MXPA00003251A - Metodos y composiciones para inducir citotoxidad especifica para tumor - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a la expresion especifica de secuencias heterólogas, particularmente genes que codifican productos citotoxicos en células tumorales bajo el control que secuencias de trasncripcion regulatorias. Los promotores particularmente preferidos incluyen secuencias regulatorias H19, el promotor IGF-1 y los promotores IGF-2 P3 y P4. la invención ofrece constructos de expresion y métodos para administrar dichos constructos de expresión. Las composiciones y métodos de la invención sonútiles para el tratamiento del cáncer.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INDUCIR CITOTOXIDAD ESPECIFICA PARA TUMOR _ La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud copendiente No. de serie 08/943,608 presentada el día 3 de Octubre de 1997, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN __ La presente invención se encuentra en el ámbito de la biología de células tumorales y en el tratamiento del cáncer. Más específicamente, la invención se refiere a la expresión específica de genes heterólogos particularmente genes que codifican productos cita-tóxicos en células tumorales. 2. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN ___ 2.1 El gen H19 El gen H19 es uno de los pocos genes conocidos impresos en los seres humanos (Hurst et al., 1996, Nature Genetics 12:234-237). Al principio de la embriogénesis, H19 es expresado a partir de ambos alelos cromosomales (DeGroot et al., 1994, Trophoblast 8:285-302). Poco después, el silenciamiento del alelo paterno ocurre, y solamente se transcribe el alelo heredado de la madre. H19 es expresado de manera abundante durante la embriogénesis y fue identificado por vez primera como un gen regulado de manera coordenada con alfa-fetoproteína en el hígado por medio de un locus de acción trans raf (Pachnis et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:5523-5527). Además, H19 ha sido clonado independientemente por varios grupos empleando tamices para aislar genes expresados durante la diferenciación tisular. Por ejemplo, Davis et al., (1987, Cell 51:987-1000) identificaron el homólogo de ratón de H19 en un tamiz para genes activos durante la diferenciación temprana de células C3H10T1/2. Pourier et al. (1991, Development 113:1105-1114) encontraron que el gen H19 de murina fue expresado durante la diferenciación dé células madres y al momento del implante. La transcripción del gen H19 humano fue también descubierta en la diferenciación de cito±rofoblastos a partir de placenta humana (Rachmile itz et al., 1992, Molec. Reprod. Dec. 32:196-202). Mientras ocurre la transcripción de ARN de H19 en varios tejidos embriónicos diferentes durante la vida fetal y durante el desarrollo placental, la expresión de H19 es regulada hacia la baja después del nacer. Niveles relativamente bajos de transcripción de H19 han sido reportados, sin embargo, en músculo e hígado adultos de murina (Brunkow y Tilghman, 1991 Genes & Dev. 5:1092-1101). Se activa también H19 después del nacer en células cancerosas. Ariel et al. (1997, Molec. Pathol. 50:34-44) demostraron la expresión de H19 en varios tumores que surgen de tejidos en los cuales es expresado de manera prenatal. Además, estos autores encontraron ARN de gen H19 en tumores derivados de tejidos neurales, particularmente astrocito a y ganglioneuroblastoma, que no son conocidos por ser asociados con la expresión de H19. Dado el gran conjunto de cánceres que expresan ARN de H19, estos autores especularon que H19 era un ARN oncofetal y propusieron la investigación de gen H19 como marcador tumoral para la neoplasia humana. Tanto los genes de H19 humanos como de murina han sido clonados y secuenciados (Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10:28-36) . La comparación de los genes H19 humanos y de ratón reveló una identidad global de secuencias de nucleótidos del 77%. A pesar de esta conservación de la homología de nucleótidos entre las especies, una identidad de secuencia de aminoácidos deducida muy baja pudo ser predicha a partir de los cuadros de lectura abierta de los dos genes (Id.) . Además, aun cuando el ARN de H19 es transcrito por la ARN polimerasa II, empalmado y poliadenilado, no parece ser trasladado. Al contrario, se ha encontrado el ARN de H19 asociado por el AR? citoplásmido 28S lo que lleva a especular que el ARN de H19 puede funcionar como un componente de ARN de una ribonucleoproteína (Id.). La función fisiológica actual de H19 no se entiende totalmente. H19 puede actuar como un gen letal dominante; una alta expresión ectópica de un transgen de H19 provoca mortalidad en ratones poco después del nacer (Brunkow et al., supra) . Este período letal coincide con el tiempo en el cual la transcripción de H19 se vuelve reprimida. Por otra parte, no se ha observado ningún defecto en ratones heterocigosos o ratones homocigosos que llevan un (unos) alelo (s) noqueado (s) H19 (Leighton et al., 1995, Nature 375:34-39). El hecho de noquear un alelo heredado de la madre no interfiere con la impresión del gen IGF-2 impreso de manera opuesta y genéticamente unido; los ratones resultantes son más grandes al nacer que sus compañeros de camada debido a la expresión prenatal incrementada de IGF-2 (Id.). Puesto que estos dos genes impresos opuestos comparten secuencias de regulación de actuación cis, Leighton y colegas especulan que H19 puede estar involucrado en la impresión del gen IGF-2. Otra función propuesta para el producto de gen H19 es la de un ARN supresor de tumor. Hao et al. (1993, Nature 365:764-767) reportaron que la transfección de dos líneas de células tumorales embrionales, RD y G401, con un constructo de expresión de H19 resultó en el retardo del crecimiento celular, cambios morfológicos así como una tumorigenicidad reducida en ratones desnudos. Dicha actividad de supresor de tumor se ha observado como consistente con la letalidad observada de la expresión ectópica en ratones (Hao et al., supra) así como el tamaño incremento de ratones con alelo H19 materno noqueado (Leighton et al., supra). La propuesta que H19 es un supresor de tumor ha sido controversial, sin embargo. Algunos de los resultados no fueron reproducidos según los reportes y puede existir otro gen supresor de tumor candidato estrechamente relacionado con H19 (Ariel et al., supra) . La función propuesta de H19 como supresor de tumor entra también en conflicto con los datos experimentales en el sentido que H19 es activado en un amplio conjunto de células tumorales (ver, por ejemplo, Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogen 23:169-177). 2.2 Genes de factor de crecimiento de tipo insulina (IGF) _ IGF-2 es otro gen impreso cuya expresión depende de su origen parental. Sin embargo, en contraste con H19, IGF-2 en ratones y en seres humanos es impreso maternalmente y por consiguiente expresado a partir del alelo heredado paternalmente (Rainier et al., 1993, Nature 363:747-749). El gen IGF-2 humano presenta un patrón de transcripción completo. Existen cuatro promotores de IGF-2 que son activados en un tejido y de manera específica según el desarrollo. Solamente tres de los promotores, P2, P3 y P4 están impresos y activos durante el desarrollo fetal y en tejidos cancerosos. El cuarto promotor, el promotor Pl, no está impreso y es activado solamente en hígado adulto y plexo coroides (ver Holthuizen et al., 1993, Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). El promotor P3 del gen IGF-2 ha sido implicado en el avance de la cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular (Kim y Park, 1998, J. Korean Med. Sci. 13:171-178) .

La pérdida de impresión de IGF-2 ha sido implicada en el tumor de Wilm (Ogawa et al., 1993, Nature 363:749-751). Esta observación llevó a muchos investigadores a especular que la pérdida de impresión y expresión bialélica de genes impresos puede estar involucrada en trastornos del crecimiento y en el desarrollo de cáncer (ver también Rainier et al., 1993, Nature 362:747-749, y Glassman et al., 1996. Cáncer Genet. Cytogenet. 89:69-73). 2.3 Terapia con genes específicos para tumores Secuencias de regulación provenientes de genes asociados con tumores han sido empleadas para enfocarse selectivamente hacia la expresión de un gen suicida en células derivadas de tumores. Por ejemplo, la expresión de alfa-fetoproteína es inducida en carcinoma hepatocelular. Huber et al. (1991, Proc. Nati. Acad. Sc. USA 88:8039-8043) emplearon secuencias de control del gen de albúmina o del gen de alfa-fetoproteína para enfocarse hacia secuencias de codificación de gen timidinquinasa de varicella-zoster (VZV TK) a células de hepatoma. Las células de hepatoma infectadas in vitro cor- un vector retroviral que contenía uno de estos constructos de expresión expresaron VZV TK y se volvieron sensibles al profármaco normalmente no tóxico 6- etoxipurinarabinonucleósido (araM) . Kaneko et al. (1995, Cáncer Res. 55:5283-5287) construyeron un vector de expresión adenoviral HSV TK bajo el control de las secuencias de control de alfa-fetoproteína. Partículas adenovirales recombinantes que contenían este vector fueron inyectadas directamente en tumores derivados de carcinoma hepatocel-ular generados en ratones desnudos atímicos. Inyecciones intraperitoneales subsecuentes con ganciclovir provocaron la regresión de los tumores derivados de carcinoma hepatocelular . Osaki et al. (1994, Cáncer Res. 54:5258-5261) transfectaron en células de carcinoma pulmonar A549 un constructo de expresión que contenía las secuencias de control para el gen de antígeno carcinoembriónico pulmonar enlazado a la secuencia de codificación para timidinquinasa de virus herpes simplex (HSV TK) . Las células transfectadas fueron sensibles al - ganciclovir. Adicionalmente, el crecimiento tumoral en ratones desnudos a partir de células transfectadas inyectadas subcutáneamente fue inhibido mediante inyecciones intraperitoneales repetidas de ganciclovir. Sin embargo, el gen de antígeno carcinoembriónico ha sido recientemente descrito como expresado en mucosa de colon normal, limitando así la utilidad de estas secuencias de control como regiones de regulación específica tumoral (Osaka et al., supra) . Así, sigue existiendo necesidad del desarrollo de vectores para terapia genética que expresan específicamente productos de genes en células tumorales. 3. COMPENDIO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a métodos y composiciones para inducir la expresión selectiva de genes heterólogos en células tumorales. Particularmente, la invención se refiere a polinucleótidos que comprenden una secuencia transcripcional regulatoria enlazada operativamente a genes heterólogos que resultan en una expresión específica para tumor de los genes heterólogos. Más particularmente, la secuencia de transcripción regulatoria se deriva de un gen impreso genómicamente específicamente expresado en células cancerosas, como por ejemplo H19, y los promotores P3 y P4 de IGF-2, y el gen heterólogo codifica una proteína citotóxica o un producto de gen citostático. En otra modalidad de la invención, el promotor IGF-1 se encuentra enlazado operativamente a un gen heterólogo para resultar en una expresión específica para tumor del gen. Las secuencias regulatorias dirigirán la expresión del gen en varios tipos diferentes de células cancerosas. Tales métodos y composiciones son útiles en el tratamiento de una amplia variedad de cánceres y condiciones hiperproliferativas . Un aspecto de la presente invención se refiere a vectores de expresión que contienen polinucleótidos que comprenden estas regiones r'égulatorias operativamente enlazadas a genes heterólogos. Regiones regulatorias particularmente preferidas son las regiones que codifican regiones regulatorias de H19 como por ejemplo secuencias de promotor y realzador, el promotor P3 o P4 de IGF-2 o bien un promotor de IGF-1. En cuanto a este aspecto, las porciones de realzador y activas de H19 pueden emplearse en cualquier combinación con promotor de H19, promotor de IGF-1, promotor P3 de IGF-2, o bien promotor P4 de IGF-2. Esta invención abarca también células huéspedes que contienen tales vectores. En cuanto a este aspecto, un constructo de expresión que contiene un gen heterólogo controlado por promotor de H19 con o sin incrementador H19 puede ser cointroducido en una célula con un segundo constructo que contiene un gen heterólogo controlado por el promotor de IGF-1 o bien promotor P3 o ?4 de IGF-2, en combinación con el incrementador de H19. En otro aspecto, la invención ofrece métodos para emplear tales vectores para expresar genes heterólogos en células • tumorales. Otro aspecto de la presente invención es el tratamiento de cáncer empleando los vectores de la invención en terapia genética. 4. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figuras 1A-1C. La secuencia de nucleótidos de región de promotor de H19 humano. La región de promotor desde la posición de nucleótidos -837 hasta - 7 (con relación al inicio de la transcripción se muestra en SEQ ID NO:l. Figura 2. Diagrama esquemático de los vectores empleados para expresar un gen heterólogo bajo el control de secuencias regulatorias de H19.

Figuras 3A-3E. Expresión directa de secuencias regulatorias de H19 de un gen heterólogo (CAT) en líneas de células de cáncer de la vejiga. Para las cinco líneas de células diferentes indicadas, la actividad específica de CAT (cpm/"?g proteína) se gráfica como una función del vector empleado para la transfección. La figura 3A: células HT-1376. Figura 3B: células EJ28. Figura 3C: células T24P. Figura 3D: células 1197. Figura 3E : células UM-UC-3. Los vectores, como se presenta a continuación, se describen más ampliamente más adelante en la sección 6: (1) pCAT-básico; (2) pCAT de control; (3) pH19E; (4) pH19EH19D; y (5) pH19EH19R. Figuras 4A-4E. La expresión directa de promotoress*~EP3 y P4 de IGF-2 de un gen heterólogo (luciferaza) en líneas de células de cáncer de vejiga. Para las cinco líneas de células diferentes ilustradas, la actividad específica luciferaza (conteos por "?g de proteína) se gráfica en función del promotor de IGF-2 empleado en el constructo transfectado para dirigir la expresión de luciferasa. Figura 4A: células T24P. Figura 4B: células 1376. Figura 4C: células UM-UC3. Figura 4D: 1197 células. Figura 4E: células EJ28. Los vectores se describen con mayor amplitud a continuación en la sección 10. Figura 5. Secuencia de nucleótidos de fragmento de promotor de H19 humano (SEQ ID NO: 2) . Figura 6. Secuencia de nucleótidos del fragmento de incrementador H19 de 0.9 kb (SEQ ID NO:3).

Figuras 7A y 7B. Secuencia de nucleótidos del fragmento de realzador de H19 de 2 kb (SEQ ID NO: 4) . Figuras 8A-8C. Secuencia de nucleótidos del fragmento de realzador de H19 de 4 kb (SEQ ID NO: 5) . Figuras 9A-9. Transfección con vectores que contienen varias regiones regulatorias de H19 y combinaciones de promotores P4 dirigen la expresión de luciferasa en células tumorales.

Figura 9A: 5637 células. Figura 9B : células Hu 7. Figura 9C: células 293T. Figuras 10A-10E. Transfección con vectores que contienen regiones regulatorias de H19 dirigen la expresión de luciferasa en células tumorales. Figura 10A: células 293T.

Figura 10B: células T24P. Figura 10C: células Huh7. Figura 10D: 5637 células. Figura 10E: células RT112. 5. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La invención se basa, en parte, en el descubrimiento que las regiones regulatorias a partir de genes impresos genómicamente que son expresadas en células de cáncer pueden emplearse para dirigir la expresión de secuencias de codificación de interés en células cancerosas. Particularmente, se encontró que la expresión de H19 es activada en un amplio conjunto de carcinomas, incluyendo, sin limitarse a estos, carcinoma de la vejiga, carcinoma hepatocelular, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de los ovarios, carcinoma cervical, carcinoma pulmonar, carcinoma de mama, carcinoma de células escamosas en cabeza y cuello, carcinoma esofágico, carcinoma de la tiroide, astrocitoma, ganglioblastoma y neuroblastoma. Además, se ha descubierto que constructos que contienen las regiones de promotor de H19 enlazadas operativamente con un gen heterólogo, o bien promotores P3 o P4 de IGF-2 enlazados operativamente a un gen heterólogo, o bien constructos que contienen un promotor de este tipo en combinación con un incrementador de H19 corriente abajo, se activan específicamente en células tumorales. En otro aspecto de la invención, un promotor de IGF-1 se emplea para enfocar la expresión del gen heterólogo. Por consiguiente, en uno de estos aspectos, la invención ofrece métodos y composiciones para alterar el f-enotipo de células cancerosas o bien para matar selectivamente células cancerosas. Este objeto se logra mediante el suministro a las células de un polinucleótido que comprende las regiones regulatorias provenientes de genes impresos genómicamente expresados en células de cáncer unidas operativamente con un gen heterólogo. El gen heterólogo puede codificar, por ejemplo, un agente citostático o citotóxico (por ejemplo, una toxina, un ARN de antisentido, o ribozima) . Regiones regulatorias de genes genómicamente impresos que son expresados en células cancerosas incluyen, sin limitarse a ellos, promotor y realzador de H19, y el promotor P3 y el promotor P4 de IGF-2. Para los propósitos de la invención descrita aquí, el término "enlazada operativamente" indica que una secuencia de nucleótidos se encuentra enlazada a una frecuencia regulatoria de una manera que permite la dirección de la expresión de la secuencia de nucleótidos por la secuencia regulatoria. Una secuencia genética "heteróloga" se refiere para los propósitos de la presente invención, a una secuencia de gen no normalmente enlazada operativamente a las secuencias regulatorias del gen H19. Generalmente, secuencias genéticas heterólogas incluyen secuencias que codifican productos genéticos citostáticos y citotóxicos. Como se emplea aquí, el término "expresión" se refiere a la transcripción del AD N de interés, y al empalme, procesamiento, estabilidad y opcionalmente translación del transcripto de mARN correspondiente. Según la estructura de la molécula de ADN suministrada, la expresión puede ser transiente o continua. 5.1 Secuencias regulatorias del gen de H19, los promotores P3 y P4 de IGF-2, y el promotor de IGF-1 Aquí se describen secuencias regulatorias de H19 que pueden emplearse para dirigir la expresión específica de células tumoral de una secuencia de codificación heteróloga. Estas . secuencias regulatorias de H19 incluyen la región de promotor de H19 corriente arriba y/o la región de incrementador de H19 corriente abajo. La secuencia de nucleótidos de una región de promotor de H19 se ilustra en las figuras 1A-1C (SEQ ID N0:1) . Esta secuencia de 830 nucleótidos se extiende desde los nucleótidos -837 a -7 a partir del sitio de tapa (de conformidad con lo descrito en Brannan et al., supra) . Una secuencia TATA de consenso ocurre en los nucleótidos -27 a - 35. Dos sitios de enlace de AP2 de consenso (8/9 correspondencias) ocurren aproximadamente en los nucleótidos -500 y -40 corriente arriba a partir del inicio de la transcripción. Cuando se coloca corriente arriba de la región de codificación para un gen heterólogo, de conformidad con lo comentado con mayores detalles a continuación, aproximadamente 830 pares de bases de la región regulatoria son suficientes para la expresión directa del gen heterólogo enlazado operativamente en células cancerosas que expresan también H19 endógeno. Además, otra región de promotor de H19 entre los nucleótidos -819 y +14 (figura 5, SEQ ID NO: 2) es también suficiente para dirigir la expresión del gen heterólogo enlazado operativamente en células cancerosas . La región de realzador corriente abajo del gen de H19 humano puede agregarse opcionalmente a un constructo de promotor de H19/gen heterólogo con el objeto de proporcionar niveles incrementados de expresión específicas para células tumorales. De conformidad con lo descrito con mayores detalles a continuación y según lo ilustrado a título ejemplar en la sección 6, la región de incrementador corriente abajo se encuentra abarcada en un fragmento de restricción Sacl que se extiende de +6kb a +11 kb con relación al sitio de inicio de la transcripción. Como se espera de una secuencia de incrementador, el incrementador corriente abajo puede ejercer su efecto cuando se coloca ya sea en orientación reversa o en orientación directa (con relación a la orientación del incrementador de H19 del gen de H19 endógeno) corriente debajo de la región de codificación de un gen heterólogo bajo el control del promotor H19. Además, fragmentos de este incrementador que contienen las secuencias ilustradas en las figuras 6, 7A, 7B y 8A-8C (SEQ ID NOS: 3-5) pueden también emplearse para facilitar la expresión de genes. La expresión del gen de IGF-1 ha sido asociada con cáncer de pulmón y cáncer de mama. El promotor de IGF-1 (secuencias de nucleótidos entre los nucleótidos 1 a 1630 en la secuencia de gen IGF-1 humano (número de acceso de Genbank. M12659 M77496 que se incorporan aquí por referencia; Rotwein et al., 1986, J. Biol. Chem. 261:4828-4832). El producto de gen de IFD-2 se expresa empleando una de las cuatro regiones de promotor diferentes, tres de estos cuatro promotores están impresos o bien expresados en tejidos embriónicos; sin embargo, el promotor Pl es activado en tejidos adultos solamente (Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9). El promotor P3 ha sido implicado en hepatocarcinoma. Se ha descubierto también que el promotor P4 impreso (secuencia de nucleótidos -546 a +102 del gen de IGF- 2) y el promotor P3 (secuencia de nucleótidos -1229 a +140 del gen de IGF-2) son activados en células de cáncer de vejiga humano, y pueden emplearse para dirigir la expresión de un gen heterólogo enlazado operativamente sobre las células tumorales. Los promotores P3 y P4 de IGF-2 pueden emplearse en combinación con el incrementador H19 o bien fragmentos activos del mismo. Estas secuencias regulatorias de genes genómicamente impresos y no impresos que son expresados en células cancerosas pueden ser delineadas adicionalmente para definir las secuencias regulatorias mínimas requeridas para obtener la expresión específica para el tumor deseado. Por ejemplo, la región de promotor puede ser alterada mediante adiciones, sustituciones o bien remociones y ensayada para la retención de una función de expresión específica de tumor. Varias porciones del incrementador corriente debajo de H19 pueden ser probadas individualmente para determinar la capacidad de incrementar la transcripción a partir del promotor de H19. Alteraciones en las secuencias regulatorias pueden ser generadas empleando varios métodos químicos y enzimáticos bien conocidos por parte de los expertos en la materia. Por ejemplo, regiones de las secuencias definidas por sitios de restricción pueden ser removidas. Una mutagénesis dirigida por oligonucleótidos puede ser empleada para alterar la secuencia de manera definida y/o para introducir sitios de restricción en regiones específicas dentro de la secuencia.

Además, se pueden generar mutantes de remoción mediante el uso de ADN nucleasas como por ejemplo Bal31 o bien ExoIII y Sl nucleasa. Progresivamente, remociones mayores en las secuencias regulatorias son generadas mediante la incubación de ADN con nucleasas durante períodos crecientes de tiempo (ver Ausubel, et al., 1989 Current Protocols for Molecular Biology, (Protocolos actuales para biología molecular) , para una reseña de técnicas de mutagénesis) . Las secuencias alteradas son evaluadas para determinar su capacidad de dirigir la expresión específica para tumor de secuencias de codificación heterólogas en células huéspedes apropiadas, particularmente células derivadas de carcinoma que expresan H19 (por ejemplo, células de carcinoma de vejiga, solamente a título de ejemplo). Dentro del alcance de la presente invención se encuentran secuencias regulatorias alteradas que conservan su capacidad de dirigir la expresión específica para tumor a incorporar en vectores de expresión recombinantes para uso adicional. Una amplia variedad de genes heterólogos puede ser empleada bajo el control de estas secuencias regulatorias como por ejemplo genes que codifican productos genéticos tóxicos, productos genéticos potencialmente tóxicos, así como productos genéticos citostáticos o antiproliferación. Genes marcadores pueden también ser expresados incluyendo enzimas (por ejemplo, CAT, beta-galactosidasa, luciferasa), proteínas fluorescentes tales como proteína fluorescente verde o bien marcadores antigenéticos. Productos genéticos citotóxicos se definen ampliamente para incluir tanto toxinas como agentes que inducen la apóptosis. Además, para los propósitos de la invención, productos genéticos citotóxicos incluyen enzimas que metabolizan fármacos que convierten un profármaco en un producto citotóxico. Ejemplos de productos genéticos citotóxicos que pueden emplearse en métodos de la invención comprende toxina de difteria, toxina de pseudomonas, ricina, toxina de cólera, PE40 y genes supresores de tumor tales como, el gen de retinoblastoma y p53. Además, secuencias que codifican péptidos apoptóticos que inducen la apóptosis celular pueden emplearse. Tales péptidos apoptóticos incluyen el betapéptido A de Alzheimer (ver LaFerla et al., 1995, Nat. Genet. 9:21-30), el péptido natriurético atrial (ver Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (ver Sakuta et al. 1996, J. Neuroimmunol . 67:103-109), así como otros péptidos apoptóticos conocidos o por descubrir.

Enzimas que metabolizan fármacos que convierten un profármaco en un producto citotóxico incluyen timidinquinasa (del virus de herpes simplex o bien varicella zoster) , citosindesaminasa, nitroreductasa, citocroma p-450 2B1, timidinfosforilasa, fosforilasa de nucleósido de purina, fosfatasa alcalina, carboxipeptidasas A y G2, linamarasa, ?lactamasa y xantinoxidasa (ver Rigg y Sikora, Agosto de 1997, Mol. Med. Today, páginas 359-366 para antecedentes).

Además, oligonucleótidos aptaméricos, de antígeno, o antisentido pueden ser administrados a células cancerosas empleando los constructos de expresión descritos en la presente invención. Ribozimas o bien ARN de hebra única pueden también ser expresados en la célula cancerosa para inhibir la expresión de un gen de interés particular. Los genes blanco para estas moléculas de antisentido o ribozima deben ser los que codifican productos genéticos que son esenciales para el mantenimiento de las células o bien para el mantenimiento del fenotipo de célula cancerosa. Tales genes objetivos incluyen, pero sin limitarse a ellos, cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinDl, cyclinE, cyclinA y cdk4. Por ejemplo, vectores que expresa, bajo el control de secuencias de regulación a partir de genes impresos o bien promotores de IGF-1 que son expresados en células de cáncer, ARNs de antisentido o bien ribozimas específicas para la transcripción de formas oncogénicas de p53, c-fos, c-jun, Kr- ras y/o Her2/neu se introducen en células con el objeto de regular hacia abajo la expresión de los genes endógenos. Células tumorales que expresan H19 y pueden activar las secuencias regulatorias de H19 (o bien que activan específicamente el promotor IGF-1, los promotores P3 o P4 de IGF-2) pueden ser enfocadas específicamente para expresión de ARN de antisentido o bien AR? de ribozima. Enfoques de antisentido incluyen el diseño de oligonucleótidos (en este caso, mAR?) que son complementarios con el mARN blanco. Los oligonucleótidos de antisentido se enlazarán sobre los transcriptos de mARN blanco complementarios y evitarán su translación. Una complementaridad absoluta, si bien se prefiere, no se requiere. Una secuencia "complementaria" de una parte de un ARN, como se conoce aquí, indica una secuencia que tiene una complementaridad suficiente para poder hibridarse con el AR?, formando un dúplex estable. La capacidad de hibridación dependerá tanto del grado de complementaridad como de la longitud del ácido nucleico de antisentido. En general, entre más largo el ácido nucleico de hibridación, mayor número de falta de correlación de bases con un AR? puede contener y seguir formando un dúplex estable (o bien triplex, según el caso) . Un experto en la materia puede determinar un grado tolerable de falta de correspondencia mediante el uso de procedimientos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado. Oligonucleótidos que son complementarios al extremo 5' del mensaje blanco, por ejemplo, la secuencia 5' no trasladada hasta el codón de iniciación AUG e incluyéndolo, deben funcionar más eficientemente para inhibir la translación. Sin embargo, se ha mostrado recientemente que secuencias complementarias de las secuencias sin trasladar 3' de mARNs son efectivas para inhibir la translación de mARNs también. Ver, generalmente, Wagner, R., 1994, ?ature 372:333-335. Así, oligonucleótidos complementarios ya sea de las regiones no codificadoras no trasladadas 5' o 3 ' de los transcriptos genéticos blanco podrían emplearse en un enfoque de antísentido para inhibir la translación de genes endógenos. Oligonucleótidos complementarios de la región no trasladada 5 ' de mAR? deberían incluir el complemento del codón inicial AUG. Oligonucleótidos de antisentido complementarios de las regiones de codificación de mARN son menos eficientes para inhibir la translación pero podrían emplearse de conformidad con la presente invención. Que se diseñen para hibridarse con el extremo 5', 3' o con la región de codificación del mAR? blanco, los ácidos nucleicos de antisentido deben tener una longitud de al menos seis nucleótidos, y son de preferencia oligonucleótidos que se indican dentro de un rango de 6 a aproximadamente 50 nucleótidos de longitud. En aspectos específicos, el oligonucleótido es de al menos 10 nucleótidos, al menos 17 nucleótidos, al menos 25 nucleótidos o bien al menos 50 nucleótidos. Independientemente de la elección de la secuencia blanco, se prefiere que estudios in vitro se realicen primero para facilitar la capacidad del oligonucleótido de antisentido para inhibir la expresión de gen. Estos estudios deben emplear controles que distinguen entre la inhibición del gen de antisentido y los efectos biológicos no específicos de oligonucleótidos. Se prefiere también que estos estudios comparen los niveles del ARN blanco o proteína con los niveles de un ARN de control interno o proteína. Moléculas de ribozima diseñadas para disociar catalíticamente un gen blanco esencial pueden también emplearse para evitar la translación de mARN blanco. (Ver, por ejemplo, Solicitud Internacional PCT WO90/11364, publicada el 4 de Octubre de 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Cuando la ribozima es específica para un transcripto de gen que codifica una proteína esencial para el crecimiento de una célula cancerosa, tales ribozimas pueden provocar la inversión de un fenotipo de célula cancerosa. Mientras las ribozimas que disocian mARN en secuencias de reconocimiento específicas para sitio pueden emplearse para destruir mAR?s blanco, el uso de ribozimas de cabeza de martillo se prefiere. Las ribozimas de cabeza de martillo disocian los mAR? en ubicaciones indicadas por regiones de flanco que forman pares de bases complementarios con el mARN blanco. El único requerimiento es que el mAR? blanco tenga la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG3'. La construcción y producción de ribozimas de cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y se describe más ampliamente en Haseloff y Gerlach, 1988, ?ature, 334:585-591). De preferencia, la ribozima es manipulada de tal manera que el sitip de reconocimiento de disociación se localice cerca del extremo 5' del mARN blanco; es decir, para incrementar la eficiencia y minimizar la acumulación intracelular de transcriptos de mAR? no funcionales. Ribozimas para su uso en la presente invención incluyen también AR? endoribonucleasas (a continuación "ribozimas de tipo Cedí") tales como la que ocurre naturalmente en tetraimenatermofila (que se conoce como IVS, o bien L-19 IVS ARN) , y que ha sido extensivamente descrita por Thomas Cech y colaboradores (Zaug et al., 1984, Science, 224:574-578; Zaug y Cech, 1986, Science, 231:470-475; Zaug et al., 1986, ?ature, 324:429-433; Solicitud de Patente Internacional publicada no. WO 88/04300 por University Patents Inc.; Been y Cech, 1986, Cell, 47:207-216). Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que se hibrida con una secuencia de ARN blanco después de lo cual se lleva a cabo la disociación del ARN blanco. La invención contempla el uso de las ribozimas de tipo Cech que enfocan secuencias de sitio activo de ocho pares de bases presentes en genes blanco. 5.2 Activación de genes en células tumorales _ Las células que reactivan la expresión de gen impreso pueden también activar específicamente la expresión de constructos que contienen dichas regiones regulatorias de gen impresas enlazadas operativamente sobre un gen heterólogo. Tales células, particularmente células tumorales, son blancos apropiados para los métodos de terapia genética de la presente invención. La expresión específica de H19, y P3 y P4 de IGF-2 en tumores y líneas celulares puede ser determinada empleando las técnicas de análisis de ARN, hibridación in situ y constructos de gen reportero. Además, células tumorales con una expresión activada de gen de IGF-1 pueden ser determinadas similarmente y enfocadas en una terapia genética empleando el promotor de IGF-1 para dirigir la expresión de un gen heterólogo. Para la mayoría de las aplicaciones de análisis de AR?, una sonda marcada que se hibrida específicamente con el transcripto de gen de interés se prepara mediante el uso de cualquier técnica bien conocida . la sonda marcada puede contener al menos 15-30 bases complementarias de la secuencia de nucleótidos de H19, y con mayor preferencia contiene al menos de 50 a 150 bases complementarias del transcripto de H19. Una sonda de hibridación particularmente preferida para la expresión H19 es un polinucleótido complementario del extremo 3' del mensaje de H19 de aproximadamente 800 pares de bases corriente arriba del sitio poli A hasta el sitio poli A. En una modalidad específica de la invención ilustrada a continuación a título de ejemplo, una sonda de ARN de antisentido marcada es generada in vitro empleando un plásmido de expresión T7 o T3. Las sondas H19 pueden también ser marcadas por impresión aleatoria en presencia de nucleótido marcado, por ejemplo, empleando el conjunto de elementos Prime-It (Stratagene, La Jolla, CA; No. de catálogo 300392) . Alternativamente, sondas marcadas pueden ser generadas en una reacción en cadena de polimerasa empleando un clon de cADN de la región de codificación de H19 e iniciadores diseñados para amplificar una región de la región de codificación, o bien a través de una reacción de translación de corte estándar. Marcadores apropiados para sondas de polinucleótidos incluyen nucleótidos que incorporan isótopos radioactivos (como por ejemplo 35S y 32P) , marcadores fluorescentes, luminiscentes y de color, así como porciones enzimáticas. La sonda marcada es hibridada in situ con una célula o muestra tisular empleando técnicas estándares tales como las descritas a continuación en el ejemplo de trabajo, y en la solicitud de patente Norteamericana copendiente No. de Serie 08/704,786, que se incorpora aquí por referencia. Alternativamente, si se puede obtener una cantidad suficiente de células apropiadas, un análisis de APN estándar (como por ejemplo análisis Northern, protección de RNasa o bien extensión de iniciador) puede llevarse a cabo para determinar el nivel de expresión de mARN del gen de interés. Además, es posible llevar a cabo dichos ensayos de expresión de genes "in situ", es decir, directamente en secciones de te ido (fijas y/o congeladas) de tejido de paciente que se obtiene de biopsias o bien resecciones, de tal manera que no se requiere de purificación de ácido nucleico. Los reactivos de ácido nucleico tales como los descritos arriba pueden emplearse como sondas y/o iniciadores para dichos procedimientos in situ (ver, por ejemplo, ?uovo, G.J. 1992, "PCR In Situ Hybridization: Protocols And Applications", (Hibridación' in situ por reacción en cadena de polimerasa: protocolos y aplicaciones) , Raven Press, ?Y) . Un método alternativo para determinar si un tipo de célula o tumor podrá activar específicamente constructos de expresión que contienen las regiones regulatorias particulares enlazadas operativamente a un gen heterólogo es transceptar realmente dichos constructos de expresión en la célula. Para estos propósitos, el gen heterólogo es de preferencia un producto de gen marcador. Un resultado positivo en un ensayo para el proceso de gen de marcador indica que la célula o la línea celular es capaz de activar la expresión a partir de las regiones regulatorias. Empleando estas técnicas, tipos de tumor --ejemplares con expresión de H19 activada son los siguientes: A. Tumores sólidos pediátricos 1. tumor de Wil 2. hepatoblastoma 3. rabdomiosarcoma embrional B. Tumores de células germinales y tumores trofoblásticos 1. tumores de células germinales testiculares 2. teratoma inmadura de ovario 3. tumor sacrococcígeo 4. coriocarcinoma 5. tumores trofoblásticos de sitio placental C. Tumores epiteliales de adultos 1. carcinoma de la vejiga 2. carcinoma hepatocelular 3. carcinoma de ovarios 4. carcinoma cervical 5. carcinoma pulmonar 6. carcinoma de mama 7. carcinoma de células escamosas en cabeza y cuello 8. carcinoma esofágico 9. carcinoma de la tiroide D. Tumores neurogénicos 1. astrocitoma 2. ganglioblastoma 3. neuroblastoma Por consiguiente, los cánceres interiores son tratables a través de los métodos de la presente invención. De hecho, cualquier tumor que active la expresión H19 puede ser tratado por los métodos de la invención. Además, las técnicas antes mencionadas pueden aplicarse para determinar tumores que activan los promotores de IGF-1, y los promotores P3 y P4 de IGF-2. Tales tumores pueden ser tratados también por los métodos de la invención. Por ejemplo, IGF-2 es activado en tumores de la niñez, como por ejemplo tumores de Wilm, rabdomiosarcomas, neuroblastomas y hepatoblastomas . 5.3 Métodos para introducir polinucleótidos bajo el control de secuencias regulatorias en células huéspedes La invención pertenece también a una célula huésped transfectada con polinucleótidos que contienen regiones regulatorias enlazadas operativamente a un gen heterólogo. Tales células huéspedes pueden ser mantenidas en cultivo o bien pueden formar parte de un animal, de preferencia un mamífero. Polinucleótidos de interés se insertan típicamente en cualesquiera de un amplio rango de vectores subsecuentemente administrados mediante el uso de los métodos y materiales presentados en el presente documento. Tales vectores pueden ser producidos empleando técnicas de biología molecular bien establecidas (ver generalmente, Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, y Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons, todos los volúmenes y actualizaciones periódicas de los mismos, que se incorporan aquí por referencia) . Típicamente, cuando se desea una translación, los genes heterólogos de interés serán también manipulados para que contengan una secuencia de poliadenilación 3' adecuada, en caso necesario. 5.3.1 Células cultivadas Células huéspedes transfectadas con polinucleótidos que contienen las regiones regulatorias de un gen impreso operativamente enlazadas con un gen heterólogo pueden ser cualquier célula procariótica o eucariótica. El enlace del polinucleótido en un constructo de gen como por ejemplo un vector, y la transformación o transfección en células huéspedes ya sea eucarióticas (levadura, aves, insecto o mamífero) o bien procariótica (células bacterianas) son procedimientos estándares empleados ampliamente en las tecnologías de cultivo de tejido o microbianas. Vectores adecuados para el cultivo de los polinucleótidos objetos de la presente invención en células bacterianas, tales como E. Coli, incluyendo plásmidos de los tipos: plásmidos derivados de pBR322, plásmidos derivados de pEMBL, plásmidos derivados de pEX, plásmidos derivados de pBTac, y plásmidos derivados de pUC. Para la replicación en levadura, los plásmidos YEP 24, YIP5, YEP51, pYES2 e YRP17 son vehículos de clonación y expresión útiles en la introducción de constructos genéticos en S. cerevisiae (ver, por ejemplo, Broach et al., 1993, en Experimental Manipulation of Gene Expresión (Manipulación experimental de expresión genética) , ed. M. Inouye, Academic Press, página 83) . Estos vectores pueden replicarse tanto en E. Coli debido a la presencia de pBR322 ori, como en levadura debido a la replicación detepninante del plásmido de círculo de levadura 2 ^m. Además, marcadores resistentes a los fármacos como por ejemplo ampicilina pueden emplearse. De manera similar, vectores de mamíferos preferidos para los polinucleótidos de la presente invención contienen ambas secuencias procarióticas para facilitar la propagación del vector en bacterias. Tales vectores, cuando están transfectados en células de mamíferos, pueden ser diseñados para integrarse en el cromosoma de mamífero para estabilidad de largo plazo mediante el uso de un gen marcador seleccionable enlazado. Alternativamente, derivados de virus tales como virus de papilomavirus bovino (BPV-1) o bien Epstein-Barr pueden emplearse para expresión transiente. Los varios métodos empleados en la preparación de transformación de plásmido de organismos huéspedes son bien conocidos en la técnica. Para otros sistemas de vectores adecuados, así como para procedimientos recombinantes generales, véase, Sambrook et al., supra. 5.3.2 Terapia genética La invención abarca también el uso de polinucleótidos que contienen una región regulatoria de genes operativamente enlazada con un gen heterólogo para su uso en una terapia genética para tratar cáncer así como enfermedades hiperproliferativas . En el caso de la terapia genética, constructos de expresión de la presente invención pueden ser administrados en cualquier vehículo biológicamente efectivo, por ejemplo, cualquier formulación o composición capaz de suministrar efectivamente el gen recombinante a células in vivo. Enfoques incluyen la inserción del gen en vectores virales que incluyen retrovirus recombinantes, adenovirus, virus asociados con adeno, así como virus 1 de herpes simplex, o bien plásmidos bacterianos o eucarióticos recombinantes. Vectores virales transfectan células directamente; el ADN de plásmido puede ser administrado c on ayuda, por ejemplo, de polímeros catiónicos, liposomas catiónicos (por ejemplo, lipofectina, derivados de colesterol tales como D.D.A.B. así como fosfolípidos catiónicos) o bien derivados (por ejemplo, anticuerpo conjugado) conjugados de polilisina, gramicidina S, envolturas virales artificiales o bien otros vehículos intracelulares de este tipo, así como inyección directa del constructo de gen desnudo, electroporación o bien precipitación en CaP04 realizada in vivo. Una reseña reciente de sistemas de transferencia de genes y expresión de genes para terapia genética de cáncer se encuentra en Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187 (Seminarios en Oncología) . Se observará que puesto que la transducción de células blanco apropiadas representa un primer paso importante en la terapia genética, la elección del sistema de administración de gen particular dependerá de factores tales como el fehotipo del blanco previsto y la vía de administración, por ejemplo, administración local o sistémica. Además, se reconocerá que el constructo de gen particular proporcionado para la transducción in vivo de constructos de expresión son también útiles para la transducción in vitro de células, como por ejemplo para el uso en los sistemas de cultivo celulares ex vivo descritos arriba. Un enfoque preferido para la introducción in vivo de ácido nucleico en una célula es mediante el uso de un vector viral que contiene ácido nucleico, por ejemplo, un gen citotóxico particular bajo el control de secuencias de regulación de H19. La infección de células con un vector viral tiene Ja ventaja que una gran proporción de las células blanco pueden recibir el ácido nucleico. Además, moléculas codificadas dentro del vector viral, por ejemplo, por un cADN contenido en el vector viral, son expresadas eficientemente en células que han absorbido el ácido nucleico de vector viral. Vectores adecuados que pueden ser administrados empleando los métodos y composiciones de la presente invención incluyen, sin limitarse a ellos, vectores de virus de herpes simplex, vectores de adenovirus, vectores de virus asociados con adeno, vectores retrovirales, virus de pseudorabia, vector de virus de alfa-herpes, y similares. Una reseña completa de vectores virales, particularmente de vectores virales adecuados para la modificación de células no replicantes, y cómo emplea tales vectores en combinación con la expresión de polinucleótidos de interés puede encontrarse en el libro "Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications" (Vectores virales: terapia genética y aplicaciones neurocientíficas) , Ed. Caplitt y Loewy, Academic Press, San Diego (1995) . Se ha mostrado que es posible limita el espectro de infección de virus y por consiguiente los vectores basados en virus, mediante la modificación de la proteína de envoltura viral en la superficie de la partícula viral (ver, por ejemplo, las publicaciones PCT/W093/25234 y WO94/06920) . Por ejemplo, estrategias' para la modificación del espectro de infección de vectores retrovirales incluyen: el acoplamiento de anticuerpos específicos para antígenos de la superficie celular a la proteína de envoltura viral (Roux et al., 1989, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:9079-9083; Julan et al., 1992, J. Gen. Virol. U3 : 3251-3255; y Goud et al., 1983, Virology 163: 251-254); o bien el acoplamiento de ligandos de receptor de superficie celular con proteínas de envoltura viral (Neda et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14143-14146). El acoplamiento puede llevarse a cabo en forma de reticulación química con una proteína o bien otra variedad (por ejemplo, lactosa para convertir la proteína de envoltura en una coproteína de asialogía) , así como mediante la generación de proteínas de fusión (por ejemplo, anticuerpo de cadena única/proteínas de fusión de envoltura). Por ejemplo, células cancerosas pueden ser enfocadas empleando esta técnica por ejemplo, mediante el acoplamiento de anticuerpos contra moléculas asociadas con tumores o bien proteínas de superficie de células cancerosas con la superficie del virus recombinante . Esta técnica, mientras es útil para limitar o bien dirigir de otra forma la infección a ciertos tipos de tejido, puede también emplearse para convertir un vector ectotrópico en un vector amfotrópico. Un sistema de administración genético viral preferido útil en la presente invención emplea vectores derivados de adenovirus. El genoma de un adenovirus puede ser manipulado de tal manera que codifique y exprese un producto de gen de interés pero es desactivado en términos de su capacidad de replicación en un ciclo de vida viral litico normal. Ver, por ejemplo, Berkner et al., 1998, BioTechbiques 6:616; Rosenfeld, et al., 1991, Science 252:431-434; y Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155. Vectores adenovirales adecuados derivados de la cepa de adenovirus de tipo AD 5 dl324 o bien otras cepas de adenovirus (por ejemplo, Ad2, Ad3, Ad7, etc.) son bien conocidas de los expertos en la materia. Adenovirus recombinantes pueden ser provechosos en ciertas circunstancias en la medida en que pueden ser empleados para infectar una amplia variedad de tipos celulares, incluyendo epitelio de las vías respiratorias (Rosenfeld et al., 1992, citado arriba), células endoteliales (Lemarchand et al., 192, Proc. Nati. Acad Sci. USA 89:6482-6486), hepatocitos (Herz y Gerard, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) así como células de músculos (Quantin et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci USA 89:2581-2584) . Además, la partícula viral es relativamente estable, se presta para purificación y concentración, y puede ser modificada para afectar el espectro de capacidad de infección. Además, ADN adenoviral introducida (y ADN foráneo contenido aquí) no está integrado en el genoma de una célula huésped sino que permanece episomal, evitando así los problemas potenciales que ocurren como resultado de mutagénesis por inserción en situaciones e las cuales el ADN introducido se integra en el genoma del huésped (por ejemplo, ADN retroviral) . Además, la capacidad portadora del genoma adenoviral para ADN foráneo es grande (hasta 8 kilobases) con relación a otros vectores de administración de genes (Berkner et al., citado arriba, Haj- Ahmand y Graham, 1986, J. Virol. 57:267). La mayoría de los vectores adenovirales defectuosos para replicación actualmente en uso y por consiguiente preferidos para la presente invención presentan una remoción de la totalidad o de una parte de los genes El y E3 virales pero conversan hasta el 80% del material genético adenoviral (ver, por ejemplo, Jones et al., 1979, Cell 16:683; Berkner et al, supra; y Graham et al. en Methods in Molecular Biology (Métodos en biología molecular), E.J. Murria, Ed. (Humana, Clifton, NJ, 1991), vol. 7, página 109-127). Otro sistema de vector viral útil para administración de uno de los constructos de expresión de la presente invención es el virus asociado con adeno (AAV) . El virus asociado con adeno es un virus defectuoso que ocurre naturalmente que requiere de otro virus, como por ejemplo un adenovirus o bien un virus herpes, como virus auxiliar para una replicación eficiente y un ciclo de vida productivo, (para una reseña ver, Muzyczka et al-, 1992, Curr. Topics in Micro. and Immunol 158:97-129) . Es también uno de los pocos virus que pueden integrar su ADN en células que no se dividen, y presenta una alta frecuencia de interacción estable (ver, por ejemplo, Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:3822-3828; y McLaughlin et al., 1989, J. Virol, 63:1963-1973). Vectores que contienen desde 300 pares de bases de AAV pueden ser empacados y pueden integrarse. El espacio para el ADN exógeno es limitado a aproximadamente 4.5 kb. Un vector de AAV tal como el descrito en Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 puede emplearse para introducir ADN en células. Varios ácidos nucleicos han sido introducidos en diferentes tipos de células empleando vectores AAV (ver, por ejemplo, Hermonat et al., 1984, Proc. Nati. Acad. Sci USA 81:6466- 6470; Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081; Wondisford et al., 1988; Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al., 1984, J. Virol. 51:611-619; y Flotte et al., 1993, J. Biol Chem. 268:3781-3790). Además de métodos de -trasnferencia viral tales como los ilustrados arriba, métodos no virales pueden también emplearse para provocar la expresión dirigida de un gen heterólogo deseado en el tejido de un animal. La mayoría de los métodos no virales de transferencia de genes se basan en mecanismos normales empleados por las células de mamíferos para la absorción y transporte intercelular de macromoléculas. En modalidades preferidas, sistemas no virales _de administración de genes de la presente invención se basan en vías endocítica para la absorción de los constructos de expresión de la presente invención por la célula a la cual van dirigidos. Sistemas de administración de genes ejemplares de este tipo incluyen sistemas derivados liposomales, conjugados de polilisina, asi como envolturas virales artificiales. En entornos clínicos, los sistemas de administración de genes para el constructo de expresión terapéutico pueden ser introducidos en un paciente a través de cualesquiera de varios métodos, cada uno de los cuales es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, una preparación farmacéutica del sistema de administración de genes puede ser introducida sistémicamente, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, y la expresión específica del constructo en las células blanco ocurre predominantemente a partir de la especificidad de la transfección proporcionada por e-xpresión de tipo celular o expresión de tipo tejido debido a las secuencias regulatorias que controlan la expresión del gen heterólogo, o bien las secuencias regulatorias en combinación con el vehículo de administración de gen que se enfoca hacia tipos particulares de células. En otras modalidades, la administración inicial de constructo de expresión recombinante es más limitada con introducción en animales siendo bastante localizada. Por ejemplo, el vehículo de administración de genes- puede ser introducido por catéter (ver Patente Norteamericana 5,328,470) o bien mediante inyección esterotáctica (por ejemplo, Chen et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3054-3057). Un constructo de expresión de la invención puede ser administrado en un constructo de terapia genética mediante electroporación empleando técnicas descritas, por ejemplo, por Dev et al., 1994, Cáncer Treta. Rev. 20:105-115. La preparación farmacéutica del constructo de terapia genética puede consistir esencialmente del sistema de administración de genes en un diluyente aceptable, o bien puede comprender una matriz de liberación lenta en donde se integra el vehículo de administración de genes. Alternativamente, en los casos donde el sistema de administración de genes completo puede ser producido intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede comprender una o varias células que producen el sistema de administración de genes. 5.3.3 Puntos finales terapéuticos y dosificaciones Una persona con ciertos conocimientos en la materia observará que, desde la perspectiva de un médico o bien desde la perspectiva de un paciente, virtualmente cualquier alivio o prevención de un síntoma indeseable asociado con una condición cancerosa (por ejemplo, dolor, sensibilidad, pérdida de peso y similar) será deseable. Además, cualquier reducción de la masa tumoral o de la velocidad de crecimiento es deseable, así como una mejora del cuadro histopatológico del tumor. Así, para los propósitos de esta solicitud, los términos "tratamiento", "uso terapéutico", o bien "uso medicinal" empleados aquí se referirá a todos y cada uno de los usos de las composiciones reclamadas que remedian un estado de enfermedad o síntomas, o bien que previenen, impiden, retrasan o invierten de otra forma el progreso de la enfermedad u otros síntomas indeseables de cualquier manera. Una dosificación efectiva y protocolo de tratamiento pueden ser determinados por medios convencionales, empezando con una dosis baja en animales de laboratorio y después incrementando la dosificación mientras se monitorean los efectos, y variando sistemáticamente el régimen de dosificación también. Estudios con animales, de preferencia estudios con mamíferos, se emplean habitualmente para determinar la dosis máxima tole-able, o bien MTD, de agente bioactivo por kilogramo de peso. Los expertos en la materia extrapolan regularmente dosis para eficacia y para evitar la toxicidad para otras especies, incluyendo los seres humanos. Antes de llevar a cabo estudios con seres humanos de eficacia, se llevan a cabo estudios clínicos de fase I en sujetos normales para ayudar a establecer dosis seguras. Se pueden tomar en cuenta varios factores por parte de un médico cuando se determina una dosificación óptima para un paciente dado. Entre estos factores el primero es la toxicidad y vida media del producto genético heterólogo escogido. Factores adicionales incluyen la estatura del paciente, la edad del paciente, la condición general del paciente, la enfermedad cancerosa particular que se está tratando, la severidad de la enfermedad, la presencia de otros fármacos en el paciente, la actividad in vivo del producto genético, y similares. Las dosificaciones de ensayo deben escogerse después de la consideración de los resultados de estudios con animales y la literatura clínica. Por ejemplo, una dosis humana típica de un vector adenoviral que contiene una región regulatoria de H19 enlazada operativamente a un gen heterólogo que codifica un agente citotóxico como por ejemplo timidinquinasa es de 1 x 107 pfu a 1 x 1010 pfu que se inyectan directamente en la masa tumoral por día. Con mayor preferencia, la dosis diaria de dicho vector adenoviral inyectado directamente en un tumor es de 1 x 108 pfu a 1 x 1010 pfu, según el tamaño del tumor. En el caso de un vector adenoviral que contiene una región regulatoria de H19 operativamente enlazada a un producto genético citotóxico con un nivel diferente de toxicidad, estos valores serían evidentemente alterados de manera correspondiente. Dosis similares de un vector adenoviral que contienen un promotor P4 de IGF-2 operativamente enlazado a un gen heterólogo que codifica un agente citotóxico como por ejemplo timidinquinasa pueden también emplearse como punto inicial sugerido. Particularmente cuando se contempla el uso in vivo, los varios componentes bioquímicos de la presente invención son de preferencia de alta pureza y sustancialmente exentos de contaminantes potencialmente dañinos (por ejemplo, al menos grado de Alimento Nacional (NF) , generalmente al menos grado analítico, y de preferencia al menos grado farmacéutico) . En la medida en que un compuesto dado debe ser sintetizado antes de su uso, dicha síntesis o purificación subsecuente resultará de preferencia en un producto sustancialmente exento de cualquier agente potencialmente tóxico que pueda ser empleado durante los procedimientos de síntesis o purificación . Para su uso en el tratamiento de una condición cancerosa en un paciente, la presente invención ofrece también en uno de sus aspectos un conjunto de elementos o paquete, en forma de un frasco o ampolla llenada estéril que contiene un vector de polinucleótidos que contiene una región regulatoria de H19 operativamente enlazada a un gen heterólogo que codifica un agente citotóxico o una célula de liberación de vector. En una modalidad, el conjunto de elementos contiene un vector de polinucleótidos que contiene una región regulatoria de H19 operativamente enlazada a un gen heterólogo que codifica un agente citotóxico, como una formulación lista para su administración, ya sea en dosis unitaria o bien en dosis múltiples, donde el paquete incorpora una etiqueta que da instrucciones de uso de su contenido para el tratamiento del cáncer. Alternativamente, y de conformidad con otra modalidad de la presente invención, el paquete ofrece un frasco o ampolla llenada estéril que contiene dicha célula de liberación de vector o bien línea celular. Para almacenamiento y transporte, la célula de liberación de vector o bien línea celular debe estar congelada. Opcionalmente, el paquete puede también contener medios y reactivos para cultivar la célula de liberación de vector o línea celular. Se ha- descrito la invención y ahora se ofrecen los siguientes ejemplos para ilustrar dicha invención pero no para limitarla. 6. EJEMPLO: SECUENCIAS REGULATORIAS DE H19 QUE FACILITAN LA EXPRESIÓN DE UN GEN HETERÓLOGO EN LÍNEAS DE CÉLULAS TUMORALES Esta sección describe la construcción de una variedad de constructos de expresión que contienen un gen reportero CAT colocado bajo el control de secuencias regulatorias de H19 y su transferencia en varias líneas de células de cáncer de la vejiga diferentes. 6.1 Materiales y métodos 6.1.1 Líneas celulares y transfecciones __ _ Líneas de células de cáncer de vejiga HT-1376, EJ28, T24P, 1197 y UM-UC-3 fueron obtenidas de la American Type Culture Collection (ATCC) y dichas líneas fueron mantenidas de conformidad con las recomendaciones de la ATCC.

Se llevaron a cabo transfecciones transientes empleando el método de transfección por precipitación de fosfato de calcio. Los precipitantes (que contenía 7 "?g de plásmido) fueron agregados en 1 ml de medios a 0.3 x 106 células en platos de 30 mm. Después de 16 horas, se removieron los medios de transfección y se agregaron medios frescos. Las células fueron cosechadas 24-96 horas después de la transfección y se determinó la actividad CAT empleando el procedimiento de extracción de fase orgánica butiril-CoA (Sambrook et al., 1989). Una alícuota de la fase superior orgánica (100 "21) fue transferida a un pozo de centelleo que contenía 3 ml de un fluido de centelleo y se llevó a cabo el conteo . 6.1.2 Construcción de vectores de expresión plásmidos pCAT-básicos (que contenían un gen reportero CAT precedido por un sitio de clonación múltiple) , promotor pCAT (que contenía el gen reportero CAT bajo el control de un promotor SV40) , incrementador de pCAT (que contenía el incrementador SV40 corriente abajo del gen reportero CAT, y un sitio de clonación múltiple para inserción de un promotor corriente arriba del gen reportero CAT) y control de pCAT (que contenía un gen reportero CAT bajo el control tanto del promotor SV40 como del incrementador) fueron obtenidos todos comercialmente de Promega (Madison, Wl). Para construir el plásmido pH19E, que contenía el gen reportero CAT bajo el control del promotor de H19, la región de promotor de H19 (SEQ ID N0:1) fue primero clonada en pBluescript II SK+ (promega) . Se amplificó un nucleótido que contenía la secuencia de promotor de H19 a partir de ADN de placenta humana empleando iniciadores ESPCR21: CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT (SEQ ID NO: 6) y ESPCR22: CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT (SEQ ID NO: 7). El producto de reacción en cadena de polimerasa fue pulido en extremos con enzima de Klenow y clonado en el sitio EcoRV de pBluescriptIISK+ . El ADN insertado fue verificado mediante digestión con enzimas de corte interno PvuII, EcoRI y Apal . La orientación del promotor fue opuesta a la orientación de la región de codificación lacZ del vector. La región de promotor fue después cortada por disociación con Hindi y PstI, y el fragmento de aproximadamente 0.9 kb resultante fue insertado en los sitios Hindi-PstI de pCAT-básico para producir pH19E. Plásmidos de expresión que contenían la región de incrementador de H19 insertada en ambas orientaciones corriente abajo del promotor de H19/gen reportero CAT fueron construidos de la siguiente manera. Un fragmento Sacl de 5 kb que contenía el incrementador corriente deb'ajo de H19 (de +6.0 kb a +11 kb con relación al inicio de la transcripción de H19) fue clonado en el sitio Sacl de pUC19. Este fragmento de incrementador fue después cortado con EcoRI y Hindi y ligado en los sitios EcoRI-HindIII de pBluescript IISK+ para crear pBhH19En-Sa. pBhH19En-Sa fue parcialmente digerido con BamHl, y el fragmento de 5 kb que contenía el incrementador de -H19 (y un sitio BamHl interno) fue clonado en el sitio BamHl corriente abajo del promotor de H19/gen reportero CAT en pH19E. Plásmidos que contienen el incrementador de H19 tanto en la orientación directa (pH19EH19D) como en la orientación reversa (pH19EH19R) fueron generados. 6.2 Resultados y comentarios Cinco líneas diferentes de células de cáncer de la vejiga HT- - 1376, EJ28, T24P, 1197 y UM-UC-3 fueron transfectadas cada uno con pCAT-básico (indicado P-E en la figura^ 2), pCAT- control (indicado pSV40ESV40 en la figura 2), pH19E, pH19EH19D, y pH19EH19R. Los resultados de la expresión de cada uno de los constructos aparecen en las figuras 3A-3E. En cada línea celular, el nivel más alto de actividad CAT fue observado con el plásnido pCAT-control que contenía tanto el incrementador de SV40 como el promotor de SV40. Este constructo sirvió como control positivo, puesto que las secuencias de regulación de SV40 habían sido establecidas como inductores de la expresión genética. Sin embargo, secuencias regulatorias SV40 no son específicas para células tumorales en su capacidad de inducir la expresión de genes. Líneas celulares transfectadas con pH19E que contienen el gen reportero CAT bajo el control del promotor de H19, presentaron también una expresión significativamente incrementada de CAT en comparación con el fondo . El nivel de inducción de la actividad CAT por el promotor de H19 se ubicó dentro de un rango de cinco veces en la línea celular HT-1376 a diez veces en la línea celular UM-UC-3. La adición del incrementador de H19 a los constructos de promotor de H19/gen reportero de CAT incrementó adicionalmente los niveles de expresión en ciertas líneas celulares. Por ejemplo, en líneas celulares EJ28, T24P y 1197, el incrementador de H19 incrementó significativamente la expresión a partir del promotor de H19/gen reportero de CAT. Sin embargo, la orientación del incrementador proporcionó resultados diferentes en líneas celulares diferentes. En las líneas celulares HT-1376 y UM-UC-3, el incrementador tuvo poco o ningún efecto sobre la expresión. Los resultados demuestran que la región del promotor de H19 humano dirige la expresión de un gen reportero heterólogo enlazado operativamente en una amplia variedad de líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga. En algunas líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga, el incrementador de H19 puede incrementar adicionalmente la expresión de un gen reportero bajo el control de H19. 7. EJEMPLO: UN GEN DE TOXINA BAJO EL CONTROL DE SECUENCIAS REGULATORIAS DE H19 _ ___ 7.1 Materiales y métodos Los constructos de expresión descritos arriba en la sección 6 son modificados para expresar una secuencia que codifica un producto tóxico o un profármaco en vez de CAT. Por ejemplo, la secuencia que codifica el producto de gen de CAT es removida reemplazada con una secuencia que codifica la timidinquinasa de virus de herpes simplex (HSV-TK) empleando métodos estándares de clonación bien conocidos en la técnica. Los plésmidos de expresión H19/profármaco son transfectados en líneas celulares derivadas de cáncer de vejiga de conformidad con lo descrito en la sección 6. Cuando son transfectados en líneas de células de cáncer de vejiga, un plásmido de expresión H19/HSV-TK induce una citotoxicidad específica para células de cáncer de vejiga en presencia de ganciclovir. 8. EJEMPLO: EXPRESIÓN DE H19 EN UN MODELO DE RATÓN DE CARCINOMA DE VEJIGA INDUCIDO QUÍMICAMENTE 8.1 Materiales y métodos Setenta ratones C3H/H3 de sexo femenino de cinco semanas de edad (Charles River) fueron alojados a razón de 6 ratones por jaula y se permitió que se aclimataran en un cuarto con aire acondicionado con un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. A las 8 semanas de edad, el experimento fue empezado y los ratones fueron divididos arbitrariamente en un grupo de control (10 ratones) y un grupo experimental (60 ratones) . El grupo experimental de ratones recibió 0.05% de N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBM) (Tokio Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokio, Japón) disuelta en su agua de beber ad libitum. Los ratones de control recibieron agua del grifo.

Animales de ambos grupos fueron sacrificados 4, 8, 12, 16, 20 y 26 semanas después del inicio del experimento. Las vejigas fueron removidas, fijadas, e integradas en bloques de parafina empleando procedimientos estándares. 8.1 Preparación de sonda Un fragmento de 2.1 kb que contenía la región de purificación de H19 de ratón fue subclonado en el plásmido pBluescript II KS (Stratagene, La Jolla, CA) detrás de los sitios de enlace de ARN polimerasa T7 y T3. Se produjo ARN de H19 de antisentido impreso con [35S] in vitro a partir de ADN de plásmido linearizado con Hindi empleando polimerasa T7 (Boehringer Mannheim) y un conjunto de elementos Amersham RPN 2006. Los transcriptos generados in vitro presentaban una actividad específica de 107 cpm/'pg. El ARN de H19 de sentido, preparado con polimerasa T3 (Boehringer Mannheim) y templado linearizado con EcoRI, se empleó como control. 8.1.2 Hibridación in situ Secciones de cera de parafina (5"?M) de tejidos fijados con formalina fueron montadas en platinas de microscopio revestidas con 3-aminopropiltrietoxilano (Tespa, Sigma) y secadas durante la noche a una temperatura de 37 °C. Las secciones fueron limpiadas de cera con xileno, fijadas con paraformaldehído al 4%, y después tratadas con proteinaza K (Sigma) . Las platinas fueron acetiladas para reducir el enlace no específico de la sonda y deshidratadas a través de una serie de etanol. Sondas de ARN marcadas con [35S] (actividad específica de 50,000 cpu/"?l) fueron hibridadas de conformidad con lo descrito por Rangini et al. 1991, Mech. Dec. 35:13-24, omitiendo el paso tio-AMP. Las platinas fueron expuestas a película durante 10 días, y contrateñidas con hematoxilina y eosina. Las platinas fueron examinadas y fotografiadas empleando un microscopio Polyvar (Reichert Jung) bajo iluminación de campo brillante y oscura. Los controles incluían hibridación con sonda de Aire de Sentido y tratamiento de prehibridación con AR?asa. Además, secciones de vejigas de ratones sanos adultos (que no expresaban H19) y vejigas de ratón embrionales (que expresaban H19) sirvieron como controles negativos y positivos, respectivamente. 8.2 Resultados y comentarios A las 26 semanas, todos los ratones del grupo experimental sobrevivientes habían desarrollado tumores de vejiga palpables. La expresión extensiva de H19 fue observada en los tumores de vejiga inducidos químicamente. En contraste, no se detectó ninguna expresión de H19 en las vejigas de ratones adultos normales. Por consiguiente, el modelo de ratón de cáncer de vejiga inducido químicamente puede emplearse como modelo animal para demostrar la citotoxicidad específica para tumores in vivo de constructos que contienen las regiones regulatorias de H19 enlazadas operativamente a un gen de toxina. 9. EJEMPLO: TERAPIA GENÉTICA EMPLEANDO SECUENCIAS REGULATORIAS DE H19 PARA EXPRESAR UN GEN HETERÓLOGO EN UN MODELO DE RATÓN DE CARCINOMA DE VEJIGA Se incorporaron plásmidos de expresión de profármaco o H19/toxina en liposomas (de conformidad con lo descrito por Takashita et al., 1993, J. Clin. Invest. 93:652-651, que se incorpora aquí por referencia) para administrar a vejiga de ratón in vivo. Los ratones empleados para este experimento tenían tumores de vejiga inducidos químicamente de conf-ormidad con lo descrito arriba en la sección 8. En resumen, 50"?g de ADN de plásmido, disueltos en 500 "jl de medio exento de suero de Optimen (BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) se agrega a 250 "?1 de lipofectamina, 250 "?1 de agua. La mezcla es incubada durante 30 minutos a temperatura ambiente y después diluida en 10 mis de una solución salina balanceada (BSS(-): 140 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6). Después de formación de pellas mediante la centrifugación de la solución a 15,000 revoluciones por minuto durante 30 minutos, los liposomas son resuspendidos en 1 ml de BSS (-) que contiene 1 mM de CaCl2. Se administra aproximadamente 0.2 mis de los liposomas concentrados a ratones con tumores de vejiga inducidos químicamente a través de un catéter. Un grupo de control de ratones con tumores de vejiga recibe liposomas sin ADN o bien con un constructo que contiene un gen irrelevante bajo el control de las secuencias regulatorias de H19. En puntos de tiempo definidos, ratones provenientes de cada grupo son sacrificados y se remueven las vejigas las cuales son fijadas e integradas en bloques de parafina empleando procedimientos estándares. Secciones alternas se procesan para la hibridación in situ empleando ya sea la sonda de H19, de conformidad con lo descrito arriba, o bien una sonda para la secuencia de codificación de gen de toxina de pseudomonas. Además, se comparan el tamaño, número y necrosis de tumores entre los grupos de control y de experimento. La expresión de toxina de pseudomonas se encuentra en colocaciones con la expresión de H19 en los tumores de vejiga del grupo experimental de ratones. Además, los tumores de vejiga en el grupo experimental de ratones son reducidos en cuanto a tamaño y necrosis en comparación con los tumores de vejiga en el grupo de control de ratones . 10. EJEMPLO: EXPRESIÓN A PARTIR DE PROMOTORES P3 Y P4 DE IGF- 2 EN LINEAS DE CÉLULAS TUMORALES , 10.1 Materiales y métodos En este experimento, varios constructos que contienen el gen reportero luciferasa colocado bajo el control de uno de los cuatro promotores diferentes de IGF-2 fueron construidos y transferidos en varias líneas diferentes de células de cáncer de vejiga. Los siguientes constructos de promotor de IGF-2 humano/luciferasa fueron elaborados: Constructo de secuencia de nucleótidos promotor plásmido de gen de IGF-2 Hupl de -980 a +54 promotor 1 Hup2 de -379 a +271 promotor 2 Hup3 de -1229 a +140 promotor 3 Hup4 de -546 a +102 promotor 4 Las " secuencias de promotores de IGF-2 se describen en Sussenbach et al., 1992, Growth Reg 2:1-9, que se incorpora aquí por referencia. El vector reportero de luciferasa se encuentra comercialmente disponible en Promega, Madison, Wl (número de catálogo E1641) . 10.2 Resultados y comentarios Los plásmidos de expresión resultantes fueron transfectados en líneas humanas de células de cáncer de vejiga HT-1376, EJ28, T24P, 1197 y UM-UC-3 de conformidad con lo descrito arriba en la sección 6. La actividad luciferasa fue ensayada empleando un conjunto de elementos comercial (Promega, Madison, Wl, número de catálogo E1500) . Los resultados, que aparecen en las figuras 4A-4E, demuestran que el promotor P4 de IGF-2 dirigió la expresión del gen reportero luciferasa en cada línea de célula de cáncer de vejiga probada. En la línea de células 1197, el promotor P3 de IGF-2 dirigió también la expresión del gen reportero de luciferasa. En experimentos subsecuentes, los promotores P3 y P4 de IGF-2 dirigieron la expresión de gen de luciferása en otras líneas de células tumorales incluyendo células de coriocarcinoma y células de rabdomiosarcoma . 11. EJEMPLO: FUNCIÓN DE PROMOTOR H19 Y PROMOTOR DE IGF-2 CON _ INCREMENTADOR DE H19 PARA FACILITAR LA EXPRESIÓN EN UN GEN HETERÓLOGO 11.1 Materiales y métodos Cuatro vectores reporteros de luciferasa, pGL3-básico, pGL3-promotor, pGL3-incrementador y pGL3-control fueron obtenidos de Promega. Estos vectores fueron transfectados en líneas de células cultivadas empleando varios reactivos de transección diferentes, incluyendo lipofetamina (Gibco/BRL) , fugeno (Boehringer) , el Perfec Transfection Kit de 8 reactivos lípidos diferentes (Invitrogen), TFX-10, TFX-20, Transfast (Promega), y el método de fosfato de calcio (Gorman et al., 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051). El promotor de H19 clonado en el sitio EcoRV de pBluescript II SK (pbhl9p#l) se describe en la sección 6.1, supra. El promotor de H19 fue removido por disociación con Sma I e Hind III, y el fragmento de 0.9 kb resultante fue insertado en los sitios Sma I-Hind III del vector pGL3-bésico para producir el constructo Luc-pbhl9.

La región de promotor H19 desde nt -819 a +14 fue amplificada por reacción en cadena de polimerasa a partir del plásmido pbhl9p #1, empleando iniciadores 5'- ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3' (corriente arriba, SEQ ID NO: 8) y 5 '-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3' (corriente abajo, SEQ ID NO: 9) . El producto de reacción en cadena de polimerasa resultante fue digerido con Kpnl y Hind III, y ligado en los sitios Kpnl-Hind III del vector pGL3-básico, proporcionan el constructo Luc-PBH19. Este promotor de H19 generado por reacción en cadena de polimerasa fue secuenciado en ambas direcciones mediante secuenciamiento de ciclo de terminador de colorante automatizado (secuenciador de ADN ABT Prism 377, Perkin Elmer) . La figura 5 muestra la secuencia de nucleótidos del promotor de H19 (SEQ ID NO: 2) generado por reacción en cadena de polimerasa. El incrementador corriente debajo de H19 de 5 kb descrito en la sección 6, supra, fue digerido con Da H para proporcionar dos fragmentos de 4.1 kb y 0.9 kb en el extremo 3 ' . Los constructos Luc-PBH19-0.9EH19 y Luc-PBH19-4EH19 fueron construidos mediante la inserción de los fragmentos BamH I de 0.9 kb y 4.1 kb del incrementador de H19 en el sitio BamH I del plásmido Luc-PBH19, respectivamente. Las secuencias de incrementador fueron colocadas corriente abajo del gen promotor de H19/reportero de luciferasa. El fragmento de incrementador de BamH I de 0.9 kb fue ligado en el sitio BamH I del vector pGL-básico para producir Luc- 0.9EH19. El promotor de H19 del plásmido pbhl9p#l fue removido por Kpnl-BamH I, y ligado en los sitios Kpnl-BglII del constructo Luc-0.9EH19, proporcionando el constructo de expresión Luc-pbhl9-0.9EH19 que contenía los clones de promotor de conformidad con lo descrito en la sección 6, supra, y el incrementador de 0.9 kb corriente abajo del gen reportero Hl9/Luc. Los vectores de expresión designados como Hup-1, Hup-2, Hup- 3, y Hup-4, que contienen el gen de luciferasa bajo el control de los promotores de IGF-2 humanos Pl, P2, P3 y P4, respectivamente, fueron construidos de conformidad con lo descrito en Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. Una región de 512 pares de bases de P4 fue amplificada por reacción en cadena de polimerasa a partir de constructo Hup-4 empleando los iniciadores 5 '-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3 ' (corriente arriba, SEQ ID NO: 10) y 5'-ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (corriente abajo, SEQ ID No: 11). El producto de reacción en cadena de polimerasa resultante fue digerido con Kpnl-Hind III, y ligado en los sitios Kpnl- _ Hind III del vector de gen reportero pGL3-básico para producir el vector de gen reportero Luc-P4. Se prepararon también vectores de expresión que contenían el promotor P4 de IGF-2 y el incrementador de H19. Un fragmento de incrementador BamHl de 2 kb derivado del fragmento de 4.1 kb previamente descrito fue clonado en el sitio BamHl del constructo Luc-P4, produciendo el vector de expresión Luc-P4- 2EH19. Los incrementadores de H19 de 0.9 kb, 2 kb y 4.1 kb fueron secuenciados empleando un secuenciamiento de ADN automatizado. La secuencia de nucleótidos del incrementador de 0.9 kb se ilustra en la figura 6 (SEQ ID NO:3). La secuencia de nucleótidos del incrementador de 2 kb aparece en la figura 7A y en la figura 7B (SEQ ID NO: 4) . La secuencia de nucleótidos del incrementador de 4.1 kb aparece en la figura 8 A-8C (SEQ ID NO: 5) . 11.2 Resultados y comentarios Cuando se emplearon varios reactivos de transfección para introducir cuatro vectores que contenían genes de luciferasa en líneas de células cultivadas, la precipitación de fosfato de sodio produjo la mayor eficiencia de transfección para la mayoría de las líneas celulares probadas. Por consiguiente, la precipitación por calcio fue subsecuentemente empleada para transfectar varios vectores de expresión. Además, una concentración incrementada de ADN de plásmido no inhibió la eficiencia de la transfección, aun cuando se emplearon en concentraciones arriba de la meseta. La línea de células de cáncer de vejiga 5637, la línea de-células de carcinoma hepatocelular (HCC) Huh7 y la línea de línea de células de tumor de riñon 293T fueron transfectadas cada una con constructos diferentes que contenían el gen reportero de luciferasa bajo el control de H19 o bien bajo el control del promotor P4 de IGF-2 en combinación con el incrementador H19. Las células transfectadas con Luc-phl9 y Luc-PH19 que contenían el gen reportero y el promotor H19 presentaron una expresión incrementada de genes en comparación con el fondo (figuras 9A-9C) . El constructo Luc-PH19 que contenía el promotor generado por reacción en cadena de polimerasa presentó una actividad más importante que Luc-phl9 en cada línea de células probada. La adición del fragmente de incrementador de 0.9 kb de H19 al vector reportero Luc-phl9 (Luc-pH19-0.9EH19) incrementó adicionalmente los niveles de expresión de 2 a 4 veces en las líneas de células 5637 y 293T, respectivamente. El promotor P4 de IGF-2 incrementó también la expresión de luciferaza en todas las líneas de células en comparaciór- con el fondo. La adición del fragmento de icrementador de H19 de 2kb al vector de expresión Luc-P4 incrementó la actividad de promotor P4. El nivel de inducción de la actividad luciferasa por el fragmento de incrementador de 2 kb se ubicó dentro de un rango de dos veces en una línea de células 293T a seis veces en la línea de células Huh7, mientras que el incrementador incrementó solamente de manera marginal la actividad promotora en las células 5673.

Las figuras 10A-10E muestran que la expresión del constructo Luc-phl9-4EH19 contiene tanto el promotor de H19 generado por reacción en cadena de polimerasa como el fragmento de incrementador de H19 de 4.1 kb. El incrementador incrementó en gran medida la actividad del promotor en 3-28 veces en las líneas celulares, excepto en la línea de células 5637. 12. DEPOSITO DEL CLON El siguiente plásmido fue depositado ante la American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, de conformidad con los términos del Tratado de Budapest en materia de Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para Propósitos de Procedimiento de Patente: Clon No. de acceso ATCC Fecha de depósito PH19EH19 209322 2 de Octubre de 1997 EQUIVALENTES La especificación anterior es suficiente para permitir a un experto en la materia la práctica de la invención. De hecho, varias modificaciones a los medios antes descritos para llevar a cabo la invención que son evidentes a los expertos en la materia de la biología molecular, medicina o bien campos relacionados se encuentran dentro del alcance de las siguientes reivindicaciones. Todas las publicaciones citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad.

LISTA DE SECUENCIAS <110> Yissim Research Development Company of The Hebrew University of Jerusalem <120> MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA INDUCIR CITOTOXIDAD ESPECIFICA PARA TUMOR <130> 9457-0014-228 <140> PCT/IL98/00486 <141> 1998-10-04 <150> US 09/165,240 <151> 1998-10-01 <150> US 08/943, 608 <151> 1997-10-03 <160> 11 <170> FastSEQ para Windows Versión 3.0 <210> 1 <211> 830 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 1 c?gcacssc; ccaacaacic ecaccaaagg ccaaggtggt gascgacgga cccacagcgg SO ggcggctggg ggagecgaaa cccgccagtc cccaceccac ecccaacc e ggegccccac 120 gcgggcccgg gagagectge gaggccgccc ageagagtgc gcccgcgagc 130 cgcaagcaca cccggcaac aegcggtcet cagacaggaa ageggccgcg aaegcgaccg 240 eggegcccag cggcegegcg ga ecegccc egcggaaacc gcggtgacga gcacaagctc 300 ggecaaccgg acgggaatcg ccc gsggg ccggcaccgc gcccaccagg Sss -Scgg 3S0 cacc;ccc:e egcccctcag caccccaccc ceacecccca gaacgegag gectgagccg -120 cgat gcggc aggaaggggc cctccgtgcc aeccgagecc ccagggaccc gcagceggcc 430 cccagccacg tgcaaageae gegcagggcg ceggcagg 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1260 cceagagcce ccagecccgg eggcccccag cccgagggeg aacggcceca cccegggecg 1320 egggacagag ggcacseeca ecaagagegg cec caaggg acacgcggce gteegcagee 1380 cacaggaagc aeecgagaea aggagceege eeecccageg ggcacggagc cagca gggg 1440 gcegeggggc agcccaggge gcaaggccag gcrgeggggc egcagcegcc tegggcccca 1 S C0 cecccaggcc ee egcgggag gegggaggcg ggaggcggra gcegcacage ggccccaggc 1560 gaggcececa gccccagecg cececcggge gggcagccca agag geceg gcegagccec 1620 ccacatctgg gactccatca cccaacaacr taattaaggc egaate e ac gegeccegeg 16S0 aceegggtag acaaagcccc egeccaaagg ggcagccagc ceaaggcage ggggacgscg 1740 egggeggcgg gcgacggggg agaeggacaa casgaccgag ggcgegcggg cgaeggggga 1800 gatggacaac aggaccgagg gtgtgcgggc ga eg gggag atggacaaca ggaccgaggg 1860 egegcgggae acgcaegeca cecaegcacg ccaaeggggg gcgegggagg ceggggagca 1 S20 gacagacegg gcegggcegg gcgggaagga cgggcagaeg 1360 <210> 5 <211> 4085 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 5 ccgggeaccg agceccca g aagaeaaaeg aeeeccecce ceceagagae gggggeggga 60 ccegagcact cagagccaag ggcgcagegg geccgggcgg gggcccecce cggccceccc 120 aacatggggg ccaggaggtc agccccecaa cceggacccc ggctgggece cagggaaegg 180 ectcccccag eggcccagct egceegegee eecagaes g egegcatggg tgegegegeg 240 egegtgegeg egegegtgeg egegegtgeg egegaegcce gacaagcccc agagagccaa 300 agacctgage ggagaeceeg cgacttceca aaagggggae eggaaggeec gagaaagagc 360 egeggecagc ceegcectcc ceeaaggceg eggtaaccac aceaggcaea gcataggcct 420 gcgccccgec ccecceeccc ecceccgcgc cececceetc ecececcccc ccccceaccc 480 cgctcccegg cctgctcctg gegacaccgt eggccccctt ccagggctga gggaagccag 540 cgggggcccc eecctgaaag cccacctgca ggccggceeg cegggaaggg gcegcectcg 600 cagaggcecc cgcc gccct gcagccgetc cceggaagca gecgcegegg geaetcegee 660 ccttgecagc actgtgcceg caaagaaagc agacactgeg cecctegecc teagggagcc 720 ccgctccaec acccaacac tggctggaca caggcgggag gccgggtccg cggggagcgg 780 cgcggggceg gggccggacc aeeaaacaca cacgggcgcc aggcactgca ggctccecce 840 cctccecceg cccagcgcct cegcecacag gcacgegcca agccccta g ccaggaggcc 900 agcageggge gcagaacaag ceccegggaa gggggegcag ggcggacccc cggggagaag 360 ggceggcagg gcegeggggg acgcegaccg egggccccac' eegcagaaa aceggnegcc 1020 eggctggaag atgggggaga egccaagcct cegaggcagc acgagcaggg egcaeggagg 1080 ccggggcgcg gggaggctgc acegcagcae gcaccccaaa gcccanaggg ageggagacc 1140 aggcccegga atcgagaagc agaaaggcgg ceeggaggcc tcggaaccgg ctgaccccca 1200 acagageggg gccggccctg gaggcaaaga ggegcccggg gtccggccce gcctggggga 1260 gctatgtgtc atgggcaagc cacaggatat gtagcccgcc cegagcceae ggacccaggg 1320 cagggcegca aggcagggca ggggagacag cacgggggag caaggagcag agagggggcc 1380 tcaggctctc ccaggaggaa caeececccg acaggaggaa gagacggccc aggggegact 1440 gegg gagcc atggeggca ctggggecge ggcagatggg agagaggceg gcgaggegaa 1300 ggtgcagggg ecagggctct ggggcccaca egcctgtggg agcaggcagg cccagggcec 1560 eccgccacec cccactcccg cteggcecat aggctgggcc caagggeggg gtgggatgag 1620 caggagatgg ggc cag gg gcaa caggg ccccaaagac aeteagaaaa accggeteae 1680 gcaggcagca tt agagca gcggcgtgcg ggcgggggc cctcggagca cagagaggca 1740 cacgeagggc ccccgagggg ctccccaeeg gccggcagtg acatcacccc tgtgtcaaca 18C0 gcgaegeceg cagceccggc cagccaggge etaeggagcg agacscagcc cggccegggc 1860 cctcaceccc caggcccaca cacea ccca cegetcaggg eccggggtgg cggcae gcc 1920 tgggggtcct ggc.a cgctg ctccectgcc caccctaact tcccggcatc gcggcegccc 1980 cccctgagcg eccccaacca geaagegegg ggcccagcag gccegccgec ceccecctct 2040 cccccectag agagaaacge ggaggecceg gggceggggg cgcecaeagc ccecegacac 2100 aggegcaegg ggecaggcge ccca aaegg cccctgggaa ggaccecagc egggccggcg :?eo gceceaggce ecaggggcce gecegcacag g gneagscc cecccagacc tcegegaagc :22o cageacgggc ctcccceccc egccc gegc ecegeccgge gceeccegga cegcacegcg 2280 ggccactggt gagagggegg acagggaagg g cgccgtgg tgcctgCtcc tgcccacceg 2340 gctgtgegge cccceccaag eagggacaac ccttcegagg gceegggggc acccecggge :40o egccagggcc tcccagagcc cegegagccc ceggggggec eggccegatg ccccccecca 246C cgtccagggc ccgctgtggc ccagaacccc agcttcccag caggccggeg tgcggeggeg 2520 acccaggaga ggcctcgcct ccacegaggg gccaccgacc ecegeca ac cacagagacc 2580 cceaaggagt ctgaaggceg gagacccggg gcegggacca ggegggacee tcccacggag 2640 ccgtccccag gcccagctgg ggacacgtcc ccctectctc cagacacacc ctgcctgcca 2700 ccaggacaca ccggcctg?t gggggtctce ettaagegct tgccaceceg aggtgactgt 2760 ccctttccaa agaggetect ggggcccagg egggatgcge cggccegagc aggaggatce 2820 gggccgccag gggcegggga ctgtctcceg gggaaggaag cgccegggag cgegtgtgct 2880 gacccaggác catccaggga ggcccgtceg eggggcaagc gggaagggag cggceggaga 2940 ggcttggccg cccccgccct gcctcccatt ccttagctcc atgccegtca accecegtca 3000 cccagtgagt gaegtccagg ggccceggaa aggecacagc atgtetgagc ggggtgagag 3060 agaggsgaaa ggcgggggcg gggaaaagea cgtggaggaa gctttaggcc caaggaagga 3120 g-acagggttc tgggagggag ggagccaceg gggccgccgg gaaggtccce gcttgctgct 3180 gccacccaga acccecgcce cteagceagc ccccgcagcc ccagcctttc tggcr.tgtgg 3240 ccctcececc caeccccagg egeccegegc aaccaggcce eggacccaaa ccctccegcc 3300 ccctcctcec cceccecacc cecccaaegc agtggtctcc agcceggcec egcccc ccg 3360 caggeccsct ccccecatea ccaggcceag agcceccage cccggeggcc cccagcccga 3420 gggegaacgg ccecaccceg gg cgeggga cagagggcac getcaecaag age gceccc 3480 aggrgacacg eggcegteeg cageecacag gaagcaeecg agaeaaggag ceegeeetcc 3540 cagtgggcac gagccagca ggggggc gt ggggcagccc agggtgcaag gccaggcegt 3600 ggggcegcag cegcceeggg ccccaccccc aggcctttgc gggaggeggg aggcgggagg 3660 cggcagcegc acageggccc caggcgaggc tcecagcccc agtcgcece cgg - c» 3720 gcccaasagg geceggctga gcctcc aca tcegggacec catcacccaa caacteaatt 3780 aa gcegaae eecacgegtc ctgcga ttg ggeagacaaa gcccctgecc aaaggggcag 3840 ccagcceaag gcagecggga cggcgtggge SS^SaSC^ac gggggagatg gacaacagga 3900 ccgagggtge ccgggcgaeg ggggagacgg acaacaggac cgagggegeg cgggcgatgg 3960 gggagaegga caacaggacc ga ggtgtgc gggacacgca egecacecae gcacgccaae 4020 ggggggcgeg ggaggceggg gagcag cag a=cgggcegg gceg gcggg aa gacgggc 4080 agatg 4085 <210> 6 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 6 cggttcccca cttccccagt tt 22 <210> 7 <211-> 33 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 7 cggaagtcga caaccctcac caaaggccaa ggt 33 <210> 8 <211> 27 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 8 atatggtacc gacaaccctc accaaag 27 <210> 9 <211> 29 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 9 atataagctt cttctccctc accctgctc 29 <210> 10 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 10 acaggtacct ctagagtcga cct 23 <210> 11 <211> 24 <212> ADN <213> Homo sapien <400> 11 atataagctt gctcccatcc tgca 24

Claims (36)

1. REIVINDICACIONES Un método para expresar una secuencia heteróloga en una célula tumoral, que comprende la introducción en la célula tumoral de un polinucleótido que comprende una secuencia regulatoria enlazada de manera operativa con una secuencia heteróloga que codifica un producto de gen citotóxico, donde la secuencia regulatoria es derivada de un gen impreso genómicamente específicamente expresado en la célula tumoral.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la secuencia regulatoria es una secuencia regulatoria de H19.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la secuencia regulatoria es un promotor P4 de IGF-2.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la secuencia regulatoria es un promotor P3 de IGF-2.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la célula tumoral es una célula de tumor de vejiga.
6. El método de conformidad con la reivindicación 5 donde la célula de tumor de vejiga se selecciona dentro del grupo que consiste de Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 y Um-UC-3.
7. El método de conformidad con la reivindicación 2 donde las secuencias regulatorias de H19 son el promotor de H19, el incrementador de H19, o bien tanto el promotor de H19 como el incrementador de H19.
8. 8. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la secuencia heteróloga se selecciona dentro del grupo que consiste de la secuencia de codificación para ?galactosidasa, toxina de difteria, toxina de pseudomonas, ricina, toxina de cólera, gen de retinoblastoma, p53, timidinquinasa de herpes simplex, timidinquinasa de varicella zoster, citosindesaminasa, nitroreduct-asa, citocromo p-450 2B1, timidinfosforilasa, purinnucleosidfosforilasa, fosfatasa ~~ alcalina, carboxipeptidasas A y G2, linamarasa, ~?lactamasa y xantinoxidasa .
9. 9. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la secuencia heteróloga es una secuencia de antisentido que se hibrida específicamente con una secuencia que codifica un gen seleccionado dentro del grupo que consiste de cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, formas oncogénicas de p53, c-fos, c-jun, Kr-ras y Her2/neu.
10. 10. El método de conformidad con la reivindicación 1 donde la secuencia heteróloga codifica una ribozima que disocia específicamente un APN que codifica un gen seleccionado dentro del grupo que consiste de cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyclinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, formas oncogénicas de p53, c-fos, c-jun, Kr-ras y Her2/neu.
11. 11. El método de conformidad con la 'reivindicación 1 donde la célula tumoral se encuentra en un paciente.
12. 12. El método de conformidad con la reivindicación 11 donde el paciente tiene un tumor seleccionado dentro del grupo que consiste de carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma de ovario, carcinoma cervical, carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de células escamosas en cabeza y cuello, carcinoma esofágico, carcinoma de la tiroide, astrocitoma, ganglioblastoma y neuroblastoma.
13. 13. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el promotor de H19 comprende los nucleótidos 1 a 830 de SEQ ID NO: 1.
14. 14. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el promotor de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 2.
15. 15. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia del incrementador de H19 clonada en el plásmido pH19EH19 (número de depósito ATCC 209322) .
16. 16. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
17. 17. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 4.
18. 18. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el incrementador de HÍ9 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5.
19. 19. El método de conformidad con la reivindicación 7 donde el incrementador de H19 se coloca en 3' con relación a la secuencia heteróloga.
20. 20. Un vector para expresar una secuencia en una célula tumoral, el vector comprende un polinucleótido que comprende una secuencia regulatoria enlazada de manera operativa con una secuencia heteróloga que codifica un producto de gen citotóxico, donde la secuencia regulatoria es de un gen genómicamente impreso específicamente expresado en células cancerosas.
21. 21. El vector de conformidad con la reivindicación 20 donde la secuencia regulatoria es una secuencia regulatoria de H19.
22. 22. El vector de conformidad con la reivindicación 20 donde la secuencia regulatoria es un promotor P4 de IGF-2.
23. 23. El vector de conformidad con la reivindicación 20 donde la secuencia regulatoria es un promotor P3 de IGF-2.
24. 24. El vector de conformidad con la reivindicación 21 donde las secuencias regulatorias de H19 y el incrementador de H19, y la secuencia heteróloga codifica una proteína seleccionada dentro del grupo que consiste de ?galactosidasa, toxina de difteria, toxina de pseudomonas, ricina, toxina de cólera, gen de retinoblastoma, p53, timidinquinasa de herpes simplex, timidinquinasa de varicella zoster, citosindesaminasa, nitroreductasa, citocromo p-450 2B1, timidinfosforilasa, purinnucleosidfosforilasa, fosfatasa alcalina, carboxipeptidasas A y G2, linamarasa, "?lactamasa y xantinoxidasa .
25. 25. Una célula huésped que contiene el vector de conformidad con la reivindicación 20.
26. 26. Un método para el tratamiento del cáncer en un paciente, que comprende la administración al paciente de un polinucleótido que codifica un producto genético citotóxico o citostático enlazado de manera operativa a una secuencia regulatoria derivada de un gen genómicamente impreso específicamente expresado en células cancerosas.
27. 27. El método de conformidad con la reivindicación 26 donde la secuencia regulatoria es una secuencia regulatoria de H19.
28. 28. El método de conformidad con la reivindicación 26 donde la secuencia regulatoria es un promotor P4 de IGF-2.
29. 29. El método de conformidad con la reivindicación 26 donde la secuencia regulatoria es un promotor P3 de IGF-2.
30. 30. 'El método de conformidad con la reivindicación 26 donde el producto genético citotóxico se selecciona dentro del grupo que consiste de toxina de difteria, toxina de pseudomonas, ricina, toxina de cólera, gen de retinoblastoma y p53.
31. 31. El método de conformidad con la reivindicación 27 donde las secuencias regulatorias de H19 son el promotor de H19, el incrementador de H19, o bien tanto el promotor de H19 como el incrementador de H19.
32. 32. El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el promotor de H19 comprende los nucleótidos 1 a 830 de SEQ ID NO.l.
33. 33. El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el promotor de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO.2.
34. 34. El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia del incrementador de H19 clonada en el plásmido pH19EH19 (número de depósito ATCC 209322) .
35. 35. El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 3.
36. 36. El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO : 4. 7. El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el incrementador de H19 comprende la secuencia de SEQ ID NO: 5. 8. 'El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el incrementador de H19 se coloca en 3' con relación a la secuencia heteróloga. . El método de conformidad con la reivindicación 31 donde el cáncer se selecciona entre carcinoma de vejiga, carcinoma hepatocelular, hepatoblastoma, rabdo iosarcoma, carcinoma de ovario, carcinoma cervical, carcinoma de pulmón, carcinoma de mama, carcinoma de células escamosas en cabeza y cuello, carcinoma esofágico, carcinoma de la tiroide, astrocitoma, ganglioblastoma y neuroblastoma. . Un método para expresar una secuencia heteróloga en una célula tumoral, que comprende la introducción en la célula tumoral de un polinucleótido que comprende un promotor de IGF-1 enlazado de... manera operativa con una secuencia heteróloga que codifica un producto genético citotóxico. . Un vector para expresar una secuencia heteróloga en una célula tumoral, que comprende un polinucleótido que comprende un promotor de IGF-1 enlazado operativamente a una secuencia heteróloga que codifica un producto genético citotóxico .