MXPA00001300A - Produccion de lineas de celulas germinales embrionicas (ge) de aves mediante el cultivo prolongado de pgc, el uso de las mismas para clonacion y quimerizacion - Google Patents

Abstract

Se provee un sistema de cultivo para producir células de CGP o GE mediante el cultivo de CGP durante largos períodos en el cultivo de tejidos. Este sistema de cultivo utiliza LIF, b FGF, IGF, y SCF. Las células de GE resultante sonútiles para la producción de aves transgénicas y quiméricas, en particular, pollos y pavos, y también para fines de clonación.

Description

PRODUCCIÓN DE LINEAS DE CÉLULAS GERM INALES EMBRIONICAS (GE) DE AVES M EDIANTE EL C ULTIVO PROLONGADO DE PGC, EL USO DE LAS MISMAS PARA CLONACIÓN Y QUIM ERIZACION CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un novedoso método para mantener células germinales primordiales (PGCs) (o por sus siglas en español , CGP) de aves, en particular PGCs de pollo, durante períodos prolongados en cultivo de tejido, lo cual resulta en la producción de germen embriónico (EG) (o por sus siglas en español, GE) . Estas células de EG pueden ser usadas para la inserción de secuencias de DNA deseadas, por ejemplo, genes humanos. Estas células de EG y células EG transgénicas derivadas de las mismas, pueden ser usadas para producir aves quiméricas, en particular pollos quiméricos y para clonación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN En años recientes ha habido mucha investigación enfocada hacia la producción de animales quiméricos, clonados y transgén icos. En particular, la modificación del genoma de especies de animales de granja es un área la cual ha sido activamente perseguida, con grados variantes de éxito, durante las pasadas dos décadas. Por ejemplo, tal investigación ha sido enfocada hacia la generación de cerdos, vacas y pollos transgénicos. A la fecha, la mayoría de los animales transgénicos disponibles ha sido generada mediante la microinyección directa de embriones de células simples con constructos de DNA que alojan el gene de interés. Sin embargo, aunque las técnicas de microinyección han sido exitosas, tales métodos son desventajosos ya que son muy costosos y frecuentemente sufren de baja eficiencia. Recientemente, el éxito de la tecnolog ía de célula eje embriónica (ES) para la producción de ratones "knock-out" ha conducido a una investigación enfocada hacia el desarrollo de sistemas de cultivo de tejido para células ES y células germinales primordiales (PGCs) en especies de animales de granja. La capacidad para mantener células ES no diferenciadas en cultivo continuo permite la transfección in vitro de tales células y de manera ideal, la selección de células transfectadas, las cuales contienen un gene deseado antes de su transferencia a la masa celular interior de un embrión en desarrollo para generar animales quiméricos. De manera ideal, al menos algunos de los animales quiméricos resultantes serían capaces de segrerar el constructo de DNA vía la línea germinal y, de ah í, producir progenie transgénica. Sin embargo, a la fecha, las integraciones enfocadas (de sitio específico) han sido logradas solamente en ratones. Actualmente, la capacidad para hacer la integración de DNA enfocada en otras especies animales está limitada. Sin embargo, el trabajo en esta dirección está en progreso y debería ser realizado pronto.

En particular, ha habido una considerable investigación enfocada hacia mejorar el genoma de Gallinácea y pollos, en particular debido a la considerable importancia económica de ello. Una revisión bastante completa del estado de investigación dirigida a la generación de pollos transgénicos fue publicada hace tres años (Sang, Trends in Biotech. 1 2:41 5-420 (1 994)). Como se discutió en la presente, existen básicamente dos rutas alternativas bajo investigación para producir pollos transgénicos . Estos métodos pueden distinguirse basados en el momento en el cual se efectúa la manipulación del genoma, es decir, antes de la puesta o después de la puesta. El último método incluye la transferencia de PGC y ES del donador a embriones receptores. Más aún, en ambas rutas, el volumen del trabajo ha sido efectuado al infectar células donadoras con vectores retrovirales conteniendo un gene de interés. La primera aproximación, la cual comprende la manipulación del genoma antes de la puesta ha producido resultados mezclados y/o ineficientes. Por ejemplo, la infección de oocitos en el ovario (Shuman y Shoffner, Poultry Sci. 65: 1437-1494 (1 986)) y la pre-incubación de esperma con DNA de piásmido (Gruenbaum et al. , J. Cell. Biochem Supp., 15: 1 94 ( 1 991 )) fueron ineficientes y no han sido repetidas. Además, la transfección de células de esperma con un constructo de piásmido por lipofección ha sido demostrada (Squires y Drake, Anim. Biotech. , 4:71 -78 1 993). Sin embargo, no se reportó la transmisión de líneas germinales. Además, la microinyección directa de DNA en el disco germinal seguido por el cultivo de embriones ha sido reportada por producir 0.1 % de aves q uiméricas transgénicas vivas (Sang, W. , Trends in Biotech. , 12:41 5-42 (1 994)) con un ave transmitiendo el transgene a 3.4% de su progenie (Love et al. , Bio/Technology, 12:60-63 (1994)) . La misma aproximación fue tomada por Naito et al (J. Reprod. Fértil. , 102 : 321 -325 (1 994)). Sin embargo, de manera similar no se reportó en la misma ninguna trasmisión de línea germinal del transgene.

La segunda aproximación, la cual comprende la manipulación del genoma después de la puesta, ha producido mejores resultados. Las aves quiméricas, generadas por inyección de huevos puestos con vectores retrovirales de replicación competente, han mostrado transmisión de línea germinal a 1 % y 1 1 % de su progenie (Salter et al. , en Manipulation of the Avian Genome (Manipulación del genoma de aves), Etches, RJ et al. , eds. Pp 1 38-150 CRC Press (1 993)). Los resultados más alentadores, usando vectores retrovirales de replicación defectuosa e inyección en huevos puestos, generó 8% de las aves macho quiméricas que transmitieron el vector a su progenie a una frecuencia de 2 a 8% (Bosselman et al. , Science, 243:535-535 ( 1 989)). Sin embargo, ha fracasado la inyección de los huevos puestos con constructos de piásmido en la presencia de reactivos conocidos por promover la transfección para producir aves transgénicas o constructos o establemente integrados (Rosenblum y Cheng , J . , Cell Biochem Supp. , 1 5E 208 (1 991 )). En general, el uso de vectores retrovirales para la generación de pollos transgénicos no está muy esparcido debido a las desventajas significativas asociadas con el mismo. Tales desventajas incluyen las restricciones en el tamaño de la inserción de clonación que puede ser introducida establemente en los mismos, y la desventaja potencial más seria de inducir posiblemente casos de recombinación con lugares virales endógenos o con otros virus de leucosis de ave diferente. Un problema significativo con todos estos métodos es el hecho de que sistemas de cultivo de largo plazo para PGC y ES de pollo han sido relativamente difíciles de establecer. Hasta donde saben los investigadores, se cree que las PGCs de aves más grandes han sido cultivadas con la producción exitosa de aves quiméricas es menor de 5 días. Los métodos para cultivar PGC previos han incluido el uso de factor de crecimiento, en particular LI F o IGF-I . Sin embargo, como se notó, tales métodos no han sido capaces de proporcionar períodos de cultivo prolongados, una preocupación que prevalece, ya que facilitaría la producción de PGCs transgénicas. Sin importar los problemas para lograr el cultivo de largo plazo, tanto células ES como PGC han sido usadas exitosamente para generar quimeras mediante infección de tales células con vectores retrovirales de replicación competente e incompetente. Además, como se discutió antes, las células blastodérmicas recién obtenidas han sido inyectadas en embriones receptores, resultando en aves con gónadas quiméricas (Carsience et al, Devel. 1 17:669-675, 1993)). Las células blastodérmicas pueden ser transfectadas de manera eficiente por lipofección y entonces son transferidas hacia embriones receptores. Sin embargo, no se ha reportado la transmisión de línea germinal de células transfectadas. Además, Pain et al. , Devel. , 122:2329-2398 ( 1 996) , han demostrado recientemente la presencia de células ES de pollo putativas obtenidas a partir de células blastodérmicas. Reportaron además el mantenimiento de estas células en cultivos por 35 pasos de manera sostenida sin pérdida del fenotipo de ES (como se define por los anticuerpos monoclonales para cél ulas ES de ratón). (Id.) Estas células aparentemente se desarrollan en PGCs sobre la transferencia en embriones de ave, donde forman colonias en las gónadas. Sin embargo, no establecieron de manera definitiva que estas células eran , de hecho, células ES . La reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales de ES de ratón con células ES de pollo podría argüir favorablemente la conservación de receptores de células ES entre especies. Además, el hecho de que estos investigadores también fueron capaces de generar dos pollos quiméricos con inyecciones de cultivos celulares blastodérmicos de 7 días de edad, sugeriría de manera razonada la presencia de células ES en su sistema. Sin embargo, estos investigadores no descartaron la posibilidad de que las PGCs estuvieran presentes en su sistema de cultivo complejo. Así, este sistema de cultivo ES de largo plazo debería ser probado adicionalmente por pluripotencia y transmisión de l ínea germinal. (Id.) Una ruta alternativa para la producción de células ES, comprende PGCs. Se han desarrollado procedimientos para el aislamiento y transferencia de PGCs de donador a embriones receptores y han generado exitosamente pollos quiméricos con la transmisión de líneas germinales del genotipo del donador (Vick et al. , London Ser. B, 251 : 1 79-1 82 (1 993), Tajima et al. , Theriogenology, 40:509-519 (1993)). Además, se han crioconservado PGCs y han sido descongeladas posteriormente para generar aves quiméricas (Naito et al. , J. Reprod. Fértil. , 1 02:321 -325 (1 994)). Sin embargo, este sistema es de mucho trabajo y solo produce, en promedio, solo 50 a 80 PGCs por embrión . La infección de PGCs con vectores retrovirales también ha sido reportada. Sin embargo, a la fecha, no se ha logrado el crecim iento de PGCs en cultivo durante períodos prolongados para facilitar la selección de PGCs transfectadas.

De esta manera, con base en lo anterior, está claro q ue los métodos mejorados para cultivar PGCs comprende una importante necesidad en la técnica. Además, otra importante necesidad comprende novedosos métodos para producir células eje embriónicas (ES) o germinales embriónicas (EG) de aves, debido a su aplicación en la producción de aves clonadas y para la producción de aves quiméricas y formans transgénicas de las mismas.

OBJETIVOS DE LA INVENCIÓN Un objetivo de la invención es resolver los problemas de la técnica anterior. Un objetivo más específico de la invención es proporcionar un novedoso método para cultivar células germinales primordiales (PGCs) de ave durante períodos prolongados en cultivo de tejido, el cual resulte en la producción de líneas de células germinales embriónicas (EG). Un objetivo aún más específico de la invención es proporcionar un novedoso método para cultivar células germinales primordiales (PGCs) de Gallinácea, especialmente pollo o pavo, durante períodos prolongados en cultivo de tejido para producir líneas de células germinales embriónicas (EG) . Otro objetivo de la invención es usar celias germinales embriónicas de ave, las cuales han sido obtenidas por cultivo de PGCs durante períodos prolongados en cultivo de tejido para la producción de aves quiméricas, de preferencia aves de corral, y muy preferiblemente pollos.

Otro objetivo de la invención es introducir secuencias de ácido nucleico deseadas en células germinales embriónicas de ave, las cuales han sido obtenidas por cultivo de células germinales primordiales de ave durante períodos prolongados en cultivo de tejido. Todavía otro objetivo de la invención es usar células germinales de ave, las cuales han sido producidas al cultivar células germinales primordiales en cultivo durante períodos prolongados, en las cuales se ha introducido una secuencia de ácido nucleico deseada, para la producción de aves quiméricas transgénicas, de preferencia, pollos quiméricos transgénicos. Todavía otro objetivo de la invención es usar las aves quiméricas transgénicas resultantes, de preferencia Gallinácea, y muy preferiblemente pollos o pavos, para la producción de proteína o proteínas heterólogas codificadas por una secuencia de ácido nucleico contenida en las células introducidas en las mismas, de preferencia mediante la recuperación de tales proteínas de los huevos de tales aves quiméricas transgénicas, en particu lar, pollos quiméricos transgénicos y su progenie. De manera alternativa, tales proteínas pueden ser recuperadas del ave quimérica transgénica directamente, por ejemplo, a partir del sistema circulatorio (sangre o linfa) u otros tejidos o fluidos corporales. Otro objetivo de la invención es usar células germinales de ave, de preferencia células germinales embriónicas de pollo obtenidas mediante cultivo prolongado de células germinales primordiales de ave, para clonación de aves, por ejemplo, pollos clonados (los cuales pueden ser transgénícos).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DI B UJOS Figura 1 . Manchado con anticuerpo EMA-1 en células ES de ratón . Los paneles A y B denotan dos cultivos diferentes. A1 y B1 - imágenes manchadas con DAPI de agrupamientos de células ES de ratón. A2 y B2 -imágenes de fase de contraste de agrupamientos de células ES de ratón. A3 y B3 - señal positiva de FITC en células ES de ratón. Figura 2. Manchado con anticuerpo EMA-1 en cultivos de PGC de 98 días de edad. Los paneles A y B denotan dos agrupam ientos diferentes. A1 y B 1 - imágenes manchadas con DAPI de agrupamientos de PGC de 98 días de edad. A2 y B2 - imágenes de fase de contraste de los agrupamientos de PGC. A3 y B3 - señal positiva de FITC en PGCs. Figura 3. Manchado con anticuerpo EMA-1 en PGCs de pollo recién recolectadas. Los paneles A y B denotan dos diferentes tratamientos. A1 y B 1 - imágenes manchadas con DAPI de PGCs frescas. A2 y B2 - señal positiva de FITC en PGCs. Notar las puntas de flechas en PGCs manchadas con DAPI en A1 que corresponden a PGCs que muestran una señal positiva de FITC en A2. Figura 4. Manchado con anticuerpo EMA-1 en células de fibroblasto primarias de pollo. Los paneles A y B denotan dos cultivos diferentes. A1 y B 1 - imágenes manchadas con DAPI de fibroblastos de pollo. A2 y B2 -imágenes de fase de contraste de fibroblastos de pollo. A3 y B3 - imagen de FITC de fibroblastos de pollo (negativa) . Figu ra 5. Manchado con anticuerpo MC-480 en células ES de ratón. Los paneles A y B denota n dos cultivos diferentes. A1 y B 1 - imágenes manchadas con DAPI de agrupamiento de células ES. A2 y B2 - imágenes de fase de contraste de células ES de ratón . A3 y B3 - señal positiva de FITC en células ES de ratón. Figura 6. Manchado con anticuerpo MC-480 en un tratamiento de un cultivo de PGC de 98 días de edad. A1 - imagen manchada con DAPI de agrupamiento de PGC de 98 días de edad . A2 - imagen de fase de contraste del agrupamiento de PGC. A3 - señal positiva de FITC en PGCs de 98 días de edad. Figura 7. Manchado con anticuerpo MC-480 en PGCs de pollo recién recolectadas. Los paneles A y B denotan dos diferentes tratamientos. A1 y B 1 - PGCs frescas manchadas con DAPI . A2 y B2 - señal positiva de FITC en PGCs. Ver las puntas de flecha en las PGCs manchadas con DAPI en A1 que corresponden a señales positivas de FITC en A2. Figura 8. Manchado con anticuerpo MC-480 en células de fibroblasto primarias de pollo. Los paneles A y B denotan dos cultivos diferentes. A1 y B 1 - imágenes manchadas con DAPI de fibroblastos de pollo, A2 y B2 - imágenes de fase de contraste de fibroblastos de pollo. A3 y B3 - imagen de FITC en fibroblastos de pollo (negativa) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Como se discutió, la presente invención proporciona un novedoso método para mantener células germinales primordiales (PGCs) de ave " (pollo) en cultivo de tejido durante períodos prolongados, es decir, durante al menos 14 d ías, más preferiblemente al menos 25 días e idealmente, de manera indefinida. Nos encontramos ahora en 4 meses de cultivo continuo y aproximadamente 32 pasos celulares. Antes de la presente invención, no había ningún método reportado para mantener PGCs de ave en cultivo de tejido, el cual proporcionar su mantenimiento durante más de aproximadamente 5 d ías (como era demostrado por su capacidad para producir aves quiméricas). Los presentes inventores han descubierto, de manera sorprendente, mediante experimentación juiciosa, que el uso de un medio de cultivo conteniendo al menos los sig uientes factores de crecimiento: factor inhibidor de leucemia (LI F) , factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), factor de célula eje (SCF) y factor de crecimiento similar a insulina (IGF), permite que células germinales primordiales de ave, especialmente células germinales primordiales específicamente de pollo, sean mantenidas y que proliferen durante períodos prolongados, es decir, al menos 14 días, y substancialmente por más tiempo en cultivo de tejido. Más aún, se ha demostrado que estas PGCs son útiles para la generación de pollos quiméricos. Estas PGCs son útiles para la producción de PGCs de ave transgénicas, las cuales pueden ser usadas para producir aves quiméricas transgénicas. Se espera que estas aves quiméricas transgénicas serán útiles para la recuperación de proteínas heterólogas, las cuales, de preferencia, pueden ser recuperadas directamente de los huevos de tales aves transgénicas quiméricas, o de tejidos y otros fluidos corporales. Por ejemplo, tales aves pueden ser usadas para la producción y recuperación de proteínas terapéuticas y otros polipéptidos.

Sin embargo, la base de esta invención es la observación adicional de q ue estas PGCs, después de cultivo prolongado, es decir, aproximadamente después de 25 días, se des-diferencían, y aparentemente resultan en la producción de células germinales embriónicas (EG). Específicamente, después de 25 d ías, las PGCs cultivadas (amontonamientos) forman monocapas celulares que se esparcen rápidamente, las cuales tienen una base adherente plana. En la superficie de las mismas se encuentras células "similares a PGC" más sueltas. Más aún , algunas de estas células son PAS positivas con el manchado. Además, las células manchadas con Dil obtenidas de estas monocapas, sobre la transferencia a embriones de ave receptora, se localizan en las gónadas. Más aún, estas monocapas celulares pueden ser pasadas, en teoría , de manera indefinida. También se observó que después de aproximadamente 3 a 5 pasos, algunas células se hacían lentas en su papel de proliferación y adoptaban una apariencia similar a fibroblasto. Sin embargo, algunas líneas celulares han sido pasadas múltiples veces, y continúan medrando sin ninguna señal de diferenciación, aún después de cuatro meses en cultivo de tejido continuo. También se observó que, conforme el número de células aumenta en tales colonias celulares, la monocapa celular se vuelve más "com pacta", dando la apariencia de colonias celulares de múltiples capas.

Como se discute infra, se han obtenido de ah í dos líneas de células, una de las cuales es positiva para fosfatasa alcali na y aparentemente no está diferenciada. Además, expresa otros m arcadores característicos de tipos de células pluripotentes y totipotentes. De esta manera, se cree que esta línea celular es una l ínea de células germinales embriónicas. Así, esta invención se basa en el descubrimiento de que PGCs pueden desdiferenciarse en cultivo para producir células EG. Como se discute infra, esto es un descubrimiento muy significativo, ya que tales células pueden ser usadas para clonar aves, y para producir aves quiméricas. Además, estas células germinales embriónicas pueden ser usadas para estudiar la diferenciación de líneas de células embriónicas de ave in vitro. Adicionalmente, estas células pueden hacerse transgénicas (mediante la introducción de la secuencia de ácido nucleico deseada) y pueden usarse para hacer aves clonadas o quiméricas transgénicas, de preferencia del género Gallinácea, y muy preferiblemente pollos o pavos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA I NVENCIÓN De esta manera, la presente invención obvia los problemas asociados con métodos de cultivo de PGC de ave previos, los cuales no permitían que tales PGCs fueran mantenidas en cultivo de tejido durante períodos mayores que aproximadamente cinco días. Como se discute con detalle infra, los presentes inventores han descubierto, de manera sorprendente, que las PGCs de ave, de preferencia PGCs de Gallinácea, y muy preferiblemente PGCs de pollo, pueden ser mantenidas en cultivo de tejido durante períodos prolongados, en al menos 14 días, más preferiblemente al menos 25 días, y preferiblemente por más tiem po, mediante el uso de medio de cultivo, el cual contiene al menos los siguientes cuatro factores de crecimiento: factor inhibidor de leucemia (LI F) , factor de célula eje (SCF) , factor de crecimiento similar a insulina (IGF) y factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF). En general, tal método de cultivo comprende los siguientes pasos: (i) aislar PGCs de embriones de ave de Etapa XI I a XIV donadores; y (ii) cultivar dichas PGCs aisladas en un medio de cultivo que contenga cantidades relativas de LI F, bFGF, SCF e IGF efectivas para promover su proliferación , durante un período prolongado, es decir, normalmente después de al menos 28 d ías, en cultivo de tejido para producir células EG. Más aún , como se discutió supra, la presente invención se basa en el descubrimiento de que tales PGCs, después de ser cultivadas en este medio durante períodos prolongados, en promedio a aproximadamente 25 días, aparentemente se des-diferencían para producir células germinales embriónicas de ave. A este respecto, se ha reportado antes que PGCs de ratón mantenidas en monocapas de células alimentadoras STO en la presencia de LI F y bFGF, resultaron en células que se asemejan a las células eje embríónicas (Resnick et al, Nature, 359:550-551 , 1 992; Matsui et al, Cell, 70: 841 -843, 1 992). Resnick et al (Id .) sugirieron el nombre de células germinales embriónicas (EG) para este tipo de célula, para implicar que son originadas de PGCs in vitro, aunque no estuvo claro en ese momento si las células EG fueron significativamente diferentes que las células ES tradicionales.

Desde entonces se ha mostrado, al menos con l íneas de células embriónicas de ratón, que las células EG difieren de células ES en el estado de metilación de ciertos genes (Labosky et al . , Development, 120:31 97-3204, 1994; Piedra hita et al . , Biology of Reproduction (Biología de la reproducción), 58: 1 321 -1 329, 1 998). Sin embargo, como las células ES, se ha mostrado que las células EG se diferencian extensivamente en cultivo y contribuyen a q uimeras cuando son inyectadas en blastocitos huéspedes, demostrando así su naturaleza pl uripotente y totipotente. Está por mostrarse si las células EG y ES de ave también tendrán diferencias en la metilación de genes. Aunque no se desea sostener con esta hipótesis, se cree que la presente invención son células EG porque se derivan de PGC y no de blastodermo como lo son las células ES . El hecho de que estas células son aparentemente células germinales embriónicas está soportado por varias pruebas. En particular, células de tejido son positivas para fosfatasa alcalina (Pain et al, Development, 122:2339-2342, 1 996), y antígenos 1 y 3 específicos de ratón (basados en la reactividad con anticuerpos monoclonales específicos para SSEA-1 y SSEA-3). Estos son marcadores para células pluripotentes y totipotentes. De esta manera, las células eje pluripotentes y totipotentes de ave (pollo) y ratón, aparentemente comparten epitopes relacionados, característicos de su estado no diferenciado. Así, estos anticuerpos son útiles para seleccionar cél ulas germinales embriónicas de ave, las cuales surgen en colonias de células producidas sobre el cultivo prolongado de PGCs de ave usando el sistema de cultivo objetivo.

La totipotencia y pluripotencia de estas células EG pueden confirmarse mediante transferencia a embriones de pollo de etapa X (como se describió por Etches et al, Poultry Science, 72:882-887, 1 993). Esto proporcionará evidencia de que estas células EG de ave son capaces de ocasionar diferentes características de tejido de etapas de desarrollo diferentes (pluripotentes), así como que migran a las gónadas, demostrando la transmisión de la línea germinal. En consecuencia, después de la transferencia, estas células EG deberían ocasionar aves quiméricas de línea germinal y somática. Los métodos para el aislamiento de células germinales primordiales a partir de embriones de aves donadoras han sido reportados en la literatura y pueden efectuarse por alguien experto en la técnica, (ver, por ejemplo, J P 924997 publicada el 7 de septiembre de 1 993 Pub. No. 05-227947; Chang et al. , Cell Biol. Int. , 19(2): 143-149 (1 992); Naito et al. , Mol. Reprod. Devel. 39: 1 53-161 (1 994); Yasuda et al. , J. Reprod. Fert. , 96:521 -528 (1 992); y Chang et al. , Cell Biol. Int. Repórter, 16(9): 853-857 (1 992), todas incorporadas en la presente por referencia en su totalidad). Los presentes inventores eligieron aislar PGCs de ave de huevos de pollo, los cuales habían sido incubados durante aproximadamente 53 horas (etapa 1 2-14 de desarrollo embriónico), la remoción de embriones de los mismos , la recolección de sangre embriónica de la aorta dorsal de los mismos, y transferencia de la misma a medio de cultivo celular adecuado (medio M 1 99) . Estas PGCs fueron purificadas entonces mediante centrifugación de densidad de ficoll , y se resuspendieron en 1 0 µl del medio de cultivo conteniendo factores de crecimiento de la presente invención . Sin embargo, como se discutió antes, se conocen otros métodos para aislar PGCs y pueden ser usados de manera alternativa. Las PGCs aisladas son contadas entonces y separadas manualmente (por ejemplo, usando una pipeta). Posteriormente, las PGCs recolectadas a partir de estos diferentes embriones de ave son depositadas (para aumentar los números de PGC) y son incubadas en el medio conteniendo factor de crecimiento objetivo. Este medio de cultivo, de aqu í en adelante referido como medio "completo" contiene LI F, bFGF, SCF e IGF, as í como otros substituyentes normalmente comprendidos por medio de células eje embriónicas y PGC. De manera más específica, el medio "completo" objetivo preferiblemente comprenderá a-MEM , un medio de crecimiento celular comercialmente disponible, bien conocido, al cual se han adicionado los cuatro factores de crecimiento anteriores y que adicionalmente incluye 10% de suero de ternera fetal, L-glutamina 2 mM, 0.48% de antibiótico/antimitótico, 2-ß mercaptoetanol 132 µM , 1 U/µl de LI F, 0.40 pg/µl de bFGF, 60 pg/µl de IGF-I y 80 pg/µl de SCF. Basado en los experimentos conducidos a la fecha, se cree que éstas corresponden a las concentraciones m ínimas de estos factores de crecimiento. Sin embargo, como se describe infra, las cantidades de estos factores de crecimiento han sido dobladas manteniendo exitosamente las PGCs en cultivo de tejido. De esta m anera, se sabe que las cantidades respectivas de estos factores de crecimiento pueden incrementarse sin ningún efecto adverso. Más aún , incluso estas cantidades m ínimas pueden variar, por ejemplo, si se cultivan PGCs de otras aves .

Como se nota, los presentes inventores usaron como el medio base, a-MEM , un medio de cultivo de tejido comercialmente disponible, bien conocido. Sin embargo, se espera que otros medios puedan ser substituidos por el mismo, siempre que también estén presentes estos cuatro factores de crecimiento esenciales. Los solicitantes contemplan de manera particular, la modificación del "medio completo" objetivo para eliminar el suero de ternera fetal, debido a su composición variable y no definida. Una ventaja particular de la presente invención es el hecho de que las células EG pueden ser mantenidas en la ausencia de una capa alimentadora, lo cual proporciona colonias más puras y una preparación más limpia cuando se producen animales quiméricos o clonados. La pureza incrementada de la preparación de células EG resulta a su vez en una probabilidad incrementada de éxito para producir animales quiméricos y clonados. Sin embargo, la presente invención también puede realizarse con una capa alimentadora, siempre que estas células sean transfectadas con genes que codifican los factores de crecimiento descritos, eliminando con ello la necesidad para la adición exógena de estos factores durante el cultivo. Esencialmente, las células proporcionarán una fuente continua de estos factores de crecimiento. (Esto se logrará al colocar estos genes de factores de crecim iento bajo el control de un promotor fuerte constitutivo y también secuencias que proporcionen la secreción del mismo, haciendo dispon ibles con ello los factores de crecimiento para las PGCs cultivadas).

Como se notó, las cantidades de estos factores se refieren a cantidades relativas de los mismos, efectivas para permitir el cultivo prolongado de PGCs de aves, de preferencia, PGCs de Gallinácea, y muy preferiblemente PGCs de pollo o pavo, durante períodos prolongados en cultivo de tejido. En la presente invención, esto se refiere a cantidades que ocasionan la des-diferenciación de las PGCs cultivadas en células EG. De preferencia, las cantidades relativas de estos factores de crecimiento cae dentro de los siguientes rangos: LI F 1 U/µl a 100 U/µl, más preferiblemente 1 a 1 0 U/µl y muy preferiblemente 1 a 5 U/µl; IGF-I 0.60 pg/µl a 60.00 pg/µl, más preferiblemente 0.60 pg/µl a 6.0 pg/µl en peso y muy preferiblemente 0.60 pg/µl a 1 .0 pg/µl; SCF 80 pg/µl a 8000 pg/µl en peso, más preferiblemente 80 pg/µl a 800 pg/µl y muy preferiblemente 80 pg/µl a 160 pg/µl en peso; y bFGF 0.40 pg/µl a 40 pg/µl, más preferiblemente 0.40 pg/µl a 4.0 pg/µl en peso y muy preferiblemente 0.40 pg/µl a 0.80 pg/µl. En los rangos expuestos arriba, los rangos superiores no son críticos para la invención y son dictados enormemente por el costo (dado el sig nificativo gasto asociado con la fabricación de los factores de crecimiento). Sin embargo, se espera que estos rangos preferidos pueden variar, por ejemplo, si a-MEM es substituido por otro medio de crecimiento y si se cultivan otros tipos de PGCs de ave. Como se discutió, estas PGCs pueden ser mantenidas durante largos períodos en cultivo con la producción exitosa de aves quiméricas. A la fecha, las células han sido mantenidas en cultivo de tejido hasta por aproximadamente 4 meses , aparentemente sin efectos adversos . Además , las cél ulas de hasta 25 d ías han sido probadas por su capacidad para formar colonias de manera efectiva en gónadas embriónicas de aves y producir aves quiméricas. Sin em bargo, se espera que estas células puedan ser cultivadas de manera indefinida, con retención de la capacidad para producir aves quiméricas. Se conocen métodos para usar PGCs para producir quimeras en la técnica, como es evidenciado por la técnica anterior discutida supra. De preferencia, las células EG serán transferidas en embriones de aves receptoras de acuerdo a los métodos descritos en el ejemplo que sigue. Posteriormente, la producción exitosa de quimeras es evaluada con base en la migración y colonización de PGCs en las gónadas, retención de fenotipo PGC o al evaluar la presencia de PGCs de donador en las gónadas después de la salida del cascarón y crianza. En el presente ejemplo, los inventores seleccionaron genotipos, los cuales son seguidos fácilmente, los cuales afectan la coloración. (Las aves donadoras fueron tipo pollo tierno blanco y las aves receptoras fueron aves de pluma negra, respectivamente, teniendo genotipos potenciales específicos.) Las quimeras putativas fueron de plumas negras y produjeron progenie negra/blanca cuando se aparearon con aves de plumas negras. Con ello, se demostraron quimeras exitosas con base en la producción de aves conteniendo plumas negras/blancas. En una segunda estrategia , se usaron aves Bar Rock como receptoras, y aves de plumas blancas como donadoras. Las aves quiméricas putativas fueron demostradadas con base en la producción de progenie de plumas blancas teniendo algunas plumas rayadas.

Sin embargo, el método objetivo debería ser aplicable para introducir cualquier rasgo deseado mediante quimerización. Esto dependerá, por supuesto, de las propiedades genotípicas de las PGCs transferidas. Como se discute, una aplicación significativa de las PGCs objetivo, las cuales pueden ser mantenidas en cultivo durante períodos largos, es la producción de aves quiméricas. Esto se logrará al introducir una secuencia de DNA deseada en las PGCs cultivadas. Se conocen medios para introducir DNAs en células receptoras e incluyen técnicas de lipofección, transfección, microinyección, transformación, de microproyectiles, etc. En particular, los presentes inventores eligieron in icialmente introducir un vector conteniendo un gene reportador por lipofección. Sin embargo, aunque se produjeron PGCs transientemente transfectadas, todavía no se ha aislado una línea celular transfectada estable. No obstante, se espera que esto puede lograrse mediante técnicas conocidas usando las PGCs objetivo. De preferencia, se introducirá un DNA que codifique un gene deseado, por ejemplo, polipéptido terapéutico, factor de crecimiento, enzima, etc. , bajo el control regulador de secuencias operables en aves. De preferencia, estas secuencias reguladoras serán de origen eucariótico, muy preferiblemente secuencias reguladoras de ave, por ejemplo, pollo. Los promotores operables en células de ave, por ejemplo, derivadas de genes o virus de ave son conocidos en la técnica. I nícialmente, una l ínea celular estable, la cual produce la proteína deseada, será aislada y usada para la producción de quimeras. Además, es deseable que el DNA introducido contenga un DNA marcador, cuya expresión sea fácilmente detectada, para identificar más fáiclmente las céulas que contienen el DNA insertado. Tales marcadores seleccionares son bien conocidos e incluyen ß-lactamasa, ß-galactosidasa, neomicin fosfotransferasa, etc. La inyección de PGCs transgénicas resultantes en embriones de ave, resultarán entonces en la producción de aves quiméricas transgénicas. De preferencia, la proteína deseada será recuperada entonces a partir de fluidos corporales de huevo, etc. de estas aves transgénicas, proporcionando con ello un suministro continuo de la proteína. Como se discute, la presente invención involucra la producción de células EG a partir de PGCs, las cuales han sido cultivadas como se describió antes. Estas células EG serán identificadas con base en su expresión de marcadores o antígenos "ES" característicos, en partir, fosfatasa alcalina y antígenos embriónicos de etapa específica. Por ejemplo, pueden usarse anticuerpos monoclonales específicos para SSEA-1 y SSEA-3 para identificar células pluripotentes y totipotentes en PGCs, las cuales han sido cultivadas durante períodos prolongados, normalmente al menos 25 días en cultivo de tejido. MC-480, por ejemplo, es un anticuerpo monocional específico para el antígeno SSEA-1 (Solter y Knowles ( 1978)) .

Además, otro anticuerpo monoclonal, EMA-1 , es específico para PGCs de ratón y pollo, y por ello debería permitir la identificación de cultivos de PGC que retengan epitopes específicos de PGC. (Este anticuerpo une epitopes específicos expresados tanto en células germin ales primordiales de ratón como de pollo.) En consecuencia , EMA-1 debería ser útil para la caracterización adicional de célu las EG de ave genéricamente, ya que estos epitopes son aparentemente conservados en especies muy diferentes (aves y mamíferos) . Como se discute, la totipotencia y pluripotencia de estas células EG pueden ser probadas por transferencia a embriones de aves, por ejemplo, por transferencia a embriones de pollo de etapa X, como se describió por Etches et al, Poultry Science, 72:882-889, 1 993 y embriones de etapa XI I-XIV, como se discutió antes. Esto proporcionará evidencia experimental de que estas células EG se diferencian en tipos de tejidos diferentes (pluripotentes) encontrados en embriones en desarrollo y también que pueden migrar y colonizar exitosamente las gónadas (demuestra que tales céluls serán transm itidas a la línea germinal). En consecuencia. Estas células resultarán en aves quiméricas de línea germinal y somática, por ejemplo, pollos quiméricos.

GENERACIÓN DE POLLOS TRANSGENICOS: El desarrollo de un sistema de cultivo para soportar la proliferación de PGCs y permitir además su des-diferenciación en células EG, aumenta nuestra capacidad para transfectar células con constructos de vector de DNA portando genes exógenos para la producción sistém ica de proteínas extrañas en pollos. De manera similar, la generación de sitio dirigido (recom binación homologa) también conocida como pollos transgénicos "knock-outs" y "knock-ins" será posible debido a que el método facilita la selección y proliferación de células EG después de la transfección .

USO DE CÉLULAS EG PARA CLONACIÓN DE POLLOS: Ya se ha logrado la clonación de mam íferos. La clonación de aves puede ser efectuada usando células EG y PGCs y posiblemente células embriónicas diferenciadas (fibroblastos embriónicos de pollo, CEF). Esto puede lograrse como sigue: 1 . Se producirán quimeras de pollo mediante irradiación gamma de huevos recién puestos en una forma tal que las células del embrión son comprometidas. Esto será seguido por microinyección de células EG clonadas en números aproximadamente equivalentes al número de células contenidas en el blastodermo comprometido. El nivel óptimo de irradiación gamma y el número de células inyectadas puede ser determinado fácilmente de acuerdo a las enseñanzas en la técnica (Carsience et al. , Development (1 993) 1 1 7:659-675; Etches et al. , Poultry Sci. (1 993) 73:882-889). 2. Los clones de pollo serán generados a partir de huevos no fertilizados recién puestos, mediante la extracción del oocito no fertilizado seguido por irradiación gamma, estimulación eléctrica del oocito, inyección y fusión de un EG, PGC o CEF. Después de la fusión, el oocito será transferido a una caja petri conteniendo medio de cultivo de embriones (Ono et al, Devel. Biol. , 161 : 1 26-1 30, 1 994), o injertado nuevamente en un huevo no fertilizado.

EJ EMPLO Se usaron los siguientes materiales y métodos en los experimentos descritos más adelante.

Materiales y métodos. Anticuerpos monoclonales Los anticuerpos primario EMA-1 y MC-480 (anticuerpo anti-SSEA-1 ) fueron obtenidos de Developmental Studies Hybridoma Bank (DS HB) , The University of lowa. Anticuerpo EMA-1 : El anticuerpo monoclonal EMA-1 es un marcador de superficie celular específico para células germinales primordiales de ratón (PGCs), desarrollado por Hahnel y Eddy (1 986). Este reactivo se desarrolló contra los marcadores de superficie celular de células de carcinoma embrional (EC) de ratón Nulli SCCI . El anticuerpo fue preparado al fusionar células de mieloma NS-1 con células de bazo de ratones C57BI/6J inmunizados con células EC de Nulli SCCI . El anticuerpo monoclonal EMA-1 es de isotipo IgM (Addendum # 1 ). El antígeno reconocido por el anticuerpo es una glicoproteína de superficie celular. La expresión del antígeno EMA-1 en PGCs de ratón está restringida a los días 8 a 1 3 en un embrión de ratón en desarrollo. EMA-1 reacciona con la mayoría, pero no con todas, las células pluripotentes en embriones tempranos (Hahnel y Eddy, 1987). De acuerdo a Hahnel y Eddy (1 986), las PGCs son las únicas células que se manchan fuertemente con EMA-1 en las regiones caudales de embriones de 9.5 a 1 1 días. Se mostró reactividad con PGCs en los bordes urogenitales de la región media caudal de secciones de embriones de 1 3 días de edad de ratón macho. No se mostró reactividad con PGCs en secciones de embrión de ratón de 14 días de edad. EMA-1 se une a la periferia y a un granulo citoplásm ico presente en PGCs. El antígeno que porta EMA- 1 determinante en las células Null i es insensible a tratamiento de tripsina y EDTA. Anticuerpo MC-480 (Anti-SS EA-1 ): El anticuerpo monoclonal MC-480 reconoce un antígeno embriónico de ratón de etapa específica SSEA-1 . El anticuerpo es el isotipo IgM, descrito por Solter y Knowles (1978). El antígeno de superficie celular SSEA-1 identificado por este anticuerpo está compuesto por un epitope de carbohidrato en glicolípidos y glicoproteínas involucrando el grupo sanguíneo tipo 2 fucosilado (addendum #2). El anticuerpo se desarrolló por la fusión de células de mieloma de ratón con células de bazo de ratones inmunizados con células de teratocarcinoma F9. La especificidad de este anticuerpo fue probada en una serie de l íneas de células humanas y de ratón usando un radioinmunoensayo (RÍA). El anticuerpo reaccionó con células de teratocarcinoma de ratón y dos líneas de células derivadas de teratocarcinoma humanas (Solter y Knowles, 1 978). Todas las líneas de células diferenciadas derivadas de las mismas líneas de células eje de teratocarcinoma y tumores fueron negativas para el antígeno. El sobrenadante del hibridoma se probó adicionalmente en embriones de ratón. El anticuerpo no mostró reactividad con huevos no fertilizados, cigotos , y embriones de las etapas celulares 2 a 4. El anticuerpo une con eficiencia en incremento para mórulas y embriones de etapa celular 8 tard ía. La cantidad de ligadura dismin uyó en blastocistos. Las pruebas que usan lisis depend iente de complemento mostraron una tendencia similar. No se observó lisis alguna de embriones antes de la etapa celular 8. Se observó lisis moderada de embriones de etapa celular 8 ( 1 0-20%) mientras q ue las móru las, blastocistos y masas celulares internas se usaron con alta eficiencia (Solter y Knowles, 1978). Los resultados con ensayos de inmunofluorescencia indirecta también fueron similares donde los huevos sin fertilizar, cigotos y embriones de etapa 2 y 4 fueron negativos. La mayoría de las masas celulares internas (ICM) cultivadas in vitro hasta 3 días fueron positivas para el antígeno. El ectodermo expuesto al remover la capa exterior del endodermo de ICM que creció in vitro, siempre fue com pletamente positivo. Solter y Knowles (1 978) argumentaron que probablemente varias glicosil transferasas de etapa específica son sintetizadas o activadas y están presentes en las superficies celulares durante la preimplantación y desarrollo embriónico temprano.

Animales Se han usado pollos tipo pollo tierno blancos (E/E e l/l) como donadores de PGCs para desarrollar el sistema de cultivo de PGC de largo plazo. Se usaron dos tipos de ave como embriones receptores, una línea de pollo de plumas neg ras dom inante (E7- e i/i) y una línea Bar Rock (E7E e i/i). Las aves negras dominantes inyectadas con PGCs tipo pollo tierno blanco (WB) son referidas como El- (WB) y las aves Bar Rock inyectadas con PGCs tipo pollo tierno blanco son referidas como BR (WB).

Extracción de PGCs Se seleccionaron embriones de etapa 1 2 a 1 4 para extracción de PGC. Las PGCs fueron recolectadas de la aorta dorsal con una micropipeta fina, como se describió por Naito et al. , Mol. Reprod. Dev. , 37: 1 67-171 (1994). Las PGCs de 20 embriones fueron depositadas en solución de Hank complementada con 1 0% de suero bovino fetal y se concentraron por centrifugación de gradiente de densidad de Ficoll (Naito et al. , Mol. Reprod. Dev. , 39: 1 53-171 , 1994). Las PGCs fueron contadas y distribuidas en gotas de 1 0 µl de medio de cultivo (DM EM , conteniendo cantidades diferentes de factores de crecimiento) en aproximadamente 100 hasta 600 PGCs por gota. Las gotas de cultivo fueron sobrepuestas con aceite mineral ligero estéril.

Invección de PGCs en embriones receptores Se usaron embriones de etapa 1 3-14 como embriones receptores. Después de colocar el huevo en la superficie apropiada, se permitió que se el embrión en desarrollo se colocara por sí mismo en el lado superior del huevo en reposo. Se hizo una pequeña abertura de 1 0 mm o menos ("ventana") en el cascarón con un fórceps fino. El embrión fue llevado cerca de la superficie al adicionar una mezcla de solución salina de amortiguador de fosfato con 4% de antibióticos. Después de acomodar el embrión para visualizar su corazón, la aorta dorsal y/o vena marginal pudieron ser identificadas fácilmente. Se tomaron doscientas PGCs donadoras en 2 µl de medio conteniendo 0.04% de azul tripano en una micropipeta. Se inyectaron PGCs en la aorta dorsal del embrión receptor. El azul tripano, un colorante celular inerte, permitió la visualización de la suspensión de PGC cuando estaba siendo entregada. Después de la inyección, se cerró la abertura del cascarón de huevo con cinta quirúrgica y se reforzó con parafina. Los huevos fueron mantenidos durante 24 horas bajo observación en una incubadora de CO2 humidificada y posteriormente se transfirieron a una incubadora regular hasta la salida del cascarón.

Manchado fluorescente viable de PGCs Para evaluar el éxito de las transferencias y/o la capacidad de PGCs para migrar a las gónadas, las PGCs fueron manchadas con mancha fluorescente de Dil . Los embriones fueron recolectados después de 24 horas de transferencia, se colocaron en una caja petri y se observaron bajo un microscopio invertido equipado para análisis epi-fluorescente.

Condiciones de cultivo Se han probado varias concentraciones de factor inhibidor de leucemia humano (Lif), factor de crecimiento de fibroblasto básico humano (b-FGF) , factor de crecimiento similar a insulina humano (IGF) y factor de célua eje humano (SCF). De igual manera, se probaron fibroblasto de pollo tratado con mitomicina y capas alimentadoras de células STO de ratón.

MEDIO DE CU LTIVO CELULAR DE LARGO PLAZO DE PGC El medio de cultivo celular completo se hace de a-MEM, 1 0% de suero de ternera fetal, L-glutamina 2 m M, 0.56% de antibiótico/antimitótico, 2-ß mercaptoetanol 34.56 mM, 0.00625 U/µl de factor inhibidor de leucemia (LI F) , 0.25 pg/µl de factor de crecimiento de fibroblasto básico (b-FGF) , 0.5625 pg/µl de factor de crecim iento similar a insu lina (IGF) y 4.0 pg/µl de factor de célula eje (SCF) . Se realizaron cambios de medio un día sí y otro no al remover 5 µl de medio y adicionar 5 µl de medio nuevo 2X. el último asum ió que los factores de crecimiento fueron lábiles después de algún periodo de cultivo continuo. Sin embargo, el resultado neto es que la concentración de los factores de crecimiento es doblada. De ahí que el medio final contiene ahora las siguientes concentraciones de factores de crecimiento: 0.0125 U/µl de factor inhibidor de leucemia (LI F) , 0.5 pg/µl de factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), 1 .1 25 pg/µl de factor de crecimiento similar a insulina (IGF) y 8.0 pg/µl de factor de célula eje (SCF). El rango de concentraciones de factor de crecimiento descrito aqu í promueve el mantenimiento y proliferación de PGCs en cultivo continuo. Sin embargo, las PGCs sobreviven y proliferan mejor en el extremo más alto de las concentraciones de factores de crecimiento descritas. Usando estas condiciones de cultivo, PGCs forman amontonamientos adherentes de manera suelta, densos, grandes de células (algunos de los amontonamientos tienen varios cientos de células en ellos) dentro de 3 a 4 días después de la recolección. Al final de 7 días, los amontonamientos comienzan a tener grandes números de células muertas y desechos celulares alrededor de ellos. Los amontonamientos de PGC sobreviven hasta cuatro semanas antes de que se vuelvan monocapas celulares. En las semanas 1 , 2 y 3, los amontonamientos han sido disociados, manchados con un colorante vital Dil y transferidos a embriones receptores. En los tres puntos en el tiempo, se encontraron células en las gónadas de algunos de los embriones receptores. El número de células y el número de embriones que muestran PGCs manchadas en las gónadas, fue inversamente proporcional a la edad del cultivo de PGCs.

PROCEDIMIENTO DE PRUEBA DE ANTICUERPO Y CRECIMIENTO DE LI N EAS DE C ÉLULAS DE CONTROL Se sembraron células de capas alimentadoras STO irradiadas con rayos gamma (8000 rads) (American Type Culture Collection, Cat # 1503-CRL) en portaobjetos de cámaras de 4 cavidades a aproximadamente 70 a 80% de confluencia en Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; SIGMA, Cat # D-5523) . Las células ES de ratón, usadas como controles experimentales positivos, fueron sembradas en las capas de células alimentadoras STO 8 a 10 horas después. Se preparó el medio completo de DMEM al complementar el medio base a una concentración final de 4.5 g/l de glucosa (SIGMA, Cat # G-7021 ), 1 .5 g/l de bicarbonato de sodio (SIGMA, Cat # S-401 9), piruvato de sodio 1 mM (GI BCO, Cat # 21 985-023), 1 0% de suero bovino fetal (Hyclone, Cat # SH30070-03) y 1 % de antibiótico/antimicótico (S IGMA, Cat # A-7292). Los fibroblastos de pollo sembrados en los portaobjetos de cámara de 4 cavidades en medio completo de DMEM fueron usados como controles negativos. Las células fueron incubadas durante 3 d ías a 37°C y 6% de C02 cuando las células ES de ratón formaron colonias visibles. El medio se decantó, enjuagó con solución salina amortiguada de fosfato (PBS) y las células se fijaron en paraformaldeh ído al 4% frío (SI GMA, Cat # P-6148) durante 1 5 minutos a 4°C. Los agrupamientos de células de cultivos de PGC de pollo de 98 días de edad in vitro fueron transferidos en portaobjetos de cámara de 4 cavidades y se fijaron en paraformaldeh ído al 4% frío, al tiempo que las PGCs de pollo frescas se fijaron en portaobjetos de vidrio regulares. Se realizó el bloqueo durante 30 minutos usando un reactivo bloqueador (1 mg/ml de albúmina de suero bovino en PBS, Fisher, Cat # BP 1605-1 00). Los anticuerpos fueron diluidos a una proporción de 5 µg/ml en el reactivo bloqueador, y se aplicaron 200 µl en los portaobjetos respectivos, y se incubó durante 1 8 horas durante la noche a 4°C. Las células fueron enjuagadas una vez en PBS frío. Doscientos microlitros del anticuerpo secundario (IgM anti-ratón de cabra affinipure conj ugada con fluoresceína, Jackson laboratories, Cat 91 1 5-01 5-020), a una proporción de 5 µg/ml en reactivo bloqueador, se aplicaron en cada portaobjeto y se incubaron durante un periodo adicional de una hora a 37°C. Los portaobjetos se lavaron tres veces durante 5 minutos cada uno en Citrato Salino de Sodio (SSC) 4X conteniendo 0.1 % de Tween-20 (Fisher, Cat # BP337-100) a 37°C. Las células se mancharon durante 1 0 minutos a temperatura ambiente en 2X SSC conteniendo 400 ng/mi de DAPI (SIGMA, Cat # D-9542), se enjuagaron durante 3 minutos en 2X SSC conteniendo 0.05% de Tween-20 y se montaron en antidesvanecimiento DABCO (SIGMA, Cat D-2522). Se observaron los portaobjetos bajo un fotomicroscopio Nikon Eclipse E800 equipado con cam po brillante, D I C, fase y óptica de fluorescencia incluyendo una iluminación de epifluorescencia de lámara de mercurio de 100-Watt con filtros de barrera/excitación estándares. Las células fueron observadas bajo el conjunto de filtros apropiados para detectar señales FITC y núcleos manchados con DAPI . También se obtuvieron imágenes de fase de constraste de las células. Las imágenes digitalizadas fueron capturadas usando una cámara CCD enfriada con l íquido CoolCam (Cool Camera Company, Decatur, GA) usando el programa de cómputo Image Pro Plus versión 3.0 (Media Cybernetics, Silver Springs, NM) y se almacenaron en un drive Iomega ZI P. Las imágenes fueron procesadas usando el programa de cómputo Photoshop 4.0 (Adobe) y se imprimieron en papel brillante de calidad de fotografía usando la impresora Epson Stylus-800.

TRANS FERENCIA DE PGC A EMBRION ES RECEPTORES Para la transferencia de PGC, el huevo receptor fue colocado horizontalmente bajo un alcance de disección. Se perforó un pequeño orificio en el espacio de aire del huevo para dism inuir la presión interna del huevo y prevenir la fuga. Se abrió una ventana de 1 0 mm en la superficie ventral del huevo y se inyectó ~ 1 m i de PBS con 4% de antibiótico/antimitótico a través del orificio para llevar el embrión casi al ras de la ventana del cascarón del huevo. Para inyectar las PGCs, se inclinó una pipeta de 30 µl y entonces se jaló usando una microforja para formar un punto fino con bordes pulidos. Se escogieron manualmente doscientos de PGCs para transferencia de embrión, disociadas como se describió más adelante , usando una pipeta de aguja y un tubo de succión .

Antes de la transferencia, y cuando estaban en la pi peta, las PGCs fueron mezcladas con una solución al 0.04% de mancha de azul tripano. El volumen de inyección total por embrión fue 2 µl. Para el paso final, el embrión receptor fue colocado para revelar una porción de la vena marginal . La pipeta de agua con las PGCs fue insertada y los contenidos fueron expelidos cuidadosamente. La pipeta de agua fue sostenida en su lugar durante unos cuantos segundos y entonces se removió. Los huevos receptores fueron sellados con 2 capas de cinta quirúrgica seguida por recubrimiento de cera de parafina del área entera. Los huevos receptores fueron colocados entonces de regreso en una incubadora receptora y se incubaron hasta la salida del cascarón.

EVALUACIÓN DEL FENOTIPO DE PGC Las PGCs de pollo son positivas para manchado ácido de Schiff periódico (PAS) y se reclaman por ser positivas para fosfatasa alcalina.

Sin em bargo, no existe ninguna evidencia convincente de que las PGCs de pollo son positivas para lo último. En la ausencia de un método marcador molecular o enzimático alternativo para caracterizar PGCs de pollo, se evaluó su fenotipo al transferir célu las a em briones receptores y evaluar su presencia en las gónadas del embrión en desarrollo. Este método requirió cultivar las PGCs en 1 00 µg/m l de Dil en un medio a-MEM y enjuagar antes de la transferencia a embriones receptores . Se removieron los embriones receptores post-transferencia veinticuatro horas después, y se colocaron bajo un m icroscopio i nvertido. Las células marcadas con Dil observadas en las gónadas fueron interpretadas como la migración de PGC exitosa a las gónadas y la confirmación de la retención de las características de PGC. Se persiguió un segundo método para evaluar la retención del fenotipo de PGC al dejar que los embriones receptores salieran del cascarón y entonces evaluar la presencia de PGCs donadoras en sus gónadas después de la crianza.

ESTRATEGIA DE CRIANZA PARA EVALUACIÓN DE PGC Se siguieron dos estrategias de crianza. La primera estrategia usó aves de plumas negras receptoras con posible genotipo i/i, E/E, s/s, b/b y aves tipo pollo tierno de plumas blancas donadoras con genotipo l/l , E/E, S/S, B/B. Para probar que los animales receptores fueron quiméricos, es decir, que contienen sus propias PGCs y PGCs donadoras en sus gónadas, se aparearon con aves de plumas negras puras. Si la progenie resultante fue toda de plumas negras, entonces, se asumió que el animal era no quimérico. Sin embargo, si alguna de la progenie era de plumas blancas con algunos parches de plumas negras, entonces el animal receptor sería quimérico. Para la segunda estrategia de crianza, se usaron aves Bar Rock como embriones receptores, mientras que las aves tipo pollo tierno de plumas blancas se siguieron usando como donadoras. En este último caso, cuando las aves quiméricas putativas se aparearon con Bar Rocks puras, la presencia de progenie de plumas blancas con algunas plumas rayadas identificaría un ave quimérica positiva. Se obtuvieron cincuenta progenie de cada ave quimérica putativa antes de concluir sobre su estado quimérico.

PRU E BAS DE PROGENI E Las aves E/-(WB) quiméricas putativas, cuando se cruzaron con aves WB, produjeron pollos blancos puros, cuando se originaron de una PGC donadora (WB) y, pollos de plumas negras salpicadas cuando se originaron de PGC de (E/-). De manera similar, cuando BR(WB) se cruzaron con aves WB, se produjeron pollos blancos puros cuando se originaban de una PGC donadora (WB) y pollos negros manchados con blanco, cuando se originaron de una PGCS de (BR). También se hicieron cruzas entre aves quiméricas BR putativas. Para las últimas, se produjeron pollos blancos cuando ocurrió fertilización entre dos PGCs de (WB) y pollos negros fueron el resultado de la fertilización con dos PGC de (BR). El pollo blanco intermedio con plumas negras salpicadas solo ocurrió cuando una PGC de (BR) fue fertilizada por una PGC de (WB) .

CULTIVOS DE LARGO PLAZO MAS ALLÁ DE 25 DÍAS Después de 25 días de cultivos continuos, los amontonamientos de PGC forman rápidamente monocapas en propagación. Estas monocapas de células rebanan una base adherente plana y los amontonamientos más sueltos y cadenas de células sim ilares a PGC en la superficie superior. Algunos paquetes de estas monocapas de células siguen siendo PAS positivas. Las células manchadas con Dil obtenidas de estas monocapas han sido transferidas a embriones receptores. Algunos embriones han mostrado pocas células localizadas en sus gónadas. Las monocapas celulares han sido pasad as exitosamente. De manera general , estas células son capaces de experimentar 3 a 5 pasos antes de que comiencen a disminuir su proliferación, envejezcan y se vuelvan de apariencia fibroblástica. Hay pocas líneas celulares que han atravesado múltiples pasos y continúan medrando sin una aparente diferenciación durante aproximadamente cuatro meses en cultivo continuo. Se han congelado dos líneas celulares obtenidas de monocapas, P1 02896 y P1 1 0596. La primera no mostró una diferenciación aparente y fue marginalmente positiva para fosfatasa alcalina, mientras que la última mostró morfolog ía celular neuronal y fue fuertemente positiva para fosfatasa alcalina. Como se discutió antes, se describen en la presente caracterizaciones adicionales de monocapas de PGC (específicamente las células EG putativas) , confirmarán adicionalmente su totipotencia y pluripotencia.

Sumario de resultados Se generaron pollos quiméricos a partir de PGCS frescas y crioconservadas. Veinticinco (74%) de 34 pollos quiméricos putativos, producidos con transferencias de PGCs frescas, probaron ser animales quiméricos verdaderos después de la prueba de la progenie. Treinta (88%) de las 34 aves quiméricas putativas, producidas con PGCs crioconservadas, demostraron ser pollos quiméricos verdaderos. En todos los casos, al menos 40 progenie fueron producidas y el número de PGCs donadoras que fueron fertilizadas por ave quimérica variaron desde 1 .4% hasta 1 00% , con la mayoría variando entre 30% a 60%. Asumiendo que lo último es un reflejo del número de PGCs que migraron a la gónada después de la inyección , entonces el rango de éxito por inyección fue variado. Sin embargo, otros mecanismos pudieron estar operando que pudieron impactar en el número de PGCs que se estableció en la gónada receptora. Tales mecanismos no fueron evaluados en este estudio. Además, en promedio, no observamos ninguna alteración significativa de la proporción de sexo en la progenie de aves q u iméricas.

Condiciones de cultivo de PGC Ninguna de las capas alimentadoras celulares evaluadas en este estudio mejoraron las condiciones de cultivo de largo plazo de las PGCS. Ninguno de los factores de crecimiento solo, en ninguna de las concentraciones estudiadas, fue capaz de sostener PGCs in vitro sin diferenciación. También se probaron combinaciones de dos y tres factores de crecimiento con poco éxito. Basándose en nuestros resultados, parece que todos los factores descritos antes (LI F, BFG F, IGF-I y SCF) son requeridos para cultivo a largo plazo de PGCS . Con base en el manchado con Dil de PGCs hemos observado que, bajo nuestras condiciones de cultivo , las PGCs que se originan de cultivos continuos de 14 días de edad migran a las gónadas de los embriones receptores después de la inyección. También hemos transferido PGCs que han sido mantenidas en cultivo durante 25 días a tres embriones receptores. Se demostró que uno de estos embriones era quimérico, con base en los resultados de prueba de progenie.

Fenotipo de PGC bajo condiciones de cultivo de largo plazo Después de la recolección , PGCs son reconocidas por su tamaño y por la presencia de gotas de lípido en su membrana y citoplasma. A aproximadamente 48 horas después de la recolección , las PGCs se amontonan y comienzan a dividirse como es evidenciado por el crecimiento en tamaño del amontonamiento y el número de células observadas después de la disociación de tripsina del amontonamiento. Solo las PGCs que forman amontonamiento sobreviven, todas las demás mueren. De manera general, un cultivo que inicia con 1 00 PGCs terminaría con un promedio de 600 a 800 PGCs dentro de siete d ías. Claramente algunas PGCs se dividen, aunque no a una proporción eficiente. Sin embargo, como se indicó antes, estas PGCs mantienen su capacidad de migrar a las gónadas.

CUTLIVOS DE LARGO PLAZO MAS ALLÁ DE 25 DÍAS Después de 25 días de cultivos continuos, los amontonamientos de PGC forman monocapas que se propagan rápidamente. Estas monocapas de células tienen una base adherente plana y amontonamientos más sueltos y cadenas de células similares a PGC en la superficie superior. Algunos paquetes de estas monocapas de células siguen siendo PAS positivas. Las células manchadas con Dil obtenidas a partir de estas monocapas han sido transferidas a embriones receptores . Algunos embriones han mostrado pocas células localizadas en sus gónadas. Las monocapas celulares han sido pasadas exitosamente. De manera general, estas células son capaces de experimentar 3 a 5 pasos antes de que comiencen a disminuir su proliferación , envejecer y volverse de apariencia fibroblástica. Existen pocas líneas celulares que han atravesado múltiples pasos y continúan medrando sin una aparente diferenciación durante aproximadamente cuatro meses en cultivo continuo. Se han congelado dos líneas celulares en particular, obtenidas de monocapas y son designadas P1 02896 y P1 10596, aunque se han establecido muchas líneas celulares que tienen características similares. La primera no mostró una diferenciación aparente y fue marginalmente positiva para fosftasa alcalina, al tiempo que la última mostró morfología celular neuronal y fue fuertemente positiva para fosfatasa alcalina. En particular, se ha mostrado que PGCs cultivadas usando los cuatro factores de crecimiento anteriores durante al menos 25 días, pueden colonizar de manera exitosa las gónadas y producir pollos quiméricos. Además, hemos mantenido células PGC en cultivo hasta por cuatro meses. Estos cultivos todavía parecen comprender células que tienen el fenotipo de PGC deseado. Aunque estas células no fueron probadas por su capacidad para producir aves quiméricas, basadas en su apariencia, se espera que deberían ser útiles para lo mismo.

Detección de anticuerpos EMA-1 y MC-480 en PGCs de pollo en cultivo de largo plazo Se probaron los anticuerpos monoclonales EMA-1 y MC-480 en células ES de ratón (controles positivos) , PGCs de pollo que estaban en cultivo durante 98 días, PGCs de pollo recién recolectadas, y células de fibroblasto de pollo (controles negativos).

El anticuerpo EMA-1 se unió con alta afinidad a célu las ES de ratón (Fig ura 1 ), células en cultivos de PGC de 98 días de edad (Fig ura 2) y a la mayoría de las PGCs de pollo frescas (Figura 3). EMA-1 no se unió a fibroblastos de pollo (Figura 4). Estos resultados concuerdan con aquéllos de Hahnel y Eddy (1 987), quienes reportaron que este anticuerpo detectó marcadores de superficie celular que están presentes en la mayoría de las células embriónicas de ratón pluripotentes, así como PGCs. También reportaron que EMA-1 mostró células positivas recurrentes a lo largo del epitelio del tracto urogenital de tejidos adultos, así como embriones tem pranos. No reportaron la detección de este epitope en ningún otro tejido adulto. Es posible que el anticuerpo detecte el epitope en el borde urogenital de adulto en virtud de la presence de células germinales. Pain et al (1996) reportaron el uso de EMA-1 para identificar las celias ES de pollo en cultivo. Sugirieron que el epitope de EMA-1 puede ser un marcador útil para identificar células eje embriónicas no diferenciadas. En nuestros experimentos, EMA-1 dio señales positivas muy fuertes en cultivos de PGC de pollo de 98 días de edad, comparables con las células ES de ratón, así como en PGCs frescas. Sin embargo, este anticuerpo no diferencia entre los fenotipos de PGC y ES; simplemente indica el potencial para pluripotencia y totipotencia. Esto sugiere que las PGCs en cultivos de largo plazo, ya sea permanecen como PGCs o son desdiferenciadas a células EG pluripotentes. El anticuerpo MC-480 reaccionó fuertemente con antígenos de superficie celular en células EG de ratón (Figura 5) y PGCs de 98 días de edad en cultivo (Figura 6). Muy pocas PGCs frescas fueron positivas para el antígeno (Fugura 7) , mientras que los fibroblastos de pollo siempre fueron negativos (Figura 8) . Estos resultados sug ieren que las PGCs en cultivo in vitro de largo plazo se des-diferencían en células EG pluripotentes. El hecho de que algunas de las PGCs frescas dieran señales positivas con el anticuerpo indica que algunas PGCs frescas todavía retienen algunos de los antígenos ES durante su periodo migratorio a las gónadas embriónicas. Subsecuentemente, estos antígenos pueden perderse. Sin embargo, también es posible que las PGCs que exhiben el antígeno EG en sus superficies eventualmente continúen sobreviviendo bejor en nuestros cultivos de largo plazo. Los dos resultados tomados juntos sugieren que las PGCs en nuestros cultivos de largo plazo se des-diferencían para volverse células eje pluripotentes. Este hallazgo es similar al reporte de que las PGCs de ratón se des-diferencían en cultivo y se convierten en células EG (Matsui et al, 1 992). Estos resultados indican que nuestro medio de cultivo celular PGC de pollo influencia la des-diferenciación de PGCs de pollo en células EG. Este es un importante paso en la producción de células de pollo pluripotentes útiles para la generación eficiente de animales transgénicos y clonación de aves.

Transfección de PGC La lipofección de u n vector conteniendo el gene reportador de prote ína de fluorescencia verde ha sido usado para la transfección de PGCS . En promedio 1 /50 PGCs fueron transfectadas transientemente, sin embargo, no se ha desarrollado todavía una línea celular transfectada estable. En resumen, estos resultados indican que las PGCs pueden ser mantenidas durante períodos largos y ser usadas exitosamente para la producción de aves quiméricas. Cambios adicionales en concentraciones de factor(es) de crecimiento y el uso de otros factores de crecimiento pueden optimizar adicionalmente las condiciones de cultivo. Para ser útil, un sistema de cultivo de PGC debería permitir la transfección y selección de PGCs, al tiempo que mantiene la capacidad de PGC para migrar a las gónadas. Además, estos resultados indican que las PGCs de ave (por ejemplo, pollo) revierten el fenotipo de célula EG, como ocurre con PGCs de ratón (Matsui et al, Cell, 70:841 -847, 1992) . En consecuencia, la inyección de células EG dispersas en blastodermos receptores debería permitir la generación de pollos quiméricos y transgénicos. Además estas células son potencialmente útiles para producir líneas de células EG transgénicas, las cuales pueden ser usadas para producir aves transgénicas quiméricas y clonadas.

Claims (9)

REIVI N DICACION ES

1 . Un método de cultivo, el cual proporciona la producción de células germinales (EG) y PGC de ave, que comprende los siguientes pasos: (i) aislar células germinales primordiales de un ave deseada; y (ii) cultivar dichas células germinales primordiales en un medio de cultivo que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento, contenidos en cantidades suficientes para mantener dichas PGCs durante períodos prolongados en cultivo de tejido: (1 ) factor inhibidor de leucemia (LIF), (2) factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), (3) factor de célula eje (SCF) y (4) factor de crecimiento similar a insulina (IGF), durante un período de tiempo prolongado suficiente para producir un cultivo que tiene una apariencia similar a múltiples capas compactas; (iii) identificar las células EG contenidas en el mismo.

2. El método de la reivindicación 1 , en donde las cantidades mínimas de dichos factores de crecimiento son : (1 ) LI F (0.00625 U/µl) , (2) BFGF (0.25 pg/µl) , (3) IGF (0.5625 pg/µl) , y (4) SCF (4.0 pg/µl).

3. El método de la reivindicación 2, en donde las cantidades máximas de dichos factores de crecimiento varían desde aproximadamente dos veces hasta un ciento de veces dichas cantidades m ín imas.

4. El método de la reivindicación 1 , en donde dichas PGCs de ave son obtenidas de un ave del género Gallinácea.

5. El método de la reivindicación 4, en donde dichas PGCs son PGCs de pollo o PGCs de pavo.

6. El método de la reivindicación 1 , en donde dichas PGCs son mantenidas en cultivo durante al menos 25 días.

7. El método de acuerdo a la reivindicación 6, en donde dichas PGCs son mantenidas en cultivo durante más de 25 días.

8. El método de acuerdo a la reivindicación 7, en donde dichas PGCs son mantenidas en cultivo durante al menos 4 meses.

9. El método de la reivindicación 1 , en donde las células EG de ave son identificadas con base en su expresión de antígeno de etapa específica de ratón, y/o reactividad con anticuerpo monoclonal EMA-1 o MC-480. 1 0. El método de la reivindicación 9, en donde el fenotipo EG de dichas células es confirmado adicionalmente por transferencia de tales células a un em brión de ave adecuado. 1 1 . El método de la reivindicación 10, en donde dicho embrión es un embrión de pollo de etapa X. 12. Ei método de la reivindicación 1 , el cual comprende además: (iv) transfectar o transformar las células EG resultantes con una secuencia de ácido nucleico deseada. 1 3. El método de la reivindicación 12, en donde dicha secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido terapéutico. 14. U n método mejorado para producir aves quiméricas , el cual comprende: (i) aislar células germinales primordiales de un ave; (ii) mantener tales PGCs en un medio de cultivo de tejido que contiene al menos los siguientes factores de crecimiento: (1 ) factor inhibidor de leucemia (LI F), (2) factor de crecimiento de fibroblasto básico (bFGF), (3) factor de célula eje (SCF) y (4) factor de crecimiento similar a insulina (IGF), durante un tiempo suficiente para producir células germinales embriónicas (EG); (iii) transferir dichas células EG hacia un embrión de ave receptora; y (iv) seleccionar aves quiméricas, las cuales tengan el fenotipo PGC deseado. 1 5. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde dichas PGCs son derivadas de embriones de aves del género Gallinácea. 16. El método de acuerdo a la reivindicación 15, en donde dichos embriones de ave son embriones de pavo o pollo. 17. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde dichas células EG son transfectadas o transformadas con una secuencia de ácido nucleico deseada antes de la transferencia a un embrión de ave receptora. 1 8. El método de acuerdo a la reivindicación 1 7, en donde dicha secuencia de ácido nucleico codifica un polipéptido terapéutico. 1 9. El método de acuerdo a la reivindicación 18, el cual incluye además purificar dicho polipéptido terapéutico de los huevos de las aves quiméricas producidas de acuerdo al paso (iv) , o el sistema circulatorio sistém ico o tejidos o fluidos corporales. 20. El método de acuerdo a la reivindicación 14, en donde las PGCs son inyectadas en la aorta dorsal de un embrión de ave receptora o en blastodermos receptores. 21 . Una línea de células EG de ave obtenida mediante el método de cultivo de la reivindicación 1 . 22. La línea de células de la reivindicación 21 , la cual es una 'línea de celias EG de pollo o pavo. 23. La línea de células de la reivindicación 21 , la cual contiene una secuencia de ácido nucleico insertada. 24. La l ínea de células de la reivindicación 22, la cual es P1 02896.