MXPA00005780A - Estimulacion de la respuesta inmunologica mediante manipulacion de celula dendritica humana - Google Patents

Abstract

Un método para preparar células dendríticas humanas que contienen antígenos, que consiste en someter las células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antégeno, a fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno. Adicionalmente, se expone un método para producir lifocitos T auxiliares CD8+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD4+, humanos, específicos para antígenos, mediante la incubación de los linfocitos T humanos con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno producidas por el método expuesto, bajo condiciones que promuevan la generación de linfocitos T específicos para antígenos, con especificidad al antígeno con el cual las células dendríticas fueron sometidas a pulsos. También se revela el uso de las células dendríticas pulsadas con antígeno en la inmunoterapia y en la vacunación profiláctica. Adicionalmente se revela el uso de linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ de tipo humano, específicos para antígeno, estimulados, para la inmunoterapia adoptiva y para la vacunación profiláctica. Se describen también composiciones que contienen linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, de tipo humano, específicos para antígenos y/o células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, producidas por los métodos de la present invención. Los métodos y composiciones de la presente invención. Los métodos y composiciones de la presente invención . Los métodos y composiciones de la presente son particularmenteútiles para estimular la respuesta inmunitaria contra las oncoproteínas E7 o E6 de longitud completa del papilomavirus humano (HPV) que han sido asociadas con cáncer cervical humano.

Description

ESTIMULACIÓN DE LA RESPUESTA INMUNOLOGICA MEDIANTE MANIPULACIÓN DE CÉLULA DENDRITICA HUMANA ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de los Estados Unidos No. de Serie 60/147,263 titulada "Genetically Altered Dendritic Cells Transduced with Adeno-Associated Virus (AAV) , Methods of Producing Genetically Altered Dendritic Cells and Uses Thereof," presentada el 5 de agosto de 1999, que se incorpora aquí como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método para estimular o activar la respuesta inmunológica humana mediante la administración de células dendríticas (DC-por sus siglas en inglés) humanas manipuladas o linfocitos T humanos también referidos como células T, cebados con estas DC manipuladas, como una terapia para un paciente afligido con una enfermedad para la cual se conozca un antígeno asociado con la enfermedad o bien éste pueda prepararse, o alternativamente como profilaxis para un sujeto normal contra una enfermedad para la cual se conoce un antígeno asociado a la enfermedad y para la cual puede elaborarse una preparación que contenga al antígeno. Esta invención está dirigida además a métodos para elaborar las DC humanas manipuladas y los linfocitos T humanos cebados con estas DC manipuladas y a los usos in vi tro de estas células, para estudiar la estimulación de la respuesta inmunitaria . La presente invención está también dirigida a la pulsación o incubación de DCs humanas con liposomas catiónicos que contienen un antígeno que está asociado con una enfermedad o que es específico para una enfermedad, por ejemplo un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico para un tumor. La presente invención es útil para preparar liposomas catiónicos que contienen proteínas de longitud completa, péptidos, péptidos eluidos con ácido de la célula del tumor y usados de tejidos o células de tumor que se utilizan en la pulsación de células dendríticas, de manera que las células dendríticas cumplan su función como una célula presentadora de antígeno (APC-por sus siglas en inglés) y en esta forma estimula en el sistema inmunológico del sujeto o del paciente. Las preparaciones de péptido eluido con ácido de la célula de tumor y de antígeno de lisado del tejido o de la célula de tumor son útiles para preparar células dendríticas (DC) pulsadas, para el tratamiento y para el estudio de la respuesta inmunitaria ante tumores que surgen espontáneamente y que no están asociados con oncoproteínas conocidas ni son específicos para oncoproteínas conocidas. Los estudios desarrollados por varios grupos han establecido recientemente el papel clave desarrollado por las células dendríticas (DC) en el sistema inmunológico y proporcionan una justificación del uso de las DC como adyuvantes naturales para la inmunoterapia humana (45) . Las DC son las APC más efectivas para la activación de las células T sencillas (45,51) y recientemente la combinación de GM-CSF e IL-4 ha mostrado generar un gran número de DCs para manipular la respuesta inmunológica de las células T humanas autólogas (44) . La infección con papilomavirus humano (HPV-por sus siglas en inglés) representa el factor de riesgo más importante para el desarrollo de cáncer cervical. Aunque hay más de 20 genotipos de HPV oncogénicos, el HPV 16 y el HPV 18 son los más prevalentes en los diferentes tipos de cáncer cervical, sin importar el origen geográfico (11) .

Las oncoproteínas transformantes E6 y E7 de estos dos virus se detectan en la vasta mayoría de las biopsias de cáncer HPV-positivas y casi todas las líneas celulares que contienen HPV y desempeñan un papel crucial en ambas transformaciones y el mantenimiento del genotipo maligno (12) . Por lo tanto, E6 y E7 son candidatos ideales, como blancos potenciales específicos del tumor para inmunoterapia de cáncer cervical . Varias líneas de pruebas sugieren que las respuestas inmunitarias mediadas con células son importantes para controlar las infecciones con HPV y los neoplasmas asociados con HPV. Primero, hay una mayor incidencia de cáncer genital asociado en pacientes inmunosuprimidos mientras que solamente una minoría de las infecciones HPV genitales originan el desarrollo de cáncer en individuos que de otra manera son sanos (41,39,32) . En segundo lugar, la infiltración de CD4+ (células T inductoras/auxiliares) y CD8+ (células T citotóxicas/supresoras) , se han observado células T en verrugas asociadas con HPV, de regresión espontánea. En tercer lugar, los estudios en animales han demostrado que los animales inmunizados están protegidos de las infecciones con papilomavirus y de las células de tumor transplantadas que expresan proteínas virales E6/E7 de HPV (14,30,15) . A pesar de estas observaciones, a la fecha, sólo unos cuantos reportes han demostrado la generación de CTLs (linfocitos T citotóxicos) específicos de E6 y E7 de HPV en pacientes con cáncer cervical, sugiriendo que estos precursores CTL pueden estar presentes a niveles muy bajos (1,19,36) . Sin embargo, se sabe que los blancos infectados naturalmente con HPV (por ejemplo queratinocitos) expresan bajos niveles de proteínas virales (46,22) y elementos de restricción MHC (17,24) así como la falta de moléculas de coestimulación cruciales para el cebado (35) de la célula T simple. Por lo tanto, la presentación de antígenos virales mediante estas células presentadoras de antígeno (APC) no profesionales pudiera, por lo menos parcialmente, explicar la capacidad del HPV para evadir al sistema inmunológico del hospedero (35) . En forma consistente con esta hipótesis, la tolerancia o capacidad de hiporrespuesta se ha reportado previamente después de la presentación de antígenos "no propios" por queratinocitos (31,35,5) . Hasta hace poco, se habían emitido algunos reportes de las respuestas CTL especificas para HPV en humanos. La mayoría de los CTL específicos para HPV se han documentado en ratones, en donde el HPV no es un patógeno natural (14,30,15,18) . Esto ha conducido a la sugerencia de que HPV fue coadaptado al hospedero humano evadiendo el sistema inmunológico (9) . Sin embargo, las células epiteliales infectadas con HPV podían ser incapaces de generar de manera efectiva respuestas con CTL, no debido a la falta de precursores CTL específicos sino porque estos no presentan los niveles adecuados de péptidos antigénicos en asociación con las moléculas HLA Clase I y no expresan moléculas coestimulatorias necesarias para el cebado de las células T simples (31,35,5) . En concordancia con esta hipótesis, los CTLs específicos de HPV que reconocen oncoproteínas de HPV se han generado recientemente de la sangre periférica de los pacientes con cáncer cervical utilizando un planteamiento de epítope a base de péptido (1,19,10,42) . Desafortunadamente, las respuestas citotóxicas contra las células de tumor autólogas infectadas por HPV natural no fueron probadas en estos estudios. En este aspecto, los reportes previos han emitido advertencias contra el uso exclusivo de líneas celulares acopladas con HLA, parcialmente alogénicas (19,28) o de líneas celulares sometidas in vi tro a transducción/pulsos (13,2,3) como un medio para demostrar confiablemente la lisis específica de blancos que expresan antígenos edógenamente . En efecto, las líneas celulares CTL generadas por la estimulación primaria in vi tro en altas concentraciones de péptido normalmente no son capaces de lisar los blancos que expresan antígenos endógenos (9,13,2,3) . Los solicitantes han sido los primeros en preparar y utilizar células dendríticas DCs humanas sometidas a pulsos con la oncoproteína E7 de HPV 16 ó 18, de longitud completa, para incluir una respuesta a la célula T específica de E7 de HPV en los pacientes con cáncer cervical positivo para HPV 16 ó 18. El uso de un sistema completamente autólogo hace que la generación in vi tro de las respuestas proliferativas específicas para E7 sea demostrada por los linfocitos CD4+ autólogos y también la inducción in vi tro de CTLs CD8+ restringidos por la HLA Clase I contra tumores cervicales autólogos, infectados naturalmente con HPV 16 ó 18, en 3 pacientes con cáncer cervical invasivo. No sólo las DCs y los linfocitos T del sujeto son autólogos sino que también el tumor, la fuente del antígeno, es autólogo. Además, el uso del análisis citométrico de flujo de dos colores en la expresión de citocina intracelular al nivel de célula simple muestra que puede inducirse un patrón de secreción de citocina de tipo 1, fuertemente polarizado, en las poblaciones CD4+ y CD8+ cebadas con E7, de los tres pacientes. Estos resultados son prueba de que los linfocitos autólogos específicos E7 de HPV 16 y 18 restringidos por clase I y clase II pueden ser inducidos consistentemente en pacientes de cáncer cervical, in vi tro, utilizando DC autóloga, sometida a pulsos con E7, de longitud completa. Este planteamiento novedoso supera varias de las limitaciones impuestas por el uso de vacunas a base epítope de péptido en una población exogámica, por ejemplo en humanos y, por lo tanto, proporciona implicaciones importantes en el tratamiento de pacientes con cáncer cervical con inmunoterapia activa o adoptiva, es decir, administración de DCs sometidas a pulsos de antígeno o linfocitos T estimulados con DC sometida a impulsos de antígeno.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Esta invención está dirigida a un método para preparar células dendríticas humanas que contienen antígenos, cuando se someten estas células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno . La presente invención también está dirigida a un método para producir linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, humanos, específicos para el antígeno, mediante el sometimiento de las células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, con el fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno; e incubar los linfocitos T humanos con las células dendríticas humanas sometidas a pulsos de antígeno bajo condiciones que promuevan la generación de linfocitos T específicos para el antígeno, con especificidad para el antígeno al cual las células dendríticas se sometieron a pulsos. Adicionalmente, esta invención está dirigida a un método para estimular el sistema inmunológico de un sujeto humano, el método comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, en donde las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno se obtienen sometiendo las mismas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, en donde el sistema inmunológico es estimulado por la respuesta del linfocito T del sujeto ante el antígeno que se utilizó para someter a las células dendríticas a pulsos de antígeno. Además, esta invención está dirigida a un método para estimular al sistema inmunológico de un sujeto humano, el método comprende administrar a un sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de los linfocitos T humanos estimulados, en donde los linfocitos T fueron estimulados por la incubación con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, en donde estas células se obtuvieron sometiendo a las células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos, que comprenden por lo menos un antígeno, con el fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, mediante lo cual el sistema inmunológico se estimula por la respuesta del linfocito T del sujeto ante el antígeno que se utilizó para someter a pulsos a las células dendríticas. Esta invención está dirigida adicionalmente a células dendríticas humanas pulsadas con antígeno que se producen por los métodos de está invención. La presente invención también está dirigida a una composición que comprende linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, humanos, producidos por los métodos de esta invención. También, la presente invención está dirigida a una composición farmacéutica que comprende: (a) células dendríticas humanas pulsadas con antígeno producidas por los métodos de la presente invención; (b) linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) (b) CD8+, humanos y específicos, incubados con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno tomadas de (a) o una combinación de células (a) y (b) ; y un portador farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra los resultados de las respuestas del CTL CD8+ específico para E7 de HPV 16 y 18, específico para el tumor, inducidas por las DCs sometidas a pulsos con E7 en pacientes con cáncer cervical invasivo; las respuestas se midieron en un estudio de 6 horas de liberación de 5iCr _ El porcentaje de lisis (± desviación estándar) a una proporción de célula efectora/célula blanco de 20:1 también se muestra. El anticuerpo de bloqueo anti-HLA clase I (W6/32) se utilizó a 50 mg/ml y el anti-CDlla/LFA-1 se utilizó a 10 mg/ml. Paciente 1; 1, Tumor autólogo; 2, Tumor autólogo+ 6/32 mAb anti-Clase I; 3, Tumor autólogo+anti-CDlla/LFA-1 ; 4, LCL/DOTAP control; 5, LCL/E7; 6, CaSki ; 7, K562. Pacientes 2 y 3; 1, Tumor autólogo; 2, Tumor autólogo+ 6/32 mAb anti-HLA Clase I; 3, Tumor autólogo+anti-CDlla/LFA-1; 4, LCL control; 5, K562. La Figura 2 muestra los resultados del análisis citométrico de flujo de dos colores para la expresión de CD56 mediante las células T CD8+ específicas para E7. Se obtuvo el fenotipo de la células T al momento de la primera citotoxicidad y posteriormente, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Un experimento representativo de cada paciente también se muestra. A, B, y C; pacientes 1, 2 y 3, respectivamente. La Figura 3 muestra la proliferación de la célula T CD4+ en respuesta a la estimulación con LCL irradiado autólogo sometido a pulsos con E7 de HPV (LCL/E7) en presencia o ausencia de un mAb de bloqueo específico HLA clase II (L243, 50 mg/ml) . Las células T (2 x 104) se cultivaron por triplicado con LCLs autólogos sometidos a pulsos de E7, irradiados (2 x 104) en una placa de 96 cavidades 72 horas. Se añadió [3H] timidina (1 mCi/cavidad) a cada cavidad durante por lo menos 16 horas del estudio y se determinó la proliferación por la incorporación de [3H] timidina. La estimulación de las células T CD4+ con LCL irradiado o LCL/DOTAP sólo sirvió como un control negativo. 1, LCL control; 2, LCL/DOTAP control; 3, LCL/E7+L243 ; 4, LCL/E7. La diferencia en la media de las proliferaciones determinada por la incorporación de [3H] timidana en presencia de LCL/E7, se comparó con la diferencia en la presencia de los controles LCL y es significativa a P < 0.01 por la prueba t de Student para los tres pacientes. La Figura 4 muestra el análisis citométrico de flujo de dos colores de la expresión intracelular de IFN-? e IL-4 por células T CD8+ específicas del tumor. Las células T fueron sometidas a prueba a aproximadamente 6 semanas después del cebado, después de reposar por 14 días posteriores a la última estimulación con antígeno, antes de la activación con PMA e ionomicina. Las células T se estimularon (A, C y E) o se estimularon por 6 horas con PMA e ionomicina (B, D y F) . A-B, paciente 1; C-D, paciente 2; y E-F, paciente 3. La Figura 5 muestra el análisis citométrico de flujo de dos colores de la expresión intracelular de IFN-? e IL-4 por células T CD4+ específicas del tumor. Las células T fueron sometidas a prueba a aproximadamente 6 semanas después del cebado, después de reposar por 14 días posteriores a la última estimulación con antígeno, antes de la activación con PMA e ionomicina. Las células T se estimularon (A, C y E) o se estimularon por 6 horas con PMA e ionomicina (B, D y F) . A-B, paciente 1; C-D, paciente 2; y E-F, paciente 3. La Figura 6 muestra las respuestas CTL CD8+ específicas para el tumor inducidas por las DCs sometidas a pulsos con el lisado del tumor de pacientes con cáncer ovárico avanzado, las respuestas se midieron en un estudio de 6 horas de liberación de 51Cr. Se muestra el porcentaje de lisis ( + desviación estándar) a una proporción de célula efectora/blanco de 20:1. El anticuerpo de bloqueo anti-HLA clase I ( 6/32) y el anticuerpo de bloqueo HLA-A2/A26 (BB7-2) se utilizaron a 50 mg/ml y el anti-CDlla/LFA- 1 se utilizó a 10 mg/ml. Paciente 1; 1, Tumor autólogo; 2, Tumor autólogo+W6/32 mAb anti-Clase I; 3, Tumor autólogo+anti-+anti-LFA-l MAb; 4, LCL control; 5, K562; Paciente 2; 1, Tumor autólogo; 2, Tumor autólogo+W6/32 MAb anti-HLA clase I; 3, linfocitos activados Con-A; 4, K562. Paciente 3; 1, tumor autólogo; 2, Tumor autólgo+W6/32 anti-HLA Clase I MAb; 3, Tumor autólogo+anti -BB7 -2 ; 4, LCL control; 5, K562.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La presente invención proporciona un método para preparar DCs humanas, las APCs cebadoras, que llevan antígenos que son suministrados a las DCs por lipofección con liposomas catiónicos. Típicamente, el agentes exógenos no replicantes y los antígenos solubles entran a la ruta endosomal de las DC y se presentan a las superficie celular en asociación con las moléculas de HLA (complejo de histocompatibilidad principal en humanos) Clase II, en donde activan a los linfocitos T CD4+. Inversamente, los antígenos sintetizados endógenamente, por ejemplo las oncoproteínas E7 y E6 de HPV que son producidas fisiológicamente en células de tumor infectadas por HPV, se asocian como fragmentos de proteína con las moléculas Clase I y el complejo resultante activa a los linfocitos T citotóxicos CD8+. Los linfocitos T CD4+ y los linfocitos T CD8+ son cruciales para la activación de un respuesta inmunológica intensa en un sujeto. Los inventores de la presente han determinado que los lípidos catiónicos comercialmente disponibles, por ejemplo DOTAP y el reactivo Lipofectin®, se requieren para suministrar un antígeno, por ejemplo la oncoproteína E7 de HPV hacia la ruta del HLA Clase I de las DCs para producir una respuesta CTL CD8+. En este aspecto, DOTAP, así como otras preparaciones lípidas catiónicas pueden permitir una mejor unión a las membranas DC y activar la absorción de las oncoproteínas E6 y/o E7. Adicionalmente, los liposomas pueden suministrar las proteínas virales directamente hacia el citoplasma en donde ocurre el procesamiento de las moléculas HLA Clase I. Por lo tanto, los liposomas catiónicos proporcionan un importante vehículo para suministrar antígenos, por ejemplo proteínas de longitud completa hacia las DC, y para producir respuestas CTL CD8+. Aunque el péptido derivado de HPV se ha introducido directamente, los inventores fueron los primeros en introducir oncoproteínas E6 y /o E7 de longitud completa directamente en los pacientes y, específicamente, con un sistema completamente autólogo. Adicionalmente, algunos investigadores han utilizado el virus vaccinia que codifica para los genes E6 y E7 con el fin de inmunizar a las mujeres que tienen cáncer cervical. Estos dos planteamientos han sido intentados en pequeños grupos de pacientes con una enfermedad muy avanzada. Por esta razón, es difícil llegar a conclusiones sobre el efecto potencial de estos tratamientos experimentales. Las ventajas de utilizar las oncoproteínas E6 o E7 de longitud completa como una fuente de antígeno en lugar de los péptidos, son varias: 1) el uso de los péptidos como antígenos tiene muchas limitaciones en una población extensamente exogámica, como los humanos. Esto se debe a que los protocolos de vacunación con péptidos se basan en el conocimiento que el alotipo MHC de cada paciente así como la rigurosa restricción MHC de cada péptido sintetizado específico para HPV, lo cual no resulta práctico para protocolos de vacunación a gran escala. 2) Las DC autólogas pulsadas con oncoproteínas E6 o E7 de longitud completa del genotipo HPV implicadas en la enfermedad ofrecen la ventaja significativa de presentar potencialmente múltiples epítopes CTL inmunogénicos así como permitir que las DC diseñen estos péptidos para que se adapten a las propias moléculas MHC sin la necesidad de un conocimiento previo del alotipo individual. Se ha reportado que las oncoproteínas E6 o E7 de longitud completa contienen epítopes auxiliares T CD4+. Esta calidad, a la luz del conocimiento reciente del requisito crucial para la presencia de los epítopes auxiliar y CTL en la misma APC para una activación eficiente y duradera de las células T CD8+ indica la eficacia y reproducibilidad del método que utiliza las DC pulsadas con E7 de longitud completa para generar potentes respuestas inmunitarias de los CTL, en pacientes con cáncer cervical, contra los tumores autólogos blanco infectados naturalmente con HPV. 4) Debido a que la perdida selectiva de un elemento de restricción MHC sobre las células de tumor cervical es un hallazgo mucho más frecuente que la pérdida total de las moléculas MHC, es muy probable que el uso de la vacunación a base de oncoproteína E6 y/o E7 de longitud completa, que incorpora péptidos capaces de unirse a múltiples elementos de restricción HLA clase I, sugiera un uso como una forma superior de vacunación . Adicionalmente, los inventores reconocieron que las DC lipofectadas con antígeno de esta invención fueron más poderosas en producir una respuesta CTL CD8+ si las DC se incuban bajo condiciones para producir DCs totalmente maduras antes de la lipofección del antígeno. Estas DCs totalmente maduras ya no actúan como fagocitos y, por lo tanto, no pueden tomar activamente proteínas. Por lo tanto, es importante que el antígeno sea suministrado por un método, por ejemplo la lipofección, que todavía permita que el antígeno sea suministrado a las DCs cuando ya no pueden actuar como fagocitos activos de proteínas y péptidos. Este método para producir las DCs por pulsos o por incubación con antígenos que contienen liposomas proporciona un método para utilizar las DCs más potentes que contienen a los antígenos específicos, a fin de producir respuestas intensas del CTL CD8+ y respuestas del auxiliar CD4+. La presente invención se aplica a la preparación y uso de DCs humanas que han sido sometidas a pulsos o se han incubado por los métodos proporcionados en los siguientes Ejemplos, con liposomas catiónicos que contienen un antígeno o una pluralidad de antígenos provenientes, por ejemplo, de un lisado de tumor o de un eluyente ácido proveniente de una célula de tumor. En general, el método de la presente para preparar DCs humanas que contienen antígenos emplea un método en donde las células dendríticas se someten a pulsos o bien se incuban con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, para obtener DCs humanas que se someten a pulsos de antígeno. El término "pulsar o someter a pulsos" es sinónimo de "incubar" o "mezclar" dentro del contexto de esta invención. El término "lipofección" significa también que las liposomas entran a la membrana celular y se internalizan. Para que las DCs que se van a someter a pulsos pueden obtenerse de cualquier fuente, por ejemplo células mononucleares de sangre periférica (PBMCs-por sus siglas en inglés) , DCs de Langerhans obtenidas de la piel y DCs linfoides presentes en el sistema linfático. Esta invención utiliza PBMCs como una fuente de DCs, pero cualquiera de las otras fuentes de DCs o cualquier otra fuente de DCs podrá utilizarse en este método. Las DCs de preferencia se preparan en la siguiente forma: (a) se obtienen los precursores de DC a partir de un sujeto humano; (b) se incuban los precursores DC bajo condiciones necesarias para producir las DCs y después las DCs producidas se someten a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener DCs humanas con pulsos de antígeno. Las condiciones de incubación para producir DCs a partir de precursores DC comprenden incubar las DCs en un medio que comprende por lo menos una citocina que promueve la proliferación de DC, por ejemplo el factor estimulador de colonia del macrófago granulocito (GM-CSF-por sus siglas en inglés) . Más preferentemente, se utilizan por lo menos dos citocinas y, con más preferencia, estas citocinas son GM-CSF e interleucina-4 (IL-4) . Este cultivo de DCs se incuba para obtener la maduración parcial de las DCs. Este nivel de maduración de DC en general se logra después de aproximadamente 5 a 7 días de incubación a 37°C en un incubador humidificado de 5% C02-95% aire. La sección de ejemplo que continua describe el método con detalle. Las DC en este nivel de maduración parcial se examinan visualmente en el microscopio y se determinan como parcialmente maduras cuando algunas de las células se separan y forman largas proyecciones desde las membranas celulares. Aunque el intervalo de 5 a 7 días para lograr la maduración parcial es una guía, las células deben incubarse durante por lo menos 5 días con GM-CSF y el IL-4 se añade periódicamente como se describe en el siguiente ejemplo, y se examina visualmente para determinar la madurez de las DCs. Para promover mayor maduración de las DCs en cultivo, aproximadamente al día 5 después del establecimiento de los cultivos y cuando las características visuales antes mencionadas se observan, se añade al medio de cultivo una citocina adicional que promueve mayor maduración de la DC . La citocina adicional se selecciona del grupo que consiste de factor de necrosis tumoral (TNF) , interleucina-1 (IL-1) , prostaglandina (PG) , GM-CSF y una combinación de los mismos, con mayor preferencia las citocinas utilizadas para lograr la maduración comprenden: TNF- , IL-lß, PGE2a, y GM-CSF. La incubación en este medio en general se hace por lo menos por 7 días para obtener la completa maduración de las DC, pero este tiempo de incubación puede variar en una amplia gama de 7 a 10 días y puede verificarse por observación visual. Estas DCs totalmente maduras han perdido la habilidad de fagocitar proteínas extrañas o antígenos, en comparación con las DCs parcialmente maduras, que todavía son capaces de fagocitar y tomar antígenos. Las DCs parcialmente maduras son DCs transicionales que producen pocas moléculas co-estimulatorias sobre la superficie de las células, lo que es crucial para las células T simples cebadoras. El lípido o liposoma catiónico que se utiliza para encapsular al antígeno y después se utiliza para someter a pulsos a las DCs preparadas puede conseguirse comercialmente o puede ser un liposoma catiónico preparado que de preferencia deberá ser aprobado por la Food S. Drug Administration para uso en humanos. El lípido catiónico, DOTAP, de Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN es adecuado para la presente invención y de hecho es el preferido. DOTAP es el lípido catiónico consistente en metilsulfato de N- [1 - (2 , 3 -dioleoiloxi) propil] -N,N,N trimetilamonio. El Reactivo Lipofectin® es un producto de LifeTechnologies , Inc., Gaithersburg, MD y puede utilizarse para suministar antígenos a las células. El Reactivo Lipofectin® es una formulación de liposoma 1:1 (peso/peso) del lípido catiónico consistente en cloruro de N-[l-(2,3-dioleoiloxi) propil] -N, N,N trimetilamonio (DOTMA) y dioleoil fosfatidiletanolamina (DOPE) . El método de esta invención se aplica a el suministro de un antígeno a una DC mediante un liposoma catiónico. Por lo tanto, el antígeno debe poder incubarse con el liposoma y debe poder ser encapsulado por éste. El antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado a un tumor o un antígeno específico para un tumor, más específicamente es una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con un ácido de célula de tumor o un usado proveniente de un tumor. La preparación de estos antígenos se analiza con detalle en los ejemplos. Posteriormente el antígeno se mezcla con el liposoma catiónico o con un lípido a temperatura ambiente por aproximadamente 20 minutos para formar un complejo y después se añade a las DCs previamente preparadas para "someter a pulsos o pulsar" o incubar las DCs con los liposomas que llevan el antígeno. Las DCs se lavan con PBS y se resuspenden en el medio, por ejemplo AIM-V (Gibco-BRL, Grand Island, N.Y.), descrito con detalle en los ejemplos. El antígeno preferido es un antígeno viral y, más preferentemente, una oncoproteína HPV y con mayor preferencia la oncoproteína E7 o E6 de HPV de longitud completa. La invención está destinada a abarcar un método para preparar las DCs pulsadas así como las DCs producidas por cualquiera de los métodos descritos en esta invención. La presente invención también se dirige a un método para producir linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, humanos, específicos para el antígeno, el método consiste en: (a) someter a pulsos las DCs humanas con los liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno para obtener las DCs humanas pulsadas con antígeno; y (b) incubar los linfocitos T humanos con las DCs pulsadas con antígeno bajo condiciones que promueven la generación de los linfocitos T específicos del antígeno, con una especificidad al antígeno con el cual las DCs se sometieron a los pulsos. Más específicamente, los linfocitos T se obtienen de un sujeto humano y se incuban o someten a pulsos con las DCs humanas pulsadas con antígeno, que se prepararon como se describió en lo anterior. Más preferentemente, las DCs y los linfocitos T son autólogos. Posteriormente, los linfocitos T humanos y las DCs humanas pulsadas con antígenos se incuban en un medio que promueve la generación de linfocitos T específicos de antígeno con especificidad a los antígenos con los cuales se sometieron a pulso las DCs. Esta incubación de preferencia se presenta en la presencia de por lo menos una citocina para promover el crecimiento de linfocito T. De preferencia, la citocina en el medio de incubación de linfocito T es interleucina-2 (IL-2), y opcionalmente GM-CSF, para expandir el número de linfocitos T hasta que haya un número suficiente de linfocitos T citotóxicos específicos para el antígeno, a fin de efectuar los experimentos in vi tro para el estudio de la respuesta inmunitaria y la citotoxicidad de los linfocitos T específicos para el antígeno del sujeto o bien para la inmunoterapia adoptiva in vi vo . Si los estudios in vi tro se llevan a cabo, entonces la respuesta del linfocito T específico para el antígeno se mide mediante la actividad citotóxica contra una muestra de tejido, por ejemplo, las células de tumor del sujeto humano, es decir autólogas . Los linfocitos T y las muestras de tejido no tienen que provenir del mismo sujeto humano, es decir será autólogas, sin embargo para que sean útiles en el estudio de la respuesta inmunitaria y de la actividad citotóxica de los linfocitos T cebados, los linfocitos T y los tejidos de tumor deben ser autólogos (ver la referencia 52 respecto a los resultados de este estudio, esta referencia se incorpora aquí en su totalidad) . La presente invención también está dirigida a una composición que comprende linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, humanos, específicos para el antígeno, sensibilizados o cebados, producidos por el método de esta invención . Un aspecto importante de la presente invención es proporcionar un método para estimular el sistema inmunitario de un sujeto humano, donde el método comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de las DC pulsadas con antígeno, mediante lo cual el sistema inmunitario del sujeto humano es estimulado por la respuesta del linfocito T del sujeto ante el antígeno con el cual se pulsaron las células dendríticas. Particularmente, las DCs pulsadas con antígeno se producen de acuerdo al método antes descrito y descrito en los ejemplos de esta solicitud, y para la administración a un sujeto se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para uso humano. La respuesta del linfocito T del sujeto es la respuesta del linfocito T citotóxico CD8+ y la respuesta del linfocito T auxiliar CD4+. Las DCs de preferencia son autólogas . Una terapia alternativa es un método de inmunoterapia adoptiva para estimular el sistema inmunológico de un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de linfocitos T humanos estimulados, en donde los linfocitos T se estimulan incubando a las DCs humanas pulsadas con antígeno, mediante lo cual el sistema inmunitario del sujeto es estimulado por la respuesta del linfocito T del sujeto humano ante el antígeno con el cual se pulsaron las células dendríticas. Al igual que con la inmunoterapia con DCs pulsadas con antígeno, la respuesta al linfocito T es la respuesta del linfocito T citotóxico CD8+ y la respuesta del linfocito T auxiliar CD4+. La preparación de los linfocitos T del sujeto y de las DCs pulsadas con antígeno se analizan en lo que antecede, en el siguiente ejemplo y en la referencia (52) . Para la administración a un sujeto, los linfocitos T citotóxicos CD8+ y los linfocitos T auxiliares CD4+ se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para uso humano. Una terapia alternativa incluye la administración de las DCs pulsadas con antígeno y también de los linfocitos T citotóxicos CD8+ sensibilizados con DCs pulsadas con antígeno y linfocitos T auxiliares CD4+ a un paciente en un régimen de tratamiento. Para obtener un número suficiente de linfocitos T específicos para el antígeno pudiera ser necesario incubar adicionalmente estas células para expandir el número de linfocitos T en un medio de expansión de linfocito T, como se describe en los ejemplos, mediante la adición de componentes como los PBL alogénicamente irradiados (PBL-linfocitos de sangre periférica), anticuerpos monoclonales anti-CD3 , plasma autólogo y GM-CSF. Esta invención también está dirigida a una composición farmacéutica que comprende células que se seleccionan de: (a) células de dendríticas humanas pulsadas con antígeno producidas por el método de la presente invención; (b) linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ humanos, específicos para el antígeno y cebados, incubados con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno de (a) , o (c) una combinación de las células de (a) y (b) ; en combinación con un portador farmacéuticamente aceptable. La administración de las composiciones que contienen las DCs humanas pulsadas con antígeno y/o los linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ estimulados con antígeno se efectúa por infusión directamente a una vena o arteria central, de preferencia cerca del sitio del tumor, si es posible, o cerca del tejido linfático para que las células administradas puedan entrar fácilmente al sistema linfático. Las células se diluyen en solución salina amortiguada con plasma o albumen autólogo. Las células pueden administrarse junto o en ausencia de IL-2. Las DCs pulsadas con antígeno pueden alternativamente inyectarse por vía subcutánea, intradérmica, intramuscular o intravenosa. El número de células a inyectar es de aproximadamente l-5xl06 células por dosis, pero esto puede ajustarse por el médico con base en los parámetros clínicos. Inicialmente las inyecciones consisten en una inyección cada 2 a 3 semanas por 3 a 6 meses, con dosis de refuerzo cada 2 a 3 meses en forma posterior. Sin embargo, la dosificación y el tiempo de aplicación de la dosis puede variar dependiendo del paciente y del tipo de tumor o enfermedad que se esté tratando. Aunque esta invención se analiza en términos de la inmunoterapia o inmunoterapia adoptiva para el tratamiento de enfermedades o tumores o tipos de cáncer, la inmunoterapia de la presente invención también puede utilizarse como un tratamiento profiláctico, como una vacuna para evitar los tipos de cáncer y enfermedades para los cuales se ha asociado un antígeno conocido. Las dosis de inmunización pueden determinarse con base en las metodologías conocidas por los expertos en este campo .

EJEMPLOS MATERIALES Y MÉTODOS Células Dendríticas Pulsadas E7 de los Pacientes. Tres pacientes que habían pasado por una histerectomía abdominal total debido a cáncer cervical invasivo proporcionaron tejido de tumor y linfocitos de sangre periférica. Se obtuvieron muestras al momento de la cirugía por el Departamento de Oncología Ginecológica y el Departamento de Patología en la Universidad de Arkansas para las Ciencias Médicas (UAMS) , Little Rock, Arkansas, con aprobación del Consejo de Revisión Institucional. Se efectuó la tipología de HPV en biopsias de tejido reciente y en cultivos recientes derivados por PCR utilizando cebadores específicos de secuencia para HPV -16, -18, 31, -33, 52b y 58 (20) . Los pacientes 1 y 2 tuvieron carcinomas de célula escamosa en etapas IB2 y IIB positivos para HPV 16 y sus edades eran 36 y 45 años respectivamente, mientras que el paciente 3 tuvo adenocarcinoma en etapa IB2 positivo para HPV 18 y tenía 27 años. Las pacientes 1 y 2 recibieron radiación y/o tratamientos de quimioradiación antes de la cirugía, mientras que el paciente 3 no recibió ninguna forma de terapia antes de la cirugía.

Células Dendríticas Pulsadas con Lisado de Tumor de los Pacientes. Se obtuvo el tejido de tumor y los linfocitos de sangre periférica (PBL) de tres pacientes que habían pasado por histerectomía abdominal y salpingo oforectomía bilateral debido a cáncer ovárico invasivo. Se obtuvieron muestras en el momento de la cirugía por el Departamento de Oncología Ginecológica y el Departamento de Patología de la Universidad de Arkansas para Ciencias Médicas (UAMS), Little Rock, Arkansas, bajo la aprobación del Consejo de Revisión Institucional. Los pacientes 1 y 2 tuvieron cáncer ovárico papilar seroso en etapa IVA (efusiones pleurales positivas) y tenían 44 y 79 años, respectivamente, mientras que el paciente 3 tuvo adenocarcinoma papilar seroso en etapa IIIB y tenía 40 años. Los tres pacientes, 1 y 2, no habían recibido tratamiento antes de la cirugía (55) .

Células Dendríticas Pulsadas con Eluido Ácido de los Pacientes. Los tres pacientes que habían pasado por histerectomía abdominal y salpingo oforectomía bilateral más omentectomía debido a cáncer ovárico invasivo proporcionaron tejidos de tumor y células mononucleares de sangre periférica. Las muestras se obtuvieron en el momento de la cirugía por el Departamento de Oncología Ginecológica y el Departamento de Patología de la Universidad de Arkansas para Servicios Médicos (UAMS), Little Rock, Arkansas, con la aprobación del Consejo de Revisión Institucional. Los pacientes 1 y 2 tuvieron cáncer ovárico papilar seroso escamoso en etapa IIIC y IIIB y tenían 43 y 60 años, respectivamente, mientras que el paciente 3 tubo adenocarcinoma papilar seroso etapa IVA (con efusión pleural positiva) y tenía 44 años. Ninguno recibió tratamiento antes de la cirugía . Lineas Celulares del Tumor. La línea celular citolítica natural (NK) sensible al blanco K562 (una línea celular de eritoroleucemina humana) y la línea celular de cáncer cervical alogénica HLA-A2+/HPV 16+ CaSki se adquirieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC) y se conservaron a 37°C, en 5% de C02 en medio completo (CM) que contiene RPMI 1640 Gibco Life Technologies, Grand Island, NY) , 10% de suero bovino fetal (FBS, Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) . Las células de tumor autólogas nuevas se obtuvieron de múltiples biopsias por punción de todos los pacientes. Las biopsias se dividieron en dos partes, para los estudios de evaluación histopatológica y para los estudios in vi tro . Las líneas celulares de tumor nuevas se conservaron en medio de queratinocito libre de suero (KSFM-GibcoBRL) , suplementado con 5 ng/ml del factor de crecimiento epidérmico y 35 a 50 µg/ml de extracto de pituitaria de bovino (Gibco Life Technologies, Grand Island, N.Y.) a 37°C, 5% de C02. En resumen, las suspensiones celulares simples se obtuvieron procesando las muestras de tumor sólido bajo condiciones estériles a temperatura ambiente. El tejido de tumor viable se desmenuzó mecánicamente en RPMI 1640 en porciones no mayores a 1-3 mm- y se lavaron dos veces con RPMI 1640. Las porciones de tumor desmenuzados se colocaron en matraces de tripcinización de 250 ml que contenían 30 ml de solución enzimática [0.14% Collagenasa Tipo I (Sigma, St. Louis, MO) y 0.01% DNAasa (Sigma, 2000 KU/mg) ] en RPMI 1640, y se incubaron en un aparato agitador magnético por toda la noche a 4°C. El tumor disociado enzimáticamente se filtró a través de una malla de nylon con tamaño de poro de 150 µm para generar una suspensión celular simple. La suspensión celular resultante se lavó entonces dos veces en RPMI 1640 más 10% de plasma autólogo. Todos los experimentos se realizaron con cultivos de tumor nuevos o crioconservados que tenían por lo menos 90% de viabilidad y contenían >99% de células de tumor. Análisis Fenotípico HLA de Cultivos CD8+.

La tipificación HLA clase I de los cultivos CD8 + purificado se realizó por linfocitoxicidad estándar (25) en el laboratorio de tipificación de tejidos del Servicio De Transfusión Sanguínea Y Trasplante De Médula Ósea en la UAMS. Plásmidos y Producción de Proteínas E7. Se generaron grandes cantidades de oncoproteínas E7 purificadas de HPV 16 y 18 utilizando plásmidos previamente caracterizados que codifican para proteínas de fusión E7 de glutatión S- transferasa (GST) (29,4) . En resumen, la GST y las proteínas de fusión derivadas se conservaron en Escheri chia Coli BL21 y la expresión de la proteína se indujo en cultivos a una densidad óptica de 0.6 a 600 nm por la adición de isopropil -b-D- tiogalactósido (IPTG; concentración final, 0.1 mM) . Los cultivos se dejaron crecer por 6 horas para preparaciones a gran escala (2000-4000 ml ) . Las células se sedimentaron y se lavaron una vez en solución salina regulada con fosfatos (PBS, pH 7.4), enfriada con hielo y después se resuspendieron para su desintegración mediante sonificación sobre hielo, en ráfagas cortas. Posteriormente se añadió 20% Tritón X-100 en PBS a una concentración final de 1% y se mezcló suavemente por 30 minutos para ayudar a la solubilización de las proteínas de fusión. El Usado bacteriano se centrifugó a 12,000 g por 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se purificó utilizando una columna de glutatión Sepharose 4B RediPack de acuerdo a los procedimientos sugeridos por el fabricante (Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, NJ) . La escisión de la oncoproteína E7 a partir de la GST fue lograda posteriormente con una proteasa sitio específica (es decir trombina humana) (Sigma, S.Louis, MO) , 100 U en 2 ml de PBS a temperatura ambiente por 16 horas. La proteína E7 se eluyó de la columna por centrifugación (1000 g x 5 minutos) y el material recolectado se esterilizó por filtración. La pureza de la proteína se analizó por SDS-PAGE y tinsión de azul de Coomassie mientras que la cuantificación se obtuvo espectrofotométricamente utilizando el ensayo de proteína BIO-RAD (BIO-RAD Laboratories, Hercules, CA) . Las preparaciones fueron típicamente > 98% de pureza de la oncoproteína E7.

Preparación del Lisado de Tumor 5 a 10 x 106 de células de tumor autólogas cultivadas en RPMI 1640 más 15% de ascitis autóloga se lavaron dos veces con solución salina regulada con fosfatos (PBS, pH 7.4) y se recolectaron por raspado. Las células se lisaron por 3 a 4 ciclos de congelación (en nitrógeno líquido) y ciclos de descongelación (a temperatura ambiente) . La lisis se monitoreó por microscopía de luz. Las partículas más grandes se retiraron por centrifugación (10 minutos, 600 r.p.m.), los sobrenadantes se hicieron pasar a través de un filtro de a 0.2-mm y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Preparación de los Péptidos Eluidos con Ácido Los péptidos se extrajeron de la superficie de 5 a 10 x 106 células de tumor autólogas ya sea sedimentadas o adheridas a los matraces. Las células adherentes cultivadas in vi tro en RPMI 1640 más 15% de ascitis autóloga se lavaron dos veces con solución salina regulada con fosfatos (pH 7.4, Gibco-BRL) , seguido de 5 ml de regulador citrato-fosfato (0.131 M ácido cítrico, 0.066 M Na2HP04, 0.15M NaCl, pH3.0 ) por matraz T75. Los matraces se agitaron suavemente y las células en suspensión se mezclaron por pipeteo suave por 5 minutos a temperatura ambiente. Los eluatos de péptido de las células se centrifugaron y además se clarificaron por centrifugación y los péptidos se almacenaron a -70°C en regulador de citratos-fosfato hasta su procesamiento adicional o bien se procesaron inmediatamente en cartuchos Sep-Pak C?8(Waters, Bedford, MA) (53) .

Aislamiento de Células Mononucleares de Sangre Periférica (PBMC) y Generación de Células Dendríticas Parcialmente Maduras. Las PBMCs se separaron de la sangre venosa heparinizada por centrifugación de gradiente de densidad Ficoll-Hypaque (Sigma) y se crioconservaron en RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, N.Y.) más 10% de DMSO, 30% de plasma análogo o se utilizaron inmediatamente para la generación de DC . En resumen, el PBMC obtenido de 42 ml de sangre periférica se colocó en placas de cultivo de 6 cavidades (Costar, Cambridge, MA) en AIM-V (Gibco-BRL, Grand Island, N.Y.) a 0.5-1 X 107/3 ml por cavidad. Después de 2 horas a 37 C se retiraron las células no adherentes y las células adherentes se cultivaron a 37 °C en un incubador humidificado de 5% C02/95% aire, en medio suplementado con GM-CSF humano recombinante [(800 U/ml), Immunex, Seattle, WA] y IL-4 [(1000 U/ml) Genzyme Cambridge, MA] (44) . En experimentos tempranos, solo se utilizó GM-CSF [(800 U/ml)] . Cada 2 días, 1 ml del medio agotado se reemplazó por 1.5 ml de medio nuevo que contenía 1600 U/ml GM-CSF y 1000 U/ml IL-4 para dar concentraciones finales de 800 U/ml y 500 U/ml, respectivamente (44) . Después de 6 ó 7 días de cultivo, las DC se recolectaron para someterse a pulsos con oncoproteínas E7 de HPV 16 ó 18 como se describe a continuación.

Maduración Completa de Cultivos de Célula Dendrítica y Generación de Células T Específicas para E7 de HPV La sangre periférica heparinizada (PBMC) se recolectó de dos donadores adultos sanos de acuerdo a los protocolos aprobados por el consejo de revisión institucional . Los voluntarios adultos sanos estudiados no tenían historial previo de infección clínica o citológica con HPV y presentaron un frotis cervical rutinario normal (es decir, donador 2) recolectado al momento del estudio. La derivación de las células dendríticas del PBMC, donador y su uso subsecuente para la generación de las células T específicas de E7 de HPV se llevó a cabo esencialmente como ya se describió. En resumen, entre 40 y 50 ml de PBMC se colocaron en las placas de cultivo de 6 cavidades (Costar, Cambridge, MA) en AIM-V (Gibco-BRL) a 0.5-1 X 107/3 ml por cavidad. Después de 2 horas a 37°C se retiraron las células no adherentes y las células adherentes se cultivaron a 37°C en un incubador humidificado de 5% C02/95% aire, en medio suplementado con GM-CSF humano recombinante [(800 U/ml), Immunex, Seattle, WA] e IL-4 [(1000 U/ml) Genzyme, Cambridge, MA] . La maduración final de DC derivadas de monocito fue inducida por exposición durante las últimas 48 horas del cultivo (es decir día 6 a día 8) a TNF-a (1000 U/ml) IL-lß (500 U/ml) (Research and Diagnostic, Minneapolis, MN) y PGE2a (0,5 M/Ml) (Sigma, St. Louis, MO) . Después de la maduración final las DC se recolectaron para someterse a pulsos con las oncoproteínas E7 de HPV 16 ó 18 generadas utilizando los plásmidos previamente caracterizados que codifican para la proteína de fusión E7 de glutatión S -transferasa (GST) . El DOTAP lípido catiónico (Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN) se utilizó para suministrar las proteínas E7 de HPV 16 ó 18 en las células, como ya se describió. La generación de CTLs específicos de E7 de HPV se obtuvo cultivando el PBMC respondedor (10-20xlOe células/cavidad en placas de cultivo de 6 cavidades) (Costar) en AIM-V con DC autólogo sometido a pulsos con E7 (proporciones de 20 : 1 a 30 : 1 PBMC respondedor : DC) . Los cultivos se suplementaron con IL-2 humano recombinante (10 U/ml -Aldesleukin, Chiron Therapeutics, Emeryville, CA) y se reestimularon una vez con DC sometida a pulsos con E7 durante 10 a 14 días. En los días 21 a 28, las células T DC8+ se separaron de los cultivos a granel mediante selección positiva con CD8 -Dynabeads (Dynal Inc., Lake Success, NY) y además se expandieron en número por 5 a 7 días utilizando PBL irradiado autólogo o alogénico (5000 cGy) (lxl0G células/cavidad) y anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Ortho Pharmaceutical Corp, Raritan, NJ) (0.2 µg/ml) más 5% de plasma autólogo y 100 U/ml de IL-2 en placas de 24 cavidades (Costar) , antes de analizarse respecto a la característica fenotípica y la actividad CTL. En algunos experimentos, para analizar y diferenciar directamente la capacidad citolítica así como la estabilidad de la característica fenotípica de las dos poblaciones de las células T efectoras CD8+ obtenidas (es decir CD8+/CD56+ y CD8+/CD56-), las fracciones almacenadas (ver abajo) se cultivaron en RPMI 1640 más 5% de plasma autólogo y 100 U/ml de IL-2 en placas de 24 cavidades por un tiempo diferente, antes de analizarse para determinar el fenotipo por citometría de flujo o por actividad CTL. Pulsado de las DC. Después del cultivo, las DCs se lavaron dos veces en AIM-V y se añadieron a tubos de polipropileno de 50 ml (Falcon, Oxnard, CA) . El lípido catiónico DOTAP (Boehringer Mannheim, Indianapolis , IN) se utilizó para suministrar las proteínas E7 de HPV 16 ó 18 hacia las células. 100 mg/ml de la oncoproteína E7 y DOTAP (125 µg en 500 µl de AIM-V) se mezclaron en tubos de poliestireno de en 12 x 75 mm a temperatura ambiente por 20 minutos. El complejo se añadió a la DC en un volumen total de 2 a 5 ml de AIM-V y se incubó a 37 °C en un incubador con agitación ocasional por 3 horas . Las células se lavaron dos veces con PBS y se resuspendieron en AIM-V como se describió abajo. Si las DCs se someten a pulsos con lisado de tumor, la preparación del cual ya se describió, la única diferencia entre el lisado de tumor y los pulsos con proteína E7 es que se mezclan 500µl del extracto celular total derivado de 5 a 10 x 10 células de tumor en AIM-V con el DOTAP. (53) Si las DCs se someten a pulsos con péptidos eluidos en ácido, cuya preparación ya se describió, la única diferencia entre los péptidos eluidos en ácido y los pulsos con proteína E7 es que se mezclan 500µl de los péptidos eluidos derivados de 5 a 10 x 10s células de tumor en AIM-V con DOTAP. (54) Generación In Vi tro de CTLs Específicos de E7 de HPV. Las PBMCs respondedoras recientemente obtenidas o crioconservadas se lavaron y resuspendieron en AIM-V a 10-20 x 106 células/cavidad en placas de cultivo de 6 cavidades (Costar, Cambridge, MA) con DCs autólogas pulsadas con E7 (proporciones de PBMC respondedoras : DC de 20:1 a :1) . Los cultivos se suplementaron con GM-CSF humano recombinante (500 U/ml) y con IL-2 humano recombinante (10 U/ml -Aldesleukin, Chiron Therapeutics, Emeryville, CA) y se incubaron a 37 °C . Se añadió rIL-2 humano (10 U/ml) a los cultivos posteriormente cada 3 a 4 días. En el día 21, las células CD8+ se separaron de los cultivos a granel mediante selección positiva con CD8 -Dynabeads (Dynal Inc., Lake Success, NY) y se expandieron en número por 5 a 7 días utilizando PBL irradiado autólogo o alogénico (5000 cGy) (1 x 106 células/cavidad) y anticuerpo monoclonal anti-CD3 (Ortho Pharmaceutical Corp, Rariatan, NJ) (0.2 mg/ml) más 5% de plasma autólogo y 100 U/ml de IL-2 en placas de 24 cavidades (Costar, Cambridge, MA) , antes de analizarse para actividad CTL. Como blancos de control negativo se prepararon linfoblastos autólogos por estimulación de 3 días con Con-A (GIBCO; 1 mg/ml) en RPMI-1640 más IL-2 (25 U/ml), 5% plasma autólogo mientras que las líneas de célula B de linfoblastoide autólogo transformadas con EBV (LCL) se establecieron por cocultivo de PBMCs con sobrenadante que contiene EBV a partir de la línea celular B95.8 en la presencia de 1 mg/ml de ciclosporina A (Sandoz, Camberley, UK) y se mantuvieron en AIM-V suplementado con suero AB humano al 10 % (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA) . Ensayo de Proliferación de Células T. Las células T CD4+ derivadas de las poblaciones de células T agotadas CD8+ a partir del día 21, se reestimularon una vez con DC pulsada con E7 a una proporción de 20:1, y 2 semanas después se purificaron por selección positiva con CD4 -Dynabeads (Dynal Inc. Lake Success, NY) para obtener una población más del 99% pura. Las respuestas linfoproliferativas específicas contra E7 se probaron utilizando LCL autólogo pulsado con E7 de longitud completa en presencia de DOTAP, como se describe antes para los pulsos efectuados en DC . Los LCL autólogos no pulsados o pulsados con E7, irradiados (7,500 cGy) se sembraron en una placa de 96 cavidades por placa (2 x 104 células/cavidad) . Las células T CD4+ (2 x 10 4 células/cavidad) se probaron para proliferación específica después de 72 horas. Los cultivos se pulsaron con 1 mCi/cavidad de [3H] timidina por las últimas 16 horas y la radioactividad incorporada se midió como se describe (33) . La restricción HLA de las respuestas proliferativas se investigó añadiendo mAb anti-HLA Clase II (L-243) o anti-HLA clase I (W6/32) (50 µg/ml) (hibridomas obtenidos de ATCC, Rockville. MD) . Todos los ensayos se llevaron a cabo en cavidades por triplicado. Actividad Citotóxica. Se realizó un ensayo de liberación de cromo (51Cr) de 6 horas como ya se describió antes (33) para medir la reactividad citotóxica de los linfocitos T estimulados por E7 de DC . Además de las células de tumor cervicales autólogas, la línea celular alogénica HPV16+ CaSki, compartiendo con el paciente 1 el elemento de restricción HLA-A2 (36) se utilizó como blanco. La línea celular de tumor K562 se utilizó como un blanco para la detección de la actividad NK. Los linfocitos de sangre periférica activados Con-A, autólogos y/o los LCL autólogos transformados por EBV se utilizaron como blancos de control autólogos. Para determinar las estructuras del efector y de las células blanco implicadas en la lisis de anticuerpos monoclonales (MAbs) se utilizaron para bloquear la citotoxicidad. Las células efectoras se preincubaron por 30 minutos a temperatura ambiente con MAbs que reconocían CD3 humano (10 µg/ml) (Ortho Pharmaceutical Corp, Raritan, NJ) o anti-CDlla/LFA-1 (10 µg/ml) (Pharmingen, San Diego, CA) y su control isotípico [anti TNP estándar de isotipo mAb IgGlK (10 µg/ml) (Pharmingen, San Diego, CA) ] . Los blancos de tumor marcados con 51Cr se preincubaron con MAbs específicos para HLA monofórmico clase I (W6/32) (50 µg/ml) . Las células efectoras y los blancos marcados ^lrjr se incubaron entonces en un volumen final de 200 µl/microporoso a 37°C con 6% de C02.

Análisis Fenotípico de Células T Los cultivos enriquecidos de células T CD8+ se sometieron a determinación de fenotipo en el momento de la primera citotoxicidad y posteriormente, a fin de correlacionar la especificidad citolítica con un subconjunto linfoide particular. La citometría de flujo se efectuó utilizando MAbs directamente conjugados contra los siguientes antígenos de leucocito humano: Leu-4 (CD3, células pan T) ; Leu-3 (CD4, inductores/auxiliares T) ; Leu-2a (CD8, citótóxico/supresor T) ; Leu-19 (CD56, células NK/K) ; Tac (CD25, el IL-2R) ; anti-HLA-DR (L-243); y receptor de células T (TCR) a/ß o ?/d (TCR-a/ß o TCR-? /d, respectivamente) (Becton Dickinson, San José, CA) y se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson) .

Análisis Citométrico de Flujo de las Citocinas I traceluíares Este protocolo está adaptado del descrito por Openshaw et al. (37) . Las células T CD4+ y CD8+ se analizaron por aproximadamente 6 semanas del cebado, después de reposar por 14 días posteriores a la última estimulación con antígeno, antes de la activación con miristato acetato de forbol (PMA) y con ionomicina. En resumen, las células T (7.5 x 105/ml) se incubaron a 37 °C por 6 horas en AIM-V 5% de plasma autólogo más 50 ng/ml de PMA y 500 ng/ml de ionomicina. Se añadieron 10 µg/ml de Brefeldin A por las últimas 3 horas de incubación. Los controles (cultivos no activados) se incubaron en presencia solamente de Brefeldin A. Las células se recolectaron, se lavaron y se fijaron con 2% de paraformaldehído en PBS por 20 minutos a temperatura ambiente, después de lo cual se lavaron y almacenaron por toda la noche en PBS a 4°C. Para tinsión intracelular, las células se lavaron y permeabilizaron por incubación en PBS más 1% BSA y 0.5% de saponina (S-7900, Sigma) por 10 minutos a temperatura ambiente. Las células activadas y las células de control se tiñeron con FITC-anti- IFN-? y con ficoeritina (PE) -anti-IL-4 , y con los controles de isotipo coincidente (FITC-anti -IgG2a y PE-anti-IgGl) de Becton-Dickinson. Después del teñido, las células se lavaron dos veces con PBS más 1% BSA y 0.5% saponina, una vez con PBS más 0.5% BSA, y se fijaron una segunda vez con 2% de paraformaldehído en PBS. El análisis se llevó a cabo con un FACScan, utilizando el software LYSIS II y WinMDI (amablemente proporcionado por Joe Trotter, Scripps Research Institute, La Jolla, CA) .

RESULTADOS Células Dendríticas Pulsadas con E7 de HPV Tipificación de HLA. Las células mononucleares de sangre periférica de los pacientes con cáncer cervical manifestaron los siguientes halotipos: Pt 1; HLA Al, A2 , B7, B41, CW7. Pt 2; HLA Al, A2, B57, B35, CW6. Pt 3; HLA Al, A2 , B7, B41, CW2 , CW7.

Respuestas Citotóxicas CD8+ Específicas del Tumor. Los estudios de citotoxicidad se llevaron a cabo después de un mínimo de 4 semanas posteriores a la estimulación de las células T con DC pulsado con E7. Para los pacientes 1 y 2, las células T se estimularon con DC pulsado con la proteína E7 de HPV 16, mientras que para el paciente 3, cuyo adenocarcinoma cervical llevaba HPV 18, las DC se pulsaron con proteína E7 de HPV 18. La fuerte lisis restringida por HLA clase I de las células de tumor autólogas en una proporción de célula efectora .-blanco de 20:1 fue observada para cada paciente (Figura 1), mientras que los linfocitos estimulados con DC en la ausencia de oncoproteína E7 no generaron respuestas específicas contra células de tumor autólogas (datos no mostrados) . Los resultados presentados en la Figura 1 representan la media de no menos de 8 estudios, con intervalos de 67 a 86% de lisis para el paciente 1, 26 a 67% de lisis para el paciente 2, y 36 a 70% de lisis para el paciente 3. Cierta citotoxicidad contra la línea celular sensible NK, K562, fue observada, pero esto en general sucedió en un nivel bajo, particularmente para el paciente 1. En todos los casos se observó una actividad de citotoxicidad mínima contra el LCL autólogo transformado por EBV (Figura 1) o los linfoblastos Con-A autólogos (no mostrados) . En el caso del paciente 1, se mostró que CTL CD8+ no solo mata las células de tumor autólogas sino que fueron líticas contra el LCL autólogo pulsado con E7/D0TAP, pero no contra blancos control de LCL pulsado con DOTAP, confirmando la especificidad de la respuesta citotóxica para E7 de HPV. El nivel menor de lisis de LCL autólogo pulsado con E7/DOTAP en comparación con células de tumor puede ser una reflexión de la ineficiencia relativa del método de liposoma catiónico para introducción de antígenos hacia la ruta de procesamiento y presentación HLA clase I, en comparación con la síntesis de la proteína endógena en las células de tumor. Se observa además que CTL CD8+ del paciente 1 fue citotóxico contra la línea celular CaSki infectada con HPV 16 alogénica (Figura 1) , que comparte la expresión HLA A2 con células de tumor provenientes del paciente 1 (es decir lisis que varía entre 47 a 52% a una proporción 20:1) . Este resultado sugeriría que la respuesta CD8+ específica para E7 en el paciente 1 es por lo menos en parte restringida por HLA A2. Los estudios de bloqueo indicaron que en todos los casos la lisis específica de tumor por las células T CD8+ fue inhibida por MAb específico para HLA clase I, el intervalo de inhibición fue de 65 a 91% para el paciente 1, 67 a 85% para el paciente 2, y 45 a 82% para el paciente 3. Además, encontramos que anti-CDlla (LFA-1) pero no el Mab anti-CD3 (OKT-3) fue capaz de bloquear la lisis del tumor en un grado significativo, el intervalo de inhibición entre 70 a 76% para el paciente 1, 63 a 65% para el paciente 2, y 49 a 57% para el paciente 3. Este hallazgo sugiere que la ruta de adhesión CDlla-CD54 es crítica para la lisis efectiva mediada por la célula T CD8+ de las células blanco de tumor cervical .

Análisis Fenotípico. El análisis citométrico de flujo fue utilizado para determinar el fenotipo de las poblaciones de las células T CD8+ estimuladas con E7 y DC, derivadas de los tres pacientes. Todas las células fueron CD3/CD8+ y CD4-, con una proporción variable de células CD56 antígeno positivas. Un análisis adicional reveló que la población era TCR-aß+ (95-98%), TCR-?d+ (2-5%), CD25+, HLA-DR+ y CD16- (datos no mostrados) . La expresión de CD56 en los linfocitos T se analizó además por inmunofluorescencia de dos colores (Figura 2) . Mediante esta técnica, las células T CD8+ se compararon para coexpresión de CD56. Diferentes porcentajes de los linfocitos T CD8+ (intervalo de 5 a 55%) coexpresaron al antígeno de superficie CD56 durante el cultivo y el porcentaje de la expresión CD56 fue mostrado en experimentos repetitivos mostrando estar estrechamente correlacionado con una actividad citotóxica alta (datos no mostrados) . Sin embargo, la expresión CD56 sobre las células T CD8+ no pareció ser un fenotipo estable. Efectivamente, varios experimentos revelaron que la expresión de este marcador se perdió por la mayoría de las células T CD8+/CD56+ previamente positivas cuando las células se cultivaron a dosis bajas de IL-2, solo para ser re-expresadas después de la re-estimulación con células de alimentación (es decir células de tumor irradiadas autólogas o PBL irradiado autólogo o alogénico) (datos no mostrados) .

Estudio de Proliferación. Las células T CD4+ más estimuladas con E7 (pureza >99%) se analizaron para determinar la proliferación específica contra LCL autólogo pulsado con E7. Como controles se usaron células LCL autólogas no pulsadas o células LCL pulsadas DOTAP autólogas. Como se muestra en la Figura 3, la proliferación específica fue detectable con LCL autólogo pulsado con E7 y fue significativamente superior (P < 0.01) que el inducido por LCL solo o LCL pulsado con DOTAP. Finalmente, la proliferación CD4+ más específica para E7 fue significativamente inhibida por la adición mAb a las moléculas MHC clase II (L243) (Figura 3) pero no por MAb anti-clase I (W6/32) (datos no mostrados) demostrando el reconocimiento de los epítopes presentados por una molécula o moléculas HLA-Clase II del LCL autólogo.

Expresión de Citocina Intramolecular por Células T Específicas de E7 de HPV-16 o HPV-18. Para evaluar si la expresión de citocina de las células T CD4+ y CD8+ estimuladas con E7 se segregaron en subconjuntos discretos de IFN-?+/lL-4- e IFN-?-/IL-4+, se utilizaron técnicas citométricas de flujo par la detección de la expresión de citocina intracelular al nivel de una célula. El análisis citométrico de flujo de dos colores de la expresión intracelular de IFN-? e IL-4 por los CTLs se efectuó después de 6 semanas de cultivo y posteriormente como se describe en la sección de métodos. Como se muestra en la Figura 4, la mayoría de las células T CD8+ contuvieron IFN-? intracelular pero no IL-4, mientras que un segundo subconjunto contuvo tanto IFN-? e IL-4 y un tercer subconjunto menor contuvo solo IL-4 (Figura 4) . Todos los pacientes revelaron patrones similares de expresión de citocina en las células T CD4+ (Figura 5) . Se obtuvieron resultados similares de manera consistente en varios análisis repetidos para todos los pacientes. Las células T CD8+ o CD4+ no activadas (es decir en reposo) de los tres pacientes no dieron la tinsión para IFN-? o IL-4 (Figura 4 y 5) . Similarmente , los controles de isotipo FITC-anti-IgG2a y P?-anti-IgGl no dieron la tinsión para las células T CD4+ o CD8+ ni activadas ni no activas (datos no mostrados) . El paciente 3 fue tratado con dos infusiones de células T específicas de tumor citotóxico estimuladas con DC, autólogas, pulsadas con E-7, a intervalos de 2 semanas y le siguió la distribución in vi vo de las células T. La acumulación persistente de radioactividad en los pulmones, el sitio de enfermedad metastática extensiva se detectó hasta 120 horas después de la infusión. Tomando conjuntamente los resultados se ilustra el potencial de la inmunoterapia a base de CTL específico de tumor y específico de E7 para el tratamiento de pacientes con cáncer cervical invasivo (54) . Esta invención demuestra que el DC autólogo pulsado por E7 de longitud completa puede estimular-una respuesta de célula T citotóxica CD8+, específica, que es capaz de matar a las células de tumor autólogas en pacientes con cáncer cervical invasivo. Se muestra que las DC pulsadas con E7 pueden producir respuestas proliferativas de célula T CD4+, antígeno específicas, a partir del mismo paciente. La oncoproteína E7 de HPV-16/18 fue seleccionada como un antígeno blanco por las siguientes razones: (a) HPV 16 y 18 se asocian con la basta mayoría de cánceres cervicales y las proteínas oncogénicas HPV E6 y E7, son importantes en la inducción y mantenimiento de transformación celular y se coexpresan en la mayoría de los cánceres cervicales que contienen HPV; y (b) E7 es una proteína citoplásmica/nuclear bien caracterizada con poca variación de secuencia intratípica y es más abundante que E6 en los cánceres cervicales asociados con HPV. Adicionalmente, la clonación y expresión en bacterias de E7 como una proteína de fusión GST hace que E7 esté disponible y permite la purificación por afinidad de proteína bajo condiciones no desnaturalizantes (21) y la producción de grandes cantidades de antígeno viral para el pulsado de DC . El uso de DOTAP de lípido catiónico fue mostrado como instrumental en la inducción de respuestas CTL CD8+ fuertes y específicas contra células de tumor de cáncer cervical, En este aspecto, mientras que la toxicidad intrínseca de DOTAP hacia DC fue baja, su función presumiblemente facilita la incorporación citoplásmica de antígenos hexógenos para la presentación restringida por MHC clase I hacia las células T CD8+. En forma consistente con este punto de vista, fue más difícil inducir los CTLs específicos contra los blancos de tumor autólogos cuando se utilizaron DCs pulsadas por toda la noche con E7, sin DOTAP (datos no mostrados) . Actualmente, la inmunoterapia a base de epítope para cáncer cervical se enfrenta a varias limitaciones importantes. Una de las principales es que las respuestas inmunológicas de la célula T ante una proteína son limitadas a aquellos epítopes presentados por las moléculas HLA hospederas. Esto impone severas limitaciones al uso de los péptidos sintéticos como inmunógenos en una población heterogénea (es decir exogámica) como son los humanos. En contraste, el uso de DCs autólogas pulsadas con E7 del serotipo HPV específico implicadas en el cáncer dejan a las células presentadoras de antígeno, profesionales, autólogas, el procesamiento y presentación de uno o más epítopes en asociación con las moléculas HLA hospederas. La generación de las respuestas inmunológicas CTL potentes requiere de la presencia de las células T auxiliares CD4 y la presencia de los determinantes CTL y auxiliares en la misma APC (8) . Efectivamente, la incapacidad de montar una respuesta inmunológica antitumor muy potente se ha atribuido normalmente a la falta de generación de suficiente ayuda de la célula T específica al tumor (6,38) . En estudios recientes, la persistencia in vi vo de las células T CD8+ específicas para el antígeno y transferidas adoptivamente, contra citomegalovirus (50) o bien la generación reforzada de CTLs específicos para hepatitis B (49) fue dependiente de las respuestas CD4 endógenas. Además, la generación de las células auxiliares T reactivas ante el tumor ha mostrado ser particularmente importante para la inmunoterapia de los tumores establecidos (es decir vascularizado) y de la enfermedad metastática en varios modelos de tumor murino (7,40) . Por lo tanto, la estimulación de respuestas de célula T específicas para E7, CD8+ y CD4 + , sería terapéuticamente más efectiva contra cáncer cervical que las células T CD8+ solas. En esta invención, se muestra que las DC pulsadas con E7 pueden fácilmente estimular las respuestas de célula T CD4+ proliferativas , restringidas en HLA clase II, específicas para E7, además de una respuesta efectiva de CTL CD8 + , específica para el tumor. La inmunoterapia con células T CD4+ y CD8+ específica para E7 de HPV puede promover de esta manera el establecimiento de inmunosupervisión específica del tumor, a largo plazo, in vivo . Una proporción significativa de la citotoxicidad específica del tumor autólogo fue inhibida por el anticuerpo anti-HLA Clase I. Anti-CDlla/LFA-1, a diferencia del MAb anti-CD3 también fue capaz de bloquear significativamente la exterminación de la célula blanco por el CTL CD8+.

Por lo tanto, estos datos indican que la mayoría de la citotoxicidad contra las células de tumor autólogas fue mediada por CTLs restringidos con HLA •clase I, específicos del antígeno, utilizando LFA-1 como un receptor accesorio para el reconocimiento eficiente de la célula blanco dependiente de TCR (para revisión ver la referencia 47) . La exterminación de K562 fue más baja o estuvo ausente para CTL del paciente 1, pero fue detectable en las poblaciones CTL de los pacientes 2 y 3. El LCL autólogo no fue exterminado significativamente por los CTLs específicos de E7 a menos que se sometieran a pulsos con oncoproteínas E7, confirmando que aunque estos CTL fueron altamente citolíticos para las células de tumor autólogas, no exterminaron a las células blanco E7-negativas de HPV, autólogas. Finalmente cuando el CTL del paciente 1 fue analizado respecto a su capacidad de lisar específicamente un tumor blanco cervical alogénico (CaSki) (pero coincidente con HLA-A2+/HPV16+) , la fuerte exterminación se detectó de manera consistente (intervalo de 47 a 52% a una proporción de 20:1) . La lisis de CaSki fue inhibida significativamente con MAb anti-HLA clase I (W6/32) (intervalo 58-72%) indicando citotoxicidad restringida HLA Clase I . Para los tres pacientes, el análisis fenotípico del CTL reveló una subpoblación CD8+/CD56+ significativa. Esta observación está en concordancia con los resultados de Hilders, quien 'describe la expresión de CD56 mediante CTL CD8+ derivado de linfocitos que infiltran el tumor (TIL por sus siglas en inglés) provenientes de un paciente de cáncer cervical (23) . Aunque CD56 puede verse como un marcador del linaje NK, los CTL descritos en este estudio fueron restringidos por HLA clase I, a diferencia del TIL descrito por Hilders y sus colegas (23) . La clasificación de células activadas por fluorescencia para células T CD56ni y CD56ls no proporcionó poblaciones estables de CTL CD8+ parecidos a NK, no restringidos por HLA o restringidos por HLA, aunque si se observó que las células T CD8+ de CD56 fueron consistentemente mas fuertemente citotóxicas que las células T CD8+ de lo CD56 (datos no mostrados) . Por lo tanto, la expresión de CD56 por CTL CD8+ puede ser un antígeno de activación asociado con la función citotóxica, en lugar de un marcador específico de linaje. La protección mediada por células T a partir de la infección viral así como el control de los tumores se piensa es promovida por las respuestas de citocina Tipo 1 y menguada por las respuestas de citocina Tipo 2 (para revisión ver referencia 43) . En general, las células T Tipo 1 (CD4 o CD8) expresan IL-2, IFN-?, y TNFa/ß y son citotóxicas, mientras que las células T Tipo 2 expresan IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13, proporcionando ayuda suficiente para la activación de la célula B y son no citotóxicas. En forma consistente con esta observación, las células T Tipo 1 productoras de IL-2 e IFN-? se considera promueven el desarrollo de inmunidad mediada por células contra neoplasmas asociados con HPV. Recientes estudios de Tsukui (48) y Clerici (16) han mostrado disfunción significativa de las respuestas de las células T Tipo 1 en pacientes con alto grado de lesiones intraepiteliales cervicales y con cáncer cervical invasivo, sugiriendo que la progresión hacia el cáncer cervical de las lesiones precursoras puede estar asociada con una respuesta preferencial de la célula T Tipo 2. La presente invención aprovecha una técnica citométrica de flujo recientemente desarrollada para detectar la expresión de citocina intracelular al nivel de célula simple en células T CD8+ y CD4+ estimuladas con E7, HPV 16 ó 18. El análisis citométrico de flujo de dos colores de la expresión intracelular de IFN-? y de IL-4 por las células T específicas para E7, CD8+ y CD4 + , demostraron que las células T específicas de HPV de los pacientes con cáncer cervical mostraron una desviación principal Tipo 1 en la expresión de citocina. Efectivamente, la mayor parte de las células T que expresan citocina mostraron expresión de IFN-? mientras que una minoría expresó solamente IL-4 (Figura 4 y 5) . Por lo tanto, estos hallazgos apoyan la observación de que incluso en pacientes con una infección HPV progresiva que conduce a un cáncer cervical invasivo, la presentación de E7 de HPV por las DCs todavía es posible, por lo menos in vi tro , para activar una fuerte respuesta de la célula T Tipo 1 y que la expresión de citocina Tipo 1 está asociada con alta actividad citotóxica contra las células de tumor autólogas por las células T CD8+. Muchas estratégicas recientes a base de genes en la inmunoterapia del cáncer se han enfocado en la modificación genética de los tumores con objeto de aumentar su inmunogenicidad intrínseca. Sin embargo, se está haciendo cada vez más evidente que la inducción eficiente de las respuestas CTL específicas de tumor requiere la presentación de los péptidos antigénicos relevantes ante las células T por APCs de hospedero profesionales (27) . Los reportes recientes utilizando DC pulsadas con péptidos específicos ya han mostrado una gran promesa del tratamiento efectivo de malignidades humanas mediante la intervención inmunológica (26,34) . Conjuntamente, los hallazgos de este documento ilustran la factibilidad de las vacunas DC pulsadas con E7 de longitud completa o la inmunoterapia adoptiva con las células T cebadas con DC y con especificidad para E7, como una estrategia poderosa para la prevención y tratamiento de cáncer cervical asociado con HPV (52) .

Células Dendríticas Pulsadas con Lisado de Tumor Respuestas Citotóxicas CD8+ Especificas al Tumor Los estudios de citotoxicidad se realizaron después de un mínimo de 4 semanas posteriores a la iniciación de los cultivos de linfocito T y los resultados presentados en la Figura 6 representan la media de no menos de 5 estudios para cada paciente. La citotoxicidad de célula T CD8+ contra los blancos de la célula de tumor autólogos se demostraron para los 3 pacientes, variando de 32 a 50% (PT1) , de 13 a 35% (PT2) , y de 27 a 53% (PT3) en 20 efectores por blanco. La citotoxicidad con la línea celular sensible NK, K562, fue detectable a un nivel bajo en todos los pacientes. La ausencia de citotoxicidad contra linfoblastos Con-A autólogos (Paciente 2) o LCL transformado con EBV autólogo (Pacientes 1 y 3) (Figura 1) mostraron que aunque estas células fueron altamente citotóxicas contra células de tumor autólogas, no pudieron exterminar a las células normales o células autólogas infectadas con EBV. Los estudios de bloqueo demostraron en todos los casos que la actividad lítica específica del tumor contra los blancos de tumor autólogos fue inhibida por el pretratamiento de blancos de tumor con MAb específico para HLA clase I (W6/32) (rango de inhibición: de 52 a 75% (PT1) , de 41 a 65% (PT2), de 65 a 95% (PT3) (Figura 6) pero no con el pretratamiento por controles de isotipo (datos no mostrados) . En el paciente 1 también mostramos que los MAbs específicos para anti-CDlla (LFA-1) fueron capaces de bloquear la lisis del tumor a un grado significativo, el rango de inhibición fue de 35 a 76%. Estos hallazgos sugieren que la ruta de adhesión CDlla-CD54 puede desempeñar un papel crítico en la lisis efectiva mediada por células T CD8+ de las células blanco de tumor ovárico (Figura 6) . Finalmente, cuando se utilizó MAb BB7-2 para bloquear la citotoxicidad en paciente 3, (un MAb anti HLA-A2 , que también encontramos fue reactivo contra las moléculas HLA-A26 clase I mediante FACS) (datos no mostrados) , una reducción en la exterminación fue evidente (rango de inhibición de 67 a 94%) (Figura 6) . Por lo tanto, estos datos indican la importancia de este elemento de restricción en la presentación de epítopes inmunogénicos por las células de tumor de este paciente (55) .

Análisis Fenotípico Se utilizó análisis citométrico de flujo para determinar el fenotipo de las poblaciones de células T estimuladas por DC, pulsadas con lisado de tumor derivadas de los tres pacientes. Casi todos los linfocitos cultivados fueron células T que expresan el antígeno CD3 sobre la superficie (85% a 95%) . Los linfocitos activados DC, pulsados con lisado de tumor en las tres semanas de cultivo consistieron de subpoblaciones con una predominancia de células T CD4+ (rango de 50 a 72%) sobre células T CD8+ (rango de 31 a 45%) . Las células CD56+ variaron de 15 a 27%. El estudio de citotoxicidad in vi tro se llevó a cabo utilizando poblaciones puras de célula T CD8+ (es decir más de 95% CD8 + ) . Todas estas células fueron CD3+/CD8+ y CD4-, con una proporción variable de células CD56+. Un análisis adicional reveló las poblaciones de células T CD8+ también como CD25+, HLA-DR+ y CD16- (datos no mostrados) . Las células T CD8+ también se compararon para la coexpresión de CD56 mediante inmunofluorescencia de dos colores (datos no mostrados) . La expresión de CD56 fue recientemente asociada a la función citotóxica en células T CD8+ humanas (12) . Diferentes porcentajes de linfocitos T CD8+ (rango de 5 a 35%) coexpresaron al antígeno de superficie CD56 durante el cultivo. Sin embargo, la coexpresión de CD56 en las células T CD8+, como ya se reportó previamente durante la caracterización de las poblaciones CTL obtenidas de los pacientes con cáncer cervical (11) , no pareció ser de un fenotipo estable.

Expresión de Citocina Intracelular por Células T Especificas del Tumor Para evaluar si la expresión de citocina a partir de células T CD8+ estimuladas por el tumor inducidas en pacientes con una etapa avanzada de cáncer ovárico se segregaban en subconjuntos discretos de IFN-?+/lL-4- e IFN-?-/IL-4+ aprovechamos las técnicas citométricas de flujo recientemente desarrolladas para la detección de la expresión de citocina intracelular al nivel de célula simple. El análisis citométrico de flujo de dos colores de la expresión intracelular de IFN-? y de IL-4 por los CTLs CD8+ fue desarrollada después de por lo menos 6 semanas de cultivo, como se describe en la sección de métodos. La mayoría de las células T de CD8+ de todos los pacientes contuvieron IFN-? intracelular, mientras que un segundo subconjunto solo contuvo IL-4 y un tercer subconjunto contuvo a ambos. Se obtuvieron resultados consistentemente similares en varios análisis repetitivos de diferentes cebados para todos los pacientes. Consistentemente, encontramos que los números más altos de los expresores IFN-? por arriba de los secretores IL-4 entre las poblaciones de células T CD8+ estaban asociados con actividad citotóxica superior contra células de tumor autólogas (datos no mostrados) . Las células T CD8+ no activadas (es decir en reposo) de los tres pacientes no dieron tinsión para IFN-? o IL-4 (datos no mostrados) . Similarmente, los controles de isotipo FITC-anti- IgG2a y PE-anti-IgGl no dieron tinsión para células T CD4+ o CD8+ ni activadas ni no activadas (datos no mostrados) . (55) Células Dendríticas Pulsadas con Péptido Eluido con Ácido Las respuestas del linfocito T citotóxico CD8+ inducidas por DCs pulsadas con péptido contra células de tumor ovárico autólogas fueron producidas en tres mujeres consecutivas que tenían cáncer ovárico avanzado. Aunque las poblaciones de linfocito T citotóxico de todas las mujeres expresaron fuerte actividad citolítica contra células de tumor autólogas, no lisaron a los linfoblastos autólogos o a las líneas celulares transformadas por EBV y mostraron citotoxicidad despreciable contra la línea celular sensible a las células citolíticas naturales, K-562. La citotoxicidad contra las células de tumor autólogas fue significativamente inhibida por los anticuerpos monoclonales anti-HLA clase I (W6/32) y anti-HLA-A2 (BB7-2) . El linfocito T citotóxico CD8+ expresó a niveles variables de CD56 y de preferencia expresó IFN-? en lugar de IL-4. (53) Las publicaciones y referencias citadas aquí se incorporan en su totalidad como referencia.

REFERENCIAS CITADAS EN LA SOLICITUD 1. Alexander, M. et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 175:1586-1593 (1996) . 2. Alexander, M.A. et al., J. Exp. Med. 173 :849-858 (1991) . 3. Alexander-Miller, M.A. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 93:4102-4107 (1996) . 4. Antinore, M.J. et al., EMBO J. 15:1950-1960 (1996) . 5. Bal, V. et al., Eur. J. Immunol . 20:1893- 1897 (1990) . 6. Baskar, S. et al., Cell. Immunol . 155:123-133 (1994) . 7. Baskar, S. et al., J . Exp . Med. 181:619-629 (1998) . 8. Bennett, S.R.M. et al., J. Exp. Med. 186:65-70 (1997) . 9. Beverly, P.C. et al., Ciba Found. Symp . 187:78-86 (1994) . 10. Borysiewicz, L.K. et al., Lancet. 347:1523- 1527 (1996) . 11. Bosh, F.X. et al., J. Nat. Cáncer Inst . 87: 796-802 (1995) . 12. Brinton, L.A., The epidemioloay of human papillomavirus and cervical cáncer. N. Muñoz, et al. (eds.), Lyon, France IARC Science Publications . 119:3-23 (1992) . 13. Carbone, F.R. et al., J. Exp. Med. 167:1767-1779 (1998) . 14. Chen, L. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 88.110-114 (1991) . 15. Chen, L. et al., J. Immunol . 148:2617-2621 (1992) . 16. Clerici, M. et al., J. Nati. Cáncer Inst . 89 :245-250 (1997) . 17. Connor, M.E., and Stern, P.L., Int. J. Cáncer. 46:1029-1034 (1990) . 18. De Bruijn, M.L.H. et al., Cáncer Res. 58 :724-731 (1998) . 19. Evans, E. M-L. et al., Cáncer Res. 57:2943-2950 (1997) . 20. Fujinaga, Y. et al., J. Gen. Virol . 72:1039- 44 (1991) . 21. Guan, K., and Dixon, J.E., Anal. Biochem. 192 :262-267 (1991) . 22. Higgins, G.D. et al., J. Gen. Virol. 73:2047-2057 (1992) . 23. Hilders, C.G.J.M. et al., Int. J. Cáncer. 57 : 805-813 (1994) . 24. Honma, S. et al., Int. J. Cáncer. 57:650-655 (1994) . 25. Hopkins, K.A., ASHI laboratorv manual .

Lenexa (KS) : American Society for Histocompat ibility and Immunogenetics . 195-201 (1990) . 26. Hsu, F.J. et al., Nature Med. 2:52-58 (1996) . 27. Huang, A.Y.C. et al., Science. 264:961-965 (1994) . 28. Jochmus, I. et al., J. Gen. Virol. 78:1689-1695 (1997) . 29. Mclntyre, M.C. et al., Virology, 215:73-82 (1996) . 30. Meneguzzi, G. et al., Virol. 181:62-69 (1991) . 31. Molero, I. et al., J. Virol. 71:3998-4004 (1997) . 32. Nasiell, K. et al., Obstet . Gynecol. 67:665- 669 (1986) . 33. Nazaruk, R.A. et al., Blood. 91:3875-3883 (1998) . 34. Nestle, F.O. et al., Nature Med. 4:328-332 (1998) . 35. Nikoloff, B.J. and Turka, L.A., Immunol . Today. 15:464-469 (1994) . 36. Nimaco, M. et al., Cáncer Res. 57:4855-4861 (1997) . 37. Openshaw, P.J.M. et al., J. Exp. Med. 182 :1357-1364 (1995) . 38. Ossendorp, F. et al., J. Exp. Med. 187:5, 693-702 (1998) . 39. Penn, I., Cáncer. 53:539-545 (1988) . 40. Pulaski, B.A. and Ostrand-Rosenberg, S, Cáncer Res. 58:1486-1493 (1998) . 41. Rellihan, M.A. et al., Gynecol. Oncol . 36:435-438 (1990) . 42. Ressing, M.E. et al., J. Immunol . 154:5934-5943 (1995) . 43. Romagnani, S., Int. Arch. Allergy Immunol . 98 :279-285 (1992) . 44. Romani, N. et al., J. Exp. Med. 180:83-93 (1994) . 45. Steinman, R.A.. Ann . Rev. Immunol . 9:271-296 (1991) . 46. Stoler, M.H. et al., Hum. Pathol . 23:117-128 (1992) . 47. Thiele, D.L. and Lipsky, P.E. Immunol . Today . 10:375-381-(1989) . 48. Tsukui, T. et al., Cáncer Res. 56:3967-3974 (1996) . 49. Vitiello, A. et al. J. Clin. Invest . 95:341-349 (1995) . 50. Walter, E.A. et al., N. Engl . J. Med. 333 :1038-1044 (1995) . 51. Young, J.W. and Inaba, K. , J. Exp. Med. 183 :7-ll (1996) . 52. Santin et al. J .Virol .73 -.5402-5410 (1999) . 53. Santin et al. Obstet Gynecol 2000 ;XX (In Press) - "Induction of Ovarían Tumor-Specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes by Acid-Eluted Peptide-Pulsed Autologous Dendritic Cells". 54. Santin et al. European Journal of Gynaecologi cal Oncology 21 (í):17-23 (2000). 55. Santin et al . (Manuscript In Press) "Induction of Tumor-Specific CD8+ Cytotoxic T Lymphocytes by Ovarían -Tumor Antigen-Pulsed Autologous Dendritic Cells in Patients with Advance Ovrian Cáncer"

Claims (53)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES ; 1. Un método para preparar células dendríticas humanas que contienen antígenos, en donde el método comprende : someter las células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno.
2. 2. El método según la reivindicación 1, en donde las células dendríticas son células dendríticas parcialmente maduras.
3. 3. El método según la reivindicación 1, en donde las células dendríticas son células dendríticas totalmente maduras .
4. 4. El método según la reivindicación 4, en donde las células dendríticas han madurado por incubación con por lo menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de: factor de necrosis tumoral (TNF) , interleucina-1 (IL-1) , prostaglandina (PG) , GM-CSF, y una combinación de los mismos.
5. 5. El método según la reivindicación 4, en donde la citocina comprende TNF-a, IL-lß, PGE2a, y GM-CSF.
6. 6. El método según la reivindicación 1, en donde el liposoma catiónico es DOTAP o Reactivo Lipofectin®.
7. 7. El método según la reivindicación 1, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico del tumor, seleccionado del grupo que consiste de una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de la célula de tumor y un lisado de la célula de tumor.
8. 8. El método según la reivindicación 7, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
9. 9. El método según la reivindicación 3, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico del tumor seleccionado del grupo que consiste de una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de la célula de tumor y un lisado de célula de tumor.
10. 10. El método según la reivindicación 9, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
11. 11. Una célula dendrítica humana pulsada con antígeno producida por el método de la reivindicación 1.
12. 12. Una célula dendrítica humana pulsada con antígeno producida por el método de la reivindicación 3.
13. 13. Un método para producir linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, humanos, específicos para antígeno, que comprende: someter las células dendríticas humanas a pulsación con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno; e incubar los linfocitos T humanos con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno bajo condiciones que promueven la generación de linfocitos T específicos para el antígeno, la especificidad a ese antígeno es con respecto al antígeno con el cual las células dendríticas se sometieron a pulsos.
14. 14. El método según la reivindicación 13, que además comprende : medir la respuesta del linfocito T específico del antígeno contra una muestra de tejido que proviene de un sujeto humano del cual se obtuvieron los linfocitos T humanos.
15. 15. El método según la reivindicación 13, en donde los linfocitos T humanos y las células dendríticas humanas pulsadas son autólogas.
16. 16. El método según la reivindicación 13, en donde las células dendríticas son células dendríticas parcialmente maduras.
17. 17. El método según la reivindicación 13, en donde las células dendríticas son células dendríticas totalmente maduras .
18. 18. El método según la reivindicación 17, en donde las células dendríticas han madurado por incubación con por lo menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de: factor de necrosis tumoral (TNF) , interleucina- 1 (IL-1) , prostaglandina (PG) , GM-CSF, y una combinación de las mismas.
19. 19. El método según la reivindicación 18, en donde la citocina comprende TNF-a, IL-lß, PGE2a, y GM-CSF.
20. 20. El método según la reivindicación 13, en donde el liposoma catiónico es DOTAP o Reactivo Lipofectin® .
21. 21. El método según la reivindicación 13, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico para el tumor, seleccionado del grupo que consiste de una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de la célula de tumor y un lisado de célula de tumor.
22. 22. El método según la reivindicación 21, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
23. 23. El método según la reivindicación 17, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico del tumor seleccionado del grupo que consiste de proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de la célula del tumor y un lisado de la célula del tumor.
24. 24. El método según la reivindicación 23, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
25. 25. Una composición que comprende linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+, humanos, producidos por el método de la reivindicación 13.
26. 26. Una composición que comprende linfocitos T auxiliares CD4+ y linfocitos T citotóxicos (CTL) CD8+ , humanos, producidos por el método de la reivindicación 17.
27. 27. Un método para estimular el sistema inmunológico de un sujeto humano, que comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, en donde las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno son obtenidas al someter las células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, mediante lo cual el sistema inmunológico es estimulado por la respuesta del linfocito T del sujeto ante el antígeno con el cual se pulsaron las células dendríticas.
28. 28. El método según la reivindicación 27, en donde la respuesta de linfocito T es la respuesta de linfocito T citotóxico CD8+ y la respuesta de linfocito T auxiliar CD4+.
29. 29. El método según la reivindicación 27, en donde las células dendríticas humanas pulsadas con antígenq se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable adecuado para uso humano.
30. 30. El método según la reivindicación 27, en donde las células dendríticas son células dendríticas parcialmente maduras.
31. 31. El método según la reivindicación 27, en donde las células dendríticas son células dendríticas totalmente maduras .
32. 32. El método según la reivindicación 31, en donde las células dendríticas han madurado a través de la incubación con por lo menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de: factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina- 1 (IL-1), prostaglandina (PG) , GM-CSF, y una combinación de los mismos .
33. 33. El método según la reivindicación 32, en donde la citocina comprende TNF-a, IL-lß, PGE2a, y GM-CSF.
34. 34. El método según la reivindicación 27, en donde el liposoma catiónico es DOTAP o Reactivo Lipofectin® .
35. 35. El método según la reivindicación 27, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico del tumor, seleccionado del grupo que consiste de: una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de la célula del tumor y un lisado de la célula del tumor.
36. 36. El método según la reivindicación 35, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
37. 37. El método según la reivindicación 31, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con un tumor o un antígeno específico del tumor seleccionado del grupo que consiste de: una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con el ácido de la célula de tumor y un lisado de la célula de tumor.
38. 38. El método según la reivindicación 37, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
39. 39. El método según la reivindicación 35, en donde las células de los linfocitos T humanos, las células dendríticas humanas pulsadas, los lisados de célula de tumor y el péptido eluido con ácido de célula de tumor son autólogos con el sujeto.
40. 40. Un método para estimular el sistema inmunológico de un sujeto humano que comprende administrar al sujeto humano una cantidad terapéuticamente efectiva de los linfocitos T humanos estimulados, en donde los linfocitos T fueron estimulados por incubación - con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, en donde las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno se obtienen sometiendo las células dendríticas humanas a pulsos con liposomas catiónicos que comprenden por lo menos un antígeno, a fin de obtener células dendríticas humanas pulsadas con antígeno, mediante lo cual el sistema inmunológico es estimulado por la respuesta del linfocito T del sujeto humano ante el antígeno con el cual fueron pulsadas las células dendríticas.
41. 41. El método según la reivindicación 40, en donde la respuesta de linfocito T es la respuesta del linfocito T citotóxico CD8+ y la respuesta de linfocito T auxiliar CD4+.
42. 42. El método según la reivindicación 40, en donde los linfocitos T humanos estimulados se combinan con un portador farmacéuticamente aceptable para uso humano.
43. 43. El método según la reivindicación 40, en donde las células dendríticas son células dendríticas parcialmente maduras .
44. 44. El método según la reivindicación 40, en donde las células dendríticas son células dendríticas totalmente maduras .
45. 45. El método según la reivindicación 44, en donde las células dendríticas han madurado a través de la incubación co, por, lo menos una citocina seleccionada del grupo que consiste de: factor de necrosis tumoral (TNF), interleucina- 1 (IL-1), prostaglandina (PG) , GM-CSF, y una combinación de las mismas .
46. 46. El método según la reivindicación 45, en donde la citocina comprende TNF-a, IL-lß, PGE2a, y GM-CSF.
47. 47. El método según la reivindicación 40, en donde el liposoma catiónico es DOTAP o Reactivo Lipofectin® .
48. 48. El método según la reivindicación 40, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico del tumor, seleccionado del grupo que consiste de una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de célula de tumor y un lisado de célula de tumor.
49. 49. El método según la reivindicación 48, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
50. 50. El método según la reivindicación 44, en donde el antígeno es un antígeno viral, un antígeno asociado con tumor o un antígeno específico del tumor, seleccionado del grupo que consiste de una proteína de longitud completa, un péptido, un péptido eluido con ácido de célula de tumor y un lisado de célula de tumor.
51. 51. El método según la reivindicación 50, en donde la proteína de longitud completa es la oncoproteína E7 o E6 de HPV.
52. 52. El método según la reivindicación 48, en donde las células de los linfocitos T humanos y las células dendríticas humanas pulsadas, el lisado de célula de tumor y el péptido eluido con ácido de célula del tumor son autólogos con el sujeto.
53. 53. Una composición farmacéutica que comprende células seleccionadas del grupo que consiste de: (a) células dendríticas humanas pulsadas con antígeno producidas por el método de la reivindicación 1; (b) linfocitos T citotóxicos CD8+ humanos, específicos (CTL) y linfocitos T auxiliares CD4+ incubados con las células dendríticas humanas pulsadas con antígeno del (a) ; (c) una combinación de las células de (a) y (b) ; y un portador farmacéuticamente aceptable.