MX2014007474A - Celulas madre pluripotentes inducidas preparadas a partir de celulas derivadas de riñon humano. - Google Patents

Abstract

Se ha descrito una célula madre pluripotente inducida y el método para preparar la célula madre pluripotente inducida a partir de una célula derivada de riñón humano; más particularmente, se ha descrito una célula iPS derivada de riñón humano que puede diferenciarse en células de linajes de ectodermo, mesodermo y endodermo.

Description

CÉLULAS MADRE PLURIPOTENTES INDUCIDAS PREPARADAS A PARTIR DE CÉLULAS DERIVADAS DE RIÑÓN HUMANO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se relaciona con celulas madre pluripotentes inducidas. Más particularmente, la invención se relaciona con la reprogramación de células derivadas de riñón humano (hKDC) para convertirlas en células madre pluripotentes inducidas (iPS).

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) han generado interés para aplicarse en medicina regenerativa, ya que permiten la generación in vitro de progenitores específicos de pacientes que tienen un valor potencial para terapia celular (Takahashi, K. y Yamanaka, S., Cell 126, 663-76 (2006)). Sin embargo, en muchos casos, sería deseable un método estándar, tal como para terapia celular de afecciones agudas o cuando las células somáticas del paciente se alteran como consecuencia de una enfermedad crónica o del envejecimiento. La expresión ectópica de factores de pluripotencia y oncogenes mediante el uso de métodos virales integrativos es suficiente para inducir pluripotencia en fibroblastos de ratón y de seres humanos (Takahashi, K. y Yamanaka, S., Cell 126, 663-76 (2006); Takahashi, K. y otros, Cell 131,861-72 (2007); Hochedlinger, K. y Plath, K., Development 136, 509-23 (2009); Lowry, W. E. y otros, Proc NatlAcad Sci USA 105, 2883-8 (2008)). Sin embargo, este proceso es lento, ineficiente, y la integración permanente de los vectores en el genoma limita el uso de celulas iPS para aplicaciones terapéuticas (Takahashi, K. y Yamanaka, S., Cell 126, 663-76 (2006)). Otros estudios han demostrado que la edad, el origen y el tipo de célula usada tienen un profundo impacto sobre la eficiencia de reprogramación. Recientemente, se demostró que la transducción retroviral de queratinocitos humanos dio como resultado la reprogramación a un estado pluripotencial, que fue 100 veces más eficiente y dos veces más rápida en comparación con fibroblastos. Se planteó la hipótesis de que estas diferencias podrían ser el resultado de la expresión endógena de KLF4 y c-MYC en la población de queratinocitos de partida y/o la presencia de un conjunto de células progenitoras indiferenciadas que presentan un estado epigenético más sensible a la reprogramación (Lowry, W. E. y otros, Proc NatlAcad Sci USA 105, 2883-8 (2008)). Esta última hipótesis ha sido apoyada, además, por otros estudios en ratones. (Silva, J. y otros, PLoS BioiB, e253 (2008); y Eminli, S. y otros, Stem Cells 26, 2467-74 (2008)). Sin embargo, las células madre son, generalmente, escasas y difíciles de obtener y aislar en grandes cantidades (por ejemplo, células madre neurales) (Kim, J. B. y otros, Cell 136, 411-9 (2009); Kim, J. B. y otros, Nature 454, 646-50 (2008)).

Las células iPS derivadas de riñón humano representan un suministro viable de células pluripotentes para varias aplicaciones. Por ejemplo, las células iPS obtenidas de pacientes que padecen trastornos genéticos de riñón u otros trastornos renales se pueden usar para construir modelos de la enfermedad con el fin de comprender el desarrollo de esta. Las celulas iPS derivadas de riñón humano pueden diferenciarse en células renales y en hepatocitos para terapias de trasplante y reemplazo celular en enfermedades renales y hepáticas, respectivamente. Adicionalmente, las células renales y los hepatocitos diferenciados a partir de células iPS derivadas de riñón humano son ideales para seleccionar compuestos a fin de evaluar su eficacia y toxicología con respecto a afecciones y enfermedades específicas del riñón y el hígado.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente descripción, se describe una célula madre pluripotente inducida preparada por reprogramación de una célula derivada de riñón humano, en donde la célula derivada de riñón humano es positiva para la expresión de HLA-I y CD 44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, cadherina-11 , FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativa para la expresión de CD133 y E-cadherina y al menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 o GATA-4.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1. Morfología de células iPS derivadas de riñón humano obtenidas a partir de la transducción de hKDC con OCT4, SOX2, KLF4 y c- MYC de origen humano. Los clones se muestran sobre una capa de celulas allmentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en el pase 1.

Figura 2. Morfología de células iPS derivadas de riñón humano obtenidas a partir de la transducción de hKDC con OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC y ARNhc para p53, todos de origen humano. Los clones se muestran sobre una capa de células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) en el pase 1.

Figura 3. Células iPS derivadas de riñón humano (clon RV4-5) cultivadas sobre MATRIGEL y con tinción para fosfatasa alcalina (ampliación de 4x).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En la presente descripción se describe la reprogramación de células derivadas de riñón humano (hKDC) a un estado de pluripotencia por transducción retroviral de cuatro factores de transcripción (OSKM) con o sin la regulación descendente de p53. Al usar los métodos y composiciones descritos en la presente descripción, las hKDC se reprograman en pluripotentes por transducción retroviral con OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC. Las hKDC reprogramadas resultantes tienen las características de una célula madre pluripotente inducida (¡PS).

En una modalidad, se prepara una célula madre pluripotente inducida (iPS) a partir de una célula derivada de riñón humano, denominada, en la presente descripción, celula ¡PS derivada de riñón humano. Las hKDC se reprogramaron mediante la expresión forzada de los factores de reprogramación en presencia o ausencia de ARNhc para p53. Las células reprogramadas se caracterizaron por morfología, tinción para fosfatasa alcalina, expresión de marcadores de pluripotencia, metilación de promotores específicos y expresión de marcadores específicos de la capa germinal.

Las hKDC son una población única de células aisladas de tejido renal cadavérico humano. Los métodos para aislar las hKDC se describen en la publicación de patente pendiente de los Estados Unidos núm. 2008/0112939, incorporada en su totalidad como referencia en la presente descripción. Brevemente, estas células se aislaron por la obtención de tejido de la región subcapsular, de la corteza o de la médula de un riñón de mamíferos. El tejido fragmentado de riñón se incubó en presencia de una metaloproteasa, una proteasa neutra o una enzima mucolítica, y las células se cultivaron en placas en un recipiente para cultivo de tejidos.

La población de células derivadas de riñón humano aislada o purificada es capaz de autorrenovarse y expandirse en el cultivo. La población de células es positiva para la expresión de HLA-I y CD 44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1 , Pax-2, cadherina-11 , FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativa para la expresión de CD133 y E-cadherina y al menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 o GATA-4.

Adicionalmente, las células son positivas para la expresión de al menos uno de los marcadores de la superficie celular CD24, CD29, CD49c, CD73, CD90, CD166 o SSEA-4; y negativas para al menos uno de los marcadores de la superficie celular HLA II, CD31, CD34, CD45, CD56, CD80, CD86, CD104, CD105, CD117, CD138 y CD141.

La población de celulas derivadas de riñón humano secreta al menos uno de los factores tróficos FGF2, HGF, TGFa, TIMP-1 , TIMP-2, MMP-2 o VEGF; y no secreta al menos uno de los factores tróficos PDGF-bb o IL12p70.

Las hKDC se pueden reprogramar mediante el uso de téenicas de reprogramación convencionales que incluyen técnicas virales, tales como adenoviral, lentiviral y retroviral; químicas, tales como la mímica de moléculas pequeñas; proteínicas, tales como proteínas recombinantes; de ARN, tales como microARN y ARN mensajero (ARNm); y vectores.

En una modalidad, las hKDC se reprogramaron mediante el uso de métodos de reprogramación viral. En una modalidad, las hKDC se transfectaron con retrovirus murinos de VSVg que portan, individualmente, los factores de transcripción humanos constitutivamente expresados OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC. Brevemente, las hKDC se cultivaron en placas en una placa de 6 pocilios, a 1x105células por pocilio en medio de crecimiento epitelial renal (REGM) y se incubaron durante toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. Para las transfecciones virales, se preparó, para cada pocilio, un medio de transducción que tiene los cuatro constructos retrovirales murinos de VSVg (OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC) y un agente para aumentar la eficacia de la transfección. Se aspiró el medio de los pocilios, se adicionó el medio de transducción, y se incubó toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. Esta etapa de transducción se repitió al día siguiente y después de la incubación de toda la noche; el medio de transducción se reemplazó con REGM. Se dejó que las células se incubaran por otros cuatro días con REGM reemplazado cada dos días.

Opcionalmente, el medio de transducción incluyó, además, el retrovirus murino de VSVg que porta el p53-ARNhc. Anteriormente se ha demostrado que la inhibición de p53 aumenta la eficiencia de reprogramación de tipos específicos de células, presumiblemente, al desacelerar la proliferación celular (Zhao Y y otros, (2008) Cell Stem Cell 3: 475-479; Sarig, R., y otros, J. Exp. Med. 207: 2127-2140 (2010)). Después, se cultivaron las hKDC transfectadas y se observaron para detectar la aparición de la morfología clásica de las células iPS. La morfología clásica de las células iPS hace referencia a la formación de colonias de células muy compactas que son refractivas o “brillantes” bajo microscopía lumínica, con bordes muy afilados y bien definidos. Las células que exhiben la morfología clásica de células iPS se aislaron, subcultivaron y expandieron para proporcionar células iPS derivadas de riñón humano.

En otra modalidad, las hKDC se reprogramaron mediante el uso de ARNm que codifica para los factores de transcripción OCT4, KLF4, SOX2, C-MYC y LIN28. Brevemente, las hKDC se cultivaron en placas en una placa de 6 pocilios con REGM y se incubaron durante toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. Para las transfecciones con ARNm, se preparó un complejo de transfección de ARNm que contiene los cinco ARNm humanos (OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC y LIN28) y un agente para aumentar la eficiencia de la transfección. Se aspiró el medio REGM de los pocilios, se agregó medio de transducción, despues de cuatro, el medio de transducción se reemplazó con un medio de reprogramación y se incubó durante toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. Esta etapa de transducción se repitió diariamente durante dieciséis días. Se supervisaron las células para detectar colonias de células iPS, y el medio se renovó todos los días.

Para evaluar si las células iPS están completamente reprogramadas, se usan varios criterios que incluyen la morfología (como se describió anteriormente), la tinción para fosfatasa alcalina, la expresión de marcadores de pluripotencia, la metilación de promotores específicos y la expresión de marcadores específicos de la capa germinal. La expresión de factores de pluripotencia clave (OCT4, NANOG) y antígenos específicos (SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81) de la superficie de células madre embrionarias se ha usado rutinariamente para identificar células humanas completamente reprogramadas. En el nivel funcional, las células iPS demuestran, además, la capacidad para diferenciarse en linajes de las tres capas germinales embrionarias.

La célula iPS derivada de riñón humano preparada con los métodos descritos en la presente descripción se caracterizó por pluripotencia. Estas células, que exhiben la morfología clásica de las células iPS, son capaces de autorrenovarse, expresan los marcadores de pluripotencia clave (TRA1-60, TRA1-81, SSEA3, SSEA4 y NANOG), demuestran la diferenciación en linajes de las tres capas germinales y muestran un cariotipo normal.

Las celulas ¡PS derivadas de riñón humano representan una fuente adecuada de células pluripotentes para la medicina regenerativa. Con esta teenología, ahora es posible generar células pluripotentes en grandes cantidades. Otro beneficio importante es el potencial para obtener células ipS derivadas de riñón humano específicas para enfermedades a partir de pacientes con enfermedades renales genéticas, tales como la enfermedad renal poliquística (PKD) y el síndrome de Alport. Las células reprogramadas derivadas de pacientes con PKD y síndrome de Alport que mantienen indefinidamente el genotipo y fenotipo de la enfermedad podrían usarse para construir modelos de la enfermedad y seleccionar compuestos dirigidos a modificar anormalidades epigenéticas y/o de transcripción, reguladores importantes de estos trastornos genéticos. Adicionalmente, estas líneas de iPS derivadas de pacientes con PDK y síndrome de Alport se podrían generar para corregir el defecto genético identificado en las células.

Las hKDC que se han diferenciado en células similares a los hepatocitos tienen gran potencial terapéutico para la medicina regenerativa y para las enfermedades hepáticas. La falla hepática aguda (ALF) es un síndrome clínico devastador que produce aproximadamente 2000 casos por año en los Estados Unidos y está asociado con una mortalidad que llega al 80 %. Actualmente, el trasplante hepático ortotópico es la única terapia disponible que muestra índices de supervivencia de 70 % a 85 %. Una terapia celular podría ser una solución potencial, ya que el trasplante celular que usa hepatocitos primarios se ha empleado con éxito en modelos humanos y de roedores. Los hepatocitos derivados de celulas iPS derivadas de riñón humano representan una fuente potencial de células trasplantabas para promover la función hepática normal en hígados enfermos.

La invención se explica adicionalmente en la descripción que sigue con referencia a las figuras que ilustran, por vía de ejemplos no limitantes, varias modalidades de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1. Reproaramación viral de las hKDC en células iPS Las hKDC obtenidas de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0112939 se transdujeron con constructos retrovirales de Stemgent, Inc. (San Diego, CA), específicamente, retrovirus murinos de VSVg que incluyen, individualmente, los factores de transcripción humanos constitutivamente expresados (OCT4, SOX2, KLF4 y c-MYC) con o sin retrovirus murino de VSVg que contiene p53-ARNhc.

Los retrovirus murinos se produjeron con células empaquetadoras de retrovirus 293-gp2 que se cultivaron en placas un día antes de la transfección sobre placas de 6 centímetros a una densidad de 3x106 células por placa y se incubaron toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. Después, cada placa se transfectó con 3 microgramos de un solo vector pMX (Sox2, Oct4, cMyc o Klf4, o p53-ARNhc), 1 microgramo de VSV-g y 16 microlitros del agente de transfección que se vende con el nombre comercial de FUGENE HD (Roche Applied Bioscience, Indianapolis, IN, número de catálogo 04709705001) de conformidad con el protocolo estándar del fabricante. Los virus se recolectaron 48 horas después de la transfección y se filtraron a través de un filtro de 0.45 mieras antes del uso.

Las hKDC se descongelaron y cultivaron para un pase antes de la transducción. Un día antes de la transducción, las hKDC se trataron con tripsina y se cultivaron en placas en dos pocilios de una placa de 6 pocilios a 1x105 células por pocilio en 2 milímetros de medio de crecimiento epitelial renal (REGM, Lonza LTD. Corporation, Walkersville, Inc., Walkersville, MD) por pocilio. Las células se incubaron durante toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. En el día 1 , se preparó 2.5 mililitros de medio de transducción para cada pocilio que contiene 500 microlitros de cada virus recién preparado (OCT4, KLF4, SOX2 y C-MYC) y 4 nanogramos/mililitro de Polybrene. Se aspiró el medio de cultivo de los pocilios, se agregó el medio de transducción y se incubó toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. En el día 2, se repitió la etapa de transducción viral. En el día 3, se eliminó el medio de transducción y se reemplazó con REGM. Los medios se renovaron cada dos días hasta el día 7.

Para controlar la formación de colonias de células iPS o reprogramadas, las hKDC transducidas se recolectaron por tratamiento con tripsina, se resuspendieron en el medio de cultivo que se vende con el nombre comercial de STEMEDIUM NUTRISTEM (Stemgent, Inc., Cambridge, MA, número de catálogo 01-0005) complementado con otros 20 nanogramos/mililitro de factor básico de crecimiento de fibroblastos (bFGF) (medio iPS-Nu) o medio de células madre embrionarias humanas que contiene sustitución de suero de inactivación génica estándar (KSR) con 20 nanogramos/mililitro de bFGF (medio iPS-KSR) y, después, se cultivaron en placas sobre una placa con células alimentadoras de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) o recubierta con una matriz de membrana basal que se vende con el nombre comercial de MATRIGEL (BD Biosciences, Chicago, IL, número de catálogo 354277) a una concentración de 1x104 células por pocilio en una placa de 6 pocilios. El medio se cambió por medio de células ¡PS fresco cada dos días durante la primera semana y diariamente durante las semanas 2 a 6. Las placas se revisaron diariamente para identificar colonias de células iPS.

Las colonias que exhiben la morfología “clásica” de células iPS o reprogramadas se recolectaron manualmente de las placas de células alimentadoras de MEF y se sembraron en un solo pocilio de una placa de células alimentadoras de MEF de 12 pocilios. El medio de cultivo se renovó diariamente. Después de 4-6 días, las colonias se recolectaron manualmente de las placas de 12 pocilios y se expandieron en placas de 6 pocilios. El medio de cultivo se renovó diariamente y se dividió manualmente 1:3 cada 4-6 días. Las células de cada pocilio se congelaron en varias etapas con un medio de congelamiento que se vende con el nombre comercial de CRYOSTEM (Stemgent, Inc., número de catálogo 01-0013).

Resultados La reprogramación de las hKDC con los retrovirus que expresan los cuatro factores de reprogramación produjo colonias que exhiben la morfología de celulas iPS. Se recolectaron manualmente doce colonias reprogramadas obtenidas de la transducción viral con los cuatro factores de reprogramación, que se indican como RV4 seguidos del número de colonia, y de estas colonias, 6 se expandieron y congelaron (Figura 1). Para la reprogramación de las hKDC con los factores de reprogramación y el ARNhc para p53, que se indican como RV5 seguido del número de colonia, se recolectaron manualmente 12 colonias y 6 se expandieron y congelaron (Figura 2).

Ejemplo 2. Expresión de marcadores de pluripotencia Se evaluaron las células iPS derivadas de riñón humano preparadas en el Ejemplo 1 para detectar la expresión de marcadores de pluripotencia por téenicas de inmunocitoquímica. Después de fijar las colonias en paraformaldehído al 4 %, se realizó la tinción inmunofluorescente para marcadores de pluripotencia con los reactivos de anticuerpos mostrados en la Tabla 1 (todos los anticuerpos se obtuvieron de Stemgent, Inc.).

Tabla 1 Resultados Se evaluaron dos clones representativos de células iPS derivadas de riñón humano para expresión de marcadores de pluripotencia. Ambos clones de células iPS derivadas de riñón humano sometidos a prueba, RV4-5 y RV5-1 , expresan los marcadores TRA1-60, TRA1-81, SSEA3, SSEA4 y NANOG. Estos marcadores no se detectaron en las hKDC iniciales. La expresión de estos marcadores indica pluripotencia de las células iPS derivadas de riñón humano.

Ejemplo 3. Análisis de metilación de los promotores de Oct4. Nanoq v Sox2 Se analizaron las células iPS derivadas de riñón humano preparadas en el Ejemplo 1 , clones RV4-5 y RV5-1 , para determinar el estado de metilación de las regiones de los promotores de Oct4, Nanog y Sox2 mediante el uso del método de secuenciación con bisulfito; el análisis fue realizado por Seqwright, Inc. (Houston, TX). El método de bisulfitos es la téenica más comúnmente usada para identificar patrones específicos de metilación dentro de una muestra de ADN. El metodo consiste en tratar el ADN con bisulfito, que convierte las citosinas no metiladas en uracilo, pero no cambia las citosinas metiladas. Se usa para análisis de todo el genoma o específico de sitios.

Se examinaron regiones de los promotores de Oct4, Nanog y Sox2 de aproximadamente 100 a 500 pb de longitud para identificar patrones de metilación. El ADN (ver la Tabla 2) se preparó con el estuche de extracción de ADN que se vende con el nombre comercial de DNeasy (Qiagen, Inc., Valencia, CA, número de catálogo 69506) y se envió a Seqwright, Inc. para el análisis.

Tabla 2 Resultados: La Tabla 3 resume los resultados obtenidos del análisis de metilación de las regiones de los promotores. Dentro de las regiones analizadas, no se detectaron sitios de metilación dentro de las regiones de los promotores de Nanog y Sox2. Para la región del promotor de Oct4, se detectaron 7 sitios de metilación. Ambos clones de células iPS derivadas de riñón humano mostraron un cambio en la metilación de estos 7 sitios con respecto a las células Iniciales. Los cambios en el patrón de metilaclón con respecto a las células iniciales es una característica de las células iPS.

Tabla 3 Ejemplo 4. Tinción de fosfatasa alcalina La pluripotencia de las células iPS derivadas de riñón humano preparadas en el Ejemplo 1 , clon RV4-5, se evaluó, además, por tinción de fosfatasa alcalina (AP) y se realizó con un estuche de detección de fosfatasa alcalina (Millipore Corporation, Billerica, MA, número de catálogo SCR004). Las células iPS derivadas de riñón humano se cultivaron en placas sobre placas de 24 pocilios y se mantuvieron en un incubador a 37 °C. Después de 3-5 días, el medio de cultivo se aspiró de los pocilios, y las células se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 1-2 minutos. Se eliminó el fijador, y las células se lavaron con 1 mililitro de regulador de enjuague 1x. Después, el regulador de enjuague se reemplazó con 0.5 mililitros de mezcla de reactivos de tinción y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. El reactivo de tinción se preparó al mezclar los componentes del estuche “fast red violet” (FRV) y solución de naftol AS-BI fosfato con agua en una relación de 2:1:1 (FRV:Naftol:agua) en un tubo cubierto con una hoja delgada de aluminio. Se eliminó el reactivo de tinción, y las celulas se lavaron una vez con 1 mililitro de regulador de enjuague 1x y, después, se incubaron en 0.5 mililitros de PBS. Se capturaron imágenes de las células teñidas con un fotomicroscopio. Las células que exhiben actividad AP aparecen de color púrpura.

Resultados Como se muestra en la Figura 3, las células iPS derivadas de riñón humano, clon RV4-5, exhibieron tinción positiva para fosfatasa alcalina que es indicativa del estado pluripotente.

Ejemplo 5. Diferenciación en linajes de las tres capas germinales Se evaluó la capacidad de diferenciación de las células iPS derivadas de riñón humano preparadas en el Ejemplo 1, clon RV5-1, en linajes ectodérmicos, mesodérmicos y endodérmicos, al inducir la formación del cuerpo embrioide y realizar la tinción para detectar marcadores específicos de las tres capas germinales.

Los cuerpos embrioides se generaron con placas de agolpamiento, comercializadas con el nombre de AGGREWELL 400 (STEMCELL Technologies, Inc., Vancouver, Canadá, número de catálogo 27940). Las células se disociaron enzimáticamente con una solución de separación celular que se vende con el nombre comercial de ACCUTASE (STEMCELL Technologies, Inc.), se resuspendieron en medio acondicionado de MEF (GlobalStem, Incorporated, Rockville, MD número de catálogo GSM-9100) complementado con 100 nanogramos/mililitro de bFGF, y el recuento celular se realizó por tinción de azul tripán mediante el uso de un hemocitómetro. Para inducir la formación de cuerpos embrioides, se agregaron de 0.5 a 1 millón de celulas a cada pocilio de una placa AGGREWELL 400, y la placa se centrifugó a 1000 rpm durante 5 minutos para capturar las células en los micropocillos. Después de la incubación a 37 °C en 5 % de CO2 y 95 % de humedad por 24 horas, los cuerpos embrioides se recolectaron por aspiración, y la suspensión se pasó a través de un filtro celular invertido de 40 mieras puesto encima de un tubo cónico de 50 mililitros para eliminar las células individuales. Los conglomerados celulares quedaron encima del filtro celular invertido y se recolectaron al quitarlos del filtro celular por lavado con medio acondicionado de MEF. Después, los cuerpos embrioides se colocaron en placas de grupos mínimos. El medio se cambió a una mezcla de 1:1 de medio acondicionado de MEF y DMEM/F12 después de 24 horas y se mantuvo en cultivo durante 7 días antes de la tinción para marcadores de diferenciación de la capa germinal.

El análisis de inmunocitoquímica de las células iPS derivadas de riñón humano diferenciadas se realizó al fijar las células en formaldehído al 4 % en solución salina tamponada con fosfatos (PBS), pH de 7.4, durante 15- 20 minutos a temperatura ambiente y lavado con PBS helada. Las células se incubaron con suero normal de burro o cabra al 10 % en PBS a temperatura ambiente durante una hora para bloquear la unión no específica de los anticuerpos. Despues, las células se incubaron en el anticuerpo específico (Tabla 4) en suero de cabra al 10 % en PBS en una cámara humidificada durante 2 horas a temperatura ambiente o durante toda la noche a 4 °C. Las células se lavaron con PBS y, después, se incubaron con el anticuerpo secundario durante 1.5-2 horas a temperatura ambiente en la oscuridad. Después de lavar las células con PBS, los núcleos celulares se hicieron visibles al incubar las células en 0.1-1 microgramos/ mililitro de API (tinción de ADN, dilución 1:10000) durante 2 minutos. Después de un lavado final con PBS, las células se procesaron para microscopía de inmunofluorescencia.

Resultados Las células iPS derivadas de riñón humano se tiñeron con anticuerpos para nestina, alfa-actina de músculo liso (alpha-SMA) y alfafetoproteína 1(AFP1) para evaluar la diferenciación en los linajes del ectodermo, mesodermo y endodermo, respectivamente. La célula iPS derivada de riñón humano, clon RV5-1, expresó estos marcadores de capa germinal despues de la formación del cuerpo embrioide, lo que indica que estas células tienen la capacidad de diferenciarse en células de estas capas germinales.

Ejemplo 6. Diferenciación en linaje hepático La diferenciación de células iPS derivadas de riñón humano preparadas en el Ejemplo 1 en células del linaje hepático se realizó mediante el uso de las modificaciones de los protocolos publicados (Hay, D. y otros, Proc Nati Acad Sci USA. 105(34): 12301 -6 (2008)).

Las células ¡PS derivadas de riñón humano, clon R4-5, separadas de la capa de células alimentadoras se cultivaron en MATRIGEL y mantuvieron en medio acondicionado de fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) (GlobalStem, Incorporated, número de catálogo GSM-9100) que contiene 100 nanogramos/mililitros de bFGF (Millipore Corporation, Billerica, MA, número de catálogo GF003). Se incluye el inhibidor de Rho quinasa (ROCK), 10 uM, (EMD Chemicals, Inc., Gibbstown, NJ, número de catálogo 668000), en el medio de cultivo solamente el primer día después del pase.

Cuando las células iPS derivadas de riñón humano alcanzaron aproximadamente 50-70 % de confluencia, el medio acondicionado de MEF se reemplazó con medio RPMI1640 (Invitrogen Corporation, número de catálogo 21870092) que contiene una concentración de 1x de un suplemento libre de suero que se comercializa con el nombre de B27 SUPPLEMENT (Invitrogen Corporation, número de catálogo 17504044), 2 mM de la L- glutamina alternativa comercializada con el nombre de GLUTAMAX (Invitrogen Corporation, número de catálogo 35050-061), 100 nanogramos/mililitro de activina A (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, número de catálogo 338-AC-050) y 50 nanogramos/mililitro de Wnt3a (R&D Systems, Inc., número de catálogo 5036-WN-010) durante 72 horas.

Despues, las células se dividieron 1:2 en placas nuevas recubiertas con MATRIGEL y se cultivaron en medio de diferenciación: inactivación génica-medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen Corporation, número de catálogo 10829-018) que contiene 20 % de sustitución de suero (SR; Invitrogen Corporation, número de catálogo 10828010), L-glutamina alternativa GLUTAMAX, 1 mM, 1 % de aminoácidos no esenciales (Invitrogen Corporation, número de catálogo 11140050), beta-mercaptoetanol, 1 mM, (Sigma-Aldrich, número de catálogo M7522) y 1 % de sulfóxido de dimetilo (DMSO) (Sigma-Aldrich, número de catálogo S2650), durante 7 días. Por último, las células se cultivaron en medio de maduración: medio L15 de Leibovitz (Invitrogen Corporation, número de catálogo 11415) complementado con 8.3 % de suero fetal bovino comercializado con el nombre de HYCLONE FBS (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA, número de catálogo SH30070.031), 8.3 % de caldo triptosa fosfato (Sigma-Aldrich, número de catálogo T8159), hidrocortisona 21-hemisuccinato, 10 uM, (Sigma-Aldrich, número de catálogo H2882), insulina, 1 uM, (Sigma-Aldrich, número de catálogo I9278), L-glutamina alternativa GLUTAMAX, 2 mM, 10 nanogramos/mililitro de factor de crecimiento de hepatocitos (HGF; R&D Systems, Inc., número de catálogo 294-HG-005) y 20 nanogramos/mililitro de oncostatina M (OSM; R&D Systems, Inc., número de catálogo 295-OM-010) durante 7 días. El medio se renovó diariamente durante la diferenciación.

La expresión de marcadores hepáticos se evaluó por qPCR. El ARN se preparó al usar un estuche de extracción de proteínas y ARN comercializado con el nombre de AllPrep RNA/Protein Kit (Qiagen, Inc., número de catálogo 80404), de conformidad con las instrucciones del fabricante. La cantidad de regulador de lisis usada para las celulas cultivadas en placas de 6 pocilios se calculó correspondientemente.

Para preparar muestras para qPCR, la extracción del ADN genómico se realizó de conformidad con las instrucciones del fabricante. La síntesis del ADNc se realizó con 0.5 microgramos del ARN total aislado de células iPS derivadas de riñón humano o células diferenciadas mediante el uso del estuche de síntesis de ADNc comercializado con el nombre de QUANTITECT Reverse Transcription Kit (Qiagen, Inc., número de catálogo 205313) en un volumen total de 20 microlitros. La PCR se realizó en un sistema de PCR de tiempo real 7300 en placas de reacción ópticas de 96 pocilios comercializadas con el nombre de MICROAMP (Applied Biosystems, Inc., Carlsbad, CA, número de catálogo 4306737) en un volumen final de 20 microlitros. Los transcritos humanos se detectaron con 10 microlitros de mezcla de reacción para PCR 2x comercializada con el nombre de TAQMAN, mezcla maestra universal para PCR, (Applied Biosystems, Inc, número de catálogo 4364338), 1 microlitro del par de iniciadores, 20X, comercializados con el nombre de TaqMan, ensayo de expresión génica, (Applied Biosystems, Inc, número de catálogo 4331182), 1 microlitro de plantilla de ADN y 8 microlitros de agua libre de ARNasas (Sigma-Aldrich, número de catálogo W4502). Los estuches de ensayo específicos para expresión génica usados fueron FoxA2 (ID de ensayo:Hs 00232764_m1), Sox17 (ID de ensayo: Hs 00751752_m1), alfafetoproteína (AFP, ID de ensayo: Hs00173490_m1), transtiretina (TTR, ID de ensayo:Hs00174914_m1), albúmina (ID de ensayo: Hs00910225_m1), factor nuclear de hepatocitos (HNF) 4 alfa (ID de ensayo: Hs00230853_m1), tirosina aminotransferasa (TAT, ID de ensayo: Hs00356930_m1), citocromo P (CYP) 3a (ID de ensayo: Hs 00604506_m1) y GAPDH (ID de ensayo: Hs99999905_m1) como gen de normalización. Las amplificaciones se realizaron comenzando con una etapa de activación con UNG a 50°C durante 2 minutos seguida de una desnaturalización del templado de 10 minutos a 95 °C. Se llevaron a cabo 40 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 15 segundos y combinaron hibridación/extensión de iniciadores a 60 °C durante 1 minuto.

Los hepatocitos inducidos se procesaron, además, para inmunotinción de marcadores hepáticos. Brevemente, las células diferenciadas cultivadas en placas de 12 pocilios se lavaron con PBS y se fijaron con paraformaldehído al 2.2 % durante 20 minutos a temperatura ambiente. Las células fijadas se lavaron dos veces con PBS y, después, se incubaron a temperatura ambiente durante una hora con anticuerpos primarios en regulador de bloqueo/permeabilización (PBS con 0.3 % de Tritón X-100 y 3 % de suero de cabra). Las células teñidas se lavaron tres veces en el regulador de bloqueo/permeabilización antes de la incubación con los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos adecuados. Después del lavado final (cinco veces en regulador de lavado), las células teñidas se examinaron con un microscopio de fluorescencia invertido.

Resultados Las células iPS derivadas de riñón humano, clon RV4-5, se cultivaron en presencia de activina A y Wnt3a. Después del tratamiento con activina y Wnt3a durante 3 días, se extrajo el ARN y se determinaron varios marcadores de hepatocitos por qRT-PCR.

Se muestran los niveles de transcripción para los marcadores de endodermo (FoxA2 y Sox17), hepatocitos primarios (AFP y TTR), hepatocitos intermedios (albúmina y HNF 4 alfa) y hepatocitos maduros (TAT y Cyp7a) de células en diferentes etapas (día 0, 3, 9 y 17). El nivel de transcripción se expresa como el aumento de x veces con respecto a las células de control (célula iPS indiferenciada en el día 0). Los valores marcados con un asterisco (*) indican que el ciclo umbral promedio de este gen es alto en el control indiferenciado y es bajo en la muestra de prueba. Esto sugiere que el valor real del cambio de multiplicación de veces es al menos tan grande como el resultado del cambio de la multiplicación de veces calculado. Los valores marcados con el símbolo numeral (#) indican que el ciclo umbral promedio de este gen es alto, pero su nivel de expresión relativo es bajo tanto en el control indiferenciado como en las muestras de prueba.

Como se muestra en la Tabla 5, las células inducidas mostraron un incremento significativo en los transcritos de Sox17 y Fox2a según lo determinado por qRT-PCR. Es interesante observar que el transcrito de HNF 4 alfa (pero no la proteína) es detectable, además, en esta etapa. Estos resultados demuestran que las células iPS derivadas de riñón humano fueron inducidas hacia el linaje del endodermo definitivo.

Tabla 5 Las células iPS derivadas de riñón humano inducidas en células del endodermo definitivo se indujeron aún más para convertirse en hepatocitos con dos formulaciones de medios diferentes durante 7 días cada una. Después del tratamiento con el medio de diferenciación por 6 días, las células se diferenciaron en hepatocitos tempranos-intermedios. Las células en esta etapa expresaron un nivel alto de transcritos de AFP, TTR y HNF 4 alfa. Por otra parte, los transcritos de Sox17 y FoxA2 comenzaron a disminuir (Tabla 5). La inmunotinción demuestra que las células tuvieron tinción positiva para alfafetoproteína (-20 %), TTR (aproximadamente -40 %) y HNF 4 alfa (aproximadamente 40 %) en el día 6. En el día 17, las células expresan un nivel más alto de alfafetoproteína y hay un incremento moderado en TTR. Es interesante observar que hay una reducción en los transcritos de HNF 4 alfa (Tabla 3) y la cantidad de células con tinción positiva para HNF 4 alfa.

Ejemplo 7. Diferenciación hematoendotelial de células iPS derivadas de riñón humano en cocultivo de OP9 Cultivo celular Las células iPS derivadas de riñón humano (clon RV4-5, pase 28) se mantuvieron en un estado indiferenciado por pase semanal en matriz de membrana basal apta para células madre embrionarias humanas, comercializada con el nombre de GELTREX (Invitrogen Corporation, número de catálogo A1048001) en el medio de cultivo independiente de células alimentadoras, comercializado con el nombre de medio MTESR1 (STEMCELL Technologies, Inc., número de catálogo 05850). La línea celular estromal de médula ósea de ratón OP9 se obtuvo de ATCC (American Tissue Culture Collection, Manassas, VA, número de catálogo CRL2749). Esta línea celular se mantuvo en matraces recubiertos con gelatina, comercializados con el nombre de ESGRO, Millipore Corporation, número de catálogo SF008) en medio de crecimiento para OP9 que consiste en medios mínimos esenciales (MEM) modificados con medio alfa (alpha-MEM, Invitrogen Corporation, número de catálogo A1049001) complementados con 20 % de suero fetal bovino sin inactivación por calor (FBS, Invitrogen Corporation, número de catálogo 16000-044).

Diferenciación hematopovetica de células iPS derivadas de riñón humano en cocultivo con células OP9 Para la diferenciación celular, las células OP9 se colocaron en placas en matraces comercializados con el nombre de CELLBIND SURFACE HYPERFLASK M, recipiente para cultivo celular, (Corning Inc., Lowell, MA, número de catálogo 10020) recubiertos con solución de gelatina ESGRO en medio de crecimiento para OP9. Después de la formación de cultivos confluentes en el día 4, se renovó el 50 % del medio, y las células se cultivaron por otros 4 días. Las células iPS derivadas de riñón humano se recolectaron por tratamiento con 1 miligramo/mililitro de colagenasa IV (Invitrogen Corporation, número de catálogo 17104-019) y se dispersaron por raspado para mantener las células en aglomeraciones pequeñas. Concurrentemente, se usaron cultivos de células iPS derivadas de riñón humano que crecen en las mismas condiciones para obtener una sola suspensión celular para el recuento. Las células iPS derivadas de riñón humano se agregaron a los cultivos de OP9 a una densidad de 4.7 x 104 células/cm2 en alfa-MEM complementado con 10 % de FBS (HYCLONE FBS), 50 miligramos/mililitro de solución de ácido ascórbico y monotioglicerol, 100 uM, (MTG; Sigma-Aldrich). Las celulas iPS derivadas de riñón humano/cocultivos de OP9 se incubaron por 10 días a 37 °C en condiciones normóxicas y 5 % de CO2 con la renovación del 50 % del medio en los días 4, 6, y 8. Las células se recolectaron en el día 10, y se preparó una sola suspensión celular por tratamiento de las células iPS derivadas de riñón humano/cocultivos de OP9 con colagenasa IV (Invitrogen Corporation; 1 miligramo/mililitro en alfa-MEM) por 20 minutos a 37 °C, seguido de tratamiento con tripsina al 0.05 %-EDTA 5 mM (ácido etilendiaminotetraacético, Invitrogen Corporation) durante 15 minutos a 37 °C. Las células se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfatos (PBS) que contiene 2 % de FBS, se filtraron a través de un filtro celular de 100 mieras (BD Biosciences, Palo Alto, CA, número de catálogo 352360), se contaron y usaron para ensayos citométricos de flujo.

Análisis fenotípico por citometría de fluio Se tiñeron previamente las células para determinar la viabilidad celular por tinción con el estuche de tinción celular por téenicas de infrarrojo cercano comercializado con el nombre de LIVEOEAD Fixable Near-IR Dead Cell Stain Kit (Invitrogen Corporation, número de catálogo L10119) para analizar solamente las células vivas. Las células se prepararon en PBS que contiene azida de sodio al 0.05 %, EDTA 1 mM, 2 % de FBS, solución de bloqueo del receptor Fe comercializada con el nombre de HUMAN TRUSTAIN FCX (BioLegend, Inc., San Diego, CA, número de catálogo 422301) y 2 % de suero normal de ratón (Sigma-Aldrich, número de catálogo L2280) y se marcaron con una combinación de anticuerpos monoclonales (AcM). Las muestras se analizaron mediante el uso de un citómetro de flujo FACS LSRII (Becton Dickinson Immunocytometry Systems [BDIS], San Jose, CA) con el software de captación FACSDIVA (BDIS). Se analizaron los archivos en modo de lista con el software FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Se usaron los siguientes AcM: CD43-FITC, TRA-1-85-PE, CD117-PerCP/Cy5.5, CD34-PE/Cy7, CD31-APC, CD45-AmCyan, FLk-1-V450. Se incluyó una tinción de control con los AcM de control adecuados del mismo isotipo (BD Pharmingen) para establecer los umbrales de tinción positiva.

Resultados Las células iPS derivadas de riñón humano mantenidas estrictamente en un estado indiferenciado no expresaron CD34, CD31, CD43 o CD45 en relación con los controles de isotipos para anticuerpos. Se comprobó que tanto Flk-1 como CD117, conocidos por expresarse en progenitores hematopoyéticos primitivos, se expresaron en células iPS derivadas de riñón humano indiferenciadas. En el cocultivo de OP9, aproximadamente 11 % de las células iPS derivadas de riñón humano viables (positivo para TRA-1-85) fueron células CD34+. Las células iPS derivadas de riñón humano se diferenciaron en células endoteliales, y los progenitores hematopoyéticos pueden identificarse por la expresión de un marcador hematoendotelial común, CD31 (PECAM-1).

Después de 10 días de cocultivo, 11.44 % de las células ¡PS derivadas de riñón humano fueron CD31+ y 89 % de las células CD34+ fueron CD31+ (marcador hematoendotelial), lo cual se observa comúnmente en la diferenciación de hES en células CD34+ (Vodyanik, M.A., y Sluvin, II, CurrProtoc Cell Biol Capítulo 23: Unidad 23-26 (2007). Los progenitores hematopoyéticos se distinguieron de células endoteliales por la expresión de CD43 (leucosialina; marcador panhematopoyético). Después de 10 días de cocultivo, CD43 estuvo presente en 8 % de las células iPS derivadas de riñón humano con 4 % de CD31+CD43 (potencial endotelial) y 7 % de CD31+CD43+ (potencial hematopoyético). Adicionalmente, 5 % de las células ¡PS derivadas de riñón humano cocultivadas con células OP9 fueron CD34+CD43\ que tienen potencial hematopoyético para generar múltiples linajes y son capaces de diferenciarse hacia todos los linajes de células sanguíneas así como células linfoides B. El marcador panhematopoyético CD45 comúnmente usado no se expresó en las células CD34+' y la proporción de células CD34+ fue baja, además, en CD117 y Flk-1.

Ejemplo 8. Diferenciación endodérmica de células iPS derivadas de riñón humano Diferenciación endodérmica de células iPS derivadas de riñón humano Las células individuales (células iPS derivadas de riñón humano preparadas en el Ejemplo 1 , clon RV4-5, se sembraron en placas sobre placas de 12 pocilios recubiertas con GELTREX a 105,000 vc/cm2. Después de 3 días en medio mTesii, las células se trataron con una proteína de la superfamilia TGF-beta por tres días consecutivos en medio RPMI 1640 con 0.1 % de albúmina de suero bovino libre de ácido graso (FAF-BSA, Proliant Health and Biologicals. Ankeny, IA, número de catálogo 68700) y CHIR99021 (inhibidor de glicógeno sintasa quinasa 3, Stemgent, Inc., número de catálogo 04-0004).

Análisis fenotípico de células iPS derivadas de riñón humano diferenciadas Las células se retiraron de las placas de 12 pocilios con ACCUTASE y se analizaron para marcadores fenotípicos indicadores de diferenciación endodérmica. Las células se tiñeron previamente con el producto LIVE/DEAD near infrared (Invitrogen Corporation) que permite analizar solamente las células vivas. Las células se prepararon en PBS que contiene azida de sodio al 0.05 %, EDTA 1 mM, 2 % de FBS, HUMAN TRUSTAIN FCX (solución bloqueadora del receptor Fe) y 2 % de suero normal de ratón (Sigma-Aldrich). Las células se tiñeron en la superficie con anticuerpo conjugado con ficoeritrina (PE) para CXCR4 (Biolegend, Inc., número de catálogo 306506). Las células se fijaron, permeabilizaron y tiñeron con anticuerpo conjugado con aloficocianina (APC) para SOX17 (R&D Systems Inc., número de catálogo IC1924A). Se seleccionaron los marcadores CXCR4 (marcador mesodérmico) y SOX17 (marcador del endodermo definitivo) ya que estos marcadores se han usado para dilucidar la diferenciación del endodermo definitivo en células pluripotentes (D'Amour, K.

A. y otros, Nat Biotechnol 23(12): 1534-1541 (2005); Spence, J. R. y otros, Nature 470(7332): 105-109 (2011)). Se incluyó una tinción de control con anticuerpos de control adecuados del mismo isotipo para establecer los umbrales de tinción positiva. Las muestras se analizaron con un citómetro de flujo (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) y se captaron mediante el uso de citometría de flujo comercializado con el nombre de FACSDIVA (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Se analizaron los archivos en modo de lista con un software de análisis de citometría de flujo comercializado con el nombre de FLOWJO (Tree Star, Inc., Ashland, OR).

Resultados Las células iPS derivadas de riñón humano diferenciadas hacia el endodermo definitivo produjeron 80 % de las células viables que son positivas para SOX17 (marcador del endodermo definitivo). SOX17 no se expresa en los otros linajes celulares (mesodermo, ectodermo, trofectodermo); por lo tanto, las células que expresan la proteína SOX17 son del linaje del endodermo definitivo. El 36 % de las células tuvieron resultado positivo para SOX17 y para CXCR4 (marcador mesoendodérmico). Aunque CXCR4 ha sido informado en el mesodermo, no se registraron células CXCR4+SOX17 , lo que demuestra, adicionalmente, que las células son células del endodermo definitivo. La célula iPS indiferenciada no mostró ninguna prueba de la diferenciación en endodermo definitivo debido a la expresión negativa de SOX17 y CXCR4.

Ejemplo 9. Hepatocitos diferenciados a partir del trasplante de células iPS derivadas de riñón humano en ratones Fah~/~Rag2~/~ Los ratones Fah-/ tienen un metabolismo deficiente en tirosina y requieren el suministro de 2-(2-nitro-4-trifluoro-metilbenzoil)-1,3-ciclohexanodiona (NTBC) para sobrevivir. Sin el NTBC (ausencia de NTBC), los ratones Fah-/ experimentan una falla hepática y mueren. El rescate de estos ratones puede hacerse por trasplante de hepatocitos primarios de tipo silvestre, que representan un modelo útil para caracterizar in vivo la repoblación y funciones de hepatocitos diferenciados a partir de células iPS derivadas de riñón humano. Se usan ratones Fah_/ Rag2_/ inmunodeficientes para el trasplante a fin de reducir la probabilidad de una respuesta inmunitaria de rechazo (Huang, P. y otros, Nature 475: 386-389 (2011)).

Los ratones Fah-/-Rag2-/ se mantienen con 7.5 miligramos/litro de NTBC en el agua que beben. Los hepatocitos diferenciados a partir de células iPS derivadas de riñón humano se trasplantan en los bazos de ratones Fah /_Rag2_/_ a la edad de 8-12 semanas. Después del trasplante de células, se elimina el NTBS del agua que beben. Además, como control, se elimina el NTBS del agua que beben los ratones Fah /_Rag2-/- no trasplantados. Se generó una curva de supervivencia con el programa SPSS para Windows mediante el uso del método de Kaplan-Meier. Ocho semanas después del trasplante, se extrajo sangre del seno retroorbital de los ratones Fah_/_Rag2_/_ sobrevivientes trasplantados y se centrifugó a 12,000 rpm durante 15 minutos. El suero se congeló a -80 °C hasta el momento de los análisis bioquímicos. Se midió el total de bilirrubina, albúmina, nitrógeno ureico en sangre y creatinina. Despues de la muestra de sangre, se sacrificó a los ratones por dislocación cervical, y se recolectaron los hígados, se fijaron y tiñeron con hematoxilina y eosina. Se recolectaron muestras de sangre y del hígado de los ratones Fah_/ Rag2 /_ de control sin NTBC después de perder 20 % de peso corporal.

Ejemplo 10. Reproqramación mediada por ARNm de las hKDC en células iPS Las hKDC, obtenidas de conformidad con los métodos descritos en la publicación de patente de los Estados Unidos núm. 2008/0112939, se transdujeron con constructos de ARNm de Stemgent, Inc. (San Diego, CA, número de catálogo 00-0067), específicamente, ARNm que codifica para los factores de transcripción humanos OCT4, SOX2, KLF4, c-MYC y LIN28.

Las hKDC se descongelaron y cultivaron para un pase antes de la transducción. Un día antes de la transducción, las hKDC se trataron con tripsina y se cultivaron en placas sobre una placa de 6 pocilios (se presembraron con fibroblastos inactivados de prepucio humano de recién nacido (Globalstem Incorporated, Rockville, MD número de catálogo GSC-3001 G o GSC-3001M) a 2.5x104 células por pocilio en 2 mililitros de medio de crecimiento epitelial renal (REGM, Lonza Walkersville, Inc., Walkersville, MD) por pocilio. Las células se incubaron durante toda la noche con 5 % de CO2 y a 37 °C. Las placas con células alimentadoras de fibroblastos de prepucio humano de recién nacido (NuFF) se prepararon 24 horas antes del uso por siembra de NuFF a una densidad de 2.5x105 en medio de cultivo de NuFF en placas de 6 pocilios recubiertas previamente con 0.1 % de gelatina.

El día 1, se aspiró el REGM y se reemplazó con 2 mililitros de medio de reprogramación optimizado comercializado con el nombre de PLURITON, medio de reprogramación del ARNm (Stemgent, Inc., número de catálogo 00-0070 complementado con 1x de penicilina/estreptomicina (Invitrogen Corporation, número de catálogo 15070-063) que contiene 200 nanogramos/mililitro de B18R (receptor de ¡nterferones tipo I, eBioscience, Inc., San Diego, CA, número de catálogo 34-8185-85) y se incubó en 5 % de CO2 y a 37 °C por 4 horas. El complejo de transfección del ARNm se preparó al agregar 200 microlitros de un medio de cultivo de suero reducido comercializado con el nombre de Opti-MEM (Invitrogen Corporation, número de catálogo 31985-070) en un vial que contiene 50 microlitros del cóctel de ARNm y se mezcló suavemente. Se preparó un tubo separado al mezclar, suavemente, 225 microlitros de OPTI-MEM y 25 microlitros de un reactivo de transfección comercializado con el nombre de LIPOFECTAMINE RNAIMAX (Invitrogen Corporation, número de catálogo 13778075). El contenido de los dos tubos se combinó e incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos para permitir que el ARNm formara complejos con el reactivo de transfección. Para transfectar las hKDC, se agregó 120 microlitros de la transfección del ARNm, en gotas, en cada pocilio. Se meció la placa suavemente para distribuir el complejo de transfección del ARNm y, despues, la placa se incubó en 5 % de C02 y a 37 °C por 4 horas. Después, el medio de cultivo que contiene el complejo de transfección del ARNm se aspiró y reemplazó con 2 mililitros de medio de reprogramación PLURITON que contiene 200 nanogramos/mililitro de B18R y se incubó durante toda la noche en 5 % de CO2 y a 37 °C.

La etapa de transfección se repitió 4 veces más en los días 2-5. En los días 6-17, la transfección se repitió durante 12 veces más y, en estos días, las celulas se mantuvieron en medio acondicionado de NuFF. El medio acondicionado de NuFF se generó al colocar en placas NuFF inactivado en un matraz de cultivo de tejido T75 (recubierto previamente con una solución de gelatina al 0.1 %) a una densidad de 4x106 células en 25 mililitros de medio que contiene DMEM (Invitrogen Corporation, número de catálogo 11965-092), 10 % de FBS definido (Atlas Biologicals, Inc., Fort Collins, CO, número de catálogo F-0500-A), GLUTAMAX, y penicilina-estreptomicina, y se incubó durante toda la noche en 5 % de CO2 y a 37 °C. Se aspiró el medio de cultivo, las células se lavaron una vez con 10 mililitros de PBS, y el medio se reemplazó con 25 mililitros de medio de reprogramación PLURITON (Stemgent Inc., número de catálogo 01-0015) complementado con 4 nanogramos/mililitro de bFGF comercializado con el nombre STEMFACTOR (Stemgent, Inc., número de catálogo 03-0002) y 1x de penicilina/estreptomicina. Después de la incubación durante toda la noche en 5 % de CO2 y a 37 °C, el medio acondicionado de NuFF se recolectó y almacenó a -20 °C. Se agregó medio PLURITON fresco complementado con 4 nanogramos/mililitro de FGF básico STEMFACTOR (Stemgent, Inc., número de catálogo 03-0002) y penicilina/estreptomicina 1x, se incubó toda la noche y se recolectó durante otros 5 días para producir 150 mililitros de medio acondicionado de NuFF. Se combinaron las alícuotas recolectadas, se esterilizaron por filtración con un filtro de 0.22 mieras y se almacenaron a -20 °C hasta usarse. Antes del uso, se agregó PLURITON Supplement (2500X, Stemgent Inc., número de catálogo 01-0016) a una concentración de 1x.

Durante el período de transfección, se realizó el pase de las celulas confluentes para permitir una mayor proliferación y la formación de colonias de células iPS. Para esto, las células se lavaron con PBS y se recolectaron al agregar 0.5 mililitros de tripsina/EDTA para células primarias (ATCC, número de catálogo PCS-999-003) por pocilio y se incubaron durante 5 minutos en 5 % de CO2 y a 37 °C. Se dieron golpecitos suaves en una de las caras del pocilio para ayudar a la disociación y liberación de las células, y se agregó 0.5 mililitros de neutralizador de tripsina (ATCC, número de catálogo PCS-999-004) en cada pocilio. Las células se recolectaron por transferencia a un tubo cónico de 15 mililitros, lavado del pocilio con 1 mililitro de medio de reprogramación PLURITON y centrifugado a 200x g durante 5 minutos. El botón celular se resuspendió en 1 mililitro de medio de reprogramación de PLURITON y se sembró sobre placas con células alimentadoras de NuFF fresco que contienen 2 mililitros de medio de reprogramación PLURITON complementado con 200 nanogramos/mililitro de B18R y Y27632, 10 uM, (inhibidor ROCK, Stemgent Inc., número de catálogo 04-0012).

Para controlar la formación de colonias de células iPS o reprogramadas, las hKDC transfectadas se incubaron en medio acondicionado de NuFF sin B18R durante 3 días para permitir la expansión de las colonias. Las colonias de celulas iPS primarias se identificaron según la morfología y por tinción vital estéril con el anticuerpo murino anti TRA1-81 humano comercializado con el nombre de STAINALIVE DYLIGHT 488 (Stemgent, Inc., número de catálogo 09-0068). Las colonias que exhiben la morfología “clásica” de células iPS o reprogramadas se recolectaron manualmente y se sembraron en un solo pocilio de una placa de 12 pocilios con células alimentadoras de de NuFF. El medio de cultivo se renovó diariamente. Después de 4-6 días, las colonias se recolectaron manualmente de las placas de 12 pocilios y se expandieron en placas de 6 pocilios. El medio de cultivo se renovó diariamente y se dividió manualmente 1:3 cada 4-6 días. Las células de cada pocilio se congelaron en medio de congelamiento CRYOSTEM.

Resultados La reprogramación de las hKDC con el ARNm que codifica los cinco factores de reprogramación produjo colonias reprogramadas que exhiben la morfología de células iPS y tinción positiva para TRA1-81.

RESUMEN En términos generales, se ha demostrado la generación de células iPS derivadas de riñón humano por sobreexpresión de factores de transcripción humanos mediante el uso de métodos integrativos (virales) y no integrativos (no virales). Estos resultados demuestran que las celulas iPS derivadas de riñón humano expresan los marcadores de pluripotenda TRA1-60, TRA1-81, SSEA3, SSEA4 y NANOG y exhiben tinción positiva para fosfatasa alcalina. Al examinar una región de 100-500 pares de bases del promotor de Oct4, las células iPS derivadas de riñón humano muestran un cambio en la metilación en 7 sitios de metilación en comparación con la línea original de las hKDC.

Estas células exhiben, además, marcadores de proteínas de células derivadas de linajes del ectodermo, mesodermo y endodermo que muestran el potencial de diferenciación de estas células reprogramadas. La expresión de marcadores específicos de células sugiere que después de emplear protocolos de diferenciación, estas células pueden diferenciarse en células del tipo de los hepatocitos, células del linaje hematoendotelial y células del endodermo definitivo.

Si bien la presente invención se ha descrito e ilustrado con referencia a modalidades y ejemplos particulares, aquellos con experiencia ordinaria en la materia comprenderán que la invención se adapta a variaciones no ilustradas, necesariamente, en la presente descripción. Por este motivo, entonces, se hará referencia únicamente a las reivindicaciones anexas para los fines de determinar el verdadero alcance de la invención.

Claims (8)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una celula madre pluripotente inducida que comprende una célula derivada de riñón humano reprogramada, en donde la célula derivada de riñón humano es positiva para la expresión de HLA-I y CD 44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, cadherina-11, FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativa para la expresión de CD133 y E-cadherina y al menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 o GATA-4.

2.- La célula madre pluripotente inducida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la célula madre pluripotente inducida expresa TRA1-60, TRA1-81, SSEA3, SSEA4 y NANOG.

3.- La célula madre pluripotente inducida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la célula madre pluripotente inducida es positiva para la tinción de fosfatasa alcalina.

4.- La célula madre pluripotente inducida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la célula madre pluripotente inducida se diferencia en células de linajes del ectodermo, mesodermo y endodermo.

5.- La célula madre pluripotente inducida de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada además porque la célula madre pluripotente inducida se diferencia en un hepatocito, una célula hematoendotelial y una célula del endodermo definitivo.

6.- Una célula madre pluripotente inducida preparada por un método que comprende las etapas de: proporcionar una célula derivada de riñón humano, en donde la célula de riñón humano es positiva para la expresión de HLA-I y CD 44 y al menos uno de Oct-4, Rex-1, Pax-2, cadherina-11 , FoxD1, WT1, Eya1, HNF3B, CXC-R4, Sox-17, EpoR, BMP2, BMP7 o GDF5; y negativa para la expresión de CD133 y E-cadherina y al menos uno de Sox2, FGF4, hTert, Wnt-4, SIX2 o GATA-4; transfectar la célula derivada de riñón humano con cada uno de un retrovirus murino de VSVg que expresa el factor de transcripción humano OCT4, un retrovirus murino de VSVg que expresa el factor de transcripción humano SOX2, un retrovirus murino de VSVg que expresa el factor de transcripción humano KLF4, y un retrovirus murino de VSVg que expresa el factor de transcripción humano c-MYC; cultivar la célula derivada de riñón humano transfectada; identificar una célula madre pluripotente inducida; aislar la célula iPS derivada de riñón humano; subcultivar la célula madre pluripotente inducida; y proporcionar una célula madre pluripotente inducida.

7.- El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque transfecta, además, la célula derivada de riñón humano con un retrovirus murino de VSVg que expresa el factor de transcripción humano p53-ARNhc.

8.- Una celula madre pluripotente inducida preparada por un método que comprende las etapas de: proporcionar una célula derivada de riñón humano, transfectar las células derivadas de riñón humano con cada uno de un ARNm que codifica una proteína de Oct-4, un ARNm que codifica una proteína de Sox2, un ARNm que codifica una proteína de Klf4, un ARNm que codifica una proteína de c-myc y un ARNm que codifica una proteína de Lin28; cultivar la célula iPS derivada de riñón humano transfectada; identificar una célula madre pluripotente inducida; aislar la célula madre pluripotente inducida; subcultivar la célula madre pluripotente inducida; y proporcionar una célula madre pluripotente inducida.