MX2013013822A - Formulacion con hongos entomopatógenos para el control de plagas. - Google Patents

Abstract

Los hongos entomopatógenos al infectar a los insectos, garrapatas y/o pulgas producen metabolitos, como las enzimas hidrolíticas y los depsipéptidos cíclicos. estas enzimas degradan la cutícula del insecto, garrapata 7/o plaga. además, estos hongos al encontrarse en nichos ecológicos con alta biodiversidad y competencia sintetizan la actividad de control biológicos de plagas. Todos los compuestos bioactivos señalados pueden ser utilizados como bioinsecticidas o fungicidas, y ser producidos por procesos fermentativos. esto abre nuevas áreas de desarrollo agrobiotecnológico, acorde con las nuevas tendencias de la investigación agrícola a nivel mundial. La formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas se origina de un proceso orgánico esto representa una alternativa viable. Los hongos entomopatógenos suprimen la acción de control químico el cual representa efectos para otros organismos, el propio ser humano y la contaminación del medio ambiente. La aplicación de los biocontroles junto a otros métodos alternativos permitirá lograr buenos rendimientos en el sector granadero sin perjudicar al ecosistema. Los entomopatogenos son competitivos con otras prácticas de control, considerando su efectividad, costo de producción y seguridad al ambiente.

Description

FORMULACION CON HONGOS ENTOMOPATOGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS DESCRIPCIÓN OBJETO DE LA INVENCIÓN La presente invención se encuadra en el Sector Agroindustrial-ganadero y en la necesidad imperante de exterminar a las diversas plagas particularmente la garrapata Boophilus y que se han convertido en graves detonantes que invalidan los esfuerzos en la producción ganadera.

Las plagas en la ganadería han sido controladas durante años mediante el empleo de plaguicidas químicos de fuerte impacto negativo sobre los organismos benéficos presentes en el ambiente. Con el objetivo de promover y acelerar el uso de hongos en el control de plagas en ganadería es necesario el desarrollo de formulaciones eficaces y estables que permitan su manejo y aplicación.

El desarrollo y aplicación de agentes de control biológico de plagas como la presente invención debe adquirir una importancia relevante como una alternativa en el desarrollo de una ganadería sostenible que preserve los recursos naturales y el medio ambiente para las futuras generaciones. La aplicación controlada en agroecosistemas de organismos vivos o sus metabolitos para el control de plagas y enfermedades, implica la aceptación de propuestas como la que se presenta para su análisis.

ANTECEDENTES En la naturaleza, los hongos entomopatógenos pueden eliminar o mantener las plagas en niveles que no ocasionan daños económicos a la ganadería. Estos hongos se encuentran en rastrojos de cultivos, estiércol, en el suelo, las plantas; logrando un buen desarrollo en lugares frescos, húmedos y con poco sol. Constituyen, además, el grupo de mayor importancia en el control biológico de insectos plagas. Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por hongos.

Los Hongos entomopatógenos se conocen desde hace dos milenios, cuando los Chinos identificaron especies de Cordyceps e Isaria de especímenes del gusano de seda y una especie de cicada (Chicharra o cigarra). Agostino Bassi en 1836 relata un tratado sobre la enfermedad del gusano de seda, la muscardina, cuyo agente causal era Beauveria bassiana.

Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de hongos entomopatógenos. Entre los géneros más importantes están: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium.

Para utilizar hongos entomopatógenos como insecticidas deben producirse cantidades masivas del hongo, el cual debe mantener su capacidad infectiva por un período de tiempo considerable. Los hongos se han reproducido para su uso como agentes ' biológicos de plagas desde hace 100 años, para lo cual se ha utilizado diferentes métodos de reproducción. Entre ellos, el uso de sustratos como arroz, trigo y medios líquidos mediante téenicas más sofisticadas.

La explotación de los hongos para el control de plagas (invertebrados, malezas y enfermedades) implica una amplia investigación donde se involucran disciplinas como la patología, ecología, genética, fisiología, producción masiva, formulación y estrategias de aplicación.

Particularmente se requiere exterminar plagas y en prioridad a las garrapatas Boophilus que son el enemigo más dañino para el ganado bovino; cada garrapata que chupa sangre causa estrés y debilitación del animal afectado.

Los Hongos entomopatógenos se conocen desde hace dos milenios, cuando los Chinos identificaron especies de Cordyceps e Isaria de especímenes del gusano de seda y una especie de cicada (Chicharra o cigarra). Agostino Bassi en 1836 relata un tratado sobre la enfermedad del gusano de seda, la muscardina, cuyo agente causal era Beauveria bassiana.

Es por esto que el objeto de la presente invención está centrado en combatir ésta infestación y plagas secundarias ya que a partir de unas 20 a 30 garrapatas por animal el daño empieza a tener efectos económicos (merma del aumento de peso o de la producción de leche, posible efecto negativo sobre la fertilidad, debilitamiento que favorece otras enfermedades). Se ha calculado que una infestación de 50 o más hembras repletas de garrapatas Boophilus adicionales a las plagas secundaria causan una reducción anual del aumento de peso de cerca de 500 gramos por garrapata. En ganado lechero la reducción de la producción láctea anual de un animal puede ser de 200 litros o más.

La B. bassiana, elemento utilizado en la Formulación con Hongos Entomopatógenos para el control de plagas fue registrada en 1999 como "Mycotrol" por la Enviromental Protection Agency en Estados Unidos, que es utilizado en campo para el control de saltamontes, mosca blanca, thrips, áfidos y muchos otros plagas de insectos. Este producto es estable por más de 12 meses almacenado a 25 ° C en base a lo descrito por Wraight, Jackson, Kock, (2001). Existen otros dos formulados a partir de B. bassiana comercializados como "BotanicGard" que es recomendado para el uso en casas de cultivos y "Mycotrol O" que contiene ingredientes en la formulación que permite su uso por agricultores en Estados Unidos según lo establecido por Shah y Pell, 2003.

Actualmente, el micoinsecticidad basado en conidios secos de Metarhizium anisopliae se mezcla con aceite del diesel o querosén antes de atomizar como lo establece Bateman, Neethling y Osthuizen, 1998. La infección y muerte de 70-90% de langosta o saltamontes ocurren dentro de 14-20 días después de la aplicación, sin efecto perjudicial en organismos no diana según Lomer, Bateman, Johnson, Langewald y Thomas, 2001. El producto patentado, "Green Muscle", fue comercialmente disponible después de 12 años de investigación involucrando a 40 científicos y costando $17 millones (Shah y Pell, 2003). El "Green Muscle" se recomienda para cigarras, langostas o saltamontes por la Organización de las Naciones Unidas por la Alimentación y la Agricultura en base a las investigaciones de Lomer, Bateman, Johnson, Langewald y Thomas, 2001.

Conidios de Beauveria brongniartii crecidos en granos de la cebada se vende comercialmente bajo los nombres de "Engerlingspilz" y "Beauveria Schweizer." El uso de conidios en granos de la cebada se prefiere, desde que los productos pueden guardarse durante un año a 2 ° C mientras las blastosporas formuladas en suspensión acuosa con leche descremada y un protector ultravioleta son más inestables y necesitan ser usadas dentro de 4 semanas de producción establecido por Keller, 1992.

En un reciente proyecto europeo, Biocontrol of important soil dwelling pests by improving the effícacy of insect pathogenic fungí (BIPESCO) (Control biológico de plagas importantes que habitan en el suelo mediante la mejora de la eficacia de los hongos patógenos en insectos) , se completará los estudios de producción, formulación y aplicación con Beauveria brongniartii según los estudios realizados por Jung, Gonschorrek, Ruther, Zimmerman, 2002.

La producción y el uso de los entomopatógenos se ha expandido rápidamente y Cuba ha desarrollado capacidades únicas en esta área. Se han elaborado muchas téenicas mejoradas de producción, cosecha, formulación, aplicación y control de calidad para numerosas bacterias y hongos.

En el mundo, numerosos grupos de investigadores y empresas productoras se concentran en el desarrollo de productos comerciales a partir de hongos en forma de gránulos o polvo humectable entre los que se citan Biofox C (F. oxysporium y F. moniliforme SIAPA, Italia), Mycotal (V. lecanii, Koppert, Holanda), Mycotrol GH ( B . bassiana, Mycotech, USA), Green Muscle (M flavoviride, CABI Bioscience, UK), DiTera (M verrucaria, Valent (Sumitomo), USA, Japón) en referencia a lo propuesto por Burges, 1998 ;Butt y Copping, 2000.

Algunas formulaciones granuladas muy sencillas son las del hongo en arroz o arroz molido obtenidas mediante el proceso de producción masiva del hongo. Otras como las de gránulos de aceite hidrogenado es utilizada para conidios de B. bassiana referenciado por Carballo, 1998.

Se han evaluado formulaciones en gránulos de alginato usando agentes aumentadores como cáscara de naranja seca molida. Existen, además, procedimientos para la preparación de formulaciones de micelio o conidios en gránulos de alginato, Carballo, 1998.

La temperatura y la humedad son las principales limitaciones para la eficacia de los hongos. Varios adyuvantes mejoran la germinación de las esporas, como es el caso del aceite de maíz sin refinar, que mejora la actividad de Colletotrichum truncatum, (Schwein, Andrus y Morre) y reduce los requerimientos de humedad necesarios para su germinación. Surfactante anionico organofosforados como Tween 20 permiten a las plantas reducir la tensión superficial y mejoran la dispersión de las esporas en las" gotas. Hay que tener en cuenta la posible acción inhibitoria/estimuladora del surfactante aniónico organofosforado en la germinación de las esporas, infección y desarrollo, Fernández y Juncosa, 2002.

Lecanicillium lecanii ( Verticillium lecanii ) esta disponible en dos productos producidos por la Koopert Biological System en Inglaterra los cuales contienen diferentes aislamientos del ingrediente activo: "Vertalec" se utiliza contra áfidos y "Mycotal" contra mosca blanca y thrips. "Vertalec" introducido en 1981, es formulado con una fuente de nutrientes en forma de polvo humedecible y demostrado su eficacia contra diferentes especies de áfidos, Milner, 1997; Burges, 2000; Yeo, Pell, Alderson, Clarck, Pye, 2003; Shah y Pell, 2003.

Estos productos son utilizados exclusivamente en invernaderos donde el ambiente de humedad puede ser modificado. Recientes avances de la empresa Koopert en teenología de formulaciones, han logrado obtener un adyuvante basado en un aceite vegetal emulsificable llamado "Addit" con el cual se le puede cambiar la actividad de Mycotal a bajas humedades pero no es compatible con "Vertalec". El poco mercado de estos productos es debido a los requerimientos de humedad que limita su uso en campo abierto, Milner, 1997; Shah y Pell, 2003.

Se puede establecer que a lo largo del tiempo se han reportado distintos mecanismos para controlar plagas y matar garrapatas. Hay comercialmente disponibles vacunas contra B. microplus en algunos países. Se basan sobre todo en el antígeno recombinante Bm86, un polipéptido del intésürio de las garrapatas. Estas ingieren el anticuerpo correspondíénte al chupar sangre de un hospedador vacunado.

Los anticuerpos destruyen poco a poco las células digestivas de la garrapata y acaban causando su muerte. Algunas garrapatas mueren sobre el hospedador y otras una vez ya en el suelo, comenzada la ovoposición. La viabilidad de los huevos depositados es variable. Si se vacuna regularmente todo el hato que ocupa un potrero, la población de garrapatas en dicho potrero será decimada poco a poco hasta descender, tras varios años, bajo el umbral de daño económico.

Las vacunas contra B. microplus están indicadas para el control de poblaciones de garrapatas, pero no para la protección a corto o medio plazo de las reses individuales contra las infestaciones, ni para derribar inmediatamente las garrapatas que ya infestan el ganado en un momento determinado. Las vacunas tienen ventajas: son eficaces contra garrapatas resistentes a los productos químicos, y no dejan residuos en la carne o en la leche, lo que las hace particularmente atractivas para explotaciones lecheras. El mayor inconveniente de estas vacunas es que el antígeno no se introduce en el hospedador durante la picadura, lo que exige inyecciones periódicas de refuerzo cada 6 a 10 semanas.

Otro inconveniente es que la vacuna no evita que el ganado se infeste con las garrapatas presentes en los pastos tras la vacunación, lo que exige que el ganado vacunado siga siendo tratado con acaricidas clásicos hasta que los pastos se limpien poco a poco de garrapatas, algo que puede durar "varios años: el número de tratamientos acaricidas necesarios disminuirá sólo lentamente.

Otra desventaja de las vacunas es que la respuesta inmunológica individual de cada res puede variar considerablemente, y se ve reducida si la res sufre de estrés, está enferma o debilitada. Por lo tanto, dentro de un mismo hato la eficacia de la vacuna puede variar considerablemente, frenando el proceso de limpieza de los pastos y dando la impresión de que no trabaja porque algunos animales siguen llevando bastante garrapata.

Los productos químicos para el control de garrapatas Boophil se basan en garrapaticidas de contacto, en endectocidas sistémicos o en inhibidores del desarrollo de las garrapatas. La mayoría de los productos contra las garrapatas contienen garrapaticidas de contacto (también llamados acaricidas o ixodicidas) pertenecientes a los organofosforados, piretroides o amidinas. El fipronil también tiene actividad de contacto. La mayoría de estos productos están disponibles como concentrados para baños de inmersión o aspersión, o como listo para el uso (no hay que diluirlo). Son eficaces contra las larvas, las ninfas y los adultos. Muchos de ellos también controlan otros parásitos de los bovinos como moscas, piojos, ácaros, etc.

El fluazurón, actualmente es el único inhibidor del desarrollo de las garrapatas comercializado, actúa de modo sistémico y está disponible como pour-on. Es altamente específico de las garrapatas. No mata ningún estadio directamente, sino que interrumpe el ciclo vital al inhibir la muda de un estadio a otro o íá eclosión de los huevos de hembras repletas afectadas.

Cada vez más productos garrapaticidas contienen endectocidas sistémicos que actúan a través de la sangre del hospedador cuando la garrapata chupa sangre. También afectan a los estadios inmaduros y a los huevos de hembras repletas que sobreviven. Están disponibles como inyectables y listo para el uso (no hay que diluirlo). Son también eficaces contra otros parásitos intemos y extemos: gusanos barrenadores, hipodermas, tórsalo, piojos, etc. Los inyectables no suelen procurar de ordinario un control suficiente de garrapatas salvo algunos de larga duración.

Hay reportes recientes de buena eficacia del Spinosad contra las garrapatas Boophilus, pero hasta la fecha no se han introducido productos comerciales garrapaticidas con este compuesto.

Actualmente el proceso que sigue cada sustancia activa de origen químico una vez aplicada sobre el animal es diferente y depende de su estructura molecular y de otros factores como la formulación, el método de aplicación, etc. Aplicada sobre la piel de una res, la sustancia activa se evapora progresivamente, se descompone a la luz solar, o reacciona con las grasas de la piel, etc.

Los productos sistémicos se metabolizan, excretan o almacenan en el tejido graso, etc. El resultado es que los productos mantienen su eficacia garrapaticida completa durante más o menos días. Es lo que se llama el poder o efecto residual que varia dependiendo las variaoies mencionadas con anterioridad.

El control biológico de las garrapatas Boophilus usando sus enemigos naturales permanece todavía como materia de investigación y no ha desembocado aún en soluciones prácticas. Algunas aves (p.ej. las garzas), pequeños roedores y varios insectos (p.ej. hormigas, himenópteros) se alimentan de garrapatas, pero su impacto en las poblaciones de los pastos infestados es muy pequeño.

No hay por ahora alternativas que consistan en tratar el entorno (los pastos, el bosque, la maleza, etc.) con productos que maten allí las garrapatas y otras plagas. Teóricamente sería posible, pero el costo sería prohibitivo y el daño ecológico enorme, pues los garrapaticidas matarían también a la mayoría de los insectos benéficos y podrían contaminar el agua.

Se han detectado también concentraciones de DDT (diclorodifeniltricloroetano) que es un insecticida organoclorado sintético de amplio espectro, acción prolongada y estable, aplicado en el control de plagas para todo tipo de cultivos desde la década del cuarenta, que inclusive quedaron prohibidos y cancelados totalmente del mercado de comercialización, ya que el consumo humano de alimentos de origen animal contaminados con DDT provoca su acumulación y posterior intoxicación.

Los casos agudos presentan alteraciones gastrointestinales, trastornos neurológicos y parálisis muscular; si la dosis es elevada puede sobrevenir la muerte por paro respiratorio; lamentablemente en México se siguen vendiendo productos con éste componente, es por esto importante y totalmente viable ésta propuesta de Formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas particularmente para matar garrapatas Boophilus en bovinos ya que se genera mediante un proceso totalmente orgánico y amigable con el medio ambiente y todos los seres vivos.

Cabe mencionar que las moléculas de los químicos actuales tienen una vida promedio de 100 años para degradarse al no ser orgánicos y emanar de procesos totalmente químicos como pesticiadas o plaguicidas, como son los organofosforados, ya hemos analizado en el Laboratorio del Centro Universitario de Estudios de Investigación de Proyectos, S.C. la calidad del agua de la zona conurbada también avalados y respaldados por estudios de laboratorios acreditados ante EMA como QUANTUM, en donde se observa trazas (concentraciones) de éstos químicos que se canalizan a través de los mantos freáticos en donde inicia el agua subterránea que después desemboca en pozos, lagos, lagunas, manantiales, etc. y contamina todo tipo de organismos y en escenario cancerígenos para el Ser Humano.

Este hecho marca el inicio de la Patología de Insectos y plagas. Se conocen aproximadamente 100 géneros y 700 especies de hongos entomopatógenos. Entre los más importantes están: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erinia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecilomyces y Verticillium.

A nivel mundial, las dos especies más frecuentes y estudiadas de hongos entomopatógenos son Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae, debido a su eficiencia y facilidad de multiplicación, por los cual éstos pueden servir de agentes entomopatógenos, contra organismos patógenos causantes de enfermedades, o de organismos que sirven de vectores de otros microorganismos que causan daño a plantaciones, animales y al propio ser humano.

En general, las fases que desarrollan los hongos sobre sus hospedantes son: germinación, formación de apresorios, formación de estructuras de penetración, colonización y reproducción. El inoculo o unidad inefectiva esta constituido por las estructuras de reproducción sexual y asexual, es decir las esporas o conidias.

El proceso se inicia cuando la espora o conidia se adhiere a la cutícula de la garrapata Boophilus; luego se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la penetración al interior del cuerpo de la garrapata boophilus, en la que participa un mecanismo físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida por la hifa, la cual rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula.

El mecanismo químico consiste en la acción enzimática, principalmente proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan descomposición del tejido de la zona de penetración. Después de la penetración, la hifa se ensancha y ramifica dentro del tejido de la garrapata Boophilus, colonizando completamente y a partir de la 'cuai se forman pequeñas colonias y estructuras del hongo, lo que corresponde a la fase final de la enfermedad plagizante.

Algunas de las ventajas de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas particularmente para matar garrapatas Boophilus en bovinos son: la especificidad, la cual varía considerablemente, algunos hongos infectan un amplio rango de hospederos y otros están restringidos a unos pocos o a una sola especie de plagas. Por ejemplo la Beauveria Bassiana y Metharhizium anisopliae, infectan cerca de 100 especies diferentes de insectos, larbas y plagas en varios ordenes, (Coleóptera, Lepidóptera, Hemíptera, Homóptera) pero los aislamientos de estos dos hongos tienen un alto grado de efectividad. Los hongos entomopatógenos son efectivos y más en ésta formulación y composición planteada para ser sujeta de patente.

Cabe mencionar que la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas particularmente para matar garrapatas boophilus en ganado bovino será efectiva contra las plagas, no contaminará el medio ambiente por su composición natural, no destruirá insectos benéficos, no será tóxica para el ser humano ya que está demostrado que existen otras propuestas de origen químico que alteran los niveles hormonales de los hombres, afectando su fuerza y generándoles escenarios de debilidad física y sexual.

La formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas particularmente para matar garrapatas boophilus en ganado bovino no desarrolla resistencia, y no deja residuos en la piel o en el organismo del bovino.

Hay investigaciones prometedoras sobre el posible uso de hongos entomopatógenos para el control de garrapatas Boophilus. Pero hasta ahora la disponibilidad de productos comerciales y la experiencia con los mismos es limitada y aún NO existen composiciones o formulaciones patentadas en México, según rastreo y revisión pormenorizada en distintos medios de información y con especialistas en el área.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1.- Muestra una vista frontal del Cultivo de Hongos Entomopatógenos dentro de una incubadora.

Figura 2.-Muestra una vista superior de una caja Petri con el cultivo de Beauveria bassiana donde se aprecian sus características morfológicas.

Figura 3.- Características morfológicas del Metarhizium anisopliae.

Figura 4.- Bioensayos realizados en larvas de entre 7 y 10 días con los 2 formulados de Beauveria bassiana llevando a cabo el método para la multiplicación de hongos entomopatogenos con sustrato natural (arroz).

Figura 5.- Bioensayos realizados en larvas de entre 7 y 10 días con los formulados de Beauveria bassiana con materiales inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros aditivos llevando a cabo el método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas.

Figura 6.- Bioensayo agregando el agente tensioactivo o surfactante aniónico organofosforado al método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas.

Figura 7.- Muestra el procedimiento en donde la Beauveria bassiana se incorpora en el método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas. Se presenta la perspectiva de la cepa de hongo denominada Beauveria bassiana parte esencial de la formulación la cual se disuelve en 5 litros de agua. Figura 8.- Muestra el procedimiento en donde el metarhizium se incorpora en el método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas. Se presenta la perspectiva de la cepa de hongo denominada Metharhizium anisopliae parte esencial de la formulación la cual se disuelve en 5 litros de agua.

Figura 9.- Procedimiento en donde la materia prima celulosa se incorpora en el método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas Figura 10.- Bioensayo del Procedimiento en donde se muestra la combinación manual del método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas.

Figura 11.- Bioensayo del vertimiento del agente tensioactivo o surfactante anionico organofosforado dentro del método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas.

Figura 12.- Muestra la formulación de hongos entomopatógenos recombinados preferentemente en partes iguales y los diluimos en agua ozonificada: un litro de agua por 1 gr. (gramo) de hongos entomopatógenos.

Figura 13.- determinando la fase final ciel método preferente de obtención de la formulación con hongos entomopatógenos para el control de plagas Figura 14.- Muestra un diagrama general donde se aprecian los elementos para el aislamiento de hongos entomopatógenos de la formulación objeto de la presente invención en medios de cultivo.

Figura 15.- Muestra la aplicación preferente de la formulación objeto de la presente ' invención.

Figura 16.- Ilustra un diagrama con el Proceso de infección y de invasión del hospedero en ganado cuando se ha aplicado al cuerpo del animal la formulación de hongos entomopatógenos, en donde se esquematiza las etapas de: adhesión de la espora a la cutícula del insecto, la germinación y formación del apresorio, penetración de la cutícula, crecimiento lateral y penetración en la epidermis, agregación de los hemocitos en el lugar de penetración fungica, fagocitocis de cuerpos hifales por células fagócitas del insecto, transformación a cuerpos lavaduriformes, evasión del sistema inmune, propagación en el hemocelele, transformación a cuerpo hifal, esporulación y germinación atravesando la cutícula del insecto y diseminación de esporas.

Figura 17.- Proceso toxicológico del hospedero en ganado cuando se ha aplicado al cuerpo del animal la formulación de hongos entomopatógenos.

Figura 18.- Diagrama de flujo general del proceso de producción de hongos entomopatógenos.

Figura 19.- Muestra una gráfica donde se aprecia el porcentaje de Eficacia contra plagas y pulgas.

Figura 20.- Muestra una gráfica de efectividad que ilustra el porcentaje de Eficacia contra '” garrapatas 5 Figura 21.- Diagrama de flujo de proceso de la formulación con hongos entomopatógenos.

Figura 22.- Muestra el cadáver de garrapa boophilus invadida por el efecto de la aplicación de la formulación de hongos entomopatógenos objeto de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN 0 El MIP (Manejo Integral de Plagas) es una alternativa para disminuir la dependencia en el uso de insecticidas químicos sintéticos. Se basa en las prácticas culturales con orientación al control de plagas, la capacidad que tiene el ganado para tolerar o resistir sus daños y la acción de los factores naturales de mortalidad de las mismas, como lo son los 5 parasitoides, depredadores y patógenos de insectos-plagas. Estas tres últimas son la alternativa de control más usada para sustituir el uso inadecuado de los insecticidas Es por lo anteriormente expuesto que el Centro Universitario de Estudios e Investigación de Proyectos, S.C., se dio a la tarea de hacer estudios de investigación en 0 campo y gabinete, con la finalidad de usar microorganismos entomopatogenos (hongos) viviendo en un medio acuoso surfactante aniónico organofosforado y su aplicación en suelos agrícolas y ganado vacuno; para el control de insectos plaga. Estos organismos generalmente tienen como efecto la muerte directa de la especie de insecto que atacan o actúan como antagonistas inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos mediante 5 sustancias que excretan.

La formulación con Hongos Entomopatógenos para el control de plagas particularmente para matar garrapatas Boophilus en bovinos es una invención única sujeta a patentarse por sus cualidades y relevantes resultados, ya que constituye una solución importante en’ el control biológico de diversas plagas, considerando como prioridad a la garrapata boophilus.

El Laboratorio del Centro Universitario de Estudios e Investigación de Proyectos, S.C. es la Institución sede para la creación de ésta formulación, es el lugar idóneo conformado y adaptado para el cultivo de éstas dos cepas de hongos ya que se acondicionó de tal forma que tuviera los aspectos como temperatura, escasa iluminación, medio ambiente y atmósfera acordes a los escenarios idóneos para su reproducción, todo está delimitado dentro del Laboratorio de Cultivo.

EJEMPLO 1: MÉTODO PREFERENTE DE CULTIVO DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS El medio de cultivo es una sustancia o solución que permite el desarrollo de microorganismos, mientras que el cultivo es el producto del crecimiento de un organismo. Los medios utilizados en micología deben contener los nutrientes suficientes para asegurar el desarrollo y reproducción de los hongos (carbono, nitrógeno, vitaminas, oligoelementos, etc.) y un pH ligeramente ácido (6 - 6.3) para facilitar su crecimiento e inhibir al mismo tiempo el desarrollo de otros microorganismos. Se puede añadir antibióticos antibacterianos para inhibir el crecimiento de bacterias saprofitas que suelen contaminar las muestras. Los medios pueden ser sólidos o líquidos. Para conseguir un medio sólido (arroz) se debe agregar una sustancia solidificante como el agar (gelatina vegetal) o el agar agar (polisacáridos provenientes de algas), el cual no tiene valor nutritivo sino que sirve simplemente para mantener la humedad por un tiempo más o menos prolongado. (Figura 1).

La humedad es fundamental para el desarrollo de los hongos, porque cuando ésta comienza a disminuir, la formación de micelio también disminuye y el hongo tiene que’ asegurar su perpetuidad formando estructuras propagativas (esporas, conidias) y de conservación (clamidosporas). El agar empieza a derretirse a partir de 80 °C y soporta temperaturas altas sin descomponerse, solidificándose entre los 35 y 50 oC.

Los medios de cultivo se vierten en placas Petri o en tubos inclinados. Los primeros ofrecen la ventaja de tener mayor superficie para el desarrollo del hongo y se utilizan para trabajos rutinarios de aislamientos, aspecto del cultivo, velocidad de crecimiento, etc. sin embargo, son más fáciles de contaminarse. Los tubos, a pesar de tener una superficie mucho más reducida, ofrecen seguridad en su manipulación y buena resistencia a la deshidratación y a la contaminación. Se utilizan para conservar cultivos por tiempo más o menos prolongado. Los medios se seleccionan en base al tipo de muestra que queremos reproducir. (Figura 20) El pH recomendado para el cultivo de hongos en el laboratorio es de alrededor de 7, un pH neutro o ligeramente ácido (6.8). Para seguridad del que opera y evitar contaminaciones, los medios de cultivo se deben manipular en campanas de flujo laminar.

EJEMPLO 2: EVALUACIÓN DE LAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Beauveria bassiana (Bálsamo) Vuillemin Colonia: La colonia en PDA a los 14 días es algodonosa a polvorienta, blanca. A medida que va pasando el tiempo la colonia se vuelve amarillenta, cremosa. El revés es de color rojizo al centro y amarillento alrededor. (Figura 2) EJEMPLO 3: EVALUACIONES DE LAS CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS MÁS IMPORTANTES DE LOS HONGOS ENTOMOPATÓGENOS Metarhizium anisopliae (Metschnikoff) Sorokin Colonia a los diez días: Pegada al medio, completamente redonda, de colores oliváceo, amarillento,’ verdoso, marrón oscuro, dependiendo del aislamiento. Revés incoloro a marrón, a veces verdoso citrino. (Figura 3) EJEMPLO 4: DE UN MÉTODO PARA LA MULTIPLICACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS CON SUSTRATO NATURAL (ARROZ).

El sustrato puede ser humedecido previa esterilización o previa inoculación dependiendo del tipo de materia prima o combinación de estas y ajustes realizados. Un exceso de humedad (70-80% aproximadamente) provocaría baja disponibilidad de oxígeno y por ende pobre desarrollo del microorganismo. Además compactaría el substrato impidiendo una colonización total de su superficie. Por otro lado, una baja humedad podría inhibir el desarrollo del microorganismo al no poner la suficiente cantidad de nutrientes en solución para ser usado por este además de la poca resistencia a la desecación que tienen los hongos en el periodo activo de crecimiento micelial.

Durante la incubación se debe regular el régimen luz-oscuridad. Cuando se obtiene la biomasa conidial óptima sobre toda la superficie del sustrato se pasa al proceso de secado para que los conidios permanezcan viables en almacenamiento por mayor tiempo. Este proceso se optimiza con deshumidificadores o aires acondicionados o acelerando la ventilación con ventiladores lo que depende de las condiciones locales. El sustrato con el hongo proveniente del cuarto de crecimiento se coloca en el cuarto de secado, a una temperatura no mayor de 28 °C, con baja humedad relativa (<70%) y sin entrada de rayos solares. Un cuarto con acondicionador de aire provee las condiciones adecuadas para el secado de este material. El material se esparce sobre papel periódico y sobre un plástico negro, manteniéndose por 12 días, hasta que el contenido dé númedad descienda al 12 ó 14% . En estas condiciones el material es enfundado en recipientes de 1 Kg y estará listo para ser utilizado directamente en las aplicaciones en el campo ó almacenarse en refrigeración (4 a 8°C). En este último caso, el hongo puede permanecer viable hasta por 6 meses.

Posterior al secado y previo al paso final de envasado en el flujo de producción se realiza la cosecha. Es en este momento que comienza la etapa de formulación donde se prepara una combinación de ingredientes de forma que el principio activo (esporas) se mantenga estable, efectivo y fácil de aplicar.

Durante todo el proceso la regulación de la temperatura ambiental es esencial la que debe ser lo más próxima posible a la temperatura óptima (máxima 22.1 grados centígrados y mínima 12.6 grados centígrados) de desarrollo del microorganismo.

Los sustratos utilizados varían según la región y la finalidad de la multiplicación. En éste procedimiento se utilizó arroz pelado (Figura 20). El Procedimiento es el siguiente: 1. Remojar el sustrato en agua con hipoclorito de sodio al 1% durante 16 horas. 2. Enjuagar varias veces con abundante agua, hasta que ya no se sienta el olor a hipoclorito. 3. Embolsar 800 gramos de sustrato por bolsa y agregar 200 mi de agua destilada. 4. Esterilizar durante 20 minutos a 15 libras de presión por dos días consecutivos.

Preparación del inoculo: 1. Preparar un litro de medio PDA líquido y mantener durante tres días en agitación de 130 rpm. 2. Sembrar el hongo en el medio.

Inoculación al sustrato: 1. Agregar en cada bolsa 20 mi del inoculo, en la cámara de flujo laminar. 2. Sellar las bolsas. 3. Incubar a 20 °C durante siete días. 4. A los siete días, realizar el primer conteo de número de conidias Conteo del número de estructuras propagativas: 1. Agregar en un vaso de precipitados o en un tubo de ensayo un gramo del sustrato y 10 mi de agua destilada estéril. 2. Agitar enérgicamente, o con un agitador, por espacio de un minuto, para que las conidias se desprendan. 3. Tomar 100 ml de la suspensión y completar a 1 mi con agua destilada más Tween al 0.1%. 4. Hacer las diluciones necesarias hasta poder contar las conidias en la cámara de Neubauer. 5. Realizar el cálculo correspondiente al peso de la bolsa. (Figura 4) EJEMPLO 5: MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. En donde la formulación del hongo es el proceso mediante el cual el ingrediente activo, es decir las conidias del hongo, se mezclan con materiales inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros aditivos. Estos materiales inertes ayudan a que el hongo trabaje mejor. Todo esto se hace con el fin de lograr una buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder ser manipuladas y aplicadas adecuadamente. Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95% y el contenido de humedad debe estar entre 4 y 6 %.A temperatura ambiente las conidias mantienen su viabilidad por m.s tiempo cuando el hongo ha sido formulado que cuando se almacena el polvo sin formular. (Figura 5) EJEMPLO 6: DEL AGENTE TENSIOACTIVO O SURFACTANTE AGREGADO AL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. En cuanto a la formulación en mención se adhirió el agente tensioactivo o surfactante anionico organofosforado anionico organofosforado agregado a la composición en una proporción de 0-20% preferentemente. (Figura 6) EJEMPLO 7: DE LA BEAUVERIA BASSIANA EN EL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. Se presenta la perspectiva de la cepa de hongo denominada Beauveria bassiana parte esencial de la formulación la cual se disuelve en 5 litros de agua con 1 gramo de la muestra con un dispersante, con lo cual se tendría la solución madre. De esta se toma un mililitro y se disuelve en 9 mi de agua destilada teniendo la dilución 10 -1 y así sucesivamente hasta obtener una dilución 10 -4, de la cual se toma una muestra de 0,01 mi y se llena el hemocitómetro. Se cuentan todos los cuadrantes el centro que son 25 y se aplica la siguiente fórmula (C= N * Dilución empleada * Factor de la cámara) donde C es la concentración de conidios que se desea conocer, N es el promedio de conidios por cuadrante y el factor de la cámara que es 104; de esta forma se determina la concentración de conidios del hongo evaluado por mi. (Figura 7) EJEMPLO 8: DEL METARHIZIUM EN EL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. La presente invención cuenta con los medios suficientes para soportar la viabilidad de la utilización de la FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente para MATAR GARRAPATAS BOOPHILUS EN BOVINOS, es por esto que las figuras en mención muestra el panorama de la cepa de Hongo Metarhizium anisopliae en sus diferentes etapas de producción hasta la fase en la que se encuentra lista para su incorporación en la composición de la fórmula, en una proporción propuesta de 0-18%. (Figura 8) EJEMPLO 9: MATERIA PRIMA CELULOSA EN EL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. La materia prima ceiuiosa se suma a la FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente para MATAR GARRAPATAS BOOPHILUS EN BOVINOS, ya que su función será la de formar cadenas largas y lineales, las cuales no se presentan aisladas sino unidas entre sí mediante enlaces de hidrógeno intramolecular formando una estructura supramolecular cristalina y organizada, resistente a la hidrólisis, las celulasas o preparados con actividad enzimática múltiple (celulasa, hemicelulasa y pectinasa) se indexaron debido a su efecto sinergístico, por el potencial que tienen sobre la hidrólisis de los componentes estructurales de la pared celular de diversos organismos. (Figura 9) EJEMPLO 10: MEZCLA MANUAL DEL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. Según la panorámica en donde se presenta la combinación manual industrial de 9000 rpm de la formulación concentrada de hongos entomopatógenos, al efectuarse tal recombinación las proteínas se potencializarán y penetrarán con mayor fuerza en la cutícula de la piel de la garrapata y así se generará en su organismo una intoxicación lo que desencadenará su exterminio. (Figura 10) EJEMPLO 11: VERTIMIENTO DEL AGENTE TENSIO ACTIVO O SURFACTANTE ANIONICO ORGANOFOSFORADO DENTRO DEL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. Se presenta la vista perspectiva del vertimiento del agente tensioactivo o surfactante aniónico organofosforado. Se observo en nuestros laboratorios que la muerte del insecto se produce con mayor rapidez cuando es afectado por nuestro producto (hongo en medio acuoso surfactante aniónico organofosforado) que produce cantidades considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destrucción de los tejidos y a las deficiencias nutricionales. Los individuos enfermos no se alimentan, presentan debilidad, desorientación y cambian de color, presentando manchas oscuras sobre el tegumento, que corresponden con las esporas germinadas del hongo. Con la muerte del insecto termina el desarrollo parasítico del hongo y empieza la fase saprofítica: el hongo crece en el hemocele formando masas miceliares que salen al exterior fundamentalmente por las regiones intersegmentales, esporulando sobre el cadáver y produciendo inoculo para infectar a otros insectos y por las aberturas naturales: espiráculos, boca y ano. (Figura 11) EJEMPLO 12: RECOMBINACIÓN DE HONGOS DENTRO DEL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. En base a la Figura 9 las dos cepas de hongos Beauveria bassiana y Metarhizium anisopliae recombinados por un periodo de 20 días mezclan sus proteínas entre sí dejando un hongo entomopatogeno con patologías de alta efectividad para actuar sobre diversas plagas particularmente las garrapatas boophilus y exterminarlas. Nuestro microorganismo, hongos entomopatógenos, posee características muy especiales que les permiten sobrevivir en forma parasítica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposición.

El crecimiento saprofito dio como "resultado la producción de conidióforos, conidias y ? desarrollo miceliar, lo cual pemiite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando téenicas de producción en masa de bajo costo. Prácticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos hongos. La formulación finalmente consta de hongos entomopatógenos recombinados preferentemente en partes iguales y los diluimos en agua ozonificada: un litro de agua por lgr. (gramo) de hongos entomopatógenos. (Figura 12) EJEMPLO 13: FASE FINAL DEL MÉTODO PREFERENTE DE OBTENCIÓN DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. En donde se muestra la combinación de ésta cepas de hongos entomopatógenos en su fase final siendo una medida de supresión directa, su efecto depende de la siguiente aplicación: (Figura 13) La formulación del hongo es el proceso mediante el cual el ingrediente activo, es decir las conidias del hongo, se mezclan con materiales inertes, tales como vehículos, solventes, emulsificantes y otros aditivos. Estos materiales inertes ayudan a que el hongo trabaje mejor. Todo esto se hace con el fin de lograr una buena homogeneidad y distribución de las partículas del hongo, para poder ser manipuladas y aplicadas adecuadamente.

Para ser formulado, la viabilidad del hongo no debe ser menor de 95% y el contenido de humedad debe estar entre 4 y 6 %. A temperatura ambiente las conidias mantienen su viabilidad por mi. tiempo cuando el hongo ha sido formulado que cuando se almacena el polvo sin formular. (Figura 23) g EJEMPLO 14: EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS.

Los parámetros que deben ser evaluados son: Supervivencia de garrapatas adultas. Se registró en una hoja electrónica de datos 0 diariamente durante tres meses el número de garrapatas adultas muertas para cada concentración del hongo.

Periodo de preoviposición y oviposición. Se calculó el periodo de preoviposición y oviposición en las hembras teleoginas inoculadas con las diferentes concentraciones del hongo. 5 Porcentaje de eclosión y supervivencia larvaria. Para los dos ensayos el porcentaje de eclosión se calculó mediante un conteo de cascarones y la supervivencia larvaria se determinó ocho días después de observar la eclosión de todos los huevos. índice de eficiencia de la conversión (IEC). (IEC) = Peso de los huevos de la unidad experimental / peso de las hembras de la unidad experimental al inicio del ensayo, es un 0 parámetro cuantitativo utilizado para determinar la conversión del peso de una hembra ingurgitada en huevos, Benavides et al. 1999.

Eficiencia del hongo (EH). El índice de eficiencia de la conversión (IEC) de cada grupo de garrapatas tratadas se comparó con el IEC de los grupos control para obtener la eficiencia del hongo. EH = (IEC grupo control - IEC grupo tratado)/ (IEC grupo control) x 100, Raymond et al. 2004.

Análisis estadístico. Las variables peso final, peso de la oviposición, periodo de preoviposición, periodo de oviposición, y porcentaje de eclosión de huevos se estudiaron mediante análisis de varianza bifactorial teniendo en cuenta como factores el peso inicial de la garrapata y la concentración del hongo. La mortalidad diaria para cada concentración se comparó mediante las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier aplicando la prueba Generalizada de Gehan Wilcoxon. Se calculó también el tiempo letal 50 (TL50) para cada concentración. Las comparaciones múltiples de medias se efectuaron con la prueba de Newman- Keuls para a = 0,05. Los análisis se realizaron con el paquete estadístico STATISTICA 7.0, StatSoft, Inc. Tulsa, Ok, U.S.A.

EJEMPLO 15 EVALUACIÓN DE LA EFECTIVIDAD DE LA FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS. Según lo esquematizado en las Figuras 12-1 y 12-2 se presentó durante y después de la aplicación una acción ovicida, elimino el 100% de las larvas del parásito y además fue efectivo contra el 40% de los parásitos adultos tratados. Es por esto que nuestra propuesta de FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente para MATAR GARRAPATAS BOOPHILUS EN BOVINOS comprueba que la unión de los elementos entomopatógenos nos ayuda a controlar el parásito en todos sus estados de vida. (Figura 21).

Cabe mencionar que para el método de recuento de garrapatas y medición de los resultados de la aplicación de la FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente MATAR GARRAPATAS BOOPHILUS EN BOVINOS se llevó a cabo bajo lo siguiente: (Figura 22) a) La evaluación se realizó sobre dos grupos, cada uno de 20 caninos mestizos, uno de los grupos naturalmente infestado con una elevada carga de garrapatas de la especie boophilus. En uno de los establecimientos, la formulación en estudio, aplicada por el método spot on (exactamente o perfecto) demostró una eficacia en el control del 98.43% a las 24 horas posteriores de la aplicación del tratamiento y del 99.82% de eficacia al día +2 post-tratamiento, a partir del día +3 presentó un 100% de eficacia, la que se mantuvo durante los 32 días de duración del ensayo.

En el otro establecimiento, se trataron 20 bovinos, naturalmente infestados de garrapátas y la misma formulación aplicada en forma de spot on, demostró una eficacia, en el control de la garrapata de la especie boophilus del 97.76% el primer día post-tratamiento y del 98.86% el segundo día post-tratamiento. A partir del tercer día y hasta el día 28 (días de observación), presentó una eficacia del 100%. A pesar de que el día 32 la eficacia disminuyó al 98.07% aún se mantuvo en un buen nivel.

Ambos grupos fueron comparados con animales testigos, los que se mantuvieron parasitados durante los 32 días de duración del ensayo. b) Se revisó todo el cuerpo del animal, prestando especial atención a los pabellones auriculares, tabla del cuello y margen inferior del mismo, cara interna de las extremidades, región perianal y espacios interdigitales. c) Se consideró el número totáf’tíe formas parasitarias halladas, tanto teleoginas ovigeras como también larvas y ninfas. d) En ambas evaluaciones se revisaron los animales y se recontaron garrapatas de los animales tratados y testigos los días -1, 0, +1, +2, +7, +14, +21, +28 y +32. e) Se evaluaron los resultados con el objetivo de medir la eficacia y el poder residual de la FORMULACIÓN sujeta a patentarse, la cuál se midió bajo la fórmula de Henderson & Milton, 1995. 100 - (IQOxpromedio de garrapatas del lote tratado) X promedio garrapatas lote testigo pre-tratamiento Promedio garrapatas lote testigo promedio de garrapatas lote tratado pre-tratamiento Ninguno de los animales en estudio recibió medicación alguna durante el transcurso de la prueba ni se realizó en las instalaciones aplicación de ningún insecticida y/o acaricida de acción ambiental, habiéndose constatado que tampoco se lo hubiera hecho en los treinta días previos para descarta cualquier tipo de reacción residual. f) Las garrapatas observadas estaban muertas y algunas no alcanzaron a desprenderse lo que seguramente determinó una dispersión más lenta del producto sobre el cuerpo del animal. (Figura 24) En todos los escenarios los grupos testigos de bovinos sin tratamiento se mantuvieron con una infestación elevada de garrapatas, superior o igual a la infestación inicial.

EJEMPLO 16: PROTOCOLO PROPUESTO PARA EL AISLAMIENTO DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS DE LA FORMULACIÓN OBJETO DE LA PRESENTE INVENSIÓN EN MEDIOS DE CULTIVO. a) caja Petri con papel filtro (Cámara seca); b) larvas muertas después del contacto con la muestra de suelo; c) larvas que muestran la patología típica de infección por nematodos; d) emergencia de juveniles infectivos en la trampa White. e) dilución seriada de la suspensión acuosa que contiene al hongo; f) inoculación de la suspensión (alícuota de 0.1 mi) en una caja petri con medio de cultivo; g) incubación bajo condiciones controladas en una cámara DBO; h) almacenaje de conidios en tubos Eppendorf, bajo condiciones de congelación. (Figura 14) EJEMPLO 17: GENERALIDADES DE LA APLICACIÓN PREFERENTE DE LA FORMULACIÓN OBJETO DE LA PRESENTE INVENSIÓN Se sugiere utilizar cinco litros de la formulación de hongos entomopatógenos por cada 10 kg de peso del animal, a los diez días repetimos la aplicación y realizamos aplicaciones subsecuentes de acuerdo al comportamiento que presente el parásito.

Las recomendaciones y el seguimiento del control biológico que debemos seguir para el buen uso de esta invención son: • Aplicar en horas de baja luminosidad de 19:00 a 21:00 hrs.

• Antes del ordeño lavar las ubres de las vacas tratadas.

· Utilizar una bomba de espalda libre de residuos químicos.

• En zonas cálidas (> 30°C) conservar los productos refrigerados entre 2 y 9 °C.

• Si se han bañado los animales con venenos esperar 10 días para la aplicación del control biológico.

Resaltamos la importancia de que la aplicación tiene que ser hecha en las tardes para que los hongos no mueran, durante la noche es asimilada la proteína tóxica sobre la piel de las garrapatas, y al día siguiente los hongos son exterminados por los rayos ultravioleta, haciendo prácticamente inocuos al medio ambiente a diferencia de otras alternativas para el control biológicos de plagas que dejan residuos tóxicos. (Figura 15) EJEMPLO 18: PROCESO DE INFECCIÓN Y DE INVASIÓN DEL HOSPEDERO EN GANADO CUANDO SE HA APLICADO AL CUERPO DEL ANIMAL LA FORMULACIÓN DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS La enfermedad producida por hongos se llama micosis y se presenta de la siguiente fonna: 1.- Adhesión y germinación de la espora en la cutícula del insecto: El proceso de adhesión, dependiendo del hongo, puede ser un fenómeno específico o no específico. Mientras que la germinación de las esporas es un proceso mediante el cual una espora emite uno o varios pequeños tubos germinativos que al crecer y alargarse dan origen a las hifas, este proceso depende de las condiciones de humedad y temperatura ambiental. En menor grado la luz condiciona el ambiente alimenticio. La espora que germina en el insecto forma un tubo germinativo el cual funciona como ú á hifa de penetración de la cutícula. También puede producir uña" estructura llamada apresorio, la cual ayuda a la adhesión de la espora.

El éxito de la germinación y penetración no dependen necesariamente del porcentaje de germinación sino del tiempo de duración de la germinación, modo de germinación, agresividad del hongo, tipo de espora y susceptibilidad del hospedante.

Los hongos, además, pueden infectar a los insectos a través de las aberturas corporales como son cavidad bucal, espiráculos y otras aberturas externas. Las esporas pueden germinar rápidamente en estos ambientes por ser húmedos. Cuando lo hacen en los fluidos digestivos, pueden destruir a la hifa germinativa. En este caso, el insecto no muere de micosis sino a causa de las toxinas. 2.- Penetración dentro del hemocele: Esta penetración por parte de la hifa es el resultado de la degradación enzimática de la cutícula y la presión mecánica ejercida por el tubo germinativo. Además, depende de las propiedades de la cutícula, grosor, esclerotización, presencia de sustancias nutricionales y antifungosas y estado de desarrollo del insecto. La digestión del integumento se produce mediante las enzimas (proteasas, aminopeptidasas, lipasas, esterasas y quitinasas). Cuando la hifa ha llegado al hemocele, se pueden producir diferentes reacciones de defensa del insecto frente a un cuerpo extraño: la fagocitosis, encapsulación celular y la formación de compuestos antimicrobianos como las lisozimas, aglutininas y melanización. En este caso, el hongo debe vencer el sistema inmunológico del hospedante antes de entrar a la hemolinfa y desarrollarse dentro del insecto. 3. Desarrollo del hongo que resulta en la muerte del insecto: Luego de que llegue al hemocele, el hongo puede evitar la defensa inmune del insecto produciendo células parecidas a levaduras, llamadas blastosporas, que se multiplican y dispersan rápidamente, desarrollando protoplastos, elementos discretos ameboideos, sin pared celular que no son reconocidos por los hemocitos del hospedante y produciendo micotoxinas. La dispersión de éstos en el hemocele depende de la especie del hongo.

Las toxinas producidas juegan un rol muy importante en el modo de acción de los hongos entomopatógenos. La muerte del insecto se produce con mayor rapidez cuando es afectado por un hongo entomopatógeno que produce cantidades considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destrucción de los tejidos y a las deficiencias nutricionales.

Cuando se dá el crecimiento del hongo en el hemocele, se producen los síntomas fisiológicos del insecto afectado como convulsiones, carencia de coordinación y comportamientos alterados (deja de alimentarse, reduce su movimiento), entra en un estado letárgico y finalmente muere, lo que puede ocurrir relativamente rápido o en unos cuantos días. Ocurre una competencia entre el hongo y la flora intestinal. Los hongos pueden producir sustancias antibacterianas que alteran la coloración del cadáver. Con la muerte del insecto termina el desarrollo parasítico del hongo y empieza la fase saprofítica: el hongo crece en el hemocele formando masas micelianas que salen al exterior fundamentalmente por las regiones intersegmentales -esporulando sobre el cadáver y produciendo inoculo para infectar a otros insectos- y por las aberturas naturales (espiráculos, boca y ano).

La gran dependencia de la humedad es el mayor factor limitante que presentan los hongos, ya que para que se produzca la germinación y esporulación fuera del hospedante se requieren valores de humedad relativa superiores al 6%.

La invasión del hospedero, directamente a través de la cutícula, partes bucales, membranas intersegmentales, o a través de espiráculos, sitios donde existe alta humedad que promueve la germinación de las esporas y permite la penetración de las hifas, constituye el principal aspecto de la patogénesis. Una vez én contacto con la cutícula en hongo germina, produce un tubo que empieza a deslizarse sobre la cutícula buscando puntos que faciliten su penetración.

Durante el proceso de invasión los tubos germinativos obedecen a cambios bioquímicos o procesos adaptativos y diferenciación celular. El hongo atraviesa la epicuticula, forma placas que van invadiendo y destruyendo los diferentes estratos. Una vez dentro del hemocele la colonización del hospedero se realiza por medio de blastosporas (un estado de desarrollo tipo levaduriforme) y del micelio. El hongo invade la hemolinfa, en cuyo caso la muerte es el resultado de una combinación de daños mecánicos producidos por el crecimiento del hongo, desnutrición (el hongo utiliza azucares y proteínas 'presentes en la hemolinfa) y por la acción de metabolitos secundarios o toxinas. Las enzimas degradadoras de la cutícula una vez absorbidas dentro de la cutícula degradan progresivamente los polímeros en monómeros precursores utilizables.

Las enzimas catabólicas candidatas son aquellas que afectan las proteínas, quitina, cera y lípidos, y otras capas del exoesqueleto tejidos del insecto, del hemocele y de la hemolinfa. (Figura 16) EJEMPLO 19: PROCESO TOXICOLÓGICO DEL HOSPEDERO EN GANADO CUANDO SE HA APLICADO AL CUERPO DEL ANIMAL LA FORMULACION DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS: Los hongos sintetizan metabolitos con acción toxica, identificados a partir de los filtrados del cultivo de hongos o mediante la inyección en lepidópteros y dípteros algunas toxinas son clasificadas dentro de los depsipeptidos cíclicos cómo la beauvericina producida por Lecanicillium (^verticiihum) lecanii y Beauveria hassiana , además del basianolide que es producido por este ultimo hongo y por Paecilomyces fumosoroseu, productos que alteran el transporte de cationes a través de la membrana celular.

Las toxinas provocan alteraciones en varios órganos, paralizan las células o causan un mal funcionamiento del intestino medio, tubos de malpigio, tejido muscular y hemocitos. ( Figura 17)

Claims (14)

REIVINDICACIONES Habiendo descrito suficiente mi invención, considero como una novedad y por lo tanto reclamo como de mi exclusiva propiedad, lo contenido en las siguientes cláusulas:

1. FORMULACION CON HONGOS ENTOMOPATOGENOS PARA EL" CONTROL DE PLAGAS Y SU MÉTODO, caracterizada porque comprende el 1% de Bauveria Bassiana junto con Metharhizium Anisopliae, un 10% de Celulasa y un 89% del Agente Tensioactivo o surfactante anionico organofosforado; lo anterior es porcentaje en Peso.

2. Formulación con hongos entomopatógenos para control de plagas, de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el hongo entomopatógeno es producto de la RECOMBINACIÓN de dos cepas B. Bassiana y Metharhizium Anisopliae.

3. FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS según cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizada porque comprende además un . efecto sinergético dejando un hongo entomopatogeno de alta efectividad para actuar sobre las diversas plagas particularmente la garrapata boophilus y exterminarlas.

4. Método para la producción DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS caracterizada porque comprende: a).- Remojar el sustrato en agua con hipoclorito de sodio al 1% durante 16 horas; b).- Enjuagar tres veces en un recipiente con de abundante agua, hasta que ya no se sienta el olor a hipoclorito; c).- Embolsar 800 gramos de sustrato por bolsa y agregar 200 mi de agua destilada; d).- Esterilizar durante 20 minutos a 15 libras de presión por dos días consecutivos; Preparación del inoculo: e).- Preparar un litro de medio PDA líquido y mantener durante tres días en agitación de 130 rpm; f).- Sembrar el hongo en el medio. Inoculación al sustrato: g).- Agregar en cada bolsa 20 mi del inoculo, en la cámara de flujo laminar; h).- Sellar las bolsas; i).- Incubar a 20 °C durante siete días; j).- A los siete días, realizar el primer conteo de número de conidias; Conteo del número de estructuras propagativas: k).- Agregar en un vaso de precipitados o en un tubo de ensayo un gramo del sustrato y 10 mi de agua destilada estéril; l).- Agitar enérgicamente, o con un agitador, por espacio de un minuto, para que las conidias se desprendan; m).- Tomar 100 ml de la suspensión y completar a 1 mi con agua destilada más Tween al 0.1%; n).- Hacer las diluciones necesarias hasta poder contar las conidias en la cámara de Neubauer; y o).- Realizar el cálculo correspondiente al peso de la bolsa.

5. Método Subsecuente según reivindicación 5 donde, para la producción DE HONGOS ENTOMOPATÓGENOS según la reivindicación 1 se llevarán a efecto los siguientes pasos: a).- El vertimiento del agente tensioactivó o surfactante anionico organofosforado; b).- La recombinación preferentemente en partes iguales b. bassiana y Metharkizuim Anisopliae y diluidos en agua ozonificada: un litro de agua por lgr. (gramo) de hongos entomopatógenos; y c).- La mezcla con celulasa, para formar cadenas largas y lineales, las cuales no se presentan aisladas sino unidas entre sí mediante enlaces de hidrógeno intramolecular formando una estructura supramolecular cristalina y organizada, resistente a la hidrólisis, por el potencial que tienen sobre la hidrólisis de los componentes estructurales de la pared celular de diversos organismos.

6. FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente la garrapata boophilus EN BOVINOS de acuerdo a la reivindicación 1 caracterizado porque el proceso de recombinación de los hongos entomopatógenos se inicia cuando la espora o conidia se adhiere a la cutícula de la garrapata boophilus; luego se produce un tubo germinativo y un apresorio, con éste se fija en la cutícula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa de penetración) se da la penetración al interior del cuerpo de la garrapata boophilus, en la que participa un mecanismo físico y uno químico, el primero consiste en la presión ejercida por la hifa, la cual rompe las áreas esclerosadas y membranosas de la cutícula y penetra al organismo de la garrapata boophilus exterminándola.

7. La FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente la garrapata boophilus EN BOVINOS según reivindicación 1 y 2 caracterizado porque consta de los elementos entomopatógenos en partes iguales y los diluimos en agua: un litro de agua por gramo de entomopatógenos. Utilizamos cinco litros de agua por animal, a los diez días repetimos la aplicación y realizamos aplicaciones subsecuentes de acuerdo al comportamiento que presente el parásito.

8. Que derivado de la Reivindicación 3 las recomendaciones para la aplicación de FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS caracterizado porque particularmente es para MATAR GARRAPATAS BOOPHILUS EN BOVINOS y el seguimiento del control biológico que debemos seguir para el buen uso de esta invención serán: a) Aplicar en horas de baja luminosidad, b)Antes del ordeño lavar las ubres de las vacas tratadas, c) Utilizar una bomba de espalda libre de residuos químicos, d) En zonas cálidas (> 30°C) conservar los productos refrigerados entre 2 y 9 °C y e) Si se han bañado los animales con venenos esperar 10 días para la aplicación del control biológico.

9. En base a la Reivindicación No. 1 la FORMULACIÓN CON HONGOS ENTOMOPATÓGENOS PARA EL CONTROL DE PLAGAS particularmente para MATAR GARRAPATAS BOOPHILUS EN BOVINOS caracterizado porque se origina de un PROCESO ORGÁNICO, es por esto que será efectiva contra las plagas, no contaminará el medio ambiente por su composición natural, no destruirá insectos benéficos, no será tóxica para el ser humano ya que está demostrado que existen otras propuestas de origen químico que alteran los niveles hormonales de los hombres, afectando su fuerza y generándoles escenarios de debilidad física y sexual.

10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 caracterizado porque el hongo entomopatógeno es seleccionado de cualquiera de las cepas con número de depósito FHE250312 (cepa 205) y FHE180513 (cepa 298).

11. Hongo entomopatógeno caracterizado porque es seleccionado de cualquiera de las cepas con número de depósito FHE250312 (cepa 205) y FHE 180513 (cepa 298).

12. Uso de la FORMULACION según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 para el control biológico de plagas.

13. Uso según la reivindicación 2 donde la plaga es la recombinación de los hongos B. bassiana y Metharizium.

14. Que según reivindicaciones anteriores el HONGO ENTOMOPATÓGENO que se origina de la formulación presenta una patogenicidad que es diferente y inexistente y que la hace ser una medida de supresión directa hacia la garrapata boophilus sujeta a patentarse.