MX2013012309A - Formulacion antigenica. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una formulación antigénica que comprende un antígeno biológico, en donde la formulación comprende un aceite que contiene, como constituyente principal, un éster de ácido graso de ácido eleosteárico; la invención también se refiere al uso de dicho aceite para fabricar una formulación antigénica.

Description

FORMULACIÓN ANTIGÉNICA MEMORIA DESCRIPTIVA Las presentes invenciones se refieren a una formulación antigénica que comprende por lo menos un antigeno biológico.

En la técnica se conocen las formulaciones que comprenden antígenos biológicos, y se pueden usar, por ejemplo, con propósitos de diagnóstico o como vacunas para prevenir, mitigar o curar una enfermedad causada por un micro(organismo) como bacterias, virus, rickettsias y parásitos. Dicha formulación contiene por lo menos un antigeno (es decir, una sustancia que tenga la capacidad de combinarse específicamente con los productos finales de una respuesta inmune, es decir, anticuerpos y/o receptores superficiales en células T) de origen biológico. Un antígeno biológico puede ser, por ejemplo, un microorganismo vivo (opcionalmente atenuado), un microorganismo muerto, una toxina de un organismo (opcionalmente en una forma inactivada, conocida como toxoide), o cualquier otro metabolito de un organismo, una subunidad de dicho organismo, como por ejemplo el ADN del organismo o una molécula superficial de dicho organismo, como una proteína superficial exterior, una proteína de membrana exterior, lipopolisacárido, carbohidrato, etc. En cualquier caso, el término "antígeno biológico" cubre un microorganismo vivo o muerto, y una molécula biológica (de preferencia una proteína o polisacárido) derivada de un organismo, como una bacteria, virus, animal, protista, hongo, etc. El término "derivado de" comprende que la misma molécula biológica o un precursor de la misma, es producida por el organismo.

La cantidad de interacción entre el antígeno que está presente en una formulación antigénica y los anticuerpos o células T no sólo depende de la propiedad de unión intrínseca del antigeno con los respectivos anticuerpos o receptores de células T, sino también de disponibilidad del/de los sitio(s) de unión relevante(s), también conocidos como epítope(s), del antígeno en la formulación. Esta disponibilidad depende a su vez de la presentación, y la preservación, del antigeno en la formulación. Las formulaciones ideales proporcionan una presentación óptima de antígenos, y de preferencia protegen al antígeno contra la degradación. En la técnica se utilizan más las formulaciones que comprenden aceites inertes, como aceite de hidrocarburo ligero (por ejemplo, Marcol 52™) y escualeno, para la presentación de antígeno. Para aplicaciones en seres humanos se usa ampliamente acetato de vitamina E.

Pero sigue existiendo la necesidad de formulaciones alternativas que proporcionen una buena presentación de antígeno. Con este fin se ha ideado una formulación antigénica de acuerdo con el preámbulo, en donde la formulación comprende un aceite que contiene, como un constituyente principal (normalmente más del 50% en una base en peso del mismo aceite) un éster de ácido graso de ácido eleosteárico. Sorpresivamente se ha encontrado que la capacidad de varios tipos diferentes de antígenos en la presente formulación para su combinación con anticuerpos, se ve mejorada sobre las formulaciones de la técnica anterior, y también que la presentación puede mejorar todavía más sometiendo a la formulación a radiación ultravioleta. Esto último está en completa contradicción con lo que debe esperarse cuando se somete una formulación que contiene un antígeno a radiación UV. Como se conoce comúnmente, la radiación UV resulta nociva para la constitución de muchos antígenos, en particular para las proteínas. No está clara la razón de presentación mejorada encontrada de los antigenos. Una ventaja concomitante del uso de un ácido graso de ácido eleosteárico es su biodegradabilidad, gracias a lo cual el aceite puede dejar menos trazas en el cuerpo si se compara, por ejemplo, con aceites no biodegradables, como aceite de hidrocarburo ligero y escualeno. La presente invención también se refiere al uso de un aceite que contiene, como constituyente principal, un éster de ácido graso de ácido eleosteárico para fabricar una formulación antigénica que comprende por lo menos un antígeno biológico.

Se ha visto que el aceite se puede usar para constituir una emulsión junto con una fase acuosa. Como es comúnmente sabido, una emulsión es un sistema dispersado que contiene por lo menos dos fases líquidas inmiscibles. Invariablemente una de las dos fases inmiscibles es acuosa, mientras que la otra es un aceite (lo que denota simplemente un líquido inmiscible en agua). Que la fase acuosa o la fase de aceite se vuelva la fase dispersada depende, entre otras cosas, de las cantidades de las dos fases líquidas presentes. Una emulsión en la que el aceite está dispersado como gotitas a través de la fase acuosa, se conoce como una emulsión de aceite en agua (O/W por sus siglas en inglés). Cuando la fase dispersada es agua y el aceite es el medio dispresante (también llamado medio continuo), la emulsión es del tipo agua en aceite (W/O por sus siglas en inglés). Además, se han desarrollado múltiples emulsiones, en particular con la intención de retardar la liberación de un ingrediente activo. En estos tipos de emulsión están presentes tres (o más) fases. Una emulsión tal es, por ejemplo, del tipo W/O/W ó O/W/O. Se sabe que los antígenos biológicos pueden dar lugar a una respuesta inmunológica más rápida y mejor cuando están emulsificados en vez de estar simplemente suspendidos en una formulación acuosa.

El éster de ácido graso puede ser un triglicérido de ácido eleosteárico, que es una forma común de ésteres naturales de ácido eleosteárico. De preferencia dichos aceites contienen entre 60 y 90% del éster de ácido graso de ácido eleosteárico. Un típico aceite que se puede usar en la presente invención, se deriva de aceite de semilla de Aleurites fordii (también conocido como "aceite de tung" o "aceite de madera china"). Este aceite de semilla está disponible comúnmente y es económico. Por ejemplo, se puede hacer un aceite derivado afinado (para cumplir con requerimientos específicos) a partir de de este aceite natural, removiendo las impurezas del verdadero aceite de semilla, o agregando componentes como modificadores de viscosidad, estabilizadores, detergentes, etc. En una modalidad el aceite es aceite de tung verdadero, es decir, el aceite obtenido del árbol de tung. El aceite de tung contiene más del 50% (p/p) de un éster de ácido eleosteárico, normalmente entre 73 y 82% (p/p), lo que lo hace idealmente adecuado para usarlo en formulaciones de acuerdo con la presente invención.

Una modalidad de la formulación es una emulsión del aceite en un líquido acuoso. De preferencia, el antígeno está presente en el líquido acuoso. Ejemplos de antígenos adecuados son la toxina APX III, antígenos del virus respiratorio sincitial bovino (como una subunidad de este virus o el virus completo) y antígeno del virus de parainfluenza 3 (como una subunidad de este virus o el virus completo).

Todavía en otra modalidad, la formulación se expone a radiación UV. Fue una total sorpresa encontrar que la presentación del antígeno puede mejorar todavía más sometiendo la formulación a radiación ultravioleta.

La invención se explicará adicionalmente en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 Toxina RTX APXIII formulada en un aceite en emulsión con agua.

Ejemplo 2 Virus de BRS inactivado formulado en un aceite en emulsión con agua.

Ejemplo 3 Virus de PI-3 inactivado formulado en un aceite en emulsión con agua.

Ejemplo 4 Toxina RTX APXIII formulada en un aceite alternativo en emulsión con agua.

EJEMPLO 1 Como un primer ejemplo se hicieron formulaciones con la APX III bacteriana de repetición en toxina, producida por el patógeno de cerdo Actinobacillus pleurpneumoniae (también conocida como APP). Este antígeno se usa como un componente de vacuna, en la vacuna comercialmente disponible Porciíis APP™ (disponible con Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, Los Países Bajos) y se puede usar en una prueba de diagnóstico para establecer si un cerdo ha sido infectado o no por cualquiera de los serotipos de APP 2, 3, 4, 6 u 8 (dichos serotipos producen Axplll).

Se hizo una solución de Tween 80 (Uniqema Nederland BV, Gouda, Los Países Bajos) en 0.01 M de regulador de pH de fosfato (PBS) mezclando magnéticamente 40.79 gramos del Tween 80 en 159.21 gramos del regulador de pH de PBS (50 °C) hasta obtener una solución clara. Esta solución se enfrió a aproximadamente 8°C. A 53.07 gramos de esta solución se le agregaron lentamente 50 gramos de aceite de tung (Vliegenthart BV, Tiel, Los Países Bajos) que tenía una temperatura de aproximadamente 20°C y se mezcló bajo una atmósfera de nitrógeno, utilizando un mezclador Ultra Turrax de 14N rotor/estator (IKA, Staufen, Alemania). La adición del aceite se hizo en 3 minutos y 12 segundos, a una velocidad de mezclado de aproximadamente 1 1000 rpm. Después la emulsión fue agitada durante otros 10 minutos a aproximadamente 22000 rpm. Durante este proceso, la temperatura de la emulsión se elevó de 16 °C a 32 °C. Parece que el 80% de las gotitas de aceite tenían un diámetro de menos de 2 pm (determinado microscópicamente).

A 9.25 gramos de la solución se le agregaron 50.58 gramos de una suspensión acuosa (0.01 M PBS) del antígeno APXIII, hasta alcanzar la formulación final de APXIII. La concentración de antígeno buscada en esta formulación final era de 25 U/ml.

Para constituir una formulación de control, se agregaron 50.58 gramos de la misma suspensión de antígeno APXIII a 9.25 gramos de 0.01 M PBS (buscando también una concentración de APXIII de 25U/ml).

El titulo de las formulaciones fue determinado por un ELISA de masa antigénica, usando anticuerpos dirigidos contra APX III. Para establecer si las formulaciones pueden preservar o no la toxina de la degradación, se realizó una prueba en la que las formulaciones fueron expuestas a radiación ultravioleta. En esta prueba se utilizó el sistema Mirasol PRT (lllumínator versión 5.1 , disponible con CaridianBCT, Lakewood, Colorado, E.U.A.). Aproximadamente 57 mi de una muestra a ser expuesta fueron transferidos a una bolsa de plástico que es estándar para el equipo Mirasol. Después de esto también se agregaron 120 mi de oxígeno. La bolsa que incluía este contenido fue ubicada en el equipo Mirasol de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se se realizó el programa de radiación UV (estándar). El tiempo de irradiación total fue de 15 minutos. Después del tratamiento con UV el gas oxígeno fue removido expulsándolo con gas nitrógeno.

En el cuadro 1 está representada la titulación según fue determinada en las formulaciones. Los títulos son el valor promedio de dos mediciones.

Tal parece que el aceite tiene un efecto positivo sobre la presentación del antígeno en la prueba ELISA: con el aceite el titulo aumenta 13 unidades/ml. Tal parece que la disponibilidad del sitio de unión relevante de APXIII aumenta gracias a la presencia del aceite de tung. Es remarcable el aumento en el título debido a la exposición a radiación UV de 43 a 69 U/ml.

CUADRO 1 Títulos de APXIII de varias formulaciones, con o sin exposición a UV EJEMPLO 2 En un segundo ejemplo se hicieron formulaciones con virus de BRS inactivado. Este antígeno se usa como componente de vacuna en la vacuna comercialmente disponible Bovilis Bovipast™ (disponible con Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, Los Países Bajos) y se puede utilizar en una prueba de diagnóstico para establecer si el ganado ha sido infectado o no con el virus respiratorio sincitial bovino.

Se hizo una solución de Tween 80 (ICI Americas, Wilmington Delaware) en 0.01 M de regulador de pH de fosfato (PBS) mezclando magnéticamente 40.79 gramos del Tween 80 en 159.21 gramos del regulador de pH de PBS (50 °C) hasta obtener una solución clara. Esta solución se enfrió a aproximadamente 20°C. A 53.07 gramos de esta solución se le agregaron lentamente 50 gramos de aceite de tung (Vliegenthart BV, Tiel, Los Países Bajos) que tenía una temperatura de aproximadamente 20°C y se mezcló bajo una atmósfera de nitrógeno, utilizando un mezclador Ultra Turrax de 18N rotor/estator (IKA, Staufen, Alemania). La adición del aceite se hizo en 3 minutos y 13 segundos, a una velocidad de mezclado de 17000 rpm. Después la emulsión fue agitada durante 5 minutos y 30 segundos a 20200 rpm y otros 3 minutos y 30 segundos a 24000 rpm. Durante este proceso, la temperatura de la emulsión se elevó de 22°C a 35 °C. Parece que aproximadamente de 80-90% de las gotitas de aceite tenían un diámetro de menos de 5 pm (determinado microscópicamente).

A 9.25 gramos de la emulsión se le agregaron 50.58 gramos de una suspensión acuosa (0.01 M PBS) del virus de BRS inactivado, hasta alcanzar la formulación final. La concentración de antígeno buscada en esta formulación final era de 125 U/ml.

Para constituir una formulación de control, se agregaron 50.58 gramos de la misma suspensión de virus de BRS a 9.25 gramos de 0.01 M PBS (buscando también una concentración de BRSV de 125U/ml).

El título de las formulaciones fue determinado por un ELISA de masa antigénica, usando anticuerpos dirigidos contra el virus de BRS. También se llevó a cabo una prueba en la que las formulaciones fueron expuestas a radiación ultravioleta. En esta prueba se utilizó el sistema Mirasol PRT (llluminator versión 5.1 , disponible con CaridianBCT, Lakewood, Colorado, E.U.A.). Aproximadamente 57 mi de una muestra a ser expuesta fueron transferidos a una bolsa de plástico que es estándar para el equipo Mirasol. Después de esto también se agregaron 120 mi de oxígeno. La bolsa que incluía este contenido fue ubicada en el equipo Mirasol de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se se realizó el programa de radiación UV (estándar). El tiempo de irradiación total fue de 15 minutos. Después del tratamiento con UV el gas oxígeno fue removido expulsándolo con gas nitrógeno.

En el cuadro 2 está representada la titulación según fue determinada en las formulaciones. Los títulos son el valor promedio de dos formulaciones, cada una fue medida dos veces.

CUADRO 2 Títulos de BRSV de varias formulaciones, con o sin exposición a UV Tal parece que el aceite tiene un efecto positivo sobre la presentación del antigeno en la prueba ELISA: con el aceite el título aumenta 22 unidades/ml. Tal parece que la disponibilidad del sitio de unión relevante de BRSV aumenta gracias a la presencia del aceite de tung. También es importante la aparente protección completa contra la exposición con radiación UV. Sin la presencia del aceite de tung, la radiación UV resulta en una completa pérdida del título. Con el aceite de tung, el título permanece constante.

EJEMPLO 3 En un tercer ejemplo se hicieron formulaciones con el virus de parainfluenza-3 inactivado. Este antígeno se usa como componente de vacuna en la vacuna comercialmente disponible Bovilis Bovipast™ (disponible con Intervet Schering-Plough Animal Health, Boxmeer, Los Países Bajos) y se puede utilizar en una prueba de diagnóstico para establecer si el ganado ha sido infectado o no con el virus de parainfluenza.

Se utilizó la misma emulsión en aceite hecha para la preparación de la formulación de BRSV. A 9.25 gramos de la emulsión se le agregaron 50.58 gramos de una suspensión acuosa (0.01 M PBS) del virus PI-3 inactivado, hasta alcanzar la formulación final. La concentración de antigeno buscada en esta formulación final era de 25 U/ml.

Para constituir una formulación de control, se agregaron 50.58 gramos de la misma suspensión de PI-3 a 9.25 gramos de 0.01 M PBS (buscando también una concentración de PI-3 de 25U/ml).

El título de las formulaciones fue determinado por un ELISA de masa antígénica, usando anticuerpos dirigidos contra el virus PI-3. También se llevó a cabo una prueba en la que las formulaciones fueron expuestas a radiación ultravioleta. En esta prueba se utilizó el sistema Mirasol PRT (llluminator versión 5.1 , disponible con CaridianBCT, Lakewood, Colorado, E.U.A.). Aproximadamente 57 mi de una muestra a ser expuesta fueron transferidos a una bolsa de plástico que es estándar para el equipo Mirasol. Después de esto también se agregaron 120 mi de oxígeno. La bolsa que incluía este contenido fue ubicada en el equipo Mirasol de acuerdo con las instrucciones del fabricante, se se realizó el programa de radiación UV (estándar). El tiempo de irradiación total fue de 15 minutos. Después del tratamiento con UV el gas oxígeno fue removido expulsándolo con gas nitrógeno.

En el cuadro 3 está representada la titulación según fue determinada en las formulaciones. Los títulos son el valor promedio de dos formulaciones, cada una fue medida dos veces.

CUADRO 3 Títulos de PI-3 de varias formulaciones, con o sin exposición a UV Tal parece que el aceite tiene un efecto positivo en la presentación del antigeno en la prueba ELISA: con el aceite el titulo aumenta 2 unídades/ml (aunque las desviaciones estándar en los resultados de las pruebas 1 y 2 viz. 0.9 y 1.1 respectivamente, son tales que estadísticamente este aumento puede no ser relevante). Es muy importante el aumento en el titulo después de la exposición a radiación UV, y todavía más teniendo en cuenta que' sin la presencia del aceite de tung, la radiación UV da como resultado una pérdida completa del titulo. Con el aceite de tung, teniendo como constituyente principal un éster de ácido graso de ácido eleosteárico, el título aumenta.

EJEMPLO 4 En este ejemplo se repitió el experimento del ejemplo 1 , con un éster graso alternativo de ácido eleosteárico, viz. el éster metílico de ácido eleosteárico. Este éster fue usado en forma pura en vez del aceite de tung, como se describe en el ejemplo 1.

La formulación resultante fue sometida a la misma determinación del título como se describe en el ejemplo 1 , incluyendo un tratamiento con UV, como se describe. La diferencia fue que sólo se aplicó 1 minuto de tratamiento UV, teniendo en cuenta el hecho de que 250 µ? de la formulación resultante fue tratada con UV, en vez de los 57 mi como se describe en el ejemplo 1. Los resultados se muestran a continuación en el cuadro 4.

CUADRO 4 Títulos de APXIII de varias formulaciones, con o sin exposición a UV Tal parece que el éster metílico de ácido eleosteárico tiene un efecto positivo sobre la presentación del antígeno en la prueba ELISA: con el aceite el título aumenta 8 unidades/ml. Tal parece que la disponibilidad del sitio de unión relevante de APXIII aumenta gracias a la presencia del aceite. De nuevo, se produce un importante aumento en el título (de 32 a 42 U/ml) gracias a la exposición a radiación UV.

Claims (10)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1. Una formulación antigénica que comprende un antigeno biológico, caracterizada porque la formulación comprende un aceite que contiene, como constituyente principal, un éster de ácido graso de ácido eleosteárico.

2. La formulación de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el éster es un triglicérido de ácido eleosteárico.

3. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el aceite comprende de entre 60 y 90% (p/p) del éster de ácido graso de ácido eleosteárico.

4. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque el aceite se deriva de aceite de semilla de Aleurítes fordii.

5. La formulación de conformidad con la reivindicación 4, caracterizada además porque el aceite es aceite de tung.

6. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación es una emulsión del aceite en un líquido acuoso.

7. La formulación de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada además porque el antigeno está presente en el líquido acuoso.

8. La formulación de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el antígeno se elige de toxina APX III, antígeno del virus respiratorio sincitial bovino y antígeno del virus de parainfluenza 3.

9. La formulación de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, caracterizada además porque la formulación se expone a radiación UV.

10. El uso de un aceite que contiene, como constituyente principal, un éster de ácido graso de ácido eleosteárico para fabricar una formulación antigénica que comprende por lo menos un antígeno biológico.