MXPA00005493A - Ribozimas capaces de conferir resistencia a infeccion con potyvirus y plantas que expresan dichas ribozimas - Google Patents

Abstract

La invención concierne a una molécula deácido nucleico, llanada poliribozima, que tiene actividad de endoribonucleasa, comprendiendo al menos primera y segunda regiones de hibridación y al menos dos regiones catalíticas, siendo complementarias dichas primera y segunda regiones de hibridación a las primera y segunda regiones objetivo, respectivamente, en el RNA (+) genómico de un potyvirus, o en el RNA de filamento (-) de replicación de un potyvirus, estando dichas primera y segunda regiones objetivo ya sea:dentro o comprendiendo diferentes genes o regiones sin trasladar en el mismo filamento de RNA, o en diferentes filamentos de RNA, o dentro de una región que corresponde a un gene o cistrón en el RNA de filamento (-) de replicación.

Description

RI BOZI MAS CAPACES DE CONFERI R RESISTENCIA A I N F ECCIÓN CON POTYVI RUS Y PLANTAS QU E EXPRESAN DICHAS RIBOZI MAS La presente invención se refiere a una clase de "ribozimas", es decir, moléculas de ácido nucleico que tienen actividad de endoribonucleasa, las cuales son capaces de conferir en plantas, resistencia a la infección con potyvirus. La invención también se refiere a plantas y células de plantas que expresan las ribozimas, y que m uestran resistencia o tolerancia a la infección con potyvirus. Los potyvirus pertenecen al su pergrupo similar a picorna de virus, y dentro de este supergrupo, a la familia de los potyviridae. Los potyvirus son principalmente transmitidos por áfidos, aunque algunos son transmitidos por garrapatas, moscas blancas u hongos. Son unos de los patógenos de plantas más esparcidos en el m undo, provocando especialmente una severa enfermedad en cucurbitáceas en muchos países.

Los potyvirus incluyen : virus de mosaico amarillo de calabacita (ZYMV) , virus de mosaico de sandía 2 (WMV2) , virus de moteado de venas de tabaco (TVMV), virus de grabado de tabaco (TEVj, virus Y de papa (PVY) , virus de moteado de pimienta (PepMoV) , virus de mosaico de soya (SbMV) , virus de anillada de papaya (PRSV), virus de mosaico soportado en sem illa de chícharo (PSbMV) , virus de mosaico de nabo (TuMV) , virus de mosaico de pasto Johnson (JGMV), virus pox de ciruela (PPV), virus de ma íz enano (MDV) , virus de mosaico de frijol común (BCMV), virus de mosaico amarillo de frijol (BYMV), virus de moteado de vena de clavel (CarVMV) , virus de mosaico de apio (CeMV) , virus de vena amarilla de trébol (CIYVV), virus de mosaico de beleño (HMV) , virus de mosaico de lechuga (LtMV), virus de mosaico de caña de azúcar (SCMV). Los potyvirus considerados como cepas de los potyvirus anteriores, o de una relación incierta para los virus anteriores, e incluidos en la definición de "potyvirus" para los fines de la presente i nvención , incluyen: virus de mosaico de trébol, virus de mosaico de datura, virus de mosaico de desmodium , virus de mosaico de fresia, virus de mosaico de mungbean, virus de anillada de fruta de la pasión, virus de necrosis de chícharo, virus de papa dulce A, virus de mosaico de papa salvaje. Los posibles miembros de la familia de Potyvirus incluyen: virus de mosaico de zanahoria , virus latente de apio, virus de mosaico de palma y virus de helécho. De estos virus, WMV2, ZYMV y PRSV son responsables de una severa reducción de la producción en las cosechas de cucurbitáceas. La resistencia completa a la infección por potyvirus, ocurre rara vez en cosechas económicamente importantes, aunque es más común la tolerancia, en plantas que son susceptibles a infección pero que ya sea permanecen asintomáticas o solo desarrollan lentamente síntomas indiscernibles y frecuentemente soportan la replicación de virus restringida. El establecimiento de un medio para impartir resistencia a la infección con potyvirus y/o desarrollo de enfermedad claramente tendría una considerable importancia económica .

Además de cultivo para resistencia, se ha explorado una variedad de aproximaciones usando la ingeniería genética en un intento por proporcionar resistencia a potyvirus. Por ejemplo, Van der Vlugt (Plant Molecular Biology, 1 992, vol. 20: 631 -639) produjo plantas de tabaco transgénicas expresando tanto RNA de proteína de recubrimiento (CP) trasladable como no trasladable a partir de PVY. En algunas plantas se observó la completa protección (es decir, com pletamente libre de virus sistémicamente esparcidos) siguiendo la inoculación mecánica de planta de tabaco transformada , ya sea que el RNA de CP fuera trasladado o no. El trabajo descrito no se extendió a probar la resistencia contra la inoculación por áfidos, o contra otros potyvirus relacionados y no relacionados. La inmunidad a la infección por ZMV en plantas de melón amarillo expresando el gene de CP de ZYMV de long itud completa ha sido reportada por Fang y Grumet (Mol. Plant-Microbe I nteractions, 1 993, vol. 6 no. 3: 358-367). También se exhibió protección por plantas expresando ya sea un núcleo conservado, truncado, del gene de CP, o un RNA antisentido de CP, aunque estos constructos fueron reportados por ser menos eficientes, que el gene de CP de sentido de longitud completa. Estos resultados están en contraste con aquéllos obtenidos por Lindbo y Dougherty (Mol. Plant-Microbe Interactions, 1992, vol. 5: 144-1 53), donde la expresión de RNA de CP de TEV de sentido traslacionalmente deficiente y antisentido, resultó en una protección mucho mayor contra la infección de TEV que la conferida por la expresión de la versión de sentido del gene de CP de longitud completa. La efectividad de la proteína de recubrimiento y técnicas antisentido para obtener resistencia a potyvirus parece, en consecuencia, haber cumplido con éxito variante dependiendo de los constructos precisos y virus involucrados. Otra aproximación ha sido descrita por Van der Vlugt et al (Virus Research, 1 993, vol . 27: 1 85-200), quien sintetizó dos ribozimas contra una región relativamente conservada del cistrón que cod ifica RNA polimerasa, dependiente de RNA (también conocido como el cistrón Nlb) de PVY. La terna objetivo de estas ribozimas es GUC en la posición 8122-81 24 de PVYn como se describió en Robaglia ( 1 989) . Estas ribozimas fueron probadas in vitro contra un RNA objetivo específico de PVY, artificial . Mientras que la ribozima de "brazo largo" (longitud de brazo total de 1 06 bases) cortó el RNA de substrato de manera eficiente, la ribozima de "brazo corto" (longitud de brazo total de 1 9 bases) falló en el corte. Sin embargo, esta ribozima de brazo corto fue capaz de cortar un transcripto de RNA específico de PVY mucho más corto. Los autores concluyen que la actividad de corte de la ribozima es determinada, en parte, por el substrato involucrado, el RNA siendo probable que el RNA de substrato largo, tal como RNA viral de longitud completa, posea una extensa estructura secundaria, la cual prevenga la formación de la estructura de cabeza de martillo de ribozima correcta y de esta manera prevenga el corte. No se describen pruebas in vivo para estas ribozimas.

El problema técnico que sirve de fundamento a la presente invención es proporcionar un medio para conferir protección , en plantas, a la infección con potyvirus, o desarrollo de enfermedad. De manera ventajosa, el medio proporciona protección para un gran número de plantas huésped contra un potyvirus particular y para potyvirus serológicamente relacionados, de preferencia en el estado heterócigo. La presente invención proporciona una solución al problema técnico anterior al proporcionar moléculas de ácido nucleico o "ribozimas" que tienen actividad de endoribonucleasa, las cuales son diseñadas para cortar específicamente RNA potyviral de longitud completa, (ya sea RNA genómico de sentido (+) y/o el RNA de filamento de replicación de sentido (-))- Las ribozimas de la presente invención pueden com prender regiones catal íticas sim ples o múltiples ("mono" o "poli" ribozimas) . La presente invención se refiere a una molécula de ácido nucleico llamada "ribozima", que tiene actividad de endoribonucleasa, comprendiendo al menos una región de hibridación y al menos una región catal ítica, siendo com plementaria dicha región de h ibridación a una o más regiones objetivo del RNA (+) genómico de un potyvirus, y/o a una o más regiones objetivo del RNA de filamento (-) negativo de replicación. De manera ventajosa, dicha reg ión objetivo no contiene la terna GUC ubicada en la posición 81 22-81 24 de la cepa PVYn o la terna eq uivalente de otros potyvirus. De manera más particular, la invención se refiere a una molécula de ácido nucleico, llamada poliribozima, que tiene actividad de endoribonucleasa, com prend iendo al menos primera y segunda regiones de hibridación y al menos dos regiones catalíticas, siendo complementarias dichas primera y segunda regiones de hibridación a las primera y segunda regiones objetivo, respectivamente, en el RNA (+) genómico de un potyvirus, o en el RNA de filamento (-) de replicación de un potyvirus, estando dichas primera y segunda regiones objetivo, ya sea: - dentro de, o comprendiendo, diferentes genes o regiones sin tralsadar en el mismo filamento de RNA, o - en diferentes filamentos de RNA, o - dentro del mismo gene en el RNA de filamento (-) de replicación. La resistencia proporcionada por las ribozimas de la presente invención es, por una variedad de razones, inesperada en la base de conocimiento previos. De manera específica, se ha mostrado tanto por los presentes inventores como por otros autores (Edington y Nelson, Gene Regulation - Biology of Antisense RNA and DNA (Regulación de genes -biología de RNA y DNA antisentido), Ed. Erickson e Izant, Raven Press Ltd . Nueva York, 1 992) , que los resultados de corte in vitro obtenidos con las ribozimas no siempre son predecibles de situaciones in vivo. En consecuencia, los datos in vitro obtenidos por Van der Vlugt (1993 supra) pueden no ser extrapolados de manera confiable a situaciones in vivo. Adicionalmente, no podría esperarse que el uso de ribozimas en RNA viral de longitud com pleta trabjara eficientemente en vista de la estructura secundaria asociada con tal RNA largo, como se señaló por Van der Vlugt et al ( 1 993 et al supra) . Más aún, algunos autores han postulado que el RNA de filamento (+) puede ser protegido por un recubrimiento de proteína durante las etapas tempranas de infección (hipótesis "stripeosome") hasta la replicación, y por lo tanto no sería un objetivo apropiado para ribozimas.

Muchas de las presentes ribozimas ocasionan la resistencia en el estado heterócigo, facilitando con ello la transmisión de la característica de resistencia a la progenie de plantas transgénicas. Además, las ribozimas poliméricas de la invención son capaces de conferir resistencia in vivo a cepas de virus relacionadas a, pero diferentes de, las cepas enfocadas particulares. Finalmente, muchas de las ribozimas poliméricas de los sitios objetivo de la invención , los cuales están , ya sea en filamentos diferentes de RNA (es decir (+) y (-)), o tienen sitios q ue son reg iones ampliamente separadas en el mismo filamento. De esta manera, las ribozimas no solo actúan como una molécula simple enfocando simultáneamente una pluralidad de sitios, sino que más bien puede actuar como si la molécula fuera una plural idad de monoribozimas, enfocando cada una un sitio simple, aumentando así la probabilidad de q ue el substrato sea cortado. En el contexto de la presente invención , los sig uientes términos tienen los siguientes significados: Potyvirus: un gran grupo de VI RUS DE PLANTAS , en el cual los viriones son filamentos flexuosos (ca. 680-900 x 1 1 mm) , com prendiendo un tipo de prpteína de recubrim iento (MW (peso molecu lar) ca. 32,000-36, 000) y una molécula de ssRNA de sentido positivo, lineal (MW ca. 3.0-3.5 x 1 06) com prendiendo un marco de lectura abierto (ORF) largo, simple, que codifica una poliproteína de ca. 350.000 Da , que se procesa proteol íticamente mediante proteinasas codificadas viralmente. Como un grupo, los vi rus infectan un amplio rango de plantas huésped, incluyendo monocotiledóneas y dicotiledóneas, pero los miembros individuales normalmente tienen un rango de huésped angosto. Los síntomas dependen del cultivo de planta, cepa de virus y condiciones ambientales, pero normalmente incluyen mosaico o moteado en las hojas, interrupción de color en flores; moteado y/o distorción en los frutos; se forman corpúsculos de inclusión proteináceos característicos (serológicamente no relacionados con la proteína de recubrimiento de virus) en el citoplasma de células de plantas infectadas, apareciendo como "molinillos" en sección transversal o como "manojos" en sección longitudinal . Unos cuantos miembros también forman inclusiones nucleares cristalinas. Los potyvirus son transmitidos (de manera no persistente) por áfidos y pueden ser transmitidos de manera mecánica; algunos virus tentativamente incluidos en el grupo son transmitidos por mosca blanca, garrapatas u hongos. El ciclo de replicación de los potyvirus involucra las siguientes etapas sucesivas: infección, descubrimiento, traslación, procesamiento de poliproteínas para producir productos codificados virales, funcionales, repl icación de genoma vía una plantilla de RNA de filamento negativo, montaje de partícula de virus de progenie, movim iento célula-a-célula dentro de la planta infectada y transmisición de vector de planta a planta.

Gene: En el contexto de RNA genóm ico potyviral , el térm ino "gene", como es usado en la presente, es sinómico de "cistrón" . Todas las proteínas potyvirales son generadas a partir de un producto de traslación primaria, grande, simple (poliproteína) por proteasas virales, producido por traslación del ORF genómico simple. En el presente contexto, "gene" significa u na región del ORF genóm ico que codifica una proteína liberada como una molécula independiente por proteasas virales. "Genes" o cistrones potyvirales son referidos en la presente por referencia a la designación aceptada en la técnica para los miembros tipo de la familia de potyvirus PVY, como se muestra en la figura 20, o su eq uivalente funcional en otros miembros de la familia. La referencia a genes o cistrones en el filamento (-) sig nifica la región correspondiente a, (es decir, com plementaria a) ese gene o cistron en el filamento (+) .

RNA de sentido (+): En el contexto de RNA potyviral , " RNA de sentido (+)" significa el RNA genóm ico del virus, como es conten ido dentro del virión , el cual sirve directamente como una plantilla para la traslación de una poliproteína. El RNA de sentido (+) puede ser encapsidado o no. El RNA de sentido (+) llano tam bién es infeccioso.

RNA de sentido (-) o de replicación: En el contexto de RNA potyviral, "RNA de sentido (-) o de replicación" significa el RNA de plantilla de filamento negativo, de no codificación , de long itud completa , producido mediante el copiado del genoma de RNA (+) entero por la polimerasa viral (N l b) . No se producen RNAs sub-genómicos en potyvirus. En el contexto de la presente invención , las posiciones de nucleótidos en el RNA de sentido (-) viral están indicadas por referencia a la posición correspondiente del filamento (+), con un (-) en corchetes. La referencia a genes o cistrones en el filamento (-) (el cual es de hecho no codificante) sig nifica una región o un sitio en el filamento (-) correspondiente a esa región o sitio en el filamento (+).

RNA potyviral : En el presente contexto, esta expresión abarca tanto RNA genómico de sentido (+) como RNA de replicación de sentido (-) .

Resistencia: La reducción o prevención de infección viral, por ejemplo, ausencia de síntomas y ausencia de partículas virales detectables, ausencia o reducción o retraso de la aparición de síntomas. Los síntomas algunas veces son atípicos. La recuperación es posible.

Hibridación/complementaria: se dice q ue los "brazos" de la ribozima "hibridan" a una secuencia de RNA objetivo o que son "complementarios" para la región objetivo en el potyvirus. Tal hibridación o complementaridad es definida en la presente como un grado de formación dúplex suficiente para formar una estructura suficientemente estable, de manera que puede ocurrir el corte adyacente a la terna objetivo. Dependiendo de la secuencia objetivo, la ribozima y la estructura secundaria del RNA, preferiblemente menos de aproximadamente 5-1 0, más preferiblemente menos de aproximadamente 3 a 5 y aún más preferiblemente menos de 1 a 3 bases, sería desigualada entre la secuencia de RNA objetivo y uno o ambos brazos de hibridación de la ribozima. Sobre la longitud completa del brazo de hibridación , no deberían ocurrir más de 1 0% de desigualdades. De acuerdo con esto, la presente invención se extiende a ribozimas descritas en la presente, a las poliribozimas que las contienen, y a cualquier o todo mutante, derivado, parte, homólogo o análogo funcional de las mismas. Ejemplos de tales mutantes incluyen substituciones de nucleótidos simples o múltiples, supresiones y/o adiciones a las regiones de hibridación y/o reg iones catalíticas de las ribozimas proporcionadas de manera q ue las ribozimas modificadas sean todavía funcionales para cortar la secuencia de RNA objetivo, y/o conferir resistencia a potyvirus. Se dice que tales mutantes exhiben "complementaridad substancial" a la secuencia objetivo viral. En consecuencia, la presente invención se extiende a una ribozima q ue tiene uno o una pluralidad de dom inios de hibridación y dominios catal íticos, en donde el dominio de hibridación comprende una secuencia de nucleótidos substancíalmente complementarios a una secuencia de nucleótidos en un RNA de potyvirus in vitro, bajo cond iciones de alta severidad , y en donde dicha región catal ítica es capaz de cortar dicha secuencia de RNA objetivo. Este aspecto de la presente invención es determinado convenientemente por el grado de corte de la secuencia de RNA objetivo in vitro. Para los fines de la presente invención, las condiciones de severidad expuestas en Sambrook et al , Molecular Cloning : A Laboratory Manual (Clonación molecular: un manual de laboratorio) , Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, US, páginas 387-389 en el párrafo 1 1 son consideradas condiciones de alta severidad. De manera alternativa , puede usarse severidad med ia involucrando 0.25-0.5% p/v de SDS a 45°C durante 2-3 horas. Las condiciones alternativas son aplicables dependiendo de la concentración , pureza y fuente de moléculas de ácido nucleico.

Región de hibridación: la longitud total de los brazos de hibridación . Normalmente, en el contexto de la invención , cuando se dice que una región de hibridación es complementaria a una región dentro de o que comprende un gene, se pretende que signifique que el sitio en el cual ocurre el corte endoribonucleol ítico está dentro de ese gene.

Reg ión objetivo: en el contexto de RNA potyviral , "región objetivo" significa un tramo de ribon ucleótidos, ten iendo normalmente una longitud desde aproximadamente 1 0 bases hasta la longitud del RNA potyviral completo, al cual hibrida la región de h ibridación de las ribozimas de la invención . La región objetivo contiene un sitio objetivo preciso, en el cual el corte puede ocurrir cuando la ribozima actúa sobre el mismo. Hablando de manera general, el grado de la "región objetivo" es definido como la longitud de la secuencia en el RNA viral sobre la cual ocurre la hibridación.

Terna obietivo: En el contexto de las ribozi mas de cabeza de martillo, "terna objetivo" significa las tres bases inmediatas 5' al sitio de corte en el RNA de substrato. La terna objetivo será anotada en la presente como X°X°X° , en donde X° = cualquier ribonucleótido, preferiblemente X°UX°, en donde X° es cualquier ribonucleótido y U es uracilo, o X°UY, en donde Y es adenina, citosina o uracilo.

Sitios obietivo en RNA de sentido (-): los sitios objetivo de ribozima en el RNA de replicacíón de filamento (-) potyviral son designados por referencia al cistrón correspond iente (o "gene") en el filamento (+) . Los potyvirus enfocados por los ribozimas de la presente invención son , de preferencia: Virus de mosaico amarillo de calabacita (ZYMV) , Virus de mosaico de sand ía 2 (WMV2), Virus de moteado de vena de tabaco (TVMV), Virus de grabado de tabaco (TEV) , Virus Y de papa (PVY) , Virus de moteado de pim ienta (PepMoV) , Virus de mosaico de soya (SbMV) , Virus de an illada de papaya (PRSV) , Virus de mosaico soportado en semilla de chícharo (PSbMV), Virus de mosaico de nabo (TuMV), Virus de mosaico de pasto Johnson (JGMV) , Virus pox de ciruela (PPV) , Virus de maíz enano (MDV).

Particularmente se prefieren cepas de ZYMV y WMV2 , así como virus serológicamente relacionados. Las regiones objetivo de RNA potyviral, las cuales son particu larmente preferidas, son aquellos cistrones (y las regiones correspondientes de RNA de sentido (-)) , que ocasionan proteínas invol ucradas en procesamiento viral , repl icación y montaje, tales como, N ía, N l b y CP. Estos cistrones están ubicados en la mitad de 3' del RNA genómico. De acuerdo con una modalidad preferida, las moléculas de ácido nucleico de la invención comprenden al menos una un idad "R" que tiene la fórmula general: 3' [(X)n - Q - (X')n.]p 5' en donde: - X y X' cada una representa, de manera independ iente, cualquier ribonucleótido; (X)n y (X')n' representan secuencias de ribonucleótidos substancialmente complementarias a al menos parte de dicha región objetivo de RNA (+) genómico de potyvirus o al menos parte de su RNA de replicación de filamento (-) ; - n y n ' son cada una iguales o mayores que 4; - Q representa la región catal ítica de una ribozima; - p > 1 . En la fórmula general anterior (X)n y (X')n' representan las secuencias complementarias o "brazos" de la ribozima, la cual hibrida a la reg ión objetivo elegida del potyvirus. (X)n y (X')n' j untas representan la "región de hibridación" de la ribozima. (X)n y (X')n' normalmente hibridan a las secuencias inmediatamente 5' y 3' respectivamente del sitio objetivo en el RNA viral. Los valores de n y n' son, independientemente, al menos 4, preferiblemente al menos 8, por ejemplo desde 4 hasta 4000. Los valores preferidos son desde 5 hasta 50, por ejemplo 6 hasta 50 , u 8 a 12 nucleótidos para ribozimas de "brazo corto". La longitud total de los dos brazos de hibridación es al menos de 8 nucleótidos, preferiblemente al menos 1 6. Para ribozimas de "brazo largo", n y n' normalmente tienen valores mayores que 50, por ejemplo 50 a 400, particularmente 60 a 300 nucleótidos. En la fórmula general anterior, p = 1 para monoribozimas. Para poliribozimas, p > 2, por ejemplo 2-20 o 4- 1 0. Particularmente se prefieren las poliribozimas. De preferencia, las secuencias complementarias (X)n y (X')n' son complementarias para regiones objetivo de RNA de potyvirus, las cuales son conservadas entre cepas de una especie dada, y preferiblemente también entre diferentes especies de potyvi rus. En el contexto de la presente invención "conservadas" significa que las secuencias en al menos un lado, y preferiblemente en ambos lados del sitio de corte en el substrato, son esencialmente idénticas sobre u na longitud de 20 bases, es decir, tienen al menos 85% de identidad , y preferiblemente al menos 90% de identidad sobre 20 bases. Hablando de manera general , en una región objetivo conservada, la terna objetivo por sí m isma es conservada de manera idéntica entre dos virus. De manera excepcional , ya que la tercera base en la terna objetivo X°X°X° permanece sin par después de la hibridación de la ribozima para la reg ión objetivo en el substrato, esta base puede variar entre dos virus en una región conservada sin afectar la capacidad del corte. Todavía de acuerdo con u na modalidad ad icional de la invención, los brazos de hibridación de la poliribozíma pueden ser derivados de al menos dos diferentes tipos de virus. Tales poliribozimas son referidas, de aquí en adelante como, "poliribozimas quiméricas". Como un ejemplo de este tipo de construcción, pueden citarse mezclas de secuencias derivadas de ZYMV y WMV2. Este tipo de poliribozima asegura la inactivación de ambos tipos de virus, si se presentan juntos, o permite el uso de una construcción simple en diferentes áreas geográficas. De acuerdo con una modalidad preferida, la reg ión catal ítica "Q" en la fórmula general anterior es una región catalítica de ribozima de cabeza de martillo. Tales ribozimas son descritas en la patente europea EP-B-0 321 201 . Tal ribozima puede ser representada como una molécula de fórm ula (I ) : ( X) n Y Y (X) n ' A C A u G G C G '\ . A y I i i en donde, (X)n y (X'A representan secuencias de ribonucleótidos substancialmente com plementarias a una secuencia de RNA de un potyvirus (ya sea intermediario genómico o de replicación); un (*) representa un par de bases entre los ribon ucleótidos complementarios; Y representa cualquier ribonucleótido y cada Y puede ser ig ual o diferente; y' y Y" representan ribonucleótidos de secuencia complementaria a lo largo de al menos parte de su longitud para permitir la formación de pares de bases entre los oligoribon ucleótidos, o Y' y Y" forman juntos una secuencia de RNA simple, en donde al menos parte de dicha secuencia comprende un tallo formado por pares de bases entre nucleótidos complementarios; y de manera opcional, un nucleótido adicional seleccionado de cualquiera de A, G, C o U es insertado después de 1A. En otra modalidad, la ribozima es como está expuesta en la fórmula (II): » (X)nA Y(X)n« A A u G C * G Y * Y Y * Y (Y)m * (Y)m' Y Y B en donde (X)n y (X')n' representa secuencias de ribonucleótidos substancialmente complementarias a un RNA de un potyvirus; Y representa cualquier ribonucleótido y cada residuo Y puede ser igual o diferente; un (*) representa un par de bases entre ribonucleótidos complementarios; n y n' son como se definió previamente; B representa un enlace, un par de bases, un ribonucleótido, o un oligoribonucleótido conteniendo al menos 2 ribonucleótidos; m y m' son 1 o más y pueden ser iguales o diferentes; y opcionalmente, un nucleótido adicional seleccionado de cualquiera de A, G, C o U es insertado después de 1A. En una modalidad preferida, la ribozima es como se expone en la fórmula (lll): (X)nA Y(X)n' A c A ü G A G C * G ? A A U xi G * c G * c. A G u en donde (X)n y (X')n' representan una secuencia de ribonucleótidos substancialmente complementaria a un RNA de un potyvirus; Y representa cualquier ribonucleótido y cada residuo Y puede ser igual o diferente; un (*) representa un par de bases entre ribonucleótidos complementarios; n y n' son como se definió previamente. De acuerdo con modalidades adicionales de la invención, la región catalítica de la ribozima, por ejemplo "Q" en la fórmula general anterior, puede ser un dominio de horquilla, como se describe en WO 95/06731 y EP-B-360257. Un ejemplo de tal dominio de horquilla está dado a continuación en la fórmula IV: RIBOZIMA SECUENCIA OBJETIVO ?? ? u c u c c u » * ß • A C 2 ' C U G G U W N N N K N N N «••• r C ? ICI C I A « A C C A W K W K Ml l l l A A G A N' tr N' - w r 5- A A C A De manera alternativa, la región catalítica de la ribozima puede ser el dominio catalítico de un virus de Hepatitis delta, como se describe en WO 95/06731 , o el dom inio catalítico de una ribozima de RnasaP, como se describe en EP 546092. ? Aunque las regiones catalíticas ¡lustradas antes tienen una estructura y secuencia conservada, se ha observado que algunos nucleótidos pueden ser suprimidos, insertados, substituidos o modificados, sin perjuicio a la actividad de la ribozima. La invención comprende el uso de estas regiones catalíticas modificadas en la poliribozima siempre que su actividad catalítica sea conservada. Esta actividad puede ser verificada al usar las pruebas descritas más adelante. Por ejemplo, uno o más nucleótidos de la región catalítica I I ilustrada en la fórmula I , I I y l l l , pueden ser reemplazados por nucleótidos conteniendo bases, tales como, adenina, guanina, citosina, metilcitosina, uracilo, timina , xantina, h ipoxantina , inosina u otras bases metiladas. Las bases "conservadas" C-G , las cuales forman juntas el primer par de bases del lazo catalítico, pueden ser reemplazadas por U-A. Otras regiones catal íticas de cabeza de martillo, variantes, preferidas, tienen las siguientes secuencias: Ribozima m utante I : cugaugaGUCCugaGGACgaa Ribozima mutante I I : cugaugaG UCCcgugaGGACgaa Ribozima mutante l l l : cugaugaGUCgugagGACgaa Ribozima mutante IV: cugaugaGCGg ugaCGCgaa. sTobRV tipo natural: cugaugaGUCCgugaGGACgaa (Hélice I I mostrada en mayúscu las) Debido a que las ribozimas actúan en una manera de secuencia específica, es posible para un RNA objetivo volverse resistente a la inactivación mediada por ribozima al solo cambiar una o unas cuantas bases críticas. Para la presente solicitud , también fue deseable construir genes de resistencia, los cuales protegieran a las plantas contra infección por varias cepas de una especie de virus. Ambos objetivos de lograr un gene de resistencia robusta y obtener la protección contra muchas cepas, se lograron al seleccionar los sitios objetivo para las ribozimas de acuerdo con los sig u ientes criterios: - se eligen sitios, los cuales no pueden mutar fácilmente sin cambiar la capacidad de codificación (es decir, los am inoácidos correspondientes a un codón particular); - se eligen sitios, los cuales son ubicados en regiones altamente conservadas. En una modalidad preferida de la invención, la secuencia 3' (X)n de una unidad R dada y la secuencia 5' (X'A de la unidad R adyacente, son com plementarias a secuencias las cuales están contig uas en el RNA de filamento (+) genómico de potyvirus o RNA de filamento (-) de replicación. De acuerdo con esta variante, la secuencia complementaria puede hibridar con la longitud completa del transcripto objetivo. Por otra parte, puede hibridar con solo una porción o región del transcripto enfocado. La porción o región en cuestión debe ser suficientemente grande para permitir la inclusión de al menos una región catalítica en la secuencia correspondiente de la poliribozima. En general , para esta variante, la long itud de la secuencia complementaria, sin contar las regiones catalíticas (la suma de los brazos de hibridación) , puede variar desde aproximadamente 4 hasta 4000 bases. Las longitudes de 40 a 1 000 son particularmente preferidas. De acuerdo con otra modalidad altamente preferida de la invención, en la poliribozima que tiene la fórmula: R? -R2-R3 Rn' el brazo de hibridación 3' (X')n de una unidad "R" dada y el brazo de hibridación 5' (X')n' de la unidad "R" adyacente son complementarios a porciones no contiguas del genoma o del transcripto de RNA de sentido (-) .

Un ejemplo de este tipo de estructura es la "poliribozima de brazo corto" . Puede pensarse en la estructura de estas poliribozimas no contiguas como una secuencia complementaria a la secuencia objetivo, en la cual las regiones catal íticas de ribozima están incrustadas y la cual ha experimentado supresiones en la secuencia complementaria. De acuerdo con esta modalidad, la distancia entre dos regiones catalíticas en la poliribozima normalmente es más corta que la distancia entre los dos sitios X°X°X° correspondientes en la secuencia objetivo. La distancia entre las ribozimas puede ser reducida significativamente con respecto a la distancia entre los sitios objetivo correspondientes en el substrato, por ejemplo, si dos sitios X°UX° enfocados adyacentes en el substrato están separados por una distancia de 1 000 nucleótidos, la distancia entre las regiones catal íticas de la "ribozima de brazo corto" puede ser tan poca como 30 o 40 nucleótidos. Por lo tanto, pueden hacerse reducciones por encima de 90% de la longitud de la secuencia de hibridación . La long itud m ínima entre dos regiones catal íticas adyacentes normalmente es aproximadamente 8 nucleótidos y preferiblemente al menos 20. Los presentes inventores han mostrado que tales secuencias de hibridación acortadas no evitan, de manera sorprendente, que la poliribozima corte de manera eficiente el substrato y puede, de hecho, mejorar en muchos casos la eficiencia de la inactivación . Por ejemplo, la reducción en la long itud de la secuencia com plementaria evita problemas asociados con la formación de la estructura secundaria de competencia o desfavorable que conduce a la inactivación de la ribozima. Así, para una longitud dada de molécula de ribozima, pueden insertarse más regiones catalíticas enfocando más sitios de corte en el substrato. Adicionalmente, el uso de las poliribozimas de brazo corto significa que pueden construirse poliribozimas eficientes, aún si solo se conocen partes de la secuencia del substrato. Es suficiente conocer 1 0 o 1 5 bases que rodean un sitio objetivo X°X°X°. Otra ventaja importante es la posiblidad para usar, como los brazos de hi bridación acortados, exclusivamente aquellas secuencias que son conservadas en diferentes virus, por ejemplo, virus del mismo tipo. En esta manera, los virus diferentes pueden ser ¡nactivados por la misma poliribozima aún si las secuencias entre las reg iones conservadas son totalmente distintas. Estos virus pueden ser de la familia potyviridae o una especie dentro de la familia o aislados diferentes de la misma especie.

Finalmente, la molécula más pequeña perm ite una síntesis más fácil y biológicamente más económica. La naturaleza funcional de las ribozimas de "brazo corto" de la i nvención prueba que, en una poliribozima, las diferentes regiones catalíticas pueden actuar independientemente unas de otras. Las ribozimas de brazo largo, teniendo long itudes de brazo de al menos 50 nucleótidos, ya sea contiguos o no contiguos, también son modalidades preferidas de la invención. Ejemplos se muestran en la Tabla 8 más adelante. Cualquier poliribozima de la invención puede inclu ir una mezcla de ribozimas de "brazo largo" y "brazo corto", y también de ribozimas "contiguas" y "no contig uas" . De manera alternativa, puede incluir solo ribozimas de brazo largo, o solo de brazo corto, o solo contig uas, etc. En consecuencia, la estructura de la ribozima puede ser optimizada mediante pruebas usando el ensayo in vitro - in vivo y transiente descrito más adelante. De acuerdo con una variante adicional de la invención , las poliribozimas pueden incluir, entre dos unidades " R" consecutivas, una secuencia no complementaria (A), la cual tiene una longitud de al menos 1 base, por ejemplo 3 o más bases, y la cual es no complementaria para el RNA potyviral de sentido (+) o (-). La secuencia no complementaria de la poliribozima puede tener una función precisa , por ejemplo, puede constituirse mediante una secuencia de codificación , la cual puede ser usada para seleccionar transformantes o también una secuencia que contiene una ribozima, la cual actúa sobre un substrato diferente al objetivo primario del DNA de virus o la cual actúa en cis en una parte de la poliribozima. Normalmente contiene un polienlazador para clonación, o un adaptador para facilitar las construcciones de poliribozima quimérica . La secuencia no complementaria "A" usualmente tiene una longitud comprendida entre aproximadamente 2 y 500 bases, por ejemplo 20 a 1 00 bases. Cuando existe una pluralidad de secuencias no complemenarias, puede constituir juntas tanto como aproximadamente 90% de la longitud de la poliribozima, más preferiblemente 50% . Las ribozimas preferidas de la presente invención tienen dom inios catal íticos múlti ples ("poliribozima") que enfocan diferentes regiones o diferentes filamentos de RNA del potyvirus. De acuerdo con su construcción (brazo largo o brazo corto, contig ua o no contigua), la poliribozima puede actuar como una serie de monoribozimas individuales o puede actuar como una "unimolécula" simultáneamente contra cada uno de sus sitios objetivo. En particular, de acuerdo con una variante preferida, en una poliribozima, dos unidades de ribozima R1 y R2 enfocan ya sea, d iferentes cistrones (o "genes" en el mismo filamento de RNA, o enfocan cistrones iguales o diferentes en diferentes filamentos de RNA. En tales sistemas, los RNAs enfocados difieren uno de otro, ya sea en q ue comprende, o están dentro de diferentes cistrones y/o en que están dentro de diferentes filamentos. De manera alternativa, las secuencias enfocadas pueden estar dentro del mismo cistrón en el RNA de filamento (-) de replicación . De manera específica, tal ribozima comprende al menos dos de dichas unidades R, "RJ y "R2" , en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X')n' de Ri son complementarias a secciones de una primera región objetivo, Zj , del RNA (+) genómico de potyvirus o del RNA de filamento (-) de replicación , estando la región Zi dentro o com prendiendo un primer cistrón o región sin trasladar (UTR) , y X y X' de R2 son complementarios a secciones de una segunda región objetivo, Z2, del RNA genómico de potyvirus o intermediario de replicación de filamento (-) , estando la región Z2 dentro o comprendiendo un segundo cistrón o región sin trasladar, siendo Zj y Z2 ya sea: - diferentes cistrones o regiones sin trasladar, en el mismo filamento de RNA, o - siendo cistrones iguales o diferentes o regiones sin trasladar en diferentes filamentos del RNA de potyvirus, o - siendo los mismos genes en el RNA de replicación de filamento (-) . Las regiones Zj y Z2 contienen la terna objetivo para las ribozimas Ri y R2, respectivamente. Las regiones Zj y Z2 contienen así los sitios de corte de ri bozima de Rj y R2, respectivamente. Los ejemplos preferidos de este tipo de poliribozima son aquéllos que comprenden una pluralidad de objetivos en el filamento (+) , pero dentro de cistrones diferentes. Este tipo de poliribozima es ejemplificado por un ácido nucleico, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X'A de Rj son complementarias a u na región dentro de, o comprendiendo, un primer gene o U .T. R. en el RNA (+) genómico, y X y X' de R2 son complementarios a una región dentro de, o comprendiendo, un segundo gene o U.T. R. en el RNA (+) genómico.

De manera alternativa, todos los objetivos pueden estar en el filamento (-) , usualmente dentro de regiones correspondientes a diferentes cistrones o regiones sin trasladar. Este tipo de poliribozima es ejemplificado por un ácido nucleico, en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X'A de R^ son com plementarias a un primer gene o U .T. R. en el RNA de filamento (-) de replicación , y X y X' de R2 son complemenarias a una región dentro de, o comprendiendo, una región correspondiente a un segundo gene o U .T. R. en el RNA de filamento (-) de repl icación . Otro ejemplo de la ribozima de la invención es una poliribozima, la cual enfoca regiones en diferentes filamentos de RNA del potyvirus. Este tipo de poliribozima es ejemplificado por un ácido nucleico, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de Rj son com plementarias a una reg ión Zj dentro de, o comprendiendo, un gene o U .T. R. en el RNA (+) genómico, y X y X' de R2 son complementarias a una región Z2 dentro de, o com prendiendo, una región correspondiente a un gene o U .T. R. en el RNA de filamento (-) de repl icación. En este tipo de poliribozima, las regiones objetivo pueden corresponder a formas (+) y (-) del m ismo cistrón, o pueden ser regiones del filamento (+) y (-) , las cuales no tienen relación funcional o estructural una con otra. Cuando las reg iones objetivo corresponden a formas (+) y (-) del mismo cistrón, la poliribozima puede ser definida como un ácido nucleico de la invención , en donde las secuencias complementarias (X)n y (X' de R^ son complementarias a una región Zj dentro de, o comprendiendo, un cistrón "C" en el RNA de filamento (+) y las secuencias complementarias de (X)n y (X')n' de R2 son complementarias a una región Z2 en el filamento (-) dentro de, o comprendiendo, la región correspondiente al mismo cistrón "C". En todas las ribozimas anteriores, las secuencias complementarias (X)n y (X')n' pueden ser de brazos cortos o largos, como se definió previamente. Las poliribozimas pueden comprender tanto brazos cortos como largos. Las poliribozimas que enfocan diferentes cistrones en el mismo filamento, frecuentemente son diseñadas para ser estructuras de brazo largo, excepto cuando los objetivos son todo el gene de proteína de cápside (-) , en cuyo caso, se prefieren las estructuras de brazo corto. Las poliribozimas que enfocan los mismos cistrones en diferentes filamentos pueden ser de brazo corto, o una mezcla de brazo corto y largo, o de manera alternativa, de brazo largo. Las poliribozimas preferidas tienen al menos un sitio objetivo en el filamento (+) o (-) de gene de proteína de cápside, en asociación con al menos un sitio objetivo en un gene diferente. Una poliribozima preferida adicional de la invención es una pol iribozima q ue enfoca al menos dos sitios dentro del mismo cistrón en el mismo filamento. Este tipo de poliribozima comprende al menos dos unidades "RJ y "R2" , en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X')n' de una región objetivo Z dentro de un gene o reg ión sin trasladar dado del RNA de filamento (+) genómico, de potyvirus, o de la región correspondiente del RNA de filamento (-) de replicación , y las secuencias de hi bridación (X) y (X') de R2 son complementarias a una región objetivo Z2 dentro del mismo gene o región sin trasladar como ese de Z en el mismo filamento de RNA. De preferencia , ambas reg iones Z^ y Z2 están en el filamento (-). Sin embargo, si , de acuerdo con esta variante, Zj y Z2 están ambas en el filamento ( + ) genómico y ambas están dentro del gene de proteína de cápside, la poliribozima contiene una unidad catalítica adicional que enfoca un sitio en un gene diferente o en el RNA de filamento (-) . Las regiones objetivo preferidas para las ribozimas de la invención son regiones dentro de, o comprendiendo, el cistrón que da origen a la proteína de cápside, el cistrón N ía, el cistrón N l b, la región sin trasladar 3' de un potyvirus, o las secuencias correspondientes en el RNA de filamento (-) de replicación . Las poliribozimas particularmente preferidas incluyen entre sus sitios objetivo, al menos uno dentro del cístrón de proteína de cápside, o dentro del cistrón correspondiente del RNA de filamento (-) . Tales ribozimas ¡ncluyen moléculas de ácido nucleico, en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X'A de al menos una unidad R son com plementarias a regiones dentro de, o comprendiendo, el gene de proteína de cápside (CP) , o las secuencias correspondientes en el RNA di filamento (-) de replicación. Tales poliribozimas también pueden incluir secuencias de ribozima q ue enfocan otros cistrones o regiones sin trasladar de un RNA de potyvirus o su RNA de filamento (-) de replicación. Las poliribozimas que enfocan al menos un sitio en la región del RNA de filamento (-) correspondiente a la proteína de cápside son especialmente preferidas, particularmente en asociación con un sitio objetivo en un gene diferente. Las poliribozimas de filamento (+) o (-) que enfocan la proteína de cápside, pueden tener cualquier combinación de otros objetivos, longitudes de brazo y configuraciones de brazo descritas antes. Ejemplos preferidos de ribozimas de proteína de cápside tienen , ya sea, solo un objetivo en la proteína de cápside en el filamento (+) o (-), o alternativamente tres o cuatro objetivos en el RNA de filamento (+) de proteína de cápside. Las ribozimas de proteína de cápside de acuerdo con esta variante de la invención son especialmente ventajosas cuando son complementarías a WMV2. Ejemplos específicos de las ribozimas de la invención son los sig uientes: - ribozimas que comprenden al menos dos unidades R, Ri y R2, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de Rj y de R2 son respectivamente complementarias a regiones dentro del cistrón CP (ya sea de filamento (+) o (-)) y la región no trasladada 3' del RNA de filamento (+) genómico; - ribozimas que comprenden al menos dos unidades R, Rj y R2, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de Rj y R2 son respectivamente complementarias a regiones dentro de la región del RNA de filamento (-) de replicación correspondiente al cistrón CP y el cistrón N l b, o al cistrón N l b y al cistrón N ía; - ribozimas q ue comprenden al menos dos unidades R, Rj y R2, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de Rj son complementarias al cistrón CP del RNA de filamento (+) genómico y las regiones de hibridación de R2 son complementarias a toda o una porción de la región correspondiente al cistrón CP en el RNA de filamento (-) de replicación; - ribozimas que comprenden al menos tres unidades R, R R2 y R3, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X'A de Rj son complementarias a regiones dentro del cistrón CP o la región 3'NT del RNA de filamento (+) genómico, las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de R2 son complementarias a regiones dentro de la región correspondiente al cistrón N l b en el RNA de filamento (-) de repl icación y las secuencias com plementarias (X)n y (X'A de R3 son complementarias a reg iones dentro de la región correspondiente a los cistrones N í a o CP en el RNA de filamento (-) de replicación ; - ribozimas en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')r de R-i y R2 son complementarias a regiones dentro del gene CP en el RNA de filamento (-) de replicación . Ejemplos adicionales de las ribozimas preferidas se indican en la tabla 8 más adelante. Además de la elección de sitio o sitios objetivo, región o regiones objetivo y región o regiones catal íticas, una variante adicional puede ser obtenida al incluir en la construcción de ribozima, toda o parte de una reg ión de no codificación 3' de un potyvirus, preferiblemente WMV2, para controlar la localización intracelular del gene de ribozima . Esto puede ayudar a dirigir el RNA de ribozíma al compartimento celular, donde pudiera estar el RNA potyviral . Se sospecha el funcionamiento intensificado de ribozimas que portan la región de no codificación 3' por analog ía a las observaciones en células animales (Sullenger y Cech 1 993, Science vol. 262 p 1 566-1 569) que una ribozima contra un retrovirus fue mucho más eficiente cuando se co-local izó con el objetivo, usando un vector retroviral para expresarla.

La secuencia no trasladada 3' usualmente contiene toda la región sin trasladar del virus y también puede contener los últimos 10 a 20 codones de la proteína y los primeros 1 0 a 1 5 residuos del apéndice poly A viral. Las ribozimas de la presente invención pueden ser probadas por su capacidad para cortar un RNA de substrato y/o para conferir resitencia a infección con potyvirus, mediante ensayos in vitro, in vivo o transientes, como se describe más adelante en los ejemplos 8, 9 y 1 0, respectivamente. La prueba in vitro involucra incubar un substrato de RNA adecuado, marcado uniformemente con una marca rad ioactiva, con la ribozima bajo prueba, preparada por transcripción in vitro. La incubación es realizada a temperaturas variantes, como se describió en el ejemplo 8. La capacidad de la ríbozima para cortar el substrato en los sitos objetivo esperados, se muestra al realizar un auto-radiograma en un gel de poliacrilamida. Las ribozimas y constructos genéticos de la presente invención pueden ser probados convenientemente in vivo usando plantas sensibles al virus. El análisis puede ser cualitativo, tal como, por clasificación por severidad de síntomas, o cuantitativo donde las muestras son analizadas, por ejemplo, al medir el nivel de virus que replica en plantas infectadas usando procedimientos, tales como, ELISA, o de manera alternativa, el nivel de RNA de ribozima, o el nivel de RNA objetivo. También puede emplearse una combinación de análisis cualitativos o cuantitativos. La naturaleza genética de las plantas transgénicas resistentes al virus puede determinarse al realizar un anál isis de seg regación . El objetivo de esta prueba es determinar el enlace genético del gene de ribozima y resistencia al virus. La auto-fertilización, o una cruza con un genotipo no transformado puede realizarse en un descend iente primario para obtener T-i . Subsecuentemente, plantas Ti son inoculadas con el potyvirus med iante inocu lación mecánica, o inoculación natural , o al usar áfidos al imentados en plantas infectadas. Las plantas son registradas por resistencia a la infección. Una proporción de segregación de 3: 1 (resistente : susceptible) indica un sitio simple que actúa como un rasgo heterócigo ("dominante") ; una proporción de segregación de 1 : 3 indica un sitio simple que actúa como un rasgo heterócigo ("recesivo") , y una proporción de segregación de >3: 1 indica una pluralidad de sitios, que actúan independientemente unos de otros, y que confieren resistencia como una copia simple como un rasgo heterócigo. Las ribozimas de la invención también pueden ser probadas usando un ensayo de transformación transiente, como se describe más adelante en el Ejemplo 1 0. El objetivo es enlazado a un gene reportador, tal como, LUC. El DNA que codifica el h íbrido de gene reportador-substrato es cointroducido en una célula de planta junto con un plásmido que codifica la ribozima bajo prueba. El nivel de expresión del gene reportador es medido. La expresión es dism inuida cuando la ribozima interactúa con el objetivo. La presente invención también se extiende a constructos genéticos comprend iendo las ribozimas descritas en la presente. Estos constructos genéticos generalmente comprenden una secuencia de vector como un veh ículo para transferir la ribozima a una célula huésped y una secuencia de promotor para dirigir la transcripción de la ribozima y un terminador para señalar la term inación de la transcripción . Un promotor preferido incluye, pero no está limitado a, virus de mosaico de coliflor 35S (CaMV) o a un promotor de CaMV 35S doble. El promotor de CaMV es descrito por Odell et al , Nature 31 3: 81 0-81 2, 1 985. Generalmente, las ribozimas están en la forma complementaria , de manera que sobre la transcripción , la ribozima es producida. Los constructos genéticos de la presente invención son usados para generar plantas transgénicas capaces de expresar de manera constitutiva, de desarrollo o inducible (por ejemplo, en respuesta a ciertos estímulos) las ribozimas aquí descritas. Las células y plantas transgénicas más preferidas se hacen substancialmente resistentes a la infección con potyvirus. La invención también se extiende a un método para producir plantas transgénicas, las cuales exhiben al menos alguna resistencia a la infección por potyvirus, y a las plantas que pueden ser obtenidas por el mismo. De acuerdo con este aspecto de la presente invención. Se proporciona un método para generar plantas transgénicas que exhiban síntomas reducidos siguiendo a la exposición a potyvirus comparadas con plantas no transgénicas, comprendiendo dicho método transformar células de plantas con un constructo genético que codifica una ribozima como se describió antes en la presente, capaz de cortar RNA de potyvirus, regenerar plantas a partir de dichas cél ulas transformadas, auto-fertilizar dichas plantas regeneradas y obtener semillas de las mismas y entonces hacer crecer plantas transgénicas a partir de dichas semillas. Pueden usarse todos los med ios conocidos para introducir DNA extraño en plantas, por ejemplo, Agrobacterium , electroporacíón , fusión de protoplasto, bom bardeo con una pistola de partículas, o penetración de DNA en células, tales como, polen , la microespora, la semi lla y el embrión inmad uro, vectores virales, tales como, los Geminivirus o los virus satélites. Agrobacterium tumefaciens y rhizogenes constituyen los medios preferidos. En este caso, la secuencia de codificación para la poliribozima es introducida en un vector adecuado junto con todas las secuencias reguladoras necesarias, tales como, promotores, terminadores, etc. , así como cualquier secuencia necesaria para seleccionar los transformantes. La invención también se extiende a la progenie, material reproductivo y semillas de las plantas transgénicas. Las ri bozimas pueden ser expresadas de manera constitutiva, de desarrollo o inducible en la planta completa, o en tejidos específicos de la planta. Como ejemplos de plantas que pueden hacerse resitentes a la infección con potyvirus por la presente invención , puede mencionarse a plantas que pertenecen a las familias: Cucurbitaceae (por ejemplo, melón, calabacín) , Chenopodiaceae (por ejemplo, remolacha) , Cruciferaceae, Gram inaceae (por ejemplo, avena, trigo, caña de azúcar, cebada , ballico) , Leguminoseae (por ejem plo, frijol , ch ícharo, soya, cacahuate) , Ombellíferaceae (por ejemplo, zanahoria, apio, chiviría) , Rosaceae (por ejemplo, ciruela) , Solanaceae (por ejemplo, papa , tomate, tabaco, pimienta) . La presente invención tam bién se extienden al uso de las ribozimas reclamadas en células de plantas o plantas, en asociación con otros genes o sistemas de resistencia a virus, ya sea para potyvirus o para otros virus, por ejemplo, ribozimas anti-CMV (CMV significa "virus de mosaico de pepino") , o sistemas mediados con proteína de recu brim iento para resistencia de virus, tales como, RNA de antisentido o sentido (trasladado o de traslación deficiente) de proteína de recubrimiento. De acuerdo con esta variante de la invención , la planta puede comprender células que son transformadas tanto por las secuencias de ribozima de la invención como por las secuencias que proporcionan la protección asociada. La expresión de las secuencias diferentes que proporcionan protección puede ser simultánea o de otra manera . De acuerdo con una modalidad adicional de la invención, se proporciona una molécula de ácido nucleico que consiste de un fragmento del RNA (-) de replicación viral WMV2, la cual se ha mostrado que es particularmente receptiva para el corte o inactivación por ribozimas, y de esta manera puede ser usada como una molécula objetivo artificial . En real idad , el descubrim iento inesperado de que la secuencia del filamento negativo del virus alrededor del sitio 1 747 es especialmente susceptible a la inactivación de gene, abre posiblidades útiles para usar esta secuencia como una ribozima u objetivo antisentido no solo para proteger plantas contra virus, sino también para otros usos. Esta molécula, y sus derivados, será referida de aq uí en adelante como la molécula "objetivo artificial". Las moléculas objetivo artificiales de la invención consisten ya sea de nucleótidos 1704 a 1 873 del filamento (-) de la secuencia ¡lustrada en la figura 1 8, o de al menos 20, por ejemplo, entre 40 y 1 70, nucleótidos consecutivos del fragmento 1 704-1 873, incluyendo ATG mostrado en la posición 1 748-1 750 en la Figura 1 8. Las moléculas objetivo artificiales también pueden consistir de una secuencia que tiene al menos 75% de identidad y preferiblemente al menos 85% o incluso 95% de identidad con la secuencia subrayada de la Figura 1 8, o un fragmento de la misma teniendo al menos 20 n ucleótidos. La secuencia objetivo artificial presente en pBPL 01 86, como se describe en la figura 1 5, está hecha de aproximadamente 1 80 bases de secuencia viral a partir del filamento negativo del genoma viral , en la región que codifica en el filamento positivo para el gene N l b de replicasa. La secuencia está hecha de 1 25 bases en 5' de A del sitio de corte de ribozima GUA y 44 bases en 3' de A. A es la base complementaría a T mostrada como base n° 1 748 en la figura 1 8. Parte de esta secuencia está presente en muchos virus de RNA. Por ejem plo, alrededor de este sitio de corte en WMV2: Virus Y de papa tiene 20 de 22 bases idénticas a WMV2 (90.9%) Virus A de papa tiene 22 de 23 bases idénticas a WMV2 (95.6%) Virus de mosaico soportado en semilla de ch ícharo tiene 20 de 23 bases idénticas a WMV2 (86.95%) Citomegalovirus h umano tiene 1 7 de 23 bases idénticas a WMV2 (73.9%) Virus de influenza tiene 1 7 de 1 9 bases idénticas a WMV2 (89.5%) . Por lo tanto, esta región es un buen objetivo para moléculas diseñadas contra esos virus. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico mayores que contienen las secuencias objetivo artificiales de la invención, con la excepción del RNA (-) viral de longitud com pleta, conocido, el cual contiene de manera natural la secuencia. Ejemplos preferidos de moléculas que comprenden las secuencias objetivo artificiales son moléculas en las cuales la secuencia objetivo artificial es fusionada de manera transcripcional o traslacional a una segunda molécula de ácido nucleico. La secuencia objetivo artificial y sus derivados es añadida de esta manera a un gene de interés (de aquí en adelante llamado "gene útil" o "gene de interés") , en 5' o en 3' del marco de lectura abierto o secuencia de codificación del gene úti l , de manera que no previene la función del gene útil y hace a este gene fácilmente controlable por una ribozíma (tal como, aquéllas descritas antes) , o antisentido, dirigido contra el objetivo artificial. El término "secuencia de codificación" en este contexto incluye aquéllas secuencias activas como tRNA sim ilar a RNA, rRNA, etc. además de aquellas secuencias que codifican proteínas. La secuencia agregada también puede ser una secuencia reg uladora , secuencia que codifica RNA funcional, tal como, rRNA, tRNA, m RNA, etc. La fusión 5' puede ser transcripcional o traslacional. De manera similar, la fusión 3' puede ser transcripcional o traslacional. La naturaleza precisa de la fusión depende de la funcionalidad del gene útil. Por ejemplo, en el caso de un gene que codifica una prote ína, puede usarse una fusión traslacional si los aminoácidos adicionados a la proteína (en el extremo N H2 o COOH seg ún pueda ser el caso) no evitan su función.

La secuencia objetivo artificial puede ser menor que la secuencia descrita antes, según se demuestra por la actividad inhibidora de la formación de pares de ribozimas de brazo corto con solo un tramo muy pequeño de esa secuencia. Por ejemplo, la secuencia objetivo artificial puede ser reducida a 40 bases en cado lado de A de GUA, o a 1 0 bases en 5' y 1 2 bases en 3' de A, o incluso a 8 bases en cada lado de A, si es aceptable una eficiencia ligeramente menor de la ribozima. La longitud óptima puede ser encontrada mediante experimentación de rutina. La alta actividad de las ribozimas contra la secuencia objetivo artificial en los experimentos descritos puede ser explicada probablemente en parte por su accesibilidad a moléculas de RNA inhibidoras. Por lo tanto, es posible usar no solo ribozimas sino también RNA antisentido contra el objetivo artifical , aunque con una eficiencia menor. La fusión entre el gene de interés y el objetivo artificial puede ser usado ahora como un objetivo para ribozimas o RNA antisentido. La inactivación del gene útil conteniendo el objetivo artificial puede ser provocada por el gene de ribozima tra ído a través de una cruza, o mediante la expresión de tej ido específico del gene de ribozima, si el gene de ribozima está bajo control de un promotor específico de tejido. De manera alternativa, puede ser provocada por la expresión inducible del gene de ribozima si el gene de ribozima está bajo control de un promotor inducible. Por inducible se quiere decir químicamente ind ucible (por una molécula natural o artificial) o inducible por factores ambientales, tales como, luz, seq uía , tensión, ataque de patógenos y otros estímulos. Los promotores inducibles y específicos de tejido son bien conocidos. La ventaja de controla la expresión de gene de esta manera es que se hace uso de un gene de ribozima conocido, que ya demostró funcionar adecuadamente. Por lo tanto, se reduce la necesidad de experimentar para encontrar la mejor molécula para inactivar el gene útil . Un ejemplo de un gene útil es el gene A9-PR-Glucanase (Worral et al . , The Plant Cell , 1 992, vol . 4, p 759-771 ) . Este gene es usado para provocar esterilidad masculina artificial (AMS) en plantas transgénicas. Las plantas AMS son usadas como el padre femenino en la cruza para producir sem illas híbridas. Cuando la planta h íbrida obtenida se hace crecer para sus frutos, frecuentemente es deseable restaurar su fertilidad para garantizar la disposición óptima de frutos. Para facilitar la restauración de la AMS provocada por el gene A9-PR-Glucanase, el gene puede ser diseñado al fusionarlo a la secuencia objetivo artificial descrita antes, de manera que la función del gene no se afecte. Entonces es posible usar una ribozima contra el objetivo artificial como un restaurador de la esterilidad masculina. El gene de ribozima es introducido en el padre masculino, donde no tiene efecto (ya que no existe una secuencia objetivo en esa planta). La planta híbrida resultante de la cruza entre la planta femenina de AMS y la planta de restaurador masculino será completamente fértil , ya que la ribozima llevada por el padre masculino inactivará el gene AMS l levado por el padre femenino. Otro gene AMS puede ser usado de manera similar. El uso del objetivo artificial no es lim itado al área de mejoramiento de planta. El objetivo artificial podría ser usado con cualquier gene artificial cuando una inhibición eficiente del gene es necesaria en alg unas circunstancias. Por ejemplo, el objetivo artificial podría ser agregado a un gene terapéutico usado en un tratamiento de terapia de gene en humanos o animales. Un gene de ribozima específico de tejido contra el objetivo artificial podría ser usado entonces para proteger algún tejido específico contra la actividad del gene terapéutico, si tal actividad fue considerada indeseable en dicho tejido. Un gene de ribozima inducible contra el objetivo artificial podría ser usado para dar la médico cl ínico la habi lidad para parar el efecto del gene terapéutico si fuera necesario, al inducir solamente el gene de ri bozima. En realidad, tales sistemas pudieran ser requeridos absolutamente para ciertos procedimientos de terapia de genes, quizás donde está involucrada la expresión de genes de toxina. Una ribozima si ntética contra el objetivo artificial también podría ser usada a través de la entrega extraña para controlar la actividad del gene terapéutico en el tej ido apropiado o en el momento apropiado. De manera similar, el objetivo artificial podría ser usado en asociación con genes usados en el mejoramiento animal . Tam bién podría usarse en asociación con genes usados en las áreas de alimentos, por ejemplo, para mejorar los microorganismos usados en la producción de alimentos. Diferentes aspectos de la invención se ilustran en las figuras: Figura 1 : U bicación de los in iciadores usados para amplificar las secuencias virales. Se indica la secuencia de aminoácido usada para diseñar los iniciadores (ver figura 2, 3 y 4 más adelante) .

Figura 2: Secuencia conservada en la región de codificación Nlb, usada para diseñar el iniciador 2. Los virus son mencionados con la referencia de la publicación para su secuencia genómica parcial (WMV2 y ZYMV) o completa (todos los demás) . Se indica la posición en la secuencia publicada. Se usa el código estándar de aminoácidos de una letra . Figura 3: Secuencia conservada en la región de codificación Nlb, usada para diseñar el iniciador 3. Las anotaciones son como en la Figura 2. CP es proteína de recubrimiento. Figura 4: Secuencia conservada en el extremo de la región de codificación N ía, usada para diseñar el iniciador 4. Las anotaciones son como en la Figura 2. Figura 5: Secuencia del cDNA de la reg ión 3' de la cepa WMV2 Mar6. Las bases 1 -1 0 fueron adicionadas durante la clonación . La secuencia viral inicia en la base 1 1 y termina en la base 2971 , donde inicia el apéndice poIyA. Figura 5 bis: Secuencia del cDNA de la región 3' de WMV2 cepa Val3. Las bases 1 -1 0 se adicionaron durante la clonación . La secuencia viral inicia en la base 1 1 y termina en la base 2970, donde inicia el apéndice poIyA. Figura 6: Secuencia del cDNA de la región 3' de ZYMV cepa E 1 5. Las bases 1 -6 se adicionaron durante la clonación. La secuencia viral in icia en la base 7 y termina en la base 2922, donde inicia el apéndice poIyA.

Fig ura 7: Secuencias usadas para construir el gene de ribozima de brazo corto contra WMV2. A: Ribozima de brazo corto contra el filamento negativo, clonada en BlueScript SK+ (pBPL4741 ) . Las letras minúsculas se usan para la secuencia catal ítica de ribozima y las bases de los polienlazadores. Los sitios de restricción relevantes están en negritas. Se muestra la secuencia complementaria a el RNA de ribozima. B: Ribozima de brazo corto contra el filamento positivo, clonado en BlueScript S K+ (pBPL4742) . Las anotaciones son como antes. Se muestra la secuencia complementaria al RNA de ribozima. C: Secuencia de 3' UTR clonado de MVW2 Val 3 usada en el gene de ribozima de brazo corto. Las minúsculas muestran las regiones de polienlazador de BlueScript o el sitio de clonación Bam H l adicionado por PCR. Los sitios de clonación destruidos durante la clonación se muestran entre paréntesis. La numeración se refiere a la secuencia original determinada. Figura 8: Secuencias usadas para construir ribozimas de brazo corto contra ZYMV. A: Primera combinación contra el filamento positivo, clonado en BlueScript SK+: pBPL4746. Las anotaciones como en la Figura 7. Se muestra la secuencia complementaria al RNA de ribozima . B: Primera combinación contra el filamento negativo, clonada en BluScript SK+: pBPL4747. Las anotaciones son como antes. Se muestra la secuencia complementaria al RNA de ribozima.

C: Segunda combinación, contra ambos filamentos, clonada en BlueScriptSK+: pBPL4750. Las anotaciones son como antes. La secuencia complementaria al RNA de ribozima. D: Tercera com binación, contra filamento negativo, clonada en BlueScriptSK+: pBPL4751 . Las anotaciones son como antes . Se muestra la secuencia complementaria al RNA de ribozima . Figura 9: Secuencia del gene de ribozima de brazo largo contra ZYMV: pBPL4760. Números de bases correspondientes a la secuencia del filamento + mostrado en la figura 6 se indican con un * debajo de la base. Las primeras 486 bases están enfocando el filamento negativo (entre la base 2383 y la base 1 961 ), la unión es mostrada por ** bajo las bases, y las últimas 568 bases están enfocando el filamento + (entre la base 2388 y la base 2871 ). Las anotaciones son como antes. Se muestra la secuencia complementaria al RNA de ribozima. Figura 1 0: Ensayo in vitro de ribozima a partir de pBPL4734. Figura 1 1 : Ensayo in vitro de ribozima a partir de pBPL4736. Figura 1 2: Ensayo in vitro de ribozima a partir de pBPL4741 . Figura 1 3: Ensayo in vitro de ribozima a partir de pBPL4742. Figura 14: Ensayo in vitro de ribozima a partir de pBPL4750 y pBPL4751 . Fig ura 1 5: Plásmidos usados en el ensayo transiente. A: Plásmidos objetivo pBPL01 84, 01 85, 01 86 y 01 87 contienen 1 90 bp, 21 0 bp, 1 70 bp y 180 bp, respectivamente, de secuencia de filamento negativo de WMV2 clonado en los sitios Nsil - Ncol de pGLFuz (Sawyer y Birch 1996). El plásmido objetivo pBPL0188 contiene 540 bp del filamento positivo de WMV2 clonado en los sitios Nsil - Ncol de pGLFuz. B: El plásmido de ribozima pBPL0189 contiene una inserción de 400 bp clonada en los sitios Bglll - Xhol de un derivado de pGLFuz, codificando una ribozima octamérica contra WMV2, enfocando los sitios 696 (-), 996 (-), 1747 (-), 2067 (-), 2259 (+), 2403 (+), 2520 (+) y 2720 (+). El plásmido de ribozima pBPL0190 contiene una inserción de 220 bp clonada en los sitios Bglll - Shol de un derivado de pGLFuz, codificando una ribozima pentamérica contra ei filamento negativo de QYMV, enfocando los sitios 1243, 1743 (equivalente a 1747 en WMV2), 1929, 2442 y 2564. Figura 16: Actividad de LUC transiente después del co-bombardeo ya sea de una ribozima octanomérica (pBPL0189) o una ribozíma pentamérica (pBPL0190) con varios plásmidos conteniendo diferentes regiones objetivo fusionadas en 5' al gene de luciferasa. Cada co-bombardeo consistió de 2 µg de plásmido de ribozima (pBPL0189 o pBPL0190) y 2 µg del plásmido objetivo como se indica. Las barras representan errores estándares del promedio de tres experimentos independientes. Figura 17: Construcción del vector pGLFuz (Sawyer y Birch 1996). El gene uidA modificado con PCR de 1.8 Kb fue insertado como un fragmento de DNA Nsil - Ncol corriente arriba del gene luc de pZorz para producir pGLfuzTAG. El gene luc de pGLfuzTAG fue removido (por digestión con Notl, tratamiento con T4 DNA polimerasa, entonces digestión con Xhol) y se reemplazó por el gene luc de 1.9 Kb de pSPNF+luc (preparado por digestión con Kpnl, tratamiento con T4 DNA polimerasa y digestión con Xhol), produciendo el constructo de fusión uidA :luc pGLFuz. B, Gglll; Bl, extremo romo; K, Kpnl; Luc, gene luc de pZorz; Mod. GUS, gene uidA modificado con PCR; Nc, Ncol; Ne, Nhel; Ni, Nsil; No, Notl; P, región de promotor artificial osa conteniendo las regiones líderes 4ocs-?35S-Ac; pSPNF+Luc, gene luc de pSPNF+luc; T, región de poliadenilación 3' oes; TAG, codón de paro; X, Shol. Figura 18: Secuencia de la región de WMV2 cepa Mar6 (línea superior = filamento (+), línea inferior = filamento (-)) alrededor del sitio de corte de ribozima 1747 en el filamento (-) (indicado en negritas). La secuencia subrayada (posiciones 1704 ? 1873 en el filamento (-)) representa la secuencia objetivo artificial de longitud completa, la cual puede ser enlazada a un gene reportador en ensayos de ribozima transientes, o a un gene de interés como un elemento regulable de ribozima. La flecha (T) indica el nucleótido en el filamento (-), el cual está inmediatamente 5' del sitio de corte de ribozíma. (G/T) en la posición 1863 en el filamento (-) indica que la G que ocurre de manera natural puede ser reemplazada con una T para hacer una mutación en el codón de paro en 1864-1862 (TGA). Esto facilita la fusión en marco, y puede ser introducida usando iniciadores de PCR apropiados. Figura 19: muestra la secuencia de DNA de pBPL3817 (ribozima de brazo largo contra cistrones Nlb y CP de WMV2). La secuencia es escrita de 5' a 3'. La primera base corresponde al número de base 279 en la figura 5. La última base viral es G, 34 bases antes del final de la secuencia. Las regiones catalíticas de ribozima están subrayadas, en itálicas. Figura 20: muestra la organización de genoma del tipo de miembro de la familia potyvirus, PVY (del capítulo 4, "The Potyviridae", Ed. Shukla, D.D., Ward, C.W., Brunt, A. A, 1994 CAB International). P1: primera proteína; HC-Pro: componente auxiliar; P3: tercera proteína; 6K1, 6K2: proteínas de 6 kb adicionales; Cl. Proteína de inclusión cilindrica; Nía: pequeña proteína de inclusión nuclear; Nlb: proteína de inclusión nuclear grande; CP: proteína de recubrimiento. Figura 21: muestra la determinación de la epidemiología viral en la Temporada 2 de ensayos de campo (descritos en el Ejemplo 10 más adelante). La técnica usada fue análisis de ELISA en el control susceptible a virus, tomado aleatoriamente. Las anotaciones se hicieron sobre un periodo de un mes a intervalos de una a dos semanas. WMV2 = virus de mosaico de sandía 2; CMV = mosaico de pepino; ZYMV = virus de mosaico amarillo de calabacita; PRSV = virus de anillada de papaya.

EJEMPLOS Las técnicas de biología molecular usadas son esencialmente aquéllas descritas en Current Protocols in Molecular Biology (Protocolos actuales en biología molecular) (Ausubel F.M. et al. Eds, 1994-1997, John Wiley & Sons, I nc. , Nueva York. ) , excepto donde se mencione de otra manera. 1 . Clonación y secuenciación de la región 3' del RNA genómico de virus obietivo Los virus objetivo para este trabajo son virus de mosaico de sand ía 2 (WMV2) y virus de mosaico amarillo de calabacita (ZYMV) . Para d iseñar ribozimas contra estos virus, se determinó una secuencia parcial del genoma de aislados de cam po de estos virus de la región mediterránea , como sigue: a - Se recolectó material de planta infectada y se extrajo el RNA total . b - Se usó el RNA como la plantilla para una Reacción en cadena de polimerasa - transcripción inversa (RT-PCR) usando iniciadores específicos para la región term inal 3' del genoma potyviral. c - Los productos de PCR fueron clonados y secuenciados. Estos tres pasos son detallados a continuación: a - Las plantas de calabacita fueron inoculadas mecánicamente con las cepas Mar6 o Val3 de WMV2 o las cepas E9 o E 1 5 de ZYMV. Estas cepas son aislados de campo de la región mediterránea. Las hojas fueron recolectadas y se extrajo el RNA total. b - Una comparación de secuencias de todas las secuencias de potyvirus publicadas permitieron la identificación de regiones de la conservación de secuencia entre potyvirus.

La Figura 1 muestra la ubicación de las secuencias conservadas relevantes identificadas en el genoma de varios potyvirus. La Figura 2 muestra la secuencia conservada identificada en la región que codifica la proteína N l b usada para diseñar el iniciador 2. La Fig ura 3 muestra la secuencia conservada identificada en la región que codifica la proteína N l b usada para diseñar el iniciador 3. La Fig ura 4 m uestra la secuencia conservada identificada en el final de la región que codifica la proteína N ía, y usada para diseñar el iniciador 4. La transcripción inversa se realizó usando el iniciador Poly-T-anchor: Poly-T-anchor: 5' GGGAGCTCGCTAGCGGATCCT1 7 El iniciador 1 , usado en el paso de PCR, es homólogo para la región de ancla, con bases extra adicionadas para facilitar la clonación de los productos de PCR: I niciador 1 : 5' AATTGGGAGCTCGCTAGCGGAT Los otros iniciadores fueron diseñados para ig ualar la secuencia de consenso de las regiones conservadas identificadas como se describió antes, y algunas bases se adicionaron para facilitar la clonación . Los iniciadores fueron degenerados moderadamente para considerar el polimorfismo. Múltiples bases en una posición son indicadas en la secuencia por u na / : T/G significa que tanto T como G pudieran estar presentes en el iniciador en una posición dada. N significa que cualquier base podría estar presente. I niciador 2 : 5' AATTGCTAGCAGTT/GGTT/GGACAATACACTT/AATGG I niciador 3: 5' AATTCTAGAATA/CAT/GATCATCACCATTG/TGC Iniciador 4: 5' AATTCTAGATTCTGGAT/AACATTGGATAA/TC/GNAC c - Los productos de PCR del tamaño predicho fueron obtenidos con pares de iniciadores 1 -2 ( 1 .7 kb) y 3-4 (1 .3 kb) . Los productos de PCR fueron purificados en gel , cortados con las enzimas de restricción apropiadas, clonados en el plásmido BluScript SK+ (comercialmente disponible de Stratagene) y la secuencia de nucleótidos completa del fragmento viral fue determinada usando los métodos estándares conocidos en la técnica. La mayoría de la secuencia se determi nó a partir de dos productos de PCR independientes de cada plantilla de RNA. Para WMV2, también se obtuvo un producto de PCR con un par de iniciadores 1 -4. Subsecuentemente se usó para construir genes de ribozima de brazo largo (ver Ejemplo 3 más adelante) . La secuencia de la región 3' de WMV2 cepa Mar6 se describe en la Fig ura 5 y la secuencia de de la región 3' de WMV2 cepa Val3 se describe en la Figura 5 bis. Las dos cepas son más de 99% idénticas. La secuencia de la región 3' de ZYMV cepa E 1 5 se describe en la Fig ura 6. La cepa E9 fue más del 99% idéntica a E 1 5. 2. Diseño de ribozimas contra WMV2 Tanto el filamento de RNA (+, de codificación o genóm ico) positivo del virus como el filamento de RNA (-, de replicación intermedio) negativo del virus, fueron enfocados por ribozimas. Se usaron los siguientes criterios cuando se eligieron los sitios de corte en el RNA objetivo: Se prefirieron ternas conocidas por ser bien cortadas in vitro (Perriman et al. , 1 992): GUC, GUA, GUU , UUC, UU U . Se prefirieron ternas donde los codones han limitado la degeneración . Esto aumenta la posibilidad de que la secuencia objetivo se desarrollará fácilmente, de manera que el virus supere la resistencia. Algunos ejemplos son mostrados más adelante para ilustración, con la terna cortada en negritas. Son posibles muchas más combinaciones. Para el filamento positivo: Secuencia de aminoácidos: MetSer MetTyr MetPhe Phe Secuencia de nucleótidos: AUGUCN AUGUAU/C AUGUUU/C UUU/C Para el filamento negativo: Secuencia de aminoácidos (+): MetLys MetThr GluLys Tyr Secuencia de nucleótidos (+): 5AUGAAA/G AUGACN GAA/GAAA/G UAU/C Secuencia de nucleótidos (-): 3'UACUUU/C UACUGN CUU/CUUU/C AUA/G Se prefirieron las ternas ubicadas en una región de conservación de secuencia. Esto incrementaría la oportunidad de que la ribozima pudiera enfocar cepas m ú ltiples del virus o incluso múltiples especies de virus relacionados. También disminu iría la oportunidad de que surgiera un virus resistente a corte. Se seleccionaron cuatro sitios en el filamento positivo y se seleccionaron cuatro sitios en el filamento negativo. El número usado para describir una ribozima dada se refiere a la base subrayada , en el filamento + en las siguientes tablas, de acuerdo con la numeración de la secuencia presentada en la figura 5. El sitio de corte está en negritas y el enlace cortado es indicado por un -. Sitios seleccionados en el filamento negativo: Número Secuencia objetivo secuencia de Secuencia de aminoácidos filamento + 696 5' U UC - A 3' 5' UGAA 3' Met Lys 996 5' GUC - A 3' 5' UGAC 3' Met Thr 1 747 5' GUA - U 3' 5' AUAC 3' Tyr 2067 5' U U U - G 3' 5' CAAA 3' Thr Lys Sitios seleccionados en el filamento positivo: Número Secuencia objetivo Secuencia de aminoácidos 2259 5' U UU - A 3' Phe 2403 5' U UC - U 3' Phe 2520 5' UU U - U 3' Phe 2720 5' GUA - A 3' Gln Och De estos sitios, el sitio 2259 fue conservado en ZYMV (en la base 2249 en la figura 6). El sitio 1 747 fue altamente conservado entre la mayoría de los potyvirus: una comparación de un segmento de 23 bases rodeando el sitio muestra la siguiente identidad: ZYMV: 23/23 Virus Y de papa: 20/22 Virus de mosaico de caña de azúcar: 1 9/23 Virus de mosaico soportado en semilla de ch ícharo: 20/23 Virus pox de ciruela: 20/23 Virus de mosaico de maíz enano: 20/23 La estructura y propiedades de las ribozimas ejemplificando la presente invención son indicadas a continuación en la Tabla 8.

Tabla 8 3. Construcción de un gene de ribozima multimérico de brazo largo contra el filamento negativo de WMV2 (pBPL 4738) Se construyó un subclon del cDNA para la región 3' de WMV2 Mar6, extendiéndose de la base 269 (sitio EcoRI) a la base 21 6 8 (sitio Xhol) (ver figura 5) mediante supresiones internas de un plásm ido conteniendo el producto de PCR obtenido con los iniciadores 1 y 4, como se describió en 1 . anterior. Este subclon se usó como una plantilla para el sig uiente paso. Se usaron las reacciones de PCR inversas (I PCR) para insertar una secuencia catal ítica de ribozima en el reemplazo de la tercera base de cada terna objetivo, esencialmente como se describió en la Unidad 3.1 7.3 de Current Protocols in Molecular Biology. Se usó la secuencia catalítica de ribozima del satélite de virus de anillada de tabaco (sTobRV, Haseloff y Gerlach , 1 988) . Los iniciadores usados se listan más adelante. Las bases en m inúsculas están codificando la secuencia catalítica de ribozima. Las bases en mayúsculas son complementarias a la región objetivo y se usan para iniciar la plantilla de plásmido. Las bases emparejadas con las primeras 2 bases de la terna cortada están en neg ritas. Para el primer par de iniciadores, se m uestra la secuencia del producto final alrededor del sito 696, para demostrar que la ligación del producto de IPCR producirá una molécula con una secuencia catalítica funcional insertada en el reemplazo de la tercera base del sitio objetivo.

Rbz696-3' : 5 ,gtgaggacgaaAAAGCTGCTGTCGGTGCTC3 ' Rbz696-5 ' : 3 ' CTAAATACCTAGGGACTTGTAgactactcagg5 ' Resultado para 696: 5 ' ... GAACAUcugaugaguccgugaggacgaaAAAGC ..3 ' Rbz996-3 • : 5 • gtgaggacgaaACTAAGTTTTATGGGGGTTGG3 ' Rbz996-5 * : 3 ' CAGGTACCTGTCAACCGTAgactactcaggS ' Rbzl747-3 ' : 5 ' gtgaggacgaa?CATAGCTGAGACAGCATTG Rbzl747-5 ' : 3 ' CGTAGGCCTTTTCGAGGTgactactcagg5 ' Rbz2067-3 ' : 5 ' gtgaggacgaaAAGAAAATGAACCTTCCAACAG3 ' Rbz2067-5 ' : 3 ' GGGTGCTGATGTTTTCTATTGgactactcaggd ' La plantilla de plásmido se amplificó por I PCR usando el primer par de iniciadores. El producto de PCR de longitud completa se purificó en un gel y se dio forma circular por ligación. El producto circular fue transformado en bacterias, y el plásm ido resultante se extrajo de una colonia bacteria y se sometió a la segunda reacción de I PCR usando el segundo par de iniciadores. El procedimiento se repitió con el tercero y cuarto par, y el producto final fue analizado al secuenciar las regiones modificadas. Se obtuvo un plásmido llamado pBPL4734; ten ía la secuencia correcta excepto por la ribozima 696, la cual ten ía una base extra en el lazo, y la ribozima 996, donde había tenido lugar una pequeña supresión . Se hicieron intentos para reparar los errores en 996 mediante una nueva ronda de I PCR. El producto final fue llamado pBPL4738 y tuvo la secuencia esperada , excepto en los sitios 696 y 996, donde la secuencia catal ítica sufre mutación en el lazo de ribozima (mayúscula) : Ribozima mutante 696: cugaugaguccCGUGAggacgaa Ribozima mutante 996: cugaugaguccUGAggacgaa STobRV tipo natural: cugaugaguccGUGAggacgaa.

Para construir un gene de ribozima funcional en un vector de transformación de planta, la secuencia de ribozima de brazo largo multimérico se clonó en el cartucho de expresión de planta de pBIOS512, hecho del promotor 35S intensificado y el terminador nos, y el gene fue insertado entonces en el vector de transformación de planta pSCK. Descripción de pBIOS512: este plásmído se construyó al reemplazar la región de promotor 35S del plásmido pBIOS3 (Pérez et al., 1989), un plásmido derivado de pJIT60 (descrito en Guerineau y Mullineaus, 1993), al insertar un sitio Ncol en el polienlazador. El promotor 35S intensificado fue aislado de pJIT163 como un fragmento Sstl - BamHl y se clonó en los sitios Sstl - BamHl de pBIOS3 en el reemplazo del promotor 35S. Descripción de pSCK: este plásmido se construyó al insertar un gene de resistencia a canamicina en el vector de transformación de planta pSCV1 (Firek et al., 1993). El gene de resistencia a canamicina se construyó al insertar la secuencia de codificación nptll de pCAMVNEO (Fromm et al., 1986) como un fragmento BamHl en el sitio BamHl de pBIOSI (Pérez et al., 1989), resultando en pBIOSIK. El gene fue aislado entonces de pBIOSIK como un fragmento EcoRI (Klenow) y se insertó en el sitio EcoRV de pSCV1, resultando en pSCK. La secuencia de ribozima se clonó en el cartucho de expresión de pBIOS512, como un fragmenot EcoRV-Smal - Hindlll en el sitio Hindll (Klenow) de pBIOS51 2. El gene fue cortado entonces como un fragmento EctolCRI - EcoRI (Klenow) y se insertó en el sitio Smal de pSCK. El plásm ido resultante fue llamado pBPL381 7. Contiene un T-DNA con un gene marcador confiriendo resistencia a la canam icina y el gene de ribozima de brazo largo expresando un RNA con aproximadamente 1900 bases com plementarias al filamento negativo del virus (RNA objetivo) y enfocando cuatro sitios en el RNA objetivo. 4. Construcción de un gene de ribozima multimérico de brazo largo contra el filamento positivo de WMV2 (pBPL 4739) Un procedim iento simi lar a aquél descrito en 3. se usó para construir un gene de ribozima contra el filamento +. La plantilla de plásmido usada en las reacciones de I PCR se extendió desde la base 21 64 (sitio Xhol) al final del cDNA (base 2988, incluyendo 1 8 A del apéndice poIyA) y se obtuvo por supresiones internas de un clon de cDNA parcial de la región 3' de WMV2. Las reacciones de PCR inversa se usaron como se describió antes en 3. usando los siguientes pares de iniciadores: (mismas anotaciones que antes) Rbz2259+3 ' : 5 ' gtgaggacgaaAAACCATTCATAATCACACCC3 ' Rbz2259+5 ' : 3 ' CAATAGCTATGTGGTTTGGTAgactactcaggd ' Rbz2403+3 ' : 5 ' gtgaggacgaaAAATGGTGCATGATTTGTC3 ' Rbz2403+5 ' : 3 ' CGAAGACGACGCAGACTgactactcaggd ' Rbz2520+3' : 5 ' gtgaggacgaaAAGTCAAAAGCATAGCGTGC3 ' Rbz2520+5 ' : 3 ' CACAAAACCTTCATTGGAGTATgactactcagg5 ' Rbz2720+3 ' : 5 ' gtgaggacgaaACTGCGGTGGACCCATACC3 ' Rbz2720+5 ' : 3 ' CACTGGTCAAATGGATCAGAAgactactcaggd ' El plásmido obtenido fue llamado pBPL4736 y le faltó la mitad de la ribozima 2259, y tuvo una supresión de base en el lazo de las otras 3 ribozimas. N uevas rondas de I PCR insertaron una ribozima correcta para 2259 y corrigieron la ribozima 2403. El producto final todavía conten ía algunos errores, los cuales no fueron considerados problemas serios. La secuencia de ribozima para los sitios 2259 y 2403 es correcta (tipo natural como se describió). Las secuencias de ribozima para los sitios 2520 y 2720 tuvieron cada una una base suprimida: Ribozima mutante en 2520: cugaugaguccUGAggacgaa Ribozima mutante en 2720: cugaugagucGUGAGgacgaa sTobRV tipo natural : cugaugaguccG UGAggacgaa Se sabe que estas mutaciones no anulan la actividad de ribozima. Esto se confirmó por ensayos in vitro (ver más adelante) . Este plásmido fue llamado pBPL4739. La secuencia de pBPL4739 se clonó en el cartucho de expresión de pBIOS51 2 como un fragmento Bam H l (Klenow - EcoRI en el sitio Hind l l l (Klenow) de pBIOS51 2. El gene fue transferido entonces al vector de transformación de planta pSCK, como se describió antes en 3.

El plásmido resu ltante fue llamado pBPL3801 0. Contiene un T-DNA con un gene marcador que confiere resistencia a la canamici na y el gene de ribozima que expresa un RNA con aproximadamente 830 bases complementarias al filamento positivo del virus (el RNA objetivo) y que enfoca cuatro sitios en el RNA objetivo.

. Construcción de u n gene de ri bozima multimérica de brazo corto contra ambos filamentos de WMV2 (pBPL 4743) Con el fin de construir una ribozima multimérica de brazo corto que enfoq ue los sitios descritos antes para las ribozimas de brazo largo, se com praron oligonucleótidos sintéticos abarcando la secuencia completa del gene de ribozima deseado. Los oligonucleótidos fueron montados y el producto de longitud completa deseado fue obtenido usando PCR basada en Ligación (LbPCR) como se descri bió por Betzner et al. ( 1 997). Los genes de ribozima multimérica de brazo corto contra el filamento negativo y el filamento positivo se sintetizaron de manera independ iente y se montaron usando sitios de restricción construidos en el extremo de la secuencias sintéticas. La secuencia catal ítica de ribozima usada para estos constructos fue una variante de la ribozima sTobRV descrita antes, con una hélice I I de 3 pares de bases en lugar de la natural de 4 pares de bases. La ribozima usada para la ribozima m ultimérica corta fue: cugaugaGCGgugaCGCgaa. (Hélice I I mostrada aqu í en mayúsculas) Las regiones de formación de pares entre las ribozimas y el objetivo (hélice I y hél ice l l l) se hicieron de 2 brazos de 1 0 a 1 2 bases (ver Haseloff y Gerlach, 1 988 para una descripción de hélices I , I I y l l l). La secuencia de los oligonucleótidos usada está dada más adelante; las mi núsculas son la secuencia catalítica de ribozima , las minúsculas en itálicas son regiones en lazadoras, las mayúscu las son secuencias objetivo.

Todas las secuencias son mostradas 5' a 3' . La secuencia sintetizada (mostrada) es realmente el filamento complementario al RNA de ribozima.

Los oligonucleótidos usados para las ribozimas contra el filamento negativo: M2067S : gcagctgctggatccatgTCATTTTCTTttcgcgtcaccgctcatcagGTTATCT TTTG WM1747S : TCAGCTATGTttcgcgtcaccgctcatcagTGGAGCTTTTC WM996S : Caga tctATAAAACTTAGTttcgcgtcaccgctcatcagATGCCAACTG M696S : CAGCAGCTTTttcgcgtcaccgctcatcagATGTTCAGGGAcctgcatctga tca agcttg Los oligonucleótidos gu ía usados para alinear la secuencia de longitud completa para la reacción de ligación : WMGU4S : montar WM2067S con WM 1 747S GAAACATAGCTGACAAAAGATAACCTG WMGU5S: montar WM 1 747S con WM996S GTTTTATAGATCTGGAAAAGCTCCAC WMG U6S: montar WM996S con WM696S GAAAAAGCTGCTGCAGTTGGCATC Oligonucleótidos usados para las ribozimas contra filamento positivo: M2259S : gcagctgctggatccATGAATGGTTTttcgcgtcaccgctcatcagATGGTTTGG WM2403S: TGCACCATTTttcgcgtcaccgctcatcagTCAGACGCAGat WM2520S: CTTTTGACTTttcgcgtcaccgctcatcagTATGAGGTTAC WM2720S: CACCGCAGTttcgcgtcaccgctcatcagAAGACTAGGTAAcctgcatctgatca agcttg Oligonucleótidos guía usados para alinear la secuencia de longitud completa para la reacción de ligación : WMGU 1 S : montar WM2259S con WM2403S GAAAAATGGTGCACCAAACCATCTG WMG U2S: montar WM2403S con WM2520S CGAAAAGTCAAAAGATCTGCGTCTGAC WMGU3S: montar WM2520S con WM2720S AAACTGCGGTGGTAACCTCATACTG I niciadores usados para amplificar los ol igonucleótidos ligados montados por PCR: WM PC 1 S: AATTGCAGCTGCTGGATCCATG WMPC2S: AATTCAAGCTTGATCAGATGCAG Los productos de PCR fueron digeridos con Bam H l y H indl l l y se clonaron en BlueScript SK+. La ribozima contra el filamento negativo dio el plásm ido pBPL4741 , y la ribozima contra el filamento positivo dio pBPL4742. Las secuencias de las regiones relevantes están en la figura 7. Los sitios de restricción usados para clonación adicional están indicados. Las 2 ribozimas fueron combinadas al insertar el fragmento BstXI - BspM I de pBPL4742 en los sitios BstXI - Bam H l de pBPL4741 , produciendo pBPL4743. La región de no codificación 3' de WMV2 cepa Val3 (3' UTR) se clonó entonces en 3' de la secuencia de ribozima multimérica . Esto se hizo como un intento para incrementar la eficacia de la ribozima por co-compartimental ización con el RNA viral objetivo. Si las secuencias de extremo 3' de RNA están involucradas en la localización celular de RNA, como es el caso con muchos RNAs, se espera que al proporcionar el RNA de ribozima con una secuencia 3' sim ilar a aq uélla de su objetivo, las 2 moléculas estarían presentes en el mismo compartimento celular.

La región 3' UTR de WMV2 Val3 se clonó a partir del cDNA original (ver secuencia en la figura 5 bis) como un fragmento Hinfl (en la base 2678) - Bam H l (de la región ancla en el iniciador 1 , ver 1 . anterior) hacia EcoRI - Bam H l de BlueScript SK+. El fragmento contiene bases 2678 a 2970 del cDNA de la cepa Val3, que contiene los últimos 14 codones del cDNA seguido por la región sin trasladar completa. Esta secuencia (mostrada en la figura 7) fue insertada entonces como u n frag mento EcoRV - Notl en los sitios Bam H l (Klenow) - Notl de pBPL4743, dando pBPL4744. La secuencia ahora completa fue transferida entonces como un frag mento BamH l - Hind l l l en los sitios BamH l - Hind l l l de pBIOS512 para crear un gene funcional , como se describió en 3. Este gene fue clonado entonces en el sitio Smal de pSCK como se describió antes en 3. , produciendo pBPL3754. pBPL3754 contiene un T-DNA con un gene marcador que confiere resistencia a canamicina y el gene de ribozima que expresa un RNA de aproximadamente 700 bases de largo. Este RNA contiene 8 regiones de homolog ía para el filamento positivo o negativo del virus. Cada región está entre 20 y 22 bases de largo, y está dividido en la mitad por la secuencia catal ítica de ribozima. Además, el RNA de ribozima tiene una región 3' que contiene aproximadamente 300 bases idénticas al extremo 3' viral. 6. Construcción de varios genes de ribozima multiméricos de brazo corto contra ZYMV La selección de sitio será descrita usando las mismas anotaciones como en 2. anterior. La numeración se refiere a la secuencia mostrada en la figura 6. Sitios seleccionados en el filamento negativo: Número Secuencia objetivo Secuencia de Secuencia de filamento + aminoácidos 1245 5' GUU - G 3' 5' CAAC 3' Asn 1743 5' GUA - U 3' 5' AUAC 3' Tyr 1929 5' GUC -A 3' 5' UGAC 3' Asp 2009 5' UUC -A 3' 5' UGAA 3' ValAsn 2027 5' UUC - C 3' 5' GGAA 3' GlyLys 2354 5' UUU - U 3' 5' AAAA 3' GluAsn 2442 5' GUA - U 3' 5' AUAC 3' Tyr 2564 5' UUC -A 3' 5' UGAA 3' MetLys Sitios seleccionados en el filamento positivo: Número Secuencia objetivo Secuencia de aminoácidos 110 5' GUC - U 3' Val 2161 5' GUC - U 3' AlaSer 2255 5' GUU - U 3' Val 2455 5' GUA - U 3' ArgTyr 2466 5' UUC - G 3' LeuArg 2590 5' UUC - U 3' ValSer 2603 5' UUU - G 3' Phe Se construyeron varias com binaciones de ri bozimas de brazo corto usando oligonucleótidos. El procedim iento fue similar al procedimiento descrito en 5. anterior. 6.1 . Construcción de pBPL 4748 La primera combinación conten ía 1 0 actividades de ribozima, 5 contra cada filamento: 1 245 - 1 743 - 1 929 - 2442 - 2564 contra el filamento negativo (plásmido pBPL4747) 1 1 0 - 21 61 - 2255 - 2455 - 2590 contra el filamento positivo (plásmido pBPL4746) La secuencia catal ítica de ribozima usada para estos constructos fue la misma variante de la ribozima sTobRV como se describió en 5. anterior, con una hélice I I de 3 pares de bases GCG en lugar de la natural de 4 pares de bases. Las regiones de formación de pares entre las ribozimas y el objetivo (hélice I y hélice l l l) se hicieron de 2 brazos de entre 8 y 1 1 bases. La secuencia de la región relevante de pB PL4746 y pBPL4747 se muestra en la figura 8. Las secuencias fueron montadas juntas con 3'UTR de WMV2 Val3 (mostradas en la figura 7) mediante una ligación tripartita: el fragmento EcoRV (desfosforilado) - Notl conten iendo 3' UTR y el framento BamH l (Klenow) - Hindl l l (Klenow) de pBPL4747 se ligaron juntos en pBPL4746 cortado con Bam H l (Klenow) y Notl (ambos sitios desfosforilados). El plásmido resultante fue llamado pBPL4748 y contenía (de Hindl l l a BamHl) la secuencia para las ribozimas contra el filamento positivo, seguido por las ribozimas contra el filamento positivo, seguido por las ribozimas contra el filamento negativo seguido por 3'UTR. La secuencia completa fue clonada entonces como un fragmento BamH l - Hind l l l en el cartucho de expresión de pBIOS51 2 como se describió en 3. anterior, y el gene funcional se clonó en el vector de transformación de planta pSCK como se describió en 3. anterior produciendo pBPL3906. El plásm ido pBPL3906 contiene un T-DNA con un gene marcador que confiere resistencia a la canam ícina y el gene de ríbozima que expresa un RNA aproximadamente 750 bases de largo. Este RNA contiene 1 0 regiones de homolog ía para el filamento positivo o negativo de ZYMV. Cada reg ión está entre 1 6 y 20 bases de largo, y se divide en el centro por la secuencia catalítica de ribozima. Además, el RNA de ribozima tiene una región 3' que contiene aproximadamente 300 bases idénticas para el extremo 3' sin trasladar de WMV2 Val3. 6.2 Construcción de pBPL4750 Se hizo una segunda com binación usando las siguientes ribozimas: 2354 (-) - 2455 ( + ) - 2466 ( + ) - 2590 ( + ) - 2603 ( + ) . La secuencia sintética clonada en BlueScript SK+ produjo pBPL4750. Esto fue un intento para capitalizar a partir del amontonamiento de los sitios 2455-2466 y 2590-2603.

La secuencia catalítica de ribozima usada para estos constructos fue la ribozima de cabeza de martillo sTobRV natural , excepto por 2354 y 2603, donde la m isma variante de la ribozima sTobRV como se describió en 5. anterior, usando u na hélice I I de 3 pares de bases GCG en l ugar de la natural de 4 pares de bases. Las regiones de formación de pares entre las ribozimas y el objetivo (hélice I y hélice l l l) se hicieron de 2 brazos entre 8 y 1 2 bases. Las ribozimas adyacentes 2455-2466 y 2590-2603 tuvieron u n brazo en común .

La secuencia relevante de pBPL4750 se m uestra en la figura 8. La secuencia de ribozima se clonó directamente como un fragmento BamHl - Hind l l l en el cartucho de expresión de pBI OS51 2 como se describió en 3. anterior, y el gene funcional fue clonado entonces en el vector de transformación de la planta pSCK como se descri bió en 3. anterior, produciendo pBPL41 86. El plásm ido pBPL41 86 contiene un T-DNA con un gene marcador que confiere resistencia a canamicina y el gene de ribozima que expresa un RNA de aproximadamente 250 bases de largo. Este RNA contiene 3 regiones de homología para el filamento positivo y negativo de ZYMV. U na región de 21 bases está d ividida en el centro por una secuencia catalítica de ribozima. Las otras 2 regiones de 31 y 32 bases se dividen cada una en tres partes por dos secuencias de ribozima. 6.3 Construcción de pBPL4751 Se hizo una tercera combinación usando una doble ribozima contra los sitios 2009 - 2027 (ambos de filamento negativo) . La secuencia sintética clonada en BluScript SK+ produjo pBPL4751 . La secuencia catal ítica de ribozima usada para este constructo fue la misma variante de la ribozima sTobRV como se describió en 5. anterior, con una hélice I I de 3 pares de bases GCG en lugar de la natural de 4 pares de bases. Las regiones de formación de pares entre las ribozimas y el objetivo (hélice I y hélice l l l) se hicieron de 2 brazos de 1 0 y 17 bases para cada ribozima. El brazo de 1 7 bases fue compartido entre las 2 ribozimas. En efecto, la región de formación de pares total fue 37 bases ( 1 0 + 1 7 + 1 0) , se interrumpió en 2 lugares por las 2 secuencias de ribozimas. La secuencia relevante de pBPL4751 es mostrada en la figura 8. La secuencia de ribozima se clonó directamente como un fragmento de BamHl - Hind l l l en el cartucho de expresión de pBIOS51 2 como se describió en 3. anterior, y el gene funcional se clonó entonces en el vector de transformación de planta pSCK como se describió en 3. anterior, produciendo pBPL4194. El plásm ido pBPL41 94 contiene un T-DNA con un gene marcador que confiere resistencia a canam icina y el gene de ribozima q ue expresa un RNA de aproximadamente 1 00 bases de largo. Este RNA contiene 1 región de homolog ía para el filamento negativo de ZYMV. La región es de 37 bases de largo y está dividida en tres partes por las 2 secuencias catal íticas de ribozima. 7. Construcción de un gene de ribozima multimérica de brazo largo contra ZYMV Se hizo un gene sim ple, expresando un RNA de poliribozima enfocando varios sitios en ambos filamentos. Los sitios elegidos fueron (ver 6. anterior para la numeración): 2009 (-) , 2027 (-) , 2354 (-) , 2455 ( + ), 2466 ( + ) , 2590 ( + ) y 2603 ( + ). Para crear la plantilla apropiada , se clonaron dos fragmentos del cDNA de la región 3' de QYMV en la orientación opuesta como sigue (ver la figura 6 para la secuencia) . El clon de cDNA obten ido de ZYMV E 1 5 con los iniciadores 1 y 2 de PCR (como se describió en 1 . anterior) se cortó con Nsi l (en la base 2383) y Sacl l (en el polienlazador, junto al extremo 5' del cDNA) , entonces se trató con Klenow y se desfosforiló. El fragmento grande fue purificado entonces y se usó como un vector en la ligación subsecuente. El mismo plásm ido se cortó con Nsi l (en la base 2383) y AlwN I (en la base 1 955), entonces se trató con Klenow, y el fragmento de base 470 se purificó y se usó como la inserción en la subsecuente ligación . Los clones obtenidos fueron clasificados por la orientación apropiada, y el plásmido seleccionado fue llamado pBPL01 57. Este plásmido contiene la secuencia entre las bases 2383 y 2922. Ligación coloca lado a lado, la región 3' de 1 961 y la región 3' de 2383. Cuando un promotor es colocado en la orientación apropiada, el producto de transcripción de esta secuencia será complementaria al filamento negativo de ZYMV entre la base 1 961 y 2383, y com plementaria al filamento positivo de ZYMV entre la base 2388 y 2922.

Las secuencias catalíticas de ribozima fueron insertadas en las posiciones mencionadas antes usando una secuencia de reacciones de I PCR en el plásmido de plantilla pBPL01 57, siguiendo el procedim iento descrito por WMV2 en 2. anterior. La secuencia catalítica de ribozima usada para este constructo fue la ribozima de cabeza de martillo sTobRV natural como se describió previamente. Se probó que la inserción de la secuencia catal ítica que enfoca el sitio 2354 (-) era difícil , como se esta secuencia de ribozima fuera tóxica para E . coli o replicación de plásm ido afectado. El plásmido conteniendo las 7 secuencias de ribozima se llamó pBPL4760. La secuencia del gene de ribozima en pBPL4760 se muestra en la figura 9. La secuencia completa se recuperó usando H indl l l (que corta en la base 2866) y Sacl (Klenow) (del polienlazador) y el fragmento se clonó en el cartucho de expresión de pBIOS51 2 en los sitios Hind l l l - Sal í (Klenow). Esto tuvo el efecto de remover de la región que enfoca el filamento positivo los últimos 51 nucleótidos. El gene funcional fue transferido entnces al vector de transformación de planta pSCK como se describió previamente, produciendo el plásm ido pBPL.4771 . El plásm ido pBPL4771 contiene un T-DNA con un gene marcador que confiere resistencia a canamicina y el gene de ribozima de brazo largo que expresa un RNA con aproximadamente 900 bases complementarias al filamento positivo y negativo de RNA de ZYMV y que enfoca siete sitios en los RNAs objetivo. 8. Ensayo i n vitro de las ribozimas La actividad de ribozima se ensayó in vitro al incubar un RNA objetivo apropiado, preparado mediante transcripción in vitro y marcado de manera uniforme con UTP rad ioactivo, con el RNA de ribozima preparado por transcripción in vitro. El protocolo es descrito en detalle a continuación y se muestra el resultado para cada ribozima.

Preparación de RNA obietivo Los plásmidos usados para la síntesis de RNA objetivo se derivaron todos de los plásmidos conten iendo las secuencias virales amplificadas con PCR originales descritas en 1 . anterior. Los promotores T3 y T7 presentes en el vector BlueScript fueron usados para transcribir el filamento positivo o el negativo del fragmento clonado según sea apropiado. La transcripción ¡n vitro usando T3 RNA polimerasa o T7 RNA polimerasa de Promega o New England Biolabs se hizo siguiendo las instrucciones de los abastecedores (por ejemplo, en Promega Protocols and Application Guide (Protocolos de Promega y Gu ía de Aplicaciones) , disponible de Promega Company, Madison, Wisconsin, USA), en la presencia de a32P-UTP radioactivo. El plásmido de plantilla se linealízó con una enzima de restricción apropiada antes de la transcripción . El RNA objetivo fue cuantificado al medir la incorporación de radiomarca usando el ensayo de unión de filtro DE81 , como se describió en Promega Protocols. El RNA objetivo fue almacenado como un precipitado bajo etanol a -20°C y se resuspendió en agua entre 0.01 y 0. 1 pmol/µl cuando fue necesario. La actividad específica estuvo usualmente entre 20,000 y 200, 000 cpm/pmol .

Preparación de RNA de ribozima Los plásm idos descritos antes en las secciones 3, 4, 5, 6 y 7, hechos de las diversas secuencias de poliribozima clonadas en BlueScript, se usaron como plantillas para reacciones de transcripción in vitro como se describió antes, pero usando solamente nucleótidos no radioactivos. Se hizo una reacción piloto con una pequeña cantidad de trazador por separado para cuantificar el RNA sintetizado, usando el ensayo de unión de filtro DE81 . El RNA de ribozima fue almacenado como un precipitado bajo etanol a -20°C y se resuspendió en agua entre 0.1 y 1 pmol/µl cuando fue necesario.

Reacción de ribozima El RNA objetivo y el RNA de ribozima se mezclaron en amortiguador de T7 RNA polimerasa (de New Englands Biolabs) y se incubó a varias temperaturas (22°C, 37°C o 50°C) . La reacción estándar fue en 4 µl y conten ía 0.005 a 0. 1 pmol de objetivo, y entre 1 y 1 0 veces de exceso molar de ribozima. La reacción se paró al adicionar un volumen igual de amortiguador cargando paro (Formamida conteniendo 1 0mM EDTA y 1 mg/ml de cada uno de xileno cíanol y azul bromofenol) a la reacción y congelar la muestra a -20°C hasta que todas las m uestras estuvieron listas. Las reacciones se hicieron hervir entonces durante 30 segundos, se colocaron en hielo, y se cargaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante en amortiguador TBE con urea 7M . La concentración de poliacrilam ida estuvo entre 7 y 6% dependiendo de la longitud esperada de los productos. El gel fue transferido a un papel Whatmann 3MM , se secó y se expuso a una pantalla Phosphorl mager. Se obtuvo un auto-radiograma del gel mediante rastreo de la pantalla usando un Phosphorl mager.

Ribozima de brazo largo contra el filamento negativo de WMV2 Los ensayos in vitro de ribozimas de brazo largo probaron ser difíci les debido a que el objetivo y las ribozimas no se disocian fácilmente antes de cargarse y/o reasociarse en el gel . Por lo tanto, los datos son de pobre calidad y difíciles de interpretar. La ribozima usada se obtuvo de pBPL4734 (descrito en 3. anterior) .

El objetivo conten ía 1 898 bases de secuencia viral, complementarias a la secuencia de la base 21 68 (sitio Xhol) a la base 270 (sitio EcoRI) de WMV2 Mar6, con alguna secuencia del pol ienlazador de BlueScript KS + (entre el promotor T3 y el sitio Xhol). La Figura 1 0 muestra el resultado de un ensayo. Hubo un exceso de 4 veces de ribozima y la reacción se hizo a 50°C durante 30, 60 y 90 min. Los productos claramente identificables incluyen los fragmentos generados al cortar los cuatro sitios (mostrados por flechas en el gel) . Sin embargo, parece que los sitios 996 y 1 747 fueron cortados preferencialmente.

Ribozima de brazo largo contra el filamento positivo de WMV2 La ribozima usada se obtuvo de pBPL4736 (descrito en 4. anterior). El objetivo conten ía 807 bases de secuencia viral , entre la base 21 63 (sitio Xhol) y la base 2970 (inicio del apéndice poIyA), con el apéndice poIyA y la secuencia de políenlazador de BlueScript KS+ (entre el promotor T7 y el sitio EcoRI) . La Figura 1 1 muestra el resultado de un ensayo. La incubación del objetivo con 4 veces de exceso de ribozima a tres diferentes temperaturas, mostró q ue el sitio 2259 no estaba cortado como se esperada debido a la mutación en esa ribozima (ver 4. anterior). El sitio 2720 fue el cortador más rápido y dio productos a 22°C. El sitio 2403 fue el sigu iente y el sitio 2520 parece ser el más lento. Cuando se probó la ribozima del plásm ido pBPL4739, se vio evidencia de corte en el sitio 2259 (datos no mostrados) Ribozima de brazo corto contra el filamento negativo de WMV2 La ribozima usada se obtuvo de pBPL4741 (descrito en 5. anterior) .

El objetivo conten ía 1 880 bases de secuencia viral complementaria a la secuencia entre la base 2278 (sitio Clal) y la base 398 (sitio Spel), con la secuencia de polienzador en 5' de BlueScript KS+ (entre el promotor T3 y el sitio Cla l) . La Fig ura 1 2 muestra el resultado de un ensayo. Los cuatro sitios son cortados a alta temperatura. A 22°C, todos los sitios excepto 696 son cortados, pero el corte es muy lento como se demuestra por la escasa abundancia de productos doblemente cortados.

Ribozima de brazo corto contra el filamento positivo de WMV2 La ribozima usada se obtuvo de pBPL4742 (descrito en 5. anterior) . El objetivo fue el mismo que como se describió antes para la ribozima de brazo largo. La Figura 1 3 muestra el resu ltado de u n ensayo. Note que el exceso molar de ribozima sobre el substrato fue 4.5 (+) , 9 ( ++) y 13.5 (+ ++) . Los cuatro sitios fueron cortados a 50°C; con cuatro veces de exceso de ribozima, el corte está esencialmente completo después de 1 .0 a 1 .5 hora. A 22°C, solo se cortaron los sitios 2259 y 2403, siendo la ribozima 2259 la cortadora más rápida.

Ribozima de brazo corto contra ZYMV: primera combinación (pBPL4746 y PBPL4747) Las 2 poliribozimas mostraron algo de actividad de corte a 50°C, pero muy poca a 37°C y ninguna detectable a 22°C. A 50°C, para el filamento negativo, todos los sitios fueron cortados, los sitios 2442, 1 743 y 1245 fueron cortados mejor que 2564 y 1 929. Para el filamento positivo, todos los sitios fueron cortados; los sitios 1 1 0, 2590 y 2255 fueron cortados más rápido que 2455 y 21 61 .

Ribozima de brazo corto contra ZYMV: segunda combinación (pBPL4750) La poliríbozíma mostró actividad de corte en el filamento positivo en los 4 sitios predichos solamente a 50°C. No se detectó actividad a 22°C. Sin embargo, la misma poliribozima mostró buena actividad de corte en el único sitio presente en el filamento negativo (sitio 2354) tanto a 50°C como 22 °C.

La Figura 14 muestra el resultado de un ensayo de esta ribozima en el objetivo de filamento negativo. El objetivo contenía 1058 bases de secuencia viral , complementaria a la secuencia entre la base 2633 (sitio Spel ) y la base 1 575 (sitio Xbal) como se muestra en la figura 6, con 39 bases adicionadas en 5' (secuencia de polienlazador entre el promotor T3 y el sitio Xbal de BlueScript SK+) y 1 1 bases adicionadas en 3' (secuencia de polienlazador entre el sitio Xbal y el BamH l de SK+; Bam H l se usó para linealizar el plasmido antes de la transcripción in vitro) . Para este experimento, la ribozima marcada de la reacción piloto usada para cuantificar, se mezcó con la ribozima sin marcar. La posición de la banda de ribozima en el gel se muestra mediante una flecha. La ribozima se usó a un exceso molar de 5 veces sobre el substrato.

Ribozima de brazo corto contra ZYMV: tercera combinación (pBPL4751 ) La ribozima de pBPL4751 (sitios objetivo 2009 y 2027 en el filamento negativo) se ensayó en el mismo objetivo que la ribozima de pBPL4750. La Figura 14 muestra el resultado de este ensayo. Ambos sitios fueron cortados de manera eficiente tanto a 22°C como 50°C. La presencia de dos bandas de igual intensidad para los productos 5' - 2 y 5' - 3 (ver la figura 14) sugieren que el sitio 2009 es cortado más fácilmente o más rápidamente que 2027: aproximadamente 50% de los productos cortados, son cortados solamente en 2009. 9. Determ inación de la resistencia en plantas transgénicas 9.1 Transformación genética de melón El método usado es descrito en las siguientes solicitudes de patente: solicitud francesa no. 891 0848 de 1 1 /08/89, solicitud europea no. 904022829 de 09/08/90 y patente estadoun idense no. 5,422,259 de 06/06/95. Las plantas genéticamente transformadas regeneradas, verificadas por am plificación de PCR por la presencia del gene nptl l , se transfirieron en macetas conten iendo una mezcla de composta y arena gruesa (2. 1 ) y se colocaron en cultivo en un invernadero. Durante los primeros siete días, las plantas son protegidas por una cubierta de plástico con el fin de mantener una atmósfera húmeda. Las plantas son regadas diariamente. Se induce el floreado en las plantas, seguido por auto-fertilización . Las sem illas (generación T1 ) son recolectadas. 9.2 I noculación artificial de WMV2 y ZYMV en melón para detectar plantas resistentes Cepas de virus: La cepa de WMV2 usada es llamada "MAR" . Se usan dos cepas de QYMV patotipo 0: - una llamada " 1 3-1 8" (patotipo F) es una cepa de marchitam iento debido a los síntomas inducidos en cultivos susceptibles, los cuales portan el gene Fn (Flaccida necrosis) (Lecocq y Pitrar, 1984) . - una llamada "E 1 5" (patotipo N F) induce los síntomas de aclarado de vena para todos los cultivos susceptibles (Lecocq y Pitrar, 1984) independientemente de la presencia o no del gene Fn .

Almacenam iento de virus: Las hojas que muestran síntomas (aclarado de vena) son cortados de manera delgada con una navaja para rasurar y se colocan en cajas con cloruro de calcio para secarlas. Las cajas son almacenadas a 6°C durante un máximo de un año (Bos, 1 969).

Multiplicación de virus: Las plantitas de melón de una variedad susceptible en la etapa de dos hojas son inoculadas al frotar dos cotiledones con la solución de virus (Marrov, 1 967) .

Solución de virus: Un gramo de hojas mostrando los síntomas o un gramo de virus almacenado es molido en 4 ml de amortiguador de extracción ( 1 .075 g de fosfato ácido disódico, adicionado con 0.2 g de dietilditiocarbamato de sodio para 1 00 ml de agua destilada) adicionados con carbón activado (0. 1 g) y carborundo (0.0875 g) (Marrov, 1 967). Esta solución de virus tiene que ser mantenida a temperatura fría.

I noculación de virus: Se siem bran cuarenta y seis a cuarenta y ocho sem illas (progenie T-, ) per caso de transformación genética en macetas de 10 cm cuadrados rellenas con tierra para macetas. La temperatura es mantenida de 1 8 a 25°C con un fotoperiodo de 12 horas. La Inoculación mecánica en las plantitas de melón es realizada en la primera etapa de hoja (aproximadamente 1 5 d ías después de la siem bra) (Marrov, 1 967). Las plantitas son inocu ladas en la misma manera como para la multiplicación de virus.

Observación de los síntomas: Los síntomas son registrados entre 2 y 4 semanas después de la inoculación. Para WMV2: - planta susceptible: bandas de vena - planta tolerante: banda de vena ligera o los síntomas aparecen tarde - planta resistente: sin síntomas Para ZYMV: - planta susceptible (ausencia del gene Fn) : aclarado de vena con las cepas E 1 5 o 1 3-1 8. - planta susceptible (presencia del gene Fn): aclarado de vena con la cepa E 1 5 y reacción de marchitamiento con la cepa 13-1 8. - planta resistente: sin síntomas ya sea con la cepa E 1 5 o 1 3-1 8.

En algunos casos, las plantas de control no muestran síntomas de ataque de virus debido a la mala inoculación de los cotiledones. El com portamiento de estas plantas de control permite la determinación del valor de la prueba de patolog ía. Plantas de "escape" son consideradas como que han escapado de una inocu lación de virus "correcta". 9.3 Resistencia de plantas transformadas a WMV2 y ZYMV Se demuestra que las plantas transformadas son resistencies a WMV2 y a ZYMV.

A. Resistencia a WMV2 de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL3754 Con ei constructo pBPL3754, se analizaron ocho casos de transformación genética por com portamiento de resistencia a WMV2 (ver tabla 1 ). Para seis casos de transformación genética se observó resistencia a WMV2. La proporción de segregación (susceptible: resistente) fue 3: 1 , como se esperaba para un sitio simple siendo introducido.

B. Resistencia a WMV2 de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL38010 Con el constructo pBPL3801 0, se analizaron quince casos de transformación genética para el comportam iento de resistencia a WMV2 (ver tabla 2) . Para doce casos de transformación genética , se observóresistencia a WMV2. La proporción de segregación (susceptible: resistente) fue 3. 1 para nueve casos de transformación genética. Para un caso de transformación genética, la proporción de segregación (susceptible: resistente) fue 1 :3.

C. Resistencia a WMV2 de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL381 7 Con el constructo pBPL381 7, se analizaron veintiún casos de transformación genética para el comportam iento de resistencia a WMV2 (ver tabla 3). Para catorce casos de transformación genética, la proporción de segregación (susceptible:resistente) fue 1 .3 y para tres casos de transformación genética , la proporción de segregación (susceptible: resistente) fue 3: 1 .

D. Resistencia a ZYMV de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL3906 Con el constructo pBPL3906, se analizaron trece casos de transformación genética para el comportamiento de resistencia a ZYMV (ver tabla 4). Con la cepa 1 3. 1 8, se probó la progenie de diez plantas transformadas genéticamente. Cuatro casos de transformación genética mostraron una segregación de resistencia con una proporción (susceptible:resistente) de 3. 1 . Con la cepa E 1 5, toda la progenie probada de n ueve casos de transformación genética fue susceptible.

E. Resistencia a ZYMV de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL4186 Con el constructo pBPL41 86, se analizaron cinco casos de transformación genética para el comportamiento de resistencia a ZYMV (ver tabia 5).

Un caso de transformación genética de los cinco probados mostró una resistencia a la segregación (proporción susceptible. resistente de 3. 1 ) cuando se probó con la cepa 1 3. 1 8. Con la cepa E 1 5, la progenie de los tres casos de transformación genética independiente probaron ser susceptibles.

F. Resistencia a ZYMV de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL4194 Con el constructo pBPL4194, se analizaron ocho casos de transformación genética para el comportamiento de resistencia a ZYMV (ver tabla 6) . Con la cepa 1 3.1 8, la progenie de cuatro casos de transformación genética de los siete probados, mostró una segregación a resistencia con una proporción (susceptible: resistente) de 3: 1 . Con la cepa E 1 5, la progenie de los seis casos de transformación genética probó ser susceptible.

G. Resistencia a ZYMV de plantas de melón transformadas genéticamente con pBPL4771 Con el constructo pBPL4771 , se analizaron seis casos de transformación genética para comportamiento de resistencia a ZYMV (ver tabla 7). Con la cepa 1 3.1 8, se estudiaron dos casos de transformación genética. La progenie de un caso de transformación genética mostró una proporción de segregación (susceptible: resistente) de 3: 1 y la otra una proporción de 1 :3. Con la cepa E 15, la progenie de dos casos de transformación genética de los seis probados, mostró una segregación de resistencia con una proporción (susceptible: resistente) de 1 : 3.

Ejemplo 10 - Resistencia a WMV2 en el campo Se han realizado pruebas de cam po de melón genéticamente transformado para resistencia de virus. 1 0. 1 - Temporada no. 1 : Este ensayo concirnió al caso de transformación genética W38 (inserción de poliribozima de pBPL3817 en una línea de melón llamada RZ33) . El análisis molecular de su DNA genómico mostró una integración de sitio simple del T-DNA. Se hicieron crecer doce variedades: - variedad 1 : generación T1 del caso W38 - variedad 2: generación de T2 del caso W38 - variedad 3: progenie obtenida de la cruza entre la generación T2 del caso W38 y la línea sin transformar RZ33 variedad 4 a 1 1 : h íbridos F 1 realizados con W38 (generación T3) y otras l íneas padre variedad 12: línea sin transformar, RZ33 Hubo 3 pruebas para cada variedad y para cada prueba se cultivaron 9 plantas. Las plantas se hicieron crecer de acuerdo con la práctica agronómica normal y se registraron tres veces por temporada por síntomas de virus. Las observaciones de síntomas se notaron 0 a 9 como sigue: 0: sin síntoma de virus, - 5: síntomas de virus severos, 9: la planta está casi muerta, cubierta por síntomas de virus.

Algunas muestras de hoja son tomadas para análisis ELI SA. Los datos de observación y valores ELISA son expuestos en la Tabla 9 más adelante. Las plantas padre no transgénicas y plantas de control fueron atacadas duramente por WMV2, mostrando que la presión de infección fue alta ese año en esta área. Se observaron síntomas de mosaico foliar normales en el material no transformado. En contraste, al final de la temporada, todas las plantas transgénicas (variedades 1 a 1 1 ) habían permanecido inm unes a WMV2. Esto puede verse mediante comparación de la densidad óptica para la planta bajo prueba con aquéllas de control seguro X2 y control inoculado.

Leyenda de la Tabla 9: Control seguro: planta no transformada, no inoculada . Control inoculado: planta no transformada , inoculada. % de infección viral: presión de infección natural para el virus indicado. ???: i nd ica error de muestreado. "-": indica densidad óptica por debajo de aquélla del control seguro. Espacio en blanco: indica que no se tomó muestra. 1 0.2 - Temporada no. 2: Los resu ltados obtenidos de la prueba de cam po en la temporada no. 2 se exponen a continuación. Esta prueba concirnió el caso de transformación genética W38 (inserción de pol iribozima de pBPL381 7 en una línea de melón llamada RZ33) . Se hicieron crecer seis variedades: - variedad 1 : línea sin transformar, RZ33 - variedad 2 : generación T2 del caso W38 - variedad 3: generación T3 del caso W38 - variedad 4: generación T4 del caso W38 variedad 5: híbrido F1 realizado con W38 (generación T4) - variedad 6: h íbrido F 1 de control realizado con RZ33 Hubo tres pruebas para cada variedad y para cada prueba, se cultivaron 8 plantas. Las plantas se hicieron crecer de acuerdo con la práctica agronómica normal y se reg istraron cinco veces por temporada por síntomas de virus. Las observaciones de síntomas se anotaron 0 a 9 como sigue: 0: sin síntomas de virus - 5: s íntomas de virus severos 9: la planta está casi muerta, cubierta por síntomas de virus Algunas muestras de hojas se tomaron para análisis ELI SA. Los datos de observación y valores de ELISA se presentan en la Tabla 1 0 más adelante. Las plantas padre no transgénicas y plantas de control fueron atacadas duramente por WMV2 y CMV, mostrado que la presión de infección fue alta ese año en esta área. La Figura 21 muestra la epidemiolog ía viral en la prueba de campo de temporada no. 2, para WMV2 , CMV, ZYMV y PRSV. La presión de infección para WMV2 fue alta durante la temporada no. 2 (ver Tabla 1 0 "% de infección viral") . Los síntomas de mosaico foliar normales fueron observados en el material no transformado. El desarrollo de síntomas de virus se expandió al fruto como "verrugas" verdes levantadas, y por lo tanto, serían considerados no comerciales. La identidad del virus fue verificado por ELISA. En contraste, al final de la temporada, todas las plantas transgénicas (variedades 2 a 5) habían permanecido inmunes a WMV2. Los frutos transgénicos fueron seguros y de alta calidad.

Leyenda de la Tabla 10 Ver la leyenda de la Tabla 9.

Tabla 1 . Resultados de la prueba de resistencia contra WMV2 en la progenie Ti de plantas genéticamente transformadas con pBPL3754 Nombre Número Número de Número de Número Número de Determinación de la de la de plantas plantas no plantas de plantas plantas resistencia más probable planta T0 Tj registrables suceptibles tolerables resistentes probadas 2.1 46 44 0 Escape? 4.4 45 33 6 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 4. 1 0 43 21 14 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente 00 en la condición homóciga J 4. 1 2 24 1 6 4 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 8.1 47 36 1 1 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 93.16 45 5 37 1 2 Escape? 93.42 45 1 34 4 6 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 93.47 26 1 9 5 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Tabla 2. Resultados de la prueba de resistencia contra WMV2 en la progenie Ti de plantas genéticamente transformadas con pBPL38010 Nombre de Número de Numero de Número de Número de Número de Determinación de la resistencia más probable la planta T0 plantas Ti plantas no plantas plantas plantas probadas registrables suceptibles tolerables resistentes 432 45 0 43 2 571 45 1 43 1 / 715 33 0 14 0 19 Inserción en un sitio ? 717 23 1 17 0 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 7317 46 0 46 0 / 7320 20 0 16 0 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 809 37 28 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 869 46 11 16 5 14 Inserción en un sitio ? 8621 46 0 34 0 12 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 8624 12 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga (problema de germinación) 8639 13 0 5 2 Inserción en un sitio "> de un gene resistente (problema de germinación) 8643 45 0 19 13 13 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 9225 44 1 17 17 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 9231 46 1 18 10 17 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga9 9286 17 1 5 2 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga Tabla 3. Resultados de la prueba de resistencia contra WMV2 en la progenie T-¡ de plantas genéticamente transformadas con pBPL3817 Nombre Número de Número de Número de Número de Número de Determinación de la resistencia de la plantas Tj plantas no plantas plantas plantas más probable planta T0 probadas registrables suceptibles tolerables resistentes 301 7 0 Apariencia de una planta haploide 382 46 46 Inserción de múltiples sitios 442 18 5 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga (problema de germinación) 461 46 35 Inserción de 2 sitios de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 462 46 0 45 1 ¿escape? / 463 44 2 9 29 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 48 1 46 33 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 723 46 10 11 25 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 726 27 24 Inserción en 1 o 2 sitios de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 727 36 27 Inserción en 1 o 2 sitios de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 74 11 5 Problema de germinación (Tabla 3 - continuación) Resultados de la prueba de resistencia contra WMV2 en la progenie T^ de plantas genéticamente transformadas con pBPL3817 Nombre Número de Número de Número de Número de Número de Determinación de la resistencia de la plantas Ti plantas no plantas plantas plantas más probable planta T0 probadas registrables suceptibles tolerables resistentes 771 41 0 10 7 24 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 773 44 34 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 774 31 29 Inserción en 2 sitios de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga 775 44 37 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heterociga 779 39 18 15 Inserción en 1 sitio de un gene o de resistencia eficiente en la condición homóciga 77 11 37 24 6 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 852 41 17 20 9? 879 46 35 10 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga 87 13 40 18 17 Inserción en 1 y 2 sitios de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga? 87 15 11 Inserción en 1 sitio de un gene resitente Tabla 4. Resultados de la prueba de resistencia contra ZYMV (cepas 13.18 FN y E15) en la progenie Ti de plantas genéticamente transformadas con pBPL3906 Nombre de la Número de Número de "Reacción FN" Número de Determinación de la resistencia planta T0 plantas A plantas no o planta s plantas más probable probadas regtstrables suceptibl es resistentes Cepa 13 18, FN Z63 37 0 37 0 / Z64 43 0 43 0 / Z65 33 0 33 0 / Z66 18 0 18 0 / Z67 15 0 15 0 / Z11 41 38 0 34 4 Escape? Z11 42 23 0 16 7 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z19 12 30 0 20 10 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z1920 10 0 8 2 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z1921 19 11 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Cepa E15 Z63 36 0 36 0 Z64 45 o 45 0 Z65 17 o 17 0 Z66 8 o 8 0 Z67 10 o 10 0 Z194 8 o 5 0 Z1920 11 o 11 0 Z1923 22 o 12 1 Z20 1 23 12 9 2 Tabla 5. Resultados de la prueba de resistencia contra ZYMV (cepas 13.18, FN y E15) en la progenie Ti de plantas genéticamente transformadas con pBPL4186 Nombre de Número de Número de "Reacción FN" Número de Determinación de la resistencia la planta T0 plantas Tj plantas no o plantas plantas más probable probadas registrables suceptibles resistentes Cepa 13.18, FN I Z4.1 40 4 36 0 Z5.1 38 0 38 0 Z5.2 27 16 11 0 Z12.7 40 0 32 8 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la yo condición homóciga Z12.8 28 11 17 Problema de inoculación Cepa E15 Z4.1 46 0 46 0 Z5.1 34 0 34 0 Z12.8 19 0 19 0 Tabla 6. Resu Itados d e la prueba de res istencia contra ZYMV (cepas 1 3.18, FN y E15) en la progen ie Ti de plantas genél icamente trans formadas con pBPL41 94 Noml bre de Número de Número de "Reacción Número de 1 Determinación de la res istencia más la ple mta T0 plantas Ti plantas no FN" o plantas plantas prob able probad as registrables suceptibles resistentes Cepa 1 3. 1 8, FN Z1 .9 36 0 36 Z2.5 41 o 41 / Z2.6 44 o 40 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z2.7 47 4 43 0 / Z2.23 46 0 40 6 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z18.6 45 29 16 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z22.9 20 1 5 I nserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Cepa E 1 540 Z1 .9 40 0 40 0 Z2.5 41 0 41 0 Z2.6 9 0 9 0 Z2.7 38 0 38 0 Z22.9 19 0 19 0 Z22. 1 3 1 2 8 4 0 Tabla 7. Resultados de la prueba de resistencia contra ZYMV (cepas 13.18, FN y E15) en la progenie Ti de plantas genéticamente transformadas con pBPL4771 Nombre de Número de Número de "Reacción Número de Determinación de la resistencia la planta T0 plantas Ti plantas no FN" o plantas plantas más probable probadas registrables suceptibles resistentes Cepa 13.18, FN Z23.15 28 15 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición homóciga Z28.3 43 20 20 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga Cepa E156 Z23.15 39 20 13 Inserción en 1 sitio de un gene de J-. resistencia eficiente en la condición homóciga Z23.22 36 25 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga Z25.1 12 1 10 1 / Z25.14 11 6 3 2 / Z28.3 40 11 5 24 Inserción en 1 sitio de un gene de resistencia eficiente en la condición heteróciga Z31.2 22 18 / TABLA 10 Datos de observación y valores de ELIS de laprueba de campo de melón transformado (temporada no. 2) (pBPL 3817) M3 Ln Las muestras con densidad óptica mayor que el valor del control de segu ridad X2 fueron consideradas positivas m uestras consideradas como negativas pe punto clorótico NJ no se puodo juzgar Plt planta SD Os TABLA 9 Datos de observación y valores de ELISA de la prueba de campo de melón transformado (temporada no. 1) (pBPL 3817) 1 1 . Ensayo transiente de actividad de genes de ribozima anti-viral 1 1 .1 Descripción del sistema El sistema de ensayo transiente para la actividad in vivo de ribozima o genes antisentido se describió por Sawyer y Birch ( 1 996). Un gene reportador objetivo y el gene de ribozima a ser probado se clonaron en dos plásm idos separados y se co-introdujeron en células de cultivo de suspensión de N icotiana mediante bombardeo de partículas. El gene reportador objetivo es una fusión en marco entre la secuencia objetivo y la secuencia LUC. Esta fusión en marco codifica una proteína quimérica con actividad de luciferasa. 48 horas después de la entrega de plásmidos, las células son colocadas bajo una cámara, la cual mide la em isión de luz; la em isión de luz representa el nivel de expresión del gene reportador objetivo. El gene de ribozima probado expresa de manera transiente una ribozima, la cual interactúa con la secuencia objetivo y disminuye la cantidad del m RNA objetivo-LUC quimérico, el cual es detectado como una actividad de luciferasa reducida. Para medir la actividad de varios genes de ribozima que protegen las plantas de melón transgénicas contra infección de poytivirus, hemos construido varios genes reportadores objetivo con secuencias virales fusionadas a LUC. 11 .2 Genes usados (ver la figura 15) Sitios objetivo en el filamento positivo del virus WMV2 (PBPL01 88) : Un fragmento de 540 bases conteniendo cuatro sitios enfocados por la pol iribozima (2259, 2403, 2520, 2729) se amplificó por PCR y se clonó en marco en frente de LUC, bajo control de una versión modificada del promotor 35S , usando el plásmido pGLFuz (ver la fig ura 1 7) como se describió por Sawyer y Birch ( 1 996) . Debido a que la mayoría del sitio 3' está ubicado cerca del codón de paro, también fue necesario cambiar una base de la secuencia viral para remover este codón de paro y proporciona una secuencia flanqueadora para este sitio.

Sitios objetivo en el filamento negativo del virus WMV2 (pBPL01 84 a 01 87): Debido a que el filamento negativo no está codificando, fue imposible clonar una secuencia grande conteniendo varios sitios de ribozima en marco con LUC. Se amplificaron cuatro secuencias más cortas (entre 1 80 y 220 bases en longitud) , conteniendo cada una un sitio de ribozíma (696, 996, 1 747, 2067) por PCR y se clonaron en marco en frente de LUC, bajo control de la versión modificada del promotor 35S en pGLFuz como antes.

Gene de ribozima contra WMV2 (pBP0189) : La poliribozima de brazo corto enfocando cuatro sitios del filamento positivo (2259, 2403, 2520 y 2720) y cuatro sitios del negativo (696, 996, 1 747 y 2067) de WMV2 de pBPL4743 se clonó bajo el control de la versión modificada del promotor 35S en pGLFuz.

Gene de ribozima contra ZYMV (pBPL0190) : Un sitio en el filamento negativo (de aquí en adelante referido como 1747) del virus está presente en ambos WMV2 y ZYMV. La ribozima pentamérica contra el filamento negativo de ZYMV en pBPL4747 está enfocando el sitio 1 747 entre otros. En esta secuencia, la ribozima contra el sitio 1747 es idéntica a la ribozima presente en el constructo contra WMV2, pero los brazos son más cortos: 8 bases de cada lado. La ribozima pentamérica se clonó bajo control de la versión modificada del prpmotor 35S en pGLFuz. 1 1 .3 Ensayo y resultados (ver figura 16) Los ensayos fueron realizados como se describió por Sawyer y Birch ( 1 996) . Para cada ensayo, DNA de plásmido de ribozima y objetivo (2µg de cada uno, aprox. 25% de exceso molar de ribozima) se co-precipitaron sobre partícu las de tungsteno y se dispararon sobre células de Nicotiana plumag nifolia en discos de papel filtro (recolectados de cultivo de suspensión) . Después del bombardeo, las células se cultivaron en los discos durante 48 horas a 28°C en la obscuridad . Para el ensayo de luciferasa, las células fueron colocadas en una caja petri conteniendo D-luciferina durante 30 minutos, entonces se formaron imágenes usando una cámara CCD enfriada de nitrógeno líquido y programa de cómputo AT1 (Wrig ht I nstruments Ltd , Enfield , UK) . Los resultados son mostrados en la figura 16. La poliribozima WMV2 (pBPL01 89) podría inhibir el objetivo conteniendo los cuatro sitios en el filamento positivo (pBPL01 88) hasta un grado (70%) no visto en usos previos del sistema con antisentído de longitud completa cuando se usó una cantidad igual de gene inhibidor y objetivo (Sawyer y Birch , 1 996). Ambas ribozimas (pBPL01 89 y pBPL01 90) podrían inhibir el objetivo conteniendo el sitio 1 747 (pBPL 1 086) a un grado aún mayor (75%). El sitio 696 (pBPL01 86) pareció ser receptivo de inhibición ; esta ausencia de efecto en un objetivo muestra que el efecto observado simplemente no es provocado por una interacción entre los 2 plásmidos o su promotor. Los sitios 996 (pBPL01 85) y 2067 (pBPL01 87) se i nh ibieron ligeramente. 1 1 .4 Comparación con datos in vitros obtenidos previamente Objetivo de filamento negativo (ver la figura 1 2) : El sitio 696 fue el sitio menos cortado in vitro por la ri bozima WMV2, y no se cortó en absol uto a 22°C. Esto está en acuerdo con los resultados de ensayo transiente. Los sitios 1747 y 996 parecieron ig ualmente cortados in vitro y 2067 fue el sitio más receptivo para corte in vitro, particularmente a 22°C. Esto no es completamente consistente con los resultados de ensayo transiente sugiriendo que 1 747 es claramente más receptivo a corte que los otros 2. La comparación de los resultados in vitro e in vivo transientes, sugiere que la actividad in vitro no es un pronosticador perfecto de la actividad transiente in vivo (incapaz de los sitios de rango 996, 1 747, 2067) , pero tiene alg una capacidad pred ictiva (podría prededir q ue 696 no sería un buen objetivo). Objetivo de filamento pos itivo (ver fig ura 1 3) : Cuando la ribozima fue probada in vitro en un objetivo de aproximadamente 900 bases, el sitio 2259 fue cortado un tanto a 22°C y 37°C (con 4.5 - 1 3 veces de exceso de ribozima) y a un menor grado el sitio 2403; el corte estuvo lejos de ser com pleto. A 50°C los cuatro sitios fueron cortados, siendo aparentemente más rápido 2259 y luego 2403. El ensayo in vivo transiente muestra q ue esta ríbozima está activa, a pesar del bajo nivel de actividad observada in vitro a baja temperatura. Ribozima ZYMV: Cuando la ribozima ZYMV fue valorada in vitro en un objetivo ZYMV, el sitio 1 747 no fue cortado a 22°C. Este resu ltado no puede ser comparado directamente con el ensayo in vitro en WMV2, debido a que la secuencia objetivo es significativamente diferente, excepto inmediatamente alrededor del sitio por sí mismo; sin embargo, sugiere que los brazos más cortos reducen la actividad in vitro. Los resultados del ensayo transiente sugieren que al menos para este sitio particular 1 747, la longitud del brazo puede ser reducida sin ningún efecto significativo en la actividad in vivo. Por lo tanto, la capacidad de predicción del ensayo in vitro para este sistema no es buena. 1 1 .5 Construcción de pGLFuz (ver Figura 17): Para crear un vector de fusión de traslación uidA: : luc (pGLFuz), se modificó primero el gene udiA mediante amplificación de PCR para introducir nuevos sitios Xhol y Nsil corriente arriba del codón de inicio, reem plazar el codón de paro con un codón de alanina (TGA -> GCG) e introducir un sitio Notl novedoso corriente debajo de este codón. El produto de PCR uidA modificado se ligó en pGemT (Promega). El plásmido recombinante apropiado se diseñó pGemGUS. El gene uidA modificado de pGemGUS se ligó en el vector pZorz como un fragmento Nsi l - Ncol . En el clon de plásm ido resultante, pGLFuzTAG, la región de codificación uidA es flanq ueada por un promotor osa y región de poliadenilación oes. Debido a la presencia de un codón de paro entre los genes uidA y luc, previniendo una fusión de traslación , el gene luc en pGLFuzTAG fue removido (mediante digestión con Notl , tratamiento con T4 DNA polimerasa para crear extremos romos, y entonces digestión con Xhol ) y se reemplazó por el gene luc de pS PN F + luc (Promega) (preparado por digestión con Kpn l , tratam iento con T4 DNA polimerasa y digestión con Xhol). El plásmido recombínante apropiado fue designado pGLFuz. Para construcción de genes objetivo, la secuencia de codificación uidA es reemplazada por secuencias virales. Para construcción de genes de ribozima, ambas secuencias de codificación uidA y luc son reemplazadas por las secuencias de ribozima (ver figura 1 5).

REFERENCIAS Betzner et al. , 1 997, The Plant Journal, vol. 1 1 , no. 3, p. 1 01 -1 09. Bos L (1 969). Experience with a collection of plant viruses in leaf material dried and stored over calcium chloride and a discussion of literature on virus preservation (Experiencia con una recolección de virus de plantas en material de hoja seco y almacenado sobre cloruro de calcio y una discusión de literatura en conservación de virus). Medec. Fac. Landbouwwet. Rijksuniv. Gent.34:875-887. Firek et al., 1993, A wound-induced promoter driving nptll expression limited to dedifferentiated cells at wound sites is sufficient to allow selection of transgenic shoots (Un promotor inducido por herida que conduce la expresión de nptll limitada a células dediferenciadas en sitios heridos es suficiente para permitir la selección de brotes transgénicos). Plant Mol. Biol., vol.22, p 129-142. Fromm M.E., Taylor L.P. y Walbot V., 1986. Nature, vol. 319, p.791. Guerineau F. y Mullineaux P., 1993, Capítulo 4 "Plant transformation and expression vectors" (Transformación de planta y vectores de expresión) en Plant Molecular Biology LABFAX, ed. Croy R.R.D., BIOS Scientific Publishers, Blackwell Scientifica Publications. Haseloff y Gerlach, 1988, Simple RNA enzymes with new and highly specific endoribonuclease activities (Enzimas de RNA simples con actividades de endoribonucleasa nuevas y altamente específicas). Nature, vol.334, p.585-591. Lecocq H y Pitrat M (1984). Strains of ZYMV in Muskmelon (C. meló L.) (Cepas de ZYMV en melón amarillo (C. meló L.). Phytopath. Z., 11:165-173 Marrov J (1967). Amélioration des méthodes de transmíssion mécanique des virus par absorption des inhibiteurs d'infection sur le charbon vegetal (Mejoramiento de métodos de transmisión mecánica de virus para absorción de inhibidores de infección sobre el carbón vegetal). C.R. Acad. Agrie. Fr.53:972-981 Pascual Pérez, Gérard Tiraby, Jean Kallerhoff y Joel Perret, 1989, Phleomycin resistance as a dominant selectable marker for planta cell transformation (Resistencia a fleomicina como un marcador seleccionable dominante para la transformación de células de plantas) . Plant Molecular Biology, vol. 1 3, p 365-373. Perriman et al, 1 992, Extended target-site specificity for a hammerhead ribozyme (Especificidad de sitio objetivo extendida para una ribozima de cabeza de martillo). Gene, vol. 1 1 3, p. 1 57-1 63. Sawyer B. y Birch R. , 1 996, A generic transient assay for antisense and ribozyme inhibition in vivo (U n ensayo transiente genérico para antisentido e inhibición de ribozima in vivo) , vol 28, 1 996, Proceedings of the Australian Society for Biochemistry and Molecular Biology.

LISTADO DE SECUENCIAS (1) INFORMACIÓN GENERAL: (i) SOLICITANTE: (A) NOMBRE: GENE SHEARS PTY LTD (B) CALLE: Suite 1, Building 5 - 105 Dehli Road (C) CIUDAD: NORTH RYDE (E) PAÍS: AUSTRALIA (F) CÓDIGO POSTAL (ZIP): NSW 2113 (ii) TITULO DE LA INVENCIÓN: RIBOZÍMAS CAPACES DE CONFERIR RESISTENCIA A INFECCIÓN CON POTYVIRUS Y PLANTAS QUE EXPRESAN DICHAS RIBOZÍMAS (iii) NUMERO DE SECUENCIAS: 109 (iv) FORMA LEGIBLE DE COMPUTADORA: (A) TIPO DE MEDIO: disco flexible (B) COMPUTADORA: IBM PC compatible (C) SISTEMA OPERADOR: PC-DOS/MS-DOS (D) PROGRAMA DE COMPUTO: Patente en liberación #1.0, Versión #1.30 (EPO) (v) DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL: NUMERO DE SOLICITUD: PCT/EP (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA SINTÉTICO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..21 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "ribozima mutante I" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1: CÜGAUGAGUC CUGAGGACGA A 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA SINTÉTICO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..23 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "ribozima mutante II" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2: CUGAUGAGUC CCGUGAGGAC GAA 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA SINTÉTICO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..21 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Ribozima mutante lll" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3: CUGAUGAGUC GUGAGGACGA A 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA SINTÉTICO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..20 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Ribozima mutante IV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4: CUGAUGAGCG GUGACGCGAA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA SINTÉTICO" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..22 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "sTobRV tipo natural" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5: CUGAUGAGUC CGUGAGGACG AA 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..21 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "poli-T-anchor" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6: GGGAGCTCGC TAGCGGATCC T (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..22 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "INICIADOR 1" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7: AATTGGGAGC TCGCTAGCGG AT 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..33 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "INICIADOR 2" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8: AATTGCTAGC AGTKGTKGAC AATACACTWA TGG (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..29 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Iniciador 3" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 9: AATTCTAGAA THAKATCATC ACCATTKGC 29 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..32 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Iniciador 4" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 10: AATTCTAGAT TCTGGAWACA TTGGATAWSN AC 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ696-3"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 11: GTGAGGACGA AAAAGCTGCT GTCGGTGCTC 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: m¡sc_feature (B) UBICACIÓN: 1..32 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ696-5"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 12: GGACTCATCA GATGTTCAGG GATCCATAAA TC 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..32 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ996-3"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 13: GTGAGGACGA AACTAAGTTT TATGGGGGTT GG 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ996-5"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 14: GGACTCATCA GATGCCAACT GTCCATGGAC 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..31 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ1747-3"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 15: GTGAGGACGA AACATAGCTG AGACAGCATT G 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 29 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..29 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ1747-5' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 16: GGAC CATCA GTGGAGCTTT TCCGGATGC . 29 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..33 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ2067-3"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 17: GTGAGGACGA AAAGAAAATG AACCTTCCAA CAG 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: m¡sc_feature (B) UBICACIÓN: 1..32 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ2067-5"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 18: GGACTCATCA GGTTATCTTT TGTAGTCGTG GG 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..23 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Ribozima mutante 696" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 19: CUGAUGAGUC CCGUGAGGAC GAA 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..21 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Ribozima mutante 996" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 20: CUGAUGAGUC CUGAGGACGA A 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: mísc_feature (B) UBICACIÓN: 1..31 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ2259-3"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 21: GTGAGGACGA AAAACCATTC ATAATCACAC CC 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..32 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ 2259-5'" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 22: GGACTCATCA GATGGTTTGG TGTATCGATA AC 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ2403-3"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 23: GTGAGGACGA AAAATGGTGC ATGATTTGTC 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 28 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ2403-5"' (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 24: GGACTCATCA GTCAGACGCA GCAGAAGC 28 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..31 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ 2520-3'" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 25: GTGAGGACGA AAAGTCAAAA GCATAGCGTG C 31 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 33 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..33 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ 2520-5'" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 26: GGACTCATCA GTATGAGGTT ACTTCCAAAA CAC 33 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ 2720-3'" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 27: GTGAGGACGA AACTGCGGTG GACCCATACC 30 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..32 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "RBZ 2720-5'" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 28: GGACTCATCA GAAGACTAGG TAAACTGGTC AC 32 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: m¡sc_feature (B) UBICACIÓN: 1..21 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "Ribozima mutante 2520" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 29: CUGAUGAGUC CUGAGGACGA A 21 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 21 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..21 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 30: CUGAUGAGUC GUGAGGACGA A (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 20 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "RNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..20 (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 31: CUGAUGAGCG GUGACGCGAA 20 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 59 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..59 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM2067S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 32: GCAGCTGCTG GATCCATGTC ATTTTCTTTT CGCGTCACCG CTCATCAGGT TATCTTTTG 59 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..41 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM1747S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 33: TCAGCTATGT TTCGCGTCAC CGCTCATCAG TGGAGCTTTT C 41 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 49 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..49 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM996S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 34: CAGATCTATA AAACTTAGTT TCGCGTCACC GCTCATCAGA TGCCAACTG 49 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..61 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM696S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 35: CAGCAGCTTT TTCGCGTCAC CGCTCATCAG ATGTTCAGGG ACCTGCATCT GATCAAGCTT 60 G 61 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..27 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMGU4S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 36: GAAACATAGC TGACAAAAGA TAACCTG (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 26 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..26 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMGU5S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 37: GTTTTATAGA TCTGGAAAAG CTCCAC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..24 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMGU6S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 38: GAAAAAGCTG CTGCAGTTGG CATC (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 55 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..55 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM2259S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 39: GCAGCTGCTG GATCCATGAA TGGTTTTTCG CGTCACCGCT CATCAGATGG TTTGG 55 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 42 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..42 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM2403S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 40: TGCACCATTT TTCGCGTCAC CGCTCATCAG TCAGACGCAG AT 42 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 41 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..41 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM2520S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 41 CTTTTGACTT TTCGCGTCAC CGCTCATCAG TATGAGGTTA C (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 61 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (íi) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..61 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WM2720S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 42: CACCGCAGTT TCGCGTCACC GCTCATCAGA AGACTAGGTA ACCTGCATCT GATCAAGCTT G (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..25 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMGU1S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 43: GAAAAATGGT GCACCAAACC ATCTG (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..27 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMGU2S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 44: CGAAAAGTCA AAAGATCTGC GTCTGAC 27 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 25 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..25 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMGU3S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 45: AAACTGCGGT GGTAACCTCA TACTG 25 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 22 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc eature (B) UBICACIÓN: 1..22 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMPC1S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 46: AATTGCAGCT GCTGGATCCA TG 22 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 23 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..23 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "WMPC2S" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 47: AATTCAAGCT TGATCAGATG CAG 23 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..51 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2A, WMV2 USA" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 48: GGG AAC AAC AGT GGG CAG CCA TCT ACA GTT GTT GAC AAT ACA CTT ATG 48 GLY ASN ASN SER GLY GLN PRO SER THR VAL VAL ASP ASN THR LEU MET 1 5 10 15 GTT Val 51 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 49: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 " 5 ' 10 15 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..51 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2A, ZYMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 50: GGT AAC AAC AGT GGG CAÁ CCC TCA ACA GTG GTG GAT AAC ACA CTA ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 GTT 51 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 51: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 ?o 15 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..51 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2A, VIRUS POX DE CIRUELA NAT" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 52: GGA AAC AAT AGT GGT CAÁ CCC TCG ACA GTT GTT GAC AAT ACA CTC ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 GTT 51 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 53: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..51 (D) OTRA INFOR ACION.7nota= "FIGURA 2A, TVMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 54: GGC AAC AAC AGT GGA CAG CCA TCT ACG GTT GTG GAC AAC ACA CTC ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 GTG 51 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 55: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..51 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2A, TEV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 56: GGC AAC AAT AGC GGG CAÁ CCT TCA ACA GTG GTG GAC AAC ACA CTC ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 GTC 51 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 57: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 51 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..51 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2A, PVY" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 58: GGT AAT AAT AGT GGT CAÁ CCT TCT ACC GTT GTG GAT AAT TCT CTC ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Ser Leu Met 1 5 10 15 GTT 51 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 17 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 59: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Ser Leu Met 1 5 10 15 Val (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..57 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2B, PRSV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 60: GGC AAT AAT AGT GGC CAA CCT TCG ACA GTT GTT GAT AAT ACA TTG ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 GTT TTA ATC 57 Val Leu lie (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 61: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 61: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 Val Leu lie (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 62: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..57 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2B, PSbMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 62: GGA AAT AAT AGT GGA CAA CCA TCA ACA GTT GTT GAT AAC ACA TTG ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 GTG ATT CTT 57 Val lie Leu (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 63: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 63: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 Val He Leu (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 64: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 57 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..57 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 2B, TuMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 64: GGA AAC AAT AGC GGA CAG CCA TCG ACT GTT GTA GAC AAC ACA CTC ATG 48 Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 . 5 . 10 15 GTC ATA TTG 57 Val He Leu (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 65: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 19 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 65: Gly Asn Asn Ser Gly Gln Pro Ser Thr Val Val Asp Asn Thr Leu Met 1 5 10 15 Val He Leu (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 66: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3A, WMV2 USA" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 66: TTC TTT GCC AAT GGT GAT GAT ATT ATC CTG Phe Phe Ala A=n Gly Asp Asp lie lie Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 67: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 67: Phe Phe Ala A=n Gly Asp Asp lie lie Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 68: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3A, ZYMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 68: TTC TTT GCA AAT GGA GAT GAT CTG ATA CTT 30 Phe Phe Ala Asn Gly Asp Asp Leu He Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 69: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 69: Phe Phe Ala Asn Gly Asp Asp Leu He Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 70: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3A, VIRUS POX DE CIRUELA NAT" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 70: TAC TTT -GTG AAT GGT GAT GAT CTT GTC CTC 30 Tyr Phe Val Asn Gly Asp Asp Leu Val Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 71: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 71: Tyr Phe Val Asn Gly Asp Asp Leu Val Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 72: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3A, TVMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 72: TTC TTT GCC AAT GGA GAT GAT CTT ATA ATT 30 Phe Phe Ala Asn Gly Asp Asp Leu He He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 73: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 73: Phe Phe Ala Asn Gly Asp Asp Leu He He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 74: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3A, TEV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 74: TAT TAC GTC AAT GGC GAT GAC CTA TTG ATT 30 Tyr Tyr Val Asn Gly Asp Asp Leu Leu He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 75: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 75: Tyr Tyr Val Asn Gly Asp Asp Leu Leu He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 76: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3B, PVY" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 76: TTC TTT GTT AAT GGT GAT GAC TTA TTG ATT 30 Phe Phe Val Asn Gly Asp Asp Leu Leu He 5 ?o (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 77: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 77: Phe Phe Val Asn Glv Asp Asp Leu Leu He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 78: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3B, PRSV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 78: TTT TAT ATC AAT GGT GAT GAT CTC TGT ATT 30 Phe Tyr He Asn Gly Asp Asp Leu Cys He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 79: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 79: Phe Tyr He Asn Gly Asp Asp Leu Cys He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 80: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 3B, PSbMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 80: TAT TTT GCA AAT GGT GAT GAT CTA TTG ATA 30 Tyr Phe Ala As Gly Asp Asp Leu Leu He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 81 (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 81: Tyr Phe Ala Asn Gly Asp Asp Leu Leu He 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 82: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: CDS (B) UBICACIÓN: 1..30 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIBURA 3B, TuMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 82: TTC TTC GTC AAC GGA GAC GAT TTA CTG CTA 30 Phe Phe Val Asn Gly Asp Asp Leu Leu Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 83: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 10 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 83: Phe Phe Val Asn Gly Asp Asp Leu Leu Leu 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 84: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: Proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4A, WMV2 USA" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 84: Gly Ser Phe Trp He His Trp He Thr Thr Gln Asp Gly Phe 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 85: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 85: TTCTGGATAC ATTGGATAAC GACT 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 86: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4A, Virus Pox de ciruela NAT" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 86: Ser His Phe Trp Lys His Trp lie Ser Thr Lys Asp Gly His 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 87: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 87: TTCTGGAAAC ACTGGATTAG TACG (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 88: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (íi) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4A, TVMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 88: Thr Ser Phe Trp Gln His Trp He Thr Thr Lys Asp Gly Gln 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 89: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 89: TTCTGGCAAC ACTGGATAAC AACA 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 90: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4A, TEV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 90: Gly He Phe Trp Lys His Trp He Gln Thr Lys Asp Gly Gln 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 91: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 91: TTCTGGAAGC ATTGGATTCA AACC 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 92: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4A, PVY" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 92: Ser Thr Phe Trp Lys His Trp He Glu Thr Asp Asn Gly His 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 93: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 24 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 93: TTCTGGAAGC ATTGGATTGA AACA 24 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 94: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4A, PRSV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 94: Gly Asp Phe Gly Cys His Trp He Ser Thr Asn Asp Gly Asp 1 5 ?o (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 95: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4B, PSbMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 95: Gly Lys Tyr Trp Lys His Trp He Thr Thr Lys Glu Gly His 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 96: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 14 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) FILAMENTO: desconocido (D) TOPOLOGÍA: desconocida (ií) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: proteína (B) UBICACIÓN: 1..14 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 4B, TuMV" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 96: Ser Gln Phe Trp Lys His Trp He Ser Thr Lys Asp Gly Gln 1 5 10 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 97: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2975 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..2975 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURAS 5(a) a 5 (d)" (xi) DESCRI PCIÓN DE SECUENCIA: SEQ I D NO: 97: GAATTCTAGA TTCTGGAAAC ATTGGATAAC CACTCAAGAT GGTTTTTGTG GGCTACCTCT 60 CGTGTCTGTC AATGATGGAT ATATTGTTGG TATACATGGA TTAACATCTA ATGATTCAGA 120 GAAGAATTTC TTTGTTCCAT TTACTGACGG ATTTGAAACG GAATACTTGA ACAATGCTGA 180 TAATCTGTCG TGGGACAAAC ACTGGTTTTG GGAACCAAGT AAGATCGCAT GGGGCTCTTT 240 GAATTTAGTA GAAGAACAGC CAAAGGAAGA ATTCAAGATA TCAAAACTCG TGTCTGATCT 300 TTTTGGCAAC ACGGTAGCAG TACAGAGTAG AAAAGAGAGA TGGGTTTTGG ATGCCATGGA 360 AGGGAATTTG ATAGCTTGTG GGCAAGCTGA TGGCGCACTA GTGACAAAGC ACGTGGTTAA 420 AGGAAAATGC CCTCATTTTG CACAATATCT TTCGTTACAT GATGAAGCAA AACAGTTCTT 480 TGAGCCATTG ATGGGGGCAT ACCAGCCAAG TCGGTTGAAT AAAGACGCTT TCAAGAAAGA 540 TTTCTTTAAG TACAACAAAC CGGTTGTTCT GAATGAAGTT GATTTTAATG CTTTCGAGAA 600 GGCAGTCGAG GGAGTGATAA CAATGATAGT CGACTTTGAA TTTGCAGAAT GCTTATTTGT 660 GACTGATCCT GATGAGATTT ATGGATCCCT GAACATGAAA GCTGCTGTCG GTGCTCAATA 720 CAAAGGAAAG AAACAGGATT ACTTTTCTGG CATGGATAGT TTTGATAAGG AGCGCCTGTT 780 GTACCTTAGC TGTGAGAGGC TTTTTAATGG AGAGAAAGGA ATTTGGAACG GTTCCTTGAA 840 AGCGGAGTTG AGGCCAATTG AAAAAGTGCA GGCAAACAAA ACTAGAACAT TTACAGCAGC 900 ACCGATTGAT ACATTGCTTG GAGCTAAAGT TTGCGTCGAT GATTTTAATA ATCAATTCTA 960 CAGCTTCAAC TTAAAATGTC CATGGACAGT TGGCATGACT AAGTTTTATG GGGGTTGGGA 1020 TAAGCTAATG AGGAGTTTGC CTGATGGCTG GACATATTGC CACGCAGACG GTTCACAGTT 1080 CGACAGTTCT TTGACTCCCT TATTGTTGAA TGCTGTCCTC AGTATTAGAT GTTGCTTCAT 1140 GGAAGATTGG TGGGTTGGAA AGGAAATGCT TGAAAACCTT TACGCTGAGA TAGTTTACAC 1200 ACCAATCTTA GCACCTGATG GCACAATTTT CAAAAAGTTT AGAGGGAATA ACAGTGGACA 1260 GCCATCTACA GTTGTTGACA ATACGCTTAT GGTTGTCATT GCTATGTATT ACTCGTGCTG 1320 TAAACAAGGT TGGTCAGAGG AGGATATTGA AGAAAGGTTG GTGTTCTTTG CTAATGGTGA 1380 TGATATTATC TTGGCAGTTA GGGATGAGGA TGTGTGGCTG TATGACACTC TAAGTGCTTC 1440 ATTCGCTGAG CTTGGCCTGA ATTATAACTT CGATGAGCGG ACAAAGAAAA GAGAGGAGCT 1500 ATGGTTCATG TCACACCAAG CCATGCTAGT TGATGGGATT TACATTCCAA AGCTTGAACC 1560 TGAAAGGATA GTTTCCATCT TAGAGTGGGA TAGGAGCAAG GAACTTACGC ATCGCACTGA 1620 GGCAATTTGT GCAGCCATGA TTGAGGCATG GGGACATACT GAGCTTTTGC AGGAAATTCG 1680 CAAATTTTAT TTGTGGCTTC TAAGCAAAGA TGAATTTAAG GAACTCGCTG CATCCGGAAA 1740 AGCTCCATAC ATAGCTGAGA CAGCATTGAG AAAGCTCTAC ACAGATGTTA ACACACAACC 1800 AAGTGAATTG CAAAAATACC TTGAAGTTTT GGATTTTAAC CACATTGATG GTTGCTGTGA 1860 ATCAGTGTCT CTGCAATCAG GAAAAGAAGC AGTAGAAAAT TTGGATGCAG GGAAGGACTC 1920 GAAGAAGGAC ACCAGTGGCA AAGGGGATAA GCCACAAAAT TCGCAAACTG GTCAAGGTAG 1980 CAAAGAACAG ACAAAAACTG GTACAGTCAG CAAAGATGTG AATGTTGGAT CGAAAGGAAA 2040 AGAAGTCCCA CGACTACAAA AGATAACAAA GAAAATGAAC CTTCCAACAG TTGGTGGGAA 2100 AATCATTCTT AGCTTAGACC ATTTACTCGA GTACAAACCT AATCAAGTTG ATCTGTTTAA 2160 CACTCGAGCA ACAAAAACAC AGTTTGAATC ATGGTACAGC GCAGTTAAAG TTGAATACGA 2220 TCTTAACGAT GAGCAAATGG GTGTGATTAT GAATGGTTTT ATGGTTTGGT GTATCGATAA 2280 CGGTACATCT CCAGATGTCA ATGGAGTTTG GGTGATGATG GATGGGGAAG AGCAAGTTGA 2340 GTATCCATTA AAGCCAATTG TTGAAAATGC GAAACCAACT TTAAGACAAA TCATGCACCA 2400 TTTCTCAGAC GCAGCAGAAG CATATATTGA AATGAGAAAC TCTGAAAGTC CGTATATGCC 2460 TAGATACGGA TTACTAAGAA ATTTGAGAGA CAGGGAATTA GCACGCTATG CTTTTGACTT 2520 TTATGAGGTT ACTTCCAAAG CACCTAATAG GGCAAGAGAA GCAATAGCAC AAATGAAGGC 2580 CGCAGCTCTC GCGGGAATTA ACAGCAGGTT ATTTGGGCTT GATGGTAATA TCTCGACCAA 2640 TTCCGAAAAT ACTGAGAGGC ACACTGCAAG GGACGTGAAT CAGAATATGC ATACTTTGTT 2700 GGGTATGGGT CCACCGCAGT AAAGACTAGG TAAACTGGTC ACAGTTAGCA TTTCGGGTCG 2760 TTATAAGTTT TCTATAATAT AATATGTTGC ACTTTTTAGT ATAGTGTGAT TTTATCACCT 2820 TTGTACTGTT TATGTTAGTG TGGTTTAACC ATCTTAGTGT GCTTTATATT ATAGTTTATG 2880 CATAACAGGG AGAACCATTA CAATACCGGA GTTGTTTGTA GTGTGATTAC ATCACGGTTA 2940 ATAGCCGAGG TACGGTAATG TTTGTTGTCC TAAAA 2975 (2) I N FORMACIÓN PARA SEQ I D NO: 98: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2974 pares de bases (B) TI PO: ácido nucleico (C) FI LAM E NTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCULA: cDNA a mRNA (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: m isc_feature (B) UBICACIÓN: 1 ..2974 (D) OTRA I NFORMACI ON :/nota= " FIGURA 5 bis(a) a (d)" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ I D NO: 98: GAATTCTAGA TTCTGGAAAC ATTGGATAAG CACTCAAGAT GGTTTTTGTG GGCTACCTCT 60 CGTGTCTGTC AATGATGGAT ATATTGTTGG TATACATGGA TTGACATCTA ATGATTCAGA 120 GAAGAACTTC TTTGTTCCAT TTACTGACGG ATTTGAAACG GAATACCTGA ACAATGCTGA 180 TAATCTGTCG TGGGACAAAC ACTGGTTTTG GGAACCAAGT AAGATCGCAT GGGGCTCTTT 240 GAATTTAGTA GAAGAACAGC CAAAGGAAGA ATTCAAGATA TCAAAACTCG TGTCTGATCT 300 TTTTGGCAAC ACGGTAGCAG TACAGAGTAG AAAAGAGAGA TGGGTTTTGG ATGCCATGGA 360 AGGGAATTTG ATAGCTTGTG GGCAAGCTGA TAGCGCACTA GTGACAAAGC ACGTGGTTAA 420 AGGAAAATGC CCTCATTTTG CACAATACCT TTCGTTACAT GATGAAGCAA AACAGTTCTT 480 TGAGCCATTG ATGGGGGCAT ACCAGCCAAG TCGGTTGAAT AAAGACGCTT TCAAGAAAGA 540 TTTCTTTAAA TACAACAAAC CGGTTGTTCT GAATGAAGTT GATTTTAATG CTTTCGAGAA 600 GGCAGTCGAG GGAGTGGTAA CAATGATGGT CGACTTTGAA TTTGCAGAAT GCTTATTTGT 660 GACTGATCCT GATGAGATTT ATGGATCCCT GAACATGAAA GCTGCTGTCG GTGCTCAATA 720 CAAAGGAAAG AAACAGGATT ACTTTTCTGG CATGGATAGT TTTGATAAGG AGCGCCTGTT 780 GTACCTTAGC TGTGAGAGGC TTTTTAACGG GGAGAAAGGA ATTTGGAATG GTTCCTTGAA 840 AGCGGAGTTG AGGCCAATTG AAAAAGTGCA GGCGAACAAA ACTAGAACAT TTACAGCAGC 900 ACCAATTGAC ACATTGCTTG GAGCTAAAGT TTGCGTCGAT GATTTTAATA ATCAATTCTA 960 TAGCTTCAAC TTAAAATGTC CATGGACAGT TGGCATGACT AAGTTTTATG GGGGTTGGGA 1020 TAAGCTAATG AGGAGTTTGC CTGATGGCTG GACATATTGC CACGCAGACG GTTCACAGTT 1080 CGACAGTTCT TTGACTCCCT TATTGTTGAA TGCTGTCCTC AGTATTAGAT GTTGCTTCAT 1140 GGAAGATTGG TGGGTCGGAA AGGAAATGCT CGAAAACCTT TACGCTGAGA TAGTTTACAC 1200 ACCAATCTTA GCACCTGATG GCACAATTTT CAAAAAGTTT AGAGGGAATA ACAGTGGACA 1260 GCCATCTACA GTTGTTGACA ATACGCTTAT GGTTGTCATT GCTATGTATT ACTCGTGCTG 1320 TAAGCAAGGT TGGTCAGAGA AGGATATTGA AGAAAGGTTG GTGTTCTTTG CTAATGGTGA 1380 TGATATTATC TTGGCAGTTA GGGACGAGGA TGTGTGGCTG TATGACACTC TAAGTGCTTC 1440 ATTCGCTGAG CTTGGCCTGA ATTATAACTT CGATGAGCGG ACAAAGAAAA GAGAGGAGCT 1500 ATGGTTTATG TCACACCAAG CCATGCTAGT TGATGGGATT TATATTCCAA AGCTTGAACC 1560 TGAAAGGATA GTTTCCATCT TAGAGTGGGA TAGGAGCAAG GAACTTATGC ATCGCACTGA 1620 GGCAATTTGT GCAGCCATGA TTGAGGCATG GGGACATACT GAGCTTTTGC AGGAAATTCG 1680 CAAATTTTAT TTGTGGCTTC TAAGCAAAGA TGAATTTAAG GAACTCGCTG CATCCGGAAA 1740 AGCTCCATAC ATAGCTGAGA CAGCATTGAG AAAGCTCTAC ACAGATGTTA ACACACAACC 1800 AAGTGAATTG CAAAAATACC TTGAAGTTTT GGATTTTAAC CACATTGATG GTTGTTGTGA 1860 ATCAGTGTCT CTGCAATCAG GAAAAGAAGC AGTAGAAAAT TTGGATGCAG GGAAGGACTC 1920 GAAGAAGGAC ACCAGTGGCA AAGGGGATAA GCCACAAAAC TCGCAAACTG ATCAAGGTAG 1980 CAAAGAACAG ACAAAAACTG GCACAGTCAG CAAAGATGTG AATGTTGGAT CGAAAGGAAA 2040 AGAAGTCCCA CGACTACAAA AGATAACAAA GAAAATGAAC CTTCCAACAG TTGGTGGGAA 2100 AATCATTCTT AGCTTAGACC ATTTGCTCGA GTACAAACCT AATCAAGTTG ATCTGTTTAA 2160 CACTCGAGCA ACAAAAACAC AGTTTGAGTC ATGGTACAGC GCAGTTAAAG TTGAATATGA 2220 TCTTAACGAT GAGCAAATGG GTGTGATTAT GAATGGTTTT ATGGTTTGGT GTATCGATAA 2280 CGGTACATCT CCAGATGTCA ATGGAGTTTG GGTGATGATG GATGGGGAAG AGCAAGTTGA 2340 GTATCCATTA AAGCCAATTG TTGAAAATGC AAAACCAACT TTAAGACAAA TCATGCACCA 2400 TTTCTCAGAC GCAGCAGAAG CATATATTGA AATGAGAAAC TCTGAAAGTC CGTATATGCC 2460 TAGATACGGA TTACTAAGAA ATTTGAGAGA CAGGGAATTA GCACGCTATG CTTTTGACTT 2520 TTATGAGGTT ACTTCCAAAG CACCTAATAG GGCAAGAGAA GCAATAGCAC AAATGAAGGC 2580 CGCAGCTCTC GCGGGAATTA ACAGCAGGTT ATTTGGGCTT GATGGTAATA TCTCGACCAA 2640 TTCCGAAAAT ACTGAGAGGC ACACTGCAAG GGACGTGAAT CAGAATATGC ATACTTTGTT 2700 AGGTATGGGT CCACCGCAGT AAAGACTAGG TAAACTGGTC ACAGTTAGCA TTTCGGGTCG 2760 TTACAAGTTT TCTATAATAT AATATGTTGC ACTTTTTAGT ATAGTGTGAT TTTATCACCT 2820 TTGTACTGTT TATGTAGTGT GGTTTAACCA CCTTAGTGTG CTTTATATTA TAGTTTATGC 2880 ATAACAGGGA GAACCATTGC AATACCGGAG TTGTTTGTAG TGTGATTACA TCACGTTTAA 2940 TAGCCGAGGT ACGGTAATGT TTGTTGTCCT AAAA 2974 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ I D NO: 99: (i) CARACTERÍ STICAS DE SECU ENCIA: (A) LONG ITUD: 2922 pares de bases (B) TI PO: ácido nucleico (C) FI LAM ENTO: simple (D) TOPOLOG ÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCU LA: cDNA a mRNA (ix) CARACTERÍ STI CA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) U BICAC I ÓN : 1 ..2922 (D) OTRA I NFORMACION :/nota= "FIGU RA 6(a) a (d)" (xi) DESCRI PCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ I D NO: 99: TCTAGATTCT GGAAACATTG GATAACACCA ACGAAGGGGA TTGCGGATTG CCCATGGTTT 60 CAACAACGGA TGGCAAGATA ATTGGAGTTC ATGGTTTGGC TTCCACAGTC TCATCTAAGA 120 ATTATTTTGT CCCATTCACT GATGATTTTA TAGCCACGCA TTTGAGCAAA CTTGATGACC 180 TCACATGGAC TCAGCATTGG CTATGGCAAC CTAGCAAAAT TGCGTGGGGA ACGCTCAACT 240 TAGTTGATGA ACAACCAGGG CCCGAATTTC GTATTTCAAA TCTAGTCAAG GATTTATTfA -??? CTTCTGGTGT TGAAACACAG AGCAAGCGAG AAAGATGGGT CTACGAAAGC TGTGAAGGGA 360 ACCTTCGGGC TGTTGGAACT GCACAATCAG CGTTAGTCAC CAAACATGTT GTGAAAGGCA 420 AGTGTCCTTT CTTCGAAGAA TATTTACAAA AACACGCAGA AGCGAGCGCC TATTTCAGAC 480 CCCTAATGGG AGAGTACCAG CCGAGCAAGT TGAACAAAGA AGCCTTTAAA AAGGATTTCT 540 TTAAATACAA TAAACCCGTC ACTGTTAATC AACTGGATCA TGATAAATTT TTGGAAGCAG 600 TGGATGGGGT TATACGTATG ATGTGTGACT TTGAGTTCAA CGAATGTCGA TTCATTACAG 660 ATCCCGAGGA GATTTACAAC TCTTTGAACA TGAAAGCAGC AATTGGAGCC CAGTATAGAG 720 GAAAGAAGAA AGAGTTTTTG AGGGGCTAGA TGATTTTGAT CGAGAGCGAC TTTTATTCCA 780 AAGTTGTGAA AGGTTGTTCA ATGGCTACAA AGGTCTGTGG AATGGATCTT TAAAGGCCGA 840 GCTCAGGCCG CTTGAGAAAG TCAGGGCTAA CAAAACACGA ACCTTTACAG CAGCGCCAAT 900 TGATACATTG CTTGGAGCTA AAGTTTGTGT GGATGATTTC AACAATGAGT TCTACAGGAA 960 AAACCTCAAG TGTCCATGGA CGGTCGGCAT GACAAAATTT TATGGTAGTT GGGATAAATT 1020 GATGAGATCA TTACCTGATG GTTGGTTGTA TTGTCATGCT GATGGATCAC AGTTCGATAG 1080 TTCGTTAACC CCAGCCTTAC TGAACGCAGT GCTCATAATC AGGTCATTTT ATATGGAGGA 1140 TTGGTGGGTT GGCCAAGAGA TGCTTGAAAA TCTTTATGCC GAGATTGTGT ACACTCCAAT 1200 TCTTGCTCCT GATGGAACAA TTTTCAAGAA ATTTAGAGGT AACAACAGTG GGCAACCCTC 1260 AACAGTGGTG GATAACACAC TAATGGTTGT GATCTCTATT TACTATGCGT GCATGAAATT 1320 TGGTTGGAAC TGCGAGGAGA TTGAGAATAA ACTTGTCTTC TTTGCAAATG GGGATGATCT 1380 GATACTTGCA GTCAAAGATG AGGATAGCGG CTTACTTGAT AACATGTCAT CCTCTTTTTG 1440 CGAACTTGGA CTGAATTATG ATTTTTCAGA ACGTACGCAT AAAAGAGAAG ATCTTTGGTT 1500 CATGTCCCAC CAAGCAATGC TAGTTGATGG AATGTACATT CCAAAACTCG AGAAAGAGAG 1560 AATTGTTTCA ATTCTAGAGT GGGATAGAAG CAAAGAAATT ATGCACCGAA CAGAGGCTAT 1620 TTGCGCTGCG ATGATTGAGG CATGGGGGCA CACCGAGCTC TTGCAAGAAA TCAGAAAGTT 1680 TTACCTATGG TTCGTTGAAA AAGAAGAAGT GCGAGAATTG GCAGCCATCG GGAAAGCTCC 1740 ATACATAGCT GAGACAGCAC TTCGTAAGTT ATACACTGAC AAGGGAGCAG ATACAAGTGA 1800 ACTGGCACGC TACCTACAAG CCCTCCATCA AGACATCTTC TTTGAACAAG GAGACACTGT 1860 GATGCTCCAA TCAGGCACTC AGCCAACTGT GGCAGATGCT GGAGCTACAA AGAAAGACAA 1920 AGAAGATGAC AAAGGGAAAA ACAAGGACGT TACAGGCTCT GGCTCAGGTG AGAAAACAGT 1980 AGCAGCTGTC ACGAAGGACA AGGATGTGAA TGCTGGTTCT CATGGGAAAA TTGTGCCGCG 2040 TCTTTCGAAG ATCACAAAGA AAATGTCATT GCCACGCGTG AAAGGAAATG TGATACTCGA 2100 TATTGATCAT TTGCTGGAAT ATAAACCGGA TCAAATTGAG TTATATAACA CACGAGCGTC 2160 TCATCAGCAG TTCGCCTCTT GGTTCAACCA GGTTAAGACG GAATATGATT TGAACGAGCA 2220 ACAGATGGGA GTTGTAATGA ATGGTTTCAT GGTTTGGTGT ATTGAAAATG GCACTTCACC 2280 CGACATTAAT GGAGTGTGGG TTATGATGGA CGGAAATGAG CAAGTTGAGT ATCCCTTGAA 2340 ACCAATAGTT GAAAATGCAA AGCCAACGCT GCGGCAAATA ATGCATCATT TTTCAGATGC 2400 AGCGGAGGCA TATATAGAGA TGAGAAATGC AGAGGCACCA TACATGCCGA GGTATGGTTT 2460 GCTTCGAAAC CTACGGGATA GGAGTTTAGC ACGATATGCT TTCGATTTCT ATGAAGTCAA 2520 TTCTAAAACT CCTGAAAGAG CCCGCGAAGC TGTTGCGCAG ATGAAAGCAG CAGCTCTTAG 2580 CAATGTTTCT TCAAGGTTGT TTGCCTTGAT GGAAATGTTG CCACCACTAG TGAAGACACT 2640 GAACGGCACA CTGCACGTGA TGTTAATAGA AACATGCACA CCTTACTAGG TGTGAATACA 2700 ATGCAGTAAA GGGTAGGCCG CCTACCTAGG TTATTGTTTC GCTGCCGACG TAATTCTAAT 2760 ATTTACCGCT TTATTTGATA TCTTTAGATT TCCAGAGTGG GCCTCCCACC TTTAAAGCGT 2820 AAAGTTTATG TTAGTTGTCC AGGAGTGCCG TAGTCCTGTC GGAAGCTTTA GTGTGAGCCT 2880 CTCACGAATA AGCTCGAGAT TAGACTCCGT TTGAAGCCTA AA 2922 (2) I NFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 100: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONG ITUD: 236 pares de bases (B) TI PO: ácido nucleico (C) FI LAMENTO: simple (D) TOPOLOG ÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRI PCIÓN : /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍ STICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBI CACIÓN : 1 ..236 (D) OTRA I NFORMACI ON :/nota= "FIGU RA 7A" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ I D NO: 100: GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGA ACTAGTGGAT CCATGTCATT TTCTTTTCGC 60 GTCACCGCTC ATCAGGTTAT CTTTTGTCAG CTATGTTTCG CGTCACCGCT CATCAGTGGA 120 GCTTTTCCAG ATCTATAAAA CTTAGTTTCG CGTCACCGCT CATCAGATGC CAACTGCAGC 180 AGCTTTTTCG CGTCACCGCT CATCAGATGT TCAGGGACCT GCATCTGATC AAGCTT 236 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 101: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 230 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (íi) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..230 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 7B" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 101: GAGCTCCACC GCGGTGGCGG CCGCTCTAGA ACTAGTGGAT CCATGAATGG TTTTTCGCGT 60 CACCGCTCAT CAGATGGTTT GGTGCACCAT TTTTCGCGTC ACCGCTCATC AGTCAGACGC 120 AGATCTTTTG ACTTTTCGCG TCACCGCTCA TCAGTATGAG GTTACCACCG CAGTTTCGCG 180 TCACCGCTCA TCAGAAGACT AGGTAACCTG CATCTGATCA AGCTTGAATT 230 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 102: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 348 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..348 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 7C" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 102: AAGCTTGATA TCGAATCAGA ATATGCATAC TTTGTTAGGT ATGGGTCCAC CGCAGTAAAG 60 ACTAGGTAAA CTGGTCACAG TTAGCATTTC GGGTCGTTAC AAGTTTTCTA TAATATAATA 120 TGTTGCACTT TTTAGTATAG TGTGATTTTA TCACCTTTGT ACTGTTTATG TAGTGTGGTT 180 TAACCACCTT AGTGTGCTTT ATATTATAGT TTATGCATAA CAGGGAGAAC CATTGCAATA 240 CCGGAGTTGT TTGTAGTGTG ATTACATCAC 'GTTTAATAGC CGAGGTACGG TAATGTTTGT 300 TGTCCTAAAA AAAAAAGGAT CCACTAGTTC TAGAGCGGCC GCCACCGC 348 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 103: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 227 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..227 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 8A" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 103: GCGGCCGCTC TAGAACTAGT GGATCCATGC AATGTTTTTC GCGTCACCGC TCATCAGTTC 60 AAGGTGCCGA GGTTTCGCGT CACCGCTCAT CAGTGGTTTG CTTCATGGTT TCGCGTCACC 120 GCTCATCAGT GGTGCATACG AGCGTTTCGC GTCACCGCTC ATCAGTCATC AGCTCCACAG 180 TTTCGCGTCA CCGCTCATCA GTCATCTAAC TGCATCTGAT CAAGCTT 227 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 104: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 226 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (¡i) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..226 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 8B" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 104: AAGCTTGATC AGATGCAGGC TGCTTTTTCG CGTCACCGCT CATCAGATCT GCGCCGGCAT 60 GTTTCGCGTC ACCGCTCATC AGTGGTGCCT CCCTTTGTTT CGCGTCACCG CTCATCAGAT 120 CTTCTTAGCT ATGTTTCGCG TCACCGCTCA TCAGTGGAGC TTCCCACTGT TTCGCGTCAC 180 CGCTCATCAG GTTACCTCAT GGATCCACTA GTTCTAGAGC GGCCGC 226 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 105: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 220 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc eature (B) UBICACIÓN: 1..220 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 8C" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 105: GGATCCATGC TTTGCATTTT CGCGTCACCG CTCATCAGTC AACTATCGAT GCCGAGGTTT 60 CGTCCTCACG GACTCATCAG TGGTTTGCTT TTCGTCCTCA CGGACTCATC AGGAAACCTA 120 CGCTGCAGCA ATGTTTTTCG TCCTCACGGA CTCATCAGTT CAAGGTTGTT TTCGCGTCAC 180 CGCTCATCAG GGCCTTGATG ACCTGCATCT GATCAAGCTT 220 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 106: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 93 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..93 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 8D" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 106: GGATCCGCAC AATTTTTTCG CGTCACCGCT CATCAGCCAT GAGAACCAGC ATTTTCGCGT 60 CACCGCTCAT CAGACATCCT TGTGATCAAG CTT 93 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 107: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 1054 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico (A) DESCRIPCIÓN: /desc = "DNA sintético" (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..1054 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 9 (a) y (b)" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 107: TTATTTGCCG CAGCGTTGGC TTTGCATTTT CGTCCTCACG GACTCATCAG TCAACTATTG 60 GTTTCAAGGG ATACTCAACT TGCTCATTTC CGTCCATCAT AACCCACACT CCATTAATGT 120 CGGGTGAAGT GCCATTTTCA ATACACCAAA CCATGAAACC ATTCATTACA ACTCCCATCT 180 GTTGCTCGTT CAAATCATAT TCCGTCTTAA CCTGGTTGAA CCAAGAGGCG AACTGCTGAT 240 GAGACGCTCG TGTGTTATAT AACTCAATTT GATCCGGTTT ATATTCCAGC AAATGATCAA 300 TATCGAGTAT CACATTTCCT TTCACGCGTG GCAATGACAT TTTCTTTGTG ATCTTCGAAA 360 GACGCGGCAC AATTTTTTCG TCCTCACGGA CTCATCAGCC ATGAGAACCA GCATTTTCGT 420 CCTCACGGAC TCATCAGACA TCCTTGTCCT TCGTGACAGC TGCTACTGTT TTCTCACCTG 480 AGCCAGTCAT TTTTCAGATG CAGCGGAGGC ATATATAGAG ATGAGAAATG CAGAGGCACC 540 ATACATGCCG AGGTTTCGTC CTCACGGACT CATCAGTGGT TTGCTTTTCG TCCTCACGGA 600 CTCATCAGGA AACCTACGGG ATAGGAGTTT AGCACGATAT GCTTTCGATT TCTATGAAGT 660 CAATTCTAAA ACTCCTGAAA GAGCCCGCGA AGCTGTTGCG CAGATGAAAG CAGCAGCTCT 720 TAGCAATGTT TTTCGTCCTC ACGGACTCAT CAGTTCAAGG TTGTTTTCGT CCTCACGGAC 780 TCATCAGGGC CTTGATGGAA ATGTTGCCAC CACTAGTGAA GACACTGAAC GGCACACTGC 840 ACGTGATGTT AATAGAAACA TGCACACCTT ACTAGGTGTG AATACAATGC AGTAAAGGGT 900 AGGCCGCCTA CCTAGGTTAT TGTTTCGCTG CCGACGTAAT TCTAATATTT ACCGCTTTAT 960 TTGATATCTT TAGATTTCCA GAGTGGGCCT CCCACCTTTA AAGCGTAAAG TTTATGTTAG 1020 TTGTCCAGGA GTGCCGTAGT CCTGTCGGAA GCTT 1054 (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 108: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 239 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOGÍA: lineal (ii) TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico) (ix) CARACTERÍSTICA: (A) NOMBRE/CLAVE: misc_feature (B) UBICACIÓN: 1..239 (D) OTRA INFORMACION:/nota= "FIGURA 18(-)" (xi) DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 108: GTTTAAAATA AACACCGAAG ATTCGTTTCT ACTTAAATTC CTTGAGCGAC GTAGGCCTTT 60 TCGAGGTATG TATCGACTCT GTCGTAACTC TTTCGAGATG TGTCTACAAT TGTGTGTTGG 120 TTCACTTAAC GTTTTTATGG AACTTCAAAA CCTAAAATTG GTGTAACTAC CAACGACACT 180 TATCACAGAG ACGTTAGTCC TTTTCTTCGT CATCTTTTAA ACCTACGTCC CTTCCTGAG 23! (2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 109: (i) CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA: (A) LONGITUD: 2005 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) FILAMENTO: simple (D) TOPOLOG ÍA: lineal (ii) TI PO DE MOLÉCU LA: otro ácido nucleico (A) DESCRI PCIÓN: /desc = " DNA sintético" (ix) CARACTERÍ STI CA: (A) NOM BRE/CLAVE: misc eature (B) UBI CACIÓN : 1 ..2005 (D) OTRA I NFORMACION:/nota= "FIGURA 19" (xi) DESCRI PCIÓN DE SECU ENCIA: SEQ I D NO: 1 09: TATCAAAGCT CGTGTCTGAT CTTTTTGGCA ACACGGTAGC AGTACAGAGT AGAAAAGAGA 60 GATGGGTTTT GGACGCCATG GAAGGGAATT TGATAGCTTG TGGGCAAGCT GATAGCGCAC 120 TAGTGACAAA GCACGTGGTT AAAGGAAAAT GCCCTCATTT TGCACAATAT CTTTCGTTAC 180 ATGATGAAGC AAAACAGTTC TCTGAGCCAT TGATGGGGGC ATACCAGCCA AGTCGGTTGA 240 ATAAAGACGC TTTCAAGAAA GATTTCTTTA AGTACAACAA ACCGGTTGTT CTGAATGAAG 300 TTGATTTTAA TGCTCTCGAG AAGGCAGTCG AGGGAGTGAT AACAATGATG GTCGACTTTG 360 AATTTGCAGA ATGCTTATTT GTGACTGATC CTGATGAGAT TTATGGATCC CTGAACATCT 420 GATGAGTCCC GTGAGGACGA AAAAGCTGCT GTCGGTGCTC AATACAAAGG AAAGAAACAG 480 GATTACTTTT CTGGCATGGA TAGTTTTGAT AAGGAGCGCC TGTTGTACCT TAGCTGTGAG 540 AGGCTTTTTA ATGGAGAGAA AGGAATTTGG AACGGTTCCT TGAAAGCGGA GTTGAGGCCA 600 ATTGAAAAAG TGCAGGCAAA CAAAACTAGA ACATTTACAG CAGCACCGAT TGATACATTG 660 CTTGGAGCTA AAGTTTGCGT CGATGATTTT AATAATCAAT TCTACAGCTT CAACTTAAAA 720 TGTCCATGGA CAGTTGGATC TGATGAGTCC TGAGGACGAA ACTAAGTTTT ATGGGGGTTG 780 GGATAAGCTA ATGAGGAGTT TTGCCTGATG GCTGGACATA TTGCCACGCA GACGGTTCAC 840 AGTTCGACAG TTCTTTGACT CCCTTATTGT TGAATGCTGT CCTCAGTATT AGATGTTGCT 900 TCATGGAAGA TTGGTGGGTT GGAAAGGAAA TGCTTGAAAA CCTTTACGCT GAGATAGTTT 960 ACACACCAAT CTTAGCACCT GATGGCACAA TTTTCAAAAA GTTTAGAGGG AATAACAGTG 1020 GACAGCCATC TACAGTTGTT GACAATACGC TTATGGTTGT CATTGCTATG TATTACTCGT 1080 GCTGTAAACA AGGTTGGTCA GAGGAGGATA TTGAAGAAAG GTTGGTGTTC TTTGCTAATG 1140 GTGATGATAT TATCTTGGCA GTTAGGGATG AGGATGTGTG GCTGTATGAC ACTCTAAGTG 120C CTTCATTCGC TGAGCTTGGC CTGAATTATA ACTTCGATGA GCGGACAAAG AAAAGAGAGG 1260 AGCTATGGTT CATGTCACAC CAAGCCATGC TAGTTGATGG GATTTACATT CCAAAGCTTG 1320 AACCTGAAAG GATAGTTTCC ATCTTAGAGT GGGATTGGAG CAAGGAACTT ATGCATCGCA 1380 CTGAGGCAAT TTGTGCAGCC ATGATTGAGG CATGGGGACA TACTGAGCTT TTGCAGGAAA 1440 TTCGCAAATT TTATTTGTGG CTTCTAAGCA AAGATGAATT TTAAGGAACT CGCTGCATCC 1500 GGAAAAGCTC CACTGATGAG TCCGTGAGGA CGAAACATAG CTGAGACAGC ATTGAGAAAG 1560 CTCTACACAG ATGTTAACAC ACAACCAAGT GAATTGCAAA AATACCTTGA AGTTTTGGAT 1620 TTTAACCACA TTGATGGTTG CTGTGAATCA GTGTCTCTGC AATCAGGAAA AGAAGCAGTA 1680 GAAAATTTGG ATGCAGGGAA GGACTCGAAG AAGGACACCA GTGGCAAAGG GGATAAGCCA 1740 CAAAATTCGC AAACTGGTCA AGGTAGCAAA GAACAGACAA AAACTGGTAC AGTCAGCAAA 1800 GATGTGAATG TTGGATCGAA AGGAAAAGAA GTCTCACGAC TACAAAAGAT AACCTGATGA 1860 GTCCGTGAGG ACGAAAAGAA AATGAACCTT CCAACAGTTG GTGGGAAAAT CATTCTTAGC 1920 TTAGCCATTT ACTCGAGTAC AAACCTAATC AAGTTGATCT TTAACACTCG AGCCCAGCTT 1980 CCACCATGGC GTGCAGGTCG ACGGA ?nr>«,

Claims (1)

1. REIVI NDICACION ES 1 Una molécula de ácido nucleico, llamada polipbozíma, teniendo la actividad de endopbonucleasa , comprendiendo al menos las primera y segunda regiones de hibridación y al menos dos regiones catalíticas, siendo complementarias dichas primera y segunda reg iones de hibridación a una primera y seg unda regiones objetivo, respectivamente, en el RNA (+) genómico de un potyvirus, o en el RNA de filamento (-) de replicación de un potyvirus, estando las primera y segunda regiones objetivo ya sea - dentro de, o comprendiendo, diferentes genes o regiones sin trasladar en el mismo filamento de RNA, o - en diferentes filamentos de RNA, o dentro de una región correspondiente a un gene o cistrón en el RNA de filamento (-) de replicacion 2 La molécula de ácido nucleico llamada polipbozíma, teniendo actividad de endopbon ucleasa, comprendiendo al menos dos unidades "RJ y "R2", cada una de las cuales tiene la siguiente fórmula general en donde - X y X' representan cada uno, de manera independiente, cualquier ribonucleótido, (X)n y (X')n representan secuencias de ribonucleótido substancialmente complementarias a al menos parte de una región objetivo de RNA (+) genómico de potyvirus a al menos parte de su RNA de replicación de filamento (-), - las secuencias complementarias (X)n y (X')n- de Rj son complementarias a secciones de u na primera región objetivo, Z1 t del RNA (+) genómico de potyvirus o del RNA de filamento (-) de replicación , estando la región Z, dentro de, o comprendiendo, un primer gene o región sin trasladar (UTR); y (X)n y (X')n' de R2 son complementarias a las secciones de una segunda reg ión objetivo, Z2, del RNA genómico de potyvirus o intermediario de replicación de filamento (-), estando la región Z2 dentro de, o comprendiendo, un segundo gene o región sin trasladar; siendo Z, y Z2 ya sea: - diferentes genes o regiones sin trasladar, en el mismo filamento de RNA, o - siendo los mismos o diferentes genes o regiones sin trasladar en diferentes filamentos del RNA de potyvirus, o - estando los mismos genes en el RNA de replicación de filamento (-) ; - n y n' son cada uno iguales a o mayores que 4, preferiblemente iguales a o mayores q ue 8; - Q representa la región catalítica de una ribozima; - p > 2. 3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2, en donde cada una de las unidades R es representada por la siguiente fórmula: (X) n Y Y (X) rr A C en donde, cada X representa un ribonucleótido, el cual puede ser igual o diferente, (X)n y (X')n' representan secuencias de ríbonucleótidos cada una substancialmente complementaria a una de dos secuencias de RNA en un genoma de potyvirus o RNA de filamento (-) de replicación , estando separadas dichas dos secuencias de potyvirus una de otra por al menos un nucleótido en el genoma, o en el RNA de filamento (-) de replicación; un (*) representa un par de bases entre los ribonucleótidos complementarios; Y representa cualquier ribonucleótido y cada Y puede ser igual o diferente; Y' y Y" representan ribon ucleótidos de secuencia complementaria a lo largo de al menos parte de su longitud para perm itir la formación de pares de bases entre los olígoribonucleótidos, o Y' y Y" juntas forman una secuencia de RNA simple, en donde al menos parte de dicha secuencia comprende un tallo formado por la formación de pares de bases entre nucleótidos complementarios; y de manera opcional, un nucleótido adicional seleccionado de cualquiera de uno de A, G , C o U es insertado después de 1A. 4. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X'A de Rj son complementarias a una región dentro de, o comprendiendo, un primer gene o U .T. R. en el RNA (+) genómico y X y X' de R2 son complementarias a una región dentro de, o comprendiendo, un segundo gene o U .T. R. en el RNA (+) genómico. 5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')rr de R^ son complementarias a una región dentro de, o com prendiendo, una región correspondiente a un primer gene OR U .T. R. en el RNA de filamento (-) de replicación , y X y X' de R2 son complementarias a u na región dentro de, o com prendiendo, u na región correspondiente a un segundo gene o U.T. R. en el RNA de filamento (-) de replicación . 6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivind icación 2 o 3, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de Rj son complementarias a una reg ión Zj dentro de, o comprendiendo, un gene o U.T. R. en el RNA g(+) genómico, y X y X' de R2 son complementarias a una reg ión Z2 dentro de, o comprendiendo, una región correspondiente a un gene o U .T. R. en el RNA de filamento (-) de replicación. 7. La molécu la de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6, en donde las secuencias complementarias de Rj son complementarias a una región Zj dentro de, o comprendiendo, un cistrón "C" en el RNA de filamento (+) y las secuencias complementarias de R2 son com plementarias a una reg ión Z2 en el filamento (-) dentro de, o com prendiendo, la región correspondiente al mismo cistrón "C". 8. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 comprendiendo unidades R adicionales, cuyas secuencias complementarias a regiones dentro de, o com prendiendo, genes adicionales en el filamento (+) genómico o en el filamento (-) de replicación , y/o a regiones dentro de los mismos genes como Zj y/o Z2. 9. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con cualquiera de las reivind icaciones precedentes, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de al menos una un idad R son com plementarias a regiones dentro de, o comprendiendo, el gene de proteína de cápside, el gene N ía, el gene N l b, la región sin trasladar 3' de un potyvirus , o las secuencias correspondientes en el RNA de filamento (-) de replicación . 1 0. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 9, en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X')n' de al menos una unidad R son complementarias a regiones dentro de, o comprendiendo, el gene de proteína de cápsíde (CP) o las secuencias correspondientes en el RNA de filamento (-) de replicación. 1 1 . La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 0, en donde los segmentos complementarios (X)n y (X')n' de Rj son complemenarios a regiones dentro de, o comprendiendo, el gene CP en el RNA de filamento (-) de replicación . 1 2. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 0, en donde los segmentos complementarios (X)n y (X')n' de R son complementarios a regiones dentro de, o comprendiendo, el gene CP en el RNA de filamento (+) genómico. 1 3. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 1 , en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de ambos Rj y R2 son com plementarias a reg iones dentro del gene CP en el RNA de filamento (-) de replicación . 14. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 4, 10 y 12, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')r de Ri y de R2 son respectivamente complementarias a regiones dentro del gene CP y la región sin trasladar 3' del RNA de filamento (+) genómico. 1 5. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 5 y 9, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')r de Ri y R2 son respectivamente complementarias a regiones del RNA de filamento (-) de repl icacíón correspondientes a regiones dentro del gene CP y el gene N l b, o ai gene N l b y el gene N í a. 1 6. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 1 y 1 2 com prendiendo al menos dos unidades R, Rj y R2, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n- de Ri son complementarias al gene CP del RNA de filamento (+) genómico y las regiones de hibridación de R2 son complementarias al gene CP en el RNA de filamento (-) de replicacíón . 1 7. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 8 y 9 comprendiendo al menos tres unidades Rj , R2 y R3, en donde las secuencias complementarias (X)n y (X' de R son com plementarias a regiones dentro del gene CP o la reg ión sin trasladar 3' (3'NT) del RNA de filamento (+) genóm ico, las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de R2 son complementarias a regiones dentro del gene N l b en el RNA de filamento (-) de replicación y las secuencias complementarias dentro de los genes N í a o CP en el RNA de filamento (-) de replicación. 1 8. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 2 o 3, com prendiendo al menos dos unidades R, "Rj " y "R2" en donde las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de R^ son complementarias a secciones de u na región objetivo Zj dentro de una región correspondiente a un gene dado o región sin trasladar en el RNA de filamento (-) de replicación, y las secuencias de hibridación X y X' de R2 son complementarias a una reg ión objetivo Z2 dentro del mismo gene o región sin trasladar como aquélla de Zj , en el mismo filamento de RNA. 1 9. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivind icaciones 1 o 2 a 1 8, en donde "p" tiene un valor desde 2 hasta 20, por ejemplo 4 a 1 0. 20. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 1 9, en donde cada una de las secuencias complementarías (X)n y (X'A de al menos una unidad R comprenden, de manera independiente, más de 50 nucleótidos, por ejem plo 60 a 300 nucleótidos. 21 . La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 1 9, en donde cada u na de las secuencias complementarias (X)n y (X'V de al menos una unidad R comprenden, independientemente, de 4 a 50 nucleótidos, por ejemplo de 8 a 1 2 nucleótidos. 22. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con las reivindicaciones 20 y 21 , en donde al menos u na primera unidad R tiene secuencias complementarias (X)n y (X')n' comprendiendo cada una más de 50 nucleótidos, y al menos una segunda u nidad R tiene secuencias com plementarias (X)n y (X'A cada una com prend iendo de 4 a 50 nucleótidos. 23. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 22, en donde la secuencia 3' (X)n de una unidad R dada y la secuencia 5' (X'A de la unidad R adyacente son complementarias a secuencias que están contiguas en el RNA de filamento (+) genómico de potyvirus o RNA de filamento (-) de replicación. 24. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 22 , en donde la secuencia 3' (X)p de una unidad R dada y la secuencia 5' (X'V de la unidad R adyacente son complementarias a porciones no contiguas del RNA de filamento (+) genómico de potyvirus o RNA de filamento (-) de replicación. 25. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 24, en donde al menos un nucleótido o una secuencia de nucleótidos "A", no complementario al genoma viral o el RNA de filamento (-) de replicación, está incluido entre 2 unidades R consecutivas. 26. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 25, en donde la secuencia no com plementaria "A" es un polienlazador o un separador. 27. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 a 26, en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X')n' , de una primera unidad R y las secuencias complementarias (X)n y (X')n' de una segunda unidad R son complementarias a secuencias objetivo en el genoma o en el RNA de sentido (-) de al menos 2 especies distintas de potyvirus. 28. La molécu la de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 1 o 2 , en donde una o más regiones catalíticas comprenden , o se derivan de una región catal ítica de ribozima de horquilla. 29. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 27, en donde las regiones de hibridación son complementarias a regiones objetivo de uno o más potyvírus elegidos de potyvirus transmitidos por áfidos, garrapatas y mosca blanca , incluyendo Virus de mosaico amarillo de calabacita (ZYMV) , Virus de mosaico de sandía 2 (WMV2), Virus de moteado de vena de tabaco (TVMV), Virus de grabado de tabaco (TEV) , Virus Y de papa (PVY) , Virus de moteado de pimienta (PepMoV), Virus de mosaico de soya (SbMV), Virus de anillada de papaya (PRSV), Virus de mosaico soportado en semilla de ch ícharo (PSbMV), Virus de mosaico de nabo (TuMV), Virus de mosaico de pasto Johnson (JGMV) , Virus pox de ciruela (PPV) , Virus de ma íz enano (MDV) Virus de mosaico com ún de frijol (BCMV) Virus de mosaico amari llo de frijol (BYMV) Virus de moteado de vena de clavel (CarVMV) Virus de mosaico de apio (CeMV) Virus de vena amarilla de trébol (CIYVV) Virus de mosaico de beleño (HMV) Virus de mosaico de caña de azúcar (SCMV) Virus de rayas de cacahuate (PStV) 30. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con la reivindicación 29, en donde las secuencias com plementarias (X)n y (X')n' son complementarias a regiones objetivo de ZYMV y/o WMV2 , o a mutantes o derivados de las mismas. 31 . La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reividicaciones 1 a 30 comprendiendo además en su extremo 3' , toda o parte de la región 3' sin trasladar de un potyvirus, particularmente ZYMV o WMV2. 32. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con cualq uiera de las reivindicaciones 1 a 31 , capaz de cortar RNA de filamento ( + ) genómico de potyvirus o RNA de filamento (-) de replicación, reduciendo con ello la replicación viral, infección, montaje, movim iento célula a célula y/o síntomas. 33. La molécula de ácido nucleico que consiste de los nucleótidos 1 704 a 1 873 del filamento (-) de la secuencia ilustrada en la Fig ura 1 8, o un fragmento de la m isma, consistiendo de la menos 20 nucleótidos consecutivos de dicha molécula, incluyendo dicho fragmento la GTA mostrada en la posición (-) 1 748 a (-) 1 750. 34. La molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia que tiene al menos 75% de identidad y preferiblemente al menos 85% de identidad con la molécula de acuerdo con la reivindicación 33, incluyendo la GTA mostrada en la posición (-) 1 748 a (-) 1 750 de la Fig ura 1 8. 35. La molécula de ácido nucleico comprendiendo cualquiera de las moléculas de acuerdo con la reividicación 33 o 34, pero la cual no es un RNA de replicación de sentido (-) viral completo. 36. La molécula de ácido nucleico, comprendiendo una secuencia complementaria a las moléculas de la reivindicación 33 o 34. 37. La molécula de ácido n ucleico comprendiendo la molécula de la reivindicación 33 o 34 enlazada como una fusión de traslación o transcripción a una segunda molécula de ácido nucleico. 38. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con la reivindicación 37, en donde la segunda molécu la de ácido nucleico comprende una secuencia de codificación, codificando, por ejemplo, una proteína reportadora, o cualquier otro gene de interés. 39. La molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualq u iera de las reivindicaciones 1 a 3 ten iendo la actividad de endoribonucleasa, en donde dicha molécula es capaz de hibridar a, y cortar, una molécula de acuerdo con las reivindicaciones 33-35 o 37-38. 40. Un gene quimérico comprendiendo u na secuencia de DNA, que se enlaza operablemente a señales de regulación de transcripción 5' y 3' funcionales en células de plantas y que, sobre la transcripción, origina una o más moléculas de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39. 41 . El vector comprendiendo una molécula de ácido nucleico, o el cual, cuando se transcribe origina una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reividicaciones 1 a 39, o un gene quimérico de acuerdo a la reivindicación 40, y opcionalmente un gene marcador seleccionable, gene reportador y/o secuencias funcionales capaces de transferir DNA a un genoma de célula de planta. 42. Las células de planta que comprenden una molécula de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 39, o un gene quimérico de acuerdo con la reivindicación 40, o una secuencia de DNA, que sobre la transcripción , origina una molécula de ácido nucleico de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 39. 43. La planta transgén ica com prendiendo un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 32 o un gene quimérico de acuerdo con la reivindicación 40, y capaz de reducir la replicación , infección , movimiento cél ula a célula y/o montaje de un potyvirus. 44. La planta transgén ica com prendiendo un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 39. 45. La planta transgénica de acuerdo con la reivindicación 43, en donde la planta es elegida a partir de los siguientes géneros: Cucurbitaceae, Chenopodiaceae, Cruciferaceae, Graminaceae, Leguminoseae, Ombelliferaceae, Rosaceae, Solanaceae. 46. La planta transgén ica de acuerdo con la reivindicación 45, siendo dicha planta calabacín , melón , remolacha, avena, trigo, caña de azúcar, cebada, ballica, frijol, ch ícharo, soya, cacahuate, zanahoria , apio, chirivía, ciruela, papa, tomate, tabaco, pimienta . 47. Las sem illas de plantas transgénicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46. 48. La progenie de plantas transgénicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46. 49. La fruta de plantas transgénicas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 43 a 46. 50. El proceso para conferir resistencia a un potyvírus en una planta, comprendiendo introducir en la planta, o en una parte de la planta, un ácido nucleico comprendiendo, o codificando, un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicciones 1 a 32 , opcionalmente seguido por la regeneración de una planta transgénica que exhibe la resistencia requerida , y opcionalmente la reporducción para producir progenie. 51 . El método para controlar la expresión funcional de una molécula de ácido nucleico al i) fusionar de manera de traslacional o transcripcional una secuencia objetivo artificial comprendiendo un ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 33 a 35, al ácido nucleico cuya expresión va a ser controlada , originando un gene h íbrido cuya expresión y función no son interrumpidas por la fusión. ii) permitir que el producto de transcripción del gene h íbrido entre en contacto con una molécula de RNA complementaria a al menos una parte de la secuencia objetivo artificial y capaz de hibridar a, y/o cortar el objetivo artificial. 52. El método de acuerdo con la reivindicación 51 , en donde la molécula de RNA complementaria es una ribozima o molécula antisentido. 53. La molécula de ácido nucleico, llamada "ribozima" , que tiene actividad de endoribonucleasa , com prendiendo al menos una región de hibridación y al menos una región catal ítica, siendo complementaria dicha región de hibridación a una o más regiones objetivo del RNA (+) genómico de un potyvirus, y/o a una o más regiones objetivo del RNA de filamento (-) de replicación de un potyvirus, consistiendo o comprendiendo dicha región objetivo la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 33 o 34. 54. La molécula de ácido n ucleico de acuerdo con la reivindicación 53, teniendo una región catalítica. (54) Título: RIBOZÍMAS CAPACES DE CONFERIR RESISTENCIA A INFECCIÓN CON POTYVIRUS Y PLANTAS QUE EXPRESAN DICHAS RIBOZÍMAS (57) Resumen: La invención concierne a una molécula de ácido nucleico, llamada poliribozima, que tiene actividad de endoribonucleasa , comprendiendo al menos primera y segunda regiones de hibridación y al menos dos regiones catalíticas, siendo complementarias dichas primera y segunda regiones de hibridación a las primera y segunda regiones objetivo, respectivamente, en el RNA (+) genómico de un potyvirus, o en el RNA de filamento (-) de replicación de un potyvirus, estando dichas primera y segunda regiones objetivo ya sea: dentro o comprendiendo diferentes genes o regiones sin trasladar en el mismo filamento de RNA, o en diferentes filamentos de RNA, o dentro de una región que corresponde a un gene o cistrón en el RNA de filamento (-) de replicación.