MX2013009650A - Sustratos indirectos para microorganismos que metabolizan 1, 2-propanodiol. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere generalmente a mejorar la actividad de ciertos probióticos. El aumento a la eficacia se logra al usar ciertos componentes de sustrato que indirectamente suministran a los probióticos una fuerte específica de energía. Los componentes de sustrato están diseñados específicamente para estimular la producción de 1,2-propandiol. El sustrato se ejemplifica con ramnosa, fucosa, pectina con un alto porcentaje de ramnosa, y fucodian que tiene un alto porcentaje de fucosa.

Description

SUSTRATOS INDIRECTOS PARA MICROORGANISMOS QUE METABOLIZAN 1 ,2-PROPANODIOL Campo de la Invención La presente invención se refiere en general a mejorar la actividad de ciertos probióticos en mamíferos. Además, esta invención se refiere a preparaciones que comprenden componentes de sustrato y ciertos probióticos, los componentes del sustrato están diseñados específicamente para mejorar la eficacia de los probióticos. Los componentes del sustrato se seleccionan para generar 1 ,2-propanodiol, que de forma única.. Ja mayoría de las cepas de Lactobacillus reuteri pueden utilizar como fuente de energía y/o como un aceptor de electrones externo.

Antecedentes de la Invención La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura define los probióticos como-"microorganismos viv'os que cuando se administran en cantidades adecuadas confieren un beneficio de salud al hospedero". Hoy en día, un número de diferentes bacterias se utilizan como probióticos, por ejemplo, bacterias de ácido láctico tales como las cepas de Lactobacillus y Bifidobacterium .

La eficacia de los probióticos es específica de la cepa, y cada cepa puede contribuir a la salud del hospedero a través de diferentes mecanismos. Diferentes probióticos pueden prevenir o inhibir la proliferación de patógenos, suprimir la producción de factores de virulencia por patógenos, modular la respuesta inmune en una manera pro-inflamatoria o antiinflamatoria e influir en el hospedero en varias maneras diferentes.

Los prebióticos se definen como "ingredientes alimenticios no digeribles que afectan beneficiosamente al hospedero mediante la estimulación selectiva del crecimiento y/o actividad de una o un número limitado de bacterias en el colon que pueden mejorar la salud del hospedero". Los objetivos de los prebióticos son por lo general las bifidobacterias y los iactobacilos, sin embargo, los prebióticos frecuentemente no son selectivos, y por lo tanto puede ser difícil de lograr la estimulación de los géneros beneficiosos o cepas probióticas específicas. Puesto que es difícil encontrar un prebiótico que sea selectivo para ciertos probióticos, el inventor de la presente invención ha descubierto cómo utilizar los componentes específicos del sustrato (CES) que indirectamente suministrarán a los probióticos específicos una fuente de energía y/o un aceptor de electrones externo que aumentará el rendimiento energético.

Lactobacillus reuteri es una bacteria de ácido láctica heterofermentativa y se encuentra con frecuencia en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y otros animales L. reuteri se considera un organismo indígena del tracto gastrointestinal humano y por ejemplo, está presente en la mucosa del cuerpo gástrico, el antro gástrico, el duodeno, y el íleon. Véase, por ejemplo, la patente norteamericana no. 5,43,678, 5,458,875, 5,534,253, 5,837,238, y 5,849,289. Cuando las células de L. reuteri se cultivan en condiciones anaerobias en presencia de glicerol, producen la sustancia antimicrobiana conocida como reuterina (ß-hidroxi propionaldehído). La capacidad de producir reuterina es debido a el operón de utilización de propanodiol (PDU). El operón de PDU es una maquinaria metabólica que también permite el crecimiento en 1 ,2-propanodiol (PD). Este operón de PDU es una característica muy importante para L. reuteri al colonizar los seres humanos y explotar todo el potencial de las bacterias. Esta maquinaria es rara entre otros lactobacilos y por lo tanto aquellos sin la maquinaria de PDU no son capaces de crecer en 1,2-PD y tampoco son capaces de utilizar 1,2-PD como un aceptor de electrones.

Diferentes cepas de L. reuteri tienen la capacidad de colonizar el intestino, actúan como un agente terapéutico contra la diarrea, modulan la motilidad intestinal, la función como un inhibidor de patógenos bacterianos, inmunológicamente modulan la mucosa gastrointestinal, la función como un agente anti-inflamatorio en el estómago, etc.

En la solicitud de patente WO2009/151391 , la maquinaria PDU de L. reuteri se ceba con 1,2-PD o glicerol antes de la liofilización d.e las bacterias. Con este diseño de fabricación la maquinaria de PDU liofilizada de L. reuteri se ceba con la capacidad para hacer y almacenar reuterina.

Emma Arskold et al., la vía de fosfocetolasa domina en Lactobacillus reuteri ATCC 55730 que contiene vías duales para glucólisis (Journal of Bacteriology , enero 2008, págs. 206-212) describe que el rendimiento de crecimiento de L. reuteri sobre la glucosa se puede mejorar mediante ta adición de fructosa como un aceptor de electrones externo. Sin embargo, nada en este artículo enseña cómo seleccionar ciertos CES en función de su capacidad para suministrar indirectamente ciertos probióticos con 1,2-PD, que sólo podrían ser utilizados por las bacterias con la maquinaria de PDU.

Un problema común con la administración oral de bacterias probióticas es una cantidad y/o actividad insuficiente de las bacterias probióticas en ubicaciones del tracto intestinal donde van a ejercer sus efectos. Esto puede tener como consecuencia que la dosificación de las bacterias probióticas tiene que ser aumentada y/o se necesita una administración más frecuente y también puede resultar en la pérdida de la actividad. Esto conduce a costos innecesarios, frecuencia indeseable de consumo y/o disminución de los beneficios para la salud. En la presente invención las cantidades locales y/o la actividad metabólica de, por ejemplo, L. reuteri se mejora, lo que lleva, por ejemplo, a la posibilidad de reducir la dosis del probiótico y, además, a que sean posibles los beneficios de salud dirigidas al sitio. 1 ,2-propanodiol (1,2-PD) es una fuente de energía que puede ser producida localmente por otros microorganismos coexistentes y que pueden ser utilizados, posiblemente en combinación con azúcares adicionales, por ciertas especies probióticas, por ejemplo, L. reuteri. El inventor de la presente invención ha descubierto sorprendentemente que los microbios coexistentes pueden ser estimulados para producir 1,2-PD . mediante la administración oral de CES muy selectivos y de ese modo mejorar indirectamente la actividad de los organismos que utilizan 1,2-PD la utilización de tales como L. reuteri.

La pectina es un polisacárido de las paredes celulares de las plantas. Varios polisacáridos pécticos se pueden detectar en la pared celular, incluyendo homogalacturonano (HG), xilogalacturonano (XGA), apiogalacturonano, ramnogalacturonano I (RGI), y ramnogalacturonano II (RGII). La relación entre HG, XGA, RGI y RGII es variable, pero típicamente HG es el polisacárido más abundante que constituye aproximadamente el 65% de la pectina, mientras RGI constituye 20% a 35%. XGA y RGII son componentes menores, cada uno constituye menos del 10%. Los diferentes polisacáridos pécticos no son moléculas separadas, sino dominios unidos covalentemente. L-ramnosa se encuentra como un constituyente en las estructuras de pectina RGI y RGII. L-fucosa también se encuentra como un constituyente en la estructura RGII. Las bacterias que se encuentran en el tracto Gl-que son capaces de convertir la L-ramnosa o L-fucosa pertenecen por ejemplo a Bacteroides y géneros de enterobacterias, incluyendo bacterias E. coli.

La pectina es resistente a la digestión humana, pero se degrada en azúcares y después se metaboliza más, por ejemplo, en 1 ,2-propanodiol, por las bacterias en el intestino delgado y el colon. La pectina estimula el crecimiento de bacterias en el intestino delgado y en el colon. La pectina se utiliza como remedio para la diarrea, está relacionado con la mejora del entorno intestinal y también se sabe que tiene propiedades anti-cancerígenas. La pectina cítrica modificada (MCP) es pectina cítrica que ha sido degradada a moléculas menos complejas, y se utiliza para apoyar el crecimiento y la proliferación celular.

Fucoidan es un polisacárido sulfatado que se encuentra principalmente en diversas especies de algas marrones y las algas marinas como mozuku, kombu, limu, moui, el fucus, wakame y hijiki, formas variantes de fucoidan también se han encontrado en las especies animales, incluyendo el pepino de mar. Los galacto-oligosacáridos (GOS) generalmente comprenden una cadena de unidades de galactosa que surgen a través de reacciones consecutivas transgalactosilación, con una unidad de glucosa terminal, se clasifican como prebióticos.

Lynch MB et al, el efecto de la dieta de laminarina derivada de Laminaria y fucoidan en la digestabilidad de los nutrientes, la utilización de nitrógeno, la microflora intestinal y la concentración de ácidos grasos volátiles en los cerdos (J Sci Food Agrie 2010 Feb. 90 (3) :430-7), han observado que los cerdos a los que se les ofrece dietas que contienen fucoidan presentan un aumento de Lactobacillus spp. en el colon proximal y distal en comparación con las dietas que no contienen fucoidan. Por lo tanto se sugiere que el fucoidan puede proporcionar medios dietéticos para mejorar la salud intestinal en cerdos. El aumento de las poblaciones de lactobacilos en las heces, debido a una dieta de fucoidan también han sido vistos por JV O'Doherty ef al, El efecto de dieta con laminarina y fucoidan en los lechones destetados sobre el rendimiento y las poblaciones microbianas fecales seleccionadas (Livestock science 2010 de septiembre).

Sin embargo, no se conocía anteriormente el seleccionar, por ejemplo, pectina y fucoidán, o fracciones de los mismos, basados en las cantidades de L-ramnosa y/o L-fucosa con el fin de generar 1,2-PD a través de la fermentación bacteriana y utilizar tales composiciones con alto contenido de azúcar desoxi, particularmente alto contenido en L-ramnosa y/o en L-fucosa que dará lugar a grandes cantidades de 1,2-PD, suministrando así indirectamente determinado microorganismo, por ejemplo, L. reuteri con una fuente de energía y/o un aceptor de electrones externo, que la mayoría de otros microbios no son capaces de utilizar debido a la falta de la maquinaria de PDU.

La solicitud de patente WO2010/117274 se refiere a un carbohidrato que es capaz de inducir un aumento detectable de un C5 y/o una cadena corta de ácidos grasos C6 (AGCC). La AGCC tiene un efecto positivo en la salud gastrointestinal del sujeto tratado. El carbohidrato utilizado contiene pectina. A pesar de que se eligieron pectinas que pueden contener huellas de ramnosa, no describen cómo seleccionar y utilizar pectina específica alta en L-ramnosa o L-fucosa para suministrar indirectamente probióticos con la maquinaria de PDU con una fuente específica de energía y/o un aceptor de electrones externo aumentando así su actividad.

La patente norteamericana no. 7,101,565 se refiere a una composición que contiene un prebiótico y un probiótico. El prebiótico puede contener pectina o un polisacárido péctico. Sin embargo, no se da a conocer en esta invención la forma de seleccionar ciertas pectinas, o utilizar combinaciones con pectina y L-ramnosa o L-fucosa, que generarán altas cantidades de 1 ,2-PD en el tracto gastrointestinal, beneficiosos para los probióticos con la maquinaria de PDU.

En la patente norteamericana no. 5,902,578 se da a conocer una invención que se refiere a un método de prevención de la diarrea asociada con agentes infecciosos tales como el rotavirus, o la diarrea asociada a los tratamientos antibióticos mediante el uso de Lactobacillus. Sin embargo, en esta invención los Lactobacillus no están asociados con CES adicionales para una mejor eficacia.

Nadie hasta ahora ha descrito la forma de mejorar los efectos promotores de la salud de ciertos probióticos por la administración de los CES, junto con un probiótico, por ejemplo, L. reuteri, para suministrar indirectamente tales probióticos con una única fuente de energía y/o un aceptor de electrones externo. La administración oral de los CES, con alto contenido de L-ramnosa y/o L-fucosa asegurará el suministro de 1 ,2-propanodiol y así suministrará indirectamente ciertos prebióticos con una fuente de energía y/o un aceptor de electrones externo. Esto aumentará la cantidad local de microorganismos que promueven la salud, por ejemplo, L. reuteri, y proporcionar una mejor eficacia, haciendo posible efectos dirigidos al sitio.

A pesar de que ha sido previamente conocido el uso de, por ejemplo, pectina junto con probióticos, no se sabía previamente cómo seleccionar los CES en base a su capacidad para formar 1,2-PD para el suministro indirecto de ciertos probióticos con una fuente de energía específica y/o un aceptor de electrones externo específico.

Breve Descripción de la Invención Esta invención describe un método para mejorar la actividad de ciertos probióticos y la fabricación y uso de productos, que contiene componentes del sustrato y, opcionalmente, un probiótico. Los productos de la presente invención se pueden usar para mejorar la actividad de, por ejemplo, L. reuteri en los mamíferos. Este producto se puede utilizar para mejorar la salud del hospedero. Dependiendo de la cepa probiótica utilizada, el producto se puede utilizar por ejemplo para mejorar la salud gastrointestinal, mejorar la salud relacionada con la inmunidad, tratar y/o prevenir la diarrea y el estreñimiento, normalizar la consistencia fecal, mejorar la motilidad gastrointestinal, tratar y/o prevenir enfermedades infecciosas, modular la inflamación y el efecto anti-patogénico.

El aumento de la eficacia de los probióticos se puede lograr mediante la estimulación de los microbios coexistentes para producir 1 ,2-propanodiol (1,2-PD). Los microbios coexistentes se estimulan con ciertos componentes específicos de sustrato (CES), como se describe en este documento. Los CES asegurarán la presencia de 1,2-PD en el tracto gastrointestinal y el suministro de 1,2-PD de forma indirecta a ciertos organismos benéficos.

La capacidad de utilizar 1,2-PD ya sea como fuente de energía y/o como un aceptor de electrones externo es única para las bacterias con la maquinaria PDU y por lo tanto, la administración de los CES mejorará la actividad solo de ciertos probióticos.

Los CES se pueden administrar junto con los probióticos para mejorar la actividad de los probióticos administrados conjuntamente. Los CES también podrían ser administrados solos, por ejemplo para aumentar la actividad de los probióticos administrados previamente. 1 ,2-DP, administrado solo o generado por los CES, puede además ser combinado con galacto-oligosacáridos (GOS) u otros sacáridos que contiene galactosa para proporcionar una mejor fuente de energía a los microorganismos.

Las bacterias de ácido láctico heterofermentativas producen lactato, etanol y dióxido de carbono usando la vía de fosfocetolasa (PKP). La PKP tiene un rendimiento energético pobre en comparación con la Embden-Meyerhof (EMP). Esta desventaja se puede compensar mediante la adición de aceptores de electrones externos.

El inventor ha encontrado, sorprendentemente, que al garantizar la presencia de 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal, los probióticos se pueden suministrar simultáneamente con un aceptor de electrones externo adecuado y de ese modo mejorar la actividad del probiotico.

Los CES de la presente invención aumentarán selectivamente el crecimiento de bacterias de ácido láctico heterofermentativas, tales como Lactobacillus reuteri, ya que proporcionarán a las bacterias con un aceptor de electrones adecuado que permite una actividad mejorada.

L. reuteri dependen de un buen aceptor de electrones para el crecimiento en ciertos ambientes, y el inventor de la presente invención ha encontrado sorprendentemente que el 1 ,2-propanodiol servirá como un buen receptor de electrones y puede ser suministrado por la administración de los CES.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona un método para mejorar la actividad de las bacterias probióticas que tienen un operón de pdu, en el tracto gastrointestinal de un individuo, que comprende administrar una sustancia a tal individuo, sustancia que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal del individuo.

En una modalidad del método, la sustancia contiene un azúcar desoxi, que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal del individuo. En una modalidad, el azúcar desoxi es ramnosa o fucosa.

En una modalidad del método, la sustancia contiene (a) ramnosa, (b) fucosa, (c) pectina con un alto porcentaje de ramnosa, (d) ramnosa en combinación con pectina, (e) fucosa en combinación con pectina, (f) fucoidan con un alto porcentaje de fucosa, o (g) la combinación de ramnosa, fucosa y pectina.

En una modalidad de la invención, la pectina con un alto porcentaje de ramnosa se define como que contiene 5-15% de ramnosa, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15% de ramnosa. En una modalidad de la invención, el fucoidan con un alto porcentaje de fucosa se define como que contiene más de 15% de fucosa.

En una modalidad del método, la sustancia se administra simultáneamente con bacterias que tienen un operón de pdu.

En una modalidad preferida de la invención, la sustancia se administra por vía oral al individuo.

En otra modalidad preferida del método, las bacterias que tienen el operón de pdu son Lactobacillus reuteri.

En una modalidad del método, la sustancia se administra al individuo a una dosis diaria de 0.25 a 25 g, preferiblemente de 1-2 g.

En una modalidad de la invención, el método comprende además administrar al mismo tiempo un galactooligosacárido u otros sacáridos que contienen galactosa.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se proporciona una sustancia para su uso para mejorar la actividad o aumentar el crecimiento de bacterias probióticas que tienen un operón de pdu, en el tracto gastrointestinal de un individuo, que contiene una sustancia de azúcar desoxi que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal del individuo.

En una modalidad, el azúcar desoxi es ramnosa o fucosa.

En una modalidad de la invención, la sustancia contiene (a) ramnosa, (b) fucosa, (c) pectina con un alto porcentaje de ramnosa, (d) ramnosa en combinación con pectina, (e) fucosa en combinación con pectina, (f) fucoidan con un alto porcentaje de fucosa, o (g) la combinación de ramnosa, fucosa y pectina.

En una modalidad de la invención, pectina con un alto porcentaje de ramnosa se define como que contiene 5-15% ramnosa, tal como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15% ramnosa. En una modalidad de la invención, el fucoidan con un alto porcentaje de fucosa se define como que contiene más de 15% de fucosa.

En una modalidad preferida en relación con la sustancia, las bacterias que tienen el operón de pdu son Lactobacilllus reuteri.

En una modalidad de la invención, la sustancia se administra al individuo a una dosis diaria de 0.25 a 25 g, preferiblemente de 1-2 g.

En una modalidad de la invención, la sustancia debe usarse en combinación con galactooligosacáridos u otros sacáridos que contienen galactosa.

De acuerdo con un tercer aspecto de la invención, se proporciona una composición que comprende (i) las bacterias que tienen un operón de pdu y (ii) una sustancia que contiene un azúcar desoxi, azúcar desoxi que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal de un individuo.

En una modalidad, la composición contiene bacterias que tienen un operón de pdu, en combinación con (a) ramnosa, (b) fucosa, (c) pectina con un alto porcentaje de ramnosa, (d) ramnosa en combinación con pectina, (e) fucosa en combinación con pectina, (f) fucoidan con un alto porcentaje de fucosa, o (g) la combinación de ramnosa, fucosa y pectina.

En una modalidad de la invención, pectina con un alto porcentaje de ramnosa se define como que contiene 5-15% ramnosa, tales como 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 o 15% ramnosa.

En una modalidad de la invención, el fucoidan con un alto porcentaje de fucosa se define como que contiene más de 15% de fucosa .

En otra modalidad, la composición contiene además galactooligosacáridos u otros sacáridos que contienen galactosa.

En una modalidad en relación con la composición, las bacterias que tienen el operón de pdu son Lactobacilllus reuteri.

En una modalidad de la composición, la sustancia está presente en una cantidad tal como para dar una dosis diaria de 0.25 a 25 g, preferiblemente de 1-2 g.

De acuerdo con otra realización de la invención, la composición anteriormente descrita se usará para mejorar la actividad o aumentar el crecimiento de bacterias probióticas que tienen un operón de pdu, en el tracto gastrointestinal de un individuo.

Breve Descripción de las Figuras La figura 1 es un gráfica que muestra el crecimiento de L. reuteri DSM 17938 en MRS modificado (con glucosa y citrato) con la adición de 1,2-PD, galactosa y una combinación de los mismos.

Descripción Detallada de la Invención La utilización por el propanodiol de la maquinaria (PDU) de ciertos probióticos, entre ellos, por ejemplo, Lactobacillus reuteri, permite el crecimiento en 1 ,2-propanodiol (1,2-PD) como fuente de energía y permite la posibilidad de utilizar 1,2-PD como una externa aceptor de electrones.

El inventor de la presente invención encontró sorprendentemente una manera de mejorar la actividad de ciertos probióticos, usando ciertos componentes específicos de sustrato (CES) para apoyar indirectamente un organismo probiótico específico con 1,2-PD que puede ser utilizado como una fuente de energía o como un aceptor de electrones externo.

El CES es una sustancia. De acuerdo con una realización de la invención, la sustancia es un sustrato. En una modalidad, la sustancia se compone de un único componente. En otra modalidad, la sustancia contiene dos o más componentes.

La administración oral de estos CES cuidadosamente seleccionados estimula los microbios coexistentes para producir 1,2-PD, que conduce a la producción local de 1,2-PD que puede servir como una fuente de energía o como un aceptor de electrones externo para ciertos microorganismos con la maquinaria PDU, tal como, por ejemplo L. reuteri. Los CES se pueden administrar solos o junto con los probióticos.

La presencia de 1,2-PD mejorará las condiciones de crecimiento para ciertos microorganismos, por otra parte el inventor ha descubierto que esto puede ser mejorado aún más en la presencia de galacto-oligosacáridos (GOS) o galactosa, como se puede ver en la figura 1.

Los CES de la presente invención se eligen por su capacidad de apoyar indirectamente un probiótico específico con 1,2-DP, que puede ser utilizado como fuente de energía o como un aceptor de electrones externo. El inventor de esta invención ha descubierto que los CES con altas cantidades de L-ramnosa o L-fucosa son los más eficaces cuando se utilizan para aumentar la actividad de ciertos probióticos. Por lo tanto los CES usados en esta invención se seleccionan cuidadosamente en lo que respecta a las cantidades de L-ramnosa y L-fucosa.

Las pectinas, preferentemente ciertas fracciones de pectina que contienen altos porcentajes de L-ramnosa, tales como ramnogalacturonano I y II, se pueden usar como los CES. Preferiblemente, estas fracciones preferidas de pectina contienen 5-15% ramnosa. Estas fracciones de pectina, cuando son degradadas, dan lugar a más ramnosa de pectina no fraccionada, que en el presente texto puede ser llamada pectina, pectina ordinaria, o pectina regular. Una cierta dosis diaria de tales fracciones preferidas de pectina, por ejemplo, 2 g, por lo tanto va a generar cantidades más altas de 1,2-PD en comparación con la misma dosis diaria (2 g) de la pectina regular. La pectina ordinaria también se podría utilizar, si se administra junto con L-ramnosa o L-fucosa para indirectamente y de la misma manera ser ventajosa para ciertos microbios, por ejemplo, L. reuteri. Esta combinación, además de 1,2-PD, también suministra ciertos probióticos con otros sustratos, por ejemplo, galactosa, arabinosa y ácido galacturónico como resultado de la degradación de pectina. El inventor de la presente invención ha demostrado que el 1,2-PD en combinación con determinados componentes de pectina, por ejemplo, galactosa, arabinosa y ácido galacturónico generará un efecto sinérgico que mejora la utilización de 1,2-PD para ciertos probióticos, por ejemplo, L. reuteri, como se ve en la figura 1. en la presente invención como CES se puede usar fucoidan, preferentemente ciertas fracciones de fucoidan que contienen altas cantidades de L-fucosa, y preferiblemente estas fracciones de fucoidan contienen más de 15% de fucosa. Estas fracciones de fucoidan, al ser degradadas, dan por resultado más fucosa que el fucoidan ordinario y así generar mayores cantidades de 1,2-PD.

Solo L-ramnosa o solo L-fucosa también se pueden usar solos como CES de esta invención.

Otros CES, por ejemplo, gomas y otros polisacáridos, se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención si contienen L-ramnosa, L-fucosa o similares. Las gomas incluyen, pero no se limitan a goma de karaya y goma arábiga. Además, algunos oligosacáridos de leche humana (HMO) de la leche materna humana se pueden utilizar como los CES en la presente invención.

La administración de los CES de la presente invención, ya sea solos o junto con un probiótico, por ejemplo, L. reuteri, asegura el suministro de fuente de energía para un probiótico específico y/o asegura la presencia de un aceptor de electrones externo que aumentará el rendimiento de la energía, por lo tanto la mejora de la actividad local y la eficacia del probiótico.

En otras formas de realización y para apoyar este efecto es posible además añadir GOS o galactosa con el fin de aumentar la capacidad de L. reuteri de utilizar 1,2-PD.

Dependiendo de la indicación de destino, un número de cepas de L. reuteri se pueden utilizar en la presente invención con diferentes capacidades de colonizar el intestino, actuar como un agente terapéutico diarrea, modular la motilidad intestinal, la función como un inhibidor de patógenos bacterianos, modular inmunológicamente la mucosa gastrointestinal, funcionar como un agente anti-inflamatorio en el estómago, etc.

La pectina, la L-ramnosa y la L-fucosa son resistentes a la digestión humana, pero se degradan en azúcares y después se metabolizan adicionalmente a, por ejemplo, 1 ,2-propanodiol por microbios coexistentes que se encuentran en los seres humanos y disponible en ciertos lugares del tracto gastrointestinal humano, por ejemplo, en la mucosa del cuerpo gástrico, del antro gástrico, del duodeno y del intestino delgado. La invención por lo tanto, en este documento también hace que sea posible favorecer los efectos dirigidos al sitio en el tracto gastrointestinal humano. Por ejemplo mediante el uso de cepas seleccionadas de L. reuteri como probiótico, es posible mejorar el efecto anti-inflamatorio de esta cepa en el íleon.

Cuando se utiliza el sistema descrito de cierta CES en la presente invención, con por ejemplo una cepa específica de L. reuteri en los seres humanos con una microflora muy perturbada, incluyendo una falta de los microbios que normalmente se encuentran coexistentes capaces de convertir los CES a 1 ,2-PD, es también otra posibilidad de la invención en este documento para suministrar activamente tales microorganismos coexistentes, por ejemplo Lactobacillus rhamnosus, al receptor garantizando la eficacia de los CES administrados.

Los productos que contienen los CES de esta invención, solo o en combinación con ciertos probióticos se formulan preferiblemente en forma de una tableta, cápsula, sobres de polvo o similares. El producto puede ser un suplemento alimenticio, un producto farmacéutico o similar. En este tipo de producto, la cantidad de alimento probiótico debe encontrarse en una cantidad suficiente para dar el efecto deseado de la cepa específica, ahora también teniendo en cuenta el efecto aumentado por el CES. Tales niveles son típicamente, pero no se limitan a 10E + 4 CFU a 10E + 11 CFU por día, preferiblemente en el intervalo de 10E + 6 CFU a 10E + 9 CFU de L. reuteri.

La cantidad de la CES debe estar en el intervalo de 0.25 a 25 gramos (g) por día cuando se utiliza pectinas con altas cantidades de L-ramnosa y/o L-fucosa. Cuando se utiliza una combinación de pectina regular con L-ramnosa y/o L-fucosa separadas, la cantidad total de los CES debe estar en el intervalo de 0.25 a 25 g por día. En ambos casos, la dosis diaria de 0.25 a 25 g puede ser, por ejemplo 0.25, 0.5, 1 , 1.5, 2, 5, 10, 15, 20 o 25 g, preferiblemente 1-2 g, tal como 1, 1.25, 1.5, 1.75 o 2 g. La relación entre la pectina regular y ya sea uno de L-ramnosa o L-fucosa, o la combinación de los mismos, debe estar en el intervalo de 95:5 a 0:100, pero preferiblemente de 80:20 a 20:80 e incluso más preferiblemente 70:30.

Otra opción para utilizar la presente invención es alimentar alternativamente, los CES y los probióticos conjuntamente, y en una o varias ocaciones después de la primera alimentación para alimentar sólo el CES en una especie de programa de transporte para reducir el costo del tratamiento.

Es esencial para esta invención que los probióticos utilizados tengan la maquinaria PDU, ya que esto es esencial para la capacidad de utilizar 1,2-PD como una fuente de energía y/o como un aceptor de electrones externo. Por lo tanto, en otra modalidad de la invención, la maquinaria de PDU de los probióticos se ceba con 1,2-PD durante la producción de la cepa probiótica para una eficacia mejorada. Esto se hace mediante la adición de 1,2-PD o glicerol y, posiblemente, de cobalto o de vitamina B-12 (ya que la vitamina B-12 y el cobalto son importantes para la producción de reuterina) al inicio de la etapa de fermentación cuando se cultivan las bacterias. Con este diseño de fabricación, las bacterias liofilizadas que van a ser utilizadas en el siguiente paso están mejor preparados para activar más rápidamente la maquinaria PDU. Este aumento de la eficacia de la maquinaria PDU a su vez, mejorar la eficacia de los CES administrados de la presente invención. Otra manera de mejorar la eficacia de los CES administrados es combinarlos con GOS o galactosa, y el inventor ha demostrado que la combinación de 1,2-PD y galactosa tiene un beneficio inesperado en el crecimiento de L. reuteri.

Puesto que numerosas modificaciones y cambios se les ocurrirán fácilmente a los expertos en la técnica, no se desea limitar la invención a la construcción y funcionamiento exactos mostrados y descritos, y en consecuencia, todas las modificaciones adecuadas y equivalentes a las cuales se puede recurrir a, entran dentro del alcance de la invención como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1 Fabricación de una bolsita que contiene una composición de L. reuteri junto con pectina, ramnosa y galacto-oligosacáridos.

La composición está hecha de: L. reuteri DSM 17938: 10E + 8 CFU/bolsita Pectina (pectina GENU® (cítrica) tipo USP/200, CP Kelco France SARL, Francia): 840 mg/bolsita L-ramnosa: (monohidrato de ramnosa L-( + ), Kaden Biochemicals GmbH, Hamburgo, Alemania) 360 mg/bolsita GOS15 (Vivinal®, FrieslandCampina Domo, Países Bajos) 800 mg/bolsita La composición se llena a temperatura ambiente en bolsas de película de aluminio como se conoce en la técnica con desecante (10 cm x 12 cm, utilizando material de empaque PET12/PE/ALU 12/PE/PE + desecante/PE de Alean) en una cabina de flujo laminar (Holten Laminair Modelo S-2010 1.2 de Heto-Holten A/S, Dinamarca). A cada bolsa, se añade 2 g de polvo con L. reuteri, pectina, L-ramnosa y los galacto-oligosacáridos usando la báscula XP-600 de Denver Instrument GmbH, Alemania. Las bolsas de película de aluminio llenas luego se sellan térmicamente con un dispositivo de sellado de película modelo F460/2 de Kettenbaum Folienschweisstechnik GmbH & Co. KG, Alemania.

Ejemplo 2 Fabricación de una bolsita que contiene una composición de L. reuteri junto con ramnosa.

La composición está hecha de: 2 g de L-ramnosa: (monohidrato de ramnosa L-( + ), Kaden Biochemicals GmbH, Hamburgo, Alemania)) que contiene 10E + 8 CFU L. reuteri DSM 17938/bolsita.

La composición se empaca en bolsas de película de aluminio como en el ejemplo 1.

Ejemplo 3 Fabricación de una bolsita que contiene una composición de L. reuteri con galacto-oligosacáridos y ramnosa.

La composición está hecha de: 1 g GOS15 (Vivinal®, FrieslandCampina Domo, Países Bajos) y 1 g de L-ramnosa: (monohidrato de ramnosa L-( + ), Kaden Biochemicals GmbH, Hamburgo, Alemania) que contiene 10E + 8 CFU L. reuteri DSM 17938/bolsita La composición se empaca en bolsas de película de aluminio como en el ejemplo 1.

Ejemplo 4 Fabricación de una cepa de L. reuteri cebada Este ejemplo describe cómo fabricar un polvo liofilizado de L. reuteri con la maquinaria PDU activada. La cepa de L. reuteri cebada, a continuación, se puede utilizar para la producción de los sobres de los ejemplos 1-3.

Composición del medio de fermentación Dextrosa monohidratada 60 g/1 Extracto de levadura KAV 20 g/1 Peptona Tipo PS (de origen porcino) 20 g/1 Citrato de hidrógeno dimonio 5 g/1 Acetato de sodio (x 3 H20) 4.7 g/1 Hidrofosfato dipotásico 2 g/1 Tween 80 0.5 g/1 Silibione (anti-espumante) 0.14 g/1 Sulfato de magnesio 0.10 g/1 Sulfato de manganeso 0.03 g/1 Heptahidrato de sulfato de zinc 0.01 g/1 Agua es Medio de centrifugación Peptona 0-24 Orthana (de origen porcino) Crioprotectores Lactosa (de origen bovino) 33% Gelatina hidrolizada (de origen bovino) 22% Glutamato de sodio 22% Maltodextrina 11 % Ácido ascórbico 11 % Pasos de producción del polvo liofilizado de Lactobacillus reuteri 1. Se inocularon veinte mi del medio de fermentación con 0.6 mi de liofilizado de Lactobacillus reuteri en polvo de un frasco del banco de células de trabajo. La fermentación se lleva a cabo en una botella a 37°C por 18-20 horas sin agitación ni control del pH es decir, de forma estática. 2. Dos matraces de 1 litro de medio de fermentación se inocularon con 9 mi de suspensión celular (de la etapa 1) por litro de medio. La fermentación se realizó a 37°C durante 20 a 22 horas sin agitación ni control del pH es decir, de forma estática . 3. Las dos suspensiones celulares de un litro del paso no. 2 se utilizan para inocular el recipiente de 600 litros que contenía 600 litros de medio de fermentación. La fermentación se realizó a 37°C durante 13 horas con agitación y control del pH. Al comienzo de la fermentación el pH es de 6.5. El control del pH se inicia cuando el pH cae por debajo de 5.4 usando una solución de hidróxido de sodio al 20%. El control del pH se ajusta a pH 5.5. 4. El cuarto y último etapa de fermentación se realiza en un recipiente de 15,000 litros con la inoculación del posa no. 3. La fermentación se realizó a 37°C durante 9 a 12 horas con agitación y control de pH. Al comienzo de la fermentación el pH es 6.5. El control del pH se inicia cuando el pH cae por debajo de 5.4 usando una solución de hidróxido de sodio al 20%. El control del pH se ajusta a pH 5.5. 100 mM de glicerol se añaden en la fase final de la fermentación, justo antes de que el cultivo alcance la fase estacionaria. La fermentación es completa cuando el cultivo alcanza la fase estacionaria, que puede ser vista por la reducción de la adición de las sales de la solución de hidróxido de sodio. Aproximadamente 930 litros de la solución de hidróxido de sodio se añade a los 10,200 litros de medio y 600 litros de inóculo durante la fermentación.

La suspensión de células a partir de la fermentación final (paso 4) se separa a 10°C dos veces en una centrífuga continua de Alfa Laval. Mediante la primera centrifugación, el volumen de la suspensión celular se reduce de aproximadamente 11,730 litros a 1200 litros. Este volumen se lava con 1200 litros de una solución de peptona (peptona 0-24, Orthana) en un recipiente de 3000 litros y se separa de nuevo antes de mezclar con los crioprotectores (ver adelante). La etapa de lavado con peptona se lleva a cabo para evitar cualquier reducción del punto de congelación en el proceso de liofilización.

Mediante la segunda centrifugación, el volumen de la suspensión de células se reduce a 495 litros. Este volumen se mezcla con 156 kg de la solución de crioprotector para llegar a aproximadamente 650 litros de la suspensión celular.

La pasta celular se bombea a un recipiente de 1000 litros. El recipiente se transporta a la planta de liofilización.

En la planta de liofilización, exactamente 2 litros de la suspensión celular se vierte en cada placa en el liofilizador. La capacidad máxima del secador por congelación es de 600 litros y se desecha todo el volumen de suspensión celular en exceso.

La suspensión de células de Lactobacillus reuteri tiene un contenido de materia seca de 18% y se liofiliza durante cuatro a cinco días.

Durante el proceso de liofilización, la presión en el proceso es entre 0.176 mbar y 0.42 mbar. La bomba de vacío se pone en marcha cuando la presión alcanza 0.42 mbar. El PRT (prueba de presurización) se utiliza para determinar cuándo se completa el proceso. Si la PRT o el aumento de la presión es inferior a 0.02 mbar después de 120 segundos, se detiene el proceso.

Ejemplo 5 La combinación de 1,2-PD y galactosa genera un efecto sinérgico que mejora la actividad de L. reuteri L. reuteri DSM 17938 se cultivó en caldo MRS modificado (sin glucosa y citrato) con la adición de 1 ,2-PD (0.3%), galactosa (0.3%) o una combinación de los dos. Las bacterias se cultivaron durante 24 horas a 37°C. L reuteri cultivadas en la presencia de tanto 1,2-PD y galactosa sorprendentemente mostraron un crecimiento significativamente mayor que el crecimiento en las sustancias separadas como se ve en la figura 1.

Ejemplo 6 Ejemplo de programa de transporte que se va a suministrar Gracias a la actividad mejorada de L. reuteri inducida por los CES descritos en esta solicitud es posible alternar los sobres del ejemplo 1 (sobre A) con sobres en los cuales L. reuteri se excluye, pero de otro modo fabricado según el ejemplo 1 (B bolsita) en un programa de transbordadores. Este programa de transbordadores no reduce la eficacia de L. reuteri y puede reducir el costo del tratamiento.

Bolsita A se administra al receptor en el día 1, en el día 2 y 3 el destinatario se da bolsita B. Este esquema de administración se repite durante todo el período de tratamiento.

Ejemplo 7 Colonización intestinal in vivo en seres humanos Una comparación entre la colonización intestinal por L. reuteri sola y la misma L. reuteri administrado junto con CES se realiza en un estudio clínico. 12 voluntarios sanos se dividen en dos grupos (A y B) con 6 participantes en cada grupo. El grupo A recibe las bolsitas de polvo del ejemplo 1, que contiene una composición de L. reuteri junto con los CES en la forma de pectina, ramnosa y los galacto-oligosacáridos. El grupo B recibe la misma cepa de L. reuteri, pero ninguno de los CES anteriores. Ambos grupos reciben 10E + 8CFU de L. reuteri por día durante 60 días. La evaluación cuantitativa de la colonización intestinal por cepas administradas solas o junto con los CES se realiza mediante un examen de la muestra fecal en el inicio del estudio, y después de 30 y 60 días del período de tratamiento. L. reuteri fecales se cuentan y se comparan las cantidades de heces de grupo A y B.

Un aumento significativo en las cantidades fecales de L. reuteri se observa en pacientes en los que L. reuteri se administran junto con los CES, en comparación con pacientes en los que L. reuteri se administran solas, como se ve en la tabla 1. Los valores se dan como la media I og 10 CFU por gramo de heces ± SEM.

Tabla 1 Grupo de estudio Conteo de L. reuteri (n) antes día 30 día 60 el grupo A (6) n.d. 5.5 ± 0.2 5.8 ± 0.3 grupo B (6) n.d. 4.2 ± 0.3 4.5 ± 0.4

Claims (17)

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar la actividad de las bacterias probióticas que tienen un operón de pdu, en el tracto gastrointestinal de un individuo, que comprende administrar una sustancia a ese individuo, sustancia que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal del individuo.

2. El método de la reivindicación 1, en el que la sustancia contiene (a) ramnosa, (b) fucosa, (c) pectina con un alto porcentaje de ramnosa, (d) ramnosa en combinación con pectina, (e) fucosa en combinación con pectina, (f) fucoidan con un alto porcentaje de fucosa, o (g) la combinación de ramnosa, fucosa y pectina.

3. El método de la reivindicación 1 o 2, en donde la sustancia se administra simultáneamente con bacterias que tienen un operón PDU.

4. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que las bacterias que tienen el operón de pdu contienen reuteri Lactobacilllus.

5. El método de cualquier reivindicación precedente, en el que la sustancia se administra al individuo a una dosis diaria de 0.25 a 25 g, preferiblemente de 1-2 g.

6. El método de cualquier reivindicación precedente, que comprende además la administración simultánea de un galactooligosacárido u otros sacáridos que contienen, galactosa

7. Una sustancia para usarse para mejorar la actividad o aumentar el crecimiento de bacterias probióticas que tienen un operón de pdu, en el tracto gastrointestinal de un individuo, que contiene una sustancia de azúcar desoxi que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1 ,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal del individuo.

8. La sustancia de la reivindicación 7 que contiene (a) ramnosa, (b) fucosa, (c) pectina con un alto porcentaje de ramnosa, (d) ramnosa en combinación con pectina, (e) fucosa en combinación con pectina, (f) fucoidan con un alto porcentaje de fucosa, o (g) la combinación de ramnosa, fucosa y pectina.

9. La sustancia de cualquiera de las reivindicaciones 7-8, en el que las bacterias que tienen el operón de pdu son reuteri Lactobacilllus.

10. La sustancia de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, que se administra al individuo a una dosis diaria de 0.25 a 25 g, preferiblemente de 1-2 g.

11. La sustancia de cualquiera de las reivindicaciones 7-10, que es para su uso en combinación con galactooligosacáridos u otros sacáridos que contienen galactosa.

12. Una composición que contiene bacterias que tienen un operón de pdu y una sustancia que contiene un azúcar desoxi, azúcar desoxi que tiene la capacidad de ser metabolizada a 1,2-propanodiol en el tracto gastrointestinal de un individuo.

13. La composición de la reivindicación 12, que contiene bacterias que tienen un operón de pdu, en combinación con (a) ramnosa, (b) fucosa, (c) pectina con un alto porcentaje de ramnosa, (d) ramnosa en combinación con pectina, (e ) fucosa en combinación con pectina, (f) fucoidan con un alto porcentaje de fucosa, o (g) la combinación de ramnosa, fucosa y pectina.

14. La composición de la reivindicación 12 o 13, que contiene además galactooligosacáridos u otros sacáridos que contienen galactosa.

15. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 12-14 en el que las bacterias que tienen el operón de pdu son reuteri Lactobacilllus.

16. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 12-15 en el que la sustancia está presente en una cantidad tal como para dar una dosis diaria de 0.25 a 25 g, preferiblemente de 1-2 g.

17. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 12-16 para usarse para mejorar la actividad o aumentar el crecimiento de bacterias probióticas que tienen un operón de pdu, en el tracto gastrointestinal de un individuo. RESUMEN La presente invención se refiere generalmente a mejorar la actividad de ciertos probióticos. El aumento a la eficacia se logra al usar ciertos componentes de sustrato que indirectamente suministran a los probióticos una fuerte específica de energía. Los componentes de sustrato están diseñados específicamente para estimular la producción de 1 ,2-propandiol. El sustrato se ejemplifica con ramnosa, fucosa, pectina con un alto porcentaje de ramnosa, y fucodian que tiene un alto porcentaje de fucosa.