MXPA00008260A - Proteinas que interactuan con caspasa-8 - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a proteínas que interactúan con caspasa-8;además se provee la producción y el uso de dichas proteínas.

Description

PROTEÍNAS QUE INTERACTUAN CON CASPASA-8 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se ubica generalmente en el campo de las proteasas de cisteína. Muy específicamente, la invención se refiere a proteínas que interactúan con caspasa-8 (MACH) y/o modulan su función en las trayectorias de muerte celular (o trayectorias apoptóticas) mediadas por CD95 (Fas/Apo-1) o por CD120a (receptor p55 de NFT). En particular, la presente invención se refiere a proteínas que interactúan con caspasa-8/MACH directa o indirectamente. La invención también se refiere a la preparación y uso de las proteínas que interactúan con caspasa-8/MACH.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El Factor de Necrosis de Tumor (FNT-alfa) y Linfotoxina (FNT-beta) (en lo sucesivo, NFT, se refiere tanto a NFT-alfa como a NFT-beta) son citocinas pro-inflamatorias multifuncionales formadas principalmente por fagocitos mononucleares, que tienen muchos efectos en las células (Wallach, D. (1986)) En: Interferon 7 (Interferón 7) (Ion Gresser, ed.), pp. 83-122, Academic Press, London; y Beutler y Cerami (1987). Ambos, NFT-alfa y NFT-beta inician sus efectos al unirse a receptores específicos de la célula.

Algunos efectos son propensos a ser benéficos para el organismo: por ejemplo, pueden destruir células tumorosas o células infectadas por virus y aumentar las actividades antibacterianas de los granulocitos. En esta forma, NFT contribuye a la defensa del organismo contra tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación por lesiones. Por lo tanto, el NFT se puede utilizar como un agente antitumoral en cuya aplicación se une a sus receptores en la superficie de las células tumorosas y de esa forma inicia los eventos que conducen a la muerte de las células tumorosas. El NFT también se puede utilizar como un agente antiinfeccioso. Sin embargo, tanto NFT-alfa como NFT-beta tienen también efectos perjudiciales. Existen evidencias de que la sobreproducción de NFT-alfa puede desempeñar un papel patogénico principal en diversas enfermedades. Por ejemplo, los efectos del NFT-alfa, principalmente en el sistema vascular, son conocidos como la principal causa de síntomas de choque séptico (Tracey et al., 1986). En algunas enfermedades, el NFT puede causar una excesiva pérdida de peso (caquexia) al suprimir las actividades de los adipositos y causando anorexia, y por eso el NFT-alfa fue entonces llamado caquectina. También fue descrito como mediador del daño a los tejidos en enfermedades reumáticas (Beutler y Cerami, 1987) y como mediador principal del daño observado en reacciones injerto-contrahospedero. (Piquet et al., 1987). Además, se conoce que el NFT está involucrado en el proceso de inflamación y muchas otras enfermedades.

Dos receptores, distintos, independientemente expresados, el p55 (CD120a) y el p75 (CD120b) de NFT-R que se unen específicamente a ambos, al NFT-alfa y al NFT-beta, inician y/o median los efectos biológicos arriba mencionados del NFT. Estos dos receptores tienen dominios intracelulares estructuralmente disimilares sugiriendo que señalan de forma diferente (Véase Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Leoetscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990; y Holler et al., 1990). Sin embargo, los mecanismos celulares, por ejemplo, las diversas proteínas y posiblemente otros factores, que están involucrados en la señalización intracelular del CD120a y CD120b todavía tienen que ser esclarecidos. Es la señalización ¡ntracelular, que ocurre generalmente después de la unión del ligando, es decir, NFT (alfa o beta) al receptor, la que es responsable del comienzo de la cascada de reacciones que finalmente resulta en la respuesta observada de la célula al NFT. Por lo que respecta al efecto citocida de NFT anteriormente mencionado, en la mayoría de las células que se han estudiado hasta ahora, este efecto es impulsado principalmente por CD120a. Los anticuerpos contra el dominio extracelular (dominio de unión de ligando) de CD120a pueden por sí mismos impulsar el efecto citocida (véase EP 412486) que se correlaciona con la efectividad del entrecruzamiento del receptor por los anticuerpos, lo que se considera como el primer paso en la generación del proceso de señalización intracelular. Más aún, los estudios de mutaciones (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) han demostrado que la función biológica de CD120a depende de la integridad de su dominio intracelular, y por consiguiente, se ha sugerido que el inicio de la señalización intracelular que conduce al efecto citocida de NFT ocurre como consecuencia de la asociación de dos o más dominios ¡ntracelulares de CD120a. Adicionalmente, el NFT (alfa y beta) ocurre como un homotrímero, y como tal, se ha sugerido que induce la señalización intracelular vía CD120a por medio de su habilidad para unirse a y entrelazar las moléculas del receptor, es decir, provoca la adhesión del receptor. Otro elemento de la superfamilia NFT/NGF de receptores es el receptor FAS/AP01 (CD95), que también ha sido llamado como el antígeno FAS, una proteína de superficie celular expresada en varios tejidos y compartiendo homología con un número de receptores de superficie celular incluyendo NFT-R y NGF-R. CD95 media la muerte celular en forma de apoptosis (Itoh et al., 1991), y parece que es útil como selector negativo de células T auto reactivas, es decir, durante la maduración de las células T, CD95 media la muerte apoptótica de las células T reconociendo auto-antígenos. También se ha descubierto que las mutaciones en el gen CD95 (Ipr) causan un trastorno de linfoproliferación en ratones que se asemeja a la enfermedad auto inmune en humano de eritematosis de lupus sistémico (SLE por sus siglas en Inglés) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). El ligando para CD95 parece ser una molécula asociada de superficie celular, transportada por, entre otras, células T asesinas ( o linfocitos-CTL T citotóxicos) y por ende, cuando dichos CTL hacen contacto con células que portan CD95, son capaces de inducir la muerte celular apoptótica de las células que transportan CD95. Además, se ha preparado un anticuerpo monoclonal que es específico para CD95, este cuerpo monoclonal tiene la capacidad de inducir la muerte celular apoptótica en células que transportan CD95 incluyendo células de ratón transformadas por ADN que codifica CD95 humano (Itoh et al., 1991 ). Aunque algunos de los efectos citotóxicos de los linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos con el receptor CD95 que se presenta ampliamente, mismo que tiene la habilidad de impulsar la muerte celular, también se ha descubierto que otras diversas células normales, además de los linfocitos T, expresan CD95 en su superficie y pueden ser aniquiladas por la capacidad de impulso de este receptor. Se presume que la inducción sin control de dicho proceso de aniquilación contribuye al daño en los tejidos en ciertas enfermedades, por ejemplo, la destrucción de células hepáticas en hepatitis aguda. Por consiguiente, el encontrar formas que restrinjan la actividad citotóxica de CD95 puede tener un gran potencial terapéutico. Por el contrario, como además se ha descubierto que ciertas células malignas y células infectadas por VIH transportan CD95 en su superficie, se pueden utilizar anticuerpos contra CD95, o bien, el ligando CD95, para impulsar los efectos citotóxicos mediados por CD95 en esas células y por lo tanto proporcionar el medio para combatir dichas células malignas o células infectadas por VIH (véase Itoh et al., 1991). El hecho de encontrar todavía otras formas para mejorar la actividad citotóxica de CD95 puede, por lo tanto, tener también un gran potencial terapéutico. Ha sido una amplia necesidad el proveer una forma de modular la respuesta celular a NFT (alfa o beta) y al ligando CD95. Por ejemplo, en las situaciones patológicas que se mencionaron anteriormente, donde el NFT o Ligando CD95 está sobreexpresado, es deseable inhibir los efectos citocidas inducidos por NFT o por el ligando CD95, mientras que en otros casos, por ejemplo, en aplicaciones de curación de heridas, es deseable mejorar el efecto del NFT, o en el caso del CD95, en células tumorosas o células infectadas por VIH, es deseable mejorar el efecto mediado por CD95. Se han presentado numerosas propuestas, por parte de los solicitantes (véase, por ejemplo, las Solicitudes de Patente Europea Nos. EP 186833, EP 308378, EP 398327, y EP 412486) para regular los efectos perjudiciales de NFT inhibiendo la unión de NFT a sus receptores utilizando anticuerpos anti-NFT o usando receptores NFT solubles (que son esencialmente los dominios extracelulares de los receptores) para competir con la unión de NFT a los NFT-R unidos a la superficie celular. Además, sobre la base en que se requiere la unión de NFT a sus receptores para los efectos celulares inducidos por NFT, se han presentado propuestas por parte de los solicitantes (véase, por ejemplo, EP 568,925) para modular el efecto de NFT modulando la actividad de los NFT-R. Por ejemplo, la EP 568925 se refiere a un método para modular la transducción de señal moduladora y/o corte en los NFT-R en donde los péptidos u otras moléculas pueden interactuar ya sea con el receptor en sí o con proteínas efectoras interactuando con el receptor, modulando de ese modo la función normal de los NFT-R. En EP 568925, se describe la construcción y caracterización de varias formas mutantes de CD120a, teniendo mutaciones en su transmembarana extracelular, y dominios intracelulares. De esta forma, se identificaron regiones con los dominios anteriores de CD120a por ser esenciales para el funcionamiento del receptor, es decir, la unión del ligando (NFT) y la transducción de señal subsiguiente y señalización ¡ntracelular que finalmente resulta en el efecto de NFT observado en las células. Además, también se describe un número de enfoques para aislar e identificar proteínas, péptidos u otros factores que son capaces de unirse a las diversas regiones en los dominios anteriores de CD120a, cuyas proteínas, péptidos y otros factores se pueden involucrar en la regulación o modulación de la actividad de NFT-R. En el documento EPO 368925, se describen un número de propuestas para aislar y clonar las secuencias de ADN que codifican para dichas proteínas y péptidos, para construir vectores de expresión para la producción de esas proteínas y péptidos; y para la preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos, que interactúan con CD120a o con las proteínas y péptidos anteriores que unen varias regiones de CD120a. Sin embargo, EP 568925 no especifica las proteínas y péptidos reales que se unen a los dominios ¡ntracelulares de los NFT-R (por ejemplo, CD95), ni describe el enfoque de dos híbridos de levadura para aislar e identificar dichas proteínas o péptidos que se unen a los dominios intracelulares de NFT-R. En forma similar, el EP 568925 no existe descripción de proteínas o péptidos capaces de unir el dominio intracelular de CD95. Por lo tanto, cuando se desea inhibir el efecto de NFT, o del ligando CD95, sería deseable reducir la cantidad o la actividad de NFT-R o de CD95 en la superficie celular, aunque se desearía un incremento en la actividad de NFT-R o CD95 cuando se busque un efecto de ligando NFT o CD95 incrementado. Para este fin, los promotores de ambos CD120a y de CD120b se han secuenciado, analizado, y se han encontrado un número de motivos de secuencia clave que son específicos para varios factores de regulación de la transcripción, y como tal se puede controlar la expresión de estos NFT-R a su nivel promotor, es decir, inhibición de transcripción desde los promotores para la reducción en el número de receptores, y un incremento de transcripción desde los promotores para un incremento en el número de los receptores (EP 606869 y WO 9531206). Aunque se conoce que los receptores del factor de necrosis de tumor (NFT), y el receptor CD95 estructuralmente relacionado, impulsan en células, a la estimulación por ligandos producidos por leucocitos, las actividades destructivas que conducen a su propio fallecimiento, y los mecanismos de este impulso, todavía son muy poco conocidos. Los estudios de mutaciones indican que en la señalización de CD95 y CD120a para citotoxicidad involucran distintas regiones dentro de sus dominios ¡ntracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., Itoh y Nagata, 1993). Estas regiones "los dominios de muerte", tienen una similitud de secuencias.

Los "dominios de muerte" de ambos CD95 y CD120a tienden a auto asociarse. Su auto asociación aparentemente promueve la adhesión de receptores que es necesaria para el inicio de la señalización (véase Song et al., 1994; Wallach et al., 1994; Boldin et al., 1995), y a niveles altos de expresión de receptores que pueden dar como resultado el impulso de la señalización independiente del ligando (Boldin et al., 1995). Algunos de los efectos citotóxicos de linfocitos están mediados por la interacción de un ligando producido por linfocitos con CD95, un receptor de superficie celular que se presenta ampliamente, mismo que tiene la habilidad de acelerar la muerte celular (véase además Nagata y Goldstein, 1995); y que la aniquilación de la célula mediante fagocitos mononucleares involucra una pareja de ligando-receptor, en NFT y su receptor CD120a que está estructuralmente relacionado a CD95 y a su ligando (véase además Vandenabeele et al., 1995). Como otros efectos inducidos por receptor, la inducción de muerte celular por los receptores NFT y CD95 ocurre mediante una serie de interacciones proteína-proteína, conduciendo desde la unión ligando-receptor a la activación eventual de las funciones efectoras enzimáticas, que en los estudios de caso cuenta con interacciones proteína-proteína no enzimática elucidada que inician la señalización para la muerte celular: la unión de moléculas de ligando triméricas de NFT o de CD95 a los receptores, las interacciones resultantes de sus dominios intracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh y Nagata, 1993) incrementadas por la capacidad de los motivos muerte-dominio para auto asociarse (Boldin et al., 1995 a), y la unión inducida de dos proteínas citoplásmicas (que también se pueden unir entre sí a los dominios intracelulares de receptores-MORT-1 (o FADD ) a CD95 (Bolding et al., Chinnaiyan et al., 1995; Kischkel et al., 1995) y TRADD a CD120a (Hsu et al., 1995; Hsu et al., 1996). Se identificaron tres proteínas que se unen al dominio intracelular de CD95 y CD120a en la región de "dominio de muerte" involucrada en la inducción de muerte celular por los receptores a través de la heteroasociación de regiones homologas y que independientemente también tiene la capacidad de acelerar la muerte celular mediante el procedimiento de selección de dos híbridos de levadura. Una de estas, es la proteína MORT-1 (Boldin et al., 1995b), también conocida como FADD (Chinnaiyan et al., 1995) que se une específicamente a CD95. La segunda proteína, TRADD (véase también Hsu et al., 1995, 1996) que se une a Cd120a, y la tercera, RIP (véase también Stanger et al., 1995), que se une a ambos CD95 y CD120a. Además de su unión a CD95 y CD120a, estas proteínas también tienen la capacidad de unirse entre sí, lo que origina una "interferencia cruzada" funcional entre CD95 y CD120a. Estas uniones ocurren a través de un motivo de secuencia conservado, el "módulo de dominio de muerte" común para los receptores y sus proteínas asociadas. Más aun, aunque en la prueba de dos híbridos de levadura, MORT-1 mostró que se unía espontáneamente a CD95, en células de mamíferos, y esta unión se lleva a cabo solamente después de la estimulación del receptor sugiriendo que MORT-1 participa en los eventos de iniciación de la señalización de CD95. MORT-1 no contiene ninguna característica de motivo de secuencia de actividad enzimática, y por lo tanto, su habilidad para acelerar la muerte celular parece que no involucra la actividad intrínseca de MORT-1 en sí, pero en su lugar, la activación de algunas otras proteínas que se unen a MORT-1 y actúan además corriente abajo en la cascada de señalización. Se ha demostrado que la expresión celular de mutantes de MORT-1 que carecen de la parte N-terminal de la molécula bloquea la inducción de citotoxicidad de CD95 o CD120a (Hsu et al., 1996; Chinnaiyan et al., 1996), indicando que esta región N-terminal transmite la señalización para el efecto citocida de ambos receptores a través de interacciones proteína-proteína. Estudios recientes han implicado un grupo de proteasas tiol citoplásmicas que están estructuralmente relacionadas a la proteasa CED3, Caenorhabdittis elegans y a la enzima de mamífero (ICE) de conversión de interleucina-1 beta en el comienzo de varios procesos de muerte celular fisiológicos (revisado en Kumar et al., 1995 y Henkart, 1996). También han existido algunas indicaciones de que la(s) proteasa(s) de esta familia pueden actuar en la citotoxicidad de células inducidas por CD95 y NFT-R. Se descubrió que los inhibidores de péptidos específicos de las proteasas y dos proteínas codificadas por virus que bloquean su función, la proteína crmA de vacuna y la proteína p35 de Baculovirus, proveen protección a las células contra esta citotoxicidad-célula (Enari et al., 1995; Los et al., 1995; Tewari et al., 1995; Xue et al., 1995; Beidler et al., 1995). Se pudo demostrar el corte rápido de ciertas proteínas celulares, aparentemente mediadas por proteasa(s) de la familia CED3/ICE, en células poco tiempo después de la estimulación de Cd95 o NFT-R. Una de tales proteasas y varias isoformas de las mismas (incluyendo las inhibitorias, se conocen como MACH (ahora caspasa-8) que es una proteína de unión MORT-1 y que sirve para modular la actividad de MORT-1 , y por lo tanto, de CD95 y CD120a, y que también puede actuar independientemente de MORT-1 , ha sido recientemente aislada, clonada, caracterizada, y se describen además sus posibles usos, como se establece en detalle y se incorpora en la presente en su totalidad a modo de referencia, en las solicitudes de patente de Israel copendientes y de propiedad conjunta Nos. IL 114615, 114986, 115319, 116588 y 117932, así como su contraparte PCT No. PCT/US96/10521 , y en una publicación reciente de los presentes inventores (Boldin et al., 1996). Otra proteasa y varias isoformas de la misma (incluyendo las inhibitorias) designada como Mch4 (también llamada caspasa-10) ha sido recientemente aislada y caracterizada por los presentes inventores (no publicada) y otros (Femandes-Alnemeri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996). La caspasa-10 también es una proteína de unión MORT-1 que sirve para modular la actividad de MORT-1 y por lo tanto similar también a la de CD95 y CD120a y que también puede actuar independientemente de MORT-1. Por lo tanto los detalles concernientes a todos los aspectos, detalles, características y usos de caspasa-10 se establecen en las publicaciones anotadas anteriormente, que todas ellas se incorporan en la presente en su totalidad por referencia.

Se debe anotar además, que las caspasas, caspasa-8 y caspasa-10, que tienen prodominios similares, (véase Boldin et al., 1996; Muzio et al., 1996; Femandes-Alnemri et al., 1996; Vincent y Dixit, 1997) interactúan a través de sus prodominios con MORT-1 , esta interacción se presenta mediante "motivo de dominio de muerte" o "dominio efector de muerte" DED, presente en la parte N-terminal de MORT-1 y presente por duplicado en caspasa-8 y caspasa-10 (véase Boldin et al., 1995b; Chinnaiyan et al., 1995). Dichas proteasas, ahora conocidas como caspasas, (proteinasas especificas-cisteína aspartato) son una familia de cultivo de cisteína proteasas que comparten varias características comunes. Se ha descubierto que la mayoría de las caspasas participan en el inicio y ejecución de muerte o apoptosis celular programada, mientras que las otras parecen estar involucradas en la producción de citocinas pro inflamatorias (Nicholson DW et al., 1997, Salvesen GS et al. 1997, Cohén GM 1997). Estas son sintetizadas como precursores catalíticamente activos y están activadas generalmente por corte después de residuos de aspartato internos específicos presentes en enlazadores de interdominio. Los sitios de corte de las caspasas están definidos por secuencias de tetrapéptidos (X-X-X-D) y el corte siempre ocurre corriente abajo del ácido aspártico. Como resultado, ciertas caspasas activas maduras pueden procesar y activar sus propios precursores, así como otros precursores inactivos (Femandes-Alnemeri et al., 1996; Srinivasula et al., 1996).

La activación del proceso de muerte celular programada es generalmente especifico e involucra el procesamiento secuencial de caspasas corriente abajo denominadas caspasas de "ejecución" mediante caspasas corriente arriba denominadas caspasas "iniciadoras". Las características funcionales de las dos clases de caspasas también se reflejan por su estructura. De hecho, las "caspasas iniciadoras" contienen regiones de prodominio más largas comparadas con las caspasas "ejecutadoras" (Salvensen GS et al., 1997, Cohén GM 1997). El largo prodominio permite que las caspasas iniciadoras o "apicales" sean activadas mediante el accionamiento de los receptores de muerte de la familia de receptores NFT. Con la trimerización inducida por ligando de los receptores de muerte, las caspasas iniciadoras son renovadas a través de su largo prodominio N-terminal con moléculas adaptadores especificas para formar la muerte induciendo el complejo de señalización (Cohén GM 1997, Kischkel FC et al., 1995). Por ejemplo, la caspasa-8/MACH y probablemente la caspasa-10 que contiene dos Dominios Efectores de Muerte (DED) o dominios FADD, son renovados al complejo receptor por las moléculas adaptadoras FADD/MORT1 , mientras que la caspasa-2 es renovada por CRADD/RAIDD y RIP (Nagata S et al., 1997, MacFarlane N et al., 1997, Ahmad M et al., 1997, Duan H et al., 1997). Debido a la naturaleza trimérica del complejo receptor activado se piensa al menos que dos moléculas de caspasa son transportadas en proximidad cercana a las demás, conduciendo así a su activación mediante procesamiento auto catalítico (Yang et al., 1998, Muzio et al., 1998).

Las caspasas son sintetizadas como proenzimas que consisten de tres subunidades principales, el prodominio N-terminal, y dos subunidades, que algunas veces están separadas por un péptido enlazador. Las dos subunidades han sido denominadas "largas" o la subunidad 1 que contiene el sitio enzimático activo, y "cortas" o subunidad 2. Para la activación total de la enzima, el prodominio y los dos subdominios son cortados. Las dos subunidades cortadas forman un heterodímero, en donde el dominio largo se deriva de la N-terminal, y la subunidad corta es derivada de la región C-terminal del precursor de caspasa. En base a la estructura tridimensional derivada de caspasa-3, parece que el extremo C-terminal del dominio largo, así como la N-terminal del subdominio corto han sido liberados y la C-terminal de la subunidad corta ha sido transportada en proximidad cercana con la N-terminal de las subunidad larga para rendir una enzima activa y correctamente doblada (Rotonda et al 1996, Mittl et al. 1997, Srinivasula et al. 1998) N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa es una enzima intracelular conocida por estar involucrada en el metabolismo intracelular de glucosamina. Un fragmento de ADN genómico que contiene N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa fue clonado de la bacteria productora de chitinasa y Vibrio cholerae (Yamano et al., Biosci Biotechnol Biochem. 61 , p. 1349-53, 1997). El gen nagA que codifica N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa de E. coli también es conocido (véase, por ejemplo, Peri et al., enero 1990, 68(1), pp 123-137). La N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa humana a la fecha, no ha sido identificada como clonada y secuenciada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención provee una proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de la misma, que tiene la capacidad de interactuar con la subunidad 1 y/o subunidad 2 de caspasa-8. La invención además provee N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa humana, o ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de la misma. Más aun, la invención provee una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la figura 2, 3, 5B ó 6. La invención además provee una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína Tip-60 excluyendo los aminoácidos 94 a 145. Además, dentro del alcance de la invención se incluye una proteína que comprende la secuencia de aminoácidos codificada por los clones P27, P70, P79, L7, L12, M26, B4, B17, J40, B13, B37, B33, o P74, y sus variantes de empalme P16 y P43, como se describe en la presente a continuación. La invención también provee una proteína como se definió anteriormente, que es cortada in vitro o in vivo por caspasa-8.

La invención también provee una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína de la invención. Dentro de ese alcance se incluye una secuencia de ADN de la figura 2 y figura 3. También se incluye dentro del alcance de la invención un ADN aislado que tiene la capacidad de de hibridar dicha secuencia de ADN bajo condiciones moderadas moderadas. La invención también provee un vector que comprende una secuencia de ADN como se definió anteriormente. La invención además provee una célula hospedero eucarióntica o procarióntica que contiene un vector de la invención. La invención además provee un método para producir una proteína, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de una proteína que interactúa con caspasa-8 de la invención, que comprende el cultivar una célula hospedero de la invención bajo condiciones que permiten la producción de dicha proteína, que afectan las modificaciones de la post-traducción conforme sea necesario para obtener dicha proteína, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, o mutante, o derivado, y aislar dicha proteína, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, o mutante, o derivado. La invención además provee dicho método en donde la célula es una célula procarióntica. La invención además provee dicho método en donde la célula es una célula eucarióntica.

La invención también provee dicho método en donde la célula es una célula de mamífero, insecto, o levadura. La invención además provee dicho método en donde la célula es una célula HeLa or 293 T HEK. La invención además provee dicho método en donde, como un promotor, se emplea el promotor CMV humano. Más aun, la invención provee un péptido que interactúa con caspasa-8 que comprende al menos 4 aminoácidos consecutivos de una proteína de la invención. Además, dentro del alcance de la invención, se abarca un derivado de dicho péptido. Más aun, se abarca dentro del alcance de la invención dicho derivado péptido, que tiene la capacidad de formar un enlace covalente con caspasa-8 al contacto de dicha caspasa-8. La invención también provee un ribosoma específico para una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de ADN de la invención. La invención además provee un oligonucleótido antisentido que comprende al menos 9 nucleótidos de una secuencia que corresponde a una secuencia de ADN de la invención. La invención además provee un anticuerpo dirigido a un epítope de una proteína de la invención.

La invención además provee un inmunoensayo para la detección de una proteína que interactúa con caspasa-8, que comprende el anticuerpo de la invención. La invención además provee un inmunoensayo para la detección de caspasa-8, que comprende un péptido de la invención. La invención además provee un ¡nmunoensayo para la detección de caspasa-8 que comprende una proteína de la invención. La invención además provee un método para identificar proteínas que interactúan con caspasa-8, que comprende los pasos de: a)proveer una célula de levadura que tiene un gen reportero enlazado a un promotor que comprende un motivo de secuencia de ADN; a) expresar en dicha célula de levadura una subunidad p20 de dicha caspasa-8; b) expresar en dicha célula de levadura una proteína de fusión de un dominio de unión a ADN y el p10 y/o subunidad p20 de dicha caspasa-8 en donde dicho dominio de unión a ADN que tiene la capacidad de unirse a dicho motivo de secuencia de ADN; c) opcionalmente, expresar en dicha célula de levadura una subunidad p10 o p20 no fusionada de dicha caspasa-8; d) transformar un cultivo de dicha célula de levadura con una genoteca que consiste de un vector de expresión, impulsar la expresión de una proteína de fusión que consiste de una genoteca de ADNc y un activador de la transcripción; e) seleccionar el cultivo de células de levadura transformadas para células de levadura en donde el gen reportero es activado, y f) aislar una célula de levadura del paso e) y además aislar la proteína que interactúa con caspasa-8, que es expresada en su vector presa. La invención además provee dicha proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, dicho ribosoma, oligonucleótido antisentido o anticuerpo, para su uso en la modulación de la actividad de caspasa-8. La invención además provee dicha proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, dicho ribosoma, oligonucleótido antisentido o anticuerpo, para su uso en la modulación del receptor de FNT o de los efectos mediados por Fas. Más aun, la invención provee dicha proteína que interactúa con caspasa-8, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, dicho ribosoma, oligonucleótido antisentido o anticuerpo, para su uso en la modulación de apoptosis. La invención también provee dicha proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, dicho ribosoma, anticuerpo u oligonucleótido antisentido, para su uso como un medicamento. La invención además provee dicha proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, dicho ribosoma, anticuerpo u oligonucleótido antisentido, para su uso como un medicamento en el tratamiento de esclerosis múltiple con oligodendrogliopatía primaria, uveoretinitis autoinmune, diabetes, lupus, miocarditis autoinmune I, hepatitis crónica mediada por HCV, gastritis crónica, por ejemplo, gastritis de tipo A, enfermedad mixta del tejido conectivo, (MCTD por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn, o colitis ulcerativa. La invención también provee un oligonucleótido de formación triple que tiene la capacidad de unirse a una secuencia rica en purina en la región del promotor de un gen que ¡nteractúa con caspasa-8. El oligonucleótido de formación triple puede contener modificaciones químicas, tales como enlaces de fosfato intemucléosido modificado con el catión N,N-dietil-etilendiamina, Uridina, benzo[g]-quinazolin-2,4-dion-(1 H,3H)-diona o residuos de benzo[f]quinazolín-2,4-dion-(1 H,3H9-diona en lugar de residuos de Timidina. El oligonucleótido de formación triple puede además estar enlazado de forma covalente a sustancias químicas que tienen afinidad con el ADN, preferiblemente tales agentes como se pueden intercalar en el ADN, tal como acridina y psoraleno. El término "que interactúa" en el contexto de esta descripción, en relación con la interacción de una proteína de la invención con caspasa-8, significa que incluye formas directas de interacción, tales como unión, corte, e interacción indirecta, por ejemplo, a través de proteínas adaptadoras. La interacción puede resultar opcionalmente en la modulación de la señal mediada por caspasa-8.

El término"unión" en el contexto de esta aplicación, cuando se refiere a la unión de las proteínas de interacción con caspasa-8, significa relacionarse a la asociación física de la proteína que interactúa con caspasa-8, con caspasa-8. Se puede medir esta asociación física en inmunoensayos, tales como ELISA o RÍA, en la prueba de dos híbridos, en ensayos de inmunoprecipitación, o en ensayos basados en separación por tamaños, tal como electroforesis en gel de acrilamida no desnaturante o cromatografía en gel de exclusión por tamaños de una mezcla de caspasa-8, o una subunidad de la misma, y una proteína de la invención. Cuando se utiliza la prueba de dos híbridos, se entiende que la caspasa-8 o subunidad de la misma es expresada como una fusión de dominio de activación del ADN, y la proteína que interactúa con caspasa-8 es expresada como una fusión de dominio de unión al ADN, o viceversa. El término "prueba de dos híbridos" se refiere al ensayo de dos híbridos en donde se pueden medir las interacciones proteína-proteína introduciendo en células de levadura un primer vector de expresión que codifica para una fusión de una primer proteína y un dominio de unión al ADN, y un segundo vector de expresión que codifica para una fusión de una segunda proteína con un dominio de activación del ADN. Las células de levadura deben contener al menos un gen reportero impulsado por un promotor que contiene un motivo de secuencia de ADN que es reconocido por dicho dominio de unión al ADN. Generalmente, se utilizan dos genes repórteres, por ejemplo, Histidina sintetasa y beta-Galactosidasa. Esto permite al investigador evitar falsos-positivos que pueden resultar de la mutación. Esta técnica ha sido modificada y refinada por los presentes solicitantes para su uso en proteínas de selección, aislamiento y de prueba que median las señales FNT-R y Fas, véase, por ejemplo, WO 97/03998 y las referencias de dicho documento. La prueba de dos híbridos se basa en la localización de ambas proteínas de fusión al núcleo de la célula. El término "prueba de dos híbridos", como se utiliza en la presente, además comprende una modificación de la técnica de dos híbridos, en donde se utilizan proteínas de señalización de crecimiento de células, tales como ras y sos (Broder et al., Curr Biol 1998, 8, p.1121-4, Aronheim et al., Nucleic Acids Res 1997 25, p. 3373-4, y referencias del mismo). Para ser funcionales, estas proteínas requieren la relocalización a la membrana celular. Esto se logra expresando una proteína de señalización de crecimiento de células como una fusión con una primer proteína, y expresando una señal de localización de membrana celular, tal como una secuencia de señal de miristilación, como una fusión con una segunda proteína. La interacción entre la primer y segunda proteínas volverá a ubicar a la proteína de señalización de crecimiento de células a la membrana celular y por lo tanto impulsará el crecimiento de células. Entonces las células que están creciendo agresivamente son seleccionadas para un estudio adicional. Este sistema es diferente del sistema de dos híbridos anteriormente descrito, porque no se basa en la localización de ambos híbridos al núcleo de la célula.

El término "cebo" se refiere a la proteína en la prueba de dos híbridos anteriormente mencionada, que es expresada como una proteína de fusión con un dominio de unión a ADN. El término "presa" se refiere a la proteína en la prueba de dos híbridos anteriormente mencionada, que es expresada como una fusión con un dominio de activación de ADN.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la representación esquemática de la construcción de cadena sencilla de caspasa-8, utilizada como cebo en la selección de dos híbridos que se describe en el Ejemplo 1 B. La figura 2 es un nucleótido parcial preliminar (SEQ ID NO: 1 ) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 2) del clon 32 codificando una proteína que interactúa con caspasa-8 como se obtiene de un clon ADNc. La figura 3 muestra la secuencia de longitud total putativa del nucleótido de humano (SEQ ID NO: 3) y la secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO: 4) N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa compuesta por la extensión al extremo 5' del clon J2, el clon AA460869 de EST y el clon de trampa de exón L48741. La figura 4A muestra la actividad funcional del clon J2 expresado como el porcentaje de células apoptóticas, seguido de la transfección de células HEK-293T con el receptor de FNT p55 únicamente (marcado FNTR p55) o con el receptor de FNT p55 junto con p35, un inhibidor de baculovirus de caspasas (p55+35) o con el clon J2 (p55+J2), o con el receptor de FNT p55 junto con el mutante no digerible de J2 (denominado J*) que contiene una sustitución de Asp a Glu en la posición 346 de la figura 3 (p55+J2*). Este mutante no puede ser cortado ni in vitro ni in vivo. La figura 4B muestra el porcentaje de células HeLa apoptóticas solamente, o seguido de la transfección con p35 o J2 o J2* tratado con FNT y cicloheximida. La figura 5A muestra 1725 pares de base codificantes hacia el extremo 5' del clon P74 (SEQ ID NO:5). La figura 5B muestra la secuencia de aminoácidos 574 derivada de la secuencia del clon P74.de la figura 5A ( SEQ ID NO: 6). La figura 6 muestra los aminoácidos 1428 (SEQ ID NO: 7) de un marco de lectura abierto derivado de una secuencia de aminoácidos derivada del clon PAC, con número de acceso RPCI5-1057I20. La figura 7 muestra la alineación de los 574aminoácidos del marco de lectura abierto de la secuencia de aminoácidos derivada del clon p74 (clon denotado) comparada con los aminoácidos 1428 del marco de lectura abierto derivado de la secuencia de aminoácidos derivada del clon PAC - RPC115-1057I20 (derivado denotado). La figura 8 muestra la alineación del marco de lectura abierto de la secuencia de aminoácidos del clon PAC RPC115-1057120 (secuencia superior) (SEQ ID NO: 8) con la secuencia de histona desacetilasa A (secuencia inferior, número de acceso de Genebank NP-006028.1) (SEQ ID NO: 9). La figura 9A muestra una autoradiografía de la proteína Bid y las proteínas codificadas por los clones de ADNc: J2, o P16, o P43, o P70, o P74, o P79, producidas en un lisado de reticulocitos en presencia de 35S Metionina, separadas en un gel SDS PAGE. La figura 9B muestra una autoradiografía de la proteína Bid y las proteínas codificadas por los clones de ADNc: J2, o P16, o P43, o P70, o P74, o P79, producidas como en la figura 9A, analizadas para unirse a caspasa-8 expresada en bacterias como una proteína de fusión de sus dos suburadades, 8 fusionadas a GST. La posición de los marcadores de peso molecular se muestra a la izquierda del gel. La figura 10 muestra los resultados del corte de la proteína codificada por el clon parcial P43 de ADNc por Caspasa-8 o por Caspasa-10, o por Caspasa-3 o por Caspasa-9 o por mutantes de Caspasa-3 o de Caspasa-9 o de Caspasa-10. Los volúmenes del lisado bacteriano de las caspasas recombinantes expresadas en E. Coli que se utilizaron, se indican en unidades relativas (RU). La posición de los marcadores de peso molecular se muestra a la izquierda del gel. Las proteínas de interés están marcadas con un asterisco: las flechas de punta completa muestran la proteína P43 de tamaño completo y las flechas de punta abierta muestran los productos de corte.

La figura 11 muestra la actividad funcional de las proteínas codificadas por clones ADNc identificadas por selección de dos híbridos expresadas como el porcentaje de células que sufren apoptosis, seguido de la co-transfección de células HEK-293T con el receptor de FNT p55 y con la Proteína de Fluorescencia Verde (denotada PC) sin o con los injertos de ADNc de los clones J2 ó P16, o P27, P43 o P79 o P74 o P70. La figura 12 muestra la actividad inhibitoria de la muerte de células de tipo silvestre y del mutante no cortable de Tip60 en células HEK-293T cotransfectadas con el receptor de FNT p55 y con la Proteína de Fluorescencia Verde, así como el efecto de ? 32-T¡p60 que carece de los primeros 32 aminoácidos N-terminales. Las células de control fueron transfectadas con el vector pCGN solamente.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN No se detallan en la presente una cantidad de métodos de las técnicas de biología molecular, ya que son muy conocidos para los expertos en dichas técnicas. Dichos métodos incluyen mutagénesis dirigida en sitio, clonación por PCR, selección de genotecas de fagos utilizando sondas de ADNc u oligonucleótidos, expresión de ADNc, análisis de proteínas recombinantes, transformación de células bacterianas y de levadura, transfección de células de mamíferos y similares. Los libros de texto que describen dichos métodos son por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, (Manual de Laboratorio sobre Clonación Molecular) Cold Spring Harbor Laboratory; ISBN: 0879693096, 1989, Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Actuales en Biología Molecular) por F. M. Ausubel, ISBN: 047150338X, 1988, y Short Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Breves en Biología Molecular) por F. M. Ausubel et al., (ediciones) 3a. Edición, John Wiley & Sons; ISBN 0471137812, 1995. Esas publicaciones se incorporan en la presente en su totalidad, por referencia. Para identificar proteínas que actúan con caspasa-8 y sustratos potenciales, mediante el método de selección de dos híbridos, se puede utilizar el sistema de dos híbridos o tres híbridos. El sistema de dos híbridos se utiliza en el método de la invención como se describió en Fields y Song (Nature 340, p.245, 1989).

Preferiblemente los vectores individuales, las cepas de levadura, y genotecas se pueden obtener de Clontech (Palo Alto, E.U.A.), como componentes del sistema de dos híbridos de apareamiento "Matchmaker" (#PT 1265-1 ). La modalidad preferida del sistema de dos híbridos de levadura como se utiliza en el método de la invención ha sido descrita por Boldin et al., Cell, 85, p.803-15, 1996. El sistema de dos híbridos de levadura ha sido descrito además en la patente EU 5,580,736, Brent et al. Estas publicaciones, por lo tanto, se incorporan en la presente en su totalidad por referencia. El sistema de tres híbridos se utiliza esencialmente como lo describe Tirode et al, J. Biol. Chem. 272, p.22995-9, 1997. Para detectar proteínas que ¡nteractúan con caspasa-8 de acuerdo con la invención, se requiere que las dos subunidades de caspasa-8 sean expresadas independientemente. Para ese propósito las dos unidades de caspasa-8 son preferiblemente expresadas en forma separada bajo el control de diferentes promotores. En una modalidad preferida, la subunidad p10 de caspasa-8 (Serina 375 a ácido aspártico 479) se expresa bajo el control de un promotor débil operable en temperatura dentro del marco con un dominio de unión a ADN. Preferiblemente, el promotor débil es el promotor ADH de levadura y la proteína de unión a ADN es el dominio de unión a ADN del activador Gal4 de transcripción de levadura o de la proteína LexA bacteriana. El promotor ADH y el dominio de unión a ADN Gal4 están presentes, por ejemplo, en el pGBD comercialmente disponible por Clontech, Palo Alto, E.U.A. Sin embargo, será aparente para una persona experta en la técnica, que se pueden utilizar otros promotores siempre y cuando el promotor sea efectivo en células de levadura. Bajo la misma prueba, se pueden utilizar dominios de unión a ADN, siempre y cuando estos dominios de unión a ADN no tengan la función activadora de la transcripción. La subunidad p20 de caspasa-8 larga, activa (Serina 217 a ácido aspártico 374) es expresada como proteína no fusionada bajo el control de un promotor no inducible, operable en células de levadura. Preferiblemente, el promotor reprimible de metionina Met25 como se describió en Tirode et al., anterior, se puede utilizar. El uso de un promotor inducible simplifica la detección del complejo p10-p20 mediante inmunoprecipitación y electroforesis de gel de poliacrilamida. El promotor inducible tiene ventajas adicionales ya que permite la expresión en levadura de proteína que puede ser tóxica para las células de levadura debido a la posibilidad para delimitar el período en donde la proteína potencialmente tóxica es expresada. Las proteínas que se van a seleccionar con el método de la invención están provistas preferiblemente en la forma de una genoteca ADNc. Sin embargo, también se pueden utilizar genotecas genómicas o genotecas de combinación. La genoteca es clonada en el extremo C-terminal de un dominio de activación de la transcripción operable en levadura. Preferiblemente, se utiliza el dominio de activación de la transcripción de la proteína Gal-4 de levadura, sin embargo, se puede utilizar un gran número de otros activadores de la transcripción. Preferiblemente, el vector pGAD GH disponible de Clontech se utiliza para la clonación de la genoteca. La cepa de levadura utilizada para la selección debe contener un marcador de selección tal como histidina sintetasa bajo el control de un promotor que comprende una secuencia de ADN a la cual el dominio de unión a ADN anteriormente mencionado se une específicamente. Preferiblemente, la célula de levadura también contiene un gen reportero bajo el control de un promotor que comprende una secuencia de ADN a la cual el dominio de unión a ADN anteriormente mencionado se une específicamente. La cepa de levadura HF7c, disponible de Clontech se puede utilizar para la selección con híbridos de dominio de unión a Gal-4; se puede utilizar la cepa L40 cuando lexA es el dominio de unión a ADN.

Después de la transformación, las células de levadura son colocadas en condiciones selectivas para ser depositadas en placas activas sobre medios que carecen de ciertos aminoácidos como se requiere para la estabilidad de los plásmidos introducidos en los mismos. El medio es selectivo para células de levadura en el cual en gen para el marcador de selección anteriormente mencionado es activado. Preferiblemente el marcador de selección es el gen de histidina sintetasa. Las células de levadura que expresan este gen pueden ser seleccionadas cultivando en un medio que carece de histidina. Una ventaja de este sistema, es ia posibilidad de añadir el inhibidor 3-aminotriazol de histidina sintetasa al medio de cultivo. Por lo tanto es posible, inhibir el cultivo de células de levadura en el cual una pequeña cantidad de histidina sintetasa es expresada, provocada por la fuga del promotor que contiene la secuencia a la cual el dominio de unión a ADN anteriormente mencionado se une específicamente. En algunos clones, una interacción no especifica, débil, entre la subunidad p10 de caspasa-8 y/o subunidadp20 y dicho clon pueden causar la activación falsa de dicho promotor. Por lo tanto, elevando la concentración de dicho inhibidor, en el medio utilizado para la selección de clones que interactúan, es posible seleccionar clones que ¡nteractúan con una cierta fuerza mínima. La concentración de 3-aminotriazol es preferiblemente 7.5 mM. Los clones identificados por su habilidad para cultivarse en un medio que carece de histidina son analizados además mediante cuantificación de su actividad genética reportera. Preferiblemente, se utiliza el gen lacZ como el gen reportero. La cuantificación de la actividad de lacZ se realiza preferiblemente en cultivo líquido como se describe en Boldin et al., J. Biol.. Chem. 270, 7795-8, 1995. El método de selección anteriormente mencionado se puede llevar a cabo utilizando la prueba de dos híbridos. La diferencia esencial es que las dos subunidades de la caspasa-8 están expresadas como una cadena sencilla de péptidos, que es una proteína de fusión con el dominio de unión a ADN anteriormente, mencionado. La subunidad p20 está mutada en su sitio activo (cisteína 360- Serina 360) como se describió anteriormente. Preferiblemente, la subunidad p10 está separada de la subunidad p20 mediante un enlazador, que es preferiblemente de entre 10 y 50 aminoácidos en longitud. Dicho enlazador comprende preferiblemente aminoácidos cortos no cargados tales como glicina, serina, treonina, alanina y valina. Muy preferiblemente el enlazador consiste de residuos de serina y glicina. Muy preferiblemente, la relación entre los residuos de glicina y serina en dicho enlazador es de 3:1 a 4:1. La obtención de clones utilizando el sistema de dos híbridos con el cebo caspasa-8 anteriormente descrito, es similar al uso que se describe arriba del sistema de tres híbridos, con la excepción del hecho que los clones que se unen a solamente una de las subunidades no se pueden distinguir fácilmente de aquellos que se unen a ambos o que requieren el complejo de ambas unidades para la unión. Sin embargo, cualquier clon encontrado en el método de dos híbridos puede ser probado fácilmente para la unión a dos subunidades mediante la evaluación de la unidad lacZ de transformantes dobles, células de levadura que son transformadas con el clon recientemente identificado y cualquiera de las subunidades p10 o p20 de caspasa-8, en donde dicha subunidad es fusionada al dominio de unión a ADN. Se puede también evaluar la unión al complejo de las subunidades p10 y p20 determinando la actividad de lacZ de transformantes triples en donde una de las subunidades de caspasa-8 es expresada como una proteína de fusión con el dominio de unión a ADN, y la otra como proteína no fusionada. Es evidente que el sistema de tres híbridos que se menciona arriba, es por lo tanto útil además para determinar las características de unión de clones encontradas con el sistema de dos híbridos, como el promotor inducible que ahí permite la rápida identificación de clones que interactúan con la subunidad p10 solamente, o con el complejo p10-p20 de subunidades. Los clones que tienen la capacidad de crecer en un medio que carece de histidina y que expresa la actividad lacZ son seleccionados entonces para su estudio adicional. Primero, las proteínas codificadas por los clones son sometidas a prueba para obtener su habilidad para unirse a proteínas no relevantes tales como Lamin. En general, se descartaron los clones que se unen a Lamin. Además, son analizados los clones que parece que ¡nteractúan específicamente con caspasa-8. Esto se realiza también con clones parciales como se obtienen directamente con los métodos de selección descritos anteriormente, así como con clones de longitud total que son obtenidos sobre la base de la secuencia de dichos clones parciales. Para obtener clones de longitud total, se obtiene la secuencia del clon parcial extrayendo el ADN de dicho clon de las células de levadura mediante los métodos conocidos por los expertos en la técnica. El ADN es entonces transformado en bacterias para obtener grandes cantidades de ADN purificado, que se puede utilizar para secuenciación. Como alternativa, el injerto en el vector, que es preferiblemente el vector pGBD, puede ser cortado utilizando enzimas de restricción y clonado en otro vector, tal como pBluescript disponible de Stratagene, para el propósito de secuenciación. La secuenciación se realiza mediante el método de terminación en cadena, preferiblemente utilizando la enzima Sequenase2 conforme está disponible en el equipo de secuenciación de United States Biochemicals. La secuencia así obtenida, puede entonces ser ingresada en un programa de búsqueda de datos y las secuencias traslapantes pueden ser identificadas mediante búsqueda por computadora. Los programas utilizados son muy conocidos para todos aquellos expertos en la técnica y comprenden por ejemplo, el paquete GCG (grupo de computadora genética). Preferiblemente, se utiliza una utilidad de búsqueda tal como Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) (Herramienta de Búsqueda de Alineación Local Básica). Disponible del servidor (EMBL por ejemplo http:// dove.embl-heidelberg.de/Blast2/). Se puede utilizar el comando Blastn para buscar secuencias de nucleótidos que se están traslapando o bien, que son similares al clon identificado.

La proteína identificada por el método de la invención está provista con un dominio de unión a ADN. Por lo tanto, es conocido el marco en el cual la secuencia de ácidos nucleicos debe ser traducida, como debe ser dentro del marco con la secuencia de codificación del dominio de unión a ADN. La secuencia de ADN del clon identificado por la invención, por lo tanto puede ser traducida de manera no ambigua dentro de una secuencia de aminoácidos. El programa Blastp disponible en el servidor EMBL que se identifica arriba se puede utilizar entonces para la identificación de secuencias de proteínas traslapantes o proteínas similares. Alternativamente o además de los métodos anteriormente mencionados de búsqueda de bases de datos, se puede seleccionar una genoteca, tal como una genoteca genómica o una genoteca cADN, que se puede seleccionar para identificar clones completos. Dichos métodos de selección se describen en Sambrook et al y Ausubel et al, que se describen anteriormente. Alternativamente, o además de, se pueden utilizar técnicas de clonación con base en PCR, tales como la amplificación de extremos de ADNc (RACE 5' y 3', Graham et al, Biochem Biphys Res Commun 177, p- 8-16, 1991 y referencias en la misma). Además, se investigan entonces los clones parciales identificados en el ensayo de selección de la invención o los clones de longitud total obtenidos mediante cualquiera de los métodos anteriores. Esto se realiza por ejemplo, sometiendo a prueba la sensibilidad de estos clones a la digestión proteolítica con caspasa-8 activa. Esta prueba se puede realizar in vivo. Para este fin, una línea celular de mamífero es transfectada con un vector de expresión que produce la proteína codificada por el clon que va a ser sometido a prueba, y un vector de expresión que codifica a una segunda proteína, cuya expresión inducirá la actividad de caspasa-8. Los vectores de expresión preferiblemente comprenden un promotor fuerte para la expresión del clon y de la segunda proteína tal como el virus de sarcoma de Rous (RSV, Yamamoto et al., Cell 22, p. 787-97, 1980), virus de sarcoma mieloproliferativo (MPSV, Artelt P et al., Gene 68 p. 213-9, 1998), Citomegalovirus (CMV, Thomsen, et al. PNAS 81 p. 659-63, 1984) o promotores similares virales de origen viral o celular. La segunda proteína cuya expresión induce la actividad de caspasa-8 es seleccionada del dominio Fas-intracelular, dominio CD120a intracelular, Mort-1 , caspasa-8, o una proteína equivalente que puede inducir la actividad de caspasa-8- Alternativamente, la actividad de caspasa-8 puede ser inducida en las células mediante tratamiento con ligando NFT o CD-95. Los experimentos que detallan el posible mecanismo y los detalles técnicos posteriores de este tipo de ensayo se encuentran en Boldin et al., Cell 1996, que se mencionó anteriormente. Después de introducir el vector de expresión arriba identificado para la segunda proteína y la proteína que va a ser sometida a prueba en la célula de mamífero, el cultivo de células es cultivado durante un período suficiente para permitir que ocurra la expresión de las proteínas, activación o expresión de caspasa-8, y el corte de la proteína que se va a someter a prueba. Generalmente, dicho período es de 4 a 72 horas, preferiblemente 16 a 30 horas, muy preferiblemente de 20 a 24 horas. Para determinar el grado de corte, se prepara un usado celular completo. Alternativamente, la proteína marcada puede ser purificada utilizando anticuerpos anti-marca, o cromatografía de ácido níquel-nitrilotriacético, reactivos y protocolos detallados que están disponibles de Qiagen GMBH, Hilden, Alemania. La técnica de inmunoprecipitación se describe en el anterior documento de Boldin et al., Cell 1996. Los reactivos y las instrucciones para inmunoprecipitación están disponibles además de Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemania en forma de equipo. El lisado celular completo de la proteína purificada es ahora resuelto por tamaños mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. La proteína que va a ser probada o sus fragmentos marcados se pueden visualizar ahora mediante la técnica de Western Blot utilizando anticuerpos anti-marca. Una marca preferida es la marca de histidina, en combinación con un anticuerpo de anti-polihistidina. Sin embargo, se pueden utilizar otras combinaciones de secuencias de marcas y anticuerpos específicos para las mismas, siempre y cuando el anticuerpo permanezca específico para la secuencia de marcas, es decir, que no reconozca otras proteínas en el lisado celular completo. El carácter específico del corte puede ser verificado al correr reacciones de control en donde un inhibidor de caspasa específico se agrega al cultivo de células de mamífero en el periodo mencionado anteriormente. Un inhibidor preferido es un inhibidor seleccionado de zVAD-fmk, Zdevd-fmk, zlETD-fmk (véase Keppler-Hafkemeyer et al., Biochemistry 37, p- 16934-42, 1998). Un inhibidor más preferido es zVAD-fmk. Otros inhibidores que se pueden utilizar son proteínas tales como Bclx o la proteína p35 que actúa como inhibidor celular de caspasas. La inhibición del corte cuando dichas proteínas son coexpresadas en el ensayo, indica que el corte es específico para caspasas. Un segundo ensayo para realizar pruebas si la proteína que va a ser sometida a prueba es digerible por caspasa-8, es un ensayo in vitro, en donde la caspasa-8 producida como recombinante es utilizada en una reacción enzimática junto con la proteína marcada a aquella sometida a prueba. La proteína que va a ser sometida a prueba puede ser producida como se describe arriba, clonando la secuencia codificante de la misma en un vector de expresión que contiene un promotor fuerte y transfección en una célula de mamífero. De manera conveniente, la proteína que va a ser sometida a prueba es marcada, como se describió anteriormente, de tal manera que pueda ser purificada desde el extracto de célula de mamífero, mediante anticuerpos anti-marca u otros agentes con la capacidad de unir específicamente la secuencia de marcas. Como alternativa, la proteína que va a ser sometida a prueba puede ser producida in vitro utilizando un sistema de traducción in vitro. La técnica de la traducción in vitro es muy conocida para el experto en la técnica, y los reactivos y protocolos detallados por consiguiente están disponibles, por ejemplo, de Stratagene, La Jolla, EUA. 9 Como alternativa, la proteína que va a ser sometida a prueba puede ser marcada, por ejemplo, utilizando un radioisótopo. De forma conveniente, cuando se utiliza una marcación de radioisótopo, la proteína que va a ser sometida a prueba es expresada in vitro y el aminoácido marcado isotópicamente, junto con el aminoácido no marcado, son agregados durante la reacción de traducción in vitro. Preferiblemente, el isótopo es S35. Muy preferiblemente, el aminoácido marcado es S35-Metionina y la relación entre el aminoácido marcado y el no marcado es 1:1 a aproximadamente 1 :1000. La proteína producida en forma recombinante, que va a ser sometida a prueba y la enzima activa de caspasa-8 producida de forma recombinante son entonces combinadas en un regulador de pH adecuado y durante un período suficiente para permitir que ocurra el corte. El regulador de pH preferido y otros parámetros preferidos del ensayo se describen en el anterior documento Boldin et al., Cell 1996. El período preferido es generalmente entre 10 min. y varias horas, preferiblemente entre 30 min. y una hora. Después de permitir que ocurra el corte, la reacción es separada por tamaños mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS. Si se ha utilizado la marcación isotópica, el gel puede ser secado y el isótopo detectado con película fotográfica o con fosfoformación de imagen (Fuji). La proteína que va a ser sometida a prueba es marcada, y puede ser detectada utilizando anticuerpos específicos de marca en western blot.

La apariencia de bandas de bajo peso molecular adicionales en reacciones en las cuales se agregó caspasa-8, comparada con las reacciones de control sin caspasa-8 indica corte de la proteína que va a ser sometida a prueba mediante caspasa-8. El tamaño de la banda de bajo peso molecular indica además la ubicación próxima del sitio de corte. La presente invención se refiere a una secuencia de ADN que codifica para proteínas que ¡nteractúan con caspasa-8. Más aun, la presente invención además se refiere a secuencias de ADN que codifican una isoforma biológicamente activa, alélica variante, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de la proteína que interactúa con caspasa-8, y la proteína, ¡soforma, alélica variante, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado codificada de ese modo. La preparación de dichos análogos, fragmentos, mutantes o derivados se realiza mediante un procedimiento estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989) en el cual, en las secuencias de ADN que codifican para la proteína que interactúa con caspasa-8, uno o más codones pueden ser deletados, agregados o sustituidos por otro, para rendir análogos que tienen al menos un cambio de residuo de aminoácido con respecto de la proteína origen. De las secuencias de ADN anteriores de la invención que codifican para una proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, alélica variante, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, también se incluye, como una modalidad de la invención, secuencias de ADN capaces de hibridar con una secuencia ADNc derivada de la región codificante de una proteína que interactúa con caspasa-8 origen, en la cual dicha hibridación se realiza bajo condiciones moderadamente estrictas, y cuyas secuencias de ADN hibridables codifican una proteína que interactúa con caspasa-8 biológicamente activa. Estas secuencias de ADN hibridables incluyen, por lo tanto, secuencias de ADN que tienen una homología relativamente alta a la secuencia de ADNc de la proteína que interactúa con caspasa-8 origen, y como tales representan secuencias similares a la proteína que interactúa con caspasa-8 que pueden ser, por ejemplo, secuencias derivadas naturalmente que codifican las varias isoformas de proteína que interactúa con caspasa-8, o bien, secuencias que se presentan de forma natural que codifican proteínas que pertenecen a un grupo de secuencias similares a la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 que codifican una proteína que tiene la actividad de la proteína que interactúa con caspasa-8. Además, estas secuencias pueden, por ejemplo, incluir también secuencias que no se presentan de forma natural, sintéticamente producidas, que son similares a la secuencia de ADNc de proteína que interactúa con caspasa-8 origen, pero incorporar un número de modificaciones deseadas. Dichas secuencias sintéticas incluyen, por lo tanto, todas las secuencias posibles que codifican análogos, fragmentos y derivados de proteína que interactúan con caspasa-8, todos los que tienen la actividad de la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8. Como se utiliza en la presente, las condiciones de astringencia son una función de la temperatura utilizada en el experimento de hibridación, la molaridad de los cationes monovalentes y el porcentaje de formamida en la solución de hibridación. Para determinar el grado de astringencia involucrado con cualquier conjunto de condiciones establecidas, se utiliza primero la ecuación de Meinkoth et al (1984) para determinar la estabilidad de híbridos de identidad al 100% expresada como temperatura de fusión Tm del híbrido ADN-ADN: Tm= 81.5 °C +16.6 (LogM) + 0.41 (%GC) -0.61 (% form) - 500/L donde M es la molaridad de cationes monovalentes, %GC es el porcentaje de nucleótidos G y C en el ADN, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares base. Para cada 1 °C que Tm es reducida para aquella calculada para un híbrido de identidad al 100%, la cantidad de no apareamiento permitido se incremente en un 1% aproximadamente. Por lo tanto, si la Tm utilizada para cualquier experimento de hibridación determinado en las concentraciones especificadas de sal y formamida es 10°C debajo de la Tm calculada para un híbrido al 100% de acuerdo con la ecuación de Meinkoth, la hibridación ocurrirá aún si existe un no apareamiento arriba del 10% aproximadamente. "Condiciones moderadamente estrictas" son aquéllas que proveen una Tm que no sea mayor de 20°C debajo de Tm que existiría para un dúplex perfecto con la secuencia objetivo, ya sea calculada mediante la fórmula anterior o como realmente se ha medido. Sin limitación, las condiciones moderadamente estrictas (15-20°C debajo de la Tm calculada o medida del híbrido) utilizan una solución de lavado de 2 X SSC (citrato salino estándar) y 0.5% de SDS (dodecilsulfato de sodio) a la temperatura apropiada debajo de la Tm calculada del híbrido. La astringencia final de las condiciones se debe principalmente a las condiciones de lavado, particularmente si las condiciones de hibridación utilizadas son aquéllas que permitan híbridos menos estables para formarse junto con híbridos estables. Las condiciones de lavado con una alta astringencia remueven entonces los híbridos menos estables. Una condición común de hibridación que se puede utilizar con condiciones de lavado moderadamente estrictas que se describen anteriormente, es la hibridación en una solución de 6 X SSC ( ó 6 X SSPE (EDTA-salino-fosfato estándar)), 5 X reactivo de Denhardt, 0.5% SDS, 100 µg/ml, desnaturalizan ADN de esperma de salmón fragmentado a una temperatura de aproximadamente 20° a 25° debajo de la Tm. Si se utilizan sondas mixtas, es preferible utilizar cloruro de tetrametilamonio (TMAC) en lugar de SSC (Ausubel, 1987, 1999). Para obtener las diversas secuencias similares a proteína que interactúa con caspasa-8, que se presentan de forma natural, mismas que se mencionaron anteriormente, se pueden emplear procedimientos estándar de selección y aislamiento de muestras de ADN y ARN naturalmente derivadas a partir de varios tejidos, utilizando ADNc de proteína que interactúa con caspasa-8 o una porción de la misma como sonda (véase por ejemplo, los procedimientos estándar que se indican en Sambrook, et al., 1989). La invención se refiere a la proteína que interactúa con caspasa- 8 como se puede identificar mediante el ensayo de selección anterior. La invención también se refiere a un polipéptido o proteína que corresponde sustancialmente a la proteína que interactúa con caspasa-8. El término "que corresponde sustancialmente" incluye no solamente la proteína que interactúa con caspasa-8, sino también polipéptidos o proteínas que son análogos a estos. Los análogos que corresponden sustancialmente a la proteína que interactúa con caspasa-8 son aquellos polipéptidos en donde uno o más aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 ha sido reemplazado con otro aminoácido, deletado y/o insertado, siempre y cuando la proteína resultante exhiba sustancialmente la misma o mayor actividad biológica que la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 a la cual corresponde. Para corresponder sustancialmente a la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, los cambios en la secuencia de proteínas que ¡nteractúan con caspasa-8, tales como las ¡soformas, son generalmente menores. Aunque el número de cambios puede ser mayor a diez, preferiblemente no hay más de diez cambios, muy preferiblemente no más de cinco, y muy preferiblemente aún no más de tres tales cambios. Aunque se puede utilizar cualquier técnica para encontrar proteínas potencial y biológicamente activas que sustancialmente correspondan a las proteínas que interactúan con caspasa-8, una de esas técnicas es el uso de técnicas de mutagénesis convencionales en el ADN que codifica para la proteína, originando pocas modificaciones. Las proteínas expresadas por dichos clones pueden entonces ser seleccionadas por su habilidad para unirse a caspasa-8 y para modular la actividad de caspasa-8 en la modulación/mediación de trayectorias intracelular es que se indicaron arriba. Los cambios "conservadores" son aquellos cambios de los cuales no se esperaría que modificaran la actividad de la proteína y generalmente son los primeros en ser seleccionados, ya que no se esperaría que éstos cambiaran sustancialmente el tamaño, carga o configuración de la proteína y por lo tanto, no se esperaría que cambiaran las propiedades biológicas de las mismas. Las sustituciones conservadoras de proteínas que interactúan con caspasa-8 incluyen un análogo en donde al menos un residuo de aminoácido en el polipéptido ha sido conservadoramente reemplazado por un aminoácido diferente. Dichas sustituciones preferiblemente son realizadas de acuerdo con la siguiente lista, como se presenta en el cuadro IA, cuyas sustituciones pueden ser determinadas por experimentación de rutina para proveer las propiedades estructurales y funcionales modificadas de una molécula de péptido sintetizada mientras se mantiene la actividad biológica característica de la proteína que interactúa con caspasa-8.

CUADRO 1A Sustitución Residuo Ejemplar Original Ala Gly; Ser Arg Lys Asn Gln; His Asp Glu Cys Ser Gln Asn Glu Asp Gly Ala; Pro His Asn; Gln He Leu; Val Leu lie; Val Lys Arg; Gln; Glu Met Leu; Tyr; lie Phe Met; Leu; Tyr Ser Thr Thr Ser Trp Tyr Tyr Trp; Phe Val lie; Leu Como alternativa, otro grupo de sustituciones de proteína que interactúa con caspasa-8 es aquel en el cual al menos un residuo de aminoácido en el polipéptido ha sido removido y ha sido insertado un residuo diferente en su lugar, de acuerdo con el siguiente cuadro IB. Los tipos de sustituciones que se pueden llevar a cabo en el polipéptido se pueden basar en el análisis de frecuencias de cambios de aminoácidos entre una proteína homologa de diferente especie, tales como aquellas presentadas en el cuadro 1-2 de Schultz et al., G E, Principies of Protein Structure Springer-Verlag, (Principos sobre ia Estructura de las Proteínas) Nueva York, NY, 1798, y las figuras 3-9 de Creighton, T.E. Proteins: Structure and Molecular Properties, (Proteínas: Propiedades estructurales y moleculares) W.H. Freeman & Co., San Francisco, CA 1983. Basándose en dicho análisis, se definen en la presente sustituciones conservadoras alternativas, como intercambios dentro de los siguientes cinco grupos: CUADRO 1B 1.- Residuos alifáticos menores, no polares o ligeramente polares: Ala, Ser, Thr, (Pro, Gly); 2.- Residuos polares negativamente cargados y sus amidas: Asp, Asn, Glu, Gln; 3.- Residuos polares positivamente cargados His, Arg, Lys; 4.- Residuos alifáticos mayores, no polares : Met, Leu, lie, Val (Cys); y 5.- Residuos aromáticos mayores: Phe, Tyr, Trp. Los tres anteriores residuos de aminoácidos en paréntesis tienen funciones especiales en la arquitectura de las proteínas. Gly es el único residuo que carece de alguna cadena lateral y por lo tanto imparte flexibilidad a la cadena. Sin embargo, esto último tiende a promover la formación de una estructura secundaria diferente de la a-helicoidal. Pro, debido a su geometría poco usual, fuertemente restringe la cadena y generalmente tiende a promover estructuras en forma de beta-vuelta, aunque en algunos casos Cys puede tener la capacidad de participar en la formación de enlace de disulfuro que es importante en el doblamiento de proteínas. Se debe apreciar que Schulz et al., supra fusionaría los grupos 1 y 2 anteriores. Se debe notar también que Tyr, debido a su potencial de unión a hidrógeno, tiene una afinidad significativa con Ser y Thr, etc. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos de acuerdo con la presente invención, por ejemplo como se presentó anteriormente, son conocidas en la técnica y se esperaría que mantuvieran las propiedades biológicas y estructurales del polipéptido después de la sustitución del aminoácido. La mayoría de deleciones y sustituciones de acuerdo con la presente invención son aquéllas que no producen cambios radicales en las características de la proteína o molécula de polipéptido. El término "características" se define de manera no inclusiva para indicar ambos cambios en la estructura secundaria, por ejemplo, a-hélice o beta-placa, así como a los cambios en la actividad biológica, por ejemplo, unión a caspasa-8 y/o mediación del efecto de caspasa-8 en la muerte celular. Los ejemplos de la producción de sustituciones de aminoácidos en proteínas que se pueden utilizar para obtener análogos de proteínas que interactúan con caspasa-8, para su uso en la presente invención incluyen cualquiera de los pasos de los métodos conocidos, tales como se presentan en las patentes EU RE 33.653, 4,959,314, 4,588,585, Y 4,737,462, a Mark et al.; 5,116,943, a Koths et al., 4,965,195 a Ñamen et al.; 4,879,111 a Chong et al.; y 5,017,691 a Lee et al.; y proteínas sustituidas con lisina que se presentan en la patente EU No. 4,904,584 (Shaw et al.). Además de las sustituciones conservadoras que se describen anteriormente, que no cambiarían de forma significativa la actividad de la proteína que interactúa con caspasa-8, tanto las sustituciones conservadoras como las menos conservadoras y los cambios más aleatorios, que conducen al incremento de la actividad biológica de los análogos de proteínas que ¡nteractúan con caspasa-8, tienen la intención de ser incluidos dentro del alcance de la invención. Cuando se va a confirmar el efecto exacto de la sustitución o deleción, los expertos en la técnica apreciarán que el efecto de la(s) sustitución(es), deleción(es) etc., será evaluado por unión de rutina y por ensayos de muerte celular. La selección que utiliza dicha prueba estándar no involucra la experimentación indebida. Los análogos que interactúan con caspasa-8 aceptables, son aquellos que retienen al menos la capacidad de interactuar con caspasa-8, y de esa forma median la actividad de caspasa-8 en las trayectorias intracelulares, o modulan la actividad de caspasa-8 en sí. De esa forma, se pueden producir análogos que tienen el efecto tan denominado dominante-negativo, a saber, un análogo que es defectuoso tanto para unirse a caspasa-8, o en la subsiguiente señalización u otra actividad seguida de dicha unión. Por ejemplo, se pueden utilizar dichos análogos, para inhibir el efecto citotóxico de caspasa-8, o para incrementarlo, dependiendo si se desea incrementar la muerte celular o sobrevivencia celular y dependiendo en cuál de estas actividades está aquélla principal, modulada por la interacción de la proteína que interactúa con caspasa-8 y caspasa-8 (véase arriba), a esto por dichos análogos compitiendo con la proteína que interactúa con caspasa-8 natural para unirse a, ó interactuar con caspasa-8 A nivel genético, estos análogos generalmente son preparados mediante mutagénesis dirigida en sitio de nucleótidos en el ADN que codifican para la proteína que interactúa con caspasa-8, produciendo por lo tanto ADN que codifica el análogo, y posteriormente sintetizando el ADN y expresando el polipéptido en cultivo de células recombinantes. Los análogos típicamente exhiben la misma actividad o una actividad biológica cualitativa incrementada como la proteína que se presenta de forma natural, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, (Protocolos Actuales en Biología Molecular) Greene Publications y Wiley Interscience, New York, NY, 1987-1995; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1989. La preparación de la proteína que interactúa con caspasa-8 de acuerdo con la presente, o una secuencia de nucleótidos alternativa que codifica para el mismo polipétido pero difiere de la secuencia natural debido a los cambios permitidos por la degeneración conocida del código genético, se puede lograr mediante mutagénesis especifica en sitio de ADN que codifica un análogo preparado antes o una versión de origen de una proteína que ¡nteractúa con caspasa-8. La mutagénesis especifica en sitio permite la producción de análogos a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proveer una primer secuencia de tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable en ambos lados de la unión de deleción que ha sido atravesada. Típicamente, un iniciador de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos de longitud es el preferido, con aproximadamente 5 a 10 nucleótidos complementarios en cada lado de la secuencia que han sido alterados. En general, la técnica de mutagénesis especifica en sitio es muy conocida en las técnicas, como se ejemplifica mediante las publicaciones tales como Adelman et al., DNA 2: 183 (1983), descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia. Como se apreciará, la técnica de mutagénesis especifica en sitio típicamente emplea un vector de fago que existe en ambas formas, de cadena simple y de cadena doble. Los vectores típicos útiles en la mutagénesis dirigida en sitio incluye vectores tales como el fago M13, por ejemplo, como se describe en Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, (Tercer Simposio en Cleveland sobre Macromoléculas y Recombinates) Editor A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981), descripción de la cual se incorpora en la presente por referencia. Este fago está fácilmente disponible en forma comercial y su uso es generalmente muy conocido para aquellos expertos en la técnica. Como alternativa, los vectores plásmidos que contienen un fago de cadena sencilla de origen de replicación (Veira et al., Meth Enzymol. 153:3 1987) se puede utilizar para obtener ADN de cadena sencilla. En general, la mutagénesis dirigida en sitio de acuerdo con la presente se desarrolla primero obteniendo un vector de cadena sencilla que incluye dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica el polipéptido relevante. Se prepara sintéticamente un iniciador de oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada, mediante síntesis de oligonlucleótido/ADN automatizado. Este iniciador es fijado con el vector que contiene la secuencia de proteína de cadena sencilla, y sometido a enzimas polimerizantes de ADN tales como fragmento I Klenow de polimerasa de E. coli, para completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Por lo tanto, una secuencia mutada y las segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heterodoble se utiliza entonces para transformar células apropiadas, tales como células JM101 E. coli que son seleccionadas para incluir vectores recombinantes que llevan la disposición de secuencia mutada. Después que dicho clon ha sido seleccionado, la secuencia de proteínas que ¡nteractúan con caspasa-8 mutada puede ser removida y colocada en un vector apropiado, generalmente una transferencia o vector de expresión del tipo que puede ser empleado para la transfección de una hospedero adecuada. De conformidad con lo anterior, el gen o ácido nucleico que codifica para una proteína que interactúa con caspasa-8 puede ser detectado, obtenido y7o modificado, in vitro, in situ y/o in vivo, mediante el uso de técnicas de amplificación de ADN o ARN conocidas, tales como PCR y síntesis química de oligonucleótidos. PCR permite la amplificación (incremento en números) de secuencias de ADN específicas mediante reacciones repetidas de polimerasa de ADN. Esta reacción se puede utilizar como un reemplazo para la clonación; todo lo que se requiere es un conocimiento de la secuencia de ácidos nucleicos. Para llevar a cabo PCR, se designan los iniciadores, que son complementarios a la secuencia de interés. Posteriormente, los iniciadores son generados mediante síntesis de ADN automatizada. Debido a que los iniciadores pueden ser designados para hibridar cualquier parte del gen, las condiciones que puedan ser creadas de tal forma que los no apareamientos en el par de base complementario puedan ser tolerados. La amplificación de estas regiones de no apareamiento pueden conducir a la síntesis de un producto mutagenado resultando en la generación de un péptido con nuevas propiedades (es decir, mutagénesis dirigida en sitio). Véase además, por ejemplo, Ausubel, supra, Cap. 16. Además mediante síntesis complementaria de ADN (ADNc) de acoplamiento, utilizando transcriptasa inversa, con PCR, se puede utilizar ARN como el material de partida para la síntesis del dominio extracelular de un receptor prolactina sin clonación. Además, se pueden designar iniciadores de PCR para incorporar nuevos sitios de restricción u otras características tales como codones de terminación a los extremos del segmento del gen que va a ser amplificado. Esta colocación de sitios de restricción en los extremos 5' y 3' de la secuencia de gen amplificado permite que los segmentos de gen que codifican para la proteína que interactúa con caspasa-8 o un fragmento de la misma se pueda designar en forma acostumbrada para la ligación de otras secuencias y/o la clonación de sitios en vectores. PCR y otros métodos de amplificación de ARN y/o ADN son muy conocidos en la técnica y se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención sin experimentación indebida, en base a la enseñanza y guía que se presenta en este documento. Los métodos conocidos de amplificación de ADN o ARN incluyen, más no se limitan a reacción de polimerasa en cadena (PCR) y procedimientos de amplificación relacionados (véase, por ejemplo, patente E.U.A. No. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,965,188, a Mullís et al.; 4,795,699 y 4,921 ,794 a Tabor et al.; 5,142,033 a Innis; 5,122,464 a Wilson et al.; 5,0941 ,310 a Innis; 5,066,584 a Gyllensten et al.; 4,889,818 a Gelfand et al.; 4,994,370 a Silver et al,; 4,766,067 a Biswas; 4,656,134 a Ringold; e Innis et al., eds., PCR Protocols: A Guide to Method and Applications) y amplificación mediada por ARN que utiliza a ARN antisentido para la secuencia objetivo como un molde para síntesis de ADN de cadena doble (patente E.U.A. No. 5,130,238 a Malek et al., con el nombre comercial NASBA); una inmuno-PCR que combina el uso de amplificación de ADN con marcación de anticuerpos (Ruzicka et al., Science 260:487 (1993); Sano et al., Science 250:120 (1992); Sano et al., Biotechniques 9: 1378 (1991)) los contenidos totales, cuyas patentes y referencias se incorporan en la presente a modo de referencia.

De forma análoga, los fragmentos biológicamente activos, de proteínas que interactúan con caspasa-8 (aquellos de cualquier proteína que interactúa con caspasa-8 o sus isoformas) se pueden preparar como se indica arriba con respecto a los análogos de proteína que ¡nteractúan con caspasa-8. Los fragmentos adecuados de proteína que ¡nteractúan con caspasa-8 son aquellos que retienen la capacidad de la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 y que pueden mediar la capacidad biológica de caspasa-8 u otras proteínas asociadas con caspasa-8 directa o indirectamente. Por consiguiente, pueden ser preparados los fragmentos de proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, que tienen un efecto dominante-negativo o un efecto dominante-positivo como se indica arriba con respecto a los análogos. Se debe apreciar que estos fragmentos representan una clase especial de los análogos de la invención, a saber, son porciones definidas de proteínas que interactúan con caspasa-8 derivadas de la secuencia completa de proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 (por ejemplo, desde aquélla relacionada de la proteína que interactúa con caspasa-8 o sus isoformas), cada porción o fragmento tiene una de las actividades deseadas que se denotan arriba. Dicho fragmento puede ser, por ejemplo, un péptido. De forma similar, se pueden preparar derivados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más residuos de aminoácido de la proteína que ¡nteractúa con caspsasa-8, sus análogos o fragmentos, o mediante conjugación de la proteína que interactúa con caspasa-8, sus análogos o fragmentos, a otra molécula, por ejemplo un anticuerpo, enzima, receptor, etc., que son muy conocidos en la técnica. Por consiguiente, "derivados" como se utiliza en la presente, abarca derivados que pueden ser preparados a partir de grupos funcionales que se presentan como cadenas laterales en los residuos o en los grupos N- o C-terminal a través de medios conocidos en la técnica, y son incluidos en la invención. Los derivados pueden tener porciones químicas tales como residuos de carbohidrato o fosfato, toda vez que dicha fracción tiene la misma actividad biológica más elevada como las proteínas que interactúan con caspasa-8. Por ejemplo, los derivados pueden incluir esteres alifáticos de los grupos carboxilo, amidas de los grupos carboxilo mediante reacción con amoníaco o con aminas primarias o secundarias, N-acilo derivados o grupos amino libres de los residuos aminoácidos formados con porciones acilo por ejemplo alcanoilo o grupos aroilo carbocíclicos) o derivados de O-acilo del grupo hidroxilo libre (por ejemplo aquél de los residuos de serilo o treonilo) formados con porciones acilo. El término "derivados" tiene la intención de incluir solamente aquellos derivados que no cambian de un aminoácido a otro de los veinte aminoácidos que comúnmente se presentan de forma natural. Como se describió anteriormente, se pueden utilizar ensayos de corte para determinar si una proteína que interactúa con caspasa-8 es cortada por caspasa-8. La separación por tamaños de fragmentos cortados da una indicación aproximada de la ubicación del sitio de corte.

El sitio de corte puede ser además determinado preparando mutantes de deleción de la proteína para que sean sometidos a prueba y probando cada mutante de deleción para descubrir su susceptibilidad al corte mediante caspasa-8 como se describió anteriormente. Los mutantes de deleción pueden ser construidos mediante clonación de PCR de fragmentos deseados de la proteína que va a ser sometida a prueba, utilizando la secuencia de ADN del clon que codifica para dicha proteína que va a ser sometida a prueba como un molde. Los fragmentos amplificados de PCR pueden ser entonces clonados en vectores de expresión, en donde un codón de inicio ATG y preferiblemente, una secuencia Kozak (Kozak, M, Nucleic Acids Res. 12 p. 857-72, 1984) debe ser provista. Puede encontrase detalles adicionales sobre la expresión de proteínas en la información arriba indicada de Qiagen, en relación sus proteínas marcadas pero también a la expresión de proteínas en general. Otra referencia para la expresión de proteínas de los protocolos actuales (Current Protocols) arriba mencionados, y específicamente en el capítulo 16 de los mismos. El sitio de corte de una proteína que va a ser sometida a prueba puede ser entonces definido preparando varios mutantes de deleción de los mismos y determinando el mutante de deleción más pequeño que es cortado mediante caspasa-8. Otra forma de identificar el sitio de corte utiliza péptidos que son generados de acuerdo con la secuencia de proteínas predicha del clon que va a ser probado. Los péptidos pueden ser sintetizados químicamente por ejemplo, como se detalla en Bodanzky y Bodanzky, The practice of peptide síntesis, (Práctica de síntesis de péptidos) Springer New York, ISBN 0-387-13471-9, y Bodansky. Los principios de síntesis de péptidos Springer, New York, ISBN 0-387-12159-4. La síntesis de péptidos habitual está además disponible de diversas compañías comerciales, por ejemplo SynPep Corp. Dublin (CA) EUA, y California Peptide Research, Inc., Napa, CA, EUA. Los péptidos también pueden también ser producidos, ya sea por fusión con otras proteínas o no fusionados expresando ADN recombinante que codifica para, como se detalla en el capitulo 16 anterior de Current Protocols. Para utilizar péptidos para mapear el sitio de corte de una proteína que va a ser sometida a prueba, la secuencia de aminoácidos predicha de esa proteína es dividida en áreas y es sintetizado un péptido correspondiente a cada área. Además, son sintetizados los péptidos que comprenden aproximadamente los aminoácidos de un área y contiguamente comprenden además aproximadamente la mitad de los aminoácidos de un área cercana directamente, para traslapar el borde entre las dos áreas. El área comprende entre 5 y 100 aminoácidos, preferiblemente entre 9 y 40 aminoácidos y muy preferiblemente entre 20 y 30 aminoácidos. El grupo entero de péptidos es sometido a prueba como se describió anteriormente para obtener la susceptibilidad al corte por caspasa-8. Se pueden proveer péptidos preparados puros y en cantidades mayores. Después de la reacción de corte, pueden ser analizados directamente mediante electroforesis de gel de poliacrilamida SDS y mediante detección UV o visualización mediante teñido, por ejemplo, utilizando azul Comassie. Como alternativa, los péptidos pueden ser marcados para una fácil detección, por ejemplo, mediante marcado de extremo isotópico (véase por ejemplo, Shevchenko A, et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 11 , p. 1015-24, 1997). Después que se ha completado la selección del péptido como se describió anteriormente, el péptido que ahora es conocido para incluir el sitio de corte para caspasa-8 puede ser estudiado además repitiendo la misma técnica, pero eligiendo áreas mas pequeñas seleccionadas para la secuencia del péptido que ha sido identificado. El sitio de corte verdadero de los péptidos se debe conformar a la secuencia XXXD de corte de caspasa (véase Boldin et al., Cell 1996 y Nicholson et al., Killer caspases, Trends in Biochem Sci. (Caspasas asesinas, Tendencias en Bioquímica) 22,299-306, 1997). La contribución de cada aminoácido en el péptido puede ser evaluada al preparar péptidos que son mutados en un aminoácido y probando estos péptidos mutados para la susceptibilidad al corte con caspasa-8. El aminoácido que va a ser mutado, preferiblemente es reemplazado por un aminoácido seleccionado del grupo de aminoácidos no polares cargados (véase Lehninger, Biochemistry, Worth, NY, 1979 capítulo 4), muy preferiblemente seleccionado de glicina o alanina. Al mutar aminoácidos críticos, es posible generar péptidos que se unen a caspasa-8, pero no son susceptibles al corte en ese sitio. Se puede realizar la prueba de unión mediante separación por tamaños de complejos péptidos-caspasa-8 bajo condiciones no desnaturantes utilizando electroforesis de gel de acrilamida.

Además es posible construir péptidos modificados que son capaces de reaccionar con la cisteína activa de caspasa-8 para que de esa forma se una covalentemente a dicha cisteína. Los reactivos que reaccionan con grupos tiol son conocidos para aquellos expertos en la técnica de la química que pueden utilizar para ese propósito. Dichos reactivos pueden unirse de forma reversible. Por ejemplo, el grupo-tiol que contiene reactivos puede reaccionar con el grupo SH de la cisteína activa de caspasa-8. El enlace S-S covalente formado puede ser cortado por reducción, por ejemplo, bajo condiciones fisiológicas en el citosol o utilizando un reactivo que reduce los grupos S-S tal como Ditiotreitoi (DTT). Los reactivos que reaccionan con grupos tiol pueden también unirse irreversiblemente a caspasa-8. Dichos reactivos pueden fácilmente ser encontrados entre los enlazadores, capaces de reaccionar con grupos tiol como se conoce en la técnica, tal como se describe en p.O-90 y las siguientes páginas en el catálogo de ciencias PIERCE Life Sciences catalog (PIERCE, Rockford, IL.USA). Los grupos adecuados que reaccionan con grupos tiol son por ejemplo grupos piridilditio, yodoacetamido, o maleimido. Estos grupos pueden ser enlazados al péptido mediante enlazadores que comprenden opcionalmente cadenas de hidrocarburo alifáticas insaturadas, -O, -S, -NH-, o grupos aromáticos. Los enlazadores pueden ser opcionalmente sustituidos. Los grupos tiol-reactivos pueden ser enlazados al péptido mediante síntesis química conocida en la técnica; los grupos funcionales del péptido pueden ser reaccionados con grupos funcionales adecuados de la molécula enlazadora de grupo que reacciona con tiol. Por ejemplo, un residuo de lisina presente en la secuencia de péptidos, o agregado a la misma para el propósito de crear un grupo funcional adecuado, que en el caso de lisina es un grupo epsilon-amino, puede ser reaccionado con un entre-enlazador heterobifuncional tal como éster de N-gamma-meleimidobutiriloxi-succinimida, para crear un péptido en donde dicho grupo epsilon-amino de lisina es reaccionado con el grupo N-hidroxisuccinimida del entre-enlazador, mientras que el grupo maleimido del entre-enlazador se mantiene sin reaccionar y puede, al contacto con la caspasa-8 cisteína que ocurre cuando dicho péptido específicamente se une a dicha caspasa-8, reaccionar con el grupo tiol de dicha cisteína y por lo tanto desactivar dicha caspasa-8. La posición dentro del péptido utilizada para reaccionar así al reactivo tiol, se puede elegir para que esté cercana al aminoácido (generalmente ácido aspártico) donde ocurre el corte mediante caspasa-8. El enlazador al cual el grupo tiol-reactivo es enlazado al péptido puede ser variado en su longitud, presencia de grupos polares, tales como hidroxi, grupos cargados tales como grupos nitrógeno y sulfo, y grupos aromáticos tales como residuos de fenileno o fenilo. Estas variaciones en la estructura enlazadora permitirá la generación de reactivo que comprende un péptido y covalentemente unido al mismo un reactivo tiol-reactivo que específicamente se unirá a caspasa-8 y efectivamente reaccionará con el grupo tiol de su cisteína activa.

La proteína que va a ser sometida a prueba, o un fragmento del péptido del mismo puede ser además caracterizado al introducir dicha proteína o péptido en una célula de mamífero y medir el efecto de reactivos inductores de apoptosis en dicha célula. La expresión de una proteína o péptido dentro de una célula de mamífero puede ser realizada insertando el ADN que codifica para la proteína que va a ser sometida a prueba en un vector que comprende un promotor, opcionalmente una secuencia de intrones y señales donantes/aceptoras de empalme, y además opcionalmente comprende una secuencia de terminación. Estas técnicas generalmente se describen en Current Protocols, (Protocolos Actuales) que se identificaron arriba, capítulo 16. El promotor anterior, el intrón, y las secuencias de terminación anteriores son operables en células de mamíferos. El promotor es preferiblemente un promotor fuerte tal como los promotores RSV, CMV, o MPSV que se describieron arriba. El promotor también puede ser el promotor temprano SV40 (Everett, et al. Nucleic Acids Res. 11p. 2447-64, 1983, y referencias en la misma), o un promotor celular, tal como el promotor beta-actina o el promotor ELF-1 (Tokushige, et al., J Virol Methods, 64 p. 73-80,1997). Además, se puede utilizar un promotor híbrido, tal como el híbrido entre el operador lac y el promotor ELF-1 alfa de humano tal como se describe en Edamatsu et al. (Gene 187,p 289-294,1997), el promotor híbrido CMV-beta actina descrito por Akagi et al., Kidney Int. 51 , p. 1265-9,1997), o el híbrido entre las secuencias operadoras y el promotor CMV (Furth et al., PNAS 91 ,p.9302-6,1994, y referencias en la misma). Las secuencias de intrones que pueden ser insertadas como secuencias completas, es decir incluyendo el donante de división y los sitios aceptores, pueden ser insertadas en la secuencia de codificación de la proteína que se desea expresar. La inserción de dicha secuencia de intrones puede mejorar la estabilidad de ARN y por lo tanto incrementar la producción de la proteína deseada. Aunque en principio, se pueden seleccionar secuencias de intrones adecuadas de cualquier gen que contenga intrones, las secuencias de intrones preferidas son el intrón beta-actina, el intrón SV 40, y el intrón de receptor de FNT p55. La secuencia de intrones puede contener elementos incrementadores que pueden incrementar la transcripción a partir de los promotores arriba mencionados. Frecuentemente, las secuencias de intrones también contienen secuencias de control de la transcripción o traducción que confieren expresión específica en el tejido. Por lo tanto, cuando se desea expresar una proteína de la invención en una manera específica del tejido, dichas secuencias de intrones se pueden emplear de manera conveniente. Un ejemplo de un intrón que contiene elementos incrementadores específicos de tejido es el incrementador eritroide localizado en el intrón 8 del gen 5-aminolevulinato sintasa 2 humana (Surinya et al., J Biol. Chem. 273, p. 16798-809,1998), y la descripción del principio para incrementar la producción de proteínas utilizando secuencias de intrones, junto con secuencias de intrones ejemplares, se proporciona en Huang et al., Nucleic Acids Res. 18, p. 937-47, 1990). Las secuencias de terminación de la transcripción y las señales de poliadenilación se pueden agregar hacia el extremo 3' del ADN que codifica para la proteína que se desea expresar. Dichas secuencias se pueden encontrar en muchos o aún en la mayoría de los genes. De forma conveniente, la señal de poliadenilación SV 40 se utiliza (Schek et al., Mol Cell Biol., p. 5386-93, 1992 y referencias en la misma). Un vector preferido para la expresión de una proteína en una célula de mamífero es el vector pcADNHis (Invitrogen) que contiene el promotor CMV para impulsar la expresión del gen que codifica para la proteína deseada. Otros vectores que también se pueden utilizar incluye los vectores pCADN3 ó pMPSVEH. Estos vectores contienen los promotores CMV y el MPSV, respectivamente. Utilizando expresión recombinante de la proteína que va a ser sometida a prueba, dicha proteína puede ahora ser evaluada para su efecto en la señal apoptótica que es mediada por caspasa-8. Para ese fin, la apoptosis puede ser inducida ya sea por sobreexpresión de una proteína que induce apoptosis, tal como el dominio ¡ntracelular CD120a, el dominio intracelular CD95, la proteína Mort-1 , caspasa-8, o un equivalente de la misma; o bien activación de una señal apoptótica mediante el accionamiento de CD120a, CD95, TRAMP/DR3, o un receptor equivalente. Se puede lograr la activación del receptor ya sea contactando los receptores con ligando o entrecruzando receptores con anticuerpos, preferiblemente anticuerpos policlonales (véase Engelmann et al., J. Biol. Chem. 265, p. 14497-504, 1990). Aunque en general al accionar un receptor como CD120a requiere la adición de un inhibidor de síntesis de proteína como cicioheximida para lograr una señal fuerte para apoptosis, la sobreexpresión de dominios ¡ntracelulares receptores o de proteínas involucradas en la transducción de señal de apoptosis no (veáse Boldin et al., Cell 85, p. 803, 1996). La detección de apoptosis, los tiempos de incubación y otros detalles y parámetros para este ensayo han sido descritos en la referencia anterior de Boldin et al. La muerte celular en células que expresan la proteína que va a ser sometida a prueba, contra las células que no lo hacen, puede ser evaluada mediante cualquier número de métodos, tales como los métodos que se basan en la fragmentación de ADN o detección de antígenos apoptosis- específicos y epítopes, reactivos y protocolos para la detección de apoptosis en forma de equipo que están disponibles de Boehringer Mannheim y otras compañías. La muerte celular también puede ser determinada al evaluar la apariencia morfológica de las células. La muerte celular apoptótica se caracteriza por una membrana de célula ondulada y encogiendo las células en la ausencia de lisis celular. De forma conveniente, un gen reportero es expresado en la célula de mamífero, para proporcionar un marcador para la transfección exitosa. Como el procedimiento de transfección en sí resulta en cierta muerte en la célula, incluyendo la muerte de células que no han sido transfectadas, es una ventaja evaluar solamente células que han sido transfectadas. Un gen reportero preferido para este propósito es el gen lacZ, que es fácilmente detectado mediante incubación de células transfectadas con Xgal o un agente reactivo similar indicativo de beta-galactosidasa activa. Sin embargo, se puede utilizar cualquier otro gen reportero, preferiblemente un gen cuyos productos son fácilmente detectados utilizando simple reacción de color, Y cuyos resultados pueden ser evaluados utilizando un microscopio. Por ejemplo, se puede utilizar la proteína fluorescente en verde, para la detección directa sin la necesidad de reacción de color. Este gen reportero necesita el uso de un microscopio fluorescente. Por lo tanto, solamente considerando las células que han sido transfectadas, es decir, que expresan el gen reportero, y contando el porcentaje de células que demuestran una morfología apoptótica, es posible evaluar el efecto de un clon transfectado particular y la proteína expresada de ese mismo en apoptosis. Las células de mamífero son preferiblemente HeLa o células (HEK) 293-T de riñon de embrión humano. La transfección preferiblemente se realiza mediante al método de calcio fosfato como se describió en la referencia anterior Current Protocols. Si la morfología de células es evaluada debe ser de 1 a 150 horas después de la transfección, preferiblemente 4 a 35 horas y muy preferiblemente 20 horas después de la transfección.

Generación de anticuerpos Los anticuerpos policlonales pueden ser generados en conejos, pollos, ratones, ratas, borregos, o mamíferos similares. Para la generación de anticuerpos contra una proteína o péptido de la invención, la proteína o péptido es producida, como se describió anteriormente, mediante tecnología de ADN recombinante en células de mamíferos. La proteína también puede ser producida en células bacterianas o de insectos como se detalló en Current Protocols, capítulo 16. La proteína o péptido es la forma purificada de células en la cual se van a producir. Los métodos de purificación de proteínas son conocidos para los expertos en la técnica y se detallan, por ejemplo en Current Protocols in Molecular Biology, referencia anterior, Capítulo 16, y en Current Protocols ¡n Protein Science, Wiley & Sons Inc. Capítulos 5 y 6. De forma conveniente, la proteína puede ser producida como una fusión con una segunda proteína, tal como Glutatión-S-transferasa o similar, o una marca de secuencias, tal como la secuencia de marcas de histidina. El uso de fusión o proteínas marcadas simplifica la purificación del procedimiento, como se detalló en Current Protocols in Molecular Biology, referencia anterior, Capítulo 16, y las instrucciones para la expresión de proteína de marca Qiagen y el equipo de purificación. Si la proteína o péptido ha sido expresada como una proteína de fusión, es deseable cortar la pareja de fusión antes de utilizar la proteína para generación de anticuerpos, para evitar la generación de anticuerpos contra la pareja de fusión. El corte de parejas de fusión y el aislamiento de la proteína deseada se describe en Current Protocols ¡n Molecular Biology, Capítulo 16, que se indica arriba. Los vectores, protocolos y reactivos para expresar y purificar las proteínas recombinantes fusionadas a proteína de unión a maltosa también están disponibles comercialmente. Cuando se produce un péptido de la invención, sería deseable no remover la pareja de fusión, ya que la proteína de fusión puede estimular la producción de anticuerpos contra el péptído. Generalmente, esta consideración puede ser relevante cuando se generan anticuerpos a partir de péptidos que tienen menos de 50 aminoácidos en longitud. Como se indicó anteriormente, el péptido también puede ser sintetizado mediante métodos químicos conocidos en las técnica de la Química. La generación de anticuerpos policlonales contra proteínas se describe en el Capítulo 2 de Current Protocols in Immunology, Wiley and Sons Inc. La generación de anticuerpos contra péptidos puede necesitar algunos cambios en protocolo, debido a que generalmente disminuyen la antigenicidad de péptidos cuando se comparan con las proteínas. La generación de anticuerpos policlonales contra péptidos se describe en Current Protocols in Immunology, Capítulo 9, que se indica arriba. Los anticuerpos monoclonales pueden ser preparados a partir de células B tomadas del bazo o nodulos linfáticos de animales inmunizados, en particular ratas o ratones, mediante fusión con células B inmortalizadas bajo condiciones que favorecen el crecimiento de células híbridas. Para la fusión de células B de murino, es preferida la línea celular Ag-8. La técnica para generar anticuerpos monoclonales se describe en muchos artículos y libros de texto, tal como el Capítulo 2 que se indica anteriormente de Current Protocols ¡n Immunology. El Capítulo 9 describe la inmunización, con péptidos o animales. Las células del bazo o nodulos linfáticos de estos animales se pueden utilizar en la misma forma que el bazo o células de nodulos linfáticos de animales inmunizados a proteína para la generación de anticuerpos monoclonales como se describió en el Capítulo 2 de dicha referencia. Las técnicas utilizadas para generar anticuerpos monoclonales se describen además en Kohler y Milstein, Nature 256, 495-497, y en USP 4,376,110. La preparación de anticuerpos de un banco genético de anticuerpos humanos cuyas regiones muy variables de los mismos son reemplazadas por secuencias casi aleatorias, se describe en USP 5,840,479. Dichos anticuerpos son preferidos si es difícil inmunizar un animal con un péptido o proteína determinada. Algunas estructuras son reducidamente inmunogénicas y pueden mantenerse así a pesar de la adición de adyuvantes y del enlace a otras proteínas en construcciones de fusión. Se prefieren además los anticuerpos descritos en USP 5,840,479 si se desea utilizar anticuerpos con una estructura similar a los anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando los anticuerpos que son deseados tienen una baja inmunogenicidad en humanos. Una vez que se ha identificado un anticuerpo adecuado se puede desear cambiar las propiedades del mismo. Por ejemplo, un anticuerpo quimérico puede lograr rendimientos más altos en la producción. Además se desea anticuerpos quiméricos en donde las regiones constantes son reemplazadas con regiones constantes de anticuerpos humanos cuando se necesita que el anticuerpo sea de baja inmunogenicidad en humanos. La generación de anticuerpos genéricos se describe en un número de publicaciones, tales como Cabilly et al., PNAS 81 ,p.3272,1984, Morrison et al., PNAS 81 , 6851 , 1984, Boulianne et al., Nature 312, p. 643, 1984, EP 125023, EP 171496, EP 173494, EP 184187, WO 86/01533, WO 87/02671 , y Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor Laboratory, 1988. Otro tipo de anticuerpo es un anticuerpo antiidiotípico. Un anticuerpo antiidiotípico (anti-ld) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicas generalmente asociadas con el sitio de unión-antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede ser preparado inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) como la fuente de mAb al cual un anti-ld ha sido preparado. El animal inmunizado reconocerá y responderá a las determinantes idiotípicas del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo para estas determinantes ¡diotípicas (el anticuerpo anti-ld). Véase, por ejemplo, Patente EUA No. 4,699,880 que se incorpora a la presente en su totalidad por referencia.

También se puede utilizar el anticuerpo anti-ld como un "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune y de hecho otro animal, que produce el tan denominado anticuerpo anti-anti-ld. El anti-anti-ld puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-ld. Por lo tanto, utilizando anticuerpos a las determinantes idiotípicas de un mAb, es posible identificar otros clones que expresen anticuerpos de carácter específico idéntico. Por consiguiente, los mAbs generados contra la proteína que interactúa con caspasa-8, análogos, fragmentos o derivados de la misma, de la presente invención, se pueden utilizar para inducir anticuerpos anti-ld en animales adecuados, tales como ratones BALB/c. Las células del hígado de dichos ratones inmunizados se utilizan para producir hibridomas anti-ld que secretan anti-ld mAbs. Además, los anti-ld mAbs pueden ser acoplados a un portador tal como lapa hemocianina (KLH) y utilizado para inmunizar ratones BALB/c adicionales. El suero de estos ratones contendrá anticuerpos anti-anti-ld que tienen las propiedades de unión del mAb original específico para un epítope de la proteína que interactúa con caspasa-8 anterior, o análogos, fragmentos o derivados del mismo. Por lo tanto, los anti-ld mAb tiene sus propias epítopes idiotípicas, o "idiótopes" estructuralmente similares al epítope que ha sido evaluado. El término "anticuerpo" también significa que incluye tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab and F(ab')2, que son capaces de unir antígenos. Los fragmentos Fab y F(ab')2 carecen del fragmento Fe de anticuerpo intacto, se liberan más rápidamente de la circulación, y pueden tener un tejido menos no-específico que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucí. Med. 24:316-325 (1983)). Será apreciable que Fab y (F(ab')2 y otros fragmentos de los anticuerpos sean útiles en la presente invención, se pueden utilizar para la detección y cuantificación de la proteína que interactúa con caspasa-8 de acuerdo con los métodos descritos en la presente para moléculas de anticuerpos intactas. Dichos fragmentos son típicamente producidos mediante corte proteolítico, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')2. Se dice que un anticuerpo "tiene la capacidad de unirse" a una molécula si tiene la capacidad de reaccionar específicamente con la molécula para unirse a la molécula al anticuerpo. El término "epítope" significa que se refiere a esa porción de cualquier molécula que tiene la capacidad de ser unida mediante un anticuerpo mismo que puede ser también reconocido por ese mismo anticuerpo. Los epítopes o "determinantes antigénicos" generalmente consisten de agrupamientos de superficie químicamente activa de moléculas tales como cadenas de aminoácidos o laterales de azúcar y que tienen unas características estructurales tridimensionales específicas así como características de carga específicas. Un "antígeno" es una molécula o una porción de una molécula que tiene la capacidad de ser unida mediante un anticuerpo que es adicionalmente capaz de inducir a un animal a producir anticuerpos capaces de unirse a un epítope de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más de un epítope. La reacción específica que se refiere anteriormente significa que indica que el antígeno reaccionará, en forma sumamente selectiva, con su anticuerpo correspondiente y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden ser evocados por otros antígenos. Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención, pueden ser utilizados para detectar cuantitativa o cualitativamente la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 en una muestra o para detectar la presencia de células que expresen la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 de la presente invención. Esto se puede lograr mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase a continuación) acoplado con microscopio de luz citométrico de flujo , o detección fluorométrica. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden ser empleados histológicamente, como un microscopio de inmunofluorescencia o de inmunoelectrones, para la detección in situ, de la proteína que interactúa con caspasa-8 de la presente invención. La detección in situ puede ser lograda removiendo un espécimen histológico de un paciente, y proporcionar el anticuerpo marcado de la presente invención a dicho espécimen. El anticuerpo (o fragmento) preferiblemente se provee aplicando o sobretraslapando el anticuerpo marcado (o fragmento) a una muestra biológica. A través del uso de dicho procedimiento, es posible determinar no solamente la presencia de la proteína que interactúa con caspasa-8, sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la presente invención, aquellos expertos en la técnica fácilmente percibirán que cualquier variedad amplia de métodos histológicos (tales como procedimientos por marcación de tinción) pueden ser modificados para lograr dicha detección in situ. Dichos ensayos para la proteína que interactúa con caspasa-8 de la presente invención, típicamente incluyen el incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recientemente cultivadas tales como linfocitos o leucocitos, o células que han sido incubadas en cultivo de tejidos, en la presencia de un anticuerpo detectable marcado que tiene la capacidad de identificar la proteína que interactúa con caspasa-8, y detectar el anticuerpo mediante cualquier número de técnicas conocidas. La muestra biológica puede ser tratada con un soporte o vehículo de fase sólida tal como nitrocelulosa, u otro soporte sólido o vehículo que tiene la capacidad de inmovilizar células, partículas de células o proteínas solubles. El soporte o vehículo puede ser lavado con reguladores de pH adecuados seguido del tratamiento con un anticuerpo marcado de manera detectable de acuerdo con la presente invención, como se indicó arriba. El soporte o vehículo de fase sólida puede ser lavado entonces con un regulador de pH, una segunda vez, para remover el anticuerpo no unido. La cantidad de marca de unión en dicho soporte o vehículo sólido puede ser entonces detectada mediante algunos medios convencionales. Al mencionar "soporte de fase sólida", "vehículo de fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" tiene la intención de significar cualquier soporte o vehículo que tiene la capacidad de unir antígenos o anticuerpos. Los soportes o vehículos muy conocidos, incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, nylon amilasas, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser ya sea soluble en cierto grado o insoluble para los propósitos de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier posible configuración estructural siempre y cuando la molécula acoplada tenga la capacidad de unirse a un antígeno o anticuerpo. Por lo tanto, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una cuenta, cilindrica como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie externa de una varilla. Alternativamente, la superficie puede ser plana tal como una lámina o tira de pruebas, etc. Los soportes o vehículos preferidos incluyen cuentas de poliestireno. Aquellos expertos en la técnica conocerán cualquier otro vehículo adecuado para unir anticuerpos o antígenos, o tendrán la capacidad de asegurar los mismos mediante el uso de experimentación de rutina. La actividad de unión de un cierto lote de anticuerpos, de la invención como se mencionó anteriormente, puede ser determinada de acuerdo con métodos muy conocidos. Aquellos expertos en la técnica tendrán la capacidad de determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando la experimentación de rutina. Otros pasos comunes como el lavado, agitación, filtración y similares se pueden agregar a los ensayos como es habitual o necesario para cierta situación en particular. Una de las formas en las cuales un anticuerpo, de acuerdo con la presente invención puede ser marcado de manera detectable es enlazando el mismo a una enzima y utilizado en un ensayo de enzima (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando posteriormente es expuesta a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal forma para producir una porción química que puede ser detectada, por ejemplo mediante espectrofotometría, fluorometría o mediante medios visuales. Las enzimas que se pueden utilizar para marcar de manera detectable el anticuerpo incluyen, más no se limitan a, malato deshidrogenasa, nucleasa de estafilococo, delta-5-esteroide ¡somerasa, deshidrogenasa de alcohol de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, alcalino fosfatasa, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, gluco-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolin-esterasa. La detección puede ser lograda mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección también se puede realizar mediante comparación visual del grado de reacción enzimática de un sustrato en comparación con estándares similarmente preparados.

La detección se puede lograr utilizando cualquier variedad de inmunoensayos diferentes, por ejemplo, mediante marcación radioactiva de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos, es posible detectar R-PTPasa a través del uso de radio inmunoensayo (RÍA). Se puede encontrar una buena descripción de RÍA en técnicas de laboratorios y bioquímica en Laboratory Techniques and Biochemistry ¡n Molecular Biology, (Técnicas de Laboratorio y Bioquímica en Biología Molecular) por Work, T.S. et al., Holanda del Norte Publishing Company, NY (1978) con particular referencia al capítulo titulado "An introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques" ("Una Introducción a radio ¡nmunoensayo y Técnicas Relacionadas") por Chard, T., que se incorpora por referencia en la presente. El isótopo radioactivo puede ser detectado con esos medios como el uso de un contador g ó un contador de cintilación o mediante autoradiografía. También es posible marcar un anticuerpo de acuerdo con la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando el anticuerpo fluorescentemente marcado es expuesto a la luz de la propia guía o longitud de onda, su presencia puede ser entonces detectada debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcación fluorescente que se utilizan con mayor frecuencia son, fluorescein isotiocianato, rodamina, ficoeriterina, picocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina. El anticuerpo también puede ser marcado de manera detectable utilizando metales emisores de fluorescencia tales como 152E, u otros de la serie de lantánidos. Estos metales se pueden enlazar al anticuerpo utilizando dichos grupos quelatadores de metal tales como ácido dietilenetraminpentaacético (ETPA). El anticuerpo también puede ser marcado de manera detectable acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo quimioluminiscente-marcado es determinada al detectar la presencia de luminiscencia que surge durante el curso de una reacción química. Ejemplos de compuestos de marcación quimioluminiscente particularmente útiles son luminol, isoluminoi, éster teromático de acridinio, imidazol, sal de acridinio y éster de oxalato. De igual forma, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia que se encuentra en sistemas biológicos en los cuales una proteína catalítica incrementa la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminisente es determinada al detectar la presencia de luminiscencia. Los compuestos bioluminiscentes importantes para los propósitos de marcación son luciferín, luciferasa y aequorina. Una molécula de anticuerpo de la presente invención para ser adaptada para su uso en un ensayo inmunométrico, también conocido como ensayo de "dos-sitios" o "sandwich" (emparedado). En un ensayo inmunométrico típico, una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) es unido a un soporte o vehículo sólido y una cantidad de anticuerpo soluble marcado de manera detectable es agregado para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre el anticuerpo de fase sólida, antígeno y anticuerpo marcado. Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos, incluyen ensayos "directos" en donde el anticuerpo unido a la fase sólida es primero contactado con la muestra que se va a someter a prueba para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de una fase sólida binaria de complejo de antígeno-anticuerpo. Después de un período de incubación adecuado, el soporte o vehículo sólido es lavado para remover el residuo de la muestra de fluido, incluyendo el antígeno sin reaccionar, si existe, y de posteriormente se hace contacto con una solución que contiene una cantidad no conocida de anticuerpo marcado (que funciona como una "molécula reportera"). Después de un segundo período de incubación para permitir que el anticuerpo marcado forme complejo con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo no marcado, el soporte o vehículo sólido es lavado una segunda vez para remover el anticuerpo marcado sin reaccionar. En otro tipo de ensayo de "sandwich", (emparedado) que puede ser también útil con los antígenos de la presente invención se utilizan los ya denominados ensayos "simultáneos" y de "reversa". Un ensayo simultáneo involucra una simple etapa de incubación conforme el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y anticuerpo marcado son agregados ambos a la muestra que se va a someter a prueba al mismo tiempo. Después de que ha finalizado la incubación, el soporte o vehículo sólido es lavado para remover el residuo de muestra fluida y de anticuerpo marcado no complejado. La presencia de anticuerpo marcado asociada con el soporte o vehículo sólido se determina entonces como si fuera en un ensayo de sandwich (emparedado) "directo" convencional. En el ensayo "de reversa" se utiliza primero la adición por pasos de una solución de anticuerpo marcado a la muestra de fluido seguido por la adición de anticuerpo no marcado unido a un soporte o vehículo sólido después de que se utiliza un período de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, la fase sólida es lavada de forma convencional para liberarla del residuo de la muestra que se está sometiendo a prueba y la solución de anticuerpo marcado sin reaccionar. La determinación del anticuerpo marcado asociada con el soporte o vehículo sólido se determina entonces como en los ensayos "simultáneos" y "directos".

Inmunoensayos La creación de inmunoensayos tales como RÍA o ELISA, se han descrito en muchos artículos, libros de texto y otras publicaciones. Se hace referencia a WO 97/03998, p. 48, renglón 4 a p 52, línea 27. Los inmunoensayos de la invención pueden ser de dos tipos generales: primero, los ¡nmunoensayos utilizando proteína que interactúa con caspasa-8 inmovilizada, o un péptido equivalente puede ser utilizado en la cuantificación de caspasa-8. Segundo, los ¡nmunoensayos que utilizan cuerpos anticuerpos inmovilizados contra un epítope de una proteína que ¡nteractúa con caspasa-8 pueden ser utilizados para cuantificar proteínas que interactúan con caspasa-8. Dichos ensayos pueden encontrar su uso en diagnósticos, tales como el nivel de caspasa-8 y otras proteínas involucradas en trayectorias apoptóticas pueden necesitar ser evaluadas en un número de trastornos o síndromes donde es posible que se involucren dichas trayectorias. Ácidos nucleicos Se espera que los clones obtenidos en la selección de la invención sean clones parciales. Si es necesaria la obtención de clones completos, ya se ha descrito además anteriormente. La secuencia de ADN de un clon completo y del clon parcial que ¡nicialmente se encontró en la selección de la invención, puede encontrar una variedad de usos. Por ejemplo, para manipular la expresión de una proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, podría ser deseable producir un ARN antisentido en una célula. Para este fin, el ADNc completo o parcial que codifica para la proteína que interactúa con caspasa-8 es insertado en un vector de expresión que comprende un promotor, como se indica anteriormente. El extremo 3' del ADNc por lo tanto es insertado junto a el extremo 3' del promotor, con el extremo 5' del ADNc separado del extremo 3' del promotor mediante el dicho ADNc. A la expresión del ADNc en una célula, se produce por lo tanto un ARN antisentido que no tiene la capacidad de codificar para la proteína. La presencia de ARN antisentido en la célula reduce la expresión de la copia celular (genómica) del gen que interactúa con caspasa-8. Para la producción de ARN antisentido, se puede utilizar ADNc completo. Como alternativa, se puede utilizar un fragmento del mismo que es preferiblemente entre alrededor de 9 y 2000 nucleótidos de longitud, muy preferiblemente entre 15 y 500 nucleótidos y muy preferiblemente entre 30 y 150 nucleótidos. El fragmento corresponde preferiblemente a una región dentro de la mitad 5' del ADNc, más preferiblemente la región 5' que comprende la región 5' no traducida y/o la primera región del exón, y muy preferiblemente comprende el sitio de inicio de la traducción ATG. En forma alternativa, el fragmento puede corresponder únicamente una secuencia de ADN de la región 5' no traducida. Se puede usar un oligonucleótido sintético como oligonucleótido antisentido. El oligonucleótido es de preferencia un oligonucleótido de ADN. La longitud del oligonucleótido antisentido está de preferencia entre 9 y 150, más preferiblemente entre 12 y 60, y muy preferiblemente entre 15 y 50 nucleótidos. La región cubierta por el oligonucleótido antisentido comprende de preferencia la región 3' no traducida del ADNc, más preferiblemente comprende la señal de poliadenilación o el codón de detención de la traducción, o ambos. El mecanismo de acción del ARN antisentido y el estado actual de la técnica del uso de herramientas antisentido, se revisan en Kumar et al, Microbiol Mol Biol Rev. 62, p. 1415-1434, 1998. El uso de oligonucleótidos antisentido en la inhibición de la síntesis del receptor BMP, ha sido descrito por Yeh et al. J. Bone Miner Res. 13,. p. 1870-9, 1998. El uso de oligonucleótidos antisentido para inhibir la síntesis del gen Kv1.4 de los canales de potasio dependientes de voltaje, ha sido descrito por Meiri et al. PNAS 95, p. 15037-15042, 1998. El uso de oligonucleótidos antisentido para la inhibición de la síntesis de Bcl-x, ha sido descrito por Kondo et al., Oncogene 17, p. 2585-91 , 1998. El uso terapéutico de fármacos antisentido es descrito por Stix en Sci Am. 279, p. 46, 50, 1998, Flanajan, Cáncer Metástasis Rev 17, p. 169-76, 1998, Guinot y Temsamani, Pathol Biol (París) 46, p. 347-54, 1998, y referencias citadas en las mismas. Las modificaciones de oligonucleótidos que incrementan propiedades deseadas, se usan generalmente cuando se diseñan oligonucleótidos antisentido. Por ejemplo, se usan enlaces fosforotioato en lugar de los enlaces fosfoéster que ocurren naturalmente en el ADN, debido principalmente a que dichos oligonucleótidos de fosforotioato son menos susceptibles a sufrir degradación por enzimas celulares. Peng et al. describen que se pueden reducir efectos secundarios indeseables in vivo debidos a oligonucleótidos de fosforotioato cuando se usa una estructura de base mixta de fosfodiéster-fosforotioato. De preferencia, se usan modificaciones de 2'-metoxirribonucleótidos en 60% del oligonucleótido. Dichos oligonucleótidos modificados son capaces de inducir un efecto antisentido comparable al efecto observado con oligonucleótidos de fosforotioato. Peng et al. describen además que oligonucleótidos análogos incapaces de sustentar actividad de ribonucleasa H, son inactivos. Por lo tanto, el oligonucleótido antisentido preferido de la invención tiene una estructura de base mixta de fosfodiéster-fosforotioato.

Más preferiblemente, se usan modificaciones de 2'-metox¡rr¡bonucleótidos en aproximadamente 30% a 80%, más preferiblemente aproximadamente 60% del oligonucleótido. Se pueden introducir más modificaciones en un oligonucleótido antisentido. Por ejemplo, la molécula de oligonucleótido puede ser enlazada a un grupo que comprenda opcionalmente una cadena de hidrocarburo alifático parcialmente insaturada, y uno o más grupos polares o con carga, tales como grupos de ácido carboxílico, grupos éster y grupos alcohol. En forma alternativa, los oligonucleótidos pueden ser enlazados a estructuras peptídicas, las cuales son de preferencia péptidos membranotrópicos. Dicho oligonucleótido modificado penetra más fácilmente las membranas, lo cual es crítico para su función, y puede incrementar por lo tanto significativamente su actividad. La permeabilidad de la membrana es especialmente deseable para fármacos antisentido que se desea lleguen al cerebro. Oligonucleótidos enlazados a palmitilo, han sido descritos por Gerster et al. Anal Biochem 262, p. 177-84, 1998. Oligonucleótidos enlazados a geraniol han sido descritos por Shoji et al., J Drug Target 5, p. 261-73, 1998. Oligonucleótidos enlazados a péptidos, por ejemplo, péptidos membranotrópicos, y su preparación, han sido descritos por Soukchareun et al., Bioconjug Chem 9, p. 466-75, 1998. Las modificaciones de moléculas antisentido u otros fármacos que dirigen la molécula hacia ciertas células e incrementan la captación del oligonucleótido por dichas células, son descritas por Wang, J. Controlled Reléase 53, p. 39-48, 1998.

Ribozimas Dada la secuencia conocida del ARN mensajero de un gen, se pueden diseñar ribozimas, las cuales son moléculas de ARN que se unen a, y cortan específicamente, dicha secuencia de ARN mensajero (véase, por ejemplo, Chem et al., Ann. NY Acad. Sci. 660, 271-3, 1992, Zhao y Pick, Nature 365, p. 448, 1993, Shore et al., Oncogene 8, 3183, 1993, Joseph y Burke, J. Biol. Chem. 268, 24515, 1993, Shimayama et al., Nucleic Acids Symp Ser 29, p. 177, 1993, Cantor et al., PNAS 90, p. 10932, 1993). Por consiguiente, se pueden diseñar secuencias de ARN que codifiquen para ribozima que corten el ARN mensajero de una proteína que ¡nteractúa con la caspasa-8 de la invención. El punto de corte se localiza preferiblemente en la región de codificación o en la región 5' no traducida, más preferiblemente, en la parte 5' de la región de codificación cerca del codón de inicio de la traducción AUG. Un ADN que codifica para una ribozima de conformidad con la invención puede ser introducido en células mediante captación de ADN, captación de ADN modificado (véase modificaciones para oligonucleótidos y proteínas que dan como resultado permeabilidad mejorada de la membrana, como se describe más adelante), o transferencia de genes mediada por vectores virales, como se detalla más adelante.

Introducción de proteínas, péptidos y ADN que ¡nteractúan con la caspasa-8 en células La presente invención provee proteínas, péptidos derivados de las mismas, moléculas de ADN antisentido y oligonucleótidos que interactúan con la caspasa-8. Un uso terapéutico o asociado a investigación de estas herramientas, requiere su introducción en células de un organismo vivo. Para este propósito, se desea mejorar la permeabilidad de la membrana a péptidos, proteínas y oligonucleótidos. Formas de mejorar la permeabilidad de la membrana a oligonucleótidos, se describieron ya anteriormente. El mismo principio, a saber, derivación con estructuras lipófilas, se puede usar también para crear péptidos y proteínas con permeabilidad mejorada a la membrana. Por ejemplo, la secuencia de un péptido membranotrópico conocido como se describió anteriormente, se puede añadir a la secuencia de la proteína o péptido. Además, el péptido o proteína se puede derivar mediante estructuras parcialmente lipófilas, tales como las cadenas de hidrocarburo descritas anteriormente, las cuales son sustituidas con por lo menos un grupo polar o con carga. Por ejemplo, derivados de lauroilo de péptidos han sido descritos por Muranishi et al., Pharm. Research 8, 649, 1991. Otras modificaciones de péptidos y proteínas comprenden la oxidación de residuos de metionina para crear de esta manera grupos sulfóxido, como es descrito por Zacharia et al., Eur. J. Pharmacol, 203, p. 353, 1991. Zacharia y colaboradores describen también péptidos o derivados, en donde el enlace peptídico relativamente hidrófobo es reemplazado por su isoéster de cetometileno (COCH2). Estas y otras modificaciones conocidas por los expertos en la técnica de química de proteínas y péptidos, incrementan la permeabilidad de la membrana. Otra forma de incrementar la permeabilidad de la membrana es el uso de receptores tales como receptores virales sobre superficies celulares para inducir la captación celular del péptido o proteína. Este mecanismo es usado con frecuencia por virus, los cuales se unen específicamente a ciertas moléculas de superficie celular. Después de la unión, la célula lleva al virus hacia su interior. La molécula de superficie celular es denominada receptor viral. Por ejemplo, las moléculas de integrina CAR y AdV han sido descritas como receptores virales para adenovirus; véase Hemmi et al., Hum Gene Ther 9, p. 2363-73, 1998, y referencias citadas en la misma. Las moléculas CD4, GPR1 , GPR15 y STRL33, han sido identificadas como receptores/correceptores para VIH; véase, por ejemplo, Edinger et al. Virology. 249, p. 367-78, 1998, y referencias citadas en la misma. Por lo tanto, la conjugación de péptidos, proteínas u oligonucleótidos con moléculas que se sabe se unen a receptores de superficie celular, incrementará la permeabilidad de la membrana a dichos péptidos, proteínas u oligonucleótidos. Ejemplos de grupos adecuados para formar conjugados son azúcares, vitaminas, hormonas, citocinas, transferrina, asialoglucoproteína, y moléculas similares. Low et al., USP 5,108,921 , describen el uso de estas moléculas con el propósito de incrementar la permeabilidad de la membrana a péptidos, proteínas y oligonucleótidos, así como la preparación de dichos conjugados. Low y colaboradores describen además que moléculas tales como foliato o biotina se pueden usar para dirigir el conjugado hacia una multitud de células en un organismo, debido a la expresión abundante y no específica de los receptores para estas moléculas. El uso descrito anteriormente de las proteínas de superficie celular para incrementar la permeabilidad de la membrana a un péptido, proteína u oligonucleótido de la invención, se puede usar también para dirigir dicho péptido, proteína u oligonucleótido de la invención hacia ciertos tipos de células o tejidos. Por ejemplo, si se desea dirigir células cancerosas, es preferible usar una proteína de superficie celular que sea expresada más abundantemente sobre la superficie de dichas células. Ejemplos son el receptor de foliato, los antígenos de mucina MUC1 , MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B y MUC7, los antígenos de glucoproteína KSA, antígeno carcinoembrionario, antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), HER-2/neu, y gonadotropina beta coriónica humana. La cita de Wang et al., 1998, descrita anteriormente, describe el uso de foliato para dirigir células cancerosas, y Zhang et al. Clin Cáncer Res 4, p. 2669-76 1998, describen la abundancia relativa de cada de uno de otros antígenos descritos anteriormente en varios tipos de células cancerosas y en células normales.

La proteína, péptido u oligonucleótido de la invención puede ser dirigido, por lo tanto, usando las técnicas de conjugación descritas anteriormente, hacia ciertos tipos de células, según se desee. Por ejemplo, si se desea incrementar la apoptosis en células del linaje linfocítico, una proteína o péptido de modulación positiva de la caspasa-8 puede ser dirigido hacia dichas células, por ejemplo, mediante el uso de moléculas MHC de clase II que sean expresadas en dichas células. Esto se puede lograr acoplando un anticuerpo, o el sitio de unión a antígeno del mismo, dirigido contra la región constante de dicha molécula MCH de clase II hacia la proteína o péptido de la invención. Además, se han descrito numerosos receptores de superficie celular para varias citocinas y otras moléculas de comunicación celular, y muchas de estas moléculas son expresadas en forma más o menos restringida en el tipo de célula o tejido. De esta manera, cuando se desea dirigir un subgrupo de células T, se puede usar la molécula de superficie celular CD4 T para producir el conjugado de la invención. Las moléculas de unión CD4 son provistas por el VIH, cuyo antígeno de superficie gp42 es capaz de unirse específicamente a la molécula CD4. Una proteína o péptido de la invención que incremente la apoptosis y que interactúe con la caspasa-8, puede ser dirigido ventajosamente hacia las células T en el tratamiento de pacientes que sufren de reacciones autoinmunes basadas en células T, tales como pacientes con lupus eritematoso.

Localización celular mediada por virus Las proteínas, péptidos y secuencias antisentido de la invención pueden ser introducidos en células mediante el uso de un vector viral. El uso del vector de vaccinia para este propósito se detalla en el capítulo 16 de la cita Current Protocols in Molecular Biology, descrita anteriormente. El uso de vectores de adenovirus ha sido descrito, por ejemplo, por Teoh et al., Blood 92, p. 4591-4601 , 1998, Narumi et al., Am J Respir Cell Mol Biol 19, p. 936-941 , 1998, Pederson et al, J Gastrointest Surg 2, p. 283-91, 1998, Guang-Lin et al., Transplant Proc 30, p. 2923-4, 1998, y referencias citadas en las mismas, Nishida et al., Spine 23, p. 2437-42, 1998, Schwarzenberger et al., J Immunol 161 , p. 6383-9, 1998, y Cao et al., J Immunol 161 , p. 6238-44, 1998. La transferencia retroviral de secuencias antisentido ha sido descrita por Daniel et al., J Biomed Sci. 5, p. 383-94, 1998. Cuando se usan virus como vectores, las proteínas de superficie viral se usan generalmente para dirigir al virus. En vista de que muchos virus, tales como los adenovirus anteriores, son más bien no específicos en su tropismo celular, puede ser deseable impartir carácter específico adicional mediante el uso de un promotor específico de tejidos o de tipo celular. Griscelli et al., Hum Gene Ther. 9, p. 1919-28, 1998, describen el uso del promotor de la cadena ligera 2 de miosina cardíaca específica del ventrículo, para dirigir un gen específico del corazón, cuya transferencia es mediada por adenovirus. En forma alternativa, el vector viral puede ser diseñado para expresar una proteína adicional sobre su superficie, o la proteína de superficie del vector viral puede ser modificada para incorporar una secuencia peptídica deseada. El vector viral puede ser diseñado de esta manera para expresar uno o más epítopes adicionales los cuales se pueden usar para dirigir dicho vector viral. Por ejemplo, se pueden usar epítopes de citocina, péptidos de unión a MHC de clase II, o epítopes derivados de moléculas mensajeras para dirigir al vector viral de acuerdo con las enseñanzas de la invención.

Aplicaciones de las herramientas descritas anteriormente Las proteínas de la invención que interactúan con la caspasa-8, interactúan específicamente con las subunidades de la caspasa-8 que intervienen en la actividad proteolítica de la misma. Sin desear que sea limitado por la teoría, los inventores piensan que las proteínas de la invención que interactúan con la caspasa-8 son elementos "hacia el extremo 3'" en la vía de señalización que implica a la caspasa-8. Los agentes hacia el extremo 5' parecen unirse a través del prodominio de la caspasa-8, el cual media el dominio de interacción de proteína-proteína. Parece ser que una interferencia extensiva con numerosos agentes que dirigen la respuesta apoptótica, puede ser mediada por interacciones de proteína-proteína que implican al dominio efector de muerte (DED) y dominios relacionados, tales como los dominios localizados en el prodominio de la caspasa-8. Contrariamente a estas proteínas, las proteínas de la presente invención que interactúan con la caspasa-8 pueden estar entre los ejecutores directos del proceso de muerte celular. Por ejemplo, Tip-60, una de las proteínas de la invención que interactúan con la caspasa-8, es una enzima histona desacetilasa. Por lo tanto, la proteína puede intervenir directamente en el cambio de la estructura de la cromatina. La interacción de las proteínas de la invención con la caspasa-8, tiene varias consecuencias posibles: en primer término, la modulación de la actividad de la caspasa-8. Esto se demuestra en la presente en una prueba ¡n vivo, en donde el clon J2 de la invención inhibe la apoptosis mediada por la caspasa-8. En segundo término, una proteína que interactúa con la caspasa-8 puede incrementar la actividad de la caspasa-8 evitando la degradación de la misma, o disminuyendo su actividad al funcionar como inhibidor. En tercer término, la actividad de la proteína que interactúa con la caspasa-8 puede ser modulada. Esto se demuestra en la presente mediante la capacidad de la caspasa-8 para cortar las proteínas que interactúan con la misma. Es probable que algunas de estas proteínas sean inactivadas por el corte. Sin embargo, también es posible que la actividad de las proteínas sea modificada, que sean inducidas actividades novedosas, o que la proteína que interactúa con la caspasa-8 sea activada por el corte, tal como ocurre en las caspasas mismas. Por consiguiente, las proteínas, los péptidos, oligonucleótidos y anticuerpos de la invención que interactúan con la caspasa-8, son útiles para modular la actividad de la caspasa-8. La submodulación de la caspasa-8 es deseable en casos en donde ocurre muerte celular excesiva por apoptosis, por ejemplo, en esclerosis múltiple con oligodendrogliopatía primaria, uveoretinitis autoinmune, diabetes, lupus, miocarditis autoinmune I, insuficiencia hepática aguda sin importar su etiología, hepatitis crónica mediada por HCV, gastritis crónica, por ejemplo, gastritis tipo A, enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD), enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa; se ha sugerido que la destrucción del tejido corporal es causada por señales apoptóticas. Por lo tanto, puede ser benéfico para pacientes que sufren de estas enfermedades, submodular la actividad de la caspasa-8 en aquellas células que son destruidas por muerte celular apoptótica. Por ejemplo, en la oligodendropatía anterior, es deseable inhibir la actividad de la caspasa-8 en oligondendrocitos. El receptor de ácido lisofosfatídico-fosfolípidos acoplado a la proteína G de superficie celular, es expresado en oligodendrocitos y en varias otras células del cerebro, pero no en otros tejidos del cuerpo. Por lo tanto, un péptido o proteína de la invención es dirigido hacia esas células. Esto se puede lograr acoplando dicho péptido o proteína al ácido lisofosfatídico-fosfolípidos, o introduciendo la secuencia de un anticuerpo que reconozca específicamente a dicho receptor de ácido lisofosfatídico-fosfolípidos en un vector viral, de modo que dicho vector viral se una específicamente a dicho receptor de ácido lisofosfatídico-fosfolípidos. En forma similar, los péptidos o proteínas de la invención pueden ser dirigidos hacia otro tipo celular involucrado en otras enfermedades descritas anteriormente y otras enfermedades en donde se ha demostrado que un exceso de muerte celular apoptótica media el daño en el tejido corporal observado. Del mismo modo, el ARN antisentido, oligonucleótido antisentido y la ribozima de la invención, pueden ser dirigidos en forma similar hacia los oligodendrocitos anteriores, o células correspondientes en otras enfermedades. En ese caso, la expresión de las proteínas que interactúan con la caspasa-8 es inhibida, más que la expresión de la caspasa-8 misma. La inhibición de la expresión de un número de proteínas que interactúan con la caspasa-8 puede disminuir el efecto apoptótico de la caspasa-8. Sin embargo, la disminución de la expresión de ciertas proteínas que interactúan con la caspasa-8 puede incrementar en realidad el efecto de la caspasa-8, ya que ciertas proteínas que interactúan con la caspasa-8 son capaces de actuar como un regulador negativo de la actividad de la caspasa-8. Por lo tanto, se debe poner a prueba primero el efecto de usar oligonucleótidos antisentido y ARN antisentido y ribozimas, por ejemplo, en la prueba in vivo descrita anteriormente, antes de que dichos agentes sean considerados para tratamiento. Por otra parte, existen ciertas situaciones en donde puede ser deseable incrementar la actividad de la caspasa-8. Este puede ser el caso en la misma enfermedad como se describió anteriormente, por ejemplo, en el lupus eritematoso sistémico. Sin embargo, los tipos de células que serán dirigidos son diferentes. Por ejemplo, en el lupus, la población de células puede contener células autorreactivas que no son destruidas en el timo. Por lo tanto, el agente que sobremodula a la caspasa-8 de la invención debe ser dirigido hacia las células. Es preferible dirigir el agente que sobremodula a la caspasa-8 hacia las células autorreactivas. En algunas enfermedades tales como la esclerosis múltiple, se piensa que ciertos clones de células T desempeñan una función crítica en el desarrollo de la enfermedad. El agente que sobremodula a la caspasa-8 de conformidad con la invención puede ser por lo tanto dirigido hacia dichas células, mediante el uso de uno o más anticuerpos dirigidos específicamente a la región variable del receptor de células T de los clones de células T autorreactivas, para dirigir al agente que sobremodula a la caspasa-8 de la invención, el cual puede ser una proteína o un péptido que interactúa con la caspasa-8 de conformidad con la invención. En vista de lo anterior, la presente invención abarca preparaciones farmacéuticas que comprenden una sustancia activa que comprende uno o más de una proteína, un péptido, un anticuerpo, una ribozima, ARN antisentido u oligonucleótido antisentido que interactúa con la caspasa-8 de conformidad con la invención. La invención abarca además una composición farmacéutica que comprende un vector viral capaz de infectar a células de mamífero, en donde dicho vector comprende un promotor enlazado operablemente y una secuencia de ADN de la invención que codifica para una proteína o péptido, una ribozima, un ARN antisentido, un oligonucleótido antisentido o un anticuerpo que interactúa con la caspasa-8 de conformidad con la invención. El vector viral puede comprender opcionalmente una secuencia de codificación enlazada operablemente a un promotor que codifica para un péptido o proteína localizado sobre la superficie del virus, y el cual es capaz de unirse a una proteína de superficie de una célula de mamífero. La proteína de superficie es preferiblemente una proteína que permite la captación del vector viral, y es expresada preferiblemente en una forma específica del tipo de célula o tejido, para permitir la localización del vector viral. La proteína que ¡nteractúa con la caspasa-8, así como sus análogos, fragmentos o derivados, se pueden usar también para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, es decir, aquellas que se unen a la caspasa-8 o a proteasas o proteínas funcionalmente relacionadas que intervienen en el proceso de señalización intracelular. En esta solicitud, se puede usar el sistema de dos híbridos de levadura descrito anteriormente, o se puede usar un sistema recién desarrollado que utiliza hibridación Southern no estricta seguida de clonación mediante PCR (Wilks et al., 1989). En la publicación de Wilks et al., se describe la identificación y clonación de dos proteína-tirosina cinasas putativas mediante la aplicación de hibridación Southern no estricta, seguido de clonación mediante PCR con base en la secuencia conocida del motivo de cinasa, una secuencia de cinasa concebida. Este procedimiento se puede usar de conformidad con la presente invención, usando la secuencia de la proteína que interactúa con la caspasa-8 para identificar y clonar aquellas proteínas relacionadas que interactúan con la caspasa-8.

Otro procedimiento para utilizar la proteína que ¡nteractúa con la caspasa-8, o sus análogos, fragmentos o derivados de la misma de la invención, es usarlos en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores a los cuales son capaces de unirse, por ejemplo, otras proteínas o factores que intervengan en el proceso de señalización intracelular. En esta solicitud, la proteína que interactúa con la caspasa-8, así como sus análogos, fragmentos o derivados de la presente invención, se pueden unir individualmente a matrices de cromatografía de afinidad y entonces se pueden poner en contacto con extractos de células o proteínas o factores aislados que se piensa intervienen en el proceso de señalización intracelular. Siguiendo el procedimiento de cromatografía de afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a la proteína que interactúa con la caspasa-8, o sus análogos, fragmentos o derivados de la misma de la invención, pueden ser eluídos, aislados y caracterizados. Como se describió anteriormente, la proteína que interactúa con la caspasa-8, o sus análogos, fragmentos o derivados de la misma de la invención, se pueden usar también como inmunógenos (antígenos) para producir anticuerpos específicos para la misma. Estos anticuerpos se pueden usar también con el propósito de purificar la proteína que interactúa con la caspasa-8 (por ejemplo, N-acetil-glucosamina-6-fosfato desacetilasa de humano o cualquiera de sus isoformas), ya sea a partir de extractos de células o a partir de líneas de células transformadas que producen la proteína que interactúa con la caspasa-8, o sus análogos o fragmentos. Además, estos anticuerpos se pueden usar con propósitos de diagnóstico para identificar trastornos relacionados al funcionamiento anormal del ligando FAS-R o sistema del FNT mediados por la caspasa-8. De esta manera, si dichos trastornos se relacionan con un mal funcionamiento del sistema de señalización intracelular que implica a la proteína caspasa-8, o una proteína que interactúa con la caspasa-8, dichos anticuerpos servirían como una herramienta de diagnóstico importante. Debe observarse también que el aislamiento, identificación y caracterización de la proteína que interactúa con la caspasa-8 de la invención se pueden llevar a cabo usando cualquiera de los procedimientos de selección estándar bien conocidos. Por ejemplo, uno de estos procedimientos de selección, el procedimiento de dos híbridos de levadura como se describe más adelante en la presente, se usó para identificar a la proteína caspasa-8 (véase Stanger et al. 1995), y subsecuentemente las diferentes proteínas que interactúan con la caspasa-8 de la invención (además de varias otras nuevas proteínas de las solicitudes de patente copendientes y coasignadas descritas anteriormente y que se describen más adelante). Asimismo, como se describió anteriormente y como se describe más adelante, se pueden utilizar otros procedimientos tales como cromatografía de afinidad, procedimientos de hibridación de ADN, etc., como es bien sabido en la técnica, para aislar, identificar y caracterizar la proteína que interactúa con la caspasa-8 de la invención, o para aislar, identificar y caracterizar otras proteínas, factores, receptores, etc., los cuales son capaces de unirse a las proteínas que interactúan con la caspasa-8 de la invención.

EJEMPLO IA Selección de dos híbridos para la identificación de proteínas que interactúan con la caspasa-8 Se usó un sistema modificado de dos híbridos de levadura descrito como "sistema de tres híbridos de levadura" (Tirode F. et al. 1997) para seleccionar proteínas que interactúan con la caspasa-8 y sus substratos potenciales. Los vectores individuales, cepas de levadura y genotecas usados, fueron obtenidos de Clontech (Palo Alto, E.U.A.), como componentes del sistema de dos híbridos Matchmaker (#PT1265-1 ). Las dos subunidades de caspasa-8 fueron expresadas separadamente bajo el control de diferentes promotores. La subunidad p10 corta (serina 375 a ácido aspártico 479), fue clonada en el vector pGBT9 (Clontech) en marco con el dominio de unión de ADN de la proteína Gal4 de levadura (aminoácidos 1 a 147, números de secuencia de acuerdo con Laughon et al., Molecular and Cellular Biology, 4, 260-267, 1984). La subunidad p20 activa y larga (serina 217 a ácido aspártico 374), fue mutada en la posición 360, es decir, la cisteína presente en esa posición fue cambiada por una serina (C360S), haciendo inactiva la actividad de proteasa de la enzima. La subunidad p20 mutada de C360S fue expresada como proteína no fusionada bajo el control del promotor Met25, el cual es regulado positivamente en medio que carece de metionina (Sangsoda, Mol Gen Genet. 200, p. 407-14, 1985). La posibilidad de controlar la actividad del promotor que dirige la expresión de la subunidad p20, ajustando la concentración de metionina en el medio de crecimiento de células de levadura, hace posible (1 ) usar subunidades de proteína tóxica como cebo, y (2) controlar la dependencia de la interacción de proteína-proteína en el tercer miembro, es decir, la subunidad p20. Las unidades que expresan a p10 y p20 se pueden localizar en diferentes vectores. Se pueden localizar también en el mismo vector. En el ejemplo descrito actualmente, se usó el vector pGBT9 modificado, pGBT9-3H (véase la cita anterior de Tirode et al.). La subunidad p20 es expresada preferiblemente como una fusión con una señal de localización nuclear. Después de la expresión, en ausencia de metionina, las dos subunidades de asocian entre sí en la célula de levadura. La asociación de las dos subunidades fue demostrada mediante coinmunoprecipitación y experimentos de Western Blot. Una genoteca de ADNc de células B clonada en el vector pGAD GH (Durfee et al., Genes Dev 7, 555-569), fue un obsequio del Dr. S. Elledge. El vector contiene el dominio de activación de GAI4 (aminoácidos 768-881). Este dominio de activación de GAL4 es suficiente cuando se fusiona al dominio de unión de ADN de GAL4 para inducir actividad de transcripción sustancial del gen de GAL4; véase Ma y Ptashne, Cell, 48, 847-853 (1987).

El sitio de activación hacia el extremo 5' de GAL (UAS.sub.G), como es descrito por Keegan et al. (1986), citado anteriormente, está presente en la región hacia el extremo 5' de un gen reportero (lacZ) y de un gen que permite la selección (His) en las cepas de levadura HF7c obtenidas de Clontech. Un cultivo de HF7c fue transformado mediante los plásmidos anteriores que contienen a la caspasa-8 y células de levadura transformantes seleccionadas mediante crecimiento en medio de selección, como es descrito en protocolos de levaduras de Clontech, es decir, careciendo de triptófano, leucina, metionina y tirosina. Se añadió opcionalmente homoserina a 80 mg/l. Un cultivo de dichos transformantes fue transformado entonces adicionalmente con la genoteca de células B que contiene al vector, seguido de siembra en el medio anterior que carece de histidina (medio de selección). Opcionalmente, el medio de selección fue complementado con 3 aminotriazol, el cual es un inhibidor de la enzima histamina sintetasa. La adición del inhibidor sirve para controlar la fuga del promotor que dirige a este gen de histidina en células de levadura que no contienen proteínas que interactúan con la caspasa-8. En algunos casos, una interacción débil y no específica puede conducir a transcripción falsa a partir del promotor Gal4-UAG-his, llevando a clones de levadura que crecen en medio de selección. Los transformantes que crecen en medio de selección fueron seleccionados, y los plásmidos de ADN del mismo fueron extraídos. El ADN fue transformado entonces en bacterias HB101 que permiten la selección en medio que carece de leucina. Después de cultivar las bacterias y de extraer y purificar el ADN plasmídico de las mismas, el plásmido de ADN fue transformado entonces en células de levadura SFY526. La actividad de lacZ de transformantes SFY526 fue puesta a prueba entonces mediante siembra en medio de selección que incluía histidina y que contenía Xgal. Las colonias de levadura fueron levantadas entonces usando un papel filtro No. 50 3MM Whatman (para una descripción del levantamiento de colonias, véase la cita de Sambrook et al. anterior), colocadas entonces durante aproximadamente 20 segundos en papel aluminio, transferidas durante aproximadamente 25 segundos a nitrógeno líquido para congelar las células de levadura, expuestas durante aproximadamente 1 minuto a temperatura ambiente para descongelas las células de levadura, colocadas en caja de Petri sobre un papel filtro No. 1 3MM Whatmann, el cual fue sumergido previamente en regulador de pH Z (regulador de pH de reacción de beta-galactosidasa; véase, por ejemplo, los protocolos de Clontech, la cita de Sambrook et al., anterior, o la cita Current Protocols in Molecular Biology), conteniendo Xgal y beta-mercaptoetanol. La aparición de color azul en las colonias es una indicación de beta-galactosidasa activa. Las proteínas que interactúan con la caspasa-8 desarrollan usualmente color azul en esta prueba dentro de minutos a durante la noche, de preferencia dentro de 5 minutos a 3 horas, y más preferiblemente dentro de 5 minutos y 1 hora. En forma alternativa, se cuantificó la actividad de beta-galactosidasa mediante cultivo líquido en medio que contiene Xgal, removiendo las células mediante centrifugación, y midiendo la absorbancia del medio usando un espectrofotómetro. Los clones de ADNc identificados en el procedimiento de selección anterior, fueron puestos a prueba entonces adicionalmente para su interacción con otras proteínas. Esto se llevó a cabo transformando los clones que serían puestos a prueba junto con una proteína no relevante expresada como una fusión con un domino de activación de ADN en el vector pGAD GH. Los transformantes dobles que son capaces de crecer en medio que carece de histidina o demostrar actividad de lacZ, indicaron que el clon de la genoteca se une en forma no específica. Como proteínas no relevantes, se usaron proteínas que se sabe son "pegajosas", es decir, que interactúan no específicamente con otras proteínas, así como también otras proteínas no relacionadas. Por ejemplo, las proteínas fueron puestas a prueba para su unión a lamina, RIP, RAIDD, TRAF2 y MORTI. En general, se descartaron proteínas de unión a lamina. La prueba de tres híbridos anterior también se llevó a cabo con la subunidad p10 de la caspasa-8 fusionada al dominio de unión de ADN lexA.

Un vector preferido es el vector pLexA, disponible de Clontech. Cuando se usa lexA como dominio de unión de ADN, se debe usar la cepa de levaduras L40 o su equivalente. Proteínas que ¡nteractúan con la caspasa-8 fueron identificadas en el método de selección descrito anteriormente, y analizadas posteriormente usando pruebas de corte in vivo e in vitro y pruebas de transducción de señal, como se describe más adelante.

EJEMPLO IB Cebo modificado para selección de dos híbridos para la identificación de proteínas que interactúan con la caspasa-8 Un cebo de caspasa-8 modificado se usó para seleccionar proteínas que interactúan con la caspasa-8 con el sistema de dos híbridos de levadura (Fields y Song, 1989). La caspasa-8 fue expresada a partir del vector cebo pGBT9 (Clontech) como una proteína de cadena sencilla. Para crear una proteína cebo que asemejara la conformación de la caspasa activa, el prodominio fue removido, y la subunidad pequeña 2 (partiendo de la serina 375 y terminando en el ácido aspártico 479), fue fusionada al dominio de unión de ADN de Gal4. El C-terminal de la subunidad pequeña fue separado del N-terminal de la subunidad grande 1 (partiendo de la serina 217 y terminando en el ácido aspártico 374) mediante un enlazador de glicina-serina de 16 aminoácidos (GGGGSGGGGSGGGGSG). Las dos subunidades de la caspasa activa se derivan de esta manera del plegamiento espontáneo de una molécula. La cisteína del sitio activo en la subunidad 1 fue mutada por serina (sub 1 C360S). Se demostró que la sobreexpresión de esta caspasa-8 de cadena sencilla es funcionalmente similar a la sobreexpresión de la caspasa-8 de tipo silvestre, determinada mediante su capacidad para inducir apoptosis en células HEK 293-T, cuando fue sobreexpresada a partir del vector pcADNHis similar a caspasa-8. La actividad de la caspasa-8 de cadena sencilla puede ser bloqueada mediante la coexpresión de p35, el cual es un inhibidor de caspasa. La selección de dos híbridos se llevó a cabo como se describió anteriormente, excepto que la caspasa-8 de cadena sencilla descrita anteriormente fue expresada a partir del vector pGBT9 (Clontech).

EJEMPLO 2 Identificación de proteínas que interactúan con la caspasa-8 Usando la selección de dos híbridos modificados descritos en el ejemplo IA, se identificaron varios clones que codifican para proteínas de unión específica a la caspasa-8. El carácter específico de la unión de los clones se confirmó en la prueba de dos híbridos de levadura, mientras que no se detectó unión a proteínas control. Los clones de ADNc seleccionados fueron aislados y secuenciados, y la secuencia de nucleótidos se comparó con la encontrada en el banco de genes, como se describe más adelante.

EJEMPLO 2.1 Se encontró que el clon L1 contiene una secuencia de ADNc parcial idéntica a los aminoácidos 690-750 de Stat 1. Statl fue identificado como un factor de transcripción que se une al elemento de respuesta estimulada por ¡nterferón (ISRE) y al elemento de secuencia activada gamma (GAS) (para una revisión, véase Ifflc SN, 1998). Recientemente, se ha demostrado que Stat 1 interviene en la regulación de niveles constitutivos de caspasa (Kuiner et al. 1997), y que funciona como un substrato in vitro para la caspasa-3 (King P. et al 1998). Se sugirió que el corte de Stat 1 puede desempeñar una función en la regulación de la respuesta apoptótica misma.

EJEMPLO 2.2 Se encontró que el clon L7 codifica para un ADNc parcial que iguala casi por completo la parte C-terminal de un clon EST presente en el banco de genes al que no se atribuyó función alguna (número de acceso AA608733).

EJEMPLO 2.3 Se encontró que el clon L20 es idéntico a los aminoácidos 104-420 de NEFA (número de acceso 462693). NEFA es una proteína novedosa que contiene un dominio de unión de ADN putativo de aminoácidos básicos con una señal de localización nuclear potencial, dos regiones de motivo de hélice-bucle-hélice (HLH), motivos de dominio concurrentemente EF, una región rica en aminoácidos ácidos entre los motivos de dominio EF, y un motivo en cremallera de leucina (Barnikol-Watanabe et al. 1994). Se encontró también que NEFA es una proteína de unión a calcio, y se encontró que está localizada dentro del citoplasma y sobre la superficie celular, y que también puede ser detectada en el medio de cultivo. NEFA pertenece a la subfamilia nucleobindin. Sin embargo, aún no se ha aclarado su función biológica. El clon L20 es cortado por la caspasa-8 in-vitro e in-vivo.

EJEMPLO 2.4 Se encontró que el clon L12 codifica para un ADNc parcial el cual se aparea casi por completo con un clon EST de humano presente en la base de datos (número de acceso M62097). El clon L12 es cortado in vitro por la caspasa-8, como se muestra mediante una prueba de proteasa in vitro. Por poco tiempo, la proteína marcada con 35S sintetizada in vitro fue incubada durante 30 a 60 minutos en regulador de pH de proteasa en presencia de caspasa-8 producida por bacterias. Las proteínas y sus fragmentos fueron separados sobre SDS-PAGE, y los resultados fueron visualizados mediante autorradiografía o fosfoformación de imágenes. La actividad de proteasa pudo ser bloqueada por el inhibidor de pancaspasa específico z-VAD-fluorometilcetona.

EJEMPLO 2.5 Se encontró que el clon L5 codifica para un ADNc idéntico a la proteína TipdO (número de acceso 3024755). La proteína Tip60 (proteína que interactúa con Tat, de 60 kDa) fue descrita primero como una proteína de interacción con el transactivador Tat de VIH celular (Kamine et al., Virology 216, 357-366, 1996), y se demostró después que exhibe actividad de histona acetiltransferasa (Yamamoto y Horikoski), 1997). Mas allá de su capacidad para incrementar la activación del promotor de VIH mediada por Tat, queda aún por definir la función biológica de Tip60. En la prueba de 2-híbridos de levadura, se encontró que el clon L5 se une a la subunidad 2 de la caspasa-8 sola, así como también al complejo p10-p20. El clon L5 fue cortado in vitro por la caspasa-8 en la prueba de proteasa in vitro descrita en el ejemplo 2.4. La proteína Tip60 fue cortada también en una forma dependiente de la caspasa después de cosobreexpresión junto con el receptor de FNT p55 en células HeLa y HEK 293-T. Fue cortada también en células HeLa después del tratamiento del FNT aun en ausencia de inhibidores de síntesis de proteínas. Por poco tiempo, la proteína fue clonada en el vector pcADNHis (Invitrogen) y expresada en células HEK 293-T o HeLa junto con la proteína inductora de apoptosis (por ejemplo, p55FNT-R o caspasa-8). Veinticuatro horas después de la transfección, las células fueron cosechadas, y lisados completos de células de 0.5-1x106 células fueron aplicados a SDS-PAGE y Western Blot subsecuente con anticuerpos anti poly-His (Sigma). Los resultados fueron visualizados mediante ECL. Se aislaron varios clones de ADNc que codifican para insertos que se aparean con la proteína TipdO. Se encontró que todos los clones, incluyendo el clon de "longitud total de tipo silvestre" de T¡p60 carece de un segmento que se extiende del aminoácido 94 (prolina) al aminoácido 145 (treonina). Esta sección de la proteína no forma parte del sito activo de acetilasa, y no se considera como esencial para el funcionamiento de la proteína. Se encontró que no es digerible un mutante de Tip60 en donde los residuos de ácido aspártico en las posiciones 200 y 203 fueron remplazados por residuos de alanina.

EJEMPLO 2.6 Se encontró que el clon M26 codifica para un ADNc parcial que se aparea casi por completo con un clon EST de humano presente en el banco de genes (número de acceso C18037). En la prueba de dos híbridos de levadura, se encontró que el clon M26 se une a la subunidad 2 de la caspasa- 8 sola.

EJEMPLO 3 Aislamiento de proteínas que interactúan con la caspasa-8 Usando la selección de 2 híbridos descrita en el ejemplo IB, se identificaron varios clones adicionales que codifican para proteínas específicas de unión a caspasa-8. Los clones de ADNc fueron aislados y secuenciados, y la secuencia de nucleótidos se comparó con la presente en el banco de genes, según se describe más adelante. Se seleccionaron una genoteca de células B (Durfee T et al., 1993) y una genoteca de células T Jurkat. El cuadro 2 muestra la caracterización inicial del primer grupo de clones.

CUADRO 2 in vivo: Células 293-T y/o HeLa.

Los clones parciales que codifican para partes de NEFA, así como también el clon B8.1 , fueron aislados también mediante el método de dos híbridos de levadura descrito en el ejemplo IA.

EJEMPLO 3.1 Clones B4 (número de acceso 3327044), B17 (número de acceso H23509), B27 (número de acceso AA936350) y J40 (número de acceso 2887413) que codifican para inserciones de ADNc homologas al extremo terminal de ESTs respectivos.

EJEMPLO 3.2 Clon B11 que codifica para una inserción de ADNc homologa al extremo C-terminal de CTP-fosfoenolamina citidililtransferasa (ET, número de acceso D84307). ET es una enzima que interviene en el metabolismo de fosfolípidos y cataliza la conversión de fosfoetalonamina en CDP-etanolamina (Nakashima et ai. 1997). El clon B11 fue cortado in vitro por la caspasa-8, según se demostró en la prueba descrita en el ejemplo 2.4 mencionado anteriormente.

EJEMPLO 3.3 Clones B13 y B37 que codifican para una inserción de ADNc homologa al extremo C-terminal de un clon que codifica para una parte del genoma de EBV (número de acceso V01555).

EJEMPLO 3.4 Clon B22 que codifica para una inserción de ADNc homologa al extremo C-terminal de ciclofilina de células C (número de acceso Y00052). La ciclofilina de células T fue identificada como un receptor ¡ntracelular para ciclosporina A y FK506 y por poseer actividad intrínseca de peptidilpropil cis-írans-isomerasa (Haendler B. et al., 1987).

EJEMPLO 3.5 Clon B33 que codifica para una inserción de ADNc homologa a Nucleobindin C-terminal (número de acceso 2506255). Nucleobindin es una proteína secretada con propiedad de unión a Ca2+ y ADN, la cual es muy similar a la proteína NEFA descrita en el ejemplo 3.3. Nucleobindin fue descrita originalmente como una proteína de 55 kDa que incrementaba la producción de anticuerpos anti-ADN en cultivos de células Ipr de bazo de ratón autoinmunes (Miura K. et al. 1992). El clon B33 fue cortado por la caspasa-8 in-vitro e in-vivo, según se demuestra en las pruebas de los ejemplos 2.4 y 2.5 mencionados anteriormente.

EJEMPLO 3.6 El clon J2 contiene una inserción de 600 pb que codifica para una secuencia de proteína parcial que da lugar a un polipéptido de aproximadamente 20 kDa cuando se expresa in vitro en un sistema libre de células, así como también en células. El polipéptido codificado por el clon J2 es cortado in vitro por la caspasa-8 e in vivo en células HEK 293-T y HeLa después de coexpresión con p55FNT-R o caspasa-8 en las pruebas de los ejemplos 2.4 y 2.5 mencionados anteriormente. La secuencia de nucleótidos y la secuencia deducida de aminoácidos del clon J2 se proveen en la figura 2. La comparación y la alineación de la extensión 5' del clon J2 mediante PCR con la secuencias publicadas en la base de datos, reveló homología del clon J2 con una EST de humano (número de acceso AA460869), que corresponde a una N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilasa putativa de humano, así como también a un clon adicional L48741), y permitió la composición de la N-acetilglucosamina-6-fosfato desacetilasa putativa de longitud total de humano provista en la figura 3.

EJEMPLO 4 Caracterización funcional del clon J2 La caracterización funcional inicial del clon J2 reveló que exhibe actividad inhibidora sobre la caspasa-8, y que el p55FNT-R de humano indujo apoptosis en células HEK 293-T y HeLa. La expresión de J2 suprimió/retardó la apoptosis de las células HEK 293-T cotransfectadas con el receptor de FNT p55, o de las células HeLa tratadas con FNT y cicioheximida hasta 25-50%, como se ilustra en la figura 3. Se llevó a cabo la cuantificación de muerte celular apoptótica mediante determinación de la porción de células que expresan beta-galactosidasa y que exhiben morfología apoptótica 20 horas después de la transfección de las construcciones indicadas. Los datos se expresan como el porcentaje promedio de células azules que exhiben signos de apoptosis como una fracción del número total de células azules contadas (aproximadamente 500 células por muestra). En forma alternativa, se usó proteína fluorescente verde como marcador, y se detectó mediante microscopía confocal fluorescente.

EJEMPLO 5 Clonación de proteínas que interactúan con la caspasa-8 Se seleccionó una genoteca de ADNc de placenta humana expresada a partir del vector pACT2 (disponible de Clontech, Palo Alto, E.U.A.) mediante el método de selección de dos híbridos usando el cebo descrito en el ejemplo IB anterior. Mediante el uso de este procedimiento de selección, se identificaron varios clones que codifican para proteínas específicas de unión a caspasa-8. Se estudiaron además los clones P16, P27, P43, P70, P74 y P79. La secuenciación de las inserciones de ADNc de los clones de ADNc P43, P16 y P74, indicó que comparten ciertas secuencias homologas. El clon P74 tuvo la inserción de ADNc más larga, de aproximadamente 3000 pb, y pareció codificar para una proteína con un marco de lectura abierto deducido de 574 aminoácidos y con un peso molecular esperado de aproximadamente 68-70 kDa. Se compararon las secuencias de 3 inserciones de ADNc mencionadas anteriormente con las secuencias encontradas en bases de datos públicas. Se encontró que las inserciones de ADNc de los clones P43, P16 y P74 tienen cierta homología con la secuencia de dos clones EST presente en el banco de genes (W04418 y N64095). La secuencia de las 3 inserciones de ADNc pareció constituir los extremos 3' de diferentes ¡soformas de empalme de la misma proteína. La alineación de las secuencias de las 3 inserciones de ADNc confirmó el marco de lectura abierto de 574 aminoácidos dentro de la secuencia de P74 (mostrada en la figura 5). Se encontró también una secuencia similar dentro de un clon genómico identificado en otra base de datos pública (RPC15-1057120; genoteca de PAC Roswell Park Cáncer Institute Human), la cual se localiza hacia el cromosoma humano 12q31. El marco de lectura abierto deducido a partir de la secuencia de este clon PAC fue de 1428 aminoácidos (mostrado en la figura 6), y comprende el marco de lectura abierto anterior que tiene 574 aminoácidos. La figura 7 muestra una alineación de la secuencia del marco de lectura abierto de la secuencia deducida de aminoácidos de la inserción de ADNc del clon P74 (denotada como "clonada"), en donde el marco de lectura abierto se deduce a partir de la secuencia del clon PAC (denotado como "deducido"). Con base en la comparación de la secuencia deducida de aminoácidos del clon P74 y la secuencia deducida a partir del clon PAC de longitud total, parece ser que la proteína de longitud total que corresponde a P74 es más larga en el extremo 5', y posiblemente puede iniciar con la primera o una de las primeras metioninas de la secuencia de PAC mostrada en la figura 6. Se encontró también que la secuencia del clon P74 exhibe homología significativa con una región altamente homologa de histona desacetilasas de ratón y de humano, una región que podría ser el dominio que contiene al sitio activo enzimático de histona desacetilasa, sugiriendo que la proteína codificada por P74 puede compartir la función de estas proteínas. La secuencia en la región entre 163-1716 pb del ADNc parcial del clon P74, exhibe aproximadamente 80% de homología con la histona desacetilasa A (número de acceso NP_006028). La secuencia en la región entre 385-1707 pb del ADNc parcial del clon P74 exhibe homología con la secuencia de la histona desacetilasa 5 (número de acceso NP_005465). La secuencia en la región entre 418-1629 pb del ADNc parcial del clon P74 exhibe homología con la secuencia de la histona desacetilasa mHDA1 (número de acceso AAD09834), y la secuencia en la región entre 424-1551 pb del ADNc parcial del clon P74 exhibe homología con la secuencia de la histona desacetilasa 6 (número de acceso NP_006035). Una alineación de la secuencia de aminoácidos de la proteína de longitud total deducida a partir de la secuencia de PAC con la de la histona desacetilasa A (número de acceso del banco de genes NP-006028.1), se muestra en la figura 8.

EJEMPLO 6 Caracterización funcional de proteínas que interactúan con la caspasa-8 A) Proteínas codificadas por clones de ADNc J2, o P16, o P43, o P70, o P74, o P79, identificados en el sistema de selección de dos híbridos, fueron expresadas en lisados de reticulocitos en presencia de metionina 35S en el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TnT T7 (disponible de Promega, cat. #L4610), y separadas sobre un gel de SDS-PAGE (véase figura 9A). Las mismas cantidades de proteínas expresadas por lisados de reticulocitos fueron analizadas para su unión a la proteína de fusión de las dos subunidades de caspasa-8 GST-S2-S1 (C360S) del ejemplo IB anterior, fusionadas a GST y expresadas en bacterias. Después de depuración previa mediante incubación durante 1 hora a 4°C únicamente con esferas de GST, las proteínas producidas por TnT fueron precipitadas con proteína de fusión caspasa-8 GST-S2-S1 acoplada a esferas de GST mediante incubación durante 1 hora a 4°C con las esferas de GST. Los precipitados de GST fueron lavados, y las proteínas que se unieron a la caspasa-8 fueron separadas de las esferas mediante ebullición en regulador de pH para muestra que contenía SDS, y resueltas mediante SDS-PAGE. Las proteínas capaces de unirse a la construcción de caspasa-8 podrían ser visualizadas de esta manera mediante autorradiografía. La proteína codificada por el clon P74 pareció unirse específicamente ¡n vitro a la caspasa-8 (véase la figura 9B), comparativamente con la unión de GST-S2-S1 (C360S) a Bid, un substrato proximal conocido de la caspasa-8 en la vía de señalización apoptótica de Fas. Las proteínas de tamaño total producidas en el lisado de reticulocitos están marcadas en la figura mediante asteriscos. En las pruebas de dos híbridos descritas en el ejemplo IA anterior, se encontró que la proteína codificada por P74 se une a la proteína de fusión codificada por las dos subunidades de la caspasa-8, pero no a la subunidad pequeña de la caspasa-8 expresada sola. Comparativamente, otras proteínas mencionadas en los ejemplos anteriores, tales como Tip60, se unen a la subunidad S2 pequeña de la caspasa-8 cuando se expresa sola (datos no mostrados). B) La proteína codificada por el ADNc de P43 fue expresada in vitro en lisados de reticulocitos en presencia de metionina 35S usando el sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TnT T7, y sometida a corte mediante caspasa 3 o caspasa 9 o caspasa 10 mutante o de tipo silvestre recombinante expresada en E. coli como proteínas de fusión de subunidad 2- subunidad 1 (S2-S1) marcadas con histidina. La caspasa-8 fue expresada como una proteína de fusión de subunidad 1 -subunidad 2 (S1-S2) marcada con histidina. Se usaron 1 y 4 volúmenes de lisado total de bacterias, definido como 1 o 4 unidades relativas (RU) en una prueba de proteasa (figura 10). Por poco tiempo, proteínas marcadas con 35S sintetizadas in vitro fueron incubadas durante 30 minutos en regulador de pH de proteasa a 37°C en presencia de caspasa-8 producida por bacterias. Las proteínas y sus fragmentos fueron separados sobre SDS-PAGE, y los resultados se visualizaron mediante autorradiografía o mediante fosfoformación de imágenes. Los resultados indicaron que la proteína codificada por el ADNc de P43 usado como substrato, fue cortada eficazmente por la caspasa-8, fue cortada débilmente por la caspasa-10, y no fue cortada por la caspasa-3 ni por la caspasa-9 (figura 10). De esta manera, la proteína parece ser un substrato específico de la caspasa-8. C) Para analizar el efecto de las proteínas recién clonadas sobre la muerte celular apoptótica inducida por la vía de señalización del receptor de FNT, las moléculas de ADNc seleccionadas fueron clonadas en vectores de expresión pcADN 3.1 /His C (disponibles de Invitrogen), y cotransfectadas transitoriamente con el receptor de FNTR p55 expresado en el vector pcADN3 (Invitrogen) y con la proteína de fluorescencia verde (GFP) expresada a partir del vector de expresión pEGFPCI (Clontech), en células HEK-293-T. El ADNc de Tip60 y el ?32-Tip60 que carece de los primeros 32 aminoácidos N-termínales, fueron clonados en el vector pCGN (descrito en M. Tanaka y W.

Herr, Cell 60, 375-386, 1990) en el cual una marca de hemaglutinina (HA) fue fusionada al extremo N- terminal del ADNc, y usada en la misma instalación experimental. Después de 24 horas, las células transfectadas fueron examinadas bajo un microscopio fluorescente, y se evalúo la muerte celular determinando el número de células que mostraban una morfología apoptótica diferente de la población total de células fluorescentes. Se encontró que la proteína P74 sobreexpresada del ADNc parcial clonado en el vector pcADN-His, protege a las células HEK-293-T y HeLa de la muerte celular inducida por la sobreexpresión del receptor de FNT p55 (figura 11) o la sobreexpresión de las dos subunidades fusionadas de la caspasa-8 (no mostradas). Se encontró que TipdO de tipo silvestre y el mutante TipdO no digerible, en donde los residuos de ácido aspártico en las posiciones 200 y 203 fueron reemplazados por residuos de alanina, protegen a las células HEK-293-T de la muerte inducida por la sobreexpresión del receptor de FNT p55 (figura 12), mientras que el ?32-Tip60 que carece de los primeros 32 aminoácidos N-terminales, no mostró este efecto protector. Habiendo descrito ahora totalmente esta invención, será apreciado por los expertos en la técnica que la misma puede ser llevada a cabo dentro de una amplia escala de parámetros, concentraciones y condiciones equivalentes sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención, y sin experimentación indebida.

Aunque esta invención se ha descrito en relación con modalidades específicas de la misma, se entenderá que es capaz de sufrir otras modificaciones. Se pretende que esta solicitud abarque cualquier variación, uso o adaptación de las invenciones siguientes; en general, los principios de la presente descripción están dentro de la práctica conocida y habitual dentro de la materia a la cual la invención pertenece, y se pueden aplicar a las características esenciales descritas en el alcance de las reivindicaciones anexas. Todas las referencias citadas en la presente, incluyendo artículos de revistas o resúmenes, publicados o que correspondan a solicitudes de patente extranjeras o de los Estados Unidos, patentes expedidas extranjeras o de los Estados Unidos, o cualquier otra referencia, se incorporan en su totalidad en la presente como referencia, incluyendo todos los datos, cuadros, figuras y texto presentados en las referencias citadas. Además, todos los contenidos de las referencias citadas en la presente se incorporan en su totalidad en la misma como referencia. La referencia a pasos de método conocidos, pasos de método convencionales, métodos conocidos o métodos convencionales, de ninguna manera es un reconocimiento de que cualquier aspecto, descripción o modalidad de la presente invención es descrito, enseñado o sugerido en la técnica relevante. La descripción anterior de las modalidades específicas revelará así totalmente la naturaleza general de ia invención que otros pueden, aplicando el conocimiento dentro de la aptitud en la técnica (incluyendo los contenidos de las referencias citadas en la presente), fácilmente modificar y/o adaptar varias aplicaciones a dichas modalidades específicas, sin experimentación indebida, sin apartarse del concepto general de la presente invención. Por lo tanto, se pretende que dichas adaptaciones y modificaciones estén dentro del significado y la gama de equivalentes de las modalidades descritas, con base en la enseñanza y guía presentadas en la presente. Se entenderá que la fraseología o terminología de la presente es con el propósito de descripción y no de limitación, a fin de que la terminología o fraseología de la presente especificación sea interpretada por el experto en la técnica a la luz de las enseñanzas y guía presentadas en la presente, en combinación con el conocimiento del experto en la materia.

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caccatggca acggcaccca gcaaaccttc 1020 taccaagacc ccagtgtgct ctacatctcc ctgcatcgcc atgacgacgg caacttcttc 1080 ccagggagtg gggctgtgga tgaggtaggg gctggcagcg gtgagggctt caatgtcaat 1140 gtggcctggg ctggaggtct ggaccccccc atgggggatc ctgagtacct ggctgctttc 1200 aggatagtcg tgatgcccat cgcccgagag ttctctccag acctagtcct ggtgtctgct 1260 ggatttgatg ctgctgaggg tcacccggcc ccactgggtg gctaccatgt ttctgccaaa 1320 tgttttggat acatgacgca gcaactgatg aacctggcag gaggcgcagt ggtgctggcc 1380 ttggagggtg gccatgacct cacagccatc tgtgacgcct ctgaggcctg tgtggctgct 1440 cttctgggta acagggtgga tcccctttca gaagaaggct ggaaacagaa acccaacctc 1500 aattccatcc gctctctgga ggccgtgatc cgggtgcaca gtaaatactg gggctgcatg 1560 cagcgcctgg cctcctgtcc agactcctgg gtgcctagag tgccaggggc tgacaaagaa 1620 gaagtggagg cagtaaccgc actggcgtcc ctctctgtgg gcatcctggc tgaagatagg 1680 ccctcggagc agctggtgga ggaggaagaa cctatgaatc tctaa 1725 <210 6 <211> 574 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Glu Gln Leu Lys Thr His Val Gln Val He Lys Arg Ser Ala Lys Pro 1 5 10 15 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Pro Gly Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gln Glu 530 535 540 Leu Leu Phe Arg Gln Gln Ala Leu Leu Leu Glu Gln Gln Arg He Hxs 545 550 555 560 Gln Leu Arg Asn Tyr Gln Ala Ser Met Glu Ala Ala Gly He Pro Val 565 570 575 Ser Phe Gly Gly His Arg Pro Leu Ser Arg Ala Gln Ser Ser Pro Ala 580 585 590 Ser Ala Thr Phe Pro Val Ser Val Gln Glu Pro Pro Thr Lys Pro Arg 595 600 605 Phe Thr Thr Gly Leu Val Tyr Asp Thr Leu Met Leu Lys His Gln Cys 610 615 620 Thr Cys Gly Ser Ser Ser Ser His Pro Glu His Ala Gly Arg He Gln 625 630 635 640 Ser He Trp Ser Arg Leu Gln Glu Thr Gly Leu Arg Gly Lys Cys Glu 645 650 655 Cys He Arg Gly Arg Lys Ala Thr Leu Glu Glu Leu Gln Thr Val His 660 665 670 Ser Glu Ala His Thr Leu Leu Tyr Gly Thr Asn Pro Leu Asn Arg Gln 675 680 685 Lys Leu Asp Ser Lys Lys Leu Leu Gly Ser Leu Ala Ser Val Phe Val 690 695 700 Arg Leu Pro Cys Gly Gly Val Gly Val Asp Ser Asp Thr He Trp Asn 705 710 715 720 Glu Val His Ser Ala Gly Ala Ala Arg Leu Ala Val Gly Cys Val Val 725 730 735 Glu Leu Val Phe Lys Val Ala 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Leu Asp Pro Leu Pro Glu Lys 945 950 955 960 Val Leu Gln Gln Arg Pro Asn Ala Asn Ala Val Arg Ser Met Glu Lys 965 970 975 Val Met Glu He His Ser Lys Tyr Trp Arg Cys Leu Gln Arg Thr Thr 980 985 990 Ser Thr Ala Gly Arg Ser Leu He Glu Ala Gln Thr Cys Glu Asn Glu 995 1000 1005 Glu Ala Glu Thr Val Thr Ala Met Ala Ser Leu Ser Val Gly Val Lys 1010 1015 1020 Pro Ala Glu Lys Arg Pro Asp Glu Glu Pro Met Glu Glu Glu Pro Pro 1025 1030 1035 1040 Leu

Claims (40)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una proteína que interactúa con caspasa-8, o una isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de la misma, capaz de inetractuar con su subunidad 1 y/o subunidad 2 de caspasa-8.

2.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , siendo N-acetilglucosamin-6-fosfato desacetilasa de humano, o una ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivada de la misma.

3.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende las secuencias de aminoácidos de la figura 2, figura 3, figura 5B o figura 6.

4.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que es una proteína codificada por el clon p74, o una variante de empalme del mismo.

5.- La proteína de conformidad con la reivindicación 4, donde la variante de empalme es seleccionada de los clones p16 y p43.

6.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que es una proteína codificada por el clon p27, p70 o p79.

7.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende la secuencia de aminoácidos de la proteína Tip-60 excluyendo los aminoácidos 94 a 145.

8.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que es una proteína codificada por los clones L7, L12, M26, B4, B17, J40, B13, B37 o B33.

9.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que es cortada in vitro por caspasa-8.

10.- La proteína de conformidad con la reivindicación 1 , que es cortada in vivo por caspasa-8.

11.- Una secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína de conformidad con la reivindicación 1.

12.- La secuencia de ADN aislado que codifica para una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-10.

13.- La secuencia de ADN aislado que comprende la secuencia de ADN de la figura 2.

14.- La secuencia de ADN aislado que comprende la secuencia de ADN de la figura 3.

15.- La secuencia de ADN aislado que comprende la secuencia de ADN de la figura 5A.

16.- La secuencia de ADN aislado con la capacidad de hibridarse a una secuencia de ADN de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 bajo condiciones moderadamente estrictas.

17.- Un vector que comprende una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 16.

18.- Una célula hospedero eucarióntica o procarióntica que contiene un vector de conformidad con la reivindicación 17.

19.- Un método para producir una proteína, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de una proteína que interactúa con caspasa-8 de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende cultivar una célula hospedero de la reivindicación 18 bajo condiciones que permiten la producción de dicha proteína, afectando las modificaciones de la post-traducción conforme sea necesario para obtener dicha proteína, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, y aislar dicha proteína, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado.

20.- Un método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la célula es una célula procarióntica.

21.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la célula es una célula eucarióntica.

22.- El método de conformidad con la reivindicación 21 , caracterizado además porque la célula es una célula de mamífero, insecto o de levadura.

23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque la célula es una célula HeLa ó 293 T HEK.

24.- El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque como promotor, se emplea un promotor CMV humano.

25.- Un péptido que ¡nteractúa con caspasa-8 que comprende al menos 4 aminoácidos consecutivos de una proteína de la reivindicación 1.

26.- Un derivado de un péptido de conformidad con la reivindicación 23.

27.- Un derivado de un péptído de conformidad con la reivindicación 26, que tiene la capacidad de formar un enlace covalente con caspasa-8 al contactar dicha caspasa-8.

28.- Un ribosoma específico para una secuencia de nucleótidos que corresponde a una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.

29.- Un oligonucleótido antisentido que comprende al menos 9 nucleótidos de una secuencia que corresponde a una secuencia de ADN de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-16.

30.- Un anticuerpo dirigido hacia un epítope de una proteína de conformidad con la reivindicación 1.

31.- Un inmunoensayo para la detección de una proteína que interactúa con caspasa-8, que comprende el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 30, como un reactivo.

32.- El inmunoensayo pafa la detección de caspasa-8, que comprende un péptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 25-27.

33.- El inmunoensayo para la detección de caspasa-8, que comprende una proteína de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10.

34.- Un método para identificar proteínas que interactúan con caspasa-8, que comprende los pasos de: a)proveer una célula de levadura que tiene un gen reportero enlazado a un promotor que comprende un motivo de secuencia de ADN; a) expresar en dicha célula de levadura una subunidad p20 de dicha caspasa-8; b) expresar en dicha célula de levadura una proteína de fusión de un dominio de unión a ADN y la subunidad p10 y/o p20 de dicha caspasa-8, en donde dicho dominio de unión a ADN es capaz de unirse a dicho motivo de secuencia de ADN; c) opcionalmente, expresar en dicha célula de levadura una subunidad p10 o p20 no fusionada de dicha caspasa-8; d) transformar un cultivo de dicha célula de levadura con una genoteca que consiste de un vector de expresión, impulsar la expresión de una proteína de fusión que consiste de una genoteca de ADNc y un activador de la transcripción; e) seleccionar el cultivo de células de levadura transformadas para células de levadura en donde el gen reportero es activado, y f) aislar una célula de levadura del paso e) y además aislar la proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, que es expresada en su vector presa.

35.- Una proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, de la reivindicación 1 , o un ribosoma de la reivindicación 28, o un oligonucleótido antisentido de la reivindicación 29, o un anticuerpo de la reivindicación 30, para su uso en la modulación de la actividad de caspasa-8.

36.- La proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, de conformidad con la reivindicación 1, o un ribosoma de la reivindicación 28, o un oligonucleótido antisentido de conformidad con la reivindicación 29, o un anticuerpo de conformidad con la reivindicación 30, para su uso en la modulación de los efectos del receptor de FNT o mediados por Fas.

37.- La proteína que interactúa con caspasa-8, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, de conformidad con la reivindicación 1 , o un ribosoma de conformidad con la reivindicación 28, o un oligonucleótido antisentido de conformidad con la reivindicación 29, o un anticuerpo de conformidad con a reivindicación 30, para su uso en la modulación de apoptosis.

38.- La proteína que interactúa con caspasa-8, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, de conformidad con la reivindicación 1 , o un ribosoma de conformidad con la reivindicación 28, o un oligonucleótido antisentido de conformidad con la reivindicación 29, o un anticuerpo de conformidad con a reivindicación 30, para su uso como un medicamento.

39.- La proteína que ¡nteractúa con caspasa-8, ¡soforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado, de conformidad con la reivindicación 1 , o un ribosoma de conformidad con la reivindicación 28, o un oligonucleótido antisentido de conformidad con la reivindicación 29, o un anticuerpo de conformidad con a reivindicación 30, para su uso como un medicamento en el tratamiento de esclerosis múltiple con oligodendrogliopatía primaria, uveoretinitis autoinmune, diabetes, lupus, miocarditis autoinmune I, hepatitis crónica mediada por HCV, gastritis crónica, por ejemplo, gastritis de tipo A, enfermedad mixta del tejido conectivo, (MCTD por sus siglas en inglés), enfermedad de Crohn, o colitis ulcerativa.

40.- El uso de una proteína que interactúa con caspasa-8, isoforma, variante alélica, fragmento, análogo funcional, mutante o derivado de conformidad con la reivindicación 1para el aislamiento, identificación y clonación de otra proteína de la misma clase.