MX2014009893A - Mejora de resistencia a la sequia en plantas: upl3. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con un método novedoso para aumentar la resistencia a la sequía de una planta. El método abarca la afectación de la expresión de un gen o genes en la planta. En comparación con una planta no manipulada para afectar la expresión de los genes, las plantas exhiben una resistencia mejorada a la sequía. También se proporcionan plantas y productos vegetales que se pueden obtener mediante el método de acuerdo con la invención.

Description

MEJORA DE RESISTENCIA A LA SEQUÍA EN PLANTAS: UPL3 CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con un método novedoso para aumentar la resistencia a la sequía de una planta. El método abarca el deterioro de la expresión de un gen o genes o proteínas funcionales en la planta. En comparación con una planta no manipulada para afectar la expresión de los genes o proteínas funcionales, las plantas exhiben una resistencia mejorada a la sequía. También se describen plantas y productos vegetales que se pueden obtener mediante el método de acuerdo con la invención.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los estreses abióticos, tales como sequía, salinidad, temperaturas extremas, toxicidad química y estrés oxidativo son amenazas para la agricultura y es la causa principal de la pérdida de cultivos a nivel mundial ( ang et al. (2003) Planta 218(1) 1-14).

En la técnica, están disponibles diversos reportes que abordan el antecedente bioquímico, molecular y genético del estrés abiótico (Wang et al. (2003) Planta 218 (1) 1-14 o Kilian et al (2007) Plant J 50(2)347-363). La modificación a las plantas para abordar el estrés abiótico con frecuencia se basa en la manipulación de genes que protegen y mantienen la función y estructura de los componentes celulares. Sin embargo, debido a respuestas genéticamente complejas a las condiciones del estrés abiótico, estas plantas parecen ser más difíciles de controlar y crear por ingeniería. Wang, (Wang et al. (2003) Planta 218 (1) 1-14), Ínter alia, menciona que una de las estrategias para la creación por ingeniería depende del uso de uno o diversos genes que estén ya sea implicados en trayectorias de señalización y reguladoras, o que codifiquen para las enzimas presentes en las trayectorias que conducen a la síntesis de protectores funcionales y estructurales, tales como osmolitos y antioxidantes, o que codifican para proteínas que confieren tolerancia al estrés.

Aunque se han reportado mejoras para proporcionar plantas tolerantes al estrés abiótico, la naturaleza de los mecanismos genéticamente complejos que la fundamentan proporciona una necesidad constante por una mejora adicional en este campo. Por ejemplo, se ha reportado que las plantas tolerantes a la sequía transformadas genéticamente en general, pueden exhibir crecimiento más lento y biomasa reducida (Serrano et al (1999) J. Exp. Bot 50:1023-1036) debido a un desequilibrio en el desarrollo y fisiología, teniendo de esta forma un costo de conveniencia significativa en comparación con las plantas que no se transformaron (Kasuga et al. (1999) Nature Biot. Vol. 17; Danby and Gehring (2005) Trends in Biot. Vol. 23 No. 11) .

Se han propuesto diversos procedimientos biotecnológicos para obtener plantas que crezcan bajo condiciones de estrés. Las plantas con una resistencia aumentada al estrés salino, por ejemplo, se describen en la WO03/020015. Este documento describen plantas transgénicas que son resistentes al estrés salino al utilizar ácidos nucleicos de 9-cis-epoxicarotenoide dioxigenasa y polipéptidos .

Las plantas con una tolerancia aumentada a la sequía se describen en, por ejemplo, la US 2009/0144850, la US 2007/0266453 y la WO 2002/083911. La US 2009/0144850 describe una planta que exhibe un fenotipo de tolerancia a la sequía debido a la expresión alterada de un ácido nucleico DR02. La US 2007/0266453 describe una planta que exhibe un fenotipo de tolerancia a la sequía debido a la expresión alterada de un ácido nucleico DR03 y la WO 2002/083911 describe una planta que tiene una tolerancia aumentada al estrés por sequía, debido a una actividad reducida de un transportador de ABC que se expresa en células guardas. Otro ejemplo es el trabajo de Kasuga y co-autores (1999), quienes describen que la sobreexpresión del ADNc que codifica para DREB1A en plantas transgénicas activa la expresión de muchos genes de tolerancia a estrés bajo condiciones normales de crecimiento y da por resultado en una tolerancia mejorada a la sequía, carga salina, y congelamiento. Sin embargo, la impresión de DREB1A también da por resultado en un retardo hospedero del crecimiento bajo condiciones normales de crecimiento (Kasuga (1999) Nat . Biotechnol 17 (3) 287-291). Sigue habiendo una necesidad por una metodología novedosa, alternativa y/o adicional para aumentar la resistencia al estrés abiótico, en particular, el estrés abiótico similar a la sequía.

Un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos novedosos para aumentar la resistencia a la sequía en una planta. Con esta planta, por ejemplo, es posible producir más biomasa y/o más cultivo y productos vegetales derivados de los mismos si se hacen crecer bajo condiciones de baja disponibilidad de agua/sequía en comparación con las plantas que no se someten al método de acuerdo con la invención.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de una proteína UPL en una planta, la proteina UPL comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un dominio Pfam HECT de acuerdo con PF00632 y al menos una de repetición de súper-familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371, y regenerar opcionalmente la planta.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional en una planta, la célula vegetal o el protoplasto vegetal, en donde la proteína UPL3 funcional comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y opcionalmente regenerar la planta.

La proteína UPL3 funcional puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un dominio Pfam HECT de acuerdo con PF00632 y al menos una de repetición de súper-familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371.

La proteína UPL3 funcional puede ser una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción del T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteina UPL3 funcional .

La invención se dirige además a un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional en una planta, una célula vegetal o un protoplasto vegetal, en donde la proteína UPL3 funcional comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un dominio Pfam HECT de acuerdo con PF00632 y al menos una de repetición de la súper-familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371, y opcionalmente regenerar la planta.

La invención también pertenece a un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende la secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, y regenerar opcionalmente la planta.

La proteína UPL3 funcional puede ser una proteína que cuando se expresa en una linea de inserción de T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional .

El paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional puede comprender mutar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína UPL3 funcional- La mutación de la secuencia de ácido nucleico puede implicar una inserción, una supresión y/o sustitución de al menos un nucleótido. El paso de afectar la expresión puede comprender silenciamiento génico. El paso de afectar la expresión puede comprender afectar- la expresión de dos o más proteínas UPL3 funcionales en la planta.

El método puede comprender además el paso de producir una planta o un producto vegetal proveniente de la planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía.

La invención también se relaciona con el uso de una secuencia de aminoácidos que tenga al menos 30% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico que tenga al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 en la selección para la resistencia a la sequía en plantas.

La invención se dirige al uso de una secuencia de aminoácidos UPL3 que tiene la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico UPL3 de la SEC ID NO: 1 en la detección de resistencia a la sequía en plantas de Arabidopsis thaliana .

La invención también se relaciona con el uso de al menos parte de una secuencia de ácido nucleico UPL3 de la SEC ID NO: 1 o al menos parte de una secuencia de aminoácidos UPL3 de la SEC ID NO: 2 como un marcador para la propagación de plantas Arabidopsis thaliana resistentes a la sequía.

La invención proporciona además el uso de una proteína UPL3 funcional, como se define en la presente, para modular, de preferencia aumentar, la resistencia a la sequía de una planta.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de una planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tenga un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tenga un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional para el crecimiento, bajo condiciones de estrés por sequía, en donde las condiciones de estrés por sequía provocan una planta control, una célula vegetal o un producto vegetal en donde no se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional para que muestre señales de estrés por sequía, tales como señales de marchitamiento más temprano que la planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde no se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional.

La invención también muestra una planta, célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypiu hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, en donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional. La planta, célula vegetal o producto vegetal puede comprender un gen UPL3 endógeno interrumpido.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1, muestra los resultados de un experimento típico descrito en los Ejemplos 1 y 2.

La figura 2, muestra el fenotipo resistente a la sequía de UPL3 inactivado (mutante de inserción At4g38600 en Arabidopsis) en comparación con el fenotipo sensible a la sequía de una planta control (tipo silvestre) .

La figura 3, muestra la supervivencia a la sequía del mutante de inserción At4g38600 (UPL3) . El mutante de inserción At4g38600 en Arabidopsis thaliana sobrevivió a la sequía significativamente mejor (p <0.05) de las plantas tipo silvestre (Col-0) o los mutantes de inserción At4g38600 complementados con la secuencia codificante (CDS) de At5g38600 (SEC ID NO: 1; control positivo) y los homólogos provenientes de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO: 3), Solanum lycopersicum (SEC ID NO: 5 y 7) o Oryza sativa (SEC ID NO: 9) . Esta figura demuestra que una mutación de inserción en el gen UPL3 produce un fenotipo resistente a la sequía. Además, también indica que los homólogos de este gen provenientes de especies monocotiledóneas y dicotiledóneas funcionan para restaurar el fenotipo normal susceptible a la sequía. Por lo tanto, estos homólogos realizan la misma función en la tolerancia a la sequía en sus especies respectivas de cultivo. La observación de que los genes UPL3 tanto de monocot ledóneas como dicotiledóneas pueden restaurar la susceptibilidad a la sequía cuando se insertan en el mutante de inserción UPL3 de Arabidopsis sugiere que una actividad reducida de la proteína codificada por el gen UPL3 presenta fenotipos tolerantes a la sequía en todo el reino vegetal. Por lo tanto, la predicción de UPL3 (con base en investigaciones de homología y el dominio característico [HECT] y las secuencias de repetición de armadillo) permitirán la identificación de los homólogos UPL3 en plantas, en especies vegetales. Por consiguiente, se pueden utilizar métodos bien conocidos para reducir la actividad proteínica de estos homólogos vegetales (por ejemplo, mutagénesis, ADNt o inserción de transposones, ARNi, etc.) para obtener plantas resistentes a la sequía. Las barras grises tienen valores significativamente menores (p <0.05) que las barras negras.

La figura 4, muestra el fenotipo de resistencia de un mutante UPL3 de tomate {Solanum lycopersicum) . Para un experimento de sequía se utilizó una población M2 segregante que contiene homocigotos, heterocigotos y alelo tipo silvestre. La fotografía -tomada 21 días después del inicio del tratamiento para sequía- muestra una planta de tomate tipo silvestre (derecha) y una planta que porta la mutación V158E en Slg98247 (izquierda) . El fenotipo tolerante a la sequía y la supervivencia del tratamiento para sequía fue significativamente mejor (p <0.1) para la planta que porta la mutación V158E en Slg98247 en comparación con el alelo tipo silvestre, indicando que esta alteración de la proteína conduce a un fenotipo tolerante a la sequía en el tomate.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Definiciones En la siguiente descripción y ejemplos, se utiliza una serie de términos. Para proporcionar una comprensión clara y consistente de la especificación y reivindicaciones, incluyendo el alcance que se otorgará a estos términos, se proporcionan las siguientes definiciones. A menos que se defina de otra manera en la presente, todos los términos técnicos y científicos utilizados tienen el mismo significado como se entiende comúnmente por alguien con experiencia normal en la técnica a la cual pertenece esta invención. Las descripciones de todas las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y otras referencias se incorporan en la presente en su totalidad como referencia.

Los métodos para llevar a cabo las técnicas convencionales utilizadas en los métodos de la invención se harán evidentes para el trabajador experto. La práctica de técnicas convencionales en biología molecular, bioquímica, química computacional , cultivo de células, ADN recombinante, bioinformática, genómica, secuenciación y campos relacionados son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se analizarán, por ejemplo, en las siguientes referencias bibliográficas: Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2a Edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John iley & Sons, New York, 1987 y actualizaciones periódicas; y la serie Methods in Enzymology, Academic Press, San Diego.

En este documento y en sus reivindicaciones, el verbo "comprender" y sus conjugaciones se utiliza en su sentido no limitante para dar a entender que se incluyen los puntos que siguen a la palabra, aunque no se excluyen los puntos que no se mencionan específicamente. Esto abarca verbos "que consiste esencialmente de", así como "que consiste de".

En el sentido en el que se utiliza en la presente, las formas singulares "uno", "una" y "el", incluyen referencias al plural a menos que el contexto claramente dicte otra cosa. Por ejemplo, un método para aislar "una" molécula de ADN, en el sentido en el que utilizó anteriormente, incluye aislar una pluralidad de moléculas (por ejemplo, 10, 100, 1000, 10 de miles, 100 de miles, millones, o más moléculas) .

Alineación y alineamiento: Con el término "alineación" y "alineamiento" se debe entender la comparación de dos o más secuencias de nucleótidos con base en la presencia de tramos cortos o largos de nucleótidos idénticos o similares. Se conocen en la técnica diversos métodos para la alineación de las secuencias de nucleótidos, como se explicará adicionalmente más adelante.

"Expresión de un gen", se refiere al proceso en donde una región de ADN, que está ligado funcionalmente con las regiones reguladoras adecuadas, en particular un promotor, se transfiere en un ARN, que sea biológicamente activo, es decir, que sea capaz de ser traducido en una proteina o péptido biológicamente activo (o fragmento peptidico activo) . "Expresión ectópica", se refiere a la expresión en un tejido en el cual no se expresa normalmente el gen. "Expresión de una proteina", se utiliza en la presente indistintamente con el término expresión de un gen. Se refiere al proceso en el cual una región de ADN, que está ligado funcionalmente con las regiones reguladoras adecuadas, en particular un promotor, se transcriben en un ARNm y que se traduce posteriormente en el interior de una proteina o péptido (o segmento peptidico activo) .

"Funcional", en relación con las proteínas UPL3 (o variantes, tales como ortólogos o mutantes, y fragmentos) , se refiere a la capacidad del gen y/o la proteína codificada para modificar la resistencia a la sequía (cuantitativa y/o cualitativa), por ejemplo, al modificar el nivel de expresión del gen (por ejemplo, mediante la sobre-expresión o silenciamiento) en una planta. Por ejemplo, la funcionalidad de una proteína UPL3 obtenida de la especie vegetal X se puede probar mediante diversos métodos. De preferencia, si la proteína es funcional, el silenciamiento del gen que codifica para la proteína en la especie vegetal X, utilizando por ejemplo vectores de silenciamiento génico, conducirá a una resistencia mejorada a la sequía como se puede probar y como se explica en la presente en detalle. También, el complemento de un UPL3 inactivado con una proteína UPL3 (o gen UPL4) funcional tendrá la capacidad para restaurar o conferir la característica, en este caso restaurará la sensibilidad a la sequía. El experto no tendrá dificultades para probar la funcionalidad.

El término "gen" significa una secuencia de ADN que comprende una región (región transcrita) , que se transcribe en una molécula de ARN (por ejemplo un ARNm) en una célula, ligado funcionalmente a regiones reguladoras adecuadas (por ejemplo, un promotor). De esta forma, un gen puede comprender diversas secuencias ligados funcionalmente, tal como un promotor, una secuencia líder 5' que comprende por ejemplo, las secuencias implicadas en el inicio de traducción, una región codificante (proteínica) (ADNc o ADN genómico) y una secuencia no traducida 3' que comprende por ejemplo, los sitios de secuencia para terminación de transcripción.

El término "ADNc" significa ADN complementario. Un ADN complementario se produce mediante un ARN de transcripción inversa en una secuencia de ADN complementario. Las secuencias de ADNc de esta forma corresponden a secuencias de ARN que se expresan a partir de genes. Mientras que las secuencias de ARNm cuando se expresan a partir del genoma pueden experimentar eliminación de intrones, es decir, los intrones se eliminan del ARNm y los exones se juntan, antes de ser traducidos en el citoplasma en las proteínas, se entiende que la expresión de un ADNc significa la expresión del ARNm que codifica para el ADNc. La secuencia de ADNc de esta forma puede no ser idéntica a la secuencia de ADN genómico a la cual corresponde mientras que el ADNc puede codificar sólo para el marco de lectura abierto completo, que consiste de los exones unidos, para una proteína, mientras que el ADN genómico codifica y los exones se entremezclan por secuencias de intrones. Modificar genéticamente un gen que codifica el ADNc de esta forma, puede no estar sólo relacionado con la modificación de las secuencias correspondientes al ADNc, sino que también puede implicar la mutación de las secuencias intrónicas del ADN genómico y/u otras secuencias reguladoras de genes de este gen, siempre y cuando esto de por resultado en la afección de la expresión génica .

"Identidad" es una medición de la identidad de las secuencias de nucleótidos o secuencias de aminoácidos. En general, las secuencias están alineadas de tal forma que se obtenga la coincidencia de orden mayor. "Identidad", per se tiene un significado reconocido en la técnica y se puede calcular utilizando técnicas publicadas. Véase, por ejemplo: ( COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; BIOCOMPUTING : INFORMATICS AND GENOME PROJECTS, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA, PART I, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and SEQUENCE ANALYSIS PRIMER; Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press, New York, 1991) . Mientras que existen una serie de métodos para medir la identidad entre dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos , el término "identidad" es bien conocido por los expertos (Carillo, H., and Lipton, D., SIA J. Applied Math (1988) 48:1073). Los métodos comúnmente empleados para determinar la identidad o similitud entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa, aquellos descritos en GUIDE TO HUGE COMPUTERS, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego, 1994, and Carillo, H., and Lipton, D., SIAM J. Applied Math (1988) 48:1073. Los métodos para determinar la identidad y similitud están codificados en programas computacionales . Los métodos en programas computacionales preferidos para determinar la identidad y similitud entre dos secuencias incluyen, de manera enunciativa, el paquete de programas GCS (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research (1984) 12(1) :387), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S. F . et al., J. Molec. Biol. (1990) 215:403). El porcentaje de identidad de preferencia se determina sobre la longitud total de la secuencia de nucleótidos o aminoácidos.

Como una ilustración, mediante un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos que tenga al menos, por ejemplo, 95% de "identidad" con una secuencia de nucleótidos de referencia que codifica para un polipéptido de una cierta secuencia se pretende que la secuencia de nucleótidos del polinucleótido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia de polinucleótidos puede incluir hasta cinco mutaciones puntuales por cada 100 nucleótidos de la secuencia de polipéptidos de referencia. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una secuencia de nucleótidos con una secuencia del nucleótido de referencia se calculará sobre la longitud total de la secuencia del nucleótido de referencia. En otras palabras, para obtener un polinucleótido que tenga una secuencia de nucleótidos al menos 95% idéntica con una secuencia de nucleótidos de referencia, hasta el 5% de los nucleótidos en la secuencia de referencia se puede suprimir y/o sustituir con otro nucleótido, y/o una serie de nucleótidos hasta el 5% de los nucleótidos totales en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas mutaciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones terminales 5' o 3' de la secuencia de nucleótidos de referencia, o en cualquier lugar entre estas posiciones terminales, entremezclados ya sea individualmente entre los nucleótidos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Similarmente, por un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos que tenga al menos, por ejemplo, 95¾ de "identidad" con una secuencia de aminoácidos de referencia de la SEC ID NO: 2 se pretende que la secuencia de aminoácidos del polipéptido sea idéntica a la secuencia de referencia excepto que la secuencia del polipéptido puede incluir hasta cinco alteraciones de aminoácidos por cada 100 aminoácidos del aminoácido de referencia de la SEC ID NO: 2. Por lo tanto, el porcentaje de identidad de una secuencia de aminoácidos con una secuencia de aminoácidos de referencia se calculará sobre la longitud total de la secuencia de aminoácidos de referencia. En otras palabras, para obtener un polipéptido que tenga una secuencia de aminoácidos a al menos 95' idéntica con una secuencia de aminoácidos de referencia, hasta el 5% de los residuos de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede suprimir o sustituir con otro aminoácido, o una serie de aminoácidos hasta el 5% de los residuos totales de aminoácidos en la secuencia de referencia se puede insertar en la secuencia de referencia. Estas alteraciones de la secuencia de referencia se pueden presentar en las posiciones terminales amino o carboxi de la secuencia de aminoácidos de referencia o en cualquier lugar entre esas posiciones terminales, entremezclados ya sea individualmente entre los residuos en la secuencia de referencia o en uno o más grupos contiguos dentro de la secuencia de referencia.

Un ácido nucleico de acuerdo con la presente invención puede incluir cualquier polímero u oligómero de pirimidina y bases de purina, de preferencia citosina, timina, y uracilo, y adenina y guanina, respectivamente (Véase Albert L. Lehninger, Principies of Biochemistry, at 793-800 (Worth Pub. 1982) que se incorpora en la presente como referencia en su totalidad para todos los fines) . La presente invención contempla cualquier desoxirribonucleótido, ribonucleótido o componentes de ácido nucleico peptidico, y cualesquiera variantes químicas de los mismos, tales como formas metiladas, hidroximetiladas o glucosiladas de estas bases, y lo semejante. Los polímeros u oligómeros pueden ser heterogéneos u homogéneos en la composición, y se pueden aislar de las fuentes de origen natural o se pueden producir artificial o sintéticamente. Además, los ácidos nucleicos pueden ser ADN o ARN, o una mezcla de los mismos, y pueden existir permanente o transicionalmente en una forma de cadena individual o doble cadena, incluyendo estados homodúplex, heteroduplex e híbridos.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "ligado funcionalmente" se refiere a una ligadura de elementos de polinucleótidos en una relación funcional. Un ácido nucleico está "ligado funcionalmente" cuando se coloca en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, un promotor, o en su lugar una secuencia reguladora de transcripción, está ligado funcionalmente a una secuencia codificante si afecta la transcripción de la secuencia codificante. Ligado funcionalmente puede significar que las secuencias de ADN que estén ligadas sean contiguas.

"Planta", se refiere a cualquier planta entera o partes de una planta, tales como células, tejidos u órganos (por ejemplo, polen, semillas, gametos, raices, hojas, flores, capullos, anteras, frutos, etc.) que se pueden obtener de la planta, asi como los derivados de cualquiera de estas y la progenie derivada de esta planta mediante autofecundación o cruza. "Célula vegetales" incluyen protoplastos , gametos, cultivos en suspensión, microesporas , granos de polen, etc., ya sea en aislamiento o dentro de un tejido órgano u organismo.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "promotor" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que funciona para controlar la transcripción de uno o más genes, ubicados en la dirección 5' con respecto a la dirección de transcripción del sitio para inicio de transcripción del gen, y se identifique estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la polimerasa de ARN dependiente de ADN, los sitios para inicio de transcripción y cualesquiera otras secuencias de ADN, incluyendo, de manera enunciativa los sitios de unión al factores de transcripción, los sitios de unión a la proteina represora y activadora, y cualesquiera otras secuencias de nucleótidos conocidas por alguien con experiencia en la técnica para que actúen directa o indirectamente para regular la cantidad de transcripción a partir del promotor. Opcionalmente, el término "promotor" incluye en la presente también la región de UTR 5' (región sin traducir 5') (por ejemplo, el promotor en la presente puede incluir una o más partes en la dirección 5' (5' ) ) del codón para inicio de traducción de un gen, ya que esta región puede tener una función para regular la transcripción y/o traducción. Un promotor "constitutivo" es un promotor que es activo en la mayoría de tejidos bajo condiciones fisiológicas y de desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que se regula fisiológicamente (por ejemplo, mediante la aplicación externa de ciertos compuestos) o mediante desarrollo. Un promotor "tejido específico" sólo es activo en tipos de tejidos específicos o células. Un "promotor activo en plantas o células de plantas" se refiere a la capacidad general del promotor para conducir la transcripción dentro de una planta o célula vegetal. No importan las implicaciones acerca de la actividad espacio-temporal del promotor.

Los términos "proteína" o "polipéptido" se utilizan indistintamente y se refieren a moléculas que consisten de una cadena de aminoácidos, sin referencia a un modo de acción específico, tamaño, estructura tridimensional u origen. Un "fragmento" o "porción" de una proteína de esta forma todavía puede denominarse como una "proteína". Una "proteína aislada" se utiliza para hacer referencia a una proteina que ya no está en su entorno natural, por ejemplo in vitro o en una célula hospedera bacteriana o vegetal recombinante .

"Planta transgénica" o "planta transformada" se refiere en la presente a una planta o célula vegetal que se haya transformado, por ejemplo, mediante la introducción de una mutación no silente en un gen endógeno o parte del mismo. Esta planta se ha modificado genéticamente para introducir, por ejemplo una o más mutaciones, inserciones y/o supresiones en el gen y/o inserciones de una estructura de silenciamiento génico en el yenoma. Una célula vegetal transgénica puede hacer referencia a una célula vegetal en aislamiento o en cultivo de tejidos, o a una célula vegetal contenida en una planta o en un órgano o tejido diferenciado, y ambas posibilidades se incluyen específicamente en la presente. Por lo tanto, una referencia a una célula vegetal en la descripción o las reivindicaciones no significa que haga referencia únicamente a células aisladas o protoplastos en cultivo, sino que hace referencia a cualquier célula vegetal, sin importar que pueda ser ubicada o en cualquier tipo de tejido vegetal u órgano pueda estar presente.

El intercambio de nucleótidos dirigido (TNE) es un proceso mediante el cual un oligonucleótido sintético, complementario parcialmente hacia un sitio en un gen cromosómico o uno episómico dirige la inversión de un nucleótido individual en un sitio especifico. El TNE se ha descrito utilizando una amplia variedad de oligonucleótidos y blancos. Algunos de los oligonucleótidos reportados son quimeras de ARN/ADN, contienen modificaciones terminales para impartir resistencia a nucleasas.

En el sentido en el que se utiliza en la presente, el término "estrés por sequía" o "sequía" se refiere a una condición ambiental sub-óptima asociada con una disponibilidad limitada de agua para una planta. La disponibilidad limitada de agua se puede presentar cuando, por ejemplo, está ausente la lluvia o disminuye y/o cuando las plantas se riegan con menos frecuencia de la requerida. La disponibilidad limitada de agua para una planta también se puede presentar cuando, por ejemplo, el agua está presente en el suelo, pero que no se puede extraer deficientemente por la planta. Por ejemplo, cuando hay abonos fuertemente unidos al agua o cuando el agua tiene un alto contenido de sales, puede ser más difícil que la planta extraiga el agua del suelo. Por lo tanto, muchos factores pueden contribuir a dar por resultado en una disponibilidad limitada del agua, es decir, sequía para una planta. El efecto de someter las plantas a "sequía" o "estrés por sequía" puede ser que las plantas no tengan un crecimiento y/o desarrollo óptimos. Las plantas sometidas a sequía pueden tener señales de marchitamiento. Por ejemplo, las plantas se pueden someter a un periodo de al menos 15 dias bajo condiciones controladas especificas donde no se proporcione agua, por ejemplo, sin caída de lluvia y/o riego de las plantas.

El término "resistencia mejorada a la sequía" se refiere a plantas que, cuando se producen con una resistencia mejorada a la sequía, cuando se someten a la sequía o estrés por sequía no muestran efectos ni muestran efectos aliviados según se observa en plantas no proporcionadas con una resistencia mejorada a la sequía. Una planta normal tiene algún nivel de resistencia a la sequía. Esto se puede determinar fácilmente si una planta ha mejorado la resistencia a la sequía al comparar una planta control con una planta proporcionada con resistencia mejorada a la sequía bajo condiciones controladas seleccionadas de tal forma que en las plantas control se puedan observar señales de sequía después cierto periodo, es decir cuando las plantas se someten a la sequía o estrés por sequía. Las plantas con resistencia mejorada a la sequía mostrarán menos y/o señales reducidas de haber sido sometidas a la sequía, tales como marchitamiento, en comparación con las plantas control. El experto sabe la forma de seleccionar las condiciones adecuadas tales como por ejemplo, las condiciones controladas en los ejemplos. Cuando una planta tiene "resistencia mejorada a la sequía", es capaz de sostener un crecimiento normal y/o desarrollo normal cuando se someten a sequía o estrés por sequía de lo que de otra manera podría haber dado por resultado en un crecimiento reducido y/o desarrollo reducido de plantas normales. Por lo tanto, "la resistencia mejora a la sequía" es un término relativo determinado al comparar plantas, con lo cual la planta con mayor capacidad para sostener un crecimiento (normal) bajo estrés por sequía es una planta con "resistencia mejorada a la sequía". El experto se dará cuenta de la forma de seleccionar las condiciones adecuadas para determinar la resistencia a la sequía de una planta y la forma de medir las señales de sequías, tal como se describen, por ejemplo, en los manuales proporcionados por el IRRI, Breeding rice for drought prone environments, Fischer et al., 2003, and by the CIMMYT, Breeding for drought and nitrogen stress tolerance in maize: from theory to practice, Banzinger et al, 2000. Se proporcionan, los ejemplos de métodos para determinar la resistencia mejorada a la sequía en plantas Snow and Tingey, 1985, Plant Physiol, 77, 602-7 y Harb et al., Analysis of drought stress in Arabidopsis, AOP 2010, Plant Physiology Review, y como se describe en la sección de ejemplos más adelante .

La presente invención se relaciona con la mejora de resistencia a la sequía de una planta, al afectar la expresión de una proteína UPL3 funcional en la planta. La mejora se relaciona con una planta control, en la cual no se haya introducido o no esté presente esta modificación y en la cual no se afectó la expresión de una proteína UPL3 funcional. En otras palabras, la planta modificada de acuerdo con la invención, está en comparación con la planta control, es decir, una planta no modificada, con mejor capacidad para crecer y sobrevivir bajo condiciones de disponibilidad reducida de agua, privación de agua (temporal) o condiciones de la sequía. Se debe entender que de acuerdo con la invención, modificar, por ejemplo, afectar, la expresión de la proteína UPL3 funcional puede implicar una modificación genética, por ejemplo, de la expresión del gen UPL3, o un intercambio dirigido a nucleótidos.

La modificación genética incluye introducir mutaciones, inserciones, supresiones en la secuencia de ácido nucleico de interés y/o la inserción de estructuras de silenciamiento génico en un genoma de una planta o célula vegetal que se dirija a la secuencia de ácido nucleico de interés. Modificar genéticamente una secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, un gen, que codifica para el ARNm puede no estar relacionado únicamente con la modificación con las secuencias de exones correspondientes a la secuencia de ARNm, sino que también puede implicar mutar las secuencias intrónicas del ADN genómico y/o (otras) secuencias reguladoras génicas de esta secuencia de ácido nucleico, por ejemplo, el gen.

En el contexto de la presente invención, la proteína UPL3 funcional puede ser una proteina que, cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN en Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL4 endógeno interrumpido, tal como una línea At4g38600 interrumpida, por ejemplo, SALK_037636C (http : //www . arabidopsis . org/servlets/TairObj ect?type=stock&id =3501631890) mencionado en la presente, da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN en Arabidopsis thaliana que tenga un gen UPL3 endógeno interrumpido, por ejemplo, una línea At4g38600 interrumpida, por ejemplo, SALK_037636C, en la cual no se expresa la proteína UPL3 funcional.

El término "gen UPL3 endógeno interrumpido" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a un gen UPL3 presente naturalmente en el genoma de una planta que está interrumpido, por ejemplo, interrumpido, por ejemplo, por medio de una inserción de T-ADN en el gen UPL3. La interrupción del gen UPL3 endógeno puede dar por resultado en la ausencia de expresión del gen UPL3 endógeno, y de esta forma en la ausencia de la proteina UPL3 endógena (ya sea funcional o no funcional) .

El término "planta control" en el sentido en el que se utiliza en la presente, se refiere a una planta de la misma especie, de preferencia de la misma variedad, de preferencia del mismo antecedente genético.

La presente invención, también se relaciona con la modulación de la resistencia a la sequía de una planta al modificar la expresión de la proteína UPL3 funcional en la planta. La modulación es con relación a una planta similar (de preferencia de la misma especie y/o variedad, y de preferencia del mismo antecedente genético) en la cual no se haya introducido o no esté presente esta modificación.

En un aspecto, la presente invención proporciona un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, que comprende el paso de afectar la expresión de una proteina UPL en una planta, la proteína UPL comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos uno dominio Pfam HECT de acuerdo con PF00632 y al menos una repetición de la súper-familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371.

En otro aspecto, la invención se relaciona con un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, el método comprende el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional en la planta.

"Afectar la expresión de una proteína UPL3 funcional" en el sentido en el que se utiliza en la presente, puede significar que ha sido afectada la expresión del gen UPL3, y/o que la expresión del gen UPL3 es normal, aunque se inhibe o evita la traducción del ARNm resultante (por ejemplo, mediante interferencia del ARN) , y/o que la secuencia de aminoácidos de la proteína UPL3 se haya alterado de tal forma que se reduzca su actividad ligasa específica de la proteína ubiquitina en comparación con la actividad ligasa específica de la proteína ubiquitina de la proteína como se representa en la SEC ID NO: 2, de preferencia bajo condiciones fisiológicas, en particular condiciones fisiológicas idénticas. Alternativamente, una proteína UPL3 se puede convertir en no funcional o mediante expresión simultánea de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína UPL3, reduciendo con esto su actividad específica. La actividad ligasa específica de la proteína ubiquitina de una proteína UPL3 se puede considerar "reducida" si la actividad ligasa específica de la proteína ubiquitina de esta proteína es estadísticamente significativamente menor que la actividad ligasa específica de la proteína ubiquitina de la proteína como se representa en la SEC ID NO: 2. La actividad ligasa específica de la proteína ubiguitina de una proteína UPL3 por ejemplo, se puede reducir en al menos el 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, o más. La expresión reducida del gen UPL3 endógeno de una planta se puede llevar a cabo al alterar la secuencia de promotores, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida.

Los inventores de la presente creen que afectar la expresión (por ejemplo, al reducir, reprimir o suprimir la expresión y/o actividad) de la proteína UPL3 funcional conduce a la ausencia de un nivel reducido de la proteína UPL3 funcional, ya sea como consecuencia de una baja expresión, por ejemplo, vía interferencia de ARN, o como una secuencia de la actividad/ funcionalidad disminuida de la proteína UPL3, o uno o más de los anteriores, y que la ausencia o nivel reducido de la proteína UPL3 funcional conduce a una necesidad disminuida de agua o una resistencia mejorada a la sequía de la planta.

Las proteínas de ligasa de la proteína ubiquitina (UPL) se sabe que están implicadas en la degradación selectiva de proteínas reguladoras, tanto en levadura como animales (Huibregtse et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 92, 2563-2567; Pickart (2001) Annu. Rev. Biochem. 70, 503- 533) . Las proteínas comprometidas para degradación se modifican con una cadena de múltiples ubiquitinas y luego se reconocen por la proteasoma 26S. Una clase importante de estas proteínas de ligasa de la proteína ubiquitina se forma por los HECT E3, que comprenden un dominio conservado de 350 aminoácidos denominado el dominio HECT en el extremo C-terminal (con base a su homología al término C de la proteína humana E6 asociada (E6-AP) (Huibregtse et al. (1995) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 92, 2563-2567). El dominio HECT incluye una región bastante conservada que circunda la cisteína posicionalmente invariable requerida para catalizar la transferencia de ubiquitina.

De acuerdo con Downes et al. (2003, Plant J 35, 729-742), las plantas también contienen HECT E3s, con siete presentes en Arabidopsis: UPL1, UPL2, UPL3, UPL4, UPL5, UPL6 y UPL7. Downes et al. describen además que UPL1, UPL2, UPL3, UPL4, UPL5, UPL6 y UPL7 pueden estar agrupadas por estructura en cuatro subfamilias con base en las posiciones de introncs/exones de los genes correspondientes, la secuencia y longitud de la proteína, y la presencia de motivos proteínicos adicionales en la dirección 5' del dominio HECT: UPL1/2, UPL3/4, UPL5, y UPL6/7. La presencia de una variedad de dominios en la dirección 5' del dominio HECT sugiere que los miembros individuales de la familia UPL1-UPL7 tienen distintos conjuntos de blancos y funciones (véase Downes et al. 2003 The Plant Journal, 35, 729-742, en particular la figura 1 del mismo, para mayor información sobre las distintas características de las diferentes proteínas UPL) .

En Arabidopsis thaliana, la ligasa 4 de la proteína ubiquitina se puede distinguir de la ligasa 3 de la proteína ubiquitina por ejemplo mediante la ausencia de una región de 225 residuos de 650 aminoácidos a partir del término C de la ligasa 4 de ubiquitina (Downes et al. (2003) Plant J 35, 729-742) .

La ligasa 4 de la proteína ubiquitina como se encuentra en Arabidopsis thaliana se ha reportado mediante otro que tiene aproximadamente 54% de identidad de secuencia de aminoácidos con la ligasa 3 de la proteína ubiquitina (Downes et al. (2003) Plant J 35, 729-742) . El nombre de ubicación de la ligasa 3 de la proteína ubiquitina es At4g38600/At4g38610, y el nombre ORF es F20M13.160/F20M13.170 (ambos de acuerdo con http://www.uniprot.org/uniprot/Q6WWW4) .

La proteína UPL3 de Arabidopsis thaliana constituido por 1888 aminoácidos (como se representa en la SEC ID NO: 2) . El ADNc que codifica para la proteína UPL3 de Arabidopsis thaliana comprende 4506 nucleótidos (representados en la SEC ID NO: 1) .

Una "proteína UPL3" en el sentido en el que se utiliza en la presente comprende la proteina representada en la SEC ID NO: 2, así como los fragmentos y variantes de la misma. Las variantes de una proteína UPL3 incluyen, por ejemplo, proteínas que tengan al menos el 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70¾, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, tal como el 100%, de identidad de la secuencia de aminoácidos, de preferencia con respecto a la longitud total, con la SEC ID NO: 2. La identidad de secuencia de aminoácidos se determina por alineamiento por pares utilizando el algoritmo de Needleman and Wunsch y los parámetros por defecto GAP como se definió anteriormente. Una proteína UPL3 se puede considerar funcional si tiene una actividad de ligasa en la proteína ubiquiti a .

Una planta Arabidopsis thaliana que tenga una inserción T-ADN en el gen que codifica para UPL3 se conoce a partir Downes et al. ((2003) Plant J. 35, 729-742). Este mutante UPL3 muestra un desarrollo de tricomas aberrantes.

En otro aspecto, se proporciona un método para producir una planta que tenga una resistencia mejorada a la sequía, el método comprende el paso de afectar la expresión en la planta de un gen que codifica para una proteína UPL3.

"Expresión afectada", de acuerdo con la presente invención denota la ausencia o presencia reducida de una proteína UPL3 funcional y las variantes de la misma que comprenden una secuencia de aminoácidos con más del 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95 % de identidad de secuencia con la misma. También denota la ausencia de una presencia disminuida de las proteínas descritas en la presente que comprenden al menos un dominio Pfam HECT, PF00632, y al menos una repetición de la súper-familia ARM, modelo SSF48371. Un experto se dará cuenta de los muchos mecanismos disponibles para el mismo en la técnica para impartir la expresión de un gen en por ejemplo el nivel transcripcional o el nivel transduccional .

En otro aspecto, se proporciona un método para aumentar la resistencia a la sequía de una planta, el método comprende el paso de afectar la expresión en la planta de un gen o una proteína, en donde la secuencia de amino ácido (o proteína) codificada por el gen comprende al menos uno dominio Pfam HECT (PF00632) y al menos una repetición de la súper-familia ARM (modelo SSF48371), como se determinará y describirá más adelante. Se debe entender que la frase "al menos una repetición de la súper-familia ARM modelo SSF48371" comprende las cuatro secuencias de repetición de armadillo provenientes del gen UPL3 como se muestra en la SEC ID NO: 1. De esta forma, la frase "al menos una repetición de la súper-familia ARM modelo SSF48371" significa que comprende las cuatro secuencias de repetición de armadillo.

En el sentido en el que se utiliza en la presente "Pfam" o "PFAM" se refiere a una gran colección de múltiples alineaciones de secuencias y modelos Markov ocultos que cubren muchas familias de proteínas comunes, y está disponible de http://pfam.sanger.ac.uk/. La base de datos Pfam contiene una gran colección de familias de proteínas, cada una representada por múltiples alineamientos. Estos alineamientos se han utilizado para constituir modelos Markov ocultos (HMM) para cada familia de dominios proteínicos. Los alineamientos representan las estructuras conservadas evolutivas y la presencia de un dominio en una proteína de interés puede ser indicativa hacia su función biológica. El perfil de modelos Markov ocultos (perfil HMM) constituido a partir de los alineamientos Pfam son útiles para reconocer automáticamente que una nueva proteína pertenece a una familia existente de proteínas, incluso si la homología mediante alineamiento parece ser menor. Otras proteínas en la misma familia de proteínas se identifican al consultar la secuencia de aminoácidos de una secuencia de proteína contra el modelo Markov oculto utilizando el software HMMER. El software HMMER (versión 3.0 de http://hmmer.janelia.org/) es capaz de utilizar este HMM para la búsqueda de una presencia de este dominio en nuevas secuencias. Los éxitos de proteínas candidato potenciales se derivaron al tomar en cuenta sólo los éxitos HMMER en sus secuencias que fueron superiores al umbral de inclusión predeterminado.

La versión Pfam 24.0 (octubre de 2009) contiene alineamientos y modelos para 11912 familias de proteínas (véase, The Pfam protein families datábase: R.D. Finn, et al Nucleic Acids Research (2010) Datábase Issue 38-.D211-222) . Pfam se basa en una base de datos de secuencias denominada Pfamseq, que se basa en el lanzamiento UniProt 15.6 (lanzamiento Swiss-Prot 57.6 y lanzamiento SP-TrEMBL 40.6).

Los alineamientos en la base de datos Pfam representan estructura conservada evolutiva que pueden ser relevantes para una función de la proteína. Los modelos Markov ocultos (HMM) construidos a partir de los alineamientos Pfam son útiles para establecer si una proteína pertenece a una familia existente de proteínas. Esto es incluso el caso si la homología por alineamiento pudiera ser baja. Una vez, por ejemplo, que esté implicada una proteína en un cierto carácter (por ejemplo, sensibilidad a la sequía) se reconoce, y, por ejemplo, el afectamiento de su expresión transmite un rasgo intensificado (por ejemplo, una resistencia aumentada a la sequía) , se pueden identificar por el experto otras proteínas en la misma familia de proteínas al comparar la secuencia de aminoácidos de una proteína (y codificada por un ADN candidato) contra el Modelo Markov Oculto que caracteriza el dominio Pfam (en la presente invención el modelo Pfam HECT PF00632) utilizando el software HMMER (http :/ /hmmer . j anelia . org/ ' versión . HMMER versión 3.0 se lanzó el 28 de marzo de 2010) .

Después de establecer la presencia de un dominio de Pfam HECT (PF00632) como se describió anteriormente, una proteina candidato también tiene que cumplir con el requisito de comprende al menos en una repetición de la súper-familia ARM (modelo HMM SSF48371; http://supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop . cgi?ipid=SSF48371 ) , como se puede establecer mediante, por ejemplo, la utilización de la aplicación InterProScan (htt : //www. ebi . ac . uk/Tools/pfa/ iprscan/ ; Quevillon et al. (2005) 33 (2) W116- 120; E.M. Zdobnov and R . Apweiler (2001) Bioinformatics, 17, 847-848) . Quevillon y colegas describen que el InterProScan es una herramienta que combina diferentes métodos para reconocimiento de firmas proteinicas provenientes de la base de datos de los miembros del consorcio InterPro en un recurso, con distintas bases de datos disponibles al público en la aplicación. La proteina, asi como las secuencias de ADN se pueden analizar. Una versión con base en la web está accesible para organizaciones académicas y comerciales a partir del EBI (http : / /www . ebi . ac . uk/ InterProScan/ ) .

La anotación SUPERFAMILIA se basa en una colección de modelos Markov ocultos, que representan los dominios de proteínas estructurales al nivel de la súper-familia SCOP. Una súper-familia agrupa conjuntamente los dominios que tienen una relación evolutiva. La anotación se produce mediante la exploración de secuencias proteínicas a partir de más de 1,400 genomas secuenciados completamente contra los modelos Markov ocultos.

La totalidad del software se aplica bajo ajustes predeterminados .

En resumen, un modelo Markov oculto para el dominio HECT (modelo PF00G32 http : //pfam. sanger . ac . uk/family?acc=PF00632) se obtuvo de la base de datos Pfam (versión 24 de http://pfam.sanger.ac.uk/) y se colocó en un archivo por separado. El software HMMER se utilizó para determinar que las secuencias de proteínas de aminoácido se caracterizan por el dominio HECT Pfam. Además, el conjunto filtrado de proteínas se redujo adicionalmente al emplear el paquete SuperFamily (utilizando el modelo SSF48371 http: //supfam.org/SUPERFAMILY/cgi-bin/scop.cgi?ipid==SSF48371) de la aplicación InterProScan (http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/iprscan/) para extraer repeticiones ARM.

Las proteínas (vegetales) que cumplen ambos requisitos (que tienen un dominio Pfam HECT PF00632 y una repetición de la súper-familia ARM modelo SSF48371), son proteínas de acuerdo con la invención; y la afectación de la expresión de las mismas puede ser útil para proporcionar una resistencia mejorada/aumenta a la sequía de la planta, y los ejemplos de estas proteínas y el ADNc se describen en la presente. El experto se dará cuenta de la forma para determinar y probar con base en la información proporcionada anteriormente .

Sin estar vinculados por la teoría, los inventores de la presente especulan que la presencia de esta combinación de dominios en la proteína de acuerdo con la invención aumenta la sensibilidad de las plantas a la sequía, y que la afectación de la expresión de estas proteínas que tienen estos dominios, mejora la resistencia de una planta a la sequía.

La afectación a nivel transcripcional puede ser el resultado de la introducción de una o más mutaciones en las secuencias regulatorias de transcripción, entre las que se incluyen las secuencias de promotores, intensificadores, de inicio, de terminación o para eliminación de intrones. Estas secuencias en general están ubicadas en 5', 3' o dentro de la secuencia codificante de los genes de acuerdo con la invención. Independientemente, o al mismo tiempo, la afectación de la expresión también se puede proporcionar mediante supresión, sustitución, redisposición o inserción de nucleótidos en la región codificante de los genes.

Por ejemplo, en la región codificante, los nucleótidos se pueden sustituir, insertar o suprimir conduciendo a la introducción de uno, dos o más codones de paro prematuros. También, la inserción, supresión, redisposición o sustitución puede conducir a modificaciones en la secuencia de aminoácidos codificada, y con esto proporcionar una expresión afectada de la proteína UPL3 funcional. Aún más, se pueden eliminar grandes porciones de los genes, por ejemplo, al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80¾, 90% o incluso el 1001 de la (región codificante) del gen se elimina del ADN presente en la planta, afectando con esto la expresión de la proteína UPL3 funcional .

Alternativamente, se pueden introducir uno, dos, tres o más nucleótidos en el gen o los genes que codifican para una proteína UPL3, ya sea conduciendo a, por ejemplo, un marco de lectura, o conducir a la introducción de una secuencia que codifica para aminoácidos adicionales, o la introducción de una secuencia que no codifica para aminoácidos, o la introducción de grandes insertos, afectando con esto la provisión/expresión de la proteína UPL3 funcional .

En otras palabras, la supresión, sustitución o inserción de nucleótidos en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína UPL3, como se describió anteriormente, pueden conducir a, por ejemplo, un marco de lectura, una introducción de un codón de paro, o la introducción de un codón sin sentido. En particular, la introducción de un codón de paro y la introducción de una mutación del marco de lectura en general se aceptan como formas eficientes para producir una planta interrumpida, es decir, una planta con una expresión y/o actividad reducida, reprimida o suprimida de una proteína específica.

Una mutación de marco de lectura (también denominada como un error de enfoque o un desplazamiento de marco de lectura) es una mutación genética provocada por indels (inserciones o supresiones) de una serie de nucleótidos que no se puede dividir uniformemente entre tres en una secuencia de nucleótidos. Debido a la naturaleza de tripletes de la expresión génica por codones, la inserción o supresión puede cambiar el marco de lectura (el agrupamiento de los codones) , dando por resultado en una traducción completamente diferente de la original. Entre más pronto se presente en la secuencia la supresión o inserción, más alterada será la proteína producida. Una mutación de marco de lectura, en general, provocará que la lectura de los codones después de la mutación codifique para diferentes aminoácidos, aunque puede haber excepciones que resulten de la redundancia en el código genético. Además, el codón de paro ("UAA", "UGA" o "UAG") en la secuencia original no se leerá, y puede resultar un codón de paro alternativo en un sitio anterior o posterior. La proteína producida puede ser anormalmente corta o anormalmente larga.

La introducción de un codón de paro en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína UPL3, como se define en la presente, puede dar por resultado en un paro de transcripción prematuro, que en general da por resultado en una proteína UPL3 truncada, incompleta, y no funcional . De preferencia, el codón de paro se introduce antes en la dirección de transcripción. Entre más pronto se introduzca el codón de paro en la secuencia de nucleótidos, más corta y más alterada será la proteína producida. La introducción de un codón sin sentido en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína UPL3 puede dar por resultado en la transcripción de un ARNm en donde por ejemplo, un codón ya no codifica para el aminoácido como lo hace naturalmente en UPL3, por ejemplo, un codón que normalmente codifica para un aminoácido que es esencial para una proteína UPL3 será funcional. Por lo tanto, esta proteína UPL3 puede no ser funcional .

En otras palabras, la afectación puede comprender la mutación de uno o más nucleótidos en los genes descritos en la presente, dando por resultado ya sea en la presencia de menos o incluso en la ausencia total del producto de expresión proteinica (es decir, la ausencia de la proteina que se podría obtener cuando no se modificaron los genes de acuerdo con la invención como se describió anteriormente) , o en presencia de una proteína no funcional.

Por lo tanto, en una modalidad del método descrito en la presente, la afectación es la consecuencia de una o más mutaciones en el gen dando por resultado en la presencia de menos producto para expresión proteinica o ausencia de un producto para expresión proteinica.

El término inhibición/presencia de menos en el sentido en el que se utiliza en la presente se relaciona con una reducción en la expresión proteinica de al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 99% en comparación con una planta control, en la cual no se altera la expresión. El término "ausencia de la expresión proteinica" se refiere a la ausencia virtual de cualquier producto de expresión, por ejemplo menos del 5%, 4%, 3%, 2% o incluso menos del 1% en comparación con el control.

Como se entenderá por un experto, también se puede introducir una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para UPL3, como se define en la presente, mediante la aplicación de compuestos mutagénicos, tales como metansulfonato de etilo (EMS) u otros compuestos capaces de introducir mutaciones (aleatoriamente) en las secuencias de nucleótidos. Los compuestos mutagénicos o el otro compuesto se pueden utilizar como un medio para crear plantas que alberguen una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína UPL3.

Alternativamente, la introducción de una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína (UPL3) de acuerdo con la invención es efectuado mediante la introducción de ADN de transferencia (T-ADN) en la secuencia de nucleótidos, que codifica para esta proteína, por ejemplo el T-ADN del plásmido inductor de tumores (Ti) de algunas especies de bacterias tales como Agrobacterium turnefaciens . Se puede introducir un elemento de T-ADN en la secuencia de nucleótidos, conduciendo a ya sea una proteína no funcional o a la ausencia de expresión de la proteína, disminuyendo por consecuencia, la necesidad de agua de una planta obtenida mediante el método de acuerdo con la invención (véase, por ejemplo Krysan et al. 1999 The Plant Cell, Vol 11. 2283-2290). Asimismo, se puede aprovechar el uso de una inserción de un elemento susceptible de transposición (véase, por ejemplo, Kunze et al (1997) Advances in Botanical Research 27 341-370 o Chandlee (1990) Physiologia Planta 79(1) 105-115).

De preferencia, introducir una mutación en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteina de acuerdo con la invención se realiza mediante un intercambio dirigido de nucleótidos (TNE) , por ejemplo como se describe en la WO2007073170. Al aplicar TNE, se pueden alterar nucleótidos específicos en una secuencia de nucleótidos que codifica para UPL3, con lo cual, por ejemplo, se puede introducir un codón de paro que por ejemplo puede dar por resultado en una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína truncada de acuerdo con la invención con actividad disminuida o sin actividad.

En otra modalidad, se proporciona un método como se describió anteriormente, en donde la afectación de la expresión de la proteína UPL3 funcional se provoca por la expresión de una proteína no funcional. Como se explicó anteriormente, un experto no tendrá problemas para determinar la funcionalidad de los genes de acuerdo con la invención. Por ejemplo, puede realizar estudios complementarios, al introducir el gen control, sin ninguna modificación, en una planta en la cual se ha afectado la expresión de una proteína de acuerdo con la invención y un estudio de resistencia a la sequía .

Alternativamente, puede realizar experimentos análogos a aquellos experimentos descritos más adelante en los ejemplos, y determinar la resistencia a la sequía en una planta en la cual se introdujeron una o más mutaciones en los genes de acuerdo con la invención, por comparación con una planta control/tipo silvestre adecuada.

La afectación también se puede proporcionar al nivel de traducción, por ejemplo, al introducir un codón de paro prematuro o mediante modificaciones pos-traduccionales que influyen, por ejemplo, en el plegado de la proteína.

Independiente del mecanismo, la afectación de acuerdo con la presente invención se indica por la ausencia o presencia reducida de una proteína UPL3 funcional.

Como se explicó anteriormente el término inhibición de la expresión o presencia reducida, en el sentido en el que se utiliza en la presente se relaciona con una reducción en la expresión de la proteína de al menos el 10¾, 20%, 30¾, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o incluso 99% en comparación con una planta control, en la cual no se afecta la expresión. El término "ausencia de expresión de la proteína" se refiere a la ausencia virtual de cualquier producto de la expresión, por ejemplo menor del 5%, 4%, 3%, 2% o incluso menor del 1¾ en comparación con el control.

De acuerdo con otra modalidad, la afectación se provoca por silenciamiento génico, por ejemplo, con interferencia de ARN o silenciamiento de ARN.

Con la ayuda de métodos de biología molecular disponibles fácilmente para el experto, la afectación de los genes también se puede llevar a cabo mediante silenciamiento génico, por ejemplo utilizando técnicas de interferencia de ARN, ARNds u otras técnicas de silenciamiento de expresión (véase, por ejemplo, Kusaba et. al (2004) Current Opinión in Biotechnology 15:139-143, o Preuss and Pikaard (2003) en RNA Interference (RNAi)~Nuts & Bolts of siRNA Technology (pp.23-36), ©2003 por DNA Press, LLC Editado por: David Engelke, Ph.D.) o, como ya se analizó anteriormente, mediante interrupción .

En otra modalidad preferida, y como ya se analizó anteriormente, se proporciona un método de acuerdo con la invención en donde la afectación se provoca por inserción, supresión y/o sustitución de al menos un nucleótido. Por ejemplo, 1, 2, 3... 10, 40, 50, 100, 200, 300, 1000, o incluso más nucleótidos se pueden insertar, suprimir o sustituir en los genes de acuerdo con la invención. También se anticipan las combinaciones de inserción, supresión y/o sustitución, en las regiones ya sea codificantes o no codificantes del gen.

En otra modalidad del método descrito en la presente, el método comprende el paso de afectar la expresión en la planta de más de 1, por ejemplo 2, 3, 4, 5, o todos los genes que codifican para una proteina UPL3.

En esta modalidad, se afecta la expresión de más de un gen como se describió anteriormente, y se presenta en una planta particular. Por ejemplo, se afecta la expresión de uno, dos, tres, cuatro, o todos los genes que codifican para una proteina UPL3, presente en una planta. Al afectar la expresión de más genes, como se describió anteriormente, al mismo tiempo (cuando están presentes en una planta) incluso se puede alcanzar una mejorada resistencia a la sequía.

En otra modalidad, la planta proporcionada por el método de acuerdo con la invención, se puede utilizar para la producción de plantas adicionales y/o productos vegetales derivados de las mismas. El término "productos vegetales" se refiere a aquellos materiales que se puede obtener del crecimiento de plantas, e incluyen frutos, hojas, órganos de la planta, grasas de la planta, aceites de la planta, almidón de la planta, fracciones proteínicas de la planta, ya sea triturados, molidos o todavía intactos, mezclados con otros materiales, deshidratados, congelados, etc. En general estos productos vegetales, por ejemplo se pueden reconocer por la presencia de un gen como se describe en la presente tan modificado que se afecta la expresión de una proteína funcional, como se analizó anteriormente.

De preferencia, la expresión y/o actividad de la proteina UPL3 acuerdo con la invención se afecta (por ejemplo, reduce, reprime o suprime) en una planta que pertenece a la familia Brassicaceae que incluye Brassica napus (semilla de colza) , familia Solanaceae, incluyendo tomate, o familia Cucurbitaceae, incluyendo melón y pepino, o la familia Poacease incluyendo Oryza, incluyendo arroz, o Zea mays, incluyendo maíz (cereal) , o la Fabaceae incluyendo legumbres, guisantes, o frijoles. De preferencia, el método de acuerdo con la invención se aplica en tomates, arroz, maíz, melón, o pepino, mejorando con esto una planta con menor necesidad de agua o una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta no transformada correspondiente .

También se proporciona una planta, célula vegetal o producto vegetal derivada del mismo que se pueda obtener mediante el método de acuerdo con la invención, y en donde la planta, célula vegetal o producto vegetal muestra una expresión reducida de la proteína UPL3 funcional, en comparación con una planta control no sometida al método de acuerdo con la invención.

También se proporciona una planta, célula vegetal o producto vegetal, derivada del mismo, caracterizado porque en la planta, célula vegetal o producto vegetal derivada del mismo, la expresión de al menos uno, de preferencia todos los genes que codifican para la proteina UPL3, tales como cuando la secuencia de ADNc correspondiente de la secuencia ARNm transcrito de al menos un gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o la ADNc correspondiente a secuencia de ARNm transcrita del gen que comprende la secuencia con al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con la secuencia de la SEC ID NO: 1, de preferencia sobre su longitud total y/o donde la secuencia de aminoácidos codificada por al menos un gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y la secuencia de aminoácidos de secuencias con más de 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con la secuencia de la SEC ID NO: 2 y/o en donde se afecta la secuencia aminoácidos codificada por al menos un gen comprende al menos un dominio Pfam HECT (PF00632) y al menos una repetición de la súper-familia ARM (modelo SSF48371) como se definió anteriormente. De preferencia, la planta no es un mutante para inserción T-ADN de Arabidopsis como se describe en los ejemplos.

En otro aspecto, la invención se dirige al uso de un gen secuencia de nucleótidos en donde el ADNc correspondiente a la secuencia de ARNm transcrita desde el gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 1, o el ADNc correspondiente a secuencia ARNm transcrita del gen comprende la secuencia con al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con las mismas y/o en donde la secuencia de aminoácidos codificada por el gen comprende la secuencia mostrada en la SEC ID NO: 2, y las secuencias de aminoácidos con más del 30%, 35%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% de identidad con las mismas y/o en donde la secuencia de aminoácidos codificada por el gen comprende al menos un dominio Pfam HECT (PF00632) y al menos una repetición de la súper-familia ARM (modelo SSF48371) como se definió anteriormente, para proporcionar una resistencia aumentada a la sequía a una planta.

En esta modalidad, el gen descrito se puede utilizar como un blanco para mejorar la resistencia a la sequía en una planta, de acuerdo con la descripción en la presente, o el gen se puede utilizar para identificar nuevas proteínas implicadas en la sensibilidad y resistencia a la sequía .

En otra modalidad, se proporciona el uso de una secuencia UPL3 que tenga la SEC ID NO: 1 ó 2 de la especie Arabidopsis thaliana en la selección de la resistencia a la sequía en plantas Arabidopsis thaliana. Además, se proporciona el uso en donde la secuencia UPL3 es una secuencia análoga con la SEC ID NO. 1 ó 2 de otra especie de plantas y en donde la selección se realiza en plantas de otra especie vegetal. Además, se proporciona un método para seleccionar plantas o células vegetales con resistencia mejorada a la sequía que comprende los pasos de: proporcionar una población heterogénica de células vegetales o plantas de la especie Arabidopsis thaliana ; proporcionar una secuencia UPL3 que tenga la SEC ID NO: 1 ó 2 ; determinar la secuencia de al menos parte del gen UPL3 de las células vegetales o plantas; comparar las secuencias UPL3 determinadas a partir de las células vegetales o plantas con la secuencia UPL3 proporcionada; identificar las células vegetales o plantas en donde la secuencia UPL3 comprende una mutación.

Alternativamente, en el método, las células vegetales o plantas que se proporcionan son de una especie distinta, y en donde la secuencia de genes UPL3 que se proporciona es una secuencia análoga de la otra especie.

Por lo tanto, al utilizar la secuencia UPL3 de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2 de la especie Arabidopsis thaliana, o una secuencia análoga de la misma proveniente de otra especie, las secuencias UPL3 mutadas se pueden identificar en la especie vegetal que puede proporcionar una resistencia mejorada a la sequía. Una secuencia análoga, en otra especie, de la secuencia UPL3 de la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2 de la especie Arabidopsis thaliana se define como una secuencia que tiene al menos 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, o al menos 99%, de identidad de secuencia con la misma. La proteína UPL3 análoga puede tener sustancialmente la misma función que la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2.

En el método, se proporciona una población heterogénica de células vegetales o plantas de la especie. La población heterogénica, por ejemplo, se puede proporcionar al someter células vegetales a un mutante que introduzca mutaciones aleatorias proporcionando con esto una población heterogénica de células vegetales. Por lo tanto, la población heterogénica se puede derivar de una sola variedad de plantas, que se somete a mutagénesis aleatoria para obtener una variedad de mutaciones en la progenie proporcionando con esto una población heterogénica. Se conocen en la técnica muchos mutágenos, por ejemplo radiación iónica, radiación UV, y productos químicos mutagénicos, tales como azidas, bromuro de etidio o metansulfonato de etilo (EMS) . Por lo tanto, el experto sabe la forma de proporcionar una población heterogénica de plantas o células vegetales. También el experto puede proporcionar una variedad de plantas como una población heterogénica, es decir, no una variedad individual proveniente de una especie. Una variedad de plantas muestran variedad genética, no son genéticamente idénticas, pero provocan que las plantas que provienen de la misma especie sean sustancialmente idénticas. En cualquier caso, una población heterogénica de células vegetales o plantas puede tener al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 98%, 99%, 99.5% o al menos el 99.9% de identidad de secuencia.

Al determinar al menos parte de la secuencia de la secuencia de genes UPL3 con la secuencia de las plantas o células vegetales provenientes de la población heterogénica, y posteriormente comparar estas secuencias con la secuencia de genes UPL3 proporcionada (la referencia) , se pueden identificar que las células vegetales o plantas comprenden una mutación en la secuencia del gen UPL3. Se debe entender que esta comparación se puede realizar mediante el alineamiento de las secuencias y que una mutación es una diferencia con respeto al menos un ácido nucleico o una posición del aminoácido en la secuencia UPL3 análoga (de referencia) de la especie vegetal. De esta forma, las plantas o células vegetales se identifica que tienen mutaciones en el gen UPL3 (por ejemplo, inserciones, supresiones, sustituciones) que puedan proporcionar una resistencia mejorada a la sequía.

De preferencia, se seleccionan plantas que tengan mutaciones que podrían dar por resultado en una afectación de la expresión de una proteína UPL3 funcional, tal como ya se señaló anteriormente. Las mutaciones que podrían afectar la expresión de una proteína UPL3 funcional pueden ser mutaciones que podrían interrumpir el marco de lectura abierto (introducir un marco de lectura o un codón de paro) o interrumpir o de otra manera alterar la función de la proteína codificada al alterar los nucleótidos en los codones que codifican para los aminoácidos que son esenciales para un funcionamiento adecuado de la proteína, conduciendo con esto a una resistencia modificada (por ejemplo, aumentada) a la sequía, en comparación con la proteína no alterada. El método también se puede utilizar, por ejemplo en la investigación y selección de plantas que se hayan sometido a modificación genética que se dirige a la secuencia del gen UPL3 como se señaló anteriormente. También, la secuencia UPL3 se puede utilizar en un ensayo de selección, en el cual una población (heterogénica) de plantas se somete a la sequía. Se pueden proporcionar plantas que muestran una resistencia mejorada a la sequía.

En otra modalidad, se proporciona el uso de al menos parte de UPL3 que tenga la SEC ID NO: 1 o la SEC ID NO: 2 de la especie ñrabidopsis thaliana como un marcador para sembrar plantas Arabidopsis thaliana resistentes a la sequía. También, la secuencia UPL3 puede ser de una secuencia análoga de otra especie en donde el marcador es para sembrar plantas resistentes a la sequía de la otra especie de planta.

La presente invención también pertenece con el uso de una planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tenga un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional para crecimiento bajo condiciones de estrés por sequía, en donde las condiciones de sequía provocan una planta control, una célula vegetal o un producto vegetal en donde no se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional para que muestre signos de estrés por sequía, tales como señales de marchitamiento antes de la planta, célula vegetal o producto vegetal en donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional.

En un aspecto, la presente invención pertenece a una planta, célula vegetal o producto vegetal que se puede obtener o se obtiene mediante el método mostrado en la presente. Adicionalmente , la invención proporciona una semilla derivada de esta planta.

La invención también se relaciona con una planta, célula vegetal, o producto vegetal en donde se afecta la expresión de la proteina UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thalíana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thalíana que tenga un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional. La planta, célula vegetal o producto vegetal, por ejemplo, puede comprender un gen UPL3 endógeno interrumpido .

La planta, célula vegetal o producto vegetal puede ser cualquier planta o célula vegetal, o se puede derivar de cualquier planta, tal como plantas monocotiledóneas o plantas dicotiledóneas, aunque de mayor preferencia la planta pertenece a la familia Solanaceae . Por ejemplo, la planta puede pertenecer al género Solanum (incluyendo lycopersicum) , Nicotiana, Capsicum, Petunia y otros géneros. Se pueden utilizar adecuadamente las siguientes especies hospederas: Tabaco (especies Nicotiana, por ejemplo, N. benthamiana , JV. plumbaginifolia , N. tabacum, etc.), especies vegetales, tales como tomate {Solanum lycopersicum) , tales como por ejemplo, tomate cherry, var. cerasiforme o tomate grosella, var. pimpinellifolium) o árbol de tomate (S. betaceu , syn. Cyphomandra betaceae) , papa {Solanum tuberosum) , berenjena (Solanum melongena) , pepino (Solanum muricatum) Cocona (Solanum sessiliflorum) y naranjilla (Solanum quitoense) , pimientos (Capsicum annuumr Capsicum frutescens, Capsicum baccatum) , especies ornamentales (por ejemplo, Petunia hybrida Petunia axillaries, P. integrifolia) .

Alternativamente, la planta puede pertenecer a cualquier otra familia, tal como a la Cucubitaceae o Gramineae. Las plantas hospederas adecuadas incluyen, por ejemplo, maíz/cereal (especie Zea), trigo (especie Triticum) , cebada (por ejemplo, Hordeum vulgare) , avena (por ejemplo, Avena sativa) , sorgo (Sorghum bicolor) , centeno (Sécale cereale) , soya (Glycine spp, por ejemplo, G. max) , algodón (especie Gossypium, por ejemplo, G. hirsutum, G. barbadense) , Brassica spp. (por ejemplo, B. napus, B. júncea, B. olerácea, B. rapa, etc.), girasol (Helianthus annus) , cártamo, ñame, mandioca, alfalfa (Medicago sativa) , arroz (especie Oryza, por ejemplo, O. sativa indica grupo cultivar o japónica grupo cultivar), pastos para forraje, mijo ( Pennisetum spp. por ejemplo, P. glaucum) , especies arbóreas {Pinus, poplar, fir, plantain, etc.), té, café, aceite de palma, coco, especies vegetable, tales como, guisantes, calabacín, frijoles (por ejemplo, especie Phaseolus) , pepino, alcachofa, espárrago, brócoli, ajo, puerro, lechuga, cebolla, rábano, nabo, coles de Bruselas, zanahoria, coliflor, achicoria, apio, espinaca, endivia, hinojo, remolacha, plantas de frutos frescos (uva, duraznos, ciruelas, fresa, mango, manzana, ciruela, cereza, albaricoque, plátano, mora, mora azul, cítricos, kiwi, higos, limón, lima, nectarinas, frambuesa, sandía, naranja, pomelo, etc.), especies ornamentales (por ejemplo, Rosa, Petunia, Crisantemo, Lily, especie Gerbera) , hierbas (menta, perejil, albahaca, tomillo, etc.), árboles madereros (por ejemplo, especies de Populus, Salix, Quercus, Eucalyptus) , especies de fibra por ejemplo, lino {Linum usitatissimum) y cáñamo (Cannabis sativa), u organisos modelo, tales como Arabidopsis thaliana .

Los hospederos preferidos son "plantas de cultivo", es decir, las especies de plantas que se cultivan y se reproducen por seres humanos. Una planta de cultivo se puede cultivar para fines de alimentación (por ejemplo, campos de cultivos), o para fines ornamentales (por ejemplo, la producción de flores para corte, pastos de césped, etc.) . Una planta de cultivo, como se define en la presente también incluye plantas de las cuales se recolectan productos no alimenticios, tales como, aceite para combustible, polímeros plásticos, productos farmacéuticos, corcho y lo semejante.

De preferencia, la planta, la célula vegetal o el producto vegetal de la invención no es una planta, célula vegetal o producto vegetal de Arabidopsis thaliana o Brachypodi um .

La planta, célula vegetal o producto vegetal de la invención por ejemplo puede ser una planta célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum o Brassica rapa.

De esta forma, la invención pertenece, por ejemplo, a una planta, célula vegetal o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticu spp., Hordeum vulgare, Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, en donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional. La planta, célula vegetal o producto vegetal puede comprender un gen UPL3 endógeno interrumpido.

Todas las referencias mencionadas en la presente se incorporan en la misma como referencia en su totalidad.

E emplos Ejemplo 1 Prueba de la sequía Semillas de Arabidopsis thaliana (At) transformadas con el vector Agrobacterium turnefaciens de pR0K2, gue conduce a la ausencia de la proteina UPL3 funcional (NASC ID: N670558, código AGI At5g38600 y SALK_03 636C; en lo sucesivo denominado como semillas mutantes o plantas mutantes) se obtuvieron de Nottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC, School of Biosciences, University of Nottingham, Sutton Bonington Campus, Loughborough, LE12 5RD Reino Unido) . Como control se utilizaron At Col-0 (Columbia, N60000) ; en lo sucesivo, denominado como semilla o planta control) .

Medio de crecimiento: Se utilizó una mezcla de suelos que comprende una parte de arena y vermiculita y dos partes de composta (arena : vermiculita : composta = 1:1:2) . Esta mezcla aumenta la percolación de agua, y por lo tanto, facilita una absorción uniforme de agua por cada maceta y un mejor drenaje del agua.

Antes de la siembra, las semillas se mantuvieron a 4°C durante 3 días bajo la oscuridad y condiciones de humedad para estratificación.

Las semillas tanto imitantes como control se sembraron en una bandeja rectangular que contiene 8 x 5 = 40 macetas de -4 cm de diámetro con densidad de 5 plantas por maceta. Se suministró una solución de nutrientes (EC = 1.5) a todas las plantas desde el fondo de las macetas en la bandeja 10 días después de la germinación (DAG) , y a 15 DAG las plantas se sometieron a la sequía (durante 15, 16, 17 ó 18 días) al transferir las macetas a bandejas secas. Posteriormente, las plantas se rehidrataron y se observaron para recuperación después de 1 semana.

Se incluyeron tres replicados de macetas de cada genotipo en la selección pre-sequía. El tiempo total necesario para una prueba completa fue de aproximadamente 36-39 dias .

Examen para el análisis de sequía Una vez que las plantas alcanzaron la fase de 2 hojas verdaderas, las mismas se hicieron poco tupidas para mantener exactamente 5 plantas por maceta. A 10 DAG, las plantas recibieron nutrición (EC = 1.5) y a 15 DAG cada maceta se movió a una bandeja seca. Desde este día en adelante, las plantas no recibieron agua. Cada dia las plantas, en especial las control (o tipo silvestre) (Col-0) se observaron para señales de marchitamiento. En el dia 15 de sequía (DOD) , Col-0 se marchitaron totalmente y no se recuperaron con la rehidratación . Se determinó este día como su punto de marchitamiento permanente (PWP) . Desde este día en adelante, se rehidrató un replicado proveniente del mutante y se observó para señales de recuperación y se tomaron fotografías. El mutante mostró una supervivencia durante al menos 2 días más bajo sequía en comparación con el control y se sometió a selección rigurosa adicional.

Ejemplo 2 Prueba de sequía Medio de crecimiento: El mismo mutante y las plantas control como en el Ejemplo 1 se hicieron crecer en una bandeja similar preparada como se describió anteriormente en la prueba de pre-selección. Las plantas se sometieron a estrés al privarlas de agua desde 15 DAG hasta que el control alcanzó su PWP. Durante este período, cada tercer día las macetas se movieron dentro de las bandejas para reducir los efectos de la posición y permitir una evaporación uniforme. En el día 15 DOD, las plantas control alcanzaron el PWP y no se recuperaron con la rehidratación. Un replicado de la macera proveniente del mutante se rehidrató cada dia desde 15 DOD en adelante y se verificó para recuperación o detención por sequía. Se tomaron fotoqrafías y se marco la recuperación. El mutante mostró una recuperación del estrés por sequía durante al menos 3 días más después de que el control alcanzó su PWP .

La figura 1, muestra una fotografía que compara el mutante y el control (izquierda) , demostrando el efecto superior del mutante (columna derecha) con respecto a la resistencia al estrés por sequía.

Ejemplo 3 Prueba de seguía Material vegetal. Se obtuvieron líneas de inserción de TADN con un gen AT4G38600 interrumpido ( SALK_037636C ) a partir del Centro de Reserva de Arabidopsis Stock Nottingham Arabidopsis (NASC) . Las líneas de complementación se produjeron mediante la transformación estable de plantas Arabidopsis thaliana utilizando transformación por solución química floral (Bent et al., 2006. Methods Mol. Biol. Vol. 343:87-103) . Los homólogos del gen UPL4 de Arabidopsis thaliana (AT4G38600) UPL3 se identificaron a partir de diversas especies de cultivo, incluyendo Solanum lycopersicum (tomate) y Oryza sativa (arroz) y la especie modelo Arabidopsis thaliana (UPL4; AT5G02880) .

Tabla 1. Homólogos del gen UPL3 de Arabidopsis thaliana Tabla 2 Porcentaje de identidad de la secuencia de ácido nucleico entre la secuencia de ADNc de UPL3 de Arabidopsis thaliana (SEC ID NO: 1) y secuencias 0 de ADNc de los homólogos en Arabidopsis thaliana (At5g02880 (UPL4); SEC ID NO: 3), Solanum lycopersicum (Slg98247; SEC ID NO: 7 y Slg81026, SEC ID NO: 5), y Oryza sativa (Os05g03100 ; SEC ID NO: 9) (primera columna); y el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácido entre la secuencia de la proteina UPL3 de Arabidopsis 5 thaliana (SEC ID NO: 2) y las secuencias proteinicas de los homólogos en Arabidopsis thaliana (At5g02880 (UPL4); SEC ID NO: 4), Solanum lycopersicum (Slg98247; SEC ID NO: 8 y 5lg81026; SEC ID NO: 6), y Oryza sativa (Os05g03100; SEC ID NO: 10) (segunda columna) . 0 ?.5 Análisis de la sequía. Se sembraron líneas interrumpidas y de complementacion de TADN, tipo silvestre en un diseño de bloque replicado en bandejas de sembrado de 50 células que contuvieron una mezcla 2:1:1 de medio sin tierra Metro-Mix 852, arena fina y vermiculita. Las bandejas plantadas se colocaron a 4°C durante tres días para interrumpir la latencia y luego se transfirieron a una cámara de crecimiento (16 h, 22/20°C, 50% rH) para germinación y establecimiento. Las líneas de complementacion se rociaron con una formulación glufosinato (20 mg de glufosinato, 20 }iL de tensioactivo Silwet, 200 mL de agua) una vez que las cotiledóneas se expandieron totalmente para asegurar que se seleccionaran sólo las líneas transformadas. Después de este tratamiento, las plántulas en cada celda se redujeron a una sola planta. Una vez que las plantas alcanzaron la fase de 4-6 hojas verdaderas se aclimataron a condiciones de mayor déficit de presión por vapor para estimular el estrés por sequía uniforme (28/26°C, 25% rH) e inusualmente las plantas pequeñas se identificaron para retiro antes del tratamiento de sequía. Las bandejas de plantación se empaparon con agua y luego se dejaron secar, dejando todas las células a la capacidad de maceta. Las bandejas enteras se humedecieron una vez que la mitad de las plantas tipo silvestre en cualquier bandejas determinada parecieron estar a su punto de marchitamiento permanente (1.5-2 semanas de tratamiento de sequía) . Se dejó que las plantas se recuperarán durante unos cuantos días y se registró la supervivencia, con las plantas pequeñas anormalmente pre-identificadas omitidas de los análisis adicionales.

Análisis estadístico. Se evaluó la significancia estadística de las diferentes probabilidades de supervivencia durante este tratamiento de sequía al aplicar la prueba de proporciones iguales o proporcionadas en el programa de software estadístico, R (http://www.r-project.org/). Se utilizó la función prop.test para probar la hipótesis nula de que fueron iguales las proporciones de supervivencia de las plantas entre el mutante y tipo silvestre (unilateral), o alternativamente, entre las líneas de mutantes de inserción que contienen o no contienen transgenes complementarios (bilateral) .

Resul tados La figura 2 muestra el fenotipo resistente a sequía del UPL3 interrumpido (mutante de inserción At4g38600 de ñrabidopsis) en comparación con el fenotipo sensible a la sequía de una planta control (tipo silvestre) .

El mutante de inserción At4g38600 de Arabidopsis sobrevivió a la sequía significativamente mejor (p <0.05) que las plantas tipo silvestre (Col-0) o los imitantes de inserción At4g38600 complementados con la secuencia codificante (CDS) de At4g38600 (SEC ID NO: 1; control positivo) y los homólogos provenientes de Arabidopsis thaliana (At5g02880; SEC ID NO: 3), Solanum lycopersicum (SEC ID NO: 5 y SEC ID NO: 7) u Oryza sativa (SEC ID NO: 9). La figura 3, demuestra que una mutación de inserción en el gen UPL3 produce un fenotipo resistente a la seguía. Además, también indica que los homólogos de este gen provenientes de especies monocotiledóneas y dicotiledóneas funcionan para restaurar el fenotipo normal susceptible a la sequía. Por lo tanto, estos homólogos se adquieren para realizan la misma función en la tolerancia a la sequía en sus especies de cultivo respectivos. La observación de que los genes UPL3 tanto de monocotiledóneas como dicotiledóneas pueden restaurar la susceptibilidad a la sequía cuando se insertan en el mutante UPL3 de Arabidopsis sugiere que una actividad reducida de la proteína codificada por el gen UPL3 hace a los fenotipos tolerantes a la sequía en todo el reino vegetal. Por lo tanto, la predicción de UPL3 (con base en investigaciones de homología y un dominio característico [HECT] y las secuencias de repetición armadillo) permitirá la identificación de homólogos de UPL3 vegetales en especies de plantas. Posteriormente, se pueden utilizar métodos bien conocidos para reducir la actividad proteinica de estos homólogos vegetales (por ejemplo, mutagénesis, inserción de TADN o transposones, ARNi, etc.) para obtener plantas resistentes a la sequía. Las barras grises tienen valores significativamente menores (p <0.05) que las barras negras.

Ejemplo 4 Resistencia a la sequía en tomate Material vegetal. A través de selección EMS se generó una mutación novedosa en el gen de tomate Solycl0g055450 (Slg98247; SEC ID NO: 7) utilizando EMS y se identificó. La mutación consistió de un cambio del aminoácido valina (propiedades hidrófobas) a ácido glutámico (aminoácido cargado negativamente) (en la posición 158 de la proteína) . Para todos los experimentos de la sequía se utilizó una población M2 de segregación que contiene homocigotos, heterocigotos y alelos tipo silvestre.

Se identificó una segunda mutación en el mismo gen de tomate, provocando un cambio del aminoácido de ácido aspártico (aminoácido cargado negativamente) a ácido glutámico (aminoácido cargado negativamente) (en la posición 114 de la proteína) . Debido a la similitud en las propiedades bioquímicas, esta mutación fue improbable que provoque cambios significativos en las propiedades proteinicas y por lo tanto se utilizó como un control negativo en los análisis de sequía. El análisis de tamizado (Ng and Henikoff, 2003 -Nucí. Acids Res. 31:3812-3814) mostró que esta mutación probablemente será tolerada. Para todos los experimentos de la sequía se utilizó una población M2 de segregación que contiene homocigotos, heterocigotos y un alelo tipo silvestre .

Análisis de la sequía. Plántulas de tomate que fueron homocigotos, heterocigotos o tipo silvestre para la mutación V158E descrita se hicieron crecer en macetas de plástico de 6.35 cm (2.5 pulgadas) que contuvieron una mezcla 2:01:1 de medio sin suelo Metro-Mix 852, arena fina y vermiculita en una cámara de crecimiento (16 h, 22/20°C, 50% rH) . Con el establecimiento, las plántulas se aclimataron a condiciones de mayor déficit de presión por vapor para estimular una tensión de la sequía uniforme (28/26°C, 25?, rH) . Las macetas se empaparon con agua y luego se dejaron secar, dejando todas las plantas a la capacidad de la maceta. Las plantas se sometieron a un período de estrés por sequía de 1 semana y luego se empaparon y se dejaron recuperar durante 24 h, cuando se evaluó la supervivencia.

Análisis estadístico. Se evaluó la significancia estadística de diferentes probabilidades de supervivencia durante este tratamiento de la sequía al aplicar la prueba de proporciones iguales o proporcionadas en el programa de software estadístico, R (http://www.r-project.org/). Se utilizó la función prop.test para probar la hipótesis nula de que fueron iguales las proporciones de supervivencia de las plantas entre los mutantes homocigotos y tipo silvestre (unilateral) .

Resultados Plantas de tomate, homocigotos para la mutación V158E en Slg98247 sobrevivieron al tratamiento de la sequía significativamente mejor (p <0.1) en comparación con el alelo tipo silvestre, indicando que esta alteración de la proteína conduce a un fenotipo tolerante a la sequía en tomate (figura 4) . Como se esperaba, la mutación adicional en Slg98247 (D114E) no mostró ningún fenotipo relacionado con la sequía (todas las plantas provenientes de la población M2 de segregación fueron igualmente susceptibles a la sequía) .

Claims (19)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES:

1. Un método para producir una planta que tiene una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión de una proteína UPL en una planta, la proteína UPL comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un dominio Pfam HECT de acuerdo con PFC0632 y al menos una repetición de la súper- familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371, y opcionalmente regenerar la planta .

2. Un método para producir una planta que tiene una resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional en una planta, célula vegetal o protoplasto vegetal, en donde la proteína UPL3 funcional comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos 30% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2, y opcionalmente regenerar la planta.

3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque la proteína UPL3 funcional comprende una secuencia de aminoácidos que comprende al menos un dominio Pfam HECT de acuerdo con PF00632 y al menos una repetición de la súper-familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371.

. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2 ó 3, caracterizado porque la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia afectada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción de T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional .

5. Un método para producir una planta que tiene resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión la proteína UPL3 funcional en una planta, célula vegetal o protoplasto vegetal, en donde la proteína UPL3 funcional comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un dominio Pfam HECT de acuerdo con PF00632 y al menos una repetición de la súper-familia ARM de acuerdo con el modelo SSF48371, y opcionalmente regenerar la planta.

6. Un método para producir una planta que tiene resistencia mejorada a la sequía en comparación con una planta control, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional está codificada por una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de ácido nucleico que tiene de al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1, y opcionalmente regenerar la planta.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 5-6, caracterizado porque la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen endógeno UPL3 interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional .

8. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, caracterizado porque el paso de afectar la expresión de la proteína UPL3 funcional comprende mutar una secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína UPL3 funcional .

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque la mutación de la secuencia de ácido nucleico implica una inserción, una supresión y/o una sustitución de al menos un nucleótido.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque el paso de afectar la expresión comprende silenciamiento génico.

11. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-10, caracterizado porque comprende el paso de afectar la expresión de dos o más proteínas UPL3 funcionales en la planta.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado además porque comprende el paso de producir una planta o un producto vegetal proveniente de la planta que tenga resistencia mejorada a la sequía .

13. El uso de una secuencia de aminoácidos que tiene de al menos 30% de identidad con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico que tiene al menos 60% de identidad con la secuencia de ácido nucleico de la SEC ID NO: 1 en la selección para resistencia a la sequía en plantas.

14. El uso de una secuencia de aminoácidos UPL3 que tiene la SEC ID NO: 2 o una secuencia de ácido nucleico UPL3 de la SEC ID NO: 1 en la selección para resistencia a la sequía en plantas de Arabidopsis thaliana .

15. El uso de al menos parte de una secuencia de ácido nucleico UPL3 de la SEC ID NO: 1 o al menos parte de una secuencia de aminoácidos UPL3 de la SEC ID NO: 2 como un marcador para la propagación de plantas de Arabidopsis thaliana resistentes a la sequía.

16. El uso de una proteína UPL3 funcional, de conformidad como cualquiera de las reivindicaciones 2-7 para modular de preferencia aumentar, la resistencia a la sequía de una planta.

17. El uso de una planta, célula vegetal, o producto vegetal, en donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional para crecimiento bajo condiciones de estrés por sequía, en donde las condiciones de estrés por sequía provocan una planta control, célula vegetal o producto vegetal en donde no se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional para mostrar señales de estrés por sequía, tales como señales de marchitamiento más temprano que la planta, célula vegetal o producto vegetal donde se afecta la expresión de la proteína UPL3 funcional.

18. Una planta, célula vegetal, o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum sp . , Hordeum vulgare., Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, en donde se aleda la expresión de la proteína UPL3 funcional, en donde la proteína UPL3 funcional es una proteína que cuando se expresa en una línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido da por resultado en una planta con una resistencia mejorada a la sequía en comparación con la resistencia a la sequía de la línea de inserción T-ADN de Arabidopsis thaliana que tiene un gen UPL3 endógeno interrumpido en el cual no se expresa la proteína UPL3 funcional.

19. Una planta, célula vegetal, o producto vegetal de Solanum lycopersicum, Gossypium hirsutum, Glycine max, Triticum spp., Hordeum vulgare., Avena sativa, Sorghum bicolor, Sécale cereale, o Brassica napus, de conformidad con la reivindicación 18, que comprende un gen UPL3 endógeno interrumpido .