamado un marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de células huésped transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican las proteínas que (a) confieren la resistencia a los antibióticos u otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o tetraciclina, (b) complementan las deficiencias auxotróficas, o (c) proporcionan nutrientes críticos no disponibles del medio complejo, por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina Racemasa para Bacilli.

Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Aquellas células que son transformadas con buen resultado con un gen heterólogo expresa una proteína que confiere la resistencia de fármaco y de este modo sobrevive el régimen de selección. Los ejemplos de tal selección dominante usa los fármacos neomicina (Southern et al. (1982), J. Molec. Appl. Genet. 1:327), ácido micofenólico (Mulligan et al. (1980), Science 209:1422) o higromicina (Sugden et al. (1985), Mol. Cell. Biol. 5:410-413).

Los tres ejemplos dados anteriormente emplean genes bactéricos bajo el control eucariótico para transmitir la resistencia al fármaco apropiado G418 o neomicina (geneticina) , xgpt (ácido micofenólico), o higromicina, respectivamente.

Los ejemplos de oros marcadores seleccionables adecuados para las células de mamífero son aquellos que permiten la identificación de células competentes para absorber el ácido nucleico de anticuerpo, tal como la reductasa de dihidrofolato (DHFR) o timidina cinasa. Los transformantes de células de mamífero se colocan bajo una presión de selección que solamente los transformantes son adaptados únicamente para sobrevivir en virtud de tener que absorber el marcador. La presión de selección se impone cultivando los transformantes bajo condiciones en las cuales la concentración del agente de selección en el medio se cambia sucesivamente, por lo mismo lleva a la amplificación tanto del gen de selección y el DNA que codifica el anticuerpo. La amplificación es el proceso por el cual los genes en demanda mayor para la producción de una proteína crítica para el crecimiento son reiterados uno tras otro dentro de los cromosomas de generaciones sucesivas de células recombinantes. Las cantidades aumentadas de anticuerpo se sintetizan a partir del DNA amplificado.

Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección del DHFR primero se identifican cultivando todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo de DHFR. Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR del tipo silvestre es la línea celular de ovario de hámster de la China (CHO) deficiente en la actividad del DHFR, preparado y propagado como se describe por Urlaub and Chasin (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216.

Luego las células transformadas son expuestas a niveles aumentados de Mtx. Esto lleva a la síntesis de copias múltiples del gen de DHFR, y, concomitantemente, copias múltiples de otro DNA que comprende los vectores de expresión, tal como el DNA que codifica el anticuerpo. Esta técnica de amplificación se puede usar con cualquier otro huésped adecuado, por ejemplo, ATCC No. CCL61 CHO-Kl, no obstante la presencia de DHFR endógeno sí, por ejemplo, se emplea un gen de DHFR mutante que es altamente resistente al Mtx (documento EP 117,060). Alternativamente, las células huésped (particularmente huéspedes del tipo silvestre que contienen DHFR endógeno) transformado o cotransformado con secuencias de DNA que codifican el anticuerpo, proteína de DHFR del tipo silvestre, y otro marcador seleccionable, tal como aminoglucosido 3' fosfotransferasa (APH) se puede seleccionar por crecimiento celular en un medio que contiene un agente de selección para el marcador seleccionable, tal como un antibiótico aminoglucosidico, por ejemplo, canamicina, neomicina, o G418. Véase la Patente U.S. No. 4,965,199.

Un gen de selección adecuado para uso en levadura es el gen trpl presente en el plasmido YRp7 de levadura (Stinchcomb et al. (1979), Nature 282:39; Kingsman et al. (1979), Gene 7:141; o Tschemper et al. (1980), Gene 10:157). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una raza mutante de levadura que carece de la capacidad para crecer en triptofano, por ejemplo, ATCC No. 44076 o PEP4-1 (Jones (1977), Genetics 85:12). Luego la presencia de la lesión de trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona un medio efectivo para detectar la transformación por el crecimiento en la ausencia de triptofano. Similarmente, las razas de levadura deficiente de Leu2 (ATCC NO. 20,622 ó 38,626) se complementan por plasmidos conocidos que tienen el gen Leu2. (iv) Componente de Promotor Los vectores de expresión y clonación usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo huésped y se enlaza de manera operable al ácido nucleico de anticuerpo. Los promotores son secuencias no traducidas situadas corriente ascendente (5') hasta el codón de inicio de un gen estructural (generalmente dentro de aproximadamente 100 hasta 1000 bp) que controlan la transcripción y la traducción de la secuencia de ácido nucleico particular, tal como la secuencia de ácido nucleico de anticuerpo, a la cual se enlazan de manera operable.

Tales promotores típicamente caen dentro de dos clases, inducible y constitutiva. Los promotores inducibles son promotores que inician los niveles aumentados de transcripción de DNA bajo su control en respuesta a cierto cambio en las condiciones de cultivo, por ejemplo, la presencia o ausencia de un nutriente o un cambio en la temperatura. En este periodo un gran número de promotores reconocidos por una variedad de células huésped potenciales son bien conocidos. Estos promotores se enlazan de manera operable al anticuerpo que codifica el DNA eliminando el promotor de la fuente de DNA por digestión enzimática de restricción e insertando la secuencia del promotor de anticuerpo en el vector. Tanto la secuencia del promotor de anticuerpo nativa y muchos promotores heterólogos se pueden usar para dirigir la amplificación y/o expresión del DNA de anticuerpo. Sin embargo, los promotores heterólogos son preferidos, ya que permiten generalmente mayor transcripción y mayores rendimientos de anticuerpo expresado en comparación al promotor nativo.

Los promotores adecuados para uso con huéspedes procarióticos incluyen los sistemas de ß-lactamasa y promotor de lactosa (Chang et al. (1978), Nature 275:615; y Goeddel et al. (1979), Nature 281:544), fosfatasa alcalina, un sistema de promotor de triptofano (trp) (Goeddel (1980), Nucleic Acids Res. 8:4057 y EP 36,776) y promotores híbridos, tales como el promotor tac (deBoer et al. (1983), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80:21-25). Sin embargo, otros promotores bactéricos conocidos son adecuados. Sus secuencias de nucleótido se han publicado, por lo mismo permiten a un trabajador experto ligarlas de manera operable al DNA que codifica el anticuerpo (Siebenlist et al. (1980), Cell 20:269) usando enlazadores o adaptadores para proporcionar cualquiera de los sitios de restricción requeridos. Los promotores para uso en sistemas bactéricos también contendrán una secuencia de Shine-Dalgarno (S.D.) enlazada de manera operable al DNA que codifica el polipéptido de anticuerpo .

Las secuencias del promotor son conocidas por eucariotas. Virtualmente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente 25 hasta 30 bases corriente ascendente desde el sitio donde se inició la transcripción. Otra secuencia se encontró 70 hasta 80 bases corriente ascendente desde el inicio de la transcripción de muchos genes es una región de CXCAAT, donde X puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayor parte de genes eucarióticos es una secuencia de AATAAA que puede ser la señal para la adición de la extremidad poli A al extremo 3' de la secuencia de codificación.

Todas estas secuencias se insertan adecuadamente en los vectores de expresión eucarióticos.

Los ejemplos de secuencias promotoras adecuadas para uso con huéspedes de levadura incluyen los promotores para la 3-fosfoglicerato cinasa (Hitzeman et al. (1980), J. Biol. Chem. 255:2073) u otras enzimas glicolíticas (Hess et al. (1968), J. Adv. Enzyme Reg. 7:149; y Holland (1978), Biochemistry 17:4900), tal como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato dehidogenasa, hexocinasa, piruvato decarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfafo isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucocinasa.

Otros promotores de levadura, los cuales son promotores inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones de promotor para el alcohol dehidrogenasa 2, isocitocroma C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneina, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, y enzimas responsables para la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores adecuados y promotores para uso en la expresión de levadura son además descritos en Hitzeman et al., documento EP 73, 657A. Los intensificadores de levadura también son usados ventajosamente con promotores de levadura.

La transcripción de anticuerpo a partir de los vectores en células huésped de mamífero se pude controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de los genomas de los virus, tales como el virus de polioma, virus de la postulación de bovino (documento UK 2, 211,504, publicado el 5 de Julio de 1989), adenovirus (tal como el Adenovirus 2) , virus del papiloma de bovino, virus del sarcoma avícola, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis B y de manea más preferible el virus de simio 40 (SV40) , de los promotores de mamífero heterólogos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina, de promotores de choque térmico, y del promotor asociado normalmente con la secuencia de anticuerpo, dado que tales promotores son compatibles con los sistemas de célula huésped.

Los primeros y últimos promotores del virus SV40 se obtienen convenientemente como un fragmento de restricción de SV40 que también contiene el origen vital de replicación del SV40. Fiers et al. (1978), Nature 273:113; Mulligan and Berg (1980), Science 209:1422-1427; Pavlakis et al. (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:7398-7402. El primer promotor intermediario del citomegalovirus humano se obtiene convenientemente como un fragmento de restricción HindIII E. Greenaway et al. (1982), Gene, 18:355-360. Un sistema para expresar el DNA en huéspedes de mamífero usando el virus del papiloma de bovino como un vector se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4, 419,446. Una modificación de este sistema se describe en la Patente de Estados Unidos No. 4,601,978. Véase también Gray et al. (1982), Nature 295:503-508 sobre expresar el cDNA que codifica el interferon inmune en células de mono; Reyes et al. (1982), Nature 297:598-601 sobre la expresión del cDNA de interferon beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple; Canaani and Berg (1982), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:5166-5170, sobre la expresión de un gen de interferon ßl humano en células de ratón y conejo cultivadas; y Gorman et al. (1982), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 79:6777-6781 sobre la expresión de las secuencias de CAT bactéricas en células de riñon de mono de CV-1, fibroblastos de embrión de gallo, células de ovario de hámster de la China, células de HeLa, y células de NIH-3T3 de ratón usando la repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous como promotor. (v) Componente del Elemento Intensificador La transcripción de un DNA que codifica el anticuerpo de esta invención por eucariotas mayores se incrementa frecuentemente insertando una secuencia de intensificador en el vector. Los intensificadores son elementos que actúan en cis del DNA, de manera usual aproximadamente desde 10 hasta 300 bp, que actúa sobre un promotor para incrementar su transcripción. Los intensificadores son independiente de la orientación y posición relativamente, que se han encontrado en 5' (Laimins et al. (1981), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 78:993) y en 3' (Lusky et al. (1983), Mol. Cell Bio. 3:1108) a la unidad de transcripción, dentro de un intrón (Banerji et al. (1983), Cell 33:729), así como dentro de la secuencia de codificación sí misma (Osborne et al. (1984), Mol, Cell Bio. 4:1293). Muchas secuencias de intensificador son ahora conocidas de genes de mamífero (globina, elastasa, albúmina, a-fetoproteína, e insulina) . Típicamente, sin embargo, se usará un intensificador de un virus de célula eucariotica. Los ejemplos incluyen el intendificador de SV40 en el último lado del origen de replicación (bp 100-270) , el intensificador del primer promotor de citomegalovirus, el intensificador de polioma en el último lado del origen de replicación, e intensificador de adenovirus. Véase también Yaniv (1982), Nature 297:17-18, sobre aumentar elementos para la activación de promotores eucarióticos. El intensificador se puede unir en el vector en una posición 5' ó 3' a la secuencia que codifica el anticuerpo, pero se sitúa preferiblemente en un sitio 5' del promotor. (vi) Componente de Terminación de Transcripción Los vectores de expresión usados en las células huésped eucarióticas (levadura, hongos, insecto, planta, animal, humano, o células nucleadas de otros organismos multicelulares) también contendrá secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el mRNA. Tales secuencias están disponibles comúnmente de las regiones no traducidas 5' y, ocasionalmente 3' de DNAs o cDNAs eucarióticos o virales. Estas regiones contienen segmentos de nucleótido transcriptos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del mRNA que codifica el anticuerpo. (vii) Construcción y Análisis de Vectores La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de los componentes listados anteriormente emplean técnicas de ligación estándar. Los plasmidos aislados o fragmentos de DNA se separan, se hacen a la medida, y se religan en la forma deseada para generar los plasmidos requeridos.

Para el análisis confirmar las secuencias correctas en plasmidos construidos, las mezclas de ligación se usan para transformar la raza 294 de K12 E. Coli (ATCC No. 31,446) y transformantes exitosos seleccionados por resistencia a la ampicilina o tetraciclina fueron apropiados. Los plasmidos de los transformantes se preparan, se analizan por digestión de endonucleasa de restricción, y/o se ordenan por el método de Messing et al. (1981), Nucleic Acids Res. 9:309 o por el método de Maxam et al. (1980), Methods in Enzymology 65:499. (viii) Vectores de Expresión Transientes Son particularmente útiles en la práctica de esta invención los vectores de expresión que se proporcionan para la expresión transiente en células de mamífero de DNA que codifica el polipéptido de anticuerpo. En general, la expresión transiente comprende el uso de un vector de expresión que es capaz de replicar eficientemente en una célula huésped, tal que la célula huésped acumula muchas copias del vector de expresión y, a su vez, sintetiza altos niveles de un polipéptido deseado codificado por el vector de expresión. Sambrook et al., supra, pp. 16.17-16.22. Los sistemas de expresión transiente, que comprenden un vector de expresión adecuado y una célula huésped, tiene en cuenta la identificación positiva conveniente de los polipéptidos codificados por los DNAs clonados, así como para la clasificación rápida de tales polipéptidos para las propiedades biológicas o fisiológicas deseadas. De este modo, los sistemas de expresión transiente son útiles particularmente en la invención para propósitos de identificar análogos y variantes del polipéptido de anticuerpo que tienen actividad biológica de polipéptido de anticuerpo. (ix) Vectores Celulares de Vertebrado Ejemplares Adecuados Otros métodos, vectores, y células huésped adecuadas para la adaptación a la síntesis del anticuerpo en el cultivo de células de vertebrado recombinante se describen en Gething et al. (1981), Nature 293:620-625; Mantei et^a-K' (1979), Nature 281:40-46; Levinson et al.; EP 117,060; y EP 117,058. Un plasmido útil particularmente para la expresión del cultivo de células de mamífero es pRK5 (documento EP 307,247, patente U.S. no. 5,258,287) o pSVI6B (solicitud del PCT No. WO 91/08291).

Las células huésped adecuadas para clonar o expresar los vectores aquí son los procariotas, levadura, o células eucarioticas mayores descritas anteriormente. Los procariotas adecuados incluyen eurobacterias, tal como organismos Gramnegativos o Grampositivos, por ejemplo, E. Coli, Bacilli, tal como B. subtilis, especies de Pseudomonas, tal como P. aeruginosa, Salmonella typhimurium, o Serratia marcescans. Un huésped de clonación de E. Coli preferido es E. Coli 294 (ATCC No. 31,446), aunque otras razas, tales como E. Coli B, E. Coli X1776 (ATTC No. 31,537), y E. Coli W3110 (ATCC No. 27,325) son adecuados. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitantes.

De manera preferible la célula huésped segregaría cantidades mínimas de enzimas proteolíticas . Alternativamente, los métodos in vitro de clonación, por ejemplo, PCR u otras reacciones de polimerasa de ácido nucleico o PCR, son adecuados.

Además de los procariotas, microbios eucarióticos tal como hongos filamentosos o levadura son huéspedes adecuados para los vectores que codifican el anticuerpo. Los Saccharomyces cerevisiae, o levadura de panificación común, es lo más comúnmente usado entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. Sin embargo, un número de otros géneros, especies, y razas son disponibles comúnmente y útiles aquí, tal como el Schizosaccharomyces pombe (Beach and Nurse (1981), Nature 290:140; documento EP 139,383 publicado el 2 de Mayo de 1985), huéspedes de Kluyveromyces (Patente U.S. No. 4,943,529) tales como, por ejemplo, K. lactis (Louvencourt et al. (1983, J. Bacteriol. 737), K. fragilis, K. bulgaricus, K. thermotolerans, y K. marxianus, yarrowia (EP 402, 226) , Pichia pastoris (EP 183,070; Sreekrishna et al. (1988), J. Basic Microbiol. 28:265-278), Candida, Trichoderma reesia (EP 244,234), Neurospora crassa (Case et al. (1979), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 76:5259,5263), y hongos filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de Enero de 1991), y huéspedes Aspergillus, tales como A. nidulans (Ballance et al. (1983), Biochem. Biophys. Res. Commun. 112:284-289; Tilburn et al. (1983), Gene 26:205-221; Yelton et al. (1984), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:1470-1474) y A niger (Kelly and Hynes (1985), EMBO J. 4:475-479) .

Las células huésped adecuadas para la expresión de anticuerpo glucosilado se derivan a partir de organismos multicelulares. Tales células huésped son capaces del procesamiento complejo y actividades de glucosilación. En principio, cualquier cultivo de células eucarióticas mayor es practicable, sí es de cultivo de vertebrado o invertebrado. Los ejemplos de células de invertebrado incluyen células de planta e insecto. Numerosas razas baculovirales y variantes y células huésped de insecto permisivas correspondientes de huéspedes tales como Spodoptera frugiperda (caterpillar) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (fruitfly), y Bombyx mori se han identificado. Véase, por ejemplo, Luckow et al. (1988), Bio/Technology 6:47-55; Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al. (1986), eds., Vol. 8 (Plenum Publishing), pp. 277-279; y Maeda et al. (1985), Nature 315:592-594. Una variedad de razas virales para la transfección están disponibles públicamente, por ejemplo, el variante de L-1 de Autographa californica NPV y la raza Bm-5 de Bombyx mori NPV, y tales virus se pueden usar como el virus aquí de acuerdo a la presente invención, particularmente para la transfección de células Spodoptera frugiperda.

Los cultivos de células de planta de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tomate, y tabaco se pueden utilizar como huéspedes. Típicamente, las células de planta son transfectadas por incubación con ciertas razas de la bacteria Agrobacterium tumefaciens, la cual se ha manipulado previamente para contener el DNA de anticuerpo. Durante la incubación del cultivo de células de planta con A. tumefaciens, el DNA que codifica el anticuerpo se transfiere al huésped de celular de planta, tal que se transfecta, y, bajo condiciones adecuadas, expresará el DNA de anticuerpo. Además, las secuencias regulatorias y de señal compatibles con las células de planta están disponible, tales como las secuencias de promotor de nopalina sintetasa y promotores de señal de poliadenilación. Depicker et al. (1982), J. Mol. Appl. Gen. 1:561. Además, los segmentos de DNA aislados de la región de corriente ascendente del gen T-DNA 780 son capaces de activar o incrementar los niveles de transcripción de genes expresibles de planta en tejido de planta que contiene DNA recombinante. Documento EP 321,196 publicado el 21 de Junio de 1989.

Sin embargo, ha sido de mayor interés en células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrado en cultivo (cultivo de tejido) ha llegado a ser un procedimiento rutinario en levaduras recientes (Tissue Culture (1973) , Academic Press, Kruse and Patterson, editores) . Los ejemplos de líneas de células huésped de mamífero útiles son la línea de CVl de riñon de mono transformada por el SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); línea de riñon embriónico humano (293 ó 293 células subclonadas para el crecimiento en cultivo de suspensión, Graham et al. (1977), J. Gen. Virol. 36:59); células de riñon de hámster pequeño (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster de la China/DHFR (CHO, Urlaub and Chasin (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216); células de Sertoli de ratón (TM4, Mather (1980), Biol. Reprod. 23:243-251); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde Africano (VERO-76, ATCC CRL-1587); células del carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células de riñon de canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñon de rata de búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humano (W138, ATCC CCL 75); células de hígado humano (Hep G2, HB 8065); tumor de mamífero de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51); células de TRI (Mather et al. (1982), Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68); células de MRC 5; células de FS4; y una línea de hepatoma humano (Hep G2 ) .

Las células huésped son transfectadas y transformadas preferiblemente con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente de esta invención y se cultivan en medios nutrientes convencional modificado como es adecuado para inducir los promotores, seleccionar los transformantes, o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas.

La transfección se refiere a la toma de un vector de expresión por una célula huésped sí o no cualquiera de las secuencias de codificación son expresadas en realidad. Numerosos métodos de transfección son conocidos para el artesano experto ordinariamente, por ejemplo, CaP04 y electroporación. La transfección exitosa se reconoce generalmente cuando se presenta cualquier indicación de la operación de este vector dentro de la célula huésped.

La transformación significa introducir un DNA en un organismo de modo que el DNA es replicable, ya sea como un elemento extracromosómico o por un integrante cromosómico.

Dependiendo de la célula huésped usada, la transformación se hace usando técnicas estándar apropiadas a tales células.

El tratamiento con calcio empleando cloruro calcico, como se describe en la sección 1.82 de Sambrook et al., supra, se usa generalmente para los procariotas u otras células que contienen barreras de pared celular substanciales. La infección con Agrobacterium tumefaciens se usa para la transformación de ciertas células de planta, como se describe por Shaw et al. (1983), Gene 23:315, y documento WO 89/05859 publicado el 29 de Junio de 1989. Además, las plantas se pueden transfectar usando un tratamiento ultrasónico como se describe en el documento WO 91/00358 publicado el 10 de Enero de 1991. Para células de mamífero sin tales paredes celulares, se prefiere el método de precipitación con fosfato calcico de Graham and van der Eb (1978), Virology 52:456-457. Los aspectos generales de las transformaciones del sistema de huésped celular de mamífero se han descrito por Axel en la Patente U.S. No. 4,399,216 emitida el 16 de Agosto de 1983. Las transformaciones en levadura se llevan a cabo típicamente de acuerdo al método de Van Solingen et al. (1977), J. Bact. 130:946, y Hsiao et al. (1979), Proc.

Nati. Acad. Sci. (USA) 76:3829. Sin embargo, también se pueden usar otros métodos para introducir el DNA en células, tales como por inyección nuclear, electroporación, o fusión de protoplasto.

Las células procarióticas usadas para producir el polipéptido de anticuerpo de esta invención se cultivan en un medios adecuados como se describe generalmente en Sambrook et al . , Supra .

Las células huésped de mamífero usadas para producir el anticuerpo de esta invención se pueden cultivar en una variedad de medios. Los medios comercialmente disponibles, tales como FIO de Ham (Sigma), Medio Esencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI-1640 (Sigma) , y Medio de Eagle Modificado de Dulbecco ( (DMEM) , Sigma) son adecuados para cultivar las células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham and Wallace (1979), Meth. Enz. 58:44, Barnes and Sato (1980), Anal. Biochem. 102:255, Patente U.S. No. 4,767,704; 4,657,866; 4,927,762; ó 4,560,655; documento WO 90/03430; documento WO 87/00195; o Patente U.S. Re. 30,985; las revelaciones de todos de las cuales se incorporan aquí por referencia, se pueden usar como medios de cultivo para las células huésped. Cualquiera de estos medios se pueden complementar como es necesario con hormonas y/o otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina, o factor de crecimiento epidémico) , sales (tales como cloruro sódico, calcio, magnesio, y fosfato) , amortiguadores (tal como HEPES) , nucleósidos (tales como adenosina y timidina) , antibióticos (tal como fármaco de Gentamicina), elementos de traza (definidos como compuestos inorgánicos usualmente presentes en concentraciones finales en el rango micromolar) , y glucosa o una fuente de energía equivalente. Cualquiera de los oros complementos necesarios también se pueden incluir en concentraciones adecuadas que serían conocidas para aquellos expertos en la técnica. Las condiciones del cultivo, tales como temperatura, pH, y lo parecido, son aquellos usados previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y será aparente para el artesano experto ordinariamente.

Las células huésped referidas en esta revelación incluyen células en cultivo in vitro, así como células que están dentro de un animal huésped.

La amplificación y/o expresión de genes se puede medir en una muestra directamente, por ejemplo, por manchado de Southern, manchado de Northern para cuantificar la transcripción del mRNA (Thomas (1980), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:5201-5205), manchado de punto (análisis de DNA) , o hibridación in si tu, usando una sonda marcada apropiadamente, basada en las secuencias proporcionadas aquí. Varias marcas se pueden emplear, más comúnmente radioisótopos, particularmente 32P. Sin embargo, también se pueden emplear otras técnicas, tal como usando nucleótidos modificados con biotina para la introducción en un polinucleótido. Luego la biotina sirve como el sitio para enlazar a la avidina o anticuerpos, los cuales se pueden marcar, con una amplia variedad de marcas, tales como radionucleótidos, substancias fluorescentes, enzimas, o similar. Alternativamente, se pueden emplear los anticuerpos gue pueden reconocer duplexes específicos, incluyendo duplexes de DNA, duplexes de RNA, y duplexes híbridos de DNA-RNA o duplexes de DNA-proteína. Los anticuerpos a su vez se pueden marcar y el ensayo se puede llevar a cabo donde el dúplex se une a una superficie, de modo que con la formación del dúplex en la superficie, se puede detectar la presencia del anticuerpo unido al dúplex.

La expresión de genes, alternativamente, se puede medir por métodos inmunológicos, tales como manchado inmunohistoquímico de secciones de tejido y ensayo del cultivo celular o fluidos corporales, para cuantificar directamente la expresión del producto genético. Con las técnicas de manchado inmunohistoquímico, se prepara una muestra celular, típicamente por deshidratación y fijación, seguido por reacción con anticuerpos marcados específicos para el producto genético acoplado, donde las marcas usualmente son perceptibles visualmente, tal como marcas enzimáticas, marcas fluorescentes, marcas luminiscentes, y similar. Una técnica de manchado sensitivo particularmente adecuada para uso en la presente invención se describe por Hsu et al. (1980), Am. J. Clin. Path. 75:734-738.

El anticuerpo de manera preferible se recupera del medio de cultivo como un polipéptido segregado, aunque también se puede recuperar de productos de lisis de célula huésped cuando se expresa directamente sin una señal secretoria.

Cuando el anticuerpo se expresa en una célula recombinante diferente de una de origen humano, el anticuerpo está libre completamente de las proteínas o polipéptidos de origen humano. Sin embargo, es todavía necesario usualmente purificar el anticuerpo de otras proteínas o polipéptidos de célula recombinante para obtener preparaciones que son homogéneas substancialmente en cuanto al ligando per se . Como primer paso, el medio de cultivo o producto de lisis se centrifuga para eliminar los fragmentos celulares particulados. Luego se separan las fracciones de membrana y proteína soluble. Alternativamente, se puede usar un filtro de concentración de proteína disponible comercialmente (por ejemplo, unidades de ultrafiltración de AMICON o Millipore PELLICON) . Luego el anticuerpo se puede purificar a partir de la fracción de proteína soluble. Por lo tanto el anticuerpo se purifica a partir de proteínas solubles contaminantes y polipéptidos por salado y cambio o procedimientos cromatográficos que emplean varias matrices de gel. Estas matrices incluyen; acrilamida, agarosa, dextrano, celulosa y otros comunes para la purificación de proteína. Los procedimientos cromatográficos ejemplares adecuados para la purificación de proteína incluyen inmunoafinidad, afinidad del dominio de Gla del FIX (por ejemplo, -IgG o proteína A SEPHAROSE) , cromatografía de interacción hidrofóbica (HIC) (por ejemplo, éter, butilo, o Toyopearl de fenilo) , cromatografía de lectina (por ejemplo, Con A-SEPHAROSE, lentil-lectin-SEPHAROSE) , exclusión de tamaño (por ejemplo, SEPHADEX G-75) , columnas de intercambio catiónico y aniónico (por ejemplo, DEAE o carboximetil y sulfopropilcelulosa) , y cromatografía líquida de alto rendimiento de fase inversa (RP-HPLC) (véase, por ejemplo, Urdal et al. (1984), J. Chromatog. 296:171, donde dos pasos de RP-HPLC consecutivos se usan para purificar el IL-2 humano recombiante) . Otros pasos de purificación opcionalmente incluyen: precipitación con etanol, precipitación con sulfato de amonio, cromatoenfoque, SDS-PAGE preparativa, y similar'.

Los variantes de anticuerpo en los cuales los residuos se han borrado, insertado o substituido se recuperan de la misma manera, tomando en cuenta cualquiera de los cambios substanciales en propiedades ocasionadas por la variación. Por ejemplo, la preparación de una fusión de anticuerpo con otra proteína o polipéptido, por ejemplo, un antígeno bactérico o viral, facilita la purificación; una columna de inmunoafinidad que contiene el anticuerpo para el antígeno se puede usar para absorbe el polipéptido de fusión. Las columnas de inmunoafinidad, tal como una columna antianticuerpo policlonal de conejo, se pueden emplear para absorber el variante de anticuerpo enlazándolo a por lo menos un epitopo inmune restante.. Alternativamente, el anticuerpo se puede purificar por cromatografía de afinidad usando un dominio de Gla del FIX-IgG acoplado a una resina inmovilizada (preferiblemente), tal como AFFI-Gel 10 (Bio-Rad, Richmond, CA) o similar, por medios bien conocidos en la técnica. Un inhibidor de proteasa, tal como fluoruro de fenil metil sulfonilo (PMSF), también se puede usar para inhibir la degradación proteolítica durante la purificación, y se pueden incluir antibióticos para prevenir el crecimiento de contaminantes adventicios. Un experto en la técnica apreciará que los métodos de purificación adecuados para el anticuerpo nativo pueden requerir la modificación para tener en cuenta los cambios en el carácter del anticuerpo o sus variantes con la expresión en un cultivo celular recombinante.

Utilidad Los anticuerpos descritos aquí son útiles para los ensayos de diagnóstico in vitro para inhibir la activación del FIX hasta el FlXa por el FXIa o por TF-FVIIa e inhibir la coagulación en un ensayo dependiente del FlXa.

Las composiciones de esta invención se pueden usar en el tratamiento y prevención de las enfermedades o desordenes mediados por el FlXa que incluyen, pero no se limitan a, la prevención de la retrombosis arterial en combinación con la terapia trombolítica . Se ha sugerido que el FIX juega un papel significante en una variedad de estados clínicos que incluyen la trombosis venosa profunda, trombosis arterial, ataque de parálisis, DIC, choque séptico, cirugía de derivación cardiopulmonar, síndrome de angustia respiratoria en adulto, angioedema hereditario, así como crecimiento tumoral, y metastsis. Por lo tanto los inhibidores del FIX pueden jugar papeles importantes en la regulación de desordenes inflamatorios y/o trombóticos.

De este modo, la presente invención incluye un método para prevenir un evento mediado por el FIX/FIXa en un humano que comprende administrar a un paciente en necesidad del mismo una cantidad efectiva terapéuticamente de la composición de anticuerpo de la presente invención. Una cantidad efectiva terapéuticamente de la molécula de anticuerpo de la presente invención se predetermina para lograr el efecto deseado. La cantidad que se emplea terapéuticamente variará dependiendo de los objetivos terapéuticos, las rutas de administración y la condición que se trate. Por consiguiente, las dosificaciones que se administran son suficientes para unirlas al FIX/FIXa disponible y formar un complejo inactivo que lleva a la coagulación disminuida en el sujeto que se trata.

La eficacia terapéutica se mide por un mejoramiento en uno o más síntomas asociados con la coagulación dependiente del FlXa. Tales dosificaciones efectivas terapéuticamente se pueden determinar por el artesano experto y variarán dependiendo de la condición de edad, sexo y condición del sujeto que se trata. Los rangos de dosificación adecuados para la administración sistémica están típicamente entre aproximadamente 1 µg/kg hasta 100 mg/kg o más y depende de la ruta de administración. De acuerdo a la presente invención, una dosificación terapéutica preferida está entre aproximadamente 1 µg/kg de peso corporal y aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal. Por ejemplo, los regímenes adecuados incluyen la inyección o infusión intravenosa suficiente para mantener la concentración en la sangre en los rangos especificados para la terapia contemplada.

Las composiciones farmacéuticas las cuales comprenden los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden administrar de cualquier manera adecuada, incluyendo administración parenteral, tópica, oral, o local (tal como aerosol o transdérmica) o cualquier combinación de las mismas. Los regímenes adecuados también incluyen una administración inicial por inyección de bolo intravenosa, seguido por dosis repetidas en uno o más intervalos.

Donde la composición de la invención se administra en combinación con un agente trombolítico, por ejemplo, para la prevención de la reformación de un trombo de oclusión en el transcurso de la terapia trombolítica, una dosificación efectiva terapéuticamente del agente trombolítico está entre aproximadamente 80 y 100% del rango de dosificación convencional. El rango de dosificación convencional de un agente trombolítico es la dosificación diaria usada en la terapia y está disponible fácilmente al médico tratante. (Physicians Desk Reference (1994), 50th Edition, Edward R. Barnhart, editor). El rango de dosificación típico dependerá del agente trombolítico que se emplea e incluye para el activador del plasminogeno de tejido (t-PA), 0.5 hasta aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal; estreptocinasa, 140,000 hasta 2,500,000 unidades por paciente; urocinasa, 500,000 hasta 6,250,000 unidades por paciente; y complejo de activador del plasminogeno de estreptocinasa anisolado (ASPAC) , 0.1 hasta aproximadamente 10 unidades por kg de peso corporal.

El término combinación como se usa aquí incluye una forma de dosificación única gue contienen al menos una molécula de la presente invención y al menos un agente trombolítico. El término también significa que incluye formas de dosificación múltiples, en donde la molécula de la presente invención se administra por separado, pero concurrentemente por dos administraciones separadas, tal como en administración periódica. Estas combinaciones y composiciones funcionan para disolver o prevenir la formación de un trombo de oclusión que da por resultado la disolución del rombo de oclusión. Cuando se usa para la administración in vivo, la formulación de anticuerpo debe ser estéril. Esto se lleva a cabo fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles, antes de o después de la liofilización y reconstitución. El anticuerpo ordinariamente será almacenado en forma liofilizada o en solución.

Las composiciones de anticuerpo terapéuticas generalmente se colocan en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o frasco de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica.

La ruta de administración del anticuerpo es de acuerdo con los métodos conocidos, por ejemplo, inyección o infusión por ruta intravenosa, intraperitoneal, intracerebral, intramuscular, infraocular, inraarterial, intratecal, inhalación o intralesional, o por sistemas de liberación mantenida como se observa a continuación. El anticuerpo se administra preferiblemente de manera continua por infusión o por inyección de bolo.

Los anticuerpos de la invención se pueden preparar en una mezcla con un portador aceptable farmacéuticamente. Esta composición terapéutica se puede administrar de manera intravenosa o a través de la nariz o pulmón, de manera preferible como un aerosol líquido o en polvo (liofilizado) . La composición también se puede administrar parenteralmente o subcutáneamente como es deseado. Cuando se administra sistemáticamente, la composición terapéutica deber ser estéril, libre de pirogeno y en una solución aceptable parenteralmente gue tiene en consideración el pH, isotonicidad, y estabilidad.

Estas condiciones son conocidas para aquellos expertos en la técnica. Brevemente, las formulaciones de dosificación de los compuestos de la presente invención se preparan para el almacenamiento o administración mezclando el compuesto que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables fisiológicamente. Tales materiales no son tóxicos a los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas, e incluyen amortiguadores, tales como TRIS HCl, fosfato, citrato, acetato y otras sales de ácido orgánico; antioxidantes, tales como ácido ascórbico; péptidos de bajo peso molecular (menor que aproximadamente 10 residuos) , tal como poliarginina; proteínas, tal como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona; aminoácidos, tal como glicina, ácido glutámico, ácido aspártico, o arginina; monosacáridos, disacáridos, y otros carbohidratos que incluyen celulosa o sus derivados, glucosa, mañosa, o dextrinas; agentes quelantes, tal como EDTA; alcoholes de azúcar, tal como manitol o sorbitol; contraiones, tal como sodio y/o tensoactivos no iónicos, tales como TWEEN, PLURONICS o polietilenglicol.

Las composiciones estériles para la inyección se pueden formular de acuerdo a la práctica farmacéutica convencional.

Por ejemplo, puede ser deseada la disolución o suspensión del compuesto activo en un vehículo, tal como agua o aceite vegetal que se presenta naturalmente parecido a aceite de ajonjolí, cacahuate o aceite de semillas de algodón o un vehículo graso sintético parecido al oleato de etilo o similar. Los amortiguadores, conservadores, antioxidantes y similar se pueden incorporar de acuerdo a la práctica farmacéutica aceptada .

Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación mantenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el polipéptido, cuyas matrices están en la forma de artículos formados, por ejemplo, películas, o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación mantenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) como se describe por Langer et al. (1981), J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277, y Langer (1982), Chem. Tech. 12:98-105, o poli (vinilalcohol) ) , polilactidos (Patente U.S. No. 3,773,919, documento EP 58,481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma etil-L-glutamato (Sidman et al. (1983), Biopolymers 22:547-556), etileno-acetato de etilo no degradable (Langer et al., supra), copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico degradable, tal como el LUPRON Depot™ (microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) , y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico (documento EP 133,988).

Mientras que los polímeros, tales como etileno-acetato de vinilo y ácido láctico-ácdo glicólico, permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan las proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Cuando las proteínas encapsuladas permanecen en el cuerpo durante un largo periodo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37 °C, dando por resultado una pérdida de actividad biológica y posibles cambios en la inmunogenicidad. Las estrategias racionales se pueden planear para la estabilización de proteínas dependiendo del mecanismo comprendido. Por ejemplo, sí se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través del intercambio de disulfuro, se puede lograr la estabilización modificando los residuos de sulfhidrilo, liofilizando las soluciones acidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos adecuados, y desarrollando composiciones de matriz de polímero específicas. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. Las revelaciones de todas las citaciones en la especificación se incorporan expresamente aquí por referencia.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Reactivos. El FIX y FXIa se obtuvieron de Haematologic Technologies Inc., (Essex Jet., VT) . El FX se obtuvo de Enzyme Research Laboratories Inc. (South Bend, IN) . El 1, 2-diacil-sn-glicero-3- (fosfo-L-serina) (PS) de dioleoilo y 1, 2-diacil-sn-glicero-3-fosfocolina (PC) de oleoilo se obuvieron de Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). El substrato #299 cromogénico del FlXa se obtuvo de American Diagnostica (Greenwich, CT) . El Actin FS e Innovin se obtuvieron de Dade International Inc. (Miami, FL) . Las resinas de SEPHAROSE y columnas se obtuvieron de Amersham Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ) . El dietilenglicol (grado analítico) y FeCl3 (grado reactivo) se obtuvieron de Mallinckrodt Inc. (París, KY) . El BSA libre de ácido graso se obtuvo de Calbiochem (La Jolla, CA) . La heparina sódica para inyección se obtuvo de Elkins Sinn Inc. (Cherry Hill, NJ) . La solución salina estéril para inyección se compró de Baxter Healthcare Corp. (Deerfield, IL) . El TF purificado (1-243) se obtuvo de E. Coli y el F. Villa recombinante se proporcionó normalmente por Robert F. Kelley (Genentech, Inc.) Métodos Síntesis y biotinilación del péptido de Gla: La síntesis del péptido de Gla se llevó a cabo en un Sintetizador de Péptidos ABI431 usando protocolos químicos de Fmoc estándar en una escala de 0.25 mmoles. Los acoplamientos se llevaron a cabo con BTU [hexafluorofosfato de 2- (lH-benzotriazol-1-il) -1, 1, 3, 3-tetrametiluronio] , HOBT (N-hidroxibenzotriazol) , y DIPEA (diisopropiletilamina) durante 1 hora. Los grupos protectores de cadena lateral de aminoácido de Fmoc fueron como sigue: Tyr(tBut), Thr(tBut), Ser(tBut), Lys (Boc), Arg(pbf), Asn(trt), Gln(trt), Gla(OtBut)2, Cys(acm) y Trp (Boc). La oxidación se llevó a cabo con el péptido todavía en la resina agitando la resina con 10 equivalentes de yodo en DMF a 4°C durante 1 hora. El péptido se separa usando TFA: diclorometano : triisopropilsilano 70:30:0.1 durante 3 horas a temperatura ambiente, se tritura con éter, se extrae la resina con NH4OH 30 mM y se liofiliza. La identidad del material se confirmó por espectrometría de masas de electropulverización, formación de secuencias de péptidos y análisis de aminoácidos. El Fmoc-L-Gla (OtBut ) 2 se obtuvo de Península Labs (Belmont CA) y el Fmoc-Lys (alloc) se obtuvo de Perseptive Biosystems (Framingham MA) . El catalizador Pd(0) y Biotin-NHS se compraron de Fluka (Ronkonkoma NY) y Sigma (St Louis MO) , respectivamente.

La síntesis de péptidos de Gla biotinilado se modifica a partir del procedimiento anterior como sigue. La síntesis de péptidos se llevó a cabo usando Fmoc-Lys (alloc) en la posición 40 y el grupo Fmoc final en el extremo N del péptido no se eliminó. La eliminación del grupo alloc (aliloxicarbonilo) se hizo con un catalizador de paladio usando una solución de paladio (0) de tetrakistrifenilfosfina 0.1M con ácido acético al 5% y N-metilmorfolina al 2.5% en cloroformo durante 3 horas. El Biotin-NHS (N-hidroxisuccinimidobiotina) se acopló a la cadena lateral de Lisina (40) con DIPEA toda la noche en DMF/DCM. Luego el grupo Fmoc final se eliminó con piperidina al 20%/DMF y el péptido se oxidó en la resina, se separó de la resina y se extrajo la resina como s describe en el párrafo previo.

Resultados La secuencia de aminoácidos del péptido de Gla sintetizado se muestra en la Figura 1 (humano) EJEMPLO 2 Procedimiento de biopanoramización. Una biblioteca grande de 1010 scFv (Cambridge Antibody Technology, Cambridgeshire, UK) (Vaughan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:309-314) se panoramizó a través de dos periodos de enriquecimiento contra el péptido biotinilado. La selección accionada por la afinidad (Hawkins et al., (1992) J. Mol. Biol. 226:889-896) se llevó a cabo disminuyendo la cantidad de antígeno en cada periodo subsecuente de panoramización (100 nM y 10 nM, durante los periodos 1 y 2, respectivamente) . Para asegurar la conformación adecuada del péptido de Gla, se adicionó cloruro calcico (2 mM) a todas las soluciones, salvo indicación contraria, durante el procedimiento de panoramización y todos los ensayos subsecuentes. Para cada selección, aproximadamente 101 unidades tituladas de fago, bloqueadas en 1 ml de TBS que contiene leche desnatada al 3%, TWEEN al 0.1% y CaCl2 2 mM (MTBST/Ca) , se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) con el péptido biotinilado. Los glóbulos conjugados con estreptavidina (DYNABEADS, Dynal, Oslo Norway) bloqueados en MTBS, se adicionaron a la mezcla de fago/antígeno biotinilado durante 15 minutos a temperatura ambiente. Un volumen de 300 µl de DYNABEADS se usó durante el periodo 1, y se redujo hasta 100 µl en el periodo 2. Los DYNABEADS se lavaron tres veces con cada una de las siguientes soluciones: TBST/Ca, MTBST/Ca, MTBS/Ca, y TBS/Ca, usando un MPC Dynal (Concentrador de Partículas Magnético) . Los fagos de enlace se eluyeron en pasos con MgCl2 4M, Tetra-etilamina (TEA) 1 mM, y HCl 100 mM. Cada elución se llevó a cabo a temperatura ambiente durante 5 minutos, y las fracciones eluidas se neutralizaron con Tris-HCl 50 mM, pH 7.5.

Los fagos recuperados después de cada periodo de panoramización se propagaron en el TG1 de raza de supresor bactérico.

Resultados El aislamiento y caracterización de los scFvs al FIX humano - En un intento de aislar los anticuerpos específicos para el FIX humano con actividad antitrombótica potencial, se clasificó una biblioteca representada en fagos de los anticuerpos de scFv humanos con un péptido correspondiente al dominio de Gla del FIX humano. Ya que el enlace de Ca++ al dominio de Gla del FIX se mostró que indujo los cambios de conformación importantes para la interacción con los fosfolípidos y superficies celulares, todos los pasos de selección de panoramización se llevaron a cabo en la presencia de CaCl2 2 mM. Dos periodos de panoramización se hicieron en solución con 100 nM y 10 nM de péptido biotinilado, respectivamente. Después del segundo periodo de panoramización, 96 de 800 clones clasificados (12%) se seleccionaron por su capacidad para enlazar al péptido de Gla del FIX específicamente por placas ELISA de fagos (Griffiths et al. (1993), EMBO J. 12:725-734) .

EJEMPLO 3 Métodos Caracterización de clones - Placas Elisa de MAXISORP (Nunc) se recubrieron toda la noche a 4CC con péptido de Gla (5 µg/ml) en solución salina amortiguada con HEPES (HBS) . Las placas se bloquearon con amortiguador de HBS que contiene TWEEN al 0.1% y polvo de leche al 3%. Los sobrenadantes de cultivo de fagos (50 µl) se aplicaron directamente a las placas. Luego se adicionó peroxidasa de rábano picante (HRP)- antiM13 conjugado (Pharmacia, Uppsala, Suecia) . El DNA purificado de los clones seleccionados se caracterizó por la digestión y formación de secuencias de BstNI (ABI377, Perkin Elmer, Foster City, CA) .

Las placas ELISA-ELISA de proteína de ScFv se recubrieron con ya sea el anticuerpo de 9E10 anti-c myc en amortiguador de carbonato (Formato I) , FIX o factores relacionados al FIX, en HBS con CaCl2 2 mM (HBSCa) (Formato II) . Las placas se bloquearon con HBSCa que contiene TWEEN al 0.1% (HBST/Ca). Los ScFvs se adicionaron a una concentración de 5 µl/ml. En el formato I, el FIX biotinilado (1 µg) se aplicó a las placas, seguido por Streptavidina-HRP. En el formato II, la detección de los ScFvs se llevó a cabo usando mAb anti-c myc de 9E10 y un mAb específico de Fe anti ratón de cabra conjugado con HRP (Zymed, South San Francisco, CA) . Todas las diluciones con recativo se prepararon en HBST/Ca de amortiguador de bloqueo y las placas se lavaron con HBS/Ca que contiene Tween al 0.05%.

Resultados Para además valorar la diversidad de líneas germinales de los clones seleccionados, el DNA se purificó a partir de clones individuales y se sometió a impresión digital con BstNI (Clackson et al., (1991) Nature 352:624-628). Los 96 clones se clasificaron en 24 familias de impresión digital distintas. Los ScFvs se expresaron como proteínas marcadas por episodios que contienen una secuencia de marcador de c-myc reconocida por el 9E10 de anticuerpo monoclonal (Griffiths et al. (1993), EMBO J. 12:725-734) y un marcador de polihistidina (his6) y se purificaron sobre Ni-NTA con elución de imidazol como se recomienda por el fabricante (Qiagen, Chatsworth, CA) . Un clon de cada familia de impresión digital se seleccionó por la expresión de scFvs. Luego los scFv purificados se probaron por su reactividad al péptido de Gla y el FIX de longitud completa por ELISA. De los 24 clones probados, se mostró que seis clones (10C12, 11C5, 11G9, 13D1, 13H6, y 14H9) reaccionan transversalmente a varios grados tanto con el péptido de Gla y FIX de longitud completa por ELISA (Figura 4), todos los otros reaccionan con el péptido de Gla solamente. Los clones 10C12, 13D1 y 13H6 muestran un enlace más fuerte al FIX que los clones 11G9, 11C5, y 14H9.

Estos seis clones se caracterizaron además por la formación de secuencias de DNA para anilizar el uso de segmentos (Figura 2). Cuatro clones (10C12, 11C5, 11G9, y 13D1) representan la misma cadena ligera (V? 1) con regiones de CDR idénticas. Las cadenas ligeras de los clones 13H6 y 14H9 fueron únicas y diferentes de las otras, con ninguna homología encontrada en las regiones de CDR. La formación de secuencias de las cadenas pesadas reveló una homología fuerte entre los clones 10C12 y 13D1 con diferencias en solamente 3 residuos, uno localizado en la CDR2 y dos en las regiones de la estructura. La cadena pesada del clon 11C5 tuvo un CDRl y CDR2 casi idéntico como el 10C12 y 13D1, pero una región de CDR3 diferente. Estos resultados mostraron gue el 10C12, 11C5, 11G9, y 13D1 son relacionados estrechamente, la diferencia más sorprendente que radica en la región de CDR3 de cadena pesada del clon 11C5. La homología global sugiere gue estos anticuerpos enlazan un epitopo idéntico dentro del dominio de Gla del FIX. En la presencua de Ca++ y Mg++, el dominio de Gla del FIX adopta diferentes conformacionbes, las cuales exponen epitopos de anticuerpo distintos. Los anticuerpos 10C12, 13D1, 11C5 y 13H6 los cuales representan una alta homología en sus CDRs (excepto para el 13H6) se unen exclusivamente a la conformación inducida por el Ca++ del dominio de Gla, consistente con la vista que reconocen un epitopo común. En contraste, los clones 13H6 y 14H9 ambos tienen cadenas pesada y ligera únicas. El clon 14H9 parece tener significativamente más residuos cargados en los dominios de CDR, especialmente en CDR3.

Cuatro de los seis anticuerpos se eligen para ser reformatados como moléculas de F(ab')2, basado en la fuerte actividad de inhibición del FlXa (10C12, 13D1, y 13H6) y diversidad de líneas germinales del DNA (14H9).

La especificidad de enlace de los scFvs y F(ab')2 a varios factores de coagulación sanguínea - Hay un alto grado de homología entre los dominios de Gla de diferentes factores de coagulación sanguínea (FVII, FIX, FX, protrombina, y proteína C) (véase la Figura IB) . Para determinar la especificidad de los anticuerpos seleccionados para enlazar el dominio de Gla del FIX, los experimentos ELISA se llevaron a cabo recubriendo varios factores (FIX, FVII, FX, protrombina y proteína C) sobre placas e incubando con scFvs (Figura 6A) o F(ab')2 (Figura 6B) en una concentración de 5 µg/ml (0.02 µg/ml para el F(ab')2. Los resultados mostraron gue tanto el scFv y el F(ab')2 de los clones 10C12, 13D1 y 13H6 reaccionan con el FIX solamente mientras que el 14H9 reconoce todos los factores probados.

Además, el enlace del scFv de los clones 10C12, 13D1 y 13H6 al FIX no se redujo cuando los scFvs se preincubaron con el suero deficiente de FIX, excluyendo cualquier interacción de estos clones con los factores, diferentes del FIX, presentes en el suero. En contraste, el enlace del scFv del clon 14H9 se disminuyó grandemente después de la incubación del scFv con el mismo suero. Estos resultados mostraron que el epitopo reconocido por el clon 14H9 es único y diferente de la secuencia vista por los otros 3 anticuerpos.

Dependencia de calcio y magnesio del F(ab')2 antiFIX que enlaza al FIX. La selección de los anticuerpos de scFv descritos en este estudio se llevó a cabo en la presencia de iones de Ca++. El FIX se ha mostrado que se somete a dos transiciones de conformación dependientes de metal, una dependiente de metal, pero no selectiva de catión, la segunda una selectiva de metal para Ca++ o Sr++. Para probar la influencia de iones metálicos sobre el enlace de los anticuerpos antiFIX, los experimentos ELISA se llevaron a cabo con ya sea Ca++, Mg++, o EDTA (el cual quela los iones de Ca++ ) adicionados a todos los amortiguadores. Los resulados indicaron que los clones 10C12, 13D1 y 13H6 reconocen el FIX solamente en la presencia de Ca++ , y el enlace fue parcialmente o completamente inhibido en la presencia EDTA 2 mM. En contraste, el clon 14H9 enlazaría al FIX en presecia de ya sea Mr++ o Ca++. Ninguna inhibición se observó en la presencia de EDTA, la cual mostró que los iones de Ca++ no fueron necesarios para que se presentará el enlace.

EJEMPLO 4 Métodos Evaluación por BIAcore de afinidades de F(ab')2 antiFIX -La afinidades de enlace de antígeno de varios fragmentos de "zíper de leucina" de (Fab')2 se calcularon (Lófas & Johnsson (1990), J. Chem. Soc. Commun. 21:1526-1528) a partir de las constantes de velocidad de asociación y disociación medidas usando un sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore- 2000™ (Pharmacia Biosensor) . Un chip biosensor se activa usando clorhidrato de N-etil-N' - (3-dimetilaminopropil) -carbodiimida (EDC) y N-hidoxisuccinimida (NHS) de acuerdo a las instrucciones del proveedor (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ) . El factor IX, y el Factor X como control negativo, se diluyeron aproximadamente 30 µg/ml en amortiguador de acetato sódico 10 mM (pH 4.5). Las alícuotas se inyectaron para lograr aproximadamente 519 unidades de respuesta (RU) del FIX acoplado, y 2330 RU o 13,590 RU del FX acoplado. Finalmente, se inyectó etanolamina 1M como agente de bloqueo.

Para las medidas cinéticas, las diluciones consecutivas en dos partes (10 µL) de anticuerpo se inyectaron en amortiguador de funcionamiento (Tween-20 al 0.05%, NaCl 150 mM, CaCl2 2 mM, Hepes 10 mM pH 7.4) a 25 °C usando una velocidad de flujo de 10 uL/minuto. La regeneración se logra con MgCl2 4.5 M, seguido por solución de lavado (EDTA 50 mM, NaCl 150 mM, TWEEN-20 al 0.05%). Las constantes de disociación en equilibrio, Kd's, de las medidas de SPR se calcularon como k0ff/kon. Los datos de disociación se fijaron a un modelo de enlace de Langmuir 1:1 simple. Las pseudo-constantes de velocidad de primer orden (ks) se calcularon para cada curva de asociación, y se trazaron como función de la concentración de la proteína para obtener k0n +/- s.e (error estándar de ajuste). Los errores resultantes e[K] en Kd's calculados se calcularon como sigue: e [ K ] = [ ( kc >off ) k0 íí l ( kon) ( S on l i donde s0ff y son son los errores estándar en kon y koff, respectivamente .

Resultados Medida de afinidad del F(ab')2 antiFX que enlaza al FIX - En los experimentos de enlace de SPR, las formas de F(ab' )2-zíper del 10C12, 13D1, y 13H6 muestran un enlace específico al FIX (contra el F.X, o una célula de flujo lisa) .

Para estos experimentos, se usó una densidad baja (519 RU) de antígeno inmobilizado (FIX) . Aunque la forma bivalente de los anticuerpos podría haber dado por resultado efectos de afinidad en el enlace al antígeno, las cinéticas de enlace observadas fueron consistentes con los modelos 1:1 simples de asociación y disociación. Todos los tres anticuerpos tuvieron constantes de velocidad de disociación similares (koff) , correspondientes a las vidas medias de disociación de aproximadamente 50-70 minutos (Figura 3) . La velocidad de asociación (kon) para el 13H6, sin embargo, fue significativamente más rápida que el 10C12 o 13D1. Por consiguiente, la constante de disociación en equilibrio (kd) para el 13H6 es más baja (kd=0.45 nM) que el 10C12 (kd= 1.6 nM) o 13D1 (2.9 nM) .

EJEMPLO 5 Métodos Enlace del FIX a las células endoteliales de bovino - Las células endoteliales aórticas de bovino primarias se hicieron crecer como se describe (Marcum et al. (1986), J. Biol. Chem. 261:7507) durante cuatro días. Las células se lavaron con amortiguador de Hepes que contiene HEPES 10 mM pH 7.2, NaCl 137 mM, KCl 4 mM, Glucosa 11 mM, BSA 5 mg/ml y CaCl2 2 mM. Luego las células se incubaron a 4°C durante 2 horas con FIX biotinilado, y/o FIX biotinilado preincubado durante 1 hora con varias cantidades de proteínas de FIX, scFv o F(ab')2 frías. Las placas se lavaron y un conjungado de estreptavidina-HRP se adiciono durante 1 hora a temperatura ambiente (RT) , seguido por un substrato de TMB/H202. Las placas se analizaron sobre un lector de placas a 620 nm.

Ensayo de coagulación dependiente de plaquetas - Las placas de microtítulo (Linbro # 76-232-05) se recubrieron con 4 µg/ml de colágeno III humano (GibcoBRL #12167-011) en PBS, CaCl2 1 mM, MgCl2 1 mM toda la noche a 4°C. Después de lavar con PBS, las placas se incubaron además con BSA de Tyrode, CaCl2 2 mM durante 60 minutos a 37°C antes de usarse.

Las plaguetas lavadas se prepararon a partir de sangre completa cifrada humana como se describe (Dennis et al. (1989), Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87:2471-2475). Las plaquetas lavadas se ajustaron a una concentración de aproximadamente 6xl08 plaguetas por mililitro en BSA de Tyrode y se dejaron reposar durante 120 minutos a 37 °C. Después de adicionar CaCl2 1 mM y MgCl2 1 mM, las plaquetas se activaron con ADP (concentración final de 10 µM) . Se adicionó por pozo 60 µl de suspensión de plaquetas, la placa se centrifugó a 60xg durante 5 minutos y luego las plaquetas se dejaron adherir firmemente a los pozos recubiertos con colágeno durante 60 minutos a temperatura ambiente. Las plaquetas no adherentes se decantaron poco a poco y la placa se lavó dos veces con PBS que contiene CaCl2 1 mM y MgCl2 1 mM. Luego la capa de plaquetas adherente al colágeno se incubó durante 10 minutos con los anticuerpos en BSA de Tyrode-CaCl2 2 mM (40 µl/pozo) . Se adicionó a cada pozo 60 µl de plasma cifrado humano (depósito de plasma del Península Blood Bank) recalcificado con CaCl2 (hasta una concentración final de 11 mM) . La coagulación se cuantificó verificando el incremento en densidad óptica a 405 nm en un lector de microplacas cinético (SLT Lab Instruments, modelo EAR 340AT) .

Resultados Efecto inhibitorio potente de los scFvs sobre el enlace de FIX a las células endoteliales y sobre la coagulación dependiente de las plaquetas - Ya que se conoce que el dominio de Gla del FIX se requiere para la interacción del FIX con el fosfolípido y superficies celulares (Ryan et al. (1989), J. Biol. Chem. 264:20283-20287; Toomey et al. (1992), Biochemistry 31:1806-1808; Cheung et al. (1992), J. Biol. Chem. 267:20529-20531; Ahmad et al. (1994), Biochem. 33:12048-12055), los scFvs generados contra el dominio de Gla del FIX se probaron además por su capacidad para bloquear el enlace del FIX a las células endoteliales. En un ensayo de competición usando células endoteliales aórticas de bovino, el enlace del FIX biotinilado a las células se midió en ausencia o presencia de los scFvs decualquiera de los clones 10C12, 11C5, 11G9, 13D1, 13H6, 14H9, 6E11 o FIX no marcado. Los resultados de este experimento se mostraron en la Figura 5A. Los scfvs de los clones 10C12, 13D1, 13H6 y 11G9 mostraron el efecto inhibitorio más potente sobre el enlace de FIX, similar al FIX no marcado (IC50 equivalente a 20-50 nM) . Los ScFvs de los clones 11C5, 6E11 y 14H9 mostraron una inhibición mucho más débil (IC50 > 300 nM) .

El dominio de Gla del FIX también contiene un determinante principal para el enlace a las plaquetas (Ahmad et al. (1994), supra) . Un ensayo de coagulación de plasma dependiente de las plaquetas humano se usó para valorar la potencia de los varios scFvs como inhibidores de la actividad del FIX. En este ensayo, las plaquetas humanas lavadas se activaron y se dejaron adherir al colágeno, y se adicionó plasma humano recalcificado libre de plaquetas. La coagulación en curso se verificó como un cambio en la densidad óptica hasta 90 minutos. La omisión de las plaquetas o uso del plasma deficiente de FIX en la presencia de plaquetas no lleva a cualquier cambio significante en la absorbancia durante este periodo de tiempo. Estos descubrimientos indican que la coagulación en este sistema in vitro es dependiente de las plaquetas y la actividad del FlXa. Como se muestra en la Figura 5B, los scFvs de los clones 10C12, 11G9, 13H6, y 13D1 inhiben completamente la formación de coágulos a una concentración de 500 nM. En esta concentración, el 14H9 no tuvo ningún efecto, mientras que el 11C5 mostró una respuesta intermedia. A una concentración mayor (2 µM) , ambos de estos scFv fueron inhibitorios completamente. La potencias de los scFvs examinados interfieren con la función del FlXa en este rango del sistema en el mismo orden como en el ensayo de enlace de células endoteliales. Esto puede indicar que los elementos estructurales similares del dominio de Gla se reconoce por células endoteliales y plaquetas.

EJEMPLO 6 Métodos Ensayos de coagulación plasmática - El tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) y tiempo de protrombina (PT) del plasma de las diferentes especies se midieron en un ACL 300 (Coulter Corp., Miami, FL) usando Actin FS (Dade Diagnostics, PR) y Innovin de reactivo de factor de tejido relipidado humano (Dade International Inc., Miami, FL) como inhibidores de coagulación. Para el PT de conejo, se usó tromboplastina C Plus de conejo (Dade Diagnostics, PR) . El Innovin fue un iniciador potente de coagulación a través de todas las especies examinadas aquí, de acuerdo con los descubrimientos de Janson et al. (1984) Haemostasis 14:440-444 ya que el factor de tejido relipidado humano puede coagular efectivamente el plasma de las diferentes especies animales. El plasma derivado de sangre cifrada de conejos blancos de Nueva Zelanda, ratones C-57, ratas de Sprague-Dawley y perros se prepararon por procedimientos estándar y se almacenaron a -80 °C. El plasma combinado humano se obtuvo del Península Blood Bank (Burlingame, CA) . Los anticuerpos antiFIX se incubaron, se diluyeron 10 partes en plasma cifrado y se incubaron durante 10 minutos antes de que se inició la coagulación adicionando Actin FS y CaCl2 (para el APTT) o Innovin (para el PT) . El efecto de los anticuerpos se expresó como prolongación de x-partes la cual es la proporción de los tiempos de coagulación en la presencia o ausencia (=control) del anticuerpo.

La activación del FX por el complejo de FVIIIa:FIXa en fosfolípidos - Una mezcla de Factor IXa 0.5 nM, F.VIII 0.7 U/ml, vesículas de fosfolípido 200 µM (PC:PS=7.3) y CaCl2 10 mM en amortiguador de HBSA (Hepes 0.1M, pH 7.5, NaCl 0.14M, BSA libre de ácido graso 0.5 mg/ml) se incuba con a-trombina (2.8 nM) durante 1 minuto a temperatura ambiente para activar el FVIII. La actividad de la trombina se neutralizó por adición de hirudina 23.3 nM. Los anticuerpos se adicionaron a la mezcla y se incubaron durante 20 minutos a temperatura ambiente antes de que se adicionó el FX 0.8 µM. En esta mezcla de reacción final, la concentración de reactivos fue: FlXa 0.25 nM, F. Villa 0.35 U/ml, fosfolípidos 25 µM, FX 100 nM y CaCl2 5mM. En diferentes puntos de tiempo, se adicionaron alícuotas de 50 µl a 150 µl de EDTA 20 mM para detener la reacción. Para medir la concentración del FXa en las muestras, se adicionó 50 µl de S 2765 1.5 mM a cada pozo y el cambio de absorbancia se verificó en un lector de microplacas cinético (Molecular Devices, Menlo Park, CA) . Las velocidades de generación de Fxa se determinaron usando análisis de regresión lineal de las concentraciones del FXa contra el tiempo.

Resultados Inhibición selectiva de la función del FX por el F(ab')2 de 10C12 y 13H6 - Un número de diferentes ensayos funcionales se emplearon para investigar sí el enlace específico observado al FIX por el 10C12 y 13H6 también se translada en una inhibición específica de la función del FlX/IXa. Tanto el 13D1, debido a su identidad al 10C12, y el 14H9, debido a su patrón de enlace no específico, no se persiguieron además. En primer lugar, se miden los efectos del 10C12 y 13H6 sobre el APTT dependiente del FIX y PT independiente del FIX en plasma humano. Como se muestra en la Figura 9A, ambos anticuerpos prolongan específicamente el APTT, pero no cambian el PT. Un F(ab')2 de control (antineurturina) ni prolonga el APTT ni el PT. En segundo lugar, tanto el F(ab')2 de 10C12 y 13H6 interfieren fuertemente con la coagulación dependiente de las plaquetas, similares a los resultados obtenidos con sus formas de cadena única. El 10C12 fue más potente que el 13H6 con un IC50 de 59.0 ± 3 nM en comparación con 173 ± 43 nM (Figura 7) .

La reactividad del F(ab')2 del 10C12 en especies cruzadas -Las secuencias de aminoácidos de los dominios de Gla del FIX de diferentes especies animales son conservadas mucho (Figura 1A) , sugiriendo que un anticuerpo que enlaza al Gla del FIX humano puede también reconocer el FlX/IXa de plasma de varios animales. La potencia del F(ab')2 de 10C12 para inhibir el APTT en plasma de diferentes especies se examinó por lo tanto. Como se muestra en la Figura 9B, el F(ab')2 de 10C12 prolongó más potentemente el APTT en el perro y hasta un grado menor que en el plasma de rata y conejo. La especificidad del efecto del anticuerpo hacia el FlX/IXa se mostró por la ausencia de cualquier efecto sobre el PT en plasma homólogo.

Los anticuerpos se evaluaron en un ensayo de activación del FX mediado por el FVIIIa:FIXa usando vesículas de fosfolípido (PCPS) (Figura 8) . Una inhibición dependiente de la concentración de velocidades de activación del FX se observó con inhibiciones de velocidad máxima media de 3.5 ± 1.8 nM para el 10C12 y 7.3 ± 1.3 nM para el 13H6. Un F(ab')2 de control no pertinente dirigido contra la neurturina (a-NTN) no afecta la velocidad de activación. Además, los anticuerpos no tuvieron efecto sobre la actividad del FXa para separar el substrato cromogénico S2765, el cual se usó en la segunda etapa del ensayo para determinar la concentración del FXa formado recientemente. Por lo tanto, el efecto de los anticuerpos fue solamente debido a la interferencia con la función del Xase intrínseca. En conjunto estos resultados indican que tanto el F(ab')2 de 10C12 y 13H6 inhiben específicamente la función del FIX/FIXa de acuerdo con su especificidad de enlace mostrada en ensayos del tipo ELISA.

EJEMPLO 7 Mecanismo Inhibitorio del 10C12 Métodos Activación del FIX por el FXIa. Los anticuerpos se incubaron con FIX en hepes 20 mM, pH 7.5, NaCl 0.15M, CaCl2 5 mM, BSA al 0.05% (amortiguador de HBSA) usando tubos de microtítulo (8.8x45 mm, OPS, Petaluma, CA) . Después de un periodo de incubación de 20 minutos, se adicionó FXIa para iniciar la reacción. La concentración del FIX y FXIa en esta mezcla de reacción fueron 400 nM y 1 nM, respectivamente. En intervalos de 30 segundos se tomaron alícuotas de 100 µl y se enfriaron rápidamente en placas Costar de 96 pozos (Corning Inc., Corning, NY) que contiene 125 µl de amortiguador de EDTA 30 mM-etielnglicol al 60% (v/v) . El etilenglicol se incluyó debido a su efecto intensificador sobre la actividad amdiolítica del FlXa (Sturzebecher et al., (1997) FEBS lett., 412:295-300; Neuenschwander et al., (1997) Thromb. Haemostatsis 78 (Suppl. ): 428) . Después de adicionar 25 µl de substrato #299 de FIX 5 mM, la actividad amidolítica del FlXa se midió a 405 nm en un lector de microplacas cinético (Molecular Devices, Menlo Park, CA) . La inhibición por loa anticuerpos probados se expresó como velocidades relativas (vi/vo) de la generación del FlXa.

Activación del FIX por el complejo de factor de tejido: F.VIIa. El TF (1-243) que carece del dominio citoplásmico (Paborsky et al. (1989), Biochemistry 28:8072; Paborsky et al. (1991), J. Biol. Chem. 266:21911-21916) se relipido con PC/PS (proporción molar 7:3) de acuerdo a Mimms et al. (1981), Biochemistry 20:833-840. El TF de membrana (mTF) se preparó a partir de una línea celular de riñon embriónico humano (293) que expresa el TF de longitud completa (1-263) (Kelley et al. (1997), supra). Las células se lavaron en PBS, se separaron con EDTA 10 mM y se centrifugaron dos veces (2500 rpm durante 10 minutos) . El pellet celular (4-5x107 células/ml) se volvió a suspender en Tris, pH 7.5 y se homogeneizó en PBS usando un homogeneizador de mano, seguido por centrifugación (2500 rpm en un GSA de Beckman) durante 40 minutos a 4°C. La concentración de la proteína de la fracción de membrana celular se determinó y las membranas se almacenaron en alícuotas a -80°C hasta usarse.

Los anticuerpos se incubaron con FIX en amortiguador de HBSA durante 20 minutos en tubos de microtítulo. Un complejo de TF relipidado (1-243) (20 nM) y FVIIa (5 nM) se preformó durante al menos 10 minutos antes de que éste se adicionó a la solución de incubación de FlX/anticuerpo. En esta mezcla de reacción, las concentraciones de TF relipidado (1-243), el FVIIa y FIX fueron 4 nM, 1 nM y 400 nM, respectivamente. Para experimentos con mTF se preformó un complejo de mTF (concentración de la proteina de membrana de 750 µg/ml) y FVIIa 5 nM. Esta concentración del mTF dio una actividad del FVIIa máxima y fue igual a aquella observada con el TF relipidado (1-243). La concentración del mTF y FVIIa en la mezcla de reacción fue 150 µg/ml (concentración de la proteína de membrana) y 1 nM, respectivamente. En intervalos de 30 segundos se tomaron alícuotas de 100 µl de la mezcla de reacción y se enfriaron rápidamente en placas de 96 pozos (Costar) gue contienen 125 µl de EDTA 30 mM-amortiguador-etilenglicol al 60% (v/v) . Después de adicionar 25 µl de substrato #299 de FIX 5 mM, la actividad amidolítica del FlXa se midió a 405 nm en un lector de microplacas cinético (Molecular Devices, Menlo Park, CA) . La inhibición por los anticuerpos probados se expresó como velocidades relativas (vi/vo) de la generación de FlXa. Usando las curvas estándar con FlXab, se determinó que, tanto en el ensayo con TF:FVIIa y con FXIa, menos de 15% de FIX de zimogeno se convirtió durante el periodo de reacción.

Resultados Mecanismo inhibitorio del 10C12.

Los efectos del 10C12 sobre la activación del FIX mediada por el FlXa y el complejo de TF:FVIIa se examinaron. Recientemente, Stuerzebecher et al. (1997), Febs lett. 412:295-300, y Neuenschewander et al. (1997), Thromb. Haemostasis 78 (suppl.) :428 se reportó que el etilenglicol aumentó la actividad amidolítica del FlXa hacia ciertos tipos de substratos cromogénicos . Se derivo un ensayo de activación del FIX usando etilenglicol para incrementar la actividad amidolítica del FlXa generado recientemente. Como se muestra en la Figura 10A, la conversión inhibida por el 10C12 del FIX en FlXa por el FlXa de una manera dependiente de la concentración (IC50 28.8 ± 1.7 µg/ml; ± SD) . Un anticuerpo de control, antineurturina (NTN) , el cual también fue formatado como un F(ab')2 provisto de un zíper de leucina, no tuvo efecto. Debido a que el 10C12 se une al dominio de Gla del FIX y FlXa, no se esperó que el 10C12 interfiriera con la capacidad del FlXa para separar el substrato cromogénico pequeño usado para medir la concentración del FlXa generado en el ensayo. Para confirmar esta suposición, las concentraciones crecientes del FlXa se incubaron con 100 µg/ml de 10C12 y se ensayaron con substrato de FlXa. El 10C12 no cambió las velocidades de partición del substrato por el FlXa, indicando que el 10C12 inhibió solamente la activación dependiente del FlXa del FIX, y no la actividad amidolítica del FlXa.

Además, los efectos del 10C12 sobre la activación extrínseca del FIX se midieron usando un complejo de TF relipidado (1-243) y FVIIa. La conversión inhibida por el 10C12 del FIX con una inhibición máxima media a 34.2 ± 1.6 µg/ml, mientras que un anticuerpo de control (NTN) no tuvo efecto (Figura 10B) . Luego, el TF de membrana (mTF) se usó en lugar del TF relipidado (1-243) . Como para los ensayos con TF relipidado (1-243), la concentración del mTF usada se saturaron respecto a la actividad enzimática del FVIIa. Los resultados mostraron que la inhibición de la activación del FIX por el 10C12 se inhibió de una manera similar con un IC50 a una concentración un poco más baja (15.4 ± 0.7 µg/ml; ± SD) en comparción al TF relipidado (1-243) (Figura 10B) . Para además evaluar la especificidad del 10C12 para el FIX, la interferencia con la fnción de dos factores de coagulación que contienen Gla diferentes, se examinan el FVIIa y FX. Las velocidades de la activación del FX (200 nM) por el complejo de TF elipidado (1-243) : FVIIa (0.2 nM/0.04 nM) se midieron ya sea después de la incubación del 10C12 durante 20 minutos con el FVIIa o con el FX de substrato. El 10C12 hasta 200 µg/ml no inhibe la generación del FXa en cualquiera ajuste experimental, confirmando la especificidad del anticuerpo de 10C12.

La inhibición específica de la coagulación dependiente del FIX en plasma de conejillo de Indias/rata. Sí la inhibición específica de la función del FIX humano por el 10C12 se mantuvo para el conejillo de Indias y rata, se examinó el FIX. El 10C12 se incubó con plasma pobre en plaquetas derivado a partir de la sangre cifrada de la rata y conejillo de Indias, y se midieron los efectos sobre el APTT y PT. El 10C12 prolongó específicacmente el APT tanto en el plasma de conejillo de Indias y rata (Figura 11). La prolongación del APTT de 2 partes fue a 65 µg/ml (650 nM) y a 60 µg/ml (600 nM) para el conejillo de Indias y rata, respectivamente. Estas potencias fueron casi idénticas a aquellas en el plasma humano donde el 10C12 dio una prolongación del APTTT de 2 partes a 60 µg/ml. Un anticuerpo de control (NTN) ni afecta el APTT ni el PT. Estos datos sugirieron gue el 10C12 une y neutraliza el FlX/IXa en plasma de conejillo de Indias y rata, todavía mantiene su especificidad, como se indica por el PT sin cambio. La reactividad de especies cruzadas observada y especificidad del 10C12 dejó examinar la actividad antitrombótica en modelos de trombosis establecidos en conejillo de Indias y rata.

EJEMPLO 8 La Administración de Anticuerpos de Dominio de Gla AntilX/IXa Previene las Variaciones de Flujo Cíclico en Arterias Carótidas Dañadas sin Afectar los Parámetros de Coagulación y Sangría.

Métodos Producción y purificación del anticuerpo de F(ab')2 de 10C12 provisto de zíper de leucina. Los cDNAs que codifican la cadena pesada y ligera variable del clon 10C12 se amplifican por la PCR y se subclonan en un vector de expresión que contiene tanto regiones constantes de cadena pesada (Fd' ) y ligera (lambda) humanas (Cárter et al. (1992) Bio/Technology 10:163-167), así como una secuencia de zíper de leucina (Kostelny et al. (1992), J. Immunol. 148:1547-1553) se adiciona en el extremo 3 ' de la secuencia de cadena pesada constante. Este vector se expresa en raza 33B6 de K12 E. Coli (fhuA phoA-delta-E15delta (argF-lac) 169 deoC2 degP41 (deltaPstl-kanR) IN (rrnDrrnE) 1 ilvG2096) , derivado a partir de la raza W3110. Las células se hicieron crecer durante 46 horas en un fermentador de 60 litros aireado a 30 °C en un medio que contiene inicialmente tetraciclina 12 mg/l caseína digerida 12 g/1, glucosa 5 nM, (NH )2S04 47 mM, NaH2P0 10 mM, K2HP04 18 mM, citrato trisódico 4 mM, MgS0 12 mM, FeCl3 250 mM, y cada uno de ZnS04, MnS02, CuS04, CoCl2, H3B03, y NaMo04 40 mM. La fermentación recibe una alimentación automatizada de amoniaco: leucina (proporción molar 35:1) para mantener el pH a 7.0 y glucosa, ajustada a la velocidad mayor que previene la acumulación de acetato. Las condiciones de operación fueron suficientes para proporcionar oxígeno a 3 mmoles/1 minuto. La expresión se indujo por la falta de fosfato. La densidad de la célula final fue 160 OD55o. El pellet de célula de E. Coli cosechado se almacena, se congela a -70°C. El pellet congelado se divide en piezas pequeñas con un mazo y se mezcla con 5 volúmenes de MES 20 mM (ácido 2-{N-morfolino}etano-sulfónico) /urea 2M/EDTA 5 mM/NaCl 0.25M, pH 5.0 (amortiguador de extracción) usando un homogeneizador de tejido ulraturax hasta que se logra una suspensión uniforme. Luego la suspensión de células se hace pasar a través de un homogeneizador (Modelo 15M, Gaulin Corp., Everett, MA) para romper las células. El extracto se clarificó ajustando la mezcla hasta pH 3.5 con HCl 6N y centrifugando durante 20 minutos a 6000 X g. El pH del sobrenadante se reajustó hasta 5.0 usando NaOH. El sobrenadante se condicionó para cromatografía por dilución con 4 partes de MES 20 mM/urea 2M, pH 5.0, se filtró a través de un filtro de 0.2 mieras (Millipore Corp., Bedford, MA) y se aplicó a una resina de intercambio catiónico de flujo rápido SP-SEPHAROSE equilibrada en el amortiguador de dilución. La columna se lavó extensivamente en el mismo amortiguador y luego con MES 20 mM, pH 5.0. La columna se eluyo en dos pasos usando NaCl 0.5M y NaCl 1M en amortiguador de MES 20 mM, pH 5.0. El F(ab')2 provisto de zíper de leucina de 10C12 se recuperó en la fracción de NaCl 1M/MES 20 mM. El depósito de SP-SEPHAROSE se cargó en ciclos múltiples a una columna de flujo rápido de proteína G-SEPHAROSE. La columna se equilibró y se lavó con Tris 20 mM/NaCl 0.5 M, pH 7.5. La elución fue con ácido acético O.lM/NaCl 0.15M, pH 3.0, y la columna se regeneró después de cada ciclo con Tris 20 mM/Guanidina HCl 2M, pH 7.5. Los depósitos de proteína G combinados se concentraron aproximadamente 20 partes usado un sistema celular agitado de A icon (Amicon Inc. Beverly, MA) equipado con una membrana de YM30. El depósito concentrado se cambió con amortiguador usando un tramo de columna SEPHADEX G25 en NaP04 20 mM/NaCl 0.15 M, pH 7.0. El depósito de G25 se hizo pasar a través de una columna de flujo rápido Q-SEPHAROSE en NaP04 20 mM/NaCl 0.15M, pH 7.0, para la eliminación de endotoxina. El depósito final contiene 12.5 EU/mg de proteína y se hizo pasar a través de un filtro de 0.22 mieras.

Como un anticuerpo de control para todos los experimentos, se usó el anticuerpo de F(ab')2 provisto de zíper de leucina antineurturina (NTN) . Este anticuerpo también se produjo en E. Coli y se purificó con una columna de flujo rápido con proteína G. El F(ab')2 de control provisto de zípre de leucina y el F(ab')2 de 10C12 provisto de zípre de leucina será referido simplemente como anticuerpo antineurturina (NTN) y anticuerpo de 10C12. El peso molecular de ambos anticuerpos se calculó como 100,000.

Modelo de trombosis arterial en el conejillo de Indias. Los experimentos se llevaron a cabo como se describe por Carteaux et al. (1995), Circulation 91:1568-1574). Los conejillos de Indias machos GOHI (350-450 g, BRL, Füllinsdorf, Suiza) se anestesian por inyección i.m. de cetamina HCl 40 mg/kg (Ketasol-100R, Gráub AG, Bern, Suiza) y xilazina 5 mg/kg 2% (RompunR, Bayer AG, Leverkusen, Alemania) . Un ransductor de presión de catéter (Millar 2F Mikro-Tip SPC-320 Millar Instr. Inc. Houston, TX) se insertó en la arteria femoral derecha para medir la presión sanguínea y velocidad del corazón. En la arteria femoral izquierda se colocó un catéter (Tricath In 22G, Codan, Espergaerde, DK) para el muestreo de sangre. También se insertó un catéter en la vena yugular izquierda para la administración de fármaco. La arteria carorida derecha se dividió en pedazos libre y una sonda de flujo Doppler del tipo puño de silicona de 0.8 mm de diámetro (tipo D-20-0.8, Iowa Doppler Products, IA) se conectó a un módulo de medidor de flujo Doppler de impulsos de 20 MHz (System 6-Model 202, Tritón Technology, Inc. San Diego, CA) para verificar la velocidad del flujo de sangre. La presión sanguínea (mm Hg) , velocidad del corazón (latidos/minuto) y velocidad del flujo sanguíneo de la arteria carótida (Volts) se registraron en un registrador VII Graphter Linear (Model WR 3101, Hugo Sachs, March-Hugstetten, Alemania) .

Los conejilos de Indias reciben un bolo único de solución salina, 10C12 o anticuerpo de control (NTN) vía el catéter en la vena yugular izquierda y después de que se inició el daño vascular de 15 minutos. A dos milimeros de distancia a la sonda de flujo Doppler, se indujo el daño al subendotelio comprimiendo un segmento de 1 mm de la arteria carótida cortada en pedazos con un fórceps cubierto de caucho durante 10 segundos como se describe previamente (Carteaux et al. (1995), supra; Roux et al. (1994), haemostasis 71:252-256). Después del daño, la velocidad del flujo sanguíneo de la artería carótida típicamente decae hasta la oclusión completa, seguido por restauración del flujo con agitación suave del área dañada para desalojar el trombo. El patrón de las variaciones de flujo cíclico (CFVs) se establecieron ser similares a aquellas descritas por Folts (1991), Circulation 83:Supple. IV: 3-14) en un modelo de trombosis coronaria de perro. Sí ninguna de las CFCs se observaron durante 5 minutos, una constricción adicional se llevó a cabo además del primer daño. El mismo procedimiento se repitió cada 5 minutos hasta que se presentan las CFVs. Finalmente, el número de constricciones necesarias para producir las CFVs se contaron durante un periodo de observación de 40 minutos. Se asumió que varias constricciones son aptas para incrementar la trombogenecidad de la capa subendotelial de la arteria carótida, de este modo un índice de trombo se calculó como la proporción del número de CFVs al número de constricciones (Carteaux et al (1995), supra). Bajo estas condiciones experimentales, la velocidad de corte calculada de la arteria carótida estuvo cerca de 1500-2800 s"1 (Roux et al. (1994) , supra) .

La sangre se colecta antes de la administración del inhibidor (prevalor) y a 60 minutos después de la administración del fármaco (postvalor) para la medición del tiempo de coagulación activado (ACT), tiempo de protrombina (PT), tiempo de tromboplastina parcial activado (APTT) y cuentas de células de sangre. Los tiempos de sangría de la cutícula de la uña también se miden en estos animales en los periodos pre y postexperimental . Los tiempos de iniciación de trombo y colección de muestra se basaron en un estudio farmacocinético piloto en el cual la prolongación del APTT alcanzó un máximo dentro de 15 minutos de dosificación de bolo IV (5 mg/kg, n=2 ) y luego permaneció esencialmente sin cambio durante las siguientes dos horas. Los métodos de manipulación de muestra, ensayos de coagulación y tiempo de sangría se describen a continuación.

Mediciones del tiempo de sangría de la cutícula en el conejillo de Indias. El método de sangría de la cutícula se adapta a partir de modelos de perro (Giles et al. (1982), Blood 60:727-731) y conejo (Kelley et al. (1997), Blood 89:3219-3227, Himber et al. (1997), Haemostasis 78:1142-1149) de la sangría dependiente de la coagulación. Un corte estándar se hizo en la punta de la cutícula de la uña por medio de tijeras. La sangre se dejó fluir libremente manteniendo la pata en contacto con la superficie de agua a 38°C. El tiempo de sangría de la cutícula se determinó como la cantidad de tiempo que la sangre continua fluyendo de la cutícula cortada transversalmente. Este procedimiento se llevó a cabo por triplicado tanto para las determinaciones de predosis o postdosis (60 minutos). La proporción del postratamiento al pretratamiento se calculó dividiendo la media del valor de postratamiento por la media del valor de pretratamiento.

Resultados Efectos antitrombóticos y hemostáticos del 10C12 en el conejillo de Indias. Para evaluar el potencial antitrombótico del 10C12 in vivo, se usó un modelo de trombosis arterial de conejillo de Indias establecido previamente de variaciones de flujo cíclico (CFCs) . En 12 animales de control los cuales recibieron solución salina, el número de CFVs durante el periodo de medición de 40 minutos fue 11.2 ± 1 (±SEM) y el índice de trombosis calculado fue 9.3 ± 1.5. la administración de un anticuerpo de control (NTN) dio 13.7 ± 1.8 CFVs y un índice de trombosis de 12.5 ± 2.11. Ninguno de estos puntos finales trombóticos ni cualquiera de los puntos finales hemostáticos fueron diferentes significativamente del control salino. Por lo tanto, los datos de control salino y NTN se combinaron para la comparación subsecuente a los tratamientos con 10C12. El índice de trombosis media (±SEM) de los controles combinados fue 10.4 ± 1.2. Como se muestra en la Figura 12, la administración de bolo de concentraciones crecientes de 10C12 dio por resultado una reducción de CFVs dependiente de la dosis, alcanzando una reducción altamente significante a 6 µg/kg (p<0.01) y inhibición completa de las CFVs a 60 µg/kg. En toas las dosis probadas, incluyendo 1000 µg/kg, la presión sanguínea, velocidad del corazón, hematocrito, y cuentas de células de sangre permanecen sin cambio (datos no mostrados). Igualmente, el 10C12 no afecta significativamente (p>0.05 en la prueba de Kruskal-Wallis) al APTT, ACT o PT hasta 1000 µg/kg (Tabla I) . Sin embargo, hubo un incremento dependiente de la dosis en el APTT y CT, pero no en el PT, el cual alcanzó importancia estadística (p=O.01) a 1000 µg/kg sí una prueba de t de dos colas se usó para comparar los grupos de dosis individuales contra el control.

Tabla I. Efectos del anticuerpo de 10C12 sobre los parámetros de coagulación en conejillo de Indias. Los datos son media ± SEM.

Rx No. de Prolongación Prolongación Prolongación Prolonagción animales del APTT del PT del ACT del tiempo (post/pre)A (post/pre)? (post/pre)A de sangría de la cutícula (post/pre)A Control" 18 1.10±0.03 l.OT±O.Ol 0.97±0.02 1.00±0.03 10C12 -3µg/kg 7 1.15±0.05 l.Od±O.Ol 1.06±0.02 0.90±0.02 -6µg/kg 7 1.07±0.03 1.08±0.02 0.97±0.03 0.92±0.06 -lOµg/kg 6 l.H±O.06 1.06±0.03 1.04±0.03 1.01±0.09 -60µg/kg 3 1.18±0.10 l.lO±O.Ol 1.01±0.09 0.78±0.04 -lOOOµg/kg 3 1.31+0.07 1.04±0.02 1.23±0.14 0.9710.05 Medidas tomadas antes de (pretratamiento) y 60 minutos después de (postratamiento) ) la administración de Rx. Bdatos combinados de los experimentos con control salino y anticuerpo de control (NTN) .

El efecto del 10C12 sobre la hemostasis nornmal se valoró midiendo el tiempo de sangría de la cutícula, el cual se ha mostrado previamente ser dependiente de la coagulación en perros y conejos. El tiempo de sangría se midió antes de la administración de 10C12 y no prolongó el tiempo de sangría de la cutícula. Incluso a 1000 µg/kg, el tiempo de sangría de la cutícula permanece sin cambio (Tabla I) . El efecto de la dosis más alta del 10C12 (1000 µg/kg) sobre la sangría de la cutícula en un punto de tiempo anterior se acceso en un grupo separado de conejillos de Indias. En estos experimentos, el tiempo de sangría de la cutícula y la pérdida de sangre total se midieron a 1 minuto más bien que 60 minutos del postratamiento. Como se muestra en la Tabla II, hubo una tendencia hacia un incremento en estos parámetros en el grupo tratado con 10C12. Sin embargo, en ciertos casos (8 de 9 en controles y 4 de 6 en 10C12 tratados), la sangría cesa completamente después de que se completó la hemostasis primaria.

Tabla II. Efectos comparativos del anticuerpo de 10C12 sobre la sangría de la cutícula en conejillo de Indias y rata. Los datos son media ± SEM.

Especies Número Tiempo de ResangradoB Pérdida de Rx de sangría de la (número) sangre totalc Animales cutícula* (mg) (minutos) Conejillo de Indias Control0 9 3. .1 ± 0.4 1 90 ± 21 10C12 -1000 µg/kg 6 4, .5 ± 0.7 2 137 ± 37 Rata Control0 10 2. .5 ± 0.4 10 494 ± 105 10C12 -1000 µg/kg 10 2. .6 ± 0.5 10 593 ± 197 A Medidas tomadas 1 minuto después de la administración de Rx B número de animales los cuales tienen un episodio de sangría de la cutícula después del cese inicial de sangría. c cantidad total de sangre derramada durante 30 minutos (a partir del corte transversal de la cutícula) D datos combinados de los experimentos con control salino y anticuerpo de control (NTN) .

EJEMPLOS 9 La Administración de Anticuerpos de Dominio de Gla AntilX/Ixa Reduce el Peso del Coágulo y Duración de la Oclusión de Vasos en un Modelo de Trombosis Arterial.

Métodos Modelo de trombosis arterial inducida por FeCl3 en la rata. El modelo de Kurz et al. (1990), Thromb. Res. 60:269-280, se modifica como sigue. Los catéteres de dosificación y muestreo (tubo de polietileno PE 50, Becton Dickinson and Co., Sparks, ML) se colocaron en la vena y arteria femoral de una rata macho, Sprague Dawley, anestesiada con isoflorano (Harían Labs, Indianapolis, IND) . Los pesos corporales de las ratas fluctúan desde 420 hasta 460 gramos. La tenmperatura corporal se mantuvo a 37°C durante toda la cirugía y periodos experimentales. La arteria carótida se cortó en pedazos libre de su tejido circundante y una sonda de flujo ultrasónica (Trnsonic IR, Transonic Systems Inc., Itheca, NY) se colocó en la arteria próxima al corazón. La trombosis se indujo colocando un tubo de polietileno cortado (PE 50) que contiene un disco de papel de filtro de 3 mm de diámetro saturado con FeCl3 al 70% alrededor de la arteria expuesta cranial a la sonda. El flujo de sangre se verificó antes de y durante 60 minutos después de la colocación del disco. El 10C12, NTN o heparina se diluyeron hasta la concentración adecuada en solución salina estéril para inyección. Varias dosis de 10C12 o NTN se administraron como un bolo único de 1 ml . La heparina se administró como un bolo de carga (lOOU/kg) seguido por una infusión constante (lU/kg/min) durante 65 minutos (volumen total de 2 ml) . Los controles para la administración de heparina consisten de solución salina para inyección administrada durante el mismo periodo de tiempo y en el mismo volumen. Todos lo tratamientos se administraron vía el catéter venoso 5 minutos antes de la colocación del disco. En la postdosificación de un minuto (tratamientos con NTN y 10C12) o 30 minutos (tratamientos con solución salina y heparina) , los tiempos de sangría de la cola se midieron como se describe a continuación. A los 60 minutos, la arteria se cortó y cualquier trombo presente se eliminó, se secó con papel de filtro y se pesó. Los puntos finales de trombosis registrados fueron la incidencia y duración de la oclusión, y peso del trombo. Las muestras de sangre se extrajeron del catéter arterial en predosis y a 1, 35 y 65 minutos después de la dosificación. Estas muestras se analizaron por PT, APTT y ACT como se describe .

Mediciones del tiempo de sangría de la cola y pérdida de sangre en el modelo de trombosis de rata. El tiempo de sangría de la cola se determinó por una modificación del método de corte transversal de la cola sin ayuda de instrumentos descrito por Dejana et al. (1982), Thromb. Haemostasis 48:108-111). Durante el periodo experimental, la rata se mantuvo supina en una plataforma elevada, tal que su cola estuvo perpendicular al plano del cuerpo. La temperatura de la cola se mantuvo a 37°C colocándola a través del lumen interno de un condensador enchaquetado con agua (Kontes Glass, baxter healthcare Corp., Deerfield, IL) unido a un recirculador de agua controlado termostáticamente (American Medical Systems, Cincinnati, OH) . Con esta configuración, aproximadamente 10 mm de la punta de la cola fue accesible para el corte transversal. Los tiempos de sangría de la cola se midieron después del corte transversal de 5 mm de la punta de la cola con un cortauñas veterinario (Resco modelo 727 con navaja #400, Tecla Co Inc, Walled lake MI) . Este procedimiento se llevó a cabo en un minuto (tratamientos con NTN y 10C12) o 30 minutos (tratamientos con solución salina y heparina) postdosificación. Estos tiempos de muestreo se seleccionaron para coincidir con el tiempo en el cual las concentraciones de sangre de los reactivos de prueba y por lo tanto los efectos hemostáticos se asumieron estar cerca del máximo para los regímenes de bolo o infusión usados para administrar los reactivos de prueba respectivos. Las gotas de sangre se colectaron en intervalos de 30 minutos en un tubo de microfuga pesado previamente. El tiempo de sangría se registró como el tiempo antes de que se detuvo completamente la sangría o las gotas requeridas >30 segundos para formarse. En este tiempo, un segundo tubo se colocó debajo de la cola para colectar cualquiera sangre adicional (pérdida de sangre secundaria) que se derramó durante hasta 30 minutos después del corte transversal de la cola. Después de este periodo de colección de 30 minutos, la herida se cauterizó para prevenir la pérdida de sangre adicional. La cantidad total de sangre pérdida durante 30 minutos se determinó sumando el peso de sangre colectada en dos tubos .

Experimentos del tiempo de sangría de la cutícula y pérdida de sangre adicional en conejillo de Indias y rata. Debido a que hubo diferencias en como la sangría de la cutícula del conejillo de Indias y la sangría de la cola de rata responden al tratamiento con 10C12, las mediciones de la sangría adicional se llevaron a cabo en orden para identificar la fuente de la discrepancia. En estos experimentos adicionales, la misma metodología se usó para medir la sangría tanto en conejillo de Indias y ratas. Brevemente, los animales se anestesiaron y los catéteres de dosificación se colocaron como se describe en los modelos de trombosis respectivos. Sin embargo, las muestras de sangre, presión sanguínea y mediciones de trombosis no se tomaron. Un minuto después de la administración del control (solución salina o NTN) o 1000 µg/kg de 10C12 como un bolo IV, la cutícula se cortó transversalmente y el tiempo de sangría, resangría y pérdida de sangre se midieron como se describe anteriormente para el ensayo de sangría de la cola de rata.

Resultados Efectos antitrombóticos y hemostáticos del 10C12 y heparina en rata. Los efectos del 10C12 y heparina en el modelo de trombosis arterial inducida por FeCl3 de rata se examinaron. La eficacia antitrombótica se valoró midiendo la incidencia y duración de la oclusión de vasos durante el periodo de 60 minutos después de la aplicación del FeCl3. Además, el peso del trombo recuperado en la terminación del experimento se midió. Las trazas de flujo de sangre de la arteria carótida representativas de una rata tratada con control salino y un 10C12 se mostraron en la Figura 13. Después de la administración de bolo del anticuerpo de control (NTN a 2000 µg/kg) ninguno de los puntos finales trombóticos ni cualquiera de los puntos finales hemostáticos fueron significativamente diferentes del control salino. Por lo tanto, los datos de la solución salina y control de NTN se combinaron para la comparación subsecuente a los tratamientos con 10C12 y heparina. La oclusión se presentó en 10 de 10 animales de control en un tiempo promedio de 14.1 ± 1.5 minutos. Con la excepción de un animal, en el cual el flujo arterial recuperado brevemente antes de la reoclusión, la oclusión se mantuvo durante el resto del experimento. El peso del coágulo de los controles fue 2.8 ± 0.2 mg y la duración de la oclusión de vasos fue 44.7 ± 2.6 minutos (Figura 14). La administración del 10C12 a 500 µg/kg no tuvo efecto sobre ya sea el parámetro no sobre la incidencia de la oclusión (5 de 5) . A 1000 µg/kg, la incidencia de oclusión disminuyó hasta 2 de 5 (P<0.05 contra controles), mientras que el peso del coágulo se redujo hasta 0.66 ± 0.17 mg (23.6 ± 6.1% de control) y la duración de la oclusión de vasos disminuyó hasta 9.6 ± 8.9 minutos (21.5 ± 19.9% de control) (Figura 14). Los efectos sobre el APTT/PT/ACT se determinaron a partir de las mediciones en muestras de sangre tomadas antes de y en puntos de tiempo múltiples después de la administración del fármaco. Ya que estos parámetros permanecen estables durante el periodo de postdosificación de 60 minutos, los valores de postdosis de 30 minutos se seleccionaron para la comparación al valor de predosis. El 10C12 produjo una prolongación dependiente de la dosis, modesta del APTT y ACT, mientras que el PT no se afectó (Tabla III), mostrando la especificidad del 10C12 in vivo. En comparación, la administración de la heparina (velocidad de bolo de 1000 U/kg e infusión de lU/kg/min) tuvo efectos dramáticos sobre el APTT además de afectar el ACT y PT (Tabla III) sin reducir completamente el peso del coágulo o restaurar la abertura del vaso (Figura 14).

Tabla III. Efectos del anticuerpo de 10C12 y heparina sobre los parámetros de coagulación en plasma de rata. Los datos son media ± SEM.

Mediciones tomadas antes de y 35 minutos después de la administración de Rx. B datos combinados de los experimentos con control salino y anticuerpo de control (NTN) * P=0.05, ** P=0.01 (Posthoc de Mann-Whitney después de la prueba de Kruskal-Wallis) Como se muestra en la Tabla IV, ninguna de las dosis activas antitrombóticamente del 10C12 prolongó el tiempo de sangría de la cola. Sin embargo, mayores efectos del 10C12 sobre la pérdida de sangre total se observaron. En animales de control, la hemostasis primaria en la cola cortada transversalmente se completó después de 2.0 ± 0.3 minutos y el peso de sangre colectada durante este periodo de tiempo fue 31.1 ± 9.4 mg. En contraste a la cutícula del conejillo de Indias cortada transversalmente, todas las heridas de la cola de control ya sea continúan para emanar la sangre (a una velocidad de menor que una gota de sangre por 0.5 minutos), o en ciertos casos comienza a resangrar intermitentemente. A pesar de la emanación y/o sangría recuperada, la pérdida de sangre promedio durante este periodo secundario fue pequeño (57.1 ± 32.0 mg) en relación al periodo de tiempo (media = 48 minutos) durante el cual se colectó la sangre. La administración del 10C12 exacerba esta pérdida de sangre secundaria, de este modo incrementa la pérdida de sangre total (tabla IV) . Aunque la variación de animal a animal fue considerable, la pérdida de sangre secundaria incrementó de una manera dependiente de la dosis y el incremento fue significante según la estadística en todas las dosis probadas. La pérdida de sangre primaria no se afectó significativamente. La heparina también causó pérdida de sangre acumulativa aumentada. Sin embargo, en contraste al 10C12 esta sangría aumentada fue debido principalmente a la formación de tapones hemostáticos retardada reflejada en los tiempos de sangría de la cola prolongados y pérdida de sangre primaria incrementada (tabla IV) .

Tabla IV. Efectos del anticuerpo de 10C12 y heparina sobre el tiempo de sangría y la pérdida de sangre en la rata. Los datos son media ± SEM.

Mediciones tomadas 1 minuto después de la administración de Rx B cantidad de sangre derramada durante la medición del tiempo de sangría c cantidad de sangre derramada después del cese de la sangría inicial hasta 30 minutos después del corte transversal de la cola D cantidad total de sangre derramada durante 30 minutos (a partir del corte transversal de la cola) E datos combinados de los experimentos con control salino y anticuerpo de control (NTN) * p=0.05, ** p=0.01 (Posthoc de Mann-Whitney después de la Prueba de Kruskal-Wallis) .

Sangría de la cutícula de rata. Debido al patrón de pérdida de sangre después de la administración del 10cl2 en la cutícula del conejillo de Indias y la cola de rata fueron de este modo diferentes experimentos de sangría de la cutícula se llevaron a cabo en un grupo separado de ratas. Como en los experimentos de sangría de la cola de la rata, la emanación y resangría se presentó en la cutícula cortada transversalmente de ambos animales de control y animales tratados (10C12 a una dosis de 1000 µg/kg) . Sin embargo, en contraste al ensayo de sangría de la cola, el 10C12 no incrementó la sangría secundaria en la cutícula de la rata, ya que no hubo diferencia en el tiempo de sangría de la cutícula, incidencia de la resangría o pérdida de sangre total entre los animales tratados con control y 10C12 (Tabla II) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en la siguientes.

Listado de Secuencia <110> Genentech, Inc . <120> Human Anti- Factor IX/IXa Antibodies <130> P1G61R2PCT <141> 1999-08 - 26 <150> US 60/098 , 233 <151> 1998 -08 -28 <150> US 60/122 , 767 <151> 1999- 03 - 03 <160> 32 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <2i3> Secuencia artificial <220> <223> Secuencia del enlazador artificial para unir anticuerpos de cadena única <400> i Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 2 <211> 43 <212> PRT <213> Canis familiaris <400> 2 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Arg Gly Asn Leu Glu 1 5 10 15 Arg Glu Cys lie Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu 20 25 30 Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys 35 40 43 <210> 3 <211> 43 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 3 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Arg Gly Asn Leu Glu 1 5 10 15 Arg Glu Cys He Glu Glu Arg Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu 20 25 30 Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys 35 40 43 <210> 4 <211> 43 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <400> 4 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Ser Gly Asn Leu Glu 1 5 10 15 Arg Glu Cys He Glu Glu Arg Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu 20 25 30 Val Phe Glu Asn Thr Glu Lys Thr Thr Glu Phe Trp Lys 35 40 43 <210> 5 <211> 43 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu 1 5 10 15 Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu 20 25 30 Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys 35 40 43 <210> 6 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Ala Asn Ser Lys Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val 20 25 30 Phe Glu Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn 35 40 42 <210> 7 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Ala Asn Ala Lys Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg 1 5 ?o 15 Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He 20 25 30 Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr--fcys Leu Phe Trp He 35 40 42 <210> 8 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Ala Asn Ser Lys Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg 1 5 10 15 Glu Cys He Glu Glu He Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu He 20 25 30 Phe Gln Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser 35 40 42 <210> 9 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens < C140UU0>> 9» Al Laa AAssrn Thr Lys Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg 1 10 15 Glu Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala 20 25 30 Leu Glu Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala 35 40 42 <210> 10 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Thr Tyr Ala Met His 1 5 <210> 11 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 He He Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly 17 <210> 12 <21X> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Ala Ser He Ala Ala Ala Arg Val Leu Asp Tyr 1 5 10 11 <210> 13 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Ser Gly Ser Thr Ser Asn He Gly Asn Asn Tyr Val Ser 1 5 10 13 <210> 14 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 7 <210> 15 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Glu Phe Leu 1 5 10 11 <210> 16 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Val He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly 17 <210> 17 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> unknown <222> 7 <223> unknown amino acid <400> 17 Ser Asp Tyr Gly Gly Asn Xaa- tro Gly Glu Phe 1 5 10 11 <210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 He He Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly 17 <210> 19 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Ala Ser He Ala Ala Gly Arg Val Leu Asp Tyr 1 5 10 11 <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 He He Ser Tyr Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Ser 17 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Ser Tyr Ala Met His 1 5 <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400 > 22 Val He Ser His Asp Gly Gly Lys Lys Glu Tyr Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Arg Gly 17 <210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Ala Ala Tyr Thr Ala Ala Thr He Ala Asp Asn 1 5 10 11 <210> 24 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Thr Gly Ser Ser Arg Asp Val Asp Val Ser 1 5 10 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser <210> 26 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Ser Ser Tyr Gly Gly Ser Asn Asn Val Val 1 5 10 <210> 27 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Asp Tyr Ala Met His 1 5 <210> 28 <211> 17 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Thr He Ser Pro Ser Gly Arg Ser Thr Tyr Asn Ala Asp Ser Val 1 5 10 15 Lys Gly 17 <210> 29 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Arg Gly He Gly Tyr Lys Gly Gly Phe Asp Val 1 5 10 11 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Ser Gly Gly Arg Ser Asn He Gly Ser Asn Thr Val Lys 1 5 10 13 <210> 31 <211> 7 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Gly Asn Asp Gln Arg Pro Ser 1 5 7 <210> 32 <211> 12 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Arg Gly Ser Arg Val 1 5 10 12

Claims (22)

REIVINDICACIONES

1. Una composición, caracterizada porque comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo humano reactivo con el dominio de Gla del factor IX/IXa.

2. La composición de conformidad a la reivindicación 1, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de (a) un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen que comprende: un dominio variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos de una CDRl, de una CDR2 y de una CDR3, en donde la secuencia de aminoácidos de la CDRl se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO: 10 y SEC ID NO: 21; la secuencia de aminoácidos de la CDR2 se selecciona del grupo gue consiste de: SEC ID NO: 11 SEC ID NO: 16 SEC ID NO: 18 SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 22; la secuencia de aminoácidos de la CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO: 12 SEC ID NO: 17 SEC ID NO: 19 y SEC ID NO: 23; (b) un variante de (a) que tiene una afinidad de al menos aquella del anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen para el dominio de Gla del factor IX/IXa humano; y (c) un variante de (a) el cual compite con el anticuerpo de origen para enlazar el dominio de Gla del factor IX/IXa humano .

3. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 2, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12.

4. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 2, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17.

5. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 2, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19.

6. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 2, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 12.

7. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 2, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 23.

8. La composición de conformidad a la reivindicación 2, caracterizada porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de origen comprende adicionalmente un dominio variable de cadena ligera (le) que comprende una secuencia de aminoácidos de una lc-CDRl, de una lc-CDR2 y de una lc-CDRl, en donde la secuencia de aminoácidos de la lc-CDRl se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO: 13 y SEC ID NO: 24; la secuencia de aminoácidos de la lc-CDR2 se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO: 14 y SEC ID NO: 25 y la secuencia de aminoácido de la lc-CDR3 se selecciona del grupo que consiste de: SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 26.

9. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15.

10. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, y SEC ID NO: 26.

11. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 11 y SEC ID NO: 12 y en donde la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15.

12. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 16 y SEC ID NO: 17 y en donde la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15.

13. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 18 y SEC ID NO: 19 y en donde la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15.

14. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 10, SEC ID NO: 20 y SEC ID NO: 12 y en donde la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 13, SEC ID NO: 14, SEC ID NO: 15.

15. La composición de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 8, caracterizada porque la región variable de cadena pesada comprende la SEC ID NO: 21, SEC ID NO: 22 y SEC ID NO: 23 y en donde la región variable de cadena ligera comprende la SEC ID NO: 24, SEC ID NO: 25, y SEC ID NO: 26.

16. El ácido nucleico aislado, caracterizado porque codifica el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 1.

17. Un vector, caracterizado porque comprende el ácido nucleico de conformidad a la reivindicación 16.

18. Una célula huésped, caracterizada porque comprende el vector de conformidad a la reivindicación 17.

19. Un método para producir un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, caracterizado porque comprende cultivar la célula huésped de conformidad a la reivindicación 18 bajo la condición en donde se expresa el ácido nucleico.

20. Un artículo de manufactura, caracterizado porque comprende (a) un recipiente; (b) una etiqueta en el recipiente; y (c) una composición que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 1 contenida dentro del recipiente; en donde la composición es efectiva para tratar un desorden de coagulación y una etiqueta opcional en el recipiente indica que la composición se puede usar para tratar un desorden coagulopático.

21. Un método para tratar un mamífero, caracterizado porque comprende administrar una cantidad efectiva terapéuticamente de una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 1 al mamífero.

22. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo o fragmento de anticuerpo de conformidad a la reivindicación 1.