MXPA00010584A - Preparacion de la proteina e1 del papilomavirus humano que tiene actividad de helicasa y metodo para la misma - Google Patents
Preparacion de la proteina e1 del papilomavirus humano que tiene actividad de helicasa y metodo para la mismaInfo
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Abstract
La presente invención se refiere a un método para aislar la proteina E1 del papilomavirus clonado a partir de un sistema de expresión eucariótico que tiene una actividad de la helicasa viral demostrable y reproducible y la preparación que contiene la proteina E1 esencialmente pura. La invención se refiere además al uso de estápreparación de la proteina de E! en un ensayo de selección para identificar los agentes antivirales. Más particularmente a un ensayo de rendimiento elevado para seleccionar agentes capaces de inhibir la replicación del ADN del HPV. El ensayo estábasado en la medición del efecto de los agentes antivirales sobre la actividad de la proteina E1 y más específicamente sobre su actividad de la helicasa.
Description
PREPARACIÓN DE LA PROTEINA El DEL PAPILOMA-VIRUS HUMANO QUE TIENE ACTIVIDAD DE HELICASA Y MÉTODO PARA LA MISMA
Campo de la Invención
La presente invención se refiere a un método para aislar y purificar la proteina El del papilomavirus (PV) clonado, a partir de un sistema de expresión eucariótico, que tiene una actividad de helicasa viral demostrable y reproducible y que está libre de actividades contaminantes. La invención se refiere además al uso de este método de extracción de proteínas novedoso para aislar la proteina El substancialmente purificada, de manera preferente esencialmente pura, que tiene actividad de helicasa para establecer un ensayo de selección para agentes antivirales. Más particularmente la invención se refiere a la proteina El para establecer un ensayo de rendimiento elevado para seleccionar agentes capaces de inhibir la replicación del ADN del PV. El ensayo está basado en la medición de' la inhibición de los agentes antivirales sobre la actividad de la proteina El y más específicamente sobre su actividad de la helicasa.
Ref.124477 Antecedentes de la Invención
Los papilomavirus (PV) son virus de ADN sin envoltura que inducen lesiones hiperproliferativas de los epitelios. Los papilomavirus son de una dispersión muy amplia en la naturaleza y han sido reconocidos en los vertebrados más elevados. Los virus han sido caracterizados, entre otros, de los seres humanos, el ganado vacuno, los conejos, los caballos, y los perros. El primer papilomavirus se describió en 1933 como el papilomavirus del conejo de rabo blanco (CRPV) . Desde entonces, el conejo de rabo blanco asi como el tipo 1 del papilomavirus del bovino (BVP-1) han servido como prototipos experimentales para los estudios sobre los papilomavirus. La mayoria de los papilomavirus de animales están asociados con las lesiones proliferativas puramente epiteliales, y la mayoria de las lesiones en los animales son cutáneas. En el ser humano existen más de 75 tipos de papilomavirus (HPV) que han sido identificados y los mismos han sido catalogados por el sitio de infección: el epitelio cutáneo y el epitelio de las mucosas (las mucosas oral y genital) . Las enfermedades'- relacionadas con el epitelio cutáneo incluyen verrugas planas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con el epitelio de las mucosas incluyen los papilomas de la laringe y las enfermedades anogenitales que comprenden los carcinomas cervicales (Fields, 1996, Virology, 3/a. ed. Lippincott -Raven Pub., Philadelphia, N.Y.). Existen más de 25 tipos de HPV que están implicados en las enfermedades anogenitales, estas están agrupadas en los tipos de "riesgo bajo" y de "riesgo elevado". Los tipos de riesgo bajo incluyen el tipo 6, el tipo 11 y el tipo 13 del HPV e inducen lesiones en su mayoria benignas tales como el condiloma acuminata (verrugas genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de grado bajo (SIL) . En los Estados Unidos existen 5 millones de personas con verrugas genitales de las cuales 90% son atribuidas al HPV-6 y al HPV-11. Aproximadamente 90% del SIL también es provocado por los tipos 6 y 11 de riesgo bajo. El otro 10% del SIL es provocado por los HPVs de riesgo elevado. Los tipos de riesgo elevado están asociados con el SIL de grado elevado y el cáncer cervical e incluyen muy frecuentemente los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, y 58 del HPV. La progresión desde el SIL de grado bajo hasta el SIL de grado elevado es mucho más frecuente para las lesiones que contienen los 'HPV-16 y 18 de riesgo elevado cuando se compara con aquellos que contienen los tipos de HPV de riesgo bajo. Además, solamente cuatro tipos de HPV son detectados frecuentemente en el cáncer cervical (los tipos 16, 18, 31 y 45). Aproximadamente 500,000 nuevos casos de cáncer invasivo de la cérvix son diagnosticados anualmente en todo el mundo (Fields, 1996, supra) . Los tratamientos para las verrugas genitales incluyen la remoción fisica, tales como la crioterapia, el rayo láser de C02, la electrocirugia, o la escisión quirúrgica. También se pueden utilizar agentes citotóxicos tales como el ácido tricloroacético (TCA) , la podofilina o podofilox. Los agentes inmunomoduladores también están disponibles, tales como Interferon o Imiquimod. Estos tratamientos no son completamente efectivos en la eliminación de todas las partículas virales y existe ya sea un costo elevado en el cual se ha incurrido o efectos laterales indeseables relacionados con los mismos. En efecto, no existen tratamiento antivirales actualmente efectivos para la infección por el HPV puesto que con todas las terapias actuales son comunes las verrugas recurrentes (Beutner & Ferenczy, 1997, Amer. J. Med., 102 (5A), 28-37). La inefectividad de los métodos actuales para tratar las infecciones provocadas por HPV han demostrado la necesidad de identificar nuevos medios para controlar o eliminar tales infecciones. En años recientes, los esfuerzos han sido dirigidos hacia el descubrimiento de compuestos antivirales, y especialmente compuestos capaces de interferir con la replicación viral al inicio de la infección (Hughes, 1993, Nucleic Acids Res. 21:5817-5823). Para este fin, ha llegado a ser importante por lo tanto estudiar las características genéticas de los HPVs para identificar los blancos u objetivos quimioterapéuticos potenciales para que contengan y posiblemente eliminen cualesquiera enfermedades provocadas por las infecciones del HPV al inicio de la infección. Es igualmente importante identificar una actividad viral que se puede medir, que demuestra que la especificidad y la confiabilidad van a ser utilizadas como un indicador para evaluar la efectividad de los agentes quimioterapéuticos potenciales contra los PVs. El ciclo de vida del PV está relacionado estrechamente con la diferenciación de los queratinocitos. La infección se cree que ocurre en un sitio de la alteración del tejido en el epitelio basal. Cuando las células infectadas padecen una diferenciación progresiva, la maquinaria celular es mantenida permitiendo que la expresión del gen viral se incremente, con la expresión del gen posterior eventual y el montaje del virión en los queratinocitos diferenciados terminalmente y la liberación de las partículas virales (Fields, supra) . Las hebras de codificación para cada uno de los papilomavirus contienen aproximadamente diez marcos de lectura abierta translacionales designados (ORFs) que han sido clasificados ya sea como ORFs iniciales o ORFs tardíos o finales con base en su localización en el genoma. Las El a E8 son expresadas inicialmente en el ciclo de replicación viral y dos genes tardíos o finales (Ll y L2) representan las proteínas encapsidadas mayor y menor respectivamente. Los productos de los genes El y E2 funcionan en la replicación del ADN viral, mientras que E5, E6 y E7 son expresados con relación a- la proliferación de la célula huésped. Los Ll y L2 están involucrados en la estructura del virión. Las funciones de los productos de los genes E3, E4 y E8 son inciertas o desconocidas hasta nuestros dias. Los estudios de HPV han mostrado que las proteínas El y E2 son tanto esenciales como suficientes para la replicación del ADN viral in vitro (Kuo y colaboradores, 1994, J. Biol. Chem. 30: 24058-24065). Este requerimiento es similar a aquel del tipo 1 del papilomavirus de bovino (BPV-1) . Realmente, existe un alto grado de similaridad entre las proteínas de El y E2 y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV) sin tomar en cuenta el tipo y las especies virales (Kuo y colaboradores, 1994, supra) . Se debe señalar, que El es la proteina más altamente conservada en el PV y su actividad enzimática se presume que va a ser similar para todos los tipos de PV (Jen ins, 1996, J. Gen. Virol., 77:1805-1809). La evidencia que emana de los estudios del BPV-1 ha mostrado que el El posee las actividades de ATPasa y helicasa que son requeridas al inicio de la replicación del ADN viral (Seo y colaboradores, 1993a, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 90:702-706; Yang y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. 90:5086-5090; y MacPherson y colaboradores, 1994, 204:403-408). La proteina de E2 es un activador transcripcional que se une a la proteina de El y forma un complejo que se une específicamente a la secuencia ori (véase la • Figura 1) (Mohr y colaboradores, 1990, Science 250:1694-1699). Se cree que E2 mejora la unión de El al origen de replicación de BPV (Seo y colaboradores, 1993b, Proc. Nati. Acad. Sci., 90:2865-2869) . En el HPV, Lui y colaboradores sugirieron que el E2 estabiliza la unión del El al ori (1995, J. Biol. Chem., 270(45) : 27283-27291) . La actividad de la helicasa de las proteínas El del papilomavirus constituye por lo tanto un buen blanco molecular para diseñar entidades químicas capaces de inhibir la replicación viral. Tales objetivos requieren que la proteina de El sea extraída y purificada hasta un grado en donde su actividad de la helicasa pueda ser medida de manera confiable y reproducible. Tal aislamiento de la helicasa de El ha permanecido elusiva sin embargo o en el mejor de los casos no confiable, especialmente a una escala suficiente para establecer un ensayo para seleccionar tales inhibidores .
Seo y colaboradores (1993a, supra) describe la extracción y purificación del BPV-Ei desde un sistema de expresión del baculovirus con el paso que consiste del uso del PEG y del NaCl 1M en la solución amortiguadora de extracción nuclear. Los mismos son obtenidos por la preparación de la El de BPV con una pureza de aproximadamente 90%. Sin embargo, no se ha encontrado posible obtener la El del HPV-11 puro por este procedimiento, y en cualquier caso el procedimiento no es adecuado a la gran escala requerida para purificar la El para la selección de rendimiento elevado. Los dos genes de BPV-1 que codifican las proteínas de El y E2 han sido clonados en un sistema de expresión de Baculovirus y las proteínas purificadas substancialmente (Patente US 5,464,936). La patente US ?936 describe un proceso de purificación para la El que consiste de una extracción nuclear en una solución amortiguadora hipertónica (que contiene 300 mM de NaCl) seguido por 3 separaciones cromatogréficas secuenciales. La descripción, sin embargo, no demuestra la pureza y la actividad especifica de la helicasa de El resultante. La ausencia del paso de la purificación por cromatografía de afinidad conduce a la presencia de las nucleasas contaminantes que previenen la medición exacta de la actividad de la helicasa de El. Además, aún si tal proceso pudiera producir en efecto la helicasa de Él de suficiente pureza para evaluar la actividad de la helicasa, se cree que la misma podria ser inaplicable para un proceso a gran escala, de rendimiento elevado para propósitos de HTS. Un proceso de extracción en donde los núcleos estuvieron suspendido en la solución amortiguadora para la lisis que contiene NaCl " 300 mM seguido por purificación adicional, ya ha sido descrito (Bream y colaboradores, 1993, J. Virol., 2655). Sin embargo, los autores fueron incapaces de detectar la actividad de la helicasa a partir de estas preparaciones crudas de la El. Los intentos adicionales para aislar la proteina El de los HPVs clonada en diferentes sistemas de expresión que tienen una actividad de la helicasa demostrable y especifica, han fallado (Jenkins y colaboradores, 1996, supra) . Kuo y colaboradores, 1994, supra, describen- un procedimiento de purificación (utilizando una sal 420 mM durante la extracción nuclear) pero no describen la escala a la cual el procedimiento fue llevado a cabo o el rendimiento total de la proteina. Ya se tenia la hipótesis de que la conformación de la proteina del El y su: hidrofobicidad provocan que la proteina sea "pegajosa" y se formen agregados haciendo difícil asi la extracción y la purificación. Además, se han encontrado en general dificultades en el establecimiento de las actividades enzimáticas que son especificas y libres de los contaminantes celulares. Por ejemplo, la helicasa viral y/o la actividad de ATPasa no pueden ser distinguibles de la helicasa celular y/o del contaminante de ATPasa presente en la célula huésped utilizada para expresar el gen de El. Además, los niveles muy bajos de las nucleasas destruirán el substrato haciendo imposible cualquier evaluación. Un denominador común en los diversos procesos de purificación descrito.s anteriormente radica en la presencia de concentraciones elevadas de la sal (condiciones hipertónicas) durante el paso de extracción nuclear. Realmente, de acuerdo con los deseos convencionales, se cree que las proteínas de unión del ácido nucleico pueden ser solubilizadas a las concentraciones elevadas de la sal y por esto son separadas de los ácidos nucleicos. En el presente, la técnica previa no ha revelado procesos satisfactorios para la purificación de la El. Por consiguiente existe una necesidad de aislar una actividad de helicasa viral de manera demostrable y reproducible que puede ser utilizada como un indicador del efecto inhibidor de los agentes quimioterapéuticos antivirales. Más particularmente, subsiste una necesidad de proporcionar un método de preparación de la El del PV que exhiba una actividad de helicasa elevada.
También subsiste una necesidad de obtener una preparación de la proteina El del papilomavirus humano la cual exhiba una actividad de helicasa suficiente para los propósitos de un ensayo de selección, particularmente, un ensayo de selección de rendimiento elevado. Puesto que la estructura/función de El es conservada altamente entre los diferentes papilomavirus y entre los subtipos, se supone que las proteínas de El de BPV y CRPV pueden ser extraídas y purificadas por el procedimiento de la invención. Por lo tanto, subsiste una necesidad de un método para el aislamiento/purificación de la proteina de El de varias especies de papilomavirus, incluyendo, pero sin estar limitado al papilomavirus de bovino (BPV), el papilomavirus del conejo de rabo blanco (CRPV) y el papilomavirus humano (HPV) . También subsiste una necesidad de aislar y purificar la proteina El de los diferentes subtipos de HPV, incluyendo pero sin estar limitado al HPV-6, 11, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, y 58. Antes de la presente invención, las preparaciones de la proteina de Rl incluyendo las preparaciones de la El humana, no demostraron una actividad de la helicasa reproducible. La deficiencia, en la técnica previa creó un bloque en el camino que es capaz de seleccionar una gran colección de agentes antivirales capaces de inhibir la replicación del ADN viral del papiloma. Esta deficiencia es superada por la presente invención la cual es capaz de proveer los medios para diseñar un HTS para la selección de tales agentes. El Solicitante ha encontrado ahora un proceso de purificación confiable y reproducible para la preparación de la El que tiene la actividad de helicasa. La preparación de El resultante está libre de los productos de la degradación y es capaz 'de una producción a gran escala de la El. La presente descripción se refiere a un número de documentos, el contenido de los cuales es incorporado aqui para referencia.
Breve Descripción de la Invención
Por lo tanto, de acuerdo con una primera modalidad de la presente invención, se proporciona un medio para el aislamiento y purificación de la proteina de El que tiene una actividad de helicasa demostrable, confiable y reproducible. Por consiguiente, la invención se refiere principalmente al aislamiento y purificación de la proteina de El a partir del papilomavirus o un derivado funcional del mismo, que tiene una actividad de helicasa detectable arriba de los niveles básicos. La preparación de El de acuerdo con la presente invención está significativamente libre de la contaminación de las actividades de la helicasa celular contaminante, la ATPasa y de la nucleasa. La preparación de El de acuerdo con la presente invención exhibe una actividad de helicasa viral reproducible. De acuerdo con esta primera modalidad, se proporciona un método para el aislamiento de la proteina de El expresada a partir del gen El clonado. Alli se proporciona por lo tanto un método para extraer a -partir de un extracto nuclear, la proteina El del papilomavirus o un derivado funcional de mismo que tiene una actividad de helicasa viral que comprende los pasos de: a) producir una proteína recombinante de El en un sistema de expresión eucariótico y aislar una preparación nuclear de la misma; b) extraer la proteína El de la preparación nuclear en una solución amortiguadora que comprende la sal a una concentración inferior que 300 mM. Este método novedoso para extraer la proteina de
El que tiene actividad de helicasa a partir de una preparación nuclear de las células eucarióticas, comprende el uso de las concentraciones de la sal inferiores que aquellas enseñadas en la técnica previa. Además se proporciona un método para aislar dicha proteína de El que comprende además el paso de: c) purificar la proteina de El a partir del extracto nuclear por cromatografía de afinidad.
El solicitante fue el primero en diseñar un método para el aislamiento de la proteína El del papilomavirus humano capaz de demostrar una actividad de helicasa viral reproducible, proporcionando así el elemento esencial para el diseño de un ensayo para identificar los agentes antivirales potenciales capaces de la inhibición de la actividad de la helicasa de la El y por medio de esto prevenir la replicación del ADN viral. Este método también puede ser aplicado para el aislamiento y purificación de las helicasas de El del BPV y CRPV. De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, alli se proporciona una preparación de la proteína de El del papilomavirus recombinante a partir de un sistema de expresión eucariótico, la El tiene una actividad de la helicasa viral, en donde la proteína de El es extraída de una preparación nuclear en la presencia de la sal a una concentración menor que 300 M, y purificada opcionalmente por cromatografía de afinidad. De acuerdo con una modalidad adicional de la presente invención, alli se proporciona por lo tanto el medio para utilizar la preparación de la proteína de El aislada en la selección del nivel de inhibición de los agentes antivirales candidatos sobre la actividad de la helicasa de El.
Por lo tanto se proporciona un método para ensayar o evaluar la actividad de helicasa viral específica de la proteína de El del papilomavirus, el método comprende los pasos de: incubar una mezcla de la preparación de la proteína de El como se definió anteriormente, y un substrato adecuado para dicha actividad enzimática de la helicasa viral; y medir la cantidad de la actividad de helicasa especifica de dicha proteína de El. Además se proporciona un método para identificar agentes capaces de modular dicha actividad de la helicasa, el método comprende los pasos de: a) evaluar la actividad de dicha helicasa de El en la ausencia del agente por el método que se definió anteriormente; b) ensayar o evaluar la actividad de dicha helicasa en • la presencia del agente por el método como se definió anteriormente, en donde el agente es agregado a la mezcla de la helicasa y el substrato durante la incubación; y c) comparar el resultado del paso a) con el resultado del paso b) . De acuerdo con .-' una modalidad adicional, la proteína de El aislada tiene una actividad de la helicasa detectable y específica, y, en la presencia de la proteína de E2 es capaz de unirse al ADN para formar un complejo en el origen de la replicacíón, y contribuir a la repiicación del ADN viral. Por lo tanto, una forma alternativa de medir la inhibición de la actividad de la helicasa de El es medir la inhibición de la replicación del ADN viral. Por lo tanto se proporciona un método para evaluar o ensayar la replicación del ADN del papilomavirus, el método comprende los pasos de: incubar un agente candidato con una mezcla de la preparación de la proteina de El como se definió anteriormente, con la proteína de E2 y un origen de replicación del ADN adecuado; y medir la cantidad del ADN desenrrollado o desenvuelto. También se proporciona un método para identificar un agente capaz de modular la replicación del ADN del papilomavirus, el método comprende los pasos de: a) evaluar o ensayar la actividad de replicación del AD -en la ausencia del agente por el método como se definió anteriormente; b) ensayar o evaluar la actividad de replicación del ADN en la presencia del agente por el método como se definió anteriormente, en donde al agente es agregado a la mezcla durante la incubación; y '-. c) comparar el resultado del paso a) con el resultado del paso b) .
Otros aspectos de la presente invención llegarán a ser más evidentes durante la lectura de la siguiente descripción no restrictiva de las modalidades preferidas con referencia a los siguientes dibujos los cuales son ejemplares y no deben ser interpretados como limitativos del alcance de la presente invención.
Breve Descripción de los Dibujos
Habiéndose descrito así en general la invención, se hará referencia ahora a los dibujos que se anexan, que muestran a manera de ilustración una modalidad preferida de la misma, y en los cuales: la Figura 1 muestra una representación gráfica de la interacción de El y E2 en el origen de la replicación del papilomavirus. Brevemente, la proteína El es reclutada en el origen de la replicación por la proteína E2 y luego forma un complejo que activa la actividad de helicasa de la El para desenrollar o desenvolver el ADN. El complejo de E1-E2 recluta por último las proteínas de replicación celular para iniciar eventualmente una replicación del ADN. La Figura 2 muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de las helicasas de El de varios papilomavirus y muestra su % de identidad comparado con la secuencia de la helicasa de El del HPV-11;
la Figura 3A muestra un gel teñido con ei azul de
Coomassie de diferentes condiciones para la extracción nuclear de la proteína de El de acuerdo con la presente invención (la leyenda de la cual es presentada en el Ejemplo 2) ; la Figura 3B muestra un inmunomanchado de Western del gel de la Figura 3A, teñido con un anticuerpo policlonal anti-El K72 y desarrollado o revelado con un reactivo quimioluminiscente; la Figura 4A muestra una representación esquemática del proceso de purificación de acuerdo con la invención; la Figura 4B muestra un gel teñido con el azul de Coomassie de las diferentes fracciones recuperadas de la purificación por cromatografía de afinidad (la leyenda de la cual es presentada en el Ejemplo 4); la Figura 5A muestra los resultados del ensayo de unión de El/E2/ori descrito en el Ejemplo 8; la Figura 5B muestra tres experimentos con las proteínas El de HPV-11 del tipo silvestre y mutantes, purificados. El panel superior muestra los resultados de un ensayo a base de gel de hélicasa por la detección de la actividad no desarrollada de la enzima; el panel intermedio muestra los resultados de un ensayo de ATPasa; y la Figura inferior muestra los resultados de un ensayo de helicasa, como se detectó por la SPA. Estos experimentos son descritos en el Ejemplo 9; la Figura 6 muestra una representación esquemática del ensayo de selección de rendimiento elevado para la helicasa de El como se describió en el Ejemplo 11; la Figura 7 muestra la curva de IC50 para la inhibición de la actividad de la helicasa de El por el plásmido M13 como se describió en el Ejemplo 12; la Figura 8 muestra la curva de IC50 de inhibición de la actividad de la helicasa de El por el bromuro de etidio como se describió en el Ejemplo 12; la Figura 9A muestra un gel teñido con el azul de
Coomassie del material cargado y las diferentes fracciones recuperadas de la purificación por cromatografía de afinidad (la leyenda de la cual es presentada en el Ejemplo
14); la Figura 9B muestra un inmunomanchado de Western del gel de las diferentes fracciones recuperadas de la purificación por cromatografía de afinidad (la leyenda de la cual es presentada en el Ejemplo 15); la Figura 10A muestra un gel teñido con azul de
Coomassie de las diferentes' -condiciones para la extracción nuclear de la proteína El (la leyenda de la cual es presentada en el Ejemplo 15) y también la extracción sin sal de la proteína El del HPV-6;
la Figura 10E muestra un inmunomanchado de Western del gel de la Figura 9A. El manchado se incubó con un anticuerpo policlonal anti-El y el segundo anticuerpo conjugado con la peroxidasa de rábano (HRP) . Las bandas fueron visualizadas utilizando un reactivo quimioluminiscente; la Figura 11 representa la secuencia de aminoácidos de la proteína El del HPV-11 como se aisló por el método de la invención. Los aminoácidos en negritas indican las modificaciones observadas comparado con la secuencia publicada de la Figura 2; y la Figura 12 representa la secuencia de aminoácidos 'de la proteína El de HPV-6a como se aisló por el método de la invención. El aminoácido en negritas indica la modificación observada comparado con la secuencia publicada de la Figura 2.
Descripción Detallada de las Modalidades Preferidas
Definiciones
A menos que se !• definan de otra manera, los términos científicos y tecnológicos y la nomenclatura utilizada aquí tienen el mismo significado como es entendido comúnmente por una persona de experiencia ordinaria a la cual pertenece esta invención. En general, los procedimientos para el cultivo de las células, ia infección, los métodos de biología molecular y semejantes son los métodos comunes utilizados en la técnica. Tales técnicas estándares se pueden encontrar en los manuales de referencia tales como por ejemplo Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories) y Ausubel et al. (1994, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, New York) . Las secuencias de nucleótidos son presentadas aquí por una sola hebra, en la dirección 5' a 3' , de izquierda a derecha, utilizando los símbolos de los nucleótidos de una sola letra como se utilizaron comúnmente en la técnica y de acuerdo con las recomendaciones de la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB (Bioquímica, 1972, 11:1726-1732). La presente invención se refiere a un número de términos de la tecnología del ADN recombinante (ADNr) utilizados rutinariamente. Sin embargo, las definiciones de los ejemplos seleccionados de tales términos de ADNr son provistos para claridad y consistencia. El término "ADN recombinante" o "plásmido recombinante" como se conocen en la técnica, se refieren a una molécula de ADN que resulta de la unión de los segmentos de ADN. Esta es referida frecuentemente como ingeniería genética. El término "segmento de ADN", como se utiliza aquí, se refiere a una molécula que comprende un tramo lineal o secuencia lineal de nucleótidos. Esta secuencia cuando se lee de acuerdo con el código genético, puede codificar un tramo o secuencia lineal de aminoácidos la cual puede ser referida como un polipéptido, proteina, fragmento de proteína y semejantes. El término "oligonucleótido" o molécula o secuencia de "ADN" se refiere a una molécula comprendida de los desoxirribonucleótidos de adenina (A) , guanina (G) , timina (T) y/o citosina (C) . El término "oligonucleótido" o "ADN" se puede encontrar en las moléculas o fragmentos de ADN lineal, virus, plásmidos, vectores, cromosomas o ADN derivado sintéticamente. Cuando se utilicen aquí, -las secuencias de ADN son descritas de acuerdo con la convención normal de que se da solamente la secuencia en la dirección 5' a 3' . Cuando se utilice aquí, el término "gen" se conoce bien en la técnica y está relacionado con una secuencia de ácidos nucleicos que definen una proteína o
- polipéptido único. Un "gen estructural" define una secuencia de ADN la cual es transcrita en el ARN y transladada o traducida en una proteína que tiene una secuencia de aminoácidos específica por lo cual ocasiona o conduce a un polipéptido o proteína específica. El término "proteína de fusión" como se define aquí, se refiere a dos segmentos polipeptídicos que no están unidos conjuntamente en la naturaleza. Los ejemplos no limitativos de tales "proteínas de fusión" de acuerdo con la presente invención incluyen la proteina de El fusionada al polipéptido de una "etiqueta de afinidad". En algunas modalidades puede ser benéfico introducir un sitio de segmentación entre las dos secuencias de polipéptidos las cuales han sido fusionadas. Los sitios de segmentación de la proteasa entre dos proteína fusionadas heterólogamente son bien conocidas en la técnica. Los términos "vectores" o "construcción de ADN" son conocidos comúnmente en la técnica y se refieren a cualquier elemento genético, incluyendo, pero sin estar limitado al, ADN del plásmido, el ADN del fago, el ADN viral y semejantes, los cuales pueden incorporar las secuencias de oligonucleótidos, o las secuencias de la presente invención y sirven como el vehículo del ADN en el cual el ADN de la presente invención puede ser clonado. Existen numerosos tipos de vectores y son bien conocidos en la técnica. El término "expresión" define el proceso por el cual un gen estructural es transcrito en el ARNm (transcripción), el ARNm esté siendo transladado (translación) entonces en un polipéptido (o proteína) o más. La terminología "vector de expresión" define un vector o vehiculo como se describió anteriormente pero diseñado para hacer posible la expresión de una secuencia insertada a continuación de la transformación en un huésped. El gen clonado (secuencia insertada) es. colocado usualmente bajo el control de las secuencias del elemento de control tales como las secuencias promotoras. Tales secuencias de control de la expresión variarán dependiendo de si el vector es diseñado para expresar el gen enlazado operativamente en un huésped procariótico o eucariótico o ambos (vectores de lanzamiento) y pueden contener adicionalmente elementos transcripcionales tales como elementos mejoradores, secuencias de terminación, elementos de especificidad del tejido, y/o los sitios de iniciación y terminación translacional. Por "sistema de expresión eucariótico" se entiende la combinación de un vector de expresión apropiado y una línea celular eucariótica la cual puede ser utilizada para expresar una proteína 'de interés. En algunos sistemas el gen para la proteína puede ser insertado en el genoma de un virus el cual puede infectar el tipo de célula que es utilizado. Los vectores del plásmido que contienen el gen deseado también pueden ser utilizados. En todos los casos, el vector contendrá elementos de control (promotores) apropiados para expresar la proteína en el tipo de la célula de interés. Los componentes adicionales, por ejemplo un vector o genoma viral que codifica para la polimerasa de T7, también pueden ser necesarias en ciertos sistemas de expresión. Los tipos de células eucarióticas utilizados típicamente son la levadura (por ejemplo Saccharomyces cerevisiae, Pischia pastoris) transfectada con un vector del plásmido; las células de insectos (por ejemplo SF9, SF21) infectadas con un baculovirus (Autographa californica o Bombyx morí) (Luckow, Curr. Op. Biotech., 1993, 4:564-572; Griffiths y Page, 1994, Methods in Molec. Biol. 75:427-440; y Merrington y colaboradores, 1997, Molec. Bioech. 8 (3) :283-297) ; células de mamífero infectadas con el adenovirus, el virus de Vaccinia, el virus de Sindbis, o el virus forestal de Semliki; y las células de mamífero transfectadas con los vectores de ADN para la expresión temporal o constitutiva. Se prefiere aquí particularmente el sistema de baculovirus/células de insecto. Una célula huésped o célula indicadora ha sido "transfectada" por el ADN exógeno o heterólogo (por ejemplo una construcción de ADN) cuando tal ADN ha sido introducido dentro de la célula. El ADN de transfección puede o no puede estar integrado (enlazado covalentemente) en el ADN cromosómico que compone el genoma de la célula. En las células de los procariotas, la levadura, y de los mamíferos por ejemplo, el ADN de transfección puede ser mantenido sobre un elemento episomal o episómico tal como un plásmido. Con respecto a las células eucarióticas, una célula transfectada establemente es una a la cual el ADN de transfección ha llegado a ser integrado en un cromosoma de modo que el mismo es heredado por las células hijas a través de la replicación del cromosoma. Esta estabilidad se demostró por la capacidad de la célula eucariótica para establecer las líneas celulares o los clones comprendidos de una población de las células hijas que contienen el ADN de transfección. Los métodos de transfección son bien conocidos en la técnica (Sambrook y colaboradores, 1989, supra; Ausubel y colaboradores, 1994, supra) . El término "etiqueta de afinidad" o "marbete de afinidad) cuando se utilice aquí, se refiere a una etiqueta la cual es atrapada específicamente por un ligando complementario. Los ejemplos de los pares de afinidad del ligando de afinidad/marcador incluyen pero no están limitados a: Proteína de Unión de la Maltosa (MBP) /maltosa;
Glutationa S Transferasa' (GST) /glutationa; histidina
(His) /metal. El metal utilizado como el ligando de afinidad puede ser seleccionado del grupo que consiste de: cobalto, zinc, cobre, hierro, y níquel (Wong y colaboradores (1991), Separation and Purification Methods, (20(1), 49-106). Preferentemente, el metal seleccionado es el níquel. Ei ligando de afinidad puede ser instalado en las columnas para facilitar la separación por la cromatografía de afinidad. La etiqueta de afinidad puede ser colocada sobre el extremo N- o C-terminal de la proteina, pero preferentemente sobre el extremo o terminal. N de la proteína. Por cierto, las secuencias de nucleótidos y polipéptidos útiles para la práctica de la invención incluyen "derivados funcionales". El término "derivados funcionales" está propuesto para incluir "fragmentos", "segmentos", "variantes", "análogos" o "derivados químicos" de la materia objeto de la presente invención. Los derivados funcionales de la presente invención pueden ser sintetizados químicamente o producidos a través de una tecnología del ADN recombinante. Todos estos métodos son bien conocidos en la técnica. Por consiguiente, el término "variante" se refiere aquí a una proteína o molécula de ácido nucleico la cual es substancialmente similar en estructura "y actividad biológica a la proteína o ácido nucleico de la presente invención.
Cuando se utilice aquí, "derivados químicos" se entiende que cubre las porciones químicas adicionales que normalmente no forman parte de la materia objeto de la invención. Tales porciones podrían afectar las características fisicoquímicas del derivado (es decir la solubilidad, la absorción, la vida media y semejantes, la reducción de la toxicidad) . Tales porciones son ejemplificadas en Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) . Los métodos de unión de estas porciones fisicoquímicas a un polipéptido son bien conocidos en la técnica. Como se ejemplificará aqui posteriormente, las secuencias de los nucleótidos y los polipéptidos utilizados en la presente invención pueden ser modificadas, por ejemplo por la mutagénesis in vitro, para analizar la relación de la función estructural y catalítica de las mismas y permitir un mejor diseño e identificación de las proteínas resultantes. Cuando se utilice aquí, la designación "derivado funcional" denota, en el contexto ' de un derivado funcional de una secuencia si se trata de una secuencia de ácidos nucleicos o de aminoácidos, una molécula que retiene una '•' actividad biológica (ya sea funcional o estructural) que es substancialmente similar a aquella de la secuencia original. Este derivado funcional o equivalente puede ser un derivado natural o puede ser preparado sintéticamente. Tales derivados incluyen las secuencias de aminoácidos que tienen substituciones, deleciones, o adiciones de uno o más aminoácidos, siempre que la actividad biológica de la proteína sea conservada. Lo mismo aplica a los derivados de las secuencias de los ácidos nucleicos las cuales pueden tener substituciones, deleciones, o adiciones de uno o más nucleótidos, siempre que la actividad biológica de la secuencia sea mantenida generalmente. Cuando se relaciona con una secuencia de proteínas, el aminoácido substituyente tiene propiedades fisicoquímicas las cuales usualmente, pero no necesariamente, son similares a aquellas del aminoácido substituido. Las propiedades fisicoquímicas similares incluyen, similaridades en la carga, voluminosidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y semejantes. Algunas de las substituciones de aminoácidos conservadoras conocidas más comúnmente incluyen, pero no están limitadas a: Leu o Val o lie; Gly o Ala; Asp o Glu; Asp o Asn o His; Glu o Gln; Lys o Arg; Phe o Trp o Tyr; Val o Ala; Cys o Ser; Thr o Ser; y Met o Leu. Cuando se utilice*' aqui, el término "purificado" se refiere a una molécula que ha sido separada de otros componentes celulares o virales. Por consiguiente, por ejemplo, una "proteína purificada" ha sido purificada a un nivel no encontrado en la naturaleza. El término "substancialmente purificada" se refiere a una proteína que es pura hasta aproximadamente 60% o más grande. El término "substancialmente pura" se refiere a una proteína que es pura hasta aproximadamente 80% o más grande . El término "esencialmente pura" se refiere a una proteína que es pura hasta aproximadamente 90% o más grande .
Modalidades Preferidas
En una modalidad preferida particularmente, el método de purificación de la proteína El comprende una incubación de un extracto nuclear del sistema de expresión eucariótico a una concentración de la sal inferior que 300 mM, preferentemente desde 0.100 mM, más preferentemente desde 0-50 mM y aún más preferentemente en la ausencia de una sal. Preferentemente, l'a sal se refiere a NaCl aunque se pueden utilizar otras sales bien conocidas en la técnica (tales como LiCl o KCl) para las extracciones nucleares.
De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, se proporciona un método como se describió anteriormente en donde la proteína El es la heiicasa de El del papilomavirus de bovino (BPV) , el papilomavirus del conejo de rabo blanco (CRPV) o el papilomavirus humano (HPV) . En una modalidad preferida, la proteína El es de los tipos de riesgo bajo o de riesgo elevado. Preferentemente, cuando la proteína El es del tipo de riesgo bajo, la misma se selecciona del tipo 6, del tipo 11 y del tipo 13, y especialmente del tipo 11 y del tipo 6 del HPV. Alternativamente, cuando la proteína El es del tipo de riesgo elevado, la misma es seleccionada del grupo que consiste de los tipos, 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, o 58, preferentemente del tipo 16. Un aspecto adicional de la presente invención proporciona el método que se describió anteriormente en donde el sistema de expresión eucariótico es seleccionado del grupo que consiste del: baculovirus de las células de insectos; el virus de Vaccinia (Vacunas), de Sindbis, o del virus forestal de Semliki, o el Adenovirus en las células de mamífero (tales como las células COS o Vero); y los plásmidos en los sistemas '-de expresión de la levadura, preferentemente un baculovirus en el sistema de expresión de las células de insectos.
Un aspecto adicional de la presente invención provee el método como se describió anteriormente en donde la proteína El comprende una etiqueta de afinidad seleccionada del grupo que consiste de: una etiqueta de histidina, glutationa-S-transferasa, y la proteína de unión de la maltosa y el ligando de afinidad complementario es seleccionado del grupo que consiste de: las columnas de anticuerpos, níquel, maltosa y glutationa. Preferentemente, la columna de los anticuerpos comprende los anticuerpos monoclonales o policlonales, más preferentemente los anticuerpos monoclonales. Más preferentemente, la proteína El es etiquetada con una etiqueta de histidina y la proteína etiquetada con His es separada sobre una columna del ligando de afinidad del níquel. Preferentemente, la etiqueta de afinidad es colocada en un extremo de la proteína El, más preferentemente en el extremo o terminal N de la misma. Todavía, un aspecto adicional de la presente invención proporciona una preparación de El del HPV preparada a partir de una concentración baja en sal, extraída preferentemente de: una preparación nuclear en la presente de NaCl 0-100 mM, más preferentemente de NaCl 0-50 mM, aún más preferentemente en la ausencia de NaCl, y purificada adicionalmente por cromatografía de afinidad.
Preferentemente, la preparación de El como se describió anteriormente está "purificada substancialmente" a al menos aproximadamente una pureza del 60% y superior, más preferentemente "substancialmente" a al menos aproximadamente 80% de pureza y superior, especialmente "esencialmente pura" a al menos aproximadamente 90% de pureza. Preferentemente, la preparación de El como se describió anteriormente es la helicasa de El del papilomavirus del bovino (BPV) , el papilomavirus del conejo de rabo blanco (CRPV) o el papilomavirus humano (HPV), preferentemente del tipo de riesgo bajo o de riesgo elevado del HPV. Preferentemente, cuando la proteína El es una del tipo bajo, la misma es seleccionada del tipo 6, del tipo 11 y del tipo 13, y especialmente del tipo 11 y del tipo 6 del HPV. Alternativamente, cuando la proteína El es del tipo de riesgo elevado, la misma se selecciona del grupo que consiste de los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, o 58, preferentemente, del tipo 16.
Metodología
Las construcciones del ADN recombinantes de acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando las técnicas de biología molecular, de la microbiología, y del ADN recombinante, bien conocidas para aquellos expertos en la técnica (es decir Sambrook y colaboradores, 1989, supra) . Con una construcción de ADN adecuada transfectada en una célula huésped, la presente invención proporciona un método para la expresión de un gen de interés. Alternativamente, la construcción del ADN comprende una secuencia que codifica una etiqueta de afinidad, tales como los nucleótidos que codifican la histidina (His) . La transfección de la construcción del ADN en una célula huésped proporciona un medio conveniente para expresar una proteína de fusión comprendida del polipéptido de interés y la etiqueta de afinidad, permitiendo por consiguiente el aislamiento del producto de fusión expresado por una columna del ligando de afinidad complementaria con la etiqueta de afinidad.
Construcción y Expresión
Se ha utilizado una versión particular del sistema de Gibco Lifesciences, en el cual el gen de interés es subclonado en un vector de transferencia el cual es transformado entonces en una- cepa de E. coli que contiene un genoma del baculovirus. Los sitios específicos sobre el vector permiten entonces la transposición la cual inserta el gen en el genoma del baculovirus (bacmid) . Este bacmid o bácmido recombinante puede ser aislado y transfectado entonces en las células de los insectos SF9 y SF21, las cuales producen entonces la proteína de interés, así como el virus infeccioso el cual puede ser utilizado en el futuro para producir la proteína de interés. En otros sistemas de baculovirus, el gen de interés puede ser combinado en el genoma del baculovirus dentro de la célula del insecto. Esto se hace transfectando las células de los insectos con un vector que contiene el gen de interés y al mismo tiempo infectándolas con el baculovirus. En un cierto porcentaje de estos casos, el gen de interés es transferido al genoma viral por recombinación homologa. Varios métodos son bien conocidos en la técnica los cuales se pueden utilizar para seleccionar los genomas recombinantes que llevan el gen de interés.
Extracción y Purificación
La proteína El de la invención puede ser purificada utilizando un protocolo específico que haga posible que la misma sea separada rápidamente y en un número limitado de pasos desde las proteínas nucleares y celulares eucarióticas y otros componentes contaminantes virales.
Contrario al deseo convencional que sugiere que las proteínas de unión del ácido nucleico sean más solubles en las concentraciones más elevadas de la sal, se ha establecido por el Solicitante que la proteína El sea separada rápida y eficientemente del volumen de las proteínas nucleares y el ADN por un protocolo de extracción bajo en sal. Sin desear que esté limitado por la teoría, se tiene la hipótesis de que, cuando se suspende en una solución salada hipotónica, la proteína de El se lixivia selectivamente desde la preparación del núcleo. Esto es por lo que el paso crítico de la invención comprende la extracción baja en sal de la proteína El de los extractos nucleares del cultivo celular del baculovirus infectado con el HPV. Uno de los aspectos peculiares del protocolo de extracción está basado en el tiempo de incubación en . el cual la extracción nuclear se lleva a cabo en la solución baja en sal (30-40 minutos como lo opuesto a 5-10 minutos para la lisis celular) . Realmente, en una modalidad preferida de la invención, la solución amortiguadora para la lisis celular también puede ser hipotónica, sin embargo en este caso es importante '-no dejar a las células usadas en la solución amortiguadora para la lisis celular antes de que los núcleos sean centrifugados y separados para evitar la lixiviación de El en la solución amortiguadora para la lisis previo a la extracción. Aunque los experimentos de la invención permitieron extraer la El a una concentración de la sal de hasta 500 mM, se mostró que algunos contaminantes son observados a esta concentración. Por lo tanto se prefiere utilizar las concentraciones de la sal que están abajo de 300 mM, y preferentemente las concentraciones de la sal iguales o abajo de las concentraciones de la sal isotónica (150 mM) tales como 100 mM, más preferentemente 50 mM, y aún más preferentemente, la extracción es llevada a cabo en la ausencia de una sal. A continuación de la extracción nuclear, la proteína El es purificada además de manera preferente por cromatografía de afinidad. Para tales propósitos la proteína puede ser expresada como una proteína de fusión que comprende una etiqueta de afinidad la cual es atrapada específicamente por un ligando de afinidad complementario unido al medio de la columna cromatográfica. La etiqueta de afinidad está localizada preferentemente sobre el extremo o terminal N de la proteina. Los ejemplos de •' los pares de la columna de ligandos de afinidad/etiquetas de afinidad incluyen pero no están limitados a: la columna de Proteína de Unión de la Maltosa (MBP) /maltosa; columna de Glutationa S Transferasa (GST) /glutationa; columna de histidina (His) /Ni. En una modalidad preferida, la El es expresada como una proteína de fusión de la His-El y es purificada a través de la cromatografía de afinidad de la columna de Ni de acuerdo con los métodos bien conocidos en la técnica. Alternativamente, la proteina también puede ser atrapada por los anticuerpos policlonales o monoclonales, el tal caso la misma no necesita ser modificada con una etiqueta de afinidad. Para este propósito, se debe preparar un antisuero. En general, las técnicas para preparar los anticuerpos (incluyendo los anticuerpos monoclonales y los hibridomas) y para detectar los antígenos utilizando los anticuerpos, son bien conocidas en la técnica (Campbell, 1984, En "Monoclonal Antibody Technology: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology", Elsevier Science Publisher, Amsterdam, Países Bajos) y en Harlow y colaboradores, 1988 (en: Antibody - A Laboratory Manual, CSH Laboratories) . De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un medio para detectar los agentes antivirales utilizando ensayos para seleccionar su nivel de inhibición contra el HPV. La efectividad de los agentes candidatos puede ser evaluada por su capacidad para inhibir la actividad de la helicasa viral. Esta puede ser efectuada directamente, midiendo el nivel de inhibición sobre la actividad de la helicasa viral o indirectamente, por la evaluación de la alteración durante la interacción entre el complejo de El/E2/ori midiendo la inhibición sobre el proceso de replicación del ADN viral. Los métodos para detectar tales agentes antivirales incluyen, sin limitaciones, el uso de reactivos colorimétricos, fluorescentes o radioactivos. Tales métodos de detección pueden ser aplicados en varios tipos de ensayos tales como ensayos en placas de cultivo o ensayos a base de un gel que incluyen por ejemplo el Ensayo Inmunosorbente Enlazado a la Enzima (ELISA) , o el Ensayo de la Proximidad de Centelleos (SPA) o cualquier otro ensayo bien conocido en la técnica. En una modalidad particular, se proporciona -un ensayo para seleccionar e identificar a los agentes candidatos los cuales modulan la actividad de helicasa del El, y más particularmente la actividad de la helicasa de El del tipo 11 y del tipo 6 del HPV. Una modalidad preferida de tal ensayo está basado en un ensayo de selección dé rendimiento elevado (HTS) para los agentes candidatos capaces de inhibir la actividad de helicasa de El y para identificar tales agentes. Tal ensayo de selección de rendimiento elevado es seleccionado preferentemente de un ensayo fluorescente o un ensayo de la proximidad de centelleos, más preferentemente este último. En este ensayo, el substrato de ADN duplexo consiste del ADN de una sola hebra de M13 (aproximadamente 8000 bases) al cual es recocido un oligodesoxinucleótido de 19 bases (véase la Figura 6) . Este ADN doble parcial es extendido hasta 24 bases con la incorporación del dATP etiquetado con [33P] por una reacción con el fragmento de Klenow de la polimerasa I del ADN. La actividad de la helicasa conduce a la separación de este oligo radioetiquetado a partir del ADN del M13. En la ausencia de una helicasa funcional, el substrato de ADN de doble hebra es estable durante varias horas a la temperatura de ensayo. Para detectar la actividad, un segundo desoxioligonucleótido de 24 bases, complementario con el oligo del substrato, es agregado a la mezcla de la reacci-ón en un segundo paso. Este oligo se recoce a cualquier oligo radioetiquetado, pero no puede interactuar con el oligo todavía recocido al ADN del M13. Una biotina está fijada covalentemente al extremo o terminal 5' del segundo oligo. En el tercer paso, las perlas de SPA recubiertas con estreptavidina (Amersham.- Life Science, código TRKQ7030) son agregadas a la mezcla. El oligo biotinilado y cualquier oligo radioetiquetado asociado se unen entonces a estas perlas. Las perlas de SPA son impregnadas con un agente centelleante, el cual permite la detección de la radioetiqueta en proximidad estrecha con las perlas. Por consiguiente, el oligo radioetiquetado recocido al oligo biotinilado seré detectado, mientras que el substrato que no reaccionó todavía hibridizado al M13 no está en proximidad estrecha con las perlas y no será detectado. En la presencia de un inhibidor, menos substrato está desenrollado o desenvuelto, de modo que una señal inferior es detectada. Los controles positivos utilizados para la validación de este ensayo pueden ser, entre otros substratos fríos (tales como el ADN de una sola hebra de M13) o los intercaladores del ADN (tales como el bromuro de etidio) . El ADN del M13 compite con el substrato de M13 etiquetado e inhibe la señal detectada. El bromuro de etidio es un intercalador del ADN reconocido y estabiliza el substrato de oligo-M13, por lo cual se previene la actividad de la helicasa.
EJEMPLOS
La presente invención es ilustrada con detalle adicional por los siguientes" ejemplos no limitativos.
EJEMPLO 1: EXPRESIÓN DE El Construcción del plásmido recombinante
Construcción del baculovirus recombinante (Sistemas de Expresión del Baculovirus Bac-to-Bac®) (Gibco BRL) :
El gen de El de tipo 11 de HPV fue amplificado por per utilizando el plásmido recombinante pCR3-El como el modelo o plantilla del ADN de acuerdo con Lu y colaboradores (1993, J. Virology 67:7131-7138). El cebador delantero fue 5' -CGC GGA TCC AGG ATG CAT CAC CAT CAC CAT CAC GCG GAC GAT TCA CGT ACA GAA AAT GAG-3' (SEC ID NO. 1) y el inverso fue GG CTG AAT TCA TAA AGT TCT AAC AAC T (SEC ID NO. 2) . Los productos purificados por per fueron restringidos entonces con EcoRI y BamHI y se ligaron con un plásmido donador pFASTBACl® (Gibco, BRL) el cual ha sido linearizado con las mismas enzimas.
Expresión de la proteína El del HPV-11
El His-El-pFASTBAC fue transformado entonces en el DHlOBac® de la cepa de E. coli para la transposición siguiendo las instrucciones 'del fabricante (Gibco-BRL) . Las colonias blancas fueron seleccionadas y la transposición se confirmó por per analítica utilizando cebadores que flanquean el sitio de inserción del bacmid o bácmido (ADN circular del baculovirus) . La mini-preparación de los bácmidos recombinantes se llevó a cabo y el ADN del bácmido purificado se transfectó en las células del SF9. Los sobrenadantes que contienen el baculovirus fueron colectados 72 h después de la transfección, y las células infectadas se volvieron a suspender en una solución amortiguadora Leammli 2X para el análisis de expresión por Western utilizando los anticuerpos policlonales anti-El K72 (véase la descripción del ensayo de unión del ADN de El dependiente de E2, Ejemplo 8) . Los baculovirus recombinantes, que se confirmó que expresan la proteína El-His se reamplificaron y se utilizaron además para infectar las células de los insectos de SF21 para la producción a gran escala.
EJEMPLO 2: Extracción del His-El del HPV-11 utilizando diferentes concentraciones de la sal
Extracción de El. Las células de insectos SF21 infectadas con el baculovirus -recombinante de El-pFASTBAC fueron colectadas a partir de 425 "ml del cultivo en él medio SF-900 II SFM para dar una icroesfera celular de 5 ml la cual ha sido congelada rápidamente en hielo seco. La microesfera congelada fue licuada entonces rápidamente y las células se volvieron a suspender én 5 ml de la solución amortiguadora A para la lisis de las células (20 mM tris, pH 8.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 - antipain (antidolor) , leupeptina y pepstatina cada una a 1 µg/ml - 1 mM Pefabloc®) . A continuación de 15 minutos de incubación sobre hielo, las células fueron rotas con un homogeneizador de Dounce («5 minutos, mano de mortero B) y luego se centrifugó a 2500 gravedades, 20 minutos, 4°. Los núcleos conformados en microesferas fueron resuspendidos hasta 7 ml con la solución amortiguadora para la resuspensión (20 mM Tris, pH 8.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, antipain (antidolor), leupeptina y pepstatina cada una a 2 µg/ml, 2 mM Pefabloc®) y distribuida en alícuotas de 0.5 ml en 14 tubos. 0.5 mililitros de 13 diferentes soluciones amortiguadoras de extracción 2X (a concentraciones variables de la sal y los detergentes) fueron mezcladas entonces separadamente a 13 alícuotas de los núcleos, por pipeteo hacia arriba y hacia abajo para dar las condiciones finales listadas posteriormente. Las muestras fueron incubadas a 4° con vibración durante 30 minutos y se centrifugan en una microcentrífuga a velocidad máxima durante 30 minutos. Los sobrenadantes fueron recuperados finalmente y 4 µl de cada uno se hicieron correr en SDS-PAGE al 10%. 1 gel se tiñó con el Azul de Coomassie (Figura 3A) y otro se transfirió hacia la membrana que va a ser hibridizada con el anticuerpo policlonal del anti-El K72 y se detectó con el "reactivo quimioluminiscente del manchado de western" (DuPont NEN, Boston, MA) y la luz emitida fue capturada sobre la película de autorradiografía (Figura 3B) .
Leyendas de las Figuras 3A y 3B: Faja 0: 10 mM Tris, pH 8.'0; 0.5 mM DTT; 0.5 mM EDTA Faja 1: 20 mM tris, pH 8.0; 1 mM DTT; 0.5 mM EDTA Faja 2: #1 + 100 mM NaCl Faja 3: #1 + 450 mM NaCl Faja 4: #1 + 0.01% Tritón X-100 Faja 5: #1 + 0.01% Tritón + 100 mM NaCl Faja 6: #1 + 0.01% Tritón + 450 mM NaCl Faja 7: #1 + 0.1% Tritón Faja 8: #1 + 0.1% Tritón + 100 mM NaCl Faja 9: #1 + 0.1% Tritón + 450 mM NaCl Faja 10: #1 + 10% glicerol Faja 11: #1 + 10% glicerol + 100 M NaCl Faja 12: #1 + 10% glicerol + 450 mM NaCl
Las fajas indicadas como 50, 100, y 200 µg fueron muestras del fragmento El del E. coli que fueron utilizadas como un control positivo para el inmunomanchado del anticuerpo K72.
Las Figuras 3A y 3B muestran que la extracción de El a partir de la preparación nuclear no es mejorada ampliamente por el uso del detergente (fajas 4 a 12) . Cuando las concentraciones de la sal se incrementan, más contaminantes se retiran por lixiviado de los núcleos. En la ausencia de la sal, casi la totalidad de la proteína de El ya ha sido extraída, y 100 mM no muestran más El extraída. A 450 mM de la sal, el gel muestra más contaminantes y alguna degradación de la proteína de El.
EJEMPLO 3: Extracción de El-His del HPV-11
Las células infectadas con el baculovirus recombinante fueron colectadas y congeladas rápidamente en nitrógeno líquido antes de ser almacenadas a -80 °C. Para la extracción nuclear, las microesferas de las células congeladas fueron licuadas y resuspendidas en 1 volumen (con relación al volumen de las microesferas de las células) de la solución amortiguadora B para la lisis de las células que contiene inhibidores de proteasa (20 mM Tris pH 8, 5 mM ß-mercaptoetanol, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM Pefabloc®, 1 µg/ml de pepstatina, 1 µg/ml de leupeptina, y 1 µg/ml de antipain (antidolor) ) y se dejan sobre hielo durante 15 minutos. Las células fueron rotas entonces sobre hielo con un homogeneizador de Dounce («5 min, mano de mortero B) seguido por centrifugación a 2500 gravedades, 4° durante 20 minutos. El sobrenadante (cytosol) se desechó y los núcleos se volvieron a suspender hasta 1.4 volúmenes con la solución amortiguadora A de extracción (20 mM Tris pH 8, 5 M ß-mercaptoetanol, 2 mM Pefabloc®, 2 µg/ml pepstatina, 2 µg/ml de leupeptina, y 2 µg/ml de antipain (antidolor)). Finalmente, 1.4 volúmenes de la solución amortiguadora B de extracción (20 mM Tris pH 8, 5 mM ß-mercaptoetanol, y 0.02% Tritón X-100) fueron agregados y los núcleos se incubaron a 4° con vibración durante 30 minutos antes de la ultracentrifugación a 148,000 gravedades, 4° durante 45 minutos. El glicerol fue agregado al sobrenadante hasta una concentración final del 10% y el extracto se congeló rápidamente sobre hielo seco y se almacenó a -80 °C.
EJEMPLO 4: Purificación de His-El del HPV-11
Los extractos nucleares fueron licuados o descongelados rápidamente y las concentraciones del NaCl se ajustaron a 500 mM antes que la preparación fuera cargada sobre una columna de quelación Hi-Trap® de 5 ml cargada previamente con NiS04 de acuerdo con las instrucciones del Fabricante (Pharmacia, Biotech) . La columna se pre-equilibró entonces en una solución amortiguadora de equilibrio (20 mM Tris pH 8, 5 mM ß-mercaptoetanol, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, y 10% glicerol) y se colectó el flujo pasante para el análisis. La columna se lavó primero con 10 volúmenes de la solución amortiguadora para el equilibrio y luego con 10 volúmenes de la solución amortiguadora para el lavado (solución amortiguadora para el equilibrio pero con 50 mM imidazol) antes de que el His-El (o las proteínas mutantes) se eluyeran (fracciones 1 a 10 de 1 ml) con la solución amortiguadora para la elución (solución amortiguadora para el - equilibrio pero con 180 mM de imidazol) . Las proteínas de El fueron dializadas entonces en la solución amortiguadora para la diálisis (20 mM MES pH 7.0, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.05 mM EDTA, y 10% de glicerol) antes de ser congeladas sobre hielo seco y almacenadas a -80°. Como un ejemplo de los rendimientos obtenidos, de esta preparación, una preparación de 10 litros dio una solución de 10 ml del El purificado a 30 µg/ml (3 mg de la proteína total) . Leyenda de la Figura 4B: A: carga total de la columna; B: flujo pasante; C: equilibrio con 10 mM imidazol; D: lavado con 50 mM imidazol;
Las Fajas 1 a 10 representan las fracciones de 1 mi eluidas con la solución amortiguadora para la elución (180 mM imidazol) . La Figura 4B muestra un gel teñido con el azul de Coomassie en donde las fracciones 2, 3, y 4 contienen la mayoría de la proteína El esencialmente pura.
EJEMPLO 5: Análisis de mutación de la helicasa de El del HPV-11
Las proteínas de El mutantes se hicieron para inhabilitar el sitio de activación de helicasa para legitimar que la actividad de helicasa observada se debió a la proteína El y no a los contaminantes co-purificados con El. Los plásmidos mutantes que codifican las mutaciones de la K484A, K484H, K484I y, K484R fueron construidos utilizando el juego o conjunto de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange® de Stratagene utilizando el protocolo suministrado por el fabricante. La plantilla para la mutagénesis fue la secuencia de ADN que lleva la mutación K484E. Este modelo o plantilla de ADN mutante fue utilizado en lugar del El del tipo silvestre a causa de que la mutación K484E crea un sitio de restricción. Esto les permitió a los inventores identificar los clones rápidamente los cuales llevaron las mutaciones de K484A, -H, -I, y -R simplemente seleccionando la pérdida del sitio de restricción. La mutación de K484E difirió de la secuencia del ADN de El del tipo silvestre de la siguiente manera:
WT El 5 ' -CCTGAC?CTGGGAAGTCGTGCTTTTGC-3 ' { SEC ID NO. 3) K484E 5 ' - CCTGACACTGGGGAGTCGTGCrTI'GC - 3 • { SBC D NO. 4)
(GAGTC es un sitio cortado por la enzima Pie 1). Los pares de los cebadores complementarios utilizados para la mutagénesis fueron:
K484A MDT-TOP 5 ' -CCTGACACTGGGGCGTCGTGCTT'GC-3 * (SBC D "O 5) MÜT-BOT 5 ' -GCAAAAGCACGACGCCCCAGTGTCAGG-3 ' (SEC ID NO. 22)
K484H MÜT-TOP 5 ' -CC GACAC GGGCACTOGTGCXTTTGC-3 ' ( SEC ID NO. 6) MDT-BOT 5 ' -GCAAAAGCACGAGTGCCCAGTGTCAGG-3 ' ( SBC ID NO. 23)
K484I MÜT-TOP 5 • -CCTGAC^CTGGGATCGCGTGCGTTTGC-3 • (SEC ID NO. 7) MUT-BOT 5 ' -GCAAAAGCACGAGATCCCAGTGTCAGG-3 • (SEC NO. 24) K 84R MDT-TOP 5 • - CCTGACACTGGGCCK;ta- GCrT TGC- 3 ( SEC D NO 8) MDT-BOT 5 ' -GCAAAAGCACGACCGCCCAGTGTCAGG-3 ' ( SEC D NO 25 )
La subclonación "de estos alelos mutantes * en el baculovirus fue amplificada por per utilizando los mismos cebadores que se describieron anteriormente. Todas las construcciones de His-El-K484A, -H, -I, y -R fueron clonadas en el mismo vector pFASTBac®, transformadas en los plásmidos DHlOBac® de E. coli de acuerdo con el Ejemplo 1. Los báemidos resultantes fueron transfectados en las células de SF9, y los virus recombinantes se infectaron en las células de SF21 también de acuerdo con el Ejemplo 1.
EJEMPLO 6: Expresión de la Proteína E2 de HPV-11
La E2 de HPV-11 se obtuvo por la expresión en las células de insectos infectadas por el baculovirus. Un baculovirus que codifica el 'gen para E2 de HPV-11 se obtuvo de R. Rose (U. Rochester, N.Y.) y se utilizó para infectar las células de los insectos SF21. Las células infectadas fueron resuspendidas en la solución amortiguadora C para la lisis celular (30 mM HEPES pH 7.6, 1 mM EDTA, 2 mM DTT, 1% NP-40, e inhibidores de la proteasa: lmM Pefabloc®, 1 mM PMSF, y 2.5 µg/ml de cada uno de antipain {antidolor) , leupeptina, y pepstatina) . La lisis ocurrió durante la agitación de las células, y los núcleos fueron recuperados por centrifugación. Los núcleos fueron resuspendidos en la solución amortiguadora C para la extracción nuclear (30 mM HEPES pH 7.6, 10% glicerol, 250 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT, 0.5% NP-40, y los mismos inhibidores de proteasa que anteriormente) . La suspensión se agitó durante 45 minutos, luego se sometió a la acción del sonido. La E2 se recuperó en el sobrenadante a continuación de la centrifugación.
EJEMPLO 7: Purificación de la E2 del HPV-11
La E2 se purificó a partir del extracto nuclear utilizando una cromatografía de afinidad del ADN por un procedimiento basado en aquel de Seo y colaboradores (PNAS 90 (93) 2865) . Para preparar la columna del ligando de afinidad, el ADN doble que contiene tres sitios de unión de E2 se preparó por el recocido de dos oligos (5' -biotina-AFT GAC CGA AAA CGG TCG GGA CCG.'AAA ACG GTG TAG ACC GAA AAC GGT GTA-3' (SEC ID NO. 9) y 5' -CTA CAC CGT TTT CGG TCT ACA CCG TTT TCG GTC CCG ACC GTT TTC GGT CAC T-3' (SEC ID NO. 10)). El ADN doble se unió a la estreptavidina agarosa en virtud de la biotina incorporada en el primer oiigo. L. cromatografía se llevó a cabo utilizando la solución amortiguadora D de elución (solución amortiguadora C para la extracción nuclear sin los inhibidores de proteasa) y la solución amortiguadora E de elución (solución amortiguadora D de elución más 1M NaCl) . Una columna típica consistió de 10 ml de la resina anterior. El extracto nuclear se centrifugó a 50,000 gravedades durante 20 minutos para remover cualquier material precipitado, luego se aplicó a la columna, se lavó con la solución amortiguadora D de elución hasta que la absorbencia del eluyente en 280 nm alcanzó la línea base, luego se eluyó con un gradiente lineal de elución de las soluciones amortiguadoras D y E de elución, 60 ml de cada una. Las fracciones que contienen el E2 puro (por SDS-PAGE) fueron agrupadas y concentradas hasta aproximadamente 150 µg/ml utilizando un dispositivo de filtro centrífugo Millipore (Ultrafree-15®) , luego se almacenó a -80°.
EJEMPLO 8: Ensayo de unión del ADB de la El dependiente de E2
Este ensayo fue modelado sobre un ensayo similar para el Antígeno de SV40 T descrito por McKay (J. Mol. Biol., 1981, 145:471). Una sonda del ADN radioetiquetada de 400 pb, que contiene el origen de replicación de HPV-11 (Chiang y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:5799) se produjo por per, utilizando el SK pBluescript® del plásmido que codifica el origen (nucleótidos 7886-61 del genoma de HPV-11 en el sitio de BAMH1 único) como el modelo o plantilla y los cebadores que flanquean el origen. La radioetiqueta fue incorporada como [33P]dCTP. La solución amortiguadora para el ensayo de unión consistió de: 20 mM Tris pH 7.6, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 1 mM EDTA. Otros reactivos utilizados fueron las perlas A-SPA de la proteína (tipo II, Amersham) y el antisuero policlonal de conejo K72, realzado contra un péptido que corresponde a los 14 aminoácidos C-terminales de la El de HPV-11. Siguiendo el protocolo de Amersham, una botella de las perlas se mezcló con 25 ml de la solución amortiguadora del ensayo de unión. Para el ensayo, una cantidad, de saturación del antisuero K72 fue agregada a las perlas y la mezcla se incubó durante 1 hora, se lavó con un volumen de la solución amortiguadora para el ensayo de unión, y luego se volvió a suspender en el mismo volumen de la solución amortiguadora para el ensayo de unión, fresca. Las reacciones de unión contuvieron 8 ng de E2, aproximadamente 100-200 ng de la El purificada, y 0.4 ng de la sonda radioetiquetada en un total de 80 µl de la solución amortiguadora para el ensayo de unión. Después de 1 h a temperatura ambiente, 25 µl de la suspensión de perlas de ?PA-anticuerpo K72 fueron agregados con la reacción de unión y se mezclaron. Después de una hora adicional de incubación a temperatura ambiente, las reacciones fueron centrifugadas brevemente para convertir en microesferas las perlas y la extensión de la formación del complejo se determinó por el conteo de los centelleos sobre un Packard TopCount®. Típicamente, la señal para las reacciones que contienen El y E2 fue de 20-30 veces más elevada que el fondo o línea base observada cuando ya sea El, E2, o ambos, son omitidas. La Figura 5A muestra la actividad de unión del ADN, del complejo de E1/E2 de la helicasa de El del tipo silvestre (wt) y los cuatro mutantes producidos en el Ejemplo 5. No existió diferencia significativa en la unión de El/E2/ori entre cualquiera de las proteínas que indique que las proteínas mutantes fueron dobladas o plegadas de una manera normal.
EJEMPLO 9: ENSAYOS DE HELICASA/ATPasa
Ensayos de Helicasa/ATPasa
El substrato para el ensayo de la helicasa analítica consistió de un oligonucleótido de 24 bases (GTA AAA CGA CCA GTG CCA AGC) (SEC ID. NO. 11) etiquetado en los extremos utilizando [33P]ATP y la cinasa del polinucleótido, recocida a M13mpl8. Las reacciones de helicasa/ATPasa combinadas contuvieron 800 o 1600 ng de El, 2 mM MgCl2, 1 mM ATP, y 1 µM del substrato de helicasa (concentración en los nucleótidos) en un volumen total de 80 µl de la solución amortiguadora para el ensayo de la helicasa (20 mM MES, pH 7.0, 1 mM DTT, 0.05 mM EDTA, 10% glicerol). Las reacciones fueron incubadas durante 2 horas a 37° y luego se colocaron sobre hielo.
Detección a base de un gel de la helicasa
µl de cada reacción se mezclaron con la solución de carga/detención de helicasa 5x (12.5 % Ficoll 4000, 0.5% SDS, 50 mM EDTA, y 0.125% de cada uno de azul de bromofenol y xileno cianol); 20 µl de la mezcla se sometieron a electrofóresis durante 1 hora a 125 V a través de un gel de poliacrilamida/lx TBE al 20%. Las reacciones en blanco que no contienen ninguna enzima fueron corridas en paralelo. El gel se secó y se exploró su imagen sobre un Phosphorlmager® de Molecular Dynamics. El substrato y el producto de la reacción se separaron por tamaño, con el substrato que permanece en la parte superior del gel y el oligonucleótido radioetiquetado desenrrollado o desenvuelto que migra a aproximadamente a medio camino hacia abajo. En algunos casos los productos de la degradación debidos a la actividad de la nucleasa son evidentes reduciendo o bajando adicionalmente el gel. El panel superior de la Figura 5B muestra la migración del gel del substrato de helicasa y el producto después de la incubación con las proteínas El mutantes y del tipo silvestre (wt) . La faja 13 es una muestra, hervida, la faja 12 es un blanco, mientras que la faja 11 es un blanco el cual ha sido incubado durante 2 horas a 37°. Como es evidente de la Figura 5B, ninguno de los mutantes mostró una actividad de helicasa significativa comparado con la proteína El del tipo silvestre. La intensidad de la banda de oligonucleótidos densenrrollada o desenvuelta puede ser cuantificada utilizando el Fosphorlmager®, y la cantidad de la actividad puede ser expresada con relación al 100% de desenrrollado como se describe posteriormente para el SPA.
Ensayo de ATPasa
Unos 15 µl adicionales de cada reacción se utilizaron para detectar la actividad de la ATPasa por el procedimiento de Lanzetta y colaboradores (Anal. Biochem. 1979, 100, 95).
El panel intermedio de la Figura 5B muestra que la actividad de la ATPasa sigue o es una consecuencia de la actividad de la helicasa como se demostró por el ensayo de gel.
Detección de la Proximidad de Centelleos de la Helicasa (SPA)
Unos 30 µl adicionales fueron transferidos a otra placa de 96 cavidades que contiene 30 µl de la solución amortiguadora de hibridación de detención de SPA, la cual es idéntica a la solución amortiguadora de "detención" en el Ejemplo 11, excepto que el oligonucleótido de captura biotinilado es complementario con la secuencia de substratos anterior. La actividad de la helicasa se cuantificó somo sigue: Una mezcla de reacción separada, que no contiene la enzima, se calentó a 95° durante 10 minutos, y el oligonucleótido del substrato libre resultante
(completamente desnaturalizado) se detectó como se describió para las mezclas 'de la reacción. El "nivel de la señal generada en este experimento representa 100% de desenrrollado. Los ejemplos similares, los cuales no fueron calentados, sirven como blancos, que representan la señal del fondo o básica. La cuantíficación del desenrrollado es calculada con relación a la muestra hervida con el fondo substraído. El panel inferior de la Figura 5B muestra que el porcentaje del desenrrollado es despreciable con las proteínas mutantes cuando se comparó con el control del tipo silvestre (wt) . Estos resultados están de acuerdo con unos obtenidos del ensayo a base del gel.
EJEMPLO 10: ACTIVIDAD ENZIMATICA
Actividad especifica de la helicasa de His-El
Actividades Enzimáticas de la El del HPV-11 -Comparación con la Literatura
TABLA 1
La Tabla 1 compara la actividad enzimática de la helicasa a partir del HPV-11 y -6 como se purificó de acuerdo con la presente invención, con otra helicasa reportada en la literatura. Esto representa el primer caso en donde la El de la helicasa del papilomavirus humano es purificada a un grado en donde su actividad de desenrollado puede ser cuantificada. En todos los casos la concentración de la enzima fue mayor que la concentración del substrato y el substrato fue el ADN del duplexo. parcial. Todos los experimentos se hicieron a 37° excepto para el BPV-El el cual se evaluó en 32°. La SV-40 TAg también fue evaluada en la literatura y V de 50 y 80 % de desenrrollado/µM proteína/minuto fueron obtenidos de estos grupos respectivamente (Goetz, JBC (1988); EMBO (1986)). La extensión de la diferencia con los resultados de la invención parte del hecho de que -las condiciones de ensayo de la invención fueron optimizadas para la actividad de la El y no pueden ser óptimas para la actividad de la TAg (pH inferior, etc.).
EJEMPLO 11: Ensayo de selección de rendimiento elevado Referencias de SPA
N. Bosworth, P. Towers, "Scintillation proximity assay" Nature 341, 167-168 (1989).
N. D. Cook, "Scintillation proximity assay" a versatile high throughputscreening technology" Drug Discovery Today, 1, 287-294 (1996). "Determination of DNA helicase activity using a [3H] scintillation proximity assay (SPA) system" Proximity News, Julio de 1996. Este ensayo es similar a aquel en el Ejemplo 9. El substrato de ADN radioetiquetado para este ensayo consiste de un oligonucleótido de 19 bases (TTC CCA GTC ACG ACG TTG T) (SEC ID NO 12) recocido a un plásmido M13mpl8 de una sola hebra. El fragmento de Klenow es utilizado para extender el duplexo parcial a 24 bases, utilizando cuatro [33P]dATP y un dCTP no etiquetado. Las reacciones de la helicasa son corridas mezclando 10 µl de cada uno de los siguientes componentes: 1) una combinación del substrato que comprende el substrato de ADN radioetiquetado, el ATP, y el acetato de magnesio;
2) inhibidores disueltos en la solución amortiguadora más 18% de DMSO; 3) HPV-11 El purificado como en el Ejemplo 4. El amortiguador de ensayo, utilizado para todas las diluciones, consistió "de 20 mM MES, pH 7.0, 10% de glicerol, 1.0 mM DTT, y 0.05 mM EDTA. Las concentraciones finales en el ensayo son de 0.8 µM (concentración en nucleótidos), 1.0 mM ATP, 1.0 mM de acetato de magnesio, 6% de DMSO. Suficiente El es utilizado para dar aproximadamente 20% de desenrrollado (como se determinó en el Ejemplo 9) . Las mezclas de la reacción son incubadas a 37° durante 2 h en placas de 96 cavidades Microfluor® (Dynex) . 30 µl de una solución amortiguadora de "detención" son agregados entonces, los cuales consistieron de 100 mM HEPES, pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM EDTA, 1% SDS, y un oligonucleótido biotinilado (complementario con el oligonucleótido del substrato) a 20 nM. Después de 1.5 h a temperatura ambiente, 50 µl de una suspensión de perlas de SPA polivinil tolueno recubiertas con estreptavidina (1.25 mg/ml en 50 mM HEPES, pH 7.5, 0.02% NaN3) es agregada, seguido por una incubación adicional de 0.5 h a temperatura ambiente. Las placas de ensayo son centrifugadas entonces brevemente para convertir en microesferas las perlas de SPA y la cantidad del producto de la reacción es detectada por conteo de centelleos utilizando un Packard Topcount®.
EJEMPLO 12: Inhibición de la actividad de la helicasa de El (curvas de ICs0)
Para determinar la potencia de los ' inhibidores potenciales, las reacciones de SPA de la helicasa de El (Ejemplo 11) son corridas en la presencia de inhibidores diluidos en serie. Las concentraciones tanto del M13 como del bromuro de etidio variaron desde 0.04 hasta 20 µM. Los controles de la reacción sin el inhibidor, y los blancos sin inhibidor y sin enzima, fueron corridos simultáneamente. El desenrrollado se detectó como se describió anteriormente y los resultados fueron ajustados a una logística utilizando el paquete de programación SAS. [SAS es una marca registrada del Instituto SAS,. Inc. de Cary, North Carolina] . Para ambas Figuras 7 y 8, los puntos de los datos son graficados como la inhibición porcentual a cada concentración del inhibidor. La concentración es expresada en µM a una escala logarítmica. La inhibición porcentual en cada concentración del inhibidor ( [I] ) es determinada de la siguiente fórmula:
100 - 100 x (actividad en [I] -blanco) (actividad del control-blanco)
La línea continua muestra el mejor ajuste a los datos determinado por SAS. Algunos puntos de los datos están fuera del intervalo y no se muestran en las Figuras. De las Figuras 7 y 8, se puede aproximar que la IC50 son 3 y 4 µM respectivamente para M13 y el bromuro de etidio.
EJEMPLO 13: EXPRESIÓN DE El DE HPV-6
Construcción del plásmido recombinante
La construcción del baculovirus recombinante
(sistema Bac-to-Bac) : El gen El del tipo 6a del HPV se amplificó por PCR utilizando el plásmido pCR3.1-E1 ( 6a) como el modelo del ADN construido previamente en el lab de la invención a partir del ADN aislado de una muestra clínica. El cebador delantero fue 5' -CGC GGA TCC AGG ATG CAT CAC CAT CAC CAT CACGCG GAC GAT TCA CGT ACA GAA AAT GAG 3' (SEC ID. NO.l) y el cebador inverso fue GG CTG AAT TCA TAA AGT TCT AAC AAC T (SEC ID NO. 2). El fragmento de PCR resultante fue purificado entonces y restringido con EcoRI y BamHI y ligado con el plásmido donador pFASTBACl linearizado con las mismas enzimas.
Expresión de la protelna El de HPV-6
El HIS-El-pFASTBAC se transformó entonces en la cepa DHlOBac® del E. coli para la transposición siguiendo las instrucciones del fabricante (Gibco-BRL) . Las colonias blancas fueron seleccionadas primero y la transposición se confirmó por PCR analítica utilizando cebadores que flanquean el sitio de inserción en el bácmido ADN circular del baculovirus) . La minipreparación de los bácmidos recombinantes se llevó a cabo y luego se transfectó en la célula SF9. 72 horas después de la transfección, los sobrenadantes que contienen el baculovirus fueron colectados y las células infectadas resuspendidas en la solución amortiguadora 2X Leammli para el análisis de expresión • por Western utilizando el anticuerpo policlonal K72. El baculovirus recombinante confirmó que la expresión del E1HIS fue reamplificada y además utilizada para infectar las células de SF21 para la producción a gran escala.
EJEMPLO 14 : Extracción de El-His del HPV-11 HPV-6 utilizando diferentes concentraciones de la sal
Extracción de El. Las células de insectos SF21 infectadas con el baculovirus recombinantes pFASTBAC de El fueron colectadas de 5 litros de cultivo en el medio SF-900 II SFM para dar una microesfera celular de 65 ml la cual ha sido congelada rápidamente en hielo seco. La microesfera congelada fue licuada entonces rápidamente y las células resuspendidas en 65 ml de la solución amortiguadora A para la lisis celular (20 mM tris, pH 8.0, 1 mM DTT, 1 mM EDTA, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2 - antipain (antidolor) , leupeptina y pepstatina cada uno a 1 µg/ml - 1 mM Pefabloc®) . A continuación de 15 minutos de incubación sobré hielo, las células fueron rotas con un homogeneizador de Dounce («5 minutos, piedra de mortero B) y luego centrifugadas a 2500 gravedades, 20 minutos, 4°. El sobrenadante fue recentrifugado a 148 000 gravedades, 4° durante 45 minutos y este segundo sobrenadante fue mantenido o vigilado como el "cytosol". El glicerol fue agregado a este sobrenadante hasta 10% de la concentración final y esta muestra fue congelada rápidamente sobre hielo seco y almacenada a -80 °C. Los núcleos conformados en microesferas fueron resuspendidos hasta 90 ml con la solución amortiguadora de extracción A (20 mM Tris, pH 8, 5 mM ß-mercaptoetanol, 2 mM Pefabloc®, 2 µg/ml pepstatina, 2 µg/ml leupeptina, y 2 µg/ml de antipain (antidolor) ) y se distribuyeron en alícuotas de 18 ml en 5 tubos. 18 ml de la solución amortiguadora B de extracción (20 mM Tris, pH 8, 5 mM ß-mercaptoetanol, y 0.02% Tritón X-100) fueron agregados y la concentración de NaCl fue ajustada con una solución 5M a las condiciones listadas posteriormente. Las muestras fueron incubadas a 4° con vibración durante 30 minutos y se centrifugaron a 148000 gravedades, 4° durante "45 minutos. Los sobrenadantes fueron recuperados finalmente y el glicerol fue agregado al sobrenadante a una concentración final del 10% y el extracto fue congelado rápidamente sobre hielo seco y almacenado a -80 °C.
Ejemplo 15: Purificación de El-His del HPV-11 y HPV-6.
Los extractos nucleares fueron licuados rápidamente y la concentración del NaCl ajustada a 500 mM antes que la preparación fuera cargada sobre la columna de quelación Hi-Trap® de 1 ml cargada previamente con NiS04 de acuerdo con las instrucciones del Fabricante (Pharmacia, Biotech) . La columna fue pre-equilibada entonces en la solución amortiguadora de equilibrio o compensación (20 mM Tris, pH 8, 5 M ß-mercaptoetanol, 500 mM NaCl, 10 mM imidazol, y 10% de glicerol) y se colectó a través del flujo para el análisis. La columna se lavó primero con 5-6 volúmenes de la solución amortiguadora de equilibrio y luego con 5-6 volúmenes de la solución amortiguadora de lavado (solución amortiguadora de equilibrio pero con 50 mM de imidazol) antes que el His-El fuera eluido (fracciones 1 a 10 de 1 ml) con la solución amortiguadora de la elución (solución amortiguadora de equilibrio pero con 180 mM de imidazol) . Las proteínas El fueron dializadas "entonces en la solución amortiguadora para la diálisis (20 mM MES pH 7.0, 500 mM NaCl, 1 mM DTT, 0.05 mM EDTA, y 10 % de glícerol) antes de ser congeladas sobre hielo seco y almacenadas a -80°. Para las muestras colectadas a través del flujo y la carga, 4 µl de cada una de las fracciones fueron corridas sobre SDS-PAGE al 10%. Para cada experimento de comparación, 1 gel fue teñido con el Azul de Coomassie (Figura 9A) y otro fue transferido a la membrana que va a ser hibridizada con el anticuerpo policlonal anti-El K72 y se detectó con el "reactivo quimioluminiscente del manchado de western" (DuPont NEN, Boston, MA) y la luz emitida fue capturada sobre la película de autorradiografía (Figura 9B) . Leyendas de las Figuras 9A (Coomassie) y 9B (manchado de Western) : A: carga sobre la columna Hi-Trap (Extracto Crudo) B: Flujo a través de la columna Hi-Trap Faja 1: El de HPV-11 extraído en la ausencia de NaCl Faja 2: El de HPV-11 extraído con 50mM NaCl Faja 3: El de HPV-11 extraído con 100 mM NaCl Faja 4: El de HPV-11 extraído con 250 mM NaCl Faja 5: El de HPV-11 extraído con 500 mM NaCl Faja 6: El de HPV-11 extraído a partir del citosbl La Figura 9A muestra un gel teñido con el azul de Coomassie del extracto de El crudo obtenido del protocolo del Ejemplo 14. Las Fajas 4 y 5 revelan que existe un lote de más material extraído a 250 y 500 mM de la sal pero la mayoría de esta material no está retenido sobre la columna, indicando que la mayoría del material extraído en estas concentraciones de la sal no es El . La Figura 9B permite observar que la mayoría del
El se unió a la columna. Una vez más los resultados de este experimento están de acuerdo con el ejemplo 4. El ensayo de la proteína de Bradford fue efectuado sobre las fracciones de la elución y SDS-PAGE y el manchado de western del El purificado se hicieron con una cantidad del contenido de la proteína total (1 µg para el SDS-PAGE; 0.2 µg para western) (Figuras 10A, 10B) . Leyenda de las Figuras 10A: El purificado por SDS-PAGE Faja 1: El de HPV-11 extraído en la ausencia de NaCl Faja 2: El de HPV-11 extraído con 50 mM NaCl Faja 3: El de HPV-11 extraído con 100 mM NaCl Faja 4: El de HPV-11 extraído con 250 mM NaCl Faja 5: El de HPV-11 extraído con 500 mM NaCl Faja 6: El de HPV-11 extraído a partir del citosol Faja 7: El de HPV-6a extraído en la ausencia del NaCl Leyenda de las Figuras 10B: Manchado de Western del El purificado Faja 1: El de HPV-11 extraído en la ausencia de NaCl Faja 2: El de HPV-11 extraído con 50 mM NaCl Faja 3: El de HPV-11 extraído con 100 M NaCl Faja 4: El de HPV-11 extraído con 250 mM NaCl Faja 5: El de HPV-11 extraído con 500 mM NaCl Faja 6: El de HPV-11 extraído a partir del citosol Faja 7: El de HPV-6a extraído en la ausencia del NaCl. Las Figuras 10A y 10B reproducen y extienden los resultados del ejemplo 3 en donde, cuando las concentraciones de la sal se incrementan, la preparación nuclear es menos pura y la preparación de la columna también es menos pura. En la ausencia de la sal y a 50 mM casi la totalidad de la proteína de El ya ha sido extraída. Las concentraciones de 100 mM y superiores no mejoran la extracción del El. La faja 6 también muestra claramente que la extracción y purificación de El de HPV-6 es efectiva en la ausencia de la sal. Por lo tanto se estableció que las condiciones para la extracción de rutina podrían ser efectuadas a una concentración de la sal igual o inferior que 300 mM para los resultados óptimos, preferentemente en las condiciones hipotónicas iguales o inferiores que 100 mM, más preferentemente iguales que o inferiores que 50 mM, y más preferentemente en la ausencia de la misma. Las proteínas El de HPV-11 y HPV-6a fueron secuenciadas y mostraron cambios de aminoácidos menores a partir de la literatura publicada. Las secuencias de la invención son presentadas en la Figura 11 (como la SEC ID No. 26) para HPV-11, y en la Figura 12 (SEC ID NO. 27) para HPV-6a.
LISTADO DE LAS SECUENCIAS
<110> Boehringer Ingeiheim (Canadá) Ltd.
<120> PREPARACIÓN DE LA PROTEINA El DEL PAPILOMAVIRUS HUMANO QUE TIENE ACTIVIDAD DE HELICASA Y MÉTODO PARA LA MISMA
<130> listado de secuencias (versión actualizada]
<140> <141>
<150> US 60/083,942 <151> 1998-05-01
<160> 27
<170> Patentln Ver. 2.1
<210> 1 <211> 60 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador delantero
<400> 1
CGCGGATCCA GGATGCATCA CCATCACCAT CACGCGGACG ATTCACGTAC AGAAAATGAG 60
<210> 2 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inverso
<400> 2
GGCTGAATTC ATAAAGTTCT AACAACT 27
<210> 3 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Modelo o
Plantilla de ADN natural
<400> 3
CCTGACACTG GGAAGTCGTG CTTTTGC 27
<210> 4 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: Modelo o Plantilla del mutante K484E
<400> 4
CCTGACACTG GGGAGTCGTG CTTTTGC 27
<210> 5 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador superior mutado K484A
<400> 5
CCTGACACTG GGGCGTCGTG CTTTTGC 27
<210> 6 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador superior mutado K484H
<400> 6
CCTGACACTG GGCACTCGTG CTTTTGC 27
<210> 7 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador superior mutado K48 I
<400> 7
CCTGACACTG GGATCTCGTG CTTTTGC 27
<210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador superior mutado K484R
<400> 8
CCTGACACTG GGCGGTCGTG CTTTTGC 27
<210> 9, <211> 51 <212> ADN <213> Secuencia Artificial <220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido
' -biotinilado
<400> 9
AGTGACCCGAA AACGGTCGGG ACCGAAAACG GTGTAGACCG AAAACGGTGT A . 51
<210> 10 <211> 52 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: oligonucleótido
<400> 10
CTACACCGTT TTCGGTCTAC ACCGTTTTCG GTCCCGACCG TTTTCGGTCA
CT . 52
<210> 11 <211> 21 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: substrato para el ensayo de helicasa
<400> 11
GTAAAACGAC CAGTGCCAAG C 21
<210> 12 <211> 19 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: substrato radioetiquetado para ensayo de helicasa
<400> 12
TTCCCAGTCA CGACGTTGT 19
<210> 13 <211> 649 <212> PRT <213> Proteína El Natural (org: HPV-11} <400> 13
Met Ala Asp Asp Ser Gly Thr Glu Asn Glu Gly Ser Gly Cys Thr Gly 1 5 10 15 Trp Phe Met Val Glu Ala He Val Glu His Thr Thr Gly Thr Gln He 20 25 30 Ser Glu Asp Glu Glu Glu Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr Asp Met Val 35 40 45 Asp Phe He Asp Asp Arg His He Thr Gln Asn Ser Val Glu Ala Gln 50 • 55 60 Ala Leu Phe Asn Arg Gln Glu Ala Asp Ala His Tyr Ala Thr Val Gln 65 70 75, 80
Asp Leu Lys Arg Lys Tyr Leu Gly Ser Pro Tyr Val Ser Pro He Ser 85 90 95 Asn Val Ala Asn Ala Val Glu Ser Glu He Ser Pro Arg Leu Asp Ala 100 105 110 He Lys Leu Thr Thr Gln Pro Lys Lys Val Lys Arg Arg Leu Phe Glu 115 120 125 Thr Arg Glu Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Ser Glu Val Glu Ala 13Ó 135 140 Ala Thr Gln Val Glu Lys His Gly Asp Pro Glu Asn Gly Gly Asp Gly 145 150 155 160
Gln Glu Arg Asp Thr Gly Arg Ásp He Glu Gly Glu Gly Val Glu His 165 170 175 Arg Glu Ala Glu Ala Val Asp Asp Ser Thr Arg Glu His Ala Asp Thr 180 185 190 Ser Gly He Leu Glu Leu Leu Lys Cys Lys Asp He Arg Ser Thr Leu 195 200 205 His Gly Lys Phe Lys Asp Cys Phe Gly Leu Ser Phe Val Asp Leu He 210 215 220 Arg Pro Phe Lys Ser Asp Arg Thr Thr Cys Ala Asp Trp Val Val Ala 225 230 r 235 240
Gly Phe Gly He His His Ser He Ala Asp Ala Phe Gln Lys Leu He 245 250 255
Glu Pro Leu Ser Leu Tyr Ala His He Gln Trp Leu Thr Asn Ala Trp 260 265 270 Gly Met Val Leu Leu Val Leu He Arg Phe Lys Val Asn Lys Ser Arg 275 280 285 Cys Thr Val Ala Arg Thr Leu Gly Thr Leu Leu Asn He Pro Glu Asn 290 295 300 His Met Leu He Glu Pro Pro Lys He Gln Ser Gly Val Arg Ala Leu 305 310 315 320
Tyr Trp Phe Arg Thr Gly He Ser Asn Ala Ser Thr Val He Gly Glu 325 330 335
Ala Pro Glu Trp He Thr Arg Gln Thr Val He Glu His Ser Leu Ala 340 345 350 Asp Ser Gln Phe Lys Leu Thr Glu Met Val Gln Trp Ala Tyr Asp Asn 355 360 365 Asp He Cys Glu Glu Ser Glu He Ala Phe Glu Tyr Ala Gln Arg Gly 370 375 380 Asp Phe Asp Ser Asn Ala Arg Ala Phe Leu Asn Ser Asn Met Gln Ala 385 390 395 400
Lys Tyr Val Lys Asp Cys Alá He Met Cys Arg His Tyr Lys His Ala 405 410 415
Glu Met Lys Lys Met Ser He Lys Gln Trp He Lys Tyr Arg Gly Thr 420 425 430 Lys Val Asp Ser Val Gly Asn Trp Lys Pro He Val Gln Phe Leu Arg 435 440 445 His Gln Asn He Glu Phe He Pro Phe Leu Ser Lys Leu Lys Leu Trp 450 455 460 Leu His Gly Thr Pro Lys Lys Asn Cys He Ala He Val Gly Pro Pro 465 470 . 475 480
Asp Thr Gly Lys Ser Cys Phe Cys Met Ser Leu He Lys Phe Leu Gly 485 490 .., 495 Gly Thr Val He Ser Tyr Val Asn Ser Cys Ser His Phe Trp Leu Gln 500 505 510 Pro Leu Thr Asp Ala Lys Val Ala Leu Leu Asp Asp Ala Thr Gln Pro 515 520 525 Cys Trp Thr Tyr Met Asp Thr Tyr Met Arg Asn Leu Leu Asp Gly Asn 530 535 540 Pro Met Ser He Asp Arg Lys His Arg Ala Leu Thr Leu He Lys Cys 545 550 . 555 560
Pro Pro Leu Leu Val Thr Ser Asn He Asp He Ser Lys Glu Glu Lys 565 570 575 Tyr Lys Tyr Leu His Ser Arg Val Thr Thr Phe Thr Phe Pro Asn Pro 580 585 590
Phe Pro Phe Asp Arg Asn Gly Asn Ala Val Tyr Glu Leu Ser Asp Ala 595 600 605 Asn Trp Lys Cys Phe Phe Glu Arg Leu Ser Ser Ser Leu Asp He Glu 610 615 620 Asp Ser Glu Asp Glu Glu Asp Gly Ser Asn Ser Gln Ala Phe Arg Cys 625 630 635 640
Val Pro Gly Ser Val Val Arg Thr Leu 645
<210> 14 <211> 646 <212> PRT <213> Proteína Ei (org: HPV-13; <400> 14
Met Ala Glu Asp Thr Gly Thr Asn Asn Glu Gly Thr Gly Cye Ser Gly 1 5 10 15 Trp Phe Leu Val Glu Ala Val Val Glu Arg Thr Thr Gly Gln Gln He 20 25 30 Ser Asp Asp Glu Asp Glu Thr Val Glu Asp Ser Gly Leu Asp Met Val 35 40 45 Asp Phe He Asp Asp Arg Pro He Thr His Asn Ser Val Glu Ala Gln 50 55 60 Ala Leu Leu Asn Glu Gln Glu Ala Asp Ala His Tyr Ala Ala Val Gln 65 70 75 80
Asp Leu Lys Arg Lys Tyr Leu Gly Ser Pro Tyr Val Ser Pro Leu Gly 85 90 95 His Val Glu Gln Ser Val Asp Cys Asp He Ser Pro Arg Leu Asp Ala 100 105 110 He Lys Leu Ser Arg Asn Ser Lys Lys Val Lys Arg Arg Leu Phe Gln 115 120 125 Ser Arg Glu He Thr Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Ser Glu Val Glu Ala 130 135 140
Glu Thr Gln Val Glu Arg Asn Gly Glu Pro Glu Asn Asp Cys Gly Gly 145 150 . 155 160
Gly Gly His Gly Arg Asp Lys Glu Gly Glu Gly Gln Val His Thr Glu 165 170 175 Val His Thr Gly Ser Gln He Glu Glu His Thr Gly Thr Thx Arg Val 180 185 190 Leu Glu Leu Leu Lys Cys Lys Asp Val Arg Ala Thr Leu Tyr Gly Lys 195 200 205 Phe Lys Asp Cys Tyr Gly Leu Ser Phe Thr Asp Leu He Arg Pro Phe 210 215 220 Lys Ser Asp Lys Thr Thr Cys Gly Asp Trp Val Val Ala Ala Phe Gly 225 230 235 240
He His His Ser Val Ser Glu Ala Phe Glu Lys Leu Met Gln Pro Leu 245 250 255
Thr Thr Tyr Met His He Gln Trp Leu Thr Asn Ala Trp Gly Met Val 260 265 270 Leu Leu Val Leu He Arg Phe Lys Val Asn Lys Ser Arg Cys Thr Val 275 280 285 Ala Arg Thr Leu Ala Thr Phe Leu Asn He Pro Glu Asp His Met Leu 290 ' 295 300 He Glu Pro Pro Lys He Gln Ser Ser Val Ala Ala Leu Tyr Trp Phe 305 310 315 320
Arg Thr Gly He Ser Asn Ala Ser He Val Thr Gly Glu Thr Pro Glu 325 330 335
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<210> 21 <211> 506 <212> PRT <213> Proteína El (org: HPV-16]
<400> 21
Met Leu Gln Val Glu Gly Arg His Glu Thr Glu Thr Pro Cys Ser Gln 1 5 ?o 15 Tyr Ser Gly Gly Ser Gly Gly Gly Cys Ser Gln Tyr Ser Ser Gly Ser 20 25 30 Gly Gly Glu Gly Val Ser Glu Arg His Thr He Cys Gln Thr Pro Leu 35 40 45 Thr Asn He Leu Asn Val Leu Lys Thr Ser Asn Ala Lys Ala Ala Met 50 55 60 Leu Ala Lys Phe Lys Glu Leu Tyr Gly Val Ser Phe Ser Glu Leu Val 65 70 75 80
Arg Pro Phe Lys Ser Asn Lys Ser Thr Cys Cys Asp Trp Cys He Ala 85 90 95
Ala Phe Gly Leu Thr Pro Ser He Ala Asp Ser He Lys Thr Leu Leu 100 105 1Í0 Gln Gln Tyr Cys Leu Tyr Leu His He Gln Ser Leu -Ala Cys Ser Trp 115 120 125 Gly Met Val Val Leu Leu Leu Val Arg Tyr Lys Cys Gly Lys Asn Arg
130 135 140 Glu Thr He Glu Lys Leu Leu Ser Lys Leu Leu Cys Val Ser Pro Met 145 150 155 160
Cys Met Met He Glu Pro Pro Lys Leu Arg Ser Thr Ala Ala Ala Leu 165 . 170 175
Tyr Trp Tyr Lys Thr Gly He Ser Asn He Ser Glu Val Tyr Gly Asp 180 185 190 Thr Pro Glu Trp He Gln Arg Gln Thr Val Leu Gln His Ser Phe Asn 195 200 205 Asp Cys Thr Phe Glu Leu Ser Gln Met Val Gln Trp Ala Tyr Asp Asn 210 215 220 Asp He Val Asp Asp Ser Glu He Ala Tyr Lys Tyr Ala Gln Leu Ala 225 230 " 235 240
Asp Thr Asn Ser Asn Ala Ser Ala Phe Leu Lys Ser Asn Ser Gln Ala 245 250 255
Lys He Val Lys Asp Cys Ala Thr Met Cys Arg His Tyr Lys Arg Ala 260 265 270 Glu Lys Lys Gln Met Ser Met Ser Gln Trp He Lys Tyr Arg Cys Asp 275 280 285 Arg Val Asp Asp Gly Gly Asp Trp Lys Gln He Val Met Phe Leu Arg 290 295 300 Tyr Gln Gly Val Glu Phe Met Ser Phe Leu Thr Ala Leu Lys Arg Phe 305 310 315 320
Leu Gln Gly He Pro Lys Lys Asn Cys He Leu Leu Tyr Gly Ala Ala 325 330 335
Asn Thr Gly Lys Ser Leu Phe Gly Met Ser Leu Met Lys Phe Leu Gln 340 345 350 Gly Ser Val He Cys Phe Val Asn Ser Lys Ser His Phe Trp Leu Gln 355 360 365 Pro Leu Ala Asp Ala Lys He Gly Met Leu Asp Asp Ala Thr Val Pro 370 375 380 Cys Trp Asn Tyr He Asp Asp Asn Leu Arg Asn Ala Leu Asp Gly Asn
385 390 395 400
Leu Val Ser Met Asp Val Lys His Arg Pro Leu Val Gln Leu Lys Cys 405 410 415
Pro Pro Leu Leu He Thr Ser Asn He Asn Ala Gly Thr Asp Ser Arg 420 . 425 430 Trp Pro Tyr Leu His Asn Arg Leu Val Val Phe Thr Phe Pro Asn Glu 435 440 445 Phe Pro Phe Asp Glu Asn Gly Asn Pro Val Tyr Glu Leu Asn Asp Lys 450 455 460 Asn Trp Lys Ser Phe Phe Ser Arg Thr Trp Ser Arg Leu Ser Leu His 465 470 475 480
Glu Asp Glu Asp Lys Glu Asn Asp Gly Asp Ser Leu Pro Thr Phe Lys 485 490 495 Cys Val Ser Gly Gln Asn Thr Asn Thr Leu 500 505
<210> 22 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inferior mutado K848A
<400> 22
GCAAAAGCAC GACGCCCCAG TGTCAGG 27
<210> 23 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inferior mutado K484H
<400> 23 GCAAAAGCAC GAGTGCCCAG TGTCAGG 27
<210> 24 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inferior mutado K484I
<400> 24
GCAAAAGCAC GAGATCCCAG TGTCAGG 27
<210> 25 <211> 27 <212> ADN <213> Secuencia Artificial
<220> <223> Descripción de Secuencia Artificial: cebador inferior mutado K 84R
<400> 25 GCAAAAGCAC GACCGCCCAG TGTCAGG 27
<210> 26 <211> 649 <212> PRT <213> Proteína El natural variante (org: HPV-li;
<400> 26
Met Ala Asp Asp Ser Gly Thr Glu Asn Glu Gly Ser Gly Cye Thr Gly 1 5 . 10 15 Trp Phe Met Val Glu Ala He Val Glu His Thr Thr Gly Thr Gln He 20 25 30 Ser Glu Asp Glu Glu Glu Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr Asp Met Val 35 40 45 Aep Phe He Asp Asp Arg His He Thr Gln Asn Ser Val Glu Ala Gln 50 55 60 Ala Leu Phe Asn Arg Gln Glu Ala Asp Ala His Tyr Ala Thr Val Gln
65 70 75 80
Asp Leu Lys Arg Lys Tyr Leu Gly Ser Pro Tyr Val Ser Pro He Ser 85 90 95 Asn Val Ala Asn Ala Val Glu Ser Glu He Ser Pro Arg Leu Asp Ala 100 105 110 He Lys Leu Thr Thr Gln PEO Lys Lys Val Lys Arg Arg Leu Phe Glu 115 120 125 Thr Arg Glu Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Ser Glu Val Glu Ala 130 135 140 Ala Thr Gln Val Glu Lys His Gly Asp Pro Glu Asn Gly Gly Asp Gly 145 150 155 160 Glu Glu Arg Asp Thr Gly Arg Asp He Glu Gly Glu Gly Val Glu His 165 170 175
Arg Glu Ala Glu Ala Val Asp Asp Ser Thr Arg Glu His Ala Asp Thr 180 185 190 Ser Gly He Leu Glu Leu Leu Lys Cys Lys Asp He Arg Ser Thr Leu 195 200 205 His Gly Lys Phe Lys Asp Cys Phe Gly Leu Ser Phe Val Asp Leu He 210 215 220 Arg Pro Phe Lys Ser Asp Arg Thr Thr Cys Ala Asp Trp Val Val Ala 225 230 235 240
Gly Phe Gly He His His Ser He Ala Asp Ala Phe Gln Lys Leu He 245 250 255
Glu Pro Leu Ser Leu Tyr Ala His He Gln Trp Leu Thr Asn Ala Trp 260 265 270 Gly Met Val Leu Leu Val Leu He Arg Phe Lys Val Asn Lys Ser Arg 275 280 285 Cys Thr Val Ala Arg Thr Leu Gly Thr Leu Leu Asn He Pro Glu Asn 290 295 300 His Met Leu He Glu Pro Pro Lys He Gln Ser Gly Val Ala Ala Leu 305 310 315 320
Tyr Trp Phe Arg Thr Gly He Ser Asn Ala Ser Thr Val He Gly Glu
325 330 335
Ala Pro Glu Trp He Thr Arg Gln Thr Val He Glu His Ser Leu Ala 340 345 350 Asp Ser Gln Phe Lys Leu Thr Glu Met Val Gln Trp Ala Tyr Asp Asn 355 * 360 365 Asp He Cys Glu Glu Ser Glu He Ala Phe Glu Tyr Ala Gln Arg Gly 370 375 380 Asp Phe Asp Ser Asn Ala Arg Ala Phe Leu Asn Ser Asn Met Gln Ala 385 390 395 400
Lys Tyr Val Lys Asp Cys Ala He Met Cys Arg His Tyr Lys His Ala 405 410 415
Glu Met Lys Lys Met Ser He Lys Gln Trp He Lys Tyr Arg Gly Thr 420 425 430 Lys Val Asp Ser Val Gly Asn Trp Lys Pro He Val Gln Phe Leu Arg 435 440 445 His Gln Asn He Glu Phe He Pro Phe Leu Ser Lys Leu Lys Leu Trp 450 455 460 Leu His Gly Thr Pro Lys Lys Asn Cys He Ala He Val Gly Pro Pro 465 470 475 480
Asp Thr Gly Lys Ser Cye Phe Cys Met Ser Leu He Lys Phe Leu Gly 485 490 495 Gly Thr Val He Ser Tyr Val Asn Ser Cys Ser His Phe Trp Leu Gln 500 505 510 Pro Leu Thr Asp Ala Lys Val Ala Leu Leu Asp Asp Ala Thr Gln Pro 515 520 525 Cys Trp Thr Tyr Met Asp Thr Tyr Met Arg Asn Leu Leu Asp Gly Asn - 530 535 540 Pro Met Ser He Asp Arg Lys His Arg Ala Leu Thr Leu He Lys Cys 545 550 555 560
Pro Pro Leu Leu Val Thr Ser Asn He Asp He Ser Lys Glu Glu Lys 565 570 575 Tyr Lys Tyr Leu His Ser Arg Val Thr Thr Phe Thr Phe Pro Asn Pro 580 585 590 Phe Pro Phe Asp Arg Asn Gly Asn Ala Val Tyr Glu Leu Ser Asp Ala 595 600 605 Asn Trp Lys Cys Phe Phe Glu Arg Leu Ser Ser Ser Leu Asp He Glu 610 615 620 Asp Ser Glu Asp Glu Glu Asp Gly Ser Asn Ser Gln Ala Phe Arg Cys 625 630 635 640
Val Pro Gly Ser Val Val Arg .Thr Leu 645
<210> 27 <211> 649 <212> PRT <213> Proteína El natural (org: HPV-6a) <400> 27
Met Ala Asp Asp Ser Gly. Thr Glu Asn Glu Gly Ser Gly Cys Thr Gly 1 5 10 15 Trp Phe Met Val Glu Ala He Val Gln His Pro Thr Gly Thr Gln He 20 25 30 Ser Asp Asp Glu Asp Glu Glu Val Glu Asp Ser Gly Tyr Asp Met Val 35 40 45 Asp Phe He Asp Asp Ser Asn He Thr His Asn Ser Leu Glu Ala Gln 50 55 60 Ala Leu Phe Asn Arg Gln Glu Ala Asp Thr His Tyr Ala Thr Val Gln 65 70 75 80
Asp Leu Lys Arg Lys Tyr Leu Gly Ser Pro Tyr Val Ser Pro He Asn 85 90 95 Thr He Ala Glu Ala Val Glu Ser Glu He Ser Pro Arg Leu Asp Ala 100 105 110 He Lys Leu Thr Arg Gln Pro Lys Lys Val Lys Arg Arg Leu Phe Gln 115 120 125 Thr Arg Glu Leu Thr Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Ser Glu Val Glu Ala 130 135 140
Gly Thr Gly Thr Gln Val Glu Lys His Gly Val Pro Glu Asn Gly Gly 145 150 155 160
Asp Gly Gln Glu Lys Asp Thr Gly Arg Asp He Glu Gly Glu Glu His 165 170 175
Thr Glu Ala Glu Ala Pro Thr Asn Ser Val Arg Glu His Ala Gly Thr 180 185 190 Ala Gly He Leu Glu Leu Leu Lys Cys Lys Asp Leu Arg Ala Ala Leu 195 200 205 Leu Gly Lys Phe Lys Glu Cys Phe Gly Leu Ser Phe He Asp Leu He 210 215 220 Arg Pro Phe Lye Ser Asp Lys Thr Thr Cys Leu Asp Trp Val Val Ala 225 230 235 240
Arg Phe Gly He His His Ser He Ser Glu Ala Phe Gln Lys Leu He 245 " 250 255
Glu Pro Leu Ser Leu Tyr Ala His He Gln Trp Leu Thr Asn Ala Trp 260 265 270 Gly Met Val Leu Leu Val Leu Leu Arg Phe Lys Val Asn Lys Ser Arg 275 280 285 Ser Thr Val Ala Arg Thr Leu Ala Thr Leu Leu Asn He Pro Glu Asn 290 295 300 Gln Met Leu He Glu Pro Pro Lys He Gln Ser Gly Val Ala Ala Leu 305 310 315 320
Tyr Trp Phe Arg Thr Gly He Ser Asn Ala Ser Thr Val He Gly Glu 325 330 335
Ala Pro Glu Trp He Thr Arg Gln Thr Val He Glu His Gly Leu Ala 340 345 350 Asp Ser Gln Phe Lys Leu Thr Glu Met Val Gln Trp Ala Tyr Asp Asn 355 360 365 Asp He Cys Glu Glu Ser Glu He Ala Phe Glu Tyr Ala Gln Arg Gly 370 375 380 Asp Phe Asp Ser Asn Ala Arg Ala Phe Leu Asn Ser Asn Met Gln Ala 385 390 395 400 Lys Tyr Val Lys Asp Cys Ala Thr Met Cys Arg His Tyr Lys His Ala 405 410 415
Glu Met Arg Lys Met Ser He Lys Gln Trp He Lys His Arg Gly Ser 420 425 430 Lys He Glu Gly Thr Gly Asn Trp Lys Pro He Val Gln Phe Leu Arg 435 440 445 His Gln Asn He Glu Phe He Pro Phe Leu Thr Lys Phe Lys Leu Trp 450 455 460 Leu His Gly Thr Pro Lys Lys Aen Cys He Ala He Val Gly Pro Pro 465 470 475 480
Asp Thr Gly Lys Ser Tyr Phe Cys Met Ser Leu He Ser Phe Leu Gly 485 490 495
Gly Thr Val He Ser His Val Asn Ser Ser Ser His Phe Trp Leu Gln 500 505 510 Pro Leu Val Asp Ala Lys Val Ala Leu Leu Asp Asp Ala Thr Gln Pro 515 520 525 Cys Trp He Tyr Met Asp Thr Tyr Met Arg Asn Leu Leu Asp Gly Asn 530 535 540 Pro Met Ser He Asp Arg Lys His Lys Ala Leu Thr Leu He Lys Cys 545 550 555 560
Pro Pro Leu Leu Val Thr Ser Asn He Asp He Thr Lys Glu Asp Lys 565 570 575
Tyr Lys Tyr Leu His Thr Arg Val Thr Thr Phe Thr Phe Pro Asn Pro 580 585 590 Phe Pro Phe Asp Arg Asn Gly Asn Ala Val Tyr Glu Leu Ser Asn Thr 595 600 605 Asn Trp Lys Cys Phe Phe Glu Arg Leu Ser Ser Ser Leu Asp He Gln 610 615 620 Asp Ser Glu Asp Glu Glu Asp Gly Ser Asn Ser Gln Ala Phe Arg Cys 625 630 635 640
Val Pro Gly Thr Val Val Arg Thr Leu 645 Se hace constar que con relación a esta fecha el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.
Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes
Claims (45)
1. Un método para aislar una proteína El del papilomavirus o un derivado funcional de la misma que tiene actividad de la helicasa viral, caracterizado porque comprende los pasos de: producir una proteína recombinante de El en un sistema de expresión eucariótico y aislar una preparación nuclear de la misma; y extraer la proteína de El de la preparación nuclear en una solución amortiguadora que comprende la sal a una concentración igual o abajo de la concentración isotónica.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque además comprende el paso de: purificar la proteína de El a partir del extracto nuclear por cromatografía de afinidad.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la El es purificada a partir de una preparación nuclear en la presencia de una sal 0-100 mM.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la El es purificada a partir de una preparación nuclear en la presencia de una sal 0.50 mM.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la El es purificada a partir de una preparación nuclear en la ausencia de la sal.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la sal es el NaCl.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína El es la helicasa de El del papilomavirus del conejo de rabo blanco (CRPV) , el papilomavirus de bovino (BPV) o el papilomavirus humano (HPV) .
8. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína El es de los tipos de riesgo bajo o de riesgo elevado del HPV.
9. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque la proteína El del HPV es de un HPV del tipo de riesgo bajo seleccionado del grupo que consiste del: tipo 6, del tipo 11 y del tipo 13.
10. El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque el HPV de riesgo bajo es del tipo 11 o del tipo 6.
11. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la proteína El del HPV es de un HPV del tipo de riesgo elevado seleccionado del grupo que consiste de los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, o 50.
12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque el HPV de riesgo elevado es del tipo 16.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el sistema de expresión eucariótico es seleccionado del grupo que consiste del baculovirus en las células de insectos; virus forestales de Vaccinia, Sindbis, Semliki, o del Adenovirus en las células de mamíferos; y los plásmidos en los sistemas de expresión de la levadura.
14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque el sistema de expresión eucariótico son las células de insectos infectadas con un baculovirus.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína El comprende una etiqueta de afinidad.
16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque la etiqueta de afinidad es seleccionada del grupo que consiste de la etiqueta de histidina, la glutationa-S-transferasa, y la proteína de unión de la maltosa.
17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la etiqueta de afinidad es reconocida por un ligando de afinidad seleccionado del grupo que consiste de: anticuerpos, metales, maltosa y glutationa.
18. El método • de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la etiqueta de afinidad está colocada en el extremo o terminal N de dicha proteína El.
19. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal o un anticuerpo policlonal.
20. El método de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la proteína El es etiquetada con una etiqueta de histidina y el ligando de afinidad metálico es una columna de níquel.
21. Una preparación de la proteína El del papilomavirus humano recombinante a partir de un sistema de expresión eucariótico, la El tiene una actividad de desenrollado cuantificable, caracterizada porque la proteína El es extraída desde una preparación nuclear en la presencia de la sal a una concentración igual o abajo de la concentración isotónica, y purificada por cromatografía 'de afinidad.
22. La preparación de El del HPV de la reivindicación 21, caracterizada porque la El del HPV es purificada a partir de una preparación nuclear en la presencia de una sal 0-100 mM.
23. La preparación de El del HPV de conformidad con la reivindicación 22, caracterizada porque la El de HPV es purificada a partir de una preparación nuclear en la presencia de una sal 0-50 mM.
24. La preparación de El de HPV de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la El del HPV es purificada a partir de una preparación nuclear en la ausencia de la sal.
25. La preparación de El de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la proteína El tiene una pureza mayor que el 60%.
26. La preparación de El de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque la proteína El es de una pureza mayor que el 80%.
27. La preparación de El de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la proteína El es de una pureza mayor que el 90%.
28. La preparación de El de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada porque la proteína El es del tipo de riesgo bajo o de riesgo elevado del HPV.
29. La preparación de El del HPV de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la proteína de El del HPV recombinante es del HPV del tipo de riesgo bajo colectado del grupo que consiste: del tipo 6, del tipo 11 y del tipo 13.
30. La preparación de El del HPV de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque el HPV de riesgo bajo es del tipo 11 y del tipo 6.
31. La preparación de El del HPV de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada porque la proteína El del HPV recombinante es de un HPV del tipo de riesgo elevado seleccionado del grupo que consiste: de los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, o 58.
32. La preparación de El del HPV de conformidad con la reivindicación 31, caracterizada porque el HPV de riesgo elevado es del tipo 16.
33. La preparación de El del HPV de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque la proteína El se selecciona del grupo que consiste de las: SEC ID NO. 13; SEC ID NO. 14; SEC ID NO. 15; SEC ID NO. 16; SEC ID NO. 17 ; SEC ID NO . 18 ; SEC ID NO . 19; SEC ID NO . 20 ; SEC ID NO . 26; y SEC ID NO . 27 .
34. Un método para evaluar la actividad de la helicasa viral específica de la proteína El del papilomavirus, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: - incubar una mezcla de la preparación de la proteína El de acuerdo con la reivindicación 21, y un substrato adecuado para la actividad enzimática de la helicasa viral; y medir la cantidad de la actividad de helicasa específica de la proteína de El.
35. El ensayo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque el papilomavirus es el HPV-11 o el HPV-6.
36. El ensayo de conformidad con la reivindicación 34, caracterizado porque la proteína de El es seleccionada del grupo que consiste de las: SEC ID NO. 13; SEC ID NO. 14; SEC ID NO. 15; SEC ID NO. 16; SEC ID NO. 17; SEC ID NO. 18; SEC ID NO. 19; SEC ID NO. 20; SEC ID NO. 26; y SEC ID NO. 27.
37. Un método para identificar agentes capaces de modular la actividad de helicasa de El del papílomavirus, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: a) evaluar la actividad de la helicasa de El en la ausencia de dicho agente por el método de conformidad con la reivindicación 34; b) evaluar la actividad de la helicasa en la presencia del agente por el método de la reivindicación 34, en donde el agente es agregado a la mezcla del substrato y la helicasa durante la incubación; y c) comparar el resultado del paso a) con el resultado del paso b) .
38. El ensayo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque el papilomavirus es el HPV-11 o el HPV-6.
39. El ensayo de conformidad con la reivindicación 37, caracterizado porque la proteína El se selecciona del grupo que consiste de las: SEC ID NO. 13 SEC ID NO. 14; SEC ID NO. 15; SEC ID NO. 16; SEC ID NO. 17 SEC ID NO. 18; SEC ID NO. 19; SEC ID NO. 20; SEC ID NO. 26 y SEC ID NO. 27.
40. Un método para evaluar la replicación del ADN del papilomavirus, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: incubar la mezcla de la preparación de la proteína El de conformidad con la reivindicación 21, con la proteína de E2 y un origen de replicación del /ADN adecuado; y medir la cantidad del desenrollado del ADN.
41. El ensayo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque el papilomavirus es el HPV-11 o el HPV-6.
42. El ensayo de conformidad con la reivindicación 40, caracterizado porque la proteína El se selecciona del grupo que consiste de las: SEC ID NO. 13 SEC ID NO. 14; SEC ID NO. 15; SEC ID NO. 16; SEC ID NO. 17 SEC ID NO. 18; SEC ID NO. 19; SEC ID NO. 20; SEC ID NO. 26 y SEC ID NO. 27.
43. Un método para identificar un agente capaz de modular la replicación del ADN del papilomavirus, el método está caracterizado porque comprende los pasos de: a) ensayar o evaluar la actividad de replicación del ADN en la ausencia del agente por el método de conformidad con la reivindicación 40; b) ensayar o evaluar la actividad de la replicación del ADN en la presencia del agente por el método de conformidad con la reivindicación 40, en donde el agente es agregado a la mezcla durante la incubación; y c) comparar el resultado del paso a) con el resultado del paso b) .
44. El ensayo de conformidad con la reivindicación 43, caracterizado porque el papilomavirus es el HPV 11 o el HPV-6.
45. El ensayo de conformidad con -la reivindicación 43, caracterizado porque la proteína El es seleccionada del grupo que consiste de las: SEC ID NO. 13; SEC ID NO. 14; SEC ID NO. 15; SEC ID NO. 16; SEC ID NO. 17; SEC ID NO. 18; SEC ID NO. 19; SEC ID NO. 20; SEC ID NO. 26; y SEC ID NO. 27.
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