MXPA00011976A - Metodos y composiciones protectores y curativos para el biocontrol de la descomposicion de plantas posterior a la cosecha. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a metodos y composiciones para el biocontrol de enfermedades en plantas, en particular enfermedades que causan descomposicion postcosecha de plantas. Las composiciones nuevas son " cocteles de biocontrol" que son combinaciones de microorganismos antagonicos y agentes antifungicos. Los microorganismos adecuados incluyen levaduras, tal como Candida spp. Los agentes antifungicos adecuados incluyen enzimas o combinaciones de enzimas, tal como lisozima o liticasa. Las composiciones se aplican a las plantas ya sea para prevenir o curar infecciones causadas por microorganismos, tales como hongos. Se presentan efectos sinergeticos. Los metodos y composiciones son comparables a o mejores que los fungicidas sinteticos o a cualquier agente solo.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PROTECTORES Y CURATIVOS PARA. EL BIOCCNTROL DE IA DESCOMPOSICIÓN DE PLANTAS POSTERIOR A LA COSECHA CAMPO pE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones nuevas para el ' biocontrol de enfermedades en plantas, en particular enfermedades que causan descomposición postcosecha. Los métodos y composiciones son tanto protectores y curativos. Se usan combinaciones de microorganismos antagónicos y agentes antifúngicos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El mercado de U.S. para el biocontrol de enfermedades postcosecha de frutos de árbol podría exceder los $100 millones para el año 2000 (Industrial Bioprocessing, Sept. 1992). En Postharvest News and Information (1991) se estimó que aproximadamente 25% de frutos y vegetales cosechados se pierden debido a enfermedades postcosecha. Los fungicidas sintéticos han sido los medios originales para controlar enfermedades postcosecha de frutos y vegetales. Sin embargo, la preocupación aumentada del público sobre la carcinogenicidad de fungicidas sintéticos, ha llevado al retiro de ciertos fungicidas del mercado. El desarrollo de resistencia a los fungicidas en agentes patógenos ha limitado a los fungicidas químicos como medios para controlarlos . Ref. 0125103 El control de enfermedades en plantas no es un problema limitado a los U.S. El Parlamento Europeo ha votado a favor de una prohibición total sobre el tratamiento postcosecha de frutos y vegetales con pesticidas en cuanto ésta prohibición llegue a ser factible. El retiro de fungicidas actuales del uso en los Estados Unidos y otras partes del mundo es crear un mercado nuevo, grande para agentes de control biológicos ("biocontrol"). Baker (1987) ha definido control biológico como "la disminución de inoculo o la actividad que produce enfermedad de un agente patógeno llevada a cabo a través de uno o más organismos, que incluyen la planta huésped pero que excluye al hombre". El costo para comercializar un agente de control biológico es mucho menos costoso que el costo para comercializar un pesticida sintético, debido a que solamente se requieren pruebas de toxicología de Tier 1 (Hofstein et al. 1994) . También, sí se selecciona correctamente un agente de control biológico, se requieren pocos estudios de impacto ambiental nuevos .

Un tipo de oente de control biológico es un microorganismo que es antagónico a agentes patógenos postcosecha. Por ejemplo, se han descubierto las levaduras antagónicas como agentes de biocontrol efectivos para el control biológico de enfermedades postcosecha (Wilson and El Ghaouth, 1993, 1997) . Sin embargo, no se han aceptado los microorganismos actualmente disponibles, ya que proporcionan un control comparable al control obtenido por el uso de fungicidas sintéticos. Ciertas limitaciones son debidas a la inabilidad de los microorganismos para curar infecciones establecidas previamente en las cosechas y para prevenir la continuación de infecciones quiescentes. Es deseable un biocontrol mejorado y más amplio.

Las hidrolasas antifúngicas, tales como quitinasa, ß-1, 3-glucanasa, lisozima, y liticasa, son proteínas moleculares inferiores que hidrolizan los componentes principales de paredes celulares fúngales y de levadura, ß-glucano y quitina (Bowles, 1990; Mauch et al., 1988; Schlumbaum et al., 1986; Kendra et al., 1989; Sahai and Manocha, 1993). Estas enzimas se reportaron que juegan un papel importante en la resistencia a enfermedades de plantas contra agentes patógenos invasores y pueden ser responsables de la actividad de biocontrol de ciertos antagonistas micróbicos. La acción de las glucanohidrolasas se reportó que inhibe el crecimiento fungal (Schlumbaum et al., 1986; Sela-Buurlage et al., 1993).

Se necesitan medios nuevos para controlar enfermedades postcosecha que sean seguros, efectivos, y factibles económicamente. La presente invención proporciona tales medios.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se dirige a composiciones nuevas que son combinaciones de microorganismos antagónicos con agentes antifúngicos, y a métodos para prevenir o curar enfermedades en plantas causadas por varios agentes patógenos postcosecha que causan descomposición de plantas aplicando las composiciones de la presente invención a las plantas. La "prevención o cura" se incluye bajo el término general "biocontrol" de plantas. El por ciento de plantas infectadas es una medida de control. La descomposición postcosecha es un fenómeno perjudicial que se controla por métodos y composiciones de la presente invención.

Las combinaciones de la presente invención forman un "coctel de biocontrol". Las levaduras antagónicas adecuadas incluyen aquellas del siguiente género: Candida spp; Cryptococcus spp/ Pichia spp/ Debaryomyces spp/ Bulleromyces spp/ Sporobolomyces spp; Rhodotorula spp/ Aureobasidium spp/ Issatchenkia spp/ Zygosaccharomyces spp/ Dekkera spp; y Hansenula. spp. Otros microorganismos adecuados incluyen bacterias, por ejemplo Pseudomonas syringae y Bacillus subtilus. Las enzimas adecuadas y compuestos bioquímicos incluyen las enzimas: quitinasa, laminarasa, quitosanasa, ß-1, 3 -glucanasa, lectinas; y los compuestos bioquímicos.: ß-1, 3 -glucano, ß-1, 4-glucano, un polisacárido de origen fungal o de levadura, y pplicationes, tal como glucoproteína.

En una modalidad preferida de una composición de la presente invención, el microorganismo antagónico es una levadura y el agente antifúngico es una enzima. Por ejemplo, la combinación de la propiedad antifúngica de una enzima, por ejemplo, lisozima y/o liticasa y la actividad de biocontrol de una levadura antagónica, por ejemplo, C. Sai toana, en donde la levadura puede funcionar contra el agente patógeno en la presencia de enzimas, proporciona una consistencia y eficacia mejorada en controlar el pudrimiento (descomposición) postcosecha. Además, la combinación de levadura antagónica (C. Sai toana) con lisozima o liticasa ofrece un control de la descomposición postcosecha de frutos y vegetales superior a aquel obtenido con una levadura antagonista sola o con una enzima sola, tal como lisozima o liticasa. Este mejoramiento y sinergismo es inesperado.

La combinación de microorganismos antagónicos, tal como una levadura, con enzimas antifúngicas (lisozima o liticasa) no se esperó trabajar con buen resultado para efectuar el biocontrol de agentes patógenos en plantas o para producir un efecto sinergético debido a las acciones conocidas de cada agente individualmente. Las hidrolasas antifúngicas, tales como quitinasa, ß-1, 3 -glucanasa, lisozima, y liticasa, se conocen para hidrolizar los componentes principales de las paredes celulares fúngales y de levadura, ß-glucano y quitina, y debido a eso afectan negativamente el crecimiento de las levaduras, tal como Candida spp. y de hongos filamentosos. Por lo tanto, se esperó una combinación de una levadura antagónica con enzimas antifúngicas para dañar la actividad de biocontrol de la levadura seleccionada. Sin embargo, inesperadamente, la combinación produjo un control mejorado de agentes patógenos.

Las composiciones que incluyen microorganismos antagónicos, tal como una levadura ( C. sai toana) con agentes antifúngicos, tales como las enzimas lisozima o liticasa, se pueden aplicar a plantas ya sea antes de o después de la infección debido a que las composiciones tienen tanto un efecto protector y un efecto curativo contra los agentes patógenos principales y por lo tanto ofrecen un nivel de control de descomposición mejor que aquel de los fungicidas químicos sintéticos .

Se contempla que una pluralidad de microorganismos antagónicos se pueden combinar, ya que los microorganismos no afectan de manera desfavorable el antagonismo, viabilidad, u otros parámetros que son necesarios para la actividad de los microorganismos antagónicos de acuerdo a la presente invención.

Además, no solo una pluralidad de microorganismos puede ser efectiva en combinación con un agente antifúngico, sino también puede ser efectiva una pluralidad de agentes antifúngicos, siempre que la pluralidad de agentes antifúngicos no afecte perjudicialmente l acción de biocontrol ya sea de otros agentes o microorganismos combinados con ellos.

Las composiciones de la presente invención se aplican a plantas por medios tales como rociadura, mojadura, o inmersión, los cuales son conocidos en la técnica. Las cantidades efectivas de agentes antifúngicos, por ejemplo, enzimas, se han encontrado que fluctúan desde 20 µg/ml hasta aproximadamente 1000 µg/ml, siendo preferido aproximadamente 100 µg/ml. Las cantidades efectivas de levaduras se ha encontrado que fluctúan desde aproximadamente 106 CFU hasta aproximadamente 108 CFU, siendo preferido 108 CFU. Se entiende, sin embargo, que las concentraciones óptimas variarán con situaciones particulares, y es conveniente dentro del nivel de especialidad en la técnica llegar a formulaciones óptimas siguiendo los procedimientos de prueba convencionales, tales como aquellos descritos por los Ejemplos aquí.

La complej idad del modo de acción mostrada por los agentes combinados de la presente invención hace el desarrollo de la resistencia a agentes patógenos en las plantas objetivo más difícil de lograr y presenta una barrera impeditiva de enfermedad altamente compleja.

La combinación de microorganismos antagónicos con compuestos bioquímicos antifúngicos proporciona un control efectivo contra los pudrimientos principales que afectan los productos agrícolas, tales como frutos de pomo, frutos cítricos, vegetales, cultivos de raíces, frutos de hueso, frutos tropicales, tomate, y otras plantas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los "cocteles de biocontrol" son composiciones de la presente invención que son combinaciones de microorganismos antagónicos a los agentes patógenos postcosecha que afectan perjudicialmente a los productos agrícolas, con agentes antifúngicos . La presente invención proporciona un efecto protector biológico, asi como un efecto curativo.

Los frutos y plantas que son objetivos para los métodos y composiciones de la presente invención incluyen frutos de pomo (por ejemplo, manzana, pera) ; frutos de hueso (por ejemplo, durazno, nectarina, ciruela pasa) ; frutos cítricos (por ejemplo, naranja, limón, toronja, mandarina) ; cultivos de raíces (por ejemplo, zanahoria, papa) ; vegetales (por ejemplo, tomate, pimiento dulce, pepino) ; frutos tropicales (por ejemplo, mango, plátano, guayaba, pina, aguacate) ; y frutos de melón.

Una modalidad de la invención es una composición que incluye levaduras antagónicas con enzimas antifúngicas. Entre las enzimas adecuadas para la práctica de la invención, las hidrolasas, tales como la lisozima o liticasa, se encontraron que incrementan significativamente la actividad biológica de las levaduras antagónicas, tal como C. Sai toana que se reportó por Wilson and El Ghaouth en la Patente de U.S. No. 5,591,429, incorporada aquí por referencia. La combinación de una levadura con uma enzima ejerce un efecto de biocontrol sinergéttico inesperado. Esta combinación hace posible aprovechar la propiedad biológica de enzimas antifúngicas y la actividad de biocontrol de un antagonista micróbico. Aunque las enzimas antifúngicas, tales como la lisozima y liticasa, son inhibitorias a los agentes patógenos postcosecha, tal como Botrytis cinérea (Tabla 1) , no muestran efecto sobre el crecimiento de la levadura C. sai toana (Tabla 2). Por lo tanto, se pueden combinar estos ingredientes y será mantenida la actividad de biocontrol de la levadura.

Inesperadamente, la combinación de levadura antagónica con lisozima o liticasa fue más efectiva en controlar la infección del manzano y cualquier planta del género cítrico que ya sea el antagonista o la enzima sola (Tablas 3 y 4) . El aumento de la concentración de lisozima desde 100 hasta 1000 µg/ml dio por resultado un incremento en la efectividad de la combinación (Tabla 3) . En la prueba lleva a cabo con frutos de naranjo, solamente el 30% y 26% de los frutos tratados con la combinación de C. sai toana con lisozima o liticasa se infectaron, mientras que solamente se enfermaron el 88%, 88%, y 58% de los frutos tratados con lisozima, liticasa, o C. sai toana . Todos los frutos de control se enfermaron (Tabla 4) . El mismo patrón del control de descomposición por la combinación también se observó en frutos de manzano y limonero. (Tablas 3 y 4) .

Además de tener un efecto protector, las composiciones de la presente invención, por ejemplo la combinación de levadura antagónica con lisozima o liticasa, también muestra una actividad curativa contra agentes patógenos postcosecha principales, por ejemplo, frutos de manzano y frutos cítricos (Tabla 5) . La combinación de C. sai toana con lisozima fue efectiva en controlar la descomposición de frutos de naranjo y limonero debida a la infección natural . El nivel de control de enfermedades obtenido con la combinación fue comparable a aquel obtenido con el fungicida recomendado Imazalil (Fungaflor 500EC, 44.6% de ingrediente activo, Janssen Pharmaceutica, Titusville, NJ) . (Tabla 6) .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ilustran ciertas de las modalidades de la invención: Ejemplo 1: Efecto ¿Le Enzima Antifúngica Sala sstexs el Crecimiento sie Agen es Patógenos de Enfermedad Postcosecha y sobre la Levadura La actividad inhibitoria de enzimas antifúngicas, en este ejemplo, lisozima y liticasa, contra el agente patógeno Botrytis cinérea, se determinó en un plato de microtítulo de 24 pozos. Las soluciones de caldo de extracto de maltosa al 0.2% esterilizadas en autoclave se rectificaron con soluciones esterilizadas con membrana de lisozima y liticasa para obtener una concentración de 0.1% y 0.5% de lisozima y liticasa, respectivamente. En cada pozo se dispersó 100 microlitros de la solución de enzima. Cada pozo se inoculó con 500 esporas de B. Cinérea . Cuatro replicas de ocho pozos se usaron para cada tratamiento. Los platos de microtítulo se incubaron en la oscuridad a 24 °C. El por ciento de germinación de esporas se determinó después de 24 horas . Los resultados se mostraron en la Tabla 1. Las esporas se inhibieron por cualquier enzima.

También se determinó el efecto de la lisozima y liticasa sobre la supervivencia de C. sai toana en caldo de maltosa de levadura. Los matraces de cultivo que contienen soluciones estériles de caldo de maltosa de levadura al 0.2% se rectificaron con soluciones esterilizadas con membrana de lisozima y liticasa para obtener una concentración de 0.1% y 0.6% de lisozima y liticasa, respectivamente. Cada matraz se inició con aproximadamente 104 unidades de formación de colonias (CFU) de levadura y los matraces se incubaron en un agitador orbital fijo a 200 rpm. Las muestras se colectaron y se colocaron en placas por duplicado en medio de levadura-agar de maltosa. Las placas se incubaron a 24 °C y las colonias se contaron después de 48 horas. La Tabla 2 muestra que no hubo un efecto sobre la supervivencia de levadura tratada con las enzimas .

Ej emplo 2 : Actividad de Biocontrol Protectora y Curativa de la Combinación de Enzimas Antifúngicas con Levadura.

Las células de levadura de cultivos de 48 horas de viejos de C. sai toana se convirtieron en pellets por centrifugación, se volvieron a suspender en agua destilada estéril, y se centrifugaron. Los pellets se suspendieron en agua, lisozima al 0.01% y 0.1% y liticasa al 0.6%, y la concentración de la suspensión de levadura se ajustó hasta 108 CFU/ml.

Los frutos de manzano, naranjo y limonero se lesionaron individualmente y cada lesión se trató con cincuenta microlitros de uno de los siguientes tratamientos : agua estéril de control; suspención de células de levadura (C. sai toana) , - suspensión de células de levadura que contiene lisozima al 0.01% ó 0.1%; suspensión de células de levadura que contiene liticasa al 0.6%; lisozima al 0 . 01% ó 0 . 1% ; liticasa al 0 . 6% .

Las lesiones en los frutos se trataron ya sea con los diferentes tratamientos y luego se inocularon con 20 µl de una suspensión de esporas como agente patógeno para determinar los efectos protectores, o se inocularon con una suspensión de esporas como agente patógeno y 24 horas después se trataron con los diferentes tratamientos para determinar los efectos curativos. Las lesiones de manzanas se inocularon (es decir, los agentes patógenos se colocaron en la lesión) con los agentes patógenos B. Cinérea y P. expansum, mientras que las lesiones de naranjas y limones se inocularon con P. digi tatum . Los frutos ' tratados se incubaron a 24 °C en bandejas a alta humedad. Para cada tratamiento, 20 hasta 100 frutos se arreglaron en un diseño de bloques completo aleatorizado. El por ciento de infección se determinó para cada tratamiento después de 7 días de almacenamiento. Las pruebas se repitieron dos veces. Los resultados de los efectos protectores sobre la descomposición de frutos de manzano se muestran en la Tabla 3. El grado más grande de protección se mostró por el tratamiento de lisozima al 0.1% y C. sai toana . El control de descomposición de naranjas y limones fue más efectivo usando ya sea lisozima al 0.01% o liticasa al 0.1% y levadura (Tabla 4). El efecto fue mayor que para cualquier agente solo.

En lo anterior, la falta de actividad curativa se ha identificado como una limitación principal de planteamientos biológicos para el cont ol de agentes patógenos. En realidad, el tratamiento de frutos de manzano y frutos cítricos con ya sea C. sai toana, lisozima, y liticasa tuvo poco efecto sobre la infección establecida causada por P. expansum y P . digi tatum (Tabla 5) , que la combinación de levadura antagónica con lisozima o liticasa, la cual fue muy efectiva en controlar infecciones que se presentaron 24 horas antes de la aplicación del tratamiento. La actividad curativa observada de la combinación mostró la sinergia entre el antagonista y la enzima antifúngica (lisozima o liticasa) .

También se hicieron pruebas adicionales para determinar el efecto de diferentes combinaciones de compuestos bioquímicos y microorganismos sobre infecciones naturales de frutos cítricos. Los frutos de naranjo y limonero de los recipiente de campo se lavaron en línea siguiendo las prácticas comerciales estándar [Precloro Estándar fue (50 ppm) ; clasificación de imperfecciones en tamaño y color, y aleatorizado]. Después los frutos se lavaron y se trataron con ya sea agua, una suspensión de células de levadura que contiene lisozima al 0.1%, o Imazalil usando un sistema de rociadura en línea. Cada tratamiento consistió de al menos 8 hasta 13 cajas de frutos; cada caja representa una replica de aproximadamente 60 hasta 100 frutos. Los frutos se mantuvieron a 50-55 °F y el porcentaje de descomposición se determinó después de 3 semanas . Los resultados se muestran en la Tabla 6.

Tabla 1 -- Efecto de la Lisozima y Liticasa sobre la Germinación de Esporas .

Tratamiento Inhibición de la Germinación (%) Botrytis cin rea Caldo de extracto de maltosa (MEB) lisozima al 0.1% + MEB 100 liticasa al 0.6% + MEB 100 aLos pozos de microtítulo que contienen soluciones de lisozima y liticasa rectificadas con caldo de extracto de maltosa al 0.2% se inocularon con 500 esporas de Botrytis cinérea y el plato de microtítulo se incubó a 24 °C. La germinación de esporas se determinó después de 24 horas.

Tabla 2 -- Supervivencia de Candida sai toana en Soluciones de Enzima Diferentes.

Recuentos de Células de Levadura (CFU/ml) Tratamiento 1 día 4 días Caldo de maltosa de levadura (YMB) >2.0 X 10 >2.0 X 10 lisozima al 0.1% + YMB >2.0 X 10" >2.0 X 10" liticasa al 0.6% + YMB >2.0 X 10" >2.0 X 10- bLas soluciones de lisozima y liticasa rectificadas con caldo de maltosa de levadura se inocularon con 104 células de levadura/ml y las soluciones se almacenaron a temperatura ambiente . La supervivencia de la levadura se determinó a diferentes tiempos durante un periodo de 4 días .

Tabla 3 -- Efecto Protector de la Combinación de Candida sai toana con Concentraciones Diferentes de Lisozima sobre la Descomposición de Frutos de Manzano Causada por Botrytis cinérea .

Frutos Infectados (%) a Tratamiento0 Botrytis cinérea Control 100a Lisozima al 0.01% 100a lisozima al 0.1% 100a C. sai toana 32b Lisozima al 0.01% + C. sai toana 35b Lisozima al 0.1% + C. sai toana 17c cLas lesiones en manzanas se trataron con diferentes tratamientos y luego se inocularon por interrogación con 20 µl de B. Cunerea a 104 conidios/ml . Los frutos se evaluaron por síntomas de descomposición después de 18 días de almacenamiento a 24°C. dLas columnas con la misma letra no son diferentes significativamente de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan (P=0.5). Aquellas con letras diferentes muestran diferencias significantes (Steele and Torrie, 1960) .

Tabla 4 -- Efecto Protector de la Combinación de Candida sai toana con Lisozima o Liticasa sobre la Descomposición de Frutos de Naranjo y Limonero Causada por Penicillium digi tatum .

Frutos Infectados (%) L Tratamiento Penicillium digi tatum Limón Naranj a Control 100a 100a lisozima al 0.01% 86b 88b liticasa al 0.1% 85b 88b C. sai toana 53c 58c lisozima al 0.01% + C. sai toana 21d 30d liticasa al 0.1% + C. sai toana 15d 26d eLos frutos de naranjo y limonero se lesionaron y las lesiones inmediatamente después se trataron con los diferentes tratamientos. Las lesiones tratadas se inocularon por interrogación con 20 µl de P. digi tatum a 104 conidios/ml. Los frutos se evaluaron por síntomas de descomposición después de 7 días de almacenamiento a 24 °C. fLas columnas con la misma letra no son diferentes significativamente de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan (P=0.5) Tabla 5 -- Efecto Curativo de la Combinación de Candida sai toana con Lisozima o Liticasa sobre la Descomposición de Frutos de Manzano, Naranjo y Limonero Tratamientoy Frutos Infectados (%)h Manzana Limón Naranja Control 56a 100a 100a C. sai toana 78b 97a 96a lisozima al 0.1% 33c 82b 79b liticasa al 0.6% 22d 77b 74b lisozima al 0.1% + C. sai toana 33c 27c 32c liticasa al 0.6% + C. sai toana lie 32c 23 9Las lesiones en manzanas se inocularon con suspensiones de esporas de P. expansum, mientras que las lesiones en naranjas y limones se inocularon por interrogación con P. digi tatum. Después de 24 horas de incubación a 24 °C, las lesiones inoculadas se trataron con 50 µl de 108 CFU/ml de células de levadura (cepas C. sai toana) suspendidas en agua estéril, lisozima o liticasa al 0.1%. Los frutos se evaluaron por síntomas de descomposición después de 7 días de almacenamiento a 24°C.

Las columnas con misma letra no son diferentes significativamente de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan (P=0.5) .

Tabla 6 -- Efecto de la Combinación de Candida saitoana con Lisozima sobre la Infección Natural de Frutos de Naranjo y Limonero .

Tratamiento Frutos Infectados (%) J Penicillium digi tatum Limón Naranj a Control 11.2a 11.7a lisozima al 0.1% + C. sai toana 6.7b 4.3b Imazalil 4.6b 2.4b ^os frutos de naranjo y limonero se trataron dentro de 48 horas después del cultivo bajo las condiciones semicomerciales usando una línea de procesamiento. Los frutos de los recipientes de campo se lavaron en línea siguiendo prácticas comerciales estándar y luego se trataron con agua, suspensión de células de levadura (cepas C. sai toana) que contiene lisozima al 0.1%, o Imazalil usando un sistema de rociadura lineal. Cada tratamiento consistió de 8 hasta 10 cajas de frutos; cada caja representa una replica de 70 hasta 100 frutos. El porcentaje de descomposición se determinó después de 3 semanas.

-'Las columnas con la misma letra no son diferentes significativamente de acuerdo a la prueba de rango múltiple de Duncan (P=0.5) .

MATERIALES Y MÉTODOS Preparación de Frutos Se cosecharon a mano manzanas maduras (cultivo Red Delicious) en la Appalachian Fruit Research Station, Kearneysville, WV. Los frutos de naranjo (cultivo Valencia o Navel) y limonero (cultivo Eureka) se compraron y almacenaron a 4°C. Los frutos se escogieron para eliminar cualquier fruto con daños o infecciones aparentes .

Preparación de Microorganismos Causantes de Enfermedad en la Planta Los cultivos de Botrytis (B. ) cin rea, Penicillium (P. ) expansum Link, y Penicillium (P. ) digi tatum se mantuvieron en agar de dextrosa de papa (PDA) . Las suspensiones de esporas de los cultivos se obtuvieron inundando los cultivos de 2 meses de viejos de B. cin rea, P. expansum Link, y P. digi tatum con agua destilada estéril que contiene Tween 80 al 0.1% (v/v) . [Sigma Chemical Co. , St. Louis, MO.] Los recuentos de esporas se determinaron con un hemocitómetro, y la concentración de esporas se ajustó con agua destilada.

Preparación de Levadura La levadura C. sai toana se cultivó durante 48 horas a 27 °C. Los cultivos en el matraz agitado de caldo de levadura nutriente se iniciaron con aproximadamente 108 CFU de levadura y se incubaron en un agitador orbital fijo a 200 rpm durante 48 horas. Las células de levadura se colectaron por centrifugación a 3000 g durante 20 minutos, se volvieron a suspender en agua destilada estéril, y se centrifugaron. Los pellets resultantes se dispersaron en agua destilada estéril y la concentración de la suspensión de levadura se ajustó a 108 CFU/ml.

DOCUMENTOS CITADOS Baker, K.F. (1987), Ann. Rev. Phytopathol . 25:67-85. Bowles, D.J. (1990), Ann. Rev. Biochem . 59:873-907. Düring, K. (1993), Plant Mol . Biol . , 23:209-214. Hofstein, R.S., Droby, S., Chalutz, E., Friedlander, T. (1994) In: Wilson, C.L., Wisniewski, M.E. (eds.) Biological Control of Postharvest Diseases of Frui ts and Vegetables . CRC Press, pp. 89-100. Industrial Bioprocessing (Sept., 1992). Kendra, F.D., Christian, D. and Haldwiger, L.A. (1989), Physiol .

And Mol . Plant Path . , 32:215.

Mauch, F., Mauch-Mani B. and Boller T. (1988), Plant Physiol . , 88:936-942. Postharvest News & Information (1991) . Sahai, A.S., and Manocha, M.S. (1993), FEMS Microbiology Reviews, 11:317-339. Schlumbaum, A., Mauch, F., Vogeli, U. , and Boller, T. (1986), Nature, 324:365. Sela-Buurlage, M.B., Ponstein, A.S., Bres-Vloemans, B., Melchers, L.O., Van den Elzen, P., Cornelissen, B.J.C. (1993), Plant Physiol . , 101:857-863. Steele, R.D. and Torrie, J.H. (1960) Principies and Procedures of Statistics, McGraw-Hill, New York, N.Y. Wilson, C.L. and El Ghaouth, A. (1993) Symposium Proceeding. Bel tsville Symposium XVIII, American Chemical Society. Wilson, C.L. and El Ghaouth, A., U.S. Patent No. 5,591,429 (1997) .

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims (12)

REIVINDICACIONES

1. Una composición para el biocontrol de enfermedades en plantas, caracterizada porque la planta comprende una levadura y una enzima antifúhgica.

2. La composición de conformidad a la reivindicación 1, caracterizada porque la levadura se selecciona del grupo del género que consiste de Candida, Cryptococcus, Pichia, Debaryomyces , Bulleromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula, Aureobasidium, Issatchenkia, Zygosaccharomyces , Dekkera, y Hansenula, o combinaciones de los mismos, y la enzima antifúngica es una hidrolasa seleccionada del grupo que consiste de lisozima, liticasa, quitinasa, laminarasa, quitosanasa, ß-1 , 3-glucanasa, y lectinas.

3. La composición de conformidad a la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es un fruto.

4. La composición de conformidad a la reivindicación 1, caracterizada porque la planta es un vegetal .

5. Un método para el biocontrol de enfermedades en una planta, caracterizado porque el método comprende aplicar la composición de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3, 4, 5, ó 6 a la planta.

6. El método de conformidad a la reivindicación 5, caracterizado porque la planta es un fruto.

7. El método de conformidad a la reivindicación 6, caracterizado porque el fruto se selecciona del grupo que consiste de manzanas, duraznos, y frutos cítricos.

8. El método d.e conformidad a la reivindicación 5, caracterizado porque la planta es un vegetal .

9. El método de conformidad a la reivindicación 8, caracterizado porque el vegetal se selecciona del grupo que consiste de tomate, pimiento dulce, y pepino.

10. El método de conformidad a la reivindicación 5, caracterizado porque la planta se infecta con la enfermedad antes de que se aplique la composición.

11. Uso de la composición de conformidad a la reivindicación 1 para controlar enfermedades de una planta.

12. El uso de la composición de conformidad a la reivindicación 15, en donde el control es reducir el por ciento de plantas infectadas .