MXPA01001671A - Composicion y metodos para exponer epitopes antigenicos en microorganismos cultivados. - Google Patents

Abstract

Composiciones, formulas, dispositivos y metodos para la deteccion de microorganismos objetivo, tales como, mediante ensayo de inmunoprecipitado visual, inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia, inmunoblotting o tecnologia de deteccion similar, en donde la deteccion requiere la discriminacion entre generos estrechamente relacionados, especies y cepas de microorganismos antigenicamente relacionados basados en reactividad inmunologica de epitopes de antigenos altamente conservados con un sistema de reactivo comprendido por un anticuerpo enlazado a un reactivo de deteccion. La invencion permite que ocurra un caso detectable al exponer epitopes de antigeno inaccesibles pero altamente conservados y especificos al reactivo de deteccion. La exposicion de tales epitopes de antigeno sin activar el metabolismo microbiano, permite la deteccion especifica.

Description

COMPOSI CIÓN Y MÉTODOS PARA EXPONER EPITOPES ANTI GÉNICOS EN MICROORGANISMOS CULTIVADOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere de manera general a composiciones, fórmulas, dispositivos y métodos para detectar e identificar microorganismos y, de manera más particular, a composiciones, fórmulas, dispositivos y métodos para detectar microorganismos al exponer sitios antigénicos altamente conservados de microorganismos objetivo sin ¡nact?var la capacidad de crecer de los microorganismos a niveles suficientes para ser detectados por un sistema de detección enlazado a anticuerpo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades microbianas han sido una preocupación mayor de salud alrededor del mundo. El aumento significativo en la frecuencia y severidad de epidemias a ocurrido en todo el mundo. Se han identificado nuevas bacterias patogénicas, tales como, E. coli 01 57: H7. Además, los géneros patogénicos previamente reconocidos han mutado para formar cepas altamente infecciosas, resistentes a medicamentos, tal como, Salmonella typhimurium DT 1 04. Una característica clave en la prevención de tales enfermedades es el diag nóstico temprano. Los epidemiólogos deben buscar la contaminación microbiana en el ambiente así como en productos alimenticios para encontrar las estrategias efectivas de prevención de enfermedades.

Un ejemplo es la epidemia en 1 992 de E. coli enterohemorrágica (EHEC) en Pacific Northwest de Estados Unidos debido a la carne molida contaminada. EH EC es u n patógeno relativamente "recién descubierto" . EHEC se aisló primero en 1975, y no fue hasta 1 982 que la E. coli 01 57: H7 fue asociada con dos epidemias relacionadas con alimentos de colitis hemorrágica en Estados Unidos. La frecuencia reportada de casos de E. coli 0147: H7 está aumentando. Normalmente, las cepas de E. coli son comensales inocuas , pero unas cuantas cepas son patogénicas. EH EC es particularmente virulenta y puede disparar complicaciones mortales, incluyendo varios calambres abdominales y falla renal aguda en niños, así como problemas cardiovasculares y del sistema nervioso central. Como otro ejemplo, la Salmonella es la causa principal (más del 50%) de epidemias bacterianas de enfermedades originadas en alimentos, de acuerdo con la observación de los Centers for Disease Control (CDC) estadounidenses de enfermedades originadas por alimentos. Más de 40,000 casos por año se reportaron al CDC durante el periodo de 1988-1 992. La Salmonella puede infectar una amplia variedad de animales de sang re caliente y fría, y puede sobrevivir durante largos periodos de tiempo fuera de un huésped. En un ejemplo adicional, la Salmonella typhimurium DT 104 se identificó primero en el Reino Unido en los inicios de la década de 1990. Es una cepa altamente adaptada, resistente a medicamentos de Salmonella conocida por su virulencia. Como resultado, un interés clínico significativo ha rodeado este serotipo. La S. typhimurium DT 1 04 contiene epitopes de antígeno de pared celular de núcleo que están altamente conservados entre el género Salmonella. Listeria, un género de bacterias gram positivas, está ampliamente distribuida en la naturaleza, habiéndose aislado de tierra, agua, vegetación y muchas especies animales. La frecuencia de detección para Listeria en el ambiente agrícola parece estar en aumento. Para epidemias específicas de listeriosis, los estimados colocan una mortalidad a 30% hasta 40% de los pacientes afectados, sin embargo, se sabe poco de la dosis inefectiva mínima. Un aspecto particularmente penoso del control de Listeria en alimentos es que la Listeria puede crecer a temperaturas tan bajas como -0.4°C y tan altas como 44°C. Todos estos factores contribuyen a la creciente importancia de la Listeria como un patógeno de alimentos. Los Campylobacter jejuni y coli han sido identificados recientemente como las causas principales de enteritis, especialmente de fuentes de aves de corral. Esto ha conducido a una necesidad creciente para discriminar estas dos especies de otras diversas especies de Campylobacter, las cuales no son patógenos humanos. Esto requiere la selección diferencial de epitopes de antígeno de membrana de pared celular más específicos. La capacidad para monitorear las fuentes ambientales y alimenticias potenciales de contaminación microbiana rápida y fácilmente, pero con una especificidad muy alta, reduciría el riesgo de la infección humana. Por lo tanto, sería útil un método analítico, el cual proporcione alta especificidad, de preferencia combinada con un dispositivo capaz de ensayar microorganismos, incl uyendo bacterias, levaduras , mohos, hongos, parásitos y virus, q ue no requiera equipo especial o técnico, que pueda desempeñarse en el campo y que no requiera habilidades especiales. En el caso de la contaminación bacteriana soportada por alimentos, cuatro de los principales organismos relacionados con la enfermedad son Salmonella, Listeria, EHEC y Campylobacter. Aunque existe una variedad de métodos de detección de Salmonella, Listeria y EHEC actualmente disponibles, se requieren técnicos de laboratorio entrenados y un mínimo de 2-5 d ías para obtener resultados de pruebas mediante los métodos estándares de cultivos de análisis. Los nuevos métodos, más rápidos, se basan en técnicas como ?nmunoensayo enlazado a enzimas (EIA), hibridación de DNA, inmunodifusión o mediciones de crecimiento/metabolismo. Aunque toman mucho menos tiempo ' q ue los métodos de cultivo, estas pruebas rápidas todavía req uieren entrenamiento técnico experto, un laboratorio funcional y equipo especializado. Éstas pruebas generalmente toman un total de dos o más días , incluyendo tiempo de intervención considerable. La metodolog ía de detección de Campylobacter es, a la fecha , técnicamente extensa, requiriendo condiciones ambientales y medios exigentes, además de analistas bien entrenados. Otra tecnolog ía reciente en el campo diagnóstico involucra inmunoensayos de flujo lateral. Tales pruebas han sido desarrolladas para la dectección de gonadotropina coriónica humana (hCG) y se aplican a pruebas de embarazo. Normalmente, un anticuerpo monoclonal o policlonal es inmovilizado en una banda discreta cerca del extremo distal de una tira de portador sólido , llamada la zona de detección . Otra cantidad de anticuerpos es marcada con un reactivo de detección , tal como, partícula de poliestireno teñida o sol inorgánica. Este anticuerpo marcado es fijado de manera reversible cerca del extremo proximal de la tira de portador. Sobre la hidratación del extremo proximal con un fluido de m uestra porque potencialmente contiene el antígeno, el antígeno reacciona con el anticuerpo marcado y el complejo pasa a través de la zona de anticuerpo inmovilizado, formando un sandwich sobre la reacción con el anticuerpo inmovilizado. La captura del complejo reactivo cromogéníco-antígeno provoca la formación de una señal visible en la zona de detección. Dos retos mayores deber ser resueltos para distinguir bacterias patogénicas, como se oponen a hormonas distintivas u otros objetivos moleculares solubles. Estos retos son la necesidad para detectar todas las cepas de un microorganismo patogénico en la presencia de numerosos organismos antigénicamente relacionados, con una baja tolerancia para resultados positivos falsos, y una muy baja tolerancia, de preferencia cero, para negativos falsos. El segundo reto es el tamaño físico y la heterogeneidad del microorganismo por si mismo. Una prueba diagnóstica clínica normal, tal como una prueba para hCG en orina, se enfoca en detectar una entidad simple, pequeña, única (es decir, una hormona) en una matriz bien caracterizada (por ejemplo, orina) . Adicionalmente, la estructura del analito (hCG) es definida y uniforme en tamaño y composición . La detección de patógeno, por ejemplo, una prueba para Salmonella, debe disting uir una cepa patogénica particular de cepas no patogénicas de microorganisos similares, tales como, Citrobacter spp. y Enterobacter spp.

En contraste con el tamaño y estructura bien definidos y pequeños de la mayoría de hormonas o proteínas marcadoras, los microorganismos son muy g randes, sus superficies son heterogéneas conteniendo muchos epitopes de antígeno distintos, que pueden experimentar cambios, tales como, el cambio de fase de los flagelos de Salmonella. Además, la membrana de pared celular de muchos microorganismos contienen epitopes de antígenos, tales como, Iipopolisacáridos, los cuales se repiten con un alto grado de consistencia dentro de un género dado. Estos epitopes de antígenos sirven como objetivos altamente deseables para la reacción con anticuerpos específicos complementarios los cuales, a su vez, proporcionan un método de alta precisión con bajos positivos falsos. Sin embargo, la capacidad para aislar a anticuerpos que reaccionan con estos epitopes de antígenos altamente conservados es difícil , debido a que pueden estar obstruidas estéricamente por cadenas de polisacáridos de O-antígeno. Generalmente son inaccesibles debido a un fenómeno conocido como interferencia estérica. Esta interferencia esférica es proporcionada por los epitopes de antígenos de superficie del microorganismo. Ejemplos de estructuras de superficies conocidas por contribuir a esta interferencia son proteínas de superficie, lipopolisacáridos de g rupo específico, flagelos y encapsulación celular. Aunque están disponibles tratamientos agresivos los cuales expondrán los epitopes de antígenos interiores, estos tratamientos destruyen la viabilidad celular y en muchos casos rompen la integridad celular completamente. Ejem plos de tales tratamientos son tratamiento con calor (ebullición o autoclave) y extracción qu ímica (digestión con ácido nitroso). La desventaja significativa de estas extracciones es que resultan en la muerte del microorganismo. Por lo tanto, si la población celular no ha alcanzado un nivel suficientemente detectable antes de la inactivación, resultará una determinación negativa. De esta manera, existe una necesidad en la técnica para metodolog ías que permitirán la exposición simultánea de epitopes de antígenos enmascarados altamente conservados, al tiempo q ue todavía se permite que los microorganismos se multipliquen . Además, existe una necesidad en la técnica para incorporar la selectividad mejorada para epitopes de antígenos objetivo altamente conservados de especies específicas en una población de microorganismos heterogéneos en una variedad de matrices. La presente invención proporciona estas y otras ventajas relacionadas.

BREVE DESCRI PCIÓN DE LA I NVENCI ÓN La presente invención generalmente proporciona u na novedosa composición de crecimiento de microorganismos que expone epitopes antigénicos. En un aspecto, ia invención proporciona una composición que comprende un medio de enriquecimiento general y al menos un químico orgánico modificador de estructura. En una modalidad, el químico orgánico modificador de estructura es 2,4-dinitrofenol o carbonil cianuro-m-clorofenil hidrazona. En otra modalidad , el químico orgánico modificador de estructura es 2,4-dinitrofenol. Todavía en otra modalidad, el medio de enriquecimiento general es seleccionado de u na variedad de medios hechos de m anera fácil o comercialmente disponibles , i ncluyendo Terrific Broth , medio SOB, medio SOC, medio LB, medio NZCYM, medio mínimo, caldo de lactosa, agua de peptona amortiguada, medio Brain Heart Infusión, caldo Haemophilus, caldo de soya tríptico y caldo de nutrientes. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar un método para detectar un microorganismo en una muestra de prueba al poner en contacto la muestra de prueba con una composición que comprende medio de enriquecimiento general y al menos un qu ímico orgánico modificador de estructura, formando con ello una mezcla. Esta mezcla es incubada durante un tiempo suficiente para permitir que se desarrollen niveles detectables de microorganismos, después de lo cual se detecta la presencia de microorganismos específicos. En una modalidad de este aspecto de la invención, la mezcla entra en contacto con un detergente antes de o al mismo tiempo con la detección . En otra modalidad, la mezcla entra en contacto con un detergente y es calentada antes o al mismo tiempo con la detección . En una modalidad , el detergente es aniónico. Todavía en otra modalidad , el detergente es no iónico. En ciertas modalidades, el detergente aniónico puede ser seleccionado a partir de dodecil sulfato de sodio y deoxicolato de sodio. En ciertas modalidades, el detergente no iónico es N P-40, tergitol o tritón X-1 00. En otras ciertas modalidades, la mezcla es calentada en la presencia dei detergente a una temperatura, entre 40°C y 1 21 °C. En ciertas modalidades del método de detección, el microorganismo detectado es Listeria, E. coli enterohemorrágica, Salmonella o Campylobacter.

Volviendo a otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar la presencia de Listeria, E. coli enterohemorrágica, Salmonella o Campylobacter en una muestra de prueba, en donde la muestra de prueba entra en contacto con una composición que comprende medio de enriqucimiento general y al menos un qu ímico orgánico modificador de estructura , seguido por la incubación de esta mezcla durante un tiempo suficiente para permitir que se desarrollen niveles detectables de microorganismos. Subsecuente al desarrollo de niveles detectables de microorganismos en la mezcla , se detecta de manera específica la presencia de Listeria, E. coli enterohemorrágica, Salmonella o Campylobacter. En una modalidad de este aspecto de la invención , la mezcla entra en contacto con un detergente antes de o al mismo tiempo con la detección. En otra modaidad, la mezcla entra en contacto con un detergente y es calentada antes de o al mismo tiem po con la detección . En una modalidad , el detergente es aniónico. Todavía en otra modalidad, el detergente es no iónico. En ciertas modalidades, el detergente aniónico puede ser dodecil sulfato de sodio o deoxicolato de sodio. En ciertas modalidades, el detergente no ¡ónico es N P-40, tergitol o tritón X-1 00. En otras ciertas modalidades, la mezcla es calentada en la presencia del detergente a una tem peratura, entre 40°C y 121 °C. En otra modalidad , las metodolog ías de detección descritas en la presente utilizan un inmunoensayo. En ciertas modalidades, el inmunoensayo es seleccionado de un ensayo de inmunoprecipitado visual , un inm unoensayo enlazado con enzima, quim iol uminiscencia e inmunoblotting . En otras ciertas modalidades, el inm unoensayo es un ensayo de inmunoprecipítado visual. También se proporcionan en ciertas modalidades, inmunoensayos que utilizan un anticuerpo monoclonal complementario, anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo, en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para un epitope de pared celular altamente conservado en el microorganismo objetivo. Todavía en otro aspecto de la invención, se proporciona un método, que comprende poner en contacto una muestra de prueba conteniendo un microorganismo con un dispositivo de detección basado en inmunoafinidad, " en donde la muestra de prueba se ha propagado previamente en la presencia de un químico orgánico modificador de estructura. La invención también proporciona un método para propagar un microorganismo, de manera que, los epitopes de antígenos de pared celular del microorganismo son alterados al contactar una muestra de prueba con una composición que comprende medio de enriquecimiento general y al menos un qu ímico orgánico modificador de estructura, y propagar el microorganismo en lá misma. Volviendo todavía a otro aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar epitopes específicos de microorganismo en un microorganismo objetivo en una muestra de prueba, comprendiendo propagar un microorganismo en una muestra de prueba en un medio de enriquecimiento general permisivo, en donde dicho medio comprende un químico orgánico modificador de estructura, y contactar la muestra de prueba con un anticuerpo específico de microorganismo enlazado a un reactivo de detección , en donde la reacción con el anticuerpo indica la presencia dei microorganismo. En una modalidad adicional, el contacto entre la muestra de prueba y el anticuerpo ocurre en sistema de ensayo o dispositivo. Todavía en otra modalidad , el sistema de ensayo es seleccionado de un ensayo de inmunoprecipitado visual , un inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia e inmunoblotting . En otra modalidad, el dispositivo de ensayo es un dispositivo de detección de flujo lateral . En ciertas modalidades, el anticuerpo usado en los métodos anteriores es específico para un microorganismo seleccionado de Salmonella, E. coli enterohemorrágica, Listeria y Campylobacter. Otro aspecto de la invención es proporcionar un dispositivo de flujo lateral para detectar un microorganismo objetivo en una muestra que comprende un anticuerpo específico de microorganismo y una muestra de prueba previamente propagado en un medio de enriquecimiento general, comprendiendo el medio al menos un qu ím ico orgánico modificador de estructura. En otra modalidad de este aspecto de la invención , el anticuerpo es específico para cualquiera de Salmonella, E. coli enterohemorrágica, Listeria y Campylobacter. Estos y otros aspectos de la presente invención se volverán evidentes sobre la referencia a la siguiente descripción detallada y ejemplos. Además, las diversas referencias expuestas más adelante describen con más detalle ciertos procedimientos o composiciones (por ejemplo, anticuerpos, metodolog ías de detección , etc. ) , y por lo tanto, están incorporadas cada una en la presente, por referencia, en su totalidad.

DESCRI PCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN Antes de exponer la invención, puede ser útil para el entendimiento de la misma, exponer definiciones de ciertos términos que serán usados de aqu í en adelante. El término "anticuerpo", como es usado en la presente, incluye anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, quiméricos y anti-idiotípicos, así como fragmentos de los mismos, tales como, fragmentos F(ab')2 y Fab y otros compañeros de unión producidos de manera recombinante. Además, los anticuerpos pueden ser enlazados de manera covalente a, o fusionados de manera recombinante a, una enzima, tal como, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante, a-galactosidasa y similares. "Qu ímico orgánico modificador de estructura" se refiere a un químico orgánico capaz de alterar la composición de la pared celular de un microorganismo, de manera que se exponen los l igandos específicos y conservados. Brevemente, tales químicos orgánicos normalmente inhiben la transferencia de epitopes que interfieren estéricamente a la pared celular. Tales químicos orgánicos incluyen, pero no están limitados a, 2,4-dinítrofenol , carbon?l cianuro-m-clorofenil hidrazona o desacopladores de electrones similares (es decir, que deshabilitan la fuerza motriz de protones) , los cuales tienen el efecto de exponer epitopes específicos y de alta afinidad , los cuales son reconocidos por anticuerpos monoclonales o policlonales. Ei término "medio de enriquecimiento general" se refiere a cualquier medio que sea conocido por ser útil para facilitar el crecimiento de microorganismos. Brevemente, una variedad de medios de enriquecimiento general están comercialmente disponibles y/o pueden hacerse fácilmente, estos incluyen, pero no están limitados a, medio basado en triptona (por ejemplo, Terrífic Broth, medio SOB, SOC y LB) , medio NZCYM , medio m ínimo, caldo de lactosa, agua de peptona amortiguada, medio Brain Heart I nfusión , caldo Haemophilus, caldo de soya tríptico, caldo de nutrientes y similares (ver Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) , 2a ed . , Cold Spring Harbor Press , 1 989; Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biolog ía molecular) , Greene Publíshing , 1995; comercialmente disponible de Sigma Chem ical Co. , St. Louis, MO y Difco Laboratories I nc. , Detroit, Michigan). La presente invención proporciona la detección de microorganismos objetivo, los cuales expresan epitopes de antígenos altamente conservados pero estéricamente inaccesibles, al combinar una composición inventiva de medio de crecimiento seguido por la detección con anticuerpos muy específicos usando un formato de detección , tal como un ensayo de inmunoprecipitación visual , inmunoensayo enlazado a enzima, qu?mioluminiscencia, inmunoblotting o tecnolog ía similar. La presente invención permite tal detección al proporcionar un ambiente de crecim iento en un medio de cultivo modificado, en donde se permite que los microorganismos se multipliquen a niveles óptimos, pero su estructura de superficie es alterada, sin provocar muerte celular substancial, para exponer los epitopes de antígenos altamente específicos y conservados encontrados en la estructura de pared celular interior.

Usando la presente invención , el analista puede incubar la muestra de prueba de interés bajo condiciones de laboratorio de rutina en la presencia de medio de crecimiento inventivo, el cual expone epitopes de antígenos específicos. Esta invención proporciona un resultado de prueba altamente preciso, mientras que todavía proporciona al analista la conveniencia de condiciones de laboratorio microbiológicas estándares. Un aspecto adicional de la presente invención es que no se requieren equipo e instalaciones únicas o costosas. Debido a que la viabilidad celular continua es importante para permitir que el patógeno de interés crezca a cifras suficientes para detección mediante el sistema de detección elegido (por ejemplo, ensayo de inmunoprecipitado visual, inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia, inmunoblotting o tecnolog ía de detección basada en ¡nmunoafinidad) , la presente invención utiliza metodolog ías las cuales inducen simultáneamente composiciones de pared celular alteradas, así como que permiten un crecimiento adicional del patógeno. De manera más específica, la presente invención es dirigida a una detección altamente específica de microorganismos objetivo al contactar muestras potencialmente conteniendo estos microorganismos en la presencia de un medio de crecimiento que contiene qu ímicos orgánicos modificadores de estructura, los cuales permiten la expresión y accesibilidad de estos epitopes de antígenos altamente conservados a anticuerpos de detección monocionales o policlonales específicos unidos a rectivos de detección. La detección se logra por medio de un ensayo de inmunoprecipitado visual , inmunoensayo enlazado a enzima, quim ioluminiscencia , inmunoblotting o tecnolog ía de detección basada en inmuno-afinidad. La presente invención permite tal detección al modificar la estructura de superficie del microorganismo objetivo sin provocar la muestra substancial en tal manera que los epitopes de antígenos más altamente conservados y específicos se hacen accesibles a los anticuerpos correspondientes enlazados a reactivos de detección. La composición del medio de la presente invención modifica bioquímicamente el metabolismo del microorganismo objetivo, de manera que produce una pared celular modificada, la cual expone los epitopes más específicos y conservados. (Ver, por ejemplo, Tsang et al. , "Screening for Salmonella with a Murine Monoclonal antibody M 105 Detects both Félix 01 Bacteriophage Sensitive and Resistant Salmonella Strains" (La clasificación de Salmonella con un anticuerpo monoclonal de murino M 1 05 detecta tanto cepas de Salmonella resistentes como sensibles a bacteriófago Félix 01 ) , Zbl . Bakt. 286: 23-32, 1 997; Tsang et al. "A Murine Monoclonal Antibody that Recognizes a Genus-Specific Epitope ¡n the Salmonella Lipopolysaccharide Outer Core" (Un anticuerpo monoclonal de murino que reconoce un epitope de género específico en el núcleo exterior de lipopolisacárido de Salmonella) , Zbl . Bakt. 274:446-455, 1 991 ; Tsang et al. , "A Murine Monoclonal Antibody Specific for the Outher Core Oligosaccharide of Salmonella Lipopolysaccharide" (Un anticuerpo monoclonal de murino específico para el oligosacárido de núcleo exterior de lipopolisacárido de Salmonella) , I nfection and I mmunity, 55:21 1 -216, 1 987; Tsang et al . , "Lack of the a-1 ,2-linked N-acetyl-D-glucosamine epitope in the outer core structures of lipopolysaccharides from the certain O serogroups and subspecies of Salmonella entérica", (Carencia del epitope de N-acetil-D-g lucosamina a-1 , 2-enlazada en las estructuras de núcleo exterior de lipopolisacáridos de ciertos O serogrupos y subespécíes de Salmonella entérica), Res. Microbiol. 142: 521 -533, 1 991 ). La modificación estructural ocurre sin inhibir la capacidad para crecer de los microorganismos, por lo tanto, el microorganismo patógeno objetivo continua creciendo sin inhibirse para alcanzar un nivel detectable. La combinación de la modificación estructural y la capacidad para replicar adicionalmente, proporciona una ventaja porque los microorganismos patogénicos generalmente se encuentran en una muestra a niveles por debajo del umbral de detección de los sistemas de detección más rápidos. Aunque puede emplearse cualq uier sistema de detección , los sistemas de detección preferidos incluyen , pero no están limitados a, ensayo de inmunoprecipitado visual, i nmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia, inmunoblotting y sistemas de detección similares. En una modalidad de la presente invención , una muestra de prueba que potenc?almente contiene un microorganismo patogénico es contactada con un medio de crecimiento que contiene un inhibidor de expresión de superficie celular de polisacárido de O-antígeno. Subsecuentemente, el medio conteniendo m uestra es sometido a una metodolog ía de detección , la cual puede incluir ensayo de inmunoprecipitado visual , inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia, inmunoblotti ng o sistemas de detección similares. En modalidades preferidas, las composiciones, fórmulas, dispositivos de detección y los métodos de detección son específicos para Salmonella, E. coli enterohemorrágica (EHEC), Listeria y Campylobacter. En una modalidad particularmente preferida, el medio de crecimiento inventivo, siguiendo la incubación, es introducido en un sistema de detección, tal como un ensayo de ¡nm unoprecipitado visual , un inmunoensayo enlazado a enzima, químioluminiscencia, inmunoblotting o tecnolog ía de detección similar, conteniendo un anticuerpo específico para el microorganismo objetivo, produciendo con ello un resultado altamente preciso. La presente invención combina cualquiera de varios medios de enriq uecimiento general reconocidos ampliamente, tales como, caldo de soya tríptico, caldo de nutrientes, agua de peptona amortiguada, caldo de lactosa, caldo de infusión de cerebro corazón, o medios similares con un número de químicos orgánicos modificadores de estructura de antígeno, incluyendo, pero no limitando a, 2,4-dinitrofenol, carbonil cianuro-m-clorofenil hidrazona o desacopladores de electrones similares, para exponer epitopes que son reconocidos por anticuerpos monoclonales o policlonales, los cuales tienen una alta afinidad por los epitopes específicos. El mecanismo de acción de estos qu ímicos orgánicos es alterar las rutas metabólicas del microorganismo objetivo, de manera que produce una pared celular deficiente que perm ite la exposición de Is epitopes específicos ineriores. Es la combinación de la alteración de una ruta metabólica, la cual altera la estructura de la pared celular con un reactivo de detección de anticuerpo contenido en un dispositivo de detección, tal como un ensayo de inmunoprecipitado visual, el cual hace rápida y específica la detección .

Siguiendo la incubación en el medio inventivo bajo condiciones permisivas, los resultados son detectados preferiblemente usando un método de detección rápido, tal como, pero no limitado a, ensayo de inm unoprecipitado visual, inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia, inmunoblotting o tecnolog ía de detección similar. Tales metodolog ías son descritas en mayor detalle en la patente estadounidense no. 5,658,747 y PCT WO 95/30903. En una modalidad preferida de la invención , la mezcla de la composición y la muestra de prueba, siguiendo la incubación, puede exponerse a una solución de detergente para mejorar la accesibilidad del epitope de antígeno conservado. En una modalidad m uy preferida de la invención, el detergente puede ser calentado para facilitar una exposición más rápida del epitope. Todavía en otra modalidad, la mezcla, siguiendo la incubación, es expuesta a detergente a una temperatura elevada, la temperatura es de preferencia, desde aproximadamente 40°C hasta 1 21 °C durante un tiempo especificado, de preferencia desde dos minutos a una hora. En una modalidad , la mezcla, antes de la detección, comprende hasta aproximadamente 0.02-2.0% en peso de un detergente, de preferencia un detergente aniónico, seleccionado además preferiblemente del grupo que consiste de dodecil sulfato de sodio (SDS) y deoxicolato de sodio, y similares, pero incluyendo también detergentes no iónicos, tales como , NP-40 , tergitol y tritón X-1 00 y similares. U n aspecto adicional de la presente invención es el uso de un ensayo de inmunoprecipitado visual para detectar la presencia de un microorganismo en una muestra de prueba. En el ensayo de inmunoprec?pitado visual, los anticuerpos, incluyendo el "reactivo de detección-anticuerpo" ubicado inicialmente en la zona de reactivo, normalmente es ya sea un anticuerpo policlonal o monoclonal. Además, cuando se usa un anticuerpo policlonal, el anticuerpo es preferiblemente una columna de afinidad purificada antes de su utilización en la presente invención . La producción de tales anticuerpos es bien conocida en la técnica. (Ver, por ejemplo, Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: un manual de laboratorio) , Harlow y Lañe (eds). Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1 988). Ls anticuerpos purificados por afinidad adecuados también pueden ser procurados a partir de fuentes comercialmente disponibles. Por ejemplo, un antisuero policlonal específico para Salmonella está dispoible de Kírkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg , Maryland. Un ensayo de inmunoprecipitado visual preferido es aquél que se describe por la patente estadounidense no. 5,658,747. Brevemente, la patente estadounidense no. 5,658,747 utiliza un dispositivo diagnóstico de flujo lateral, el cual comprende una zona de reactivo conteniendo un reactivo de detección de anticuerpo y u na zona de detección ubicada corriente debajo de la zona de reactivo, y que comprendiendo un compañero de unión inmóvil capaz de unir específicamente dicho complejo entre el microorganismo objetivo y el reactivo de detección de anticuerpo. Los anticuerpos policlonales pueden ser generados fácilmente por alguien de habilidad ordinaria en la técnica vía inmunización de una variedad de anim ales de sangre caliente, tales como, caballos, vacas, cabras, borregos, perros, pollos, pavos, conejos, ratones o ratas. Brevemente, el microorganismo objetivo, o un antígeno asociado de manera específica con el microorganismo objetivo, es utilizado para inmunizar al animal. La inmunogenicidad de la proteína o péptido de interés puede incrementarse a través del uso de un auxiliar, tal como auxiliar completo o incompleto de Freund, o mediante acoplamiento a otra proteína, tal como, ovalbúmína o hemocianina de lapa de bocallave (KLH).

Los anticuerpos monoclonales también pueden ser generados fácilmente usando técnicas bien conocidas. (Ver, por ejemplo, Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimensión in Biological Analyses, (Anticuerpos monoclonales, hibridomas: una nueva dimensión en análisis biológicos), Plen um Press, Kennett, McKearn and Bechtol (Eds. ) , 1 980, y Antibodies: A Laboratory Manual (Anticuerpos: una manual de laboratorio), Harlow y Lañe (eds.), supra). Brevemente, como un ejem plo, un animal sujeto es inmunizado como con la producción de un anticuerpo policlonal. De manera alternativa, también se conocen en el área técnicas de inmunización in vitro adecuadas para la producción de anticuerpos monoclonales. Las células productoras de anticuerpos son fusionadas entonces a células de mieloma inmortales para proporcionar una línea de células de híbridoma inmortal. Siguiendo la fusión, las células son colocadas en placas de cultivo conteniendo un medio adecuado, tradicionalmente medio HAT, aunque se conocen otros medios adecuados en la técnica. Después de aproximadamente siete días, las células o hibridomas fusionados resultantes pueden clasificarse con el fin de determinar la presencia de anticuerpos, los cuales reconocen el antígeno deseado. Siguiendo varias diluciones clónales y re-ensayos, pueden aislarse anticuerpos productores de hibridoma que se unen a la proteína de interés. También pueden utilizarse otras técnicas para construir anticuerpos monoclonales o compañeros de unión. (Ver, por ejemplo, Huse et al. , "Generation of a Large Combinational Líbrary of the I mmunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", (Generación de una gran genoteca de combinaciones del repertorio de inmunoglobulinas en fago lambda) , Science 246: 1 275-1 281 , 1 989; Sastry et al. , "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library", (Clonación del repertorio inmunológico en Escherichia coli para la generación de anticuerpos catal íticos monoclonales: construcción de una genoteca de cDNA específica de región variable de cadena pesada) , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:5728-5732, 1 989; Alting-Mees et al. , "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternatíve to Hybridomas", (Genotecas de expresión de anticuerpos monoclonales: una rápida alternativa para hibridomas) , Strategies in Molecular Biology 3: 1 -9, 1990; Larrick et al. , "Polymerase Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable Región Genes From Single Hybridoma Cells" , (Reacción en cadena de polimerasa usando iniciadores mixtos: clonación de genes de región variable, de anticuerpo monoclonal humano a partir de células de hibrídoma simples) , BioTechnology 7 :934-938, 1 989) .

Una vez que se ha obtenido el anticuerpo adecuado, puede aislarse o purificarse mediante muchas técnicas bien conocidas para aquéllos de habilidad ordinaria en la técnica (ver Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow y Lañe, supra). Los anticuerpos útiles en la presente invención son capaces, de preferencia, de detectar de manera selectiva todas las cepas de un microorganismo objetivo en la presencia de numerosos organismos antigénicamente relacionados. Además, los anticuerpos son preferiblemente capaces de tal detección con una baja tolerancia para unión no específica (la cual conduce a u n resultado positivo falso) y una falla muy baja, de preferencia cero, para unir el objetivo al microorganismo (lo cual conduce a un resultado negativo falso) . Un aspecto de la presente invención proporciona un medio de enriquecimiento general, caldo de soya tríptico, que contiene 0.1 -5 mM 2,4-dinitrofenol, al cual se adiciona una muestra de prueba , formando con ello una mezcla, y subsecuentemente se incuba a 37°C durante 6-8 horas. Siguiendo la incubación, una alícuota de la muestra es expuesta a 0.05-0.5% SDS a 1 00°C durante diez minutos. La muestra puede ser introducida entonces a un dispositivo de detección , por ejemplo, un dispositivo de ensayo de inmunoprecipitado visual, y puede ser observada para la formación de una línea visual. De preferencia, la muestra es una solución que contiene, o que consiste ensencialmente de, una muestra de campo sin purificar, al como una muestra de alimento, una m uestra ambiental, tal como agua o tierra. De manera alternativa, la muestra puede ser un fluido biológico, tal como, un fluido corporal. En una modalidad adicional, la muestra puede ser purificada parcial o substancialmente antes de la administración al dispositivo de diagnóstico, tal como una muestra de laboratorio. Sobre el contacto de la muestra con una composición conteniendo un reactivo de detección de anticuerpo específico para el microorganismo objetivo que está contenido potencialmente dentro de la muestra, se permite la unión entre el reactivo de detección de antígeno y el microorganismo objetivo, detectando con ello la presencia o ausencia de un microorganismo patogénico particular. Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para detectar un microorganismo en una muestra de prueba, en donde la muestra de prueba es incubada en un medio de enriquecim iento general que comprende al menos un qu ímico orgánico modificador de estructura durante tiempo suficiente para propagar niveles detectables de microorganismos. Subsecuentemente, la presencia de microorganismos patogénicos es detectada al utilizar metodolog ías de detección inmuno-basadas, las cuales incl uyen, pero no están limitadas a, inmuno-afinidad , inmunoprecipitación visual , inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminscencia, inmunoblotting y similares. De manera alternativa, la exposición de antíeno en una muestra puede ser intensificada mediante tratamiento con detergente antes de o de manera contem poránea con la detección. En una modalidad alternativa adicional, la exposición de antígeno en una muestra, previamente sometida a propagación en la presencia de la composición de la presente invención, puede ser intensificada al calentar la muestra en la presencia del detergente, antes de o al mismo tiempo con la detección. Todavía en otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para detectar un microorganismo objetivo que comprende poner en contacto una muestra que potencialmente contiene el microorganismo objetivo, en la presencia de otros géneros que no son de interés pero que expresan epitopes de antígeno de reacción cruzada con una composición como se describe antes, bajo condiciones de incubación permisivas. Siguiendo la incubación, la muestra es expuesta a un ensayo, tal como el ensayo de inmunoprecipitado visual que permite que el reactivo de detección a anticuerpo se una al microorganismo objetivo para proporcionar un complejo entre el microorganismo objetivo y el reactivo de detección de anticuerpo. El complejo migra entonces corriente abajo a lo largo de la membrana de flujo lateral a una zona de detección que contiene un anticuerpo inmóvil capaz de unirse al complejo para proporcionar un complejo unido. A continuación, el complejo unido es detectado. Los siguientes ejemplos son presentados con fines de ilustración y no de limitación.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Se identificaron nueve cepas de Salmonella , las cuales no fueron reactivas en un ensayo de inmunoprecípitado visual . Se reportó que las cepas producen niveles excesivos de antígeno de superficie. Se formuló la hipótesis de que el crecimiento de las cepas en el medio inventivo eliminaría o reduciría significativamente la expresión de epitopes de antígeno superficie de grupo O, permitiendo con ello la detección de anticuerpos monoclonales altamente específicos dirigidos contra la región de núcleo de lipopolisacárido contenida en el dispositivo de ensayo de inmunoprecipitado visual. Los organismos se hicieron crecer en el medio inventivo, seguido por extracción con 0.1 % SDS a 100°C durante diez minutos. Se demostró una fuerte reactividad. La formulación de medio inventivo fue una formulación comercialmente disponible de caldo de soya tríptico conteniendo los siguientes ingredientes complementados con 0.5mM (0.01 %) 2,4-dinitrofenol.

Caldo de soya tripticasa Digestión pancreática de caseína 17.0 g Digestión papa?ca de harina de soya 3.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Fosfato dipotásico 2.5 g Dextrosa 2.5 g Agua destilada 1 000 ml EJEMPLO 2 Se determinó que dos cepas de Salmonella, serogrupos A y B, eran débilmente reactivas en un ensayo de inmunoprecipitado visual basado en anticuerpo monoclonal y un inmunoensayo enlazado a enzima en la presencia de microorganismos competitivos relacionados . Estas cepas fueron incubadas en el medio inventivo en un exceso de 1 000 veces de bacterias competitivas y se encontraron altamente reactivas. La formulación de medio inventivo fue una formulación comercialmente disponible de agua de peptona amortiguada complementada con 0.5 mM (0.01 %) 2,4-dinitrofenol.

Peptona amortiguada Digestión pancreática de gelatina 1 0.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Fosfato dipotásico 3.5 g Fosfato monopotásico 1 .5 g Ag ua destilada 1 000 ml EJEMPLO 3 Se encontró que una cepa de E. coli 01 57: H7 era débilmente reactiva en un ensayo basado en anticuerpo policlonal . La cepa se hizo crecer en el medio inventivo y la sensibilidad se mejoró por 1 00 veces. El medio fue un caldo de soya tríptico modificado con 20 mg/ml de novobiocina complementada con 0.5 m M (0.01 %) 2,4-dinitrofenol.

Caldo de soya tríptico modificado Bacto Tryptone 17.0 g Bacto Soytone 3.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Fosfato dipotásico 4.0 g Sales biliares no. 3 1 .5 g Bacto dextrosa 2.5 g EJEMPLO 4 Se identificó una cepa patogénica de Campyiobacter jejuni, la cual no reaccionó en un ¡nmunoensayo de enzima basado en policlonal/monoclonal. La cepa se hizo crecer en el medio inventivo, seguido por tratamiento con 0. 1 % de deoxicolato de sodio y se encontró que era fuertemente reactiva. El medio fue caldo de aislamiento de Campylobacter complementado con 0.5 mM (0.01 %) 2,4-dinitrofenol.

Caldo de nutrientes no. 2 con 0.6% de extracto de levadura Polvo Lab-Lemco 1 0.0 g Peptona 1 0.0 g Cloruro de sodio 5.0 g Extracto de levadura 6.0 g Agua destilada 1 000 ml De lo anterior, se apreciará que , aunque se han descrito modalidades específicas de la invención en la presente para fines de ilustración, pueden hacerse varías modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la inención. De acuerdo con esto, la invención no será limitada excepto como por las reivindicaciones anexas.

Claims (1)

1. REIVI NDI CACIONES 1 . Una composición para exponer epitopes antigénicos de un microorganismo , comprendiendo un medio de enriquecimiento general y al menos un químico orgánico modificador de estructura desacoplador de energ ía. 2. La composición de la reivindicación 1 , en donde el químico orgánico modificador de estructura, es seleccionado del grupo que consiste de 2,4-dinitrofenoi y carbonil cianuro-m-clorofenil hidrazona . 3. La composición ya sea de la reivindicación 1 o 2, en donde el medio de enriquecimiento general es seleccionado del grupo que consiste de Terrific Broth , medio SOB, medio SOC, medio LB, medio NZCYM , medio m ínimo, caldo de lactosa , agua de peptona amortiguada, medio Brain Heart Infusión , caldo Haemophilus, caldo de soya tríptico y caldo de nutrientes. 4. La composición de la reivindicación 3, en donde el qu ímico orgánico modificador de estructura es 2,4-dinitrofenol. 5. Un método para detectar un miroorganismo en una muestra de prueba, que comprende: (a) contactar una muestra de prueba con una composición que comprende medio de enriquecimiento general y al menos un químico orgánico modificador de estructura, formando con ello una mezcla; (b) incubar la mezcla durante un tiempo suficiente para permitir que se desarrollen niveles detectables de microorganismos, y (c) detectar la presencia de microorganismos específicos en la mezcla. 6. El método de acuerdo con la reivindicación 5, que comprende además contactar la mezcla con un detergente, en donde dicho contacto expone además epitopes antigénicos antes de la detección . 7. El método de acuerdo con la reivindiación 6, que comprende además calentar la combinación de la mezcla y detergente antes de la detección. 8. El método de acuerdo ya sea con la reivindicación 6 o 7, en donde el detergente es un detergente aniónico. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el detergente es seleccionado del grupo q ue consiste de dodecil sulfato de sodio y deoxicolato de sodio. 1 0. El método de acuerdo con la reividicación 6 o 7, en donde el detergente es un detergente no iónico. 1 1 . El método de acuerdo con la reividicación 1 0, en donde el detergente es seleccionado del grupo que consiste de NP-40 , tergitol y tritón X-100. 1 2. El método de acuerdo con la reividicación 7, en donde el calentamiento es realizado a aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 121 °C durante un tiempo suficiente para exponer adicionalmente epitopes antigénicos. 13. El método de acuerdo con la reivid icación 5, en donde el microorganismo es seleccionado del grupo que consiste de Listeria, E. coli enterohemorrágica, Salmonella y Campylobacter. 14. Un método para detectar la presencia de Listeria, E. coli enterohemorrágica, Salmonella o Campylobacter en una muestra de prueba, que comprende: . (a) contactar una muestra de prueba con una composición que comprende medio de enriquecimiento general y al menos un químico orgánico modificador de estructura, formando con ello una mezcla; (b) incubar la mezcla durante un tiempo suficiente para permitir que se desarrollen niveles detectables de microorganismos, y (c) detectar la presencia de microorganismos específicos en la mezcla, en donde un resultado de detección positivo indica la presencia de Listeria, E. coli enterohemorrágíca, Salmonella o Campylobacter en la muestra de prueba. 1 5. El método de acuerdo con la reivindicación 14, que comprende además contactar la mezcla con un detergente, en donde dicho contacto expone además epitopes antigénicos antes de la detección. 16. El método de acuerdo con la reivindicación 1 5, que comprende además calentar la combinación de la mezcla y detergente antes de la detección . 17. El método de acuerdo con la reivindicación 1 5 o 1 6, en donde el detergente es un detergente aniónico. 1 8. El método de acuerdo con la reivindicación 16, en donde el detergente es seleccionado del grupo que consiste de dodecil sulfato de sodio y deoxicolato de sodio. 1 9. El método de acuerdo con la reivindicación 1 5 o 16, en donde el detergente es un detergente no iónico. 20. El método de acuerdo con la reivindicación 1 9 , en donde el detergente es seleccionado del grupo que consiste de N P-40, tergitol y tritón X- 1 00. 21 . El método de acuerdo con la reivindicación 1 6, en donde el calentamiento es realizado a aproximadamente 40°C hasta aproximadamente 1 21 °C durante un tiempo suficiente para exponer adicionalmente epitopes antigénicos. 22. El método de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la detección oucrre mediante un inmunoensayo. 23. El método de acuerdo con la reivindicación 22, en donde el inmunoensayo es seleccionado del grupo que consiste de un ensayo de inmunoprecipitado visual, un inmunoensayo enlazado a enzima, quimioluminiscencia e inmunoblotting . 24. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde el inmunoensayo es un ensayo de inm unoprecipitado visual . 25. El método de acuerdo con la reivindicación 23, en donde la detección utiliza un anticuerpo monoclonal complementario, anticuerpo policlonal o un fragmento de anticuerpo, y en donde dicho anticuerpo o fragmento de anticuerpo es específico para un epitope de pared celular altamente conservado. 26. Un método para detectar un microorganismo en una muestra de prueba, que comprende contactar una muestra de prueba conteniendo un microorganismo con un dispositivo de detección basado en inmunoafinidad, en donde dicha muestra de prueba ha sido propagada previamente en la presencia de un químico orgánico modificador de estructura . 27. Un método para propagar un microoganismo, de manera que los epitopes de antígenos de pared celular del microorganismo son alterados, comprendiendo contactar una muestra de prueba con una com posición que comprende medio de enriquecimiento general y al menos un químico orgánico modificador de estructura y propagar el microorganismo en el mismo. 28. Un método para detectar epitopes específicos de microorganismos en un microorganismo objetivo en una muestra de prueba , que comprende: (a) propagar un microorganismo en una muestra de prueba en un medio de enriquecimiento general permisivo, en donde dicho medio comprende un qu ímico orgánico modificador de estructura , y (b) contactar la muestra de prueba con un anticuerpo específico de microorganismo enlazado a un reactivo de detección, en donde la reacción con el anticuerpo indica la presencia del microorganismo. 29. El método de acuerdo con la reivindicación 28, en donde el contacto entre la muestra de prueba y el anticuerpo ocurre en el sistema de ensayo o dispositivo. 30. El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el sistema de ensayo es seleccionado del grupo de un ensayo de inmunoprecipitado visual, un inmunoensayo enlazado a enzima, químioluminiscencia e inmunoblotting . 31 . El método de acuerdo con la reivindicación 29, en donde el dispositivo de ensayo es un dispositivo de detección de flujo lateral. 32. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 28-31 , en donde el anticuerpo es específico para un microorganismo seleccionado del g rupo que consiste de Salmonella, E. coli enterohemorrág ica, Listeria y Campylobacter. 33. Un dispositivo de flujo lateral para detectar un microorganismo objetivo en una muestra, que comprende un anticuerpo específico de microorganismo y una muestra de prueba previamente propagada en un medio de enriquecimiento general, comprendiendo dicho medio al menos un químico orgánico modificador de estructura, reconociendo el anticuerpo ligandos específicos y conservados expuestos por el químico orgánico modificador de estructura. 34. El dispositivo de la reivindicación 33, en donde el anticuerpo es específico para Salmonella. 35. El dispositivo de la reivindicación 33, en donde el anticuerpo es específico para E. coli enterohemorrágica. 36. El dispositivo de la reivindicación 33, en donde el anticuerpo es específico para Listeria. 37. El dispositivo de la reivindicación 33, en donde el anticuerpo es específico para Campylobacter. 38. El método de cualquiera de las reivindicacio nes 5, 1 4, 26 y 28, en donde dicha muestra de prueba es seleccionada del grupo que consiste de un producto alimenticio, agua, una muestra ambiental, una muestra biológica, un espécimen humano y una muestra veterinaria .