MXPA00007184A - Metodos y composiciones para modificar niveles de compuestos metabolicos secundariosen plantas - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un método para hacer una planta genéticamente trasformada, la cual tiene un contenido alterado de al menos un producto de una ruta metabólica secundaria. El método consiste en introducir un cartucho de expresión de DNA en una célula de planta capaz de ser transformada y regenerada a una planta completa. El cartucho de expresión incluye secuencias de DNA requeridas para la transformación y selección en células de plantas. También incluye una secuencia de DNA que, bajo el control de un promotor activo en células de planta, codifica una proteína capaz de modificar la utilización de un substrato en la ruta metabólica secundaria. El substrato no es un metabolito primario del grupo seleccionado de glucosa, aminoácidos, nucleótidos yácidos grasos comunes. Una planta o tejidos de planta incluyendo semillas, pueden ser recuperados entonces teniendo un contenido alterado de al menos un producto de la ruta metabólica secundaria. La invención también proporciona productos alimenticios derivados de las plantas y semillas obtenidas de acuerdo con el método.

Description

MÉTODOS Y COMPOSI CIONES PARA MODI FICAR N IVELES DE COMPUESTOS METABOLICOS SECUNDARIOS EN PLANTAS Esta solicitud es una continuación en parte de la solicitud estadounidense serial no. 09/012,453, y reclama prioridad de la solicitud provisional 60/072, 156.

CAMPO DE LA I NVENCIÓN La presente invención proporciona métodos y composiciones para la alteración de compuestos producidos por rutas metabólicas secundarias en plantas. La invención también proporciona células de plantas con contenido de metabolitos secundarios alterado. En una modalidad, el contenido de productos metabólicos secundarios anti-nutricionales es alterado en plantas, células de plantas y semillas de plantas de acuerdo con la invención. En otra modalidad, los productos encontrados dentro de las rutas metabólicas secundarias de alcohol de azúcar y fenilpropanoide están alterados en plantas, células de plantas y semillas de plantas de acuerdo con la invención. La invención proporciona además constructos genéticos y vectores útiles para modificar el contenido de metabolitos secundarios de células y semillas de plantas. La invención se refiere además a harina de semilla modificada, y a alimento animal conteniendo harina de semilla modificada, particularmente harina de semilla en la cual el contenido de metabolito secundario es reducido o alterado.

ANTECEDENTES DE LA I NVENCIÓN Las plantas producen una variedad de compuestos por medio de metabolismo secundario. Aunque no se consideran esenciales para el metabolismo de la planta, las rutas metabólicas secundarias frecuentemente producen bioquímicos únicos, algunos de los cuales son considerados anti-nutricionales o incluso tóxicos. Las rutas metabólicas secundarias y los compuestos producidos por estas rutas frecuentemente son específicos para una especie o género individual . De esta manera, la manipulación de las rutas metabólicas secundarias pueden producir novedosas composiciones de bioquímicos o pueden producir tejidos de plantas con contenido metabólico secundario alterado. En particular, la manipulación de metabolismo secundario para el fin de alteración de compuestos metabólicos secundarios que son anti-nutricionales o tóxicos por naturaleza, puede proporcionar aplicaciones únicas en el alimento y área alimenticia. Es deseable manipular el metabolismo secundario sin alterar los procesos bioquímicos considerados esenciales para el crecimiento y superviviencia de las células de la planta. La colección de procesos bioquímicos y los compuestos involucrados que son esenciales para el crecimiento y supervivencia de la planta, son considerados rutas metabólicas primarias y sus productos. Generalmente se considera que el metabolismo primario abarca esos procesos bioquímicos que conducen a la formación de azúcares primarios, (tales como, glucosa), aminoácidos, ácidos grasos comunes, nucleótidos y los polímeros derivados de ellos (polisacáridos, tales como, almidón, proteínas, l ípidos, RNA y DNA, etc.) Yeoman y Yeoman, Tansley Review No. 90, Manipulatinq Secundary Metabolism in Cultured Plant Cells (Manipu lación de metabolismo secundario en células de plantas cultivadas) , New Phytologist, 1 34: 553-569, 1996. De esta manera, la técnica reconoce que el metabolismo primario puede ser definido como aquellos procesos metabólicos esenciales para la supervivencia y crecimiento de todas las células de la planta, mientras que el metabolismo secundario puede ser definido como aquellos procesos bioquímicos que no son esenciales para todas las células de la planta. Por ejemplo, las rutas metabólicas secundarias determinan características tales como color, sabor, morfología, etc. El metabolismo secundario también produce varios compuestos que son reconocidos por insectos o están involucrados en la respuesta a patógenos. Algunos de estos compuestos pueden proporcionar un beneficio a algunas especies de plantas bajo condiciones naturales, pero bajo cultivo, estos compuestos pueden ser perjudiciales a la calidad del producto cosechado o pueden restringir la utilidad de la cosecha para ciertas aplicaciones. Algunos de los metabolitos secundarios son compuestos únicos que se han desarrollado dentro de una especie como un resultado de rutas bioquímicas especializadas. El metabolismo secundario no está caracterizado por la redundancia en los mecanismos bioquímicos, lo cual es normal del metabolismo primario, así, de manera característica, los productos de metabolismo secundario no son producidos por rutas múltiples en la planta. Los metabolitos secundarios normalmente son más específicos de la planta que los bioquímicos ubicuos que están involucrados en las rutas primarias.

Numerosos intentos para manipular las rutas metabólicas primarias han resultado en células de plantas con contenido de almidón o aceite (lípido) alterado. Sin embargo, se puede esperar que la manipulación gruesa del metabolismo primario conduzca a efectos perjudiciales. Por ejemplo, la composición de lípidos puede ser cambiada, pero la eliminación de lípidos obviamente sería perjudicial para la supervivencia celular. La manipulación de metabolismo primario no siempre es completamente exitosa debido a que los mecanismos bioquímicos redundantes pueden superar algunos intentos en la manipulación. De esta manera, las rutas metabólicas en plantas frecuentemente son difíciles para manipular en una manera que sea predecible y proporcione resultados útiles y tangibles bajo condiciones de cultivación. En algunos casos , el metabolismo primario ha sido alterado de manera exitosa para producir un novedoso fenotipo, el cual representa un cambio en composición en lugar de una reducción o eliminación de una substancia específica. Normalmente, estas manipulaciones se han logrado mediante expresión ectópica de un gene de planta, tal como sobre-expresar un gene en ciertos tejidos o en una manera constitutiva en lugar de una manera regulada, o mediante inhibición de una actividad de gene específico por RNA antisentido, ribozimas o co-supresión. Sin embargo, ha sido difícil predecir a priori los resultados de tales manipulaciones. La expresión de una enzima de planta puede modificarse a muchos niveles. Esto incluye control en el nivel de expresión de genes, traslación, procesamiento de proteína y control alostérico de la función de proteínas. Así, la expresión ectópica de un gene de planta involucrado en el metabolismo primario puede no superar los complejos controles bioquímicos en la regulación de metabolismo primario. Adicionalmente, la redundancia en el metabolismo primario también plantea un difícil obstáculo a superar en estas manipulaciones, ya que las rutas metabólicas primarias son esenciales para el crecimiento y supervivencia de la planta. De acuerdo con estos intentos para alterar el metabolismo primario frecuentemente fallan en proporcionar el fenotipo pretendido. Más aún, la evaluación de estas plantas modificadas en el nivel de campo, o bajo una variedad de extremos ambientales frecuentemente ha conducida al descubrimiento que el efecto predicho no es observado o el desempeño de la planta está comprometido. De esta manera, la modificación de metabolismo primario requiere una consideración cuidadosa de la ruta metabólica primaria o el paso discreto en una ruta, con el fin de lograr un fenotipo específico. La manipulación de rutas metabólicas secundarias ha sido complicada por un pobre entendimiento de la bioqu ímica involucrada, poca información sobre los genes expresados en las rutas metabólicas secundarias y las complejas interrelaciones entre las rutas bioquímicas en general. Sin embargo, los métodos para alterar el metabolismo secundario pueden proporcionar un medio valioso para producir novedosos fenotipos, incluyendo aquéllos con niveles alterados de compuestos metabólicos, por ejemplo, aquéllos considerados anti-nutricionales por naturaleza. Así, las rutas metabólicas secundarias representan un importante objetivo para la manipulación genética de las plantas.

Se han hecho esfuerzos para transferir la ruta de biosíntesis de betaína en plantas no capaces de síntesis de la betaína osmoprotectora. Holmstrom , K.O. et al. , Production of the Escherichia coli betaine-aldehyde dehydrogenase (Producción de betaína-aldehído deshidrogenasa de Escherichia coli), una enzima requerida para la síntesis de la betaína de glicina osmoprotectora, en plantas transgénicas, The Plant Journal, (1994) 6(5): 749-58 describe el uso de un gene que codifica betaína-aldehído deshidrogenasa para sintetizar la betaína de glicina de metabolito osmoprotector. Resumen Derwent AN 96-512578, Toyota Jidosha KK, 15 de octubre de 1 996, describe el uso del gene de colina deshidrogenasa y el gene de betaína-aldehído deshidrogenasa para producir la betaína osmoprotectora.

Las dos rutas bioquímicas en plantas que son consideradas rutas metabólicas secundarias han sido el tema de estudios dirigidos a la alteración de los niveles de los productos finales. Los métodos usados para manipular estas rutas no han producido los resultados deseados. Por ejemplo, la ruta de fenilpropanoide está involucrada en la formación de lignina y es considerada una ruta metabólica secundaria. La biosíntesis de lignina es parte de la ruta biosintética de fenilpropanoide general, la cual produce al menos tres precursores fenólicos primarios, ácidos coumárico, ferúlico y sinápico, productos que son polimerizados en lignina y otros compuestos fenólicos (ver la Figura 2). En intentos para alterar la ruta metabólica secundaria de fenilpropanoide, los genes para muchas de las enzimas involucradas en la formación de los monómeros de lignina son actualmente identificados como objetivos para reducción de lignina vía tecnolog ías antisentido o cosupresión (por ejemplo, US 5,451 , 514, US 5,633,439, WO 93/05160, WO 94/08036). Estos genes objetivo incluyen aquéllos que codifican cinamil alcohol deshidrogenasa, ácido cafeico O-metil-transferasa y feniialanina amoniaco liasa. Estas técnicas están dirigidas a la reducción de contenido de lignina ya que se asume que esto tiene un efecto benéfico global sobre el procesamiento o digestibilidad de plantas. Sin embargo, la reducción de lignina mediante tecnologías antisentido o co-supresión al enfocar uno de los genes en la ruta de fenilpropanoide puede tener un número de efectos indeseables. Estos pueden incluir la susceptibilidad de enfermedad aumentada, velocidades de crecimiento alteradas o reducción de la fuerza física de la fibra de planta y de ahi una reducción en desempeño agronómico. Se mostró que la inhibición de la enzima fenilalanina amoniaco liasa conduce a numerosos fenotipos perjudiciales (Elking et al. , Abnormal Plant Development y Down-Regulation of Phenylpropanoide Biosynthesis en Transgenic Tobacco Containing a Heterologous Phenylalanina Ammonia Lyase Gene (Desarrollo anormal de planta y sub-regulación de biosíntesis de fenilpropanoíde en tabaco transgénico conteniendo un gene de fenilalanina amoiaco liasa heterólogo, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87: 9057-9061 , 1 990). La enzima fenilalanina amoniaco liasa actúa sobre el metabolito primario, fenilalanina, un aminoácido. Los resultados de estos experimentos demuestran que la alteración de metabolismo secundario a través de la modificación de uno de los metabolitos primarios involucrados en una ruta metabólica secundaria particular, puede producir fenotipos inesperados y perjudiciales. De acuerdo con esto, la elección del o los pasos bioquímicos dentro de una ruta metabólica secundaria es crucial para producir plantas, las cuales son fenotípicamente normales, pero las cuales muestran una reducción de un metabolito secundario específico. Adicionalmente, el uso de estrategias de RNA de antisentido o cosupresión puede no proporcionar el nivel o especificidad de reducción de metabolito secundario que es comercialmente aceptable. Además, la inhibición de los genes que codifican actividades de enzimas claves puede afectar la expresión de genes relacionados. Así, se ha hecho poco progreso con la reducción de compuestos fenólicos considerados anti-nutricionales, o reducción de contenido de lignina por RNA antisentido o co-supresión, sin efectos laterales perjudiciales acompañantes. Un segundo ejemplo de esfuerzos para alterar una ruta metabólica que falló en producir los resultados deseados es la modificación de la biosíntesís de glucosinolato en cañóla. Se han reportado intentos para modificar el contenido de glucosinolato de harina de cañóla mediante manipulación de la ruta de glucosinolato. Un método que ha sido propuesto para alterar la biosíntesis de glucosinolatos fue crear una nueva ruta que compite por el azufre usado en la formación de glucosinolatos, o reducir niveles de triptófano usado en la formación de glucosinolatos por conversión de triptófano a triptamina ("Engineering Altered Glucosinolate Biosynthesis by Two Alternative Strategies" (I ngeniería de biosíntesis de glucosinolato alterada mediante dos estrategias alternativas), por Ibrahim, Chavadej & De Luca, publicada en: Genetic engineerinq of plant secondary metabolism (Ingeniería genética de metabolismo secundario de plantas), 1 994, Plenum Publishing Corporation ; Nueva York; US). Sin embargo, el método no fue exitoso para reducir el contenido de glucosinolato de harina de semilla de cañóla. El método falló en reducir el contenido anti-nutricional de glucosinolatos en harina de cañóla. Los glucosinolatos se hacen en las hojas de la planta y entonces se transportan a la semilla. De esta manera, el método se basó en la creencia de que la simple alteración de la disponibilidad de uno de los metabolitos primarios (azufre, el aminoácido triptófano) usado en la formación de glucosinolatos, reduciría la producción de glucosinolatos. Sin embargo, los glucosinolatos primarios en la semilla son glucosinolatos alifáticos que no utilizan el aminoácido triptófano para la producción de cadenas laterales. Más aún, los resultados de estos experimentos (por ejemplo, Chavadej et al. , Proc. Nati. Acad. Sci USA, 91 : 2166-2170, 1994) demostraron que las plantas transgénicas que portaron una enzima capaz de alterar el aminoácido primario triptófano, no contenían glucosinolatos reducidos en la semilla, el contenido de glucosinolato alifático en la semilla fue igual o posiblemente aún mayor que las plantas no transgénicas. De esta manera, la producción de glucosinolatos totales en la semilla no fue reducida aún cuando parece ser reducido un componente menor (glucosinolatos de indol). Es claro a partir de los estudios genéticos que pueden obtenerse plantas de glucosinolato bajo mediante cultivo convencional y existe un número de lugares que controlan glucosinolatos bajos en plantas cruciferas. Existen numerosas transformaciones bioquímicas que tienen lugar dentro de la biosíntesis de glucosínolato y aquellos pasos en común con toda o la mayoría de la síntesis de glucosinolatos son los pasos que necesitan ser dirigidos, si se necesita un método para reducir los glucosinolatos totales. Así, un método general para alterar la producción de glucosinolato en plantas cruciferas debe considerar las diferentes enzimas y substratos usados en la biosíntesis de glucosinolato se se va a idear un método de utilidad general. Sin embargo, parece que las enzimas usadas para obtener esta modificación también actúan sobre los metabolitos primarios (el aminoácido triptófano y el mineral azufre), de manera que se esperaría que cualquier alteración significativa de estos compuestos en la célula de la planta tuviera un efecto perjudicial. De acuerdo con esto, el método propuesto falló en dirigir específicamente la ruta metabólica secundaria. En realidad, puede esperarse que la alteración de triptófano conduzca a muchos efectos perjudiciales. Así, la alteración de los niveles de un metabolito primario no produjo el efecto pretendido de harina de cañóla de glucosinolato bajo, acentuando la dificultad de modificar el metabolismo primario. WO 97 23599 A Method for Regulation of Plant Composition (Un método para la regulación de la composición de plantas), (E. l . DuPont y Purdue Research Foundation, 3 de julio de 1997) describe el uso de ferulato-5-hidroxilasa (F5H), derivada de un planta crucifera, para regular ia composición de lignina en células de plantas. La enzima F5H descrita en WO 97 23599 es una enzima normalmente considerada parte de la ruta de fenilpropanoide en células de plantas, por ejemplo, en la planta crucifera de la cual se deriva. La enzima F5H descrita en WO 97 23599 no exhibe actividad en la célula transformada que es heteróloga a la actividad de la enzima F5H en la célula de la cual es derivada. De acuerdo con esto, un método general para alterar el metabolismo secundario será valioso para alterar la composición bioquímica de tejidos de plantas. Esto puede incluir, por ejemplo, reducción de compuestos anti-nutricionales, alteración de perfiles metabólicos secundarios, proporcionar tejido de planta con características de procesamiento alteradas, alteración de los niveles de compuestos de utilidad industrial o interés farmacéutico, producción de plantas con sabor, textura o apariencia modificados, producción de plantas con metabolitos secundarios alterados involucrados en la atracción de insectos, tolerancia de enfermedad u otros procesos biológicos que son influenciados por metabolitos secundarios, o plantas con características de crecimiento modificadas positivamente mediante alteración de metabolitos secundarios.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un . método para dirigir la formación de un metabolito secundario. El método comprende alterar la disponibilidad de un substrato que es específico para la ruta metabólica secundaria y esencial para la formación del producto metabólico secundario final, particularmente aquéllos compuestos dentro de uno a cinco pasos bioquímicos de formación de producto final. Enfocar substratos en pasos cerca de la formación de producto final evita los problemas asociados con alteraciones de metabolitos también involucrados en las rutas primarias, ya que ocurre después del punto de entrada de un substrato en la ruta metabólica primaria. Así, el método proporciona un medio novedoso para dirigir específicamente la reducción o alteración de metabolitos secundarios al identificar los precursores usados dentro de una ruta metabólica secundaria que no comprende substratos para rutas metabólicas primarias. El método también puede comprender alterar la disponiblidad de un substrato en una manera específica de tejido, de modo que solo se alteren ciertos tejidos, por ejemplo, tejidos de semillas. De esta manera, el método proporciona un medio novedoso para dirigir específicamente la reducción o alteración de metabolitos secundarios al identificar los precursores usados dentro de una ruta metabólica secundaria que no comprende compuestos metabólicos primarios. En una modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer una planta genéticamente transformada, que comprende: A) introducir en una célula de planta capaz de ser transformada y regenerada a una planta completa, un cartucho de expresión de DNA comprendiendo, además de las secuencias de DNA requeridas para la transformación y selección en células de plantas, una secuencia de DNA que, bajo el control de un promotor activo en células de planta, codifica una proteína capaz de modificar la utilización de un substrato en una ruta metabólica secundaria, con la condición de que el substrato no sea un metabolito primario del grupo seleccionado de glucosa, aminoácidos, ácidos grasos comunes y nucleótidos, y B) recuperar una planta, la cual tiene un contenido alterado de al menos un producto de la ruta metabólica secundaria. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para hacer una semilla genéticamente transformada comprendiendo hacer crecer la planta obtenida de acuerdo con los pasos A y B del método descrito antes, bajo condiciones que permiten la formación de semillas. El DNA recombinante es integrado cromosómicamente en el genoma de una planta fértil, de manera que se pasa a generaciones subsecuentes.

En modalidades adicionales, la presente invención proporciona vectores para transformar plantas, plantas y semillas transformadas de acuerdo con el método descrito antes, y productos alimenticios conteniendo las semillas o harina derivada de las mismas.

BREVES DESCRI PCIONES DE LOS DI BUJOS Fig . 1 : Una representación esquemática del esquema general del método para alterar cualquier ruta metabólica secundaria. Fig . 2: Una representación esquemática de metabolismo de fenilpropanoide general y la producción de sinapi?a en cruciferas. Fig. 3: El inicio y progresión de la síntesis de sinapina en semillas en desarrollo. Análisis de cromatografía de capa fina de semillas de Brassica napus cv Westar. Fig. 4: Análisis cuantitativo de la acumulación de sinapina en semillas en desarrollo mediante análisis de HPLC. Fig . 5: Determinación de la competencia de semillas en desarrollo para sintetizar sinapina al alimentar colina radioactiva vía pedúnculo de silicuas cortadas, incorporación de marca en sinapina desde 7 hasta 43 días después de la polinización. Fig . 6: Determinación de la competencia de semillas en desarrollo para sintetizar sinapina mediante, e infiltrando semillas aisladas con , una solución conteniendo colina radioactiva, incorporación de marca en sinapina desde 43 hasta 64 días después de ia polinización. Fig . 7: Acumulación de sinapina recién sintetizada en el cotiledón, ejes de embrión y fracción de recubrimiento de semilla, de semillas en desarrollo como una fracción de sinapina marcada total en una semilla. Fig. 8: Contenido de sinapina de los componentes de cotiledones y ejes de embrión de semillas en desarrollo por unidad de masa de ia muestra de tejido. Fig. 9: Determinación del contenido de sinapina de los componentes de cotiledón y eje de embrión de semillas en desarrollo en una base por semilla, es decir, el eje o un par de cotiledones. Fig . 10A y 1 0B: Secuencia de nucleótidos del marco de lectura abierto de colina oxidasa (SEQ. ID NO: 3). Fig . 1 1 . Secuencia de aminoácidos deducida del marco de lectura abierto de colina oxidasa (SEQ I D NO: 4). Fig . 12: Diagrama del vector de transformación de planta pHS 731 conteniendo el gene COX bajo el control de un promotor selectivo de tejido. Fig . 1 3: Reducción del contenido de sinapina de las semillas en Brassica sp. por expresión del gene COX.

Fig. 14. Diagrama del vector de transformación de planta pHS 981 conteniendo el gene BADH bajo el control de un promotor selectivo de tejido. Fig . 1 5: Reducción del contenido de sinapina de las semillas en Brassica sp. por expresión del gene COX y BADH. Fig. 16: Alteración de contenido fenólico de las semillas en Brassica sp. por expresión del gene COX y BADH. Fig. 17: Secuencia de nucleótidos de un gene de ácido ferúlico decarboxilasa de B. pumulis optimizado por expresión en células de plantas (SEQ ID NO: 1 ). Fig. 1 8: Secuencia deducida de aminoácidos de la proteína codificada por el marco de lectura abierto de ácido ferúlico decarboxilasa de B. pumulis sintético (SEQ I D NO: 2). Fig. 19: Mapa de restricción de un vector de transformación de planta comprendiendo el gene de ácido ferúlico decarboxilasa bajo el control del promotor constitutivo 35S. Fig. 20: Mapa de restricción de un vector de transformación de planta comprendiendo el gene de ácido ferúlico decarboxilasa bajo el control del promotor napin selectivo de semilla. Fig. 21 : Acumulación de ácido fítico durante el desarrollo de la semilla. Fig. 22: Especificidad de tejido de deposición de ácido fítico en la semilla en desarrollo.

Fig . 23: El porcentaje de mio-inositol marcado metabolizado encontrado en ácido fítico, lípido, pared selular soluble en TFA y fracciones de desecho celular. Fig . 24: La secuencia del fragmento de DNA amplificado del gene de mio-inositol O-metil transferasa (SEQ I D NO: 5) . Fig. 25: El mapa de restricción del vector pSI MT comprendiendo el cartucho promotor 35S-I MT-GUS-terminador Nos en pRD400 5. Fig . 26: El mapa de restricción del vector pNl MT comprendiendo un promotor selectivo de semilla-IMT-terminador Nos en pRD400. Fig. 27: Análisis de PCR de plantas transgénicas conteniendo el gene I MT. Fig. 28: Análisis Northern blot de plantas que expresan el gene IMT.

Fig. 29: Una gráfica de barras que ilustra la reducción de ácido fítico observado en plantas transgénicas. Fig. 30: Una tabla que ilustra la reducción de ácido fítico en plantas que crecieron en campo F1 , F2 y F3 conteniendo el vector pSI MT. Fig . 31 : Una tabla que ilustra la reducción de ácido fítico en plantas crecidas en campo F1 y F2 conteniendo el vector pN l MT.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN La presente invención se basa en la reducción o alteración específica de precursores de productos de metabolismo secundario que son distintos a los metabolitos primarios. En esta manera, se evitan los efectos perjudiciales potenciales de alterar las rutas metabólicas primarías para lograr un resultado similar. Así, la presente invención evita la manipulación de compuestos que pudieran ser considerados como metabolitos primarios. En una aplicación preferida, la disponibilidad de substrato es alterada al emplear una enzima, por ejemplo, una que es heteróloga a dicha célula de planta, capaz de actuar sobre dicho substrato, y la cual remueve el substrato de o modifica la biodisponibilidad del substrato en el depósito disponible de substratos. Una revisión generalizada del método y la relación de metabolismo primario y secundario se muestra en la figura 1 . El uso de una actividad de enzima heteróloga para alterar el flujo de productos en la ruta metabólica secundaria conduce a una modificación de un metabolito secundario objetivo deseado. Esto altera el flujo de productos en la ruta metabólica secundaria, conduciendo a una modificación de un metabolito secundario objetivo deseado. Al hacerlo de esta manera, el nivel de producto final de ciertos pasos enzimáticos dentro de la ruta metabólica secundaria es disminuido, mientras que, en contraste, para otros pasos en la ruta, el producto se acumula en altos niveles, inhibiendo las enzimas responsables de producir dicho producto. Esta inhibición de retroalimentación influencia a su vez, la producción del producto final de la ruta metabólica secundaria completa. Estos cambios en los niveles de productos de una ruta metabólica secundaria específica y rutas asociadas se logran al introducir novedosas actividades enzimáticas, las cuales alteran el flujo de bioquímicos (por ejemplo, substratos y productos de los mismos) a través de la ruta. Las enzimas heterólogas han sido expresadas en tejido de plantas, provocando la desviación metabólica de precursores dentro de estas rutas en substancias que se acumulan sin efectos perjudiciales en la célula de la planta. En algunas modalidades, productos valiosos o productos con efectos benéficos para la célula de la planta se forman como un resultado de este método. En una modalidad, el precursor enfocado es modificado entonces mediante la adición de una novedosa actividad de enzima. Un aspecto preferido de la invención contempla la selección de una enzima teniendo actividad heteróloga para la célula de la planta en la cual se expresa. Por ejemplo, la enzima es una que no esté normalmente asociada con la ruta metabólica secundaria en cuestión en la célula de la planta. La enzima usada puede ser de origen vegetal, animal o microbiano y puede ser modificada para expresión apropiada en células de plantas. La enzima heteróloga seleccionada es capaz de modificar el precursor para alterar su biodisponibilidad para la formación del metabolito secundario. Al usar una actividad de enzima heteróloga para la célula en la cual se expresa, los mecanismos de control bioquímico normales son desviados y el metabolismo secundario es alterado en una manera predecible. Es de particular interés dentro del alcance de la presente invención, la modificación de los productos de la ruta metabólica secundaria relacionada con alcoholes de azúcar y la ruta metabólica secundaria de fenilpropanoide. Ejemplos adicionales de la utilidad del presente método se encuentran en la alteración de niveles de compuestos de azúcares modificados, tales como, galactosa y glicósídos de sucrosilo anti- nutricionales, tales como, estaquiosa y rafinosa. La galactosa se convierte en galactinol, que es uno de los precursores para la formación de estos glicósidos de sucrosilo anti-nutricionales. La forma precursora de galactosa es la forma conjugada referida como U DP-galactosa. Como un método contemplado dentro de la presente invención, la formación y acumulación de U DP-galactosa (y conversión subsecuente a galactinol) es prevenida al utilizar una actividad de enzima heteróloga para células de planta, siendo capaz dicha enzima de alterar los niveles de UDP-galactosa. La enzima UDP-galactosa 4-epimerasa (galE) está involucrada en uno de los principales pasos de metabolismo de galactosa en sistemas vivientes. Cataliza la conversión de U DP-galactosa en U DP-glucosa. El gene para la enzima está disponible de humanos, levaduras y bacterias. En la presente invención, se contempla el uso de una enzima codificada de manera bacteriana. Como una consecuencia de la expresión de esta enzima heteróloga en una célula de planta, la disponibilidad de UDP-galactosa sería reducida y un compuesto benéfico, UDP-glucosa sería producido. Se cree completamente que la expresión de la enzima UDP-galactosa 4-epimerasa conduciría a biosíntesis reducida de galactinol, el cual es uno de los precursores de los glicósidos de sacarosa anti-nutricionales. Además de reducir la proporción de acumulación de los glicósidos de sacarosa indeseables, la actividad de la enzima recién introducida conduciría a disponibilidad intensificada de UDP-glucosa, y subsecuentemente a la formación de sacarosa. Se esperaría que lo último participara en , e intensificara , la actividad de otras rutas metabólicas donde se necesita la sacarosa, ya sea para una fuente de carbono para productividad de planta intensificada (por ejemplo, proteínas, l ípidos, rendimiento global, etc.) o directamente como sacarosa acumulada. Todavía otras aplicaciones del método pueden ser contempladas dentro del alcance de la presente invención. Es posible alterar los niveles de varios derivados de azúcar, tales como, glucosa-1 -fosfato y glucosa-6-fosfato al usar la enzima fosfoglucomutasa (pgm). Esta enzima cataliza la interconversión de glucosa-1 - y glucosa-6-fosfato (Glc-1 -P, Glc-6-P) en la síntesis y consumo de sacarosa. La enzima juega un papel pivotal en la síntesis y utilización de sacarosa, almidón y glicógeno, y está presente en todos los organismos. El gene para esta enzima está disponible de una variedad de fuentes eucarióticas así como bacterianas (por ejemplo, Agrobacterium). Glc-6-P es un material de inicio mayor para una variedad de interconversiones de azúcar, una de las cuales es la síntesis de mio-inositol-1 -P. El último es un substrato mayor y co-factor en la síntesis de ácido fítico y los glicósidos de sucrosilo anti-nutricionales, respectivamente. Podría esperarse que la expresión de la enzima disminuyera el nivel de Glc-6-P que se traduciría en niveles inferiores de los factores anti-nutricionales antes mencionados. De esta manera, pueden contemplarse las alteraciones metabólicas dentro del alcance de la presente invención. El método no está restringido a ninguna ruta metabólica secundaria particular. Tampoco está restringido el método a alguna especie de planta particular. En su lugar, el método puede ser aplicado a alterar rutas metabólicas secundarias comunes a muchas especies de cosecha comercialmente valiosas, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, o a enfocar un metabolito secundario teniendo significancia única para una cosecha específica. La base bioqu ímica para el método de la presente invención se encuentra en el concepto de la regulación de actividad enzimática mediante la disponibilidad de substratos. En general, las velocidades enzimáticas están influenciadas por la disponiblidad de substratos. En otras palabras, una enzima producirá producto a una velocidad proporcional para la cantidad de substrato disponible. La reducción de concentración de substrato conduce a menores niveles de producto. Adicionalmente, muchas enzimas están sujetas a inhibición de producto final , significando que la velocidad enzimática es reducida en la presencia de un gran exceso del producto final. De ahí, al alterar los niveles de substratos disponibles o productos enzimáticos, puede cambiarse la producción global de compuestos producidos por una ruta bioquímica. Ejemplos de rutas metabólicas secundarias que pueden ser alteradas por la presente invención incluyen biosíntesis de. isoprenoides, biosíntesis de alcaloides, biosíntesis de terpenoides, biosíntesis fenólica, biosíntesis de alcoholes de azúcares, o cualquier otra ruta metabólica secundaria que produce compuestos de naturaleza anti-nutricional o comercialmente valiosa. Los metabolitos secundarios específicos que pueden ser modulados por la presente invención incluyen compuestos fenólicos anti-nutricionales, tales como, sinapina o glucosinolatos en cruciferas, productos de alcohol de azúcar, tales como, ácido fítico o estaquiosa y rafinosa, gosipol en algodón, nicotina, ácido clorogénico, taninos condensados o cualquier otro metabolito secundario anti-nutricional. El compuesto de ácido clorogénico es común en soya, algodón, girasol y se deriva de ácido cafeico, un compuesto producido dentro de la ruta de fenilpropanoide. Todavía otros compuestos anti-nutricionales incluyen saponinas, compuestos anti-nutricionales encontrados en muchas plantas, incluyendo alfalfa. Las saponinas son glicósidos de alto peso molecular, consistiendo de una porción de azúcar enlazada a una aglicona de esteroide o triterpeno. Existen al menos tres clases de saponinas conocidas, los glicósidos de triterpeno, glicósidos de esteroides y glicósidos de alcaloides esteroides. La biosíntesis de saponinas en plantas involucra el escualeno como material de inicio. Otras clases importantes de los metabolitos secundarios, tales como, fitoesteroles, cardenólidos, cucurbitacinas, cuasinoides y limónidos también se derivan del escualeno. Las saponinas en exceso en las dietas animales están asociadas con la condición conocida como empastamiento. La presente invención es ejemplificada mediante demostración de la utilidad del método en una variedad de rutas metabólicas secundarias no relacionadas. Sin embargo, la utilidad del método para modificar cualquier ruta metabólica secundaria de planta será evidente para el trabajador experto y se proporciona un método general para realizar la invención. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos y composiciones de DNA para la alteración de contenido de sinapina y compuestos fenólicos relacionados en plantas. En otra modalidad, la invención proporciona células de plantas modificadas en el contenido fenólico y semillas de plantas con contenido fenólico reducido, en particular, plantas cruciferas con contenido de sinapina reducido. En otra modalidad, la presente invención proporciona métodos y composiciones de DNA para la alteración de contenido de ácido fítico en células de plantas, un producto de la ruta metabólica secundaria de alcohol de azúcar. En otra modalidad, la invención proporciona células de plantas modificadas en el contenido de ácido fítico y semillas de plantas con ácido fítico reducido. En otra modalidad, la invención proporciona semillas de plantas con contenido de ácido fítico reducido adecuadas para aplicaciones alimenticias, semillas de plantas con contenido de ácido fítico reducido adecuado para la preparación de harina modificada y células de plantas con un metabolismo de alcohol de azúcar (inositol) modificado. Cada ruta metabólica secundaria en plantas tiene asociada a ella un número limitado de enzimas y substratos para estas enzimas, que son únicos o usados en una manera única. La ruta metabólica secundaria puede producir varios compuestos que son usados o están presentes a lo largo de la planta. Así, como un medio para alterar el metabolismo secundario, las actividades enzimáticas únicas se usan para alterar específicamente el flujo de compuestos a través de la ruta específica. Con el fin de proporcionar una ilustración de la utilidad del método, se modificaron dos rutas metabólicas secundarias distintas de acuerdo con el método de la presente invención. A continuación se proporciona información sobre estas rutas que ayuda a brindar un entendimiento completo de la naturaleza del método.

(A) RUTA METABOLICA SECUNDARIA PARA M ETABOLISMO DE FEN I LPROPANOI DE Las plantas producen una variedad de compuestos fenólicos mediante la ruta de fenilpropanoide, una ruta metabólica secundaria. El metabolismo de fenilpropanoide ha sido implicado entre muchos procesos fisiológicos en plantas, incluyendo resistencia a la enfermedad, protección contra luz UV y regulación de crecimiento de la planta. Los productos de esta ruta son requeridos para biosíntesis de suberina y lignina, las cuales son componentes de tejidos de plantas y están involucradas en la formación de la fibra de la planta, un término general que se relaciona con un carbohidrato sub-metabolizado en la semilla o harina de la semilla. Se cree que la lignina está involucrada en la formación de fibra insoluble y de ahí que altos niveles de lignina en semilla o harina estén correlacionados con utilización ineficiente de harina o semilla, particularmente en animales monogástricos. De ahí que los fenoles de la planta, particularmente los precursores fenólicos de la lignina, pueden ser considerados como factores anti-nutricionales para alimento animal, y la reducción o alteración apropiada de fenoles de la planta, en particular, fenoles usados en la formación de lignina, pueden proporcionar una harina que sea superior. Los fenoles de la planta también están involucrados en la formación de otros diversos compuestos, algunos de los cuales también son anti-nutricionales por naturaleza. La presente invención proporciona un medio para reducir compuestos fenólicos específicos que son considerados anti-nutrícionales en células de plantas, semillas o harinas usadas para alimento. En particular, la presente invención contempla la reducción de la sinapina, compuesto anti-nutricional de sabor amargo (o sinapoil colina) en células de plantas que la producen. También se piensa que forma complejos con proteínas en la harina, reduciendo la disponibilidad de la proteína para digestión y utilización por el animal. El sabor amargo también puede afectar los niveles de alimentación. Adicionalmente, cuando se alimenta a algunas especies de gallinas ponedoras de huevos de cascarón rojo, la sinapina provoca un olor a pescado inaceptable en los huevos. La proporción de harina conteniendo sinapina en estos casos necesita ser mantenida por debajo de ca. 10%, y esto limita el uso de harina conteniendo sinapina en estas formulaciones de alimento. De ahí que la reducción de sinapina en semillas o harina de semillas de cruciferas sea un objetivo comercial importante. La producción de sinapina ocurre como una extensión de la ruta de fenilpropanoide. La ruta definida dentro del alcance de la presente invención incluye los pasos bioquímicos que conducen a la formación de ácido sinápico, así como las rutas bioquímicas que ramifican de varios pasos, tales como, las rutas de ramificación que conducen a la formación de monómeros de lignina y otros bioquímicos derivados de productos de la ruta de fenilpropanoide. En la ruta de fenilpropanoide, L-fenilalanina, un aminoácido aromático, es un substrato para la enzima fenilalanina amoniaco liasa (PAL). La actividad enzimática de PAL conduce a la formación de ácido cinámico, el cual es un substrato para cinamato-4-hidroxilasa (C4H). El producto de C4H es ácido p-coumáríco, el cual es un precursor para muchos compuestos flavonoides, algunos de los cuales también pueden ser formados a partir de L-tirosina mediante la acción de la enzima tirosina amoniaco liasa (TAL). El ácido coumárico también puede servir como un precursor para la biosíntesis de lignina. La enzima p-coumarato-3-hidroxilasa (C3H) actúa sobre ácido p-coumárico para formar ácido cafeico. El ácido cafeico es metabolizado por cafeato/5-hidroxiferulato-O-metiltransferasa (OMT) para formar ácido ferúlico. El ácido ferúlico es uno de los tres monómeros fenólicos primarios conocidos usados para la biosíntesis de lignina. El ácido ferúlico también puede ser un substrato para la enzima ferulato-5-hidroxilasa (F5H) que forman ácido 5-hidroxiferúlico, el cual puede ser modificado adicionalmente por la enzima OMT para formar ácido sinápico. El ácido sinápico es el otro monómero de lignina fenólico mayor. El ácido sinápico también puede ser conjugado para formar sinapoil glucosa mediante la acción de la enzima U DP-glucosa sinapoiltransferasa (SGT). La sinapoil glucosa sirve como el substrato para sinapoil glucosa:colina sinapoil transferasa (SCT) , conduciendo a la formación de sinapoil colina o sinapina. Estos últimos dos pasos son frecuentes en cruciferas y en Brassicas la acumulación de sinapina en la semilla representa el compuesto fenólico no polimérico mayor encontrado en la semilla madura. Una ruta generalizada para metabolismo de fenilpropanoide es mostrada en la Figura 2. Se debería notar que actividades enzimáticas adicionales pueden ser parte de la ruta de fenilpropanoide en ciertas especies de plantas. La sinapina o sinapoil colina es el compuesto fenólico más abundante en semillas de cruciferas, y en ß. napus puede contribuir tanto como 4% de la harina (Blair y Reichert, 1984. , J Sci . Food Ag rie. 35: 29) . La síntesis de sinapina ocurre en semillas inmaduras que todavía tienen apariencia ligeramente verdes, y parece no haber degradación neta alguna conforme maduran las semillas (Vogt et al. , 1993. , Arch. Biochem. Biophys. 300: 622). Las plántulas en desarrollo (es decir, semillas germinando) degradan la sinapina mediante una reacción de esterasa que produce ácido sinápico y colina. Se ha postulado, pero no se ha probado, que la degradación de sinapina pudiera proporcionar el suministro de colina para síntesis de fosfolípido durante la germinación de semillas (Strack et al. , 1981 . , Z. Naturforsch. 36c: 21 5). Sin embargo, debido a que la mayoría de las no cruciferas no tienen sinapina en sus semillas, es poco probable que la sinapina sea un compuesto esencial para el desarrollo de la semilla o germinación en general. Se han aislado mutantes defectuosos en la ruta de fenilpropanoide general en Arabidopsis thaliana (Chapple et al. , 1992. , The Plant Cell 4: 141 3-1424) . Aunque estos mutantes proporcionan un excelente marco de trabajo para estudios fisiológicos, bioquímicos y genéticos, no son de valor agronómico debido a las consecuencias negativas de la mutación, la cual incluye hipersensibilidad a luz UV debido a la manifestación del fenotipo mutante a lo largo de la planta, particularmente en las hojas. Estos mutantes, designados SIN 1 (mutantes de biosíntesis de malato de sinapoilo), bloquean la síntesis de esteres de ácido sinápico, reduciendo el contenido de sinapina (un éster de sinapoil-colina) y alteran adicionalmente la composición de monómero de la lignina de la planta. La alteración del contenido de lignina puede conducir a plantas con lignina de composición única y de ah í fibra de planta alterada. Chapple et al. discuten además la posibilidad de usar mutantes, tales como SIN 1 para reducir el contenido de lignina o alterar el contenido de lignina en semillas de cruciferas importantes, tales como, semilla de cañóla, pero no existe dirección de cómo puede lograrse esto. Se contempla además que la reducción de sinapina en semillas de cañóla es un objetivo importante, sin embargo no se proporciona dirección alguna de cómo puede lograrse esto usando la mutación SI N 1 . Dada la aparente sensibilidad a UV del mutante SIN 1 , la mutación tiene poco valor para usarse bajo condiciones agrícolas. Aunque no se han descrito métodos para reducir el contenido de sinapina en las semillas, la mutación de SI N 1 proporciona una importante prueba científica, de que la sinapina no es un componente esencial del crecimiento y desarrollo de plantas, y que la semilla con sinapina reducida es capaz de crecer y desarrollarse. Sin embargo, la mutación SI N 1 , no proporciona un método para reducir el contenido de sinapina en semillas de cruciferas comercialmente producidas sin la sensibilidad UV perjudicial asociada. Además de compuestos fenólicos anti-nutricionales, tales como, sinapina, muchos productos de la ruta de fenilpropanoide están involucrados en la formación de lignina. La biosíntesis de la lignina es parte de la ruta biosintética de fenilpropanoide general, la cual produce al menos tres precursores fenólicos primarios, ácidos coumárico, ferúlico y sinápico, productos que son polimerizados en lignina y otros compuestos fenólicos.

La bioqu ímica de la formación de ligninas a partir de estos precursores es compleja y existe una variedad de otras enzimas involucradas, tales como, ácido cafeico/ácido 5-hidroxiferúlico-O-metiltransferasa (COMT), cafeoil-CoA-reductasa (CCoAOMT) , alcohol cinam ílico deshidrogenasa (CAD), cinamoil-CoA-reductasa (CCR), peroxidasa, 4-coumarato:CoA ligasa (4CL) y beta-glucuronidasa específica de coniferina (CBG). Otras enzimas pueden estar involucradas y la bioquímica completa de formación de lignina todavía no se entiende completamente. La lignina es un pol ímero complejo compuesto principalmente de unidades interconectadas de estos fenólicos monoméricos en varias proporciones y con diferentes tipos de enlaces en distintos tipos de células y en diversas especies. Las ligninas son componentes esenciales de paredes celulares de plantas, donde los tejidos requieren fuerza mecánica o están involucradas en conducción de agua. Adicionalmente, se cree que las ligninas están involucradas en mecanismos de resistencia a patógenos. En las dicotiledóneas es común la guaiacil-siringil lignina, comprendida tanto por unidades de guaiacilo derivadas de ácido ferúlico y residuos de siringilo derivados de ácido sinápico. De acuerdo con esto, se requiere tanto ácido sinápíco como ferúlico para la formación de lignina tipo natural. Se piensa que la capacidad de degradación o procesamiento de la madera, por ejemplo, durante la formación de pulpa, es altamente dependiente de la composición de monómeros de la lignina, la cual se basa principalmente en la disponibilidad de monómeros de lignina específicos. Se cree que la presencia de los grupos 5-O-metilo en las ligninas de siringilo derivadas de sínapoilo reduce la reticulación , debido a que hace más fácil procesar la lignina compuesta principalmente de unidades de siringilo que lignina compuesta principalmente de unidades de guaiacilo derivadas de ácido ferúlico. De acuerdo con esto, métodos para incrementar el contenido de lignina de siriginilo pueden conducir a harina que es más digerible debido a la reticulación reducida de la lignina. La digestibilidad de cosechas de forraje es influenciada por la cantidad de fibra debido a que las ligninas reticuladas son resistentes a la degradación y actúan para unir físicamente los componentes de las paredes celulares. A partir de lo anterior, es evidente que cualquier intento para mejorar la harina de la semilla al disminuir o eliminar la sinapina, y alterar el contenido fenólico general, debería estar enfocado a las semillas en desarrollo. Con el fin de que la ruta bioquímica para la síntesis de sinapina sea alterada de manera específica en las semillas, es muy apropiada una aproximación genética molecular, en vista de la carencia de plasma de germen que proporcione de manera natural un rasgo de sinapina baja. En una modalidad, la presente invención declara un método que altera el nivel de compuestos fen?licos en semillas y altera adicionalmente el nivel de ácido sinápico y compuestos fenólicos relacionados. El método se basa en la introducción de actividades enzimáticas novedosas que afectan la disponibilidad de compuestos usados como precursores y substratos para enzimas en la ruta de fenilpropanoide. La supresión o un cambio en la abundancia de estos compuestos conduce a un cambio bioqu ímico en la ruta normal y la producción de niveles alterados de varios productos de fenilpropanoides. Como un ejemplo del método, una novedosa actividad enzimática, colina oxidasa (COX) es empleada para reducir los depósitos de colina en una célula de planta, particularmente en la semilla de la planta. La colina se usa, entre otras cosas, para la producción de sinapina a partir de sinapoil glucosa. La reducción del depósito de colina provoca la alteración de los niveles del depósito de los precursores de sinapina (colina y sinapoil-glucosa), y de ahí cambia la composición de los precursores formados en etapas enzimáticas anteriores de la ruta de fenilpropanoide, incluyendo ácido sinápico. El resultado es una semilla con contenido de sinapina enormemente reducido y contenido fenólico alterado. Se sabe que la oxidación de la colina por colina oxidasa produce peróxido de hidrógeno. La producción de peróxido de hidrógeno en células de plantas es considerada benéfica y de esta manera, existe un beneficio adicional para expresar la colina oxidasa en plantas. Como una ilustración de un aspecto adicional del método, una segunda actividad enzimática, betaína aldeh ido deshidrogenasa (BADH), es empleada para intensificar la conversión del producto de colina oxidasa, betaína aldeh ido, en glicinabetaína, la cual funciona como un protector para tensión. El compuesto betaína es un valioso compuesto para diversas aplicaciones en la industria alimenticia y como un aditivo para intensificar el crecimiento de plantas. De acuerdo con esto, un efecto benéfico de alterar el contenido fenólico en células de plantas y la reducción específica de sinapina es mostrado por la reducción de un precursor simple en la ruta de fenilpropanoide. Para alguien experto en la técnica, es claro que pueden emplearse otras enzimas dentro del alcance del método para alterar otros diversos productos finales en la ruta de fenilpropanoide. Otro ejemplo dentro del alcance de la presente invención es el uso de novedosas actividades enzimáticas para degradar ácido ferúlico, también formado en la ruta de fenilpropanoide. De los tres monómeros de lignina principales, se cree que el ácido ferúlico dota la fuerza y rigidez estructural a la arquitectura de la pared celular mediante cadenas de pentosas reticulantes, arabinoxilanos y hemicelulosas, haciendo a las paredes celulares más rígidas y menos susceptibles a la degradación enzimática. De esta manera, como un componente de lignina, el ácido ferúlico juega un papel importante en la fuerza mecánica de los tejidos de plantas. La alteración del nivel de ácido ferúlico en una manera específica puede conducir a muchos efectos benéficos. El ácido ferúlico es sintetizado dentro de la ruta de fenilpropanoide general como se describió antes, y sirve como un precursor para varios productos de la ruta (revisada en JPN Rosazza et al. , Journal of I ndustrial Microbiology 15: 457-471 , 1995; R Whetten y R Sederoff, Plant Cell 7: 1 001 -1 01 3, 1995; RA Dixon y NL Paiva, 1995, Plant Cell 7: 1 085-1097, 1 995). El presente método proporciona un medio para modular los niveles de ácido ferúlico, alterando con ello la producción de otros diversos componentes en la ruta de fenilpropanoide, en particular, sinapina. Un aspecto de la presente invención declara un método que altera el nivel de ácido ferúlico en células de plantas. El método se basa en la introducción de actividades enzimáticas heterólogas que metabolizan ácido ferúlico. Algunas de las enzimas también pueden producir compuestos de utilidad comercial. Por ejemplo, se usa la enzima ácido ferúlico decarboxilasa, produciendo el compuesto vinilguaiacol, un compuesto que puede usarse como una materia prima industrial y puede acumularse en células de plantas sin un efecto perjudicial. La supresión o un cambio en la abundancia de ácido ferúlico conduce a un cambio bioquímico en la ruta de fenilpropanoide normal y la producción de niveles alterados de varios productos de fenilpropanoide. El método de acuerdo con la invención no está limitado a la ruta de fenilpropanoide. Como un ejemplo de la utilidad de la presente invención, se muestra la modificación de la ruta metabólica secundaria que produce alcoholes de azúcar.

(B) RUTA METABOLICA SECUN DARIA PARA METABOLISMO DE ALCOHOL DE AZÚCAR La presente invención también proporciona , métodos y composiciones de DNA para la alteración de contenido de alcohol de azúcar en células de plantas. Como un resultado de la aplicación del método de la presente invención, se presentan células de plantas modificadas en compuestos derivados de alcoholes de azúcar, tales como, ácido fítico, estaquiosa, rafinosa, glicósidos de sucrosilo, urónicos y pentosas, fosfoinositidos y glicofosfoceramidas. Como resultado, en algunas modalidades de la invención, se obtienen semillas de plantas con ácido fítico reducido. La invención también proporciona semillas de plantas con contenido de ácido fítico reducido adecuado para aplicaciones alimenticias, semillas de plantas con contenido de ácido fítico reducido adecuadas para la preparación de harina modificada y células de plantas con metabolismo de inositol modificado. Otros compuestos derivados del metabolismo de alcohol de azúcar también son alterados por la presente invención , incluyendo compuestos derivados de alcoholes de azúcar anti-nutricionales, tales como, estaquiosa y rafinosa. Es de particular relevancia para aplicaciones alimenticias la semilla de planta modificada en el contenido de fitato. El fitato es un componente significativo de muchas semillas que normalmente representan 2-4% de la masa de la semilla, pero pueden alcanzar niveles de 10% en algunas especies. La presencia de altos niveles de fitato en raciones de alimentos se ha enlazado a la pérdida de apetito, tamaño de camada reducido y otros factores de desempeño negativos. Estos efectos son probables debido a la capacidad de unión de cinc del fitato. Los complejos de ácido fítico con otros componentes de semillas son referidos de manera general como, fitina. Altos niveles de fitina están asociados de manera similar con efectos negativos. Además de los efectos destrozadores en el desempeño alimenticio, la presencia de ácido fítico en las formulaciones de alimento también conduce a una variedad de consecuencias ambientales indeseables. En animales monogástricos, el fósforo asociado con ácido fítico generalmente no está disponible, así , debe adicionarse fósforo a la dieta, lo cual representa un costo adicional. El fósforo asociado con ácido fítico es excretado por animales monogástricos y subsecuentemente la descomposición de las heces por microbios conduce a la liberación al ambiente del fósforo contenido dentro del ácido fítico. Los altos niveles de ácido fítico en muchas harinas de semillas resultan en una cantidad significativa de fósforo excretado. La producción de ganado continuamente en aumento ha conducido frecuentemente a la eutroficación de suministros de agua y otros problemas ambientales relacionados con la contaminación de fósforo. Se espera que estos problemas aumenten y puedan convertirse en una limitación mayor para la producción de ganado en el futuro. De esta manera, los métodos para reducir el nivel de ácido fítico excretado serán un beneficio significativo para mejorar estos problemas ambientales. Aunque los costos reales asociados con adicionar fósforo a una formulación no son una fracción significativa de los costos del alimento, las consecuencias ambientales de fósforo excretado generan costos asociados significativos que podrían ser evitados a través de la producción de harinas de fitato bajo. En animales rumiantes, la presencia de una fauna microbiana en el rumen puede provocar la liberación del fósforo contenido dentro del ácido fítico, y de ahí que el fósforo se vuelva disponible. Como resultado, la cantidad de fósforo adicionado en porciones de rumen es reducida enormemente en comparación con animales monogástricos. Sin embargo, la cantidad de ácido fítico en la mayoría de las semillas de plantas excede aquélla que realmente es requerida, siendo aún así una preocupación mayor la contaminación de fósforo en rumiantes.

A la fecha, los métodos predominantes que han sido contemplados para reducción de fitato han sido dirigidos en su mayoría a la degradación de fitato mediante la acción de la fitasa, enzima contenida dentro de la harina. Aunque este método resulta en una mayor disponibilidad de fósforo, no permite la producción de semillas o harina con contenido de ácido fítico reducido, únicamente harina donde el fósforo contenido dentro del ácido fítico generalmente está más disponible. De esta manera, el uso de la enzima fitasa encuentra utilidad únicamente para hacer más disponible al fósforo en el ácido fítico. La actividad de fitasa es encontrada comúnemente en microorganismos, tales como, mohos (Aspergillis), bacterias (Bacillus, Pseudomonas) y levaduras (Saccharomyces). La remoción de fitato al tratar materiales de plantas con mezclas de enzimas conteniendo fitasa microbiana es descrita, por ejemplo, en la patente estadounidense no. 5,554,399. La mayoría de los microbios sintetizan una variedad de actividades de fitasa, las cuales pueden incluir la actividad de fitasa por sí misma además de varias fosfatasas que degradan adicionalmente el ácido fítico. La liberación completa del fósforo disponible a partir de ácido fítico puede ser dependiente de una variedad de actividades enzimáticas distintas. También se ha descrito la aproximación alternativa de transformar plantas para producir fitasa microbiana. US 5, 593,963 describe la expresión de fitasa en plantas transgénicas bajo el control de secuencias reguladoras que incluyen aquéllas capaces de dirigir la expresión ya sea de m anera constitutiva o en una manera específica de tejido o etapa.

Pueden producirse células de plantas, o más específicamente células de semillas de plantas, las cuales contengan una actividad de fitasa que pueda liberar una porción del fósforo contenido dentro del ácido fítico. Sin embargo, la simple liberación de fósforo a partir de ácido fítico no dirige completamente el problema de reducir desecho de fósforo y los efectos anti-nutricionales potenciales del ácido fítico. De manera más importante, no se reduce la presencia de ácido fítico en complejo o fitato. La técnica publicada proporciona medios para liberar fósforo de ácido fítico, pero no proporciona un medio para controlar los niveles de ácido fítico producido. Cualquier medio por el cual los niveles de ácido fítico pudieran ser manipulados convenientemente, encontrarían gran utilidad en las aplicaciones de alimentos. Por ejemplo, semillas de plantas con niveles de ácido fítico reducido proporcionarían una harina con mayor disponibilidad de minerales. Las semillas de plantas con ácido fítico reducido también proporcionarían una harina de semilla con fitina reducida, y por lo tanto, pudiera ser más nutritiva y digerible debido a la reducción de complejos de ácido fítico. Además de las harinas nutrícionalmente mejoradas, las harinas de ácido fítico reducido resultarían en menor liberación de fósforo al ambiente y menor contaminación. Aunque los medios para liberar fósforo a partir de ácido fítico pueden reducir el nivel de fósforo adicionado y excretado, los niveles reales de ácido fítico y de ahí el fósforo potencialmente disponible, están en exceso de los requerimientos de nutrición de fósforo en la m ayoría de los animales.

De acuerdo con esto, los métodos para manipular los niveles de ácido fítico encontrarán utilidad en todas las aplicaciones de alimentos y adicionalmente, proporcionan composiciones de alimentos y harina que son novedosas y valiosas. En vista de estas preocupaciones, es evidente que un medio por el cual pudiera regularse la producción de fitato durante el desarrollo de la semilla sería útil y proporcionaría una solución a los problemas asociados con la contaminación de fósforo y efectos anti-nutricionales de ácido fítico. Adicionalmente, un mecanismo genético que encontraría utilidad a través de un amplio rango de especies de planta sería particularmente valioso. La presente invención proporciona tales soluciones. La apreciación del mecanismo bioquímico responsable de la formación de ácido fítico es requerida para entender el alcance de la presente invención. Aunque la biosíntesis de ácido fítico no es entendida completamente, existe una variedad de pasos clave que son conocidos. El ácido fítico es el derivado de hexafosfato de mio-inositol; la ruta bioquímica que sintetiza ácido fítico utiliza mio-inositol, un alcohol de azúcar, exclusivamente como el substrato inicial. Este compuesto (mio-inositol, también comúnmente referido como inositol) también es central para la producción de otros derivados de mio-inositol y epímeros. Algunos de estos derivados, tal como, sucrosil glicósidos, también son compuestos anti-nutricionales y de ahí la reducción de estos compuestos también es deseable. El mio-inositol es un alcohol de azúcar que es ubicuo en células de plantas. Sin embargo, la sim ple protección de cualquiera de los grupos de hidroxilo de mio-inositol lo hace inadecuado para la biosíntesis de ácido fítico y otras rutas. La protección de mio-inositol puede lograrse in vivo mediante metilación a sitios específicos por varias metíl transferasas. Por ejemplo, el mio-inositol es convertido a ononitol a través de la monometilación en la posición 6. La metilación en la posición 5 produce secuoyitol, el cual es epimerizado a pinitol. El pinitol no puede ser usado para biosíntesis de ácido fítico. Los derivados metilados de mio-inositol son conocidos para conferir propiedades benéficas a la planta, tal como, tolerancia de tensión y están involucrados en transporte de solutos y proteínas de membranas estabilizantes. De esta manera, la modificación de inositol mediante el uso de actividades enzimáticas heterólogas normalmente no asociadas con metabolismo de alcohol de azúcar es contemplada dentro del alcance de la presente invención. La bioquímica de la formación de fitato no está bien entendida, sin embargo, se conocen al menos dos rutas potenciales para la formación, y parece haber una variedad de actividades enzimáticas diferentes involucradas en la biosíntesis de ácido fítico. El fitato es encontrado en la mayoría de los tejidos de las plantas, sin embargo, es particularmente frecuente en semillas y polen, lo cual soporta un papel predicho en almacenamiento de fósforo. Así, ha sido difícil idear un medio para modificar la biosíntesis de fitato por medios convencionales, particularmente debido a que no se entiende bien la bioquímica de su formación . Con el fin de minimizar la producción de ácido fítico, la presente invención describe métodos y composiciones de DNA que codifican una o unas enzimas que modifican mio-inositol , previniendo la utilización de mío-inositol en la biosíntesis de ácido fítico. La presente invención contempla el uso de un gene de metil transferasa heterólogo para metilar de manera específica el mio-inositol en las semillas, particularmente los tejidos en las semillas responsables de la biosíntesis de ácido fítico. (Por heteróloga se quiere decir una enzima que normalmente no está asociada con la biosíntesis de fitato en dicha célula de planta.) La invención utiliza una actividad de enzima heteróloga obtenida de una planta halofítica, una actividad enzimática no encontrada en plantas de cosecha convencionales, tales como, maíz, soya, algodón, alfalfa, trigo, cebada, centeno, sorgo, girasol, semillas oleaginosas de Brassica y otras cosechas cultivadas de manera convencional . La producción de metil inosítol a partir de mio-inositol también proporciona el beneficio adicionado de producir un compuesto inocuo sin efecto perjudicial para la célula de la planta. De esta manera, se reduce la producción de ácido fítico mediante la reducción del depósito de mio-¡nositol disponible. El fitato es uno de los principales factores anti-nutricionales en la harina de semilla. Los efectos anti-nutricionales de ácido fítico incluyen unión de minerales, formación de complejos con proteína y otros efectos negativos, particularmente aquéllos relacionados con la excreción de exceso de fósforo en la forma de ácido fítico, el cual es metabolizado en el ambiente, creando contaminación de fósforo. De acuerdo con esto, métodos para reducir el ácido fítico en células de plantas tienen utilidad en aplicaciones alimenticias. En la acuacultura , niveles de ácido fítico altos también son un problema mayor para el uso de proteína derivada de planta como un substituto para harina de arenque. De esta manera, los métodos para reducir el contenido de ácido fítico de células de planta, en particular células de tejido de planta usadas para alimento para animales, son valiosos y tienen gran utilidad. Los métodos para reducir contenido de ácido fítico de semillas de plantas a través de un amplio rango de especies de plantas usadas para alimento para animales son particularmente valiosos para la industria alimenticia. El gene de planta que codifica mio-inositol-O-metil transferasa (IMT) ha sido aislado de Mesembryanthemum crystallinum (escarchada) y se ha mostrado que esta enzima convierte el mio-inositol a pinitol en plantas transgénicas heterólogas (patente estadounidense no. 5, 563,324). Este gene de planta ha sido colocado bajo el control de un promotor constitutivo con el objetivo de incrementar la tolerancia a la tensión en plantas por sobreproducción del derivado metilado de mio-inositol, ononitol, el cual puede ser epimerizado subsecuentemente a pinitol. En la presente invención, el gene de planta es colocado bajo el control de un promotor selectivo de semilla para alterar el metabolismo de inositol en la semilla. Se mostró que la producción de pinitol descrita en la patente estadounidense no. 5, 563, 324 confiere tolerancia a sal cuando se expresó constitutivamente en plantas de tabaco transgénico. De manera similar, la expresión de una manitol 1 -P deshidrogenasa bacteriana, cuando se expresa constitutivamente en una célula de planta cataliza la producción de manitol, un alcohol de azúcar o poliol, y provoca que la célula de planta se vuelva tolerante a la tensión por sal . De ahí, la patente estadounidense no. 5, 563, 324 describe la producción de alcoholes de azúcar mediante el uso de una enzima capaz de producir un alcohol de azúcar a partir de azúcares naturales para células de plantas como un medio para conferir tolerancia a sal en células de plantas. Sin embargo, la patente estadounidese no. 5,563, 324 no proporciona ninguna dirección para el uso de un gene capaz de modificar mio-inositol para prevenir el uso de mio-inositol como un precursor de otros compuestos, los cuales comprenden derivados naturales. Sin embargo, la patente estadounidense no. 5,563,324 proporciona clara evidencia de que la modificación de mio-inositol no conduce a efecto negativo alguno en la planta, y de aquí que no se esperaría que las manipulaciones de los niveles de mio-inositol conduzcan a efectos perjudiciales. De acuerdo con esto, no se anticipa la posibilidad de que la modificación de mio-inositol por un gene de metil transferasa sea perjudicial para células de la planta y se sabe que el producto metilado de esta reacción enzimática es inocuo para células de la planta. Sin embargo, el mio-inositol es fundamental para muchos aspectos diferentes del crecimiento y desarrollo de la planta. Además de su papel como el precursor de la biosintesis de ácido fítico, el mio-inositol también es usado para la biosíntesis de urónido y pentosa, también está presente en fosfoinositidos de membranas celulares de la planta, así como otros lípidos complejos de la planta incluyendo glicofosfoceramidas. Adicionalmente, también es un precursor de otros isómeros de inositol que ocurren de manera natural, y muchos de éstos, así como el mio-inositol, son distribuidos como metil éteres en un patrón específico de la especie a lo largo del reino vegetal. El papel del mio-inositol en el metabolismo de la planta general es grande, y la modificación del depósito de mio-inositol pudiera tener consecuencias no previstas, especialmente bajo condiciones de crecimiento agronómico. Aunque la patente estadounidense no, 5,563,324 describe la expresión constitutiva del gene de metil transferasa, no proporciona evidencia alguna de que las plantas resultantes tengan utilidad . En la patente estadounidense 5,563,324 se declara que: "Aún si genes recién insertados no hacen que una planta se desempeñe mejor en condiciones agrícolas, las plantas transgénicas portando tales genes son útiles para fines de investigación sobre cómo afectan los cambios en los procesos internos de las plantas (por ejemplo, regulación osmótica) el rendimiento de campo de las plantas". (Columna 2, l íneas 60-65). De ahí, la patente estadounidense 5,563,324 no anticipa la manipulación de los niveles de mio-inositol para la reducción de ácido fítico o espera completamente que las plantas con características agronómicas útiles, y de ahí que la utilidad, resultará de las enseñanzas contenidas en la misma. De acuerdo con esto, la patente estadounidense no. 5, 563,324 describe la expresión de un gene modificador de mio-inositol en plantas completas para los fines de tolerancia de tensión o estudio científico adicional. De acuerdo con esto, se cree por completo que una novedosa aproximación para la reducción de ácido fítico es mostrada por la presente invención . El uso del gene de metil-transferasa es específico para la reducción de ácido fítico. La presente invención no se basa en métodos ya existentes en la técnicaa, tal como, expresión de enzimas fitasa que no resuelven el problema de ácido fítico en exceso en semillas y/o harinas de semilla. En el curso del trabajo realizado en la presente, se encontró que los niveles de ácido fítico pueden ser controlados al alterar los niveles de mio-inositol disponibles para biosínteisis de ácido fítico. Se descubrió que la expresión de un gene de metil transferasa en tejidos de semilla conduce a la reducción de ácido fítico en la semilla sin cambios demostrables en otras características de la planta. Es evidente que la limitación de la expresión del gene de metil transferasa para los tejidos de la semilla, responsable de la biosíntesis de fitato redujo significativamente el ácido fítico en semillas maduras sin efectos adicionales en la planta, que creció aún bajo los extremos ambientales de las condiciones del campo. El uso de un promotor selectivo de tejido ofrece muchas ventajas sobre la técnica, incluyendo la restricción de la actividad de enzima a tejido de semilla, mientras que deja intacto el metabolismo de mio-inositol en otros tejidos. El objetivo de la presente invención es desviar la utilización de mio-inositol como un material de inicio para la biosíntesis de ácido fítico, mediante la desviación hacia un depósito metabólíco donde se convierte a compuestos que son inocuos para la planta. El método se basa en la introducción de novedosas actividades enzimáticas que comprenden, en una modalidad, un gene de metil-transferasa que suprime o altera el depósito de mio-inositol usado para producir ácido fítico. La supresión o alteración de los niveles de este precursor conduce a un cambio 5 bioquímico en la ruta normal para biosíntesis de ácido fítico y provoca la reducción en el nivel de ácido fítico producido. La base bioquímica para esta invención se basa en el concepto de la regulación de actividad enzimática mediante la disponibilidad de substratos. En general, las velocidades enzimáticas son controladas por la disponibilidad de substrato. Una enzima producirá un producto a una velocidad que generalmente es proporcional a la cantidad de substrato disponible. La reducción de concentraciones de substrato conduce a niveles inferiores de productos terminales finales. De acuerdo con esto, la presente invención toma ventaja de esta aproximación al usar una novedosa actividad enzimática, una metil transferasa que suprime la disponibilidad del substrato de inositol usado para la formación de ácido fítico. Cualquier número de enzimas capaz de actuar sobre el depósito de mio-inositol en la semilla de la planta podría ser usado dentro del alcance de la presente invención. El método se basa en una actividad enzimática introducida que en cualquier número de maneras diferentes, altera el depósito de mio-inositol usado para la biosíntesis de ácido fítico. En contraste con la patente estadounidense no. 5,563,324, la presente invención busca modificar la producción de fitato en una manera selectiva de semilla mediante la expresión de un gene capaz de modificar el mio-inositol, haciéndolo no disponible para la producción de ácido fítico. De manera sorprendente, aún la expresión constitutiva de un gene modificador de mio-inositol conduce a niveles de fitato reducidos en la semilla. Sin embargo, en una modalidad muy preferida de la presente invención se utiliza un promotor selectivo de semilla para asegurar que el desempeño agronómico de la planta no está comprometido y la planta resultante es normal en todo con excepción de los niveles de titato reducidos en la semilla. En consecuencia, en contraste con la patente estadounidense 5, 563, 324, la presente invención no anticipa la producción de plantas tolerantes a tensión ni estudia plantas útiles para fines de investigación. El método descrito ofrece muchas ventajas sobre la técnica relacionada para la reducción de ácido fítico mediante la expresión de enzimas de fitasa. Estas incluyen plantas con niveles de ácido fítico alterados en tejidos específicos, plantas con semillas con niveles de ácidos fíticos reducidos y harina de semilla con ácido fítico reducido. Los beneficios de tales plantas, semillas y harinas incluyen una mejor de utilización de alimento y desempeño de la harina, preparaciones de harina y alimento con niveles reducidos de fósforo y de ahí mejores atributos ambientales y capacidad para usar dichas harinas para aplicaciones en la industria alimenticia, usos previamente restringidos por la cantidad de ácido fítico anti-nutricional en la harina o alimento. El método descrito encuentra utilidad en muchas especies de plantas. Estas especies de plantas incluyen plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas, así como cosechas de semillas oleaginosas y granos. El método encuentra utilidad particular en plantas cruciferas y semillas oleaginosas. Los resultados de esta modificación genética son células de plantas con metabolismo de alcohol de azúcar modificado, particularmente metabolismo de inositol y células de plantas con contenido de ácido fítico reducido, en particular semillas de planta con contenido de fitato reducido. De esta manera, el método de la presente invención proporciona un medio valioso para alterar metabolismo secundario relacionado con alcoholes de azúcares. Aunque la modalidad de esta invención que involucra la alteración de metabolismo de alcohol de azúcar, por ejemplo, células de planta con contenido de ácido fítico reducido, ha sido demostrada en células de planta de cañóla, las plantas de maíz también tienen una concentración alta de ácido fítico y una reducción de contenido de ácido fítico en células de maíz se puede lograr de manera similar. La presente invención proporciona métodos, constructos genéticos y vectores útiles para modificar el contenido de fitato de células y semillas de plantas, en particular para la reducción de niveles de fitato en células de plantas. La invención proporciona además métodos y composiciones de DNA útiles para la reducción de fitato en semillas de plantas. La invención se relaciona además con harina de semilla modificada y alimento para animales conteniendo harina de semilla modificada, particularmente harina de semilla con contenido de fitato reducido. La reducción de ácido fítico se logra usando métodos recién descritos y composiciones de DNA. El método comprende el desarrollo de una "desviación metabólica" o una nueva ruta bioquímica, capaz de desviar un precursor en la ruta biosintética de ácido fítico a una nueva y novedosa "ruta de una sola salida" introducida, la cual reduce la producción de ácido fítico. Como resultado de una modalidad específica de este método, el o los productos de la "ruta de una sola salida" son compuestos que son conocidos por ser inocuos para dicha célula de planta. De acuerdo con esto, se cree completamente que la desviación de los compuestos de mio-inositol precursores en estos compuestos no comprometerán el desempeño de la planta en ninguna forma. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se proporcionan vectores y constructos de DNA recombinante para la producción de semillas de planta con contenido de ácido fítico alterado, particularmente semillas de planta con contenido de ácido fítico reducido. Además, otro aspecto de la invención proporciona semillas de planta útiles para la producción de harina de semilla con contenido de fitato reducido. Dicha harina tiene niveles de fitato reducidos y de ahí que sea útil para alimentos para animales, especialmente para aquellas aplicaciones donde el ácido fítico está asociado con la contaminación ambiental o ha sido identificada como un factor anti-nutricional. La invención también proporciona harina modificada derivada de semillas genéticamente alteradas que pueden ser usadas en diversas dietas de animales incluyendo aquéllas para aves de corral, cerdos, reses y peces. El método comprende la adición de una novedosa actividad enzimática que puede alterar el contenido de mio-inositol en semillas y puede aplicarse directamente en todas las especies y variedades de plantas. El mismo gene puede ser usado a través de cualquier especie de planta, ya que la alteración de mio-inositol ocurrirá en la misma manera en cualquier especie de planta. El método no se basa en el uso de tecnolog ías de supresión de genes que son dependientes de secuencias de DNA y de ahí, requeriría genes específicos hechos a la medida para cada gene específico o especie de cosecha. De esta manera, la utilidad de la presente invención para todas las cosechas es evidente. Pueden emplearse numerosas enzimas adecuadas para fuentes microbianas, vegetales o animales dentro del alcance del método. Los mismos constructos genéticos pueden ser usados en una variedad de diferentes especies de plantas. De esta manera, de acuerdo con un amplio aspecto de la presente invención, se proporciona un método para reducir el contenido de fitato en semillas de plantas comprendiendo la construcción de un vector de transformación de planta, además de un marcador seleccionable que permite la identificación de células de planta transformadas con dicho vector, una enzima capaz de metabolizar mio-inositol, haciendo inadecuado el mio-inositol para la producción de ácido fítico. En el contexto de la presente invención, la metabolización de inositol incluye hidroxilación, isomerización, metilación , corte o cualquier otra modificación bioquímica que imposibilite al mio-inositol para que actúe sobre él la actividad enzimática correspondiente que normalmente actúa sobre el mio-inositol para producir ácido fítico. De ahí, la metabolización incluye cualquier modificación que reduzca de manera efectiva la disponibilidad de mio-inositol del depósito de substratos disponibles para biosíntesis de ácido fítico. Como un ejemplo de la presente invención, se usa un gene que codifica un mio-inositol metil-transferasa para ilustrar un aspecto de la invención . Dicha enzima , bajo el control de un promotor selectivo para la expresión en células de semillas de plantas, es capaz de suprimir el depósito de mio-inositol disponibles para la producción de fitato en dicha semilla de planta. De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, dicha metil transferasa es capaz de convertir el mio-inositol en una substancia inocua. Por lo tanto, en general , las células de plantas producidas mediante el método de acuerdo con la presente invención, tienen metabolismo primario inalterados y tienen fenotipos que son indistinguibles de plantas sin modificar con la excepción de la alteración del producto o productos con una ruta metabólica secundaria especifica. Con el fin de asegurar que el metabolismo primario no es afectado, la presente invención describe un método para enfocar, en una manera específica de tejido, la formación de un metabolito secundario al alterar la disponiblidad de un substrato que es específico para la ruta metabólica secundaria, y esencial para la formación del producto final de esa ruta, particularmente aquéllos substratos dentro de una a cinco etapas bioquímicas de formación de producto final. En esta manera, se logra una reducción de productos específicos de la ruta metabólica secundaria. En el contexto de la presente invención, los compuestos usados como precursores para productos de la ruta metabólica secundaria de fenilpropanoide incluyen, pero no se limitan a: ácido cinámico, ácido p-coumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido 5-hidroxiferúlico, ácido sinápico, colina, varios compuestos de sinapoilo, los cuales incluyen, pero no están limitados a, sinapoil-glucosa y sinapoil-malato y sinapoil colina. Dentro del contexto de la presente invención, los productos de ruta de fenilpropanoide incluyen, pero no están limitadas a: flavonoides, ligninas, varios compuestos fenólicos monoméricos y polímerizados y sinapina. Mediante la selección de una enzima específica, puede lograrse cualquier variedad de alteraciones a los niveles de productos dentro de la ruta de fenilpropanoide. Las enzimas usadas para modificar o enfocar los compuestos usados como precursores pueden ser de origen microbiano, animal o vegetal. Las enzimas pueden ser de las que ocurren de manera natural o pueden ser derivadas por mutación de una enzima conocida para alterar su especificidad de substrato, produciendo así una novedosa actividad enzimática. Las enzimas usadas dentro del alcance de la presente invención pueden ser aquéllas capaces de modificar los compuestos usados como precursores para productos encontrados dentro de la ruta de fenilpropanoide por isomerización, conjugación, fosforilación, hidroxilación, oxidación, deshidrogenación, metilación o cualquier otra actividad bioqu ímica similar (incluyendo unión o secuestración) o pueden comprender enzimas capaz de destruir los compuestos usados como precursores dentro de la ruta de fenilpropanoide, tal como, hidrolasas, decarboxilasas, oxidasas, esterasas o cualquier otra enzima capaz de degradar, ácido cinámico, ácido p-coumárico, ácido cafeico, ácido ferúlico, ácido 5-hidroxiferúlico, ácido sinápico, sinapoil-glucosa, sinapoil-malato o colina (usado para producir sinapina de sinapoil-glucosa) . En un aspecto del método, se usan enzimas que producen substancias protectoras de tensión de compuestos usados como precursores de productos formados normalmente dentro de la ruta de fenilpropanoide. De manera similar, el uso de una actividad enzimática para la reducción específica de un substrato adicional, no producido como parte de la ruta de fenilpropanoide, pero requerido para la formación de un producto de la ruta de fenilpropanoide, pueden usarse para reducir el nivel de dicho producto. De acuerdo con esto, tanto compuestos usados como precursores en la ruta de fenilpropanoide como cualquier otro compuesto requerido por la ruta de fenilpropanoide para producir productos, pueden enfocarse dentro del alcance del presente método. En el contexto de la presente invención, compuestos usados como precursores para productos de la ruta metabólica secundaria de alcohol de azúcar incluyen, pero no están limitados a: mio-inositol, galactinol y derivados UDP de azúcares. Los productos de metabolismo de alcohol de azúcar incluyen, pero no están limitados a: ácido fítico, estaquiosa, rafinosa, glicósidos de sucrosilo, urónicos y pentosas, fosfoinositidos y glicofosfoceramidas. En el contexto de la presente invención, la actividad enzimática usada para alterar los compuestos de metabolismo de alcohol de azúcar incluyen aquéllas capaces de hidroxilación , isomerización, metilación , corte o cualquier otra modificación bioqu ímica (tal como, unión o secuestración) que imposibilite al alcohol de azúcar para que actúe sobre el la actividad enzimática correspondiente que normalmente actúa sobre dicho alcohol de azúcar. En la ilustración de la presente invención dentro de la ruta metab?lica secundaria de alcohol de azúcar, se muestra que la metilación de inositol, el cual es el precursor de ácido fítico, reduce la disponibilidad de inositol para la biosíntesis de ácido fítico.

De acuerdo con esto, está claro para aquéllos expertos en la técnica, que los precursores para un producto final dentro de una ruta metabólica secundaria son aquéllos bioquímicos, los cuales son usados directamente para la formación de un metabolito secundario, o aquéllos bioquímicos los cuales son usados en una reacción bioquímica que conduce a la formación de un metabolito secundario específico, no siendo dichos bioquímicos un metabolito primario. Las enzimas usadas para actuar sobre o enfocar los compuestos que funcionan como precursores de productos dentro de una ruta metabólica secndaria, producen preferiblemente a partir de dichos compuestos, substancias que son inofensivas para las células de plantas, y de ahí puede acumularse hasta altos niveles sin alterar las propiedades de la célula de la planta. Las enzimas también pueden producir substancias que proporcionan un efecto benéfico a la célula de la planta, tal como, la producción de protectores de tensión a partir de dichos compuestos usados como precursores de productos de la ruta metabólica secundaria. Las enzimas usadas también pueden producir substancias de utilidad, tales como, químicos industriales, substancias farmacéuticas o nutraceúticas. Una o más enzimas pueden emplearse dentro del alcance de la presente invención, y más de una actividad distinta pueden ser empleadas para reducir el nivel de compuestos específicos usados como un precursor para un producto dentro de una ruta metabólica secundaria. Las enzimas usadas en el contexto de la presente invención pueden derivarse de un número de fuentes o mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, el técnico experto puede identificar un compuesto usado como un precursor dentro de una ruta metabólica secundaria a ser enfocada dentro del alcance del presente método. La estructura química de estos compuestos son bien conocidas, o pueden ser identificadas, de ahí que la literatura de enzimas puede ser analizada para identificar una enzima con actividad conocida sobre los substratos químicamente similares. De acuerdo con esto, puede ser identificada una enzima adecuada y el gene aislado y usado dentro del contexto de la presente invención. Adicionalmente, también pueden usarse química de combinación o esquemas similares que buscan proteínas producidas artificialmente para actividad deseable como la base para obtener un gene sintético. Las enzimas usadas dentro del alcance de la presente invención pueden modificarse usando métodos comúnmente conocidos en la técnica.

Como un ejemplo de una modificación de enzima, el gene que codifica una enzima capaz de actuar sobre compuestos qu ímicamente relacionados usados como precursores en una ruta metabólica secundaria, puede ser modificado y/o seleccionado para actividad incrementada al usar tales técnicas como modificación de sitio específico, mutación y selección de especificidades alteradas en sistemas heterólogos, tales como células bacterianas o fúngales. Esto puede incluir la expresión del gene que codifica dicha enzima alterada en células bacterianas incapaces de metabolizar dichos compuestos, seleccionando bacterias que expresan la enzima son capaces de crecer en dichos compuestos como el único nutriente o fuente de carbono, y recuperando una actividad enzimática capaz de actuar sobre un compuesto específico usado como un precursor en una ruta metabólica secund aria . En esta manera, es posible producir una enzima con especificidad para un compuesto específico usado como un precursor dentro de una ruta metabólica secundaria específica. De manera alternativa, las bacterias pueden ser seleccionadas por crecimiento en varios compuestos usados como precursores dentro de una ruta metabólica secundaria. El técnico experto puede apreciar fácilmente que la selección de bacterias con mutación u otras células en compuestos específicos usados como precursores dentro de una ruta metabólica secundaria, puede proporcionar un medio para identificar las actividades enzimáticas específicas capaces de convertir dichos compuestos en substancias inocuas. Esta aproximación puede incluir la selección directa de actividades enzimáticas específicas o modificación y selección en pasos de las actividades enzimáticas deseadas. De manera similar, el uso de actividades enzimáticas conocidas actualmente usadas en el comercio, tales como, preparaciones de enzimas que usan extractos fúngales de Trichoderma capaces de degradar lignina en operaciones de formación de pulpa, pueden proporcionar una fuente de actividad enzimática adecuada, por ejemplo, para aislar enzimas involucradas en la degradación de compuestos fenólicos. Es evidente para aquéllos expertos en la técnica, que los genes que codifican enzimas usadas en las industrias de pulpa para procesamiento de lignina, pueden ser empleadas dentro del alcance del método, ya sea directamente o sobre modificación , para actuar específicamente en uno de los compuestos usados como un precursor en la ruta de fenilpropanoide. De acuerdo con esto, se contempla que puede emplearse una variedad de diferentes actividades enzimáticas dentro del alcance del presente método. Por lo tanto, el método no está limitado por la fuente o especificidad de la enzima usada. Por ejemplo, en un aspecto del método, una enzima que es expresada en una célula de planta actúa sobre un compuesto usado como un precursor o substrato para un producto dentro de la ruta de fenilpropanoide para producir una substancia sobre la cual ya no actúa la enzima, que normalmente utilizaría dicho compuesto como un precursor dentro de la ruta de fenilpropanoide. De acuerdo con esto, los niveles del producto específico de la ruta de fenilpropanoide son reducidos a través de la reducción de los precursores requeridos para la formación de dicho producto. La célula de planta resultante puede ser usada directamente o la célula puede ser inducida para regenerar una planta completa con niveles alterados de productos de la ruta de fenilpropanoide, lo cual tiene utilidad en cualquier variedad de procesos industriales no limitados a aplicaciones alimenticias, aplicaciones de pulpa o producción de plantas con novedosas composiciones de compuestos fenólicos, incluyendo sobreproducción de ciertos productos dentro de la ruta de fenilpropanoide. Arboles con niveles alterados de productos de fenilpropanoide tendrán utilidad en la industria de pulpa y papel. Las plantas con niveles alterados de productos de fenilpropanoide tendrán utilidad en la industria alimenticia. El método también se basa en la recuperación y uso de las células de plantas o tejido con las propiedades alteradas, particularmente tejido de planta usado para aplicaciones alimenticias u otros procesos industriales. Es posible que las alteraciones a la ruta de fenil propanoide contempladas dentro del alcance de la presente invención también pueden conducir a cambios positivos en el desempeño agronómico de plantas derivadas de dichos métodos, particularmente aquellos aspectos de la invención donde la producción de un protector de tensión resulta de la actividad enzimática adicionada. Otros efectos benéficos pueden ser anticipados, los cuales pueden incluir resistencia a UV y enfermedad intensificada , fuerza mecánica y así consecutivamente. En una modalidad adicional de la invención, el método incluye el paso de hacer crecer dicha célula de planta y recuperar una planta, en donde los productos de la ruta de fenilpropanoide han sido alterados. Todavía en una modalidad adicional, la invención incluye usar dicha planta para un proceso industrial, tal como, producción de compuestos útiles, preparación de alimento para animales o pulpado. Los genes que codifican las enzimas capaces de actuar sobre compuestos usados como precursores de productos de la ruta de fenilpropanoide pueden ser naturales, sintéticos o una combinación de los mismos. El practicante experto apreciará fácilmente que la secuencia de codificación del gene puede ser modificada para permitir altos niveles de expresión en células de la planta. Esto puede lograrse al alterar las secuencias de los codones para asemejar de manera más correcta el uso de codón normalmente encontrado en la célula de la planta donde se expresará el gene. Además, es obvio que pueden diseñarse sitos de restricción específicos para permitir la manipulación conveniente de la secuencia de codificación. También se contempla que la adición de varias secuencias, tales como, intensificadores de traslación , intrones, etc. , pueden ser usados para asegurar la expresión adecuada de la secuencia de codificación . Las enzimas también pueden ser modificadas por alteración de sitios de unión de substrato u otra modificación a la secuencia de aminoácidos primaria que intensifique la actividad enzimática. Todas estas manipulaciones son comunes en la técnica y serán fácilmente apreciadas por el trabajador experto. En otro aspecto de la presente invención, la enzima está bajo control de un promotor selectivo de semilla. Un promotor selectivo de semilla es un promotor, el cual funciona de manera exclusiva o preferencial para provocar la expresión de secuencias bajo su control para ser limitada a tejido dentro de una semilla de planta. De acuerdo con niveles del producto específico de la ruta de fenilpropanoide son alterados en una manera selectiva de tejido, dejando a los otros tejidos de la planta con niveles normales de productos de ruta de fenilpropanoide. El tejido en donde la enzima es expresada de manera selectiva, se usa en la preparación de un alimento o cualquier otro proceso industrial. Es obvio para el practicante experto que puede emplearse cualquier número de promotores selectivos de tejido dentro del alcance de la presente invención. En particular, se usa un promotor selectivo de semilla para alterar los productos de la ruta de fenilpropanoide en cosechas donde se usa la semilla o harina de semilla para alimento. En otras cosechas, pueden usarse varios promotores selectivos de tejido dependientes de la porción de la planta donde se desee la alteración de contenido fenólico. Por ejemplo , puede emplearse un promotor selectivo de raíz o tubérculo para alterar el contenido fenólico o de lignina de cosechas de raíces o tubérculos, tales como, papa, nabos, mandiocas, etc. En aquellos casos donde se usan las hojas o tallos como alimento, puede emplearse un promotor selectivo de hoja o tallo para lim itar la expresión de enzimas capaces de actuar sobre compuestos usados como precursores dentro de la ruta de fenilpropanoide. Otros promotores selectivos de tejido pueden ser usados en plantas, tales como, árboles que son recolectados para pulpado. De ahí que un promotor que restringe la actividad de la enzima a la madera del árbol encuentra utilidad dentro del alcance del presente método. En un aspecto específico de la presente invención, se contempla la expresión de una secuencia de codificación de una enzima que metaboliza colina en células de plantas. La expresión de dicha enzima que metaboliza colina suprime el depósito de colina disponible usado para formar sinapina a partir de sinapoil-glucosa. Algunas especies de plantas, notablemente aquéllas de la familia Cruciferae producen un compuesto anti-nutricional llamado sinapina. Se cree que la sinapina es sintetizada al intercambiar la porción de glucosa de sinapoil glucosa (sin-glu) con cooina. La reducción del compuesto anti-nutricional sinapina, intensifica el valor de la semilla y la harina resultante derivada de la misma. El uso de una enzima modificadora de colina, tal como, colina oxidasa, tiene utilidad en la presente invención. Se sabe que la colina es oxidada a betaína en plantas alimenticias, tales como, trigo, espinaca, remolacha y cebada (Rhodes y Hanson, 1993, Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 44: 357-384) . Esta ruta oxidativa es catalizada por dos enzimas (conocidas como "sistema de oxidación de colina" en términos genéricos) y los productos de esta ruta se muestran a continuación: Colina - betaína aldehido -> glicinabetaína (betaína) El primer paso es catalizado por una colina deshidrogenasa (CDH) o colina oxidasa (COX) en bacterias y animales (Rozwadowski, Khachatourians y Selvaraj , 1 991 , Journal of Bacteriology, 173: 472-478) y por una colina monooxigenasa (CMO) en plantas (Rhodes y Hanson, 1993). El segundo paso es catalizado por una betaína aldehido deshidrogenasa (BADH) (Rhodes y Hanson, 1 993). De acuerdo con esto, el uso de una enzima que metaboliza colina puede suprimir el depósito de colina disponible en una manera general o específica mediante el uso de promotores constitutivos, inducibles o específicos de tejido. La reducción de disponibilidad de colina reduce la producción de sinapina. Adicionalmente, la reducción en sinapina puede provocar cambios en los niveles de otros productos de la ruta de fenilpropanoide, conduciendo a un tejido de planta con contenido fenólico alterado. En otra modalidad específica de la presente invención, se coloca un gene de colina oxidasa (COX) microbiano (Rozwadowski, Khachatourians y Selvaraj, 1991 , Journal of Bacteriology, 173: 472-478) bajo el control de un promotor selectivo de semilla. La expresión de colina oxidasa en semillas desvía la colina, uno de los presursores de la biosíntesis de sinapina en semillas de cañóla, a una substancia inocua, betaína, a través de la formación de betaína aldeh ido, el cual es convertido lentamente a betaína mediante la actividad de la enzima COX. La semilla que comprende el DNA recombinante tiene niveles de sinapina reducidos y niveles alterados de otros productos de la ruta de fenilpropanoide. La harina derivada de dichas semillas es útil para aplicaciones alimenticias. En otra modalidad específica de la presente invención, el gene COX es usado bajo el control de un promotor selectivo de semillas y una segunda enzima, BADH , es usada para intensificar la formación de betaína a partir de betaína aldehido. En esta modalidad, BADH (Boyd , L.A. , L. Ada , L. E. Pelcher, A. McH ughen , R. Hirji y G. Selvaraj , 1990, Gene 103: 45-52) , es expresada bajo el control de un promotor selectivo de semilla. La betaína es un compuesto encontrado en las partes comestibles de muchos alimentos y plantas de alimentos, y también se usa como un alimento y aditivo alimenticio en algunos casos. La betaína también proporciona una función protectora de tensión. En otra modalidad específica de la presente invención, el gene COX es usado en una célula de planta crucifera (Brassica sp.) bajo el control de un promotor selectivo de semilla, y una segunda enzima BADH , también expresada bajo el control de un promotor selectivo de semilla, es usado para asegurar la formación de betaína a partir de betaína aldeh ido. La alteración de colina en semillas cruciferas proporciona una reducción en el contenido de sinapina y además una alteración en varios productos de la ruta de fenilpropanoide. Se cree completamente que la alteración de niveles de colina en la semilla conduce a mayores niveles de sinapoil glucosa u otros compuestos de sinapoilo, tal como, malato de sinapoilo, el cual a su vez altera los niveles de ácido sinápico, un precursor para lignina. De ahí que se invoque el mecanismo regulador bioquímico comúnmente referido como inhibición de producto terminal, conduciendo a la alteración del nivel de varios productos dentro de la ruta de fenilpropanoide. De acuerdo con esto, la prevención de la formación de sinapina resulta en cambios a los niveles de una variedad de productos formados por los pasos en la ruta de fenilpropanoide antes del paso terminal de la formación de sinapina. La ruta metabólica secundaria de fenilpropanoide también puede ser enfocada a través de la enzima, expresada en células de plantas, la cual actúa sobre ácido ferúlico. El ácido ferúlico es otro precursor en la ruta de fenilpropanoide. De acuerdo con esto, se reducen los niveles de ácido ferúlico. La reducción de la disponibilidad de ácido ferúlico conduce a alteraciones en los niveles de compuestos fenólicos, incluyendo la reducción de sinapina en plantas cruciferas. Los genes que codifica las enzimas capaces de actuar sobre ácido ferúlico pueden ser naturales, sintéticos o una combinación de los mismos. El practicante experto apreciará fácilmente que la secuencia de codificación del gene pueda modificarse para permitir altos niveles de expresión en células de plantas. De acuerdo con otro aspecto de la invención, el gene que codifica la enzima capaz de actuar sobre ácido ferúlico es colocada bajo el control de un promotor selectivo de tejido. De acuerdo con esto, los niveles de ácido ferúlico son alterados en una manera selectiva de tejido, dejando los demás tejidos de la planta con niveles normales de ácido ferúlico. El tejido en donde la enzima es expresada selectivamente, se usa en la preparación de un alimento, preparación alimenticia o cualquier otro proceso industrial. Las enzimas contempladas para usarse en estas modalidades de la presente invención incluyen aquéllas capaces de modificar ácido ferúlico y en particular aquellas enzimas conocidas por producir compuestos valiosos de ácido ferúlico. Está claro, para alguien experto en la técnica, que pueden emplearse otras enzimas dentro del alcance del método para metabolizar ácido ferúlico. Fuentes conocidas de actividad metabolizante de ácido ferúlico son encontradas en los siguientes microorganismos: Aerobacter sp, Bacillus megaterium, B. subtilis, Corynebacterium glutamicum, Enterobacter sp. , Pseudomonas sp., Streptomyces sp., Aspergillis sp., Candida sp. , Fusarium sp., Hansenula sp., Penicillum sp., Rhodotorula sp., Saccharomyces sp. Esta lista no es detallada, pero sirve para ilustrar las diversas fuentes de enzimas que metabolizan ferulato que se encuentran en la técnica. Así, el método no está limitado por la fuente de la enzima usada para metabolizar ácido ferúlico. Dentro del alcance de la presente invención, se contempla la alteración del gene codificado microbiano para asegurar la expresión óptima en células de plantas. Dichos métodos son bien conocidos en la técnica. Como un ejemplo de estas enzimas, se usa una ácido ferúlico decarboxilada de B. pumulis. El gene para esta enzima ha sido aislado y secuenciado (Zago et al. , Applied and Environmental Microbiology 61 :4484-4486, 1995). La secuencia del gene puede ser modificada para asemejarse más estrechamente a un gene de planta, al tiempo que mantiene la secuencia de aminoácidos predicha. La enzima es capaz de producir vinilguaiacol a partir de ácido ferúlico por decarboxilación. De acuerdo con esto, en un ejem plo del método, se produce un valioso compuesto (vinilguaiacol, VG) mediante la actividad de un gene introducido capaz de actuar sobre ácido ferúlico. La enzima no requiere co-factores adicionales y tiene un peso molecular aparente de aproximadamente 22 Kda. En otra modalidad específica de la presente invención, la enzima ferulato decarboxilada es colocada bajo el control de un promotor selectivo de tejido, conduciendo a una planta que comprende tejidos alterados específicamente en metabolismo de ácido ferúlico. La alteración de ácido ferúlico proporciona una reducción en el contenido de ácido ferúlico y además una alteración en varios productos de la ruta de fenilpropanoide. La presente invención también contempla la producción de tejido de planta, en particular semillas de planta, que tiene utilidad para alimento o aplicaciones alimenticias. Tanto la alimentación directa de semillas como el uso de harina modificada de semillas procesadas se encuentran dentro del alcance de la presente invención. La reducción de contenido fenólico en semillas de plantas es deseable en aplicaciones de alimentos y la semilla modificada genéticamente con contenido fenólico alterado, en particular, menor contenido fenólico anti-nutricional , tiene gran utilidad en la industria alimenticia. Además de alimentar directamente la semilla entera o parcialmente rota, existen muchos métodos para producir harina de semilla. Es de particular importancia en las semillas cruciferas la producción de harina durante la extracción de aceite a partir de semillas oleaginosas cruciferas. En general, el aceite es extraído de las sem illas oleaginosas usando ya sea un proceso con solvente o sin solvente. La torta o sólidos expelidos producidos por este proceso se usan para formulaciones de harina y usualmente contienen la mayoría del contenido fenólico de la semilla crucifera. Un método para producir harina con contenido fenólico menor proporciona una composición novedosa no encontrada actualmente en harina derivada de semillas cruciferas. La presente invención contempla utilizar la semilla genéticamente modificada producida de acuerdo con el método para obtener un producto de harina con contenido fenólico alterado. El método descrito ofrece muchas ventajas para la alteración de un fenotipo de planta. Adicionalmente, el método permite la producción de varios compuestos con utilidad industrial conocida. El método descrito encuentra utilidad en cualquier especie de planta o tejido de planta. El método descrito ofrece muchas ventajas sobre la técnica publicada relacionada con la manipulación de la ruta de fenilpropanoide. El método no se basa en mutaciones, tales como, la mutación S1 N 1 , que se manifiesta a través de la planta y está asociada con sensibilidad UV. El método no utiliza mecanismos genéticos diseñados para bloquear la expresión de gene, tal como, RNA antisentido o co-supresión, que requieren la clonación de genes de planta de la ruta de fenilpropanoide. El método no modifica específicamente algún gene natural para la planta. De acuerdo con las diversas funciones de la ruta, tal como, producción de flavonoides, producción de protectores UV, envolvimiento en respuesta a enfermedades y otras funciones bioquímicas de la ruta no son alteradas de manera perjudicial. Mediante el uso de promotores de tejido selectivo, el contenido fenólico puede ser alterado en cualquier tejido, mientras que los otros tejidos de la planta permanecen sin cambiar. El método descrito encuentra utilidad en muchas especies de plantas, pero encuentra utilidad particular en plantas cruciferas. Como resultado del método, se proporciona un beneficio adicional mediante la producción de un protector de tensión o compuesto industrial valioso como resultado de la actividad enzimática introducida. Es obvio que cualquier número de pasos dentro de la ruta de fenilpropanoide pueden ser enfocados por el método y también pueden modificarse otras rutas bioquímicas con una aproximación similar. La presente invención también encuentra utilidad para modificar otras rutas metabólicas secundarias. Por ejemplo, en una modalidad de la presente invención, se proporcionan métodos y constructos de DNA para la producción de plantas con metabolismo de alcohol de azúcar alterado, en particular, alteración de contenido de fitato en células de semillas. Ei fitato es derivado del mio-inositol de alcohol de azúcar que también sirve como un precursor o intermediario para la formación de otros compuestos incluyendo: estaquiosa, rafinosa, glicósidos de sucrosilo, urónidos y pentosas, fosfoinositidos y glicofosfoceramidas. La invención proporciona además métodos y composiciones de DNA para reducir el contenido de fitato en semillas cruciferas, semillas oleaginosas, monocotiledóneas y dicotiledóneas. La invención también proporciona semillas de plantas con contenido de ácido fítico reducido adecuadas para aplicaciones alimenticias, semillas de plantas con contenido de ácido fítico reducido adecuadas para la preparación de harina modificada y células de plantas con metabolismo de inositol modificado. La presente invención contempla la expresión de genes que codifican enzimas que actúan sobre un precursor de alcohol de azúcar para biosíntesis de ácido fítico, mio-inositol, provocando la desviación metabólica de este precursor hacia compuestos "de una sola salida" o pobremente metabolizados que pueden acumularse de manera inofensiva en la célula de la planta. En esta manera, se logra una reducción de la biosíntesis de ácido fítico. Otros alcoholes de azúcar pueden enfocarse mediante los métodos descritos en la presente invención. La enzima usada para enfocar mio-inositol puede ser de origen microbiano, animal o vegetal . La enzima puede ocurrir de manera natural o puede ser derivada por mutación de una enzima conocida para alterar su especificidad de substrato y de ahí producir una novedosa actividad enzimática. La enzima usada para actuar sobre mio-inositol, de preferencia produce compuestos que son inofensivos para la célula de la planta, y de aquí que puedan acumularse a altos niveles sin efectos perjudiciales en la célula de la planta. Pueden emplearse una o más enzimas dentro del alcance de la presente invención, y puede emplearse más de una actividad distinta para reducir el nivel de mio-inositol. Las enzimas usadas dentro del alcance de la presente invención son aquéllas capaces de modificar mio-inositol por isomerización, conjugación, fosforilación , hidroxilación , metilación o cualquier otra actividad bioquímica similar o pueden comprender enzimas capaces de elim inar mio-inositol u otros alcoholes de azúcar. Las enzimas usadas en el contexto de la presente invención pueden derivarse de un número de fuentes o mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, el técnico experto puede identificar una enzima con actividad conocida en substratos químicamente similares. De acuerdo con esto, la enzima puede ser identificada, el gene aislado y usado dentro del contexto de la presente invención. Las enzimas usadas dentro del alcance de la presente invención pueden ser modificadas usando métodos comúnmente conocidos en la técnica. El método se basa además en el uso de transformación para introducir el gene que codifica la enzima en células de plantas. La transformación de la célula de planta puede lograrse mediante una variedad de medios. Los métodos que tienen utilidad general incluyen sistemas basados en Agrobacterium, usando ya sea plásm idos binarios y cointegrados tanto de A. tumifaciens como A. rhyzogenes. , (por ejemplo, US 4,940, 838, US 5,464,763), la aproximación biol ística (por ejemplo, US 4,945,050, US 5,015, 580, US 5, 149,655), microinyección (por ejemplo, US 4,743, 548), captación de DNA directa por protoplastos (por ejemplo, US 5,231 , 01 9, US 5,453, 367) o pelillos similares a agujas (por ejemplo, US 5, 302, 523). Cualquier método para transformar genéticamente una célula de planta puede ser usado dentro del contexto de la presente invención . El método se basa en la recuperación y uso de las células o tejidos de plantas con las propiedades alteradas, particularmente tej ido de semilla de planta usado para alimento.

De esta manera, se obtienen células de plantas con metabolismo de alcohol de azúcar alterado. Numerosos compuestos son derivados de alcoholes de azúcar, pero es de importancia primaria el compuesto ácido fítico o fitato. Los métodos para reducir fitato en ciertas células de plantas encuentran gran utilidad para aplicaciones de alimentos. Los genes que codifican las enzimas capaces de actuar sobre mio-inositol pueden ser naturales, sintéticos o una combinación de los mismos. El practicante experto apreciará fácilmente que la secuencia de codificación del gene puede modificarse para permitir altos niveles de expresión en células de plantas. Esto puede lograrse al alterar las secuencias de los codones para asemejarse de manera más correcta al uso de codón encontrado normalmente en la célula de la planta, donde se expresará el gene. Adicionalmente, es obvio que pueden diseñarse sitios de restricción específicos para permitir una manipulación conveniente de la secuencia de codificación. También se contempla que la adición de varias secuencias, tales como, intensificadores de traslación , intrones, etc. , pueda usarse para asegurar la expresión adecuada de la secuencia de codificación. Todas estas manipulaciones son comunes en la técnica y se apreciarán fácilmente por el trabajador experto. También es evidente que un promotor selectivo de tejido pueda ser empleado para limitar la expresión de la enzima capaz de modificar mio-inositol a aquellos tejidos donde se hace el ácido fítico, tal como, tejido de semilla. Los promotores selectivos de semilla adecuados incluyen, el promotor napin de Brassica napus, el promotor de faseolin de Phaseolis, o cualquier otro promotor que sea selectivo de semilla.

En particular, se contempla el uso de una mio-inositol O-metil transferasa, tal como aquélla disponible de Mesembryanthemum crystallinum dentro del alcance de la presente invención. La presente invención contempla el uso de semillas genéticamente modificadas, producidas a partir de la expresión de enzimas capaces de actuar sobre mio-inositol, estando dicha enzima bajo el control de un promotor selectivo de semilla. De acuerdo con esto, se reducen los niveles de ácido fítico. Sobre el procesamiento de la semilla, se deriva un producto de harina con contenido de ácido fítico disminuido. De acuerdo con esto, también se obtiene una preparación con contenido de ácido fítico reducido como resultado del método. La presente invención proporciona un medio para producir semillas cruciferas con contenido de ácido fítico reducido. En particular, se contempla el uso de una mio-inositol O-metil transferasa, tal como aquélla de Mesembryanthemum crystallinum para reducir los niveles de ácido fítico en cosechas cruciferas dentro del alcance de la presente invención . El técnico experto apreciará fácilmente que la producción de harina con contenido de ácido fítico reducido de semillas cruciferas puede lograrse como un resultado de la presente invención. Se sabe que la presencia de ácido fítico en harinas de semillas es perjudicial para peces criados en acuacultura. Sin embargo, algunas harinas de semillas, tal como harina de semilla de cañóla, tienen una composición de proteínas la cual es adecuada para la nutrición de peces. La alta concentración de ácido fítico en harina de cañóla restringe la cantidad que puede ser usada en una dieta para peces. Por lo tanto, una harina con ácido fítico reducido producida a partir de semillas cruciferas tiene gran utilidad en la acuacultura. De acuerdo con esto, la presente invención encuentra utilidad para la producción de semillas con contenido de ácido fítico modificado y harina de semillas con contenido de ácido fítico reducido. La semilla y harina modificadas tienen utilidad en una variedad de aplicaciones alimenticias incluyendo aves de corral, cerdos, acuacultura, animales rumiantes y no rumiantes. Es evidente además por la descripción anterior, que puede usarse cualquier número de enzimas diferentes para modificar mio-inositol dentro del alcance de la presente invención. También es evidente que pueden usarse varias combinaciones de estas enzimas usando promotores selectivos de semillas para lograr una reducción específica de ácido fítico.

La aplicación de la invención a la ruta secundaria de alcohol de azúcar no está limitada a las especies de plantas ejemplificadas. En realidad, cualquier especie de planta que produce ácido fítico puede modificarse mediante el método de la presente invención. El método proporciona utilidad en cualquier especie de cosecha, ya que la enzima usada, O-metil transferasa, es heteróloga para todas las especies de cosechas principales de importancia comercial. Así, cualquier especie de cosecha la cual se use para alimento animal o que produzca semilla que se usa en parte o completa para alimento animal , puede modificarse mediante el presente método para producir plantas con contenido de fitato reducido. De acuerdo con esto, el método puede aplicarse a través de cualquier cosecha, incluyendo monocotiledóneas (por ejemplo, maíz, arroz, trigo, cebada , centeno) y dicotiledóneas (por ejemplo, soya, algodón, alfalfa, Brassica, lino, girasol , etc) . La modificación tanto de metabolismo de fenilpropanoide como de alcohol de azúcar, se logra mediante el presente método, proporcionando ejemplos específico de cómo se logra la reducción de compuestos metabólicos específicos, en particular compuestos anti-nutricionales, en una manera confiable y predecible de acuerdo con el método de la presente invención. Es evidente para aquellos expertos en la tecnia que cualquier ruta metabólica secundaria puede ser alterada dentro del alcance de la presente invención. Se ha demostrado la invención en dos rutas metabólicas secundarias no relacionadas y proporciona resultados predecibles y tangibles. La reducción de agentes anti-nutricionales en, por ejemplo, células de planta de cañóla, células de planta de maíz, células de planta de arroz y células de planta de algodón, se logra bajo las amplias enseñanzas de la invención . Como parte del método de la presente invención, el practicante experto es dirigido a evaluar la producción del metabolito secundario específico. De ahí que el técnico experto apreciará fácilmente que se requiere un entendimiento básico de los tejidos en donde el metabolito secundario o compuesto usado como un precursor para el mismo es sintetizado además del marco de tiempo de desarrollo en el cual se hace. Tal información proporcionará una guía para la selección de un promotor para controlar la expresión de la enzima que actúa sobre el metabolito secu ndario o precursor para el mismo. En esta manera, el lector experto apreciará fácilmente que el enfoque de un metabolito secundario requerirá una enzima capaz de actuar sobre un precursor para dicho metabolito secundario en el tejido en donde se hace dicho metabolito secundario, así como durante un marco de tiempo de desarrollo en donde se hace. Así, la enzima que actúa sobre el precursor para dicho metabolito secundario debería ser expresada en o aproximadamente en el tiempo de síntesis de dicho precursor. El trabajador experto es dirigido adicionalmente a realizar un análisis bioquímico del tejido, en donde la invención se va a practicar. Dicho análisis puede incluir la determinación de los niveles de varios compuestos en el tejido a través del desarrollo, cualquier compartimentalización o ubicación subcelular de biosíntesis, el periodo durante el desarrollo cuando el compuesto es sintetizado por primera vez o ya no es sintetizado y cualquier otra información bioquímica relevante. Al realizar este análisis, el técnico experto será capaz de seleccionar un promotor, el cual proporciona niveles adecuados de expresión para introducir el cambio deseado en el contenido de metabolito secundario en el tejido de la planta. Se apreciará que aún pequeñas alteraciones en los niveles de compuestos usados como precursores pueden proporcionar el efecto deseado. Por ejemplo, como una parte de la modalidad de ácido fítico de la presente invención, el practicante experto apreciará fácilmente que un entendimiento básico de los tejidos en donde se sintetiza el ácido fítico, además del marco de tiempo de desarrollo en donde se hace el ácido fítico, proporcionarán una guía para la selección de un promotor para controlar la expresión de la enzima que actúa sobre mio-inositol. En esta manera, el lector experto apreciará fácilmente que el enfoque de mio-inositol requerirá la enzima capaz de actuar sobre mio-inositol en el tejido en donde se hace el ácido fítico, así como un marco de tiempo de desarrollo en donde se hace el ácido fítico. De esta manera, la enzima que actúa sobre mio-inositol debería ser expresada en o cerca del momento de síntesis de ácido fítico. El nivel de la expresión de la enzma puede ser modificado para alcanzar un nivel específico de reducción de ácido fítico. Este nivel de reducción puede variar desde un pequeño porcentaje a casi la eliminación completa de ácido fítico. El técnico experto apreciará fácilmente que la reducción de ácido fítico, especialmente en ciertas especies de cosecha altas en ácido fítico, puede requerir mayores niveles de expresión del gene que modifica mio-inositol que en aquellas especies de cosecha donde se presenta ácido fítico en menores niveles. La manipulación de los niveles de expresión por varios medios es bien conocida en la técnica. Esto puede incluir la adición de secuencias de DNA que intensifiquen la traslación , promotores fuertes que proporcionan altos niveles de transcripción o adición de secuencias de DNA, tales como, regiones de unión de matriz o unión de andamio que parecen proporcionar niveles confiables de altra transcripción a transgenes. Esta modalidad de la presente invención también contempla la producción de tejido de planta, en particular semilla de planta que tiene utilidad para aplicaciones alimenticias. Tanto la alimentación directa de las sem illas como el uso de harina modificada de semillas procesadas está dentro del alcance de la presente invención. La reducción de contenido de ácido fítico en semillas de planta es deseable en aplicaciones alimenticias y la semilla modificada genéticamente con contenido de ácido fítico alterado tiene gran utilidad en la industria alimenticia. En algunas aplicaciones, pueden alimentarse animales con grano entero o el grano puede ser procesado m ínimamente, pero no fraccionado. Por ejemplo, el grano de maíz frecuentemente es usado para alimento con procesamiento mínimo. Sin embargo, algún grano de maíz es procesado y los productos de procesamiento resultantes, tal como harina de gluten de maíz también son proporcionados como alimento a animales. Ambos tipos de alimento de maíz pueden beneficiarse de niveles de ácido fítico reducido, particularmente en lo que se refiere a la degradación ambiental debido al exceso de fósforo excretado por animales. Otros granos usados para alimento, tales como, trigo, cebada y avena también pueden beneficiarse de la presente invención . De esta manera, la presente invención encuentra utilidad a través de un amplio rango de especies de cosecha económicamente importantes. El gene demostrado en la presente invención por alterar niveles de mio-inositol se encontrará trabajando en cualquier especie de cosecha, ya que el mio-inositol es encontrado en todas las especies de cosecha y es el único precursor conocido para la biosíntesis de ácido fítico. De esta manera, la utilidad del gene de metil-transferasa usado para alterar mio-inositol ha sido demostrada claramente. El técnico experto puede apreciar fácilmente que la secuencia de codificación de la región de codificación o la secuencia de DNA específica del promotor o secuencia líder sin trasladar, terminador, etc. , puede modificarse para asegurar la expresión óptima en la célula de planta de la especie de planta particular. Todo esto está dentro de la habilidad del técnico ordinario. Así, se anticipa completamente que ia presente invención puede ser practicada en cualquier especie de planta capaz de ser transformada genéticamente, incluyendo aquellas especies de plantas, donde el grano es usado directamente para aplicación alimenticia o aquéllas especies de plantas donde el grano es procesado antes de ser usado para aplicaciones alimenticias. De acuerdo con esto, una preparación de alimento de semilla entera con contenido de ácido fítico reducido es producida como un resultado del método. Además de alimento directo de semilla entera o parcialmente rota, existen muchos métodos usados para producir harina de sem illa. La molienda húmeda de maíz se usa para producir, entre otros productos, harina de gluten de maíz. Además de productos alimenticios de maíz procesados, el grano de maíz entero con ácido fítico reducido puede ser producido de acuerdo con el método de la presente invención. La presente invención también encuentra utilidad en la producción de harina de gluten de maíz con ácido fítico reducido. Además de cosechas alimenticias mayores, tales como, maíz, las cosechas de semillas oleaginosas proporcionan una gran cantidad de harina de planta usada para alimento. Es de particular importancia en las semillas oleaginosas la producción de harina durante la extracción de aceite. En general, el aceite es extraído a partir de semillas oleaginosas usando ya sea un proceso con solvente o sin solvente. La "torta" o sólidos expelidos producidos por este proceso, son usados para formulaciones de harina y . usualmente contienen la mayoría del contenido de ácido fítico de la semilla. El procesamiento más común para semillas oleaginosas involucra la extración del aceite y la recuperación de la torta o componentes residuales de la semilla siguiendo la extracción de aceite. La presente invención encuentra utilidad en este proceso y los productos de harina resultantes pueden ser más valiosos que la harina producida convencionalmente debido al ácido fítico reducido. De ahí que un método para producir harina con contenido de ácido fítico menor proporcione una novedosa composición no encontrada acutalmente en harina derivada de semillas oleaginosas. Las cosechas de semillas oleaginosas principales que se beneficiarán de la presente invención ¡ncluyen cosechas de semillas oleaginosas cruciferas, tales como, Brassica napus, Brassica rapa, Brassica júncea, Brassica nigra, Sinapis alba, Crambe, Eruca sativa, y otras semillas oleaginosas cruciferas que pueden ser comercialmente importantes y pueden ser usadas para harina. Las semillas oleaginosas no cruciferas que son usadas frecuentemente en aplicaciones de harina incluyen soya, algodón, maíz, cártamo, girasol y cacahuate. La presente invención contempla el uso de la semilla oleaginosa genéticamente modificada producida a partir de la expresión de enzimas capaces de actuar sobre mio-inositol , estando dicha enzima bajo el control de un promotor selectivo de semilla. De acuerdo con esto, los niveles de ácido fítico son reducidos. Sobre el procesamiento de la semilla oleaginosa, se deriva un producto de harina con contenido de ácido fítico disminuido. Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar el método y en ninguna manera limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1 : Métodos generales empleados para la identificación de productos de ruta de fenilpropanoide: Determinación de contenido de sinapina, un producto terminal de la ruta de fenilpropanoide, en semillas cruciferas. Es evidente que el técnico experto puede adaptar todos los métodos ilustrados para la determinación de productos de la ruta de fenilpropanoide por referencia a numerosas publicaciones en qu ímica analítica. En el primer método ejemplificado, un simple ensayo para la identificación de sinapina en un tejido de planta, a saber, tejido de semilla de plantas cruciferas fue adaptado de métodos publicados (Chapple, C.C. S. , T. Vogt, B. E. Ellis y C. R. Somerville, 1992, Plant Cell 4: 141 3- 1424). Un protocolo de cromatografía de capa fina (TLC) fue estandarizado para la estimuación de la sinapina de producto de ruta de fenilpropanoide. Este método empleó la separación de extractos de plantas y una cantidad conocida de sinapina manchada en placas de sílice (por ejemplo, Whatman 60A SilicaG). La sinapina puede ser purificada mediante métodos publicados (por ejemplo, D. Strack, 1 977, Z. Pflanzenphysiol. 84: 1 39-145). La separación fue por movimiento de una mezcla de solvente n-butanol, ácido acético y agua a una proporción de 1 0: 2: 3, respectivamente, a aproximadamente 10 cm del origen. Los extractos de semillas se prepararon al remojar durante la noche una muestra pre-pesada en un tubo estrechamente cerrado conteniendo 1 00-500 microlitros de solución de metanol (98% metanol , 2% ácido acético) seguido por adición de un volumen igual de metanol como se adicionó antes y molido. El sobrenadante fue obtenido después de la centrifugación ca. 12, 000 x g. el sobrenadante fue extraído con una mezcla de cloroformo: agua (CW; 400 microlitros: 1 00 microlitros) y se centrifugó como antes, la fase lipídica se removió y la fase acuosa se secó con aire o se secó bajo vacío. Las muestras se disolvieron en agua y se mancharon en placas de TLC. Una cantidad definida de la muestra según se determinó de intentos empíricos se manchó en placas de TLC antes de exponer a solvente ascendente. Las mediciones de peso seco donde se usaron, fueron obtenidas al secar y entonces pesar una cantidad conocida de muestras frescas. La placa de TLC fue vista entonces bajo luz UV y se visualizó la sinapina como una mancha brillante. Una muestra de sinapina previamente purificada fue usada como un estándar, sola y también como una mezcla artificial con un extracto de semilla para asegurar que la sinapina purificada migró con la sinapina en el extracto de semilla cuando estaba presente con los componentes de extractos de semillas. Cuando se monitoreó la sinapina marcada de manera radioactiva, las placas de TLC fueron exploradas en un explorador Ambis400 (Scanalytics) que forma imágenes cuantitativamente de las emisiones radioactivas. Subsecuentemente, se usó cromatografía líquida de alta presión (HPLC) para verificar el contenido de sinapiuna. Los extractos de metanol de m aterial vegetal como antes, pero sin extracción de cloroformo-agua, se sometieron a análisis de HPLC en un instrumento de HPLC Varian ajustado con una columna Nucleosil C 18AB. El volumen de inyección normalmente fue de 10 microlitros y la fase móvil fue una mezcla de Solvente A (2% de ácido acético en agua) y Solvente B (2% de ácido acético en acetonitrilo) . Una condición de corrida normal involucraría en la fase móvil: Solvente A variado desde 90% hasta 80% sobre 17 minutos, seguido por una caída adicional de 1 0% sobre 1 minuto. La columna se mantuvo a 1 0% de Solvente A por cuatro minutos y entonces se descargó y equilibró con 90% de Solvente A. Estas condiciones pueden variarse para intensificar la separación de substancias levigadas. Por ejemplo, el Solvente A puede cambiarse de 90% desde el tiempo inicial hasta 80% sobre 1 5 minutos hasta 70% sobre 1 5 minutos, y entonces a 10% sobre 2 minutos, seguido por otros 2 minutos a 1 0% y equilibro con 90%. Un detector de arreglo de diodo se usó para monitorear ia absorbancia de UV. La absorbancia de UV a ajuste de 330 nanómetros se usó para análisis de muestras. Se construyó una curva estándar con sinapina purificada y se usó para cuantificación de sinapina en extractos de plantas. Es obvio para un técnico experto que las condiciones de HPLC (por ejemplo, las proporciones y gradiente de solventes, diferentes tipos de solventes) pudieran variarse. Es deseable determinar las condiciones que se adecúan al equipo y la complejidad de la muestra que es aplicada. La literatura publicada muestra una variedad de métodos de HPLC para analizar compuestos fenólicos incluyendo sinapina. Se usaron estudios de rastreadores radioactivos para obtener una representación más precisa del inicio de la síntesis de sinapina y para la determinación de la proporción de sinapina recién sintetizada en varias partes de una semilla. El método de rastreador radioactivo también puede ser usado para determinar la competencia de los componentes de semillas individuales (por ejemplo, cotiledones, embrión, recubrimiento de semilla) para sintetizar la sinapina de un suministro exógeno de colina. Los productos radiomarcados pueden ser analizados entonces por sinapina, por ejemplo, mediante el protocolo de TLC seguido por exploración por Ambis4000. El protocolo de HPLC fue empleado para análisis cuantitativo de contenido de sinapina total en semillas y componentes de semillas. Se usó TLC para análisis cualitativo del contenido de sinapina en varias etapas de desarrollo de semillas, y el rastreador radioactivo junto con TLC seguido por conteo de las manchas radioactivas se usó para la determinación del inicio y distribución de sinapina en semillas y tejido de semilla, tal como, cotiledones, ejes y recubrimiento de semilla. El método de rastreador radioactivo para establecer la síntesis de novo de sinapina a partir de colina, empleó vainas enteras (silicuas), en lugar de semillas aisladas, con el fin de proporcionar condiciones experimentales tan representativas como fera posible de condiciones in vivo. Las silicuas de varias etapas de desarrollo fueron obtenidas de plantas que crecieron bajo condiciones contrladas, normalmente 20°C de temperatura diurna, 1 5°C de temperatura nocturna, en un ciclo día/noche de 16/8 horas. La porción del pedúnculo de la silicua fue sumergida en una solución conteniendo colina marcada con 14C comprada a New England Nuclear (actividad específica de base de 2.0 GBq/mmol; concentración 7.4 MBq/ml, la cual es igual que 0.2 mCi/ml; colina , 3.7 micromol/ml) . Las silicuas con sus pedúnculos sumergidos en un tubo conteniendo 1 .8 mi de un medio acuoso, tal como, medio Murashige-Skoog de la mitad de la fuerza y colina no radioactiva 1 mM y 1 .8 a 9 microlitros de la base de colina radioactiva se incubaron en una cámara de crecimiento de planta durante 24 a 72 h con un ciclo de día/noche de 16 h de luz/8 h de obscuridad a una temperatura de 20°C. Las condiciones de luz fueron 51 microEinsteins/m2 por segundo y las semillas removidas de estas vainas fueron usadas en el análisis de TLC. Estas muestras fueron extraídas en solución de metanol, seguido por extracción de cloroformo-agua (CW) como se describió antes. Cuando se analizaron semillas más viejas, además del método anterior, se hizo infiltración de semillas separadas de silicuas. Se infiltraron veinte semillas en 500 microlitros del medio de colina radioactiva descrito antes bajo un vacío de luz durante 1 5 minutos a temperatura ambiente de ca. 23°C. El medio radioactivo fue removido entonces y reemplazado con 500 microlitros de medio no radioactivo de la composición anterior, menos de 1 C-colina se incubó a 23°C durante 24 h. las semillas fueron extraídas entonces como antes. El material vegetal también puede ser extraído por mezcla de cloroformo: metanol:ácido fórmico (CMF) en una proporción de 5: 1 2: 3, respectivamente. Normalmente, se adicionan 2 microlitros de CMF por mg de muestra, la muestra es molida y se deja a temperatura ambiente (21 -23°C) durante la noche ( 1 6 horas) seguido por centrifugación a ca. 1 2,000 x g durant 5 m in . El sobrenadante es recolectado y la pella se mezcla a conciencia con otro volumen de" CMF como se adicionó antes, se deja por 20 minutos y se centrifuga como antes. Los sobrenadantes son depositados, se realizó una extracción de cloroformo:agua (CW) como se describió antes y se analizó la fracción acuosa como antes.

Ejemplo 2: Identificación de la ubicación de la síntesis de un producto de la ruta de fenilpropanoide en un tejido específico. En este ejemplo, se determinó la cronometrización de desarrollo de la síntesis de un producto de la ruta de fenilpropanoide. Este ejemplo particular ilustra la síntesis de sinapina y la acumulación dentro de tejido de semilla crucifera. En este ejemplo, se usaron semillas de desarrollo de Brassica napus. El análisis de TLC de extractos de silicuas obtenidas de flores polinizadas a mano se realizó para establecer el momento de inicio de la acumulación de sinapina. Se tomaron muestras 7, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32 y 34 días después de la polinización (DAP) y después de la madurez de la semilla. Los extractos de semillas se prepararon de acuerdo con los métodos descritos en el Ejemplo 1 y el contenido de sinapina visualizado mediante análisis de TLC. . Fue evidente la sinapina de 1 8 DAP a madurez de semilla, y se mostró que las semillas en maduración contenían la mayor cantidad de sinapina, sugiriendo que hubo una acumulación neta en las semillas en desarrollo. La fracción de pared de la vaina de la cual se removieron las semillas no contenía sinapina, y la sinapina estuvo ausente en semillas más jóvenes de muestras a 7- 14- y 1 6-DAP. Este análisis indicó que el inicio de la acumulación de sinapina fue aproximadamente 1 8 DAP, sin embargo, ya que este método emplea detección de fluorescencia UV, la presencia de cantidades muy pequeñas, si existen, en semillas más jóvenes no sería detectable. La Fig . 3 muestra un ejemplo de un análisis de TLC de muestras hasta 28 DPA y la segunda placa muestra un ejemplo hasta la madurez de la semilla. Como los resultados anteriores no son cuantitativos, se realizó un análisis de HPLC de extractos de semillas enteras, obtenidos con una solución de metanol como se describió en el Ejemplo 1 . Los resultados presentados en Fig. 4 confirman el inicio de síntesis de sinapina de 20 DAP aumentando rápida y continuamente hasta la madurez. La cantidad de sinapina en semillas maduras fue ca. 0.8% en base al peso seco de la semilla y debido a que el aceite respondería por aproximadamente 45% de la semilla, esto se traduciría a ca. 1 .5% de harina de semilla desgrasada.

Ejemplo 3: Determinación de los aspectos temporales y espaciales de la síntesis de un producto en la ruta de fenilpropanoide - síntesis de sinapina con referencia al desarrollo de la semilla. Con base en la información obtenida en el Ejem plo 2, se demostró además que la sinapina es sintetizada por semillas en desarrollo. También fue evidente que la degradación de sinapina fue m ínima durante el desarrollo de la semilla. Con el fin de confirmar este análisis, se incubaron semillas en desarrollo con 1 C-colina, un precursor usado para la síntesis de sinapina de sinapoil-glucosa, un paso terminal en la ruta de fenilpropanoide en plantas. La presencia del precursor radioactivo resultó en la producción de sinapina marcada. De esta manera, es posible cuantificar la biosíntesis de sinapina mediante este método. Como se muestra en la Fig . 5, la síntesis de sinapina (incorporación de 14C-colina en sínapina) no fue detectable a 1 0 DAP, y apareció por primera vez a 14 DAP . Así, la síntesis de sinapina (es decir, la producción de la sinapina de producto final de los precursores de sinapoil-glucosa y colina) tiene lugar desde 14 DAP hasta semillas casi maduras. De acuerdo con esto, el inicio de la acumulación de sinapina en semillas ocurre después de 14 DAP, y las semillas en desarrollo continúan sintetizando y acumulando sinapina hasta la madurez. Aunque 1 8 DAP parece ser el momento en el cual la acumulación de sinapina se vuelve visible en análisis no radioactivos, el ensayo radioactivo es más sensible y permite la detección de cantidades aún pequeñas de biosíntesis para ser detectadas. De ahí, como se muestra por el ensayo radioactivo, la síntesis de sinapina empieza primero a una velocidad baja a 14 DAP. Estudios de infiltración muestran que la capacidad de síntesis de sinapina también está presente en semillas más viejas, casi maduras (Figura 6). Además de determinar el marco de tiempo en desarrollo de acumulación de productos de la ruta de fenilpropanoide, el técnico experto es dirigido además a determinar la especificidad de tejido de biosíntesís del producto de la ruta de fenilpropanoide. En esta porción del ejemplo, se midió la acumulación de sinapina en cotiledones, ejes y recubrimiento de semilla. Se realizó un análisis de rastreador radioactivo con silicuas enteras desde 1 8 hasta 42 DAP. El pedúnculo de silicuas cortadas se sumergió en una solución conteniendo 14C-colina durante 24 a 72 h y los tres componentes de la semilla fueron disecados y analizados por sinapina. Los resultados resumidos en la fig. 7 muestran que los cotiledones contenían la cantidad máxima de sinapina (en una base por semilla) seguidos por los ejes y recubrimiento de semilla. Los extractos de sinapina de los cotiledones y ejes de semillas de 25 DAP a madurez mostraron que, en una base de peso seco, los ejes contenían aproximadamente 50% de sinapina de los cotiledones (Fig . 8). Sin embargo, ya que los cotiledones son relativamente mayores en masa en comparación con los ejes (ca. Seis veces el peso de los ejes en la madurez), su contenido de sinapina contribuye hasta un 90% de la sinapina total encontrada en la semilla (Fig . 9).

Ejemplo 4: Transformación genética de una planta con un gene que codifica una enzima capaz de actuar sobre un precursor de la ruta de fenilpropanoide. En este ejemplo, una enzima, colina oxidasa (COX) , la cual actúa sobre el precursor usado para síntesis de sinapina es expresado en una célula vegetal. La enzima colina oxidasa es insertada en un vector de transformación de planta bajo el control de un promotor selectivo de semilla. La colina es un precursor para la producción de sinapina de sinapoil-glucosa, de ahí que la reducción del depósito de colina reduzca la producción de sinapina. La transformación genética de Brassica napus, una especie de planta crucifera, con un constructo de colina oxidasa (COX) selectiva de semilla. La secuencia de DNA del gene de colina oxidasa es mostrada en la Figura 10, mientras que la secuencia de aminoácidos predicha es mostrada en la Figura 11. Para proporcionar la expresión específica de semillas, se usó una secuencia de promotor de napin (Kohno-Murase, J., M. Murase, H. Ichikawa, y J. Imamura, 1994, Plant Molecular Biology, 26:1115-1124). El plásmido final, pHS731, fue construido mediante una serie de clonaciones y subclonaciones de acuerdo con protocolos estándares descritos en manuales tales como Maniatis, T., Frittsch.E.F., y Sambrook, J. (1982; Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring harbor, Nueva York). El esqueleto del vector es de RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E., y Keller, W., 1992, Gene 211:383-384), el cual ha sido modificado para incluir, en lugar del marcador de selección de planta NosP-NptlI de RD400, un gene de fusión entre gus y npt (Gus::npt). El Gus-npt ha sido descrito previamente (Datla, R.S.S., Hammerlindl., J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L., y G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246). Se clonó como fragmento de 2.6 kb, conteniendo el terminador Nos (señal poIyA) en el extremo de la secuencia npt, de pGKK14 (Datla et al., 1991) en un plásmido intermediario que había perdido el T-DNA completo de RD400. Se clonó un promotor de CaMV35S parcialmente duplicado junto con el líder de Virus de Mosaico de Alfalfa de pBI525 (Datla, R.S.S., f. Bekkaoui, J.K. Hammerlindl, G. Pílate, D.l. Dunstan y W.L. Crosby, 1993, Plant Science 94:139-149) se clonó como un fragmento HindIII-BamHI en el extremo 5' de la secuencia de Gus:npt. Los sitos para Hindlll, BamHI y un sitio Xbal adyacente se removieron al llenar los extremos con fragmento de Klenow de Polimerasa I para dar pHS722. Se obtuvo una región lac-alfa funcional conteniendo los múltiples sitios de clonación de pTZ1 9R (Mead , D.A. , E. Szczesna-Skorupa, y B. Kemper, 1 986, Protein Engineering 1 : 67-74) como un fragmento de 0.26 Kb mediante reacción en cadena de polimerasa. Este fragmento fue digerido con Munl y EcoRI y se introdujo en un sitio EcoRI de pHS722 para dar pHS723. Se determinó la secuencia de nucleótidos de una porción del T-DNA del vector y se identificaron los sitios úinicos en los sitios de clonación múltiples mediante análisis de restricción. PHS725 es un derivado que se origina de pHS723 y que contiene el marco abierto de la colina oxidasa originalmente de pKR 1 1 (ver Rozwadowski et al. , 1 991 ) vía una serie de vectores intermediarios que proporcionaron sitios convenientes o características tales como Señal Poly a de Virus de Mosaico de coliflor. El vector pHS725 proporciona en el soporte de pHS723, el marco de lectura abierto de COX con una señal de PoIyA de CaMV en el extremo 3'. La porción 5' del marco de lectura abierto conteniendo el promotor de CaMV35S fue reemplazada con un promotor de napin de un plásmido intermedio para dar pHS731 . El plásm ido intermedio comprendió un derivado pUC 1 9 conteniendo un promotor de napin de 1 . 1 Kb como un cartucho HindI I I-NapinP-BamH I , recibido de J . Kohno-Murase (Kohno-Murase et al. , 1994), el cual se ligó a una inserción de Hind M I-BamH I en una ventana de HindI I I-BamH I de plásmido RD400 (Datla et al. , 1 992). El plásmido resultante fue pHS974. El cartucho de PoIyA-Kpnl-marco abierto de lectura abierto de BamHI-BADH fue aislado como un fragmento de 2.1 Kb de pRKJ6A (pRKJ6A es descrito en detalle en R. K. Jain , 1 995, Genetic Engineering of Osmolyte Biosynthesis ¡n Plants: Mainpulation of Betaine Aldehyde Dehydrogenase Gene Expression Tobacco (I ngeniería genética de biosíntesis de osmolitos en plantas: Manipulación de expresión de gene de beta ína aldehido deshidrogenasa), Ph. D. tesis, Universidad de Saskatchewan , Saskatoon, Canadá), y se ligó a la ventana BamHI-Kpn I de pHS974, resultando en pHS981 . pHS981 se usó en la derivación de pHS731 . La Figura 1 2 muestra el plásmido resultante pHS731 que contiene un promotor de napin de borde derecho e izquierdo-marco de lectura abierto COX-señal poIyA de CaMV. La secuencia de nucleótidos del segmento de promotor de napin-marco de lectura abierto COX-señal poliA de CaMV ha sido determinada de los componentes. También es posible la confirmación de secuencia adicional, debido a que el antecesor de pHS723 incluye todo pBI N 1 9 (Bevan, M. , 1 984, Nucleic Acids Research 1 2: 871 1 -8721 ) , incluyendo el borde derecho e izquierdo y toda la región exterior del mismo. La secuencia de nucleótidos completa de pBIN 19 ha sido publicada. De esta manera, el constructo de gene COX descrito antes puede ser recuperado fácilmente para clonación en otros vectores. El vector de plásm ido pH S731 en E. coli DH5 ha sido depositado el 22 de enero de 1997 con American Type Culture Collection (ATCC), 1 2301 Parklawn Drive, Rockville MD, USA 20852, bajo la designación de ATCC de número de acceso 98300. Con base en la información publicada (DeLisle, A.J . , y Crouch, M. L. , 1 989, Plant Physiology 91 :61 7-623; Hoglund, A.-S. , T. Rodin, E. Larsson, y L. Rask, 1 992, Plant Physiology, 98:509-51 5) y nuestros resultados con un promotor de napin , se encontró que la actividad se extiende sobre la porción central del desarrollo temporal de semillas de ß. napus.

El vector pHS731 se insertó en la cepa Agrobacterium M P90 mediante acoplamiento triparental estándar seguido por transformación de Brassica mediada por Agrobacterium. La transformación se realizó esencialmente como se describió por Moloney et al. , 1 989, Plant Cell Reports 8:238-242. La cepa Agrobacterium tumifaciens GV31 01 /pM P90 (Koncz C. & Schell, J . , 1 985, Mol. Gen. Genet. 204: 383-396) que aloja el vector binario pHS731 se usó para estudios de transformación. Se cosechó un cultivo bacteriano de fase estacionaria en caldo LB (Difco, US) ( 1 00 m i) mediante centrifugación y se re-suspendió en 1 0 mi de caldo LB fresco con 1 % de DMSO (sulfóxido de dímeilo) (Sigma, US) como crioprotector. Se almacenaron alícuotas de 200 µl a -20°C hasta que se usaron para transformación, en donde se adicionó una alícuota bacteriana a 2 mi de Brain Heart Infusión Broth (Difco, US) conteniendo 2% de sacarosa, 50 µM acetosiringona, pH 5.6 y se incubaron durante la noche a 28°C. La densidad de células bacterianas fue aproximadamente 1 x 1 09 células por mi . Se expusieron plantas cotiledonarias a Agrobacterium conteniendo el vector de transformación de la planta de acuerdo con el método de Moloney et al , 1 989, Plant Cell Rep. 8:238-242. La superficie de corte del pecíolo de las explantas fue sumergido brevemente en el cultivo bacteriano. Las explantas fueron insertadas en medio de co-cultivación , de manera que la superficie de corte estuvo en contacto con el medio. Se colocaron diez explantas en placas de Petri de 1 00 x 1 5 mm cada una. Las placas se sellaron con envoltura plástica Stretch'n Seal R. Las placas se incubaron durante tres d ías en un gabinete de crecimiento con condiciones de temperatura y fotoperiodo, como antes, con respecto al paso de germinación de semillas. Las explantas fueron transferidas a medio de selección. Después de 3 a 4 semanas en el medio de selección, se cortaron los brotes verdes en regeneración (transformantes putativos) y se transfirieron a medio de selección fresco para crecimiento continuado. Cuando los brotes alcanzaron una longitud de 1 .5 - 2.0 cm , se transfirieron a medio de enraizamiento. Los brotes transgénicos putativos se clasificaron por expresión del gene gus esencialmente como se describió por Jefferson, R.A. , 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405. La presencia de manchado con azul fue considerada como evidencia de la transformación. Se estableció la confirmación de la transformación mediante selección en canamicina, Southern blots, PCR (Reacción en Cadena de Polimerasa) y análisis de progenie . Las sem illas transgénicas de Brassica napus, cv Westar conteniendo el vector pHS731 , referido como 202622, han sido depositadas el 22 de enero de 1997 con American Type Culture Collection , (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville MD, USA 20852, bajo designación de ATCC número de acceso 97854. Se determinó entonces la expresión de un gene de colina oxidasa en semillas de Brassica napus. Se regeneraron varias líneas transgénicas independientes. Se demostró la actividad de COX al usar una reacción enzimática acoplada. COX produce betaína aldehido a partir de colina y este betaína aldeh ido pueden ensayarse fácilmente mediante oxidación dependiente de NAD de éste mediante BADH . La reducción de NAD es monitoreada por el cambio en absorbancia a 340 nm . Con el fin de estandarizar el ensayo, se usan cantidades variables de COX comercialmente disponible (por ejemplo, Sigma) y una cantidad constante de una preparación de BADH de E. coli (50 unidades; 1 U = 1 nmol de NAD reducida por min por mg de proteína) a partir de una cepa bacteriana que sobre-expresa BADH, para estandarizar las condiciones de reacción y para establecer una curva estándar, de manera que COX sea limitante y no BADH . El ensayo es realizado entonces con extractos de plantas de líneas transgénicas y controles. BADH puede enriquecerse o purificarse mediante métodos publicados (por ejemplo, Falkenberg , P. y Strom, A. R. , 1990, Biochemica Biophysica Acta 1 034: 253-259) . Los extractos de plantas se obtuvieron como sigue. Las hojas de plantas de aproximadamente 1 00 mg se congelan con nitrógeno líquido, se muelen con un amortiguador de extracción enfriado con hielo a dos volúmenes para el peso de la muestra. Las muestras fueron centrifugadas a ca. 1 0, 000 x g y el sobrenadante fue centrifugado nuevamente. La centrifugación se repitió hasta que no fue visible materia particulada alguna . Con las semillas, ca. 20 semillas por. muestra , después de la primera centrifugación, se adicionaron 20 mg de carbón activado y se siguió el resto del procedimiento . El amortiguador de extracción, pH 8.0 ajustado mediante KOH, contiene por 1 00 mi . 1 .92 g de HEPES, 0.2 mi de EDTA 0.5M , 1 0 mi de glicerol y agua deionizada para llevar a un volumen de 1 00 m i. Antes del ensayo, se adicionó DTT de una base de 1 M a una concentración final de 25mM y se adicionó un coctel inhibidor de proteasa com pleto (Boehringer-Man nheim , Cata log : 1 697-498) a partir de una base 1 0X en amortiguador H EPES. El amortiguador de ensayo de enzima (amortiguador de BADH) contiene HEPES-KOH 50m M , pH 8.0, EDTA 1 mM y DTT recién adicionado a una concentración final de 1 mM. El ensayo acoplado se realizó en una reacción conteniendo 50 microlitros de amortiguador de BADH , 50 microlitros de una base de NAD de 1 0mM, 50 microlitos de muestra de planta, 30 microlitos o equivalente para dar 50 U de BADH y agua deionizada para llevar a un volumen de 450 microlitros. Se monitoreó la absorbancia a 340 nm durante 20 minutos, entonces se adicionaron 50 microlitos de cloruro de colina y se continuó la lectura espectrofotométrica durante 10 a 20 minutos. Para una curva estándar, se omitió la muestra de la planta y se adicionaron en su lugar varias cantidades de COX purificada. Las unidades se calcularon usando un espectrofotómetro de registro, programable del tipo Beckman DU65. Un técnico experto puede modificar los protocolos para adecuar la disponibilidad de equipo usando datos bioqu ím icos disponibles en la literatura para el coeficiente de extinción para NAD. La reducción de NAD por sí misma es un ensayo estándar realizado por deshidrogenasas.

Ejemplo 5: Análisis de semillas transgénicas para contenido fenólico reducido En este ejemplo, las semillas fueron analizadas por contenido de sinapina. Las semillas de plantas transgénicas recuperadas en el Ejemplo 4 se hicieron crecer para obtener progenie propia , y estas l íneas de progene fueron analizadas por segregación o carencia de la misma de un transgene codificando actividad de beta glucuronidasa (GUS) . Este gene (ver Datla , R. S. S . , Hammerlindl , J . K. , Pelcher, L. E . , Crosby, W. L. , y G. Selvaraj, 1991 , Gene 101 : 239-246) está presente dentro de los límites derecho e izquierdo del T-DNA del vector pHS731 y de esta manera sirve como un marcador conveniente en análisis genético de segregación. La carencia de segregación genética indicó la naturaleza homóciga de la planta , a partir de la cual se originó la progenie. Aquéllas líneas que mostraron segregación fueron hem ícigas y las segregantes que carecieron de actividad de GUS fueron retenidas como controles que no contenían el gene OCX. Así, hubo depósitos de líneas homócigas conteniendo COX y sus contrapartes que no conteían el transgene. Estas l íneas se analizaron por su contenido de sinapina mediante un protocolo de HPLC. Los resultados mostrados en la Figura 1 3 muestran claramente que los segregantes transgénicos tienen niveles de sinapina significativamente reducidos en contraste con sus contrapartes no transgénicas. Los segregantes no transgénicos ofrecen el mejor control porque surgen de la misma planta transgénica primaria. Estos resultados demuestran la utilidad del método descrito. Es obvio para un experto técnico que varios niveles de reducción pueden lograrse al cambiar los niveles, momento y ubicación de la expresión de gene, y también buscar las variantes benéficas entre las líneas transgénicas individuales que muestran resultados deseables debido a una variedad de razones que incluyen efectos de posición y número de copias.

Ejemplo 6: Producción de un producto protector de tensión por desviación de un precursor dentro de la ruta de fenilpropanoide.

En este ejemplo, la betaína protectora de tensión fue producida mediante la actividad combinada de OCX y BADH, ambas bajo el control de un promotor selectivo de semilla. Como una primera parte de este ejemplo, se produjeron Brassica napus transgénico portando el gene BADH bajo el control de un promotor selectivo de semilla. Se realizó el análisis de estas plantas para expresión de BADH. Expresión de un gene de betaína aldehido deshidrogenasa en semillas de Brassica napus. Un gene de BADH de E. coli (betB) es aislado y manipulado por expresión específica de semilla mediante enlace a un promotor de napi de B. napus (Boyd et al., Gene 103:45-52 (1990)). Se usó el plásmido RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E., y Keller, W., 1992, Gene 211:383-384) como el vector a partir del cual se obtuvo del derivado final pHS974 conteniendo dentro de los límites de T-DNA derecho e izquierdo, el marco de lectura abierto de betB de su sitio ATG bajo el control de expresión de un promotor de napin y una señal PoIyA de virus de mosaico de coliflor. El cartucho de Napin-betB-PoIyA (ca. 3.3 Kbp) comprometió, en el orden indicado: sitio Hindlll, promotor de napin, sitio BamHI, betB ORF, sitio EcoRI-señal PoIyA de DNA de virus de mosaico de coliflor, sitio Kpnl, y sitio EcoRl. El promotor de napin fue de Kohno-Murase et al. (Plant Molecular Biology, 26:115-1124, 1994) y la señal PoIyA fue originalmente de plásmido pJIT114 (Guerineau, F., Woolston, S., Brooks, L., y Mullineaux, 1988, Nucleic Acids Research 16:11380). El plásmido final pHS981 de ca. 15 Kbp es mostrado en la Figura 14. Este fue introducido en Agrobacterium tumefaciens GV3101[pMP90] (Koncz, C, y Schell, J.. 1986, Molecular and General Genetics 204: 383-396) y la cepa resultante se usó para transformación genética de Brassica napus. Se obtuvieron varias líneas transgénicas y se ensayaron las semillas a varias etapas de desarrollo por actividad de BADH . Se encontró que la actividad de BADH tuvo un pico alrededor de 35 DAP, y las semillas maduras retuvieron actividad residual . La actividad específica como una función de la etapa de desarrollo demostró que el inicio de la actividad de BADH es concomitante con la síntesis de sinapina. Las líneas que expresan el gene BADH se cruzaron con las líneas portando el gene COX descrito en el Ejemplo 4. Las plantas conteniendo el gene COX y plantas conteniendo ambos genes BADH y COX se analizaron por contenido de sinapina y contenido fenólico total. Estos resultados se muestran en la Figura 1 5 (contenido de sinapina) y Figura 1 6 (contenido fenólico total) . Las semillas analizadas se recolectaron de plantas cultivadas bajo condiciones de campo en el verano de 1 999. Como se muestra en la Figura 1 5, la actividad combinada de COX y BADH conducen a una reducción adicional de acumulación de sinapina sobre la actividad de COX sola. Como se muestra en la Figura 1 6, existe u na reducción en el contenido fenólico total en plantas transgénicas con relación al control.

Ejemplo 7: Secuencia de nucleótidos de un gene sintético de ácido ferúlico decarboxilasa. En este ejemplo, la secuencia publicada de ácido ferúlico deca rboxilasa de Bacillus pumilus (Zago et al . , Applied and Environmental Microbiology 61 : 4484-4486, 1 995) se usó para la construcción de un gene optim izado para la expresión en células vegetales. El marco de lectura abierto de ácido ferúlico decarboxilasa se sintetizó al ligar oligonucleótidos sintéticos con base en la secuencia publicada. Los oligonucleótidos se sintetizaron con base enormemente en la preferencia de codón de genes altamente expresados de Brassica napus. Los oligonucleótidos sintéticos fueron de aproximadamente nucleótidos de largo. El diseño de los duplos de oligonucleótidos incluyó en el extremo 5', un extremo BamHI-cohesivo (5' GATC-) y un confín EcoRl cohesivo (3'-TTAA-5') en el extremo 3'. Los duplos individuales se ensamblaron y se formó un marco de lectura abierto de longitud completa con sitios 5' BamHI y 3' EcoRl . Las reacciones de ligación fueron de acuerdo con los protocolos estándares. Los productos de ligación fueron ligados a su vez en un vector de clonación . Sobre la ligación del gene sintético anterior en BamH I-EcoRI cortado pBluescript SK- (Stratagene), se identificaron los clones con una inserción de 0.5 kb mediante clasificación de DNA de plásmido de miniprep de clones de E. coli. Los candidatos potenciales se clasificaron, y se determinó la secuencia de nucleótidos de dos de los clones. Se encontró que cada uno de los clones tuvo una mutación puntual y estas dos mutaciones puntuales estaban separadas en los dos clones elegidos. La spearación de las mutaciones permitió la re-construcción de un gene intacto de combinar dos porciones sin mutar del gene de estos clones. Este clon es referido como pGS97b 1 . La secuencia de nucleótidos de este gene sintético se muestra en la Figura 17. La secuencia de aminoácidos predicha se muestra en la Figura 18. La funcionalidad del gene sintético , fue valorada mediante una prueba simple. La ácido ferúlico decarboxilasa convierte el ácido ferúlico a 4-vinilguaiacol (4-VG). El 4-VG tiene un olor distintivo a clavo y se cree que 4-VG es el compuesto simple más importante que imparte el aroma natural del clavo. La cepa de Escherichia coli con pGS97b1, cuando se hizo crecer en la presencia de ácido ferúlico 1mM en el medio de crecimiento dio un olor a clavo distinto, mientras que el cultivo sin ácido ferúlico o un cultivo de una cepa con el vector solo no produjo el olor. El análisis de HPLC de cultivos alimentados con ácido ferúlico confirmó la desaparición de ácido ferúlico. Con base en los resultados anteriores, se concluyó que un gene funcional es clonado en pGS97b1.

Ejemplo 8: Transformación genética de una planta con un gene gue codifica ácido ferúlico decarboxilasa bajo el control de un promotor constitutivo. En este ejemplo, una enzima, ácido ferúlico decarboxilasa clonada en pGS97b1 se insertó en un vector de transformación de planta RD400 (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Panchuk, B., Pelcher, L.E., y Keller, W., 1992. Gene 211:383-384), el cual se ha modificado para incluir, en lugar del marcador de selección de planta NosP-NptlI de RD400, un gene de fusión entre gus y npt (Gus:npt). El Gus-npt ha sido descrito previamente (Datla, R.S.S., Hammerlindl, J.K., Pelcher, L.E., Crosby, W.L., y G. Selvaraj, 1991, Gene 101: 239-246). El gene de ácido ferúlico decarboxilasa se colocó bajo el control del promotor 35S y el plásmido se usó para transformar plantas de tabaco de acuerdo con los protocolos estándares. El mapa de restricción del vector es mostrado en la Figura 1 9. El vector pGS97b3, como se muestra en la Fig . 1 9, es similar a pHS731 , excepto en lo que sigue. En el mismo esqueleto de vector de pHS731 , el cartucho Hindl l l-P napin-BamHI ha sido reemplazado con un cartucho de promotor 35S de virus de mosaico de coliflor-líder de virus de mosaico de alfalfa (descrito en R. S.S. Datla, F. Bekkaoui, J. K. Hammerlindl , G. Pílate, D. l . Dunstan y W. L. Crosby. Improved high-level constitutive foreign gene expression in planta using an AMV RNA4 untranslated leader sequence (Expresión mejorada de gene extraño constitutiva, de alto nivel, en plantas usando una secuencia líder sin trasladar AMV RNA4), Plant Science 94: 1 39-149, 1993). Esta porción promotora es abreviada como 35S en la Fig. 1 9. Siguiendo a 35S se encuentra el marco de lectura abierto de ferulato decarboxilasa unido por BamH I en el extremo 5' y EcoRI al extremo 3', en lugar del marco de lectura abierto de COX de pHS731 . Se recuperaron las plantas transgénicas que expresan el gene de ácido ferúlico decarboxilasa. Las plantas se analizaron por contenido fenólico y la producción de vinilguaiacol. Se encontró que las plantas transgénicas independientes de tabaco, las cuales portan el gene de ácido ferúlico decarboxilasa contienen un polipéptido inmunoreactivo de tamaño esperado en análisis de western blot con anticuerpos policlonales cultivados contra ácido ferúlico decarboxilasa. Las plantas no transformadas no tuvieron un péptido inmunoreactivo. Esto proporciona purebas para la expresión transgénica de proteína de ácido ferúlico decarboxilasa en estas plantas transgénicas.

Ejem plo 9: Transformación genética de una planta con un gene gue codifica ácido ferúlico decarboxilasa bajo el control de un promotor selectivo de tejido. En este ejemplo, se insertó una enzima, ácido ferúlico decarboxilasa, clonada en pGS97b1 en un vector de transformación de planta RD400. El gene de ácido ferúlico decarboxilasa se colocó bajo el control del promotor de napin específico de semilla de B. napus y el plásmido se usó para transformar plantas de tabaco de acuerdo con protocolos estándares. El mapa de restricción del vector se muestra en la Figura 20. El vector pGS97b2, como se muestra en la Fig . 20, es similar a pGS97b3, excepto que en el mismo esqueleto del vector, el cartucho Hind l l l-35S-BamHI ha sido reemplazado con el cartucho H indl l l-promotor napin-BamH I mostrado en la Fig . 1 2 para pHS731 . Se recuperaron las plantas transgénicas que expresan el gene de ácido ferúlico decarboxílasa. Se analizaron semillas de plantas por contenido fenólico y la producción de vinilguaiacol .

Ejemplo 1 0: Determinación de especificidad de tejido y patrón de desarrollo de acumulación de ácido fítico para desarrollar semil las de una planta crucifera, Brassica napus. Biosíntesis de ácido fítico En este ejemplo, se determinó información con respecto a la ruta biosintética de ácido fítico en semillas de Brassica. Debido a que el ácido fítico es el derivado de hexafosfato de mio-inositol (el ácido fítico es referido como I P6), se determinaron las proporciones de derivados fosforilados individuales de componentes de mio-inositol (por ejemplo, I P^ I P2, I P3, I P4 e I P5) de derivados de inositol fosforilados total. Se usó ácido fítico puro, parcialmente degradado mediante autoclave para producir los diversos derivados fosforilados, como un estándar para análisis de H PLC conducido de acuerdo con Vernon y Bohnert (1 992. The EM BO Journal 1 1 :2077-2085) y Vernon DM , Tarczynski MC y Jensen RG y Bohnert HJ, (1993. The Plant Journal 4: 1 99-205). Las diversas formas de inositol fosforilado (por ejemplo, I P^ IP2, I P3, I P4 e I P5) y se distinguieron fácilmente por este análisis. Se encontró solo un pico cuando se analizaron muestras de fosfato de inositol extraídas de semillas en desarrollo de Brassica, las cuales correspondieron a I P6, (es decir, ácido fítico) . Este resultado demostró que I P6 es la forma de fosfato de inositol predominante en semillas en desarrollo y otras formas intermedias de inositol fosforilado no pudieron ser detectadas por HPLC mediante los métodos descritos. De acuerdo con esto, se cree que la biosíntesis de ácido fítico de mio-inositol ocurre en una manera rápida y esencialmente cuantitativa.

Biosíntesis de desarrollo de ácido fítico En esta porción del ejemplo, se determinó el momento de desarrollo de la acumulación de ácido fítico. Los métodos para determinar el conten ido de ácido fítico de las semillas es como sigue: Se muelen las semillas en un mortero en la presencia de nitrógeno líquido y el polvo es transferido a un tubo estéril de 1 5 m i conteniendo 5 mi de HCl 0.5M . Después de la remoción de lípidos con extracción de hexano, la fase restante (fase acuosa con residuos de tejido) es sonicada durante 90 segundos a nivel 3 con un procesador líquido ultrasónico (Modelo XL2020, Heat Systems, Inc. , Farmingdale, NY, US). Siguiendo la centrifugación, el l íquido es transferido a un tubo fresco para análisis de ácido fítico por HPLC. Este método fue aplicado a semillas en varias etapas de desarrollo. La acumulación de ácido fítico durante el desarrollo de la semilla se muestra en la Figura 21 . Aunque el ácido fítico es detectable primero en semillas en etapas muy tempranas (es decir, 1 2 d ías después de la polinización) , el contenido no aumentó significativamente hasta 22 días después de la polinización. Durante un periodo de 1 0 días siguiendo a su primera aparición, el ácido fítico alcanza un nivel máximo de aproximadamene 240 ug/semilla. El contenido de ácido fítico expresado en términos de peso seco de semillas maduras es aproximadamente 3.2%. Estos resultados indican que la reducción de ácido fítico a través de la interferencia con biosíntesis de ácido fítico requiere un promotor que es capaz de expresión de aproximadamente 1 2 DAP a cerca de la madurez de la semilla. Análisis adicional indicó que el ácido fítico es depositado principalmente en tejido de embrión en lugar de recubrimiento de semilla (Fig ura 22) . Los coti ledones contienen casi 90% del ácido fítico de semilla 1 0% está presente en el eje de embrión . Estos hallazgos sugieren adicionalmente que los diversos tejidos de embrión son los tej idos objetivo más preferidos para reducción de ácido fítico mediante modificación genética de biosíntesis de ácido fítico.

Ejemplo 1 1 : Determinación de metabolismo de mio-inositol en tejido de semilla en desarrollo. Este ejemplo ilustra la porción del depósito de mio-inositol, el cual es utilizado para biosíntesis de ácido fítico. Aunque el mio-inositol es el precursor para síntesis de ácido fítico en plantas, también se usa en otras rutas anabólicas para la producción de componentes de pared celular y fosfatidiinositol. Eje ejemplo ilustra la porción del depósito de mio-inositol total, que se usa para biosíntesis de ácido fítico en semillas en desarrollo. El marcado in vivo de semillas de Brassica usando 3H-mio-inositol se usó para rastrear la distribución de inositol en diferentes fracciones extraídas con diferentes solventes. La técnica usada para marcado de pulso in vivo de semillas en desarrollo con 3H-mio-inositol fue como sigue. Se removieron las silicuas en diferentes etapas de desarrollo y el extremo de corte se colocó inmediatamente en 10 mi de medio de cultivo estéril conteniendo 5 uCi de 3H-mio-inositol en tubos de 50 mi y se cultivó a condiciones de crecimiento estándares (20°C durante 1 6 horas con luz, 1 5°C durante 8 horas sin luz) durante dos días. Las semillas se recolectaron para extracción de l ípidos, ácidos fíticos, componentes de pared celular solubles en ácido trifluoroacético (TFA) y desechos de paredes celulares. La radioactividad se determinó en cada fracción mediante centelleo l íquido. Se realizaron cuatro tipos de extracciones de semillas marcadas con pulso para separar componentes celulares solubles en agua (para análisis de ácido fítico) , solubles en hexano (para análisis de l ípidos) , componentes de paredes celulares solubles en ácido trifluoroacético (TFA) y desechos celulares. La Figura 23 lista la radioactividad promedio en cada fracción en diferentes etapas de semillas en desarrollo. Los datos indican que más del 20% de la marca total en semillas se encuentra en la fracción lipídica a 25-30 d ías después de la polinización (DAP) . La radioactividad en fracciones de paredes celulares (pared celular soluble en TFA y desecho celular) responde por aproximadamente 5% de la marca total incorporada durante el desarrollo de la semilla. La radioactividad en la fracción soluble en agua se analizó adicionalmente por HPLC para identificación de la porción de ácido fítico. Se encontró que se recupera aproximadamente 1 0% de la marca en el extracto soluble en agua en el pico de ácido fítico y cerca del 30% de la marca se encuentra en el pico de inyección de muestra, q ue está libre de mio-inositol. El otro material marcado presente en el extracto soluble en agua fue recuperado en picos de pre- y post-ácido fítico, representando compuestos no identificados. El porcentaje de marca metabolizada encontrada en fracciones de ácido fítico, l ípido, pared celular soluble en TFA y desecho celular se muestra en la Figura 3. Se encontró aproximadamente 30% de la marca de metabolitos derivados de 3H-mio-inositol en ácido fítico a 20 hasta 30 DAP. De manera concomitante, aproximadamente 60% de la marca estuvo presente en lípidos (fosfolípidos conteniendo inositol) y menos de 1 0% en la fracción de pared celular. Por lo tanto, la porción del depósito de mio-inositol total que se utilizó para biosíntesis de ácido fítico es aproximadamente 30% en un periodo de desarrollo de semilla donde la biosíntesis de ácido fítico parece estar en un máximo.

Ejemplo 12. Clonación de un gene que codifica una enzima capaz de actuar sobre mio-inositol En este ejemplo, se aisló un gene capaz de actuar sobre mio-inositol . El gene fue el gene de inostiol O-metil-transferasa de la escarchada común. Se usó clonación de transcriptasa inversa para aislar el gene como se describe más adelante. Se realizó la manipulación de DNA estándar de acuerdo con Maniatis et al. , Molecular Cloning , A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. El RNA total fue extraído de tejidos de hojas tratadas con NaCI 500 mM de escarchada y se purificó adicionalmente poly (A) + RNA. Este mRNA fue usado para transcripción inversa por Superscript 11 Reverse Transcriptase (Promega, Madison, Wl. ) bajo las siguientes condiciones: Se usaron tres microgramos de mRNA disueltos en 20 microlitros de agua como una plantilla. El RNA se desnaturalizó por calentamiento a 65°C durante 5 minutos y entonces se enfrió en hielo. A la mezcla se adicionaron 3 microlitros de oligo-dT (500 microgramos/ml) , 8 microlitros de 5X amortiguador de transcriptasa inversa . 4 microlitos de DTT OJ M , 2 microlitros de dNTPs 1 0 m M . La mezcla se calentó a 42°c, entonces se adicionaron 3 microlitros (60 unidades) de Supertranscript I I Reverse Transcriptase. La reacción se realizó durante una hora a 42°C. Después de este periodo de tiempo, se adicionó 1 microlitro de Rnasa H (1 .5 Unidades/microlitro) y la reacción se realizó durante 30 minutos a 37°C. El cDNA resultante se usó como plantilla para PCR por Vent polimerasa bajo las siguientes condiciones: la reacción de PCR se realizó en un volumen de 100 microlitros con ciclos comprendiendo 94°C durante 1 minuto, 55°C durante un minuto, 72°C durante un minuto con una extensión de 2 segundos para cada ciclo en un total de 30 ciclos. Los iniciadores usados en esta reacción se basaron en la secuencia de DNA de IMT publicada (número de acceso GenBank M87340). El iniciador delantero usado fue la Secuencia I . D. No. 6: S'TTTTTGGATCCATGACTACTTACA CAATGGCAACTACA3' el cual comprende un sitio BamHI en el extremo 5' (subrayado) . El iniciador trasero usado fue la Secuencia I . D . No. 7: TTTTTTTTGCGGCCGCATAAAGGCAAATCATACACTG3' el cual comprende unsitio Not I en el extremo 5' (subrayado). El fragmento de DNA amplificado se digirió con BamH I y Not I , y entonces se subclonó en pSPORT 1 (BRL, Bethesda, M D.) . Se clonó el frag mento de PCR digerido Bam H l , Not I en los sitios correspondientes del vector pSPORT para derivar pSportI MT. La Figura 24 (Secuencia I . D. No. 5) muestra la secuencia del fragmento de DNA amplificado, el cual es idéntico a la secuencia de DNA de I MT publicada, excepto por una diferencia de dos bases en la reacción sin trasladar 3'. La secuencia de proteína predicha es idéntica a la información publicada disponible de GeneBank.

Ejemplo 13: Construcción de vectores de transformación de planta con un gene que codifica una enzima capaz de actuar sobre mio-inositol: Uso del gene mio-inositol O-metil transferasa de escarcha. Este ejemplo ilustra la construcción de un vector de transformación de planta conteniendo un gene capaz de actuar sobre mio-inositol bajo el control de un promotor activo en células de plantas. El vector de transformación de planta ejemplificado comprende el gene de mio-inositol O-metil transferasa bajo el control de un promotor activo en células de semilla, el promotor 35S. La construcción del vector fue como sigue: pSportI MT fue digerido con Bam Hl y Eco Rl para liberar el gene IMT. El fragmento de gene IMT fue clonado en los sitios correspondientes de pBluescript SK(-), (Stratagene, La Jolla, CA.) y el plásmido resultante es referido como pBlueIMT. El pBluel MT fue digerido con Spe I y clonado en el vector pBI 221 (CloneTech) previamente cortado con Xba I . Un plásmod que contenía el gene IMT en la orientación correcta en relación con el promotor 35S en pBI 221 fue elegido y digerido con Hind l l l y Eco Rl . El frag mento 35S - I MT - terminador Nos fue transferido en pRD 400 resultando en el vector de transformación de planta p35SI MT.

El constructo resultante , p35SI MT, contiene un cartucho de promotor 35S-I MT-GUS-terminador Nos en pRD400 y se muestra en la Figura 25.

Ejemplo 14: Construcción de vectores de transformación de planta con un gene gue codifica una enzima capaz de actuar sobre mio-inositol bajo el control de un promotor selectivo de semilla. En este ejemplo, un gene que codifica una enzima capaz de actuar sobre mio-inositol, bajo el control de un promotor selectivo de semilla, se construyó en un vector de transformación de planta. El gene usado fue el gene de mio-inositol O-metiltransferasa y el promotor fue el promotor de napin selectivo de semilla. El vector es referido como pN l MT. El vector pN l MT fue construido como sigue: se ligó un fragmento de DNA de IMT diferido con Spe I (Ejemplo 4) en pDH 1 (el promotor de napin como se describió por Kohno-Murase et al 1 994, Plant Molecular Bioiogy, 26: 1 1 1 5-1 1 24) en el sitio Xba I , resultando en un cartucho de promotor de napin-I MT-terminador Nos. Este cartucho de expresión fue transferido adicionalmente en pRD400. El vector resultante es mostrado en la Figura 26.

Ejem plo 1 5: Transformación de Brassica napus (Westar) con p35SI MT. El vector p35SIMT se insertó en la cepa de Agrobacterium MP90 mediante acoplamiento triparental estándar seguido por transformación de Brassica mediada por Agrobacterium. La transformación se realizó como se describió en el Ejemplo 4. Las plantas transformadas con p35SI MT se obtuvieron y analizaron por contenido de fitato.

Ejemplo 16: Análisis molecular de plantas transgénicas. Se analizaron plantas transgénicas F0 comprendiendo el cartucho de expresión CaMV 35S-IMT por PCR, Southern y northern blots, así como ensayo de enzima IMT. El análisis de PCR preliminar indicó que todas ias plantas transgénicas contenían el gene IMT (Fig ura 27) . La hibridación Southern mostró que el gene IMT estaba integrado en el genoma de Brassica con varios números de copias. El RNA total fue extraído de semillas en desarrollo mediante análisis de hibridación northern, como se muestra en la Figura 28.

Ejemplo 17: Análisis de ácido fitico en plantas transgénicas Se analizó el contenido de ácido fítico en las semillas maduras recolectadas de las plantas transgénicas F0. La extracción de las semillas se realizó como se describió en el Ejemplo 1 0. Los datos recolectados indican que en promedio, se encuentra una reducción de ácido fítico de más de 1 5% en plantas transgénicas producidas con el vector pSI MT. Las semillas F T son mezclas de semillas transgénicas y no transgénicas, debido a la segregación, de ahí que la reducción real de ácido fítico sea substancialmente mayor en una base por semilla transformada. Las semillas F2 y F3 son líneas homócigas conteniendo el vector pSIMT. Es evidente que bajo las condiciones de campo, las l íneas homócigas que portan el vector de pSI MT muestran y promedian una reducción de 30% en los niveles de ácido fítico en la semilla. Además del análisis de ácido fítico, se realizó un análisis de Southern blot para determinar el número de copias de los genes insertados. I ncluso en plantas con una copia simple insertada del gene, se ve una reducción significativa (34%9 de ácido fítico (por ejemplo, planta número TP #1 1 ) . Así , la expresión de una actividad enzimática capaz de modificar mio-inositol en tejidos responsables de la biosíntesis de ácido fítico, conduce claramente a una reducción en ácido fítico en la semilla. También está claro que el rasgo de ácido fítico bajo puede ser transferido sexualmente, ya que fue hereditario. Así, el método de uso también puede incluir la transferencia del rasgo mediante técnicas de cultivo convencionales una vez que se establece el rasgo de ácido fítico bajo.

Ejem plo 1 8: Transformación de Brassica napus con pN l MT. El vector p35SNI MT fue insertado en la cepa de Agrobacterium MP90 mediante acoplamiento triparental estándar, seguido por transformación de Brassica mediada por Agrobacterium. La transformación se realizó como se describió en el Ejemplo 4. Se obtuvieron las plantas transformadas con p35NI MT y se analizaron por contenido de ácido fítico reducido como en el Ejemplo 17. La Figura 31 muestra una tabla de datos recolectados de semillas transgénicas F 1 y F2 portando el vector pN l MT, que crecieron bajo condiciones de campo. En las plantas F1 , la inserción pNlMT es segregante, de esta manera las semillas analizadas fueron una mezcla de segregantes transgénicos y no transgénicos. En la generación F2, la mayoría de las líneas fueron poblaciones homócigas o casi homócigas. En el an álisis de F2, se observó cerca de una reducción de 40% en contenido de ácido fítico en semillas de plantas que crecieron bajo condiciones de campo. Así, la expresión de una enzima capaz de reducir la disponíblidad de mio-inositol para biosíntesis de ácido fítico en una materia selectiva de semilla conduce a una reducción significativa en los niveles de ácido fítico.

Ejemplo 19: La formación y acumulación de UDP-galactosa es prevenida al utilizar una actividad enzimática heteróloga para células de plantas. La enzima U DP-galactosa 4-epimerasa (galE) está involucrada en uno de los principales pasos de metabolismo de galactosa en sistemas vivientes. Cataliza la conversión de U DP-galactosa en UDP-glucosa. El gene para la enzima está disponible de humanos, levaduras y bacterias. El objetivo de este ejemplo es sobre-expresar esta enzima en tejidos específicos de la planta objetivo con una visión a incrementar el depósito de U DP-glucosa a costa de aquél de UDP-galactosa. El resultado predicho sería biosíntesis reducida de galactinol, el cual es el precursor de los glicósidos de sacarosa anti-nutricionales (glicósidos de RFO (familia de rafinosa de oligosacáridos), por ejemplo, rafinosa, estaquiosa, etc.) . Lograr este objetivo conducirá, además de reducir la proporción de acumulación de los glicósidos de RFO no deseados, a una disponibilidad intensificada de UDP-glucosa y sacarosa concurrentemente. Se esperará que la última participará en, e intensificará en otras rutas metabólicas, donde se necesita la sacarosa ya sea para producir otros metabolitos que son esenciales para la planta, o como fuente de carbono para productividad de planta intensificada (por ejemplo, proteínas, lípidos, rendimiento global , etc. ) .

Este es un ejemplo para ilustrar la utilidad de una enzima bacteriana en plantas superiores para provocar la conversión metabólica de un substrato esencial en otro, por lo cual el nuevo substrato resultante será utilizado fácilmente por la planta en una variedad de interconversiones metabólicas importantes.

Ejemplo 20: Alteración de niveles de derivados de azúcar al usar la enzima fosfoglucomutasa (pgm) La enzima fosfoglucomutasa (pgm) cataliza la interconversión de glucosa (Glc)-1 - y Glc-6-fosfato en la síntesis y consumo de sacarosa. La enzima juega un papel pivotal en la síntesis y utilización de sacarosa, almidón y glicógeno, y está presente en todos los organismos. El gene para esta enzima está disponible de una variedad de fuentes eucarióticas, así como fuentes bacterianas (por ejemplo, Agrobacterium). Glc-1 -P y Glc-6-P son substratos esenciales en una variedad de rutas metabólicas de carbohidratos primarias en todos los sistemas vivos. De manera específica, Glc-1 -P es el substrato primario para la producción de U DP-glucosa, la cual es el principal substrato en la biosíntesis de sacarosa . Por otra parte, Glc-6-P es un material de inicio mayor para una variedad de interconversiones de azúcares, una de las cuales es la síntesis de mío-inositol-1 -P. El último es un substrato mayor y co-factor en la s íntesis de ácido fítico y RFOs respectivamente. El objetivo de este ejemplo es mostrar que al sobre-expresar el gene PGM bacteriano en una planta objetivo, la proporción relativa de Glc-1 -P a Glc-6-P puede manipularse a favor de una u otra de las dos formas fosforiladas de glucosa (dependiente de tejido). Al enfocar correctamente esta actividad, por ejemplo, en semillas en desarrollo (tejidos de vertedero), se esperaría un incremento en el nivel de Glc-1-P, lo cual sería en demanda de la producción de UDP- o ADP-glucosa, y subsecuentemente sacarosa y otras substancias de almacenamiento, tales como, proteínas, lípidos o almidón. Por otra parte, el efecto de disminuir el nivel de Glc-6-P se traduciría en menores niveles de los factores anti-nutricionales antes mencionados. - Ejemplo 21: Producción y regeneración de células de maíz transgénicas. Los cultivos de callos tipo ll se inician a partir de embriones cigóticos inmaduros del genotipo Hi-ll. (Armstrong et al, (1991) Maize Genet. Coop. Newslett., 65: 92-93). Los embriones inmaduros son aislados aproximadamente 14 días después de la polinización de mazorcas que crecieron en invernaderos a partir de cruzas entre padre Hi-ll A y padre Hi-ll B o embriones F2 derivados de auto-polinización o polinización de parentesco de una planta Hi-ll. Los embriones inmaduros (1.5 a 3.5 mm) son cultivados en un medio de iniciación que consiste de sales N6 y vitaminas (Chu et al., (1978) The N6 médium and its application to another culture of cereal crops. (El medio N6 y su aplicación a otro cultivo de cosechas de cereales). Proc. Symp. Plant tissue Culture, Peking Press, 43-56), 1.0 mg/l de 2,4-D, 25mM de L-prolma, 100 mg/l de hidrolizado de caseína, 10 mg/l de AgNO3, 2.5 g/l de GELRITE (Schweizerhall, South Plainfield, NJ) y 20 g/l de sacarosa, con un pH de 5.8. Después de cuatro a seis semanas, el callo es subcultivado en medio de mantenimiento (medio de iniciación en el cual AgNO3 es omitido y la L-prolina se reduce a 6 m M) . La selección de callo tipo I I se hace para ca. 1 2- 16 semanas. Para reventado, o introducción de DNA extraño en las células de la planta (transformación vía bombardeo de micropartículas), se precipitan 140 µg de DNA de plásmido (por ejemplo, un vector conteniendo 35S-PAT/promotor de globulina de maíz/I MT) sobre 60 mg de partículas esféricas de oro, enjuagadas con alcohol (1 .5 - 3.0 µm de diámetro, Aldrich Chemical Co. , I nc. , Milwaukee, Wl) al adicionar 74 µl de CaCI2 2.5M H2O y 30 µl de esperm idina 0. 1 M (base libre) a 300 µl de DNA de plásmido y H2O. La solución es agitada vortiginosamente de manera inmediata y se permite que se asienten las partículas de oro recubiertas con DNA. El sobrenadante claro resultante es removido y las partículas de oro son resuspendidas en 1 mi de etanol absoluto. Esta suspensión es diluida con etanol absoluto para obtener 1 5 mg de oro recubierto con DNA/ml. El DNA de plásmido usado contiene, de preferencia, un marcador seleccionable, tal como , el gene bar o pat, que confiere resistencia a fosfoinotricina o el herbicida glufosinato de amonio y un constructo genético capaz de alterar el metabolismo secundario, tal como, la región de codificación del gene I MT descrita en la figura 24 o la región de codificación del gene ácido ferúlico decarboxilasa descrito en la figura 1 7, bajo el control de un promotor selectivo de sem illa adecuado, tal como, el prom otor de globulina 1 de maíz o el promotor de zeína de maíz. De manera alternativa, puede emplearse un promotor constitutivo, tal como un promotor de ubiquitína de maíz o un promotor de actina de arroz, para expresar la I MT o ácido ferúlico decarboxilasa . Se esparcen aproximadamente 600 mg de tejido de callo embrióníco sobre la superficie del medio de mantenimiento de callo tipo I I que carece de hidrolizado de caseína y L-prolina, pero complementado con sorbitol 0.2 M y manitol 0.2 M como un osmótico. El callo es mantenido durante 4 h como un pre-tratamiento y entonces es transferido a placas de cultivo conteniendo medio de reventado (medio osmótico solidificado con 20 g/l de agar TC (PhyfoTechnology Laboratories, LLC, Shawnee Mission, KS) en lugar de 7 g/l de GELRITE. El gas helio (reventado) es usado para acelerar partículas de oro recubiertas con DNA suspendidas hacia y en los objetivos de tejido preparado. El dispositivo usado es descrito en la patente estadounidense no. 5, 141 , 1 31 , la cual es incorporada en la presente por referencia. Los tejidos son cubiertos con una pantalla de acero i noxidable (aberturas de 104 µm) y son colocados bajo un vacío parcial de 84.65 x 1 03 Pa en la cámara del dispositivo. Las partículas de oro recubiertas con DNA fueron diluidas adicionalmente 1 : 1 con etanol absoluto antes del reventado y se aceleraron a los objetivos de callos cuatro veces usando una presión de helio de 1 05.45 kg/cm2, entregando cada explosión 20 µl de la suspensión de DNA/oro. I nmediatamente después del reventado, el tejido es transferido a medio osmótico durante un periodo de recuperación de 1 6-24 h. Posteriormente, el tejido es dividió en pequeñas piezas y es transferido a medio de selección (medio de mantenimiento que carece de hidrolizado de caseína y L-prolina, pero que contiene 30 mg/l de BASTA® (AgrEvo. Berlín, Alemania). Cada cuatro semanas durante tres meses, las piezas de tejido son transferidas de manera no selectiva a medio de selección fresco. Después de 7 semanas y hasta 22 semanas , los sectores de callos que se encontró que proliferaban contra un soporte de tejido de crecimiento inhibido son removidos y aislados. El tejido resistente a BASTA® resultante es subcultivado bisemanalmente en medio de selección fresco. Siguiendo el análisis apropiado, las l íneas transgénicas positivas son identificadas y transferidas a medio de regeneración. La regeneración es iniciada al transferir tejido de callo a medio de inducción basado en citoquinina, el cual consiste de sales de Murashige y Skoog , de aquí en adelante sales MS y vitaminas (Murashige y Skoog , ( 1 962) Physiol. Plant. 1 5: 473-497) , 30 g/l de sacarosa , 1 00 mg/l de mio-inositol, 30 g/l de manitol, 5 mg/l de 6-bencilaminopurina, de aqu í en adelante BAP, 0.025 mg/l de 2,4-D, 30 mg/l de BASTA®, y 2.5 g/l de GELRITE a pH 5.7. Los cultivos son colocados a luz baja (buj ías de 38. 1 m) durante una semana seguido por una semana de luz alta (buj ías de 99.06 m). Siguiendo un periodo de inducción de dos semanas, el tejido es transferido de manera no selectiva a medio de regeneración libre de hormonas , el cual es idéntico al medio de inducción , excepto q ue carece de 2,4-D y BAP y es mantenido a luz alta. Las plantitas pequeñas ( 1 .5-3 cm) son removidas y colocadas en tubos de cultivo de 1 50x25 mm conteniendo medio SH (sales SH y vitaminas (Schenk y Hildebrandt, ( 1 972) Can . J . bot. 50: 1 99-204) , 1 0 g/l de sacarosa, 1 00 mg/l de mio-inositol , 5 ml/l de FeE DTA y 2.5 g/l de G ELRITE, pH 5.8) .

Las plantitas más grandes son transferidas a macetas de 1 2 cm conteniendo aproximadamente 0.25 kg de M ETRO-MIX 360 (The Scotts Co. Marysville, OH) en el invernadero tan pronto como exhiben crecimiento y desarrollan un sistema de raíces suficiente. Las plantitas se hacen crecer con un fotoperiodo de 16 h, complementado por una combinación de lámparas de haluro de metal y sodio de alta presión, y son regadas según sea necesario con una combinación de tres formulaciones de fertilizantes Peters Excel independientes (Grace-Sierra Horticultural Products Com pany, Milpitas, CA). En la etapa de 6-8 hojas, las plantas son transplantadas a macetas de 1 8.92 litros conteniendo aproximadamente 4 kg de METRO-MIX 360, y se hicieron crecer para madurar maíz transgénico fértil. Las semillas proporcionadas por estas plantas contienen los genes insertados en los embriones inmaduros y cuando se crezcan en plantas expresarán las proteínas codificadas por el DNA insertado.

Ejem plo 22: Producción de transgénicos de arroz. Para la iniciación de callos embriónicos, las semillas maduras de un cultivo de Japónica, Taipei 309 son descascaradas y esterilizadas en su superficie en 70% de etanol durante 2-5 min, seguido por un remojo de 30-45 min en blanqueador comercial al 50% (2.6% de hipoclorito de sodio) con unas cuantas gotas de jabón 'Liquinox'. Las semillas son enjuagadas entonces 3 veces en agua destilada estéril y son colocadas en papel filtro antes de transferir a medio de "inducción de callo" (es decir, NB). El medio de N B consiste de macro elementos N6 (Chu, 1 978, The N6 médium and its application to another culture of cereal crops. Proc. Symp. Plant Tissue Culture, Peking Press, p43-56), micro elementos B5 y vitaminas (Gamborg et al., 1968, Nutrient requirements of suspensión cultures of soybean root cells (Requerimientos de nutrientes de cultivos de suspensión de células de raíz de soya), Exp. Cell Res. 50: 151-158), 300 mg/l de hidrolizado de caseína, 500 mg/l de L-prolina, 500 mg/l de L-glutamina, 30 g/l de sacarosa, 2 mg/l de ácido 2,4-dicloro-fenoxiacético (2,4-D) y 2.5 g/l de gelrite (Schweizerhall, NJ) con el pH ajustado a 5.8. Las semillas maduras cultivadas en el medio de "inducción de callo" son incubadas en la obscuridad a 28°C. Después de 3 semanas de cultivo, el callo primario emergente inducido de la región del órgano escutiforme de un embrión maduro, es transferido a medio NB fresco para mantenimiento adicional. La transformación biolística del tejido de la planta se usa para introducir el DNA extraño. Se precipitan aproximadamente 140 µg de DNA de plásmido sobre 60 mg de partículas de oro de 1.0 miera (Bio-Rad) como se describe en el Ejemplo 21. Se usa el plásmido conteniendo el promotor de ubiquitina de maíz conduciendo la hpt (higromicina fosfotransferasa) y el promotor de ubiquitina 1 de maíz, de globulina 1 de maíz o de zeína conduciendo el gene IMT. Se precipitaron aproximadamente 140 µg de DNA de plásmido sobre 60 mg de partículas de oro de 1.0 miera (Bio-Rad) como se describe en la presente. Para reventado de helio, se sometieron cultivos de callos embriogénicos creciendo activamente, de 2-4 mm de tamaño, a un tratamiento osmótico alto. Este tratamiento incluye colocar el callo en medio NB con manitol 0.2 M y sorbitol 0.2 M (Vain et al . , 1 993, Osmoticum treatment enhances particle bombardment-mediated transient and stable transformation of rice (El tratamiento con osmoticum intensifica la transformación estable y transiente mediada por bombardeo de partículas del arroz), Plant Cell Rep. 1 2: 84-88) durante 4 h antes del reventado con helio. Siguiendo el tratamiento con osmoticum , los cultivos de callos son transferidos a medio de "reventado" (NG+2% agar) y se cubrieron con una pantalla de acero inoxidable (230 mieras). Los cultivos de callos son reventados a presiones de helio de 140.6 kg/cm2 dos veces por objetivo. Después del reventado, el callo es transferido nuevamente al medio con osmoticum alto durante la noche antes de colocarse en medio de selección, el cual consiste de medio NB con 30 mg/l de higromicina. Después de 2 semanas, los cultivos son transferidos a medio de selección fresco con una mayor concentración de agente de selección, es decir, NB + 50mg/l de higromicina (Li et al. , 1 993, An improved rice transformation system using the biolistic method . (Un sistema de transformación de arroz mejorado usando el método biolístico), Plant Cell Rep. 12: 250-255). Los cultivos de callos embriogénicos, blanco amarillentos, compactos, recuperados en NG+50 mg/l de higromicina, son regenerados al transferir a medio de "pre-regeneración" (PR) + 50 mg/l de higromicina. El medio PR consiste de medio NB con 2 mg/l de bencil aminopurina (BAP), 1 mg/l de ácido naftaleno acético (NAA) y 5 mg/l de ácido abscísico (ABA). Después de 2 semanas de cultivo en la obscuridad , el callo es transferido a medio de "regeneración" (RN) . La composición de medio RN es medio NB con 3 mg/l de BAP y 0.5 mg/L de NAA. Los cultivos de callos en medio RN son incubados durante 2 semanas a 28°C bajo luz fluorescente alta (buj ías de 99.06 m). Después de q ue las plantitas comienzan a formarse, las plantitas con un brote de 2 cm son transferidas a cajas magenta conteniendo medio 1 /2 MS (Murashige y Skoog , 1 962, A revised médium for rapid growth and bioassays with tobáceo tissue cultures (Un medio revisado para crecimiento rápido y bioensayos con cultivos de tejido de tabaco. Physiol. Plant. 15:473-497) con Vz vitaminas B5, 10 g/l de sacarosa, 0.05 mg/l de NAA, 50 mg/l de higromicina y 2.5 g/l de gelrite ajustado a pH 5.8. Las plantas grandes de 8-1 5 cm con sistemas de raíces bien desarrollados, son transferidas a tierra (1 METRO-M IX: 1 tierra superior) y se cultivaron en el invernadero (ciclo de d ía/noche de 29/24°C, 50-60% de humedad, fotoperiodo de 12 h). Las plantas de arroz crecieron en una cosecha transgénica de arroz fértil . Las semillas producidas por estas plantas contienen los genes insertados en las células de arroz y cuando se conviertan en plantas expresarán las proteínas codificadas por el DNA i nsertado.

LISTADO DE SECUENCIAS <110> GEORGES, FAWZY DONG, JIN-ZHUO KELLER, WILF HUSSAIN, ATTA A. K. SELVARAJ, GOPALAN DATLA, RAJU <120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA MODULAR METABOLITOS SECUNDARIOS DE PLANTAS <130> pct <140> <141> <150> US 60/072156 <151> 1998-01-22 <150> US 09/012453 <151> 1998-01-23 <160> 7 <170> Patente en liberación versión 2.0 <210> 1 <211> 483 <212> DNA <213> Arthrobacter pascens <400> 1 atggaccaat tcgtgggtct ccacatgatc tacacatacg agaacggttgg gagtacgaa 60 atctacatca agaacgacca cacaatcgac taccgtatcc acagtggtat ggtgggtggt 120 aggtgggtga gggaccaaga ggtgaacatc gtgaagctca caaagggtgt gtacaaggtg 180 agctggacag agccaacagg tacagacgtg agcctcaact tcatgccaga ggagaagagg 240 atgcacggtg tgatcttctt cccaaagtgg gtgcacgaga ggccagacat cacagtgtgc 300 taccaaaacg actacatcga cctcatgaag gagagcaggg agaagtacga gacataccca 360 aagtacgtgg tgccagagtt cgctgacatc acatacatcc accacgctgg agtgaacgac 420 gagacaatca tcgctgaggc tccatacgag ggtatgacag acgagatcag ggctggtagg 480 aag 483 <210> 2 <211> 161 <212> PRT <213> Bacillus pumilus <400> 2 Met Asp Gln Phe Val Gly Leu His Met lie Tyr Thr Tyr Glu Asn Gly 1 5 10 15 Trp Glu Tyr Glu He Tyr He Lys Asn Asp His Thr He Asp Tyr Arg 20 25 30 He His Ser Gly Met Val Gly Gly Arg Trp Val Arg Asp Gln Glu Val 40 45 Asn He Val Lys Leu Thr Lys Gly Val Tyr Lys Val Ser Trp Thr Glu 50 55 60 Pro Thr Gly Thr Asp Val Ser Leu Asn Phe Met Pro Glu Glu Lys Arg 65 70 75 80 Met His Gly Val He Phe Phe Pro Lys Trp Val His Glu Arg Pro Asp 85 90 95 He Thr Val Cys Tyr Gln Asn Asp Tyr He Asp Leu Met Lys Glu Ser 100 105 HO Arg Glu Lys Tyr Glu Thr Tyr Pro Lys Tyr Val Val Pro Glu Phe Ala 115 120 125 Asp He Thr Tyr He His His Ala Gly Val Asn Asp Glu Thr He He 130 135 140 Ala Glu Ala Pro Tyr Glu Gly Met Thr Asp Glu He Arg Ala Gly Arg 145 150 155 160 Lys <210> 3 <211> 546 <212> PRT <213> Arthrobacter pascens <400> 3 Met His He Asp Asn Val Glu Asn Leu Asn Asp Arg Glu Phe Asp Tyr 1 5 10 15 He He He Gly Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Ala Arg Leu 20 25 30 Ser Glu Glu Pro Thr Val Ser Val Ala Leu Val Glu Ala Gly Pro Asp 35 40 45 Asp Arg Gly Val Pro Glu Val Leu Gln Leu Asp Arg Trp Met Glu Leu 50 55 60 Leu Glu Ser Gly Tyr Asp Trp Asp Tyr Pro He Glu Pro Gln Glu Asn 65 70 75 80 Gly Asn Ser Phe Met Arg His Ala Arg Ala Lys He Met Gly Gly Cys 85 90 95 Ser Ser His Asn Ser Cys He Ala Phe Trp Ala Pro Arg Glu Asp Leu 100 105 110 Asp Glu Trp Glu Ser Lys Tyr Gly Ala Thr Gly Trp Asn Ala Glu Ser 115 120 125 Ala Trp Pro Leu Tyr Gln Arg Leu Glu Thr Asn Glu Asp Ala Gly Pro 130 135 140 sp Ala Pro His His Gly Asp Ser Gly Pro Val His Leu Met Asn Val 145 150 155 160 Pro Pro Ala Asp Pro Ala Gly Val Ala Leu Leu Asp Ala Cys Glu Gln 165 170 175 Ala Gly He Pro Ar Ala Lys Phe Asn Thr Gly Thr Thr Val He Asn 180 185 190 Gly Ala Asn Phe Phe Gln He Thr Arg Arg Ala Asp Gly Thr Arg Ser 195 200 205 Ser Ser Ser Val Ser Tyr He His Pro He He Glu Arg Gly Asn Phe 210 215 220 Thr Leu Leu Thr Gly Leu Arg Ala Arg Gln Leu Val Phe Asp Ala Asp 225 230 235 240 Lys Arg Cys Thr Gly Val Asp Val Val Asp Ser Ala Phe Gly Arg Thr 245 250 255 His Arg Leu Ser Ala Arg Cys Glu Val He Leu Ser Thr Gly Ala He 260 265 270 Asp Ser Pro Lys Leu Leu Met Leu Ser Gly He Gly Pro Ala Ala His 275 280 285 Leu Ala Glu His Gly Val Glu Val Leu Val Asp Ser Pro Gly Val Gly 290 295 300 Glu His Leu Gln Asp His Pro Glu Gly Val Val Gln Phe Glu Ala Lys 305 310 315 320 Gln Gln Met Val Gln Thr Ser Thr Gln Trp Trp Glu He Gly He Phe 325 330 335 Thr Pro Thr Glu Asn Gly Leu Asp Arg Pro Asp Leu Met Met His Tyr 340 345 350 Gly Ser Val Pro Phe Asp Met Asn Thr Leu Arg Tyr Gly Tyr Pro Thr 355 360 365 Thr Glu Asn Gly Phe Ser Leu Thr Pro Asn Val Thr His Ala Arg Ser 370 375 380 Arg Gly Thr Val Arg Leu Arg Ser Arg Asp Phe Arg Asp Lys Pro Ala 385 390 395 400 Val Asp Pro Arg Tyr Phe Thr Asp Pro Glu Gly His Asp Met Arg Val 405 410 415 Met Val Ala Gly He Arg Lys Ala Arg Glu He Ala Ala Gln Pro Ala 420 425 430 Met Ala Glu Trp Thr Gly Arg Glu Leu Ser Pro Gly Thr Glu Ala Gln 435 440 445 Thr Asp Glu Glu Leu Gln Asp Tyr He Arg Lys Thr His Asn Thr Val 450 455 460 Tyr His Pro Val Gly Thr Val Arg Met Gly Pro Ala Asp Asp Asp Met 465 470 475 480 Ser Pro Leu Asp Pro Glu Leu Arg Val Lys Gly Val Thr Gly Leu Arg 485 490 495 Val Ala Asp Ala Ser Val Met Pro Glu His Val Thr Val Asn Pro Asn 500 505 510 He Thr Val Met Met He Gly Glu Arg cys Ala Asp Leu He Arg Ala 515 520 525 Ser Arg Thr Gly Glu Thr Thr Thr Ala Glu Ala Glu Leu Ser Ala Ser 530 535 540 Leu Ala 545 <210> 4 <211> 1641 <212> DNA <213> Arthrobacter pascens <400> 4 atgcacatcg acaacgtcga aaacctcaac gaccgcgagt tcgactacat catcatcggc 60 ggcggttccg ccggagcggc agtcgccgcc cgcctgagcg aggagcccac cgtgtccgtg 120 gcgctggtgg aggccggccc ggacgaccgc ggcgttcccg aggtactgca gctcgaccgc 180 tggatggagc tgctggaatc cggctacgac tgggactacc cgatcgaacc gcaggagaac 240 ggcaactcct tcatgcgcca cgcccgcgcg aagatcatgg gtggctgctc cagccacaac 300 tcctgcatcg ccttctgggc cccgcgcgaa gacctggacg agtgggagtc caagtacggc 360 gccaccggct ggaacgctga gtccgcctgg ccgctgtacc agcggctgga gaccaacgag 420 gacgccggcc cggacgcgcc gcaccacggc gactcaggcc cggtgcacct gatgaacgtg 480 cccccggcgg accccgccgg cgtcgcactc ctggacgcct gcgaacaggc aggcattccg 540 cgcgcgaagt tcaacaccgg caccaccgtg atcaatggcg ccaacttttt ccagatcaca 600 cgccgcgcgg acggcacccg ttcctccagc tcggtctcct acatccaccc gatcatcgag 660 cgcgggaact tcaccctgct gaccgggttg cgcgcccggc aactggtgtt cgacgcggac 720 aagcgctgca ccggcgtcga cgttgtggac tcggcgttcg gccggactca ccggctctcc 780 gcgcgttgcg aggtcatcct gtccaccggc gccattgact cgcctaagct gctcatgctc 840 tccggcatcg gccccgccgc gcacctcgcc gagcacggcg tcgaggtcct ggtcgactcc 900 cccggtgtcg gcgagcacct gcaggaccac cccgaaggcg tcgtccagtt cgaggccaag 960 cagcagatgg tgcagacttc gacgcagtgg tgggagatcg gcatcttcac ccccaccgag 1020 aacggcctgg accgcccgga cctgatgatg cactacggct ccgtcccgtt cgacatgaac 1080 accctgcggt acggctaccc caccacggag aacggcttca gcctcacgcc gaacgtcacg 1140 cacgcccgct cccgcggcac cgtccggctg cgcagccgcg acttccgcga caagcccgcc 1200 gtcgacccgc ggtacttcac tgatccggag ggccacgaca tgcgcgtcat ggtggccggc 1260 atccgcaagg cccgtgaaat cgccgcccag cctgccatgg ccgaatggac cggccgcgag 1320 ctctcgcccg gcaccgaggc gcagaccgac gaggaactgc aggactacat ccgcaagacg 1380 cacaacaccg tttaccaccc cgtcggcacc gtccgcatgg gaccagccga cgacgacatg 1440 tcgccgctcg accccgagct gcgggtgaag ggcgtgaccg gcctgcgcgt cgccgatgcc 1500 tctgtcatgc ctgaacacgt cacggtcaat cccaacatca ccgtcatgat gatcggcgaa 1560 cgctgcgccg acctcatccg cgccagccgg accggcgaaa caacgacggc ggaggcggag 1620 ctcagcgcgt ccctcgcctg a 1641 <210> 5 <21 1 > 1494 <21 2> DNA <21 3> Mesembryanthemum crystallinum <400> 5 aaaaaaaaaa ttttacttct ctgttttacc aaaaagagaa aaaaaaatga ctacttacac 60 caatggcaac tacacacaac caaaaaccct agacaaagat gaacaattag ctggtttggc 120 agtgacatta gcaaatgcag ctgcttttcc aatgatcctg aaatcagcct ttgagctaaa 180 aatccttgac atattctcaa aagcagggga aggcgtgttt gtatcgactt ctgagatcgc 240 tagccaaatc ggggcaaaga accctaatgc cccggtgttg ttggaccgga tgctccggct 300 cctggctagc cactctgtgt taacatgcaa gctccaaaag ggtgagggtg gttctcaaag 360 ggtgtatggt ccagctcccc tttgcaacta tcttgctagt aatgatggtc aaggctctct 420 tggccctttg cttgttttgc atcatgacaa ggtcatgatg gagagttggt ttcacttgaa 480 tgattacata ctagaaggag gtgttccatt caagcgcgct 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Claims (32)

1. REIVI NDICACIONES 1 . Un método para hacer una planta genéticamente transformada comprendiendo: A) introducir en una célula de planta capaz de ser transformada y regenerada a una planta completa, un cartucho de expresión de DNA comprendiendo, además de secuencias de DNA requeridas para la transformación y selección en células de planta, una secuencia de DNA que, bajo el control de un promotor activo en células de planta, codifica una proteína capaz de modificar la utilización de un substrato en una ruta metabólica secundaria, con la condición de que el substrato no sea un metabolito primario del grup seleccionado de glucosa, aminoácidos, nucleótidos y ácidos grasos com unes, y B) recuperar una planta, la cual tiene un contenido alterado de al menos un producto de la ruta metabólica secundaria.
2. 2. Un método para hacer una semilla genéticamente transformada comprendiendo hacer crecer la planta obtenida de acuerdo con los pasos A y B del método de acuerdo con la reivindicación 1 , bajo condiciones que permitan la formación de la semilla.
3. 3. El método de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el promotor es selectivo de tejido.
4. 4. El método de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde el promotor es selectivo de semilla .
5. 5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde dicho promotor selectivo de semilla es seleccionado del promotor de faseolin y el promotor de napin.
6. 6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el producto de la ruta metabólica secundaria es un anti-nutricional.
7. 7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína es una enzima heteróloga.
8. 8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde la proteína codificada es una enzima capaz de alterar un substrato en la ruta de fenilpropanoide , por lo cual se altera al menos un producto de la ruta de fenilpropanoide.
9. 9. El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la proteína codificada es una enzima que metaboliza colina, capaz de actuar sobre colina para modificar el uso de colina por otras enzimas en la ruta de fenilpropanoide.
10. 1 0. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, en donde la enzima que metaboliza colina es colina oxidasa, y en donde la secuencia de DNA que codifica colina oxidasa e.stá bajo el control de un protomor selectivo de semilla activo en células de planta.
11. 1 1 . El método de acuerdo con la reivindicación 8, en donde la proteína codificada es betaína aldeh ido deshidrogenasa, capaz de actuar sobre betaína aldehido convirtiéndolo a beta ína, estando dicha secuencia de DNA que codifica betaína aldehido deshidrogenasa bajo el control de un promotor selectivo de semilla activo en células de planta.
12. 1 2. El método de acuerdo con la reivindicación 7 , en donde la proteína codificada es ácido ferúlico decarboxilasa.
13. 1 3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde la proteína codificada es una enzima capaz de actuar sobre un alcohol de azúcar.
14. 14. El método de acuerdo con la reivindicación 1 3, en donde la proteína codificada es una enzima capaz de actuar sobre mio-inositol.
15. 1 5. Una semilla de planta modificada genéticamente con contenido de sinapina reducido, preparada de acuerdo con el método reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
16. 16. Una semilla de planta modificada genéticamente con contenido fenólico alterado, preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 3.
17. 1 7. Una planta modificada genéticamente con contenido de lignina alterado, preparada de acuerdo con el método reclamado en cualquiera de as reivindicaciones 1 a 8.
18. 1 8. Una semilla de planta modificada genéticamente con contenido de alcohol de azúcar alterado, preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 3.
19. 1 9. Una semilla de planta modificada genéticamente con contenido de fitato reducido, preparada de acuerdo con el método de la reivindicación 1 3.
20. 20. El vector de DNA pHS 731 .
21. 21 . El vector de DNA pHS 981 .
22. 22. El vector de DNA pGS97b 1 .
23. 23. El vector de DNA pS I MT.
24. 24. El vector de DNA pN l MT.
25. 25. Un vector de DNA conteniendo u n gene seleccionado del gene COX, el gene BADH , el gene I MT y el gene de ácido ferúlico decarboxilasa, bajo el control del promotor de faseolin.
26. 26. Una planta preparada mediante el método reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde la planta es seleccionada de Dicotyledoneae y Monocotyledoneae.
27. 27. Una planta preparada mediante el método reclamado en cualquiera de las reivind icaciones 1 a 14, en donde dicha planta es seleccionada de miembros de las familias Malvaceae, Linaceae, Compositae, Fabaceae, Euphorbiaceae, Gramineae y Oleaceae.
28. 28. Una planta preparada mediante el método reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en donde dicha planta es un miembro de la familia Brassucaceae (= Cruciferae) .
29. 29. Una planta preparada mediante el método reclamado en cualquiera de las reivind icaciones 1 a 1 4, en donde dicha planta es seleccionada de miem bros del género Linum, Gossypium, Glycine, Arachis, Carthamus, Helianthus, Medicago, Sinapis, Raphanus, Ricinus, Olea, Zea, Hordium, Triticale y Oryza.
30. 30. Una planta preparada medi ante el método reclamado en cualquiera de las reivind icaciones 1 a 1 4, en donde dicha planta es un miembro del género Brassica.
31. 31 . U na planta preparada mediante el método reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 4, en donde dicha planta es Brassica napus o Brassica rapa.
32. 32. Un producto alimenticio comprendiendo semilla o harina derivada de la m isma, en donde la semilla es preparada de acuerdo con el método reclamado en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14. RES U MEN La presente invención proporciona un método para hacer una planta genéticamente transformada, la cual tiene un contenido alterado de al menos un producto de una ruta metabólica secundaria. El método consiste en introducir un cartucho de expresión de DNA en una célula de planta capaz de ser transformada y regenerada a una planta completa. El cartucho de expresión incluye secuencias de DNA requeridas para la transformación y selección en células de plantas. También incluye una secuencia de DNA que, bajo el control de un promotor activo en células de planta, codifica una proteína capaz de modificar la utilización de un substrato en la ruta metabólica secundaria. El substrato no es un metabolito primario del grupo seleccionado de glucosa, aminoácidos, nucleótidos y ácidos grasos comunes. Una planta o tejidos de planta incluyendo semillas , pueden ser recuperados entonces teniendo un contenido alterado de al menos un producto de la ruta metabólica secundaria. La invención también proporciona productos alimenticios derivados de las plantas y semillas obtenidas de acuerdo con el método.