MXPA00004085A - Utilizacion del acido tranexamico para la preparacion de una composicion de fibrinogeno humano - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a una utilización delácido tranexámico para la preparación de una composición de fibrinógeno humano obtenido a partir de plasma humano o mediante métodos de tecnología recombinante o transgenica, con la adición simultánea de albúmina humana, para acortar el tiempo de solubilización al añadir un disolvente fisio1ógicamente compatible y a la composición de composición de fibrinógeno.

Description

UTILIZACIÓN DEL ACIDO TRANEXAMICO PARA LA PREPARACIÓN DE UNA COMPOSICIÓN DE FIBRINÓGENO HUMANO MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a una utilización del ácido tranexámico para la preparación de una composición de fibrinógeno humano obtenido a partir de plasma humano o mediante métodos de tecnología recombinante o transgénica, con la adición simultánea de albúmina humana, para acortar el tiempo de solubilización al añadir un disolvente, fisiológicamente compatible. La composición es desecada e inactivada de virus por calor. La solución de este preparado puede ser aplicada tópicamente como adhesivo o cola biológica para la unión de tejidos u órganos humanos. Los preparados proteicos de este tipo que se hallan en el mercado incorporan agentes antifibrinolíticos como protectores auxiliares del coágulo de fibrina, tales como la aprotinina (de origen animal) o por ejemplo el ácido épsilon aminocaproico (de origen sintético) u otros. La necesidad de adicionar tales compuestos exógenos al componente básico de fibrinógeno coagulable ha sido bastante discutida y controvertida, debido a la falta de resultados clínicos que avalen dicha necesidad cuando se utiliza como pegamento biológico. Por lo demás, el estado actual de la técnica incluye como antecedentes más relevantes relacionados con el procedimiento de la invención los que se comentan a continuación : La utilización de antifibrinolíticos tales como la aprotinina, se remonta a la década de los años 70 (actualmente comercializada con los nombres registrados de: Antagosan, Fase, Iniprol , y otros) . La administración conjunta con el fibrinógeno, para su aplicación como cola biológica, se recoge ya en la patente DE 3002933 (prioridad 15/02/79) en la cual se hace mención específica a las propiedades del adhesivo de fibrina formado y a la estabilidad conferida por el antifibrinolítico . Una composición liofilizada fácilmente solubilizable formulada con aminoácidos que contienen en su molécula grupos urea o guanidino, se describe en la patente ES 519469 (prioridad 04/02/82) . Muy posteriormente se han descrito composiciones que mejoran la solubilidad del preparado de fibrinógeno deshidratado y/o su estabilidad en solución por adición previa de urea (patente WO 91/19519 con prioridad 15/06/90) y por presencia de detergentes no iónicos (patente ES 2080155 con prioridad 01/08/89, y patente WO 95/25748 con prioridad 18/03/94) . Varias han sido las patentes solicitadas referentes a métodos de inactivación de virus, específicos o no, para el fibrinógeno. La patente ES 536850 (prioridad 19/10/83) , reivindica la inactivación de virus mediante tratamiento térmico de proteínas, entre ellas el fibxinógeno, en estado de desecación y en presencia de aminoácidos ácidos y básicos.. La patente ES 524992. (prioridad 19/08/82) también se refiere al proceso de inactivación de virus por pasteurización en líquido a 60°C durante 10 horas y en presencia de estabilizantes. La patente ES 2051914 (prioridad 29/04/88) describe la composición y preparación de un compuesto útil • para la reparación del cartílago y hueso, el cual se halla formado por una cola biológica biodegradable cuya forma de preparación fue descrita en fecha anterior en la patente US 4642120 (prioridad 28/03/83) . El gel reivindicado en la patente en cuestión ES 2051914 o en su precedente US 4642120, se halla constituido entre otros por trombina y cloruro calcico, antiproteasa (aprotinina, ácido épsilon aminocaproico, ácido tranexámico, u otros inhibidores proteicos tales como la antiplasmina, etc.) y fibrinógeno. Según se indica en la mencionada patente, el compuesto se almacena 2-3 días a temperaturas de incubación, o durante 2-3 años a temperaturas criogénicas. La aplicación reivindicada en ésta, corresponde únicamente a la utilización de células de médula ósea junto con el vehículo de inmovilización (cola adhesiva) la cual contiene no menos de un 10% de suero. En la patente WO 92/22312 (prioridad 17/06/91) se reivindica específicamente una composición con propiedades adhesivas que comprende fibrina o fibrinógeno biodegradable y polímero biocompatible, de forma que básicamente se trata de una cola adhesiva que conserva como mínimo las conocidas aplicaciones clínicas de las preparaciones estándar de estos tipos de compuestos. Para su preparación se menciona la utilización de algunos de los antifibrinolíticos ya conocidos, de origen humano (antiplasmina), animal (aprotinina) y sintético (ácido tranexámico) . Otra de las patentes relacionadas con las colas biológicas es la EP 0534178 A2 (prioridad 27/09/91) . En esta patente se describe la preparación de un adhesivo en base a un compuesto A de fibrinógeno crudo y otro B constituido preferentemente por un enzima proteolítico obtenido de veneno de serpiente (batroxobin) o por trombina. En esta se contempla la posibilidad de agregar un inhibidor de proteasas tal como la aprotinina. Para elaborar el compuesto A, se describe exclusivamente la utilización de crioprecipitado como material de partida, relatando que la composición de este material (pool de 5 donaciones de plasma) es : proteína total 75 mg/ml (100%) , fibrinógeno 36 mg/ml (48% respecto a proteína total) y factor XIII 4.10 Ul/ml. Según la descripción de la patente, el producto procesado, o sea después de extracción con solución salina citratada y filtración en presencia de gel de aluminio, se lleva a una concentración proteica equivalente a la inicial (70-80 mg/ml de proteína total) , conservándose congelada en bolsa de plástico (la liofilización se contempla solo como opcional) . La patente WO 94/22503 (prioridad 30/03/93) describe la producción y aplicación de una cola de fibrina' adhesiva cuyas ventajas indicadas en la invención residen en la mayor resistencia mecánica de la cola adhesiva de la preparación. Explícitamente se señala al ácido tranexámico como el sustituto de la aprotinina, con actividad antifibrinolítica de baja respuesta inmune, capaz de conferir suficiente resistencia tensil cuando se compara con otros preparados que contienen aprotinina. En ningún caso se-realiza mención alguna a la utilización del ácido tranexámico o sus derivados como excipientes del fibrinógeno durante la liofilización, solo o en combinación con otros componentes, y sobre su marcado efecto solubilizante descubierto por los inventores, presentado en esta memoria. Se ha publicado (Jackson M.R., MacPhee M.J., et al. Fibrin Sealant : Current and Potencial Clinical Applications. Blood Coagulation and Fibrinolysis; 7, 737-746; 1996) algunas de las características de los preparados del tipo reivindicado en la patente en cuestión. Por otro lado, tanto la síntesis química como las indicaciones terapéuticas del ácido tranexámico (actividad antifibrinolítica) tanto por vías intravenosa, subcutánea, oral o tópica (pomadas y soluciones) se relatan en la Patente Belga N° 617216 (prioridad del año 1961) , enfatizándose en dicha patente la actividad específica de preparado en cuanto a su efecto inhibidor de la presencia de plasmina, con respecto a la lisis del coágulo de fibrina formado por fibrinógeno y trombina, en presencia de iones Ca(2+) . También en esta patente se reivindica la posible utilización del producto combinado con otros principios activos o ingredientes, con la condición de promover la actividad fibrinolítica.

Esta nueva composición del preparado que se revela en la invención soluciona varios de los problemas que actualmente adolecen los compuestos de fibrinógeno coagulable para uso tópico, y que en síntesis son: 1.- Utilización de compuestos de baja concentración de proteínas coagulables que repercuten en la actividad del preparado, comprometiendo su utilidad • terapéutica. 2.- Hoy en día, los métodos de inactivación- esterilización físicos y/o químicos confieren a los productos derivados del plasma humano un riesgo prácticamente nulo en cuanto a la infección potencial por la mayoría de los virus patógenos más peligrosos transmisibles por el plasma, como los que provocan la inmunodeficiencia humana y las hepatitis B o C (y muy posiblemente la G) o de cualquiera de los virus con envoltura lipídica conocidos. Sin embargo no existen métodos absolutamente contrastados para la esterilización total de virus sin envoltura lipídica transmisibles por el plasma. 3. - La obtención de preparados de fibrinógeno coagulable conservados en estado seco (liofilizado) e inactivados por calor, fácilmente solubilizables en un vehículo acuoso y a elevada concentración, continua siendo un factor limitante para la aplicación tópica del preparado con la máxima eficacia terapéutica. Los anteriores puntos indicados han sido afrontados por los autores de la presente invención que han proporcionado una composición de un complejo de proteínas adherentes que supera el estado de la técnica de los productos actuales equivalentes. Para el uso tópico del complejo de proteínas al que se refiere la invención como pegamento biológico, se requiere un compuesto auxiliar para formar un coágulo de fibrina adherente. Este compuesto auxiliar, constituido por una enzima activada tal como la trombina, al ponerse en contacto con el complejo de proteínas de la invención, y en presencia de iones calcio, da lugar a una sólida malla de fibrina . Una de las principales proteínas que componen el preparado de la invención es el fibrinógeno coagulable. Esta proteína mayoritaria se halla acompañada de otras proteínas adhesivas, que en el caso de aplicación tópica como cola, son especialmente interesantes ya que intervienen en los mecanismos de unión de los tejidos confiriendo mayor adherencia. Así pues, este complejo proteico, se caracteriza porque además de contener fibrinógeno de forma mayoritaria, va acompañado de fibronectina, así como de factor XIII y de otras proteínas minoritarias. La concentración de fibrinógeno coagulable es uno de los objetivos de interés de la presente invención. Es sabido que tanto la rapidez en la formación de la malla de fibrina como su resistencia es una función de la concentración de la proteína coagulable del complejo de proteínas aplicado. Es por tanto un requisito imprescindible administrar tópicamente una alta concentración de fibrinógeno, para que al ponerse en contacto con su activador, de lugar a una sólida malla de fibrina reticulada. La presente invención aborda la problemática de la conservación del preparado a condiciones que no requieran temperaturas de congelación, de forma que pueda almacenarse a temperatura ambiente o en refrigerador, para lo cual se desarrolla especialmente una fórmula que permite obtener un preparado liofilizado que cumpla los requisitos de Farmacopea, y mejora bajo este punto de vista a varias de las preparaciones registradas y comercializadas o aún en fase de desarrollo. Otro de los puntos especialmente relevantes de la presente invención es la incorporación de al menos una etapa específica de inactivación vírica de reconocida efectividad. Esta inactivación se realiza por tratamiento térmico terminal a alta temperatura en estado de desecación (por liofilización por ejemplo) y en el producto acabado en su envase final. El compuesto de ? fibrinógeno así tratado mantiene sus propiedades biológicas y físicas inalteradas. Para conseguir un preparado de proteínas adhesivas con las características indicadas en los puntos anteriores, los inventores han desarrollado una composición óptima para su uso tópico como cola biológica. La monografía de la Farmacopea Europea para el Adhesivo de Fibrina indica que el componente coagulable de fibrinógeno debe contener no menos de 60 g/litro, así como no menos de 10 Ul de factor XlII/ml de solución, y el tiempo de resolubilización del producto liofilizado no debe ser superior a 20 minutos a la temperatura preferente que se indique . La concentración de fibrinógeno anteriormente indicada no es fácilmente alcanzable en composiciones de preparados obtenidos por procesos sencillos de producción de complejos de proteínas adhesivas, por ejemplo a partir de crioprecipitado, debido a la gran cantidad de proteínas acompañantes que impurifican el preparado básico de fibrinógeno. No obstante, y aun en el caso en que fuese posible alcanzar la concentración. recisa de fibrinógeno por. estos métodos, el material obtenido es guardado preferentemente congelado hasta su utilización. Los preparados desecados (liofilizados) son difícilmente solubilizables, en un período de tiempo razonable, a las concentraciones requeridas para su utilización como adhesivo biológico de tejidos, de forma que se recurre a la conservación de la solución en estado de congelación (aplicado a preparados "caseros"). En la actualidad continúa siendo muy frecuente la preparación de compuestos de fibrinógeno procedentes de crioprecipitado de plasma autólogo, de un solo donante o de una mezcla de muy pocos donantes (por ejemplo, de 5) . Estos tipos de preparaciones (preparados "caseros" o artesanales) se realizan en centros hospitalarios para su propio consumo (uso interno) , pero adolecen de una falta clara de estandarización y reproducibilidad en cuanto a la calidad del preparado por lo que se obtienen resultados imprecisos y baja eficacia terapéutica. Esta práctica tampoco excluye de forma total el riesgo de transmisión vírica (excepto para el plasma autólogo) , y se consiguen concentraciones finales de fibrinógeno muy bajas que oscilan entre 10 a 29 mg/ml (1% -2.9%) de fibrinógeno coagulable aproximadamente (Jackson M.R., MacPhee M.J.. et al. Fibrin Sealant : Current and Potencial Clinical Applications. Blood Coagulation and Fibrinolysis; 7; 737-746; 1996) . Asimismo, la utilización de la anterior preparación de fibrinógeno podría presentar un marcado efecto negativo debido a alguna de las restantes proteínas acompañantes (presuntamente contiene solo un 50% aproximadamente de fibrinógeno coagulable, siendo inferior al 70% en todos los casos) , por lo que podría resultar prácticamente imprescindible la adición de un inhibidor de proteasas que estabilice y proteja primero al fibrinógeno y luego a la malla de fibrina formada al realizar su aplicación tópica. La solubilidad de la preparación liofilizada se ha mejorado por la técnica al incorporar aminoácidos que contienen el grupo urea o guanidino, tales como la arginina, isoleucina, etc., o por agentes caotrópicos como la propia urea. También se ha descrito la utilización de ácidos grasos solubles y de detergentes, que según se ha publicado, pueden favorecer la solubilización del liofilizado. En cualquier caso, es necesario mantener unas condiciones de fuerza iónica aproximadamente fisiológica, en el momento de formar la malla de fibrina. Se considera inaceptable la preparación de soluciones cuya concentración iónica final supere de forma clara el valor fisiológico (por ejemplo, más del doble de este valor) . Los inventores han solucionado el problema de mantener un preparado de fibrinógeno estable que contenga la mayoría de las proteínas adhesivas de interés y factor XIII, conservado en estado de liofilización y posibilitando la inactivación de virus por calor en estado seco, con el objetivo de disponer de dichas proteínas coagulables a alta concentración. De modo sorprendente, los inventores han descubierto una fórmula o composición final que en cantidades óptimas de los excipientes permiten solubilizar el compuesto de fibrinógeno liofilizado a concentraciones superiores a los 60 g/litro de proteína coagulable, empleando un tiempo para su reconstitución claramente inferior a los 20 minutos mandatorios para la solubilización del producto liofilizado, llegando a ser habitualmente de entre 5-10 minutos. La fórmula de la invención permite la inactivación de virus por calor de forma eficiente a alta temperatura, sin dañar la funcionalidad del preparado, y asimismo mantiene sus propiedades físicas sin alteración significativa .

En cuanto a la generación de respuesta inmunogénica del preparado, ésta puede ser prácticamente nula en la infusión de los compuestos de alto nivel de purificación, en los que además se ha reducido. suficientemente la presencia de inmunoglobulinas (isoaglutininas) . La posible formación de neoantígenos, debida principalmente a la acción del calor durante la etapa final de inactivación térmica del producto liofilizado, podría prácticamente excluirse si se controla eficazmente el grado de desecación del producto liofilizado y la atmósfera propicia (ausencia de oxígeno) para el calentamiento del sólido. Con respecto a la seguridad viral de los compuestos de fibrinógeno ya indicada, resulta en los momentos actuales un riesgo prácticamente nulo para los virus con envoltura lipídica, si los preparados han sido sometidos a alguno de los métodos reconocidos de inactivación (solvente-detergente) . Históricamente, el fibrinógeno utilizado en la década de los años 70 o anterior, presentaba un riesgo muy elevado de transmisión de enfermedades víricas, principalmente debidas a hepatitis (B, y/o no-A, no-B) , al no incorporar etapa alguna de inactivación específica de virus en su elaboración, cuando se partía de un pool de plasma de centenares o miles de donantes. Por este motivo se impulsó la preparación de fibrinógeno de plasma autólogo, o de un muy reducido y controlado número de donantes .

En la actualidad las empresas de fraccionamiento plasmático comercializan compuestos de fibrinógeno coagulable inactivado de virus, con al menos una etapa específica de eliminación de virus de alta eficiencia (se estiman necesarios por lo menos 8-10 Log (10) aproximadamente de reducción de la carga vírica inicial en el total del proceso de producción, para los virus con envoltura ' lipídica, y por lo menos una etapa en que la infectividad residual sea nula) . Así pues, los productos de fibrinógeno que se desarrollen en la actualidad deberían incorporar una doble etapa de inactivación en la que al menos una de ellas fuese también efectiva frente a virus sin envoltura lipídica, para conferir el suficiente nivel de seguridad al producto . El procedimiento de la invención afronta el reto de la inactivación dual con la posibilidad de combinar la inactivación química (solvente-detergente) introducida en el proceso de purificación del producto, con la térmica de alta eficiencia y en envase final, las cuales son complementarias y selectivas. Cabe señalar que la inactivación vírica por calor en seco puede fácilmente actuar en contra de la velocidad de solubilización del producto liofilizado así tratado y en la calidad de la solución obtenida. Mediante una formulación liofilizada novedosa, el procedimiento de la invención supera esta dificultad clave para la obtención de un preparado de fibrinógeno apropiado que contemple dicha inactivación por calor. Los inventores descubrieron que una combinación apropiada de algunas proteínas, aminoácidos y reactivos químicos podían favorecer la solubilización del material deshidratado. Sorprendentemente encontraron que el complejo adhesivo de fibrinógeno mezclado apropiadamente con albúmina, glicina y sales sódica-citratada, a la cual se adicionaba al menos un solubilizante del grupo formado por un ácido carboxílico de cadena hidrocarbonada no lineal y amino-sustituido, a una concentración precisa podía conseguirse una preparación que cumplía ampliamente con las especificaciones de la monografía del producto para su conservación en estado de desecación. El solubilizante en cuestión corresponde más concretamente a la fórmula de un compuesto de síntesis química, que se halla formado por un grupo ácido carboxílico unido a un anillo cíclico alifático de 6 unidades de carbono y asimismo sustituido por un grupo amino-metil terminal en posición 4 o "para" . La fórmula semidesarroliada corresponde a la expresión: NH3CH2 - A - CO.OH; donde A equivale a un anillo de ciclohexano. El compuesto referido es el ácido 4-aminometil ciclohexano carboxílico que se conoce por las siglas AMCHA (o también como AMCA) de los cuales, existen dos isómeros de posición, el cis-AMCHA y el trans-AMCHA, poseyendo este último actividad antifibrinolítica, siendo conocido también por ácido tranexámico, Cyklokapron u otros apelativos (con patente de aplicación US 3499925, prioridad 1965) . Sorprendentemente los inventores han descubierto ahora, y describen en esta memoria, que este compuesto actúa como solubilizante del fibrinógeno (y proteínas adhesivas acompañantes) en estado de desecación (liofilización) , cuando forman parte de una combinación adecuada de otros componentes (albúmina, glicina, sales) . En el caso de ausencia de alguno de los * anteriores componentes mencionados, fuese de albúmina o glicina o sales, disminuiría marcadamente el efecto solubilizador del AMCHA añadido . Para lograr el objetivo perseguido con respecto a la solubilización del producto, los inventores realizaron una minuciosa búsqueda experimental para hallar cuales podrían ser las composiciones aceptables, tanto cualitativa como cuantitativamente, de forma que ha sido posible la optimización de ésta. La composición del producto de la invención tiene la enorme ventaja añadida que posibilita la aplicación de una etapa de inactivación de virus por calor a elevada temperatura, lo cual confiere un máximo nivel de seguridad viral cuando se combina con la inactivación química por solvente/detergente. Los excipientes o estabilizantes de la composición son termo-resistentes a las condiciones del tratamiento por calor. La albúmina utilizada en la formulación interviene estabilizando el producto durante el calentamiento, y el ácido carboxílico sustituido continua facilitando la solubilización del producto liofilizado después de dicho tratamiento. La descripción detallada de la composición y procedimiento de preparación de la invención se indica a continuación: La solución proteica del material de partida purificada y concentrada hasta aproximadamente un 4% de proteína total, de la cual al menos un 90% corresponde a fibrinógeno coagulable, se halla en un medio acuoso que contiene concentraciones de glicina de 0.05M a 0.2M, cloruro sódico de 0.05M a 0.2M y citrato sódico de 0.01M a 0.05M, a un pH preferente de entre 6.0-8.0. El producto de partida se halla prácticamente exento de agregados de fibrinógeno de alto peso molecular, así como de compuestos lipoproteicos inestables u otros compuestos alterables por liofilización, u otro tipo de desecación. A la solución del producto se añade albúmina sérica humana entre un 0.25% hasta un 0.75%, agregándose luego una solución concentrada del solubilizante compatible, constituido por un ácido carboxílico cíclico sustituido y preferentemente el ácido 4-aminometilciclo hexanoico (AMCHA) , alcanzando una concentración entre 1% y 4% 'preferentemente, y más preferentemente entre un 2% y 2.5%, una vez ajustada la solución a 3%-4% de concentración en fibrinógeno. La solución ajustada antes de desecar (liofilizar, atomizar) se clarifica y esteriliza por filtración de hasta 0.2 mieras de poro, dosificándose el volumen adecuado requerido para la presentación deseada, dosificándose preferentemente un volumen equivalente al doble del de reconstitución previsto, por ejemplo 10 mL de solución al 3-4% de fibrinógeno que se reconstituye con solo 5 mL de disolvente (agua para inyección) . Se deseca el producto preferentemente mediante un ciclo adecuado de liofilización (preferentemente por congelación previa del producto a temperaturas de unos -60°C o inferiores, y desecación final a unos +30-40°C a alto vacío) , o por atomización, sometiéndose a continuación a una etapa de calentamiento térmico efectiva para la inactivación de virus sensibles al calor, a alta temperatura 380°C-115°C y un período de exposición de 5 minutos a 100 horas preferentemente, en su envase final sellado y al vacío. El compuesto de fibrinógeno liofilizado destinado para cola adhesiva, una vez inactivado de virus por calor, se disuelve en agua para inyección preferentemente, empleando un volumen tal de disolvente que la concentración de fibrinógeno final no es inferior a los 60 mg/mL, y preferentemente entre 60-80 mg/mL. El contenido de fibrinógeno coagulable con respecto a la proteína total es superior al 70%. Asimismo, la concentración de los excipientes una vez solubilizado el producto deshidratado es: cloruro sódico de 0.1M a 0.4M, citrato sódico de 0.02M a 0.1M, glicina de 0.1M a 0.4M, albúmina humana del 0.5% al 1.5%, y del ácido carboxílico cíclico sustituido (AMCHA) del 2% a 8%, en todos los casos preferentemente, y más preferentemente del 4% al 5% del AMCHA. El tiempo de solubilización del producto en agitación rotacional es inferior a 20 minutos, siendo habitualmente de 2-10 minutos para el producto no sometido a tratamiento térmico y de 2-15 minutos preferentemente una vez calentado a las condiciones preferentes descritas con anterioridad. La temperatura a la cual se procede a la disolución del liofilizado puede ser la ambiental (22°C aproximadamente) o superior sin que se sobrepasen los 40°C. Preferentemente se disuelve el sólido seco con agua a 35-37°C de temperatura, imprimiendo al envase (vial) que contiene la suspensión del producto, una agitación moderada y constante, la cual puede ser proporcionada por cualquier medio, sea manual o mecánico (por rotación), hasta disolución total. La solución obtenida es transparente e incolora o con tonos ligeramente amarillentos . La adición de un activador (trombina) al compuesto de fibrinógeno adhesivo de la invención promueve una activación rápida con la formación de un coágulo de fibrina, resistente y estable, biológicamente compatible y adsorbible, susceptible de uso como pegamento de tejidos con las indicaciones clínicas características de este tipo de preparados. A continuación se índica el procedimiento objeto de la presente invención mediante un diagrama esquemático.

COMPLEJO PROTEICO DE FIBRINOGENO Formulacipn (albúmina, glicina, cloruro y citrato sódico) +AMCHA Esterilización (0.2 mieras) Congelación y secado Tratamiento térmico (5 min a 100 horas a >80-115°C) EJEMPLOS Ejemplo 1 Un lote de proceso (n° 7006) de obtención de fibrinógeno (complejo proteico) , purificado por precipitación con glicina se procesó hasta producto final liofilizado, para su posible aplicación tópica como cola biológica . Se partió de 474 g de precipitado de fibrinógeno con glicina suspendiéndose en 1422 g de la solución para solubilización. Estos 1422 g de solución para solubilización del precipitado contenían 10.69 g de cloruro sódico, 8.36 g de citrato trisódico dihidratado y 45.504 g de sacarosa. El precipitado se mantuvo en agitación durante no menos de 45 minutos, y a la temperatura de unos 30°C. Después de reajustar el pH de la suspensión a 6.6 con ácido acético 1 molar, se procedió a la centrifugación de la suspensión en una centrífuga de vasos marca Sorvall modelo RC-3 a una velocidad de 4000 rpm y a una temperatura de unos 23°C. El peso de precipitado obtenido fue de 11.6 g. El sobrenadante de centrifugación tenía una turbidez de 106 NTU y una densidad óptica a 280 nm de 49.9 UA. A continuación se clarificó el sobrenadante anterior al filtrar por CP-20 (de-la marca Míllipore) obteniéndose 1730 g de filtrado cuya densidad óptica a 280 nm era de 49.6 UA y su turbidez de 103 NTU. Seguidamente se efectuó la diafiltración por un equipo de ultrafiltración con 3 cassettes de 100 kDa de corte molecular nominal y de 15 ft2 de superficie total, construidos con polietersulfona de baja capacidad para la adsorción proteica (serie Omega de la marca Pall-Filtron) . Las condiciones de ultrafiltración fueron las habituales para este tipo de operaciones, siendo la presión de alimentación de entre 1.0 y 1.4 bar y el retenido inferior a 0.5 bar. El caudal de filtrado a unos 23°C era de 150 ml/minuto aproximadamente al inicio de la operación. La solución se diafiltró por adición de fracciones empleándose hasta 6 volúmenes de solución de diálisis, mediante la técnica de adición y reducción de volumen. La solución de diálisis se hallaba compuesta por cloruro sódico 0.124 molar y citrato sódico 0.02 molar, a un pH de 6.5-6.7 Al final la solución del producto se llevó a una concentración tal que su densida*d óptica a 280 nm era de' 62.6 UA. A una parte de la solución final concentrada se añadieron diferentes concentraciones de arginina hasta 1%, 2% y 3%. A unos 240 ml de la solución se añadió 3.0 ml de albúmina terapéutica concentrada al 20%. Esta última solución estabilizada con albúmina se dividió en 2 partes, añadiéndose a una de ellas glicina hasta 0.1 molar. A las 2 anteriores soluciones se añadieron diferentes concentraciones de AMCHA para llevar a 0%, 1% y 2% final. Cada una de las soluciones de diferente composición se esterilizó por filtración con membrana de PVDF (marca Durapore) de 0.22 mieras de poro en discos de 47 mm de diámetro. Se dosificaron a viales de volumen nominal de 10 ml . Se congelaron los viales en un compartimento a -70°C aproximadamente, y luego se liofilizaron a alto vacío, realizándose la desecación final a 37°C aproximadamente, durante no menos de 24 horas . Los viales liofilizados se resolubilizaron con 5 ml de agua para inyección a la temperatura de 35-37°C, obteniéndose en todos los casos una concentración de fibrinógeno superior a 60 mg/ml, reflejándose en los tiempos de disolución del liofilizado en la tabla 1.

Tabla 1 Composición de los preparados Nota: Todas las composiciones contenían además cloruro ?.5 sódico 0.124 molar y citrato sódico 0.02 molar, a pH 6.5-6.7. Las formuladas con AMCHA contenían albúmina hasta un 0.5%. De acuerdo a los tiempos de solubilización de los productos liofilizados con agua (5 ml) a 35-37°C destaca el ¿o grupo que incorpora el AMCHA en su composición.

Concentraciones de AMCHA alrededor del 2% dan lugar a tiempos de solubilización de 4 minutos, si en la fórmula también se halla la glicina 0.1 molar, en adición a cloruro sódicc -citrato sódico-albúmina . "5 Los resultados indican que pueden obtenerse tiempos de solubilización sensiblemente inferiores a los 20 minutos con la inclusión de AMCHA y glicina, a la composición básica de cloruro y citrato sódicos y albúmina 0.5%. En ausencia de AMCHA y/o de glicina los valores de dichos tiempos aumentan claramente. Ejemplo 2 Con el propósito de optimizar las condiciones de la composición del producto para la inactivación efectiva por calor de posibles virus eventualmente presentes en el compuesto de fibrinógeno final, se probaron diferentes concentraciones de albúmina en la composición final del producto determinándose las recuperaciones de fibrinógeno y de factor XIII acompañante. El producto purificado que constituye el complejo de fibrinógeno se procesó como en el ejemplo 1. Su composición se ajustó a una concentración final de cloruro-sódico 0.124 molar, citrato sódico 0.02 molar, glicina 0.1 molar y diferentes cantidades de albúmina que dieron lugar a concentraciones del 0.4%, 0.6% y 0.8%. El producto una vez liofilizado, se calentó a 100°C durante 1 hora. El producto anterior y posterior al tratamiento térmico se solubilizó con agua y se caracterizó, cuantificándose la proteína por Bio-Rad, y la actividad coagulable de fibrinógeno y el factor XIII, determinándose también el tiempo de solubilización de dichos materiales. Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 2.

Tabla 2 N.D. : No determinado El tiempo de solubilización fue de 14 a 20 minutos para el producto no calentado, y en todos los casos superior a 20 minutos después de calentar el producto. - Las recuperaciones de fibrinógeno y factor XIII en el producto calentado con respecto a su contenido en etapa previa, corregidos por su contenido en proteína total, se reflejan en la tabla 3.

Tabla 3 Los resultados de las anteriores tablas 2 y 3 reflejan por un lado, una alta concentración de factor XIII en el material final liofilizado, una vez regenerado con agua hasta concentraciones próximas al 5% de fibrinógeno. En todos los casos, la actividad de factor XIII es superior a 40 UI/mL. Por otro lado, en la tabla 3 se recogen los valores de recuperación de actividad, tanto de fibrinógeno como de factor XIII, que se producen por el tratamiento térmico aplicado. De los resultados se deduce que el' fibrinógeno es suficientemente estable a cualquiera de las concentraciones de albúmina de la composición preparada. La actividad del factor XIII se halla ampliamente preservada durante el calentamiento, dentro de las composiciones de concentraciones de albúmina estudiadas, o sea del 0.4% al 0.8%. No obstante, se manifiesta una discreta reducción de la actividad de factor XIII por calentamiento, que se correlacionaría con la disminución de la concentración de albúmina en la composición. Ejemplo 3 Se procesaron diferentes lotes de complejo de fibrinógeno purificado hasta obtener la formulación final deseada, procediéndose luego a la liofilización y solubilización del producto final. El peso de material de partida tomado de cada uno de los tres lotes de complejo de fibrinógeno purificado (n° 7006, 7007 y 7008) fue aproximadamente igual, siendo de unos 50O g en todos los casos, los cuales se procesaron como se ha descrito en el ejemplo 1, de forma independiente hasta producto final liofilizado. Se prepararon las diferentes composiciones del producto final que se indican en la tabla 6. Los resultados obtenidos en cuanto al tiempo de disolución del liofilizado, tiempo de formación del coágulo de fibrina en presencia de trombina (solución de unas 100 Ul/ml) , turbidez del liofilizado reconstituido y tiempo de gelificación, se muestran en la tabla 4.

Tabla 4 '*' Determinación única de 1 vial. N.D. = No determinado Nota: (l) La concentración % de AMCHA indicada corresponde a la solución antes de liofilización, siendo el volumen de dosificación y de reconstitución de 10 y 5 ml en cada caso. (2) Para la determinación de los tiempos de formación del coágulo de fibrina ' se utilizaron dos diferentes lotes de preparación de trombina humana, uno aplicado al lote de proceso N° 7006 y el otro para el N° 7008. N.D.: No determinado Los resultados medios de ti mpo de solubilizacióo de los tres lotes de proceso a cada una de las composiciones se resumen en la tabla 5.

Tabla 5 10 Los anteriores resultados indican que la composición del producto con AMCHA redúcele! tiempo de ?0 aolubilización significativamente si la concentración de este solubilizante se halla en el rango de 2% al 3%" La adición del solubilizante también favorece la reducción de la turbidez de la solución reconstituida de forma significativa ya al 1% de concentración (en la solución 5 dosificada), alcanzándose prácticamente el valor mínimo cuando la concentración es del '2.5%, o en adelante. La presencia de AMCHA no disminuye el tiempo de gelificación (negatividad a 24 horas de las muestras en solución) , y en cuanto al tiempo de coagulación con trombina este es discretamente superior en las preparaciones que contienen AMCHA con respecto a su control al 0%. Ejemplo 4 La inactivación vírica por calor y su efecto sobre algunas de las propiedades del producto se refleja en este ejemplo de aplicación. Se partió de los viales liofilizados de los grupos de diferente composición reflejadas en el anterior ejemplo 3, sometiéndose estos viales a un tratamiento térmico eficiente para la inactivación de algunos virus sin envoltura, para lo cual se introdujeron en una estufa de aire a una temperatura tal que los viales en cuestión alcanzaron los 100-102°C en un lapso de tiempo de unos 50 minutos (vial con sonda testigo) , dejándose termostatizados en este rango de temperaturas durante exactamente 1 hora más . Seguidamente se enfriaron en el ambiente hasta alcanzar esta temperatura final. Los resultados obtenidos en cuanto al tiempo de disolución del liofilizado, tiempo de formación del coágulo de fibrina en presencia de trombina (unas 250-500 Ul/mL) , turbidez del liofilizado reconstituido y tiempo de gelifícación, se muestran en la tabla 6..

Tabla 6 Nota : (1) La concentración % de AMCHA indicada corresponde a la solución antes de liofilización, siendo el volumen de dosificación y de reconstitución de 10 y 5 ml en cada caso. (2) Para la determinación de los tiempos de formación i o del coágulo de fibrina se utilizaron -dos diferentes lotes de preparación de trombina humana, uno aplicado al lote de proceso N° 7006 y el otro para el N° 7008. N.D.: No determinado 15 En la tabla 7 se resumen los valores medios del tiempc de solubilización de cada una de las diferentes composiciones del total de lotes preparados.

Tabla 7 Los resultados obtenidos en el producto final acabado después de la inactivación por calor confirman la posibilidad de realizar este tratamiento en fase terminal, o sea cuando el producto se halla formulado y envasado. Las concentraciones necesarias del solubilizante son preferentemente del 2% al 3% (en la solución dosificada), puesto que en este rango de concentraciones no se observan diferencias significativas entre sí, en cuanto a tiempo de solubilización o turbidez del material solubilizado.

Asimismo, de los resultados se. desprende que el calentamiento afectaría de forma poco significativa al tiempo de solubilización, que se prolongaría entre 3-5 minutos con respecto al producto no calentado en las formulaciones con 2% a 3% de AMCHA. El calentamiento parecer ser que favorece la gelificación del compuesto, reduciendo su vida útil en estado líquido, cuando la composición de AMCHA es igual o inferior al 1%. La turbidez del producto no aumenta por causa del calentamiento a las condiciones de proceso descritas .

Claims (6)

Reivindicaciones

1. Utilización del ácido tranexámico para la preparación de una composición de fibrinógeno humano obtenido a partir de plasma humano o mediante métodos de tecnología recombinante o transgénica, con la adición simultánea de albúmina humana, para acortar el tiempo de solubilización al añadir un disolvente fisiológicamente compatible .

2 . Composición de fibrinógeno humano, según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de ácido tranexámico se halla comprendida preferentemente entre 2 y 8% y más preferentemente, entre 4 y 5% una vez-solubilizado el producto y porque la composición está inactivada de virus por acción de calor.

3. Composición de fibrinógeno humano, según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de las proteínas mayoritarias del preparado una vez solubilizado, se hallan entre 0.5% y 1.5% para la albúmina y entre 6% y 8% para el fibrinógeno, y asimismo contiene no menos del 70% de proteína coagulable con respecto a la proteína total.

4. Composición de fibrinógeno humano, según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de glicina en el producto final solubilizado es de entre 0.1M a 0.4M.

5. Composición de fibrinógeno humano, según la reivindicación 1, caracterizada porque la concentración de las sales salina-citrato, una vez solubilizado el producto, son de 0.1M a 0.4M de cloruro sódico y de 0.02M a 0.1M de. citrato sódico.

6. Composición de fibrinógeno humano, según la reivindicación 1, caracterizada porque se efectúa una inactivación de virus por calor a temperatura de 80 °C hasta 115 °C sobre el producto final desecado, con un tiempo de exposición comprendido entre 5 minutos y 100 horas, y la salúbilización en un medio acuoso se realiza en menos de 20 minutos, y preferentemente entre 2 y 15 minutos, a la temperatura preferente de 35 °C a 37 °C.