MXPA00001044A

MXPA00001044A - Uso de derivados de acido hialuronico en la preparacion de biomateriales con una actividad hemostatica fisica y obturadora, y una actividad preventiva en la formacion de adhesiones enseguida de anastomosis

Info

Publication number: MXPA00001044A
Application number: MXPA/A/2000/001044A
Authority: MX
Inventors: Alberto Rivarossa; Daniele Pressato
Original assignee: Fidia Advanced Biopolymers Srl; Daniele Pressato; Alberto Rivarossa
Priority date: 1997-07-28
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2001-05-07

Abstract

La presente invención describe el uso de derivados de polisacárido para la preparación de biomateriales biocompatibles, y biodegradables con propiedades absorbentes para los fluidos corporales y actividad hemostática física, para utilizarse tanto en anastomosis vasculares venosas como arteriales, y para prevenir la formación de adherencia post-quirúrgica de los vasoscon la formación de cicatriz de los tejidos circundantes.

Description

USO DE DERIVADOS DE ACIDO HIALURONICO EN LA PREPARACIÓN DE BIOMATERIALES CON UNA ACTIVIDAD HEMOSTÁTICA FÍSICA Y OBTURADORA, Y UNA ACTIVIDAD PREVENTIVA EN LA FORMACIÓN DE ADHESIONES ENSEGUIDA DE ANASTOMOSIS OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención describe el uso de derivados de polisacárido para la preparación de biomateriales biocompati-bles y biodegradables con propiedades absorbentes para fluidos corporales y actividad hemostática física, para utilizarse en anastomosis, y para prevenir la formación de adherencia post-quirúrgica de los vasos con formación de cicatriz de los tejidos circundantes. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Anastomosis significa en general la unión quirúrgica de una abertura formada entre los vasos u órganos . Esto incluye anastomosis venosa y arterial de los vasos sanguíneos (tanto venosos como arteriales) , anastomosis del intestino (incluyendo unión de los segmentos del tracto intestinal después de colectomía parcial o total) , la implantación quirúrgica de catéteres, y con procedimientos quirúrgicos endoscópicos . Anastomosis vascular significa la unión quirúrgica mediante sutura de dos extremos de un vaso sanguíneo dividido en seguida de remover un tramo del vaso debido a trombosis o arterieesclerosis, o la unión de dos vasos separados para propósitos de revascularización (derivación aletas libres) . Cuando se permite que fluya la sangre a través del vaso nuevamente después de la sutura, un problema que puede presentarse es la filtración de la sangre por entre las puntadas, especialmente si se han utilizado sustancias anti-trombóticas . Si continúa la pérdida de sangre, se formará un hematoma alrededor de la anastomosis o en la pared del vaso, y éste ejerce una presión extrínseca que desencadena el fenómeno hemocoagulativo, el cual a su vez puede ocasionar trombosis intravascular por la liberación de material trombogénico . En adición, los hematomas favorecen la infección. La "Técnica de Abrazadera Vascular" en microcirugía para anastomosis vascular, se utiliza con los siguientes objetivos : para reforzar la anastomosis vascular e impedir que se tuerza o se apriete el vaso, o que llegue a comprimirse (T.H. Robbins, "Microvascular anastomosis: vascular cuff technique" Plástic and Reconstructive Surgery, 87, 567-568) ; para lograr un efecto hemostático (N.B. Hart, British Journal of Plástic Surgery, 1987, 40, 300-304) ; para reducir el número de puntadas de sutura necesarias (L.K. Hung y colaboradores, "Comparative study of artery cuff and fat wrap in microvascular anastomosis in the rat", British Journal of Plástic Surgery, 41, 278-283); y para crear un medio ambiente adecuado alrededor de la anastomosis, para prevenir la adhesión con los tejidos circundantes (T.H. Robbins, Microvascular anastomosis : vascular cuff technique", Plástic and Reconstructive Surgery, 87, 567- 568) . Hasta ahora, los cirujanos han tratado de resolver el problema del sangrado mediante la utilización de biomateriales que contienen sustancias hemostáticas (N.B. Hart, British Journal of Plástic Surgery, 1987, 40, 300-304) . Sin embargo, aunque éstas reducen el tiempo de sangrado, también tienen dos efectos secundarios indeseables : mala patencia de la anastomosis; mayor presentación de fibrosis perivascular y adhesiones. Más aun, debido a que las venas son menos patentes que las arterias, es muy peligroso utilizar sustancias hemostáticas fuertes a un nivel venoso, debido al riesgo de trombosis intravascular . Muchos autores recomiendan contra el uso de biomateriales, debido a que impiden el sanado natural del tejido involucrado en la anastomosis. En su lugar, se favorece el uso de tejidos autólogos consistentes en un segmento de vaso sanguíneo envuelto alrededor de la anastomosis (Plástic and Reconstructive Surgery, Vol. 87, No. 3, marzo de 1991, páginas 567-568) . Aunque ya se conoce el uso de biomateriales constituidos por derivados de éster (Patente Europea No. EP 0216453) y derivados de ácido hialurónico autoreticulados (Patente Europea Número EP 0341745) en la prevención de adhesiones post-quirúrgicas (Publicación Internacional Número O97/07833) , nadie ha observado antes que posean una actividad hemostática física que sustituya la necesidad de utilizar una sustancia hemostática con actividad bioquímica sobre los factores de coagulación que pueden ocasionar trombosis intravascular . Otra ventaja de estos biomateriales, es su capacidad para impedir que se adhieran los vasos sanguíneos a los tej idos circundantes, y para crear, de una manera sorprendente, un medio ambiente adecuado para favorecer la regeneración correcta del tejido, a diferencia de otros tipos de biomateriales utilizados en este tipo de cirugía. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención describe el uso de biomateriales biocompatibles y biodegradables basados en derivados de ácido hialurónico, gelan, y ácido algínico, de preferencia derivados de ácido hialurónico que, debido a sus propiedades hemostáticas físicas inesperadas, se pueden utilizar con ventaja en anastomosis, de preferencia vascular, y en la prevención de adhesión post-quirúrgica de los vasos a los tejidos circundantes. Se prefieren los siguientes derivados de ácido hialurónico de polisacárido: esteres de ácido hialurónico, en donde una parte o todas las funciones carboxilo están esterificadas con alcoholes de las series alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heterocíclica (Patente Europea Número EP 0216453) ; esteres de ácido hialurónico, en donde una parte de las funciones carboxilo están esterificadas con alcoholes de la serie aralifática, y una segunda porción de los grupos carboxilo se derivan con grupos alifáticos de cadena larga (Publicación Internacional Número WO 98/08876) ; esteres auto-reticulados de ácido hialurónico, en donde una parte ,o todos los grupos carboxilo están esterificados con las funciones alcohólicas de la misma cadena de polisacárido, o de otras cadenas (Patente Europea Número EP 0341745) ; compuestos de ácido hialurónico reticulados, en donde parte o todos los grupos carboxilo están esterificados con polialcoholes de las series alifática, aromática, arilali-fática, cicloalifática, heterocíclica, generando reticulación por medio de cadenas separadoras (Patente Europea Número EP 0265116 Bl) ; hemiésteres de ácido succínico o sales de metal pesado del hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico o con esteres parciales o totales de ácido hialurónico (Publi-cación Internacional Número WO 96/35720) ; derivados sulfatados (Publicación Internacional Número WO 95/25751) o derivados N-sulfatados (Publicación Número PCT/EP98/01973 , presentada el 3 de abril de 1998); derivados de amida del ácido hialurónico; esteres parciales y derivados de éster auto-reticulados de gelan (Patentes Europeas Números EP 0,518,710; EP 0,654,046) ; y derivados de éster de alginato (Patente Europea Número EP 251,905) . El hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico, o con un éster total o parcial de ácido hialurónico útil en la presente invención, se caracteriza por tener la siguiente unidad de repetición (I) : en donde R-^ R2 , y R3, que son iguales o diferentes unos de otros, son H ó CO (CH2) COOY, en donde Y es una carga negativa o H, y R es OH, O", ó un residuo alcohólico. La sal de metal pesado del hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico o con un éster total o parcial de ácido hialurónico, se caracteriza en particular por tener la siguiente unidad de repetición (II) : ( H ) en donde R1# R2, y R3 que son iguales o diferentes unos de otros, son H ó CO (C?2) 2COO~ , R es O" , o un residuo alcohólico, (XZ+) es un catión de un metal pesado, en donde z es un número comprendido entre 1 y 6, p es un entero o un número decimal, comprendido entre 0.1 y 5, en el entendido de que p(Xz+) es igual al número de grupos aniónicos COO" presentes en esta unidad de repetición. Los hemiésteres de ácido succínico o las sales de metal pesado del hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico o con esteres parciales o totales de ácido hialurónico, se pueden preparar de conformidad con los siguientes pasos : a) Convertir la sal sódica de ácido hialurónico en una sal seleccionada a partir del grupo que consiste en sal de piridinio, tetra-alquilamonio, tetra-arilamonio, tetra-alquil-fosfonio, tetra-arilfosfonio, en la presencia de agua y un solvente aprótico, b) Tratar la solución que viene del paso (a) con anhídrido succínico en la presencia de una base orgánica, como el catalizador, removiendo el catión de piridinio, tetraalquilamonio, tetra-arilamonio, tetra-alquilfosfonio, o tetra-arilfosfonio mediante diálisis, obteniendo de esta manera el hemiéster de ácido succínico que tiene la unidad de repetición (I) en el entendido de que cuando menos una de estas unidades de repetición (I) tenga R= OH u O" , y opcionalmente recuperar el producto obtenido mediante liofilización. c) Tratar la solución que viene directamente del paso anterior, o una solución acuosa del producto sólido recuperado que viene del paso anterior, con una solución acuosa de una sal inorgánica del metal pesado, y recuperar el producto mediante filtración y secado al vacío. En el caso de la preparación de la sal de metal pesado con el hemiéster de succinato del éster total de ácido hialurónico, se puede utilizar el siguiente proceso: b1) Tratar el éster de ácido hialurónico disuelto o suspendido en una mezcla de agua y un solvente aprótico con anhídrido succínico en la presencia de una base orgánica, como el catalizador, obteniendo de esta manera el hemiéster de ácido succínico que tiene las unidades de repetición (I) , en donde R es un residuo de un alcohol, y opcionalmente recuperar el producto obtenido mediante liofilización. c ' ) Tratar la solución que viene directamente del paso anterior, o una solución acuosa del producto sólido recuperado que viene del paso anterior, con una solución acuosa de una sal inorgánica del metal pesado, y recuperar el producto mediante filtración y secado al vacío. El término "metal pesado" abarca cualquier metal farmacéuticamente activo en el período 4, 5, ó 6 de la tabla periódica. Las sales de metal pesado preferidas de conformidad con la presente invención son aquellas cuyo catión es: sales de zinc, plata, cobre, oro, cerio, y tungsteno de derivados succínicos de ácido hialurónico. Se puede utilizar ácido hialurónico o esteres de ácido hialurónico de cualquier peso molecular para preparar sus derivados de succinilo. En los siguientes ejemplos, se utilizaron muestras de ácido hialurónico con un peso molecular de entre 30,000 y 760,000 Dáltones, pero este rango no es crítico. Los hemiésteres de ácido succínico de ácido hialurónico o esteres de ácido hialurónico preferidos son aquellos que tienen, en la unidad de repetición (I) Rx = R2 = R3 = H, y las sales de metal pesado correspondientes en donde, en la unidad de repetición (II) , X se selecciona a partir del grupo que consiste en: plata, oro, cobre, y zinc; z está comprendido entre 1 y 3 , y p está comprendido entre 0.3 y 2. Otra clase de hemiésteres de ácido succínico con ácido hialurónico o esteres de ácido hialurónico preferidos, son aquellos que tienen cuando menos una unidad de repetición (I); en donde R = R3 = H, y R2 = CO (CH2) 2C00Y, y cuando menos una unidad de repetición (I) , en donde R2 = R3 = H, y R¡ = CO(CH2)2COOY tiene los significados anteriormente mencionados, y las sales de metal pesado correspondientes tienen cuando menos una unidad de repetición (II) ; en donde Rx = R3 = H, y R2 = CO(CH2)2COO~ , y cuando menos una unidad de repetición (II), en donde R2 = R3 = H. R = CO (CH2) 2C00" ; X se selecciona a partir del grupo que consiste en: plata, oro, cobre, y zinc; z está comprendido entre 1 y 3 , y p está comprendido entre 0.6 y 3. En el paso (a) anterior, el ácido hialurónico de preferencia se convierte a la sal de piridinio correspondiente. En particular, esta conversión abarca una disolución previa de la sal sódica hialurónica en una mezcla de agua y formamida dimetílica, un tratamiento con una resina de intercambio catiónico para obtener el ácido hialurónico libre correspondiente. Después de remover la resina, la solución se neutraliza con piridina, y de esta manera se obtiene la sal de piridinio . En paso (b) ó (b' ) de ambos procesos, la cantidad de anhídrido succínico no es crítica, aunque es preferible agregar un alto exceso con respecto al ácido hialurónico. De hecho, se obtienen los mejores resultados cuando la proporción molar de anhídrido succínico/grupos OH libres presentes en la unidad de repetición (III) : ( ip ) en donde R tiene los significados anteriormente mencionados, del ácido hialurónico o del éster parcial de ácido hialurónico de partida, es de entre 15 y 90. Aunque la temperatura no es crítica, se obtienen los mejores resultados y el paso (b) ó (b' ) de ambos procesos se realiza a 70°C. La base orgánica preferida utilizada como catalizador en el paso (b) ó (b' ) de ambos procesos, se selecciona a partir del grupo que consiste en 4-dimetilaminopiridina, piridina, o mezclas de las mismas. Mediante la utilización de grandes cantidades de 4-dimetilaminopiridina, se obtiene un hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico o un éster de ácido hialurónico con un alto grado de succinilación. Mediante la utilización de piridina solamente o mezclada con pequeñas cantidades de 4-dimetilaminopiridina, se obtiene un hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico con un bajo grado de succinilación. Mientras más fuertes sean las condiciones de la reacción, tales como la temperatura, los tiempos de reacción, etcétera, mayor será el grado de esterificación de los derivados formados. Para la preparación de la sal de Ag del hemiéster de succinato con ácido hialurónico o un éster de ácido hialurónico, en el paso (c) ó (C), el hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico o el hemiéster de ácido succínico con éster de ácido hialurónico, de preferencia se trata con una solución acuosa de nitrato de plata para formar la sal de plata del hemiéster de succionato con ácido hialurónico o éster de ácido hialurónico. La sal de Ag se precipita de la solución, y se recupera mediante filtración o centrifugación. Luego se lava el precipitado con etanol, y se seca al vacío a 40°C. Los compuestos de plata de los derivados de succinilo se preparan en una obscuridad completa. Todas las operaciones para preparar las soluciones de nitrato de plata, y para preparar el hialuronato de plata de succinilo, se realizaron en la obscuri-dad, y los productos resultantes se almacenaron lejos de fuentes de luz . Para la preparación de las sales de Cu del hemiéster de succinato con ácido hialurónico o un éster de ácido hialurónico, en el paso (c) ó (c') de ambos procesos, el hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico, o el hemiéster de ácido succínico con éster de ácido hialurónico, de preferencia se trata con una solución acuosa de CuCl2 para formar la sal de Cu del hemiéster de succinato con ácido hialurónico o con el éster de ácido hialurónico. Para la preparación de las sales de Zn del hemiéster de succionato con ácido hialurónico o un éster de ácido hialurónico, en el paso (c) ó (c') de ambos procesos, el hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico, o el hemiéster de ácido succínico con éster de ácido hialurónico, de preferencia se trata con una solución acuosa de ZnCl2 para formar las sales de Zn del hemiéster de succinato con ácido hialurónico o con el éster de ácido hialurónico. Para la preparación de las sales de Au del hemiéster de succinato con ácido hialurónico o un éster de ácido hialurónico, en el paso (c) ó (c') de ambos procesos, el hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico, o el hemiéster de ácido succínico con éster de ácido hialurónico, de preferencia se trata con una solución acuosa de HAuCl4, para formar las sales de Au del hemiéster de succinato con ácido hialurónico o con el éster de ácido hialurónico. Los ejemplos específicos de los derivados de hemiéster de ácido succínico del ácido hialurónico y esteres de ácido hialurónico incluyen los siguientes: a) Ejemplo para la preparación de hemißster de ácido succínico con ácido hialurónico que tiene la unidad de repetición (I) Ejemplo 1; Una solución de hialuronato de sodio (HA-Na, 1 gramo, Peso molecular: 160,000) en agua destilada (35 mililitros), y formamida N,N-dimetílica (DMF, 100 mililitros) , se agitó durante 10 minutos en la presencia de resina de intercambio iónico (3 G. IR 120 H +) , después de lo cual se removió la resina mediante filtración después de una dilución adicional con formamida N,N-dimetílica (100 mililitros) . Luego la solución se neutralizó con un exceso de piridina (10 mililitros) , para dar la sal de piridina del ácido hialurónico (HA-Py) . Luego la solución viscosa se evaporó cuidadosamente en un vacío para remover el agua presente, teniendo cuidado de no permitir que el volumen total de la solución cayera debajo de aproximadamente 100 mililitros. Este procedimiento se repitió tres veces, cada vez agregando formamida N,N-dimetílica (20 mililitros) . Entonces la solución se trató con anhídrido succínico (3 gramos) y piridina (10 mililitros) , agitándose a la temperatura ambiente durante 24 horas. Luego la mezcla de reacción se concentró, se recogió con agua destilada (20 mililitros) , se dializó contra agua destilada (3 veces, 750 mililitros) , y se liofilizó para dar succinilato de ácido hialurónico (930 miligramos) . La Tabla 1 muestra la asignación de los valores de cambio químico del espectro de resonancia magnética nuclear 13C (50.3 MHz) de la muestra 1. TABLA 1 El análisis de resonancia magnética nuclear muestra un grado de succinilación sobre el átomo de carbono 6 de la N-acetilglucosamina (N-6) de 0.2 (moles de ácido succínico/mol de la unidad de repetición del polímero) . Ejemplo 2 Una solución de hialuronato de sodio (HA-Na, 1 gramo, Peso Molecular: 30,000) en agua destilada (35 mililitros), y formamida N,N-dimetílica (DMF, 100 mililitros) , se agitó en la presencia de resina de intercambio iónico (3 gramos, IR 120 H+). durante 10 minutos, y luego se removió la resina mediante filtración, después de una dilución adicional con formamida N,N-dimetílica (100 mililitros) . Entonces la solución se neutralizó con un exceso de piridina (10 mililitros) , para dar la sal de piridina del ácido hialurónico (HA-Py) . Luego la solución viscosa se evaporó cuidadosamente en un vacío para remover el agua presente, sin permitir que el volumen total de la solución cayera debajo de aproximadamente 100 mililitros. Este procedimiento de remoción de agua se repitió tres veces, cada vez con la adición de formamida N,N-dimetílica (20 mililitros) . Luego la solución se trató con anhídrido succínico (3 gramos) y piridina (10 mililitros) , mientras se agitaba a 70°C durante 24 horas. Entonces la mezcla de reacción se concentró, se recogió con agua destilada (20 mililitros) , se dializó contra agua destilada (3 veces, 750 mililitros), y se liofilizó, para dar succinilato de ácido hialurónico (900 miligramos) . La Tabla 2 reporta la asignación de los valores de cambio químico del espectro de resonancia magnética nuclear 13C (50.3 MHz) de la muestra 2. Tabla 2 El análisis de resonancia magnética nuclear da un grado de succinilación sobre el átomo de carbono 6 de la N-acetilglucosamina (N-6) de aproximadamente 0.45 (moles de ácido succínico/mol de unidad de repetición) . Ej emplo 3 : Una solución de hialuronato de sodio (HA-Na, 0.5 gramos, peso molecular: 160,000) en agua destilada (35 mililitros) , y formamida N,N-dimetílica (DMF 100 mililitros) , se agitó en la presencia de resina de intercambio iónico (3 G, IR 120 H+) durante 10 minutos, y luego se removió la resina mediante filtración, después de una dilución adicional con formamida N,N-dimetílica (75 mililitros) . Entonces la solución se neutralizó con un exceso de piridina (6 mililitros) , para dar la sal de piridina del ácido hialurónico (Ha-Py) ; luego la solución viscosa se evaporó cuidadosamente en un vacío para remover el agua presente, sin permitir que el volumen total de la solución cayera debajo de aproximadamente 50 mililitros. El procedimiento de remoción de agua se repitió tres veces, cada vez con la adición de formamida N,N-dimetílica (10 mililitros) . luego la solución se trató con anhídrido succínico (2 gramos) , 4-dimetilaminopiridina (10 miligramos) , y piridina (10 mililitros) , mientras se agitaba a 70°C durante 48 horas. Se agregaron cantidades adicionales de anhídrido succínico (1 gramo) y piridina (2.5 mililitros), y la mezcla se agitó durante otras 24 horas. Luego la mezcla de reacción se concentró, se recogió con agua destilada (20 mililitros) , se dializó contra agua destilada (3 veces, 750 mililitros) durante 3 días, y se liofilizó por congelación, para dar succinilato de ácido hialurónico (450 miligramos) . El producto se caracterizó por un alto grado de viscosidad cuando se disolvió en agua. El espectro de resonancia magnética nuclear, en particular, se caracterizó por picos amplios, debido al alto grado de viscosi-dad de la muestra. El grado de modificación se evaluó mediante ensayo potenciométrico, y probó ser de 1.8 (moles de ácido succínico/mol de unidad de repetición) . Ejemplo 4; Una solución de hialuronato de sodio (HA-Na, 0.5 gramos, peso molecular: 240,000) en agua destilada (60 mililitros), y formamida N,N-dimetílica (DMF, 60 mililitros), se agitó en la presencia de resina de intercambio iónico (1 G. IR 120 H+) durante 10 minutos, después de lo cual, se removió la resina mediante filtración, después de una dilución adicional con formamida N,N-dimetílica (50 mililitros) . Entonces la solución se neutralizó con un exceso de piridina (6 litros) , para dar la sal de piridina del ácido hialurónico (HA-Py) . Luego la solución viscosa se evaporó cuidadosamente en un vacío para remover el agua presente, sin permitir que el volumen total de la solución cayera debajo de aproximadamente 100 mililitros. Este procedimiento de remoción de agua se repitió tres veces, cada vez con la adición de formamida N,N-dimetílica (20 mililitros) . Luego la solución de tipo de gelatina de trató con anhídrido succínico (2 gramos) y piridina (5 ilili-tros) a 70°C, mientras que se agitaba durante 18 horas. Se agregaron cantidades adicionales de anhídrido succínico (2.5 gramos) y 4-dimetilaminopiridina (200 miligramos) , y la mezcla se agitó durante otras 24 horas. Luego la mezcla de reacción se concentró, se recogió con agua destilada (20 mililitros) , y se liofilizó, para dar succinilato de ácido hialurónico (450 miligramos) , el producto se caracteriza por ser altamente viscoso al disolverse en agua. El espectro de resonancia magnética nuclear en particular se caracteriza por picos muy amplios, debido al carácter altamente viscoso de las muestras. El grado de modificación se evaluó mediante ensayo potencióme-trico, y el resultado fue de 2.5 (moles de ácido succínico/mol de unidad de repetición) . Ejemplo 5; Una solución de hialuronato de sodio (HA-Na, 1 gramo, Peso Molecular: 40,000) en agua destilada (60 mililitros), y formamida N,N-dimetílica (DMF 60 mililitros), se agitó en la presencia de resina de intercambio iónico (1 gramo, IR 120 H+) durante 10 minutos, después de lo cual se removió la resina mediante filtración, después de la dilución adicional con formamida N,N-dimetílica (50 mililitros) . Entonces la solución se neutralizó con un exceso de piridina (10 mililitros) , para dar la sal de piridina del ácido hialurónico (HA-Py) . Luego la solución viscosa se evaporó cuidadosamente en un vacío, para remover el agua presente, sin permitir que el volumen total de la solución cayera debajo de 50 mililitros. Este procedimiento de remoción de agua se repitió tres veces, cada vez con la adición de formamida N,N-dimetílica (20 mililitros). La solución luego se trató con anhídrido succínico (3 gramos) y piridina (10 mililitros) a 70°C, mientras se agitaba durante 18 horas. Se agregaron cantidades adicionales de anhídrido succínico (2.5 gramos) y 4-dimetilaminopiridina (200 miligramos), y la mezcla se agitó durante otras 24 horas. La mezcla de reacción, que fue de un color café, entonces se concentró, se recogió con agua destilada (20 mililitros) , se dializó contra agua destilada (3 veces, 750 mililitros) , y se liofilizó, para dar succinilato de ácido hialurónico (850 miligramos) . El grado de succinilación se evaluó mediante ensayo potenciomé-trico, y fue de 3.5 (moles de ácido succínico/mol de unidad de repetición) . Ejemplo 6: Una solución de hialuronato de sodio (HA-Na, 0.5 gramos, peso molecular de: 760,000) en agua destilada (60 mililitros), y formamida N,N-dimetílica (DMF, 60 mililitros), se agitó en la presencia de resina de intercambio iónico (1 gramo, IR 120 H+) durante 10 minutos, después de lo cual, se removió la resina mediante filtración, después de una dilución adicional con formamida N,N-dimetílica (50 mililitros) . Luego la solución se neutralizó con un exceso de piridina (6 mililitros) , para dar la sal de piridina del ácido hialurónico (HA-Py) . Entonces la solución viscosa se evaporó cuidadosamente para remover el agua presente, sin permitir que el volumen total de la solución cayera debajo de aproximadamente 50 mililitros. Este procedimiento se repitió tres veces, cada vez con la adición de formamida N,N-dimetílica (20 mililitros) . La solución de tipo de gelatina se trató entonces con anhídrido succínico (2 gramos) y 4-dimetilaminopiridina (200 miligramos) , y la mezcla se agitó durante otras 24 horas. Luego la mezcla de reacción se concentró, se recogió con agua destilada (20 mililitros) , se dializó contra agua destilada (3 veces, 750 mililitros) , y se liofilizó, para dar succinilato de ácido hialurónico (430 miligramos) . El producto se caracteriza por ser altamente viscoso al disolverse en agua. El espectro de resonancia magnética nuclear en particular se caracteriza por picos muy amplios, debido al carácter altamente viscoso de las muestras. El grado de modificación se evaluó mediante ensayo potenciométrico, y fue de 2.5 (moles de ácido succínico/mol de unidad de repetición) . b) Ejemplos de la preparación de sales de plata de hialuronato de O-succinilo» Ejemplo 7: 100 miligramos de hialuronato de 0-succinilo, preparados como se describe en el Ejemplo 1, se disolvieron en 10 mililitros de agua destilada. Luego la solución polimérica se complementó con 10 mililitros de una solución de AgN03 ÍN. El precipitado blanco así formado se mantuvo en suspensión mientras se agitaba constantemente durante 2 horas, y luego se recogió mediante filtración a través de un embudo Buchner, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40°C. Todas estas operaciones se realizaron en la obscuridad para evitar la formación de óxido de plata. El análisis de absorción atómica mostró un contenido de plata del 23.5 por ciento en peso, igual al 87 por ciento del valor estequiométrico teórico. Ejemplo 8: 70 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 3, se disolvieron en 14 mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó con 14 mililitros de una solución de gNÜ3 1 N. Se formó inmediatamente un precipitado gris, y se mantuvo en suspensión mientras se agitaba constantemente durante 2 horas, después de lo cual se recogió mediante filtración a través de un embudo Buchner. Se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40°C. Todas estas operaciones se realizaron en la obscuridad para evitar la formación de óxido de plata. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de plata era del 27 por ciento en peso, igual al 71 por ciento del valor estequiométrico teórico . Ejemplo 9: 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 4, se disolvieron en 20 mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó con 20 mililitros de una solución de gN?3 2N. Se formó inmediatamente un precipitado blanco, y se mantuvo en suspensión mientras se agitaba constan-temente durante 2 horas. Luego se recuperó mediante filtración a través de un embudo Buchner, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40 °C. Todas estas operaciones se realizaron en la obscuridad para evitar la formación de óxido de plata. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de plata era de 28.8 por ciento en peso, igual al 70.5 por ciento del valor estequiométrico teórico. E emplo 10; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico preparado como se describe en el Ejemplo 5, se disolvieron en 10 mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó con 10 mililitros de una solución de AgN03 ÍN. Se formó inmediatamente un precipitado castaño, y se mantuvo en suspensión mientras se agitaba constantemente durante 2 horas, después de lo cual se recuperó mediante filtración a través de un embudo Buchner, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío a 40°C. Todas estas operaciones se realizaron en la obscuridad para evitar la formación de óxido de plata. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de plata era del 31 por ciento, igual al 70.2 por ciento del valor estequiométrico teórico. Ej emplo 11 ; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 6, se disolvieron en 10 mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó con 10 mililitros de una solución de gN?3 ÍN. Inmediatamente se formó un precipitado castaño, el cual se mantuvo en suspensión mientras se agitaba constantemente durante 2 horas, después de lo cual se recuperó mediante filtración a través de un embudo Buchner, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40 °C. Todas estas operaciones se realizaron en la obscuridad para evitar la formación de óxido de plata. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de plata era del 27 por ciento en peso, igual al 71 por ciento del valor estequiométrico teórico. C) Ejemplos de la preparación de sales de zinc de succinilato de ácido hialurónico Ejemplo 12; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 1, se disolvieron en 10 mililitros de agua destilada. La solución polimérica se complementó entonces con 10 mililitros de una solución de ZnCl2 0.2 N. La solución se agitó constantemente durante 2 horas, después de lo cual se agregaron 3 volúmenes de etanol para precipitar la sal de zinc soluble. El precipitado se recuperó mediante centrifugación a 3,000 rpm durante 15 minutos, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40°C. El análisis de absorción atómica mostró un contenido de zinc del 10 por ciento, igual al 101 por ciento del valor estequiométrico teórico. Ejemplo 13 ; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 3, se disolvieron en 20 mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó con 20 mililitros de una solución de ZnCl2 2N. Después de la adición de sal de zinc, se formó un precipitado en polvo, el cual se recuperó mediante centrifugación a 3,000 rpm durante 15 minutos, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40°C. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de zinc en la muestra era del 15.3 por ciento, igual al 105 por ciento del valor estequiométrico teórico. Ejemplo 14; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 4, se disolvieron en 20 mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó con 20 mililitros de una solución de ZnCl2 2N. Después de la adición de sal de zinc, se formó un precipitado en polvo, el cual se recuperó mediante centrifugación a 3,000 rpm durante 15 minutos, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40°C. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de zinc de la muestra era del 17.7 por ciento en peso, igual al 105 por ciento del valor estequiométrico teórico. d) Ejemplo de la preparación de la sal de cobre de succinilato de ácido hialurónico. Ejemplo 15; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 5, se disolvieron en 10 mililitros de agua destilada. La solución polimérica se complementó entonces con 10 mililitros de una solución de CuCl2 2N. Después de la adición de sal de cobre, se formó un precipitado azul, el cual se recuperó mediante centrifugación a 3,000 rpm durante 15 minutos, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío establecido a 40°C. El análisis de absorción atómica mostró que el contenido de cobre de la muestra era del 21.4 por ciento en peso, igual al 110 por ciento del valor estequiométrico teórico. Por consiguiente, es probable que el polímero incorpore una pequeña cantidad de sal de cobre durante la precipitación del derivado. e) Ejemplo de la preparación de sal de oro de succinila-to de ácido hialurónico. Ejemplo 16; 100 miligramos de succinilato de ácido hialurónico, preparado como se describe en el Ejemplo 3, se disolvieron en mililitros de agua destilada. La solución polimérica, que fue altamente viscosa, se complementó entonces con 20 milili-tros de una solución de HauCl^ 0.5N. Después de la adición de sal de oro, se formó un precipitado, el cual se recuperó mediante centrifugación a 3,000 rpm durante 15 minutos, se lavó varias veces con etanol, y se secó en un horno al vacío a 40°C. El contenido de oro en la muestra probó ser del 13 por ciento en peso, igual al 44 por ciento del valor estequiométrico teórico. La sulfatación de los hidroxilos alcohólicos presentes en la cadena polimérica del ácido hialurónico o de un derivado semisintético de ácido hialurónico, mediante la utilización de una sustancia sulfatante adecuada, puede conducir a la formación de nuevos derivados con características químicas-físicas, pero más que nada, características biológicas, que son diferentes de aquellas del material de partida. Algunos derivados semisintéticos particularmente importantes de ácido hialurónico, son los esteres del mismo con alcoholes de las series alifática, aralifática, heterocíclica, y cicloalifática, designados como "HYAFF", que se describen en las Patentes de los Estados Unidos de Norteamérica Números 4,851,521; 4,965,353 y 5,202,431 y en la Patente Europea Número EP-0 , 216, 453. En este caso, la reacción de sulfatación ya no se presenta en la fase homogénea, sino más bien sobre la superficie del biomaterial en la fase heterogénea, activando los grupos hidroxilo expuestos hacia el solvente de la reac-ción.

El grado de sulfatación que se puede obtener directamente sobre el biomaterial es una característica importante, y requiere de un control cinético cuidadoso. Para evitar la solubilización del biomaterial, inducida por la mayor naturale-za hidrofílica del polímero que constituye la matriz, el número de grupos -SO3 por unidad dimérica no debe exceder de cierto nivel, generalmente menor de 1.5-2, dependiendo del grado de hidrofilicidad del biomaterial de partida. Por ejemplo, en el caso de películas HYAFF 11, en donde están involucrados todos los carboxilos en el enlace de éster con los grupos bencilo, el máximo grado de sulfatación no debe exceder de 1.5. Los reactivos comúnmente utilizados para la sulfatación incluyen el complejo entre trióxido de azufre y piridina (SO3 -piridina) . La reacción se conduce mediante la adición del reactivo sulfatante a una sal de tetrabutilamonio del ácido hialurónico en solución, o a una solución de un éster de ácido hialurónico que, en el caso de esteres parciales, contenga las funciones carboxilo restantes en la forma de sales de tetrabutilamonio, en solventes apróticos, tales como sulfóxido de dimetilo, formamida N,N' -dimetílica, y N-metilpirrolidona, en la escala de temperatura de aproximadamente 0°C a aproximadamente 60°C. Se obtienen diferentes grados de sulfatación, medidos por el número de grupos sulfato por unidad de disacárido, variando la cantidad de SO3 -piridina. La proporción entre los moles de hidroxilo y los moles de reactivo sulfatante, puede variar entre 1:1 y 1:12. Los presentes métodos se pueden utilizar para sulfatar la cadena de polisacárido del ácido hialurónico y sus derivados semisintéticos, de una manera específica y homogénea, sin ocasionar pérdida de las características del polímero, en particular su peso molecular. Mediante este método, es posible obtener nuevos polímeros con diferentes niveles de sulfatación, pero con el mismo peso molecular. Se pueden obtener polímeros con nuevas características biológicas mediante la utilización, como materiales de partida, de biopolímeros en donde los grupos carboxilo se salifican con sal de tetrabutilamonio. Estos biopolímeros no son hemolíticos. Una característica notable de estos polisacáridos sulfatados, es su capacidad para incrementar el tipo de coagulación de la sangre. Por ejemplo, los derivados de ácido hialurónico que tienen un grado de sulfatación mayor de 2:5, exhiben una buena actividad anticoagulante. En adición, el peso molecular del polímero de partida también puede ser significativo en la influencia sobre las propiedades de los nuevos biopolímeros sulfatados de la presente invención. En particular, son notables cuando menos cuatro derivados de ácido hialurónico sulfatado, debido a su peso molecular y grado de sulfatación. Estos son: 1. Acido hialurónico que tiene un peso molecular en la escala entre aproximadamente 10,000 y aproximadamente 50,000 Dáltones, y que tiene un grado de sulfatación de 2.5, 3.0, ó 3.5; 2. Acido hialurónico que tiene un peso molecular en la escala de entre aproximadamente 50,000 y aproximadamente 250,000 Dáltones, y que tiene un grado de sulfatación de 2.5, 3.0, ó 3.5 ; 3. Acido hialurónico que tiene un peso molecular en la escala de entre aproximadamente 250,000 y aproximadamente 750,000 Dáltones, y que tiene un grado de sulfatación de 2.5, 3.0, ó 3.5; y 4. Acido hialurónico que tiene un peso molecular en la escala de entre aproximadamente 750,000 y aproximadamente 1,250,000 Dáltones, y que tiene un grado de sulfatación de 2.5, 3.0, ó 3.5. Las fracciones de ácido hialurónico que tienen los pesos moleculares descritos anteriormente, se pueden obtener mediante la utilización de membranas de separación de peso molecular particulares, como se conoce en la materia. Entre los derivados de éster semisintético de ácido hialurónico, son particularmente interesantes las matrices poliméricas de HYAFF 11 (100 por ciento de éster bencílico de ácido hialurónico), sulfatadas hasta grados de 1.0 y 1.5, y HYAFF llp75 (75 por ciento de éster bencílico de ácido hialuró-nico) sulfatadas hasta grados de 0.5 y 1.0. Los derivados sulfatados particulares de ácido hialurónico se pueden preparar como sigue: a) Sulfatación de hialuronato de aodio, grado de sulfatación 3. 0.250 gramos de sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF). Se agregan 1.305 gramos de S03-piridina solubilizada en 10 mililitros de formamida dimetílica a esta solución bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de agua purificada, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio hasta la saturación, y el precipitado se deja depositarse durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 0°C y 4°C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H 0 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear (NMR) . b) Sulfatación de hialuronato de sodio, grado de sulfatación 3.5 0.250 gramos de la sal de tetrabutilamonio de ácido hialurónico, se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF). Se agregan 2.088 gramos de S03-piridina solubilizada en 10 mililitros de formamida dimetílica a esta solución bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositarse durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y 0 °C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H20 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear. c) Sulfatación del éster etílico parcial de ácido hialurónico: 75 por ciento de los grupos carboxilo están en la forma del éster etílico, grado de sulfatación 3 0.250 gramos de la sal de tetrabutilamonio del éster etílico parcial al 75 por ciento de ácido hialurónico (HYAFF-7p75) , se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF) . Se agregan 1.305 gramos de S03-piridina solubilizada en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a esta solución bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositar durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y O °C. Él precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H20 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear . d) Sulfatación del éster etílico parcial de ácido hialurónico : 50 por ciento de los grupos carboxilo están en la forma de un éster etílico, grado de sulfatación 2. 5. 0.250 gramos de la sal de tetrabutilamonio del éster etílico parcial al 50 por ciento de ácido hialurónico (HYAFF-7p50, 50 por ciento de los grupos carboxilo esterificados con etanol) , se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetíli-ca (DMF) . Se agregan 1.044 gramos de S03 -piridina solubilizada en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a esta solución bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositar durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y 0 °C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H 0 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear. c) Sulfatación del éster etílico parcial de ácido hialurónico: 25 por ciento de los grupos carboxilo están en la forma de un éster etílico, grado de sulfatación 2. 0.250 gramos de la sal de TBA de un éster etílico parcial de ácido hialurónico (HYAFF-7p25, 25 por ciento de los grupos carboxilo esterificados con etanol) , se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF) . Se agregan 0.783 gramos de S03 -piridina solubilizada en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo (DMSO) a esta solución bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositar durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y 0 °C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H20 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear. f ) Sulfatación del éster bencílico parcial de ácido hialurónico : 75 por ciento de los grupos carboxi están en la forma de un éster bencílico, grado de sulfatación 3 . 5. 0.250 gramos de la sal de tetrabutilamonio de un éster etílico parcial de ácido hialurónico (HYAFF-llp75, 75 por ciento de los grupos carboxilo esterificados con alcohol bencílico) , se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF) . A esta solución se le agregan 2.088 gramos de S03-piridina solubilizada en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo (DMSO) bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositar durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y 0 °C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H20 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear. g) Sulfatación del éster bencílico parcial de ácido hialurónico : 50 por ciento de los grupos carboxilo están en la forma de un éster bencílico, grado de sulfatación 3. 0.250 gramos de la sal de tetrabutilamonio de un éster etílico parcial de ácido hialurónico (HYAFF-llp50 , 50 por ciento de los grupos carboxilo esterificados con alcohol bencílico) , se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF). A esta solución se le agregan 1.305 gramos de S03-piridina solubilizada en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo (DMSO) bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hr. a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 milili-tros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositar durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y 0°C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H20 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear. h) Sulfatación del éster bencílico parcial de ácido hialurónico: 25 por ciento de los grupos carboxilo están en la forma de un éster bencílico, grado de sulfatación 2. 0.250 gramos de la sal de tetrabutilamonio de un éster etílico parcial de ácido hialurónico (HYAFF-llp25, 25 por ciento de los grupos carboxilo esterificados con alcohol bencílico) , se solubilizan en 10 mililitros de formamida dimetílica (DMF) . A esta solución se le agregan 0.522 gramos de S03 -piridina solubilizada en 10 mililitros de sulfóxido de dimetilo (DMSO) , bajo un flujo de nitrógeno. La solución se agita durante cuando menos 1 hora a una temperatura de entre 4°C y 0°C. Subsecuentemente se agregan aproximadamente 200 mililitros de H20, helada a 0°C. El pH de la mezcla se lleva hasta un valor de entre 8.5 y 9.5 mediante la adición de hidróxido de sodio 1M. Luego se precipita el derivado con 120 mililitros de alcohol etílico. Se agrega acetato de sodio anhidro hasta la saturación, y el precipitado se deja depositar durante entre 1 y 24 horas a una temperatura de entre 4°C y 0°C. El precipitado se separa mediante centrifugación, por ejemplo durante 15 minutos a 1,500 rpm, se solubiliza en H20 purificada, y luego se dializa, hasta que se hayan eliminado completamente todo el reactivo residual y los productos de reacción. El grado de sulfatación se determina mediante resonancia magnética nuclear. i ) Preparación de películas de HYAFF 11 , grado de sulfatación 1 . 5 0.250 gramos de una película de HYAFF 11 se sumergen en un baño de 250 mililitros de una mezcla de cloroformo : forma-mida dimetílica en una proporción de 1:1. Luego se agregan 50 mililitros de una solución obtenida mediante la solubilización de 3.4 gramos de un complejo de piridina-S03 en formamida dimetílica. La reacción se deja proceder durante 2 horas a la temperatura ambiente, después de lo cual se remueve la pelícu-la, y luego se sumerge en un baño de agua destilada (100 mililitros), y finalmente en una solución de agua:etanol, 50:50. Entonces la película se seca al horno durante 48 horas a 55°C. j ) Preparación de películas de HYAFF llp75, grado de sulfatación 1 0.250 gramos de una película de HYAFF llp75 se sumergen en un baño de 250 mililitros de una mezcla de cloroformo : formamida dimetílica, en una proporción de 1:1. Luego se agregan 50 mililitros de una solución obtenida mediante la solubilización de 2.3 gramos de un complejo de piridina-S03 en formamida dimetílica. La reacción se deja proceder durante 2 horas a la temperatura ambiente, después de lo cual se remueve la película,' y luego se sumerge en un baño de agua destilada (aproxímadamente 100 mililitros) , y finalmente en una solución de agua: etanol, 50:50. La película se seca al horno durante 48 horas a 55°C. Se pueden preparar derivados N-sulfatados de ácidos hialurónicos, y sus derivados, opcionalmente salificados, con un anticoagulante o compuesto con actividad antitrombótica, en donde las glucosaminas estén parcialmente N-sulfatadas, o parcialmente N-sulfatadas y parcial o totalmente O-sulfatadas en la posición 6, como sigue. El siguiente proceso químico proporciona un método para utilizar un producto de partida bien caracterizado, tal como ácido hialurónico, para la sulfatación selectiva del grupo amino de glucosamina, o el grupo hidroxilo en la posición 6, para obtener nuevos derivados sulfatados de ácido hialurónico con un rango inalterado de pesos moleculares . El término "derivado parcialmente 2 -N-sulfatado" de ácido hialurónico, significa un producto obtenido por medio de una reacción de sulfatación controlada del grupo amino de la glucosamina de ácido hialurónico, previamente N-desacetilado de acuerdo con el procedimiento descrito por P. shaklee (1984) Biochem. J. 217, 187-197. La reacción procede como se ilustra en seguida : n: de 12 a 12,500 R-L = H, COCH3 TAA = tetra-alquilamonio Diagrama 1 El término "derivados parcialmente 2-N-sulfatados y 6-O-sulfatados "significa los productos de la reacción química ilustrada en el Diagrama 1, en donde, además del grupo amino de glucosamina, también está total o parcialmente involucrada la función de hidroxilo primario del mismo residuo en la reacción de sulfatación, como se ilustra en seguida: n : de 12 a 12 , 500 TAA = tetra-alquilamonio Diagrama 2 Los derivados generados de acuerdo con los Diagramas 1 y 2 se pueden utilizar como reactivos intermediarios en la preparación de los compuestos, de conformidad con el procedimiento descrito en la Patente Europea Número 0216453 Bl, en donde la función carboxi del residuo glucurónico de ácido hialurónico, parcialmente 2-N-sulfatada o parcialmente 2-N-sulfatada y parcial o totalmente 6-0-sulfatada, se hace reaccionar parcial o completamente con alcoholes de las series alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heterocíclica, produciendo los esteres parciales o totales respectivos: n: de 12 a 12,500 R? = H, COCH3 TAA = tetra-alquilamonio X = residuo alcohólico, sodio Diagrama 3 Más aun, es posible utilizar los derivados sintéticos de acuerdo con los Diagramas 1 y 2 como intermediarios en la preparación de compuestos reticulados, de conformidad con los procedimientos descritos en las Patentes Europeas 0341745 Bl y 265116 Bl respectivamente, en donde se hace reaccionar una parte o todos los grupos carboxi pertenecientes al residuo D-glucurónico: i) utilizando sustancias de condensación con las funciones de alcohol de la misma cadena de polisacárido u otras cadenas, generando esteres internos (o lactona) y esteres intermoleculares; ii) con polialcoholes de las series alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heterocíclica, generando reticulación por medio de cadenas separadoras. Los compuestos sulfatados anteriormente mencionados obtenidos de conformidad con el proceso de la presente invención, se pueden salificar opcionalmente con metales pesados, seleccionándose los metales pesados a partir del grupo de elementos de metal de los períodos 4o, 5° y 6o de la tabla periódica, tales como plata, hierro, cobalto, cobre, zinc, arsénico, estroncio, zirconio, antimonio, oro, cesio, tungste-no, selenio, platino, rutenio, bismuto, estaño, titanio, y mercurio . Los derivados sulfatados también se pueden salificar opcionalmente con sustancias f rmacológicamente activas, tales como antibióticos, anti-infecciosos, antimicrobianos, antivira-les, citostáticos, antitumorales, anti-inflamatorios y sustan-cias sanadoras de heridas, anestésicos, agonistas o antagonistas colinérgicos o adrenérgicos, antitrombóticos, anticoagulantes, hemostáticos, fibrinolíticos, y sustancias trombolíticas, proteínas y sus fragmentos, péptidos, y polinucleótidos . El proceso para la preparación de los compuestos de la presente invención consiste principalmente en dos pasos, implicando el primero la N-desacetilación controlada del polisacárido natural, e implicando el segundo la reacción de sulfatación específica de las funciones hidroxilo primario o amino libre de glucosamina. Las fracciones de .ácido hialurónico a partir de fuentes biológicas y de fermentación, con un peso molecular de entre 5,000 y 5,000,000 de Dáltones, de preferencia entre 50,000 Dáltones y 300,000 Dáltones, se solubilizan en hidróxido de hidrazina con una pureza no menor del 98 por ciento, en un rango de concentración de entre 1 y 50 miligramos/mililitro, de preferencia entre 5 y 25 miligramos/mililitro. Luego esta solución se complementa con sulfato de hidrazina en una concentración de peso/volumen que varía entre el 0.1 y el 3 por ciento, de preferencia del 1 por ciento. La reacción se conduce dentro de una escala de temperatura de 40°C a 90°C, de preferencia a 60°C, con agitación, durante tanto tiempo como se necesite para alcanzar el grado deseado de N-desacetilación. La Tabla 1 reporta posteriormente en la presente el rendimiento expresado como el porcentaje de grupos amino libres, en términos del tiempo expresado como oras de reacción.

Tabla 1 * El porcentaje de N-desacetilación se determina de acuerdo con el método de J. Riesenfeld (Analy. Bioch. 1990, volumen 188, página 383-389) . ** "DAc" = N-desacetilación Luego se detiene la reacción mediante precipitación con un solvente polar, de preferencia etanol. El precipitado se liofiliza parcialmente, y se trata con una solución de ácido yódico, con un rango de molaridad de entre 0.1 y 1M, de preferencia 0.5M, y finalmente, con ácido yodhídrico en una concentración del 57 por ciento (peso/volumen) . El pH de la solución se mantiene entre 5 y 7 mediante la adición de una solución de acetato de sodio (10 por ciento, peso/volumen) . La fase acuosa que contiene el polisacárido modificado se extrae mediante tratamientos repetidos con éter dietíli-co, y luego, una vez que haya desaparecido completamente el color amarillo, la solución se trata nuevamente con etanol. El precipitado que se forma después de un secado adicional a 40°C, se solubiliza en agua a una concentración de entre 10 nanogramos/mililitro y 40 nanogramos/mililitro, de preferencia de 25 nanogramos/mililitro, y la solución se percola a través de una columna que contiene una resina de intercambio iónico activada con un hidróxido de tetra-alquilamonio, en donde el residuo de alquilo del amonio cuaternario está constituido por una cadena de entre 1 y 4 átomos de carbono. De preferencia se utiliza hidróxido de tetxabutilamo-nio. El producto percolado, representado por la sal de amonio cuaternario del polisacárido modificado, se liofiliza. Preparación de un derivado parcialmente 2-N-sulf tado; Método A La sal de amonio cuaternario, de preferencia de tetrabutilamonio, del polisacárido parcialmente N-desacetilado, se solubiliza en un solvente apolar, tal como sulfóxido de dimetilo, formamida dimetílica, acetamida dimetílica, N-metil-pirrolidona, de preferencia formamida dimetílica (DMF) , en una concentración de entre 5 y 50 miligramos/mililitro (de preferencia 25 miligramos/mililitro) . La solución orgánica se complementa con otra solución obtenida mediante la solubilización del complejo sulfatante constituido por sulfotrióxido de formamida dimetílica (DMF-SO3) , en formamida dimetílica, en una concentración que varía entre 50 y 200 miligramos/mililitro, y de preferencia de 100 miligramos/mililitro. La cantidad de complejo que se va a utilizar, expresada en moles de S03 , es sorprendentemente equivalente a los moles de grupos amino liberados por la reacción de N-desacetilación. La reacción de sulfatación procede a una temperatura de entre 0°C y 20°C, de preferencia de 4°C, durante no más de 4 horas, y luego se detiene agregando agua destilada fría. Primero se purifica el solvente de reacción precipitando el ácido hialurónico parcialmente 2 -N-sulfatado con etanol, y luego se dializa el producto resolubilizado con agua destilada. Finalmente, la solución se seca por congelación, y el producto sólido así obtenido se somete a caracterización química-analítica, para determinar el grado de N-sulfatación y el peso molecular promedio (Tabla 2) .

Tabla 2 HA = ácido hialurónico HA-N-S = ácido hialurónico N-sulfatado Preparación de un derivado 6 -O- sulf atado, parcialmente 2 -N-sulf tado: Método B La sal de amonio cuaternario, de preferencia de tetrabutilamonio, del polisacárido parcialmente N-desacetilado, se solubiliza en un solvente apolar, tal como sulfóxido de dimetilo, formamida dimetílica, acetamida dimetílica, N-metil-pirrolidona, de preferencia formamida dimetílica (DMF) , en una concentración de entre 5 y 50 miligramos/mililitro, de preferencia de 30 miligramos/mililitro. La solución orgánica se complementa con otra solución obtenida mediante la solubilización del complejo sulfatante constituido por sulfotrióxido de formamida dimetílica (DMF-S03) , en formamida dimetílica, en una concentración que varía entre 50 y 200 miligramos/mililitro, y de preferencia de 100 miligramos/mililitro. La cantidad de complejo que se va a utilizar, expresada como moles de S03, es sorprendentemente equivalente a los moles de grupos amino liberados por la reacción de N-desacetilación. La reacción de sulfatación procede a una temperatura de entre 0°C y 20°C, de preferencia a 4°C, durante 4 horas. Se prepara una solución mediante la solubilización del complejo de piridina-sulfotrióxido en sulfóxido de dimetilo, en una cantidad tal que la proporción entre los moles de S03 del agente sulfatante y los moles de -CH2OH sea entre 1.1 y 1.3. Las cantidades mayores de reactivo pueden favorecer cualesquiera reacciones de sustitución en otros grupos alcohol (secundarios) de la cadena de polisacárido. Luego la reacción procede durante otras 16 horas cuando menos, después de lo cual se detiene mediante la adición de agua destilada fría. Todos los siguientes pasos con respecto a la purifi-cación del polisacárido modificado son aquellos descritos en el "Método A" . La caracterización analítica realizada sobre los derivados obtenidos confirmó que el método de sulfatación sorprendentemente no es solamente para sustituir todos los grupos amino obtenidos mediante la N-desacetilación parcial, sino que también da como resultado la sustitución completa del grupo alcohol primario del residuo de glucosamina de ácido hialurónico (Tabla 3) Tabla 3 HA-N-O-Sl = ácido hialurónico, N-sulfatado, y totalmente O-sulfatado en la posición 6. Más aun, mediante la variación de las cantidades molares del complejo de piridina-S03 de acuerdo con los grupos hidroxilo primarios (proporción molar de entre 0.1 y 1), el "método B" hace posible que se obtenga una serie de derivados parcialmente 2 -N-sulfatados y parcialmente 6-0-sulfatados . Los ejemplos específicos de los derivados de ácido hialurónico N-sulfatados se pueden preparar como sigue: a) Preparación de ácido hialurónico parcialmente 2 -N-sulf tado (en donde aproximadamente el 5 por ciento de los grupos N-acetilo están susti tuidos por grupos sulfatados ) 1.00 gramos de HA a partir de crestas de gallo, con un peso molecular promedio de 181,000 dáltones, se solubiliza en 50 mililitros de monohidrato de hidrazina, junto con 0.5 gramos de sulfato de hidrazina. La solución se mantiene con agitación mientras las reacción continúa durante 8 horas a 60 °C, después de lo cual se detiene mediante la adición de 100 mililitros de etanol. El precipitado gelatinoso así formado se lava con etanol, y luego se seca a la temperatura ambiente bajo presión reducida. El producto intermedio se solubiliza en una mezcla constituida por 50 mililitros de agua y 20 mililitros de una solución al 10 por ciento de acetato de sodio, y se trata finalmente con 25 mililitros de una solución de ácido yódico, en una concentración de 0.5 M. Después de una reacción de aproximadamente 30 minutos con agitación, se titula el exceso de yodo con 5 mililitros de una solución al 57 por ciento de ácido yodhídrico. Durante esta operación, es preferible mantener el recipiente de reacción frío con hielo. La solución café y rica se trata entonces cuando menos 5 veces con alícuotas de 30 mililitros de éter dietílico, para extraer los residuos de reacción de la solución acuosa que contiene al polímero modificado. Finalmente se concentra a presión reducida y a una temperatura de 40 °C, hasta un volumen de aproximadamente 40 mililitros, y luego se percola a través de una columna llenada con 20 mililitros de resina sulfónica de intercambio de iones activada con una solución al 40 por ciento en peso/volumen de hidróxido de tetrabutilamonio. La solución acuosa que contiene al polisacárido modificado en la forma de sal de tetrabutilamonio (HATBA) se cosecha entonces y se somete a un ciclo de liofilización. 1.30 gramos de sal de HA de TBA liofilizada se solubilizan en 45 mililitros de formamida dimetílica, y la solución así obtenida se complementa con 0.6 mililitros de una solución de un complejo de sulfotrióxido de formamida N,N-dimetílica en una concentración de 50 miligramos/mililitro. La reacción continúa durante 5 horas a 4°C con agitación suave continua, después de lo cual se detiene mediante la adición de 45 mililitros de agua destilada fría. Habiendo neutralizado la solución con NaOH 2M, llevándola hasta un pH de entre 7.5 y 8, luego se filtra a través de un filtro Gooch con un tamaño de poro G2 , y se trata con 250 mililitros de etanol. El precipitado así formado se lava con cuando menos 150 mililitros de etanol y se seca al vacío durante cuando menos 16 hora's, después de lo cual se resolubiliza en 50 mililitros de agua destilada, y luego se dializa contra 50 volúmenes de agua . El producto se liofiliza, y luego se caracteriza para determinar el porcentaje de grupos amino N-sustituidos, y su peso molecular promedio. Peso del producto liofilizado: O .72 gramos rendimiento : 85 por ciento moles de S03_/p"-?les de HA (unidades mono-méricas) : 0.045 moles de grupos -NH2 libres/moles de HA: 0.052 % de des-N-acetilación: 5.2 por ciento % de re-N-sulfatación: 4.5 por ciento rendimiento a partir de la reacción de N-sulfatación: 87 por ciento peso molecular promedio: 174,000 dáltones b) Preparación de ácido hialurónico parcialmente 2 -N-sulf tado (en donde aproximadamente el 25 por ciento de los grupos N-acetilo están susti tuidos con grupos sulfatados 1.2 gramos de HA de crestas de gallo, con un peso molecular promedio de 181,000 dáltones, se solubilizan en 60 mililitros de monohidrato de hidrazina, junto con 0.6 gramos de sulfato de hidrazina. La solución se mantiene con agitación mientras que la reacción procede durante 24 horas a 60°C, después de lo cual se detiene mediante la adición de 120 mililitros de etanol. El precipitado gelatinoso así formado se lava con etanol, y luego se seca a la temperatura ambiente bajo presión reducida. El producto intermedio se solubiliza en una mezcla constituida por 60 mililitros de agua y 25 mililitros de una solución al 10 por ciento de acetato de sodio, y se trata finalmente con 30 mililitros de una solución de ácido yódico en una concentración de 0.5M. Después de una reacción de aproxi-madamente 30 minutos con agitación continua, el exceso de yodo se titula con 6 mililitros de una solución al 57 por ciento de ácido yodhídrico. Durante esta operación, es preferible mantener el recipiente de reacción frío con hielo. La solución castaña y rica se trata entonces cuando menos 5 veces con alícuotas de 40 mililitros de éter dietílico para extraer los residuos de reacción de la solución acuosa que contiene al polímero modificado. Finalmente se concentra a presión reducida y a una temperatura de 40 °C, hasta un volumen de aproximadamente 50 mililitro, y luego se percola a través de una columna de intercambio iónico llenada con 25 mililitros de resina sulfónica activada con una solución al 40 por ciento en peso/volumen de hidróxido de tetrabutilamonio. La solución acuosa que contiene al polisacárido modificado en la forma de sal de tetrabutilamonio (HATBA) , se cosecha entonces y se somete a ciclo de liofilización. 1.65 gramos de sal de HA de TBA secada por congelación, se solubilizan en 55 mililitros de formamida dimetílica, y la solución así obtenida se complementa con 3.0 mililitros de solución en una concentración de 50 miligramos/mililitro de un complejo de sulfotrióxido de formamida N,N-dimetílica. La reacción continúa durante 6 horas a 4°C con agitación suave y continua, después de lo cual se detiene mediante la adición de 55 mililitros de agua destilada fría. Habiendo neutralizado la solución con NAOH 2M, llevándola hasta un pH de entre 7.5 y 8, entonces se filtra a través de un filtro Gooch con un tamaño de poros G2 , y se trata con 300 mililitros de etanol. El precipitado así formado se lava con cuando menos 150 mililitros de etanol, y se seca al vacío durante cuando menos 16 horas, después de lo cual se resolubiliza en 50 mililitros de agua destilada, y luego se dializa contra 50 volúmenes de agua. El producto se liofiliza, y luego se caracteriza para determinar el porcentaje de grupos amino N-sustituidos, y su peso molecular promedio. Peso del producto liofilizado: 0.98 gramos rendimiento : 89 por ciento moles de S03_/moles de HA (unidades mono-méricas) : 0.23 moles de grupos -NH2 libres/moles de HA: 0.24 % de des-N-acetilación: 24 por ciento % de re-N-sulfatación: 23 por ciento rendimiento de la reacción de N-sulfatación: 96 por ciento peso molecular promedio: 161,000 Dáltones c) Preparación de ácido hialurónico, parcialmente 2 -N-sulfatado (en donde aproximadamente el 25 por ciento de los grupos N-acetilo están susti tuidos por grupos sulf tados ) y 6-O- sulf tado. 5.0 gramos de HA obtenido mediante fermentación, con un peso molecular promedio de 195,000 dáltones, se solubilizan en 250 mililitros de monohidrato de hidrazina, junto con 2.5 gramos de sulfato de hidrazina. La reacción se mantiene con agitación durante 24 horas a 60°C, después de lo cual se detiene mediante la adición de 500 mililitros de etanol. El precipitado gelatinoso así formado se lava con etanol, y luego se seca a la temperatura ambiente bajo presión reducida. El producto intermedio se solubiliza en una mezcla constituida por 250 mililitros de agua y 105 mililitros de una solución al 10 por ciento de acetato de sodio, y se trata finalmente con 125 mililitros de una solución de ácido yódico en una concentración de 0.5 M. Después de una reacción de aproximadamente 30 minutos con agitación continua, se titula el exceso de yodo con 25 mililitros de una solución al 57 por ciento de ácido yodhídrico. Durante esta operación, es preferible mantener el recipiente de reacción frío con hielo. La solución castaña y rica se trata entonces cuando menos 5 veces con alícuotas de 150 mililitros de éter dietílico para extraer los residuos de reacción de la solución acuosa que contiene al polímero modificado. Finalmente se concentra a presión reducida y a una temperatura de 40°C, hasta un volumen de aproximadamente 200 mililitros, y luego se percola a través de una columna llenada con 100 mililitros de resina sulfónica de intercambio iónico activada con una solución al 40 por ciento en peso/volumen de hidróxido de tetrabutilamonio. La solución acuosa que contiene al polisacárido modificado en la forma de sal de tetrabutilamonio (HATBA) se cosecha entonces y se somete a un ciclo de liofilización. 6.0 gramos de sal de HA de TBA secada por congelación se solubilizan en 300 mililitros de formamida dimetílica, y la solución así obtenida se complementa con 13 mililitros de una solución de un complejo de sulfotrióxido de formamida N,N-dimetílica en una concentración de 50 miligramos/mililitro. La reacción continúa durante 6 horas a 4°C, con agitación suave y continua. A la mezcla de reacción se le agrega una segunda solución, constituida por 40 mililitros de un complejo de sulfotrióxido de piridina solubilizado en sulfóxido de dimetilo, en una concentración de 50 miligramos/mililitro. Aproximadamente 16 horas después, se agregan 250 mililitros de agua destilada fría, y una vez que se ha neutralizado la solución con NaOH 2 M a un pH de 8, entonces se filtra a través de un filtro Gooch, con un tamaño de poros G3 , y se trata con 1,250 mililitros de etanol. El precipitado así formado se lava con cuando menos 500 mililitros de etanol, y se seca al vacío durante cuando menos 16 horas, después de lo cual se resolubiliza en 250 mililitros de agua destilada, y luego se dializa contra 50 volúmenes de agua . El producto se liofiliza, y luego se caracteriza para determinar el porcentaje de grupos amino N-sustituidos, el grado de 6-0-sulfatación, y su peso molecular promedio. Peso del producto liofilizado: 4.12 gramos rendimiento: 82 por ciento moles de S03./moles de HA (unidades mono-méricas) : 1.24 moles de grupos -NH2 libres/moles de HA: 0.26 % de des-N-acetilación: 26 por ciento % de re-N-sulfatación: 24 por ciento rendimiento de la reacción de N-sulfata-ción: 100 por ciento peso molecular promedio: 170,000 Dáltones d) Preparación del éster bencílico de ácido hialurónico , parcialmente N-sulf tado, y O-sulf atado . 2.00 gramos del derivado obtenido en el Ejemplo 3, se solubilizan en 100 mililitros de agua destilada, y la solución se percola a través de una columna de vidrio previamente llenada con 40 mililitros de resina de intercambio iónico activada con hidróxido de tetrabutilamonio (forma TBA+) . El eluato se seca por congelación, y se obtienen 3.3 gramos del producto.

El producto se solubiliza en una mezcla constituida por 130 mililitros de N-metil -pirrolidona y 1.3 mililitros de agua, se hace reaccionar a 4°C con 0.29 mililitros de bromuro de bencilo. La reacción procede durante 48 horas a 28°C, manteniendo la solución con agitación y lejos de fuentes de luz, después de lo cual se agregan 300 mililitros de acetato de etilo . El precipitado así formado, principalmente constituido por el polisacárido modificado, se lava con 100 mililitros de acetona, y luego se liofiliza al vacío a la temperatura ambiente, después de lo cual se trata con 100 mililitros de una solución al 10 por ciento en peso/volumen de cloruro de sodio. Al final del tratamiento con suero (que dura aproximadamente una hora) , el producto se lava con 150 mililitros de agua/acetona, 20:80, y finalmente con 100 mililitros de acetona . Después de secar durante 48 horas a 30°C, se obtienen 0.92 gramos en un rendimiento del 80 por ciento. Caracterización: % de esterificación 96% e) Preparación de ácido hialurónico auto -reticulado al por ciento, parcialmente N-sulfatado, y O-sulf atado 2.00 gramos del derivado obtenido en el Ejemplo 3, se solubilizan en 100 mililitros de agua destilada, y la solución se percola a través de una columna de vidrio llenada con 40 mililitros de resina de intercambio iónico activada con hidróxido de tetrabutilamonio (forma TBA+) . Después de secar por congelación en eluato, se obtienen 3.3 gramos del producto. El producto se solubiliza en una mezcla formada por 165 mililitros de N-metil -pirrolidona (NMP) y 0.8 mililitros de agua, y luego se hace reaccionar con una solución obtenida mediante la solubilización de 205 miligramos de yoduro de 2-cloro-1-metil-piridina en 8.2 mililitros de N-metil-pirrolidona. La reacción procede durante 18 horas a -20°C, después de lo cual se agregan 165 mililitros de una solución acuosa de acetato de amonio al 3 por ciento. La mezcla se agita constantemente durante aproximadamente 4 horas, y luego se trata con 650 mililitros de etanol. El precipitado así formado se separa mediante filtración, se lava con etanol, y luego se seca al vacío durante 24 horas. Luego el producto se trata con 60 mililitros de una solución al 3 por ciento de cloruro de sodio, para favorecer el intercambio iónico, y finalmente se re-precipita mediante la adición de 180 mililitros de etanol a la solución. Después de eliminar el sobrenadante, el producto se lava cuando menos 3 veces con 50 mililitros de etanol, y luego se trata con 100 mililitros de acetona, antes de secarse finalmente a 30°C durante 48 horas. De esta manera se obtienen 0.97 gramos de derivado sulfatado y parcialmente auto-reticulado. f ) Preparación de una película de éster bencílico de ácido hialurónico parcialmente N-sulf atado, y O- sulfatado. Una solución del éster bencílico de ácido hialurónico, parcialmente N-sulfatado y O-sulfatado, se prepara en sulfóxido de dimetilo en una concentración de 180 miligramos/mililitro . Se extiende una capa delgada de solución sobre una placa de vidrio; el espesor de la capa de solución debe ser 10 veces mayor que aquél de la película final. La placa de vidrio se sumerge en etanol, el cual absorbe el sulfóxido de dimetilo sin solubilizar el éster, el cual se solidifica. La película se separa de la placa de vidrio, y se lava repetidamente con etanol, agua, y luego nuevamente con etanol. La película obtenida se seca bajo presión durante 48 horas a 30°C. g) Preparación de la sal de plata del derivado de ácido hialurónico parcialmente 2 -N-sulf tado (25 por ciento) y 6-0-sulf atado 0.50 gramos del compuesto obtenido de acuerdo con el Ejemplo 2, se solubilizan en 25 mililitros de agua destilada, y la solución obtenida se percola a través de una columna llenada con 16 centímetros cúbicos de resina de intercambio iónico fuerte en forma de H+ . Luego el eluato se cosecha y se liofiliza. El producto intermedio en forma de ácido obtenido mediante liofilización, se trata con 20 mililitros de una solución 0.5 M de AgN03 durante 60 minutos con agitación y lejos de la luz . Habiendo eliminado la fase líquida mediante filtración, el producto se lava completamente con 150 mililitros de agua destilada, y luego con 50 mililitros de etanol absoluto. Después de secar al vacío, se obtienen 0.649 gramos del derivado de ácido hialurónico sulfatado, sal de plata, a 40°C, (rendimiento: 95 por ciento) . Estos derivados de ácido hialurónico se pueden utilizar solos, unos en asociación con otros, o con polímeros naturales, semisintéticos, o sintéticos. Algunos polímeros naturales que se pueden utilizar son, por ejemplo, colágeno, coprecipitados de colágeno y glicosaminoglicanos , celulosa, polisacáridos en la forma de geles tales como quitina, quito-san, pectina o ácido péctico, ágar, agarosa, xantana, goma gelan, ácido algínico o los alginatos, polimanano o poliglica-nos, almidón, gomas naturales. Los polímeros semisintéticos, por ejemplo, se pueden seleccionar a partir del grupo que consiste en colágeno reticulado con sustancias tales como aldehidos o precursores de los mismos, ácidos dicarboxílicos o sus halogenuros, diaminas, derivados de celulosa, quitina o quitosán, goma gelan, xantana, pectina o ácido péctico, poliglicanos, polimanano, ágar, agarosa, goma natural, glicosa-minoglicanos . Finalmente, los ejemplos de los polímeros sintéticos que se pueden utilizar son como sigue: ácido poliláctico, ácido poliglicólico o copolímeros de los mismos o sus derivados, polidioxanos, polifosfazeno, resinas de polisul-fona, resinas de poliuretano, PTFE. De los esteres de ácido hialurónico que se van a utilizar en la presente solicitud de patente, es preferible utilizar los esteres bencílicos, los esteres etílicos, o los esteres propílieos, con 50-100 por ciento de los grupos carboxilo esterificados, de preferencia del 60 al 100 por ciento; más preferiblemente del 75 al 100 por ciento de los grupos carboxilo esterificados. El éster bencílico, con entre el 75 por ciento y el 100 por ciento de sus grupos carboxilo esterificados, y el porcentaje restante salificado con metales alcalinos y alcalinotérreos, de preferencia con sodio, es el particularmente preferido. También se prefieren los derivados de éster de ácido hialurónico, en donde una porción de los grupos carboxilo están esterificados con un alcohol aralifáti-co, y una segunda porción de los grupos carboxilo están derivados con alcoholes alifáticos rectos de 10 a 22 átomos de carbono. De estos derivados de éster, se prefieren particular-mente los siguientes compuestos: • ácido hialurónico esterificado con alcohol bencílico (75 por ciento) y alcohol dodecílico (25 por ciento) ; • ácido hialurónico esterificado con alcohol bencílico (75 por ciento) y alcohol hexadecílico (25 por ciento) ; • ácido hialurónico esterificado con alcohol bencílico (75 por ciento) y ácido octadecílico (25 por ciento) . • ácido hialurónico esterificado con alcohol bencílico (75 por ciento) , alcohol eicosanílico (20 por ciento) , y salificado con sodio (5 por ciento) ; y • ácido hialurónico esterificado con alcohol bencílico (75 por ciento) , alcohol docosanílico (15 por ciento) , y salificado con sodio (10 por ciento) . Los derivados reticulados preferidos de la presente invención son aquellos con entre el 0.5 por ciento y el 50 por ciento de reticulación; de preferencia entre el 0.5 por ciento y el 20 por ciento, y más preferiblemente entre el 3 por ciento y el 10 por ciento. Estos biomateriales se pueden preparar en la forma de películas, geles, esponjas, gasas, telas no hiladas, membranas, microesferas, microcápsulas, y canales de guía, de acuerdo con los procedimientos reportados en las Patentes Números EP-0216453; EP-0341745; US 5,520,916; EP 0517565; EP 0571415; WO 94/03212. En una modalidad preferida de la invención, los derivados de polisacárido se preparan en la forma de hebras. Son de un interés particular las hebras hechas de derivados de éster de ácido hialurónico, en donde una primera parte de las funciones carboxilo están esterificadas con un alcohol aralifá-tico, tal como alcohol bencílico, y una segunda parte de las funciones carboxilo se derivan con alcoholes alifáticos rectos de cadena larga, y con entre 10 y 22 átomos de carbono, tales como aquellos dados a conocer en la Solicitud de Patente Internacional Número WO 98/08876. Las hebras opcionalmente pueden contener también otros polímeros biocompatibles, tales como policaprolactona, ácido poliglicólico, ácido poliláctico, PTFE, y polihidroxibu-tirato. Las hebras hechas de los derivados de ácido hialurónico se pueden utilizar como hebras de sutura en anastomosis, particularmente en el campo cardiovascular, o las hebras se pueden utilizar para preparar malla, tela tejida, tela no hilada, tubos, u otros materiales para utilizarse alrededor de los vasos u otros órganos que hayan sufrido anastomosis. Más aun, estos biomateriales pueden estar constituí-dos por asociaciones de derivados de ácido hialurónico, gelan o alginato en otras formas diferentes, y pueden contener sustancias farmacológicamente activas, tales como sustancias hemostáticas y anti-inflamatorias, antibióticos, antitrombóticos, factores capaces de activar plasminógenos, y/o factores de crecimiento. Es de un interés particular la inclusión de sustancias hemostáticas en los biomateriales. Los ejemplos de las sustancias hemostáticas que se pueden incluir son adrenalona, adrenocromo, aminocromo, batroxobina, salicilato de carbazocro-mo, sulfonato de carbazocromo sódico, cefalinas, cotarnina, etamsilato, factores VIII, IX, XIII, fibrinógeno, 1, 2-naftoqui-nona, ácido 1-naftilamin-4-sulfónico, oxamarina, colodión estíptico de celulosa oxidado, sulmarina, trombina, tromboplas-tina, cloruro de tolonio, ácido tranexámico, vasopresina, y vitaminas K2 , K5, y K-S(II). Puede ser de un interés particular utilizar los biomateriales de conformidad con la presente invención, solos o unos en asociación con otros, posiblemente con los derivados anteriormente mencionados, en cirugía, tal como cirugía cardiovascular y peritoneal, empleando su capacidad para absorber los fluidos corporales, y de esta manera reducir su acumulación en los sitios involucrados en la operación quirúrgica. Este efecto de absorber los fluidos corporales se puede utilizar con ventaja en cirugía anastomótica, en donde se debe evitar tal acumulación. MODALIDADES EJEMPLIFICADAS DE LA INVENCIÓN Ejemplo 1 Evaluación de la respuesta del tejido vascular y perivascular en rata, a los biomateriales que comprenden un éster bencílico de ácido hialurónico con el 80 por ciento de esterificación en la forma de una película, y un derivado auto -reticulado al 5 por ciento de ácido hialurónico en la forma de un gel Materiales y Métodos. El análisis preliminar de 8 ratas estableció que una forma preferible del biomaterial para el tratamiento post-anastomótico de venas, es una forma de gel, mientras que, en el caso del tratamiento post-anastomótico de las arterias, un tratamiento preferible es una película, o un gel si el sangrado es ligero. Los geles son preferibles con el tratamiento post-anastomótico de venas, debido a que la aplicación de película a las venas puede ocasionar una constricción excesiva del vaso. Los geles no ocasionan esta constricción, y las propiedades adherentes de un gel le permitirán sellar la unión y prevenir el sangrado a través de las puntadas . Debido a que la presión sanguínea en las arterias es muy alta, es más adecuado utilizar una película, o puede ser apropiado un gel en los casos de un sangrado solamente ligero. Se utilizaron 48 ratas Sprague Dawley machos adultos, con un peso promedio de 370 gramos (entre 295 gramos y 480 gramos) . Las ratas primero se anestesiaron con éter, después de lo cual recibieron 40 miligramos/kilogramo de Pentotal mediante la vía intraperitoneal, y se sometieron a disección de los vasos femorales. Los diámetros de los vasos se midieron con papel de gráfica antes de que se bloqueara la circulación con sujetadores, y se cortara el vaso. Los animales se subdividieron en dos grupos de 24 ratas . 1° Grupo-24 ratas Cada rata se sometió a anastomosis venosa en ambas patas traseras . En este grupo, las venas de ambas patas traseras sufrieron primero anastomosis con entre 8 y 10 puntadas de sutura, después de lo cual una se trató con gel del compuesto auto-reticulado extendido alrededor de la línea de sutura antes de restablecer el flujo sanguíneo, mientras que la vena de la pata opuesta no se trató con el biomaterial, y por consiguiente, representó el control. 2o Grupo-24 ratas Cada rata se sometió a anastomosis venosa en una pata trasera, y a anastomosis arterial en la pata trasera opuesta. Las venas se cubrieron con gel del compuesto auto-reticulado, y las arterias con la película del éster bencílico de ácido hialurónico. Cada grupo se subdividió en cuatro subgrupos de 6 ratas cada uno, y se observaron sus anastomosis después de 10, 15, 25, y 45 días, respectivamente, en seguida de la aplicación del biomaterial, y las muestras se examinaron histológicamente. La evaluación clínica de la patencia de los vasos se realizó mediante la prueba de patencia de acuerdo con O'Brien, B. McC. (1997, "Microvascular Reconstructive Surgery", Edin-burgh: Churchill Livingstone) .

Se observaron muestras del tej ido perivascular para evaluar la presentación de fibrosis y adhesiones. Resultados ; Los resultados de las pruebas se resumen en las Tablas 1 y 2 Quince venas femorales estaban obturadas, y 57 estaban patentes (índice de patencia del 79.17) . Tabla 1 venas+gel : venas tratadas con gel de ácido hialurónico auto-reticulado. arterias+película: arterias tratadas con película de éster bencílico de ácido hialurónico.

Tabla 2 Los resultados mostraron una reducción en el tiempo de sangrado promedio, particularmente en el caso de las venas tratadas con gel hecho del compuesto auto-reticulado, menos fibrosis, y una formación reducida de tejido de cicatriz alrededor de vaso tratado . El análisis histológico de las muestras realizado sobre aproximadamente 20 vasos elegidos aleatoriamente del primer y segundo grupos después de diferentes días, mostró que las venas y las arterias eran generalmente patentes, aunque ligeramente estrechadas en algunos casos por un engrosamiento fibroso ligero de la íntima. Hubo solamente un caso de un pequeño trombo que se pudo ver adherido a la pared del vaso. El endotelio no fue hipertrófico, no tuvo fibrosis visibles o adherencia, y apareció fino y regular en todas partes. El teñido con hematoxilina-eosina no reveló ninguna otra alteración estructural de las paredes vasculares además de áreas esporádicas de fibrosis atribuibles a los efectos de cicatrización de la cirugía. El material quirúrgico utilizado para la operación, apareció bajo el microscopio como un material birrefringente amorfo extraño, y estaba rodeado por parches de la reacción granulomatosa, caracterizados por la presencia de linfocitos, células de plasma, e histocitos multinucleados . No hubo señales de inflamación de tipo de granuloci-tos . Habiéndose descrito de esta manera la invención, está claro que estos métodos se pueden modificar de diferentes maneras. Estas modificaciones no deben considerarse como divergencias del espíritu y propósito de la invención, y se debe considerar que cualquier modificación que pueda parecer evidente para un experto en el campo entra en el alcance de las siguientes reivindicaciones.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la invención que antecede, se considera como una novedad, y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. El uso de biomateriales que comprenden cuando menos un derivado de polisacárido, opcionalmente en asociación con polímeros naturales, semisintéticos, o sintéticos, y/o con sustancias farmacéuticamente activas, para formar una barrera física hemostática que rodea a la unión quirúrgica durante la cirugía anastomótica.
2. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque el derivado de polisacárido es un derivado de ácido hialurónico, un derivado de gelan, o un derivado de alginato.
3. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido hialurónico es de esteres de ácido hialurónico, en donde parte o todas las funciones carboxílicas están esterificadas con alcoholes de las series alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heterociclica.
4. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido hialurónico es de los esteres auto-reticula-dos de ácido hialurónico, en donde parte o todos los grupos carboxi están esterificados con las funciones alcohólicas de la misma cadena de polisacárido o de otras cadenas.
5. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido hialurónico es de los compuestos reticulados de ácido hialurónico, en donde parte o todos los grupos carboxi están esterificados con polialcoholes de las series alifática, aromática, arilalifática, cicloalifática, heterocíclica, generando reticulación por medio de cadenas separadoras.
6. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido hialurónico es de los compuestos de ácido hialurónico en donde una porción de los grupos carboxi están esterificados con un alcohol aralifático, y una segunda porción de los grupos carboxi se derivan con alcoholes alifáticos rectos de 10 a 22 átomos de carbono.
7. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido hialurónico es de hemiésteres de ácido succínico, o sales de metal pesado del hemiéster de ácido succínico con ácido hialurónico, o con esteres parciales o totales de ácido hialurónico.
8. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 2, caracterizado porque el derivado de ácido hialurónico esta sulfatado o N-sulfatado.
9. El uso se biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los polímeros naturales se seleccionan del grupo que consiste en colágeno, coprecipitados de colágeno y glicosaminoglicanos, celulosa, polisacáridos en la forma de geles tales como quitina, quitosán, pectina o ácido péctico, ágar, agarosa, xantana, goma gelan, ácido algínico o alginatos, polimanano o poliglicanos, almidón, gomas naturales.
10. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los polímeros semisintéticos se seleccionan del grupo que consiste en colágeno reticulado con sustancias tales como aldehidos o precursores de los mismos, ácidos dicarboxílicos o sus halogenuros, diaminas, derivados de celulosa, ácido hialurónico, quitina, quitosán, goma gelan, xantana, pectina o ácido péctico, poliglicanos, polimanano, ágar, agarosa, gomas naturales, glicosaminoglicanos.
11. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque los polímeros sintéticos se seleccionan del grupo que consiste en ácido poliláctico, ácido poliglicólico, o copolímeros de los mismos, o los derivados de los mismos, polidioxano, polifosfa-zeno, resinas de polisulfona, resinas de poliuretano, PTFE.
12. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 3, caracterizado porque los derivados de éster de ácido hialurónico se esterifican dentro de un rango del 60 al 100 por ciento.
13. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 4, caracterizado porque los derivados auto-reticulados de ácido hialurónico, se auto-reticulan dentro de una escala del 0.5 al 20 por ciento, de preferencia entre el 3 por ciento y el 10 por ciento.
14. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 1 a 13, en la forma de películas, geles, esponjas, gasas, telas no hiladas, membranas, microesferas, microcápsulas, hebras, cadenas de guía, y asociaciones de los mismos.
15. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 1, caracterizado porque las sustancias farmacológicamente activas se seleccionan del grupo que consiste en sustancias anti-inflamatorias o hemostáticas, antibióticos, antitrombóticos, factores capaces de activar los plasminógenos y factores de crecimiento.
16. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 1 a 15, caracterizado porque las sustancias farmacológicamente activas son fibrinógeno y trombina.
17. El uso de biomateriales de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 1 a 16, en cirugía cardiovas-cular y peritoneal.
18. Un método para formar una barrera hemostática física durante una cirugía anastomótica, el cual comprende aplicar a la unión quirúrgica un biomaterial caracterizado por cuando menos un derivado de polisacárido, opcionalmente en asociación con polímeros naturales, semisintéticos, o sintéticos, y/o con sustancias farmacéuticamente activas.
19. El método de conformidad con lo reclamado en la reivindicación 18, caracterizado porque el derivado de polisacárido es un derivado de ácido hialurónico, un derivado de gelan, o un derivado de alginato.
20. El método de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 18 a 19, caracterizado porque los biomateriales están en la forma de películas geles, esponjas, gasas, telas no hiladas, membranas, microesferas, microcápsulas, hebras, canales de guía, y asociaciones de los mismos.
21. El método de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 18 a 20, caracterizado porque las sustancias farmacológicamente activas se seleccionan del grupo que consiste en anti-inflamatorias, sustancias hemostáticas, antibióticos, antitrombotieos, factores capaces de activar el plasminógeno y factores de crecimiento.
22. El método de conformidad con lo reclamado en las reivindicaciones 18 a 21, caracterizado porque la cirugía comprende además cirugía cardiovascular y peritoneal .