MX2014015649A - Vectores de vacuna recombinante de herpesvirus bovino 1 (bohv-1) con baja virulencia. - Google Patents

Abstract

La presente descripción se encuentra en general en el campo de la vacunación y el control de enfermedades en animales de ganado vacuno y bovino. Se proporciona un vector de vacuna recombinante de herpesvirus bobino 1 (BoHV-1) para un control eficiente de uno o más patógenos bovinos tales como aquellos asociados con el complejo de la enfermedad respiratoria bovina, tal como el virus de diarrea viral bovina (BVDV), y el cual mejora las condiciones de enfermedad provocadas por el mismo. También son posibles en la presente los protocolos para el manejo de animales bovinos confinados o en manada.

Description

VECTORES DE VACUNA RECOMBINANTE DE HERPESVIRUS BOVINO 1 (BOHV-1) CON BAJA VIRULENCIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente descripción se encuentra en general en el campo de la vacunación y el control de enfermedades en animales bovinos. Se proporciona un vector de vacuna para el control eficiente de uno o más patógenos bovinos tales como aquellos asociados con el complejo de la enfermedad respiratoria bovina y el cual mejora las condiciones de enfermedad provocadas por el mismo. También son posibles en la presente los protocolos para el manejo de animales bovinos confinados o en manada.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los detalles bibliográficos de las publicaciones a las que hace referencia el autor en esta especificación se recolectan alfabéticamente al final de la descripción.

La referencia a cualquier téenica anterior en esta especificación no se deberá tomar como un reconocimiento o cualquier forma de sugerencia de que esta técnica anterior forme parte del conocimiento general común en cualquier país.

El complejo de la enfermedad bovina respiratoria (BRDC) es la enfermedad infecciosa más significativa del ganado vacuno en corrales en Australia. El BRDC provoca pérdida económica debido a la morbilidad, mortalidad, pérdida de recursos alimenticios, adquisiciones de medicamentos, tiempo aumentado en la alimentación y costos laborales asociados. El BRDC tiene una etiología complicada con al menos cuatro especies virales y tres bacterianas junto con las condiciones ambientales que predisponen a un animal a la enfermedad .

Los cuatro virus asociados con el BRDC son el herpesvirus bovino 1 (BoHV-1), el virus de diarrea viral bovina (BVDV o pestivirus bovino), virus de parainfluenza bovina 3 y virus respiratorio sincitial bovino. Los estudios serológicos han mostrado que todos estos virus infectan al ganado en corrales en Australia. Las tres especies bacterianas, Pasteurella mutocida, Manhiemia haemolytica y Haemophilus somnus, también se han implicado en el BRDC.

En Norteamérica y en Europa, se han utilizado vacunas tanto vivas como muertas para controlar las enfermedades provocadas por BoHV-1. Estas vacunas se basan en diferentes genotipos de BoHV-1 a los encontrados en Australia. Las cepas norteamericanas y europeas de BoHV-1 en general se clasifican en el subgrupo 1.1, mientras que las cepas australianas forman el subgrupo 1.2. Los virus de BoHV-1.1 provocan una enfermedad clínica más grave en comparación con los virus de BoHV-1.2. Se desconoce el mecanismo molecular exacto para esta diferencia en el fenotipo.

El BoHV-1 es un virus de la familia Herpesviridae que provoca diversas enfermedades a nivel mundial en ganado vacuno, incluyendo rinotraqueitis, vaginitis, balanopostitis, aborto, conjuntivitis y enteritis. El BoHV-1 también es un factor que contribuye a la fiebre de embarque. Se disemina a través de contacto sexual, inseminación artificial y transmisión en aerosol. Al igual que otros herpesvirus, el BoHV-1 provoca una infección latente de por vida y la dispersión del virus. El nervio ciático y el nervio trigémino son los sitios de latencia.

La enfermedad respiratoria provocada por BoHV-1 se conoce comúnmente como rinotraqueitis infecciosa bovina. Los síntomas incluyen fiebre, secreción de la nariz, tos, dificultad para respirar y pérdida de apetito. Con frecuencia se presentan úlceras en la boca y la nariz. Las tasas de mortalidad pueden alcanzar hasta el 10 por ciento. La enfermedad genital provoca vulvovaginitis pustulosa infecciosa en vacas y balanopostitis infecciosa en toros. Los síntomas incluyen fiebre, depresión, pérdida de apetito, micción dolora, una vulva hinchada con pústulas y flujo en vacas y dolor al contacto sexual en toros. En ambos casos, las lesiones en general se resuelven en un término de dos semanas. Se pueden presentar abortos y mortinatos de uno a tres meses después de la infección. El BoHV-1 también puede provocar una enfermedad generalizada en terneros recién nacidos, caracterizada por enteritis y muerte.

Similarmente, el BVDV es una enfermedad del ganado vacuno que reduce la productividad y aumenta la mortalidad. Se provoca por un pestivirus proveniente de la familia Flaviviridae. Los pestivirus tienen la capacidad de establecer una infección persistente durante la preñez. La infección persistente con los pestivirus con frecuencia prosigue sin ser notada. Los BVDV con frecuencia también experimentan una recombinación de ARN no homólogo que conduce a la aparición de virus genéticamente distintos que son letales para el hospedero.

Las señales clínicas de erosiones de las mucosas y diarrea que se presentan en forma aguda de la diarrea viral bovina tienen un efecto significativo sobre aquellos animales infectados, aunque de manera mucho más costosa en los animales que son infectados persistentemente. Típicamente, estos animales fracasan en alcanzar su potencial genético, exhibiendo una ganancia de peso aumentado, una susceptibilidad aumentada a enfermedades y fertilidad reducida. Dispersan el virus provocando pérdida reproductiva en los animales no inmunizados en la manada.

Las vacas que están expuestas a la variante citopática del BVDV (45-125 dias de gestación) típicamente abortarán el feto. La exposición más temprana a cualquier variante conduce a muerte embrionaria temprana. La exposición entre los días 125 hasta 175 días de gestación conduce a defectos en el nacimiento (tales como defectos oculares e hidrocefalia) y una exposición mayor a los 175 días típicamente conducirá a que la cría será totalmente inmune al nacimiento .

Por lo tanto, como una consecuencia de la gravedad del BRDC y el efecto significativo sobre el ganado, se requieren mejoras de vacunación en la industria. Los virus atenuados proporcionan una mejor protección que los virus inactivados debido a que presentan más antígenos virales para el sistema inmunitario del hospedero. Otra ventaja importante del virus atenuado es el potencial de administrarlo intranasalmente, es decir, en el sitio donde se presenta la primera multiplicación del virus tipo silvestre después de la infección .

Por largo tiempo se ha reconocido que la variabilidad antigénica del BVDV lo convierte en un virus difícil contra el cual realizar la vacunación. Existen dos procedimientos que se pueden llevar a cabo para la vacunación específica contra el BVDV. Uno es la inducción de anticuerpos neutralizantes que evitan que el virus blanco infecte a las células. El segundo es la inducción de inmunidad mediada por células (CM1), que dirige a las células infectadas por el virus a la destrucción, reduciendo asi los efectos de una infección viral. Los principales epitopes neutralizantes del BVDV son las glucoproteinas estructurales y como resultado de la selección inmune, estas proteínas también son las más variables. De esta forma, el diseño de una vacuna con base en las glucoproteinas requiere la inclusión de los tipos antigénicos más comunes. Las proteínas no estructurales del BVDV en general se conservan mejor, ya que tienen una función enzimática específica que limita la variación en las secuencias de la proteína que se pueden presentar.

Para un programa de control adecuado del BRDC, es necesario tener una vacuna eficaz y segura que se pueda distinguir del virus tipo silvestre. Las vacunas desarrolladas con anterioridad que utilizan BoHV-1 se construyeron con supresiones para glucoproteinas y/o constaron del mutante para supresión de la timidina quinasa. Han existido problemas con estas vacunas ya que el gen de la timidina quinasa está implicado en la replicación viral y una menor replicación puede conducir a menor protección debido a los menores niveles de glucoproteinas que están implicados en la generación de inmunidad humoral.

Existe una necesidad por desarrollar vacunas mejoradas y más eficaces que permitan el control del BRDC y los patógenos particulares asociados con el mismo.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN Se hace referencia a las secuencias de nucleótidos y aminoácidos por su número identificador de secuencia (SEC ID NO). Las SEC ID NO: corresponden numéricamente a los identificadores de secuencias <400> 1 (SEC ID NO: 1), <400> 2 (SEC ID NO: 2), etc. En la Tabla 1 se proporciona un resumen de los identificadotes de secuencias. Después de las reivindicaciones se proporciona un listado de secuencias.

El complejo de la enfermedad bovina respiratoria (BRDC) representa un riesgo significativo de enfermedad para animales bovinos en especial aquellos mantenidos en entornos confinados, tales como instalaciones para la producción de piensos y lácteos. La infección por agentes patógenos que están asociadas con el BRDC se puede dispersar rápidamente y puede dar por resultado en una morbilidad, mortalidad y pérdida de producción significativa. En la presente se muestra una portador mejorado de vacuna que comprende el genoma proveniente de una cepa con baja virulencia de BoHV-1 modificado para portar material genético que codifique para uno o más antigenos provenientes de patógenos bovinos.

Por consiguiente, en la presente es posible una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, la vacuna comprende un genoma del herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) proveniente de un genoma de BoHV-1 con baja virulencia que tiene material genético que codifica para al menos una antigeno que es heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

La vacuna tiene la capacidad de ser multivalente con respecto a la estimulación de una respuesta inmunitaria para BoHV-1, asi como el antigeno asociado con otro patógeno bovino, tal como BVDV, Mycoplasma, Pasteurella, Manhiemia y Haemophilus . Los ejemplos de los antigenos del BVDV incluyen las glucoproteinas E0 y E2.

En una modalidad, el material genético heterólogo se introduce utilizando un sistema de recombinación inducible tal como recombinación GET.

Otro aspecto mostrado en la presente es un método para vacunar un animal bovino contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método comprende administrar al animal bovino una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 de baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

En la presente es posible un método para producir una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método comprende: (i) incorporar un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia en un vector del cromosoma artificial bacteriano (BAC) para formar una estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1; (ii) insertar material genético que codifique para al menos un antigeno en la estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1 vía un sistema de recombinación inducible para generar un vector recombinante de BoHV-1-BAC (rBoHV-l-BAC); (iii) transformar y amplificar el vector rBoHV-1-BAC en un hospedero bacteriano; y (iv) purificar y aislar el vector rBoHV-l-BAC proveniente del hospedero bacteriano y formular el vector en una composición de vacuna.

También se proporciona un método para vacunar contra el complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRDC) en ganado bovino, el método comprende administrar al ganado vacuno una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de herpesvirus bovino-1 (BoHV-1) proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para el BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1, en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

La presente descripción hace posible el uso de un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente 1a expresión de los genes de BoHV-1 en la elaboración de un medicamento en la vacunación del ganado vacuno contra un patógeno bovino.

En la presente es posible un método para producir una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método comprende: (i) incorporar un genoma de BoHV-1 proveniente de una BoHV-1 con baja virulencia en un vector del cromosoma artificial bacteriano (BAC) para formar una estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1; (ii) insertar el material genético que codifica para al menos un antigeno en la estructura del BAC del pre vector de BoHV-1 via un sistema de recombinación inducible para generar un vector recombinante de BoHV-1-BAC (rBoHV-1-BAC); (iii) transformar y amplificar el vector de rBoHV-l-BAC en un hospedero bacteriano; y (iv) purificar y aislar el vector de rBoHV-l-BAC proveniente del hospedero bacteriano y formular el vector en una composición de vacuna.

Un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que cuando se expresa produce un antigeno para el cual sea capaz de ser generada una respuesta inmunitaria, el genoma de BoHV-1 comprende además un material genético que codifique para al menos otro antigeno heterólogo pasa BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1 y donde el antigeno heterólogo induce una respuesta inmunitaria.

Por lo tanto, en la presente se muestra un vector de vacuna que comprende un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

En la presente es posible un vector de vacuna polivalente que comprende: (1) una primera valencia que comprende un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia; y (2) una segunda valencia que comprende el material genético que codifica para al menos un antigeno que sea heterólogo para el BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1; en donde la primera y segunda valencias producen dos o más antigenos para los cuales se genera una respuesta inmunitaria en un hospedero bovino.

En la presente es posible además un vector de vacuna de BoHV-1 que comprende un genoma de BoHV-1 derivado de la cepa de V155 de BoHV-1 que tenga material genético heterólogo que codifique para al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino insertado en un sitio en el genoma de BoHV-1 seleccionado de los nucleótidos 16,600 hasta 16,700; 22,400 hasta 22,500; 40,700 hasta 40,800; 58,000 hasta 59,000; 67,000 hasta 68,000; 74,000 hasta 76,000; 84.000 hasta 85,000; 90,000 hasta 91,000; y 96,000 hasta 97.000 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otra BoHV-1. Para ejemplos, remitirse a la Tabla 2.

También se muestran en la presente descripción las composiciones farmacéuticas, el tratamiento y protocolos de vacunación ya que son métodos comerciales para el manejo de animales bovinos confinados o en manada.

En la Tabla 2 se proporciona un resumen de los sitios de inserción en el genoma de BoHV-1 entre genes convergentes. Los coordinados de secuencia se refieren a la secuencia de referencia de BoHV-1 depositada con el No. de acceso GenBank AJ004801.

Tabla 1 Resumen de los identificadores de secuencia Tabla 2 Lista de los sitios de inserción en el genoma de herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) entre genes convergentes los coordinados de secuencias se refieren a la secuencia de referencia de BoHV-1 con el acceso GenBank AJ004801 o su equivalente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A, IB y 1C, son representaciones gráficas que muestran una comparación del rendimiento del virus de diversas lineas celulares derivadas de mamífero infectadas con ya sea el herpesvirus-1 bovino original o el herpesvirus bovino recombinante que porta la glucoproteína E2 proveniente del virus de diarrea viral bovina a las 24 horas después de la infección. (Figura 1A) Células de origen de primate; (figura IB) células de origen bovino; (figura 1C) células de origen de conejo y rumiante pequeño. El rendimiento de virus se determinó mediante amplificación de PCR en tiempo real realizada por triplicado.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN A todo lo largo de esta especificación, al menos que el contexto requiera lo contrario, la palabra "comprenden" o variaciones tales como "comprende" o "que comprende", se deberá entender que implican la inclusión de un elemento o número entero establecido o un paso de método o grupo de elementos o enteros o pasos de métodos pero no la exclusión de ningún elemento o entero o paso de método o grupo de elementos o enteros o pasos de método.

En el sentido en la presente especificación, las formas singulares, "uno", "una" y "el" incluyen aspectos en plural a menos que el contexto dicte claramente lo contrario. De esta forma, por ejemplo, la referencia a "un virus" incluye un virus único, asi como dos o más virus; la referencia a "un antigeno" incluye un antigeno único, asi como dos o más antigenos; la referencia a "la descripción" incluye los aspectos individuales o múltiples mostrados en la presente .

La presente descripción muestra un vector de vacuna recombinante en la forma de BoHV-1 proveniente de una cepa con baja virulencia del virus. En una modalidad, la cepa con i baja virulencia se denomina como BoHV-1 V155 (Snowden (1964) Veterinary Journal Australian 40:211-288). El vector de vacuna recombinante se utiliza como un vehículo para expresar proteínas heterólogas para BoHV-1 proveniente de patógenos bovinos para los cuales se busca una respuesta inmunitaria. La porción genómica del vector de BoHV-1 mismo también puede expresar las proteínas que induzcan una respuesta inmunitaria anti-BoHV-1. La respuesta inmunitaria en animales bovinos se considera, en una modalidad, como una respuesta inmunitaria protectora ya que la respuesta inmunitaria se dirige a la proteína o se produce por un patógeno y esto facilita una reducción de la infección, la colonización y/o los síntomas de la enfermedad y/o la transmisión de patógenos y/o las consecuencias de una infección tales como morbilidad o mortalidad. La respuesta inmunitaria puede ser humoral y/o mediada por células.

En una modalidad, el vector de BoHV-1 se manipula genéticamente para insertar genes provenientes de un patógeno bovino entre genes convergentes en el genoma de BoHV-1. La inserción, en una modalidad, no disminuye sustancialmente la expresión de los dos genes de flanqueo de BoHV-1 ni ningún otro gen en el genoma de BoHV-1. Con la infección de las células de un animal bovino con el vector de vacunas recombinante, los genes patogénicos se expresan para formar antígenos proteínicos y una respuesta inmunitaria producida contra uno o más antígenos patogénicos. Como se indicó anteriormente, el vector de BoHV-1 mismo proporciona un blanco para la estimulación inmunológica contra BoHV-1. Por lo tanto, la presente descripción muestra la facilidad de un procedimiento de vacuna dual con base en la estimulación de una respuesta inmunitaria contra BoHV-1 y una respuesta inmunitaria contra una proteina heteróloga manipulada por ingeniería genética para que se exprese por el vector de vacuna de BoHV-1.

Por consiguiente, en la presente es posible una vacuna contra al menos un antígeno proveniente de un patógeno bovino, la vacuna comprende un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antígeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1, en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

La vacuna permite la expresión del antígeno heterólogo para facilitar la estimulación de una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Además, el vector de BoHV-1 mismo puede facilitar una respuesta inmunitaria para una proteína de BoHV-1. El uso de un BoHV-1 con baja virulencia en lugar de una cepa inactivada o atenuada mejora su capacidad para infectar, replicar y producir una infección no patógena y una respuesta inmunitaria efectiva contra BoHV-1 y cualesquiera antigenos heterólogos.

En la presente se muestra una vacuna multivalente contra dos o más antigenos provenientes de un patógeno bovino, la vacuna comprende un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que cuando se expresa produce un antigeno para el cual se genera una respuesta inmunitaria, el genoma de BoHV-1 comprende además material genético que codifique para al menos otro antigeno heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1 y en donde el antigeno heterólogo induce una respuesta inmunitaria.

Los términos "multivalente" y "polivalente" se pueden utilizar indistintamente para describir este aspecto que es posible en la presente.

La vacuna mostrada en la presente también se considera un vector de vacuna.

Por consiguiente, otro aspecto posible en la presente es un vector de vacuna que comprende un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

Otro aspecto que es posible en la presente es un vector de vacuna polivalente que comprende: (1) una primera valencia que comprende un genoma de BoHV-1 preveniente de un BoHV-1 de baja virulencia; y (2) una segunda valencia que comprende material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para el BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1; en donde la primera y segunda valencias producen dos o más antigenos para los cuales se genera una respuesta inmunitaria en un hospedador bovino.

El término "sustancialmente" con relación a la sub regulación, significa que ya sea no hay sub-regulación de la expresión o hay sólo una reducción menor en la expresión. Por "menor" significa que desde una perspectiva funcional, ningún cambio en la expresión no afectará adversamente el funcionamiento del virus.

Como se indicó anteriormente, la "respuesta inmunitaria" puede ser una respuesta inmunitaria humoral y/o una respuesta inmunitaria mediada por células.

La vacuna que es posible en la presente permite el tratamiento o profilaxis del complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRDC) que es particularmente prevalente en la enfermedad en ganado vacuno en grupo o en manada. Por "ganado vacuno en grupo" se incluye ganado vacuno confinado para fines de alimentación, cria o producción de leche. El BRDC es una enfermedad multi-factorial . Típicamente, un animal bovino se infecta con uno o más de BoHV-1, BVDV, parainfluenza bovina 3 y/o virus sincitial respiratorio bovino. Con frecuencia esto conduce a una infección viral o microbiana secundaria y da por resultado en condiciones tales como neumonía.

Los patógenos microbianos contemplados en la presente incluyen Mycoplasma sp, Salmonella sp, Pasteurella sp, Manhiemia sp and Haemophilus sp such as Mycoplasma bovis, Pasteurella mul tocida, Manhiemia hae olytica and Haemophilus somnus. El material genético que codifica para los antígenos provenientes de cualquiera o todas estas u otras bacterias se puede utilizar en el vector de vacuna de BoHV-1. Los antígenos del BVDV incluyen las glucoproteínas E0 y E2.

Por consiguiente, la presente descripción hace posible un método para vacunar a un animal bovino contra al menos un antígeno proveniente un patógeno bovino, el método comprende administrar al animal bovino, una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

La presente descripción muestra un método para vacunación contra el BRDC en ganado vacuno, el método comprende administrar al ganado vacuno, una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1.

La manipulación genética del vector de vacuna de BoHV-1 para insertar el material de ácido nucleico heterólogo en general se realiza mediante un sistema de recombinación inducible. En una modalidad, el sistema de recombinación inducible es una recombinación GET que utiliza una expresión transitoria de recE y recT para permitir la recombinación homologa en Escherichia coli (véase, Orford et al . Nucleic Acid s Research 28 (18) ·. 84; Mahoncy et al . (2002) Journal of Virology 76 (13) : 6660-6668; Narayanan et al . (1999) Gene therapy 6: 442-447; Schumacher et al . (2000) Journal of Virology 74:11088-11098).

En una modalidad, el material genético heterólogo se inserta entre las señales de poliadenilación de dos genes convergentes en un sitio seleccionado de 16600 hasta 16700 y 22400 hasta 22500 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otro BoHV-1. En una modalidad, el material genético heterólogo se inserta en un sitio seleccionado de entre los nucleótidos 16600 hasta 16700 y 22400 hasta 22493 con base en los coordinados de secuencia de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o su i-equivalente. La referencia a "16600 hasta 16700" incluye 16600, 16601, 16602, 16603, 16604, 16605, 16606, 16607, 1660^, 16609, 16610, 16611, 16612, 16613, 16614, 16615, 16616, 16617, 16618, 16619, 16620, 16621, 16622, 16623, 16624, 16625, 16626, 16627, 16628, 16629, 16630, 16631, 16632, 16633, 16634, 16635, 16636, 16637, 16638, 16639, 16640, 16641, 16642, 16643, 16644, 16645, 16646, 16647, 16648, 16649, 16650, 16651, 16652, 16653, 16654, 16655, 16656, 16657, 16658, 16659, 16660, 16661, 16662, 16663, 16664, 16665, 16667, 16668, 16669, 16670, 16671, 16672, 16673, 16674, 16675, 16676, 16677, 16678, 16679, 16680, 16681, 16682, 16683, 16684, 16685, 16686, 16687, 16688, 16689, 16690, 16691, 16692, 16693, 16694, 16695, 16696, 16697, 16698, 16699 y 16700. La referencia a "22400 hasta 22500" incluye 22400, 22401, 22402, 22403, 22404, 22405, 22406, 22407, 22408, 22409, 22410, 22411, 22412, 22413, 22414, 22415, 22416, 22417, 22418, 22419, 22420, 22421, 22422, 22423, 22424, 22425, 22426, 22427, 22428, 22429, 22430, 22431, 22432, 22433, 22434, 22435, 22436, 22437, 22438, 22439, 22440, 22441, 22442, 22443, 22444, 22445, 22446, 22447, 22448, 22449, 22450, 22451, 22452, 22453, 22454, 22455, 22456, 22457, 22458, 22459, 22460, 22461, 22462, 22463, 22464, 22465, 22466, 22467, 22468, 22469, 22470, 22471, 22472, 22473, 22474, 22475, 22476, 22477, 22478, 22479, 22480, 22481, 22482, 22483, 22484, 22485, 22486, 22487, 22488, 22489, 22490, 22491, 22492, 22493, 22494, 22495, 22496, 22497, 22498, 22499 y 22500.

Otros sitios se incluyen dentro de la variación de 40 700 hasta 40,800; que abarca los sitios 40,700, 40,701 40,702, 40,703, 40,704, 40,705, 40,706, 40,707, 40,708, 40,709, 40,710, 40,711, 40,712, 40,713, 40,714, 40,715, 40,716, 40,717, 40,718, 40,719, 40,720, 40,721, 40,722, 40,723, 40,724, 40,725, 40,726, 40,727, 40,728, 40,729, 40,730, 40,731, 40,732, 40,733, 40,734, 40,735, 40,736, 40,737, 40,738, 40,739, 40,740, 40,741, 40,742, 40,743, 40,744, 40,745, 40,746, 40,747, 40,748, 40,749, 40,750, 40,751, 40,752, 40,753, 40,754, 40,755, 40,756, 40,757 40,758, 40,759, 40,760, 40,761, 40,762, 40,763, 40,764, 40,765, 40,766, 40,767, 40,768, 40,769, 40,770, 40,771, 40,772, 40,773, 40,774, 40,775, 40,776, 40,777, 40,778, 40,779, 40,780, 40,781, 40,782, 40,783, 40,784, 40,785, 40,786, 40,787, 40,788, 40,789, 40,790, 40,791, 40,792, 40,793, 40,794, 40,795, 40,796, 40,797, 40,798, 40,799, 40,800; 58,000 hasta 59,( ) incluyen 58,001 , 58,002, 58,003, 58,004, 58,005, 58,006, 58,007, 58,008, 58,009, 58,010, 58,011, 58,012, 58,013, 58,014, 58,015, 58,016, 58,017, 58,018, 58,019, 58,020, 58,021, 58,022, 58,023, 58,024, 58,025, 58,026, 58,027, 58,028, 58,029, 58,030, 58,031, 58,032, 58,033, 58·,034, 58,035, 58,036, 58,037, 58,038, 58,039, 58,040, 58,041, 58,042, 58,043, 58,044, 58,045, 58,046, 58,047, 58,048, 58,049, 58,050, 58,051, 58,052, 58,053, 58,054, 58,055, 58,056, 58,057, 58,058, 58,059, 58,060, 58,061, 58,062, 58,063, 58,064, 58,065, 58,066, 58,067, 58,068, 58,069, 58,070, 58,071, 58,072, 58,073, 58,074, 58,075, 58,076, 58,077, 58,078, 58,079, 58,080, 58,081, 58,082, 58,083, 58,084, 58,085, 58,086, 58,087, 58,088, 58,089, 58,090, 58,091, 58,092, 58,093, 58,094, 58,095, 58,096, 58,097, 58,098, 58,099, 58,100, 58,101, 58,102, 58,103, 58,104, 58,105, 58,106, 58,107, 58,110, 58,111, 58,112, 58,113, 58,114, 58,115, 58,116, 58,117, 58,118, 58,119, 58,120, 58,121, 58,122, 58,123, 58,124, 58,125, 58, 126, 58,127, 58, 128; 58,129, 58,130, 58,131, 58 132 , 58,133, 58,134, 58,135, 58,136, 58,137, 58,138, 58,139, 58,140, 58,141, 58, 142, 58,143, 58,144, 58, 145, 58,146, 58,147, 58,148, 58,149, 58,150, 58,151, 58,152, 58,153, 58,154, 58 , 155 , 58,156, 58,157, 58,158, 58,159, 58, 160, 58,161, 58,162, 58,163, 58,164, 58,165, 58,166, 58, 167, 58,168, 58,169, 58,170, 58,171, 58,172, 58,173, 58,174, 58,175, 58,176, 58,177, 58,178, 58,179, 58,180, 58, 181, 58,182, 58,183, 58, 184, 58,185, 58,186, 58, 187, 58,188, 58,189, 58,190, 58,191, 58,192, 58,193, 58,194, 58,195, 58,196, 58,197, 58,198, 58,199, 58,200, 58,201, 58,202, 58,203, 58,204, 58,205, 58,206, 58,207, 58,208, 58,209, 58,210, 58,211, 58,212, 58,213, 58,214, 58,215, 58,216, 58,217, 58,218, 58,219, 58,220, 58,221, 58,222, 58,223, 58,224, 58,225, 58,226, 58,227, 58,228, 58,229, 58,230, 58,231, 58,232, 58,233, 58,234, 58,235, 58,236, 58,237, 58,238, 58,239, 58,240, 58,241, 58,242, 58,243, 58,244, 58,245, 58,246, 58,247, 58,248, 58,249, 58,250, 58,251, 58,252, 58,253, 58,254, 58,255, 58,256, 58,257, 58,258, 58,259, 58,260, 58,261, 58,262, 58,263, 58,264, 58,265, 58,266, 58,267, 58,268, 58,269, 58,270, 58,271, 58,272, 58,273, 58,274, 58,275, 58,276, 58,277, 58,278, 58,279, 58,280, 58,281, 58,282, 58,283, 58,284, 58,285, 58,286, 58,287, 58,288, 58,289, 58,290, 58,291, 58,292, 58,293, 58,294, 58,295, 58,296, 58,297, 58,298, 58,299, 58,300, 58, 301, 58,302, 58,303, 58,304, 58,305, 58,306, 58,307, 58,308, 58,309, 58,310, 58,311, 58,312, 58,313, 58,314, 58,315, 58,316, 58,317, 58,318, 58,319, 58,320, 58,321, 58,322, 58,323, 58,324, 58,325, 58,326, 58, 327, 58,328, 58,329, 58,330, 58,331, 58,332, 58,333, 58,334, 58,335, 58,336, 58,337, 58,338, 58,339, 58,340, 58,341, 58,342, 58,343, 58,344, 58,345, 58,346, 58,347, 58,348, 58,349, 58,350, 58,351, 58,352, 58,353, 58 , 354 , 58,355, 58,356, 58,357, 58,358, 58,359, 58,360, 58,361, 58,362, 58,363, 58,364, 58,365, 58,366, 58,367, 58,368, 58,369, 58,370, 58,371, 58,372, 58,373, 58,374, 58,375, 58,376, 58,377, 58,378, 58,379, 58,380, 58,381, 58,382, 58, 383, 58,384, 58,385, 58,386, 58,387, 58,388, 58,389, 58,390, 58,391, 58,392, 58,393, 58,394, 58,395, 58,396, 58,397, 58,398, 58,399, 58,400, 58,401, 58,402, 58,403, 58,404, 58,405, 58,406, 58,407, ,408, 58 409, 58 410, 58, 58,411, 58,412, 58,413, 58,414, 58,415, 58,416, 58,417, 58,418, 58,419, 58,420, 58,421, 58,422, 58,423, 58,424, 58,425, 58,426, 58,427, 58,428, 58,429, 58,430, 58,431, 58,432, 58,433, 58,434, 58,435, 58,436, 58,437, 58,438, 58,439, 58,440, 58,441, 58,442, 58,443, 58,444, 58,445, 58,446, 58,447, 58,448, 58,449, 58,450, 58,451, 58,452, 58,453, 58,454, 58,455, 58,456, 58,457, 58,458, 58,459, 58,460 58,461, 58,462, 58,463, 58,464, 58,465, 58,466, 58,467, 58,468, 58,469, 58,470, 58,471, 58,472, 58,473, 58,474, 58,475, 58,476, 58,477, 58,478, 58,479, 58,480, 58,481, 58,482, 58,483, 58,484, 58,485, 58,486, 58,487, 58,488, 58,489, 58,490, 58,491, 58,492, 58,493, 58,494, 58,495, 58,496, 58,497, 58,498, 58,499, 58,500, 58,501, 58,502, 58,503, 58,504, 58,505, 58,506, 58,507, 58,508, 58,509, 58,510, 58,511, 58,512, 58,513, 58,514, 58,515, 58,516, 58,517, 58,518, 58,519, 58,520, 58,521, 58,522, 58, 523, 58,524, 58,525, 58,526, 58,527, 58,528, 58,529, 58,530, 58,531, 58,532, 58,533, 58,534, 58,535, 58,536, 58,537, 58,538, 58,539, 58,540, 58,541, 58,542, 58,543, 58,544, 58,545, 58,546, 58,547, 58,548, 58,549, 58,550, 58,551, 58 , 552 , 58,553, 58,554, 58,555, 58,556, 58,557, 58,558, 58,559, 58,560, 58,561, 58,562, 58,563, 58,564, 58,565, 58,566, 58,567, 58,568, 58,569, 58,570, 58,571, 58,572, 58,573, 58,574, 58,575, 58,576, 58,577, 58,578, 58,579, 58,580, 58,581, 58,582, 58,583, 58,584, 58,585, 58,586, 58,587, 58,588, 58,589, 58,590, 58,591, 58,592, 58,593, 58,594, 58,595, 58,596, 58,597, 58,598, 58,599, 58, 600, 58,601, 58, 602, 58,603, 58, 604, 58,605, 58, 606, 58, 607, 58,608, 58, 609, 58,610, 58, 611, 58,612, 58,613, 58, 614, 58, 615, 58 , 616, 58,617, 58, 618, 58,619, 58, 620, 58, 621, 58, 622, 58, 623, 58,624, 58,625, 58,626, 58, 627, 58, 628, 58, 629, 58,630, 58, 631, 58, 632, 58,633, 58, 634, 58, 635, 58,636, 58, 637, 58,638, 58, 639, 58,640, 58, 641, 58,642, 58, 643, 58, 644, 58, 645, 58, 646, 58,647, 58, 648, 58,649, 58,650, 58, 651, 58, 652, 58, 653, 58,654, 58, 655, 58,656, 58, 657, 58, 658, 58, 659, 58,660, 58,661, 58, 662, 58,663, 58,664, 58, 665, 58,666, 58, 667, 58,668, 58,669, 58,670, 58, 671, 58, 672, 58,673, 58, 674, 58,675, 58, 676, 58,677, 58,678, 58, 679, 58,680, 58, 681, 58,682, 58, 683, 58,684, 58, 685, 58, 686, 58,687, 58, 688, 58,689, 58, 690, 58,691, 58,692, 58,693, 58,694, 58,695, 58,696, 58,697, 58,698, 58, 699, 58,700, 58,701, 58,702, 58,703, 58,704, 58,705, 58,706, 58,707, 58,708, 58,709, 58,710, 58,711, 58,712, 58,713, 58,714, 58,715, 58,716, 58,717, 58,718, 58,719, 58,720, 58,721, 58,722, 58,723, 58,724, 58,725, 58,726, 58,727, 58,728, 58,729, 58,730, 58,731, 58,732, 58,733, 58,734, 58,735, 58,736, 58,737, 58,738, 58,739, 58,740, 58,741, 58,742, 58,743, 58,744, 58,745, 58,746, 58,747, 58,748, 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58,996, 58,997, 58,998, 58,999 ó 59,000; 67,000 hasta 68,000 incluyen 67,001 , 67,002, 67,003, 67,004, 67,005, 67,006, 67,007, 67,008, 67,009, 67,010, 67,011, 67,012, 67,013, 67,014, 67,015, 67,016, 67,017, 67,018, 67,019, 67,020, 67,021, 67,022, 67,023, 67,024, 67,025, 67,026, 67,027, 67,028, 67,029, 67,030, 67,031, 67,032, 67,033, 67,034, 67,035, 67,036, 67,037, 67,038, 67,039, 67,040, 67,041, 67,042, 67,043, 67,044, 67,045, 67,046, 67,047, 67,048, 67,049, 67,050, 67,051, 67,052, 67,053, 67,054, 67,055, 67,056, 67,057, 67,067, 67,059, 67,060, 67,061, 67,062, 67,063, 67,064, 67,065, 67,066, 67,067, 67,068, 67,069, 67,070, 67,071, 67,072, 67,073, 67,074, 67,075, 67,076, 67,077, 67,078, 67,079, 67,080, 67,081, 67,082, 67,083, 67,084, 67,085, 67,086, 67,087, 67,088, 67,089, 67,090, 67,091, 67,092, 67,093, 67,094, 67,095, 67,096, 67,097, 67,098, 67,099, 67,100, 67,101, 67,102, 67,103, 67,104, 67,105, 67,106, 67,107, 67,110, 67,111, 67,112, 67,113, 67,114, 67,115, 67,116, 67,117, 67,118 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614, 67,615, 67,616, 67,617, 67,618, 67,619, 67,620, 67,621, 67, 622, 67, 623, 67,624, 67,625, 67,626, 67, 627, 67, 628, 67,629, 67, 630, 67,631, 67,632, 67, 633, 67, 634, 67, 635, 67,636, 67, 637, 67,638, 67, 639, 67,640, 67,641, 67, 642, 67,643, 67, 644, 67 , 645, 67, 646, 67, 647, 67,648, 67, 649, 67,650, 67, 651, 67,652, 67, 653, 67,654, 67,655, 67,656, 67, 657, 67, 667, 67,659, 67,660, 67,661, 67, 662, 67, 663, 67, 664, 67, 665, 67,666, 67,667, 67, 668, 67,669, 67,670, 67,671, 67, 672, 67,673, 67, 674, 67,675, 67,676, 67, 677, 67, 678, 67, 679, 67,680, 67, 681, 67,682, 67, 683, 67, 684, 67,685, 67, 686, 67,687, 67, 688, 67,689, 67,690, 67,691, 67,692, 67, 693, 67,694, 67, 695, 67,696, 67,697, 67, 698, 67, 699, 67,700, 67,701, 67,702, 67,703, 67,704, 67,705, 67,706, 67,707, 67,708, 67,709, 67,710, 67,711, 67,712, 67,713, 67,714, 67,715, 67,716, 67,717, 67,718, 67,719, 67,720, 67,721, 67,722, 67,723, 67,724, 67,725, 67,726, 67,727, 67,728, 67,729, 67,730, 67,731, 67,732, 67,733, 67,734, 67,735, 67,736, 67,737, 67,738, 67,739, 67,740, 67,741, 67,742, 67,743, 67,744, 67,745, 67,746, 67,747, 67,748, 67,749, 67,750, 67,751, 67,752, 67,753, 67,754, 67,755, 67,756, 67,757, 67,767, 67,759, 67,760, 67,761, 67,762, 67,763, 67,764, 67,765, 67,766, 67,767, 67,768, 67,769, 67,770, 67,771, 67,772, 67,773, 67,774, 67,775, 67,776, 67,777, 67,778, 67,779, 67,780, 67,781, 67,782, 67,783, 67,784, 67,785, 67,786, 67,787, 67,788, 67,789, 67,790, 67,791, 67,792, 67,793, 67,794, 67,795, 67,796, 67 ,797 , 67,798, 67,799, 67,800, 67,801, 67,802, 67,803, 67,804, 67,805, 67,806, 67,807, 67,808, 67,809, 67,810, 67,811, 67,812, 67,813, 67,814, 67,815, 67,816, 67,817, 67, 818, 67,819, 67,820, 67,821, 67,822, 67,823, 67,824, 67,825, 67,826, 67,827, 67,828, 67,829, 67,830, 67,831, 67,832, 67,833, 67,834, 67,835, 67,836, 67,837, 67,838, 67,839, 67,840, 67,841, 67,842, 67,843, 67,844, 67,845, 67,846, 67,847, 67,848, 67,849, 67,850, 67,851, 67,852, 67,853, 67,854, 67,855, 67,856, 67,857, 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96,496, 96, 468, 96, 69, 96, 470, 96, 471, 96, 472, 96, 473, 96,496, 96, 496, 96, 476, 96, 477, 96, 478, 96, 479, 96,480, 96,481, 96, 482, 96, 483, 96, 496, 96,485, 96,486, 96,487, 96,488, 96, 489, 96.496, 96, 491, 96, 492, 96,493, 96,494, 96,495, 96, 496, 96.497, 96,498, 96, 499, 96, 500, 96, 501, 96,502, 96, 503, 96, 504, 96, 505, 96, 506, 96, 507, 96, 508, 96,509, 96, 510, 96, 511, 96, 512, 96, 513, 96, 514, 96, 515, 96,516, 96,517, 96, 518, 96, 519, 96, 520, 96, 521, 96, 522, 96, 523, 96, 524, 96, 525, 96, 526, 96, 527, 96,528, 96, 529, 96,530, 96, 531, 96, 532, 96, 533, 96, 534, 96, 535, 96, 536, 96, 537, 96, 538, 96, 539, 96, 540, 96, 541, 96,542, 96, 543, 96,544, 96, 545, 96, 546, 96, 547, 96, 548, 96, 549, 96, 550, 96, 551, 96, 552, 96, 553, 96, 554, 96, 555, 96,556, 96, 557, 96,596, 96,559, 96, 560, 96, 561, 96, 562, 96, 563, 96, 564, 96, 565 , 96, 566, 96, 596, 96, 568, 96, 569, 96,570, 96, 571, 96,572, 96, 573, 96, 596, 96, 596, 96, 576, 96, 577, 96, 578, 96, 579, 96, 580, 96, 581, 96, 582, 96, 583, 96, 596, 96, 585, 96,586, 96,587, 96,588, 96, 589, 96.596, 96, 591, 96, 592, 96,593, 96, 594, 96, 595, 96, 596, 96.597, 96, 598, 96, 599, 96L600, 96, 601, 96, 602, 96, 603, 96, 604, 96, 605, 96, 606, 96, 607, 96, 608, 96, 609, 96, 610, 96, 611, 96, 612, 96, 613, 96, 614, 96, 615, 96, 616, 96, 617, 96, 618, 96, 619, 96, 620, 96, 621, 96, 622, 96, 623, 96, 624, 96, 625, 96, 626, 96, 627, 96, 628, 96, 629, 96, 630, 96, 631, 96, 632, 96, 633, 96, 634, 96,635, 96, 636, 96, 637, 96, 638, 96, 639, 96, 640, 96, 641, 96, 642, 96, 643, 96, 644, 96, 645, 96, 646, 96, 647, 96, 648, 96, 649, 96, 650, 96, 651, 96, 652, 96, 653, 96,654, 96, 655, 96, 656, 96, 657, 96, 696, 96, 659, 96, 660, 96, 661, 96, 662, 96, 663, 96, 664, 96, 665, 96, 666, 96, 696, 96, 668, 9¿, 669, 96, 670, 96, 671, 96, 672, 96, 673, 96, 696, 96, 696, 96, 676, 96, 677, 96, 678, 96, 679, 96, 680, 96, 681, 96, 682, 9(j, 683, 96, 696, 96, 685, 96, 686, 96, 687, 96, 688, 96, 689, 9(j, 696, 96, 691, 96, 692, 96, 693, 96,694, 96, 695, 96, 696, 9 j, 697, 96,698, 96, 699, 96, 700, 96, 701, 96, 702, 96, 703, 96, 704, 96,705, 96, 706, 96,707, 96, 708, 96, 709, 96,710, 96,711, 96,712, 96, 713, 96, 714, 96, 715, 96, 716, 96, 717, 96, 718, 96,719, 96, 720, 96, 721, 96, 722, 96, 723, 96,724, 9¿, 725, 96,726, 96, 727, 96, 728, 96,729, 96, 730, 96,731, 96!, 732, 96,733, 96,734, 96,735, 96, 736, 96, 737, 96, 738, 96|, 739, 96,740, 96, 741, 96,742, 967743, 96, 744, 96, 745, 96, 746, 96,747, 96, 748, 96, 749, 96, 750, 96, 751, 96, 752, 96¡, 753, 96,754, 96, 755, 96, 756, 96, 757, 96,796, 96, 759, 96|, 760, 96,761, 96, 762, 96,763, 96,764, 96,765, 96,766, 961, 796, 96,768, 96,769, 96,770, 96, 771, 96, 772, 96, 773, 96, 796, 96,796, 96, 776, 96, 777, 96,778, 96,779, 96,780, 96,781, 96,782, 96,783, 96, 796, 96, 785, 96, 786, 96,787, 96 ? 788, 96,789, 96.796, 96, 791, 96, 792, 96,793, 96,794, 96 795, 96,796, 96.797, 96, 798, 96,799, 96,800, 96,801, 961802, 96,803, 96, 804, 96, 805, 96, 806, 96, 807, 96, 808, 96Í 809, 96,810, 96, 811, 96, 812, 96, 813, 96, 814, 96, 815, 96| 816, 96, 817, 96, 818, 96, 819, 96, 820, 96, 821, 96, 822, 96\ 823, 96,824, 96, 825, 96,826, 96, 827, 96, 828, 96, 829, 96,| 830, 96,831, 96, 832, 96,833, 96, 834, 96,835, 96,836, 96, 837, 96, 838, 96, 839, 96, 840 96, 841, 96, 842, 96, 843, 96, 844, 96,845, 96, 846, 96, 847, 96, 848, 96, 849, 96, 850, 96, 851, 96, 852, 96, 853, 96, 854, 96, 855, 96, 856, 96, 857, 96, 896, 96,859, 96,860, 96, 861, 96,862, 96,863, 96,864, 96, 865, 96,866, 96,896, 96, 868, 96, 869, 96, 870, 96, 871, 96, 872, 96,873, 96,896, 96, 896, 96, 876, 96, 877, 96, 878, 96, 879, 96,880, 96, 881, 96, 882, 96, 883, 96,896, 96, 885, 96, 886, 96, 887, 96, 888, 96, 889, 96.896, 96, 891, 96,892, 96, 893, 96,894, 96,895, 96, 896, 96.897, 96,898, 96,899, 96, 900, 96, 901, 96, 902, 96, 903, 96, 904, 96, 905, 96, 906, 96, 907, 96, 908, 96, 909, 96, 910, 96, 911, 96, 912, 96, 913, 96, 914, 96, 915, 96, 916, 96, 917, 96, 918, 96, 919, 96, 920, 96, 921, 96, 922, 96, 923, 96, 924, 96, 925, 96, 926, 96, 927, 96, 928, 96, 929, 96, 930, 96, 931, 96, 932, 96, 933, 96, 934, 96, 935, 96,936, 96, 937, 96, 938, 96, 939, 96, 940, 96, 94, 96, 942, 96, 943, 96, 944, 96, 945, 96, 946, 96, 947, 96, 948, 96, 949, 96, 950, 96, 951, 96, 952, 96, 953, 96, 954, 96, 955, 96, 956, 96, 957, 96, 996, 96, 959, 96, 960, 96, 961, 96, 962, 96, 963, 96, 964, 96, 965, 96, 966, 96, 996, 96, 968, 96, 969, 96, 970, 96, 971, 96, 972, 96,973, 96, 996, 96, 996, 96, 976, 96, 977, 96, 978, 96, 979, 96, 980, 96, 981, 96, 982, 96, 983, 96, 996, 96, 985, 96, 986, 96, 987, 96, 988, 96, 989, 96, 996, 96, 991, 96,992, 96, 993, 96, 994 96, 995, 96, 996, ,997, 9 ,998, 96, 999 ó 97, 000.

En la Tabla 2 se proporcionan los ejemplos de sitios de inserción. Como se indicó anteriormente, los sitios se basan en el No. de acceso GenBank AJ004801 o su equivalente.

La presente descripción muestra el vector de vacuna de BoHV-1 que comprende un genoma de BoHV-1 derivado de la cepa V155 de BoHV-1 que tenqa material genético heterólogo que codifique para al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino insertado en un sitio en el genoma de BoHV-1 seleccionado de los nucleótidos 16600 hasta 16700, 22400 hasta 22500; 40,700 hasta 40,800; 58,000 hasta 59,000; 67,000 hasta 68,000; 74,000 hasta 76,000; 84,000 hasta 85,000; 90,000 hasta 91,000; y 96,000 hasta 97,000 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otro BoHV-1. Los ejemplos incluyen los sitios listados en la Tabla 2.

Existe una variación de otros sitios en los cuales se puede insertar el material genético heterólogo. Todos estos sitios son posibles en la presente.

Otro aspecto mostrado en la presente es un método para producir una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método comprende: (i) incorporar un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia en un vector del cromosoma artificial bacteriano (BAC) para formar una estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1; (ii) insertar un material genético que codifique para al menos un antígeno en la estructura del BAC del pre vector de BoHV-1 via un sistema de recombinación inducible para generar un vector recombinante de BoHV-1-BAC (rBoHV-1-BAC); (iii) transformar y amplificar el vector de rBoHV-l-BAC en un hospedero bacteriano; y (iv) purificar y aislar el vector de rBoHV-l-BAC proveniente del hospedero bacteriano y formular el vector en una composición de vacuna.

La presente descripción muestra un protocolo de vacunación en animales bovinos, tales como ganado vacuno para pienso, ganado vacuno para producción de leche y otro ganado vacuno alojado cercanamente. La preparación de vacuna se puede administrar mediante una variedad de protocolos locales y sistémicos tales como inyección intra-nasal, oral, intramuscular, sub-lingual, intravenosa, subcutánea o intra-arterial, aerosol para la piel u otra ruta conveniente que incluye la administración intra-vaginal e intra-rectal. Una ruta intranasal es particularmente eficaz. La formulación puede ser una preparación farmacéutica estándar. En una modalidad, la formulación está liofilizada y se reconstituye antes de utilizarse.

Por lo tanto, una vacuna que es útil en la presente en general se prepara o es adecuada para reconstitución como una solución liquida inyectable o que se puede administrar por la via nasal o una suspensión o una preparación liofilizada. La vacuna también puede estar emulsionada. Antes de utilizarse, un diluyente, portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. La formulación de vacuna también puede contener sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes amortiguadores de pH y/o adyuvantes .

Por consiguiente, en la presente se muestra una formulación de vacuna que comprende un geno a de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antígeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes de BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1; la formulación estará en forma liofilizada o comprenderá además uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La formulación puede comprender además un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que cuando se expresa produzca un antigeno para el cual sea capaz de generar una respuesta inmunitaria, el genoma de BoHV-1 comprende además material genético que codifique para al menos un antígeno heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1 y en donde el antigeno heterólogo induce una respuesta inmunitaria; la formulación estará en forma liofilizada o comprenderá además uno o más portadores, diluyentes y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención hace posible además un análisis de diagnóstico para distinguir serológicamente entre animales bovinos vacunados y no vacunados. En general, se conduce un análisis estándar de anticuerpos para detectar los anticuerpos esperados que hayan surgido después de la vacunación con la vacuna recombinante de BoHV-1. En una modalidad, uno de los antigenos heterólogos expresados por el vector de BoHV-1 es una proteina marcadora tal como una proteina fluorescente verde. Este es un marcador conveniente para la efectividad de la vacunación y, como una etiqueta registrada.

En la presente es posible un método comercial para manejar animales bovinos en una ubicación confinada, el método comercial comprende vacunar a un animal bovino contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método comprende administrar al animal bovino, una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1 para reducir la incidencia de la dispersión del BRDC con lo cual mantener una viabilidad económica de los animales bovinos.

El método comercial incorpora un protocolo de manejo para mantener animales bovinos y puede incluir una tarifa por servicios para los profesionales para la prueba para el BRDC, vacunar a los animales bovinos y luego mantener un análisis serológico de la manada de animales.

El costo para realizar el método comercial se puede cumplir por el propietario de la manada de animales bovinos o se trasfiere a los consumidores.

La prueba serológica también permite que se conduzcan estudios epidemiológicos.

Por lo tanto, en la presente se proporciona una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, la vacuna comprende un genoma del herpesvirus bovino-1 (BoHV-1) proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1. En una modalidad, el material genético que codifica para al menos un antigeno se inserta en el genoma de BoHV-1 vía un sistema de recombinación inducible, tal como via la recombinación GET.

El material genético que codifica para al menos un antigeno se inserta convenientemente entre las señales de poliadenilación de dos genes convergentes en un sitio seleccionado, de entre 16,600 hasta 16,700, 22,400 hasta 22,500; 40,7*00 hasta 40,800; 58,000 hasta 59,000; 67,000 hasta 68,000; 74,000 hasta 76,000; 84,000 hasta 85,000; 90,000 hasta 91,000; y 9,6000 hasta 9,7000 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otra BoHV-1. En una modalidad, al menos un antigeno se inserta entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado de un sitio listado en la Tabla 2. En otra modalidad, al menos un antigeno se inserta entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16,602 hasta 16,603 y 22,421 hasta 22,470.

Convenientemente, la vacuna proporciona un BoHV-1 que produce un antigeno de BoHV-1 y/o un antigeno seleccionado de la lista que consiste en un antigeno proveniente del virus de diarrea viral bovina (BVDV) y un antigeno proveniente de un microorganismo.

Los ejemplos de antigenos del BVDV son la glucoproteina E0 y la glucoproteina E2. Los ejemplos de microorganismos como una fuente de antigenos incluyen Mycoplasma bovis, una especie de Salmonella, Pateurella multocida, Manhiemia haemolytica y Haemophilus somnus.

En una modalidad, la cepa de BoHV-1 con baja virulencia es la cepa V155. La vacuna que es posible en la presente puede comprender además material genético adicional que codifique para otro antigeno insertado vía la digestión de endonucleasa de restricción. La vacuna también se puede formular en una composición farmacéutica tal como una composición farmacéutica adecuada para administración nasal.

En la presente se contempla un método para vacunar a un animal bovino contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino al administrar al animal bovino, una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de BoHV-1 (BoHV-1) proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes BoHV-1. El material genético que codifica para al menos un antigeno se puede insertar en el genoma de BoHV-1 via un sistema de recombinación inducible tal como mediante recombinación GET.

Como se indicó anteriormente, el material genético que codifica para al menos un antigeno se inserta entre las señales de poliadenilación de dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16600 hasta 16700, 22400 hasta 22500; 40,700 hasta 40,800; 58,000 hasta 59,000; 67,000 hasta 68,000; 74,000 hasta 76,000; 84,000 hasta 85,000; 90,000 hasta 91,000; y 96,000 hasta 97,000 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otro BoHV-1 que incluye entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16600 hasta 16612 y 22400 hasta 22493 incluyendo dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16602 hasta 16603 y 22421 hasta 22470 incluyendo entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado de los sitios listados en la Tabla 2.

De acuerdo con este método, el BoHV-1 produce un antigeno de BoHV-1 y/o al menos un antigeno se selecciona de la lista que consiste de un antigeno proveniente del virus de diarrea viral bovina (BVDV) y un antigeno proveniente de un microorganismo .

Los ejemplos del antigeno del BVDV es la glucoproteína EO o la glucoproteína E2. Los ejemplos de un microorganismo es Mycoplasma bovis, una especie de Salmonella, Pateurella multocida , Manhiemia haemolytica o Haemophilus somnus.

Como se indicó anteriormente la cepa de BoHV-1 con baja virulencia incluye V155. El material genético adicional que codifica para otro antigeno también se puede insertar via la digestión con endonucleasas de restricción.

Un método para producir una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, es posible en la presente al: (i) incorporar un genoma de BoHV-1 proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia en un vector del cromosoma artificial bacteriano (BAC) para formar una estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1; (ii) insertar material genético que codifique para al menos un antigeno en la estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1 via un sistema de recombinación inducible para generar un vector recombinante de BoHV-1-BAC (rBoHV-l-BAC); (iü ) transformar y amplificar el vector de rBoHV-l-BAC en un hospedero bacteriano; y (iv) purificar y aislar el vector de rBoHV-l-BAC proveniente del hospedero bacteriano y formular el vector en una composición de vacuna.

El sistema de recombinación inducible y los sitios de inserción son como se describió anteriormente según sean los antigenos y sus fuentes.

También es posible en la presente una célula cultivada transfectada con el vector de rBoHV-1-BAC.

Un método mostrado es la vacunación contra el complejo de la enfermedad respiratoria bovina (BRDC) en ganado vacuno, el método comprende administrar al ganado vacuno una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de un genoma de herpesvirus bovino 1 (BoHV-1) proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes BoHV-1.

Además se contempla en la presente el uso de un genoma de herpesvirus bovino-1 (BoHV-1) proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes convergentes BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes BoHV-1 en la elaboración de un medicamento en la vacunación de ganado bovino contra un patógeno bovino.

Los aspectos que son posibles en la presente se describen mediante los siguientes ejemplos no limitantes.

EJEMPLO 1 Cepa de BoHV-1 La cepa con baja virulencia de BoHV-1 utilizada fue la cepa V155, descrito originalmente por Snowden (1964) supra . Los números de la posición de los nucleótidos se basan en el No. de acceso GenBank AJ004801.

EJEMPLO 2 Construcción de un recombinante de herpes-virus - 1 bovino (BoHV-D La cepa BoHV-1 de V155 se propagó en células CRIB-1 (número ATCC CRL-18831), un derivado resistente a pestivirus de células BMD. Las células CRIB-1 se mantuvieron en medio esencial mínimo de Hank (H-MEM) que contuvo antibióticos/antimióticos, aminoácidos no esenciales, gluta AX, Hepes 25 mM y 5% en v/v de suero de ternero donador a 37°C. Todos los reactivos utilizados para la célula y la propagación de virus se obtuvieron de Invitrogen Australia a menos que se establezca otra cosa.

Las células CRIB-1 se colocaron en placas de seis pocilios (Corning) a 5 x 105 células/pocillo 24 h antes de la transfección y se incubaron a 37°C en una atmósfera de 5% en v/v de CO2. Para cada transfección, se diluyeron 1-2 mg de ADN hasta 100 pg utilizando OptiMEM y se mezclaron con 8 ml de Lipofectamina diluida a 100 ml utilizando OptiMEM. La mezcla resultante se incubó, la mezcla a temperatura ambiente durante 45 in para la formación de complejos de lipido/ADN. El volumen de reacción se aumentó a 1 mi utilizando OptiMEM y se agregó a las monocapas celulares que se habían lavado dos veces con OptiMEM. Las monocapas transíectadas luego incubaron las monocapas transfectadas a 37°C con 5% en v/v de C02 durante 16-18 h antes de la adición de 1 mi OptiMEM que contuvo 10% en v/v de suero de ternero donador. A las 24 h se retiró el líquido de transfección y se reemplazó con medios de mantenimiento. Las monocapas para el desarrollo de CPE durante hasta 7 días después de la transfección.

Para purificar el ADN genómico de BoHV-1, las células MDBK de la variante CRIB-1 se infectaron con la cepa BoHV-1 de V155 a un MOI de 5 y se dejó que la infección prosiguiera hasta término. El sobrenadante de cultivo celular luego se clarificó mediante centrifugación a 5000 g durante 10 min. Los viriones maduros de BoHV-1 se sedimentaron mediante centrifugación a 120000 g durante 2 h. El ADN genómico de BoHV-1 se recuperó del virus sedimentado utilizando el kit para extracción de ADN genómico Qiagen esencialmente como se describe por el fabricante. Los sedimentos virales se volvieron a suspender en tampón para extracción de ADN genómico en una proporción de 1:65 del volumen de sobrenadante de partida. Después de la elución a partir de la columna, el ADN de BoHV-1 se almacenó en alícuotas a -20°C. Se utilizó HindIII para digerir 1-2 mg del ADN para comparación con el perfil de digestión conocido de BoHV-1.

Para facilitar la inserción de los transgénes en el gen TK de BoHV-1 utilizando recombinación homologa GET, se construyó el vector de supresión/inserción del pTK. Este vector contiene dos segmentos del gen de timidina quinasa de BoHV-1, TKizquierda y TKderecha, para utilizarse como ramificaciones de recombinación.

Se llevó a cabo una PCR para el genoma de BoHV-1 utilizando el tampón de polimerasa Taq (Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1.5 M, KC1 50 mM, pH 8.5); 1.25 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP; 12.5 mM de cada cebador; 1U de la ADN polimerasa Taq; 10-20 ng del ADN genómico 5% en v/v de DMSO; 10% en v/v de glicerol. Estos componentes tuvieron un volumen de reacción final de 20 ml.

Las condiciones de cielización para PCR utilizadas fueron; desnaturalización a 94°C durante 4 min; 35 ciclos de 94 °C durante 20 segundos, 60°C durante 20 segundos y 72°C durante 120 seg; seguidos por 72°C durante 10 minutos y posteriormente se mantuvieron a 4°C. La cielización se realizó en un termociclador Hybaid Sprint. Después de la ciclización, el producto PCR se resolvió en 1% en p/v de gel de agarosa, el producto se retiró y se recuperó el ADN utilizando un kit para extracción de gel Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

TKizquierda y TKderecha se amplificaron a partir del ADN genómico de BoHV-1 purificado mediante PCR. Después de la amplificación los productos se purificaron utilizando una columna de purificación PCR Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El producto PCR TKizquierda se digirió con KpnI y SalI, el gel se purificó y se ligó en pBluescript-SK+ (Stratagene), que también se había digerido con Kpnl/Sall . La presencia del producto TKizquierda se confirmó mediante secuenciación. El producto PCR TKderecha se clonó en el plásmido que contuvo el producto TKizquierda después de la digestión con EcoRI y Spel utilizando procedimientos de clonación estándar. El plásmido resultante se denominó pTKdel (véase, Mahoncy et al . (2002) supra) . Los cebadores utilizados para la amplificación PCR de las regiones blanco TK se muestran en la Tabla 3. Los sitios NsiI se incorporaron en los cebadores TKizquierda5' y TKderecha3' para permitir el retiro del producto transgénico del vector pTKdel para experimentos de recombinación. Cuatro sitios de endonucleasa de restricción únicos están presentes entre las dos regiones de cruce TK para permitir la inserción de transgénes para transferencia al genoma de BoHV-1.

Para transferir el cromosoma artificial bacteriano (BAC) al genoma de BoHV-1, el vector BAC pBello-BAC II se digirió con HindIII y el gel se purificó. El vector BAC digerido se ligó en pTKdel que se había digerido con HindIII y se desfosforiló. Después de la transformación en la cepa de E. coli, se colocaron en placas los transformantes de células XLl-Blue sobre agar selectivo que contuvo 12.5 mi de cloranfenicol (CAP) y 100 mg/ml de ampicilina. La inserción del vector BAC se confirmó mediante el retiro con HindIII proveniente del ADN recuperado de las colonias resultantes. El fragmento de supresión TK (TK-BAC), que contuvo el vector BAC flanqueado por la TKizquierda y TKderecha, se retiró del pTKdel-BAC mediante digestión con Nsil y gel purificado.

Para estimular la recombinación homologa entre el fragmento BAC-TK y el ADN genómico de BoHV-1, el ADN de BoHV-1 purificado se digirió con Nsil y se desfosforiló con fosfatasa alcalina bacteriana (Pharmacia). El fragmento BAC-TK y el ADN genómico de BoHV-1 digerido con Nsil se co-transfectaron en células CRIB-1 como se describió anteriormente. Después de 18-24 h, la mezcla de transfección se retiró y se reemplazó con H-MEM completo que contuvo N,N'-hexametilen-bis-acetamida (ICN) 2 mM para estimular la transcripción de genes virales. Los sobrenadantes virales resultantes se sub-cultivaron una vez en células CRIB-1. La inserción del vector BAC en el genoma de BoHV-1 se confirmó mediante un análisis PCR especifico para el gen de resistencia a cloranfenicol utilizando el par cebador ChloramF y ChloramR.

Los moldes para PCR se prepararon mediante- la incubación de 10 ml del sobrenadante viral con 10 ml de tampón de lisis (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 que contiene 0.45% en v/v Tritón X-100 y 0.45% en v/v de Tween 20) con 2 m? de 10 g/ml de proteinasa K seguida por la incubación a 60°C durante 2 h. La proteinasa K se inactivó a 95°C durante 15 min. Las reacciones PCR se realizaron utilizando 1 hasta 2 m? de esta preparación como el molde. Después de la detección PCR del gen de resistencia a CAP dentro del genoma de BoHV-1, se recuperó el ADN genómico en volumen a partir de las partículas del virus como se describió anteriormente. Para facilitar la transformación y crecimiento en un hospedero bacteriano el ADN genómico de BoHV-1 purificado se hizo circular nuevamente utilizando procedimientos de ligación estándar. Las alícuotas de las mezclas de ligación se sometieron a electroporación en células DH10B de E. coli (1.5 kV, 100 W, 25 pF, Electroporator II; Invitrogen, San Diego). Después de la electroporación, las células DH10B se recuperaron en 960 ml de SOB y se incubaron a 37°C durante 5 hasta 6 h con agitación vigorosa suave. Las alícuotas de la mezcla de electroporación se cultivaron sobre placas LB que contuvieron 12.5 mg/ml de CAP. Se dejó que las colonias se desarrollaran durante 24 hasta 48 h a 37°C.

Las colonias resistentes a CAP se inocularon en 5 mi de caldo LB que contuvo 12.5 mg/ml de CAP y se dejaron crecer a 37°C durante 16 h. El ADN de BAC se recuperó utilizando el método de lisis alcalina estándar. Los perfiles de digestión HindIII de estos clones de BAC se compararon con el perfil HindlII del ADN genómico de BoHV-1. Los clones de BAC con perfiles HindlII similares con el ADN genómico se transíectaron en células CRIB-1 como se describió anteriormente. Las transíecciones se monitorearon diariamente para el desarrollo de CPE considerarse típico del BoHV-1.

La recombinación de BoHV-1 BAC en DH10B se presentó mediante co-electroporación del plásmido, el pGETrec (disponible de Murdoch Childrens Research Institute, Melbourne, Australia), se sometió a electroporación en células DH10B que albergan pBACBHV37 (clon infeccioso de BoHV-1) . Las células de DH10B que contuvieron ambos plásmidos se seleccionaron en agar que contuvo 12.5 mg/ml de CAP y 100 g/ml de ampicilina. Las células electro-competentes de las células de DH10B doble resistentes se prepararon con 0.2% en p/v de inducción de arabinosa durante la fase log del crecimiento celular para permitir la recombinación homologa como se describió anteriormente. El transgén amplificado mediante PCR de interés luego se sometió a electroporación en estas células. Después de la recuperación de la cubeta de electroporación en caldo de SOC, las células se dejaron recuperar a 37 °C durante al menos 6 hr con agitación vigorosa. Todas las células se recuperaron en placas selectivas de cloranfenicol junto con el antibiótico seleccionado para seleccionar el transgén.

Para demostrar que la recombinación GET se podría utilizar para modificar el genoma de BoHV-1, se crearon dos virus de rBoHV-1 diferentes. Un rBoHV-1 se creó un donde: (i) se suprimió el gen que codifica para gE. Esto se llevó a cabo al utilizar un casete de resistencia mínima a kanamicina (KanR), que se amplificó mediante PCR a partir del transposón EZ::TN<KAN-1> (Epicentre Technologies). Los cebadores de PCR: gE-KanF y gE-KanR, utilizados incluyeron las regiones de homología de 50 pb, con los extremos 5' (número de base 121671-121720 de AJ004801) y 3' (número de base 123371 hasta 123420 de AJ004801) del gen gE. El producto resultante, gE-KanR, tuvo 1300 pb de longitud y se recuperó después de la separación en gel de agarosa utilizando un kit para extracción de gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen). (ii) un gen heterólogo que codifica para la proteina fluorescente verde (GFP) se insertó en el genoma V155 en el sitio REMR de Nsil . Esto se llevó a cabo al insertar el casete de expresión GFP en el genoma ubicado entre UL46 (tegumentos de la proteina del virión proteinico) y UL44 (glucoproteina C utilizando recombinación facilitada por pGETrec), el producto resultante se recuperó después de la separación de gel de agarosa utilizando un kit para extracción en gel de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Qiagen).

Otros sitios se seleccionaron de aquellos listados en la Tabla 2.

Aproximadamente 200 ng del producto de PCR purificado en gel se sometieron a electroporación en el DH10B electrocompetentes (pBACBHV37, pGETrec) como se describió anteriormente. Las colonias recombinantes se identificaron mediante la siembra en placas sobre placas LB que contuvieron 12.5 mg/ml de CAP y 50 pg/ml de kanamicina. La PCR y el análisis de inmuno-transferencia Southern confirmaron el reemplazo del gen gE con el casete KanR.

El ADN genómico viral para inmuno-transferencia Southern se purificó como se describió más adelante. Las monocapas celulares se infectaron con la cepa V155 de BoHV-1 en un MOI de 5 y la infección se dejó proseguir hasta que aproximadamente 40% de las células mostraron un tipo de morfología "de redondeo". Después del retiro del medio de crecimiento, la monocapa se lavó suavemente dos veces con PBS a 0°C. El tampón de lisis celular a 0°C (fosfato de sodio 10 mM, pH 7.3 que contuvo 1% en v/v de Nonidet P-40) se agregó a cada matraz (4 i por 175 cm2) y los matraces se agitaron de tal forma que el tampón de lisis entrara en contacto con la monocapa completa. El tampón de lisis se retiró y se colocó en hielo, se agregaron 4 mi adicionales a cada matraz con agitación suave, se retiró y se agregó a la solución de lisis inicial. Los U sados se aclararon a 4300 g durante 10 minutos a 4°C. El sobrenadante se recolectó y se sometió a centrifugación a 12700g durante 100 min a 5°C. El sedimento viral se volvió a suspender en 500 ml de tampón G2 (Qiagen). Se agregó la proteinasa K (25 ml de 10 mg/ml) al sedimento viral resuspendido seguido por incubación a 50°C durante 1 h. el ADN viral genómico se recuperó utilizando una punta genómica 20/G (Qiagen) como sigue. La punta genómica 20/G se equilibró con 1 mi de tampón QBT. El material tratado con la proteinasa K se diluyó con un volumen igual de tampón de QBT y se cargó en la punta genómica (660 m? por punta). Las puntas se lavaron dos veces con 7.5 mi de tampón QC. El ADN viral se eluyó de la punta con 2 x 1.5 mi de tampón QF a 50°C. El ADN se precipitó, se lavó una vez con 75% en v/v de etanol y se volvió a suspender en 50 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 8.5.

Las muestras de ADN digeridas con la enzimas de restricción se sometieron a electroporación en 1% p/v de gel en 0.5X de tampón TBE durante 13.5 h utilizando un aparato para electroforesis de inversión de campo (FIGE) (BioRad) a 5°C. La rampa de tiempo de cambio fue la forma lineal de 0.1 hasta 2 s con un voltaje directo de 180 V y un voltaje inverso de 120 V. Los fragmentos de ADN se transfirieron a una membrana no cargada Hybond-N (Amersham) utilizando acción capilar y el ADN se fijó a la membrana utilizando luz UV. Las soluciones de ensayo se marcaron con DIG-II-dUTP (Roche Molecular Biosystems). Las soluciones de ensayo se sintetizaron mediante PCR utilizando una mezcla de reacción que contuvo: tampón de polimerasa Taq (Tris-HCl 10 mM, MgCl2 1.5 mM, KC150 mM, pH 8.5), 1.25 mM cada uno de dATP, dCTP, dGTP y dTTP, DIG-II-dUTP 1.25 mM, polimerasa Taq 1U (Roche Molecular Biosystems), y 5 ng de ADN molde en un volumen final de 20 ml. Las condiciones de reacción para PCR fueron 94°C durante 3 min, 94°C durante 30 seg, 55°C durante 30 seg, 68°C durante 1 min durante 35 ciclos, 68°C durante 6 min.

Después las soluciones de ensayo mediante PCR de purificación en gel se hibridaron a membranas durante 12 hasta 16 h (DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Roche Molecular Biosystems) a 55°C. Las hibridaciones se llevaron a cabo en botellas giratorias en un horno para hibridación (Hybaid). Las membranas se lavaron en cubetas de cultivo en una plataforma de agitación vigorosa a RT.

Las cinéticas de replicación de los diversos rBoHV-1 se determinaron utilizando téenicas virológicas estándar. En resumen, se permitió que 1 TCID50 del virus infectara 1 x 105 células CRIB-1 colocadas en placas, en placas de 24 pocilios durante 90 minutos a 37°C con atmósfera de CO2 al 5% v/v. Luego se inactivó cualquier virus extracelular mediante la adición de solución de citrato de sodio (citrato de sodio 40 mM, KC1 10 mM, NaCl 135 mM, pH 3.0), las capas celulares luego se lavaron dos veces con PBS y se agregó 1 mi de medio de mantenimiento y se incubaron a 37°C en una atmósfera de CO2 al 5%. Se recolectaron los sobrenadantes virales y los sedimentos celulares a 2, 4, 6, 12, 24, 48 y 72 h PI y se congelaron a -70°C hasta que se requirieron. El TCID50 de cada sobrenadante a partir de cada punto de tiempo luego se determinó por triplicado. Siguiendo un ciclo de congelación/descongelación el TCID50 del virus intracelular también se determinó para cada punto de tiempo por triplicado.

Tabla 3 Cebador Secuencia del cebador Secuencia Producto ID NO. (numero de pb) y plásmido TKizquierdo 5’ S'- j TKizquierdo (301 pb) TKizquierdo 3’ 51 -TTTGC GTCGAC CCACTCCAGCGCBTCCCftG- 2 pTKdel Salí · TKderecho 5’ S ' -AG GAATTC GCCGCGCTCGCAGACCCCA-3 ' 3 TKderecho ECORI (337 b), TKderecho 3’ 5’ - GGACTAGTCATGCATCXCTAGCGCGAACTG ACG - 4 3' pTKdei solución de Spel Nsil ensayo TK ChioramF 5'-TCACTGGATATACCACCGTTGA-3' 5 Gen CAPR, ChloramR ¾ TCACCGTAACACGCCACATCTT-3' g (402 pb) Solución de ensayo CAPR gE- anF 51 - GGGGiU¾C0GCGCACC5CO^5ACJOGTrCCaUU AaG<?ZATTr0(3CA* 7 TQCAAC-ATTTAAAT ccacgttgtgtcteaaeatc tsggatg - * SwaI gE-KanR gE-KanR 5» · TCOCOCTÍ3ÍTTACCACGaTGTAATCT3a GCGaC:CGa9GTCCa (1237 pb) CG lOGOG-ATTTAtó -cggttíiatgaflagctttgttgtagaitg- 3 * SwaI * BHV1.3 5'-GGG CAT TTG GC ATG CAA C-3' 9 Solución de ensayo gE BHV1.6 5 \ -COT CTC GTA .TAT GCG GAT G-3 > 10 (845 pb) KanRfwd s* -GGT ATT AGA AGA ATA TCC TGA TTC-3' 11 Solución de ensayo KanR Kan*rcv &' -CTC ATC GAG CAT CSA ATG AAA CT-3' 12 (483 pb) EJEMPLO 3 Evaluación de la capacidad de transmisión del rBoHV-1 El objetivo de este ensayo fue determinar si el virus recombinante (modificado genéticamente, GM) fue capaz de ser transmitido del ganado vacuno vacunados a otro ganado vacuno ubicados a distancias variables de las vacunaciones, otros rumiantes (ovejas y cabras) también se ubicaron a posiciones variables con relación a la cabra vacunada para determinar si el virus GM se pudo transmitir a estas especies de rumiantes.

La totalidad del ganado bovino, ovejas y cabras fueron negativos para los anticuerpos específicos de BoHV-1 y virus de diarrea viral bovina (BVDV) antes del comienzo del ensayo en animales. Los animales de cada especie se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: Grupo Sentírtela. A: Ganado vacuno (4), ovejas (4) y cabras (4) [obsérvese que las ovejas y cabras se encerraron juntas] ubicadas a aproximadamente a 23 metros del establo; Grupo Sentinela B: Ganado vacuno (2x2 ) , ovejas (4) y cabras (4), ubicados en corrales en el extremo oeste del establo; Grupo Sentinela C: Ganado vacuno (2x2), ovejas (4) y cabras (4), ubicados en el extremo este del establo en corrales opuestos al ganado vacuno vacunado; y Grupo en contacto con la vacuna: ganado vacuno vacunado (4) y ganado vacuno de contacto (4), ubicados en el extremo este del establo.

Se tomaron muestras ambientales de diversas ubicaciones dentro y alrededor del establo para probar la presencia del virus GM que persiste fuera de su hospedero natural (ganado vacuno) en el mismo día en que se recolectaron las muestras en animales.

Antes de la vacunación (día 0) se recolectaron hisopos de sangre (20 i) y nasales de todos los animales. También se registró la temperatura rectal de todos los animales. Luego se vacunaron intranasalmente los animales de ganado vacuno (94) con 2 mi de la vacuna prototipo (BoHV-1 TK + E2). Los animales de ganado vacuno vacunados se pusieron en corrales con un animal bovino sin vacunar. Durante los 14 días después de la vacunación (día 1-14) se recolectaron hisopos nasales de todos los animales y se registraron las temperaturas rectales de todos los animales. El ensayo concluyó en el 28 después de la vacunación. En este momento, se recolectaron hisopos de sangre (20 mi) y nasales de todos los animales. Además, se registraron las temperaturas rectales de todos los animales. Después de la recolección de estas muestras, todos los animales se sacrificaron y se recolectaron hisopos de tejidos (corazón, pulmón, riñón, bazo, músculo, hígado, cerebro y ganglios trigéminos). Las animales muertos se desecharon vía incineración a alta temperatura .

EJEMPLO 4 Comparación de las preparaciones húmedas o liofilizadas de gmBoHV-1 El objetivo de este ensayo fue comparar la eficacia de gmBoHV-1 como una preparación húmeda y una preparación liofilizada para Rhinogard (marca registrada) proporcionado por Q-Vax Pty Ltd.

Todos los animales del ganado vacuno fueron negativos para los anticuerpos específicos de BoHV-1 y BVDV antes del comienzo del ensayo en animales. Los animales de ganado vacuno se asignaron aleatoriamente a los siguientes grupos: Grupo 1: Sin vacunar; Grupo 2: Vacunados intranasalmente con 1.2 mi de la vacuna (gmBoHV-1) en 1 fosa nasal; Grupo 3: Vacunados intranasalmente con 1.2 mi de la vacuna (FD-gmBoHV-1) en 1 fosa nasal; Grupo 4: Vacunados intranasalmente con 1-2 mi de la vacuna (Rhinogard) en 1 fosa nasal.

Se tomaron muestras ambientales de las diversas ocupaciones dentro y altededor del establo para probar la presencia del virus GM que persiste fuera de su hospedero natural (ganado vacuno) cada día en que se recolectaron las muestras en animales.

Antes de la vacunación (día 0) se recolectaron para todos los animales de ganado vacuno sangre (20 mi), hisopos nasales e hisopos de ta pón nasal. También se registraron las temperaturas rectales y el peso (peso combinado en pares) de todos los animales de ganado vacuno. Los grupos 2 y 4 luego se vacunaron intranasalmente con la formulación adecuada. El gmBoHV-1 liofilizado se reconstituyó inmediatamente antes de la instilación. Se planeó administrar la vacuna utilizando un aplicador comercial, sin embargo, debido a problemas para obtenerlo para el trabajo, las vacunas se suministraron utilizando una jeringa como se realizó en una investigación anterior .

Durante los 7 dias después de la vacunación (día 1-7) se recolectaron hisopos nasales de todos los animales y se registraron para todos los animales las señales clínicas.

Todos los animales de ganado vacuno se inocularon con la cepa Q3932 de BoHV-1 en el día 14 después de la vacunación, como se describirá más adelante. Antes de la inoculación, se registraron para todos los animales hisopos nasales y señales clínicas. Los animales de ganado vacuno luego se inocularon con una instilación intranasal de la cepa Q3932 de BoHV-1 107 TCID50. Después de la inoculación de BoHV-1, se recolectaron hisopos nasales de todos los animales de ganado bovino y se realizaron evaluaciones clínicas diariamente (día 15 a 18), utilizando el método de marcado descrito en la Tabla 4.

Tabla 4 Parámetro Marca Señal clínica Ración de alimento residual 0 0-25% 1 25-50% 2 50-75% 3 75-100% Tos 0 Ausente 1 tos debida a ejercicio 2 tos en el corral Comportamiento 0 normal 1 letárgico 2 inmóvil Secreción nasal (N) 0 sin secreción 1 secreción sero-mucosa leve 2 secreción sero-mucosa moderada 3 secreción mucosa con glóbulos o pequeñas hebras de exudado mocopurulento 4 exudado mocopurulento grueso 5 exudado mocopurulento grueso que cuelga de las fosas nasales Temperatura rectal (°C) AM PM Peso† (kg) Otras observaciones Se utilizaron señales clínicas y parámetros en la evaluación clínica de los animales antes y después de la inoculación . Se calculó la frecuencia respiratoria al multiplicar el número de respiraciones tomadas durante 15 segundos por cuatro . Se observó la frecuencia respiratoria en los corrales antes del muestreo diario. Se tomaron temperaturas rectales en la mañana y se repitieron más tarde en el dia si se observó una elevación significativa. También se registraron otras notas clínicas según se requirió, por ejemplo, respiración audible. A las señales clínicas se les asignó una marca numérica (S). El peso1 se registró como una medición combinada del ganado vacuno cuando los animales fueron más estables para los procedimientos de muestreo cuando se manipularon en la aglomeración como pares.

Todos los animales del ganado vacuno se inocularon con M. haemolytica en el día 18 después de la vacunación. Antes de la inoculación, se recolectaron hisopos nasales y se registraron las señales clínicas para todos los animales. Los animales del ganado vacuno luego se inocularon con la instilación intranasal de aproximadamente 5 X 109 ufe de M. haemolytica . Después de esta inoculación secundaria, se recolectaron hisopos nasales de todos los animales de ganado vacuno y se realizaron evaluaciones clínicas diariamente (día 19 a 26), utilizando el método de marcado.

El ensayo concluyó en el día 35 después de la vacunación. En este momento, se recolectaron de cada animal hisopos de sangre (20 mi), hisopos nasales e hisopos de ta pón nasal. Además, se registraron las temperaturas rectales de todos los animales. Después de la recolección de estas muestras, todos los animales se sacrificaron y se recolectaron muestras de tejido (corazón, pulmón, riñón, bazo, músculo, hígado, el cerebro y ganglios del trigémino). Los cadáveres se desecharon vía entierro profundo.

EJEMPLO 5 Efectos de una inmunidad preexistente sobre la eficacia de la vacuna El objetivo de este ensayo fue determinar si una inmunidad preexistente a ya sea BoHV-1 o BVDV podría afectar la eficacia de la vacuna contra gmBoHV-1. Por ejemplo, si uno de los animales fue positivo a anticuerpos para BoHV-1 el gmBoHV-1 todavía podría ser capaz de inducir inmunidad BVDV (véase la Tabla 5).

Tabla 5 Evaluación del efecto de una inmunidad pre-existente sobre la eficacia de la vacuna recombinante de BoHV-1 Tratamiento Inoculación Estado en la Número de vacunación1 animales Vacunados con FD-gmBoHV-1 BoHV-1neg 4 BoHV-1 /Mh2 BVDVpos No vacunados BoHV-1neg 4 BoHV-1 /Mh2 BVDVpos Vacunados con FD-gmBoHV-1 BoHV-1neg 4 BVDV/Mh3 BVDVpos No vacunados BoHV-1neg 4 BVDV/Mh3 BVDVpos 1 Indica el estado serológico en el momento de la vacunación, BoHV-1 pos y BVDV pos indican antes de la exposición a ya sea BoHV-1 o BVDV según se determine por la presencia del anticuerpos para los virus respectivos en el suero recolectado antes de la vacunación. 2 inoculación con una cepa de campo Q3932 de BoHV-1 suministrada vía aerosol a los 14 días después de la vacunación, seguida por una inoculación con M. haemolytica 5 días después como se describió en el Ejemplo 4. 3 Al igual que para 2, excepto que se utilizó la cepa de campo del BVDV en lugar de BoHV-1.

Se tomaron hisopos ambientales de diversas ubicaciones dentro y alrededor del establo para probar la presencia del virus GM que persiste fuera de su hospedero natural (ganado vacuno) en el mismo dia en que se recolectaron las muestras en animales.

Antes de la vacunación (dia 0) se recolectaron para todos los animales de ganado vacuno sangre (20 mi), hisopos nasales e hisopos de tampón nasal. También se registraron las temperaturas rectales y el peso (peso combinado en pares) de todos los animales de ganado vacuno. Los grupos luego se vacunaron intranasalmente con el gmBoHV-1 liofilizado se reconstituyó inmediatamente antes de la instilación. Se planeó administrar la vacuna utilizando un aplicador comercial, sin embargo, debido a problemas para obtenerlo para el trabajo, las vacunas se suministraron utilizando una jeringa como se realizó en una investigación anterior.

Durante los 7 dias después de la vacunación (día 1-7) se recolectaron hisopos nasales de todos los animales y se registraron para todos los animales las evaluaciones clinicas .

Todos los animales del ganado vacuno se inocularon con la cepa Q3932 de BoHV-1 en el día 14 después de la vacunación, como se describirá más adelante. Antes de la inoculación, se recolectaron hisopos nasales y se registraron para todos los animales las evaluaciones clinicas. Los animales de ganado vacuno luego se inocularon con instilación intranasal de la cepa Q3932 de BoHV-1107 TCID50. Después se recolectaron hisopos nasales inoculados con BoHV-1 provenientes de todos los animales de ganado vacuno y se realizaron evaluaciones clinicas diariamente (día 15-18), utilizando el método de marcado descrito en la Tabla 3.

Todos los animales de ganado vacuno se inocularon con M. haemolytica en el dia 18 después de la vacunación. Antes de la inoculación, se recolectaron hisopos nasales provenientes de todos los animales y se registraron para todos los animales las temperaturas rectales, las frecuencias de respiración y los pesos. Los animales de ganado vacuno luego se inocularon con una instilación intranasal de aproximadamente 5 x 109 ufe de M. haemolytica . Después de esto, se recolectaron hisopos nasales de inoculación secundaria provenientes de todos los animales de ganado vacuno y se realizaron evaluaciones clínicas diariamente (Día 19-26) utilizando el método de marcado descrito en la Tabla 3.

El ensayo concluyo en el día 35 después de la vacunación. En este momento se recolectaron de cada animal sangre (20 mi), hisopos nasales e hisopos de tampón nasal. Después de la recolección de estas muestras, todos los animales se sacrificaron y se recolectaron las muestras de tejido (corazón, pulmón, riñón, bazo, músculos, hígado, cerebro y ganglios trigéminos). Los cadáveres se desecharon vía enterramiento profundo.

EJEMPLO 6 Reversión a virulencia El objetivo de este ensayo fue determinar si el sub-cultivo en serie del gmBoHV-1 a través de múltiples grupos de animales de ganado vacuno podrían mostrar evidencia de virulencia cada vez mayor.

Se tomaron hisopos ambientales de diversas ubicaciones dentro y alrededor del establo para probar la presencia del virus GM que persiste fuera de su hospedero natural (ganado vacuno) en el mismo dia en que se recolectaron las muestras en animales.

En el día antes de la vacunación (día 0) se recolectaron de los animales de ganado vacuno sangre (20 mi), hisopos nasales e hisopos de tampón nasal. También se registraron las temperaturas rectales y el peso (peso combinado en pares) para todos los animales de ganado vacuno.

Los animales de ganado vacuno (2) luego se vacunaron intranasalmente con el gmBoHV-1 liofilizado que se reconstituyó inmediatamente antes de la instilación. Después de la vacunación (día 1-7) se recolectaron hisopos nasales de estos animales y se registraron evaluaciones clínicas para los animales diariamente.

Cada experimento de sub-cultivo concluyó en el día 14 después de la vacunación. En este momento, se recolectaron hisopos nasales de sangre (20 mi) e hisopos de tampones nasales de cada animal. Después de la recolección de estas muestras, todos los animales se sacrificaron y se recolectaron las muestras de tejido (corazón, pulmón, riñón, bazo, músculo, hígado, cerebro y ganglios trigéminos). Los cadáveres se desecharon vía enterramiento profundo.

Para completar el sub-cultivo in vivo del virus de gmBoHV-1, el virus se re-aisló de los hisopos nasales del ganado vacuno vacunado y se utilizó para infectar dos animales de ganado vacuno que no habían tenido con anterioridad BoHV-1. Este proceso se repitió cuatro veces como se describió anteriormente. Obsérvese que sólo el primer sub-cultivo se completó utilizando gmBoHV-1 liofilizado.

EJEMPLO 7 Dosis excedente El objetivo de este ensayo fue determinar si la administración de una dosis excesiva (ED) de gmBoHV-1 podría ser nociva para el animal vacunado.

Se tomaron hisopos ambientales de diversas ubicaciones dentro y alrededor del establo para probar la presencia del virus GM que persiste fuera de su hospedero natural (ganado vacuno) en el mismo día en que se recolectaron las muestras en animales.

Antes de la vacunación (día 0) se recolectaron de los animales de ganado vacuno sangre (20 i), hisopos nasales e hisopos de tampón nasal. También se registraron las temperaturas rectales y el peso (peso combinado en pares) para todos los animales de ganado vacuno. Los grupos con ED 1 a 3 luego se vacunaron intranasalmente con el gmBoHV-1 liofilizado que se reconstituyó inmediatamente antes de la instilación como se describirá más adelante. Se planeó administrar la vacuna utilizando un aplicador comercial, sin embargo, debido a problemas para obtenerlo para el trabajo, las vacunas se suministraron utilizando una jeringa como se realizó en una investigación anterior.

Grupo con ED 1: ganado vacuno vacunado (4 utilizando instilación intranasal con (1056 TCID50) 1 mi de vacuna por fosa nasal; Grupo con ED 2: ganado vacuno vacunado (4 utilizando instilación intranasal con (106-7 TCID50) 1 mi de vacuna por fosa nasal; Grupo con ED 3: ganado vacuno vacunado (4 utilizando instilación intranasal con (107B TCID50) 1 mi de vacuna en cada fosa nasal.

Durante los siete dias después de la vacunación (dia 1-7) se recolectaron hisopos nasales de todos los animales y se registraron para todos los animales las evaluaciones clínicas. El ensayo, concluyó en el día 14 después de la vacunación. En este momento se recolectaron de cada animal sangre (20 mi), hisopos nasales e hisopos de tampón nasal. Después de la recolección de estas muestras, todos los animales se sacrificaron y se recolectaron las muestras de tejido (corazón, pulmón, riñón, bazo, músculos, hígado, cerebro y ganglios trigéminos).

EJEMPLO 8 Estabilidad genetica del gmBoHV-1 Perfiles de la enzima de restricción sobre la vacuna prototipo de gmBoHV-1 retro sub-cultivado A partir de los hisopos nasales recolectados a todo lo largo de los ensayos en corral, se identificaron representativos del grupos de tratamiento para aislamiento viral vía cultivo de células de mamíferos (células CRIB-1). La presencia del cromosoma artificial bacteriano (BAC) dentro de la estructura del gmBoHV-1 permite el aislamiento y purificación del ADN plasmídico vía replicación bacteriana para aumentar el rendimiento del ADN.

Cultivo celular Se prepararon monocapas confluentes (70%) de células CRIB-1 en placas de seis pocilios para infección. El medio se retiró y las monocapas se lavaron con solución salina amortiguada con fosfato (PBS) estéril. A las monocapas lavadas se agregaron 1 mi de los hisopos nasales (en PBS y PSF cinco veces) y se incubaron a 27°C en 5% en v/v de CO2 durante 1 hora. Los inóculos se retiraron y las células se lavaron una vez con 1 mi de PBS luego se dejaron recuperar en 3 mi de medio recién preparado con PSF durante 5 h a 37°C y 5% de CO2.

A las 6 h después de la infección, las monocapas se lavaron con 1 mi de PBS, luego se agregó a las monocapas 1 mi de tampón de lisis de ADN total (con proteinasa K recién preparada) y se incubó durante 4 horas a 37°C. Esto liso las células in situ liberando ADN total de las células CrIB-1 y la replicación del candidato de vacuna viral de pBACBHVlE2s. La recolección del ADN total en esta primera etapa de la infección asegura que algún ADN de BAC será circular y adecuado para la transformación en las bacterias para replicación clonal.

Extracción y transformación del ADN total El ADN total se purificó al utilizar extracción con fenol/cloroformo y alcohol absoluto para precipitar. El sedimento de ADN deshidratado luego se resuspendió en 50 ml de agua altamente pura estéril (18 MW) a temperatura ambiente durante 2 h. Los volúmenes de cada extracción variaron dependiendo de la viscosidad de la suspensión inicial del ADN. La transformación se alcanzó a través de la electroporación de 10 ml del ADN total en 20 m? de células competentes DH10B ElectroMax (Invitrogen) y la selección sobre placas bacterianas que contuvieron 12.5 g/ml de cloranfenicol . Se seleccionaron tres colonias de cada placa en 50 mL de caldo LB que contuvo 12.5 g/ml de cloranfenicol y crecieron durante 18 horas a 37°C con agitación vigorosa suave. El ADN de BAC se extrajo de estos cultivos utilizando un protocolo modificado de lisis alcalina (con base en el kit para aislamiento de plásmidos bastante puros Roche para mini preparaciones). Las células bacterianas se sedimentaron para retirar el caldo y se resuspendieron en un tampón Tris. Estas células se U saron para liberar el ADN plasmidico que luego se purificó, retirando las proteínas y las sales restantes. El ADN sedimentado se deshidrató y se resuspendió en 60 ml de Tris-HCl 10 mM (pH 8.5) durante la noche a 4°C.

Perfiles de las enzimas de restricción Los múltiples clones provenientes de cada aislado se analizaron para mutaciones en bruto vía comparaciones del perfil de RE con la vacuna candidato (sin retro-cultivo vía los animales) y el vector viral original (el pBACHBVl 37).5 ml del ADN de BAC preparado mediante lisis alcalina se digirieron durante 4 h en un volumen total de 20 m? para las enzimas HindIII y Sal I, (NEB) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Se utilizó Electroforesis en Gel de Inversión de Campos (FIGE) para separar y visualizar los perfiles de banda para el ADN de BAC digerido. Los 20 m? del ADN de BAC digerido se cargaron en 0.7% geles de agarosa en tampón de TBE 0.5 veces (ambos con bromuro de etidio) y se ejecutaron bajo las condiciones para el programa 3 en el aparato de FIGE (BioRad) que dirige la variación de tamaño de peso molecular de 5-100 Kb con un tiempo de ejecución de 16 h.

EJEMPLO 9 Capacidad in vi tro del gmBoHV-1 pera infectar , replicar y expresar el transgen en líneas celulares de mamífero No existe diferencia que se pueda distinguir entre el BoHV-1 original y el BoHV-1 GM en los términos de la aparición del CPE. El CPE visualizado fue típico de BoHV-1 para ambos virus. Típicamente, la cantidad de virus (deducida a partir de los valores CT) en las líneas celulares infectadas tanto en el BoHV-1 como con el gmBoHV-1 a las 24 h después de la infección fueron similares (figuras 1A, IB y 1C). Para las líneas celulares de HaCaT y CRIB-1 esto fue estadísticamente significativo, es decir, no hubo una diferencia significativa en la cantidad de virus detectada entre el original y GM (P <0.05 prueba t no pareada bilateral) . Para las líneas celulares restantes la diferencia en los valores CT entre el original y las células infectadas GM no fue mayor a 2.5 y el virus no se detectó consistentemente a un nivel superior en cada línea celular.

Se estableció que la inserción del transgén (BVDV E2 sintético) en el BoHV-1 original no alteró la capacidad del virus para infectar y replicarse en las diversas lineas celulares de mamíferos probadas en comparación con el virus original. De manera interesante, todas las líneas celulares probadas fueron susceptibles a una infección por BoHV-1 (tanto modificado como sin modificar).

EJEMPLO 10 Transmisión del gmBoHV-1 a partir del ganado vacuno a otros rumiantes Se condujo un ensayo en corral para determinar si la variación hospedera de BoHV-1 o la capacidad de BoHV-1 para transmitir a otros rumiantes se había alterado como resultado de las modificaciones genéticas realizadas. El ensayo en corral incluyó una serie de ganado vacuno centinela, ovejas y cabras colocados a diversas distancias desde el ganado vacuno vacunados.

Al inicio del ensayo en corral, se observó que algunos de los animales de ganado vacuno (particularmente aquellos en el Grupo Sentinela A) tuvieron secreción nasal. También hubo indicaciones de que algunos de los animales de ganado bovino tuvieron diarrea. Mientras que no fue óptima proseguir con el ensayo, tampoco fue factible posponer el ensayo hasta que desaparecieran estas señales. Estas señales clínicas fueron evidentes en la mayoría de los grupos de ganado vacuno en algún momento a todo lo largo del ensayo -algunos animales parecieron tener señales a todo lo largo del ensayo.

La prueba de los extractos de hisopos nasales del día 0 de todos los animales con el análisis multiplex BRD (FLOT.219) no identificó ninguna muestras que contuviera, el herpesvirus bovino 1, el virus sincitial respiratorio bovino, el virus 3 de parainfluenza bovina o el pestivirus bovino. Los análisis PCR estándar para cuatro géneros de paramixovirus, adenovirus y enterovirus también fueron negativos. La ausencia de BoHVl y pestivirus fue más importante para este ensayo ya que la presencia de cualquier virus lo podría hacer extremadamente difícil para interpretar los resultados del ensayo y puede haber provocado la terminación del experimento.

Los intentos de aislamiento del virus del día 0 de los hisopos nasales fue interesante, ya que pareció haber algún efecto citopático (CPE) en las células, indicando que estuvo presente un virus. Sin embargo, los intentos para sub cultivar estos sobrenadantes no fueron exitosos. Los intentos adicionales para identificar si un agente infeccioso se asoció con estas señales se realizaron mediante la tinción de células infectadas con el hisopo nasal del animal con las señales clínicas más persistentes (animal 377 del Sentinela A) con anticuerpos marcados fluorescentemente parra los siguientes virus bovinos; adenovirus 3, coronavirus, pestivirus, virus de parainfluenza, virus sincitial respiratorio, parvovirus y reovirus. Luego se probó el extracto de muestra nasal en el día 0 para el animal 377 utilizando una PCR estándar y se obtuvo un amplicón consistente con el tamaño esperado. ¡Sin embargo, la secuenciación de este amplicón indicó que fue un producto de amplificación no específico. Mientras que la tinción de anticuerpos pareció ser específica, sigue siendo desconocida la identidad del patógeno. Los análisis de estas muestras con todas las pruebas moleculares disponibles en el laboratorio no identificaron el agente provocador responsable de las señales clínicas observadas. Con base en una aplicación anterior de esta prueba, se considera que es bastante poco probable que el agente responsable estuviera relacionado estrechamente con ya sea BoHV-1 o BVDV y de esta forma no deberá interferir con la interpretación de los datos serológicos para estos virus.

No se detectó gmBoHV-1 ni mediante RT-PCR o el aislamiento de virus proveniente de cualquiera de las ovejas o cabras de los tres grupos centinela. Similarmente no se detectó ningún virus GM, ya sea mediante RT-PCR o la idolización de virus proveniente de cualquiera del ganado vacuno mantenido en los grupos Centinelas A, B o C en ningún momento durante el ensayo.

El virus GM se detectó en todos!los animales del ganado vacuno vacunados. Típicamente, si, una muestra fue positiva para aislamiento de virus (cultivo) fue positivo mediante RT-PCR. La mejor recuperación del virus fue a partir de un animal donde los hisopos nasales fueron positivos mediante RT-PCR del día 1 hasta el día 6 y el cultivo positivo en los días 3 y 4 .

La transmisión por contacto del virus GM se detectó en dos de cuatro pares de animales.

Con base en las amplificaciones de RT-PCR del virus GM proveniente de hisopos nasales, el periodo pico para la replicación del virus en el ganado vacuno vacunado fue el día 3. El virus GM se detectó en tres de cuatro vacunaciones en el día 3.

Para determinar si el virus GM fue capaz de persistir fuera del hospedero (ganado vacuno) se recolectaron hisopos ambientales de diversas superficies en el sitio de ensayo a todo lo largo del experimento. Los extractos de estas muestras luego se probaron para la presencia del virus GM utilizando aislamiento en el cultivo celular y RT-PCR. No se detectó ningún virus GM en ninguno de los hisopos ambientales tomados a través de todo el experimento.

La prueba de los sueros recolectados en el día 0 y el dia 28 de todos los animales del ensayo demostró sólo que el ganado vacuno vacunado desarrolló anticuerpos detectables para BoHV-1 en las muestras del día 28.

Con base en los resultados de este ensayo, no hubo transmisión del virus GM a otras especies ¡(ovejas y cabras). Similarmente, la transmisión del virus GM a través de distancias (> 2m) no se presentó para ganado vacuno alojado en proximidad con el ganado vacuno vacunado. Se presentó transmisión del virus GM a ganado vacuno alojado con el ganado vacuno vacunado, aunque no a una alta frecuencia.

Los resultados del ensayo no apoyaron ninguna alteración de la variación del hospedero para el virus GM. Aunque se presentó alguna transmisión al hospedero natural (ganado vacuno), fue poco frecuente y puede ser independiente del nivel de replicación en el animal vacunado. Agregado a esto, no se detectó ningún virus GM fuera del hospedero natural del virus en hisopos ambientales recolectados a través de todo el experimento. Conjuntamente, estos datos demuestran que el riesgo de liberar el virus GM en el entorno es mínimo.

EJEMPLO 11 Reactivación del gmBoHV-1 Al término de cada ensayo, se recolectaron hisopos nasales de animales de ganado vacuno vacunados y sin vacunar. Se extrajeron ácidos nucleicos totales provenientes de estos hisopos y se probaron para presencia del gmBoHV-1 para utilizarse en análisis PCR en tiempo real que se dirigen a BoHV-1 y el transgén E2. Todas estas muestras fueron negativas en ambos análisis PCR. Con base en esto, es razonable concluir que no se presentó ninguna reactivación antes de terminar el ensayo.

EJEMPLO 12 Persistencia y estabilidad del GM BoHV-1 No se podrían determinar diferencias entre la estabilidad del GM BoHV-1 y el virus original en condiciones de campo. La licencia estipuló que el ensayo se condujo en un establo PCI donde no fue posible la exposición a luz solar directa. La exposición a luz solar en condiciones verdaderas de campo probablemente podría aumentar la inestabilidad del virus tanto GM como original debido a la luz UV.

EJEMPLO 13 Productos g ni eos residuales No se detectó ningún gmBoHV-1 en ninguno de los tejidos probados para los animales utilizando PCR en tiempo real. Mientras que se consideró poco probable que pudieran estar presentes cualesquiera productos génicos, se condujo un análisis de transferencia Western sobre los extractos de proteina total provenientes de los tejidos de este animal. Con base en estos resultados es poco probable que el virus GM o los productos génicos se expresen persistiendo en los tejidos de animales vacunados/infectados.

No fue inesperado que las muestras de tejido de los animales fueran negativas para la presencia tanto del virus GM como de los productos transgénicos. De los tejidos probados, la presencia de gmBoHV-1 sólo se esperó en los ganglios trigéminos (TG), ya que este es el sitio donde se espera que el virus original forme una infección latente. El fracaso en detectar el virus en los TG podría indicar que el gmBoHV-1 es incapaz de establecer una infección latente. Alternativamente, la detección del gmBoHV-1 en los TG puede ser difícil, ya que sólo unos cuantos cuerpos celulares en los ganglios probablemente porten el virus -de esta forma, la probabilidad de una detección exitosa depende de la cantidad de tejido procesado y la sensibilidad de la prueba.

EJEMPLO 14 Eficacia de una preparación de gmBoHV-1 liofilizado La eficacia de la vacuna prototipo de gmBoHV-1 como una preparación liofilizada (FD-gmBoHV-1) se comparó con gmBoHV-1 como una preparación en húmedo en ensayos de vacunación/inoculación. Un grupo de animales de ganado vacuno vacunados con Rhinogard se incluyeron en este ensayo para comparación. La Tabla 3 ilustra los resultados de la detección de virus para todos los animales de ganado vacuno vacunados y sin vacunar desde el día 0 (día de la vacunación) hasta el día 7. En general, las vacunas de FD-gmBoHV-1 y gmBoHV-1 se liberaron a los índices más consistentes en el día 3 con altos niveles de virus detectados mediante PCR y virus aislados consistentemente (Tabla 6). La mayoría de los animales de ganado vacuno vacunados con gmBoHV-1 fueron positivos mediante ambos análisis PCR durante tres o más días. La excepción a esto fue que un animal (designado 581) que fue positivo sólo en el dia 3 después de la vacunación.

No se observaron señales clínicas adversas en los grupos ya sea vacunados o sin vacunar. Se detectó el BoHV-1 en tres de los animales no vacunados en tres ocasiones durante esta fase del experimento. El virus detectado no fue el gmBoHV-1 ya que el análisis PCR especifico para el transgén E2 fue negativo para todos los animales. Además los resultados PCR para BoHV-1 fueron débilmente positivos indicando que los resultados fueron debido a una contaminación de la muestra. Es más probable que esto se haya presentado durante la manipulación posterior de las muestras en el laboratorio para aquellas muestras positivas en el día 0.

Existen algunas muestras positivas para el gmBoHV-1 en el dia 0. Estas son probablemente debido a la contaminación dentro del grupo de vacunación ya que no fue posible descontaminar logisticamente todas las superficies entre los animales que recibieron el mismo tratamiento. Similarmente, los animales se mantuvieron dentro del grupo en pares ya que esto los hace típicamente más estables, de esta forma, no se podría obstruir la transferencia del miembro inicial del par al otro antes de que se hayan extraído muestras del segundo animal.

Para reducir al mínimo la probabilidad de cualquier contaminación cruzada entre grupos, los mismos siempre se procesaron en el mismo orden; controles sin vacunar, vacunados con Rhinogard, seguido por gmBoHV-1. Además, el área de manipulación para animales que incluye el grupo, se descontaminó después del grupo vacunado con Rhinogard.

El resultado positivo de BoHV-1 para el animal no vacunado 549 en el día 5 podría haber sido debido a la transmisión del grupo vacunado con Rhinogard. El animal 549 se alojó en corrales adyacentes a los grupos vacunados con Rhinogard y como resultado tuvieron que pasar estos animales en la forma en el área del grupo. Mientras que los animales se monitorearon estrechamente durante este proceso para evitar un contacto directo, sigue siendo factible que el animal 549 pudiera haber inhalado el virus que contenía el material mientras pasó de los corrales de Rhinogard ya que los animales tendieron a investigar el entrono durante este proceso de movimiento. Ya que el virus no infectó a 549 y sólo se detectó en el apoyo del día 1 que fue una contaminación ambiental en lugar de la transmisión del virus del animal infectado/vacunado. En la Tabla 6 se muestran los datos.

Tabla 6 - . - ' . 34» BHV NA NA 343-334 £2» 5» im NA NA 35.2-398 z2s $»» BHV HA NA 357-398 §2* 391 BHV HA NA ¾ 5-392 *7s $46 6HV NA NA -3¿ S-3»¿ ££¾ sn 6HV NA NA 35.5- 3*4 º2s Stt BHV HA NA 3S.5 9J £2s 567 6MV NA NA H MI E3s Fase de vacunación: resultados de la detección del virus y aislamiento del virus para ganado vacuno vacunado y sin vacunar. Los animales de ganado vacuno se vacunaron con gmBoHV-1 (Wet GM), gmBoHV-1 liofilizado (FD-GM), Rhinogard (RG) o no se vacunaron como parte del ensayo en corral para evaluar la eficacia del FD-GM en comparación con Wet GM, después de la extracción del ADN a partir de hisopos nasales, las muestras se probaron utilizando análisis PGR en tiempo real (P) especifico para el vector de gmBoHV-1 (BHV) y el transgén E2 de BVDV (E2). Los resultados PCR se expresan como, muy fuertes (++++, valor Ct <20), fuerte (+++, valor Ct >20 pero <30), débil (++, valor Ct >30 pero <35), muy débil (+, valor Ct >35 pero <40) o negativos (Pos), virus no recuperado (Neg) o no intentado (NA). La variación de temperatura (°C) para cada animal desde el día 0 hasta 7 se muestran más adelante con el número de animal.

Todas las temperaturas registradas estuvieron por debajo de 39.5°C en los 7 dias después de la vacunación, con la excepción de, 581 dia 1, 39.7°C; 596 día 739.7°C; 565 Dias 3 y 539.7°C y 39.6°C, respectivamente.

Catorce dias después de la vacunación inicial de los grupos de tratamiento, los animales de ganado vacuno se inocularon con ya sea la cepa Q3932 de BoHV-1 o la cepa MD74 de BVDV. En los hisopos nasales se detectó el BoHV-1 de dos animales recolectados antes de la administración de los virus de inoculación (Tabla 7) . Los hisopos nasales fueron negativos para el transgén E2 que indicó que el virus detectado no fue el gmBoHV-1. No hubo fuente evidente de este virus ya que todos los animales vacunados con Rhinogard fueron negativos para el virus indicando que la fuente probable en la manipulación después de la recolección de las muestras. Se detectaron altos niveles de la cepa Q3932 con la inoculación de BoHV-1 en todos los animales inoculados con BoHV-1 (Tabla 7) a los tres hasta cuatro dias después de la inoculación (dias 17 y 18).

Se implementaron medidas de seguridad para evitar ya sea la transmisión del BoHV-1 a los grupos inoculados con BVDV o la transmisión del BVDV a los grupos inoculados con BoHV-1. A pesar de esto, hubo una infección significativa del grupo inoculado con BVDV con BoHV-1 (Tabla 7). La fuente de esta infección cruzada no fue evidente fácilmente. Mientras que se han conducido estudios para evaluar específicamente la capacidad de las cepas de Australianas de BoHV-1 para la diseminación entre el ganado vacuno, en general se acepta que sé requiere un contacto estrecho para que se presente la transmisión. Puede ser que la mayoría de los ensayos conducidos que sustentan esta conclusión fueran los ensayos de vacunación y como resultado no se observó transmisión de la cepa de la vacuna (cepa V155 de BoHV-1). Sin embargo, en la fase de inoculación de estos experimentos todos los animales se inocularon, y de esta forma no hubo posibilidad de evaluar la transmisión de la cepa de inoculación para animales que no recibieron tratamiento previo. Con base en esto, podría parecer que la cepa de inoculación Q3932 se transmite más rápidamente a otros animales por ganado vacuno por medio de otro que no sea el contacto estrecho.

Tabla 7 - - .

. * - Vacunado con Rhinogard / inoculado con BoHV-1 974 SHV .

- · . Sin vacunar I inoculado con BVDV 9(6 BHV +*· ¨4# w*|* 4»* 444 Ji-38 52» BVDV Mh 533 BHV ¾.1-3í.2 52» BVDV Mh $&.9W Í =2» ».o a&s es» BVDV Mh + Resultados de la detección de virus en fase de inoculación, aislamiento del virus y detección de Manhiemia haemolytica para ganado vacuno vacunado y con placebo después de la inoculación. El día 14 después de la inoculación, los animales de ganado vacuno se inocularon con ya sea BoHV-1 (107 TCID50) o BVDV, se administró una inoculación posterior de M. haemolytica (6.8 x 109 UFC) a todos los animales de ganado vacuno en el dia 18. Después de la extracción del ADN a partir de hisopos nasales, las muestras se probaron utilizando análisis PCR en tiempo real (P) específicos para la cepa BoHV-1 de inoculación de Q3932 (VHB), el transgén E2 de BVDV (E2), la cepa de inoculación de BVDV (BVDV) o M. haemolytica (Mh). Los resultados PCR se expresan como, muy P fuerte (++++, valor Ct <20), fuerte (+++, valor Ct >20 pero <30), débil (++, valor Ct > 30 pero <35), muy débil (+, valor Ct >35 pero <40) o negativo (-). Las variaciones de temperatura (°C) para cada animal del día 14-25, se muestran debajo del número del animal. Un animal 546 tuvo un valor Ct de 36.7 para BHV sólo al término del ensayo. La PCR de BHV detectó tanto el gBoHV-1 como la cepa de inoculación de 5 BoHV-1.

Después de la administración de los dos patógenos de inoculación, los animales se evaluaron para las señales clínicas diariamente. No se registraron señales clínicas antes de la inoculación viral desde el día 14 hasta el día 18. Después de la segunda fase de la inoculación con la M. haemolytica, las señales clínicas fueron evidentes en muchos de los grupos. En general, las señales clínicas observadas fueron leves. No se registraron temperatura elevada, pérdida de apetito, alteración de la frecuencia respiratoria ni tos en ningún momento durante la fase de inoculación.

Se recolectaron muestras séricas de todos los animales en el dia 0 (vacunación). El dia 14 (inoculación viral) y al término del ensayo inmediatamente antes del sacrificio. Los sueros se probaron para la presencia de anticuerpos para BoHV-1 y BVDV utilizando pruebas de ELISA disponibles comercialmente. En la Tabla 8 se muestran los resultados de estas pruebas. En el dia 0, seis de los animales de ganado vacuno fueron positivos para anticuerpos contra BoHV-1. Los animales de ganado vacuno (60) procedieron de una propiedad individual y todos tuvieron aproximadamente la misma edad. Los sueros recolectados de todos los animales de ganado vacuno se probaron y fueron negativos para anticuerpos específicos para BVDV. Sin embargo, los sueros provenientes de 23 de los 60 animales de ganado vacuno fueron positivos para anticuerpos para BoHV-1 a partir de la misma manada anteriormente con niveles considerados para ser más normales con menos del 10% positivo para BoHV-1. Debido a la alta sero-prevalencia y la edad relativamente joven del ganado vacuno (destetados aproximadamente 8 semanas antes de la llegada), se consideró probable que la alta prevalencia de BoHV-1 positivos fue debido al anticuerpo materno. Si el anticuerpo materno fue responsable, entonces se podría esperar que la cantidad del anticuerpo presente en el suero pudiera disminuir con el tiempo. Como resultado, los animales de ganado vacuno se volvieron a probar para la presencia de anticuerpos de BoHV-1 sobre una base semanal. Entre el periodo de la primera prueba y la tercera prueba tres de los animales de ganado vacuno fueron de positivo a negativo, uno de positivo para dudoso, 15 indicaron reducción de niveles del anticuerpo y cuatro permanecieron positivos con niveles estables del anticuerpo. Un animal pareció desarrollar anticuerpos para BoHV-1 (Número 598), sin embargo, fue seronegativos cuando se probó más tarde.

Al inicio del ensayo, todos los animales de ganado vacuno positivos para anticuerpos de BoHV-1 (Tabla 8) tuvieron niveles reducidos en comparación con la prueba anterior lo cual nuevamente apoya la presencia de anticuerpos de material en estos animales.

Como se podría esperar, todos los animales de ganado vacuno vacunados con el gmBoHV-1 se sero-convirtieron con respecto a BoHV-1 al término del ensayo.

Todos los animales de ganado vacuno permanecieron seronegativos para BVDV a todo lo largo del ensayo (Tabla 8). Esto no se esperaba ya que estos animales se inocularon con BVDV, se esperó que se sero-convirtieran a BVDV. Sin embargo, en el contexto de los resultados para detección de virus no es sorprendente que no se haya detectado ninguna seroconversión ya que la cepa de BVDV utilizada no pareció haberse replicado en los animales no vacunados. El animal 546 fue el único animal PCR positivo para BVDV (en el día 18) cuatro dias después de la inoculación con BVDV mientras que esto se podría considerar un largo tiempo para que el virus persista en la cavidad nasal sin infección ni replicación, si se llevó a cabo la replicación, entonces debe estar a un nivel muy bajo ya que el animal no se sero-convirtió ni se detectó ningún virus en ningún otro día. Los resultados de serología apoyan los resultados de la detección del virus para BVDV indicando que la cepa de BVDV no infectó ni se replicó en estos animales.

Tabla 8 Anime) ID DÍA O DIA 14 FIN DEL ENSAYO BHV BVDV BHV BVDV BHV BVDV Vacunación 581 Pos eg Neg Neg Pos Neg GM F/D 577 Pee Neg Pos e Poa Ne ? úg o Ú 543 Neg Neg Neg Neg Poa Neg 561 eg eg Neg Neg Pos Neg Vacunación 595 Neg Neg Pee eg Poa GM 59 B Neg Neg Pos Neg Pos 574 Pos Neg Pe» Neg Pos 584 Pos Neg doutrt Neg Pos Sin vacunar 590 Nteg Neg Neg Neg Pos Neg 591 Neg Neg Neg Neg Pos Neg 549 Neg Neg Neg Neg Pos Neg 572 Mag Neg Neg Neg Pos Neg Vacunación con M«g Neg Neg Meg Pos Meg Rhinogard 555 Neg Neg Roe Meg Pos Meg 551 Neg Neg Pos Neg Pos Meg 550 Nog Neg Neg Meg Pos Neg Vacunación Pós Meg Pos Neg Pee Meg GM F/D «0 Pos Neg Pos Neg Pos Meg 564 Meg Neg Neg Neg Pos Neg 565 q Meg Pos Neg Pe» Neg Sin vacunar 596 Meg Meg pos Meg Pee Neg 567 •eg Neg Meg Meg Pos Meg 599 Meg Meg Meg Neg Pe» Meg 546 Me eg Meg Neg Poe Neg Estado serológico de ganado vacuno del ensayo para herpesvirus bovino 1 (BHV) o virus de la diarrea viral bovina (BVDV) en las diversas etapas a todo lo largo del ensayo de vacunación. Las muestras séricas de todos los animales de ganado vacuno se probaron utilizando el Pourquier (marca registrada) ELISA IBR- IPV suero y leche para detección de anticuerpos séricos para HBV y Pouriquier (Marca Registrada) ELISA BVD-MD-BD anticuerpos P80 para la detección de anticuerpos séricos para BVDV. La prueba especifica de BHV se confirmará antes de la infección con ya sea el BoHV-1 o el gmBoHV-ltipo silvestre. La prueba especifica para BVDV se confirmará antes de la infección con el BVDV tipo silvestre, no se detectaron anticuerpos específicos para el BVDV E2.

EJEMPLO 15 Efectos de inmunidad preexistente sobre la eficacia de la vacuna Un posible riesgo de combinar vacunas utilizando ingeniería genética es gue la inmunidad preexistente para ya sea el vector o el transgén podría reducir cualquier efectividad de la vacunación. Por ejemplo, en el estudio actual, si los animales de ganado vacuno tuvieran inmunidad pre-existente para BoHV-1, que es el vector de vacuna, entonces esto puede evitar la replicación de la vacuna de gmBoHV-1 y, ya sea evitar o reducir la estimulación de cualquier respuesta inmunológica a la proteína BVDV E2 codificada por el transgén. Si esto se presentara, entonces los animales de ganado vacuno vacunados podrían no haber tenido la posibilidad de beneficiarse del componente del BVDV de la vacuna, es decir, el ganado vacuno podría todavía ser susceptible a la infección por el BVDV y el desarrollo de la enfermedad.

Para determinar si la inmunidad preexistente pudiera interferir con la eficacia de la vacuna prototipo, se condujeron ensayos utilizando animales que fueron positivos en anticuerpos para ya sea BoHV-1 o BVDV. Las respuestas a la vacunación con el gmBoHV-1 luego se evaluaron el modelo de inoculación de dos etapas utilizado con anterioridad.

Efectos de la inmunidad preexistente para BoHV-1 sobre la eficacia de la vacuna Los animales de ganado vacuno determinados para ser positivos para anticuerpos específicos para BoHV-1 se vacunaron con el gmBoHV-1. El ADN aislado de los hisopos nasales para estos animales luego se probaron utilizando análisis PCR en tiempo real específicos para BoHV-1 y el transgén E2. Como se esperaba, todos los animales fueron negativos para ambos ensayos en el día 0. De los animales vacunados con el gmBoHV-1, el virus se detectó consistentemente vía tanto análisis PCR del día 1 hasta el día 6 después de la vacunación para todos los animales, excepto el animales 552.

No se observaron señales clínicas adversas en los animales vacunados durante los siete días después de la vacunación .

Uno de los animales no vacunados (animal 557) fue positivo para ambos análisis PCR en el día 7. Los intentos para aislar el virus de esta muestra nasal no fueron exitosos indicando que el resultado PCR fue debió a la contaminación cruzada de la muestra, ya sea durante la sub-separación en alícuotas o los procesos de extracción de ADN.

Uno de los animales vacunados (556 animales) fue PCR positivo para BoHV-1 en el día 7 únicamente. Ya que el análisis PCR para el transgén E2 es más sensible que el análisis de BoHV-1, fue evidente que esta es una cepa no recombinante o tipo silvestre de BoHV-1. No se realizaron intentos para aislar el virus de esta muestra. Ya que el uso de ácidos nucleicos de BoHV-1 se disemina ampliamente dentro de la contaminación cruzada de laboratorio de la muestra durante ya sea la sub-división en alícuotas o la extracción de ADN parece ser la causa más probable de este resultado.

Catorce días después de la vacunación, los grupos tanto vacunados como sin vacunar se inocularon con BVDV. Todos los animales de ganado vacuno fueron negativos mediante PCR para BoHV-1, el transgén E2 y BVDV en el día 14. Los animales de ganado vacuno de ambos grupos se inocularon con BVDV y se extrajeron muestras durante cinco días adicionales. En el día 18 después de la vacunación todos los animales de ganado vacuno se inocularon con M. haemolytíca . Utilizando la cepa BVDV, tres de los ocho animales de ganado vacuno fueron positivos en al menos un día de la fase de inoculación. Este primer animal fue positiva en el día 15 y el último en el día 23, tres adicionales de los animales no vacunados se sero-convirtieron a BVDV. Estos resultados son indicativos de gue la inoculación con el BVDV fue exitosa.

Después de la inoculación con el BVDV, todos los animales de ganado vacuno se evaluaron para señales clínicas diariamente. No se observaron señales clínicas entre el día 14 y el día 18. Las señales clínicas observadas provinieron del día 19 hasta el día 25.

Los resultados serológicos para estos grupos se muestran en la Tabla 9. Como se puede observar, todos los animales, excepto para 539 fueron positivos para BoHV-1 en el día 0, se sospecha que este animal contuvo anticuerpos maternos que se había disipado antes del comienzo de este ensayo. Este animal permaneció negativo para los anticuerpos de BoHV·-! durante el curso del estudio. Como se muestra en la Tabla 8, tres de los ocho animales (todos sin vacunar) se sero-convirtieron a BVDV. Tres adicionales de los ocho animales (uno sin vacunar y dos vacunados) demostraron claramente niveles cada vez mayores de anticuerpos para BVDV al término del ensayo. Estos resultados apoyan la re afirmación de que la inoculación con el BVDV fue exitosa.

Tabla 9 DÍA O DÍA 14 FIN DEL ENSAYO Animal ID BHV BVPV BHV BVDV BHV BVPV Vacunado 552 Pos Neg Pos Neg Ptw Neg 556 Pos Neg Pos Neg Pos Neg* 563 POS Neg POS Neg Pos Neg" 576 Pos Neg Pos ^eg POS Neg Sin vacunar 53$ Neg Neg Neg Neg Neg Pos 557 Pos Neg Pos Neg Pcs Pee 562 Fe» Neg Pos Neg Pee Neg* 589 Pos Neg Pos Neg Pos Pos Estado serológico del ganado vacuno del ensayo para herpesvirus bovino 1 (BHV) o virus de diarrea viral bovina virus (BVDV) en diversas etapas a todo lo largo del ensayo de vacunación. Las muestras séricas provenientes de todos los animales de ganado vacuno se probaron utilizando el Pourquier (Marca Registrada) ELISA IBR-IPV suero y leche para detección de anticuerpos séricos para BHV y Pouriquier (Marca Registrada) ELISA BVD-MD-BD anticuerpos P80 para la detección de anticuerpos séricos para BVDV. La prueba específica de BHV se confirmará antes de la infección con ya sea el BoHV-1 o el gmBoHV-ltipo silvestre. La prueba especifica para BVDV se confirmará antes de la infección con el BVDV tipo silvestre, no se detectaron anticuerpos específicos para el BVDV E2. *Clara tendencia para aumentar los niveles de anticuerpos.

Conjuntamente, estos resultados indican que la vacunación del ganado vacuno con el gmBoHV-1 proporcionó protección a estos animales de ganado vacuno.

Efectos de la inmunidad preexistente para BVDV sobre la eficacia de la vacuna (inoculación con BoHV-1) Los animales de ganado vacuno determinados para ser positivos para el anticuerpo especifico para BVDV se vacunaron con el gmBoHV-1. El ADN aislado de los hisopos nasales para estos animales luego se probó utilizando análisis PCR en tiempo real específicos para BoHV-1 y el transgén E2. Los resultados de estos análisis PCR se muestran en la Tabla 10. Como se esperaba, todos los animales fueron negativos para ambos ensayos en el día 0. De los animales vacunados con el gmBoHV-1, el virus se detectó consistentemente vía ambos ensayos PCR desde el día 2 hasta el día 6 después de la vacunación para todos los animales. El virus se aisló de todos los animales en el día 3.

Conjuntamente estos datos apoyan la buena absorción de la vacuna. El virus de la vacuna no se detectó en ninguno de los animales sin vacunar (Tabla 10).

No se observaron señales clínicas adversas en los animales vacunados durante los siete días después de la vacunación.

Tabla 10 DIA 1 DIA2 DIA 3 DÍA 4 DÍAS DÍAS DIA 7 Animal 10 P P P VI P P P P VI Vacunado 873 B V Pos 33.6-397 E2» — 4 -4 4™ +* 580 BHV Pos -4 4 4- 39,6^0 E2s *4 ¨ +* Sin vacunar 564 6HV NA 37,9-392 E2s 560 BHV NA 35.1-393 E2s 544 BHV NA 38.4403 E2» 3323 32.55 Resultados de la detección y aislamiento de virus para ganado vacuno con inmunidad existente para BVDV. Fase de vacunación: Resultados de la detección del virus y aislamiento del virus para ganado vacuno vacunado y sin vacunar con inmunidad pre-existente para BVDV. Los animales de ganado vacuno ya sea se vacunaron con gmBoHV-1 liofilizado (FD-GM) o permanecieron sin vacunar. Después de la extracción del ADN de hisopos nasales, las muestras se probaron utilizando análisis PCR en tiempo real (P) específico para el vector de gmBoHV-1 (BHV) y el transgén E2 de BVDV (E2). Los resultados PCR se expresan como, muy fuertes (++++, valor Ct <20), fuerte (+++, valor Ct >20 pero <30), débil (++, valor Ct >30 pero <35), muy débil (+, valor Ct >35 pero <40) o negativos (-). El aislamiento de virus también se intentó para las muestras seleccionadas (VI), los resultados del aislamiento se muestran como virus recuperados (Pos), virus no recuperado (Neg) o no intentado (NA), las variaciones de temperatura (°C) para cada animal desde el día 0 hasta 7 se muestran debajo del número del animal. *Se intentó el aislamiento del virus sin el virus aislado, las proporciones de los resultados PCR de BoHV-1 y E2 también fueron inconsistentes con los resultados anteriores.

En el día 14 después de la vacunación, todos los animales de ganado vacuno se inocularon con la cepa Q3932 de BoHV-1 como se describió anteriormente. Se recolectaron hisopos nasales diariamente y se registraron las señales clínicas. En el día 18 todos los animales se inocularon con M. haemolytica . Se recolectaron hisopos nasales diariamente y las señales clínicas se registraron en el día 25 después de la inoculación. Se extrajo ADN de todos los hisopos nasales.

Catorce días después de la vacunación, los grupos tanto vacunados como sin vacunar se inocularon con el BoHV-1.

Todos los animales de ganado vacuno fueron negativos mediante PCR para BoHV-1 y el transgén E2 en el día 14. Los animales de ganado vacuno provenientes de ambos grupos se inocularon con la Q3932 de BoHV-1 y se extrajeron muestran durante cinco días adicionales. En el dia 18 después de la vacunación todos los animales de ganado vacuno se inocularon con M. haemolytica . Como se esperaba, todos los animales fueron negativos mediante PCR para el transgén E2. El Q2932 se detectó consistentemente en todos los animales, sin embargo, hubo una tendencia hacia animales vacunados que liberaron menos virus durante un periodo de tiempo más corto en comparación con los no vacunados. Una tendencia similar fue evidente para el análisis PCR de M. haemolytica .

Después de la inoculación con BoHV-1, todos los animales de ganado vacuno se evaluaron para señales clínicas diariamente. No se observaron señales clínicas entre el día 14 y el día 18.

La prueba serológica de los animales de ganado vacuno demostró una seroconversión con respecto al BoHV-1 al termino del ensayo para todos los animales de ganado vacuno inoculados con el BoHV-1 como se podría esperar (Tabla 11).

Tabla 11 Vacunado 659 Neg Pe» Neg Pos Pos Pos 593 Neg Pos Pos POS Pos Pos 573 Neg Pos Nsg Pos Pos Pos 559 Neg Pos Neg Pos Pos Pos Sin vacunar 554 Neg Pe» Neg Pe» Pos Pos Estado serológico del ganado vacuno del ensayo para herpesvirus bovino 1 (BHV) o virus de diarrea viral bovina (BVDV) a diversas etapas a todo lo largo del ensayo de vacunación. Las muestras séricas provenientes de todos los animales de ganado vacuno se probaron utilizando el Pourquier (Marca Registrada) ELISA IBR-IPV suero y leche para detección de anticuerpos séricos para HBV y Pouriquier (Marca Registrada) ELISA BVD-MD-BD anticuerpos P80 para la detección de anticuerpos séricos para BVDV. La prueba especifica de BHV se confirmará antes de la infección con ya sea el BoHV-1 o el gmBoHV-1 tipo silvestre. La prueba especifica para BVDV se confirmará antes de la infección con el BVDV tipo silvestre, no se detectaron anticuerpos específicos para el BVDV E2.

Anticuerpo preexistente para ya sea BVDV o BoHV-1 no i previene la replicación o la recuperación del virus de la vacuna de gmBoHV-1 proveniente de animales vacunados En general, los resultados apoyan el suministro de múltiples antígenos a partir de otros patógenos utilizando un vector viral vivo. Además, los resultados indican que el estado inmune del hospedero con respecto al vector de vacuna no afectará negativamente el desempeño de la vacuna.

EJEMPLO 16 Reversión a la virulencia El uso de vacunas virales vivas porta un riesgo inherente del virus original para aumentar la virulencia si se transmite desde un animal a otro animal susceptible. Para investigar si esto fue probablemente con el gmBoHV-1 y tajnbién para evaluar la estabilidad de las modificaciones genéticas realizadas, se sub-cultivó una vacuna prototipo cuatro veces a través de ganado vacuno que no había recibido tratamiento previo inmunológico (con respecto a BoHV-1 y BVDV). Estos experimentos de sub-cultivo se condujeron en paralelo con otros ensayos de vacunación.

Ya que el gmBoHV-1 fue el detectado de manera más consistente y se aisló en el día 3 después de la vacunación, el virus aislado en este momento se utilizó para el sub cultivo posterior. El primer sub-cultivo provino del número de animal 598.

El ADN aislado de los hisopos nasales para estos animales luego se probaron utilizando análisis PCR en tiempo real específicos para BoHV-1 y el transgén E2. Todos los animales fueron negativos para ambos análisis en el día 0. De los animales vacunados con el gmBoHV-1 el virus se detectó consistentemente vía ambos ensayos de PCR desde el día 2 hasta el dia 7 después de la vacunación para todos los animales. El virus se aisló de todos los animales en el dia 3.

No se observaron señales clínicas adversas en los animales vacunados durante los siete días después de la vacunación. Se detectaron temperaturas elevadas leves (>40°C) para algunos animales durante los sub-cultivos, sin embargo, estas fueron esporádicas y no parecieron estar relacionadas con la presencia del virus.

Como se esperaba, la mayoría de los animales se sero-convirtieron a BoHV-1 al término del ensayo.

En resumen, no se encontró evidencia para apoyar la virulencia aumentada del gmBoHV-1 durante los experimentos de sub-cultivo. Además, el transgén pareció ser muy estable sin evidencia encontrada gue indicara pérdida a través de cualguiera de los sub-cultivos.

Conjuntamente, los resultados de los experimentos de sub-cultivo indicaron que el transgén E2 es estable dentro del genoma de BoHV-1. Similarmente, no se encontró evidencia del gmBoHV-1 que se invierta a un fenotipo de mayor virulencia. La estabilidad genética del gmBoHV-1 también se está investigando al examinar los patrones de digestión de la endonucleasa de restricción del ADN genómico a partir de los virus reaislados.

EJEMPLO 17 Dosis excedente Para que sean económicamente viables, las vacunas típicamente se suministran en formulaciones de dosis múltiples. Una posible desventaja de estas formulaciones es el potencial para efectos adversos sobre los animales vacunados si la vacuna se utiliza como una dosis superior a la recomendada. Para investigar la probabilidad de efectos adversos si el gmBoHV-1 se administró a una dosis mayor que la recomendada, se condujo un ensayo donde los animales de ganado vacuno se vacunaron con diversas concentraciones de la vacuna .

Tres grupos de los animales de ganado vacuno (cuatro por grupo) se vacunaron en cada fosa nasal, con 1065 TCID5o del gmBoHV-1 (10 x dosis), 1055 TCID50 del gmBoHV-1 (dosis esperada efectiva) o 1045 TCID50 del gmBoHV-1 (0.1 x dosis esperada efectiva). Los animales de ganado vacuno se monitorearon para señales clínicas y se extrajeron hisopos nasales diariamente después de la vacunación. El ADN aislado de los hisopos nasales para estos animales luego se probó utilizando análisis PCR en tiempo real específicos para BoHV-1 y el transgén E2.

De los animales vacunados con el gmBoHV-1, el virus se detectó consistentemente vía ambos análisis PCR desde el D2 hasta el día 7 después de la vacunación para todos los animales. El virus se aisló consistentemente de los animales en el dia 3.

No se observaron señales clínicas adversas en los animales vacunados durante los siete días después de la vacunación. Se detectaron temperaturas elevadas leves (>40°C) para algunos animales, sin embargo, estas fueron esporádicas y no parecieron estar relacionadas con la presencia del virus.

Como se esperaba, la mayoría de los animales se sero-convirtieron a BoHV-1 al término del ensayo. Hubo una tendencia hacia más animales sero-convertidos en el tratamiento que recibieron altas cantidades del virus como se podría esperar.

No hubo evidencia de ningún efecto nocivo sobre los animales vacunados con altas dosis del gmBoHV-1. A dosis menores de la vacuna, pareció ser menos eficiente la absorción de la vacuna con base en la capacidad para detectar el virus en hisopos nasales mediante la detección de PCR y/o el aislamiento del virus.

EJEMPLO 18 Estabilidad genetica del gmBoHV-1 En este ejemplo, se evaluó la estabilidad genética del gmBoHV-1 al examinar los perfiles genéticos de las cepas de vacuna aisladas de los animales durante el sub-cultivo en serie de la vacuna prototipo a través del ganado.

Esta evaluación se realizó al re-aislar primero el gmBoHV-1 proveniente de los hisopos nasales recolectados de los animales de ganado vacuno infectados. Para probar la evidencia de que sub-cultivo repetido en el ganado vacuno podría no afectar adversamente la estabilidad genética de la vacuna prototipo, estos análisis se condujeron sobre virus recuperados del sub-cultivo en serie. Los genomas aislados y clonados de los clones seleccionados aleatoriamente luego se examinaron mediante digestión con endonucleasa de restricción el cual es un método bien aceptado para evaluar la estabilidad genética de los herpesvirus. Se utilizaron dos endonucleasas de restricción en el primero fue HindIII que corta el genoma de BoH V-l y un estimado de 12 veces y de esta forma proporciona una medida de cualesquiera redisposiciones genómicas a gran escala o casos de recombinación. La segunda enzima utilizada como salí que corta el genoma de BoHV-1 un estimado de 45 veces y de esta forma proporciona una medida de cualesquiera redisposiciones genómicas de escala más fina o casos de recombinación.

Los virus se recuperaron de los hisopos nasales recolectados en el dia 3 y en el día 7 después de la vacunación y se determinaron los perfiles de restricción. No hubo redisposiciones obvias a mayor o menor escala con base en los perfiles de HundíI y Salí, respectivamente.

Con base en los perfiles de endonucleasas de restricción de los virus aislados después de los sub-cultivos en ganado vacuno, no hubo evidencia de ninguna variabilidad genética. Estos datos apoyan la conclusión de que el gmBoHV-1 utilizado para vacunar ganado vacuno en este estudio es bastante estable.

Aquellos expertos en la téenica apreciarán que los aspectos permitidos en la presente son susceptibles a variaciones y modificaciones distintas a aquellas descritas específicamente. Se debe entender que estos aspectos incluyen todas estas variaciones y modificaciones. Se permiten en la presente todos los pasos, características, composiciones y compuestos a los que se hace referencia o se indican en esta especificación, individual o colectivamente, y cualesquiera y todas las combinaciones de cualesquiera de dos o más de estos pasos o características BIBLIOGRAFÍA Mahoney et al. (2002) Journal of Virology 76 (13) : 6660-6668 Narayanan et al. (1999) Gene therapy 6:442-447 Orford et al. Nucleic Acids Research 28 (18) e84 Schumacher et al. (2000) Journal of Virology 74:11088-11098 Snowden (1964) Australian Veterinary Journal 40:277-288

Claims (21)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES :

1. Una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de patógeno bovino, la vacuna caracterizada porque comprende un genoma del herpesvirus bovino-1 (BoHV-1) proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia que tenga material genético que codifique para al menos un antigeno que sea heterólogo para BoHV-1 insertado entre dos genes de convergencia de BoHV-1 en donde la inserción no sub-regula sustancialmente la expresión de los genes de BoHV-1 y en donde el material genético que codifica para al menos un antigeno se inserta entre las señales de poliadenilación de dos genes convergentes en el sitio seleccionado de entre 16600 hasta 16700; 22400 hasta 22500; 40,700 hasta 40,800; 58,000 hasta 59,000; 67,000 hasta 68,000; 74,000 hasta 76,000; 84,000 hasta 85,000; 90,000 hasta 91,000; y 96,000 hasta 97,000 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otro BoHV-1.

2. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el material genético que codifica para al menos un antigeno se inserta en el genoma de BoHV-1 vía recombinación GET.

3. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un antigeno se inserta entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16600 hasta 16612; 22400 hasta 22493; 16602 hasta 16603; y 22421 hasta 22470.

4. La vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque al menos un antigeno se inserta entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre un sitio listado en la Tabla 2.

5. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizada porque al menos un antigeno se selecciona de la lista que consiste en un antigeno proveniente del virus de diarrea viral bovina (BVDV) un antigeno proveniente de BoHV-1, un antigeno proveniente de parainfluenza bovina 3, un antigeno proveniente del virus sincitial respirador y un antigeno proveniente de un microorganismo .

6. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el antigeno de BVDV se selecciona de la lista que consiste de la glucoproteina E0 y la glucoproteina E2.

7. La vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque el microorganismo se selecciona de la lista que consiste de Mycoplasma bovis, una especie de Salmonella , Pasteurella multocida, Mannhiemia haemolytica y Haemophilus somnus.

8. La vacuna de conformidad con la reivindicación I, caracterizada porque la cepa de BoHV-1 con baja virulencia es la cepa V155.

9. La vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, formulada en una composición farmacéutica.

10. La vacuna de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la composición farmacéutica es adecuada para administración nasal.

11. Un método para vacunar a un animal bovino contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método caracterizado porque comprende administrar al animal bovino una cantidad efectiva para inducir inmunidad humoral o inducir inmunidad mediada por células de una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

12 . El método de conformidad con la reivindicación II, caracterizado porque la administración es vía administración intra-nasal, oral, intramuscular, sub-lingual, intravenosa, subcutánea, intra-arterial, por aerosol para la piel, intra-vaginal o intra-rectal.

13. Un método de producir una vacuna contra al menos un antigeno proveniente de un patógeno bovino, el método caracterizado porque comprende: (i) incorporar un genoma de BoHV-l:proveniente de un BoHV-1 con baja virulencia en un vector del cromosoma artificial bacteriano (BAC) para formar una estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1; (ii) insertar material genético que codifique para al menos un antigeno en la estructura del BAC del pre-vector de BoHV-1 via recombinación GET para para generar un vector recombinante del BoHV-1-BAC (rBoHV-l-BAC), el material genético que codifica para al menos un antigeno se inserta entre las señales de poliadenilación de dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16600 hasta 16700; 22400 hasta 22500; 40,700 hasta 40,800; 58,000 hasta 59,000; 67,000 hasta 68,000; 74,000 hasta 76,000; 84,000 hasta 85,000; 90,000 hasta 91,000; y 96,000 hasta 97,000 de la secuencia de referencia de BoHV-1 No. de acceso GenBank AJ004801 o en un sitio funcionalmente equivalente en otro BoHV-1; (iii) transformar y amplificar el vector de rBoHV-l-BAC en un hospedero bacteriano; y (iv) purificar y aislar el vector de rBoHV-l-BAC proveniente del hospedero bacteriano y formular el vector en una composición de vacuna.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque al menos un antigeno se inserta entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado entre 16600 hasta 16612; 22400 hasta 22493; 16602 hasta 16603; y 22421 hasta 22470.

15. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque al menos un antigeno se inserta entre dos genes convergentes en un sitio seleccionado de entre un sitio listado en la Tabla 2.

16. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque al menos un antigeno se selecciona de la lista que consiste en un antigeno proveniente del virus de la diarrea viral bovina (BVDV) un antigeno proveniente de BoHV-1, un antigeno proveniente de parainfluenza bovina 3, un antigeno proveniente del virus sincitial respiratorio bovino y un antigeno proveniente de un microorganismo.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el antigeno del BVDV se selecciona de la lista que consiste en la glucoproteina E0 y la glucoproteina E2.

18. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque el microorganismo se selecciona de la lista que consiste de Mycoplasma bovis, un especies de Salmonella, Pasteurella multocida, Mannhíemia haemolytica y Haemophilus somnus.

19. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque la cepa de BoHV-1 con baja virulencia es la cepa V155.

20. Una célula cultivada transfectada con el vector de rBoHV-1-BAC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 a 19.

21. El uso de una vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la elaboración de un medicamento en la vacunación de ganado vacuno contra un patógeno bovino.