MX2013004476A - Anticuerpos. - Google Patents

Abstract

La presente descripción provee anticuerpos, incluyendo anticuerpos monoclonales aislados, que se unen específicamente a CDH17 con alta afinidad; también se proveen moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos para CDH17, vectores de expresión, células hospederas y métodos para expresar anticuerpos para CDH17; también se proveen moléculas biespecíficas y composiciones farmacéuticas que comprenden los anticuerpos para CDH17; se describen métodos para detectar CDH17, así como métodos para el tratamiento de varios cánceres, incluyendo cáncer gástrico, cáncer pancreático, cáncer de colon y cáncer colorrectal.

Description

ANTICUERPOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere generalmente a los campos de Inmunología y biología molecular. De manera más específica, aquí se proveen anticuerpos y otras proteínas terapéuticas dirigidas contra la molécula de adhesión celular Cadherina-17, ácidos nucleicos que codifican dichos anticuerpos y proteínas terapéuticas, métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales inventivos y otras proteínas terapéuticas, y métodos para el tratamiento de enfermedades, tales como cánceres mediados por la expresión/actividad de Cadherina-17 y/o asociados con la expresión/actividad anormal de los ligandos de la misma.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las cadherinas son moléculas de adhesión celular dependientes de calcio. Preferentemente, interactúan entre sí de manera homofílica en la conexión de las células; las cadherinas por lo tanto pueden contribuir a la clasificación de tipos celulares heterogéneos. La molécula de cadherina, Cadherina-17 (de ahora en adelante CDH17), es también conocida como cadherina de hígado-intestino o transportador asociado con péptido intestinal HPT-1. La CDH17 puede tener un papel en la organización morfológica del hígado y el intestino. También está implicada en el transporte de péptido intestinal. La estructura de CDH17 se caracteriza por tener un dominio extracelular con 7 dominios de cadherina, un solo dominio de transmembrana hidrofóbico y una cola citoplásmica corta del C-terminal. Se conoce solamente una isoforma de CDH17 humana, acceso a Genbank no. NM_004063. CDH17 tiene el número de acceso Q 12864 (SEQ ID NO: 38) en las bases de datos SWISS-PROT y trEMBL (sostenidos por el Instituto Suizo de Bioinformática (SIB) y el Instituto Europeo de Bioinformática (EBI), que están disponibles en www.expasy.com). El ortólogo de CDH17 de ratón (Q9R100) muestra la 76% de identidad a la CDH17 humana.

Según SWISS-PROT, CDH17 se expresa en el tracto gastrointestinal y el conducto pancreático. No se detecta en el riñon, pulmón, hígado, cerebro, glándulas suprarrenales o piel. La expresión de CDH17 se ha reportado en el cáncer gástrico (ver, por ejemplo, Ito et al., Virchows Arch 2005 Oct; 4:717-22; Su et al., Mod Pathol. noviembre de 2008; 21 (11 ): 1379-86; Ko et al., Biochem Biophys Res Commun. 25 de junio de 2004; 2:562-8; y Dong et al., Dig Dis Sci. 2007 Feb;52(2):536-42), cáncer de páncreas y el cáncer colorrectal (Su et al., Mod Pathol. Noviembre de 2008; 21 (1 1 ): 1379-86) y el carcinoma hepatocelular (Wong et al., Biochem Biophys Res Commun. 21 de noviembre de 2003; 1 (3):618-24) 31. La solicitud de patente internacional WO2008/026008 describe CDH17 como un marcador para cáncer colorrectal y como un objetivo biológico para anticuerpos terapéuticos y otros agentes farmacéuticos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención provee anticuerpos dirigidos contra CDH17, ácidos nucleicos que codificación dichos anticuerpos y proteínas terapéuticas, métodos para la preparación de anticuerpos monoclonales anti-CDH17 y otras proteínas terapéuticas y métodos para el tratamiento de enfermedades, como la trastornos mediados por CDH17, por ejemplo, cánceres humanos, incluyendo gástrico, cáncer de páncreas y cáncer colorrectal.

En una modalidad, la invención provee un anticuerpo aislado que se une específicamente a Cadherína-17, que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 46; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 47; iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 48; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 49; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 50; y iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 51.

En una modalidad preferida, la invención también provee un anticuerpo aislado que se une específicamente a Cadherina-17, que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 46; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 47; iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 48; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 49; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 50; y iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 51.

En otra modalidad preferida, la invención además provee un anticuerpo aislado que se une específicamente a Cadherina-17, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 46; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 47; iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 48; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 49; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 50; y iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 51.

En una modalidad más, la invención provee un anticuerpo aislado como se definió antes, en donde: (a) la región de marco de trabajo de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 90% o 95%, de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 26; y/o (b) la región de marco de trabajo de cadena ligera está comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85%, preferiblemente por lo menos 90% o 95%, identidad de secuencia SEQ ID NO: 31.

Ejemplos de anticuerpos preferidos incluyen anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos y fusiones de anticuerpo y fragmentos de los mismos.

En una modalidad, cualquiera de los anticuerpos anteriores posee un dominio de Fe. En algunas modalidades, el dominio de Fe es humano. En otras modalidades, el dominio de Fe es un dominio de Fe humano variante.

En otra modalidad, cualquiera de los anticuerpos anteriores descritos son anticuerpos monoclonales.

En una modalidad, cualquiera de los anticuerpos descritos anteriores contiene o se conjuga a una porción o agente terapéutico. En algunas modalidades, la porción terapéutica es una citotoxina, radiotoxina o un fármaco. En otras modalidades, el agente conjugado es un polímero. En otra modalidad, el polímero es un polietilenglicol (PEG). En otra modalidad, el PEG es un derivado de PEG.

En otra modalidad más, se provee un anticuerpo de la invención que produce o es capaz de producir citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC).

Una modalidad más provee una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la invención, opcionalmente con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

También se provee un anticuerpo o una composición farmacéutica de la invención para su uso como un medicamento o para su uso en terapia o diagnóstico.

Una modalidad adicional provee un método de tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con CDH17 o una enfermedad asociada con células objetivo que expresan CHH17, el método comprendiendo la administración a un sujeto que necesita una cantidad efectiva de un anticuerpo aislado de la invención. También se provee el uso de un anticuerpo de la invención en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad asociada con CDH17 o una enfermedad asociada con células objetivo que expresan CHH17. Preferiblemente, la enfermedad es cáncer, v.gr., cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer de colon. Preferiblemente, el cáncer es un cáncer humano.

Por lo tanto, la presente invención provee anticuerpos aislados, preferiblemente anticuerpos monoclonales, en particular, humanizados y los anticuerpos monoclonales totalmente humanos, que se unen a CDH17 y que presentan una o más propiedades funcionales deseables. Estas propiedades incluyen, por ejemplo, unión específica de alta afinidad a CDH17 humana. También se proveen métodos para tratar una variedad de enfermedades mediadas por CDH17 usando los anticuerpos, proteínas y composiciones de la presente invención.

En algunas modalidades, el anticuerpo aislado es un anticuerpo de longitud completa de un isotipo lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4.

En algunas modalidades, el anticuerpo de la presente invención se selecciona del grupo que consiste de: un anticuerpo entero, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena única, un inmunoconjugado, un anticuerpo desfucosilado y un anticuerpo biespecífico. El fragmento de anticuerpo puede ser seleccionado del grupo que consiste de: un UniCuerpo, un anticuerpo de dominio y un Nanocuerpo. En algunas modalidades, los inmunoconjugados de la invención constituyen a un agente terapéutico. En otro aspecto de la invención, el agente terapéutico es una citotoxina o un isótopo radiactivo.

En algunas modalidades, el anticuerpo de la presente invención se selecciona del grupo que consiste de: un Affibody, un DARPin, un Anticalin, un avímero, un Versabody y un Duocalin.

En modalidades alternativas, las composiciones de la presente invención representan un anticuerpo aislado o porción de unión a antigeno y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

En algunas modalidades, la invención comprende una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada o ligera del anticuerpo aislado o porción de unión de antígeno de la invención que une a un epítope en CDH17 humana. Otros aspectos de la invención comprenden vectores de expresión dichas moléculas de ácido nucleico y las células hospederas que comprenden estos vectores de expresión.

En algunas modalidades, la presente invención provee un método para la preparación de un anticuerpo anti-CDH17, dicho método comprendiendo los pasos de: obtener una célula hospedera que contiene una o más moléculas de ácido nucleico que codifican el anticuerpo de la invención; hacer crecer de la célula hospedera en un cultivo de células hospederas; proveer las condiciones de cultivo de células hospederas en donde se expresan una o más de las moléculas de ácido nucleico; y recuperar el anticuerpo de la célula hospedera o del cultivo de células hospederas.

Otra modalidad de la presente invención es un hibridoma que expresa el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo de cualquiera de los anticuerpos de la invención.

Como se utiliza aquí, el término "cáncer" incluye cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, cáncer de colon, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de tiroides, cáncer de estómago, cáncer de piel, cáncer de esófago, cáncer de hígado o cáncer cervical.

Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no deben interpretarse como limitación. El contenido de todas referencias, las entradas de Genbank, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente aquí por referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 9) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de la región variable de la cadena pesada del anticuerpo monoclonal CDH17_A4. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 1 ), CDR2 (SEQ ID NO: 2) y CDR3 (SEQ ID NO: 3) se delinean.

La figura 2 muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 10) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal CDH17_A4. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 4), CDR2 (SEQ ID NO: 5) y CDR3 (SEQ ID NO: 6) se delinean.

La figura 3A muestra la alineación de las secuencias de nucleótidos de la región de la cadena pesada CDR1 de CDH17_A4 (SEQ ID NO: 11) con los nucleótidos 67-96 de la secuencia de nucleótidos H17 del gen de línea germinal de ratón VHII (SEQ ID NO: 17).

La figura 3B muestra la alineación de las secuencias de nucleótidos de las regiones de la cadena pesada CDR2 de CDH17_A4 (SEQ ID NO: 12) con los nucleótidos 1096-1146 de la secuencia de nucleótidos H 17 del gen de línea germinal de ratón VHII del gen de línea germinal de ratón VH105 (SEQ ID NO: 18).

La figura 3C muestra la alineación de la secuencia de nucleótidos de la región de la cadena ligera CDR1 de CDH17_A4 (SEQ ID NO: 14) con los nucleótidos 510-560 de la secuencia de nucleótidos de línea germinal de ratón VK 8-30 (SEQ ID NO: 19).

La figura 3D muestra la alineación de la secuencia de nucleótidos de la región de la cadena ligera CDR2 de CDH17_A4 (SEQ ID NO: 15) con los nucleótidos 606-626 de la secuencia de nucleótidos de línea germinal de ratón VK 8-30 (SEQ ID NO: 20).

Figura 3E muestra la alineación de la secuencia de nucleótidos de la región de la cadena ligera CDR3 de CDH17_A4 (SEQ ID NO: 16) con los nucleótidos 723-749 de la secuencia de nucleótidos de línea germinal de ratón VK 8-30 (SEQ ID NO: 21).

La figura 4 muestra los resultados de análisis de FACS en CDH17_A4 y un anticuerpo anti-CDH17 en células LoVo.

La figura 5 muestra los resultados de análisis de FACS sobre CDH17 A4 y un anticuerpo anti-CDH17 en células LoVo y LS174T.

La figura 6A muestra unión de superficie de complejo de CDH17_A4/conjugado de FITC de anticuerpo secundario a células LoVo después de 60 minutos de incubación.

La figura 6B muestra la internalización de complejo de CDH17_A4/conjugado de FITC de anticuerpo secundario después de 120 minutos de incubación con células LoVo.

La figura 7A muestra resultados de internalización de la CDH17_A4 por prueba de MabZAP en células de cáncer de colon LoVo.

La figura 7B muestra resultados de internalización de CDH17_A4 por prueba de MabZAP en células de cáncer de colon LoVo.

La figura 7C muestra resultados de internalización de CDH 7_A4 por prueba de MabZAP en células de cáncer de colon LoVo.

La figura 7D muestra resultados de internalización de CDH17_A4 por prueba de MabZAP en células de cáncer de colon LS 174T.

La figura 8A muestra resultados de internalización de CDH17_A4 por prueba de MabZAP en células de cáncer de colon LoVo.

La figura 8B muestra resultados de internalización de CDH17_A4 por prueba de MabZAP en células de cáncer de colon LS 174T.

La figura 9 muestra la alineación de residuos 37-160 de SEQ ID No: 7 (SEQ ID No: 24), tres cadenas VH humanizadas con las regiones de CDR (resaltadas en negrillas) de SEQ ID No: 7 (SEQ ID Nos: 1 , 2 y 3) transferidas a las posiciones correspondientes de la línea germinal humana L01278 VH (SEQ ID Nos: 26, 27 y 28) con la línea germinal humana L01278 VH (SEQ ID No: 34). Los residuos muestran un contacto significativo con las regiones CDR sustituidas para los residuos humanos correspondientes. Estas sustituciones (subrayadas) se realizaron en las posiciones 29, 37, 48, 66, 67 y 71.

La figura 10 muestra la alineación de los residuos 47-160 de SEQ ID No: 8 (SEQ ID No: 25), dos cadenas VL humanizadas con las regiones de CDR (resaltadas en negrillas) de SEQ ID No: 8 (SEQ ID Nos: 4, 5 y 6) transferidas a las posiciones correspondientes de la línea germinal humana X02990 VL (SEQ ID No: 31 y 32) con la línea germinal humana X02990 VL (SEQ ID No: 35). Los residuos muestran contacto un significativo con las regiones CDR sustituidas para los residuos humanos correspondientes. Se realizó una sustitución (subrayado) en la posición 46.

La figura 1 1A muestra la alineación de los aminoácidos 6-10 de la región CDR1 de cadena pesada A4 (SEQ ID No: 36) con posibles sustituciones de aminoácidos (SEQ ID No: 29) y la región CDR2 de la cadena pesada A2 (SEQ ID No: 2) con posibles sustituciones de aminoácidos (SEQ ID No: 30) sin perder la afinidad de unión a antígeno.

La figura 1 1 B muestra la alineación de la región CDR1 de cadena ligera A4 (SEQ ID No: 4) con posibles sustituciones de aminoácidos (SEQ ID No: 33) sin perder la afinidad de unión a antígeno.

La figura 12 muestra resultados de análisis de FACS usando CDH17_A4_4K humanizada y CDH17_A4_4R humanizada en células LoVo.

La figura 13A muestra resultados de internalización de CDH17_A4_4K humanizada y CDH17_A4_4R humanizada por prueba HumZAP en células de cáncer de colon LoVo.

La figura 13B muestra resultados de internalización de CDH17_A4_4K humanizada y CDH17_A4_4R humanizada por prueba HumZAP en células de cáncer gástrico SNU-1.

La figura 14A muestra los resultados del análisis de FACS usando CDH17_A4_4K humanizada y CDH17_A4_4R humanizada en la CDH17 de Cynomolgus etiquetada con bandera CDH17 transfectada en células HEK293.

La figura 14B muestra los resultados del análisis de FACS usando CDH17_A4_4K humanizada y CDH17_A4_4R humanizada en la CDH17 humana etiquetada con bandera CDH17 transfectada en células HEK293.

La figura 15 muestra la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada (SEQ ID NO: 26) y la región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 31) del anticuerpo monoclonal CDH17_A4 humanizado. Las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 46), CDR2 (SEQ ID NO: 47) y CDR3 (SEQ ID NO: 48) de la cadena pesada y las regiones CDR1 (SEQ ID NO: 49), CDR2 (SEQ ID NO: 50) y CDR3 (SEQ ID NO: 51) de la cadena ligera están subrayadas.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a anticuerpos aislados, incluyendo, pero sin limitarse a anticuerpos monoclonales, por ejemplo, que se unen específicamente a CDH17 con alta afinidad. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención comprenden características estructurales particulares como las regiones CDR que comprende secuencias de aminoácidos particulares. La invención provee anticuerpos aislados, anticuerpos desfucosilados, inmunoconjugados, moléculas biespecíficas, aficuerpos, anticuerpos de dominio, nanocuerpos y unicuerpos, métodos de fabricación de dichas moléculas y composiciones farmacéuticas que comprenden dichas moléculas y un vehículo farmacéutico. La invención también se refiere a métodos de uso de las moléculas, tales como detectar CDH 7, así como para tratar enfermedades asociadas con la expresión de CDH17, tal como CDH17 expresado en tumores, incluyendo aquellos tumores de cáncer gástrico, cáncer de páncreas y el cáncer colorrectal.

A fin de que la presente invención pueda ser más fácilmente entendida, ciertos términos se definen primero. Definiciones adicionales se exponen a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "Cadherina-17", "cadherina de hígado-intestino", "cadherin L-l", "HPT-1 transportado asociado a péptido intestinal" y "CDH17" se usan indistintamente. CDH17 también ha sido identificado como OGTA001 en la solicitud de patente internacional WO2008/026008, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad. Los anticuerpos humanizados y murinos de esta descripción pueden, en ciertos casos, reaccionar en forma cruzada con CDH 7 de especies distintas al humano. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para uno o más CDH17 humanas y pueden no presentar especies u otros tipos de reactividad cruzada no humana. La secuencia de aminoácido completa de un CDH17 humana ilustrativo tiene número de acceso a Genbank NM_004063. La CDH17 tiene la secuencia que se da en SEQ ID NO: 38.

El término "respuesta inmunológica" se refiere a la acción de, por ejemplo, linfocitos, células que presentan antígeno, células fagocíticas, granulocitos y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citocinas y complemento) que resulta en daño selectivo, destrucción de, o eliminación del cuerpo humano de los patógenos invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas o, en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos humanos normales.

Una "vía de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre varias de las moléculas de transducción de señal que desempeñan un papel en la transmisión de una señal de una porción de una célula a otra porción de una célula. Como se utiliza aquí, la frase "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de dicha señal a través de la membrana plasmática de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor de la CDH17.

El término "anticuerpo" como se refiere aquí incluye anticuerpos enteros y cualquier fragmento de unión a antígeno (es decir, "porción de unión a antígeno") o cadenas sencillas del mismo. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteina que puede comprender por lo menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces de disulfuro, o un fragmento de unión a antígeno de las mismas. Cada cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (abreviado aquí como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se compone de tres dominios, CH , CH2 y CH3. Cada cadena ligera está compuesta de una región variable de cadena ligera (abreviado aquí como VL o VK) y una región constante de cadena ligera (lambda o kappa). La región constante de cadena ligera se compone de un dominio, CL. Las regiones VH y VL/VK pueden subdividirse aún más en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que son más conservadas, llamadas regiones de marco de trabajo (FR). Cada VH y VL/VK se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas de amino-terminal y carboxilo-terminal en el siguiente orden: FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesadas y ligeras contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de inmunoglobulina a los tejidos o factores del hospedero, entre ellos varias células del sistema inmunitario (v.gr., células efectoras) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico.

La definición de "anticuerpo" incluye, pero se limita a, anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpos, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos (a veces denominados aquí "miméticos de anticuerpo"), anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, fusiones de anticuerpo (a veces denominados "conjugados de anticuerpos") y fragmentos de cada uno, respectivamente.

En una modalidad, el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo. Los fragmentos de anticuerpo específicos incluyen, pero no se limitan a, (i) el fragmento Fab formado por los dominios VL, VH, CL y CH1 , (ii) el fragmento Fd consistiendo de los dominios VH y CH1 , (iii) el fragmento Fv, consistiendo de los dominios VL y VH de un solo anticuerpo, (iv) el fragmento dAb, que consiste de un solo dominio variable, (v) regiones de CDR aisladas, (vi) fragmentos F(ab') 2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab enlazados (vii) moléculas Fv de cadena sencilla (scFv), en donde un dominio VH y un dominio VL están unidos por un enlazador de péptido que permite que los dos dominios se asocien para formar un sitio de unión a antígeno, (viii) dímeros de Fv DE cadena sencilla y (ix) "diacuerpos" o "triacuerpos", fragmentos multivalentes o multiespecíficos, construidos por la fusión de genes. Los fragmentos de anticuerpos pueden ser modificados. Por ejemplo, las moléculas pueden ser estabilizadas por la incorporación de puentes de disulfuro que enlazan a los dominios VH y VL. Ejemplos de formatos y arquitecturas de anticuerpo se describen en Holliger y Hudson, 2006, Nature Biotecgnology 23(9): 1126-1136 y Cárter 2006, Nature Reviews Immonology 6:343-357 y referencias citadas en el mismo, todos expresamente incorporados por referencia.

En una modalidad, un anticuerpo descrito aquí pueden ser un anticuerpo multiespecífico y en particular un anticuerpo biespecífico, también referido a veces como "diacuerpos". Son anticuerpos que se unen a dos (o más) antígenos diferentes. Los diacuerpos pueden ser fabricados en una variedad de formas en la técnica, por ejemplo, preparados químicamente o a partir de hibridomas híbridos. En una modalidad, el anticuerpo es un minicuerpo Los minicuerpos son proteínas de tipo anticuerpo minimizadas, que comprenden un scFv unido a un dominio CH3. En algunos casos, el scFv se puede unir a la región Fe, y puede incluir algunas o todas las regiones de gozne. Para una descripción de anticuerpos multiespecíficos, véase Holliger y Hudson, 2006, Nature Biotecgnology 23(9): 1126-1136 y referencias citadas en el mismo, todos expresamente incorporados por referencia.

Por "CDR" como se usa aquí, se entiende una región determinante de complementariedad de un dominio variable del anticuerpo. La identificación sistemática de los residuos incluidos en las CDRs han sido desarrollados por Kabat (Kabat et al., 1991 , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. ed., United States Public Health Service, National Instítutes of Health, Bethesda) y alternativamente por Chothia (Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901 -917; Chothia et al., 1989, Nature 342: 877- 883; Al-Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol. 273: 927-948). Para los propósitos de la presente invención, las CDRs se definen como un conjunto ligeramente más pequeño de residuos que las CDRs definidas por Chothia. VL CDRs se definen aquí para incluir residuos en las posiciones 27-32 (CDR1), 50-56 (CDR2) y 91-97 (CDR3), en donde la numeración es según Chothia. Debido a que las VL CDRs como se define por Chothia y Kabat son idénticas, la numeración de estas posiciones de VL CDR es también según Kabat. Las VH CDRs se definen en aquí para incluir residuos en las posiciones 27-33 (CDR1), 52-56 (CDR2) y 95-102 (CDR3), en donde la numeración es según Chothia. Estas posiciones de VH CDR corresponden a las posiciones de Kabat 27-35 (CDR1), 52-56 (CDR2) y 95-102 (CDR3).

Como será apreciado por los expertos en la técnica, las CDRs descritas aquí también pueden incluir variantes, por ejemplo, cuando son retromutadas las CDRs descritas aquí en regiones diferentes del marco de trabajo. Generalmente, la identidad de aminoácidos entre las CDRs de variante individual son por lo menos 70% o 80% a las secuencias mencionadas y muy generalmente con el aumento preferiblemente de identidades de por lo menos 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% y casi el 100%.

De manera similar, el "porciento (%) de identidad de secuencia de ácido nucleico" con respecto a la secuencia de ácidos nucleicos de las proteínas de unión identificadas se define como el porcentaje de residuos de nucleótidos en una secuencia candidata que son idénticos con los residuos del nucleótido en la secuencia de codificación de la proteína de unión a antígeno. Un método específico utiliza el módulo BLASTN de WU-BLAST-2 establecido para los parámetros por omisión, con amplitud de traslape y fracción de traslape 1 y 0.125, respectivamente.

Generalmente, la identidad de secuencia de ácido nucleico entre las secuencias de nucleótidos que codifican CDRs de variante individual y las secuencias de nucleótidos mencionadas son por lo menos 70% o 80% y muy generalmente con el aumento preferiblemente identidades de por lo menos 70%, 75%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% y casi el 100%.

Por lo tanto, una "CDR de variante" es una con la homología especificada, similitud o identidad a la CDR progenitora de la invención y comparte la función biológica, incluyendo, sin limitarse a, por lo menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o el 99% de la especificidad y/o actividad de la CDR progenitora.

Mientras que el sitio o región para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminada, la mutación como tal no necesita ser predeterminada. Por ejemplo, con el fin de optimizar el rendimiento de una mutación en un sitio determinado, la mutagénesis aleatoria puede realizarse en el codón o región objetiva y las variantes de CDR de proteína de unión a antígeno expresadas para la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para hacer mutaciones de sustitución en sitios predeterminados en ADN que tiene una secuencia conocida son bien conocidas, por ejemplo, mutagénesis de iniciador M13 y mutagénesis de PCR. La determinación selectiva de los mutantes se realiza usando pruebas de actividades de proteína de unión a antígeno como se describe aquí.

Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos individuales; las inserciones generalmente serán del orden de uno (1) a aproximadamente veinte (20) residuos de aminoácidos, aunque inserciones considerablemente más grandes pueden ser toleradas. Las deleciones oscilan entre uno (1) y aproximadamente veinte 20 residuos de aminoácidos, aunque en algunos casos las deleciones pueden ser mucho mayores.

Las sustituciones, deleciones, inserciones o cualquier combinación de éstas pueden usarse para llegar a un derivado o variante final. Generalmente, estos cambios se realizan en algunos aminoácidos para minimizar la alteración de la molécula, particularmente la inmunogenicidad y especificidad de la proteína de unión a antígeno. Sin embargo, cambios más grandes pueden ser tolerados en ciertas circunstancias.

Por "Fab" o "Región Fab", como se usa aquí, se entiende el polipéptido que comprende los dominios de inmunoglobulina VH, CH1 , VL y CL. Fab puede referirse a esta región aisladamente, o esta región en el contexto de un anticuerpo de longitud completa, fragmento de anticuerpo o proteína de fusión de Fab o cualesquiera otras modalidades de anticuerpo como se indica en este documento.

Por "Fv" o "fragmento Fv" o "región Fv", como se usa aquí, se entiende un polipéptido que comprende los dominios VL y VH de un solo anticuerpo.

Por "marco de trabajo", como se usa aquí, se entiende la región de un dominio variable del anticuerpo exclusivo de aquellas regiones definidas como CDRs. Cada marco de trabajo de dominio variable de anticuerpo puede subdividirse aún más en las regiones contiguas separadas por las CDRs (FR1 , FR2, FR3 y FR4).

El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo"), como se usa aquí, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, CDH17). Se ha demostrado que se puede realizar la función de unión a antígeno de un anticuerpo por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL/VK, VH, CL y CH1 ; (¡i) un fragmento F(ab') 2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente de disulfuro en la región de gozne; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región de gozne (véase, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3a. ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1 ; (v) un fragmento Fv, que consiste de los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (vi) un fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341 :544-546), que consiste en un dominio VH; (vii) una región determinante de complementariedad aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo, un región variable de cadena pesada que contiene un solo dominio variable y dos dominios constantes. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL/V« y VH, son codificados por diferentes genes, pueden ser unidos, en métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite hacerse como una cadena sencilla de proteína en la que el par de regiones VL/VK y VH para formar moléculas monovalentes (conocido como Fv de cadena sencilla (scFv); véase por ejemplo Bird et al. (1988) Science 242:423-426; y Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Estos anticuerpos de cadena sencilla pretenden ser abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpos se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos son determinados selectivamente para utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos.

Un "anticuerpo" aislado", como se usa aquí, está diseñado para referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos tener especificidades antigénicas diferentes (por ejemplo, un anticuerpo aislado que específicamente se une a CDH17 es substancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de CDH17). Un anticuerpo aislado que se une específicamente a CDH17 puede, sin embargo, tener reactividad cruzada a otros antígenos, tales como las moléculas CDH17 de otras especies. Más aún, y/o alternativamente, un anticuerpo aislado puede ser sustancialmente libre de otro material celular y/o productos químicos en una forma que normalmente no se encuentran en la naturaleza.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la invención son proteínas recombinantes, proteínas aisladas o proteínas substancialmente puras. Una proteína "aislada" no es acompañada por lo menos del material con el que normalmente se asocia en su estado natural, por ejemplo que constituye por lo menos aproximadamente 5%, o por lo menos aproximadamente 50% en peso de la proteína total en una muestra determinada. Se entiende que la proteína aislada puede constituir de 5 a 99.9% en peso del contenido total de proteína dependiendo de las circunstancias. Por ejemplo, la proteína puede hacerse en una concentración significativamente mayor a través de un promotor inducible o promotor de alta expresión, de tal manera que la proteína se hace a niveles de mayor concentración. En el caso de proteínas recombinantes, la definición incluye la producción de un anticuerpo en una amplia variedad de organismos y/o las células hospederas que son conocidas en la técnica en las que no se produce naturalmente.

Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa aquí, se refieren a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal muestra una especificidad y afinidad de unión única parar un epítope particular.

Como se usa aquí, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (v.gr., IgM o lgG1) que es codificada por los genes de la región constante de cadena pesada.

Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se usan indistintamente aquí con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno".

El término "derivados del anticuerpo" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo, v.gr., un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención pueden ser conjugados con una toxina, etiqueta, etc. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser no humanos, quiméricos, humanizados o plenamente humanos. Para una descripción de los conceptos de quimérico y anticuerpos, véase Clark et al., 2000 y referencias citadas en el mismo (Clark, 2000, Immunol Today 21 : 397-402). Los anticuerpos quiméricos comprenden la región variable de un anticuerpo no humano, por ejemplo, los dominios VH y VL de ejemplo de origen de ratón o rata, operablemente ligado a la región constante de un anticuerpo humano (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. no. 4,816,567). En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención son humanizados. Por anticuerpo "humanizado", como se usa aquí, se entiende un anticuerpo que comprende una región de marco de trabajo humana (FR) y una o más regiones determinantes de complementariedad (CDR) de un anticuerpo no humano (generalmente de ratón o rata). El anticuerpo no humano que provee la CDR se llama a "donador" y la inmunoglobulina humana que provee el marco de trabajo se llama "aceptor".

La humanización se basa principalmente en el injerto de CDRs donadoras en marcos de trabajo de VL y VH aceptares (humanos) (patente de E.U.A. No, 5,225,539). Esta estrategia se conoce como "injerto de CDR". La "retromutación" de residuos de marco de trabajo aceptores seleccionados a los correspondientes residuos de donadores a menudo es necesaria para recuperar la afinidad que se pierde en la construcción injertado inicial (US 5,530,101 ; US 5,585,089; US 5,693,761 ; US 5,693,762; US 6,180,370; US 5,859,205; US 5,821 ,337; US 6,054,297; US 6,407,213). El anticuerpo humanizado de manera óptima también estará integrado por lo menos por una porción de una región constante de inmunoglobulina, típicamente aquella de una inmunoglobulina humana y por lo tanto generalmente estará compuesto por una región Fe humana. Los métodos para humanizar los anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica y puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones et al., 1986, Nature 321 :522-525; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-329; Verhoeyen et al., 1988, Science, 239: 1534-1536). Ejemplos adicionales de anticuerpos monoclonales murinos humanizados también son conocidos en la técnica, por ejemplo anticuerpos que se unen a proteína humano C (O'Connor et al., 1998, Protein Eng 11 :321-8), receptor de interleucina 2 (Queen et al., 1989, Proc Nati Acad Sci, USA 86: 10029-33), y receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (Cárter et al., 1992, Proc Nati Acad Sci USA 89:4285-9). En una modalidad alternativa, los anticuerpos de la presente invención pueden ser totalmente humanos, es decir, que las secuencias de los anticuerpos son completamente o sustancialmente humanas. Se conocen varios métodos en la técnica para generar anticuerpos completamente humanos, incluyendo el uso de ratones transgénicos (Bruggemann et al., 1997, Curr Opin Biotechnol 8:455-458) o genotecas de anticuerpo humano junto con los métodos de selección (Griffiths et al., 1998, Curr Opin Biotechnol 9: 102-108).

El término "anticuerpo humanizado" se refiere a anticuerpos en los que las secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie mamífero, tales como un ratón, se han injertado en secuencias marco de trabajo humano. Se pueden hacer modificaciones de región de marco de trabajo adicionales dentro de las secuencias de marco de trabajo humano.

El término "anticuerpo quimérico" se refiere a anticuerpos en los cuales las secuencias de la región variable se derivan de una especie y las secuencias de la región constante se derivan de otra especie, tales como un anticuerpo en el que las secuencias de la región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de la región constante se derivan de un anticuerpo humano.

El término "se une específicamente" (o "se une inmunoespecíficamente") no está diseñado para indicar que un anticuerpo se une exclusivamente a su objetivo. Más bien, un anticuerpo "se une específicamente" si su afinidad por su objetivo destinado es aproximadamente 5 veces mayor en comparación con su afinidad por una molécula no objetivo. Convenientemente, no hay ninguna reacción cruzada significativa o unión cruzada con sustancias indeseadas, especialmente proteínas o tejidos que ocurren naturalmente de una persona sana o un animal. La afinidad del anticuerpo, por ejemplo, será por lo menos aproximadamente 5 veces, tal como 10 veces, tal como 25 veces, especialmente 50 veces y particularmente 100 veces o más, mayor para una molécula objetivo que su afinidad por una molécula de no objetivo. En algunas modalidades, unión específica entre un anticuerpo u otro agente de unión y un antígeno significa una afinidad de unión de por lo menos 106 M"1. Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con afinidades de por lo menos aproximadamente aproximadamente 107 M" , tal como entre aproximadamente 108 M"1 a aproximadamente 109 M"1, aproximadamente 109 M'1 a aproximadamente 1010 M"1, o aproximadamente 1010 M"1 a aproximadamente 1011 M~ . Los anticuerpos pueden, por ejemplo, unirse con una EC5o de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o muy preferiblemente 10 pM o menos.

El término "no se une sustancialmente" a una proteína o células, como se usa aquí, significa que no se une o no se une con una alta afinidad a la proteína o células, es decir, se une a la proteína o células con una KD de 1 x 10"6 M o más, muy preferiblemente 1 x 10'5 M o más, muy preferiblemente 1 x 10"4 M o más, muy preferiblemente 1 x 10"3 M o más, muy preferiblemente aún 1 x 10"2 M o más.

El término "ECso", como se usa aquí, se refiere a la potencia de un compuesto cuantificando la concentración que conduce a 50% de respuesta/efecto máximos. EC50 se puede determinar por Scratchard o FACS.

El término "Kasoc" o "Ka," como se usa aquí, se refiere a la tasa de asociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular, mientras que el término "Kd¡s" o "Kd" como se usa aquí, se refiere a la tasa de disociación de una interacción anticuerpo-antígeno particular. El término "KD," como se usa aquí, se refiere a la constante de disociación, que se obtiene de la relación de Ka a KA (es decir, Kd/KA) y se expresa como una concentración molar (M). Los valores de KD para anticuerpos se pueden determinar usando métodos bien establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar la KD de un anticuerpo es usando resonancia de plasmón de superficie, preferiblemente usando un sistema de biosensor tal como un sistema Biacore®.

Como se usa aquí, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 1 x 10"7 M o menos, muy preferiblemente 5 x 10"8 M o menos, muy preferiblemente aún 1 x 10"8 M o menos, muy preferiblemente aún 5 x 10"9 M o menos y muy preferiblemente aún 1 x 10"9 M o menos para una antígeno objetivo. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo de IgM se refiere a un anticuerpo que tiene una KD de 10'6 M o menos, muy preferiblemente 10"7 M o menos, muy preferiblemente aún 10"8 M o menos.

El término "epitope" o "determinante antigénico" se refiere a un sitio sobre un antígeno al cual una inmunoglobulina o anticuerpo se une específicamente. Los epítopes se pueden formar a partir de aminoácidos contiguos o aminoácidos no contiguos yuxtapuestos por doblez terciario de una proteína. Los epítopes formados a partir de aminoácidos contiguos son generalmente retenidos al exponerse a solventes desnaturalizantes, mientras que los epítopes formados por doblez terciario generalmente se pierden bajo tratamiento con solventes desnaturalizantes. Un epítope generalmente incluye por lo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14 o 15 aminoácidos en una conformación espacial única. Los métodos de determinación de conformación espacial de epítopes incluyen técnicas en la técnica y aquellos descritos aquí, por ejemplo, cristalografía de rayos X y 2-dimensional resonancia magnética nuclear (véase, v.gr., Epitope Mapping Protocols en Methods in Molecular Biology Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

La inhibición competitiva se puede determinar usando pruebas de rutina en las cuales la inmunoglobulina bajo prueba inhibe unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común. Numerosos tipos de pruebas de unión competitivas son conocidos, por ejemplo: radioinmunoensayo directo o indirecto de fase sólida (RIA), inmunoensayo de enzima directo o indirecto de fase sólida (EIA), ensayo de competencia de intercalado (véase Stahl et al., Methods in Enzymology 9:242 ( 1983)); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (véase Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensayo marcado directo de fase sólida, ensayo de intercalado marcado directo de fase sólida (véase Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Coid Spring Harbor Press (1988)); RIA de marcador directo de fase sólida usando 1-125 (véase Morel et al, Mol. Immunol. 25(1 ):7 (1988)); EIA de biotina-avidina directo de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); y RIA marcado directo. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Por lo general, dicho ensayo implica el uso de antígeno purificado unido a una superficie sólida o células que portan cualquiera de éstos, una ¡nmunoglobulina de prueba no marcada y una ¡nmunoglobulina de referencia marcada. La inhibición competitiva se mide al determinar la cantidad de marcador unido a la superficie sólida o células en presencia de ¡nmunoglobulina de prueba. Usualmente, la ¡nmunoglobulina de prueba está presente en exceso. Usualmente, cuando un anticuerpo competente está presente en exceso, inhibirá la unión específica de un anticuerpo de referencia a un antígeno común por lo menos por 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75% o más.

Otras técnicas incluyen, por ejemplo, métodos de mapeo de epítope, tales como análisis de rayos X de cristales de complejos antígeno:anticuerpo que provee resolución atómica del epítope. Otros métodos monitorean la unión del anticuerpo a fragmentos de antígeno o variaciones mutadas del antígeno en donde la pérdida de unión debida a una modificación de un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de antígeno a menudo se considera una indicación de un componente de epítope. Además, se pueden usar métodos combinatorios computacionales para mapeo de epítope también. Estos métodos se basan en la capacidad del anticuerpo de interés para aislar por afinidad a péptidos cortos aislados de genotecas de péptidos de despliegue de fagos combinatorias. Los péptidos entonces se consideran como terminales para la definición del epítope correspondiente al anticuerpo usado para determinar selectivamente la genoteca de péptidos. Para mapeo de epítope, también se han desarrollado algoritmos computacionales desarrollados que se ha mostrado que mapean epítopes discontinuos conformacionales.

Como se usa aquí, el término "sujeto" incluye cualquier humano o animal no humano. El término " animal no humano " incluye todos los vertebrados, v.gr., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc.

Varios aspectos de la invención se describen con mayor detalle en las siguientes subsecciones.

Anticuerpos anti-CDH17 Los anticuerpos de la invención se caracterizan por características funcionales o propiedades particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a CDH17 humana. Preferiblemente, un anticuerpo de la invención se une a CDH17 con alta afinidad, por ejemplo con una KD de 8 x 10"7 M o menos, muy generalmente aún 1 x 10"8 M o menos. Los anticuerpos anti-CDH17 de la invención preferiblemente presenta una o más de las siguientes características: se une a CDH17 humana con una EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o muy preferiblemente 10 pM o menos; se une a células humanas que expresan CDH17.

En una modalidad, los anticuerpos preferiblemente se unen a un epítope antigénico presente en CDH17, dicho epítope no está presente en otras proteínas. Los anticuerpos generalmente se unen a CDH17 pero no se unen a otras proteínas, o se unen a proteínas con baja afinidad, tal como una KD de 1 x 10"6 M o más, muy preferiblemente 1 x 10'5 M o más, muy preferiblemente 1 x 10"4 M o más, muy preferiblemente 1 x 10"3 M o más, muy preferiblemente aún 1 x 10"2 M o más. Preferiblemente, los anticuerpos no se unen a proteínas relacionadas, por ejemplo, los anticuerpos no se unen sustancialmente a otras moléculas de adhesión celular. En una modalidad, el anticuerpo puede ser internalizado en una célula que expresa CDH17. Los ensayos estándares para evaluar internalización de anticuerpo son conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, un ensayo de internalización HumZap.

Pruebas estándares para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia CDH17 son conocidas en la técnica, incluyendo por ejemplo, ELISAs, Western blots, RIAs, y análisis de citometría de flujo. Los ensayos adecuados se describen con detalle en los ejemplos. La cinética de unión (v.gr., afinidad de unión) de los anticuerpos también puede ser accesada por pruebas estándares conocidas en la técnica, tales como por análisis de sistema Biacore®. Para evaluar la unión a células tumorales B de Raji o Daudi, las células de Raji (Depósito de ATCC No. CCL-86) o Daudi (Depósito de ATCC No. CCL-213) se pueden obtener de fuentes públicamente disponibles, tales como el American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo), y usar en pruebas estándares, tales como análisis de citometría de flujo.

Anticuerpos monoclonales de la invención La invención se refiere particularmente a los anticuerpos aislados definidos aquí con respecto a las CDRs de SEQ ID NOs: 46-51.

Anticuerpos adicionales de la invención son los anticuerpos monoclonales CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los ejemplos 1-6 y 11. La secuencia de aminoácidos de VH humanizados de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 26 y la secuencia de aminoácidos de VK humanizados de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO:31. La secuencia de aminoácidos de VH humanizados de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ ID NO:44 y la secuencia de aminoácidos de VK humanizados de CDH 7 A4 4R se muestra en SEQ ID NO:46.

Dado que cada uno de estos anticuerpos se puede unir a CDH17, las secuencias de VH y VK pueden ser "mezcladas y acopladas" para crear otras moléculas de unión a anti-CDH17 de la invención. La unión a CDH17 de dichos anticuerpos "mezclados y acoplados" se puede probar usando las pruebas de unión descritas antes y en los ejemplos (v.gr., ELISAs). Preferiblemente, cuando las cadenas de VH y VK son mezcladas y acopladas, una secuencia de VH de un par de VH/VK particular es reemplazada por una secuencia de VH estructuralmente similar. Asimismo, preferiblemente una secuencia de VK de un par de VHA K particular es reemplazada por una secuencia de VK estructuralmente similar.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención provee un anticuerpo, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una SEQ ID NO: 8; en donde el anticuerpo se une específicamente a CDH17, preferiblemente CDH17 humana.

Por consiguiente, en un aspecto, la invención provee un anticuerpo humanizado, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 26 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una SEQ ID NO: 31 ; en donde el anticuerpo se une específicamente a CDH17, preferiblemente CDH17 humana.

En otro aspecto, la invención provee un anticuerpo humanizado, que comprende: una región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 45 y una región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos expuesta en una SEQ ID NO: 46; en donde el anticuerpo se une específicamente a CDH17, preferiblemente CDH17 humana.

En otro aspecto, la invención provee anticuerpos que comprenden las CDR1s, CDR2s y CDR3s de cadena pesada y cadena ligera de CDH17_A4, o combinaciones de las mismas. La secuencia de aminoácidos de VH CDR1 de CDH17_A4 se muestra en SEQ ID NO: 1. La secuencia de aminoácidos de VH CDR2 de CDH17 A4 se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de VH CDR3 de CDH17 A4 se muestra en SEQ ID NO:3. Las secuencias de aminoácidos de la VK CDR1 de CDH17_A4 se muestran en SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR2 de CDH17 A4 se muestra en SEQ ID NO: 5. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR3 de CDH17 A4 se muestra en SEQ ID NO: 6. Preferiblemente, hay una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en los aminoácidos en CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera.

En otro aspecto más, la invención provee anticuerpos que comprenden las CDR1s, CDR2s y CDR3s de cadena pesada y cadena ligera de CDH17_A4_4K, o combinaciones de las mismas. La secuencia de aminoácidos de VH CDR1 de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 36. La secuencia de aminoácidos de VH CDR2 de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 2. La secuencia de aminoácidos de VH CDR3 de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 39. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR1 de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 4. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR2 de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 40. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR3 de CDH17_A4_4K se muestra en SEQ ID NO: 41. Preferiblemente, hay una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en los aminoácidos en CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera.

En otro aspecto más, la invención provee anticuerpos que comprenden las CDR1s, CDR2s y CDR3s de cadena pesada y cadena ligera de CDH17 A4 4R, o combinaciones de las mismas. La secuencia de aminoácidos de VH CDR1 de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ.ID NO: 36. La secuencia de aminoácidos de VH CDR2 de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ ID NO : 42. La secuencia de aminoácidos de VH CDR3 de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ ID NO: 39. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR1 de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ ID NO: 43. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR2 de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ ID NO: 40. La secuencia de aminoácidos de la VK CDR3 de CDH17_A4_4R se muestra en SEQ ID NO: 41 En algunas modalidades, puede haber una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, adiciones y/o deleciones de aminoácidos en los aminoácidos en CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera.

En otro aspecto más, la invención provee un anticuerpo aislado que se une específicamente a Cadherina-17, que comprende: a) a región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 46; ¡i) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47; iii) una tercera CDR que comprende una aminoácido a secuencia de SEQ ID NO: 48; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 49; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 50; y iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 51. En algunas modalidades, puede haber una, dos, tres, cuatro o cinco aminoácido sustituciones, adiciones y/o deleciones en los aminoácidos en CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de la región variable de cadena pesada y/o la región variable de cadena ligera.

Las regiones CDR son desalineadas usando el sistema de Kabat (Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH No. 91 -3242).

La invención particularmente provee un método de tratamiento de cáncer gástrico, cáncer pancreático o cáncer de colon que comprende administrar a un sujeto que necesita el mismo una cantidad efectiva de un anticuerpo como se define aquí, particularmente un anticuerpo como se definió antes.

Dado que cada uno de estos anticuerpos pueden unirse a CDH17 y la especificidad de unión a antígeno se provee principalmente por las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3, las secuencias de VH CDR1 , CDR2, y CDR3 y las secuencias VK CDR1 , CDR2 y CDR3 se pueden "mezclar y acoplar" (es decir, CDRs de diferentes anticuerpos se pueden mezclar y acoplar, aunque cada anticuerpo generalmente contiene una VH CDR1 , CDR2, y CDR3 y una V CDR1 , CDR2, y CDR3) para crear otras moléculas de unión a anti-CDH17 de la invención. Por consiguiente, la invención incluye específicamente cada posible combinación de CDRs de las cadenas pesada y ligera.

La unión a CDH17 de dichos anticuerpos "mezclados y acoplados" pueden ser probados usando las pruebas de unión descritas anteriormente y en los ejemplos (v.gr., ELISAs, análisis de Biacore®). Preferiblemente, cuando secuencias de VH CDR son mezcladas y acopladas, la secuencia de CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VH particular es reemplazada por una CDR secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Asimismo, cuando las secuencias de Vk CDR son mezcladas y acopladas, la secuencia de CDR1 , CDR2 y/o CDR3 de una secuencia de VK CDR particular es reemplazada por una secuencia(s) de CDR estructuralmente similar(es). Será fácilmente aparente para el experto en la técnica que secuencias de VH y V novedosas se pueden crear al sustituir una o más secuencias de regiones de VH y/o VL V CDR con secuencias estructuralmente similares de las secuencias de CDR descritas aquí para anticuerpos monoclonales CDH17_A4.

Por consiguiente, en otro aspecto, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: una región CDR1 variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 29, 36 y 46; una región CDR2 variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 30, 42 y 47; una región CDR3 variable de cadena pesada que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3, 39 y 48; una región CDR1 variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 4, 33, 43 y 49; una región CDR2 variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 5, 40 y 50; y una región CDR3 variable de cadena ligera que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs:6, 41 y 51 ; con todas las posibles combinaciones siendo posibles, en donde el anticuerpo se une específicamente a CDH17, preferiblemente a CDH17 humana En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende: una región CDR1 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 1 ; una región CDR2 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:2; una región CDR3 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:3; una región CDR1 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:4; una región CDR2 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:5; y una región CDR3 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:6.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: una región CDR1 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:36; una región CDR2 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:2; una región CDR3 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:39; una región CDR1 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:4; una región CDR2 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:40; y una región CDR3 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:41.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: una región CDR1 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:36; una región CDR2 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:42; una región CDR3 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO:39; una región CDR1 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:43; una región CDR2 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:40; y una región CDR3 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO:41.

En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: una región CDR1 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 46; una región CDR2 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 47; una región CDR3 variable de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 48; una región CDR1 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 49; una región CDR2 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 50; y una región CDR3 variable de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 51.

Es bien sabido en la técnica que el dominio de CDR3, independientemente del dominio(s), CDR1 y o CDR2 sólo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo para un antígeno cognado y que múltiples anticuerpos pueden ser generados predeciblemente teniendo la misma especificidad de unión con base en una secuencia de CDR3 común. Véase, por ejemplo, Klimka et al, British J. of Cáncer 83(2):252-260 (2000) (que describe la producción de un anticuerpo anti-CD30 humanizado usando sólo el dominio de CDR3 variable de cadena pesada de anticuerpo anti-CD30 de murino Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (que describe anticuerpos de glicoproteína-2 epitelial recombinante (EGP-2) usando sólo la secuencia de CDR3 de cadena pesada del anticuerpo MOC-31 anti-EGP-2 de murino progenitor); Rader et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (que describe un panel de anticuerpos anti-integrina a?ß3 humanizados usando un el dominio de CDR3 variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo anti-integrina a?ß3 de murino LM609 en donde cada miembro del anticuerpo comprende una secuencia distinta fuera del dominio de CDR3 y es capaz de unirse al mismo epítope que el anticuerpo de murino progenitor con afinidades tan altas o más altas que el anticuerpo de murino progenitor); Barbas et al, J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (que describe que el dominio de CDR3 provee la contribución más significativa a unión a antígeno); Barbas et al, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (que describe el injerto de secuencias de la cadena pesada CDR3 de tres fábricas (SI-1 , Sl-40 y SI-32) contra ADN placentario humano en la cadena pesada de un Fab de toxoide antitetánico que reemplaza la CDR3 de cadena pesada existente y que demuestra que el dominio de CDR3 sólo confiere especificidad de unión); y Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (que describe estudios de injerto en donde la transferencia de sólo la CDR3 de cadena pesada de una LNA3 de Fab poliespecífica progenitora a una cadena pesada de anticuerpo de Fab p3 3 de toxoide tetánica de IgG monoespecífica fue suficiente para retener la especificidad de la unión del Fab progenitor). Cada una de estas referencias es incorporada aquí por referencia en su totalidad.

Por consiguiente, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo que se deriva de un humano o animal no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a CDH17. En ciertos aspectos, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera desde un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de ratón o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a CDH17. En de algunas modalidades, dicho anticuerpos inventivos que comprende uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir para unión con; (b) retienen las características funcionales; (c) se unen al mismo epítope; o (d) tienen una afinidad de unión similar a la del anticuerpo de no-humano progenitor correspondiente.

En otros aspectos, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprende uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tales como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a CDH17. En otros aspectos, la presente invención provee anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios de CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaces de unirse específicamente a CDH17 y en donde el dominio CDR3 del primer anticuerpo humano reemplaza a un dominio de CDR3 en un anticuerpo humano que carece de especificidad de unión para CDH17 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse específicamente a CDH17. En de algunas modalidades, dichos anticuerpos inventivos que comprenden uno o más dominios de CD# de cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir para unión con; (b) retienen las características funcionales; (c) se unen al mismo epítope; y/o (d) tienen una afinidad similar que el primer anticuerpo humano progenitor correspondiente.

Anticuerpos que tienen secuencias de línea germinal particulares En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un gen de ¡nmunoglobulina de cadena pesada de línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de ¡nmunoglobulina de cadena ligera de linea germinal particular.

Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende a región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen de VH105 de una región de VH III de murino o un gen de VH II H17, en donde el anticuerpo se une específicamente a CDH17. En otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende a región variable de cadena ligera que es el producto de o derivado de un gen de VK 8-30 de murino, en donde el anticuerpo se une específicamente a CDH17.

En otra modalidad preferida, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo: comprende una región variable de cadena pesada que es el producto de o derivado de un gen de VHII H17 o un gen de VH105 de una región de VH II de murino (dichos genes incluyen las secuencias de nucleótidos expuestas en SEQ ID NO: 17 y 18 respectivamente); comprende una región variable de cadena ligera que es el producto de o derivada de un den de VK 8-30 de murino (que incluye las secuencias de nucleótidos expuesta en SEQ ID NOs: 19, 20 y 21); y se une específicamente a CDH17, preferiblemente CDH17 humano.

Ejemplos de un anticuerpo que tiene gen H17 VH de VH II o región de VH II VH105 y Vk de V 8-30 es CDH17_A4.

Como se usa aquí, un anticuerpo comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que es "el producto de o "derivada de" una secuencia de línea germinal particular si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que usa genes de inmunoglobulina de línea germinal de murino. Dichos sistemas incluyen determinación selectiva de una genoteca de genes de inmunoglobulina de murino desplegados en fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo que es "el producto de o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal de murino puede identificarse como tal comparando la secuencia de nucleótidos o aminoácidos del anticuerpo con las secuencias de nucleótidos o aminoácidos de las inmunoglobulinas de línea germinal de murino y seleccionar la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal de murino que está más cerca en secuencia (es decir, mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo. Un anticuerpo que es "el producto de o "derivado de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal de murino particular puede contener diferencias de aminoácidos en comparación con la secuencia de línea germinal, debido a, por ejemplo, las mutaciones somáticas naturales o introducción intencional de mutación dirigida. Sin embargo, un anticuerpo seleccionado típicamente por lo menos 90% idéntico en la secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal de murino y contiene residuos de aminoácidos que identifican el anticuerpo como siendo murinos en comparación con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies (v.gr., secuencias de la línea germinal humana). En ciertos casos, un anticuerpo puede ser por lo menos 95%, o incluso por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos idéntico a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, un anticuerpo que se deriva de una secuencia de línea germinal de murino particular mostrará no más de 10 diferencias de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal de murino. En ciertos casos, el anticuerpo puede mostrar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2 ó 1 de diferencia de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal.

Anticuerpos homólogos En otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homologas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos aquí descritos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CDH17 de la invención.

Por ejemplo, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado o fragmento de unión a antígeno, que comprende una región variable de la cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: la región variable de la cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntico a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOs: 7, 26, 27, 28 y 44; la región variable de cadena ligera compone de una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 80% idéntico a una secuencia de aminoácidos de SEQ ID No: 8, 31 , 32 y 45; y el anticuerpo se une al CDH17 humana. Los anticuerpos de la invención pueden unirse a CDH17 humana con un EC5o de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o muy preferiblemente 22 o menos.

El anticuerpo también se puede unir a células CHO transfectadas con CDH17 humana.

En varias modalidades, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano; un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico.

En otras modalidades, las secuencias de aminoácidos VH y/o VK pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las secuencias expuestas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones VH y VK que tiene altas (es decir, el 80% o superior) idénticas a las regiones VH y VK de las secuencias establecidas anteriormente, pueden obtenerse por mutagénesis (v.gr., mutagénesis dirigida al sitio o mediada por la PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican SEQ ID NOs: 9, 10, seguido por la prueba de anticuerpo alterado codificado para función retenida usando los ensayos funcionales descritos aquí El por ciento de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartida por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/total # de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de lagunas y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias pueden lograrse usando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes más adelante.

El por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Meyers E. y W. Miller (Comput. Liquid Biósci., 4: 1 1-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa de alineación ALIGN (versión 2.0), usando una tabla de residuos de peso PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y una sanción de espacio de 4. Además, el por ciento de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que se ha incorporado a el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), usando una matriz Blossum 62 o una matriz de PAM250 y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ó 4 y un peso de longitud de 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6.

Además o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención se pueden usar como una "secuencia de consulta" para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar secuencias relacionadas. Estas búsquedas se pueden realizar usando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul, et al (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Las búsquedas proteína BLASTS pueden realizarse con el programa XBLAST, puntuación = 50, longitud de palabra = 3 para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones con espacios para fines comparativos, BLAS con espacios puede ser usada como se describe en Altschul et al., (1997) los Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402. Cuando se utilizan programas BLAST y BLAS con espacios, se pueden usar parámetros por omisión de los respectivos programas (v.gr., XBLAST y NBLAST). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticuerpos con modificaciones conservativas En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias de CDR comprenden secuencias de aminoácidos especificadas basadas en los anticuerpos preferidos aquí descritos (v.gr., CDH17_A4), o modificaciones conservativas de los mismos, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CDH17 de la invención. En consecuencia, la invención provee un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDR1 , CDR2 y CDR3, donde: la secuencia de la región CDR3 variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 3, 39, 48 y modificaciones conservativas; la secuencia de la región variable CDR3 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6, 41 , 51 y modificaciones conservativas de la misma; y el anticuerpo se une a la CDH17 humana. Estos anticuerpos pueden unirse a CDH17 humana con una EC50 de 50 nM o menos, 10 nM o menos, 1 nM o menos, 100 pM o menos, o más preferiblemente 22 o menos.

El anticuerpo puede unirse también a las células CHO transfectadas con CDH17 humana.

En una modalidad preferida, la secuencia de la región CDR2 variable de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 2, 30, 42, 47 y modificaciones conservativas de la misma; y la secuencia de región CDR2 variable de cadena ligera consta de una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5, 40 y 50 y modificaciones conservativas de la misma. En otra modalidad preferida, la secuencia de región variable CDR1 de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOs: 1 , 29, 36, 46 y modificaciones conservativas de la misma; y la secuencia de región variable CDR1 de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 4, 33, 43 y 49 y modificaciones conservativas de la misma.

En varias modalidades, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o quiméricos anticuerpos.

Como se usa aquí, el término "modificaciones de secuencia conservativas" pretende referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservativas incluyen sustituciones, adiciones y deleciones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la invención por medio de técnicas estándares conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son aquellas en las que el residuo de aminoácido es reemplazado por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (v.gr., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (v.gr., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas de lado polares sin carga (v.gr., glicina, asparragina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (v,.gr., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (v.gr., tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por lo tanto, uno o más residuos de aminoácidos dentro de las regiones de CDR de un anticuerpo de la invención pueden reemplazarse por otros residuos de aminoácidos de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede probarse para función retenida usando los ensayos funcionales descritos aquí.

La secuencia de CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 1 , 29, 36 ó 46 puede comprender una o más modificaciones de secuencia conservativa, como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; la secuencia de CDR1 de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, 33, 43 y 49 puede comprender una o más modificaciones de secuencia conservativa, como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones de aminoácidos, adiciones o deleciones; la secuencia de CDR2 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, 30, 42 y 47 puede comprender una o más modificaciones de secuencia conservativa, como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; la secuencia de CDR2 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 5, 40 ó 50 puede comprender una o más modificaciones de secuencia conservativa, como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; la secuencia de CDR3 de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 3, 39 y 48 puede comprender una o más modificaciones de secuencia conservativa, como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos; o la secuencia de CDR3 de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 6, 41 y 51 puede comprender uno o más modificaciones de secuencia conservativa, como uno, dos, tres, cuatro, cinco o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos.

Anticuerpos que se unen al mismo epítope como anticuerpos ant¡-CDH17 de la invención En otra modalidad, la invención provee anticuerpos que se unen al mismo epítope en CDH17 humano como cualquiera de los anticuerpos monoclonales de CDH17 de la invención (es decir, anticuerpos que tienen la capacidad para competir en forma cruzada para unirse a la CDH17 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención). En modalidades preferidas, el anticuerpo de referencia para estudios de competencia cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal CDH17_A4 (que tiene secuencias VH y VK como se muestra en SEQ ID NOs: 7 y 8 respectivamente). Estos anticuerpos de competencia cruzada pueden identificarse con base en su capacidad para competir en forma cruzada con CDH17_A4, CDH17_A4_4K, o CDH17_A4_4R en de pruebas de unión a CDH17 estándares. Por ejemplo, análisis de BIAcore, pruebas de ELISA o citometría de flujo se pueden usar para demostrar la competencia cruzada con los anticuerpos de la presente invención. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión de, por ejemplo, de la CDH17_A4, CDH17_A4_4K, o CDH17_A4_4R, a CDH17 humana demuestra que la anticuerpos de prueba pueden competir con CDH17_A4, CDH17_A4_4K, o CDH17_A4_4R para unirse a una CDH17 humana y por lo tanto se une al mismo epítope en CDH17 humana como CDH17_A4, CDH17_A4_4K, o CDR17_A4_4R.

Anticuerpos genéticamente diseñados v modificados Un anticuerpo de la invención más se puede preparar usando un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH O Vl descritas aquí que pueden usarse como material de partida para diseñar genéticamente un anticuerpo modificado, dichos anticuerpos modificados pueden haber alterado propiedades en comparación con el anticuerpo de la partida. Un anticuerpo puede diseñarse genéticamente mediante la modificación de uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (es decir, VH y/o VL), por ejemplo dentro de una o más regiones de CDR y/o dentro de una o más regiones de marco de trabajo. Además o alternativamente, puede diseñarse genéticamente un anticuerpo mediante la modificación de residuos dentro de las regiones constantes, por ejemplo, para alterar las funciones efectoras del anticuerpo.

En ciertas modalidades, el injerto de CDR puede usarse para crear regiones variables de los anticuerpos. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácidos que se encuentran en las seis regiones determinantes de complementariedad (CDR) de cadena pesada y ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre los anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias de CDR son responsables de la mayoría de las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que simulen las propiedades de anticuerpos naturales específicos mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen secuencias de CDR del anticuerpo natural específico injertado en secuencias de marco de trabajo de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (véase, v.gr., Riechmann, L. et al. (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al. (1986) Nature 321 :522-525; Queen, C. et al. (1989) Proc. Nati. Acad. Véase. E.U..A. 86: 10029-10033; patente de E.U.A. No. 5,225,539 a Winter y patente de E.U.A. No. 5,530,101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen et al.) En consecuencia, otra modalidad de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 29, 36 y 46, SEQ ID NO: 2, 30, 42 y 47 y SEQ ID NOs: 339 y 48, respectivamente y una región variable de cadena ligera que comprende las secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, 33, 43 y 49, SEQ ID NOs: 5, 40 y 50 y SEQ ID NO: 6, 41 y 51 , respectivamente. Por lo tanto, estos anticuerpos contienen las secuencias de CDR de VH y V« de anticuerpos monoclonales CDH17_A4, CDH17_A4_4K, o CDH17_A4_4R pero puede contener diferentes secuencias de marco de trabajo de estos anticuerpos.

Tales secuencias de marco de trabajo pueden obtenerse en bases de datos públicas de ADN o referencias publicadas que incluyen secuencias de genes de anticuerpos de línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para los genes de región variable de la cadena pesada y ligera de murino pueden encontrarse en la base de datos de secuencia de línea germinal de murino de I GT (InMunoGenéTica Internacional) (disponible en Internet en imgt.cines.fr/), así como en Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; el contenido de cada una de las cuales es expresamente incorporado aquí por referencia. Como otro ejemplo, las secuencias del ADN de línea germinal para genes de la región variable de cadena pesada y ligera de murino pueden encontrarse en la base de datos de Genbank.

Las secuencias de proteínas de anticuerpo se comparan contra una base de datos de secuencia de proteína compilada usando uno de los métodos de búsqueda de similitudes de secuencia llamados BLAST con espacios (investigación de ácidos nucleicos (AltschuI et al. (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), que es bien conocido por los expertos en la técnica. BLAST es un algoritmo heurístico en que una alineación estadísticamente significativa entre la secuencia del anticuerpo y la secuencia de la base de datos es probable que contenga pares segmentos de alta puntuación (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmentos cuyas puntuaciones no pueden ser mejoradas por extensión o recorte se llaman un hit. Brevemente, las secuencias de nucleótidos en la base de datos son traducidas y se retiene la región entre y que incluye la región de marco de trabajo de FR1 a FR3. Las secuencias de bases de datos tienen una longitud promedio de 98 residuos. Se eliminan secuencias duplicadas que son coincidencias exactas sobre la longitud entera de la proteína. Una búsqueda en BLAST de proteínas con el programa blastp con parámetros estándares por omisión, excepto el filtro de baja complejidad, que se apaga, y la matriz de sustitución de BLOSU 62, filtros para coincidencia de secuencia con rendimiento de los 5 hits principales. Las secuencias de nucleótidos son traducidas en todos los seis marcos de trabajo y el marco de trabajo sin codones de detención en el segmento coincidente de la secuencia de la base de datos se considera el hit potencial. Esto, a su vez, es confirmado usando la programa de BLAST tblastx, que traduce a la secuencia de anticuerpos en todos los seis marcos de trabajo y compara estas traducciones con las secuencias de nucleótidos en la base de datos dinámicamente traducidas en todos los seis marcos de trabajo.

Las identidades son coincidencias exactas de aminoácidos entre la secuencia del anticuerpo y la base de datos de proteínas en toda la longitud de la secuencia. Los aspectos positivos (identidades + coincidencia de sustitución) no son idénticos pero sustituciones de aminoácidos, guiadas por la matriz de sustitución de BLOSUM62. Si la secuencia de anticuerpos coincide con dos de las secuencias de base de datos con la misma identidad, se decidiría el hit con más positivos sea el hit de secuencia correspondiente.

Secuencias marco de trabajo preferido para usarse en los anticuerpos de la invención son aquellos que son estructuralmente similares a las secuencias de marco de trabajo usadas por anticuerpos seleccionados de la invención, v.gr., similares la secuencia de marco de trabajo del gene H17 de VH II, la secuencia de marco de trabajo VH105 de la región VH II y/o la VK secuencia de marco de trabajo de VK 8-30 usadas por anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH y las secuencias de CDR1 , CDR2 y CDR3 de VK, pueden ser injertadas en regiones de marco de trabajo que tienen la secuencia idéntica aquella encontrada en el gene de inmunoglobulina de línea germinal del cual deriva la secuencia de marco de trabajo, o las secuencias de CDR pueden ser injertadas en regiones de marco de trabajo que contienen una o más mutaciones en comparación con las secuencias de la línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertos casos es benéfico mutar residuos dentro de las regiones de marco de trabajo para mantener o mejorar el capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (véase, v.gr., patente de E.U.A.

No. 5,530,101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 a Queen et al.).

Otro tipo de modificación de la región variable es mutar residuos de aminoácidos dentro de las regiones de CDR1 , CDR2 y CDR3 de VH o VK para mejorar así una o más propiedades de unión (v.gr., afinidad) del anticuerpo de interés. La mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR puede realizarse para introducir la mutación(es) y el efecto sobre la unión del anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, pueden ser evaluadas en ensayos in vitro o in vivo, como se describe aquí y en los ejemplos. En algunas modalidades, las modificaciones conservativas (como se describió anteriormente) se introducen. Alternativamente, se pueden hacer modificaciones no conservativas. Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos, pero preferiblemente sustituciones. Además, normalmente no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región de CDR se alteran, aunque como lo apreciarán los expertos en la técnica, las variantes en otras regiones (por ejemplo, regiones de marco de trabajo) pueden ser mayores.

Por consiguiente, en otra modalidad, la presente descripción provee anticuerpos monoclonales anti-CDH17 aislados, o porciones de unión a antígeno, que comprende una región variable de la cadena pesada que comprende: (a) una región CDR1 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEO. ID NO: 1 , 29, 36 y 46 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 1 , 29, 36 y 46; (b) una región CDR2 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 30, 42 y 47 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 2, 30, 42 y 47; (c) una región CDR3 de VH que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 3, 39 y 48 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 3, 39 y 48; (d) una región CDR1 de V« que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, 33, 43 o 49 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 4, 33, 43 y 49; (e) una región de CDR2 V« que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, 40 y 50 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 5, 40 o 50; y (f) una región CDR3 de VK que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 6, 41 y 51 o una secuencia de aminoácidos que tiene uno, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en comparación con SEQ ID NOs: 6, 41 y 51.

Los anticuerpos genéticamente diseñados de la invención son aquellos en los que se han realizado modificaciones a los residuos de marco de trabajo entro de VH y/o VK, v.gr., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Normalmente dichas modificaciones del marco de trabajo se hacen para disminuir la inmunogenicidad de los anticuerpos. Por ejemplo, un enfoque es "retromutar" uno o más residuos de marco de trabajo a la secuencia correspondiente de la línea germinal. Más específicamente, un anticuerpo que ha sufrido mutación somática puede contener residuos de marco de trabajo que difieren de la secuencia de la línea germinal del cual se deriva el anticuerpo. Estos residuos pueden identificarse mediante la comparación de las secuencias de marco de trabajo de anticuerpos con las secuencias de la línea germinal de las cuales deriva el anticuerpo.

Otro tipo de modificación del marco de trabajo implica mutar uno o más residuos dentro de la región de marco de trabajo, o incluso dentro de una o más regiones de CDR, para eliminar los epítopes de células T para reducir así el potencial de inmunogenicidad del anticuerpo. Este enfoque se conoce también como "desinmunización" y se describe con mayor detalle en la publicación de patente de E.U.A. No. 2003/0153043 por Carr et al.

Además o como alternativa a modificaciones hechas dentro de regiones de marco de trabajo o CDR, los anticuerpos de la invención pueden diseñarse para incluir modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, como la vida media en el suero, fijación de complemento, unión de receptor Fe y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede ser modificado químicamente (v.gr., una o más porciones químicas pueden acoplarse al anticuerpo) o ser modificadas para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe con más detalle a continuación. La numeración de los residuos en la región Fe es el índice de EU de Kabat.

En una modalidad, la región de gozne de CH1 se modifica de tal manera que el número de residuos de cisteína en la región de gozne es alterado, v.gr., aumentado o disminuido. Este enfoque se describe además en la patente de E.U.A. No. 5,677,425 por Bodmer et al. El número de residuos de cisteína en la región de gozne del CH1 es alterado para, por ejemplo, facilitar el ensamble de las cadenas ligera y pesada o para aumentar o disminuir la estabilidad del anticuerpo.

En otra modalidad, la región de gozne de Fe de un anticuerpo es mutada para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. De manera más específica, una o más de las mutaciones del aminoácido se introducen en la región de interfaz de dominio de CH2-CH3 del fragmento Fc-gozne de tal manera que el anticuerpo ha deteriorado la unión de la proteína estafilocócica A (SpA) en relación con la unión de SpA de dominio de Fc-gozne nativa. Este enfoque se describe con mayor detalle en patente de E.U.A. No. 6,165,745 por Ward et al.

En otra modalidad, el anticuerpo es modificado para aumentar su vida media biológica. Diversos enfoques son posibles. Por ejemplo, pueden introducirse una o varias de las mutaciones siguientes: T252L, T254S, T256F, como se describe en la patente de E.U.A. No. 6,277,375 de Ward. Alternativamente, para aumentar la vida media biológica, el anticuerpo puede ser alterado dentro de la región CH1 o CL para contener un epítope de unión a receptor de salvamento tomado de dos bucles de un dominio de CH2 de una región Fe de una IgG, como se describe en las patentes de E.U.A. No. 5,869,046 y 6,121,022 por Presta al.

En otra modalidad, el anticuerpo se produce como un unicuerpo (UniBody) como se describe en WO2007/059782 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

En otras modalidades, la región de Fe es alterada mediante el reemplazo de por lo menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar las funciones efectoras del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos procedente de los residuos del aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden ser reemplazados por un residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada por un ligando efector pero retiene la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo progenitor. El ligando efector al cual se altera la afinidad puede ser, por ejemplo, un receptor de Fe o el componente de C1 del complemento. Este enfoque se describe con mayor detalle en las patentes de E.U.A. No. 5,624,821 y 5,648,260, ambas por invierno et al.

En otro ejemplo, uno o más aminoácidos procedentes de residuos de aminoácidos, 329, 331 y 322 pueden ser reemplazados por un residuo de aminoácido diferente de tal manera que el anticuerpo ha alterado la unión a qC1 y/o reducido o suprimido la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Este enfoque se describe con mayor detalle en ja patente de E.U.A. No. 6,194,551 por Idusogie et al.

En otro ejemplo, uno o más residuos del aminoácido dentro del aminoácido posiciones 231 y 239 se alteran para alterar de tal modo la capacidad del anticuerpo para fijar el complemento. Este enfoque se describen con más detalle en el PCT publicación WO 94/29351 por Bodmer et al.

En otro ejemplo, la región de Fe es modificada para aumentar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) y/o aumentar la afinidad del anticuerpo para un receptor de Fey al modificar uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301 , 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331 , 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ó 439. Este enfoque se describen además en la publicación del PCT WO 00/42072 por Presta. Más aún, los sitios de unión en lgG1 humana para FcyR , FcyRIl, FcyRIII y FcRn se han mapeado y se han descrito variantes con unión mejorada (véase Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). Se mostró que las mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mejoraron la unión a FcyRIII.

Además, se mostró que los siguientes mutantes de combinación mejoran la unión a FcyRIII: T256A S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A 334A. Otras variantes de ADCC se describen por ejemplo en el documento WO2006/019447.

En otro ejemplo, la región de Fe es modificada para aumentar la vida media del anticuerpo, generalmente aumentando la unión al receptor de FcRn, como se describe por ejemplo en los documentos PCT/US2008/088053, US 7,371 ,826, U.S. 7,670,600 y WO 97/34631.

En otra modalidad, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, se puede hacer un anticuerpo aglicosilado (es decir, el anticuerpo carece de glicosilación). La glicosilación puede ser alterada, por ejemplo, para aumentar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Dichas modificaciones de carbohidratos pueden lograrse mediante, por ejemplo, la alteración de uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpo. Por ejemplo, se pueden hacer una o varias sustituciones de aminoácidos que den por resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de marco de trabajo de región variable para eliminar así glicosilación en ese sitio. Dicha aglicosilación puede aumentar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Este enfoque se describe con mayor detalle en las patentes de E.U.A. Nos. 5,714,350 y 6,350,861 por Co et al. y se puede lograr mediante la remoción de la asparagina en la posición 297.

Además o alternativamente, se puede hacer un anticuerpo que tenga un tipo alterado de glicosilación, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos de fucosilo o un anticuerpo que tiene las estructuras de GIcNac de bisección incrementadas. Esto se refiere a veces en la técnica como una "glicoforma genéticamente diseñada". Se ha demostrado que estos patrones de glicosilacion alterados aumentan la capacidad ADCC de los anticuerpos. Dichas modificaciones de carbohidratos generalmente pueden realizarse de dos maneras; por ejemplo, en algunas modalidades, el anticuerpo se expresa en una célula hospedera con maquinaria de glicosilacion alterada. Las células con maquinaria de glicosilacion alterada se han descrito en la técnica y pueden usarse como células hospederas en el cuales se expresan los anticuerpos recombinantes de la invención para producir así un anticuerpo con glicosilacion alterada. Se hace referencia a la tecnología POTELLIGENT®. Por ejemplo, las líneas de células Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen de fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1.6) fucosiltransferasa), de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas de células Ms704, Ms705, y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas de células Ms704, s705 y Ms709 FUT87' fueron creadas por la alteración objetivo del gen FUT8 en células CHO/DG44 usando dos vectores de recambio (véase publicación de patente de E.U.A. No. 2004/0110704 por Yamane et al., patente de E.U.A. No. 7,517,670 y Yamane-Ohnuki et al (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como otro ejemplo, EP 1 , 76,195 por Hanai et describe una línea de células con un gen FUT8 funcionalmente alterado, que codifica fucosil transferasa, de tal manera que los anticuerpos expresados en dicha línea de células presentan hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima relacionada con la unión a alfa 1 ,6. Hanai et al describen también líneas de células que tienen una actividad enzimática baja para añadir fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región de Fe del anticuerpo o no tiene la actividad enzimática, por ejemplo la rata mieloma línea de células YB2/0 (ATCC CRL 1662). La publicación del PCT WO 03/035835 por Presta describe una línea de células de CHO variante, células Lec13, con disminución de la capacidad para fijar fucosa a carbohidratos unidos a Asn(297), dando por resultado también la hipofucosilación de anticuerpos expresados en esa célula hospedera (véase también Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). La publicación del PCT WO 99/54342 por Umana et al. describe líneas de células diseñadas para expresar los modificadores de las glicosil transferasas modificadoras de glicoproteína (v gr.. beta(1 ,4)-N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII)) de tal manera que los anticuerpos expresados en las líneas de células genéticamente diseñadas presentan estructuras de GIcNac de bisección incrementadas que se da por resultado un aumento de la actividad ADCC de los anticuerpos (véase también Umana et al (1999) Nal Biotech. 17:176-180). Alternativamente, los residuos de fucosa del anticuerpo pueden ser escindidos apagado usando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa remueve residuos de fucosil de los anticuerpos (Tarentino, A.L. et al., (1975) Biochem. 14:5516-23).

Alternativamente, se pueden hacer glicoformas genéticamente diseñadas, particularmente afucosilación, usando inhibidores de molécula pequeña de enzimas de la vía de glicosilación. Ver por ejemplo Rothman et al., Mol. Immunol. 26(12): 113-1 123 (1989); Elbein, FASEB J. 5:3055 (1991); PCT/US2009/042610 y patente de E.U.A. No. 7,700,321.

Otra modificación de los anticuerpos en la presente que es contemplada por la invención es la pegilación. Un anticuerpo puede ser pegilado para, por ejemplo, aumentar la vida media biológica (por ejemplo, suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo o fragmento del mismo, típicamente se hace reaccionar con polietilenglicol (PEG), tal como un derivado de éster o aldehido reactivo derivado de PEG, bajo condiciones en las que uno o más grupos de PEG se apega al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferiblemente, la pegilación se lleva a cabo mediante una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula de PEG reactiva (o un polímero soluble en agua reactivo análogo). Como se usa aquí, el término "polietilenglicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG qúe se han usado para derivar otras proteínas, como el mono alcoxi- o ariloxi (C1-C10) polietilenglicol o polietilenglicol-maleimida. En ciertas modalidades, el anticuerpo que ha de ser pegilado es un anticuerpo aglicosilado. Los métodos para pegilar las proteínas son conocidos en la técnica y se pueden aplicar a los anticuerpos de la invención. Véase por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al y EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

En modalidades adicionales, por ejemplo en el uso de los anticuerpos de la invención para propósitos de diagnóstico o de detección, los anticuerpos pueden comprender un marcador. Por "marcados", aquí se entiende que un compuesto tiene por lo menos un elemento, isótopo o compuesto químico unido para permitir la detección del compuesto. En general, los marcadores se dividen en tres clases: a) marcadores isotópicos, que pueden ser isótopos radioactivos o pesados; b) magnéticos, eléctricos, térmicos; y c) tintes de colores o luminiscentes; Aunque los marcadores incluyen las enzimas y partículas como las partículas magnéticas también. Los marcadores preferidos incluyen, pero no se limitan, complejos de lantánidos fluorescentes (incluyendo los de europio y terbio) y marcadores fluorescentes incluyendo, pero no limitado a, puntos cuánticos, fluoresceína, rodamina, tetrametilrodamina, eosina, eritrosina, cumarina, metil-cumarinas, pireno, verde de malaquita, estilbenos, amarillo de luciferasa, azul cascada, rojo de Texas, los tintes de Alexa, los tintes de Cy y otros descritos en la 6a edición del Molecular Probes Handbook by Richard P. Haugland, incorporados expresamente aquí por referencia.

Propiedades físicas del anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse además por las diversas propiedades físicas de los anticuerpos anti-CDH17. Varios ensayos pueden usarse para detectar y distinguir diferentes clases de anticuerpos con base en las propiedades físicas.

En algunas modalidades, anticuerpos de la presente invención pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la región variable de cadena ligera o pesada. La presencia de uno o más sitios de glicosilación en la región variable pueden dar por resultado un aumento de inmunogenicidad del anticuerpo o una alteración de la pK de anticuerpos debido a la unión a antígeno alterada (Marshall et al (1972) Annu Rev Biochem 41_:673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al (1988) J Exp Med 168: 1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al. (2000) Mol Immunol 37:697-706). Se ha sabido que la glicosilación ocurre en motivos que contienen una secuencia de N-X-S/T. La glicosilación de la región variable puede probarse mediante un ensayo de Glycoblot, que escinde el anticuerpo para producir un Fab, y luego pruebas de glicosilación usando un análisis que mide oxidación de peryodato y formación de base de Schiff. Alternativamente, la glicosilación de la región variable utilizando puede probarse cromatografía de Dionex luz (Dionex-LC), que escinde sacáridos de un Fab en monosacáridos y analiza el contenido de sacáridos individuales. En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-CDH17 que no contiene la región variable de glicosilación. Esto puede lograrse ya sea seleccionando anticuerpos que no contienen el motivo de glicosilación de la región variable o mutando residuos dentro del motivo de glicosilación usando técnicas estándares conocidas en la técnica.

En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención no contienen sitios de isomerismo de asparragina. La desaminación o n efecto de ácido isoaspártico puede ocurrir en secuencias N-G o D-G, respectivamente. La desaminación o efecto ácido isoaspártico da por resultado la creación de ácido isoaspártico que disminuye la estabilidad de un anticuerpo mediante la creación de una estructura torcida fuera de una carboxilo-terminal de la cadena lateral en lugar de la cadena principal. La creación de ácido isoaspártico ácido puede medirse usando una prueba iso-quant, que usa una HPLC de fase inversa para probar ácido isoaspártico.

Cada anticuerpo tendrá un único punto isoeléctrico (pl), pero generalmente los anticuerpos caen en el intervalo de pH de entre 6 y 9.5. El, pl para un anticuerpo lgG1 típicamente cae dentro del intervalo de pH de 7-9.5 y el pl de un anticuerpo de lgG4 normalmente cae dentro del intervalo de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pl que esté fuera de este intervalo. Aunque los efectos son generalmente desconocidos, hay especulación de que los anticuerpos con un pl fuera del intervalo normal pueden tener algún desdoblamiento e inestabilidad en condiciones in vivo. El punto isoeléctrico puede probarse usando un ensayo de enfoque isoeléctrico capilar, que crea un gradiente de pH y puede utilizar láser centrado para mayor precisión (Janini et al (2002) Electrophoresis 23: 1605-11 ; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En algunos casos, se prefiere tener un anticuerpo anti-CDH17 que contiene un valor de pl que cae en el intervalo normal. Esto puede lograrse mediante la selección de anticuerpos con un pl en el intervalo normal, o al mutar residuos de superficie cargados residuos las técnicas estándares conocidas en la técnica.

Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión que es indicativa de la estabilidad térmica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361 -71 ). Una estabilidad térmica más alta indica una mayor estabilidad general del anticuerpo in vivo. El punto de fusión de un anticuerpo puede medirse usando técnicas como calorimetría diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). T I indica la temperatura del desdoblamiento inicial del anticuerpo. T 2 indica la temperatura del desdoblamiento completo del anticuerpo. Por lo general, es preferible que la TMI de un anticuerpo de la presente invención sea superior a 60°C, preferiblemente superior a 65°C, incluso muy preferiblemente superior a 70°C. Alternativamente, la estabilidad térmica de un anticuerpo puede ser medida mediante dicroísmo circular (Murray et al., (2002) J Chromatogr Sci 40:343-9).

En una modalidad preferida, se seleccionan los anticuerpos que no se degradan rápidamente. La fragmentación de un anticuerpo ant¡-CDH17 puede ser medida usando electroforesis capilar (CE) y MALDI-MS, como se entiende en la técnica (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

En otra modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos mínimos de agregación. La agregación puede conducir al desencadenamiento de una respuesta inmune no deseada y/o propiedades farmacocinéticas desfavorables o alteradas. Por lo general, los anticuerpos son aceptables con la agregación del 25% o menos, preferiblemente 20% o menos, muy preferiblemente 15% o menos, muy preferiblemente aún 10% o menos y muy preferiblemente todavía 5% o menos. La agregación puede medirse mediante varias técnicas bien conocidas en la técnica, incluyendo la columna de exclusión de tamaño (SEC), cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) y dispersión de luz para identificar monómeros, dímeros, trímeros o multímeros.

Métodos de ingeniería genética de anticuerpos Como se señaló anteriormente, los anticuerpos anti-CDH17 que tienen secuencias de VH y VK descritas aquí se pueden usar para crear nuevos anticuerpos anti-CDH17 modificando las secuencias de VH y VK, o las regiones constantes unidas a las mismas. Por lo tanto, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-CDH17 de la invención, por ejemplo CDH17_A4, CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R, se usan para crear anticuerpos anti-CDH17 estructu raímente relacionados que retienen por lo menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como unión a CDH17 humana. Por ejemplo, una o más regiones de CDR de CDH17_A4, CDH17_A4_4K y CDH17A4_4R o mutaciones de las mismas, pueden combinarse en forma recombinante con regiones de marco de trabajo conocidas y/o otras CDRs para crear anticuerpos anti-CDH17 recombinantemente diseñados por ingeniería genética adicionales, de la invención, como se describió anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección anterior. El material de partida para el método de ingeniería genética es una o más de las secuencias de VH y/o VK provistas aquí, o una o más regiones de CDR de las mismas. Para crear el anticuerpo diseñado por ingeniería genética, no es necesario preparar realmente (es decir, expresar como una proteína), un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias de VH y/o VK provistas aquí, o una o más regiones de CDR de las mismas. Más bien, la información contenida en las secuencias se usa como material de partida para crear secuencias de "segunda generación" derivadas de las secuencias originales y luego las secuencias de "segunda generación" se preparan y se expresan como una proteína.

Por consiguiente, en otra modalidad, la invención provee un método para preparar un compuesto de anticuerpo anti-CDH17 que comprende: proveer: (i) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 1 , 29, 36 ó 46, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 2, 30, 42 y 47, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3, 39 y 48; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera que comprende una secuencia de CDR1 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 4, 33, 43 y 49, una secuencia de CDR2 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 5, 40 y 50, y/o una secuencia de CDR3 seleccionada del grupo que consiste de SEQ ID NO: 6, 41 y 51 ; alterar por lo menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena pesada y/o la secuencia de anticuerpo de región variable de cadena ligera para crear por lo menos una secuencia de anticuerpo alterada; y expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína.

Técnicas estándares de biología molecular pueden usarse para preparar y expresar la secuencia de anticuerpo alterada.

Preferiblemente, el anticuerpo codificado por las secuencias de anticuerpo alteradas es uno que retiene una, algunas o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos anti-CDH17 descritos, las propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a: se une a la CDH17 humana con una KD de 1 x 10"7 M o menos; se une a las células humanas de CHO transfectadas con CDH17.

Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden ser evaluadas usando pruebas estándares disponibles en la técnica y/o descritas aquí, como los expuestos en los ejemplos (v.gr., citometría de flujo, pruebas de unión).

En ciertas modalidades de los métodos de ingeniería genética de anticuerpos de la invención, las mutaciones pueden introducirse al azar o selectivamente a lo largo de todo o parte de una secuencia codificante de anticuerpo anti-CDH17 y los anticuerpos anti-CDH 7 modificados resultantes pueden ser determinados selectivamente para la actividad de unión y/u otras propiedades funcionales como se describe aquí. Se han descrito métodos mutacionales en la técnica. Por ejemplo, la publicación de PCT WO 02/092780 por short describe métodos para crear y determinar selectivamente mutaciones de anticuerpos usando mutagénesis de saturación, ensamble de ligación sintético o una combinación de los mismos. Alternativamente, la publicación del PCT WO 03/074679 por Lazar et al., describe métodos de uso de investigación computacional para optimizar las propiedades fisicoquímicas de los anticuerpos.

Moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos de la invención Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en las células enteras, en un lisado de células o en una forma parcialmente purificada o substancialmente pura. Un ácido nucleico es "aislado" o "hecho substancialmente puro" cuando es purificado de otros componentes celulares u otros contaminantes, v.gr., otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante técnicas estándares, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, bandas de CsCI, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa y otros bien conocidos en la técnica. Véase, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede o no contener secuencias intrónicas. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse usando técnicas estándares de biología molecular. Para anticuerpos expresados por hibridomas, ADNc que codifican las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo hecho por el hibridoma pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar o técnicas de clonación de ADNc. Para anticuerpos obtenidos de una genoteca de genes de inmunoglobulina (v.gr., usando técnicas de despliegue de fagos), los ácidos nucleicos que codifican el anticuerpo pueden ser recuperados de la genoteca.

Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquellas que codifican las secuencias de VH y VK de los anticuerpos de la invención, v.gr., el anticuerpo monoclonal CDH17_A4. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VH de CDH17_A4 se muestran en SEQ ID NOs: 9. Las secuencias de ADN que codifican las secuencias de VK de CDH17_A4 se muestran en SEQ ID NOs: 10.

Otros ácidos nucleicos preferidos de la invención son ácidos nucleicos que tienen por lo menos 80% de identidad de secuencia, tales como por lo menos el 85%, por lo menos el 90%, por lo menos 95%, por lo menos el 98% o por lo menos el 99% de identidad de secuencia, con una de las secuencias mostradas en SEQ ID NOs: 1 1-16, dichos ácidos nucleicos codifican un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígeno de los mismos.

El por ciento de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico es el número de posiciones en la secuencia en la que la secuencia en la cual el nucleótido es idéntico, teniendo en cuenta el número de espacios y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y determinación del por ciento de identidad entre dos secuencias se pueden lograr usando un algoritmo matemático, tal como el algoritmo de Meyers y Miller o el programa XBLAST de Altschul descritos anteriormente.

Más aún, los ácidos nucleicos preferidos de la invención comprenden una o más porciones codificantes de CDR de las secuencias de ácido nucleico mostradas en SEQ ID NOs: 11-16. En esta modalidad, el ácido nucleico puede codificar la secuencia de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada de CDH17_A4 o la secuencia de CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena ligera de CDH17_A4.

Los ácidos nucleicos que tienen por lo menos un 80%, tal como por lo menos 85%, por lo menos 90%, por lo menos 95%, por lo menos 98% o por lo menos 99% de identidad de secuencia con una porción codificante de CDR de los nucleótidos de la invención, v.gr., SEQ ID NOs: 11-16 (secuencias de VH y V«) son también preferidos: los ácidos nucleicos de la invención. Dichos ácidos nucleicos pueden diferir de la porción correspondiente de SEQ ID NO: 16 en una región de no codificante de CDR y/o en una región codificante de CDR. En donde la diferencia está en una región codificante de CDR, la región de CDR del ácido nucleico codificada por el ácido nucleico normalmente comprenderá una o más modificaciones de secuencia conservativa, tal como se define aquí comparado con la secuencia de CDR correspondiente de CDH17_A4.

Una vez que se obtienen los fragmentos de ADN que codifican segmentos de VH y V«, estos fragmentos de ADN pueden ser manipulados además por técnicas de ADN recombinante estándares, por ejemplo, para convertir los genes de región variable a genes de cadena de anticuerpo de longitud completa, a genes del fragmento Fab o a un gen de scFv. En estas manipulaciones, el fragmento de ADN que codifica V« o VH está operativamente enlazado a otro fragmento de ADN que codifica otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o un enlazador flexible. El término "operativamente enlazado", como se usa en este contexto, significa que los dos fragmentos de ADN se unen de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en el marco de trabajo.

El ADN aislado que codifica de la región VH se puede convertir en un gen de cadena pesada de longitud completa al enlazar operativamente el ADN que codifica VH a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada (CH1 , CH2 y CH3). Las secuencias de genes de la región constante de cadena pesada de murino son conocidas en la técnica (véase, v.gr., Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH No. 91-3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante de lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero muy preferiblemente es una región constante de lgG1 o lgG4. Para un gen de cadena pesada del fragmento Fab, el ADN que codifica VH puede ser operativamente enlazado a otra molécula de ADN que codifica sólo la región constante CH 1 de cadena pesada.

El ADN aislado que codifica de la región VL/VK se puede convertir en un gen de la cadena ligera de longitud completa (así como un gen de la cadena ligera de Fab) por enlazar operativamente el ADN que codifica V|_ a otra molécula de ADN que codifica la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes de la región constante de cadena ligera de murino son conocidas en la técnica (véase, v.gr., Kabat, E. A., et al. (1991 ) Sequences of Proteins of Immunological Interest, quinta edición, U.S. Department of Health and Human Services, Publicación de NIH No. 91 -3242) y fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse por amplificación por PCR estándar. En modalidades preferidas, la región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Para crear un gen scFv, los fragmento de ADN que codifican VH y VLA/K son operativamente enlazados a otro fragmento que codifica un enlazador flexible, v.gr., que codifica la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de tal manera que las secuencias de VH y VL/Vk pueden expresarse como una proteína de cadena sencilla contigua, con la regiones VL/VK y VH unidas por el el enlazador flexible (véase, v.gr., Bird et al (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., ( 990) Nature 348:552-554).

Producción de anticuerpos monoclonales De conformidad con la invención, CDH17 o un fragmento o derivado de la misma puede usarse como un inmunogeno para generar anticuerpos que inmunoespecíficamente unen dicho inmunogeno. Esos inmunógenos pueden aislarse por cualquier medio conveniente. Un experto en la técnica reconocerá que muchos procedimientos están disponibles para la producción de anticuerpos, por ejemplo, como se describe en Antibodies, A Laboratory Manual, Ed Harlow y David Lañe, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), Cold Spring Harbor, N.Y. Un experto en la técnica también apreciará que fragmentos de unión o fragmentos Fab que simulan los anticuerpos también pueden prepararse a partir de información genética por diversos procedimientos (Antibody Engineering: A Practical Approach (Borrebaeck, C, ed.), 1995, Oxford University Press, Oxford; J. Immunol. 149, 3914-3920 (1992)).

En una modalidad de la invención, se producen anticuerpos a un dominio específico de CDH17. En una modalidad específica, los fragmentos hidrofílicos de CDH17 se usan como inmunógenos para la producción de anticuerpos.

En la producción de anticuerpos, la terminación selectiva para el anticuerpo deseado puede lograrse mediante técnicas conocidas en la técnica, v.gr., ELISA (prueba inmunoabsorbente ligada a enzima). Por ejemplo, para seleccionar anticuerpos que reconocen un dominio específico de CDH 7, uno puede probar hibridomas generados para un producto que se une a un fragmento de CDH17 que contiene dicho dominio. Para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a un primer homólogo de CDH17 pero que no se une a (o se une con menos avidez a) un segundo homólogo de CDH17, uno puede seleccionar sobre la base de unión positiva al primer homólogo de CDH17 y la falta de unión a (o unión reducida a) el segundo homólogo de CDH17. De manera similar, para la selección de un anticuerpo que se une específicamente a CDH17 pero que no se une a (o se une con menos avidez a) una isoforma diferente de la misma proteína (tal como una glicoforma diferente que tiene el mismo péptido de base como la CDH17), uno puede seleccionar sobre la base de unión positiva a CDH17 y una falta de unión a (o unión reducida a) la isoforma diferente (v.gr., una glicoforma diferente). Por lo tanto, la presente invención provee un anticuerpo (tal como un anticuerpo monoclonal) que se une con mayor afinidad (por ejemplo por lo menos 2 veces, tal como por lo menos cinco veces, particularmente por lo menos 10 veces mayor afinidad) a CD17H que a una isoforma o isoformas diferentes (v.gr., glicoformas) de CDH17.

Los anticuerpos policlonales que pueden usarse en los métodos de la invención son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpos derivadas de los sueros de animales inmunizados. También puede usarse suero inmune no fraccionado. Varios procedimientos conocidos en la técnica pueden usarse para la producción de anticuerpos policlonales de CDH17, un fragmento de CDH17, un polipéptido relacionado con CDH17 o un fragmento de un polipéptido relacionado con CDH17. Por ejemplo, una forma es purificar polipéptidos de interés o sintetizar los polipéptidos de interés usando, v.gr., métodos de síntesis de péptidos de fase sólida bien conocidos en la técnica. Véase, v.gr., Guide to Protein Purification, Murray P. Deutcher, ed., Meth. Enzymol. Vol 182 (1990); Solid Phase Peptide Synthesis, Greg B. Fields ed.; Meth. Enzymol. Vol 289 (1997); Kiso et al., Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 38: 1 192-99, 1990; Mostafavi et al., Biomed. Pept. Proteins Nucleic Acids 1 : 255-60, 1995; Fujiwara et al, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) 44: 1326-31 , 1996. Los polipéptidos seleccionados pueden usarse luego para inmunizar por inyección varios animales hospederos, incluyendo pero sin limitarse a conejos, ratones, ratas, etc., para generar anticuerpos policlonales o monoclonales. Diversos adyuvantes (es decir, inmunoestimulantes) pueden usarse para incrementar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie hospedera, incluyendo, sin limitarse a, adyuvante de Freund completo o incompleto, un gel de mineral tal como hidróxido de aluminio, sustancia activa de superficie tal como lisolecitina, poliol pluronic, un polianión, un péptido, una emulsión de aceite, hemocianina de lapa, dinitrofenol y un adyuvante tal como BCG (bacilo de Calmette-Guerin) o Corynebacterium parvum. Adyuvantes adicionales también son bien conocidos en la técnica.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales (mAbs) dirigidos hacia la CDH17, puede usarse cualquier técnica que provee para la producción de moléculas de anticuerpos por las líneas de la célula continuas en cultivo. Por ejemplo, la técnica del hibridoma originalmente desarrollado por Kohier y Milstein (1975, Nature 256:495-497), así como la técnica de trioma, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor et al., 1983, Immunology Today 4:72), y la técnica de EBV-hibridoma para producir anticuerpos monoclonales humanos (Colé et al., 1985, in Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96). Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD y cualquier subclase de los mismos. El hibridoma produce los anticuerpos monoclonales puede cultivarse in vitro o in vivo. En una modalidad adicional de la invención, se pueden producir anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando tecnología conocida (PCT/US90/02545, incorporada aquí por referencia).

El sistema de animal preferido para la preparación de hibridomas es el sistema de murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy bien establecido. Los protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para la fusión son conocidos en la técnica. Las parejas de de fusión (por ejemplo, las células de mieloma de murino) y procedimientos de fusión también son conocidos.

Los anticuerpos monoclonales incluyen pero no se limitan a anticuerpos monoclonales humanos y los anticuerpos monoclonales quiméricos (v.gr., quimeras de humano-ratón).

Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención se pueden preparar con base en la secuencia de anticuerpos monoclonales no humanos preparados como se describió anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de la cadena pesada y ligera puede ser obtenido del hibridoma no humano de interés y diseñado genéticamente para contener secuencias de inmunoglobulina no de murino (v.gr., humana) usando técnicas estándares de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables de murino pueden enlazarse con regiones constantes humanas usando métodos conocidos en la técnica (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 4,816,567 de Cabilly et al.). Para crear un anticuerpo humanizado, regiones de CDR de murino pueden insertarse en un marco de trabajo humano usando métodos conocidos en la técnica (véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 5,225,539 de Winter y patentes de E.U.A. Nos. 5,530,101 ; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 de Queen et al).

Anticuerpos completamente humanos pueden producirse usando ratones transgénicos o o transcromosómicos que son incapaces de expresar genes de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina endógena, pero que puede expresar genes de cadena pesada y ligera humanos. Los ratones transgénicos son inmunizados de manera normal con un antígeno seleccionado, v.gr., toda o una porción de CDH17. Los anticuerpos monoclonales dirigidos contra el antígeno se pueden obtener usando tecnología del hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana portados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de células B y posteriormente sufren un cambio de clase y mutación somática. Por lo tanto, usando esta técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones de las cepas HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) y KM Mouse®. El ratón de la cepa HuMAb® (Medarex®, Inc.) se describe en Lonberg and Huszar (1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93). Para una discusión detallada de esta tecnología para la producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y protocolos para la producción de estos anticuerpos, véase, por ejemplo patente de E.U.A. 5,625,126; patente de E.U.A. 5,633,425; patente de E.U.A. 5,569,825; patente de E.U.A. 5,661,016; y patente de E.U.A. 5,545,806. La cepa KM Mouse® se refiere a un ratón que porta un transgén humano de cadena pesada y un transcromosoma de cadena ligera humano y se describe detalladamente en la publicación del PCT WO 02/43478 de Ishida et al.

Además, sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y se pueden utilizar para crear anticuerpos anti-CDH17 de la invención. Por ejemplo, puede usarse un sistema transgénico alternativo referido como el Xenomouse (Amgen, Inc.); estos ratones se describen en, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,939,598; 6,075,181 ; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 de Kucherlapati et al.

Los anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítope seleccionado pueden generarse mediante una técnica referida como "selección guiada". En este enfoque, un anticuerpo monoclonal no humanos seleccionado, v.gr., un anticuerpo de ratón, se usa para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano, que reconoce el mismo epítope (Jespers et al. (1994) Bio/technology 12:899-903).

Más aún, los sistemas de animales transcromosómicos alternativos que expresan los genes de inmunoglobulina humana están disponibles en la técnica y pueden usarse para producir anticuerpos anti-CDH17. Por ejemplo, los ratones que portan un transcromosoma humano de cadena pesada y un transcromosoma humano de cadena ligera, referidos como "ratones de TC" pueden usarse; estos ratones se describen en Tomizuka et al., (2000) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 97:722-727. Además, en la técnica se han descrito vacas que portan transcromosomas de cadena pesada y ligera humanos (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) y solicitud del PCT No. WO2002/092812 y pueden usarse para aumentar los anticuerpos anti-CDH17.

Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también se pueden preparar usando ratones SCID en los que las células inmunitarias humanas han sido reconstituidas de tal manera que se puede generar una respuesta de anticuerpos humanos bajo inmunización. Estos ratones se describen en, por ejemplo, la patentes de E.U.A. Nos. 5,476,996 y 5,698,767 de Wilson et al.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser generados por el uso de tecnología de despliegue de fagos para producir genotecas de productos viables y de determinación selectiva de polipéptidos para unión a un objetivo seleccionado. Véase, v.gr. Cwirla et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 6378-82, 1990; Devlin et al., Science 249, 404-6, 1990, Scott and Smith, Science 249, 386-88, 1990; y Ladner et al., patente de E.U.A. No. 5.571.698.

Un concepto básico de los métodos de despliegue de fagos es el establecimiento de una asociación física entre ADN que codifica un polipéptido que ha de ser determinado selectivamente y el polipéptido. Esta asociación física es provista la partícula del fago, que despliega un polipéptido como parte de una cápside que encierra el genoma del fago que codifica el polipéptido. El establecimiento de una asociación física entre polipéptidos y su material genético permite la determinación selectiva masiva simultánea de una gran cantidad de fagos que portan diferentes polipéptidos. El fago que despliega un polipéptido con afinidad a un objetivo se une al objetivo y estos fagos son enriquecidos con determinación selectiva de afinidad al objetivo. La identidad de los polipéptidos desplegados a partir de estos fagos se puede determinar a partir de sus genomas respectivos. Usando estos métodos, un polipéptido identificado como que tiene una afinidad de unión para un objetivo deseado puede entonces ser sintetizado a granel por medios convencionales. Véase, v.gr., patente de E.U.A. No. 6,057,098, que es incorporada por la presente en su totalidad, incluyendo todos los cuadros, figuras y reivindicaciones. En particular, estos fagos pueden ser utilizados para mostrar dominios de unión a antígeno expresados de un repertorio o genoteca de anticuerpos combinatoria (humana o murina). El fago que expresa un dominio de unión a antígeno que se une al antígeno de interés puede ser seleccionado o identificado con el antígeno, v.gr., con antígeno marcado o antígeno unido o capturado a una superficie sólida o esfera. El fago usado en estos métodos son típicamente fagos filamentosos incluyendo dominios de unión a fd y M13 expresados del fago con Fab, Fv o dominios de anticuerpo de Fv estabilizados por disulfuro por vía recombinante fusionados a gen III de fago o proteína de gen. Los métodos de despliegue de fago que pueden ser usados para hacer los anticuerpos de la presente invención incluyen los descritos en Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995); Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994); Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280 (1994); solicitud del PCT No. PCT/GB91/01134; publicaciones del PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/1 1236; WO 95/15982; WO 95/20401 ; y patentes de E.U.A. No. 5,698,426; 5,223,409; 5,403,484; 5,580,717; 5,427,908; 5,750,753; 5,821 ,047; 5,571 ,698; 5,427,908; 5,516,637; 5,780,225; 5,658,727; 5,733,743 y 5,969,108; cada uno de los cuales es incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Como se describe en las referencias anteriores, después de la selección de fagos, el anticuerpo que codifica las regiones del fago puede ser aislado y usado para generar anticuerpos enteros, incluyendo anticuerpos humanos o cualquier otro fragmento de unión a antígeno deseado y expresado en cualquier hospedero deseado, incluyendo células de mamíferos, células de insectos, células vegetales, levaduras y bacterias, v.gr., como se describe en detalle más adelante. Por ejemplo, las técnicas para producir en forma recombinante los fragmentos Fab, Fab' y F(ab')2 también pueden utilizarse usando métodos conocidos en la técnica como aquellos descritos en la publicación del PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); y Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); y Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) (dichas referencias incorporadas por referencia en su totalidad).

Ejemplos de técnicas que se pueden usar para producir anticuerpos y Fvs de cadena sencilla incluyen aquellos descritos en patentes de E.U.A. 4,946,778 y 5,258,498; Huston et al, Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al, PNAS 90:7995-7999 (1993); y Skerra et al, Science 240: 1038-1040 (1988).

La invención provee fragmentos funcionalmente activos, derivados o análogos de las moléculas de ¡nmunoglobulina anti-CDH17. Funcionalmente activo significa que el fragmento, derivado o análogo es capaz de producir anticuerpos anti-anti-idiotipo (es decir, anticuerpos terciarios) que reconocen el mismo antígeno que es reconocido por el anticuerpo de la cual se deriva el fragmento, derivado o análogo. De manera específica, en una modalidad particular que la antigenicidad de idiotipo de la molécula de ¡nmunoglobulina puede mejorarse por la eliminación de marco de trabajo y secuencias de CDR que son C-terminal a la secuencia de CDR específicamente reconoce el antígeno. Para determinar qué secuencias de CDR se unen al antígeno, los péptidos sintéticos que contienen las secuencias de la CDR pueden usarse en pruebas de unión con el antígeno por cualquier método de prueba de unión conocido en la técnica.

La presente invención provee fragmentos de anticuerpo tales como, pero sin limitarse a, fragmentos F(ab')2 y fragmentos Fab. Los fragmentos de anticuerpo que reconocen epítopes específicos pueden generarse mediante técnicas conocidas. Los fragmentos F(ab')2 consisten de la región variable, la región constante de cadena ligera y el dominio de CH1 de la cadena pesada y son generados por digestión por pepsina de la molécula de anticuerpo. Los fragmentos Fab se generan mediante la reducción de los puentes disulfuro de los fragmentos F(ab') 2. La invención también provee los dímeros de cadena pesada y cadena ligera de los anticuerpos de la invención, o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como Fvs o anticuerpos de cadena sencilla (SCAs) (v.gr., como se describe en la patente de E.U.A. 4,946,778; Bird, 1988, Science 242:423-42; Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; y Ward et al., 1989, Nature 334:544-54), o cualquier otra molécula con la misma especificidad que el anticuerpo de la invención. Los anticuerpos de cadena sencilla se forman uniendo los fragmentos de la cadena pesada y ligera de la región de Fv mediante un puente de aminoácido, dando por resultado un polipéptido de cadena sencilla. Pueden usarse técnicas para el ensamble de fragmentos Fv funcionales en E. coli (Skerra et al., 1988, Science 242: 1038-1041 ).

En otras modalidades, la invención provee proteínas de fusión de las inmunoglobulinas de la invención (o fragmenos funcionalmente activos de las mismas), por ejemplo en las que se fusiona la inmunoglobulina mediante un enlace covalente (v.gr., un enlace peptídico), en el extremo N-terminal o C-terminal a una secuencia de aminoácidos de otra proteína (o parte de la misma, preferiblemente una porción de la proteína de por lo menos 10, 20 o 50 aminoácidos) que no es la inmunoglobulina. Preferiblemente la inmunoglobulina o fragmento de la misma, es covalente enlazada a la otra proteína en el extremo N-terminal del dominio constante. Como se mencionó anteriormente, dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación, incrementar la vida media in vivo y mejorar el suministro de un antígeno a través de una barrera epitelial al sistema inmunológico.

Las inmunoglobulinas de la invención son análogos y derivados que son modificados, es decir, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula siempre que dicha unión covalente no altere la unión inmunoespecífica. Por ejemplo, pero no a manera de limitación, los derivados y análogos de las inmunoglobulinas incluyen aquellos que han sido modificadas aún más, v.gr., por glicosilación, acetilación, pegilación, fosfilación, amidación, derivación por grupo de protección/bloqueo s conocidos, digestión proteolítica, enlace a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas pueden llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluyendo pero sin limitarse a digestión química específica, acetilación, formilación, etc. Además, el análogo o derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Inmunización de ratones Los ratones pueden ser inmunizados con una preparación purificada o enriquecida de antígeno CDH17 y/o CDH17 recombinante o células que expresan CDH17. Preferiblemente, los ratones serán de 6-16 semanas de edad a la primera infusión. Por ejemplo, una preparación purificada o recombinante (100 g) de antígeno CDH17 puede usarse para inmunizar a los ratones por vía intraperitoneal.

La experiencia acumulada con varios antígenos ha demostrado que los ratones responden cuando son inmunizados por vía intraperitoneal (IP) con antígeno en adyuvante de Freund completo. Sin embargo, adyuvantes que no son de Freund también se encuentra que son eficaces. Además, se encuentra que las células enteras en ausencia de adyuvante son altamente inmunogénicas. La respuesta inmunológica puede ser monitoreada en el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma siendo obtenidas por sangrados retroorbitales. El plasma puede determinado selectivamente por ELISA (como se describe más adelante) para probar títulos satisfactorios. Los ratones pueden ser reforzados por vía intravenosa con antígeno en 3 días consecutivos con sacrificio y extirpación del bazo 5 días más tarde. En una modalidad, se pueden usar cepas de ratón A J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) Generación de transfectomas que producen anticuerpos monoclonales Los anticuerpos de la invención pueden ser producidos en un transfectoma de célula hospedera usando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de gen como es bien sabido en la técnica (por ejemplo, Morrison, S. (1985) Science 229: 1202).

Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o fragmentos de anticuerpo de los mismos, el ADN que codifica y cadenas ligera y pesada de longitud completa, pueden obtenerse mediante técnicas de biología molecular estándares (por ejemplo, amplificación por PCR o clonación de ADNc usando un hibridoma que expresa el anticuerpo de interés) y los ADN pueden insertarse en vectores de expresión de tal manera que los genes están operativamente unidos a secuencias de control transcripcional y traduccional. En este contexto, por término "operativamente unido" se entiende que un gen del anticuerpo está ligado en un vector de tal manera que las secuencias de control transcripcional y traduccional dentro del vector sirvan su función de regulación de la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de expresión son elegidas para ser compatibles con la célula hospedera de expresión usada.

La célula hospedera puede ser co-transfectada con dos vectores de expresión de la invención, el primer vector codificacando un polipéptido derivado de cadena pesada y el segundo vector codificacando un polipéptido derivado de cadena ligera. Los dos vectores pueden contener idénticos marcadores seleccionares que permiten la expresión igual de polipéptidos de cadena pesada y ligera. Como alternativa, puede usarse un solo vector que codifique dos polipéptidos de cadena pesada y ligera. En estos casos, la cadena ligera debe colocarse antes de la cadena pesada para evitar un exceso de la cadena pesada libre tóxica (Proudfoot, 1986, Nature 322:52; Kohler, 1980, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:2197). Las secuencias que codifican para las cadenas pesadas y ligeras pueden componerse de ADNc o ADN genómico.

Los genes del anticuerpo se insertan en el vector de expresión por métodos estándares (v.gr., ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento de gen de anticuerpo y vector o ligación de extremo romo si no están presentes sitios de restricción). Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos que se describen aquí se pueden usar para crear genes de anticuerpo de longitud completa de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolas en vectores de expresión que ya codifican regiones constantes de cadena pesada y regiones constantes de cadena ligera del isotipo deseado de tal manera que el segmento VH es operativamente enlazado a los segmentos CH dentro del vector y el segmento VK es operativamente enlazado con el segmento CL en el vector. Además o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedera. El gen de la cadena de anticuerpo se puede clonar en el vector de tal manera que el péptido de señal es enlazado en marco de trabajo a amino terminal del gene de la cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptido de señal de una proteína no inmunoglobulina).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena de anticuerpo en una célula hospedera. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (v.gr., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o traducción de los genes de cadena de anticuerpo. Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel [Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)]. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que ha de ser transformada, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión de la célula hospedera de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o potenciadores derivados de citomegalovirus (CMV), virus simiano 40 (SV40), adenovirus, (v.gr., el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP) y polioma. Como alternativa, pueden usarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor de ubiquitina o el promotora de ß-globina. Además elementos regulatorios compuesto de secuencias de diversas fuentes, tales como el sistema promotor SRoc, que contiene secuencias del promotor temprano de SV40 y la repetición de terminal larga de virus de la leucemia de células T humanas tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

Además de los genes de la cadena de anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinante de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replicación del vector en las células hospederas (v.gr., orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionares. El gen marcador seleccionare facilita la selección de las células hospederas en las cuales el vector ha sido introducido (véase, v.gr., patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017, todas de Axel et al.). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionabas incluyen el gen de la dihidrofolato reductasa (DHFR) (para el uso en las células hospederas de dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para la selección de G418).

Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, los vectores de expresión que codifican las cadenas pesada y ligera son transfectados en una célula hospedera por técnicas estándares. Las diversas formas del término "transfeccion" abarcan una amplia variedad de técnicas usadas para la introducción de ADN exógeno en una célula hospedera procariótica o eucariótica, v.gr., electroporación, precipitación de fosfato de calcio, transfeccion DEAE-dextrano y similares. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención ya sea en células hospederas procarióticas o eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas y muy preferiblemente células hospederas de mamífero, es la más preferida porque las células eucarióticas y en particular las células de mamífero, son más propensas que las células procarióticas a ensamblar y secretar un anticuerpo correctamente doblado e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de genes de anticuerpo se ha reportado que son ineficaces para la producción de altos rendimientos de anticuerpos activos (Boss, M. A. y Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6: 12- 13).

Las células hospederas de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), junto con un vector como el principal elemento promotor de gen temprano intermediario de citomegalovirus humano (Foecking et al., 1986, Gene 45:101 ; Cockett et al., 1990, Biofl echnology 8:2), células dhfr-CHO, descritas en Urlaub y Chasin, (1980) Proc. Nati. Acad. Sc¡. USA 77:4216-4220, usado con un marcador seleccionare de DHFR, v.gr., como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp ( 1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS y células de SP2. En particular, para su uso con células de mieloma NSO, otro sistema de expresión preferido es el sistema de expresión del gen GS descrito en WO 87/04462 (de Wilson), WO 89/01036 (de Bebbington) y EP 338,841 (de Bebbington).

Una variedad de sistemas de vectores de expresión del hospedero pueden utilizarse para expresar una molécula de anticuerpo de la invención. Dichos sistemas de expresión del hospedero representan vehículos por los cuales las secuencias codificantes de interés pueden ser producidas y purificadas posteriormente, pero también representan las células que pueden, cuando son transformadas o transfectadas con las secuencias codificantes de nucleótido correspondientes, expresan la molécula del anticuerpo de la invención in situ. Éstos incluyen pero no se limitan a microorganismos tales como bacterias (£. coli, B. subtilis) transformadas con vectores de expresión de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plásmido o ADN de cósmido que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; levaduras (v.gr., Saccharomyces, Pichia) transformadas con vectores de expresión de la levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de insectos infectados con vectores de la expresión del virus recombinante (v.gr., baculovirus) que contienen las secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de plantas infectadas con vectores de expresión de virus recombinantes (v.gr., virus del mosaico de la coliflor, CaMV, virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de la expresión de plásmido recombinante (v.gr., plásmido de Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpos; o sistemas de células de mamífero (v.gr., COS, CHO, BHK, 293, células 3T3) que portan constructos de expresión recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de células de mamíferos (v.gr., promotor de metalotioneína) o de virus de mamíferos (v.gr., el promotor tardío de adenovirus, el promotor de virus de vaccinia 7.5 K).

En sistemas bacterianos, un número de vectores de expresión puede seleccionarse ventajosamente dependiendo del uso destinado para la molécula de anticuerpo es expresada. Por ejemplo, cuando una gran cantidad de estas proteínas es producida, para la generación de composiciones farmacéuticas que comprenden una molécula de anticuerpo, los vectores que dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteína de fusión que son purificados fácilmente pueden ser deseables. Estos vectores incluyen, pero no se limitan, al vector de expresión pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el cual la secuencia codificante de anticuerpo puede ser ligada individualmente en el vector en marco con la región codificante de lac Z de tal manera que se produce proteína de fusión; vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24:5503-5509); y similares. Los vectores pGEX pueden usarse también para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con el glutatión S-transferasa (GST). En general, estas proteínas de fusión son solubles y fácilmente pueden ser purificadas a partir de células lisadas por adsorción y unión a una matriz de agarosa de glutatión-esferas de agarosa seguido por elución en presencia de glutatión libre. Los vectores pGEX están diseñados para incluir los sitios de digestión de trombina o factor de proteasa Xa para que el producto del gen objetivo clonado pueda ser liberado de la molécula de GST.

En un sistema de insecto, el virus de la poliedrosis nuclear de Autographa califomica (AcNPV) se usa como un vector para expresar genes foráneos. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia que codifica anticuerpos puede clonada individualmente en regiones no esenciales (v.gr., el gen de la polihedrina) del virus y puestos bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina). En las células hospederas de mamífero, puede utilizarse un número de sistemas de expresión basados en virus (v.gr., un sistema de expresión de adenovirus).

Como se describió anteriormente, se puede escoger una cepa de la célula hospedera que module la expresión de las secuencias insertadas o que modifique y procese el producto del gene de la manera específica deseada. Tales modificaciones (v.gr., glicosilación) y procesamiento (v.gr., digestión) de productos proteicos pueden ser importantes para la función de la proteína.

Para la producción de anticuerpos recombinantes de alto rendimiento, a largo plazo, se prefiere la expresión estable. Por ejemplo, se pueden producir líneas de células que expresen establemente un anticuerpo de interés transfectando células con un vector de expresión que comprende la secuencia de nucleótidos del anticuerpo y la secuencia de nucleótidos de un seleccionable (v.gr., neomicina o higromicina) y seleccionando para la expresión del marcador seleccionable. Dichas líneas de ingeniería celular pueden ser particularmente útiles en la determinación selectiva y evaluación de compuestos que interactúen directamente o indirectamente con la molécula de anticuerpo.

Los niveles de expresión de la molécula de anticuerpo pueden ser incrementados por amplificación del vector (para una revisión, véase Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells ¡n DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, New York, 1987)). Cuando un marcador en el sistema de vector que expresa anticuerpo es amplificable, el aumento en el nivel del inhibidor presente en el cultivo de células hospederas incrementará el número de copias del gen marcador. Puesto que la región amplificada se asocia con el gen del anticuerpo, la producción de anticuerpo también aumentará (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3:257).

Cuando los vectores de expresión recombinantes que codifican genes de anticuerpos se introducen en las células hospederas de mamífero, los anticuerpos son producidos por el cultivo de las células hospederas durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células hospederas o, muy preferiblemente, secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el que se cultivan las células hospederas. Una vez que la molécula de anticuerpo de la invención ha sido expresada de manera recombinante, puede ser purificada por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de anticuerpo, por ejemplo, por cromatografía (cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad tal como con proteína A o antígeno específico y cromatografía de columna de dimensionamiento), centrifugación, solubilidad diferencial, o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas.

Alternativamente, cualquier proteína de fusión se puede purificar fácilmente utilizando un anticuerpo específico para la proteína de fusión que es expresada. Por ejemplo, un sistema descrito por Janknecht et al., permite la fácil purificación de proteínas de fusión no desnaturalizadas expresadas en líneas de células humanas (Janknecht et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:8972-897). En este sistema, el gen de interés es subclonado en un plásmido de recombinación de vaccinia de tal manera que el marco de trabajo de lectura abierta del gen es traduccionalmente fusionado a una etiqueta amino-terminal que consiste de seis residuos de histidina. La etiqueta sirve como un dominio de unión de matriz para la proteína de fusión. Extractos de células infectadas con virus de vaccinia recombinantes se cargan en columnas de agarosa-ácido de nitriloacético Ni2+ y proteínas etiquetadas con histidina son selectivamente eluidas con reguladores de pH que contienen imidazol.

Caracterización de unión de anticuerpo a antíqeno Los anticuerpos generados por estos métodos pueden seleccionarse entonces cribado primero de afinidad y especificidad con el polipéptido purificado de interés y, si es necesario, comparando los resultados a la afinidad y especificidad de los anticuerpos con polipéptidos que deseaban ser excluido de la unión. Los anticuerpos se pueden probar por la unión a la CDH17 mediante, por ejemplo, por ELISA estándar. El procedimiento de determinación selectiva puede involucrar la inmovilización de los polipéptidos purificados en pozos separados de placas de microtitulación. La solución que contiene un anticuerpo potencial o grupos de anticuerpos entonces se coloca en los pozos de microtitulación respectivos y se incuba durante aproximadamente 30 min a 2 hr. Después se lavan los pozos y un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, un anticuerpo anti-ratón conjugado con fosfatasa alcalina si los anticuerpos producidos son anticuerpos de ratón) se añade a los pozos y se incuba durante aproximadamente 30 minutos y después se lavan. El sustrato se añade a los pozos y una reacción de color aparecerá donde está presente el anticuerpo para la polipéptido(s) inmovilizado.

Los anticuerpos así identificados después se pueden analizar para afinidad y especificidad en el diseño de prueba seleccionado. En el desarrollo de inmunoensayos para una proteína objetivo, la proteína objetivo purificada actúa como un estándar con el cual juzgar la sensibilidad y especificidad del ¡nmunoensayo usando los anticuerpos que han sido seleccionados. Debido a que la afinidad de unión de varios anticuerpos puede diferir; algunos pares de anticuerpos (por ejemplo, en pruebas intercaladas) pueden interferir uno con otro esféricamente, etc., el rendimiento la prueba de un anticuerpo puede ser una medida más importante que absoluta afinidad y especificidad de un anticuerpo.

Los expertos en la técnica reconocen que pueden tomarse muchos enfoques en la producción de anticuerpos o fragmentos de unión y determinación selectiva y selección de afinidad y especificidad para los varios polipéptidos, pero estos enfoques no cambian el alcance de la invención.

Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 seleccionados se unen a epítopes únicos, cada anticuerpo puede ser biotinilado usando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL). Pueden realizarse estudios de competencia usando anticuerpos no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados usando placas de ELISA revestidas con CDH17. La unión de mAb biotinilado puede detectarse con una sonda de estreptavidina-fosfatasa alcalina.

Para determinar el isotipo de anticuerpos purificados, se pueden realizar ELISAs de isotipo usando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular.

Los anticuerpos anti-CDH17 pueden probarse además para reactividad con antígeno CDH17 por Western Blot. Brevemente, CDH17 puede ser preparado y sometido a electroforesis en gel de acrilamida con dodeciisulfato sodio. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, bloqueadas con el 10% de suero de ternera fetal y son sondeados con los anticuerpos monoclonales que han de ser probados.

La especificidad de la unión de un anticuerpo de la invención también puede determinarse mediante el monitoreo de unión del anticuerpo a las células que expresan CDH17, por ejemplo mediante citometría de flujo. Por lo general, una línea de células, como una línea de células CHO, puede ser transfectada con un vector de expresión que codifica CDH17. La proteína transfectada puede comprender una etiqueta, como una etiqueta de myc, preferiblemente en el extremo N-terminal, para la detección usando un anticuerpo para la etiqueta. La unión de un anticuerpo de la invención a CDH17 puede determinarse incubando las células transfectadas con el anticuerpo y detectando el anticuerpo unido. La unión de un anticuerpo a la etiqueta de la proteína transfectada puede usarse como control positivo.

La especificidad de un anticuerpo de la invención de CDH17 puede estudiarse aún más mediante la determinación de si o no el anticuerpo se une a otras proteínas, tales como otro miembro de la familia de Cadherina usando los mismos métodos por lo cuales se determina la unión a CDH17.

Inmunoconiugados En otro aspecto, la presente invención tiene un anticuerpo anti- CDH17 o un fragmento del mismo, particularmente los anticuerpos descritos aquí, conjugados a una porción terapéutica, como una citotoxina, un fármaco (v.gr., un inmunosupresor) o una radiotoxina. Estos conjugados son contemplados aquí como "¡nmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se refieren aquí como "inmunotoxinas". Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para (v.gr., mata) células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopóside, vincristina, vinblastína, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicína, dihidroxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D,1-dihidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromícina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos también incluyen, por ejemplo, antimetabolitos (v.gr., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracilo decarbazine), agentes alquilantes (v.gr., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalán, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y diclorodiamina cis platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (v.gr., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (v.gr., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC)) y agentes anti-mitóticos (v.gr., vincristina y vinblastina).

Otros ejemplos preferidos de citotoxinas terapéuticas que pueden ser conjugadas a un anticuerpo de la invención incluyen duocarmicinas, calicheamicinas, maytansinas y auristatinas, y derivados de los mismos. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo caliqueamicina está comercialmente disponible (Mylotarg®; American Home Products).

Las citotoxinas pueden ser conjugadas a anticuerpos de la invención usando tecnología de enlazador disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de enlazador que han usado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, disulfuros y enlazadores que contienen péptidos. Se puede escoger un enlazador que es, por ejemplo, susceptible a digestión por pH bajo dentro del compartimento lisosomal o susceptible a digestión por proteasas, como proteasas preferencialmente expresadas en tejido tumoral como catepsinas (v.gr., catepsinas B, C, D).

Ejemplos de citotoxinas se describen, por ejemplo, en las patentes de E.U.A. Nos. 6,989,452, 7,087,600, y 7,129,261 , y en solicitudes del PCT Nos. PCT/US2002/17210, PCT/US2005/017804, PCT/US2006/37793, PCT/US2006/060050, PCT/US2006/060711 , WO2006/110476, y en la solicitud de patente de E.U.A. No. 60/891 ,028, todos los cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad. Para la discusión adicional de tipos de citotoxinas, enlazadores y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, véase también Saito, G. et al. (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55:199-215; Trail, P.A. et al. (2003) Cáncer Immunol. Immunother. 52:328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Alien, T.M. (2002) Nat. Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan, I. y Kreitman, R. J. (2002) Curr. Opin. Investig. Drugs 3: 1089-1091 ; Senter, P.D. y Springer, C.J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. 53:247-264.

Los anticuerpos de la presente invención también pueden ser conjugados con un isótopo radiactivo para generar radiofármacos citotóxicos, también conocidos como radioinmunoconjugados. Ejemplos de isótopos radiactivos que pueden ser conjugados a anticuerpos para uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo 131 , indio 111 , itrio 90 y lutecio 177. El método para preparar radioinmunoconjugados se establece en la técnica. Ejemplos de radioinmunoconjugados están comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), y métodos similares pueden usarse para preparar radioinmunoconjugados con los anticuerpos de la invención.

Los conjugados de anticuerpos de la invención pueden usarse para modificar una respuesta biológica dada, y la porción de fármaco no debe interpretarse como agentes terapéuticos químicos limitados a clásicos. Por ejemplo, la porción de fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichas proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o fragmento activo, como abrina, ricina A, exotoxina de Pseudomonas o toxina diftérica; una proteína como factor de necrosis tumoral o interferón-?; o modificadores de respuesta biológica como, por ejemplo, linfocinas, lnterleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 "(IL-6), factor estimulante de colonia de granulocitos macrófagos"(GM-CSF), factor estimulante de colonia de granulocitos "(G-CSF) u otros factores de crecimiento.

Las técnicas para conjugar la molécula terapéutica a los anticuerpos son bien conocidas, véase, v.gr., Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cáncer Therapy," en Monoclonal Antibodies And Cáncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery," en Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cáncer Therapy: A Review," en Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cáncer Therapy," en Monoclonal Antibodies For Cáncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al., Immunol. Rev., 62: 19-58 (1982).

Moléculas biespecíficas En otro aspecto, la presente invención incluye moléculas con un anticuerpo anti-CDH17, o un fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígeno, puede ser derivado o enlazado a otra molécula funcional, v.gr., otro péptido o proteína (v.gr., otro anticuerpo o ligando para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une por lo menos a dos sitios de unión diferentes o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención de hecho puede ser derivado o enlazado a más de otra molécula funcional para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión diferentes y/o moléculas objetivo; estas moléculas multiespecíficas también son abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se usa aquí. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede enlazarse funcionalmente (v.gr., por acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más de otras moléculas de unión, tales como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de tal manera que se obtiene una molécula biespecífica.

Por consiguiente, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden por lo menos una primera especificidad de unión CDH17 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítope de destino. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítope objetivo es un receptor de Fe, v.gr., FcyRI humano (CD64) o un receptor de Fea humano (CD89). Por lo tanto, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unirse a células efectoras que expresan FcyR o FcaR (por ejemplo, los monocitos, macrófagos o células polimorfonucleares (PMN)) y a células objetivo que expresan CDH17. Estas moléculas biespecíficas dirigen a las células que expresan CDH17 a células efectoras y desencadenan las actividades de células efectoras mediadas por receptor de Fe, tales como fagocitosis de células objetivo que expresan CDH17, citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC), liberación de citocinas o generación de anión superóxido.

En una modalidad de la invención en la cual la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula además puede incluir una tercera especificidad de unión, además de una especificidad de unión a anti-Fc y una especificidad de unión a anti-CDH17. En una modalidad, la tercera especificidad de unión es una porción del factor anti-incremento (EF), v.gr., una molécula que se une a una proteína de superficie implicada en la actividad citotóxica y aumenta así la respuesta inmunológica contra la célula objetivo. La "porción de factor anti-incremento" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional o un ligando que se une a una molécula dada, v.gr., un antígeno o un receptor y por lo tanto da lugar a una mejora del efecto de los determinantes de unión para el receptor de Fe o el antígeno de la célula objetivo. La "porción de factor de anti-incremento" puede unirse a un receptor de Fe o un antígeno de célula objetivo. Alternativamente, la porción de factor de anti-incremento puede unirse a una entidad diferente a la entidad a la que se unen la primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, la porción de factor de anti-incremento puede enlazarse a una célula T citotóxica (v.gr., a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otras células inmunitarias que producen una mayor respuesta inmunológica contra la célula objetivo).

En una modalidad, las moléculas biespecífica de la invención comprenden como una especificidad de unión por lo menos un anticuerpo, o fragmento de un anticuerpo, incluyendo, v.gr., un Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o Fv de cadena sencilla. Los anticuerpos también pueden ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada o cualquier fragmento mínimo del mismo tal como un Fv o un constructo de cadena sencilla, como se describe en la patente de E.U.A. No. 4,946,778 de Ladner et al., cuyo contenido es expresamente incorporado por referencia.

En una modalidad, la especificidad de unión de un receptor de Fcy es provista por un anticuerpo monoclonal, cuya unión no es bloqueada por inmunoglobulina G (IgG) humana. Como se usa aquí, el término "receptor de IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena ?, localizados en el cromosoma 1. Estos genes codifican un total de doce isoformas de receptor de transmembrana o soluble que se agrupan en tres clases de receptores Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32) y FcyRIII (CD16). En una modalidad preferida, el receptor de Fcy es un FcyRI de alta afinidad humano. El FcyRI humano es una molécula de 72 kDa, que muestra gran afinidad para IgG monomérica (108 -109 M-1).

La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fcy se describen en la publicación del PCT WO 88/00052 y en la patente de E.U.A. No. 4,954,617 de Fanger et al., las enseñanzas de las cuales se incorporan en su totalidad por referencia aquí. Estos anticuerpos se unen a un epítope de FcyRI, FcyRIl o FcyRIII en un sitio que es distinto del sitio de unión a Fcy unión del receptor y, por lo tanto, su unión no es bloqueada substancialmente por los niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos específicos anti-FcyRI útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. Los hibridomas que producen mAb 32 están disponibles desde el American Type Culture Collection (Depósito Norteamericano de Cultivos Tipo), No. de acceso a ATCC. HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti-F.cy es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22). La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describen en Graziano, R.F. et al (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 y publicación del PCT WO 94/10332 de Tempest et al. El anticuerpo H22 que produce la línea de células fue depositado en el American Type Culture Collection bajo la designación HA022CL1 y tiene el No. de acceso CRL 11177.

En otras modalidades preferidas, la especificidad de la unión para un receptor de Fe es siempre por un anticuerpo que se une a un receptor de IgA humano, v.gr., un receptor de Fc-alfa (FcaRI (CD89)), la unión de la cual preferiblemente no es bloqueado por inmunoglobulina A humana (IgA). El término "receptor de IgA" incluye el producto de gen de un a-gen (FcaRI) localizado en el cromosoma 19. Este gen se sabe que codifica varias isoformas de transmembrana alternativamente empalmadas de 55 a 1 10 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinófilos y neutrofílicos, pero no en las poblaciones de células no efectoras. FcaRI tiene afinidad media (« 5 x 107 M'1) lgA1 e lgA2, que se incrementa con la exposición a citocinas como G-CSF o GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critica! Reviews in Immunology 16:423-440). Cuatro anticuerpos monoclonales específicos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de unión a ligando de IgA, se han descrito (Monteiro, R.C. et al., (1992) J. Immunol. 148:1764).

FcaRI y FcyRI son receptores de desencadenamiento preferidos para usarse en las moléculas biespecíficas de la invención, porque son (1 ) expresados principalmente en las células efectoras inmunes, v.gr., monocitos, PMN, macrófagos y células dendríticas; (2) expresados a niveles altos (v.gr., 5,000-100,000 por célula); (3) mediadores de actividades citotóxicas (v.gr., ADCC, fagocitosis); y (4) presentación de antígenos mejorada por antígenos, incluyendo auto-antígenos, dirigidas a los mismos.

Los anticuerpos que pueden utilizarse en las moléculas biespecíficas de la invención son anticuerpos monoclonales de murino, humanos, quiméricos y humanizados.

Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden ser preparadas por conjugación de las especificidades de unión constituyentes, por ejemplo, y especificidades de unión anti-FcR y anti-CDH17 usando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de molécula biespecífica puede ser generada por separado y luego conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, puede usarse una variedad de agentes de acoplamiento o entrelazadores para conjugación covalente. Ejemplos de agentes enterlazadores incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SAT A), ácido 5,5'-ditiobis(2-nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilendimaleimida (oPD ), N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil)ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (véase por ejemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 82:8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 1 18-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, y Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambas disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden ser conjugados por unión a sulfhidrilo de las regiones de gozne C-terminal de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de gozne es modificada para contener un número impar de residuos de sulfhidrilo, preferiblemente uno, antes de la conjugación.

Alternativamente, dos especificidades de unión pueden ser codificadas en el mismo vector expresadas y ensambladas en la misma célula hospedera. Este método es particularmente útil cuando la molécula biespecífica es un mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab') 2 o ligando x proteína de fusión Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula de cadena sencilla que comprende un anticuerpo de cadena sencilla y un determinante de unión o una molécula biespecífica de cadena sencilla que comprende dos factores determinantes de la unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender por lo menos dos moléculas de cadena sencilla. Los métodos para la preparación de moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en las patentes de Estados Unidos números: 5,260,203; 5,455,030; 4,881 ,175; 5,132,405; 5,091 ,513; 5,476,786; 5,013,653; 5,258,498; y 5,482,858, todos los cuales se incorporan expresamente aquí por referencia.

La unión de las moléculas biespecíficas sus objetivos específicos se puede confirmar, por ejemplo, por la prueba inmunoabsorbente ligada a enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), análisis FACS, prueba biológica (por ejemplo, inhibición del crecimiento) o ensayo de Western Blot. Cada uno de estos ensayos generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de interés particular mediante el uso de un reactivo marcado (v.gr., un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo pueden detectarse usando, v.gr., un anticuerpo ligado a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden ser detectados usando cualquiera de una variedad de otros inmunoensayos. Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser radiactivamente etiquetados y usarse en un radioinmunoensayo (RIA) (véase, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, Marzo, 1986, que se incorpora aquí por referencia). El isótopo radiactivo puede ser detectado por medios tales como el uso de un contador y o un contador de escintilación o por autorradiografía.

Fragmentos de anticuerpo y miméticos de anticuerpo La presente invención no se limita a anticuerpos tradicionales y puede realizarse mediante el uso de fragmentos de anticuerpos y miméticos de anticuerpo. Como se detalla más adelante, una amplia variedad de tecnologías mimética de fragmento de anticuerpo y miméticos de anticuerpo ahora han sido desarrollados y son ampliamente conocidos en la técnica. Aunque un número de estas tecnologías, como anticuerpos de dominio, Nanocuerpos y Unicuerpos hacen uso de fragmentos de, u otras modificaciones a las estructuras de anticuerpo tradicionales, también existen tecnologías alternativas, tales como Affibodies, DARPins, Anticalins, avímeros y Versabodies que utilizan estructuras de unión que, aunque simulan la unión de anticuerpos tradicional, son generados a partir y funcionan a través de distintos mecanismos.

Los anticuerpos de dominio (dAbs) son las unidades de unión funcional más pequeñas de anticuerpos correspondientes a las regiones variables de ya sea las cadenas pesadas (VH) o las cadenas ligeras (VL) de anticuerpos humanos. Los anticuerpos de dominio tienen un peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis ha desarrollado una serie de genotecas grandes y muy funcionales de dAbs de VH y VL completamente humanas (más de 10 mil millones de diferentes secuencias en cada genoteca) y utiliza estas genotecas para seleccionar dAbs que son específicos para objetivos terapéuticos. A diferencia de muchos anticuerpos convencionales, los anticuerpos de dominio también se expresan en bacterias, levaduras y sistemas de células de mamífero. Detalles adicionales de anticuerpos de dominio y los métodos de producción de los mismos pueden obtenerse por referencia a las patentes de E.U.A. Nos. 6,291 ,158; 6,582,915; 6,593,081 ; 6,172,197; 6,696,245; US Serie No. 2004/0110941 ; solicitud de patente europea No. 1433846 y patentes europeas 0368684 y 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821 , WO04/003019 y WO03/002609, cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Los nanocuerpos son proteínas terapéuticas derivadas de anticuerpo que contienen las propiedades estructurales y funcionales únicas de anticuerpos de cadena pesada que ocurren naturalmente. Estos anticuerpos de cadena pesada contienen un solo dominio variable (VHH) y dos dominios constantes (CH2 y CH3). De manera importante, el dominio de VHH clonado y aislado es un polipéptido perfectamente estable que porta la capacidad de unión a antígeno completa del anticuerpo de cadena pesada original. Los nanocuerpos tienen una alta homología con los dominios VH de anticuerpos humanos y puede ser humanizados posteriormente sin ninguna pérdida de actividad. De manera importante, los nanocuerpos tienen un bajo potencial inmunogénico, que ha sido confirmado en estudios de primates con compuestos que conducen a nanocuerpo.

Los nanocuerpos combinan las ventajas de anticuerpos convencionales con características importantes de fármacos de molécula pequeña. Como los anticuerpos convencionales, los nanocuerpos muestran alta especificidad de objetivo, alta afinidad para su objetivo y su baja toxicidad inherente. Sin embargo, como fármacos de molécula pequeña pueden inhibir enzimas y acceder fácilmente a las hendiduras del receptor. Además, los nanocuerpos son extremadamente estables, pueden administrarse por medios distintos de inyección (véase, v.gr., WO 04/041867, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) y son fáciles de fabricar. Otras ventajas de los nanocuerpos incluyen reconocer epítopes poco comunes u ocultos debido a su pequeño tamaño, unión en cavidades o sitios activos de objetivos de proteína con alta afinidad y selectividad debido a su único tridimensional, flexibilidad de formato de fármacos, ajuste de vida media y facilidad y velocidad de descubrimiento de fármacos.

Los nanocuerpos son codificados por genes individuales y eficientemente producidos en casi todos los hospederos procarióticos y eucarióticos, v.gr., E. coli (véase, v.gr., US 6,765,087, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad), mohos (v.gr., Aspergillus o Trichoderma) y levadura (v.gr., Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula o Pichia) (véase v.gr., US 6,838,254, que se incorporan aquí por referencia en su totalidad). El proceso de producción es escalable y se han producido cantidades de nanocuerpos en multi-kilogramos. Debido a que los nanocuerpos presentan mayor estabilidad en comparación con los anticuerpos convencionales, pueden ser formulados como una solución fácil de usar, de vida útil larga El método nanoclón (véase, v.gr., WO 06/079372, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad) es un método patentado para generar nanocuerpos contra un objetivo deseado, con base en la selección de alto rendimiento automatizada de células B y podría ser usado en el contexto de la presente invención.

Los unicuerpos son otra tecnología de fragmento de anticuerpo; sin embargo, éste se basa en la remoción de la región de gozne de anticuerpos lgG4. La deleción de la región de gozne da por resultado una molécula que es esencialmente la mitad del tamaño de los anticuerpos lgG4 tradicionales y tiene una región de unión univalente en lugar de la región de enlace bivalente de anticuerpos lgG4. También es bien sabido que los anticuerpos lgG4 son inertes y por lo tanto no interactúan con el sistema inmunológico, lo cual puede ser ventajoso para el tratamiento de enfermedades donde no se desea una respuesta inmunológica, y esta ventaja se pasa a unicuerpos. Por ejemplo, unicuerpos puede funcionar para inhibir o silenciar, pero no matar, las células que están unidas. Además, la unión de unicuerpo a las células cancerosas no estimula a que proliferen. Además, dado que los unicuerpos son aproximadamente la mitad de los anticuerpos lgG4 tradicionales, pueden mostrar mejor distribución sobre tumores sólidos más grandes con eficacia potencialmente ventajosa. Los unicuerpos se eliminan del cuerpo en una tasa similar a todos los anticuerpos lgG4 y son capaces de unirse con una afinidad similar para sus antígenos como anticuerpos enteros. Detalles adicionales de unicuerpos se pueden obtener haciendo referencia a la solicitud de patente WO2007/059782, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Las moléculas de Affibody representan una nueva clase de proteínas de afinidad basada en un dominio de proteína de 58 residuos de aminoácido derivado de uno de los dominios de unión de IgG de proteína estafilocócica A. Este dominio de paquete de tres hélices se ha usado como un andamio para la construcción de genotecas combinatorias de fagémido, del cual las variantes de Affibody que dirigen las moléculas deseadas pueden seleccionarse usando tecnología de despliegue del fagos (Nord, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Binding proteins selected from combinatorial libraries of an a-helical bacterial receptor domain, Nat Biotechnol 1997; 15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Human immunoglobulin A (IgA)-specific ligands from combinatorial engineering of protein A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55.). La estructura simple, robusta de moléculas de Affibody en combinación con su bajo peso molecular (6 kDa), hacen de ellas convenientes para una amplia variedad de aplicaciones, por ejemplo, como reactivos de detección (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construction and characterization of affibody-Fc chimeras produced in Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261 :199-211) y para inhibir la interacción del receptor (Sandstorm, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co-stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatorial protein engineering, Protein Eng 2003; 16:691-7). Detalles adicionales de Affibodies y métodos de producción de los mismos pueden obtenerse por referencia a la patente de E.U.A. No 5831012 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

Los Affibodies marcados también pueden ser útiles en aplicaciones para determinar la abundancia de las isoformas.

DARPins (proteínas de repetición de Ankyrin diseñadas) son un ejemplo de una tecnología de mimético de anticuerpo DRP (proteína de repetición diseñada) que ha sido desarrollada para explotar las capacidades de unión de polipéptidos no anticuerpo. Las proteínas de repetición como ankyrin o proteínas de repetición ricas en leucina, son moléculas de unión ubicuas, que ocurren, a diferencia de los anticuerpos, intra y extracelularmente. Sus características de arquitectura modular únicas representa unidades estructurales de repetición (repeticiones), que se apilan entre sí para formar dominios de repetición alargados que despliegan superficies de unión a objetivo variables y modulares. Con base en esa modularidad, se pueden generar genotecas combinatorias de polipéptidos con especificidades de unión altamente diversificadas. Esta estrategia incluye el diseño de consenso de repeticiones autocompatibles que despliegan los residuos de superficie variables y su ensamble aleatorio en dominios de repetición.

Las DARPins se pueden producir en sistemas de expresión bacteriana en muy altos rendimientos y pertenecen a las proteínas más estables conocidas. Las DARPins altamente específicas, de alta afinidad, para una amplia gama de proteínas objetivo, incluyendo receptores humanos, citocinas, quinasas, proteasas humanas, virus y proteínas de la membrana, han sido seleccionadas. Las DARPins que tienen afinidades en la escala nanomolar a picomolar gama se puede obtener.

Las DARPins se han usado en una amplia gama de aplicaciones, incluyendo ELISA, ELISA intercalado, análisis de citometría de flujo (FACS), inmunohistoquímica (IHQ), aplicaciones de chip, purificación de afinidad o Western Blot. Las DARPins también probaron ser altamente activas en el compartimiento intracelular, por ejemplo como marcador intracelular de proteínas fusionadas a la proteína verde fluorescente (GFP). Las DARPins además se usaron para inhibir la entrada viral con IC50 en la escala de pM. Las DARPins no sólo son ideales para bloquear las interacciones proteína-proteína, sino también para inhibir enzimas. Las proteasas, cinasas y transportadores han sido exitosamente inhibidos, muy frecuentemente un modo de inhibición alostérico. Los enriquecimientos muy rápidos y específicos sobre el tumor y el tumor muy favorable a las relaciones de sangre hacen a las DAEPins bien adaptadas para el diagnóstico in vivo o enfoques terapéuticos.

Información adicional sobre DARPins y otras tecnologías de DRP puede encontrarse en la publicación de solicitud de patente de E.U.A. no. 2004/0132028 y publicación de solicitud de patente internacional No. WO 02/20565, ambas de las cuales son incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

Las anticalinas son una tecnología de mimético de anticuerpo adicional, sin embargo en este caso la especificidad de unión se deriva de lipocalinas, una familia de proteínas de bajo peso molecular que se expresan naturalmente y abundantemente en fluidos corporales y tejidos humanos. Las lipocalinas han evolucionado para llevar a cabo una serie de funciones in vivo asociadas al transporte fisiológico y almacenamiento de compuestos químicamente sensibles o insolubles. Las lipocalinas tienen una sólida estructura intrínseca que comprende un ß-barril altamente conservado que soporta cuatro bucles en una terminal de la proteína. Estos bucles forman la entrada a una bolsa de unión y diferencias conformacionales en esta parte de de molécula explican la variación en especificidad de unión entre lipocalinas individuales.

Aunque la estructura general de bucles hipervariables soportados por un marco de trabajo de ß-hoja conservado es una reminiscencia de inmunoglobulinas, las lipocalinas difieren considerablemente de anticuerpos en términos de tamaño, estando compuesta de una cadena polipeptídica sencilla de 160-180 aminoácidos que es marginalmente más grande que un solo dominio de inmunoglobulina.

Las lipocalinas se clonan y sus bucles son sometidos a la ingeniería genética para crear anticalinas. Las genotecas de anticalinas estructuralmente diversas se han generado y el despliegue de anticalina permite la selección y determinación selectiva de la función de unión, seguida por la expresión y la producción de proteína soluble para análisis posterior en sistemas procarióticos o eucarióticos. Los estudios han demostrado con éxito que es posible desarrollar anticalinas que son específicas para prácticamente cualquier proteína objetivo humana y se pueden aislar y las afinidades de unión en el intervalo más alto o nanomolar se pueden obtener.

Las anticalinas también pueden ser diseñadas como proteínas d dirección doble, llamadas duocalinas. Una duocalina une dos objetivos terapéuticos separados en una proteína monomérica fácilmente producida usando procesos de fabricación estándares mientras se retiene la especificidad objetiva y afinidad independientemente de la orientación estructural de sus dos dominios de unión.

La modulación de varios objetivos a través de una sola molécula es particularmente ventajosa en enfermedades que se sabe que involucran a más de un solo factor causal. Más aún, formatos de unión bivalentes o multivalentes como las duocalinas tienen gran potencial en dirigir las moléculas de superficie de la célula en la enfermedad, mediando efectos agonistas sobre trayectorias de transducción de señal o induciendo efectos de internalización mejorados mediante la unión y agregación de receptores de superficie celular. Además, la alta estabilidad intrínseca de las duocalinas es comparable con las anticalinas monoméricas, ofreciendo potencial de formulación y suministro flexible para duocalinas.

Puede encontrarse información adicional sobre anticalinas en la patente de E.U.A. No. 7,250,297 y la publicación de solicitud de patente internacional No. WO 99/16873, ambas de las cuales son incorporadas aquí por referencia en su totalidad.

Otra tecnología de miméticos de anticuerpos útil en el contexto de la presente invención son avímeros. Los avímeros son evolucionados de una familia grande de dominios de receptor extracelular humano por mezclado de exón in vitro y despliegue de fagos, generando proteínas de multidominio con propiedades de unión e inhibidoras. El enlace a múltiples dominios de unión independientes se ha mostrado que crea avidez y da por resultado mayor afinidad y especificidad en comparación con proteínas de unión a un solo epítope convencionales. Otras ventajas potenciales incluyen la producción simple y eficiente de moléculas específicas de objetivos múltiples en Escheríchia coli, termoestabilidad mejorada y resistencia a las proteasas. Se han obtenido avímeros con afinidades sub-nanomolar contra una variedad de objetivos.

Puede encontrarse información adicional sobre avímeros en las publicaciones de solicitud de patente de EU.A. Nos. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831 , 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, todas las cuales se incorporan aquí por referencia en su totalidad.

Los Versabodies son otra tecnología de miméticos de anticuerpos que podría usarse en el contexto de la presente invención. Los Versabodies son proteínas pequeñas de 3-5 kDa con > 15% de cisteínas, que forman un armazón proteínico de disulfuro alta densidad, reemplazando el núcleo hidrofóbico que tienen proteínas típicas. El reemplazo de un gran número de hidrofóbicos aminoácidos, que comprende el núcleo hidrofóbico, con un pequeño número de resultados de disulfuros en una proteína que es más pequeño, más hidrofílicos (menos agregación y unión no específica), más resistentes a las proteasas y calor, y tiene una densidad menor de epítopes del células T, porque los residuos que más contribuyen a la presentación de MHC son hidrofóbicos. Se sabe bien que las cuatro de estas propiedades afectan la inmunogenicidad, y juntos se espera que causen una gran disminución en la inmunogenicidad.

La inspiración para Versabodies proviene de los productos biofarmacéuticos inyectables naturales producidos por las sanguijuelas, serpientes, arañas, escorpiones, caracoles, y las anémonas, que se sabe que presentan inmunogenicidad inesperadamente baja. Empezando con las familias de proteínas naturales seleccionadas, por diseño y determinación selectiva del tamaño, carácter hidrofóbico, procesamiento de antígeno proteolítico, y densidad de epítope se reducen al mínimo a niveles muy por debajo de la media para las proteínas inyectables naturales.

Dada la estructura de Versabodies, estos miméticos de anticuerpo ofrecen un formato versátil que incluye multi-valencia, multi-especificidad, una diversidad de mecanismos de vida media, módulos de dirección de tejido y la ausencia de la región de Fe de anticuerpo. Además, los Versabodies se fabrican en E. coli en altos rendimientos, y por su carácter hidrofílico y tamaño pequeño, los Versabodies son altamente solubles y pueden formularse a altas concentraciones. Los Versabodies son excepcionalmente estables al calor (pueden ser hervidos) y ofrecen vida útil extendida.

Información adicional sobre los Versabodies se puede encontrar en la publicación de solicitud de patente No. 2007/0191272 que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

La descripción detallada del fragmento de anticuerpo y tecnologías de miméticos de anticuerpo provistas anteriormente no pretende ser una lista completa de todas las tecnologías que podrían usarse en el contexto de la presente especificación. Por ejemplo, y también no a manera de restricción, una variedad de tecnologías adicionales incluyendo tecnologías alternativas basadas en polipéptidos, tales como fusiones de regiones determinación de complementariedad como se delinea en Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), que se incorpora aquí por referencia en su totalidad, así como las tecnologías basadas en ácido nucleico, tales como las tecnologías de aptámero de ARN descritas en las patentes de E.U.A. Nos. 5,789,157, 5,864,026, 5,712,375, 5,763,566, 6,013,443, 6,376,474, 6,613,526, 6,114,120, 6,261,774, y 6,387,620, todas las cuales se incorporan aquí por referencia, podrían usarse en el contexto de la presente invención.

Composiciones farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención provee una composición, v.gr., una composición farmacéutica que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porción(es) de unión a antígeno, de la presente invención, formulada junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Dichas composiciones pueden incluir uno o una combinación de (v.gr., dos o más diferentes) anticuerpos o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o bispecíficos) que se unen a diferentes epítopes en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden ser administradas en una terapia de combinación, es decir, combinado con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-CDH17 de la presente invención combinado con por lo menos otro agente anti-tumoral o un agente antiinflamatorio o inmunosupresor. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden usarse en la terapia combinada se describen con más detalle más adelante en la sección sobre los usos de los anticuerpos de la invención.

Como se usa aquí, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes isotónicos y de retraso de absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferiblemente, el vehículo es adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (v.gr., por inyección o infusión). Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, es decir, anticuerpo, immunoconjugado o molécula biespecífica, puede ser revestido con un material para proteger el recinto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar el compuesto.

Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir uno o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto progenitor y no imparte ningún efecto toxicológico no deseado (véase, v.gr., Berge, S.M., et al (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19). Ejemplos de estas sales incluyen sales ácidas y básicas de adición. Las sales ácidas de adición incluyen aquellos ácidos dicarboxílicos y derivados de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como los ácidos clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico y yodhídrico, fosforoso y similares, así como de ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos monocarboxílicos y dicarboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-sustituidos, ácidos hidroxialcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos, y similares. Las sales básicas de adición incluyen los derivados de metales alcalinotérreos, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, así como de aminas orgánicas no tóxicas, tales como ?,?'-dibenciletilendiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, procaína y similares.

Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de sodio y similares; (2) antioxidantes liposolubles, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propilo, alfa-tocoferol y similares; y (3) agentes quelatadores de metal, tales como el ácido cítrico, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.

Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden ser utilizados en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares) y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y ésteres orgánicos inyectables, tales como oleato de etilo. Puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de revestimiento, tales como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de agentes tensoactivos.

Estas composiciones también pueden contener aditivos como conservadores, agentes humectantes, agentes emulsionantes y agentes dispersantes. La prevención de la presencia de microorganismos puede garantizarse por procedimientos de esterilización, anteriores y por la inclusión de varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, ácido sórbico de fenol y similares. También puede ser deseable incluir a agentes isotónicos, como azúcares, cloruro de sodio, y similares en las composiciones. Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede ser provocada por la inclusión de agentes que retrasan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina.

Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones inyectables estériles o dispersión. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la técnica. Excepto en la medida en que el medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención. Los compuestos activos complementarios también pueden ser incorporados en las composiciones.

Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede ser formulada como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para la concentración de fármaco alta. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerina, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. Se puede mantener la fluidez adecuada, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, por el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y por el uso de agentes tensoactivos. En muchos casos, sería preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede ser provocada incluyendo en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo en la cantidad necesaria en un solvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido por microfiltración con esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes de aquellos enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son de secado al vacío y secado por congelamiento (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución previamente esterilizada por filtración.

¦ La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de soporte para producir una sola forma de dosis variará según el sujeto que ha de ser tratado y el modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de dosificación única será aquella cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Por lo general, de cien por ciento, esta cantidad oscilará del 0.01% a aproximadamente 99% de ingrediente activo, preferiblemente de aproximadamente 0.1 por ciento a aproximadamente de 70 por ciento, preferiblemente más de aproximadamente 1 por ciento a aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Los regímenes de dosis se ajustan para proveer la respuesta óptima deseada (v.gr., una respuesta terapéutica). Por ejemplo, puede administrarse un bolo único, pueden administrar varias dosis divididas con. el tiempo o la dosis puede reducirse proporcionalmente o aumentar según lo indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de unidad de dosificación para la facilidad de administración y la uniformidad de dosis. La forma de unidad de dosificación aquí se refiere a unidades discretas físicamente discretas adaptadas como dosis unitarias para los sujetos que han de ser tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de unidad de dosificación de la invención son dictados por y dependen directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que se ha de lograr y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la combinación de dicho compuesto de activo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos.

Para la administración de anticuerpos, la dosis oscila entre aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg y muy generalmente 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal de hospedero. Por ejemplo, las dosis pueden ser 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal o dentro del intervalo de 1-10 mg/kg. Un régimen de tratamiento ilustrativo implica la administración de una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada 3 a 6 meses. Los regímenes de dosis preferidos para un anticuerpo anti-CDH17 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal mediante la administración intravenosa, con el anticuerpo siendo dado usando uno de los siguientes esquemas de dosificación: (i) cada cuatro semanas para seis dosis, y luego cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguida por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas.

En algunos métodos, dos o más anticuerpos monoclonales con especificidades de unión diferentes son administrados simultáneamente, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado cae dentro de los intervalos indicados. El anticuerpo se administra generalmente en múltiples ocasiones. Intervalos entre las dosis únicas pueden ser, por ejemplo, semanal, mensual, cada tres meses o anual. Los intervalos también pueden ser irregulares, como se indica mediante la medición de los niveles en la sangre de anticuerpo para el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpos en el plasma de aproximadamente 1-1000 pg/ml y en algunas formas de 25-300 pg/ml.

Alternativamente, el anticuerpo puede ser administrado como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere administración menos frecuente. La dosificación y frecuencia varían según la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguido por los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos y anticuerpos no humanos. La dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo tratamiento para el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, a veces se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta que la progresión de la enfermedad sea reducida o terminada y preferiblemente hasta que el el paciente muestre mejora parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Posteriormente, al paciente se puede administrar un régimen profiláctico.

Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden variar con el fin de obtener una cantidad de ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular, la composición y el modo de administración, sin que sea tóxico para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, o el éster, sal o amida, la vía de administración, el tiempo de administración, la velocidad de excreción del compuesto particular usado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, sexo, peso, condición de salud general e historia médica del paciente bajo tratamiento y factores similares bien conocidos en las artes médicas.

Una "dosis terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti- CDH17 de la invención preferiblemente dan por resultado una disminución en la gravedad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de los períodos libres de síntomas de enfermedad o una prevención de deterioro o discapacidad debido a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores CDH17+, una "dosis terapéuticamente efectiva" preferiblemente inhibe el crecimiento celular o el crecimiento del tumor en por lo menos aproximadamente 20%, muy preferiblemente por lo menos por aproximadamente 40%, muy preferiblemente aún por lo menos por aproximadamente 60% y muy preferiblemente todavía por lo menos por aproximadamente 80% en relación con sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento tumoral puede evaluarse en un sistema de modelo animal predictivo de eficacia en los tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse mediante el examen de la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento de la célula, dicha inhibición puede medirse in vitro mediante ensayos sabe que el experto en la técnica. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o de otra manera mejorar los síntomas en un tema. Un experto en la técnica sería capaz de determinar dichas cantidades con base en factores tales como tamaño del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto y la composición particular o vía de administración seleccionada.

Una composición de la presente invención se puede ser administrada mediante una o más vías de administración usando uno o más de una variedad de métodos conocidos en la técnica. Como lo apreciará el experto en la técnica, la vía o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos de la invención incluyen intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras vías de administración parenterales, v.gr., por inyección o infusión. La frase "administración parenteral", como se usa aquí, significa modos de administración que no sean la administración entérica y tópica, generalmente por inyección e incluye, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, ¡ntradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraspinal, epidural e ¡ntraesternal.

Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede ser administrado por vía no parenteral, como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosal, por ejemplo, intranasal, oral, vaginal, rectal, sublingual o tópica.

Los compuestos activos se pueden preparar con vehículos que protegerán al compuesto contra la liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, y sistemas de administración microencapsulados. Polímeros biodegradables, biocompatibles pueden usarse, tales como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones son patentados o conocidos generalmente por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección de aguja hipodérmica, tal como los dispositivos descritos en las patentes de E.U.A. Nos. 5,399,163; 5,383,851 ; 5,312,335; 5,064,413; 4,941 ,880; 4,790,824; o 4,596,556. Ejemplos de implantes bien conocidos y módulos útiles en la presente invención incluyen: patente de E.U.A. No. 4,487,603, que describe una bomba de infusión microimplantable para la administración de medicamentos a una velocidad controlada; patente de E.U.A. No. 4,486,194, que describe un dispositivo terapéutico para la administración de medicamentos a través de la piel; patente de E.U.A. No. 4,447,233, que describe una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamentos a una velocidad de infusión precisa; patente de E.U.A. No. 4,447,224, que describe un aparato de infusión implantables de flujo variable para la administración continua de medicamentos; patente de E.U.A. No. 4,439,196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico tiene compartimientos anatómicos; y patente de E.U.A. No. 4,475,196, que describe un sistema de administración de fármacos osmótico. Estas patentes se incorporan aquí por referencia. Muchos otros tales implantes, sistemas de suministro y módulos son conocidos por los expertos en la técnica.

En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales de la invención pueden ser formulados para asegurar la distribución adecuada in vivo. Por ejemplo, la barrera hemato-cerebral (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrofílicos. Para asegurarse que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), pueden ser formulados, por ejemplo, en liposomas. Para los métodos de fabricación de liposomas, véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,522,81 1 ; 5,374,548; y 5,399,331. Los liposomas pueden comprenden una o más porciones que son selectivamente transportadas a células específicas u órganos específicos, incrementando por lo tanto la administración de fármaco objetivo (véase, v.gr., V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porciones objetivo ilustrativas incluyen folato o biotina (véase, v.gr., 5,416,016 de Low et al.); manósidos (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); anticuerpos (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); receptor de proteína A de agente tensoactivo (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); Véase también K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273.

Usos y métodos Los anticuerpos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades de diagnóstico y terapéuticas in vitro e in vivo que implica el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados por CDH17.

En algunas modalidades, estas moléculas pueden administrarse a las células en cultivo, in vitro o ex vivo, o a sujetos humanos, por ejemplo, in vivo, tratar, prevenir y diagnosticar una variedad de trastornos. Como se usa aquí, el término "sujeto" pretende incluir humanos y animales no humanos.

Los animales no humanos incluyen todos los vertebrados, por ejemplo, mamíferos y no mamíferos como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, gallinas, anfibios y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por la actividad de CDH17. Los métodos son especialmente adecuados para el tratamiento de pacientes humanos tener un trastorno asociado con la expresión aberrante de la CDH17. Cuando se administran anticuerpos a CDH17 junto con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente.

Dada la unión específica de los anticuerpos de la invención para CDH17, los anticuerpos de la invención pueden ser usados para detectar específicamente expresión de CDH17 sobre la superficie de las células y, además, se pueden usar para purificar CDH17 por medio de purificación de inmunoafinidad.

Además, dada la expresión de CDH17 sobre células tumorales, los anticuerpos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención se pueden usar para tratar a un sujeto con un desorden tumorígeno, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan CDH17 incluyendo, por ejemplo, cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer colorrectal. Se ha demostrado que CDH17 es internalizada en unión de anticuerpos como se ilustra en el ejemplo 10 más adelante, permitiendo así que los anticuerpos de la invención se usen en cualquier mecanismo de acción de carga, v.gr., un enfoque ADC, radio inmunoconjugado o enfoque ADEPT.

En una modalidad, los anticuerpos (v.gr., los anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la invención pueden usarse para detectar niveles de CDH17 o niveles de las células que contienen CDH17 sobre la superficie de su membrana, dichos niveles entonces pueden relacionarse con ciertos síntomas de la enfermedad. Alternativamente, los anticuerpos pueden usarse para inhibir o bloquear la función de CDH 7 que, a su vez, puede ser relacionada con la prevención o alivio de ciertos síntomas de la enfermedad, lo que implica a la CDH17 como mediador de la enfermedad. Esto puede lograrse al ponerse en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-CDH17 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y CDH17. Cualesquiera complejos formados entre el anticuerpo y CDH17 son detectados y comparados en la muestra y el control.

En otra modalidad, los anticuerpos (v.gr., los anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la invención pueden probarse inicialmente para actividad de unión asociada con uso terapéutico o de diagnóstico in vitro. Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse usando los análisis de citometría de flujo descritos en los ejemplos más adelante.

Los anticuerpos (v.gr., los anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, inmunoconjugados y composiciones) de la invención tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con CDH17. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales, las moléculas multiespecíficas y biespecíficas, y los inmunoconjugados se pueden usar para generar in vivo o in vitro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento de y/o matar una célula que expresa CDH17; mediar la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa CDH17 en presencia de células efectoras humanas, o bloquear el ligando de CDH17 que se une a CDH17.

En una modalidad particular, los anticuerpos (v.gr., los anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) se usan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con CDH17. Ejemplos de enfermedades relacionadas con CDH17 incluyen, entre otros, tejidos de cáncer humano que representa cáncer colorrectal.

Las vías de administración adecuadas de las composiciones del anticuerpo (v.gr., anticuerpos monoclonales, las moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención in vivo e in vitro son bien conocidas en la técnica y pueden ser seleccionadas por los expertos en la técnica. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo pueden administrarse por inyección (v.gr, intravenosa o subcutánea). Las dosis adecuadas de las moléculas usadas dependerán de la edad y el peso del sujeto y la concentración y/o formulación de la composición del anticuerpo.

Como se describió antes, los anticuerpos anti-CDH17 de la invención pueden ser co-administrados con uno u otros agentes terapéuticos, v.gr., un agente citotóxico, un agente radiotóxico o un agente inmunosupresor.

El anticuerpo puede ser enlazado al agente (como un inmunocomplejo) o puede ser administrado por separado del agente. En este último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o concurrentemente con el agente o puede ser co-administrado con otras terapias conocidas, v.gr., una terapia anticancerosa, v.gr., radiación. Estos agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes antineoplásicos como doxorrubicina (adriamicina), sulfato de bleomicina cisplatin, carmustiná, clorambucil y ciclofosfamida hidroxiurea que, por sí mismos, sólo son eficaces en los niveles que son tóxicos o subtóxicos a un paciente. Cisplatin se administra por vía intravenosa en una dosis de 100 mg/kg una vez cada cuatro semanas y adriamicina es por vía intravenosa administrada como una dosis de 60-75 mg/ml cada 21 días. Otros agentes adecuados para la coadministración con los anticuerpos de la invención, otro agentes incluye a otros agentes usados para el tratamiento de cánceres, v.gr., cáncer pancreático o colorrectal, como Avastin®, 5FU y gemcitabine. La coadministración de anticuerpos anti-CDH17, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos provee dos agentes anticancerosos que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico a células tumorales humanas. Dicha co-administración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a drogas o un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que los harían no reactivos con el anticuerpo.

Células efectoras específicas de objetivo, v.gr., células efectoras enlazadas a composiciones (v.gr., anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención pueden usarse también como agentes terapéuticos. Células efectoras para dirigir pueden ser leucocitos humanos tales como los macrófagos, neutrófilos y monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células asesinas naturales y otras células que tienen receptores de IgG o IgA. Si se desea, se pueden obtener células efectoras del sujeto que ha de ser tratado. Las células efectoras específicas del objetivo pueden ser administradas como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administradas puede ser del orden de 108-109 pero variará dependiendo de la finalidad terapéutica. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula objetivo, v.gr., una célula tumoral que expresa CDH17 y para afectar la muerte celular por, v.gr., fagocitosis. Las vías de administración también se pueden variar.

La terapia con células efectoras específicas del objetivo puede realizarse conjuntamente con otras técnicas para la eliminación de células objetivo. Por ejemplo, la terapia antitumoral que usa las composiciones (v.gr., anticuerpos monoclonales, moléculas específicas y biespecíficas) de la invención y/o las células efectoras armadas con estas composiciones se puede usar en combinación con quimioterapia. Además, la inmunoterapia de de combinación se puede usar para dirigir a dos poblaciones de efectores citotóxicos distintas hacia el rechazo de célula tumoral. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CDH17 enlazados a anti-Fc-gamma Rl o anti-CD3 se pueden usar conjuntamente con agentes de unión específica de receptores de IgG o IgA.

Las moléculas específicas y biespecíficas de la invención también pueden ser usadas para modular los niveles de FcyR o FcyR sobre células efectoras, tal como bloqueando y eliminando receptores sobre la superficie celular. Para este propósito se usan mezclas de receptores anti-Fc.

Las composiciones (v.gr., anticuerpos monoclonales, las moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión a complemento, tales como porciones de lgG1 , -2, ó -3 o IgM que se une a complemento, también puede usarse en presencia de complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprenden células objetivo con un agente de unión de la invención y células efectoras apropiadas puede complementarse mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de las células objetivo revestidas con un agente de unión de la invención puede mejorarse mediante la unión de proteínas del complemento. En otra modalidad, células objetivo revestidas con las composiciones (v.gr., anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también se pueden lisar por complemento. En otra modalidad, las composiciones de la invención no activan el complemento.

Las composiciones (v.gr., anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención también pueden ser administradas junto con el complemento. En ciertas modalidades, la presente descripción provee composiciones que contienen anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones pueden ser ventajosas cuando el complemento se encuentra en la estrecha proximidad de los anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas. Alternativamente, los anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas de la invención y el complemento o el suero pueden ser administradas por separado.

También dentro del alcance de la presente invención están kits que comprende las composiciones de anticuerpo de la invención (v.gr., anticuerpos monoclonales, moléculas multiespecíficas y biespecíficas o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El kit más puede contener uno o más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos adicionales de la invención (v.gr., un anticuerpo con una actividad complementaria que se une a un epítope en el antígeno CDH17 distinto el primer anticuerpo).

Por consiguiente, los pacientes tratados con composiciones de anticuerpo de la invención se pueden administrar además (antes de, al mismo tiempo con o después de la administración de un anticuerpo de la invención) con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que mejora o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos.

En otras modalidades, el sujeto puede ser tratado además con un agente que modula, v.gr., mejora o inhibe, la expresión o actividad de Fey o receptores de Fey, por ejemplo, tratando al sujeto con una citocina. Las citosinas preferidas para la administración durante el tratamiento con la molécula multiespecíficas incluyen las del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), interferón-? (IFN-?) y factor de necrosis tumoral (TNF).

Las composiciones (v.gr., anticuerpos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención se pueden usar también para células objetivo que expresan FcyR o CDH17, por ejemplo, para el mareaje de dichas células. Para tal uso, el agente de unión puede asociarse a una molécula que puede ser detectada. Por lo tanto, la invención provee métodos para localizar ex vivo o in vitro células que expresan receptores de Fe, como FcyR o CDH17. El marcador detectable puede ser, v.gr., un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de la enzima.

En una modalidad particular, la invención provee métodos para detectar la presencia de antígeno del CDH17 en una muestra, o midiendo la cantidad de antígeno de la CDH17, que comprende poner en contacto la muestra y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal, o un porción de unión a antígeno del mismo, que específicamente se une a CDH17, en condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o porción del mismo y CDH 7. Después se detecta la formación de un complejo, en donde una formación compleja de diferencia entre la muestra en comparación con la muestra de control es indicativa de la presencia del antígeno de la CDH17 en la muestra.

En otras modalidades, la invención provee métodos para tratar un trastorno mediado por CDH17 en un sujeto, v.gr., cánceres humanos, incluyendo cáncer gástrico, cáncer de páncreas o cáncer colorrectal.

En otra modalidad, los inmunoconjugados de la invención se pueden usar para dirigir compuestos (v.gr., agentes terapéuticos, marcadores, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a células que tienen receptores de superficie de células CDH17 mediante el enlace de dichos compuestos al anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti-CDH17 puede ser conjugado a cualquiera de los compuestos de toxina que se describe en las patentes de E.U.A. Nos. 6,281 ,354 y 6,548,530, publicaciones de patente de E.U.A. Nos. 2003/0050331 , 2003/0064984, 2003/0073852, y 2004/0087497, o publicadas en WO 03/022806. Por lo tanto, la invención también provee métodos para localizar células ex vivo o in vivo que expresan CDH17 (v.gr., con un marcadora perceptible tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor de enzima). Alternativamente, los inmunoconjugados pueden usarse para destruir células que tienen receptores de superficie celular de CDH17 dirigiendo las citotoxinas o radiotoxins a 17 de la CDH.

La presente invención se ilustra además mediante los siguientes ejemplos que no deben considerarse como una limitación adicional.

Todas las referencias citan en esta especificación, incluyendo sin limitación, todos los documentos, publicaciones, patentes, solicitudes de patente, presentaciones, textos, informes, manuscritos, folletos, libros, anuncios de internet, artículos de revistas, publicaciones periódicas, fichas de producto y similares, incorporados por referencia en esta especificación en su totalidad. La discusión de las referencias aquí se pretende simplemente que resuma las afirmaciones hechas por sus autores y no se hace admisión de que cualquier referencia constituye la técnica anterior y los solicitantes se reservan el derecho a desafiar la exactitud y pertinencia de las referencias citadas.

Aunque la invención anterior se ha descrito con cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será evidente para los expertos en la técnica, a la luz de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin apartarse de la esencia o alcance de las reivindicaciones anexas.

EJEMPLO 1 Construcción de una biblioteca de despliegue de fagos Una proteína recombinante compuesta de los dominios 1-2 del dominio extracelular de CDH17 (SEQ ID NO: 22) fue generada en bacterias por métodos recombinantes estándares y usada como antígeno para la inmunización (véase más adelante). Una proteína recombinante compuesta del dominio extracelular de la longitud competa de CDH17 (SEQ ID NO: 23) también fue eurcarióticamente sintetizada por métodos recombinantes estándares y usada para investigación.

Inmunización y aislamiento de ARNm Una biblioteca de despliegue de fagos para la identificación de moléculas de unión a CDH17 fue construida como sigue. Ratones A/J (Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.) fueron inmunizados por vía intraperitoneal con antígenos CDH17 recombinantes (dominios 1-2 del dominio extracelular), usando 100 pg proteína en adyuvante completo de Freund, el día 0 y con 100 pg de antígeno el día 28. La obtención de sangre de ratones de prueba se obtuvo por medio de punción del seno retro-orbital. Si, al probar los títulos, se consideraban altos por ELISA usando antígeno de CDH17 biotinilado inmovilizado a través de neutravidina (placas de poliestireno revestidas con Reacti-Bind™ NeutrAvidin™, Pierce, Rockford, III), los ratones fueron reforzados con 100 pg de proteína día 70, 71 y 72, con posterior sacrificio y a la esplenectomía el día 77. Si los títulos de anticuerpos no fueron considerados satisfactorios, los ratones fueron reforzados con 100 pg de antígeno el día 56 y una obtención de sangre de la prueba el día 63. Si se obtuvieron títulos satisfactorios, los animales fueron reforzados con 100 g de antígeno los días 98, 99 y 100 y los bazos fueron cosechados el día 105.

Los bazos fueron cosechados en una campana de flujo laminar y transferidos a una caja de petri, recortando y desechando la grasa y tejido conectivo. Los bazos se maceraron rápidamente con el émbolo de una jeringa estéril de 5 ce en presencia de 1.0 mi de solución D (25.0 g de tiocianato de guanidina (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana), 29.3 mi de agua estéril, 1.76 mi citrato de sodio 0.75 M, pH 7.0, 2.64 mi 10% sarcosilo (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania), 0.36 ml de 2-mercaptoetanol (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.)). Esta suspensión de bazo fue aspirada a través de una aguja de 18 calibre hasta que todas las células fueron lisadas y la solución viscosa fue transferida a un tubo de microcentrífuga. La caja de Petri se lavó con 100 µ? de solución D para recuperar cualquier bazo restante. Esta suspensión después fue aspirada a través de una aguja de 22 calibre 5-10 veces adicionales.

La muestra fue dividida equitativamente entre dos tubos de microcentrífuga y a continuación se añadió, en orden, con mezclado por inversión después de cada adición: 50 µ? de acetato de sodio M 2, pH 4,0, (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pensilvania), 0.5 ml de fenol saturado con agua, (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.), 100 µ? de cloroformo/alcohol isoamílico 49:1 (Fisher Scientific, Pittsburgh, Pa.). La solución se sometió a acción de remolino durante 10 segundos y se incubó sobre hielo durante 15 minutos. Después de la centrifugación a 14 krpm durante 20 min a 2-8°C, la fase acuosa fue transferida a un tubo nuevo. Un volumen igual de fenol saturado con agua:cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1) se añadió y el tubo fue sometido a acción de remolino durante diez segundos. Después de una incubación de 15 minutos sobre hielo, la muestra se centrifugó durante 20 minutos a 2-8° C, y la fase acuosa fue transferida a un nuevo tubo y se precipitó con un volumen igual de isopropanol a -20°C durante un mínimo de 30 minutos. Después de la centrifugación a 14 krpm durante 20 min a 4°C, el sobrenadante fue aspirado, los tubos se sometieron a centrifugación brevemente y todos los rastros de líquido fueron removidos del comprimido de ARN.

Los comprimidos de ARN fueron, cada uno, disueltos en 300 µ? de solución D combinados y precipitados con un volumen igual de isopropanol a -20°C durante un mínimo de 30 minutos. La muestra fue centrifugada a 14 krpm durante 20 min a 4°C, el sobrenadante se aspiró como antes y la muestra se enjuagó con 100 µ? de etanol al 70% enfriado con hielo. La muestra fue nuevamente centrifugada a 14 krpm durante 20 min a 4°C, la solución de etanol al 70% fue aspirada y secada bajo vacío del comprimido de ARN. El comprimido se resuspendió en 100 µ? de agua tratada con pirocarbonato de dietilo estéril. La concentración se determinó por A260 usando una absorbancia de 1.0 para una concentración de 40 mp/ml. Los ARN se almacenaron a -80°C.

Preparación de ADN complementario (ADNc) El ARN total purificado de bazos de ratón como se describió anteriormente fue usado directamente como plantilla para la preparación de ADNc. El ARN (50 pg) se diluyó hasta 100 pL con agua estéril y 10 pL de 130 ng/mL de oligo dT12 (sintetizado en sintetizador de ADN Applied Biosystems modelo 392) fue agregado. La muestra se calentó durante 10 min a 70°C, después enfriada sobre hielo. Cuarenta pL de 5 * regulador de pH de primera hebra se agregaron (Gibco BRL, Gaithersburg, Maryland), junto con 20 pl de ditiotreitol 0.1 M (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD.), 10 µ? de trifosfatos de desoxinucleósido 20 mM (dNTP's, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) y 10 µ? de agua sobre hielo. La muestra luego se incubó a 37°C durante 2 min. Diez pL de transcriptasa reversa (superíndice™ II, Gibco/BRL, Gaithersburg, Maryland) se añadió y la incubación se continuó a 37°C durante 1 hora. Los productos de ADNc se usan directamente para la reacción en cadena de polimerasa (PCR).

Amplificación de genes de anticuerpo mediante PCR Para ampliar sustancialmente todos los genes de cadena H y L usando PCR, se escogieron iniciadores que correspondían sustancialmente a todas las secuencias publicadas. Puesto que las secuencias de nucleótidos de los aminoterminales de H y L contenían una considerable diversidad y 33 oligonucleótidos fueron sintetizados para servir como iniciadores 5' para las cadenas H y 29 oligonucleótidos fueron sintetizados para servir como iniciadores 5' para cadenas L kappa como se describe en la patente de E.U.A. 6,555,310, presentaron el 4 de abril de 1997. Las secuencias de nucleótidos de la región constante para cada cadena requirieron sólo un iniciador 3' para las cadenas H y un iniciador 3' para las cadenas L kappa.

Se realizó una reacción de 50 pL para cada par de iniciadores con 50 pmol de iniciador 5', 50 pmol de iniciador 3', 0.25 µ? de Taq ADN polimerasa (5 unidades/pL, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 3 pL de ADNc (preparada como se describe), 5 µ? de dNTP 2mM, 5 pL de regulador de pH 10 * Taq ADN polimerasa con MgCI2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) y H20 a 50 µ?. La amplificación se realizó usando un termociclador GeneAmp(R) 9600 (Perkin Elmer, Foster City, California) con el siguiente programa de termociclado: 94°C durante 1 minuto; 30 ciclos de 94°C durante 20 segundos, 55° C durante 30 segundos y 72°C durante 30 segundos; 72° C durante 6 minutos; 4°C.

Los productos de ADNdc del proceso de PCR fueron sometidos luego a PCR asimétrica usando sólo un iniciador 3' para generar substancialmente sólo la hebra anti-sentido de los genes objetivo. Una reacción de 100 µ?_ se realizó para cada producto de ADNdc con 200 moles de iniciador 3', 2 µ?_· de producto de ADNdc, 0,5 µ?_ de Taq ADN polimerasa, 10 µ?-de dNTP 0 2 m , 10 µ?-de regulador de pH 10 * Taq ADN polimerasa con MgCI2 (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.) y H20 a 100 µ?_. El mismo programa de PCR que el descrito anteriormente se usó para amplificar el ADN de cadena sencilla (ss).

Purificación de ADN de cadena sencilla por cromatografía de líquidos alto rendimiento y ADN de cadena sencilla con cinasa Los productos de ss-PCR de cadena de H y los productos de PCR de cadena sencilla de L cadena fueron preparados con etanol añadiendo 2.5 volúmenes de etanol y 0.2 volúmenes de acetato de amonio 7.5 M y a -20°C durante por lo menos 30 minutos de incubación. El ADN fue comprimido por centrifugación en una centrífuga Eppendorf a 14 krpm durante 10 minutos a 2-8°C. El sobrenadante fue aspirado cuidadosamente, y los tubos fueron centrifugados brevemente por segunda vez. Se removió la última gota del sobrenadante con una pipeta. El ADN se secó bajo vacío durante 10 minutos a calor medio. Los productos de la cadena de H se pusieron en acervo en 210 µ?_ de agua y los productos de la cadena de L se pusieron en acervo por separado en 210 µ?_ de agua. El ADN de cadena sencilla se purificó por cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC) usando un Hewlett Packard 1090 HPLC y una columna de intercambio de aniones Gen-Pak FAX (Millipore Corp., Milford, Massachusetts). El gradiente usado para purificar el ADN de cadena sencilla se muestra en el cuadro 1 , y la temperatura del horno fue de 60°C. Se monitoreó la absorbancia a 260 nm. El ADN de cadena sencilla eluido del HPLC se recogió en fracciones de 0.5 min. Fracciones que contenían ADN de cadena sencilla fueron precipitadas con etanol, comprimidas y secadas como se describió anteriormente. Los comprimidos de ADN secos se pusieron en acervo en 200 pL de agua estéril.

CUADR0 1 Gradiente de HPLC para purificación de ADN de cadena sencilla El regulador de pH A es 25 mM de Tris, 1 mM de EDTA, pH 8.0 El regulador de pH B es 25 mM de Tris, 1 mM de EDTA, 1 M de NaCI, pH 8.0 El regulador de pH C es 40 mM de ácido fosfórico El ADN de cadena sencilla era 5'-fosforilada en preparación para mutagénesis. Veinticuatro µ?_ de regulador de pH de 10 * cinasa (United States Biochemical, Cleveland, Ohio), 10.4 µ?_ de 5'-trifosfato de adenosina 10 mM (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana) y 2 µ?_ de polinucleótido cinasa (30 unidades/pL, United States Biochemical, Cleveland, Ohio), se añadió a cada muestra y los tubos se incubaron a 37° C durante 1 hora. Las reacciones se detuvieron incubando los tubos a 70°C durante 10 minutos. El ADN se purificó con una extracción de fenol equilibrado con Tris (pH > 8.0, United States Biochemical, Cleveland, Ohio): cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1 ) y una extracción con cloroformo: alcohol isoamílico (49:1). Después de las extracciones, el ADN fue precipitado con etanol y comprimido como se describió anteriormente. Los comprimidos de ADN se secaron, luego se disolvieron en 50 pL de agua estéril. La concentración se determinó midiendo la absorbancia de una alícuota de ADN a 260 nm usando 33 pg/ml para una absorbancia de 1.0. Las muestras se almacenaron a -20°C.

Preparación de plantillas de uracilo usadas en la generación de genotecas de fagos de anticuerpo de bazo Un mi de cultivo durante la noche de E. coli CJ236 (BioRAD, Hercules, California) se añadió a 50 mi de 2*YT en un matraz de agitación con deflector de 250 mi. El cultivo se hizo crecer a 37°C a DO600 = 0.6, inoculado con 10 µ? de una dilución 1/100 de abastecimiento de fago de vector BS45 (descrito en la patente de E.U.A. 6,555,310, presentada el 4 de abril de 1997) y el crecimiento continuó durante 6 horas. Aproximadamente 40 mi del cultivo se centrifugó a 12 krpm durante 15 minutos a 4°C. El sobrenadante (30 mi) fue transferido a un tubo de centrífuga nuevo y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos después de la adición de 15 µ? de 10 mg/ml de ARNasaA (Boehringer Mannheim, Indianapolis, Indiana). Los fagos se precipitaron por la adición de 7.5 mi de polietilenglicol 8000 al 20% (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA.)/acetato de amonio 3.5M (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri) y se incubaron sobre hielo durante 30 minutos. La muestra se centrifugó a 12 krpm durante 15 min a 2-8° C. El sobrenadante fue desechado cuidadosamente, y el tubo se centrifugó brevemente para eliminar todo rastro del sobrenadante. El comprimido se resuspendió en 400 µ? de regulador de pH con alto contenido de sal (300 mM de NaCI, 100 mM de Tris pH 8.0, 1 mM de EDTA) y fue transferido a un tubo de 1.5 mi.

El abastecimiento de fagos se extrajo repetidamente con un volumen igual de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico equilibrado (50:49: 1 ) hasta que ningún rastro de una interfaz de blanca era visible y luego se extrae con un volumen igual de alcohol de cloroformo: isoamílico (49: 1 ). El ADN se precipitó con 2.5 volúmenes de etanol y 1/5 volumen de acetato de amonio 7.5 M se incubó 30 min a -20°C. El ADN se centrifugó a 14 krpm durante 10 min a 4°C, el comprimido se lavó una vez con etanol al 70% frío y se secó bajo vacío. El ADN de plantilla de uracilo se disolvió en 30 µ? de agua estéril y la concentración se determinó por A260 usando una absorbancia de 1.0 para una concentración de 40 pg/ml. La plantilla se diluyó hasta 250 ng/pL con agua estéril, en alícuota y almacenada a -20°C.

Mutagénesis de plantilla de uracilo con ADN de cadena sencilla y electroporación en E. coli para generar genotecas de dagos de anticuerpo Genotecas de despliegue de fagos de anticuerpo se generaron al mismo tiempo introduciendo genes de cadena pesada y ligera cadena de cadena sencilla en una plantilla de uracilo de vector de despliegue de fagos. Una mutagénesis típica se realizó en una escala de 2 pg mezclando lo siguiente en un tubo de reacción de 0.2 mi de PCR: 8 pl de plantilla de uracilo (250 ng/pL), 8 pL de 10 * regulador de pH de alineación (200 mM Tris, pH 7.0, 20 mM de MgCI2, 500 mM de NaCI), 3.33 pl del inserto de cadena pesada de cadena sencilla con cinasa (100 ng/pL), 3.1 µ? del inserto de cadena ligera de cadena sencilla con cinasa (100 ng/µ?) y agua estéril a 80 µ?. El ADN se alineó en un termociclador GeneAmp(R) 9600 con el siguiente perfil térmico: 20 segundos a 94°C, 85°C durante 60 segundos, rampa de 85°C a 55°C sobre 30 minutos, mantenida a 55° C durante 15 minutos. El ADN fue transferido a hielo al terminar el programa. La extensión/ligación se llevó a cabo mediante la adición de 8 µ? de regulador de pH 10* de síntesis (5 mM cada dNTP, 10 mM de ATP, 100 mM de Tris, pH 7,4, 50 mM de MgCI2, 20 mM de DTT), 8 µ? de T4 ADN ligasa (1 U/µ?, Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.), 8 µ? de T7 ADN polimerasa diluida (1 U/µ?, New England BioLabs, Beverly, Mass.) y se incubó a 37°C durante 30 minutos. La reacción se detuvo con 300 µ?_ de regulador de pH de detención de mutagénesis (10 mM de Tris pH 8.0, 10 mM de EDTA). El ADN de mutagénesis se extrajo una vez con fenol equilibrado (pH > 8):cloroformo:alcohol isoamílico (50:49:1 ), una vez con cloroformo:alcohol isoamílico (49:1 ) y el ADN fue precipitado a -20°C durante por lo menos 30 min de etanol. El ADN fue comprimido y el sobrenadante se eliminó cuidadosamente como se describió anteriormente. La muestra fue brevemente centrifugado nuevamente y se eliminaron todos los rastros de etanol con una pipeta. El comprimido se secó bajo vacío. El ADN se resuspendió en 4 \ L de agua estéril.

Un microlitro de ADN de mutagénesis (500 ng) fue transferido en 40 µ? de E. coli DH 12S electrocompetente (Gibco/BRL, Gaithersburg, MD.) usando electroporación. Las células transformadas se mezclaron con aproximadamente 1.0 mi de células de XL-1 durante la noche que se diluyeron con 2* caldo YT a 60% del volumen original. Esta mezcla fue transferida después a un tubo de cultivo estéril de 15 mi y 9 mi de agar superior añadido para colocar sobre una placa de agar LB de 150 mm. Las placas se incubaron durante 4 horas a 37°C y luego se transfieren a 20°C durante la noche. El fago de anticuerpo de primera ronda se hizo eluyendo fagos de estas placas en 10 mi de 2*YT, centrifugando los residuos y tomando el sobrenadante. Estas muestras son las genotecas de despliegue de fagos usadas para seleccionar anticuerpos contra CDH17. Eficacia de la electroporacion se midió por placas 10 µ? de una dilución de 10"4 de células suspendidas en placas de agar LB, seguido por la incubación durante la noche de las placas a 37° C. La eficiencia se calculó multiplicando el número de placas sobre la placa de dilución de 10"4 por 106. Las eficiencias de electroporacion de genoteca son generalmente mayores a 1 *107 de fagos bajo estas condiciones.

Transformación de E. coli por electroporacion Células de E. coli electrocompetentes fueron descongeladas sobre el hielo. El ADN se mezcló con 40 L de estas células por pipeteo suavemente de las células, hacia arriba y hacia abajo, 2 - 3 veces, teniendo cuidado de no introducir una burbuja de aire. Las células fueron transferidas a un tuvo Gene Pulser (espacio de 0.2 cm, BioRAD, Hercules, California) que había sido enfriada sobre hielo, nuevamente teniendo cuidado de no introducir una burbuja de aire en la transferencia. El tubo se colocó en el pulsador de E. coli (BioRAD, Hercules, California) y se sometió a electroporacion con el voltaje a 1.88 kV según las recomendaciones del fabricante. La muestra transformada fue inmediatamente resuspendida en 1 mi de caldo 2 * YT o 1 mi de una mezcla de 400 µ? de 2 * YT/600 µ? de las células XL-1 durante la noche y se procesaron como lo indican los procedimientos.

Colocación en placas de fago M13 o células transformadas con reacción de mutaqénesis de vector de despliegue de fagos de anticuerpo Se añadieron muestras de fagos a 200 µ?_ de un cultivo durante la noche de E. coli XLI-azul cuando se colocó en placa con agar LB de 100 mm LB o a 600 iL de células durante la noche cuando se colocó en placa de 150 mm en tubos de cultivo estériles de 15 mi. Después de añadir el agar superior LB (3 mi para las placas de 100 mm o 9 mi para las placas de 150 mm, agar superior almacenado a 55° C (ver, apéndice, Sambrook et al, supra.), la mezcla fue distribuida uniformemente sobre una placa de agar LB que había sido precalentada (37°C - 55°C) para eliminar cualquier exceso de humedad sobre la superficie del agar. Las placas se enfriaron a temperatura ambiente hasta que el agar superior fue solidificado. Las placas fueron invertidas y se incubó a 37°C como se indicó.

Preparación de CDH17 biotinilado y anticuerpos biotinilados El antígeno CDH17 recombinante concentrado (dominio extracelular de longitud completa) se dializó extensivamente en BBS (20 mM de borato, 150 mM de NaCI, 0.1 % de NaN3, pH 8.0). Después de la diálisis, 1 mg de CDH17 (1 mg mi en BBS) se hizo reaccionar con un exceso molar 15 veces de biotina-éster XX-NHS (Molecular Probes, Eugene, Oreg., solución de abastecimiento a 40 mM en DMSO). La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 90 minutos y luego se extinguió con taurina (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) a una concentración final de 20 mM. La mezcla de reacción biotinilada entonces se dializó contra BBS a 2-8°C. Después de la diálisis, el CDH17 biotinilado se diluyó en regulador de pH de reconocimiento y selección (40 mM de Tris, 150 mM de NaCI, 20 mg/ml de BSA, 0.1 % de Tween 20, pH 7.5), alícuotas y se almacenó a -80°C hasta que fue necesario.

Los anticuerpos se hicieron reaccionar con 3-(N-maleimidilpropionil)biocitina (Molecular Probes, Eugene, Oreg.) usando una cisteína libre situada en el carboxi terminal e la cadena pesada. Los anticuerpos se redujeron mediante la adición de DTT a una concentración final de 1 mM por 30 min a temperatura ambiente. El anticuerpo reducido se pasó por una columna de desalación Sephadex G50 equilibrada en 10 mM de ácido bórico, 150 mM de NaCI, 50 mM de fosfato de potasio, pH 7.0. 3-(N-maleimidilpropionil)-biocitina se añadió a una concentración final de 1 mM y se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente durante 60 min. Las muestras luego se dializaron extensamente contra BBS y se almacenaron a 2-8°C.

Preparación de látex magnético de avidina El látex magnético (Estapor, 10% de sólidos, Bangs Laboratories, Fishers, Ind.) se suspendió completamente y se aplicó en alícuotas de 2 mi en un tubo cónico de 15 mi. El látex magnético se suspendió en 12 mi de agua destilada y se separó de la solución durante 10 minutos usando un imán (PerSeptive Biosystems, Framingham, Mass.). Mientras se mantenía la separación del látex magnético con el imán, el líquido fue removido cuidadosamente con una pipeta estéril de 10 mi. Este proceso de lavado se repitió tres veces más. Después del último lavado, el látex se resuspendió en 2 mi de agua destilada. En un tubo cónico de 50 mi separado, 10 mg de avidina-HS (NeutrAvidin, Pierce, Rockford, III.) se disolvieron en 18 mi de 40 mM de Tris, 0.15 M de cloruro de sodio, pH 7,5 (TBS). Mientras se sometía a acción de remolino, los 2 mi de látex magnético lavado se añadieron al avidina-HS diluido y la mezcla se mezcló 30 segundos adicionales. Esta mezcla se incubó a 45°C durante 2 hr, agitando cada 30 minutos. El látex magnético de avidina fue separado de la solución con un imán y se lavó tres veces con 20 mi BBS como se describió anteriormente. Después del último lavado, el látex se resuspendió en 10 mi de BBS y se almacenó a 4°C.

Inmediatamente antes de usarse, el látex magnético de avidina fue equilibrado en regulador de pH de reconocimiento y selección (40 mM de Tris, 150 mM NaCI, 20 mg/ml de BSA, 0,1 % Tween 20, pH 7.5). El látex magnético de avidina necesario para un experimento de regulador de pH de reconocimiento y selección (200 µ?/muestra) se añadió a un tubo de centrífuga de 15 mi estéril y se llevó a 10 mi con regulador de pH de reconocimiento y selección. El tubo se colocó en el imán durante 10 minutos para separar el látex. La solución se removió cuidadosamente con una pipeta estéril de 10 mi como se describió anteriormente. El látex magnético se resuspendió en 10 mi de regulador de pH de reconocimiento y selección para comenzar el segundo lavado. El látex magnético se lavó un total de 3 veces con regulador de pH de reconocimiento y selección. Después del último lavado, el látex se resuspendió en regulador de pH de reconocimiento y selección para el volumen inicial.

EJEMPLO 2 Selección de anticuerpos policlonales recombinantes para antígeno CDH17 Los reactivos de unión que se unen específicamente a CDH17 fueron seleccionados de las genotecas de despliegue de fagos creados a partir de ratones híper-inmunizados como se describe en el ejemplo 1.

Reconocimiento y selección Fagos de anticuerpo de primera ronda se prepararon como se describe en el ejemplo 1 usando plantilla de uracilo BS45. Electroporaciones de ADN de mutagénesis se realizaron produciendo muestras de fago derivadas de diferentes ratones inmunizados. Para crear más diversidad en la genoteca policlonal recombinante, cada muestra de fago fue reconocida y seleccionada por separado. Antes de la primera ronda de reconocimiento y selección funcional con antígeno de CDH17 biotinilado, las genotecas de fago de anticuerpo se seleccionaron para despliegue de fagos taño de cadenas pesada como ligera sobre su superficie al reconocer y seleccionar con látex 7F11 -magnético (como se describe en los ejemplos 21 y 22 de la patente de E.U.A. 6,555,310). El reconocimiento y selección funcionales de estas genotecas enriquecidas se realizaron en principio como se describe en I ejemplo 16 de la patente de E.U.A. 6,555,310. De manera específica, 10 pL de antígeno CDH17 biotinilado 1*10"6 M se añadió a las muestras de fagos (aproximadamente una concentración final de 1*10"8 M CDH17), y la mezcla se dejo llegar a equilibrar durante la noche a 2-8°C.

Después de alcanzar el equilibrio, las muestras fueron reconocidas y seleccionadas con látex magnético de avidina para capturar fago de anticuerpo unido a CDH17. El látex magnético de avidina equilibrado (ejemplo 1 ), 200 µ?_ látex por muestra, se incubó con el fago durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, aproximadamente 9 mi de regulador de pH de reconocimiento y selección se añadió a cada muestra de fago y el látex magnético se separó de la solución formando un imán. Después de una separación de 10 minutos, el fago no unido fue cuidadosamente removido usando una pipeta estéril de 10 mi. El látex magnético fue después re-suspendido en 10 mi de regulador de pH de reconocimiento y selección para ser el segundo lavado. El látex fue lavado un total de 3 veces como se describió antes. Para cada lavado, los tubos estuvieron en contacto con el imán durante 10 minutos para separar el fago no unido del látex magnético. Después del tercer lavado, el látex magnético fue re-suspendido en 1 mi de regulador de pH de reconocimiento y selección y transferido a un tubo de 1.5 ml_. El volumen entero del látex magnético para cada muestra fue después recogido y re-suspendido en 200 µ? de 2*YT y colocado en placas LB de 150 mm como se descnbe en el ejemplo 1 para amplificar el fago unido. Las placas fueron incubadas a 37°C durante 4 horas, después durante la noche a 20°C.

Las placas de 150 mm usadas para amplificar el fago unido se usaron para generar la segunda ronda de fago de anticuerpo. Después de la incubación durante la noche, los fagos de anticuerpo de segunda ronda fueron eluidos de las placas de 150 mm al aplicar con pipeta de 10 mL de medio 2*YT y agitar suavemente la placa a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras de fagos después fueron transferidas a tubos de centrifuga estériles desechables de 15 mi con una tapa de sellado de tapón, y los residuos de la placa LB fueron comprimidos por centrifugación de los tubos durante 15 minutos a 3500 rpm. El sobrenadante que contenía los fagos de anticuerpo de segunda ronda fue después transferido a un nuevo tubo.

Una segunda ronda de reconocimiento y selección funcional se estableció diluyendo 100 pL de cada abastecimiento de fagos en 900 pL del regulador de pH de reconocimiento y selección en tubos de centrifuga estériles desechables de 15 mi. El antígeno CDH17 biotinilado se añadió después a cada muestra como se describe para la primera ronda de reconocimiento y selección, y las muestras de fagos se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Las muestras de fagos fueron después reconocidas y seleccionadas con látex magnético de avidina como se describió antes. El progreso de reconocimiento y selección fueron monitoreados en este punto al colocar en placas alícuotas de cada muestra de látex sobre placas de agar LB de 100 mm para determinar el porcentaje de kappa positivos. La mayor parte de látex de cada reconocimiento y selección (99%) se colocó en placas de agar LB de 150 mm para amplificar los fagos unidos al látex. Las placas de agar LB de 100 mm fueron incubadas a 37°C durante 6-7 horas, después de lo cual las placas fueron transferidas a temperatura ambiente y filtros de nitrocelulosa (tamaño de poro 0.45 mm, BA85 Protran, Schleicher and Schuell, Keene, N.H.) se tendieron sobre las placas.

Las placas con filtros de nitrocelulosa se incubaron durante la noche a temperatura ambiente y después se revelaron con un conjugado de fosfatasa alcalina kappa anti ratón de cabra para determinar el por ciento de kappa positivos como se describe más adelante. Las muestras de fagos con porcentajes más bajos (<70%) de kappa positivos en la población fueron sometidas a una ronda de reconocimiento y selección con látex magnético 7F1 1 antes de realizar una tercera ronda funcional de reconocimiento y selección durante la noche a 2-8°C usando antígeno CDH 7 biotinilado a aproximadamente 2*10"9 M. esta ronda de reconocimiento y selección también fue monitoreada para kappa positivos. Las muestras de fagos individuales que tenían porcentajes de kappa positivos mayores que 80% se pusieron en acervo y se sometieron a una ronda final de reconocimiento y selección durante la noche a 2-8°C a 5*10"9 M CDH17. Los genes de anticuerpo contenidos dentro de los fagos eluídos de esta cuarta ronda de reconocimiento y selección funcional fueron sub-clonados en el vector de expresión, pBRncoH3.

El proceso de sub-clonación se hizo generalmente como se describe en el ejemplo 18 de la patente de E.U.A. 6,555,310. Después de la sub-clonación, el vector de expresión fue electroporado en células DH10B y la mezcla se hizo crecer durante la noche en 2*YT que contenía 1 % de glicerol y 10 pg/ml de tetraciclina. Después de una segunda ronda de crecimiento y selección en tetraciclina, alícuotas de células fueron congeladas a -80°C, como la fuente para la producción de anticuerpo policlonal CDH 7. Los anticuerpos monoclonales se seleccionaron a partir de estas mezclas policlonales colocando una muestra del la mezcla en placas de agar LB que contenían 10 pg/ml de tetraciclina y determinando selectivamente para anticuerpos que reconocían CDH17.

Expresión y purificación de anticuerpos recombinantes contra CDH17 Un inoculo de matraz de agitación se generó durante la noche a partir de un banco de células a -70°C en un agitador de incubadora Innova 4330 (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) fijado a 37°C, 300 rpm. El inoculo se usó para sembrar un fermentador de 20 L (Applikon, Foster City, Calif.) que contenía medio de cultivo definido (Pack et al. (1993) Bio/Technology 1 1 : 1271 -1277) complementado con 3 g/L de L-leucina, 3 g/L de L-isoleucina, 12 g/L de digestión de caseína (Difco, Detroit, Mich.), 12.5 g/L de glicerol y 10 pg/ml de tetraciclina. La temperatura, pH y oxigeno disuelto en el termentador fueron controlados a 26°C, 6.0-6.8 y 25% de saturación, respectivamente. La espuma fue controlada por la adición de polipropilenglicol (Dow, Midland, Mich.). Se añadió glicerol al fermentador en un modo de lotes de alimentación. La expresión de Fab fue inducida por la adición de L(+)-arabinosa (Sigma, St. Louis, Mo) a 2 g/L durante la fase de crecimiento logarítmico tardía. La densidad de células se midió por densidad óptica a 600 nm en un espectrofotómetro UV-120 (Shimadzu, Columbia, Md.). Después de la terminación de la operación y el ajuste del pH a 6.0, el cultivo se pasó 2 veces a través de un micro-fluidizador M-210B-EH (Microfluidics, Newton, Mass.) a 1 195 kg/cm2. La homogeneización a presión de las células liberó el Fab en el sobrenadante de cultivo.

El primer paso en purificación fue cromatografía de afinidad de metal inmovilizada en lecho expandido (EB-IMAC). Resina de quelatación Streamline™ (Pharmacia, Piscataway, NJ.) se cargó con 0.1 M de NÍCI2 y después se expandió y se equilibró en 50 mM de acetato, 200 mM de NaCI, 10 mM de imidazol, 0.01 % de NaN3, regulador de pH a pH 6.0 fluyendo en una dirección ascendente. La solución de abastecimiento se uso para llevar el homogenado de cultivo a 10 mM de imidazol, después de lo cual se diluyó dos veces o más en regulador de pH de equilibrio para reducir el contenido de sólidos húmedos a menos de 5% en peso. Después se cargó en una columna Streamline que fluía en la dirección ascendente a una velocidad superficial de 300 cm/hr. Los residuos de células pasaron sin quedar ocultos, pero el Fab fue capturado por medio de la interacción de alta afinidad entre níquel y la etiqueta de hexahistidina y la cadena pesada de Fab. Después del lavado, el lecho expandido fue convertido a un lecho empacado y el Fab fue eluído con 20 mM de borato, 150 mM de NaCI, 200 mM de imidazol, 0.01 % de NaN3, regulador de pH a pH 8.0 fluyendo en la dirección descendente.

El segundo paso en la purificación usó cromatografía de intercambio de iones (IEC). Resina Q Sepharose FastFIow (Pharmacia, Piscataway, N.J.) fue equilibrada en 20 mM de borato, 37.5 mM de NaCI, 0.01 % de NaN3, regulador de pH a pH 8.0. El acervo de elución de Fab del paso de EB-IMAC se diluyó 4 veces en 20 mM de borato, 0.01 % de NaN3, pH 8.0 y cargado en la columna IEC. Después del lavado, Fab fue eluido con un gradiente de sal de 37.5-200 mM de NaCI. Las fracciones de elución se evaluaron para pureza usando el sistema Xcell II™ SDS-PAGE (Novex, San Diego, Calif.) antes de ponerse en acervo. Finalmente, el acervo de Fab fue concentrado y diafiltrado en 20 mM de borato, 150 mM de NaCI, 0.01 % de NaN3, regulador de pH a pH 8.0 para almacenamiento. Esto se logró en un sistema Sartocon Slice™ ajustado dentro de un cásete de 10,000 MWCO (Sartorius, Bohemia, N.Y.). Los rendimientos de purificación finales fueron típicamente 50%. La concentración del Fab purificado se midió por absorbancia de UV a 280 nm, suponiento una absorbancia de 1.6 para una solución de 1 mg/ml.

EJEMPLO 3 Selección de anticuerpos a antígeno CDH17 a partir de preparaciones de membrana de tumor Anticuerpos seleccionados en el ejemplo 2 fueron determinados selectivamente contra preparaciones de membrana de tumor para aislar anticuerpos que preferiblemente se unen a CDH17 sobre células cancerosas y no al epitelio intestinal normal.

Preparaciones de membrana de plasma biotinilado de cáncer colorrectal pareado y muestras de tejido adyacente normal se usaron para reconocer y seleccionar muestras de fagos con látex magnético de avidina para capturar fagos de anticuerpo unidos a CDH17 como se describe en el ejemplo 2. Los anticuerpos fueron seleccionados a partir de estas tres mezclas policlonales al determinar selectivamente anticuerpos que preferiblemente se unen a CDH17 en células de cáncer colorrectal y no al epitelio intestinal normal. Estos anticuerpos después se aislaron como se describe en el ejemplo 4 y se analizaron para unirse a CDH17.

EJEMPLO 4 Selección de anticuerpos monoclonales a CHD17 a partir de las mezclas de anticuerpo policlonal recombinante Anticuerpos monoclonales contra CDH17 se aislaron de clones que contenían las mezclas policlonales recombinantes (ejemplo 3) al colocar en placa una muestra diluida de la mezcla de placas de agar LB que contenían 10pg/ml de tetraciclina. Colonias individuales después se probaron para la capacidad para producir anticuerpo que reconocía CDH17 recombinante usando resonancia de plasmón de superficie (BIACORE) (BIACORE, Uppsala, Suecia). La producción a pequeña escala de estos anticuerpos monoclonales se logró usando un método de unión a lote de quelato-Ni (véase más adelante). Los anticuerpos aislados de este método se diluyeron 1 :3 en HBS-EP (0.01 M HEPES, pH 7.4, 0.15 M de NaCI, 3 mM de EDTA, 0.005% de polisorbato 20 (v/v)), capturado con un anticuerpo kappa anti-ratón de cabra (Southern Biotechnology Associates, Inc, Birmingham, Ala.) acoplado a un chip de sensor BIACORE CM5, y se probaron para la capacidad para unirse a CDH17 recombinante Minipreparación de anticuerpos monoclonales por el método de unión a lote de quelato de Ni Colonias individuales se aislaron de las mezclas policlonales recombinantes (ejemplo 3) y se usaron para inocular 3 mi de cultivos de medio 2*YT que contenía 1 % de glicerol complementado con 10 pg/ml de tetraciclina. Estos cultivos se hicieron crecer en un agitador de incubadora Innova 4330 (New Brunswick Scientific, Edison, N.J.) fijado a 37°C, 300 rpm. La mañana siguiente, 0.5 mi de cada cultivo se uso para inocular matraces de agitación que contenían 50 mi de medio definido (Pack et al. (1993) Bio/Technology 1 1 : 1271-1277) complementado con 3 g/L de L-leucina, 3 g/L de L-isoleucina, 12 g/L de digestión de caseína (Difco, Detroit, Mich.), 12.5 g/L de glicerol y 10 pg/ml de tetraciclina. Estos cultivos se agitaron a 300 rpm, 37°C hasta que se alcanzó una densidad óptica de 4 a 600 nm. La expresión de Fab fue inducida después añadiendo L(+)-arabinosa (Sigma, St. Louis, Mo.) a 2 g/L y cambiando la temperatura a 23°C, con agitación durante la noche. El día siguiente se añadió lo siguiente a los cultivos de 50 mi: 0.55 mi de imidazol 1 M, 5 mi de B-PER (Pierce, Rockford, 11 1.) y 2 mi de resina de quelatación-Ni (Chelating Sepharose FastFIow™ resin Pharmacia, Piscataway, N.J.). la mezcla se agitó a 300 rpm, 23°C durante 1 hora tiempo después del cual se detuvo la agitación y la resina se dejó sedimentar hasta el fondo de los matraces durante 15 minutos.

El sobrenadante se vació después y la resina se re-suspendió en 40 mi de BBS (20 mM de borato, 150 mM de NaCI, 0.1 % de NaN3, pH 8.0) que contenía 10 mM de imidazol. La suspensión fue transferida a un tubo cónico de 50 mi y la resina se lavó un total de 3 veces con BBS que contenía 10 mM de imidazol. El lavado se logró por centrifugación a baja velocidad (1 100 rpm durante 1 minuto), remoción de sobrenadante y resuspensión de la resina en BBS que contenía 10 mM de imidazol. Después de que el sobrenadante del lavado final se vació, 0.5 mi de imidazol 1 M se añadió a cada tubo, se sometió a acción de remolino brevemente, y se transfirió a un tubo de centrifuga estéril. Las muestras después se centrifugaron a 14 krpm durante 1 minuto y el sobrenadante fue transferido a un nuevo tubo de micro- centrifuga. Los anticuerpos contenidos en el sobrenadante fueron después analizados para unión a CDH17 usando BIACORE (BIACORE, Uppsala, Suecia).

EJEMPLO 5 Especificidad de anticuerpos monoclonales para CDH17 determinada por análisis de citometría de flujo La especificidad de anticuerpos contra CDH17 seleccionados ene el ejemplo 4 se probó por citometría de flujo. Para probar la capacidad de los anticuerpos a unirse a la proteína CDH17 de superficie celular, los anticuerpos se incubaron con células que expresan CDH17: LoVo y LS174T, líneas de cáncer colorrectal humanas. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS. Cuatro microlitros de las suspensiones se aplicaron a los posos de un portaobjetos de 8 pozos para microscopio y se dejó que secaran. Los portaobjetos fueron calentados directamente para fijar los frotis al portaobjetos y cubrir con 0.1 mg/ml de anticuerpo diluido en PBS que contenía 1 % de BSA. Los frotis se incubaron con anticuerpo durante 1 hora a 37°C en una cámara de humedad. Después de lavar los portaobjetos 3 veces remojándolos en PBS durante 5 minutos cada uno, los frotis fueron cubiertos con IgG (H&L) F(ab)'2 (anri-ratón de conejo conjugado con isotiocianato de fluorosceina (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Calif.) diluido 1 :80 en PBS, 1 % de BSA, 0.05% de azul de Evans (Sigma). Los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a 37°C en una cámara húmeda y después se lavaron como se describió anteriormente. Después de un lavado final en agua desionizada, los portaobjetos se dejo que secaran en aire en la obscuridad. Los cubreobjetos se montaron usando un medio de montaje de glicerol de 90% que contenía 10 mg/ml de p-fenilendiamina, pH 8.0 CDH17_A4 y un anticuerpo de control unido a células LoVo a diferentes concentraciones de anticuerpo. Los resultados del análisis de citometría de flujo también demostraron que los anticuerpos monoclonales designados CDH17_A4 y un anticuerpo de control se unió efectivamente a CDH17 humana de superficie celular.

EJEMPLO 6 Caracterización estructural de anticuerpo monoclonales a CDH17 Las secuencias de ADNc que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal CDH17_A4 se obtuvieron usando técnicas de PCR estándares y se secuenciaron usando técnicas de secuenciación de ADN estándares.

Las secuencias de anticuerpo pueden ser mutagenizadas para revertir a residuos de línea germinal en uno o más residuos.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena pesada de CDH17_A4 se muestran en la figura 1 y en SEQ ID NO: 9 y 7, respectivamente.

Las secuencias de nucleótidos y aminoácidos de la región variable de cadena ligera de CDH17_A4 se muestran en la figura 2 y en SEQ ID NO: 10 y 8, respectivamente.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de CDH17_A4 con las secuencias de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal de murino conocidas demostró que la cadena pesada de CDH17_A4 utiliza un segmento de VH de la región VH105 de VHII de línea germinal de murino y gen H17 de VHII. Análisis adicionales de la secuencia de CDH17_A4 VH usando el sistema de Kabat de determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1 , CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en la figura 1 y en SEQ ID Nos: 1 , 2 y 3, respectivamente. La alineación de la secuencia de CDH17_A4 CDR1 VH a la secuencia de gen H17 de VHI I de línea germinal se muestra en la figura 3A y la alineación de la secuencia de CDH17_A4 CDR2 VH a la región VH105 de VHII se muestra en la figura 3B.

La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de CDH17_A4 con las secuencias de cadena ligera de inmunoglobulina de línea germinal de murino conocidas demostró que la cadena ligera de CDH17_A4 utiliza un segmento de VK de VK 8-30 de línea germinal de murino. Análisis adicionales de la secuencia de CDH17_A4 VK usando el sistema de Kabat de la determinación de región de CDR condujo a la delineación de las regiones CDR1 , DCR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en la figura 2 en SEQ ID Nos: 4, 5 y 6, respectivamente. Las alineaciones de las secuencias de CDH17_A4 CDR1 , CDR2 y CDR3 VK a la secuencia de VK 8-30 de línea germinal se muestran en las figuras 3C, 3D y 3E respectivamente.

EJEMPLO 7 Inmunohistoquímica sobre secciones de FFPE usando anticuerpos anti- CDH17 La inmunohistoquímica se realizó sobre secciones de FFPE de tumor colorectal y tejido adyacente normal usando anticuerpo CDH17_A4 anti-CDH17.

EX-De-Wax fue de BioGenex, CA, EUA. Secciones y arreglos de tejido fueron de Biomax, MD, EUA.

Los portaobjetos se calentaron a 2 horas a 60°C en Falcons de 50 mi en un baño de agua sin regulador de pH. Cada Falcon tuvo un lado o dos lados parte posterior con parte posterior con punta de carga de gel larga entre ellos para evitar que los portaobjetos se pegaran unos a otros. Los portaobjetos fueron desparafinizados en EZ-DeWax durante 5 minutos en una gradilla de portaobjetos negra, después se enjuagaron con la misma solución de DeWax usando una pipeta de 1 mi, después lavando con agua dése la botella de lavado. Los portaobjetos se colocaron en un frasco de Coplin llenado con agua hasta que el calentador de presión estaba listo; el agua se cambió un par de veces.

El agua se cambió por una solución de recuperación de antígeno =1x regulador de pH de citrato, pH 6 (DAKO). El antígeno se recuperó por el método de calentador de presión. Los portaobjetos en el frasco de Coplin de plástico en una solución de recuperación de antígeno se colocaron en un calentador de presión que después se calentó a una posición 6 (el punto más alto). 15-20 min en la incubación, la temperatura se redujo a la posición 3 y se dejó allí (cuando la temperatura dentro del calentador de presión fue de 117°C) durante otros 20-25 minutos. Después de que la base de calentamiento se apagó y el calentado se colocó sobre la base fría y la presión fue liberada moviendo cuidadosamente la manija hacia la posición entre "abierto" y "cerrado". El sistema entero se dejó que liberara presión y se enfrió durante otros 20 minutos. La tapa se abrió y las muestras se recogieron para dejarla reposar sobre el banco. Los portaobjetos se lavaron 1 x 5 min con PBS-3T (0.5 L PBS + 3 gotas de Tween-20) y se colocaron en PBS.

Después de la recuperación de antígeno, los portaobjetos se montaron en el sistema de placa de cubierta Shandon Coverplate el atrapamiento de burbujas de aire entre el portaobjetos y la cubierta de plástico se evitó colocando la placa de cubierta en el frasco de Coplin llenado con PBS y deslizando suavemente el portaobjetos con secciones de tejido en la placa de cubierta. El portaobjetos se extrajo del frasco de Coplin mientras se sostenía fuertemente junto con la placa de cubierta. El portaobjetos ensamblado se colocó en la gradilla, dejando PBS atrapado en el embudo y entre el portaobjetos y la placa de cubierta para que pasara a través de los mismos. Por portaobjetos se lavaron con 2 x 2 mi (o 4 x 1 mi) de PBS-3T, 1 x 2 mi PBS, esperando hasta que todo el PBS había pasado a través del portaobjetos y vírtualmente no quedaba PBS en el embudo.

El bloqueo con peróxido endógeno se realizó usando 1-4 gotas de solución de peróxido por portaobjetos; el tiempo de incubación fue de 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron con agua y después una vez con 2 mi de PBS-3T y una vez con 2 mi de PBS; fue importante esperar hasta que vírtualmente no quedara líquido en el embudo antes de añadir una nueva porción del regulador de pH de lavado.

El anticuerpo primario se diluyó con un reactivo diluyente de anticuerpo (DAKO). La dilución óptima se determinó que era 1 :400. Hasta 200 µ? de anticuerpo primario diluido se aplicó a cada portaobjetos y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con 2 x 2 mi (o 4 x 1 mi) de PBS-3T y después 1 x 2 mi de PBS.

El kappa HRP secundario anti-ratón de cabra (1 mg/ml, cat. 1050-05, Southern Biotech) se aplicó 2 x 2 gotas por portaobjetos y se incubó durante 35 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron igual que antes.

El sustrato de DAB se llevó a en regulador de pH de dilución; 2 mi que contenían 2 gotas de sustrato fueron suficientes para 10 portaobjetos. El reactivo de DAB se aplicó a los portaobjetos aplicando unas cuantas gotas a la vez y dejando 10 minutos. Los portaobjetos se lavaron 1 x 2 mi (o 2 x 1 mi) con PBS-3T y 1 x 2 mi (o 2 x 1 mi) con PBS.

Se aplicó hematoxilina (DAKO); 1 mi fue suficiente para 10 portaobjetos y los portaobjetos se incubaron durante 1 minuto a temperatura ambiente. Los embudos del sistema Shandon Coverplate se llenaron con 2 mi de agua y se dejo que pasara a través de los mismos. Cuando los portaobjetos están libres de exceso de hematoxilina, el sistema se desensambló, las secciones y/o arreglos de tejido se lavaron con agua desde la botella de lavado y se colocaron en una gradilla de portaobjetos negra. Los tejidos fueron deshidratados incubando en EZ-DeWax durante 5 minutos y después en etanol al 95% durante 2-5 minutos.

Los portaobjetos se dejaron secar sobre el banco a temperatura ambiente y después se montaron en medio de montaje y se cubrieron con cubreobjetos.

El análisis inmunohistoquímico sobre anticuerpos CDH17_A4 reveló tinción de membrana específica de células tumorales en cáncer colorrectal y no hubo tinción apreciable de tejido adyacente normal en todos los casos. El anticuerpo CDH17 A4 mostró tinción de membrana específica claro en células tumorales.

EJEMPLO 8 Inmunohistoquímica sobre secciones congeladas usando anticuerpos anti-CDH17 La inmunohistoquímica se realizó sobre tumores pareados congelados y tejidos adyacentes usando el anticuerpo anti-CDH17 CDH17_A4 Las secciones de tejido fueron de BioChain Institute Inc., CA, EUA.

Las secciones congeladas se lavaron con PBS, dos veces durante 3 minutos cada una y después se colocaron en PBS.

El bloqueo con peróxido endógeno se realizó usando Peroxidase Blocker (S2001 , DAKO). 1-4 gotas de bloqueador de peroxidasa se añadió a cada portaobjetos y se incubó durante 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron tres veces con 3 mililitros de PBS.

El anticuerpo primario se diluyó con un reactivo diluyente de anticuerpo (DAKO). 150 µ? de anticuerpo primario diluido se aplicó a cada portaobjetos y se incubó durante 45 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron dos veces durante 3 minutos con PBS-3T (500 mi PBS + 3 gotas de Tween 20) y después una vez durante 3 minutos con PBS.

El HRP secundario kappa anti-ratón de cabra se aplicó a 1 :1000 (1 mg/ml, cat. 1050-05, Southern Biotech) y se incubó durante 35 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron igual que antes.

El sustrato DAB se aplicó a los portaobjetos aplicando unas cuantas gotas a la vez e incubando durante 10 minutos. Los portaobjetos se lavaron una vez durante 3 minutos con PBS-3T y dos veces durante tres minutos con agua.

Se aplicó hematoxilina (DAKO); 1 mi fue suficiente para 10 portaobjetos y los portaobjetos se incubaron durante 1 minuto a temperatura ambiente.

Los portaobjetos se dejaron secar sobre el banco a temperatura ambiente y después se montaron en un medio de montaje a base de agua del vector y se cubrieron con un cubreobjetos.

El análisis inmunohistoquímico sobre anticuerpos CDH17_A4 en tres muestras de cáncer colorrectal junto con las muestras de tejido adyacentes normal pareadas reveló fuerte tinción de membrana específica de células tumorales en cáncer colorrectal y alguna tinción débil de tejido adyacente normal. El anticuerpo CDH17_A4 mostró tinción de membrana específica clara de células tumorales.

EJEMPLO 9 Internalización de anticuerpos anti-CDH17 Se mostró que CDH17_A4 es internalizado por células LoVo al unirse a las células usando una prueba con microscopio de inmunofluorescencia. La prueba con microscopio de inmunofluorescencia mostró internalización de los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 a través de la unión de un anticuerpo secundario anti-lgG humana conjugado a isocianato de fluorosceína (GamK-FITC). Premero, CDH17_A4 se unió a la superficie de las células LoVo. Después, el anticuerpo secundario conjugado a isocianato de fluorosceína se unió a los anticuerpos primarios. En seguida, el complejo de CDH17_A4/anticuerpo secundario FITC fue internalizado por las células.

La prueba con microscopio de inmunofluorescencia se condujo como sigue: células LoVo fueron incubadas a 37°C durante 12 horas para que las células se adhirieran unas a otras. CDH17_A4 y anticuerpo secundario conjugado a isocianato de fluorosceína se diluyeron serialmente, se lavaron con regulador de pH FACS (PBS, 2% FBS) y después se añadieron al medio de cultivo.

El medio después se lavó nuevamente con regulador de pH FACS (PBS, 2% FBS) y se incubó a 37°C, después de lo cual se añadió 200 ul de PFA a 2%. Los cubreobjetos se montaron usando un medio de montaje acuoso de 9 ul y las células después fueron visualizadas en intervalos de tiempo regulares usando microscopio fluorescente Leica. Las figuras 6A y 6B muestran unión de superficie de complejo de CDH17_A4/conjugado de FITC de anticuerpo secundario a células LoVo después de 60 minutos de incubación y la internalización del complejo CDH17_A4/conjugado de FITC de anticuerpo secundario después de 120 minutos.

El anticuerpo monoclonal CDH17_A4 se mostró que es internizado por LS147T y células LoVo al unirse a las células usando una prueba de MabZap. La prueba de MabZAP mostró internalización de anticuerpos monoclonales anti-CDH17 a través de la unión de un conjugado de anticuerpo secundario de IgG anti-humano a la toxina saporina (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100) primero, CDH17_A4 se unió a la superficie de las células LS147T y LoVo. Después, los anticuerpos MabZAP se unieron a los anticuerpos primarios. En seguida, el complejo de MabZAP fue internalizado por las células. La entrada de saporina en las células dio por resultado la inhibición de síntesis de proteína y eventual muerte celular.

La prueba de MabZAP se condujo como sigue. Cada una de las células se sembró a una densidad de 5 x 103 células por pozo. Los anticuerpos monoclonales anti- CDH17 o una IgG humana de control de ¡sotipo fueron diluidas serialmente y después añadidas a la célula. El MabZAP se añadió después a una concentración de 50 pg/ml y las placas se dejaron incubar durante 48 y 72 horas. La viabilidad de las células en las placas fue detectada por CelITiter-Glo® Luminescent Cell Viability Assay kit (Promega, G7571) y las placas se leyeron a 490nM por un Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). Los datos se analizaron por Prism (Graphpad). La muerte celular fue proporcional a la concentración de CDH17_A4 y anticuerpo monoclonal. Las figuras 8A y 8B muestran que anticuerpos monoclonales anti-CDH17 fueron eficientemente internalizados por células LS174T y LoVo respectivamente en comparación con el anticuerpo de control de isotipo de IgG anti-humano.

EJEMPLO 11 Humanización de CDH17 A4 Para diseñar secuencias humanizadas de CDH17_A4 VH y VL, los aminoácidos del marco de trabajo importantes para la formación de la estructura de CDR fueron identificados usando el modelo tridimensional. Las secuencias VH y VL humanas con homologías con CDH17_A4 también fueron seleccionadas a partir de la base de datos GenBank. Sustituciones de lisina se hicieron a CDH17 en las regiones de CDR, creando dos secuencias para humanización. Una secuencia que contenía lisinas, referidas como 'CDH17_A4_4K' (SEQ ID No: 26 y 31 ) y una secuencia sin sustituciones de lisina, referida como 'CDH17_A4_4R' (SEQ ID No: 44 y 46). Las secuencias de CDR junto con los residuos de aminoácido de marco de trabajo identificados fueron injertadas de CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R a las secuencias de marco de trabajo humanas y expresadas usando procedimientos estándares. Las figuras 9 y 1 muestran la alineación de cadenas pesada y ligera de CDH17_A4 a líneas germinales humanas.

EJEMPLO 12 Inmunohistoquímica que usa CDH17 A4 4K y CDH17 A4 4R Usando el siguiente protocolo de referencia, se realizó inmunohistoquímica sobre tejidos de tumor FFPE y normales usando CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R.

Materiales y métodos EnVision plus kits (K4006 y K4010) fue de DAKO, CA, EUA. EZ-De-Wax fue de BioGenex, CA, EUA.

Las secciones de tejido y las pruebas fueron de Biomax, MD, EUA.

Desparafinización y rehidratación Los partaobjetos se calentaron durante 2 horas a 60°C en Falcons de 50 mi en un baño de agua sin regulador de pH. Cada Falcon tuvo un portaobjetos o dos portaobjetos parte posterior a parte posterior con punta de carga de gel larga entre estos para evitar que los portaobjetos se pegaran unos a otros. Los portaobjetos fueron desparafinizados en EZ-DeWax durante 5 minutos en una gradilla de portaobjetos negra, después se enjuagaron bien con la misma solución DeWax usando una pipeta de 1 mi, después con agua. Los portaobjetos fueron colocados en un frasco de Coplin llenado con agua hasta que el calentador de presión estuvo listo; el agua se cambió un par de veces.

Recuperación de antígeno El agua se cambió por una solución de recuperación de antígeno =1x regulador de pH de citrato, pH 6 (DAKO). El antígeno se recupero por el método de microonda. Los portaobjetos en el frasco de Coplin de plástico en una solución de recuperación de antígeno se colocaron en un microondas de 800W que después se calentó a potencia completa hasta que la solución de recuperación de antígeno estaba hirviendo. La solución de recuperación de antígeno después se dejó mantenerse a una temperatura más baja a baja potencia durante 10 minutos, después de lo cual el frasco de Coplin de plástico fue removido de un microondas y se dejo enfriar a temperatura ambiente durante otros 20 minutos. La tapa se abrió y las muestras se recogieron para reposar sobre el banco. Los portaobjetos se lavaron 1 x 5 min con PBS-3T (0.5 L PBS + 3 gotas de Tween 20) y los portaobjetos se colocaron en PBS.

Tinción El bloqueo de peróxido endógeno se realizó usando una solución suministrada con EnVision plus kits. El portaobjetos se sacó del frasco de Coplin y el PBS alrededor de los tejidos se limpió. El exceso de PBS sobre el tejido fue removido al golpear el portaobjetos ligeramente en un lado y remojar los paños en gota de PBS que se acumulaba al borde de la sección de tejido. La solución de peróxido se dejó caer para cubrir el tejido completo. Cuando todas las muestras fueron cubiertas con bloque de peróxido, el tiempo se fijó a 5 minutos. Los portaobjetos se enjuagaron con agua, seguidos por 1 x 5 min con PBS-3T, después con 1 x 5 min con PBS. Después se dejaron en un frasco de Coplin en PBS. El anticuerpo primario se diluyó con un reactivo de diluyente de anticuerpo (DAKO) a la concentración óptima de 20pg/ml. El exceso de PBS se limpió de los lados y las secciones de tejido se removieron. 50-200µ? de anticuerpo primario diluido se aplicó a cada sección y/o microarreglo de tejido; teniendo cuidado de cubrir el tejido completo. El portaobjetos fue ligeramente golpeado para distribuir el anticuerpo uniformemente sobre la sección o una punta de pipeta se usó sobre la parte superior de la sección. El portaobjetos se incubó durante 45 minutos en una cámara húmeda a temperatura ambiente. El anticuerpo se enjuagó con PBS y los portaobjetos fueron procesados en el banco o montados en un sistema de Shandon Coverplate. Burbujas de aire entre el portaobjetos y la placa de cubierta de plástico se evitaron al colocar la placa de cubierta sobre el frasco de Coplin llenado con PBS y deslizando suavemente el portaobjetos con la sección de tejido en la placa de cubierta. El portaobjetos se sacó del frasco de Coplin al mismo tiempo manteniéndolo herméticamente junto con la placa de cubierta. El portaobjetos ensamblado se colocó en la gradilla, dejando que el PBS pasara completamente. Los portaobjetos se lavaron con 2 x 2 mi (o 4 x 1 mi) de PBS-3T, 1 x 2 mi PBS, esperando hasta que todo el PBS pasó a través del portaobjetos y virtualmente sin PBS en el embudo. El anticuerpo secundario (el polímero de peroxidasa correspondiente) se aplicó sobre los portaobjetos (2 x 2 gotas por portaobjeto) y se incubaron durante 35 minutos a temperatura ambiente. Los portaobjetos después se lavaron igual que antes. El sustrato de DAB se hizo en un regulador de pH de dilución; los mililitros que contenían dos gotas de sustrato fueron suficientes para 10 portaobjetos. El reactivo der DAB se aplicó a los portaobjetos aplicando unas cuantas gotas a la vez. Los portaobjetos se incubaron durante 10 minutos. Los portaobjetos después se lavaron con 1 x 2 mi (o 2 x 1 mi) con PBS-3TI, seguido por 1 x 2 mi (o 2 x 1 mi) con PBS, hasta que todo el PBS había pasado por el portaobjetos y virtualmente no quedaba PBS en el embudo. Después se aplicó hematoxilina (DAKO) (1 mi fue suficiente para 10 portaobjetos) y los portaobjetos se incubaron durante 1 minuto a temperatura ambiente. Los embudos se llenaron con 2 mililitros de agua y se dejo que pasaran por completo. Cuando los portaobjetos estaban claros de exceso de hematoxilina, el sistema fue desensamblado, las secciones y/o pruebas de tejido se lavaron con agua y se colocaron en una gradilla de portaobjetos negra. EZ-DeWax durante 5 minutos; después etanol al 95% durante 2-5 minutos. Los portaobjetos se dejaron secar, después se montaron en un medio de montaje y se cubrieron con cubreobjtos.

Resultados El análisis inmunohistoquímico reveló tinción específica de CDH17 por ambos anticuerpos, CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R, en cáncer colorrectal y cáncer gástrico. A una amplificación alta fue evidente que las células cancerosas mostraran tinción en membrana plasmática. Además, no hubo caída en intensidad de tinción de CDH17 por CDH17_A4_4K o CDH17_A4_4R, lo que muestra que estos anticuerpos pueden tener utilidad como terapéuticos y diagnósticos en estos cánceres y otros tipos de cáncer que muestran expresión de CDH17.

EJEMPLO 13 Especificidad de anticuerpos monoclonales humanizados a CDH17 determinado por análisis de citometría de flujo La especificidad de anticuerpos contra CDH17 seleccionados ene el ejemplo 4 se probó por citometría de flujo. Para probar la capacidad de los anticuerpos a unirse a la proteína CDH17 de superficie celular, los anticuerpos se incubaron con células que expresan CDH17: LoVo, líneas de cáncer colorrectal humanas. Las células se lavaron y se resuspendieron en PBS. Cuatro microlitros de las suspensiones se aplicaron a los posos de un portaobjetos de 8 pozos para microscopio y se dejó que secaran. Los portaobjetos fueron calentados directamente para fijar los frotis al portaobjetos y cubrir con 0.1 mg/ml de anticuerpo diluido en PBS que contenía 1 % de BSA. Los frotis se incubaron con anticuerpo durante 1 hora a 37°C en una cámara de humedad. Después de lavar los portaobjetos 3 veces remojándolos en PBS durante 5 minutos cada uno, los frotis fueron cubiertos con IgG (H&L) F(ab)'2 (anri-ratón de conejo conjugado con isotiocianato de fluorosceína (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Calif.) diluido 1 :80 en PBS, 1 % de BSA, 0.05% de azul de Evans (Sigma). Los portaobjetos se incubaron durante 1 hora a 37°C en una cámara húmeda y después se lavaron como se describió anteriormente. Después de un lavado final en agua desionízada, los portaobjetos se dejo que secaran en aire en la obscuridad. Los cubreobjetos se montaron usando un medio de montaje de glicerol de 90% que contenía 10 mg/ml de p-fenilendiamina, pH 8.0 La figura 12 muestra la unión de CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R y anticuerpos de control para células LoVo a diferentes concentraciones de anticuerpo. Los resultados del análisis de citometría de flujo también demostraron que los anticuerpos monoclonales humanizados designados CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R y anticuerpos de control se unieron efectivamente a CDH17 humana de superficie celular.

EJEMPLO 14 Internalización de anticuerpos anti-CDH17 humanizados Los anticuerpos monoclonales humanizados, CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R, se mostró que fueron internalizados por células LS147T y LoVo al unirse a las células usando la prueba de HumZAP. La prueba de HumZAP mostró internalización de los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 a través de la unión de un anticuerpo secundario y IgG anti-humano conjugado a la toxina saporina (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100). Primero, tanto CDH17_A4_4K como CDH17_A4_4R se unieron a la superficie de las células LoVo. Después, los anticuerpos HumZAP se unieron a los anticuerpos primarios. En seguida, el complejo de HumZAP fue internalizado por las células. La entrada de saporina en las células dio por resultado la inhibición de síntesis de proteína y finalmente muerte celular.

La prueba de HumZAP se condujo como sigue. Cada una de las células se sembró a una densidad de 5 x 103 células por pozo. Los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 o una IgG humana de control de isotipo fueron diluidos en serie y después añadidos a las células. El HumZAP se añadió después a una concentración de 50 µ9??? y las placas se dejaron incubar durante 48 y 72 horas. La viabilidad celular en las palcas fue detectada por un kit de prueba de viabilidad de células luminiscentes CelITiter-Glo® (Promega, G7571) y las placas se leyeron a 490nM por un luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). Los datos fueron analizados por Prism (Graphpad). La muerte celular fue proporcional a la concentración de CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R y anticuerpo monoclonal. La figura 13A muestra que los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 fueron eficientemente internalizados por células LoVo respectivamente en comparación con el anticuerpo de control de isotipo de IgG anti-humano. La figura 13B muestra que los anticuerpos monoclonales anti-CDH17 fueron internalizados eficientemente por células SNU-1 respectivamente en comparación con el anticuerpo de control de isotipo de IgG anti-humano.

EJEMPLO 15 Análisis de FACS de transfección transitoria de HEK293 de CDH17 humano etiquetado con bandera y CDH17 de Cynomolqus CDH17 humana y CDH17 de Cynomolgus fueron transfectadas a HEK293 para probar reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales anti- CDH 7 humanizados seleccionados en el ejemplo 11.

Para cada antígeno, se hicieron dos mezclas (véase cuadro 2) y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente. Después de lo cual la mezcla 1 y 2 para cada antígeno se añadieron juntas y se incubaron durante otros 10 minutos, nuevamente a temperatura ambiente.

CUADRO 2 Mezclas de transfección para antígenos etiquetados con bandera El medio de crecimiento después fue removido de dos matraces T175 separados de células HEK293 (colocadas en placas un día antes de la transfección a una confluencia objetivo de 30 a 50%) y fue remplazada por dos mezclas anteriores. Estos matraces después se incubaron durante 4 horas a temperatura ambiente, después de lo cual las dos mezclas separadas de lípido/Optimem/ADN para cada antígeno fueron remplazadas por medio de crecimiento.

Después de dos días los dos matraces que contenían los dos constructos de antígenos separados se sometieron a centrifuga a 1100xg y el sobrenadante fue después aspirado y almacenado. Las células restantes fueron después re-suspendidas en 0.005 M de EDTA durante 5 minutos para remover las células adherentes fijadas a los matraces.

Esto después se combinó con las células del sobrenadante centrifugado y enjuagado con regulador de pH FACS, que después se sometió a centrifugación por segunda vez y se re-suspendió en regulador de pH FACS y se añadió a una placa de FACS a aproximadamente 150,000 células/pozo.

Los anticuerpos monoclonales humanizados, CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R se incubaron con células sobre hielo durante 1 hora y después se lavaron dos veces con regulador de pH FACS frió y se re-suspendieron en 100 µ? de regulador de pH FACS por pozo. Un anticuerpo secundario se añadió a 1 pg/ml junto con el H+L PE anti-ratón de cabra (Southern Biotech) para anti-bandera y control de isotipo de ratón y H+L PE anti-humano de cabra (Southern Biotech) para control de isotipo humano. La placa después se incubó durante 1 hora, después de lo cual se lavo tres veces con regulador de pH FACS y se re-suspendió en 150 µ? de regulador de pH FACS por pozo. 50 µ? de paraformaldehído al 4% se añadió después para fijar las células antes de almacenar la placa durante la noche a 4°C. La muestra después se sometió a un citómetro de flujo Guava EasyCyte Flow Cytometer HT plus y los datos se analizaron usando el paquete de software Guava Cytosoft.

Los resultados muestran que ambos anticuerpos monoclonales humanizados, CDH17_A4_4K y CDH17_A4_4R se unen a CDH17 humano y CDH17 de cynomolgus (figuras 14A y 14B) mostrando reactividad cruzada de estos dos anticuerpos entre los homólogos de CDH17 humana y de cynomolgus. Estos resultados muestran que un mono cynomolgus se podía usar para modelo de toxicología.

Breve descripción de secuencias

Claims (13)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un anticuerpo aislado que se une específicamente a Cadherina-17, que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 70% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 46; i¡) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 47; iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 48; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 49; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 50; y iii) una tercera CDR que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos 80% de identidad de secuencia a SEQ ID NO:51.

2.- El anticuerpo aislado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: (a) la región de marco de trabajo de cadena pesada comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 26, y/o (b) la región de marco de trabajo de cadena ligera comprende una secuencia de aminoácidos con por lo menos 85% de identidad de secuencia a SEQ ID NO: 31.

3. - El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado además porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste de anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos de cadena sencilla, anticuerpos biespecíficos, minicuerpos, anticuerpos de dominio, anticuerpos sintéticos y fusiones de anticuerpo, y fragmentos de los mismos.

4. - El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado además porque el anticuerpo comprende además un dominio Fe, preferiblemente en donde el dominio de Fe es humano o una variante de dominio Fe humano.

5. - El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado además porque el anticuerpo es monoclonal.

6. - El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque el anticuerpo contiene o está conjugado a una porción terapéutica, preferiblemente una citotoxina, un fármaco o una radiotoxina.

7.- El anticuerpo aislado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado además porque el anticuerpo induce citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

8.- Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, opcionalmente junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. - Un anticuerpo como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1-7 o una composición farmacéutica como se reclama en la reivindicación 8, para usarse como un medicamento o para usarse en terapia o diagnóstico.

10. - El uso de un anticuerpo aislado como se reclama en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir una enfermedad asociada con la Cadherina 17 en un sujeto.

11 - El uso como el que se reclama en la reivindicación 10, en donde la enfermedad es cáncer.

12. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 11 , en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer gástrico, cáncer pancreático y cáncer de colon.

13. - El uso de un anticuerpo aislado que se une específicamente a cadherina-17 (CDH17), que comprende: a) una región variable de cadena pesada que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia por lo menos 80% idéntica a SEQ ID NO: 36; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia por lo menos 82% idéntica a la SEQ ID NO: 2; iii) una tercera CDR que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 39; y b) una región variable de cadena ligera que comprende: i) una primera CDR que comprende una secuencia por lo menos 80% idéntica a la SEQ ID NO: 4; ii) una segunda CDR que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 40; y iii) una tercera CDR que comprende una secuencia por lo menos 90% idéntica a la SEQ ID NO: 41 , en la preparación de un medicamento para tratar cáncer gástrico, cáncer pancreático o cáncer de colon en un sujeto.