MXPA00006678A - Vacuna, basada en lipooligosacaridos, para la prevencion de infecciones de l,a moraxella (branhamella) catarrhalis en mamiferos - Google Patents
Vacuna, basada en lipooligosacaridos, para la prevencion de infecciones de l,a moraxella (branhamella) catarrhalis en mamiferosInfo
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Abstract
Una vacuna conjugada para la Moraxella (Branhamella) catarrhalis, que comprende un lipooligosacárido aislado, desde el cual se han removido losácidos grasos esterificados, para producir un lipooligosacárido destoxificado (dLOS) o del cual se ha removido el lípido A, para producir un oligosacárido (OS)destoxificado, el cual se enlaza a un portador inmunogénico. Esta vacuna esúitl para prevenir la otitis media y las infecciones respiratorias, causadas por al Moraxella catarrhalis en mamíferos, incluyendo los seres humanos.
Description
VACUNA, BASADA EN LiPOOLIGOSACÁRIDOS, PARA LA PREVENCIÓN DE INFECCIONES DE LA MORAXELLA (BRANHAMELLA) CATARRHALIS EN MAMÍFEROS
Campo de la Invención La presente invención se refiere a vacunas conjugadas para la prevención de infecciones bacterianas. Mas específicamente, la invención se refiere a una vacuna conjugada para infecciones causadas por la bacteria Moraxella (Branhamella) catarrhalis en humanos, que comprende lipooligosacáridos derivados de bacterias, desde los cuales se han removido ácidos grasos esterificados o el lípido A, y que se enlazan a ur portador inmunogénico.
Antecedentes de la Invención La Moraxella (Branhamella) catarrhalis es una bacteria patógena, reconocida como el tercer agente más común, que causa la otitis media y la sinusitis en niños, después de la Streptococcus pneumoniae y Haemophilu influenzae (Bluestone, C.D., 1986, Drugs 31 (Suppl 3): 132-41; Catlin, B.W., 1990, Clin. Microbiol. Rev. 3:293-320; Doren, G.V., 1986, Diagn. Microbiol. Infect . Dis, 4: 191-201; Enright, M.C. & H. McKenzie, 1997, J. Med. Microbiol, 46: 360-71; Faden, H. et al., 1994, J. Infect . Dis. 169: 1312-1317). Este diplococo Gram-negativo también causa infecciones del tracto respiratorio en adultos (Boyle, F.M., et al., 1991, Med. J. Aust. 154: 592-596; Sarubbi, F.A., et al., 1990, Am. J. Med. 88: 9S-14S) , especialmente aquéllas que están inmuno-comprometidas o tienen enfermedades pulmonares obstructivas crónicas (Enright, M.C., & H. McKenzie, 1997, J. Med. Microbiol. 46 360-371) . La incidencia de la enfermedad causada por M catarrhalis parece estar aumentando (McLeod, D.T. et al., 1986, Br. Med. J. 292: 1103-1105; Fung, C.P. et al., 1992, J . Antimicrob, Chemother. 30:47-55) . Actualmente no existe una vacuna para las enfermedades mediadas por la M. catarrhalis . Aunque los antígenos protectores de la M. catarrhalis no se han definido claramente, el desarrollo de anticuerpos del suero contra la M. catarrhalis parece ser importante en la inmunidad contra la M. catarrhalis . Por ejemplo, los adultos normales con inmunidad, que resulta de la colonización o infección natural, tienen un régimen portador menor (1 al 6%) que los niños (50 al 78%) y las personas de edad avanzada (>26%) y sufren menores infecciones (Ejlertsen T. et al., 1994, J. Infect . 29:23-31; Faden H. et al., 1994, J. Infect . Dis. 169:1312-1317; Eliasson, I., 1986, Drugs 31 (Suppl 3) : 7.10; Vaneechoutte, M. et al., 1990., J. Clin. Microbiol. 28: 2674-2680). Los niños desarrollan anticuerpos del suero a la M. catarrhalis gradualmente durante los primeros cuatro años de vida, lo cual parece se correlaciona con una disminución en la incidencia de la bacteremia y la otitis media, causada por la M. catarrhalis (CDR Weekly Reports, 1992-1995, Communicable Disease Surveillance Centre, Londres; Goldblatt D., et al.,. 1990, J. Infect . Dis. 162:1128-1135; Vaneechoutte, M. , et al., 1990., J. Clin Microbiol 28:2674-2589; Bluestone, C.D., 1986, Drugs 31 (Suppl 3): 132-141). Los anticuerpos a la M. catarrhalis también se han detectado en enfermedades agudas y en sueros de convalecientes de pacientes adultos (Christensen, J.J., et al., 1990., Clin.
Diagn. Lab. Immunol . 3:717-721; Arman, M., et al., 1997, APMIS 105 213-220) . La mayoría de sueros de convalecientes demostró una actividad bactericida contra el aislado correspondiente de la M. catarrhalis (Chapman, A. J. Jr. , et al., 1985, J. Infect. Dis. 151:878-882). Estos resultados indican que los anticuerpos del suero están probablemente involucrados en la protección contra infecciones con la M. catarrhalis . Los esfuerzos hasta ahora para estudiar la M. catarrhalis como un patógeno importante, generalmente se han enfocado en describir antígenos superficiales, tal como las proteínas de la membrana externa (OMP) (Bhushan, R. , et al . , 1994, J. Bacteriol-. 176: 6636-6643; Campagnari , A.A. , et al., 1994, Infect. Immun. 62:4909-4914; Helminen, M. E., et al., 1993, Infect. Immun. 61:2003-2010; Helminen, M.E., et al., 1994, J. Infect . Dis. 170:867-872; Murphy, T.F. et al., 1993, Mol. Microbiol. 10:87-97). Dos proteínas de membrana externa que se han estudiado extensamente son la protelna de alto peso molecular (UspA) y una proteína de membrana externa principal (CD) . Ambas de estas proteínas son conservadas relativamente entre diferentes cepas de la M. catarrhalis y son capaces de generar anticuerpos bactericidas (Helminen, M.E. et al., 1994, J. Infect . Dis. 170:867-872); Murphy, T.F. et al., 1993, Mol. Microbiol. 10:87-97; Yang, Y.P. et al., 1997, FEMS Immunol . Med. Microbiol. 17:187-199). Además, la inmunización pasiva con anticuerpos monoclonales a la UspA, o la inmunización con esta UspA, ha resultado en la evacuación pulmonar aumentada de las cepas de la M. catarrhalis en un modelo del murino (Helminen, M.E., et al., 1994, J. Infect . Dis. 170:867-872; Chen. D., et al., 1996, Infect. Immun. 64:1900-1905). Los genes que codifican la proteína CD se han clonado y puesto en secuencia (Murphy et al., 1993,-Molec. Microbiol.
(1) :87) Otras proteínas de membrana externa que se han purificado y caracterizado incluyen la proteína E (OMP E) (Bhushan et al., 1994, J. Bacteriol., 176 (21) : 6636) , proteína Bl (Ducey et al., 1996, Abstracts. Gen. Mtg. Am. Soc. Microbiol., 96(0) :186), y la proteína COPB (Aebi, et al., 1996, Abstracts, Intersci . Conf. Antimicrobial Agents & Chemotherapy 35:158). Otros antígenos superficiales incluyen los fimbriados, que no se han encontrado en todos los aislados (Marrs, C.F. & S. eir, 1990, Am. J. Med. 88 (suppl 5A) : 36S-40S) , y un polisacárido capsular, cuya existencia es controversial (Ahmed, K. et al., 1991, Microbiol. Immunol . 35:361-36), La proteína de membrana externa, de alto peso molecular, asociada con los lipooligosacáridos, también se ha identificado (Klingman & Murphy, 1992, Abstr. Gen Mtg. Am. Soc. Microbio.) .
El componente superficial principal de los lipooligosacáridos (LOS) de la M. catarrhalis, es un factor de virulencia para la patogénesis de las infecciones bacteriales (Doyle, . J. , 1989, Pediatr. Infect . Dis. J. 81 (Suppl): S45-S47; Formsgaard, J.S. et al., 1991, Infect . Ithmun, 59:3346-3349) . El LOS puede ser importante para el desarrollo de la inmuno-protección, debido a que (1) los anticuerpos del suero al LOS se han detectado en pacientes con infecciones de la M. catarrhalis, (2 ) La IgG de la fase de convalecencia anti-LOS de los pacientes ha demostrado actividad bactericida contra las cepas de la M. catarrhalis y (3 ) Estos LOS parecen tener una estructura conservada basada en sus propiedades serológicas en humanos (Arman, M. , et al., 1995, Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14: 297-304; Tanaka, H., et al . , 1992, J. Jpn. SAC. Infect . Dis. 55:
709.715). Similarmente, los anticuerpos LPS PS bactericidas del suero, específicos a otros microorganismos (por ejemplo, tipo b de H. influenzae, Neisseria meningi tidis , Vibrio Cholerae, Shigella sonnei) , confieren inmunidad a esos patógenos en humanos (Robbins, J.B. et al., 1995, J. Infect. Dis. 171:1387-1398; Cohén D., et al., 1997, Lancet 349: 155-159).
Tres tipos de antígenos principales (A, B y C) de LOS suman aproximadamente el 95% de las cepas de M. catarrhalis (es decir, 61% de A, 29% de B y 5% de C, en un estudio) (Vaneechoutte, M. , et al., 1990, Clin. Microbiol, 28 182.187). Los estudios han mostrado que esos
LOS contienen un oligosacárido enlazado al lípido A, sin un polisacárido O específico, y los oligosacáridos de los tres serotipos se ramifican con un núcleo interno común
(Edebrink, P.,. et al., 1994, Carbohydr. Res. 257 269-284; Edebrink, P., et al., 1995, Carbohydr. Res. 266: 237-261; Edebrink. P., et al., 1996, Carbohydr. Res. 295:127-146). Los lipopolisacáridos (LPS) y LOS, de una variedad de microorganismos, son generalmente tóxicos in vivo, en mamíferos. Muchos acercamientos se han usado para destoxificar los LPS o LOS, o para obtener polisacáridos no tóxicos del LPS o los oligosacáridos del LOS. Por ejemplo, el tratamiento con un ácido débil de los LPS o LOS se ha usado para desdoblar la porción del lípido A de la molécula del LOS en el enlace Kdo-glucosamina (Gu, X.X & C.M. Tsai, 1993, Infect. Immun, 61:1873-1880). Otro método es el tratamiento alcalino débil del LOS, que remueve los ácidos grasos enlazados al éster, mientras preservan los ácidos grasos enlazados a la amida del lípido A (Gupta, R.K. et al., 1992, Infect. Immun. ,60:3201-3208; Gu et al., 1996, Infect & Imm. 64 (10) :4047) . El desarrollo de vacunas contra la M. catarrhalis y otros microorganismos se ha intentado usando una variedad de acercamientos (Karma et al., 1995, Int ' 1. J. Ped. Otorhinolaryngol . 32 (SUPPL.): S127-S134) . Vacunas contra M. catarrhalis basadas en proteínas de membrana externa E y CD, derivadas de péptidos y oligopéptidos, o nucleótidos que codifican estas proteínas, se han descrito en las patentes de E.U.A., Nos. 5,607,846 y 5,556,755. Las vacunas conjugadas obtenidas de un antígeno que contiene carbohidrato unido a una citosina inmuno-moduladora, linfocina, hormona o factor de crecimiento, se han revelado en la patente de E.U.A., No. 5,334,379. La patente Canadiense No. 2,162,193 revela que la proteína receptora de la lactoferrina puede ser usada como una vacuna contra patógenos que producen una proteína receptora de la lactoferrina, que incluyen la M. catarrhalis . La Solicitud del PCT, WO 90/11777 revela un método para obtener subunidades del pilo bacterial sin ensamblar, para su uso en una vacuna contra la M. catarrhalis y otras bacterias, Una vacuna contra la M. catarrhalis que sea tanto no tóxica como inmunogénica es necesaria para impedir la otitis media, sinusitis e infecciones similares del tracto respiratorio en mamíferos, particularmente en niños y adultos humanos . Aunque los métodos de destoxificación del LOS desde otros microorganismos son conocidos, los productos destoxificados (es decir, hapten) son, en general, inmunogénicos pobremente in vivo . Por lo tanto, existe la necesidad de una forma de LOS de M. catarrhalis que sea destoxificada, pero suficientemente inmunogénica para provocar una respuesta inmune con producción de anticuerpos anti-LOS, preferiblemente la IgG, in vivo en mamíferos.
Compendio de la Invención De acuerdo con un aspecto de la invención, se revela una vacuna conjugada para la Moraxella catarrhalis , , que incluye un lipooligosacárido (LOS) aislado de la M. catarrhalis y destoxificada por un tratamiento para remover los ácidos grasos esterificados, con el fin de producir un LOS destoxificado (dLOS) o por tratar para remover el lípido A y producir un oligosacárido (OS) y un portador inmunogénico enlazado ahí covalentemente. En una modalidad, el portador inmunogénico es una proteína. En otra modalidad, la proteína del portador inmunogénico se selecciona del grupo que consta del UspA aislado de la M. catarrhalis , el CD aislado de la M. catarrhalis, la toxina/ toxoide del tétano, una proteína de al to peso molecular (HMP) aislada de la Haemophilus influenzae sin tipo, la toxina/ toxoide de la difteria, la toxina A de P. aeruginosa destoxificada, la toxina/toxoide del cólera, la toxina/toxoide de pertussís, las exotoxinas/toxoides de Clostridium perfringens, el antígeno superficial de la hepatitis B, el antígeno del núcleo de la hepatitis B, la proteína del retrovirus VP 7; Los materiales de reacción cruzados ("CRM"), que incluyen los CRM197 (Pappenheimer et al., Immunochem, 9 : 891 -905, 1972 ) y CRM32901 (Black et al., Science 240:656-659, 1988); y la proteína F y G del el virus sincitial respiratorio. En un aspecto de la vacuna, la proteína del portador inmunogénico es el toxoide del tétano o HMP. Otra modalidad es una composición farmacéutica que incluye tal conjugado de vacuna en un portador aceptable farmacéuticamente, el cual puede incluir un auxiliar. Preferiblemente, el auxiliar es una mezcla del lípido A de monofosforilo y el dimicolato de trehalosa o alumbre. En una modalidad, el portador inmunogénico está enlazado covalentemente al LOS desesterificado por medio de un compuesto enlazador. Preferiblemente, este compuesto enlazador se selecciona del grupo que consta de la dihidrazida del ácido adípico, el ácido e-aminohexanóico, el clorohexanol-dimetil-acetal, la D-glucuronolactona y la amina de p-nitrofeniletilo, y, más preferiblemente, el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico. En una modalidad, la vacuna además incluye un oligosacárido (OS) aislado de la M. catarrhalis, por la remoción del lípido A de LOS, que se enlaza covalentemente a un portador inmunogénico. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se revela un lipooligosacárido aislado de la Moraxella catarrhalis y destoxificado, por la remoción de los ácidos grasos enlazados al éster del mismo (dLOS) o un olígosacárido obtenido de la remoción del lípido A del LOS. E? una modalidad, la Moraxella catarrhalis de la cual se aisla el lipooligosacárido, es una cepa purificada de esta Moraxella catarrhalis . De acuerdo con otro aspecto de la invención, se describe un método para prevenir la otitis media causada por la infección con la Moraxella catarrhalis en un mamífero, que incluye la administración al mamífero de una cantidad inmuno-protectora efectiva de la vacuna conjugada que incluye un lipooligosacárido destoxificado (dLOS) , producido por la desesterificación del LOS, derivados de la Moraxella catarrhalis, o un oligosacárido (OS) , producido por la remoción del lípido A del LOS, y un portador inmunogénico enlazado covalentemente a los dLOS o a los OS. En una modalidad preferida, el mamífero es un humano. En otra modalidad, la vacuna ' conjugada se administra parenteralmente. En una modalidad, la vacuna conjugada se administra por una inyección intramuscular, inyección subcutánea, o por el depósito en la membrana mucosal intranasal o una combinación de las mismas. En otra modalidad, la cantidad inmuno-protectora efectiva está entre aproximadamente 10 y 50 µg por dosis. El método puede también incluir inyecciones entre aproximadamente 10 y 25 µg de la vacuna conjugada en aproximadamente dos meses y de nuevo en aproximadamente trece meses después de la etapa de administración. En una modalidad, la etapa de administración incluye administrar una primera dosis, y luego administrar una segunda dosis de aproximadamente 10 a 25 µg de la vacuna conjugada en aproximadamente dos meses, después de la primera dosis, administrar una tercera dosis de aproximadamente 10 a 25 µg de la vacuna conjugada en aproximadamente 2 meses después de la segunda dosis y administrar una cuarta dosis de aproximadamente 10 a 25 µg de la vacuna conjugada en aproximadamente 12 meses después de la tercera dosis. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se describe un método para destoxificar el lipooligosacárido
(LOS) aislado de la Moraxella catarrhalis, que incluye remover los ácidos grasos enlazados al éster del LOS. En una modalidad, se remueven los ácidos grasos enlazados al éster con la ídracina o un reactivo alcalino débil. La invención también incluye un método para destoxificar el LOS de la Moraxella catarrhalis, que incluye la remoción del lípido A del LOS para producir el OS. En una modalidad, el lípido A se remueve por tratamiento de ácido. De acuerdo con otro aspecto de la invención, se describe un método para obtener una vacuna conjugada contra la Moraxella catarrhalis, que incluye remover los ácidos grasos enlazados con éster del lipooligosacárido (LOS) aislado de M. catarrhalis, para producir el LOS desesterificado (dLOS) ; y enlazar covalentemente el dLOS al portador inmunogénico. En una modalidad, la etapa de remoción comprende tratar el LOS con la hidracina o un reactivo alcalino débil. En otra modalidad, la etapa de enlazamiento incluye unir el dLOS a un compuesto enlazador y unir este compuesto enlazador al portador inmunogénico . Preferiblemente, el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico, el ácido e-aminohexanóico, el clorohexanol -dimetil-acetal, D-glucuronolactona o p-nitrofeniletil -amina, y más preferiblemente, el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico. En otra modalidad, la composición de vacuna puede incluir un asistente . La presente invención también suministra una vacuna conjugada que comprende un lipooligosacárido (LOS) aislado de la M. catarrhalis, y destoxificado por el tratamiento para remover los ácidos grasos esterificados y producir el LOS destoxificado (dLOS) , o removiendo el lípido A para producir un oligosacárido (OS) , y un portador inmunogénico enlazado ahí covalentemente, para su uso en prevenir la otitis media causada por la infección con la Moraxella catarrhalis, en un mamífero. Preferiblemente, el portador inmunógeno es una proteína. En un aspecto de esta modalidad preferida, la proteína del portador inmunogénico es la UspA, aislada de la M. catarrhalis, la CD aislada de la M. catarrhalis, , toxina/toxoide del tétano, una proteína de alto peso molecular (HMP) aislada de la Haemophilus i?fluenzae, sin tipo, la toxina/toxoide de la difteria, la toxina A de P. aeruginosa detoxificada, la toxina/toxoide del cólera, la toxina/toxoide de pertussis, , la exotoxinas/toxoides de Clostridum perf ring n , el antígeno superficial de la hepatitis B, el antígeno del núcleo de la hepatitis B, la proteína del rotavirus VP7; los CRM, que incluyen el CRM197 (Pappenheimer et al., supra) y el CRM3201 (Black et al., supra) ; o la proteína F y G del virus sincitial respiratorio. Preferiblemente, la proteína portadora inmunogénica es el toxoide del tétano o la HMP.
Breve Descripción de los Dibujos La Figura 1 muestra gráficamente los títulos bactericidas contra la cepa 25238 de M. catarrhalis del antisuero del conejo, obtenido de grupos de dos a tres conejos, en los cuales cada miembro del grupo se vacunó individualmente dos veces' con: conjugados LOS ("LOS"),
("dLOS-TT" y "dLOS-HMP"), o conjugados con un auxiliar ("dLOS-TT + Ribi" y "dLOS-HMP + Ribi") . Los títulos bactericidas se muestran como las veces de aumento arriba del valor para los sueros pre-inmunológicos en la dilución del suero, que causa más del 50% de muerte de las bacterias y expresado como el medio geométrico (la barra) y la desviación estándar (la línea arriba de la barra) para cada grupo. El título bactericida de los sueros hiper-inmunológicos producidos por células enteras de M. catarrhalis fue de 1:1,600. La Figura 2 es un diagrama esquemático de un estudio de protección pasiva en un modelo de evacuación pulmonar del ratón, que usa un estímulo de aerosol de la cepa 25238 de M. catarrhalis . Cuarenta ratones se inmunizaron con cualquiera de los antisueros del conejo contra dLOS-TT, o con los sueros pre-inmunológicos, luego se estimularon con la M. catarrhalis por la cámara de aerosol, 18 horas después de la inmunización. Los ratones se sacrificaron 3 y 6 horas después del estímulo. La Figura 3 es una gráfica que muestra los resultados del estudio de protección pasiva, descrito en la leyenda de la Figura 2. Se recogieron muestras de pulmones y sangre para el análisis. El e e "y" muestra las unidades que forman colonias bacteriales • (CFU) para el pulmón. La primera barra muestra el grupo de control, y el segundo grupo muestra el grupo de vacuna. En tres horas después del estímulo, la cantidad de bacterias en el grupo de la vacuna se redujo por el 50%, comparado al control. A las 6 horas después del estímulo, hubo una reducción del 61% en el grupo de vacuna comparado con el grupo de control .
Descripción Detallada de la Invención Los lipooligosacáridos (LOS) de la bacteria
Moraxella (Branhamella) catarrhalis es un antígeno superficial principal que produce anticuerpos bactericidas contra las bacterias que causan la otitis media y la sinusitis en niños y las infecciones del tracto respiratorio en adultos. Para simplicidad, las bacterias se refieren en seguida como Moraxella catarrhalis o M. catarrhalis . Estos LOS de la M. catarrhalis se aislaron y trataron para reducir su toxicidad por alrededor de 20,000 veces, según se ensayó usando una prueba del lisado de amebocito de Limbus (LAL) . El LOS destoxificado (dLOS) se acopló a un portador (por ejemplo, el toxoide del tétano o proteínas de alto peso molecular purificadas de la Haemophilus influenzae sin tipo) , a través de un compuesto enlazador, Para formar los dLOS-TT o dLOS-HMP. Las relaciones molares de los dLOS a TT y HMP en los conjugados resultantes fueron de aproximadamente 19:1 y 3:1, respectivamente. La antigenicidad de los dos conjugados fue similar a aquélla de estos LOS aislados, según se determinó por un ensayo de inmuno-difusion doble. Para ambos conjugados de dLOS-portador, la inyección subcutánea (s.c.) o intramuscular
(i.m.) en los animales produjo niveles medios aumentados de la inmunoglobulina G (IgG) al LOS. En ratones, una elevación de 50 a 100 veces en los niveles medios de la IgG se detectó después de tres inyecciones de los conjugados, y en conejos, una elevación de 350 a 700 veces de los niveles de la IgG se detectó después de dos inyecciones. La inmunogenicidad del conjugado se aumentó por la inclusión de un auxiliar en la formulación del conjugado. En conejos, los antisueros produjeron después de la inmunización del conjugado una actividad bactericida mediada por el complemento, contra las cepas homologas y las cepas heterólogas de la M. catarrhalis . Estos resultados mostraron que el conjugado de la proteína LOS destoxificada es útil como una vacuna para inmunizar contra las enfermedades causadas por la M. catarrhalis . Un tipo A purificado de la cepa M. catarrhalis
(cepa ATCC 25238, disponible de American Type Culture Collection, Rockville, MD) , se usó como una fuente ejemplar para la purificación de estos LOS usando métodos estándar
(Edebrink, P. et al., 1994, Carbohydr. Res. 257:269-284;
Masoud, H., et al., 1994, Can. J. Chem. 72: 1466-1477).
Otras cepas conocidas de la M. catarrhalis , muchas de las cuales están disponibles de la ATCC u otros depositarios, o aislados clínicos purificados, obtenidos usando los métodos bacteriológicos bien conocidos, están también dentro del alcance de la invención, para su uso como una fuente de los
En breve, la cepa 25238 de la M. catarrhalis creció en agar de chocolate durante 8 horas, y luego se inoculó en 3% de caldo de soya tríptico (TSB) , que se incubó con agitación a 37°C, durante la noche. El cultivo se diluyó ulteriormente y se transfirió a frascos con desviaciones, que contienen el TSB y crecieron con agitación a 37°C durante 24 horas adicionales. Las células se recogieron por centrifugación y las células en forma de pellas se lavaron con etanol, acetcna y éter de petróleo, usando métodos estándar (como se describen en Masoud, H., et al., 1994, Can. J. Chem. 72:1466-1477), antes de ser secadas a un polvo. El LOS se extrajo de las células por un método estándar de fenol-agua caliente (Westphal, 0., et' al., 1965, Methods, Carbohydr. Chem. 5:83-91) con modificaciones (Gu, X-X, 1995, Infect . Immun. 63:4115-4120) para suministrar a LOS con una proteína y un contenido de ácido nucleico menor del 1% (Smith, P.K., et al., 1985, Anal. Biochem. 150:76-85; Warburg, O. & W. Christian, 1942, Biochem. Z. 310:384-421). Otros métodos conocidos de purificación de LOS pueden ser usados en lugar de los métodos aquí descritos. Aunque el uso de la hidracina para la destoxificación del LOS de la M. catarrhalis es aquí descrita, el uso de cualquier reactivo o enzima capaz de remover los ácidos grasos esterificados del lípido A, tal cómo el tratamiento con un álcali débil, es decir el tratamiento con NaOH diluido (0.1N) u otras soluciones diluidas de base acuosa, que tienen un pH entre aproximadamente 13.2 y 13.6, se encuentra dentro del ámbito de la presente invención. Es importante que las condiciones de la destoxificación sean moderada suficientemente para no hidralizar la porción del oligosacárido del LOS. La hidrólisis del oligosacárido destruirá los epítoples protectores. El LOS de la M. catarrhalis aislados se destcxificaron usando un tratamiento de hidracina anhidra, bajo condiciones substancialmente moderadas, como se describió previamente (Gu, X.X., et al., 1996, Infect, Immun. 64:4047-4053; Gupta, R.K., et al., 1992, Infect . Immun. 60:3201-3208) . En breve el LOS se suspendió en hidracina anhidra y se incµbó a una temperatura entre 1 y 100 °C, preferiblemente entre 25 y 75 °C y más preferiblemente de alrededor de 37°C. La incubación con mezcla fue entre 10 minutos y 24 horas, preferiblemente de alrededor de 2 a 3 horas, y luego la mezcla se enfrió y se agregó acetona fría hasta que se formó un precipitado, el cual se recogió por centrifugación. La pella se lavó con acetona, se disolvió en agua y luego se ultra-centrifugó . El sobrenadante obtenido después de la ultra-centrifugación se congeló-secó, redisolvió y se sometió a cromatografía en columna para eluir las fracciones que contienen carbohidrato, que se agruparon, congelaron-secaron y designaron dLOS. Por peso, los dLOS fueron de alrededor del 38% del LOS. Alternativamente, el LOS puede ser destoxificado por el tratamiento moderado con ácido, usando ácidos acuosos diluidos o débiles, que tienen un pH entre alrededor de 2 y 3, como describen Gu et al. (Infect . Immun 61:1873-1880, 1993) que resulta en la remoción del lípido A, para producir un oligosacárido (OS) . Este OS es luego conjugado a portadores usando los mismos métodos como para los dLOS. Aunque el uso del ácido acético para la remoción del LOS de M. catarrhalis se describe aquí, el uso de cualquier reactivo o enzima capaz de remover el lípido A está dentro del ámbito de la presente invención. Los conjugados de la proteína OS son también inmunogénicos en tanto ratones como conejos y producen anticuerpos en ambas proteínas de LOS y del portador. En ratones, los sueros inmunizados del conjugado (con el auxiliar) mostraron una actividad bactericida contra la cepa 25238 de la M. catarrhalis . En ratones, los sueros conjugados-inmunizados mostraron actividad bactericida contra la cepa 25238 homologa. Para la preparación de los conjugados de dLOS u OS, los dLOS pueden ser unidos covalentemente en forma directa a una proteína del portador, por ejemplo, usando un reactivo entrelazador, tal como el glutaraldehído. Preferiblemente, los conjugados de dLOS u OS se producen por el uez de un compuesto enlazadoz, que separa los dLOS u OS y el portador, usando cualquiera de una variedad de métodos conocidos (por ejemplo, véase Marburg et al., 1986, J. Am. Chem. Soc. 108:5282 y las patentes de E.U.A., Nos. 4,882,317, 5,153,312, 5,204,098). La presencia de un enlazador promueve el acoplamiento eficiente de los dLOS u OS al portador y optimiza la inmunogenicidad del conjugado. Los enlazadores que tienen cadenas cuya longitud y flexibilidad puede ser ajustada según sea deseado, pueden separar los componentes del carbohidrato y el portador. Los e?lazadores pueden permitir las características aumentadas de translación y rotación de los antígenos conjugados, aumentando así el acceso de los sitios de unión de los anticuerpos. Entre los sitios bifuncionales, las cadenas del enlazador pueden contener una variedad de características estructurales, que incluyen heteroátomos y sitios de desdoblamiento. Aunque la dihidrazida adípica (ADH) es un enlazador preferido, otros enlazadores adecuados incluyen, por ejemplo, los enlazadores heterodifuncionales, tal como el ácido e-aminohexanóico, clorohexanol-dimetil-acetal, D-glucuronolactona y p-nitrofenil-amina . Los reactivos de acoplamientos considerados para su uso en la presente invención incluyen las hidrosuccinimidas y carbodiimidas .
Muchos enlazadores adecuados y reactivos de acoplamiento son conocidos por los expertos ordinarios en la materia (Dick et al., Conjúgate Vaccines, J. M. Curse & R. E. Lewis, Jr. , Eds., Karger, New York, páginas 48-114, 1989). En una modalidad preferida, los dLOS u OS primero se derivatizan con la dihidrazida adípica (ADH) , que sirve como el enlazador a un portador de proteína. En breve, la dihidrazida del ácido adípico (ADH) se une al grupo carboxilo de la parte Kdo de los dLOS u OS, para formar los derivados de AH-dLOS o AH-OS usando métodos conocidos (Gu, X.X., & C.M. Tsai, 1993, Infect . Immun. 61: 1873-1880). Un exceso molar del ADH se usó para asegurar un acoplamiento más eficiente y para limitar el acoplamiento de d-LOS-dLOS. En la mezcla de reacción, la relación molar de ADH a dLOS u OS se encuentra típicamente entre alrededor de 10:1 hasta 250:1, preferiblemente entre alrededor de 50:1 hasta 150:1, y más preferiblemente de alrededor de 100:1. En una modalidad preferida, un ADH por dLOS u OS está presente en el conjugado de AH-dLOS. En otra modalidad preferida, en el conjugado final de dLOS-portador, la relación molar de los dLOS u OS al portador está entre aproximadamente 15 y 100, en un intervalo menor preferido de alrededor de 20 a 35 y un intervalo superior preferido de aproximadamente 40 a 75, preferiblemente entre alrededor de 25 a 50, y más preferiblemente de alrededor de 50. Esta relación se controla generalmente variando las concentraciones de partida de los AH-dLOS o AH-OS y el portador, y el tiempo de reacción. En general, dentro de estos intervalos, hay una correlación positiva entre la relación de la respuesta de anticuerpos al conjugado in vivo (es decir, cuanto mayor sea la relación, mayor será la respuesta) . Los dLOS u OS derivatizados se purificaron de la mezcla de reacción por la cromatografía en columna, para obtener fracciones de eluato que contienen tanto el carbohidrato como la hidracida adípica (Kemp, A.H. & M.R.A., Morgan, 1986, J. Immunol, Methods 94:65-72). Estas fracciones se agruparon, congelaron-secaron y se designaron AH-dLOS o AH-OS. Aunque una modalidad preferida de la presente invención es de los dLOS u OS de la M. catarrhalis enlazados a una proteína, más preferiblemente el toxoide del tétano (TT) , o proteínas de alto peso molecular (HMS) , purificadas de la H. influenzae, una variedad de portadores conocida en el arte están también disponibles para producir los conjugados de los dLOS u OS y portador de la presente invención. Las HMP se refieren a un grupo de proteínas de alto peso molecular, expuestas en la superficie, que son los objetivos de anticuerpos principales, en los sueros de humanos convalecientes, obtenidos de individuos que se han infectado con H-influenzae (definidos además estructural y funcionalmente por S. J. Barenkamp, 1992, J. Infect . Dis. 165 (Suppl. 1): S181-184) . El portador aumenta la inmunogenicidad del oligosacárido y los anticuerpos elevados contra el portador pueden ser benéficos medicinalmente. El portador puede ser soluble o insoluble en agua. Portadores inmunogénicos poliméricos adecuados, naturales o sintéticos, incluyen, por ejemplo, materiales que contienen un grupo aminc primario y/o secundario, un grupo azido o un grupo carboxilo. Cualquiera de una variedad de proteínas del portador inmunogénico puede ser usada para producir los conjugados de dLOS u OS y portador de la presente invención. Estas proteínas incluyen, por ejemplo, las pili, proteínas de membrana externa y toxinas excretadas de bacterias patogénicas, formas no tóxicas o "toxoides" de tales toxinas excretadas, proteínas no tóxicas similares antigénicamente a las toxinas bacteriales (conocidas como materiales de reacción cruzada o CRM) y otras proteínas . Las proteínas de membrana externa son aquéllas aisladas de bacterias Gram-negativas. Proteínas de membrana externa preferidas incluyen la UspA y CD aisladas de la membrana externa de la M. catarrhalis . Los toxoides son también preferidos. Ejemplos no limitativos de toxinas bacteriales y toxoides, considerados para su uso en la presente invención, incluyen, por ejemplo, la toxina o toxoide del tétano, la toxina o toxoide de la difteria, la toxina A de P. aeruginosa destoxificada, la toxina o toxoide del cólera, la toxina o toxoide de pertussis, y la exotoxina o toxoide de Clostridium sp . El uso de proteínas virales (por ejemplo, la hepatitis B superficial o antígenos del núcleo, proteína del rotavirus VP7 y proteínas F y G del virus sincitial respiratorio (RSV) ) como portadores ta bién se consideran. Los CRM incluyen los CRM197, equivalentes aitigénicamente a la toxina de la difteria (Pappenheimer et al., supra) y CRM3201, una variante manipulada genéticamente de la toxina pertussis (Black et al . , supra) . El uso de proteínas portadoras inmunogénicas de fuentes no de mamíferos, tal como, por ejemplo, la hemocianina de la lapa, hemocianina de cangrejo de herradura y la edestina de plantas, se encuentran dentro del ámbito de la invención. Muchos métodos de acoplamiento se consideran para producir los conjugados de proteínas de dLOS u OS de la M. catarrhalis . Por ejemplo, como se presentan aquí, los dLOS u OS se derivatizan con AH y luego se enlazan a la TT o la HMP. Alternativamente, otro método para producir los conjugados de proteínas adecuados de los dLOS o los OS implica la derivatización de la cistamina de los dLOS, por la derivatización mediada por EDC, seguida por la conjugación del disulfito a la proteína derivatizada del N-succimidil -3- (2 -piridilditio) -propionato . Otros métodos bien conocidos para conjugar los oligosacáridos a las proteínas portadoras inmunogénicas se encuentran también dentro del ámbito de la invención, como se describen, por ejemplo, en la patente de E.U.A., No. 5,153,312, la patente de E.U.A., No. 5,204,098; y las patentes europeas EP 0 497 525 y EP 0
245 045. Los AH-dLOS o AH-OS se acoplaron al toxoide del t"étano(TT) o a proteínas de alto peso molecular (HMP) de H. i?fluenzae para formar conjugados (Gu, X.X, & C.M. Tsai,
1993, Infect . Immun. 61:1873-1880). La relación molar de AH-dLOS o AH-OS al componente de proteína, en la mezcla de reacción, está típicamente en alrededor de 10:1 hasta 250:1, preferiblemente está entre alrededor de 50:1 y 150:1, y más preferiblemente, está en alrededor de 100:11. Los AH-dLOS, disueltos en agua, se mezclaron con el TT o HMP a relaciones molares de AH-dLOS a la proteína de conjugado de alrededor de 100:1. Luego, el pH se ajustó en 5.4 ± 0.2 y se agregó la l-etil-3- (3 -dimetilaminopropil) -carbodiimida-HCl a la mezcla de reacción agitada, durante 1 a 3 horas. La mezcla de reacción se ajustó a un pH de 7.0, se centrífugo y purificó por la cromatografía en columna. Las crestas que contenían tanto la proteína como el carbohidrato se agruparon, se designaron como dLOS-TT o dLOS-HMP, dependiendo de la proteína usada en el conjugado. Los conjugados se analizaron en sus composiciones de carbohidratos y proteínas, usando métodos convencionales, y los dLOS y BSA como estándares (Duboius, M. et al., 1956, Anal. Biochem. 28:250-256; Smith, P.K., et al., 1985, Anal. Biochem. 150:76-85). Los expertos en la materia comprenderán que los dLOS o OS acoplados al portador pueden haber sido originados con una sola cepa de M. catarrhalis o con una variedad de cepas , para producir , una mezcla multivalente , Alternativamente, los conjugados de dLOS u OS y portador pueden ser preparados individualmente, usando una sola fuente de dLOS u OS para la producción de un solo conjugado, y luego diferentes conjugados pueden ser mezclados subsiguientemente para producir una vacuna que contiene más de un tipo de conjugaos de dLOS u OS y portadores. De esta manera, una vacuna que contiene uno o más de los tipos antigénicos conocidos del LOS de M. catarrhalis puede ser producida. . Los dLOS purificados se caracterizaron y compararon al LOS purificado usando el análisis de SDS-PAGE estándar y las técnicas de teñido de la plata, substancialmente como se describió antes (Tsai, C.M. & CE. Frasch, 1982, Anal. Biochem. 119.-115-119). Partes alícuotas de LOS de M. catarrhalis (25, 50, 100 y 200 ng) y dLOS (20 µg) se separaron en el gel, que también contenía, como estándares, Salmonella minnesota LPS Ra y Rc . Cada uno de los carriles que contiene la M. catarrhalis LOS mostró una sola banda de Mr de alrededor de 4,000 (Edebrink, P et al., 1994, Carbohydr. Res. 257:269-284), mientras el carril que contiene 20 µg de dLOS no mostró una banda detectable en la ubicación del LOS. El carril que contiene 20 µg de dLOS, en lugar de ello, mostró una banda borrosa pálida en alrededor del nivel de la banda de S . minnesota LPS Ra. Estos resultados mostraron que la muestra de dLOS contiene menos del Ü.25% residual de LOS de M. ca tarrhalis . ' La toxicidad del LOS aislado y el dLOS se probó usando el ensayo del lisado amebocyte de Limulus estándar (LAL) (Hochstein, H. D., et al . , 1973, Bull. Parenter. Drug Assoc. 27:139-148). La sensibilidad del ensayo LAL es de 0.2 EU/ml, cuando se usó un estándar disponible de U.S:F:D:A: El LOS aislado mostró 20,000 EU/µg, en tanto el dLOS mostró 1 EU/µg, que representan una reducción de 20,000 veces de toxicidad, . Preferiblemente, una composición que tiene una reducción de alrededor de 500 veces a alrededor de 1,000 veces EU/µg o más se usa para una vacuna. Tales reducciones de la toxicidad in vi tro se determinaron usando, por ejemplo, el ensayo LAL, que correlaciona con los niveles reducidos y aceptables de la toxicidad in vivo . Esta toxicidad in vivo puede ser determinada fácilmente usando los métodos de prueba de pirógeno estándar in vivo (por ejemplo, en conejos, usando dosis de 0.1 µg a 1 µg/kg de peso corpóreo) .
La antigenicidad de los conjugados de los dLOS, AH-dLOS y dLOS-TT y los dLOS-HMP se probaron por la doble i muno-difusion, usando el suero hiper-inmune del conejo a las células enteras de la M. catarrhalis (cepa 25238) . El suero hiper- inmune se preparó por métodos estándar. En breve, dos conejos blancos , New Zealand (hembras, 2 a 3 kg cada uno) se inyectaron subcutáneamente e intramuscularmente dos veces (ambos s.c. e i.m., para cada inyección) en intervalos de cuatro semanas con una emulsión de 109 células enteras de la M. catarrhalis (cepa 25238) y el auxiliar de Freund incompleto (a una relación de 1:1, vol/vol) . Las muestras de sangre se recogieron antes y dos semanas después de cada inyección. Se realizó una doble inmuno-difusion usando métodos estándar en una gel de agarosa al 0.8% en una solución salina regulada con fosfato (PBS, pH de 7.4) . En este ensayo, la cavidad central contenía el suero hiper-inmune del conejo a las células enteras de la M. catarrhalis y las cavidades que lo rodean contenían individualmente estos LOS, dLOS-TT, dLOS-HMP, dLOS y HMP. El suero hiper-inmune reaccionó con LOS en el ensayo de doble inmuno-difusión, que produce una banda de precipitación detectable fácilmente, aguda. Similarmente, el suero hiper-inmune reaccionó con los dLOS para producir una banda algo más ancha de precipitación, que muestra que los dLOS aislados retuvieron la antigenicidad del LOS aislado, el suero hiper-inmune también reaccionó con los conjugados de dLOS-TT y los dLOS-HMP, produciendo una banda idéntica de precipitación, cuando se comparó al LOS. En contraste, el suero hiper-inmune no reaccionó de manera que se pueda medir con la HMP aislada. La antigenicidad también se midió usando un ensayo inmuno-sorbente enlazado a enzima (ELISA) , usando los métodos descritos previamente (Gu, X.X, et al., 1996, Infec . Immun. 64 4047-4053), con algunas modificaciones. Las placas ELISA se recubrieron con LOS y luego se bloquearon con 3% de BSA. Luego, las cavidades ELISA se incubaron con suero diluido de conejo, antes de agregar la IgG anti-conejo, conjugado con fosfatasa alcalina y la IgM (Sigma) . Entre todas las etapas, las cavidades se lavaron copiosamente con PBS que contiene un agente de dispersión polimérico (0.01% de Tween-20) . EL substrato de la enzima se agregó durante 30 minutos y luego las reacciones se cuantificaron en A405. La antigenicidad de los conjugados de dLOS y portador se determinó similarmente, usando los conjugados como los antígenos de recubrimiento y un suero inmune diluido del conejo, como un anticuerpo de unión. Ambos conjugados de dLOS y portador mostraron una unión comparable al suero hiper-inmune del conejo y la antigenicidad de los conjugados de dLOS y portador fue mayor de aquélla de LOS bajo las mismas condiciones. Para determinar la antigenicidad in vivo, los conjugados de los dLOS y portador se inyectaron parenteralmente en ratones y conejos y los niveles de los anticuerpos anti -LOS en los sueros de animales se midieron subsiguientemente usando el ensayo ELISA. En ratones, una mezcla no conjugada de los dLOS y TT o la HMP no produjo anticuerpos anti -LOS. En contraste, ambos conjugados de dLOS-TT y dLOS-HMP produjeron niveles bajos de la IgG anti-LOS después de una segunda inyección del conjugado. En seguida de una tercera inyección del conjugado, hubo una elevación aproximada de 50 a 100 veces en la IgG de anti-LOS. Tanto dLOS-TT como dLOS-HMP produjeron niveles similares de la IgG anti -LOS después de tres inyecciones. Los conjugados de LOS solos y de dLOS -portador produjeron nivel&s similares de la IgG anti-LOS.
La formulación de ambos conjugados de dLOS-TT y dLOS-HMP con un auxiliar, mejoran significantemente la inmunogenicidad en ratones. Es decir, dos dosis de los conjugados de dLOS y portador con el auxiliar produjeron 5 niveles comparables o mayores de la IgG que aquéllos de tres dosis del conjugado solo. Después de las tres inyecciones del conjugado de dLOS y portador con el auxiliar, hubo una elevación de alrededor de 9 a 15 veces de las IgG antí-LOS sobre los niveles obtenidos en seguida de las tres
inyecciones del mismo conjugado sin auxiliar. El conjugado de dLOS-TT produjo niveles menores de la IgG que el conjugado de dLOS-HMP, después de tres inyecciones de las formulaciones de conjugado y auxiliar. El auxiliar usado contiene el lípido A de
monofosforilo y el dimicolato de trehalosa (disponible comercialmente como Ribi-700, de Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) . También considerados dentro del ámbito de la invención son otros auxiliares estándar, bien conocidos, tal como, por ejemplo, los compuestos de aluminio
"-¡O (por ejemplo el alumbre), lipopol isacáridos modificados químicamente, suspensiones de Bordetella pertussis muertas, N-acetilmuramil-L-alanil-D-glutamina y otros auxiliares conocidos por un experto ordinario en la materia. Auxiliares adicionales se describen por Warren et al (Ann. Rev. Biochem, 4:369-388, 1986; New Generation Vaccines, 2a Edición, Levine, M.M. et al., Eds, Marcel Dekker, Inc., ?ew York, 1997) . El uso de compuestos de aluminio es preferido, y los auxiliares aprobados para el uso en humanos son particularmente preferidos. Cuando los sueros de ratones se ensayaron en los niveles de la IgM, los conjugados produjeron niveles bajos a medianos de los anticuerpos anti-LOS, después de cada inyección, en tanto el LOS produjo niveles altos de la IgM anti-LOS, después de la tercera inyección. La adición de un solvente a los conjugados de dLOS y proteína, mejoró los niveles de la IgM anti-LOS producidos después de la segunda inyección. Cuando los sueros de ratones se ensayaron similarmente para los anticuerpos dirigidos contra los componentes de proteínas (TT o HMP) de los conjugados de dLOS y proteínas, se encontraron los anticuerpos anti-proteína. Para los anticuerpos anti-TT, los dLOS-TT produjeron bajos niveles de la IgG después de la primera inyección, y ese nivel se elevó significantemente después de la segunda y tercera inyecciones. La inyección del conjugado de dLOS-TT con el auxiliar mejoró el nivel de la IgG producido en el grupo inyectado con los dLOS-TT, comparado a los ratones que recibieron el mismo conjugado sin auxiliar. La mezcla no conjugada de TT y dLOS produjo niveles mayores de la IgG anti-TT de aquéllos producidos por los dLOS-TT. Todos los inmunógenos produjeron bajos niveles de IgM de anti-TT, que se aumentaron por la inclusión del auxiliar en las inyecciones. Cuando los sueros del ratón se ensayaron similarmente para los anticuerpos anti-HMP, los dLOS-HMP produjeron un nivel bajo de la IgG, antes de la primera inyección, y el nivel de la IgG anti-HMP se elevó significantemente después de la segunda y tercera inyecciones. La inclusión de un auxiliar mejoró los niveles de la IgG en ratones que recibieron el conjugado de los dLOS-HMP. La mezcla no conjugada de la HMP y los dLOS produjo niveles mayores de la IgG anti-HMP que aquéllos vistes en los ratones que recibieron los dLOS-HMP, con o sin el auxiliar (véase la Tabla 2 siguiente) . Todos los inmunógenos produjeron niveles bajos de la IgM del anti-HMP. La inmunogenicidad de los conjugados de dLOS y proteína también se determinó para conejos inyectados s.c e i.m. en el momento 0 y un mes después (inyecciones tanto s.c. como i.m. para cada inyección) . Se recogieron muestras de sangre en el momento 0 (es decir en el momento de la primera inyección) , dos semanas después de la primera inyección y dos semanas después de la segunda inyección. Usando los métodos ELISA, como se usaron para medir la antigenicidad de los sueros de ratones, se determinaron los niveles de la IgM y la IgG para los sueros de conejos obtenidos después de la inyección con los siguientes inmunógenos (todos a 50 µg por inmunógeno por inyección) : LOS, dLOS-TT, dLOS-TT con auxiliar, dLOS-HMP, dLOS-HMP con auxiliar, una mezcla no conjugada de dLOS, TT y HMP, o células enteras de la M. catarrhalis . La mezcla de los dLOS, TT y HMP o LOS solos produjeron bajos niveles de la IgG anti -LOS o anticuerpos de la IgM después de dos inyecciones. El conjugado de dLOS-TT produjo una elevación significante de la IgG de anti-LOS después de la primera y segunda inyecciones, comparada con los niveles del suero pre-inyección. La inyección del conjugado de dLOS-HMP produjo niveles menores de la IgG que el conjugado de dLOS-TT. La inclusión de un auxiliar mejoró los niveles de la IgG anti-LOS para ambos conjugados, después de cada inyección, y no hubo diferencia significante entre los dos conjugados después de dos inyecciones con el auxiliar. Para la IgM, ambos conjugados produjeron niveles bajos a medianos de los anticuerpos anti-LOS, y la inclusión de un auxiliar produjo niveles generalmente aumentados de los anticuerpos de la IgM de anti-LOS, detectados después de cada inyección, comparados con el mismo conjugado inyectado sin auxiliar. Cuando los sueros de conejos se ensayaron similarmente para los anticuerpos dirigidos contra los componentes de proteínas de los conjugados de dLOS y proteína, los anticuerpos anti-proteínas se encontraron. Para los anticuerpos anti-TT, los dLOS-TT produjeron bajos niveles de la IgG después de la primera inyección, y el nivel se elevó significantemente después de la segunda inyección. Se detectó significantemente más IgG anti-TT después de la inyección de los dLOS-TT con el auxiliar, en comparación de la inyección sin auxiliar. La inyección de una mezcla no conjugada de TT, dLOS y HMP produjo mayores niveles de la IgG anti-TT que aquélla producida por los dLOS-TT, pero menor de la producida por los dLOS-TT con auxiliar, después de la segunda inyección. Todos los inmunógenos produjeron niveles bajos a medianos de la IgM del anti-TT. Para los anticuerpos anti-HMP encontrados en los suercs de conejos, los dLOS-HMP produjeron bajos niveles de la igG después de la primera inyección, ese nivel se elevó significantemente después de la segunda inyección. La inclusión de un auxiliar con los dLOS-HMP aumentó los niveles de los anticuerpos anti-HMP IgG. La mezcla de HMP, dLOS y TT produjo un nivel mayor de anti-HMP IgG que la inyección de dLOS-HMP sin auxiliar, pero algo menor que el conjugado de dLOS-portador con el auxiliar. Todos los inmunógenos produjeron niveles bajos a medianos de la IgM de anti-HMP. Los antisueros producidos en ratos y conejos se ensayaron en la actividad bactericida in vi tro contra cepas homologas y heterólogas de la M. catarrhalis, usando métodos estándar (Gu, X-X., et al., 1996, Infect Immun. 64:4047-4053) . En el modelo del conejo, los sueros producidos después de la inmunización con LOS o dLOS sin conjugar, no mostraron actividad bactericida contra la cepa homologa de la M. catarrhalis . En contraste, los sueros producidos en respuesta a la inmunización con los dLOS-TT mostraron actividad bactericida a títulos medianos de 1:16 (sin auxiliar) y de 1:40 (con auxiliar) y los sueros producidos en seguida de la inmunización con los dLOS-HMP mostraron actividad bactericida con títulos medios de 1:10 (sin auxiliar) y de 1:40 (con auxiliar) . Los niéveles de anti-LOS IgG, según se determinan por ELISA, se correlacionan con los títulos bactericidas detectados. Las actividades bactericidas de los antisueros contra las cepas homologas y las cepas heterólogas de la M. ca tarrhalis de diferentes áreas geográficas (por ejemplo el Japón, mostraron que los sueros de conejos producidos en respuesta a los conjugados de dLOS y proteínas tenían mayor actividad bactericida que la producida similarmente por los sueros de ratones. Todos los sueros de conejos, conjugados-inducidos, mostraron actividad bactericida contra la cepa homologa de M. catarrhalis y los sueros representativos mostraron actividad bactericida contra la mayoría de las cepas no homologas (9 de 10 cepas de ATCC y aislados clínicos) . En contraste, menos de la mitad de los antisueros del ratón inducidos por el conjugado de los dLOS y portadores, mostraron actividades bactericidas contra la cepa homologa. En general, los títulos bactericidas y los niveles de los anticuerpos de la IgG de anti-LOS se correlacionan. Las actividades bactericidas de los antisueros de conejos provocadas por los dLOS-TT formulados con un auxiliar, se analizaron usando veinte cepas adicionales de la M. catarrhalis (diez cepas de ATCC de tipo silvestre y diez aislados clínicos) . Diez de las veinte cepas fueron o sensibles al complemento o sensibles al suero. Usando las restantes diez cepas, el antisuero del conejo demostró actividades bactericidas para cuatro ATCC y cinco aislados clínicos en el título medio de 1:15 (intervalo de 1:2 hasta 1:43) .Una cepa fue negativa en el ensayo bactericida. En el modelo del ratón, 20% (4 de 20 ratones) de los sueros de ratones inmunizados con los conjugados de dLOS y proteínas, y el 45% (9 de 20 ratones) de sueros producidos después de la inmunización con los conjugados y auxiliares, mostraron títulos bajos de la actividad bactericida contra la cepa homologa de la M. catarrhalis (ATCC 25238) después de tres inyecciones del conjugado de dLOS y portador. Los resultados presentados en los ejemplos que siguen muestran que, después de la destoxificación, los dLOS de la M. catarrhalis retuvieron determinantes antigénicos, pero no inmunogénico in vivo . Cuando los dLOS se conjugaron a loe portadores de proteínas, el componente de los dLOS llegó a ser inmunogénico. Es decir, los conjugados de dLOS y portador de la M. catarrhalis indujeron respuestas de anticuerpo de la IgG significantes al LOS en mamíferos. En estos mamíferos, los conjugados de dLOS y portador produjeron al menos niveles similares de los anticuerpos de la IyG de anti-LOS como el LOS. La inmunogenicidad de los conjugados de dLOS-proteínas fue mejor en conejos que en ratones (es decir, después de dos inyecciones de los conjugados en conejos, las veces del aumento de los anticuerpos de los anti-LOS fue generalmente mayor que las veces de aumento de los anticuerpos anti-LOS visto en ratones, después de dos o tres inyecciones de los mismos conjugaos) . En ambas especies, los niveles de los anticuerpos anti-LOS se aumentaron cuando el conjugado se inyectó con el auxiliar, en comparación con la inyección del mismo conjugado sin auxiliar. Ambos de los conjugados de los dLOS-TT y dLOS-HMP produjeron niveles similares de los anticuerpos de la IgG anti-LOS, que se aumentaron cuando los conjugados se formularon con un auxiliar.
Los conjugados de los dLOS y portadores de la M. catarrhalis de la presente invención, son útiles como una vacuna para inducir la inmunidad contra las infecciones de la M. catarrhalis en mamíferos, particularmente para prevenir la otitis media y lasa enfermedades respiratorias en humanos. Los métodos de producir los conjugados de los dLOS y portadores, según se revelan aquí, son útiles para la fabricación de tales vacunas. Los métodos aquí descritos son también útiles para identificar otros conjugados de los dLOS y portadores (es decir, conjugados de los dLOS con otras p rtes portadoras) que son útiles en inducir las respuestas inmunológicas protectoras a la M. catarrhalis , en mamíferos, particularmente en humanos, que incluyen los niños. Se comprenderá que una vacuna contra la M. catarrhalis puede incluir el conjugado de dLOS y portador, junto con otros componentes, tal como agentes aceptables farmacéuticamente, inmunogénicamente inertes, o auxiliares aceptables rlínizamente . También se apreciará por los expertos en la materia que el conjugado de dLOS y portador de la M. catarrhalis puede también ser combinado con otros componentes activos inmunológicamente, dirigidos contra otros agentes infecciosos (por ejemplo, para producir una combinación de vacunas contra la M. catarrhalis y una o más de otras bacterias o virus, que causan enfermedades en la niñez); por ejemplo, una vacuna trivalente contra la M. catarrhalis, Haemophilus influenzae sin tipo y Streptococcus pneumoniae, para impedir la otitis media bacteriana. Para la vacuna, los conjugados de dLOS-portador se administran parenteralmente. Aunque varias rutas de administración de vacunas, que incluyen, por ejemplo, la intramuscular (i.m.), subcutánea (s.c.), intraperitoneal (i.p.), transmucosal (por ejemplo intranasalmente) e intraarterial , se consideran, se prefiere la transmucosal, s.c e i.m. Para la administración parenteral, los conjugados del dLOS-portador pueden estar en la forma de una preparación estéril, tal como, por ejemplo, una suspensión, acuosa u oleaginosa, inyectable, estéril, con o sin un auxiliar. Tales suspensiones se formulan de acuerdo con métodos bien conocidos en el arte, que usan agentes adecuados de dispersión o humectación, y agentes de suspensión. La preparación estéril puede también ser una solución inyectable estéril o una suspensión, en un diluente o solvente aceptable parenteralmente, tal como, por ejemplo, una solución del 1, 3 -butanodiol . Otros diluentes adecuados 4C
incluyen, por ejemplo, el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Igualmente, los aceites estériles fijos pueden ser empelados convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Por ejemplo, cualquier aceite blando fijo puede ser empelado, que incluyen los mono y diglicéridos sintéticos. Igualmente, los ácidos grasos, tal como el ácido oleico, pueden similarmente ser usados en la preparación de preparaciones inyectables. Para la administración intranasal, la formulación puede ser administrada en aerosol usando un portador inerte (por ejemplo aire o hidrocarburo), por medio de cualquiera de una variedad de métodos convencionales . Los conjugados de los dLOS y portadores en una vacuna de la presente invención, pueden estar en forma soluble o en micropartículas, o pueden ser incorporados en microesferas o microvesículas, que incluyen los liposomas. En una modalidad, la dosis del conjugado administrado variará de aproximadamente 10 a 100 µg, preferiblemente entre 20 y 50µg. En otra modalidad preferida, la cantidad administrada es de alrededor de 25 a 40µg. La dosis exacta puede ser determinada por los protocolos rutinarios de dosis/respuesta, conocidos por un experto ordinario en la materia, generalmente con las dosis administradas en la base del peso corpóreo, particularmente en niños. La vacuna de la invención puede ser administrada a mamíferos de cualquier edad y se adaptan para inducir la inmunización activa en mamíferos jóvenes, particularmente en humanos, contra la otitis media y las infecciones respiratorias causadas por la M. catarrhalis . Como una vacuna para la niñez, el conjugado de dLOS -cortador se administra en aproximadamente dos a doce meses de edad, preferiblemente entre dos • a seis meses de edad. Las inyecciones de refuerzo probablemente serán suministradas. Típicamente, dos inyecciones de refuerzo de entre 10 y 25 µg se administran, por ejemplo, en aproximadamente dos meses y aproximadamente trece meses después de la inyección inicial. Alternativamente, las inyecciones de refuerzo se dan en los dos, cuatro y diez y seis meses después de la inyección inicial. Otros protocolos de inyecciones de refuerzo son también considerados. Las composiciones de vacunas pueden comprender una mezcla de conjugados de diferentes cepas de la M. c:atarrhali s que protegen contra todas o la mayoría de las cepas relevantes en la medicina. Hay tres tipos conocidos de M. catarrhalis basadas en los dLOS: Tipos A, B y C, que representan el 61%, 29% y 5% de los aislados clínicos, respectivamente. Como se muestra en el Ejemplo 6, los antisueros realzados contra una cepa tienen una reacción cruzada con algunas, pero no todas, las otras cepas. Así, una mezcla de diferentes conjugados será usada probablemente. Las mezclas de conjugados que contienen los dLOS u OS de los Tipos A y B cubrirán el 90% de todas las cepas relevantes en la medicina, mientras las mezclas de conjugados que contienen los dLOS u OS de los Tipos A, B y C, cubrirán el 95% de todas las cepas relevantes médicamente . Como se discute en el siguiente Ejemplo 7, un estudio de protección pasiva se realizó en ratones inmunizados con cualquier antisuero del conejo contra los dLOS-TT, y luego se estimuló con la cepa 25238 de la M. catarrhalis por la cámara de aerosol. Reducciones significantes en las CFU bacterianas para el pulmón se observaron en el grupo de vacuna. Este modelo de evacuación pulmonar del ratón semeja la transmisión natural de las bacterias en humanos. Las ventajas de este modelo son que es sencillo, repetible y bien controlado por la máquina de aerosol, mayores números de ratones se pueden estudiar bajo las mismas condiciones de estímulo y no hay un procedimiento invasivo quirúrgicamente, requerido para la inoculación de bacterias. Aunque no se desea estar ligado a un modo particular de acción o mecanismo, los anticuerpos bactericidas producidos en respuesta a los conjugados de los dLOS-portadores, particularmente la IgG, pueden transudar a superficies mucosales de medios nasofaríngeos. Así, los anticuerpos pueden inactivar un inoculo de la M. catarrhalis en la superficie mucosal, impidiendo así o aliviando síntomas de la otitis media causada por la M. catarrhalis y las enfermedades respiratorias. La IgA secretoria puede jugar un papel en la inmunidad mucosal respiratoria, particularmente si la vacuna conjugada se administra a la mucosa nasal. Los siguientes ejemplos ilustran algunas de las modalidades preferidas de la invención. Ejemplo 1: Purificación y Destoxificación de los Llpooligosacáridos (LOS) a Partir de la M. catarrhalis La cepa 5238 de ATCC de la M. catarrhalis (tipo A) , se usó como una fuente ejemplar para la purificación de estos LOS (Edebrink, P., et al., 1994, Carbohydr. Res. 257:269-284; Masoud, H, et al., 1994, Can. J. Chem. 72:1466-1477) . La cepa creció en agar de chocolate a 37°C, 5% de C02 durante 8 horas, y se transfirió a 250 ml de caldo de soya tríptico al 3% (TSB) (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) en una botella de 500 ml . La botella se incubó a 110 rpm en un vibrador de incubadora (Modelo G-25, New Brunswick Scientific, Co . , Edison, NJ) a 37°C, durante la noche. El cultivo se transfirió a seis matraces de Fernbach de 2.8 litros, con desviaciones, cada uno de los cuales contenia 1.4 litros de TSB. Los matraces se sacudieron a 110 rpm y se mantuvieron en 37°C durante 24 horas. El cultivo se centrífugo a 15,000 x g, a 4°C durante 10 minutos para recoger las células . Las pellas de células se lavaron una vez con etanol al 95%, dos veces con acetona y dos veces con éter de petróleo, usando métodos convencionales (substancialmente como se describen en Masoud, H. , et al., 1994, Can. J. Chem. 72:1466-1477) y se secaron a un polvo. Estos LOS se extrajeron de las células por un método estándar de fenol-agua caliente (Westphal, O et al., 1965, Methods, Carbohydr. Chem. 5:83-91) con modificaciones (Gu X-X., 1995, Infect . Immun. 63:4115-4120), que suministro estos LOS con contenido de proteína y ácido nucleico menor del 1% (Smith, P.K. et al., 1985, Anal. Biochem. 150:76-85; Warburg, O. & W. Christian, 1942, Biochem, Z, 310:384-421). El tratamiento con hidrazina anhidra del LOS usando condiciones alcalinas moderadas se usó para remover los ácidos grasos esterificados del lípido A (Gu, X-X, et al., 1996, Infect . Immun. 64:4047-4053; Gupta, R.K., et al., 1992, Infect. Immun, 60:3201-3208). En breve, se suspendió el LOS (160 mg) en 16 mol de hidracina anhidra (Sigma Chemical CO., St . Louis, MO) , y se incubó a 37°C durante 3 horas, con mezcla. Esta suspensión se enfrió sobre hielo y se agregó, en gotas, acetona fría hasta formar un precipitado. La mezcla se centrífugo a 5,000 x g, a 5°C durante 30 minutos. La pella se lavó dos veces con acetona fría, se disolvió en agua exenta de pirógenos, a una concentración final de 10-20 mg/ml, y luego se ultra-centrifugó a 150,000 x g, a 5°C, durante 3 horas. El sobrenadante se congeló-secó y se pasó a través de una columna (1.6 por 90 cm) de Sephadex G-50 (Pharmacia LKB Biotechnoogy, Uppsala, Suecia) se eluyó con 25 mM de acetato de amonio y se vigiló con un refractómetro diferencial (R-400,,- Waters, Milford, Mass.) . El eluato se ensayo para los carbohidratos por el método de micro fenil-ácido sulfúrico (Dubcis, M., et al., 1956, Anal. Biochem. 28:250-256). Las fracciones que contienen carbohidrato se agruparon, se congelaron-secaron y se designaron como dLOS, que tenían alrededor del 38% de LOS en peso. Este método de destoxificación de estos LOS de la M. catarrhalis resultó en mejor rendimiento de los dLOS después de conjugar a portadores de proteína, comparado al tratamiento de ácido moderado de LOS para desdoblar la porción del lípido A de la 'molécula de LOS en el enlace de Kdo-glucosamina (es decir, el método de Gu, X.X. , & C.M., Tsai, 1993, Infect . Immun. 61:1873-1880. Ejemplo 2: Derivatización de los dLOS y Conjugación de Proteínas Los derivados de la hidracida adípica (AH) de los dLOS, preparados de acuerdo con los métodos del Ejemplo 1, se obtuvieron y purificaron como sigue. La dihidrazida del ácido adípico (ADH) (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wis.) se unió al grupo carboxilo de la parte Kdo de los dLOS, para formar los derivados de AH-dLOS usando la l-etil-3-(3-di etilaminopropil) -carbodimida-HCl (EDC) y la N-hidrcxísulfo-succinimida (sulfo-NHS) (Pierce) (Gu, X-X- . &
C-M- . Tsai, 1993, Infect . Immun. 61:1873-1880). En breve, los dLOS (70 mg) se disolvieron en 7 ml de 345 mM de la ADH
(relación molar de la ADH a LOS es de alrededor de 100:1), con base en un t . de 3,000 estimado para los dLOS) (Edebrink,
P., et al, 1994, Carbohydr .' Res . , 257:269-284). El sulfo-NHS se agregó a una concentración de 8 mM, el pH se ajustó en 4.8 y la EDC se agregó a una concentración de 0.1 M. La mezcla de reacción se agitó y mantuvo en un pH de 4.8 durante 3 horas. La mezcla de reacción se ajustó a un pH de 7.0 y se pasó a través de la columna G-50, como se describió en el Ej emplo 1. El eluato se ensayó para los carbohidratos y para la hidracida adípica (AH) (Kemp. A.H. & M.R.A. Morgan, 1986, J. Immunol . Methods 94:65-72) . Las crestas que contienen tanto el carbohidrato como la AH se agruparon, se congelaron-secaron y designaron como AH-dLOS. Se midieron estas AH-dLOS por su composición, usando dLOS y ADH como estándares. Las AH-dLOS se conjugaron a las proteínas (TT y HMP) como sigue. La TT (Connaght Labs. Inc., Swiftwater, Pa) y la HMP se purificaron de la cepa 12 de Haemophilus influenzae sin tipo (Barenkamp, S.J., 1996, Infect . Immun. 64:1216-1251). La AH-dLOS se acopló a las TT o HMP para formar conjugados (Gu, X.X., & C.M. , Tsai, 1993, Infect . Immun. 61; 1873 -1880) . En breve, la AH-dLOS (30 mg) se disolvió con 3 ml de agua y se mezcló con 15 mg de TT (5.9 mg/ml) , o con 12 mg de la HMP (4 mg/ml) . La relación molar de AH-dLOS a tanto TT (Mr de 15OK) como HMP (Mr de 12OK) fue de alrededor de 100:1. El pH se ajustó en 5.4 y la EDC es agregada a una concentración de alrededor de 0.05 a 0.1 M. La mezcla de reacción se agitó y el pH se mantuvo en 5.6 durante 1 a 3 horas. La mezcla de reacción se ajusto a un pH de 7.0, se centrífugo y se pasó a través de una columna (1.6 por 90 cm) de Sephacryl S-300 en 0.9% de NaCl. Las crestas que contienen tanto la proteína como el carbohidrato se agruparon, y se designaron como dLOS-TT o dLOS-HMP. Ambos conjugados se analizaron en su composición de carbohidratos y proteínas, usando el dLOS y BSA como estándares (Dubois, M., et al., 1956, Anal. Biochem. 28:250-256; Smith, P.K. et al., 1985, Anal. Biochem. 150:76-85). Los conjugados derivatizados de Ah-dLOS y dLOS-proteína se caracterizaron físicamente con base en las cantidades medidas (µg/ml) de AH y dLOS en el producto derivatizado, o el dLOS y proteína en los conjugados. El rendimiento de AH-dLOS, con base en el contenido de carbohidratos, fue del 93%. Para dLOS-TT, 103 µg/ml de dLOS y 266 µg/ml de proteínas se midieron; y para dLOS-HMP, 220 µg/ml de dLOS y 280 µg/ml de proteína se midieron. Las relaciones molares para los conjugados se calcularon como moles de dLOS por mol de proteína, usando pesos moleculares de 3,000 para dLOS, 150,000 para TT y 12,000 para HMP. Las relaciones molares de dLOS a TT y a HMP en dos preparaciones de conjugados fueron de 19:1 y 31:1, respectivamente. Los rendimientos para los conjugados se calcularon con base en la cantidad de partida de los dLOS y los dLOS contenidos en los conjugados, según se miden por el método de fenol -ácido sulfúrico. Los rendimientos fueron del 8% para dLOS-TT y del 19% para dLOS-HMP. Ejemplo 3: Antigenicidad de los dLOS, dLOS Derivatizados y Conjugados de dLOS -Proteínas La antigenicidad de los dLOS, AH-dLOS y conjugados se probó por la inmuno-difusion doble y el ensayo de inmunosorbente enlazado a enzima (LISA) , usando el suero hiper-inmune del conejo a células enteras de la M.
catarrhalis (cepa 25238) . El suero hiper-inmune se preparó como ze describió antes. Se realizó la inmuno-difusion doble usando métodos estándares en un gel de agarosa al 0.8% en una solución salina regulada con fosfato (PBS, pH de 7.4) . En este ensayo, la cavidad central contenía el suero hiper-inmune del conejo a las células enteras de la M. catarrhalis y las cavidades que rodean contienen individualmente lo siguiente: 1 mg/ml de LOS, 103 µg/ml de dLOS-TT, 220 µg/ml de dLOS-HMP (con base en la cantidad de dLOS) , 1 mg/ml de dLOS, 200 µg/ml de dLOS y 500 µg/ml. de HMP. El suero hiper-inmune reaccionó con LOS en el ensayo de inmuno-difusión doble, que produce una banda de precipitación aguda, fácilmente detectable. Similarmente, el suero hiper-inmune reaccionó con los dLOS (en ambas concentraciones probadas) para producir una banda algo más ancha de precipitación por la doble inmuno-difusión, que muestra que los dLOS aislados retuvieron la antigenicidad del LOS aislado. El suero hiper-inmune reaccionó con los conjugados de dLOS-TT y dLOS-HMP, que producen bandas distintas de precipitación. Los dos ronjugados y el LOS formaron líneas de precipitación por la inmuno-difusión doble. En contraste, el suero hiper-inmune no reaccionó, en forma que se pueda medir, con la HMP aislada. El ensayo ELISA se realizó substancialmente como se describió antes (Gu, X.X., et al., 1996, Infect . Immun. 64:4047-4053) con las siguientes modificaciones. Después del recubrimiento de LOS (a 10' µg/ml) de las cavidades de la placa ELISA estándar (Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) , las cavidades se bloquearon con 3% de BSA en PES durante 1 horas y luego el suero de conejo (1/8,000 de dilución) se agregó para una incubación de 2 horas. Luego se agregó la IgG y la IgM anti -conejo de la cabra, conjugado de fosfatasa alcalina (Sigma) para una incubación de 1 hora. La PBS que contiene el 0.01% de Tween-20 se usó en lavados entre toas las etapas. Los diluentes para los sueros y la fosfatasa fueron del 1% de _ BSA en PBS, 0.01% de Tween 20. Después que se agregó el substrato de enzima por 30 minutos, las reacciones se leyeron con un auto-lector de microplaca a Aj05 (EL309, Bio-Tek Instruments). La antigenicidad de los conjugados de dLOS-portador se determinaron similarmente como la reactividad de ELISA a A405. Los conjugados se usaron como antígenos de recubrimiento (a 10 µg/ml) y un suero inmune del conejo se usó como un anticuerpo de unión (dilución de 1/8,000) . Para las preparaciones de conjugados descritos en el Ejemplo 3, ambos conjugados mostraron una unión comparable al suero hiper-inmune del conejo. El valor de A405
) para dLOS-TT fue de 1.9 y para dLOS-HMP fue de 1.3. Bajo las mismas condiciones, el LOS (10 µg/ml) mostró un valor de
La inmunogenicidad in vivo de los conjugados de dLOS-proteína se examinaron en seguida en modelos de animales, es decir en ratones y conejos. Ejemplo 4: Inmunogenicidad de los Conjugados de dLOS- Proteína en Ratones Ratones hembra, de cinco semanas de edad (NIH/Swiss), 10 a 20 por grupo, se inyectaron s.c. con 5 µg
(con base en carbohidratos) de dLOS-TT, dLOS-HMP, LOS o una mezcla de dLOS más TT o HMP (5 µg de proteína) en 0.2 ml de
NaCl al 0.9%, con o sin un auxiliar. El auxiliar usado contenía 50 µg del lípido A de monofosforilo (MPL) y 50 µg de dicorinomicolato de trehalosa sintético (STD) por inyección, en un portador inerte (disponible comercialmente como Ribi-700, de Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton Mt . ) Las inyecciones se suministraron tres veces en intervalos de tres semanas y los ratones se sangraron catorce días después de la primera inyección y siete días después de la segunda y la tercera inyecciones. Los niveles de anti-LOS del suero se expresan como unidades ALISA (EU) , usando el aislado de LOS de la cepa 25238, como un antígeno de recubrimiento. Como una referencia, un suero hiper-inmune a las células enteras de la cepa 25238 se usó y los valores asignados de 65,000 EU/ml para la IgG y 800 EU/ml para la IgM. Los anticuerpos del suero contra las TT o HMP se midieron por ELISA en que las TT o HMP (5 µg/ml) se usaron como un antígeno de recubrimiento y se expresaron como unidades ELISA en la base de un suero del ratón de , referencia (producido por tres inyecciones de la TT o HMP) , que tenía valores asignados de 2,000 EU/ml para la IgG, y de 10 EU/ml para la IgM. Para el análisis estadístico de estos resultados, los niveles de anticuerpos se expresaron como las unidades ELISA medios geométricos o títulos (recíprocos) de n observaciones independientes ± la desviación estándar o intervalo (n < 4) . Se probó la significancia con la prueba t de dos costados y los valores P menores de 0.05 se consideran significantes. Como se muestra en los datos de la Tabla 1, la mezcla no conjugada de los dLOS y TT o HMP no produjo los anticuerpos anti-LOS. Ambos conjugados produjeron bajos niveles de la IgG de anti-LOS después de la segunda, pero no la primera inyección; y hubo alrededor de 50 a 100 veces una elevación después de las terceras inyecciones (P < 0.01) . Ambos dLOS-TT y dLOS-HMP produjeron niveles similares de la IgG de anti-LOS después de tres inyecciones. El LOS solo y los conjugados produjeron niveles similares de la IgG de anti-LOS . La formulación de ambos conjugados con el auxiliar Ribi aumentó significantemente 'su inmunogenicidad; dos dosis de los conjugados con el auxiliar produjo niveles de la IgG comparables o mayores de aquéllos de tres dosis de los conjugados solos, y hubo alrededor de una elevación de 9 a 15 veces de la IgG anti-LOS después de 3 inyecciones (P < 0.01) . EL conjugado de dLOS-TT produjo un nivel menor de la IgG que el conjugado dLOS-HMP, después de las tres inyecciones, cuando se formula con el auxiliar (P < 0.05) .
Para la IgM, los conj ugados produj eron niveles baj os a medianos de la IgM de anti -LOS después de cada inyección, mientras estos LOS produj eron niveles mayores de la I-jM de anti -LOS después de la tercera inyección. El auxiliar de Ribi aumentó los niveles de la IgM anti-LOS en los grupos de conj ugados . TABLA 1 - Respuesta de anticuerpo del murino al LOS de M. catarrhalis producida por los conjugados
Inmunógeno3 Muestra de Unidades ELISA Sangre6 Medio Geométrico (± intervalo de DS)° IgG igM dLOS + TT 1 1 1 2 1 Kl-2) 3 3 • 5 (1-15)
dLOS HMP 1 1 1 2 1 1(1-2) 3 1(1-2) 1
dLOS-TT 1 1 1 2 5 (1.19) 7 (2-23) 3 52 (6-447)" 17 (3-91)
dLOS-HMP 1 1 Kl-2) 2 2 (1-8)* 6(2-19) 3 101 (15- 691)** 17 (5-63) dLOS-TT 1 3 (1-11)* 2 (1-14) + auxiliar 2 210 (48-923)** 16 (62-396) 3 470 (266-828) 14 (8-25)
dLOS-HMP 1 3(1-9)* 9(2-39) + auxiliar 2 101 (26-389)** 22 (6-84) 3 1,514 (299-7,658.' 32 (13-80)
LOS 1 3 (1-9) 2 8 (2-40)* 2 (1-4) 3 113 (20-630; 52 (12-230)
a De diez a veinte ratones para cada grupo se dieron un total
de tres inyecciones subcutáneas en intervalos de tres
semanas, con 5 µg de LOS, 5 µg de conjugados, 5 µg de
conjugados con el auxiliar de Ribi, LOS, o una mezcla de
dLOS y TT o HMP (5 µg cada una) .
b Se recogieron muestras de sangre: 1) dos semanas después de
la primera inyección; 2) una semana después de la segunda
inyección; y 3) una semana después de la tercera inyección
c Las unidades ELISA se basan en un suero de referencia
contra la cepa 25238, y estos LOS de la cepa 25238 se
usaron como un antígeno de recubrimiento. Para datos
marcados con * y ** para un inmunógeno sencillo, las
mediciones son significantemente diferentes (p < 0.01) .
Anticuerpos anti-proteína en ratones. Como se muestra por los datos presentados en la Tabla 2, los dLOS-TT produjeron bajos niveles de anticuerpos anti-TT después de la primera inyección, y los niveles se elevaron significantemente después de la segunda y tercera inyecciones (P < 0.01) . La inyección con el auxiliar de Ribi aumentó el nivel de la IgG en el grupo de dLOS-TT. La mezcla de TT y dLOS produjo un nivel mayor de la IgG que aquél producido por los dLOS-TT. Todos los inmunógenos produjeron bajos niveles de la IgM anti-TT. También se muestran en la Tabla 2 los resultados obtenidos para anticuerpos anti-HMP. El conjugado de dLOS-HMP produjo un bajo nivel de la IgG después de la primera inyección, ese nivel se elevó significantemente después de la segunda y tercera inyecciones (P < 0.01) . El auxiliar de Ribi aumentó los niveles de la IgG en el grupo de dLOS-HMP. La mezcla de HMP y dLOS produjo un nivel mayor de la IgG que aquél de los dLOS-HMP. Todos los inmunógenos produjeron niveles bajos de la IgM anti-HMP.
TABLA 2. Respuesta de anticuerpo del murino a las proteínas
(TT o HMP) producidas por los conjugados
Inmunógeno3 Muestra de Unidades ELISA Sangreb Medio Geométrico (± intervalo de DS) Anti-TT IgG igM dLOS i- TT 1 1(1-2) 1 2 34 (21-54) 1 3 90 (35-237) 2 (1-3)
dLOS-TT 1 14 (6-35) 3 + auxiliar 2 303 (191-481) 11 (7-18 3 2,430 27 (13-56)
dLOS+TT 1 1 (7-18) 1 2 303 (191-481) 1(1-2) 3 729 2 (1-3)
inmunógeno3 Muestra de Unidades ELISA Sangre5 Medio Geométrico ( ± intervalo de DS) Anti - -HMP IgG igM dLOS - HMP 1 1 1 2 2 ( 1 - 8 ) 1 3 11 (3 -43 ) 1 dLOS - HMP 1 4 (2-9) 2(1-6) + auxiliar 2 52 (30-92) 7 (3-17) 3 810 (389-1,685) 11 (7-18)
dLOS + HMP 1 2(1-6) 2 (1-3) 2 377 (149-952) 2(1-3) 3 1,403 (645-3, 051) 10 (7-14)
a De diez a veinte ratones para cada grupo se dieron un total
de tres inyecciones subcutáneas en intervalos de tres
semanas, con 5 µg de LOS, 5 µg de conjugados, 5 µg de
conjugados con el auxiliar de Ribi, LOS, o una mezcla de
'dLOS y TT o HMP (5 µg cada una) . b Se recogieron muestras de sangre: 1) dos semanas después de
la primera inyección; 2) una semana después de la segunda
inyección; y 3) una semana después de la tercera inyección
Ejemplo 5: Inmunogenicidad de los Conjugados de
dLOS-Proteínas en Conejos.
Conejos (dos o tres por grupo) se inyectaron
individualmente dos veces (s.c. e i.m.) en intervalos de
cuatro semanas, con 50 µg/inyección de: LOS, el conjugado
dLOS-TT con o sin auxiliar, el conjugado dLOS-HMP con o sin
auxiliar, o una mezcla de dLOS más TT o HMP (50 µg de cada componente) . Para todas las inyecciones sin auxiliar, el inmunógeno fue en 1 ml de 0.9% de NaCl. Para inyecciones sin auxiliar, el inmunógeno fue en 1 ml de 0.9% de NaCl , que contiene 250 µg del lípido A de monofosforilo y 250 µg de dimicolato de trehalosa (auxiliar Ribi-700, Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) . Dos semanas después de cada inyección, muestras de sangre de 10-20 ml se recogieron de una vena de la oreja, usando procedimientos estándar. Como se muestra por los resultados presentados en la Tabla 3, la mezcla de dLOS, TT y HMP, o LOS produjo niveles bajos de anticuerpos déla IgG anti-LOS o de IgM, después de dos inyecciones. EL conjugado de dLOS-TT produjo una elevación significante de la IgG anti-LOS después de la primera y segunda inyecciones (37 y 700 veces arriba de los sueros de pre-inmunización) . Los dLOS-HMP mostraron niveles menores de la IgG en comparación con los dLOS-TT (6 y 347 veces, respectivamente, arriba de los niveles de los sueros en la pre-inmunización) . El auxiliar Ribi aumentó los niveles de la IgG anti-LOS en ambos grupos conjugados, después de cada inyección (40 a 2,000 veces arriba de los niveles de los sueros en la pre- inmunización) . No hubo diferencia significante entre las respuestas a los dos conjugados después de dos inyecciones. Para la IgM, ambos conjugados produjeron niveles bajos a medianos de los anticuerpos anti-LOS y los conjugados con el auxiliar Ribi produjeron niveles bajos a medios de los anticuerpos anti-LOS después de cada inyección. Tabla 3. Respuesta de anticuerpos del conejo a Moraxella
catarrhalis LOS producá .dos en los conjugados
Inmunógeno3 Muestra de Unidades ELISA Sangreb Medio Geométrico ( ± intervalo de DS) IgG igM LOS 0 6 (3-10) 6 (3-10) 1 10 (3-30) 52 (30-90) 2 52 (30-90) 90
dLOS-TT 0 5 (3-10) 14 (10-30) 1 187 (90-270) 90 2 3, 505 (2,430- 187 (90-187) 7,290)
dLOS-TT 0 10 5 (3-10) + auxiliar 1 810 (270-2,430) 389 (270-810) 2 21,870 270 (90-810)
dLOS-HMP 0 7 (3-10) 10 1 43 (30-90) 30 (10-90) 2 2,430 90 (30-270)
dLOS-HMP 0 10 (3-30) 7 (3-10) + auxiliar 1 389 (30,2,430) 90 (30-270) 2 21, 870 270 (90-810)
dLOS + TT + 0 10 (3-30) 17 (10-30) HMP 1 10 (3-30) 30 2 52 (30-90) 30
Células 0 6(3-10) 10 Enteras 1 270 156(90-270) 2 65,610 49(3-810)
Dos a tres conejos para cada grupo se inmunizaron subcutánea e intramuscularmente en el momento 0) y un mes después con 50 µg de LOS, 50 µg de conjugados, 50 µg de conjugados con el auxiliar Ribi, o una mezcla de dLOS, TT y HMP (50 µg cada uno) . Los sueros de conejos hiper- inmunes contra la M. catarrhalis son los descritos antes. b Se recogieron muestras de sangre en: 0) , antes de la inyección del inmunógeno; 1) , a 14 días después de la primera inyección; : y 2 ) : a los 14 días después de las segundas inyecciones.
Anticuerpos anti-pro eína en conejos. Como se muestra por los datos para anticuerpos anti-TT presentados en la Tabla 4, los dLOS-TT produjeron un nivel significante de la IgG después de dos inyecciones (389 veces arriba del nivel de los sueros en la pre-inmunización) . El auxiliar Ribi mejoró los niveles de la IgG producidos por los dLOS-TT por 4 veces, después de dos inyecciones. La mezcla de TT y dLOS produjo un nivel mayor de la IgG de anti-TT que el conjugado de dLOS-TT, especialmente después de una inyección. Todos los inmunógenos produjeron niveles bajos de la IgM de la anti-TT. Como se muestra en la Tabla 4 para los anticuerpos anti-HMP, los dLOS-HMP produjeron un nivel significante de la IgG después de dos inyecciones (81 veces arriba de los sueros en la pre-inmunización) . La inclusión del auxiliar de Ribi aumentó los niveles de la IgG producidos por dLOS-HMP por cuatro veces, después de dos inyecciones. La mezcla de HMP y dLOS produjo un nivel mayor de la IgG que aquél de los dLOS-HMP, especialmente después de una inyección. Todos los inmunógenos produjeron niveles bajos de la IgM anti-HMP.
TABLA 4. Respuesta del anticuerpo del conejo a las proteínas
(TT o HMP) producidas por los conjugados de dLOS-pro eína
Inmunógeno3 Muestra de Unidades ELISA Sangre Medio Geométrico ( ± intervalo de DS) Anti -TT igG IgM dLOS + TT 0 3 3 1 7 ( (3-10) 10 2 1, 168 (810-2, 430) 14 (10-30)
dLOS-TT 0 5 (3-10) 3 + auxiliar 1 14 (10-30) 14 (10-30) 2 5,055 (2,430- 10 (3-30) 21, 870) dLOS + TT + 0 10 10 HPM 1 270 90 2 2,430 30
Anti- -HMP IgG igM dLOS-HMP 0 10 (3-30) 7(3-10) 1 14 (10-30) 10 2 810 10
dLOS-HMP 0 7 (3-10) 10 (3-30) 1 130 (30-270) 14 (10-30) + auxiliar 2 3, 505 (2,430- 30 7,290) dLOS + TT + 0 10 10 1 156 (90-270) 30 HMP 2 2,430 52 (30-90) Dos a tres conejos para cada grupo se inmunizaron subcutáneamente e intramuscularmente en el momento 9 y un mes después con 50 µg de LOS, 50 µg de conjugados, 50 µg de conjugados con el auxiliar Ribi, o una mezcla de dLOS, • TT y HMP (50 µg cada uno) . Los sueros de conejos hiper- inmunes contra la M. catarrhalis se describieron previamente aquí . b Se recogieron muestras de sangre en: 0) , antes de la inyección del inmunógeno; 1) , a 14 días después de la primera inyección; : y 2) a los 14 días después de las segundas inyecciones. Ejemplo 6: Actividad bactericida de sueros de animales contra las cepas de la M. catarrhalis En este ejemplo, se probó la actividad bactericida
de los sueros de animales, preparados de acuerdo con los Ejemplos 4 y 5, contra la misma cepa de M. catarrhalis desde la cual se han aislado estos LOS (ATCC 25238; "cepa homologa") y contra otras cepas de tipo silvestre de la M. catarrhalis ("cepas heterólogas" ) . Once cepas de tipo silvestre de M. catarrhalis (ATCC Nos. 8176, 8193, 23246, 25238, 25239, 25240, 43617, 43618, 43627, 43628 y 49143) (compradas de American Type Culture Collection, Rockville, MD) , y diez aislados clínicos japoneses (designados MI hasta MÍO) , purificados de pacientes con otitis media o infecciones respiratorias (amablemente suministrados por Goro Mogi, Oíta Medican University, Japón) , se probaron. Se apreciará por los expertos en la materia que cepas adicionales de la M. catarrhalis se pueden aislar fácilmente de las muestras clínicas 'usando técnicas bacteriológicas estándar y probadas similarmente. Para el ensayo bactericida, sueros de conejos, antes y después de la inmunización (después de dos inyecciones) se inactivaron para los componentes de complemento, incubando a 56°C durante 30 minutos. Los sueros inactivados luego se probaron en la actividad bactericida contra las celas de M. catarrhalis usando el ensayo bactericida mediado por complemento, substancialmente como se describió previamente (Gu, X.X., et al., 1996, Infect . Immun. 64:4047-4053), excepto que se usó suero de conejillo de India (dilución 1:1, 20 µl por cavidad) como una fuente del complemento (Sigma, St. Louis, MO) y la placa de reacción se incubó a 37 °C durante 30 minutos, antes de la colocación en placas de agar. La dilución más alta del suero, . que causó más del 50% de mortandad, se expresó como el título bactericida recíproco. En el modelo del ratón, 20% (4 de 20 ratones) de los sueros inmunizado con conjugado o 45% (9 de 20 ratones) de sueros inmunizados (con auxiliar) con conjugados mostraron títulos bajos de la actividad bactericida contra la cepa homologa, después de tres inyecciones de los dLOS-TT o los dLOS-HMP. Como se muestra gráficamente en la Figura 1, en el modelo de conejos, los sueros de animales inmunizados con LOS (o dLOS), no mostraron actividad bactericida contra la cepa homologa de M. catarrhalis (ATCC 25238) . EN contraste, los sueros inmunizados con dLOS-TT, mostraron actividad bactericida con títulos medios de 1:16 (sin auxiliar) y 1:40
(con auxiliar) , y los sueros inmunizados con dLOS-HMP mostraron actividad bactericida con títulos medios de 1:10
(sin auxiliar) y de 1:40 (con auxiliar) . Hubo una correlación entre los niveles de ELISA de la IgG de LOS, y los títulos bactericidas (r = 0.60, P = 0.02) pero no los niveles de la IgM.
La actividad bactericida de los antisueros del conejo producidos por los dLOS-TT formulados con el auxiliar Ribi, se analizaron además usando diez cepas adicionales de tipo silvestre (cepas ATCC) y diez de los aislados clínicos japoneses. Diez de las veinte cepas fueron sensibles al complemento (cepas 23246, 43617, M9) o sensibles al suero (cepas 43627, 43628, 49143, M4 , M8 , MÍO) . Usando las diez cepas restantes, los antisueros del conejo demostraron actividades bactericidas a cuatro ATCC y cinco cepas japonesas en el título medio de 1:15 (1:2 a 1:32) . Una cepa
(ATCC 25240) fue negativa en el ensayo bactericida. La reactividad cruzada mostrada aquí para las actividades bactericidas ilustran que una vacuna protectora contra todas las cepas virulentas de la M. catarrhalis se puede formular de un número, relativamente pequeño, de conjugados obtenidos de los dLOS desde diferentes cepas (Véase la página 21, en el fondo) . Ejemplo 7: Estudio de protección pasiva en el modelo de evacuación pulmonar del ratón Cuarenta ratones se inmunizaron con cualquiera de los antisueros del conejo contra los dLOS-TT o los sueros pre-inmunes, y luego se estimularon con 108 CFU de la cepa 25238 de M. catarrhalis por la cama de aerosol, 18 horas después de la inmunización. Los ratones se sacrificaron a las 3 y 6 horas después del estímulo (Figura 2) . Se recogieron las muestras de pulmones y sangre para el análisis. Los resultados se muestran en la Figura 3. A las tres horas después del estímulo, la cantidad de bacterias en el grupo de vacuna se redujo por el 50%, comparado con el control. Hubo una reducción del 61% en el grupo de vacuna, comparado con el grupo de control, a las 6 horas después del estímulo. Existieron diferencias significantes entre los grupos de control y vacuna en cada punto del tiempo. Los niveles del anticuerpo también se analizaron, los cuales se correlacionaban inversamente con la CFU bacterial. Estos resultados indican que el anticuerpo inducido por el conjugado de dLOS-TT, aumentó la evacuación pulmonar de M. catarrhalis en los ratones. Ejemplo 8: Inmunización de humanos con el conjugado de dLOS-proteína de M. catarrhalis. Inicialmente, se seleccionaron adultos para probar la seguridad y la inmunogenicidad de los conjugados de dLOS-portador, preparados como se describió en los Ejemplos 1 y 2, o los conjugados de OS-portador, preparados como se describió en los Ejemplos 9-11. Se clasificaron individuos para los niveles relativamente bajos del anticuerpo endógeno (por ejemplo, que resulta de infecciones de la niñez con la M. catarrhalis) y adultos con niveles relativamente bajos, comparados con la población general, se escogieron para el estudio. Estos individuos se inyectaron intramuscularmente con cualquiera de el conjugado de dLOS-TT, el conjugado de dLOS-HMP, el conjugado de OS-TT o el conjugado de OS-HMP (25 µg a 50 µg, dependiendo del peso corpóreo) en un portador aceptable farmacéuticamente. Para adultos, una inyección es generalmente suficiente para producir la respuesta del anticuerpo dentro de tres días a dos semanas. La inmunogenicidad y la actividad bactericida de los antisueros resultantes se determinaron usando los métodos substancialmente como se describieron en los Ejemplos 4 a 6. Una segunda inyección se administró aproximadamente uno a seis meses después de la primera inyección, y el nivel de los anticuerpos anti- M. catarrhalis del suero se midió una semana después . Los individuos de control se inyectaron con una vacuna de control de la misma cantidad del componente de proteína correspondiente del conjugado (solo) en el mismo portador aceptable farmacéuticamente y con el mismo programa de inyección como para los adultos inmunizados. Para individuos que recibieron los conjugados de dLOS- u OS y portador, los niveles del anticuerpo del suero, después de la inmunización, mostraron que los conjugados son inmunogénicos in vivo sin producir efectos secundarios inaceptables. La actividad bactericida se asocia con los anticuerpos del suero de estos individuos. Para algunos individuos, las inmunizaciones múltiples se prefieren para lograr la respuesta óptica de anticuerpos. En contraste, el suero obtenido de los individuos de control, que recibieron inyecciones de control, exhibieron una inmunogenicidad que no se pudo medir, o una actividad bactericida anti- M. catarrhalis arriba de la encontrada en sus sueros antes de la inyección. Es decir, los antisueros de adultos que recibieron los conjugados de dLOS-TT, dLOS-HMP, OS-TT u OS-HMP, exhibieron significantemente mayor inmunogenicidad o actividad bactericida anti- . catarrhalis comparada con el grupo de control. Igualmente, la frecuencia de la ocurrencia de las infecciones del oído medio en los individuos se vigiló sobre varios años y ninguno de los adultos inmunizados con los conjugados de dLOS-TT, dLOS-HMP, OS-TT u OS-HMP, experimentó una infección del oído medio durante ese tiempo . Con base en los resultados de antisuero obtenidos en los adultos, la prueba de la vacuna se extendió a niños que recibieron una dosis inicial de la vacuna i.m (cantidades basadas en el cuerpo corpóreo, generalmente de 10 a 40 µg) con dos a cuatro meses de edad, y dos vacunas de refuerzo a los dos y cuatro meses después de la vacuna inicial. Un grupo de niños recibió tres vacunas de refuerzo, administradas en dos, cuatro y diez y seis meses después de la vacuna inicial. Niños con la misma edad, que no recibieron la vacuna, se usaron como los sujetos de control. Los anticuerpos del suero se vigilaron en los niños inmunizados y se detectaron como se describió antes, que indica tanto la inmunogenicidad como la actividad bactericida. Los niños se vigilaron en la otitis media y la sinusitis después de la primera vacuna hasta aproximadamente los cuatro años de edad. Los niños que recibieron las vacunas tenían significantemente menores episodios de otitis media y sinusitis, y síntomas disminuidos cuando se detectó la otitis media y/o sinusitis, durante el período de vigilancia, en comparación con los sujetos de control.
Ejemplo 9: Hidrólisis de ácido de LOS de la cepa 25238 de Af. catarrüalig para producir el ol gosacárido (OS) Estos LOS de la M. catarrhalis se destoxificaron por el tratamiento con ácido moderado de LOS para desdoblar la porción del lípido A desde la molécula LOS en el enlace de Kdo-glucosamina (es decir, el método de Gu, X.X & C.M. Tsai, 1993, Infect, Immun. 61:1873-1880) para producir el oligosacárido (OS) . EN breve, 421 mg de LOS se disolvieron en agua destilada a 10 mg/ml, luego se hidrolizaron en ácido acético al 1% durante 2 a 3 horas. La porción del lípido A y el LOS no hidrolizados se removieron por centrifugación a 150,000 x g durante 3 horas. El sobrenadante se congeló y secó, se disolvió en un pequeño volumen de agua, se separó en dos, y cada uno se aplicó a una columna Sephadex G-25 (1.6 x 90 cm) equilibrada con 25 mM de acetato de amonio. El eluato se ensayó en el contenido de azúcar, y las fracciones principales del OS se agruparon y liofilizaron tres veces para remover la sal . El rendimiento del OS desde el LOS de partida fue del 47% en peso. Ejemplo 10: Derivatización de OS con ADH Se acopló ADH al OS por la condensación mediada por carbodiimida, con EDC y sulfo-NHS, como se describió previamente (Gu, et al., 1993, supra . ) La mezcla de reacción se purificó con una columna de Bio-Gel P-4 (1.6 x 90 cm; Bio-Rad, Hercules, CA) . El eluato se ensayó para el contenido de azúcar y AH. Las crestas que contienen tanto el azúcar como el AH se agruparon y liofilizaron tres veces para remover la sal. Las relaciones del OS al ADH fueron de alrededor de 1. El rendimiento del azúcar en el derivado de AH-OS fue de alrededor del 74%. Ejemplo 11: Conjugación de AH-OS a proteínas La reacción de acoplamiento se realizó a un pH de
.2 ± 0.2, con 0.05 -0.1 M de EDC. Para la reacción de OS-TT, 30 mg de AH-OS se disolvieron en 3 ml de agua destilada y se mezclaron con 15 mg de TT (5.90 mg/ml) . Para la reacción de OS-HMP, 20 mg de AH-OS se disolvieron en 2ml de agua y se mezclaron con 8.4 mg de HMP (4.2 mg/ml) . La relación molar del AH-OS al TT o HMP fue de 150 ó 141 (con base en los pesos moleculares: OS como 2,000, TT como 150,000 y HMP como 120,000). Las etapas de purificación fueron las mismas como para los conjugados de dLOS-proteína descritos en el Ejemplo 2. Estos conjugados de OS-proteína tienen la misma utilidad como los conjugados de dLOS-proteína discutidos anteriormente, es decir como una vacuna para las infecciones de Moraxella (Branhamella) catarrhalis en humanos. La composición, rendimiento y antigenicidad de los conjugados OS-TT y OS-HMP se muestran en la Tabla 5.
Tabla 5. Composición, rendimiento y antigenicidad de los
conjugados OS
Conjuqado Amt (µ/ml) de Reí. molar3 Rendimiento b £ ?3405 £ OS/proteína (%) (S uero Hip inmune OS Proteína OS-TT1 23 157 11 2 . 4 1 . 1
0D -TT2 43 152 21 6 . 1 0 . 6
OS -HMP1 47 182 16 8 . 8 2 . 0
OS -HMP2 32 112 17 4 . 5 1 . 4
La relación se expresó como moles de OS por mol de proteína, con pesos moleculares de 2,000 para dLOS,
150 000 para TT y 120,000 para HMP. Basado en la cantidad de partida del OS y el OS contenido en los conjugados, según se mide por un método de micro fenil-ácido sulfúrico. La antigenicidad de los conjugados se expresó como la
. reeaCtividad ELISA a A405, cuando los conjugados se usan como antígenos de recubrimiento (10 µg/ml) y el suero hiper-inmune del conejo se usó como un anticuerpo de unión (1/8,000) . El LOS (10 µg/ml) también mostró un valor A405 de 1.1 bajo las mismas condiciones.
Los conjugados de OS-proteína produjeron respuestas de anticuerpos tanto en los ratones como los conejos contra estos LOS. Los conjugados de proteína también produjeron anticuerpos contra TT y HMP en tanto ratones como conejos. La respuesta de anticuerpo del murino a LOS de la cepa 25238 de M. catarrhalis producida por los conjugados, se muestra en la Tabla 6. Ratones hembra (NIH/Swiss), 10 por grupo, se inyectaron s.c. con 5 µg (con base en el carbohidrato) de OS-TT, OS-HMP, LOS o una mezcla de OS más TT y HMP (5 µg de proteína) en 0.2 ml de NaCl al 0.9%, con o sin un auxiliar. El auxiliar usado fue el mismo como para la respuesta del anticuerpo de dLOS. Las inyecciones se dieron tres veces en intervalos de tres semanas, y los ratones se sangraron catorce días después de la primera inyección y siete días después de la segunda y tercera inyecciones. Los niveles anti-LOS del suero se expresaron como unidades ELISA (EU) , usando el LOS aislado de la cepa 25238 como un antígeno de recubrimiento. Como una referencia, el suero hiper-inmune a las células enteras de la cepa 25238 se usó y los valores asignados de 65,000 EU/ml, para la IgG y de 800 EU/ml para la IgM. Los anticuerpos del suero contra TT o HMP se midieron por ELISA, como se describió para los conjugados de dLOS. Para el análisis estadístico de estos resultados, los niveles de anticuerpos se expresaron como las unidades ELISA medias geométricas o títulos (recíprocos) de n observaciones independientes ± la desviación estándar o el intervalo (n < 4) . La significancia se probó con la prueba' t de dos costados y los valores P menores de 0.05 se consideraron significantes. Como se muestra por los datos en la Tabla 6, la mezcla no conjugada de OS, TT y HMP no produjeron anticuerpos anti-LOS. Ambos conjugados produjeron niveles bajos de la IgG anti-LOS después de la segunda, pero no la primera inyección; y hubo un leve aumento después de las terceras inyecciones (P < 0.01). Tanto OS-TT como OS-HMP produjeron niveles similares de la IgG anti-LOS después de tres inyecciones. Estos LOS solos y los conjugados produjeron niveles similares de la IgG anti-LOS después de dos inyecciones; sin embargo, el LOS solo produjo un aumento significantemente mayor después de la tercera inyección en comparación con los conjugados. La formulación de ambos conjugados con el auxiliar aumentó significantemente su
inmunogenicidad.
TABLA 6. Respuesta de anticuerpos del murino al LOS de la
cepa 25238 de M. catarrhalis producida por loa conjugados
Inmunógeno3 Inyección No. Unidades ELISA Medio Geométrico (± intervalo de DS)b para IgG igM O-TTl 1 1 1 2 6(1-30) 2 (1-3) 3 4 (1-35) 5 (1-46)
0S-TT1 1 2(1-3) 3(1-9) + auxiliar 2 4(1-22) 3- (1-9) 3 7 (1-48) 50 (12-209)
0S-TT2 1 1 1(1-6) 2 1 4 (1-4) 3 8 (1-70) 7 (2-28)
0S-TT2 1 1(1-2) 2 (1-5) + auxiliar 2 34 (5-249) 19 (6-62) 3 113 (13-957) 126 (39-409)
OS-HMP1 1 1 1 2 (2 (1-4) 2(1-5) 3 (1-72) 4 (1-40)
0S-HMP1 1 1 (1-2) 2(1-9) 2 2 3 (1-9) + auxiliar 90 (5-1,585) 81 (26-257)
OS-HMP2 1 1 2 1 (1-2) 4 (1-15) 3 3 (1-13) 7(2-25)
OS-HMP2 1 1 7 (2-25) + auxiliar 2 6(1-26) 34 (12-92) 3 38 (8-176) 195 (46-828)
OS+TT+HPM 1 1 1 2 1 1 3 1(1-2) 3(2-5)
LOS 1 1 3 (1-9) 2 8 (2-40) 2 (1-4) 3 113 (20-630) 52 (12-230)
Diez ratones para cada grupo se dieron un total de tres inyecciones subcutáneas en intervalos de 3 semanas, con 5 µg de conjugados, conjugados con el auxiliar Ribi, LOS, o la mezcla de OS, TT y HMP (5 µg cada uno) . Muestras de sangre se recogieron 2 semanas después de la primera inyección, 1 semana después de la 2a y 3a inyecciones. b Las unidades ELISA se basan en el suero de referencia contra la cepa 25238 y LOS de la cepa 25238 se usaron como un antígeno de recubrimiento. Los sueros de inmunización previa contenían 1(1-2) U de la IgG y 1 U de la IgM.
La respuesta del anticuerpo del murino a la TT producida por los conjugados OS-TT se muestra en la Tabla 7. La respuesta del anticuerpo de la IgG fue mucho más fuerte que la respuesta del anticuerpo de la IgM. El auxiliar aumenta significantemente la respuesta inmunológica para 0S-TT2 , pero no tiene un efecto drástico para 0S-TT1.
TABLA 7. Repuesta del anticuerpo del murino a la TT producida por el conjugad Lo de OS-TT
inmunógeno3 Inyección No Unidades ELISA Medio Geométrico (± intervalo de DS)b para igG igM OS-TTl 1 2 (1-3) 1 2 22 (7-72) 1 3 90 (34-237) 1
OS-TTl 1 4(1-9) 4(2-6) + auxiliar 2 126 (69-229) 5(3-9) 3 90,(64-128) 22 (9-51)
OS-TT2 1 95 (33-269) 2 (1-3) 2 52 (9-296) 2(1-4) 3 140 (12-1,614) 5(2-11) 0S-TT2 1 113 (66-191) 3(1-5) + auxiliar 2 271 (81-908) 19(9-42) 3 1,756(454-6,769; 90 (48-169) OS+TT+HMP 1 14 (8-25) 1(1-2) 2 470 (257-851) 2 (1-6) 3 908 (332-2,487) 14 (5-40)
a Véase la Tabla 6, nota de pie a.
b Las unidades ELISA se basan en un suero de referencia
contra TT, y la TT se usó como un antígeno de recubrimiento.
Los sueros pre- inmunes mostraron <1 unidad de IgG o la IgM.
La respuesta del anticuerpo del murino a la HMP producida por los conjugados de OS-HMP, se muestra en la
Tabla 8. Como para la respuesta de anticuerpos de la TT, los
niveles de la IgG aumentaron significantemente mientras los
niveles de la IgM permanecieron bajos. La presencia del
auxiliar aumentó drásticamente la respuesta del anticuerpo
dé la IgG, mucho más que para la respuesta del anticuerpo de
la TT, mostrada en la Tabla 7.
TABLA 8. Respuesta del anticuerpo del murino para la HMP
producida por los conjugados de OS-HMP
Inmunógeno3 Inyección No Unidades ELISA Medio Geométrico (± intervalo de DS)bpara IgG IgM OS-HMP1 1 3 1(1-2) 2 65 (40 -105) 14 (5-37) 3 183 (83-398) 8 (3-21)
OS-HMP1 1 9 (2-34) 2(1-) + auxiliar 2 585 (330-1,442) 5 (3-8) 3 1,506(507-4, ,464) 6(3-23)
0S-HMP1 1 9 (4-19) 2(2-5) 2 81 (39-168) 4 (2-12) 3 175(34-902) 2(1-6)
OS-HMP2 1 81 (45-146) 6 (3-14) + auxiliar 2 1, 131 (642-1, 997) 17 (8-38) 3 4,228 (2, 500- 38 (12-120) 7,454) OS+TT+HMP 1 2 (1-4) 1 2 470 (257-851) 3 3 1.573 (752-3,281) 34 (11-104)
Véase la Tabla 6 para la nota de pie a. Las unidades ELISA se basan en un suero de referencia contra la HMP, y se usó esta HMP como un antígeno de recubrimiento. Los sueros pre-inmune mostraron 1 a 3 unidades de a IgG o la IgM.
Las respuestas del anticuerpo del conejo a estos LOS de M catarrhalis producidas por los conjugados se muestran en la Tabla 9, y la respuesta de anticuerpo del conejo a la TT o HMP, producida por los conjugados, se muestra en la Tabla 10. TABLA 9. Respuesta del anticuerpo del conejo a LOS de Af. catarrJialis producida por el conjugado.
Inmunógeno3 Inyección No Unidades ELISA Medio Geométrico (± intervalodeDS)bpara IgG igM OS-TT2 0 22 (3-90) 7 (3-30) 1 140 (30-810) 52 (30-90) 2 7,290 (2,430- 68 (30-90) 21, 870) OS-TT2+Ribi 0 4 (3-10) 10 (3-30) 1 729 (270-2,430) 156 (90-270) 2 12, 627 (7,290- 90 21,870) OS-HMP2 0 17 (10-30) 7(3-30) 1 467 (90-2,430) 10 (3-30) 2 7,290 (2,430- 90 (30-270) 21,870) OS-HMP2+Ribi 0 9 (3-30) 7 (3-30) 1 810 30 (10-90) 2 12,627 (7,290- 118 (90-270) 21, 870) OS+TT+HMP 0 5 (3-10) 17 (10.30) 1 5 (3-10) 5 (3-10) 2 38 (3-90) 17 (10.30)
LOS 0 6(3-10) 6 (3-10) 1 10 (3-30) 52 (30-90) 2 52 (30-90) 90
? Dos a tres conejos para cada grupo se inmunizaron subcutánea e intramuscularmente dos veces en intervalos de un mes con 50 µg de conjugados, los conjugados con el auxiliar Ribi, LOS o una mezcla de OS, TT y HMP (50 µg cada uno) . Las muestras de sangre se recogieron antes y 14 días después de cada inyección. b Véase la Tabla 6 para la nota de pie b.
TABLA 10- Respuesta de anticuerpo del conejo para la protßína (T o HMP) producida por los conjugados Inmunógeno3 Inyección No Unidades ELISA Medio Geométrico (+ intervalo de DS)bpara
Para ensayo de anti-TT IgG IgM
OS-TT2 0 10 10 1 270 17 (10-30) 2 4,209 (2,430- 118 (90-270) 7,290) OS-TT2+Ribi 0 17 (10-30) 10 1 2,430 90 2 21.870 355 (90-810)
OS+TT+HMP 0 30 17 (10-30) 1 468 (270-810) 155 (90-270) 2 2,430 90
Para ensayo de anti--HMP OS-HMP-2 0 52 (30-90) 17 (10-30) 1 118 (90-270) 30 2 2,430 52 (30-90)
OS-HMP2+Ribi 0 30 17 (10-30) 1 468 (270-810) 30 2 7,290 30
OS+TT+HMP 0 52 (30-90) 17 (10-30) 1 270 30 2 2,430 52 (30-90) a Véase la Tabla 9 para la nota de pie a. b Véase las Tablas 7 y 8 para las notas de pie b.
En ratones, ninguno de los sueros inmunizados con el conjugado de la proteína OS y 40% (8 de 20 ratones) de sueros inmunizados con conjugado (y auxiliar) , mostraron actividad bactericida contra la cepa 25238 homologa de M. catarrhalis en el intervalo de 1:8 hasta 1:64, después de tres inyecciones de OS-TT u OS-HMP. En conejos, 37.5% (3 de 8 conejos) de los sueros inmunizados con conjugado mostraron actividad bactericida contra la cepa 25238 homologa en el intervalo de 1:2 hasta 1:8, después de dos inyecciones de OS-TT u OS-TT con auxiliar.
Mientras se han descrito en detalle modalidades particulares de la invención, será evidente a los expertos en la materia que estas modalidades son ejemplares más bien que limitativas, y el alcance verdadero de la invención se define por las reivindicaciones que siguen.
Claims (38)
1. Una vacuna conjugada para la bacteria Moraxella ratarrhalis, que comprende un lipooligosacárido (LOS) aislado de la M. catarrhalis y destoxificado por el tratamiento para remover los ácidos grasos esterificados y producir el LOS destoxificado (dLOS) , o por el tratamiento para remover el lípido A y producir un oligosacárido (OS) , y un portador inmunogénico, enlazado covalentemente al mismo.
2. La vacuna de la reivindicación 1, en que el portador inmunogénico es una proteína.
3. La vacuna de la reivindicación 2, en que la proteína del portador inmunogénico se selecciona del grupo que consta de la proteína UspA aislada de la M. catarrhalis, la proteína CD aislada de la M. catarrhalis, la toxina/toxoide del tétano, una proteína de alto peso molecular (HMP) aislada de la Haemophilus influenzae, sin tipo, la toxina/toxoide de la difteria, la toxina A de la P-aeruginosa destoxificada, la toxina/toxoide del cólera, la toxina/toxoide de pertussis, la endotoxinas/toxoides de Clostridium perfringens, el antígeno superficial de la hepatitis B, el antígeno del núcleo de la hepatitis B, la proteína del rotavirus VP 7, CRM, CRM197, CRM3201 y la proteína del virus F y G sincitial respiratorio.
4. La vacuna de la reivindicación 3 , en que la proteína portadora inmunogénica es el toxoide del tétano o la HMP.
5. Una composición farmacéutica, que comprende el conjugado de vacuna de la reivindicación 1, en un portador aceptable farmacéuticamente.
6. La composición farmacéutica de la reivindicación 5, que además comprende un auxiliar.
7 La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en que el auxiliar es una mezcla del lípido A del monofosforilo y el dimicolato de trehalosa o el alumbre .
Una vacuna conjugada, de acuerdo con la reivindicación 1, en que el portador inmunogénico se enlaza covalentemente al dLOS o al OS, por medio de un compuesto entrelazador .
9. La vacuna conjugada de la reivindicación 8, en que el compuesto enlazador se selecciona del grupo que consta de la dihidrazida del ácido adípico, el ácido e-aminohexanóico, el clorohexanol-dimetil-acetal, la D-glucuronolactona y la p-nitrofeniletil -amina.
10. La vacuna conjugada de la reivindicación 8, en que el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico.
11. El lipooligosacárido aislado de la Moraxella catarrhalis y destoxificado por la remoción de los ácidos grasos enlazados al éster del mismo.
12. El lipooligosacárido de la reivindicación 11, en que la Moraxella catarrhalis desde la cual es aislado este lipooligosacárido, es una cepa purificada de esta Moraxell a ca tarrhal i s .
13. El lipooligosacárido aislado de la Moraxella catarrhalis y destoxificado por la remoción del lípido A del mismo .
14. Un método para prevenir la otitis media, causada por la infección con la Moraxella catarrhalis en un mamífero, este método comprende administrar al mamífero una cantidad inmunoprotectora efectiva de una vacuna conjugada, que comprende un lipooligosacárido destoxificado (dLOS) o un oligosacárido (OS) derivado de un lipooligosacárido aislado, obtenido de la M. catarrhalis y un portador inmunogénico, enlazado covalentemente al dLOS.
15. El método de la reivindicación 14, en que el mamífero es un humano.
16. El método de la reivindicación 14, en que la vacuna conjugada se administra parenteralmente.
17. El método de la reivindicación 16, en que la vacuna conjugada se administra por inyección intramuscular, inyección subcutánea o por el depósito en la membrana mucosal intranasal, o sus combinaciones.
18. El método de lar reivindicación 14, en que la cantidad inmunoprotectora efectiva está entre 10 y 50 µg por dosis, aproximadamente.
19. El método de la reivindicación 14, que además comprende inyecciones de refuerzo entre 10 y 25 µg, aproximadamente, del conjugado.
20. El método de la reivindicación 14, en que la etapa de administración comprende administrar una primera dosis de 1 a 50 µg, aproximadamente, de la vacuna conjugada, y. luego administrar una segunda dosis de 10 a 25 µg, aproximadamente, de esta vacuna conjugada, en alrededor de dos meses después de la primera dosis, administrar una tercera dosis de 10 a 25 µg, aproximadamente, de la vacuna conjugada en alrededor de 2 meses después de la segunda dosis, y administrar una cuarta dosis de 10 a 25 µg, aproximadamente, de la vacuna conjugada, alrededor de 12 meses después de la tercera dosis.
21. Un método para destoxificar un lipooligosaárido (LOS) , aislado de la Moraxella catarrhalis , que comprende remover los ácidos grasos enlazados al éster de el LOS aislado.
22. El método de la reivindicación 21, en que los ácidos grasos enlazados al éster se remueven por el tratamiento del LOS con la hidracina o un reactivo alcalino moderado .
23. Un método para obtener una vacuna conjugada contra la Moraxella catarrhalis, este método comprende: remover los ácidos grasos enlazados al éster del lipooligosacárido (LOS) , aislado de la M. catarrhalis, para producir el LOS destoxificado (dLOS) ; y enlazar covalentemente el dLOS a un portador inmunogénico.
24. El método de la reivindicación 23, en que la etapa de remoción comprende tratar el LOS con la hidracida o un reactivo alcalino moderado.
25. El método de la reivindicación 23, en que la etapa de enlazamiento comprende unir el dLOS a un compuesto enlazador y adjuntar este compuesto enlazador a un portador inmunogénico .
26. El método de la reivindicación 25, en que el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico, el acido e-aminohexanóico, el clorohexanol -dimetil -acetal, la D-glucurolactona o la p-nitrofeniletil-amina.
27. El método de la reivindicación 25, en que el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico.
28. El método de la reivindicación 23, que además comprende agregar un auxiliar al dLOS enlazado a un portador inmunogénico .
29. Un método para obtener una vacuna conjugada contra la Moraxella catarrhalis, este método comprende: remover el lípido A del lipooligosacárido (LOS) aislado de la M. catarrhalis, para producir un oligosacárido (OS) ; y enlazar covalentemente el OS a un portador inmunogénico.
30. El método de la reivindicación 29, en que la etapa de remoción comprende tratar elLOS con un reactivo ácido.
31. El método de la reivindicación 29, en que la etapa enlazadora comprende adjuntar el OS a un compuesto enlazador y adjuntar este compuesto enlazador al portador inmunogénico .
32. El método de la reivindicación 31, en que el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico, el ácido e-aminohexanóico, el clorohexanol -dimetil -acetal, la D-glucuronolactona o la p-nitrofeniletil-amina.
33. El método de la reivindicación 32, en que el compuesto enlazador es la dihidrazida del ácido adípico.
34. El método de la reivindicación 29, que además comprende agregar un auxiliar al OS enlazado a un portador inmunogénico.
35. Un vacuna conjugada, que comprende un lipooligosacárido (LOS) aislado de la bacteria Moraxella catarrhalis y destoxificado por el tratamiento para remover los ácidos grasos esterificados y producir un LOS destoxificado (dLOS) , o por el tratamiento para remover el lípido A, para producir un oligosacárido (OS) , y un portador inmunogénico, enlazado covalentemente ahí, para su uso en impedir la otitis media causada por la infección con la Moraxella catarrhalis en un mamífero.
36. La vacuna de la reivindicación 35, en que el portador inmunogénico es una proteína.
37. La vacuna de la reivindicación 36, en que la proteína portadora inmunogénica se selecciona del grupo que consta de la UspA, aislada de la Moraxella catarrhalis, la CD aislada de la Moraxella catarrhalis, la toxina/toxoide del tétano, una proteína de alto peso molecular (HMP) , aislada de la Haemophilus influenzae sin tipo, la toxina/toxoide de la difteria, la toxina A de la P. aeruginosa destoxificada, la toxina/toxoide del cólera, la toxina/toxoide de pertussis, las endotoxinas/toxoides de la Clostridium perf ring ens , el antígeno superficial de la hepati tis B, el antígeno del núcleo de la hepati tis B, la proteína del rotavirus VP 7 , CRM, CRM197 CRM3201, y la proteína del virus F y G sincitial respiratorio.
38. La vacuna de la reivindicación 37, en que la proteína portadora inmunogénica es el toxoide del tétano o la proteína HMP.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| US60/071,483 | 1998-01-13 |
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