MXPA01000096A - Tratamiento de trastornos hiperproliferativos - Google Patents

Abstract

Se describe un método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que necesita dicho tratamiento, que comprende la administración a dicho sujeto, en combinación, una cantidad efectiva de tratamiento de:un retinoide generador de ceramida como fenretinida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo;y por lo menos un inhibidor de degradación de ceramida - y en ciertas modalidades por lo menos dos -, como los compuestos seleccionados del grupo que consiste en inhibidores de síntesis de glucosilceramida, inhibidores de síntesis de esfingosina-1- fosfato, y inhibidores de proteína cinasa C;un inhibidor de síntesis de glucosilceramida que se prefiere es 1-fenil-2-palmitoilamina-3-morfolino-1-propanol;un inhibidor de síntesis de esfingosina- 1-fosfato que se prefiere es D-eritro-N,N-dimetilesfingosina;un inhibidor de proteína cinasa C que se prefiere es L-treo-dihidroesfingosina.

Description

TRATAMIENTO DE TRASTORNOS HIPERPROLIFI?RATIVOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a regímenes de quimioterapia de combinación para el tratamiento de trastornos hiperproliferativos, y formulaciones útiles para llevar a cabo los mismos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Se piensa actualmente que la fenretinida [HPR; N-(4-hidroxifenil)retinamida toda trans; número de registro de CAS 65646-68-6] efectúa citotoxicidad en células cancerosas generando especies de oxígeno reactivas. Véase, por ejemplo, D. Delia et al., Carcinogenesis 18, 943-948 (1997); N. Oridate et al., J. Nati. Cáncer Inst. 89, 1191-1198 (1997). La patente de E.U.A. No. 4,665,0 8 a Gibbs describe composiciones farmacéuticas de fenretinida como útiles para el tratamiento de cáncer de mama y vejiga. La patente de E.U.A. No. 5,821 ,072 a Schwartz et al., provee métodos para seleccionar inhibidores de proteína cinasa C capaces de potenciar la apoptosis en células tumorales, junto con métodos para seleccionar agentes terapéuticos antitumorales adecuados para terapia de combinación con un inhibidor de proteína cinasa C capaz de potenciar la apoptosis en células tumorales.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se basa en el descubrimiento inesperado de que la fenretinida a dosis apropiadas genera ceramida incrementada y sostenida en líneas de células cancerosas humanas. De esta manera, la actividad citostática o citotóxica contra trastornos hiperproliferativos (incluyendo trastornos hiperproliferativos neoplásicos y no neoplásicos como se define más adelante) de la fenretinida y otros derivados de ácido retinoico que generan ceramida, se puede incrementar administrando un agente que manipule el metabolismo celular y control celular de la citotoxicidad generada por ceramida (por ejemplo, un inhibidor de la degradación de ceramida). Dichos agentes incluyen, pero no están limitados a, inhibidores de glucosilceramida sintasa, inhibidores de la síntesis de esfingosin i-1 -fosfato, e inhibidores de proteína cinasa C, los cuales se pueden administrar solos o en combinación con algún otro. Ejemplos específicos se dan a continuación. De preferencia, el derivado de ácido retinoico se administra en una cantidad efectiva para producir necrosis, apoptosis o ambas en la célula tumoral, y el inhibidor de la degradación de ceramida se administra en una cantidad efectiva para incrementar la necrosis, apoptosis o ambas producidas en la célula tumoral sobre la que sería producida por el derivado de ácido retinoico *&&« solo, o aquella que se espera sea producida por la suma de aquella producida por el derivado de ácido retinoico y el inhibidor de la degradación de ceramida cuando se administran por separado (esto incluye la situación en donde la combinación de ambos compuestos produce una actividad eficaz a cantidades de los compuestos que no producen actividad cuando se administran por separado). Un método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que necesita de dicho tratamiento comprende administrar al sujeto, en combinación, una cantidad efectiva de tratamiento de: a) un derivado de ácido retinoico que genere ceramida tal como fenretinida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y b) un inhibidor de la síntesis de glucosilceramida (incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables del mismo), tal como 1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1 -propanol, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El inhibidor ele la síntesis de glucosilceramida se administra en una cantidad efectiva para incrementar la actividad del derivado de ácido retinoico, de modo que los dos compuestos ¿n conjunto tengan una actividad eficaz. De preferencia, el derivado de ácido retinoico se administra en una cantidad efectiva para producir necrosis, apoptosis, o ambas en una célula tumoral, y el inhibidor de la síntesis de glucosilceramida se administra en una cantidad efectiva para incrementar la necrosis, apoptosis o ambas producidas en la célula tumoral sobre aquella que sería producida por el derivado de ácido retinoico solo, o la que se espera sea producida por la suma de aquella producida del derivado de ácido --lÍi----i----^---f-Éfe- retinoico y el inhibidor de la síntesis de glucosilceramida cuando se administran por separado. También se pueden administrar otros compuestos aparte de los compuestos descritos en la presente. También descrito es un método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar al sujeto, en combinación, una cantidad efectiva de tratamiento de: a) un derivado de ácido retinoico que genere ceramida tal como fenretinida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y b) un inhibidor de la síntesis de esfingosina-1 -fosfato tal como D-eritro-N,N-dimetilesfingosina, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El inhibidor de la síntesis de esfingosina-1 -fosfato se administra en una cantidad efectiva para incrementar la actividad del derivado de ácido retinoico, de modo que los dos compuestos en conjunto tengan una actividad eficaz. De preferencia, el derivado de ácido retinoico se administra en una cantidad efectiva para producir necrosis, apoptosis o ambas en la célula tumoral, y el inhibidor de la síntesis de esfingosina-1 -fosfato se administra en una cantidad efectiva para incrementar la necrosis, apoptosis, o ambas producidas en la célula tumoral sobre la que sería producida por el derivado de ácido retinoico solo, o la que se espera sea producida por la suma de aquella producida por el derivado de ácido retinoico y el inhibidor de la síntesis de esfingosina-1-fosfato cuando se administran por separado. También descrito es un método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que necesita de dicho tratamiento, el método comprendiendo administrar al sujeto, en combinación, una cantidad efectiva de tratamiento de: a) un derivado de ácido retinoico que genere ceramida tal como fenretinida, o una sal farmacéuticamente aceptable clel mismo; y b) un inhibidor de proteína cinasa C tal como L-treo-dihidroesfingosina o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. El inhibidor de proteína cinasa C se administra en una cantidad efectiva para incrementar la actividad del derivado de ácido retinoico, de modo de que los dos compuestos en conjunto tengan una actividad eficaz. De preferencia, el derivado de ácido retinoico se administra en una cantidad efectiva para producir necrosis, apoptosis o ambas en la célula tumoral, y el inhibidor de proteína cinasa C se administra en una cantidad efectiva para incrementar la necrosis, apoptosis o ambas producidas en la célula tumoral sobre aquella que sería producida por el derivado de ácido retinoico solo, o la que se espera sea producida por la suma de aquella producida por el derivado de ácido retinoico y el inhibidor de proteína cinasa C cuando se administran por separado. También descrito es un método para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto que necesita de dicho tratamiento, el cual comprende administrar en dicho sujeto, en combinación, una cantidad efectiva de tratamiento de: a) un retinoide generador de ceramida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo; y b) por lo menos dos (por ejemplo, 2 ó 3) compuestos seleccionados del grupo que consiste de i) inhibidores de la síntesis de glucosilceramida, ¡i) inhibidores de la síntesis de esfingosina-1-fosfato, y iii) inhibidores de proteína cinasa C. Los compuestos, por lo menos . . -_>_-*»----. dos, se administran en una cantidad efectiva para incrementar la actividad del retinoide, de modo que los compuestos en conjunto tengan una actividad eficaz. Los compuestos, por lo menos dos, pueden ser de la misma categoría o de una categoría distinta. En una modalidad, los compuestos, por lo menos dos, comprenden un inhibidor de la síntesis de glucosilceramida y un inhibidor de la síntesis de esf ingosina-1 -fosfato. En otra modalidad, los compuestos, por lo menos dos, comprenden un inhibidor de la síntesis de glucosilceramida y un inhibidor de proteína cinasa C. En otra modalidad, los compuestos, por lo menos dos, comprenden un inhibidor de la síntesis de esfingosina-1 -fosfato y un inhibidor de proteína cinasa C. En otra modalidad, los compuestos, por lo menos dos, comprenden un inhibidor de la síntesis de glucosilceramida, un inhibidor de la síntesis de esfingosina-1 -fosfato y un inhibidor de proteína cinasa C. De preferencia, el derivado de ácido retinoico se administra en una cantidad efectiva para producir necrosis, apoptosis o ambas en la célula tumoral, y los otros compuestos, por lo menos dos, se administran en una cantidad efectiva para incrementar la necrosis, apoptosis o ambas producidas en la célula tumoral sobre aquella que sería producida por el derivado de ácido retinoico solo, o la que se espera sea producida por la suma de aquella producida por el derivado de ácido retinoico y los otros compuestos, por lo menos dos, cuando se administran por separado. Formulaciones que comprendan las combinaciones de compuestos mencionadas anteriormente en un vehículo farmacéutico ------i----- individual para llevar a cabo los tratamientos anteriores, son también un aspecto de la presente invención. El uso de los compuestos anteriores para la preparación de un medicamento para llevar a cabo los tratamientos mencionados anteriormente, es también un aspecto de la presente invención. Lo anterior y otros objetivos y aspectos de la presente invención se explican en detalle en los dibujos de la presente y la especificación descrita a continuación.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ilustra esquemáticamente ceramida y vías de promuerte relacionadas. La figura 2 ilustra esquemáticamente vías metabólicas de ceramida. La figura 3 ilustra el efecto de fenretinida (HPR o H marcada) a µM sobre la generación de ceramida en la línea de células de neuroblastoma SMS-LHN sensible a fármacos (círculos oscuros) y sobre el agente de alquilación y líneas de células de neuroblastoma CHLA-90 tratadas con etopósido (círculos claros). La figura 4 ilustra el efecto de varias combinaciones de fenretinida (HPR; H), L-treo-dihidroesfingosina (safingol; S), un inhibidor de proteína cinasa C y 1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1 -propanol (PPMP; P), un inhibidor de la glucosilceramida sintasa, sobre la supervivencia de células en una línea de células altamente resistente a HPR (SK-N-RA), a concentraciones variables. Los círculos oscuros representan la combinación de safingol y ppmp; los círculos claros representan la combinación de 5 fenretinida y safingol; los triángulos oscuros representan la combinación de fenretinida y ppmp; los triángulos claros representan la combinación de fenretinida, safingol y ppmp. Las dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. La figura 5 ilustra el efecto de varias combinaciones de compuestos con dosificaciones que varían como se indica, pero a una dosis fijada de fenretinida a 10 µM, sobre la supervivencia de células SK-N-RA. T o Tamoxifeno se refiere a citrato de tamoxifeno. H+P marcados con círculos oscuros representan fenretinida más ppmp; H+T marcados con círculos claros representan fenretinida más tamoxifeno; H+S marcados con círculos oscuros representan fenretinida más safingol; H+S+T marcados con círculos claros representan fenretinida más safingol y tamoxifeno (1 :1 ); los triángulos oscuros representan fenretinida más tamoxifeno fijado a 3 µM más safingol. Otras dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. La figura 6 muestra la actividad de fenretinida a baja dosificación en combinación con otros compuestos sobre la fracción de supervivencia de células SK-N-RA. Los círculos oscuros representan fenretinida a 3.3 µM más safingol; los círculos claros representan fenretinida a 3.3 µM más PPMP; los triángulos oscuros representan PPMP más safingol (1 :1 ) sin fenretinida; los -**"-' ~~-¿— - triángulos claros representan fenretinida a 3.3 µM más PPMP más safingol (1 :1 ). Otras dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. La figura 7 muestra el efecto de varias combinaciones de fármacos sobre la fracción de supervivencia de células SK-N-RA. N-DMS (o N) se refiere a d-eritro-N,N-dimetilesfingosina, un inhibidor de esfingosina cinasa. Los círculos oscuros representan N-DMS más ppmp; los círculos claros representan fenretinida más ppmp; los triángulos oscuros representan fenretinida más N-DMS; los triángulos claros representan fenretinida más N-DMS más ppmp. Las dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. La figura 8 ilustra la actividad de varias combinaciones de fármacos sobre la supervivencia de células SK-N-RA. HPR marcada con círculos oscuros representa fenretinida; N-DMS marcados con círculos claros representan N-DMS; los triángulos oscuros representan HPR más N-DMS; H+N a 10 µM marcadas con círculos oscuros representan una dosis fijada de fenretinida a 10 µM más N-DMS; H+P+N a 5 µM marcados con círculos claros represent< n una dosis fijada de fenretinida a 5 µM más una dosis fijada de ppmp a 5 µM más N-DMS. La línea continua representa fenretinida más ppmp. Las dosificaciones se fijan en donde así se indica; de otra manera, las dosificaciones son como se muestra en el eje horizontal. La figura 9 ilustra la actividad de combinaciones de fármacos sobre la supervivencia de células SK-N-RA. Los círculos oscuros representan fenretinida; los círculos claros representan fenretinida más N-DMS (3:1 ); los triángulos oscuros representan fenretinida más safingol (3:1 ); los triángulos -----ÉI-tÉHl claros representan fenretinida más N-DMS más safingol (3:1 :1 ). Las dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. La figura 10 ilustra células CHLA-90 tratadas con HPR (fenretinida) y safingol, en donde el safingol fue arrastrado a varios intervalos y reemplazado por medio preequilibrado únicamente para HPR en el tiempo indicado. La figura 11 ilustra células sk-N-RA tratadas con HPR y safingol, en donde el safingol fue arrastrado a varios intervalos y reemplazado por medio preequilibrado únicamente para HPR en el tiempo indicado. La figura 12 ilustra células de cáncer pulmonar A549 tratadas con HPR y safingol, en donde el safingol fue arrastrado a varios intervalos y reemplazado por medio preequilibrado únicamente para HPR en el tiempo indicado. La figura 13 ¡lustra células CHLA-90 tratadas con safingol y ácido retinoico todo trans (ATRA), o safingol y ácido 13-cis-retinoico. La figur a 14 ilustra células LAN-6 tratadas con safingol y ácido retinoico todo trans (ATRA), o safingol y ácido 13-cis-retinoico. La figura 15 ilustra que la conversión de ceramida en glucosilceramida no tóxica disminuye la citotoxicidad de HPR y HPR+safingol. Nótese que HPR+safingol están a una relación molar de 3:1 (por ejemplo, HPR a 9 µM + safingol a 3 µM). La figura 16 muestra que la citotoxicidad de HPR fue reducida significativamente por la enzima pancaspasa BOC-d-fmk. ------------------------------------ afa - * • La figura 17 muestra que el pretratamiento con BOC-d-fmk previo a exposición a HPR redujo significativamente los cambios nucleares morfológicos indicativos de apoptosis. La figura 18 muestra que a 24 horas, BOC-d-fmk suprimió la subfragmentación de ADN de Go/G-i inducida por HPR. La figura 19 muestra que el pretratamiento con BOC-d-fmk previo a exposición a HPR o HPR+safingol redujo cambios morfológicos indicativos de apoptosis, pero que la evidencia morfológica de necrosis inducida por la combinación de HPR+safingol fue afectada mínimamente por BOC-d-fmk.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS Los métodos de la presente invención utilizan los efectos combinados de los derivados de ácido retinoico y un agente (es decir, un agente de potenciación) que µermite manipular el metabolismo celular y el control celular de la toxicidad generada por ceramida, para inhibir o prevenir el crecimiento de tumores, cánceres, tejido neoplásico y otros trastornos hiperproliferativos premalignos y no neoplásicos, todos los cuales son referidos en conjunto en la presente como trastornos hiperproliferativos o hiperplásicos. Los tratamientos utilizados en la presente se pueden usar para inhibir el crecimiento y/o para reducir la citotoxicidad (mediante mecanismos necróticos o apoptóticos, o ambos) en las células objetivo, las cuales son generalmente células hiperproliferativas (incluyendo tumores, cánceres y tejido neoplásico, junto con trastornos hiperproliferativos premalignos y no neoplásicos o no malignos). Ejemplos de tumores, cánceres y tejido neoplásico que pueden ser tratados mediante la presente invención incluyen, pero no están limitados a, trastornos malignos tales como cánceres de mama; osteosarcomas; angiosarcomas; fibrosarcomas y otros sarcomas; leucemias; linfomas; tumores del seno; cánceres de ovario, uretra, vejiga, próstata y otros cánceres genitourinarios; cánceres del colon, esófago y estómago, y otros cánceres gastrointestinales; cánceres pulmonares; mielomas; cánceres pancreáticos; cánceres del hígado; cánceres del riñon; cánceres endocrinos; cánceres de la piel; y tumores cerebrales o del sistema nervioso central (SNC) y periférico malignos o benignos, incluyendo gliomas y neuroblastomas. Ejemplos de trastornos hiperproliferativos premalignos y no neoplásicos o no malignos incluyen, pero no están limitados a, trastornos mielodisplásicos; carcinoma cervical in ritu; poliposis intestina familiar tal como síndrome de Gardner; leucoplaquias orales; histiocitosis; queloides; hemangiomas; estenosis arterial hiperproliferativa; artritis inflamatoria; hiperqueratosis y erupciones papuloescamosas incluyendo artritis. Incluidas también son las enfermedades hiperproliferativas inducidas por virus tales como verrugas y enfermedad inducida por EBV (es decir, mononucleosis infecciosa), formación de cicatriz, y similares. Los métodos de tratamiento descritos en la presente se pueden utilizar con cualquier sujeto que se sabe o se sospecha posee o está en riesgo de desarrollar un trastorno hiperproliferativo como se define en la presente. Como se usa en la presente, el "tratamiento" de un trastorno hiperproliferativo se refiere a métodos para destruir, inhibir o retardar el 5 crecimiento o el aumento de tamaño de un cuerpo o población de células hiperproliferativas o crecimiento tumoral o canceroso, reduciendo el número de células hiperproliferativas, o previniendo su difusión hacia otros sitios anatómicos, así como también reduciendo el tamaño de un crecimiento hiperproliferativo o el número de células hiperproliferativas. Como se usa en la 10 presente, "tratamiento" no necesariamente significa que implica curación o supresión completa de los desarrollos hiperproliferativos. Como se usa en la presente, una cantidad efectiva de tratamiento es una cantidad efectiva para dar como resultado la destrucción, retraso de la velocidad de crecimiento de las células hiperproliferativas, disminución de tamaño de un cuerpo de células 15 hiperproliferativas, y/o la reducción en el número de células hiperproliferativas. El agente o los agentes de potenciación se incluyen r n una cantidad suficiente para incrementar la actividad del primer compuesto, de modo que los dos (o más) compuestos tienen en conjunto mayor eficacia terapéutica que los compuestos individuales administrados solos (por ejemplo, debido a 20 interacción sinergística; toxicidad combinada reducida, etc.). Como se usa en la presente, la administración de dos o más compuestos "en combinación" significa que los dos compuestos se administran poco tiempo después uno del otro o los otros, de modo que la -^?-u~at- --------ri-a presencia de uno altera los efectos biológicos del otro o los otros. Los dos compuestos se pueden administrar simultáneamente (concurrentemente) o secuencialmente. La administración simultánea se puede llevar a cabo mezclando los compuestos antes de la administración, o administrando los 5 compuestos en el mismo punto de tiempo, pero en diferentes sitios anatómicos o usando diferentes vías de administración. Las frases "administración concurrente", "administración en combinación", "administración simultánea" o "administrados simultáneamente", . como se usan en la presente, significa que los compuestos son administrados 10 en el mismo punto de tiempo, o inmediatamente uno después del otro. En el último caso, los dos compuestos se administran a tiempos suficientemente próximos de modo que los resultados observados son indistinguibles de los logrados cuando los compuestos se administran en el mismo punto de tiempo. Los sujetos que serán tratados mediante los métodos de la 15 presente invención incluyen sujetos humanos y sujetos animales para propósitos veterinarios. Los sujetos animales son de preferencia sujetos mamíferos que incluyen caballos, vacas, perros, gatos, conejos, ovejas, y similares. Se conoce una variedad de moléculas ¡ntracelulares que 20 desencadenan o inhiben la muerte celular (S. Rowan y D. Fisher, Leukemia 11 , 457 (1997); K. Saini y N. Walker, Mol. Cell Biochem. 178, 9 (1998)). La mayoría de las investigaciones actuales se han enfocado en elucidar las vías de la muerte celular programada (apoptosis), en la cual el desencadenamiento -----£----<-------! ------------------------------- de apoptosis (tal como daño del ADN) puede activar varias vías (por ejemplo, p53, Fas y otras), las cuales pueden ser moduladas por todavía otras moléculas (tales como la familia Bcl-2 de proteínas pro- y anti-apoptóticas), en cuyo caso la activación de la caspasa es un paso tardío en los eventos finales que conducen a la muerte celular apoptótica. Sin embargo, no toda la muerte celular ocurre mediante apoptosis, y la muerte celular inducida por 4-HPR implica apoptosis y necrosis (J. Clifford et al., Cáncer Res. 59, 14 (1999)). Se sabe que la ceramida lipídica intracelular media la apoptosis (L. Obeid et al., Science 259, 1769 (1993) (figura 1 ) y necrosis (Guo et al., Am. J. Physiol. 276, F390 (1999); Condorelli et al., Br. J. Pharmacol. 137, 75 (1999)). Se ha mostrado que causa la transición de permeabilidad de las membranas mitocondriales que induce apoptosis (S. Susin et al., J. Exp. Med. 186, 25 (1997)), causan generación de ROS mediante inhibición del complejo mitocondrial lll que induce apoptosis (A. Quillet-Mary et al., J. Biol. Chem. 272, 21388 (1997) y activa la vía de JNK/SAPK de pro-muerte (S. Basu et al., Oncogene 17, 3277 (1998); T. Okazaki et al., Cell. Signal. 10, 685 (1998)- W. Jarvis, Curr. Opin. Oncol. 10, 552 (1998)). La ceramida activa también a una proteína cinasa (CAPK) (S. Mathias et al., Biochem. J. 335 (parte 3), 465 (1998) y una fosforilasa (PP2A) (L. Leoni et al., Biochem. Pharmacol. 55, 1105 (1998)), y puede conducir a la activación del factor de transcripción nuclear, NF-kappaB (L. Johns et al., J. Immunol. 152, 5877 (1998); C. Gamard et al., J. Biol. Chem. 272, 1682 (1997)). Los mecanismos mediante los cuales las células cancerosas evitan los efectos citotóxicos de la ceramida, pueden incluir metabolismo hacia otras formas, incluyendo glucosilceramida no tóxica (Y. Lavie et al., J. Biol. Chem. 272, 1682 (1997); Y. Lavie et al., J. Biol. Chem. 271 , 19530 (1996); L. Yong-Yu et al., J. Biol. Chem. 274, 1140 (1999)) y esfingosina-1 -fosfato. La esfingosina-1 -fosfato se opone a la muerte celular inducida por ceramida activando la vía de ERK1/2 de pro-vida (O. Cuvillier et al., Nature 381 , 800 (1996); O. Cuvillier et al., J. Biol. Chem. 273, 2910 (1998)). De esta manera, la modulación del metabolismo de ceramida ofrece medios para mejorar la eficacia citotóxica de 4-HPR (fenretinida) y otros retinoides que generan ceramida. Algunas de las vías metabólicas clave que intervienen en la síntesis y el metabolismo de ceramida, se muestran en la figura 2 (Y. Hannum, Science 274, 1855 (1996). La ceramida es generada intracelularmente mediante la activación de (1 ) ceramida sintasa, la vía de síntesis de novo o mediante activación de las (2) esfingomielinasas neutras o acidas, que conduce a la degradación de la esfingomielina. La ceramida es metabolizada hasta (3) glucosilceramida no tóxica por la glucosilceramida sintasa; y convertida en (4) esfingosina citotóxica por las ceramidasas alcalinas o acidas. La esfingosina es convertida además hasta la (5) esfingosina-1 -fosfato antiapoptótica por la esfingosina cinasa. Se muestra a continuación que la modulación de estas vías puede incrementar, incluso incrementar sinergísticamente, la citotoxicidad de los retinoides que generan ceramida, tales como 4-HPR (fenretinida).

Los compuestos que se pueden usar para llevar a cabo la presente invención, y las formulaciones de los mismos y la forma de administrar los mismos, se describen en detalle a continuación. 1. Retinoides que generan ceramida Retinoides o derivados de ácido retinoico que generan ceramida y que se pueden usar para llevar a cabo la presente invención, son aquellos que generan ceramida en una célula hospedera a la cual son administrados, e incluyen los descritos en la patente de E.U.A. No. 4,190,594 a Gander (las descr pciones de todas las referencias de patente citadas en la presente se incordoran en la misma como referencia). Los retinoides que generan cerapjuda incluyen ácido retinoico todo trans (ATRA) y derivados de ácido retino co que incluyen, pero no están limitados a: (A) esteres de ácido retinoico todo trans que tienen la siguiente fórmu en donde X es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: 2-ciclohexiletilo; 10-carbometoxidecilo; 4-hidroxibutilo; colesterilo; m- y p-vinilbencilo mixtos; y 4-bromobencilo; (B) esteres de ácido retinoico todo trans que tienen la siguiente fórmula: en donde Y es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: colesteriloxi; fenilo; 4-bromofenilo; 4-metoxifenilo; 4-nitrofenilo; 4-hidroxifenilo; 4-metilfenilo; 4-cianofenilo; 4-etoxifenilo; 4-acetoxifenilo; 2-naftilo; 4-bifenilo; 2,5-dimetoxifenilo; 2,4-diclorofenilo; 2,4-dimetilfenilo; 3,4-diacetoxifenilo; 3,4,5-trimetoxifenilo; y 2,4,6-trimetilfenilo; y (C) amidas de ácido retinoico todo trans que tienen la siguiente fórmula: en donde Z es un miembro seleccionado del grupo que consiste de: n-propilamino; ter-butilamino; 1 ,1 ,3,3-tetrametilbutilamino; 1 -morfolino; 4-hidroxifenilamino; 4-carbometoxi-2-hidroxifenilamino; beta-(3,4-dimetoxifenil)- etilamino; 2-benzotiazolilamino; 1 -imidazolilo; 1-(2-nicotinoilhidrazolilo); 1- benzotriazolilo; y 1 -(1 ,2,4-triazolilo); Particularmente preferida es la N-(4-hidroxifenil)retinamida toda 10 trans, denominada también fenretinida, la cual tiene el número de registro de CAS 65646-68-6, y tiene la estructura: Los compuestos anteriores se pueden preparar de conformidad con técnicas conocidas (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,190,594 a Gander et al. y la patente de E.U.A. No. 4,665,098 a Gibbs. Otros derivados de ácido retinoico que se pueden usar para 20 llevar a cabo la presente invención incluyen análogos de C-glucósido de N-(4- hidroxifenil)retinamida-0-glucurónido. Dichos compuestos y su preparación son conocidos y se describen en las patentes de E.U.A. Nos. 5,663,377 y 5,599,953 a Curley et al., cuyas descripciones se incorporan en su totalidad --t--iÍ--li--tt-----M-h ---------á--f-t?-M¡-----l- en la presente como referencia. Dichos compuestos pueden tener la fórmula general: en donde R es COOH, CH2OH o H, y n es 0 ó 1. Ejemplos específicos de dichos compuestos incluyen: 4- (retinamido)fenil-C-glucurónido; 4-(retinamido)fenil-C-glucósido; 4- 10 (retinamido)fenil-C-xilósido; 4-(retinamido)bencil-C-glucurónido; 4- (retinamido)bencil-C-glucósido; 4-(retinamido)bencil-C-xilósido; 1 -(ß-D- glucopiranosil) retinamida; y 1-(D-glucopiranosiluronosil)retinamida. 2. Inhibidores de la síntesis de qlucosilceramida 15 Se puede usar cualquier compuesto que inhiba la síntesis de glucosilceramida, particularmente inhibidores de glucosilceramida sintasa.

Ejemplos de dichos compuestos incluyen, pero no están limitados a, compuestos que tienen la fórmula: •*• - *- »' en donde R es un anillo aromático tal como fenilo, un grupo ciciohexilo, o un grupo alifático que tiene de 10 a 15 átomos de carbono, Ri es un grupo amina tal como un grupo morfolino; y n es un entero de 4 a 18 (incluyendo homólogos funcionales, isómeros y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos). De preferencia, n es 4, 6, 8 10, 12 ó 14, y se prefiere el enantiómero D de dichos compuestos. Dichos compuestos son conocidos y se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A. No. 5,302,609 a Shayman y Radin, patente de E.U.A. No. 5,041 ,441 a Radin et al.; y patente de E.U.A. No. 5,707,649 a Inokuchi et al. Ejemplos específicos de inhibidores de glucosilceramida sintasa incluyen: 1-fenil-2-acilamino-3-morfolino-1 -propanol, en donde n es de 6 a 12; 1 -fenil-2-decanoilamino-3-morfolino-1 -propanol (PDMP); 1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1 -propanol (PPMP); y tamoxifeno, incluyendo citrato de tamoxifeno. 3. Inhibidores de la síntesis de esfinqosina-1 -fosfato Cualquier inhibidor de la síntesis de esfingosina-1 -fosfato se puede usar para llevar a cabo la presente invención, prefiriéndose actualmente inhibidores de esfingosina cinasa tales como D-eritro-N,N-dimetilesfingosina. Se conocen otros inhibidores de esfingosina cinasa. Por ejemplo, el compuesto puede ser el inhibidor de esfingosina cinasa F12509A de Sankyo Co. (o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo), descrito en la solicitud de patente japonesa 9176083 (1997), y que tiene la estructura: 4. Inhibidores de proteína cinasa C Ejemplos de inhibidores de proteína cinasa C incluye aquellos descritos en la patente de E.U.A. No. 4,816,450 a Bell et al. Dichos compuestos incluyen aquellos que tienen la fórmula general: Q-X-Y-CH-CH2— O-Z NR^ en donde Q es CH3-(CH2)n- o CH3-(CH2)m-CH=CH-(CH2)p-, en donde n es de 2 a 30, m es de 1 a 15 y p es de 1 a 15; en donde X es -CH2-CH2- o -CH=CH-, o sustituido por uno o más halógenos o grupos alquilo de CrC3; en donde Y es -C(-OH)H-, -C(=0)-, -C(-SH)H-, -CH2- o C(-W)H-; en donde W es halógeno (el término "halógeno", como se usa en la presente, se refiere a flúor, cloro, bromo, yodo, etc.); en donde R-i y R2 son ¡guales o diferentes, y se seleccionan de hidrógeno, grupos alquilo inferior que tienen de 1 a 7 átomos de carbono, aralquilo y grupos arilo; y en donde Z se selecciona del grupo que consiste de fosfato, H, 5 galactosilo, sulfogalactosilo, glucosilo, lactosilo, trihexosilo, fosforilcolina, GalNAc-Gal-Glc, Gal-Gal-Glc, Sia-Gal-Glc, Gal— Gal— NAc Gal— NAc I y I Sia— Gal— Glo — Sia— Gal— Glc — Se prefieren la dihidroesfingosina y los isómeros D, L o DL-treo- dihidroesfingosina. Más preferida es la L-treo-dihidroesfingosina, conocida también como (2S,3S)-2-amino-1 ,3-octadecanodiol o safingol. Estos compuestos se pueden preparar como emulsiones para administración como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,677,341 a Lyons. 15 Nótese que no todos los inhibidores de proteína cinasa C son necesariamente activos, deperdiendo de los subtipos de PKC específicos que son inhibidos de esta manera. El derivado de estaurosporina UCN01 no es activo en la presente invención, indicando que el inhibidor debe inhibir subtipos no inhibidos por este compuesto, o debe inhibirlos a un mayor grado que UCN01. Se piensa actualmente que el inhibidor de PKC se debe seleccionar de modo que la proteína cinasa C zeta sea inhibida de esta manera. ^^^^j No se excluye que el safingol realice funciones que contribuyan a la función de la presente invención que sea distinta de la inhibición de PKC. Por lo tanto, el safingol y otros compuestos que llevan a cabo esta función, son activos en la presente invención y se incluyen en la presente, sin que los 5 solicitantes se adhieran a alguna teoría subyacente de la invención en particular.

. Otros compuestos activos y su selección Se pueden generar compuestos activos adicionales mediante 10 técnicas conocidas, incluyendo técnicas racionales de diseño de fármaco y/o técnicas aleatorias de diseño de fármaco (o técnicas de química de combinación). En compuestos activos que interactúan con un receptor, la interacción ocurre en los sitios accesibles a la superficie en una molécula 15 tridimensional estable. Disponiendo los residuos críticos del sitio de unión en una conformación apropiada, compuesta s que imiten las características de superficie esenciales de la región de unión al compuesto activo pueden ser diseñados y sintetizados de acuerdo con técnicas conocidas. Una molécula que tenga una región de superficie con esencialmente la misma topología 20 molecular que la superficie de unión del compuesto activo, será capaz de imitar la interacción del compuesto activo con su receptor correspondiente. Métodos para determinar la estructura tridimensional de compuestos activos, y producir análogos activos de los mismos, son conocidos y son referidos como -É-------Í----------I técnicas racionales de diseño de fármaco; véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,593,853 a Chen; patentes de E.U.A. Nos. 5,612,895 y 5,331 ,573 a Balaji et al.; patente de E.U.A. No. 4,833,092 a Geysen; patente de E.U.A. No. 4,859,765 a Néstor; patente de E.U.A. No. 4,853,871 a Pantoliano; y 5 patente de E.U.A. No. 4,863,857 a Blalock (las descripciones de todas las referencias de patente de E.U.A. citadas en la presente se incorporan en la misma como referencia). En técnicas de química de combinación (o diseño aleatorio de fármaco), se seleccionan grandes bancos de combinación de compuestos candidatos para compuestos activos. Los bancos usados para llevar a cabo la presente invención se pueden producir mediante cualquiera de una variedad de métodos de síntesis por escisión. Los métodos de síntesis por escisión en los cuales una marca liberable es fijada a la partícula junto con los compuestos orgánicos de interés, se conocen también como métodos de cosíntesis. Varios de dichos métodos son conocidos. Véase, por ejemplo, A. Furka et al., J. Pept. Protein Res. 37, 487 (1991 ); K -_am et al., Nature 354, 82 (1991); R. Zuckerman et al., Int. J. pept. Protein Res. 40, 498 (1992); F. Sebestyen et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 413 (1993); y K. Lam et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 3, 419 (1993). Por ejemplo, el banco puede ser un banco de compuestos organometálicos en donde el compuesto sea un complejo de metal-ligando. El metal en el complejo puede ser un metal de transición temprano o tardío en estados de oxidación alto, bajo o cero. El metal puede ser también cualquiera de los grupos principales de metales, •«Bi--------------------------------------------^^ metales alcalinos, tierras alcalinas, lantánidos o actínidos. El ligando en el complejo de metal-ligando puede estar formado de, o se puede derivar de, formas quirales o aquirales de ciclopentadienos, aminoésteres, oxazolidinonas, hidroxiácidos, hidroxiésteres, hidroxiamidas, piridinas, piridinas fusionadas, heterociclos de nitrógeno, oxazoles, imidazoles, pirróles, éteres de corona, criptandos, carcerandos, fosfinas, difosfinas, polifosfinas, quinuclidinas, quininas, alcaloides, dextrinas, ciclodextrinas, sálenos, porfirinas, biarilos, sulfonamidas, bases de Schiff, metalocenos, monooles, dioles, polioles, aminas, diaminas, poliaminas, sales de amonio, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. Como segundo ejemplo, el banco puede ser un banco de compuestos de no metales que incluyen, pero no están limitados a, formas quirales o aquirales de ciclopentadienos, aminoésteres, oxazolidinonas, hidroxiácidos, hidroxiésteres, hidroxiamidas, piridinas, piridinas fusionadas, heterociclos de nitrógeno, oxazoles, imidazoles, pirróles, éteres de corona, criptandos, carcerandos, fosfinas, difosfinas, polifosfinas, quinuclidinas, quininas, alcaloides, dextrinas, ciclodextrinas, sálenos, porfirinas, biarilos, sulfonamidas, bases de Schiff, metalocenos, monooles, dioles, polioles, aminas, diaminas, poliaminas, sales de amonio, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos, etc. Los soportes sólidos pueden estar separados entre sí, o pueden ser regiones discretas sobre una porción de superficie de un substrato unitario, cuya porción de superficie puede estar situada en la interfase, de modo que una pluralidad de las regiones discretas esté situada en la interfase. Se conocen dichos soportes sólidos "tipo chip" o "tipo pasador". Véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,288,514 a Ellman (soporte basado en pasadores); y la patente de E.U.A. No. 5,510,270 a Fodor et al. (soporte basado en chips). Se prefieren actualmente soportes discretos separados (por ejemplo, partículas o perlas). La síntesis de el banco de catalizadores y la unión de los mismos al soporte sólido discreto, se puede llevar a cabo de acuerdo con técnicas conocidas, tal como se describe en la patente de E.U.A. No. 5,565,324 (cuya descripción se incorpora en su totalidad en la presente como referencia), o variaciones de las mismas que serán evidentes para los expertos en la técnica. Los compuestos seleccionados mediante cualquier medio que incluya, pero no esté limitado a los descritos anteriormente, se pueden seleccionar para actividad creciente, ¡ncluyendo aumentando aditivamente y sinergísticamente, pero de preferencia aumentando sinergísticamente, la actividad citostática o citotóxica de un retinoide generador de ceramid-a en células tumorales (u otras células hiperproliferativas), mediante un método que comprende: (a) poner en contacto primeras células tumorales control con una cantidad de retinoide generador de ceramida (por ejemplo, una cantidad que puede o no ser efectiva para inhibir el crecimiento de dichas células tumorales); (b) poner en contacto segundas células tumorales control con una cantidad de un compuesto de prueba (por ejemplo, una cantidad que puede o no ser efectiva para inhibir el crecimiento de dichas células tumorales); y 5 (c) poner en contacto células tumorales experimentales con dicha cantidad de retinoide generador de ceramida en el paso (a) anterior y dicha cantidad de un compuesto de prueba en el paso (b) anterior; (d) determinar la inhibición del crecimiento de dichas células tumorales de los pasos (a), (b) y (c); y entonces 10 (e) comparar la inhibición del crecimiento o la actividad citotóxica en las células tumorales experimentales del paso (c) con la inhibición del crecimiento de las células tumorales control de los pasos (a) y (b), un mayor grado de inhibición del crecimiento determinado en las células tumorales experimentales del paso (c) que la inhibición del crecimiento combinada de las células tumorales control de los pasos (b) y (c) que indique que el compuesto de prueba incrementa la actividad del retinoide generador de ceramida. El paso de comparación se puede llevar a cabo mediante cualquier medio adecuado, tal como calculando un índice de combinación, en donde un valor menor de 1 (por ejemplo, menor de 0.9) indica que los compuestos son sinérgicos. Se puede usar cualquier célula tumoral que incluya, pero no esté limitada a, células de neuroblastoma, pulmón, melanoma, próstata, leucemia, colon, mama y de tumor del páncreas. Se puede usar cualquier retinoide generador de ceramida tal como fenretinida. Se I--U-É----É-MÉ--IÉ- -- --------------a------- pueden usar otras células hiperproliferativas que incluyan células premalignas y no malignas en lugar de células tumorales, como se indicó anteriormente con respecto a las condiciones de tratamiento. En modalidades preferidas, el compuesto de prueba es un inhibidor de la degradación de ceramida, u otro 5 agente que manipule el metabolismo celular o control celular de la citotoxicidad generada por ceramida. El paso de determinación se puede llevar a cabo buscando la inhibición del crecimiento o la citotoxicidad en general, o determinando particularmente necrosis, apoptosis, o ambas. El método se puede usar para identificar compuestos activos que sean inhibidores de la degradación de ceramida, otros compuestos que manipulen el metabolismo celular o control celular de la citotoxicidad generada por ceramida, o compuestos que funcionen mediante todavía otros mecanismos aparte de los descritos en la presente. Compuestos (¡ncluyendo las sales larmacéuticamente aceptables de los mismos) que no hayan sido conocidos previamente como útiles en un método para tratar enfermedades hiperproliferativas en combinación con un retinoide generador de ceramida, se pueden preparar, formular y usar en los métodos descritos en la presente además de, o alternativamente a, los inhibidores de la degradación de ceramida descritos en la presente. Dependiendo de los compuestos seleccionados para selección, como se describe en la presente, dichos compuestos pueden ser compuestos novedosos, pueden ser compuestos conocidos pero no previamente conocidos por su uso medicinal o farmacéutico, o pueden ser compuestos ^^?^ previamente conocidos por su uso medicinal o farmacéutico pero no previamente conocidos por su uso en combinación con un retinoide generador de ceramida. 6. Formulaciones y administración Los compuestos activos descritos anteriormente se pueden formular para administración en un vehículo farmacéutico individual o en vehículos farmacéuticos separados para el tratamiento de varias condiciones. En la fabricación de una formulación farmacéutica de conformidad con la invención, los compuestos activos que incluyen las sales fisiológicamente aceptables de los mismos, o los derivados de ácido de los mismos, se mezclan típicamente, en otras cosas, con un vehículo aceptable. De hecho, el vehículo debe ser aceptable en el sentido de ser compatible con cualquier otro ingrediente en la formulación, y no debe ser perjudicial para el paciente. El vehículo puede ser un sólido o un líquido, o ambos, y se formula de preferencia con el compuesto como una formulación de dosis unitaria, por ejemplo, una tableta, la cual puede contener de 0.5% a 95% en peso del compuesto activo. Uno o más compuestos activos pueden ser incorporados en las formulaciones de la invención, las cuales se pueden preparar mediante cualquiera de las bien conocidas técnicas de farmacia que consisten esencialmente en mezclar los componentes, incluyendo opcionalmente uno o más ingredientes accesorios.

Las formulaciones de la invención incluyen aquellas adecuadas para administración oral, rectal, tópica, bucal (por ejemplo, sublingual), vaginal, parenteral (por ejemplo, administración subcutánea, intramuscular, intradérmica o intravenosa), tópica (es decir, piel y superficies mucosas, incluyendo superficies de vías respiratorias) y transdérmica, aunque la vía más adecuada en cualquier caso determinado dependerá de la naturaleza y severidad de la condición que está siendo tratada, y de la naturaleza del compuesto activo en particular que se está usando. Las formulaciones adecuadas para administración oral se pueden presentar en unidades discretas tales como cápsulas, trociscos, pastillas o tabletas, conteniendo cada una cantidad predeterminada del compuesto activo; como un polvo o granulos; como una solución o una suspensión en un líquido acuoso o no acuoso; o como una emulsión de aceite en agua o agua en aceite. Dichas formulaciones se pueden preparar mediante cualquier método adecuado de farmacia que incluye el paso de poner en asociación el compuesto activo y un vehículo adecuado (el cual puede contener uno o más ingredientes accesorios como se describió anteriormente). En general, las formulaciones de la invención se preparan mezclando uniformemente e íntimamente el compuesto activo con un líquido o vehículo sólido finamente dividido, o ambos, y entonces, si es necesario, configurando la mezcla resultante. Por ejemplo, se puede preparar una tableta comprimiendo o moldeando un polvo o granulos que contengan al compuesto activo, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Se puede preparar tabletas comprimidas comprimiendo, en una máquina adecuada, el compuesto en una forma de flujo libre, tal como un polvo o granulos mezclados opcionalmente con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte y/o agentes dispersantes/tensioactivos. Se pueden preparar tabletas moldeadas mediante moldeo, en una máquina adecuada, y el compuesto pulverizado es humedecido con un aglutinante líquido inerte. Las formulaciones adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen pastillas que comprenden el compuesto activo en una base saborizada, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto; y pastillas que comprenden el compuesto en una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia. Las formulaciones de la presente invención adecuadas para administración parenteral o vaginal comprenden convenientemente preparaciones acuosas estériles del compuesto activo, cuyas preparaciones son de preferencia isotónicas con la sangre del receptor destinado. Estas preparaciones se pueden administrar mediante inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular o intradérmica. Dichas preparaciones se pueden preparar convenientemente mezclando el compuesto con agua o un regulador de pH de glicina, y haciendo que la solución resultante sea estéril e isotónica con la sangre. Las formulaciones adecuadas para administración rectal se presentan de preferencia como supositorios de dosis unitaria. Estos se pueden preparar mezclando el compuesto activo con uno o más vehículos sólidos convencionales, por ejemplo, manteca de cacao, y entonces configurando la mezcla resultante. Las formulaciones adecuadas para aplicación tópica a la piel toman de preferencia la forma de un ungüento, crema, loción, pasta, gel, 5 rocío, aerosol o aceite. Los vehículos que se pueden usar incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles, alcoholes, mejoradores transdérmicos, y combinaciones de dos o más de los mismos. Las formulaciones adecuadas para administración transdérmica se pueden presentar como parches discretos adaptados para permanecer en 10 íntimo contacto con la epidermis del receptor durante un período prolongado. Las formulaciones adecuadas para administración transdérmica pueden ser suministradas también mediante ¡ontoforesis (véase, por ejemplo, Pharmaceutical Research 3 (6): 318 (1986)), y toman típicamente la forma de una solución acuosa del compuesto activo opcionalmente regulado en su pH. 15 Las formulaciones adecuadas incluyen regulador de pH de citrato o bis/tris (pH 6) o etanol/agua, y contienen de 0.1 a 0.2 M de ingrediente activo. Como se indicó anteriormente, la presente invención provee formulaciones farmacéuticas que comprenden los compuestos activos (incluyendo las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), en 20 vehículos farmacéuticamente aceptables para administración oral, rectal, tópica, bucal, parenteral, intramuscular, intradérmica, intravenosa y transdérmica. t M*** m * ----------------- H-Hifa La dosificación terapéuticamente efectiva de cualquier ingrediente activo, cuyo uso está dentro del alcance de la presente invención, fluctuará un poco de un compuesto a otro, de paciente a paciente, y dependerá de factores tales como la condición del paciente y la vía de suministro. Dichas dosificaciones se pueden determinar de conformidad con procedimientos farmacológicos de rutina conocidos por los expertos en la técnica, particularmente a la luz de la descripción provista en la presente. Para fenretinida, para tratamiento sistémico, se utilizará una dosis que alcance un nivel en plasma de aproximadamente 1 , 2 ó 3 µM a 10 ó 20 µM; típicamente (para dosificación oral) 50 ó 100 a 500 ó 1000, 2000 ó 3000 mg/m2 de área de superficie del cuerpo por día. Para tamoxifeno, un nivel de 1.5 a 2 µM en suero logra un efecto clínicamente deseable, y estos niveles se pueden lograr a una dosificación de aproximadamente 150 a 300 ó 500 mg/día de citrato de lamoxifeno por vía oral, o a 300 ó 400 a 500 ó 700 mg/m2 por día. Estos niveles se logran sobre una base de dosis por pulsos usando una mayor dosificación de 400-500 mg/día por vía oral. El safingol se administra para lograr niveles pico en suero de aproximadamente 1 a 10 µM (por ejemplo, 7.5), o dosificaciones de 5 ó 10 a 30 ó 40 mg/kg (por ejemplo, 20 mg/kg). La presente invención se explica en mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitativos.

EJEMPLO 1 Prueba de citotoxicidad La citotoxicidad se determina usando el sistema de prueba DIMSCAN (R. Proffitt et al., Cytometry 24, 204-213 (1996); T. Frgala et al., Proc. AACR, 36, 303 (1995). El sistema utiliza microscopía de formación de imágenes digital para cuantificar células viables, las cuales acumulan selectivamente diacetato de fluoresceína hasta volverse brillantemente fluorescentes. El sistema es capaz de medir la citotoxicidad sobre una escala dinámica de 4-5 log, extinguiendo la fluorescencia residual de células muertas y moribundas con eosina Y, y cuantificando la fluorescencia total de células viables usando el umbral digital. La fluorescencia medida es directamente proporcional al número de células viables. Una comparación de la fluorescencia total de una población celular tratada con fármacos con la fluorescencia de un número similar de células no tratadas produce una fracción de supervivencia. ?n resumen, de 5,000 a 10,000 células de neuroblastoma SK-N-RA/cavidad se colocaron en placas de replica en 60 cavidades de una placa de cultivo de tejido de 96 cavidades en un medio de 0.1 cc y se permitió que se fijaran durante la noche. Posteriormente se añadieron los fármacos en un medio de 0.05 cc a las concentraciones finales indicadas. Existen 12 cavidades tratadas por concentración de fármaco. Doce cavidades recibieron únicamente vector de fármaco a la concentración final adecuada y funcionaron como controles para la placa. Las células se incubaron durante 96 a 120 horas a 37°C en CO2 al 5%. Se añadió entonces diacetato de fluoresceína a cada cavidad en un medio de 0.05 cc a una concentración final de 8 microgramos/cc. Las células se incubaron durante 15 minutos más a 37°C y se añadió a cada cavidad?.03 cc de eosina Y al 0.5%. La fluorescencia total de células viables entonces se midió mediante microscopía digital de formación de imágenes.

EJEMPLO 2 Prueba de ceramida La prueba de ceramida se llevó a cabo como se indica a continuación. Se replicaron 500,000 células de neuroblastoma/cavidad en placas de cultivo para tejido de 6 cavidades y se permitió que se fijaran durante la noche. Acido palmítico-(3H) tritiado (un precursor de lípidos) se añadió a un microcura/cc y se añadió fenretinida a una concentración final de 10 µM. Las células de control recibieron la marca tritiada pero no recibieron fármaco. Al momento indicado, las células se cosecharon de las cavidades por triplicado, se lavaron y se extrajeron los lípidos con metanol, ácido acético, agua y cloroformo. La capa orgánica (conteniendo el marcador de tritio incorporado en lípido) se aisló y se secó con una corriente de nitrógeno. La muestra de lípido se disolvió en cloroformo:metanol y 10% de cada muestra se probaron para estimar la cantidad total de tritio en la muestra de lípidos. Los lípidos en las fracciones de la muestra, junto con los estándares de ceramida sin marcar, entonces se separaron mediante cromatografia de capa delgada y las placas se desarrollaron por vapor de yoduro. La región de la placa correspondiente a los estándares de ceramida se raspó y se midió el tritio de la ceramida muestra coemigrante. La ceramida de la muestra total entonces se expresó como marca de tritio en porcentaje en ceramida versus tritio en lípido total.

EJEMPLOS DEL 3-9 Estudios de ceramida y citotoxicidad Los ejemplos del 3 al 9 están ilustrados por las figuras de la 3 a la 9 en la presente, respectivamente. Estos ejemplos se realizaron con los procedimientos que se describieron en general en los ejemplos 1 y 2 anteriores. La figura 3 ilustra el efecto de fenretinida a 10 µM (HPR o H marcada) en O2 al 20% en la generación de ceramiJa en la línea celular SMS-LHN de neuroblastoma sensible al fármaco (círculos oscuros) y en la línea celular CHLA-90 de neuroblastoma resistente al fármaco (círculos claros). Debe observarse que se encontró que ambas líneas celulares generan ceramida como respuesta a la fenretinida. La figura 4 ilustra el efecto de varias combinaciones de fenretinida (HPR:H), L-treo-dihidroesfingosina (sanfingol; S), un inhibidor de proteína cinasa C y 1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1 -propanol (ppmp; P), un inhibidor de glucosilceramida sintasa, en la supervivencia celular en una línea celular muy resistente (sk-N-RA), con diferentes concentraciones, en O2 al 20%. Obsérvese que los efectos combinados de los fármacos. Los círculos oscuros representan la combinación de safingol y ppmp; los círculos claros representan la combinación de fenretinida y safingol; los triángulos oscuros representan la combinación de fenretinida y ppmp; los triángulos claros representan la combinación de fenretinida, safingol y ppmp. Las dosificaciones se indican en el eje horizontal. La figura 5 ilustra el efecto de varias combinaciones del compuesto con dosificaciones que varían como se indica, pero con una dosis de 10 µM fija de fenretinida, en la supervivencia de células SK-N-RA en O2 al 20%. T o tamoxifeno se refiere a citrato de tamoxifeno. Obsérvese la baja citotoxicidad para los compuestos individuales, pero la alta toxicidad para las combinaciones de los compuestos. H+P marcado con círculos oscuros representa fenretinida más ppmp; H+T marcado con círculos claros representa fenretinida más tamoxifeno; H+S marcado con círculos osr jros representa fenretinida más safingol; los círculos claros H+S+T representan fenretinida más safingol y tamoxifeno (1 :1 ); los triángulos oscuros representan fenretinida más tamoxifeno a 3µM fijo más safingol. Otras dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. La figura 6 muestra la actividad de fenretinida de baja dosificación en combinación con otros compuestos en la fracción de supervivencia de las células SK-N-RA en 02 al 20%. Los círculos oscuros -_-_i-?---y---------- ---------------Í---I----Í representan fenretinida a 3.3 µM más safingol; los círculos claros representan fenretinida a 3.3 µM más ppmp; los triángulos oscuros representan ppmp más safingol (1 :1 ) sin fenretinida; los triángulos claros representan fenretinida a 3.3 µM más ppmp más safingol (1 :1 ). Otras dosificaciones son como se indica en el eje horizontal. La figura 7 muestra el efecto de diversas combinaciones de fármaco en la fracción de supervivencia de las células Sk-N-RA en 02 al 20%. N-DMS (o N) se refiere a d-eritro-N,N-dimet¡lesf¡ngosina, un inhibidor de esfingosina cinasa. Los círculos oscuros representan N-DMS más PPMP; los círculos claros representan fenretinida más ppmp, los triángulos oscuros representan fenretinida más N-DMS; los triángulos claros representan fenretinida más N-DMS más PPMP. Las dosificaciones son como se indica en el eje horizontal. La figura 8 ilustra la actividad de varias combinaciones de fármacos en la supervivencia de células sk-N-RA en 02 al 20%. HPR marcada con círculos oscuros representa fenretinida; N-DMS marcada con cíi culos claros representa N-DMS; los triángulos oscuros representan HPR más N-DMS, N+N a 10 µM marcado con círculos oscuros representa una dosis fija a 10 µM de fenretinida más N-DMS; H+P+N a 5 µM marcado con círculos claros representa una dosis fija a 5 µM de fenretinida más una dosis fija a 5 µM de PPMP más N-DMS. La línea sólida representa fenretinida más PPMP. Las dosificaciones son fijas en donde así se indica; de otra manera las ----------------------------------- dosificaciones son como se muestran en el eje horizontal. Obsérvese la citotoxicidad incrementada cuando se añade N-DMS a fenretinida y PPMP. La figura 9 ilustra la actividad de las combinaciones de fármacos en la supervivencia de las células sk-N-RA en 02 al 20%. Los círculos oscuros representan fenretinida; los círculos claros representan fenretinida más N- DMS (3:1 ); los triángulos oscuros representan fenretinida rnás safingol (3:1 ); los triángulos claros representan fenretinida más N-DMS más safingol (3:1 :1 ). Las dosificaciones son como se indican en el eje horizontal. Obsérvese la citotoxicidad de la combinación de los tres fármacos. 10 EJEMPLO 10 Todos los compuestos necesitan no estar co-presentes en el período de tratamiento completo En algunas líneas celulares, se ha demostrado que safingol necesita únicamente estar copresente con HPR durante una parte del período de tratamiento completo para obtener un incremento en la actividad celular antitumoral. En estos experimentos, se añadió safingol y HPR juntos en Tiempo =0. Entonces, en varios tiempos, el medio de cultivo celular que contiene ambos fármacos se retiró y se volvió a colocar con el medio que contenía una concentración similar de sólo HPR. Entonces se dejó que las células completaran la incubación de 96 a 120 horas y la supervivencia se comparó con las células que se habían expuesto a ambos fármacos durante -------ÉÍÍ----Í las 96 a 120 horas completas como se describió anteriormente. Los resultados demostraron que safingol necesita no estar co-presente con HPR para el período de tratamiento con HPR completo para que con la invención se incremente la muerte de células tumorales en comparación con el tratamiento 5 con HPR sólo. En algunos casos, la co-presencia de safingol y HPR por menos de 12 horas del período de tratamiento con HPR de 96 a 120 horas fue suficiente para obtener una gran fracción del incremento total en la muerte de células que ocasionó la invención. Esto demuestra que todos los compuestos que se reclaman en la invención necesitan no estar copresentes en todo 10 momento para que la invención funcione.

Métodos Las células se añadieron en 100 µl de medio completo por cavidad a microplacas de 96 cavidades para realizar pruebas de citotoxicidad DIMSCAN como se describió anteriormente. Las líneas celulares usadas incluyeron líneas celulares de neuroblastoma CHLA-90 y SK-N-RA, y la línea celular de carcinoma de pulmón, A549. En el tiempo =+0, HPR y safingol se añadieron en las concentraciones finales de fármaco que se listan, en 50 µl de medio completo por cavidad (un total final de 150 µl de medio por cavidad).

También en el tiempo =+0, la misma concentración de HPR, como agente solo, se añadió en 50 µl de medio completo a las cavidades de una placa por duplicado (a un total final de 150 µl de medio por cavidad). Las placas se incubaron a 37°C. En los tiempos listados, los 150 µl del medio en cada 12 ^¡jj^ SMSSUS^^ ^ cavidades de la placa de HPR+safingol se eliminó, descarto y volvió a colocar con 150 µl del medio de 12 cavidades de una placa con únicamente HPR ("medio pre-equilibrado"). El medio de las cavidades de la placa HPR+safingol se volvió a colocar con el "medio equilibrado previamente", en vez de añadir 5 HPR nuevo en un medio recién elaborado, para simular cualquier acondicionamiento posible del medio o degradación de HPR que pudiera haberse presentado con el tiempo en las cavidades originales de dos fármacos. La placa se volvió a incubar y se probó su citotoxicidad mediante la prueba DIMSCAN en +96 a 120 horas como se indicó. El punto de datos 10 finales en cada gráfica representa la fracción de supervivencia para la coincubación de ambos fármacos para el período completo de +96-120 horas. En el enfoque completo se intentó simular la coexposición in vivo a safingol para únicamente una parte del período completo de tratamiento con HPR.

Resultados Las figuras 10, 11 y 12 son los resultados de citotoxicidad representativos obtenidos de diversas líneas celulares cuando safingol está copresente con HPR durante un tiempo menor que período completo de tratamiento con HPR. Mediante esta invención puede obtenerse un gran incremento en la muerte de 20 células tumorales, en algunos casos, por la co-presencia de fármacos durante un tiempo menor del período completo del tratamiento con HPR. En algunos casos la co-exposición de safingol y HPR únicamente durante un corto tiempo del período de tratamiento con HPR es suficiente para que la invención yg^i^'!'^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^^ *^^^ *^ funcione. Esto demuestra que no es necesario que todos los compuestos estén presentes en todo momento para que la invención funcione.

EJEMPLO 11 La citotoxicidad de otros retionoides aumenta por safingol El retinoide, ácido retinoico todo trans (ATRA), ha demostrado previamente que ocasiona un incremento ligero (1.5 x) en el nivel de ceramida de las células de neuroblastoma Neuro2A (L. Riboni et al., J. Biol Chem. 270: 26868 (1995)). En el presente documento se demuestra que la coexposición de ATRA, o el retinoide, ácido 13-cis-retinoide con safingol da como resultado una supervivencia celular disminuida de manera importante en las células de neuroblastoma CHLA-90 y LAN-6 en comparación con la del retinoide solo. Esto demuestra que la invención es activa con diversos retinoides diferentes.

Métodos Se añadieron células en 100 µl de medio completo por cavidad a microplacas de 96 cavidades para realizar una prueba de citotoxicidad DIMSCAN como se describió anteriormente. Las líneas celulares usadas fueron las líneas celulares de neuroblastoma CHLA-90 y LAN-6. En el tiempo = 0, se añadió ácido retinoico todo trans (ATRA), ácido 13-cis-retinoico (13-cis-RA) o una combinación de retinoide más safingol en una relación molar de 3:1 en 50 µl de un medio completo. Se incubaron las placas y se sometieron a ---MI--------I ll-É-t--------! pruebas para encontrar la citotoxicidad mediante la prueba de DIMSCAN a +120 para las células CHLA-90 y + 144 horas para las células LAN-6.

Resultados 5 Los datos establecidos en las figuras 13-14 demuestran que la adición de safingol a los retinoides ATRA o 13-cis-F.A ocasiona una disminución importante en la supervivencia celular de las líneas celulares CHLA-90 y LAN-6. Safingol a 4 µM (la concentración máxima usada en los experimentos a continuación) presentó una fracción de supervivencia de 0.11 10 en CHLA-90 y de 0.39 en las células LAN-6. Esto demostró que la invención es activa con un número de diversos retinoides.

EJEMPLO 12 La conversión específica de ceramida en Glucosilceramida no tóxica 15 disminuye la citotoxicidad de HPR y HPR+Safingol Se ha demostrado que HPR genera ceramida en las líneas celulares de tumores de neuroblastoma de manera dependiente de la dosis y del tiempo (B. Maurer et al., J. Nati. Cáncer Inst. (1999) (in press)). 20 Glucosilceramida (GC) es un metabolito no tóxico de ceramida. La ceramida se convierte en glucosilceramida mediante la acción de glucosilceramida sintasa (GCS). La glucosilceramida sintasa (GCS) se ha transfectado en células de cáncer de mama MCF7 humanas en una construcción de expresión --tfi&Ü---tiw que puede ser inducida por tetraciclina en la línea celular MCF7/GCS (Y. Liu et al., J. Biol Chem. 274:1140-46 (1999)). La incubación de células MCF7/GCS en un medio de doxiciclina, que contiene una tetraciclina, ha demostrado que incrementa la actividad de GCS, incrementa la conversión de ceramida en glucosilceramida, y disminuye la citotoxicidad de adriamicina, un fármaco que se sabe que incrementa la ceramida en estas células (Y. Liu et al., citado anteriormente). Se ha expuesto células MCF7/GCS a HPR, safingol y HPR + safingol en ausencia, así como en presencia de doxiciclina. Se ha descubierto que al incrementar la actividad de GCS con doxiciclina en las células MCF7/GCS disminuye de manera importante la citotoxicidad de HPR y disminuye de manera importante la citotoxicidad de la combinación del fármaco HPR+safingol. Esto demuestra que la ceramida que genera HPR en células MCF7/GCS es citotóxica y que la invención depende, por lo menos parcialmente, en la ceramida y la mejora de su citotoxicidad.

Métodos Se colocaron células MCF7/GCS en placas e incubaron en un medio RPMI con suero de bovino fetal al 10% y 200 microgramos/ml de higromicina B (tet OFF) para la prueba de citotoxicidad DIMSCAN como se describió anteriormente. Para incrementar la expresión de GCS, también se incubaron células MCF7/GCS en el medio mencionado con 3 microgramos/ml de doxiciclina (tet ON) durante tres días antes de volver a colocarlas en placas para realizar la prueba de citotoxicidad DIMSCAM. En las pruebas DIMSCAN con células inducidas con doxiciclina (tet ON) también se incluyó 3 microgramos/ml de doxiciclina en el medio. La células MCF7/GCS "tet OFF" y "tet ON" se expusieron a HPR safingol y HPR+safingol (relación molar 3:1 ) durante 96 horas y sometieron a una prueba para obtener la fracción de supervivencia mediante DIMSCAN como se describió anteriormente.

Resultados Se muestran los resultados representativos en la figura 15. La coincubación de células MCF7/GCS con doxiciclinas ("tet ON"), demostraron previamente que incrementa la expresión de GCS e incrementa la conversión de ceramida en glucosilceramida no tóxica (Y. Luis et al., citado en párrafos anteriores), disminuyeron en gran medida (P<.005 mediante la prueba r de student en HPR a > 6 µM) la citotoxicidad de HPR y HPR+safingol en comparación con las células MCF7/GCS "tet OFF". No hubo un decremento importante en la citotoxicidad del safingol en el margen de concentraciones (0 - 4 µM) usado en los estudios en combinación de HPR+safingol. Esto demuestra que la citotoxicidad de HPR depende parcialmente de la generación de la ceramida citotóxica. Además demuestra que la actividad de la combinación de fármacos HPR+safingol (parte de la invención) también depende, por lo menos parcialmente, de la generación de las ceramida citotóxica y de la mejora de su citotoxicidad.

EJEMPLO 13 HPR y HPR + safingol inducen la muerte celular mediante una combinación de apoptosis y necrosis; HPR y HPR + safingol pueden inducir la muerte celular mediante necrosis si la muerte celular apoptótica se inhibe Existen dos mecanismos principales reconocidos actualmente que llevan a la muerte celular después de una agresión celular bioquímica, apoptosis y necrosis (G. Nunez G. et al., Oncogene 17:3237-45 (1998), G. Cohén, Biochem. J. 326:1-16 (1997); Y. Hannun, Blood 89:1845-53 (1997); N, Thornberry, Chem. Biol. 5: R97-103 (1998); N, Zamzami et al., J. Bioenerg Biomembr. 29:185-193 (1997); D. McConkey, Toxicol. Lett. 99:157-98 (1998); M. Raffray and G. Cohén, Pharmacol Ther. 75:153-77 (1997); J. Lemasters, Am. J. Phystol. 276:G1-6 (1999)). La apoptosis consiste en una serie de pasos de activación enzimática específicas secuencial (cascada de enzimas caspasa) que usualmente conlleva a un tipo específico de degradación de ADN (escalera de ADN internucleosomal) y muerte celular. La apoptosis está tipificada morfológicamente mediante cromatina nuclear condensada y fragmentación de los núcleos en cuerpos apoptóticos que no han perdido la integridad de la membrana y un incremento en el contenido de ADN sub Go/G-i mediante citometría de flujo. La necrosis es una condición con una menor definición bioquímica que está caracterizada por una degradación general en la integridad de la membrana celular y está asociada con niveles intracelulares disminuidos de ATP (C. Renvoize et al., Cell Biol. Toxicol 14:111-20 (1998)). La necrosis está tipificada morfológicamente por una pérdida de la integridad de la membrana (demostrada mediante tinción de yoduro de propidio) con redondeo de células y separación de células. Estos dos procesos pueden 5 traslaparse en algunas partes de su mecanismo bioquímico, pero en general están considerados diferentes o, por lo menos, en los extremos opuestos de un continuum mecanístico. Como se muestra a continuación, HPR y HPR + safingol ocasionan la muerte celular a través de una combinación de apoptosis y necrosis. Estas observaciones son importantes debido a que las células tumorales con mecanismos apoptóticos deteriorados pueden morir por necrosis. De esta manera, las combinaciones de fármacos descritas en la presente tienen una utilidad importante (inducción de muerte celular por necrosis, así como por apoptosis) sobre otros métodos de muerte antitumoral que se basan principalmente en mecanismos apoptóticos o en la mejora de la apoptosis.

Métodos Para determinar la manera en que 4-HPR o HPR+safingol indujeron la muerte celular en células de neuroblastoma, se evaluó la 20 evidencia morfológica de apoptosis y/o necrosis en células CHLA-90 en presencia o ausencia de un inhibidor específico de apoptosis, el penetrante en células neurales, el inhibidor de enzima pan-caspasa, BOC-d-fmk (Enzyme Systems Products, Livermore, CA). BOC-d-fmk inhibe específicamente, y evita -Mteii--U- -É? a-Ü-i------------- la muerte por enzimas caspasa que median la apoptosis Se colocaron en placas células CHLA-90 por duplicado en un medio completo en portaobjetos con cámara Lab Tek (Nunc, Naperville, IL), se permitió que se fijaran durante 24 horas, y posteriormente se trataron la presencia o ausencia de BOC-d-fmk 5 (40 µM) durante una hora antes del tratamiento con HPR (10µM). Se trataron células de control con solventes de vehículo de 0.1% etanol (4-HPR) y/o 0.2% DMSO (BOC-d-fmk). Las características morfológicas de la apoptosis (condensación de ADN y/o cuerpos apoptóticos) se visualizaron en células no separadas a +24 o +48 horas usando fluorescencia nuclear azul inducida por la tinción supravital de ADN de Hoechst 33342 (10 µg/ml durante 30 mins a 37°C), mientras las células necróticas y las células apoptóticas avanzadas se reconocieron mediante tinción fluorescente roja con yoduro de propidio (0.5 µM/ml). Las células con tinción fluorescente roja con restos nucleares condensados se registraron como células apoptóticas. Para las células analizadas a las +48 horas, se añadió BOC-d-fmk (40 µM) adicional o un vehículo de control adecuado a +24 horas. Las células se observaron usando filtros adecuados para cada colorante secuencialmente en un microscopio epifluorescente Olympus Vanox. Múltiples campos aleatorios de célula (de -100-500 células cada uno) se contaron y fotografiaron para encontrar células viables, células apoptóticas y células necróticas. Para examinar adicionalmente las células tratadas con HPR, se realizaron pruebas de citotoxicidad en las células CHLA-90 pretratadas con o sin BOC-d-fmk a 40 µM durante una hora antes de la adición de 4-HPR (3-1 OµM ) y se analizaron a Mik---------i---- las +24 horas mediante la prueba DIMSCAN para evaluar el efecto de la inhibición de la caspasa en disponibilidad. Se trataron células de control con solventes de vehículo de etanol (4-HPR) al 0.1 % y/o DMSO (BOC-d-fmk) al 0.2%. La evaluación de la apoptosis mediante citometría de fluido (Z. 5 Darnzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808 (1992)) usó yoduro de propidio en un regulador de pH hipotónico de lisis (A. Krishan et al., J, Cell Biology. 66:188-193 (1975)), para identificar células con un contenido ADN sub Go/G-i. Las células se trataron como se indicó anteriormente y se sometieron a una prueba a +24 horas. Los núcleos con tinción se analizaron en un citómetro de 10 fluido Coulter Epics ÉLITE con un láser de argón a 488 nm y un filtro de paso de banda centrado en 610 nm. Las barras de error indican intervalos de confianza del 95%. El análisis estadístico fue sin comparación, y prueba t de Student bilateral. Todos los valores P son bilaterales.

Resultados Como se muestra en la figura 16, la citotoxic-dad de HPR se redujo en gran medida mediante la enzima pan-caspasa, el inhibidor de apoptosis, BOC-d-fmk (40 µM), a través de todas las concentraciones HPR (P<.001 ), peso HPR indujo aún citotoxicidad importante en la presencia de BOC-d-fmk en HPR a 3 µM, P=.002, en > 3 µM HPR, P <.001 ). Estos resultados indicaron que HPR ocasiona la muerte celular mediante mecanismos apoptóticos y no apoptóticos (necróticos).

----¡--------UtiÜH J^^^ Como se muestra en la figura 17, el pretratamiento con BOC-d-fmk antes de la exposición a HPR redujo de manera importante (P = .001 ) los cambios nucleares morfológicos indicativos de apoptosis (cromatina nuclear con tinción intensa, condensada de los núcleos en los cuerpos apoptóticos que no tuvieron actividad de membrana pérdida) en células CHLA-90. Sin embargo, la evidencia morfológica importante de la necrosis (P = .002) inducida por HPR (pérdida de la integridad de la membrana demostrada mediante tinción con yoduro de propidio y redondeo celular) se vio afectada mínimamente por BOC-d-fmk y aún fue importante (P = .016) a los controles. El HPR sólo indujo una apoptosis importante (P = .006). Aunque la apoptosis en células tratadas con HPR+BOC-d-fmk no fue muy diferente de los controles (P = .48). Estos resultados indican que la muerte celular inducida por HPR continúa mediante apoptosis/necrosis mixta y puede continuar mediante mecanismos necróticos incluso si se inhibe la muerte por apoptosis. Como se muestra en la figura 18, a +24 horas, BOC-d-fmk (40 µM) rechazó la subfragmentación de ADN Go/G-i inducida por HPR (10 µM) en CHLA-90 como se detectó mediante citometría de flujo que es característico de apoptosis. Una fracción importante de células CHLA-90 murió a +24 horas, estos datos proveen evidencia de que HPR puede eliminar células mediante mecanismos no apoptóticos (necróticos). También se ha informado recientemente que la muerte celular inducida por HPR (10-20 µM) actúa por necrosis de líneas celulares limfoblastoides (L. Spreinger and B. Stewart, Cáncer Lett. 128:189-196 (1998)) y en la línea celular de carcinoma embrionario (J. Clifford et al Cáncer Res. 59:14-18 (1999)). En la figura 19, el pretratamiento con BOC-d-fmk antes de la exposición a HPR o HPR+safingol (relación micromolar de 10:3) redujo los cambios nucleares morfológicos indicativos de apoptosis en células CHLA-90 a +48 horas. Sin embargo, la evidencia morfológica de necrosis inducida por la combinación de fármacos HPR+safingol a +48 horas se vio afectada mínimamente por BOC-d-fmk pero aún fue importante (P < .001 ) con relación a los controles. Estos resultados indican que la combinación de fármacos HPR+safingol (una modalidad de la invención) puede inducir la muerte celular mediante apoptosis-necrosis mixta y que la muerte celular puede actuar mediante mecanismo necróticos incluso si la muerte por apoptosis se inhibe.

EJEMPLO 14 Safingol sinergiza la citotoxicidad de 4-HPR en múltiples líneas celulares de tumores Como se indicó anteriormente, sea tenido buen éxito en el incremento de la citotoxicidad de 4-HPR a través de la inhibición de diversas vías relacionadas con la ceramida. La mayoría de los inhibidores usados se han estudiado únicamente in vitro. Sin embargo, safingol, un inhibidor de PKC con actividad contra PKC-? activado por ceramida, recientemente recibió una evaluación parcial de fase 1 (G. Schwartz et al., Clin. Cáncer Res. 3., 537-543 (1997)). Este estudio se determinó de manera prematura debido a la falta del fármaco. Sin embargo, los resultados de la fase 1 demostraron que una infusión de una hora de safingol a 120 mg/m2 alcanzó niveles de suero de 3 µM durante la infusión, sin toxicidades reportadas. Por lo tanto, se realizaron 5 estudios de citotoxicidad de 4-HPR+safingol con una relación molar fija de HPR: safingol en concentraciones esperadas que se lograran en humanos a partir de estos resultados y datos de modelos de animales (G. Kelloff et al., J. Cell. Biochem. Suppl. 20, 176-196 (1994); L. Kederis et al., Fund Appl. Tox. 25, 201 (1995)). La actividad de 4-HPR+safingol primero se evaluó en un panel modelo de células de neuroblastoma que incluyeron diversas líneas celulares resistentes a agente de alquilación. Entonces se realizaron pruebas con 4-HPR+safingol en líneas celulares derivadas de otros tipos de tumores. Estos resultados se resumen en el cuadro 1 , que también muestra el índice de combinación (Cl) calculado por el análisis de Chou como una medida de la sinergia de fármacos (Cl es un término que describe el efecto farmacológico de dos fármacos combinados, un Cl<1 indica sinergia, con números menores indicando una mayor sinergia; un Cl igual a 1 significa un efecto aditivo; y un Cl>1 significa que la combinación del fármaco es antagónica). Es notable que la citotoxicidad multiregistro se logró en líneas celulares que fueron p53 nulas o mutantes y en líneas celulares que son muy resistentes a los agentes de alquilación. Los resultados obtenidos demostraron que el safingol mejora de manera importante e incluso sinergiza la citotoxicidad de 4-HPR contra líneas celulares de varios tipos de tumores de manera independiente de p53.

---------------------- CUADRO 1 índice de combinación de HPR+safingol (3:1) de 0-12 uM índice de combinación (Cl) Registro de muerte celular por HPR (3:1 ) Tipo de célula ED99 9 µM 12 µM Neuroblastoma SK-N-RA <0.1 1.9 3 SMS-LHN Pd-IND <0.1 3.5 CHLA-90 Pd-BMT <0.1 3.1 4 CHLA-171 <0.1 2.9 4 CHLA-79 Pd-BMT <0.1 3.5 4 Pulmón 10 NCI-H146 SCLC >c-myc <0.1 3.2 4 NCI-H157 escamosas <0.1 2.9 4 NCI-H1792 <0.1 2.1 4 A549 p53 tipo silvestre 0.2 1 2 Melanoma A375 p53 tipo silvestre <0.1 2.6 4 A2058 0.2 0.9 2.7 Próstata 15 LNCaP.FGC p53 tipo silvestre <0.1 2.8 4 PC-3 p53 nulo 1.0 1.4 1.9 Colon LoVo p53 tipo silvestre 0.1 0.5 1.8 HT-29 p53 mutante 0.3 1.3 2.4 Mama MCF7 p53 tipo silvestre 0.5 1.1 1.5 DoxR MCF7 0.1 0.9 1.5 MDA-MB-231 p53 mutante 0.3 0.9 3 Páncreas PANC-1 epiteloides p53 mutante 0.2 0.3 1.7 Hs 766T 1.7 2.9 2.5 _---ll---------------i ----------------------- índice de combinación (Cl) Descripción <0.1 Sinergismo muy fuerte 0.1-0.3 Sinergismo fuerte 0.3-0.7 Sinergismo 0.7-0.85 Sinergismo moderado 0.85-0.9 Sinergismo ligero 0.9-1.10 Casi aditivo 1.1 -1.20 Antagonismo ligero Lo anterior ilustra la presente invención, y no debe interpretarse como limitante de la misma. La invención está definida por las siguientes reivindicaciones con los equivalentes de las reivindicaciones incluidos en la misma. rf----í?-fH-á^---«í--^

Claims (33)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de a) un retinoide generador de ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y b) un inhibidor de degradación de ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo para la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto.

2.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho inhibidor de degradación de ceramida se selecciona del grupo que consiste en inhibidores de glucosilceramida sintasa, inhibidores de síntesis de esfingosina-1 -fosfato, inhibidores de proteína cinasa C, y las sales aceptables farmacéuticamente de las mismas.

3.- El uso como se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicho trastorno hiperproliferativo se selecciona del grupo que consiste en trastornos malignos, premalignos y no malignos hiperproliferativos.

4.- El uso de a) un retinoide generador de ceramidas o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y b) un inhibidor de síntesis de glucosilceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo para la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto.

5.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde dicho retinoide generador de ceramidas es fenretinida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

6.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde dicho inhibidor de síntesis de glucosilceramida es un inhibidor de glucosilceramida sintasa una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

7.- El uso como se reclama en la reivindicación 4, en donde dicho inhibidor de síntesis de glucosilceramida es 1-fenil-2-palmitoilamino-3-morfolino-1 -propanol o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

8.- El uso de a) un retinoide generador de ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y b) un inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo para la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto.

9.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho retinoide generador de ceramida es fenretinida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

10.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato es un inhibidor de esfingosina cinasa o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

11.- El uso como se reclama en la reivindicación 8, en donde dicho inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato es D-eritro-N,N-dimetilesfingosina o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

12.- El uso de a) un retinoide generador de ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo y b) un inhibidor de proteína cinasa C o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto.

13.- El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho retinoide generador de ceramida es fenretinida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

14.- El uso como se reclama en la reivindicación 12, en donde dicho inhibidor de proteína cinasa C es L-treo-dihidroespignosina o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

15.- El uso de a) un retinoide generador de ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo y b) por lo menos dos compuestos seleccionados del grupo que consiste en (i) inhibidores de síntesis de glucosilceramida y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, (¡i) inhibidores de síntesis de esfingosi na- 1 -fosfato y las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos, y (iii) inhibidores de proteína cinasa C y las sales aceptables farmacéuticamente de los mismos para la elaboración de un medicamento para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto.

16.- El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde dicho retinoide generador de ceramida es fenretinida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

17.- El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde dichos por lo menos dos compuestos comprenden (i) un inhibidor de síntesis de glucosilceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo y (ii) ya sea un inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato, o un inhibidor de proteína cinasa C, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

18.- El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde dichos por lo menos dos compuestos comprenden un inhibidor de síntesis de glucosilceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, un inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

19.- El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde dichos por lo menos dos compuestos comprenden un inhibidor de síntesis de glucosilceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, y un inhibidor de proteína cinasa C o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

20.- El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde dichos por lo menos dos compuestos comprende un inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un inhibidor de proteína cinasa C o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

21.- El uso como se reclama en la reivindicación 15, en donde dichos por lo menos dos compuestos comprenden un inhibidor de síntesis de glucosilceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, un inhibidor de síntesis de esfingosina-1 -fosfato o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo, un inhibidor de proteína cinasa C o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

22.- Un método para seleccionar compuestos que incrementan la actividad citoestática o citotóxica de un retinoide que genera ceramida en células hiperproliferativas, dicho método comprende: a) hacer que las células hiperproliferativas del primer control hagan contacto con una cantidad de retinoide que genera ceramida; b) hacer que las células hiperproliferativas del segundo control hagan contacto con una cantidad de un compuesto de prueba; y c) hacer que las células hiperproliferativas experimentales hagan contacto con dicha cantidad de retinoide que genera ceramidas en el paso (a) anterior y dicha cantidad de un compuesto de prueba en el paso (d) anterior; y d) determinar la inhibición de crecimiento de dichas células hiperproliferativas de los pasos (a), (b) y (c) anteriores; y posteriormente e) comparar la inhibición de crecimiento en las células hiperproliferativas experimentales del paso (c) con la inhibición de crecimiento de las células hiperproliferativas de control de los pasos (a) y (b), un mayor grado de inhibición de crecimiento determinado en las células hiperproliferativas experimentales del paso (c) que la inhibición de crecimiento combinado de las células hiperproliferativas de control de los pasos (b) y (c) indicando que el compuesto de prueba mejora la actividad del retinoide que genera ceramidas.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde dicho paso de comparación se lleva a cabo calculando un índice de combinación.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde dichas células hiperproliferativas son células tumorales.

25.- El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde dichas células tumorales están seleccionadas del grupo que consiste en células de tumores de neuroblastoma, pulmón, melanoma, próstata, colón, mama, leucemia y páncreas.

26.- El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho retinoide que genera ceramida es fenretinida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

27.- El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho compuesto de prueba es un inhibidor de degradación de ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

28.- El método de conformidad con la reivindicación 22, en donde dicho paso de determinación de la inhibición del crecimiento se lleva a cabo determinando la necrosis, apoptosis o ambas.

29.- Un compuesto que incrementa la actividad citoestática o citotóxica de un retinoide que genera ceramida en células hiperproliferativas que se producen mediante el método descrito en la reivindicación 22, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

30.- Una formulación farmacéutica que comprende, en un vehículo aceptable farmacéuticamente, una cantidad efectiva de tratamiento de un compuesto que incrementa la actividad citoestática o citotóxica de un retinoide que genera ceramida en células hiperproliferativas producidas por el método de la reivindicación 22, o una sal aceptable farmacéuticamente del *> J 6 mismo.

31.- Una formulación farmacéutica de conformidad con la reivindicación 31 , caracterizada además porque comprende una cantidad 5 efectiva de tratamiento de un retinoide que genera cerarnida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo.

32.- El uso de (a) un retinoide que genera ceramida o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo; y (b) un compuesto que incrementa la actividad citoestática o citotóxica de un retinoide que genera ceramida en 10 células hiperproliferativas producidas de conformidad con el método de la reivindicación 22, o una sal aceptable farmacéuticamente del mismo para la » elaboración de un medicamento para tratar un trastorno hiperproliferativo en un sujeto.

33.- El uso como se reclama en la reivindicación 32, en donde 15 dicho trastorno hiperproliferativo se selecciona del grupo que consiste en trastornos hiperproliferativos malignos, premalignos y no malig..os. i^^ggÜ^^^^^^fe^^^