MXPA00011012A - Uso del interferon alfa 5 en el tratamiento de las hepatopatias virales - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a uso del interferon alfa 5 en el tratamiento de las hepatopatias vírales. La invención se refiere al uso del interferon alfa 5 en el tratamiento de las hepatopatias vírales. La invención describe la síntesis disminuida de IFNalfa5 en hígados de pacientes con hepatitis C, frente a hígados de controles sanos. El subtipo de IFN expresado en dichos hígados sanos, correspondióúnicamente al subtipo alfa 5, frente a los diferentes subtipos expresados en hígados enfermos. En SEQ ID NO:1 se muestra la secuencia parcial de cADN correspondiente a IFNalfa5. Estas diferencias significativas entre los patrones de expresión de unos hígados y otros ponen de manifiesto la importancia del uso de este subtipo de interferon en la fabricación de composicionesútiles en el tratamiento de hepatopatias de origen viral. En la invención se describe pormenorizadamente esta utilización bajo diferentes formas y procedimientos, incluyendo aquellos que utilizan la producción de proteínas recombinantes, a partir de secuencias tipo SEQ ID NO:1.

Description

USO DEL INTERFERON ALFA 5 EN EL TRATAMIENTO DE LAS HEPATOPATIAS VIRALES Ámbito de la invención La invención se relaciona con ia producción de interfercn alfa 5 para su utilización en composiciones útiles en ei tratamiento de las hepatopatias de origen viral. Hemos comprobado que el IFN-aifa 5 es el único subtipo de interferon alfa producido en el higado sano y que sus niveles se encuentran claramente descendidos en la hepatitis crónica C lo que pone de manifiesto el valor terapéutico de esta sustancia en el tratamiento de esta enfermedad y de otras hepatitis víricas. Al conocerse la secuencia génica codificante de este interferon, la producción del mismo por tecnología de ADN recombinante en diferentes huéspedes, permite el desarrollo de fármacos eficaces para el tratamiento de este tipo de hepatopatias, en sus diferentes fases de evolución.

Estado de la técnica anterior Las células infectadas pueden reconocer la presencia de virus iniciando señales que llevan a la transcripción y secreción de interferon tipo I (IFNoc e IFNß) . El IFNa es Ref: 124952 una familia de 13 polipéptidos (subtipos) codificados por diferentes genes. El IFNß es una glicoproteina producida por un único gen. Diversos tipos celulares producen tanto IFNa como IFNß (1,2) . La infección viral es el principal estimulo para la producción de interferon tipo I, aunque también existen otros factores que pueden aumentar su síntesis, como son componentes bacterianos, RNA de doble cadena, factores de crecimiento y otras citoquinas (1) . Además de la acción an-tiviral del IFNa, éste puede interactuar con cierras cito-quinas y con las células T regulando el crecimiento y diferenciación de las células del sistema inmune (3) . Los genes del IFNa son expresados constitutivamente en tejidos humanos de individuos sanos (4), aunque ia expresión de de-terminados subtipos está restringida a ciertos tipos celulares (5,6). La inducción de IFN por virus es regulada principalmente a nivel transcripcional . La activación transcripcional especifica ocurre por la interacción de factores celulares inducidos por virus con los dominios reguladores de los promotores de los genes del IFNa. (7) . Todos los subtipos de IFNa e IFNß poseen un receptor común en la superficie de las células. Ensayos de competición de unión al receptor de diversos subtipos de IFNa indican que todos ellos 'se unen al mismo receptor, pero con diferente afinidad (8). La actividad biológica de los dife rentes subtipos de IFNa es poco conocida. Los subtipos de interferon IFNa5 e IFNa8 parecen ser ios que tienen mayor actividad antiviral. La respuesta antiproliferativa también es diferente entre los diversos subtipos (9) . En humanos, las células mononucleares de sangre periférica no estimuladas expresan diversos subtipos de IFNa (10). Un mecanismo común de persistencia de la infección viral es la evasión del sistema del IFN. Muchos virus han desarrollado estrategias para evitar los efectos antivi-rales del IFN. Concretamente, un defecto selectivo en la producción de IFNa ha sido descrito en monocitos infectados por el virus de la inmunodeficiencia humana (11) . El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus RNA de cadena sencilla que conlleva a una infección crónica en más de dos tercios de las personas infectadas. La prevalencia de infección por el VHC es alrededor del 2 al 3% en la población occidental. Estudios desarrollados en Europa muestran que el 33% de los pacientes con infección crónica por el VHC desarrollan cirrosis en un tiempo medio inferior a 20 años (12) . Una proporción significativa de estos pacientes desarrollan cáncer hepático, con una incidencia anual del 1,4% (13). Ha sido difícil encontrar la razón del alto grado de persistencia de la infección por el VHC. La alta tasa de mutaciones del virus y la producción de un perfil predominante de citoquinas Th2 respecto a Thl han sido descritas como las responsables de este alto grado de persistencia de la infección. El tratamiento con IFN induce una respuesta sostenida en alrededor del 30% de los pacientes con hepatitis crónica C. El mecanismo responsable de respuesta o no respuesta al tratamiento con IFN es poco conocido. El sistema del IFN apenas ha sido estudiado en la infección crónica por el VHC. No existe un modelo animal apropiado de infección crónica por el VHC, por ello, los estudios realizados en humanos son la única fuente de información sobre la patofisioiogia y patogénesis de la hepatitis crónica C. En la presente invención se describe la expresión de los genes IFNa e IFNß en higado y en células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de controles sanos y pacientes con hepatitis crónica C. Además, hemos analizado el subtipo de IFNa expresado en tejido hepático normal y tejido hepático de pacientes con hepatitis crónica C. La expresión de los diferentes subtipos de IFNa también fue analizada en CMSP de controles sanos y de pacientes con hepatitis crónica C.

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DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Pacientes y controles La expresión génica de IFNa e IFNß fue analizada en muestras de biopsias hepáticas de 16 pacientes con hepa-titis crónica C (9 hombres y 7 mujeres, rango de edad de 24 hasta 71 años) . Cinco de estos pacientes presentaban cirrosis. El genotipo viral se determinó en 14 pacientes y resultó ser Ib en 10 pacientes, la en 2 pacientes y geno-tipo 3 en 1 paciente. Además, la expresión génica de IFNa e IFNß fue determinada en 12 muestras de higado normal obtenidas mediante laparato ia de 12 pacientes control (9 hombres y 3 mujeres, rango de edad de 49 hasta 70 años) . La laparatomia fue realizada debido a la presencia de tumores digestivos en 10 pacientes (4 de colon-recto, 5 gástricos y 1 pancreático), debido a pancreatitis crónica en 1 paciente y a la presencia de quiste hiatidico en otro paciente. En los doce casos la histología hepática era normal. Ninguno de estos casos control habia recibido tratamiento previamente a la obtención de la muestra hepática. Los niveles de RNAm de IFNa e IFNß también fueron determinados en CMSP de 25 pacientes con hepatitis crónica C (14 hombres y 11 mujeres, rango de edad de 24 hasta 69 años) (cuatro de estos pacientes presentaban cirrosis) y en CMSP de 23 controles sanos (10 hombres y 13 mujeres, rango de edad de 25 hasta 66 años) . El genotipo viral de estos pacientes era Ib en 22 pacientes, la en dos pacientes y 3 en 1 paciente. El diagnóstico de hepatitis crónica C se basó en una elevación de transaminasas séricas durante más de 6 meses, positividad para los anticuerpos anti-VHC (ELISA 2a generación, Ortho Diagnostic System, Raritan, NJ, USA) , presencia de RNA del virus C en suero (transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa) , y evidencia histológica de hepatitis crónica. La severidad del daño hepático fue evaluado por el Índice de Knodell (16) . Fueren excluidas otras causas de hepatitis crónica diferentes al virus de la hepatitis C. Ninguno de los pacientes habla recibido trátamiento con IFNa durante, al menos, los 6 meses previos al estudio.

Preparación de las muestras hepáticas , CMSP y suero Las muestras hepáticas fueron obtenidas mediante biopsia hepática realizada con aguja de biopsia Tru-Cut (Baxter, Deerfield, IL) . Un tercio de la muestra se congeló inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardó a -80°C hasta la extracción del RNA total. El resto de la muestra se utilizó para el estudio histológico. Las CMSP se aislaron a partir de sangre heparinizada mediante un gradiente de densidad con Lymphoprep (Nycomed Pharma As, Oslo, Noruega), centrifugadas a 600 g durante 30 minutos. Después de la centrifugación, las CMSP fueron recogidas, lavadas 5 veces con CINa al 0,9% y Usadas con la solución desnaturalizante de proteínas Ultraspec™ (Biotech Laboratories, Houston, USA) . El usado celular fue guardado a -80°C hasta la extracción del RNA total que fue realizada según el método de Chomcznski y Sacchi (17) . Las muestras de suero fueron obtenidas mediante cen-trifugación a partir de sangre venosa recogida en tubos estériles. El suero se guardó a -40°C hasta su utilización.

Análisis de la expresión génica de IFNa e IFNß en higado y CMSP Los niveles de RNAm de IFNa e IFNß fueron determinados mediante un método cuantitativo de transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) , utilizando un termociclador (Perkin-Elmer Gene Amp PCR system 2400) . Previamente a la transcripción reversa, 2 µg de RNA total (tanto de hígado como de CMSP) fueron tratados con 1 unidad de desoxirribonucleasa (DNase I amplification grade, Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) para eliminar el posible DNA contaminante. La presencia de trazas de DNA fue chequeada incluyendo reacciones control sin transcripción reversa. Este paso es requerido debido a la ausencia de intrones en los genes de IFNa e IFNß (18), lo que nos hace indistinguible el producto de PCR procedente del RNA o del posible DNA contaminante. Todos los controles realizados sin transcripción reversa fueron negativos, indicando ausencia de DNA contaminante. El RNA total fue transcrito (60 minutos a 37°C) ccn 400 unidades de M-MuLV transcriptasa reversa (Gibco-BRl, Gaithersburg, Md, USA) en un volumen final de 40 µl de solución salina 5x (250 mM Tris-HCl pH 8,3, 375 mM KC1, 15 mM MgCl2) , suplementado con 5mM DTT, 0,5mM desoxirpoonucleótidos trifosfato (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) , 48 unidades inhibidor de RNAsas (Promega Corporation, MD, US) y 400 ng de hexámeros aleatorios (Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania) . Después de desnaturalizar la transcriptasa reversa (95°C, 1 minuto) y rápidamente enfriar sobre hielo, una alícuota de 10 µl (0,5 µg) del cDNA fue utilizada para la amplificación de IFNa e IFNß por PCR en 50 µl de lOx bufer de PCR (160 mM (NH4),S04, 670 mM Tris-HCl pH 8,8, 0,1% Tween 20) suplementado con los cebadores sentido y antisentido (40 ng de cada uno para IFNa y 60 ng para IFNß) , 1,2 M MgCl, y 2 unidades de Biotaq™ DNA polimerasa (Bioline, Londres, UK) . En todos los experimentos fueron realizadas reacciones control sin RNA. Como control interno de cada muestra se realizaron amplificaciones de un fragmento de cDNA ß-actina, utilizando una alícuota de 10 µl del cDNA obtenido anteriormente. El IFNa fue amplificado realizando 30 o 33 ciclos (CMSP o hígado respectivamente) (94°C, 60°C y 72°C durante 20, 15, y 30 segundos cada paso respectivamente), el IFNß fue amplificado realizando 30 o 35 ciclos (CMSP o hígado respectiva-mente) (94°C, 58°C y 72°C durante 20, 15, y 30 segundos ca-da paso respectivamente) y la ß-actina fue amplificada realizando 18 o 25 ciclos (PBMC o hígado respectivamente) (94°C, 55°C y 72°C durante 20, 15, y 30 segundos cada paso respectivamente) , protocolos que evitan interferencias con la fase de saturación de la reacción de PCR. Los oligonucleótidos (5' -3') d(TCCATGAGATGATCCAGCAG) y d(ATTTCTGCTCTGACAACCTCCC) fueron utilizados como cebadores sentido y antisentido, respectivamente, para amplificar un fragmento de 274 pares de bases localizado entre los nú-cleótidos 240-514 del gen humano del IFNa (19). Estos oligonucleótidos son cebadores consenso diseñados para amplificar todos los subtipos de IFNcc. Los oligonucleótidos d(TCTAGCACTGGCTGGAATGAG) y d (GTTTCGGAGGTAACCTGTAAG) fueron los cebadores utilizados para amplificar un fragmento de 276 pares de bases localizado entre los nucleótidos 349-625 del cDNA del IFNß humano (20). d (TCTACAATGAGCTGCGTGTG) y d(GGTGAGGATCTTCATGAGGT) fueron los cebadores utilizados para amplificar un fragmento de 314 pares de bases (nucleótidos 1319-2079) del gen de la ß-actina (21) . Después de las reacciones de amplificación, 20 µl del producto de PCR fueron corridos en un gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio. Las bandas obtenidas se visualizaron con una lámpara de luz ultravioleta y fueron analizadas con un programa comercial (Molecular Analyst/PC, Bio-Rad) , capaz de digitalizar y analizar la imagen obteni-da. Finalmente, los valores correspondientes a la expresión génica del IFNa o IFNß fueron normalizados con sus correspondientes de ß-actina. Los resultados se expresaron como el cociente entre el valor de IFNa o IFNß y el correspon-diente de ß-actma. Previamente, nosotros demostramos que el RNAm de ß-actina se expresaba constantemente tanto en hígado como en CMSP de pacientes con hepatitis crónica C (22), lo que nos permite normalizar los valores de IFNa e IFNß con los obtenidos de ß-actina. Se realizaron curvas de validación de la técnica de PCR partiendo de cantidades conocidas de RNA total (de 0 hasta 1 µg) . Como se observa en la figura 3, con las cantidades de RNA total inicial utilizadas para IFNa, IFNß o ß-actina (0,5 µg, tanto en hígado como en CMSP), nos encontramos en el rango lineal de la curva de amplificación de la PCR. El coeficiente de variación interensayo para IFNa/ß-actina fue 22% y para IFNß/ß-actina fue 24%. Se comprobó la identidad del producto de PCR obtenido para IFNa e IFNß mediante secuenciación automática (ABI PRISM™ 310 Genetic Analizer, Perkin Elmer) . Identificación de los subtipos de IFNa La extracción de RNA total, transcripción reversa y reacción de PCR se realizó como describimos anteriormente, utilizando los cebadores consenso de IFNa mencionados. El producto de PCR obtenido fue clonado utilizando el kit comercial de clonaje TOPO TA (Invitrogen, Leek, Holanda) . Al menos 6 clones de cada inserto fueron secuenciados en un secuenciador automático ABI PRISM 310 (Perkin Elmer, Foster, CA) , utilizando el kit de secuenciación Dye Rhodamine Terminator Cycle Secuencing Kit (Perkin Elmer, Forter CA) .

Detección, cuantificación y genotipaje del RNA del virus C La presencia del RNA del virus C en suero se determinó mediante la técnica de RT-PCR (14, 22), utilizando 2 pares de cebadores específicos de la región 5 'no codificante del genoma del virus C. El RNA del virus C fue cuantificado mediante la técnica de PCR competitiva descrita por nosotros anteriormente (22) . El genotipo viral fue determinado siguiendo el método de Viazov (23) y como anteriormente ya fue descrito (22,24). Para determinar el genotipo 4 se utilizó la sonda 5 'G (A, G) CCGTCTTGGGGCC (A, C) AAATGAT.

Análisis estadístico Los resultados de IFNa e IFNß son presentados como la media±error standard. La normalidad de las variables fue estudiada con el test de Shapiro-Wilks. 'El análisis estadístico de los valores de IFNa e IFNß en CMSP o hígado se realizó con test no-para étricos (Mann-Whitney U test) o paramétricos (T de Student) . La asociación entre variables cuantitativas fue estudiada con el coeficiente de correlación de Pearson o Spearman, según correspondía. Para realizar el análisis estadístico se utilizó el programa informático SPSS 6.0 de Windows.

Producción de proteina recombinante Expresión y purificación de interferon-a5 humano en esche-ricnia cc- : A pesar de que la expresión de cDNAs procedentes de organismos eucariotas en Escheri chia coli asegura, en general, un alto nivel de producción, el aislamiento y purificación ae la proteína de interés implica procedimientos complejos así como bajos rendimientos. Por esta razón, se utilizan vectores de expresión que facilitan la obtención de proteínas de fusión cuya purificación se reduce a un paso de cromatografía de afinidad, de alto rendimiento y eficacia. Construcción del vector de expresión y obtención de bacterias recombinantes El cDNA que codifica para el interferon-a5 se clonará en el vector pET14b (disponible comercialmente, Novagen) .

Este vector proporciona una secuencia que codifica para una serie de residuos de histidina (1 kDa) y que se traducirán en fase con el cDNA clonado para rendir una proteína de fusión que contendrá en su extremo amino terminal una cola de histidinas de 1 kDa y a continuación el interferon-a5, con un sitio de corte por trombina entre ambos. Una vez obtenido el vector de expresión, se prepararán bacterias competentes de la cepa BL21(DE3) ya que esta cepa contiene un gen inducible de la RNA poiimerasa de T7, que será un requisito necesario para la posterior producción de proteína. Las bacterias competentes se transformarán con el vector obtenido previamente (pET14b con el cDNA del interferon-a5 clonado) . Las bacterias transformadas se seleccionarán por su crecimiento en medio LB con ampicilina, ya que el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico.

Expresión y purificación del interferon-a5 : Las bacterias transformadas se crecerán en medio LB con ampicilina a 37°C hasta una densidad óptica de 0,4 a 600 nm. A continuación se inducirá la expresión de la proteína recombinante con IPTG a una concentración final de 0.5 mM. De esta forma se induce el promotor lac y como consecuencia, el promotor de la RNA polimerasa de T7 que contiene el vector y que regula la expresión del cDNA clonado. El cultivo se crecerá 4 horas más en las mismas condiciones . Para obtener los extractos, una vez crecidas las bac terias, se centrifugarán a 4°C. Las bacterias precipitadas se resuspenderán en un tampón Tris/HCl 10 mM, sacarosa 10%, 2-mercaptoetanol 2 mM e inhibidores de proteasas. La homogeneización se realizará por sonicación tras una incubación de 30 minutos con lisozima a 4°C. Esto permitirá romper la pared bacteriana y mejorar el rendimiento del -proceso de extracción. El extracto citosólico se obtendrá a partir de la centrifugación del homogenado a 100.000 x g durante 90 minutos. La producción de proteína se verificará mediante el análisis de la fracción citosólica por SDS-PAGE. La purificación de la proteína de fusión His-interferon-a5 se purificará mediante la cromatografía del extracto citosólico en una columna de Níquel de 2 ml. Tras el lavado de la columna, la proteína se eluirá con 1 M imidazol. La proteína pura se procesará con trombina y el interferon-a5 se repurificará posteriormente mediante cromatografía de exclusión molecular.

Expresión y purificación de interferon-a5 humano en solanum tiijbero.su.ii: Construcción del vector de expresión y obtención de plantas transgénicas El cDNA que codifica para el interferon-a5 se clonará en un vector de expresión de Agrobacterium tumefaciens . Este vector contiene el promotor de la patatina (proteina más abundante en el tubérculo de Solanum tuberosum) , además de una secuencia que codifica para una serie de residuos de histidina (1 kDa) y que se traducirán en fase con ei cDNA clonado para rendir una proteína de fusión que contenerá en su extremo amino terminal una cola de histidinas de 1 kDa y a continuación el interferon-a5, con un sitio de corte por trombina entre ambos. Una vez obtenido el vector de expresión, se prepararán bacterias competentes de la cepa GV2260 de Agrobacterium tumefaciens . Las bacterias competentes se transformarán con el vector obtenido previamente. Las bacterias transformadas se seleccionarán por su crecimiento en medio LB con kanamicina, ya que el vector contiene un gen de resistencia a este antibiótico. Posteriormente se realizará un cocultivo de las bacterias transformadas con el material vegetal (hojas de Solanum tuberosum cultivadas in vi tro) y se seleccionarán las células vegetales resistentes a kanamicina. Estas células se regenerarán hasta la obtención de plantas transgénicas.

Obtención y purificación del interferon-a5': Se realizará una extracción de proteína total a partir de tubérculos de las plantas transgénicas que expresen el interferon-a5.

La purificación de la proteína de fusión His-interferon-a5 se realizará mediante la cromatografía del extracto proteico obtenido en una columna de Níquel de 2 ml. Tras ei lavado de la columna, la proteína se eluirá con 1 M imidazol. La proteína pura se procesará con trombina y el interferon-a5 se repurificará posteriormente mediante cromatografía de exclusión molecular.

Subtipos de IFNa en 'tejido hepático normal y CMSP de individuos sanos Después de la extracción del RNA total de las muestras de tejido hepático normal, el RNAm del IFNa fue amplificado utilizando cebadores universales para todos los subtipos de IFNa. Posteriormente, los productos de amplificación de PCR fueron clonados y secuenciados. Se analizaron 41 clones de cuatro hígados normales diferentes y observamos que la secuencia de IFNa de los 41 clones era la misma y correspondía al subtipo IFNa5 (Tabla 1) . Estos resultados muestran que el IFNa5 es el único subtipo de IFNa expresado en hígado normal. La secuencia parcial de cADN de IFN alfa 5 obtenida para todos los clones se muestra, como SEQ ID N0:1.

Para comparar el perfil de subtipos de IFN expresados en el hígado con el expresado en CMSP, se extrajo el RNA total de CMSP de 5 controles sanos y se amplificó el RNAm de IFNa con los cebadores universales de todos los subtipos de IFNa. De los 43 clones analizados, 15 correspondían al subtipo IFNa5, 14 al IFNal/13, 6 al !FNa21 y 8 clones a otros subtipos de IFNa (Tabla 1) . Estos resultados indican que el perfil de subtipos de IFNa expresado en CMSP difiere del expresado en hígado normal.

Subtipos de IFN en tejido hepático y CMSP de pacientes con hepatitis crónica C Los resultados anteriores muestran que el higado nor-mal expresa IFNa5, mientras que las CMS? expresan una variedad de subtipos de IFNa. En el parénquima hepático de pacientes con hepatitis crónica C existe infiltrado# de células mononucleares, siendo éstas una fuente importante de IFNa. Ello sugiere que el perfil de subtipos de IFNa expresado en el hígado de pacientes con hepatitis crónica C podría diferir del perfil encontrado en hígado normal. Para estudiar la expresión de subtipos de IFNa en la hepatitis crónica C, extrajimos el RNA total de muestras hepáticas de 3 pacientes diferentes y de 2 muestras de CMSP. Después de amplificar el RNAm de IFNa con cebadores universales para todos los subtipos, clonamos y secuenciamos 24 clones de tejido hepático y 18 clones de CMSP. Como se muestra en la tabla 1, las CMSP de pacientes con hepatitis crónica C expresan IFNoc21, IFNa5 y IFNa7 (5, 12 y 1 clon respectiva-mente) . En tejido hepático de estos pacientes encontramos además del subtipo IFNa5, los subtipos IFNa.21, IFNal7 y IFNal/13 (8, 1 y 2 clones respectivamente) (Tabla 1) . Estos datos sugieren que la producción de IFNa por el infiltrado de células mononucleares puede causar un cambio en el perfil de subtipos de IFNa expresados en el tejido hepático de pacientes con hepatitis crónica C.

Niveles de expresión de RNAm de IFN en CMSP y en higado de pacientes con hepatitis crónica C y controles El RNA total fue extraído de muestras de CMSP e hígado de pacientes con hepatitis crónica C (n=25 y 16, respectivamente) , de muestras de CMSP de controles sanos (n=20) y muestras de tejido hepático normal obtenidas mediante laparatomía (n=12) . Los niveles de RNAm de IFNa fueron determinados mediante la técnica semicuantitativa de transcripción reversa-reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR) , utilizando cebadores universales para amplificar todos los subtipos de IFNa. Los valores son expresados como el cociente entre el RNAm de IFNa/RNAm de ß-actina. Encontramos que los niveles de expresión de IFNa en CMSP de pacientes con hepatitis crónica G estaban significativamente aumentados comparados con los hallados en controles sanos (3,2±0,48 vs 1,14±0,26; p=0,001) (Fig.lA). Este resultado era esperado en una infección viral como la hepatitis C, en la que se encuentran infectadas las CMSP (14). Por el contrario, los niveles de expresión de RNAm de IFNa estaban significativamente disminuidos en tejido hepático de pacientes con hepatitis crónica C comparado con el expresado en hígado normal (0,12±0,03 vs 0,43±0,12; p=0,003) (Fig IB) . Como hemos observado anteriormente el IFNa5 es el único subtipo de IFNa detectado en hígado normal,- mientras que en tejido hepático de pacientes con hepatitis crónica C se observa una mezcla de subtipos. Nuestros hallazgos indican que en la infección por VHC existe una marcada reducción en la expresión del subtipo de IFNa constitutivamente expresado en el tejido hepático. Interesantemente,, los niveles de RNAm de IFNa en hígado de pacientes con hepatits crónica C muestran una correlación directa con el Índice de Knodell (r=0,54; p<0,05). Este hallazgo, junto con la observación que los subtipos de IFNa detectados en hígado de pacientes con hepatitis crónica C son los observados en CMSP, sugiere que la mayor parte del RNAm de IFNa encontrado en hígado de hepatitis C proviene del infiltrado inflamatorio. Parece posible que la reducción en la expresión del IFNa hepático (IFNa5) pueda jugar un papel en la cronificación de la infección por VHC. Por ello, estas observaciones pueden tener implicaciones terapéuticas si además tenemos en cuenta la marcada actividad antiviral y antiproliferativa el IFNa5 descrita por otros autores (9) .

Niveles de expresión de RNAm de IFNß en CMSP y en higado de pacientes con hepatitis crónica C y controles El IFNß, la segunda forma mayoritaria del interferon tipo I, es una glicoproteína producida por un único gen. En las infecciones virales, los genes de IFNa e IFNß son activados o reprimidos transcripcionaimente a través de diversos mecanismos (15) . Para analizar la expresión del IFNß en la hepatitis crónica C determinamos los niveles de RNAm de IFNß en las mismas muestras de tejido hepático y CMSP que previamente habíamos determinado la expresión de IFNa. Como se muestra en la figura 2, observamos que los niveles de RNAm de IFNß (expresados como cociente con sus respectivos de ß-actina) eran significativamente más altos, tanto en CMSP como en hígado, de pacientes con hepatitis crónica C comparados con los hallados en CMSP de controles sanos e hígados normales (1,66±0,2 vs 0,88±0, 6; p=0,008 en CMSP y 1,37±0,23 vs 0,97±0,16; p=0,011 en hígado). Estos resultados muestran que mientras el VHC causa represión del IFNa en hígado, la expresión de IFNß está aumentada tanto en hígado como en CMSP. Ello indica que el VHC modula de diferente forma los diferentes genes del ' IFN de tipo I en hígado, bloquea la producción de IFNa pero permite una sobreexpresión de IFNß.

Relación entre la expresión de los genes de IFNa e IFNß con la carga viral, genotipo y daño hepático en la hepatitis crónica C Para determinar si la expresión génica del IFNa o IFNß pudiera estar relacionada con la carga viral o el genotipo, cuantificanmos el RNA del virus C en suero de todos los pacientes mediante la técnica de PCR competitivo y determinamos el genotipo del VHC por un método de hibridación con sondas específicas. No encontramos correlación en-tre la expresión de los genes de IFNa o IFNß (en hígado o CMSP) y los niveles de RNA del virus C en suero o el genotipo viral. Al analizar la relación entre la expresión de los genes de IFN tipo I y la intensidad de daño hepático en pacientes con hepatitis crónica C, encontramos que los niveles de RNAm de IFNß en hígado se correlacionaban directamente con los valores de aspartato aminotransferasa sérica (r=0,64, p=0,008), y con el índice de Knodell (r=0,66, p=0,006). De igual forma los valores de RNAm de IFNa en hígado mostraban una correlación directa y positiva con el índice de Knodell como mencionamos anteriormente. Tabla 1. Subtipos de IFNa en controles y pacientes con hepatitis crónica C.

Descripción de las Figuras Figura 1: Expresión de RNAm de interferon alfa/ ß- ctina (eje ae ordenadas) en células mononucleares de sangre periférica (A) y en hígado (B) , de controles sanos y pacientes con hepatitis crónica C (HCV-RNA +) (eje de abcisas) .

Figura 2: Expresión de RNAm de interferon beta/ß-actina (eje de ordenadas) en células mononucleares de sangre periférica (A) y en hígado (B) , de controles sanos (C) y pacientes con hepatitis crónica C (HCV-RNA +) (eje de abcisas) . Figura 3: Relación entre la cantidad inicial de RNA total (abcisas) y la intensidad de banda del producto de PCR obtenido tras la amplificación del RNAm de IFNa, (•) IFNß ( "*" ) y ß-actina ( ) (en ordenadas como cuentas x mm:) en muestras de CMSP (A) y de hígado (B) . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el convencional para la manufactura de los objetos o productos a que la misma se refiere.

LISTADO DE SECUENCIAS INFORMACIÓN GENERAL: SOLICITANTE: NOMBRE: INSTITUTO CIENTÍFICO Y TECNOLÓGICO DE NAVARRA, S.A. CALLE: Avenida Pío XII, 53 CIUDAD: Pamplona ESTADO O PROVINCIA: Navarra PAÍS: España CÓDIGO POSTAL: 31008 TELEFONO: 948-10 56 00 FACSÍMIL: 948-17 52 23 TITULO: "USO DEL INTERFERON ALFA 5 EN EL TRATAMIENTO DE LAS HEPATOPATIAS VIRALES".

NUMERO DE SECUENCIAS: 1 DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA: DESTINATARIO: INSTITUTO CIENTÍFICO Y TECNOLÓGICO DE NAVARRA, S.A. CALLE: Avenida Pío XII, 53 CIUDAD: Pamplona ESTADO O PROVINCIA: Navarra PAÍS: España CÓDIGO POSTAL: 31008 FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR: TIPO DE MEDIO: DISCO 3.5" ORDENADOR: PC SISTEMA OPERATIVO: WINDOWS SOPORTE LÓGICO: WORD INFORMACIÓN SOBRE EL ABOGADO/AGENTE: NOMBRE: ALBERTO DE ELZABURU NUMERO DE REGISTRO: 232/1 NUMERO DE REFERENCIA/REGISTRO: P-99043 INFORMACIÓN SOBRE TELECOMUNICACIONES: TELEFONO: 91 7009400 FACSÍMIL: 91 3193810 TELEX O CORREO ELECTRÓNICO: elzaburu@elzaburu.es INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO.: 1 CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA: LONGITUD: 274 pares de bases TIPO: nucléotidos NÚMERO DE HEBRAS: 1 CONFIGURACIÓN: lineal TIPO DE MOLÉCULA: cADN FUENTE DE ORIGEN: Organismo: Homo sapiens Tipo de tejido: hígado POSICIÓN EN EL GENOMA: Cromosoma 9 CARACTERÍSTICA: NOMBRE/CLAVE: IFNa5 Método de identificación: RT-PCR, Secuenciación OTRAS INFORMACIONES: Nucleótidos 672 a 945 de la secuencia del gen de IFNa5 publicada en la base de datos Genoan.< con número de acceso X02956. DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA SEQ ID NO: TC ( CAT ( ?AG ATG ATC ( :AG ( :AG ACC ' GTC AAT CTC ' GTC AGC ; -.CA AAG í J?C GCA 50 Hrs Glu Met He Gln Gln Thr Phe Asn Leu Phe Ser Thr Lys Asp Ser 1 5 13 15 TCT GCT ACT TGG GAT GAG ACÁ CTT CTA GAC AAA TAC ACT GAA CTT TAC 101 Ser Ala Thr Trp Asp Glu Thr Leu Leu Asp Lys Phe Tyr Thr Glu Leu Tyr 20 25 30 CAG CAG CTG AAT GAC CTG GAA GCC TGT ATG .—-- CAG GAG GTT GGA GTG GAA 152 Gln Gln Leu Asn Asp Leu Glu Ala Cys Met Met Gln Glu Val Gly Val Glu 35 40 45 50 GAC ACT CCT r-.-pr- ATG AAT GTG GAC TCT ATC CTG ACT GTG AGA AAA TAC TTT 203 Asp Thr Pro Leu Met Asn Val Asp Ser He Leu Thr Val Arg Lys Tyr Phe 55 60 65 CAÁ AGA ATC ACC CTC TAT CTG ACÁ GAG AAG ¿--AA TAC AGC CCT TGT GCA TGG 254 Gln Arg He Thr Leu Tyr Leu Thr Glu Lys Lys Tyr Ser Pro Cys Ala Trp 70 75 80 GAG GTT GTC AGA GCA GAA AT 274 Glu Val Val Arg Ala Glu 85 90

Claims (9)

28 REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:

1. Uso del IFN-alfa 5 o de la secuencia génica que lo codifica en la fabricación de composiciones útiles en el tratamiento de enfermedades hepáticas.

2. Uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las composiciones son útiles contra la hepatitis Crónica.

3. Uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las composiciones son útiles contra la sirrosis de origen viral.

4. Uso de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque las composiciones son útiles contra el carcinoma hepatocelular. 29

5. Uso de conformidad con cualesquiera de una de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la composición comprende una proteina recombinante de IFN-alfa 5 obtenida por clonación en un huésped adecuado, de un vector de expresión que comprende la secuencia génica que codifica a IFN-alfa 5.

6. Uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el huésped clonado es un organismo eucariota, preferentemente Escherichia Coli .

7. Uso de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el huésped clonado es un organismo eucariota, preferentemente Solanum tuberosum.

8. Uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la composición puede ser incluida en cualquier alimento.

9. Uso de conformidad con las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque las composiciones comprenden la secuencia génica que codifica al IFN-alfa 5 y se aplica para terapia génica somática.