MX2013001247A - 6- (1-metil-1h-pirazol-4-il) -3- )2-metil-2h-indazol-5-iltio)- [1, 2, 4] triazolo [4, 3-b] piridazina como inhibidor de c-met. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a un inhibidor de c-Met (descrito en la presente) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo en el tratamiento de cáncer mediado por actividad de receptores de c-Met.

Description

6-(1- ETIL-1H-PIRAZOL-4-IL)-3-(2-METIL-2H-INDAZOL-5-ILTIO)- ?.2,41 TRIAZOLO G4.3-?1 PIRIDAZINA COMO UN INHIBIDOR DE C- MET La presente invención está en el campo de química medicinal. La invención se refiere al tratamiento de cáncer. Más específicamente, la presente invención se refiere a un inhibidor de la trayectoria de señalización del receptor c-Met útil para el tratamiento de cáncer.

La expresión de c-Met ocurre en células endoteliales, epiteliales y mesenquimales. La desregulación de la trayectoria de señalización de HGF/c-Met se ha implicado en formación y progreso del tumor. La desregulación de receptores c-Met de células tumorales intensifica la proliferación de célula tumoral, invasión/metástasis y resistencia a apoptosis (Poter, et al. Small molecule c-Met kinase inhibitors: a review of recent patents, Expert Opinión on Therapeutic Patents, (2010), 20(2), 159-177).

Se han reportado varios inhibidores c-Met (inhibidores c-Met). Por ejemplo, las publicaciones Internacionales del Tratado de Cooperación en Patente (PCT) WO 2008051808 A2, WO 2008/051805 A3 y WO 2009/106577 A1 describe compuestos útiles para el tratamiento de cáncer.

A pesar que se han reportado compuestos útiles para el tratamiento de varios canceres que incluyen inhibidores de c-Met, algunos de estos compuestos no son suficientemente efectivos. Algunos compuestos carecen de eficacia, algunos tienen farmacocinética/farmacodinámica (PK/PD) no satisfactoria, y algunos tienen perfiles metabólicos no satisfactorios. (Xiangdong, et al., Trends in Molecular Medicine (2010) 16(1), 41-42: véase también: Diamond S, et al., Species-specific metabolism of SGX523 by aldehyde oxidase and the toxicological implications, Drug Metab Dispos. 2010, 38(8): 1277-85).

Así, existe una necesidad para nuevos compuestos que sean potentes y eficaces para el tratamiento de cáncer. En particular, existe una necesidad para compuestos que sean potentes. Adicionalmente, existe una necesidad para compuestos que tengan eficacia sostenida. Además, existe una necesidad para compuestos que tengan perfil PK/PD aceptable para el tratamiento de cáncer. La presente invención proporciona un nuevo compuesto que exhibe alta potencia, eficacia preclínica sostenida y perfil PK/PD aceptable para el tratamiento de cánceres mediados por c-Met.

El compuesto de la invención es un compuesto de fórmula o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la invención en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente uno o más de otros agentes terapéuticos.

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un paciente en necesidad del mismo.

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer, seleccionado de colorrectal, mama, cabeza y cuello, próstata, gástrico, pancreático, hígado, renal, pulmón, leucemia, melanomas, glioblastoma y sarcomas que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un paciente en necesidad del mismo.

La presente invención se refiere a un método para tratar cáncer, seleccionado de cáncer gástrico, glioblastoma y pancreático que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un paciente en necesidad del mismo.

La presente invención proporciona un método para tratar cáncer de mama o colorrectal que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un paciente en necesidad del mismo.

La presente invención proporciona un compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable para uso en terapia.

La presente invención proporciona un compuesto de la invención para uso en el tratamiento de cáncer.

La presente invención proporciona un compuesto de la invención para uso en el tratamiento de cáncer gástrico, pancreático, glioblastoma, mama o cáncer colorrectal.

La presente invención se refiere al uso de un compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable en la manufactura de un medicamento para tratar cáncer.

La presente invención se refiere al uso de un compuesto de la invención o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, en la manufactura de un medicamento para tratar cáncer, seleccionado de cáncer gástrico, cáncer pancreático y glioblastoma.

Como se usa en la presente "Met", "c- et" o "receptor c-Met" se refiere al receptor del factor de crecimiento hepatocito (HGF) y formas del mismo.

La frase "desregulación de la trayectoria de señalización HGF/c-Met" significa niveles elevados o ¡napropiados de señalización a través de la trayectoria de señalización HGF/c-Met.

Una "cantidad terapéuticamente efectiva" del compuesto de la invención es una cantidad del compuesto capaz de lograr la inhibición de la actividad del receptor c-Met en una o más dosis para lograr el tratamiento de cáncer. Una cantidad efectiva puede ser fácilmente determinada por el médico tratante o diagnosticador, un experto en la técnica, considerando un número de factores conocidos por una persona experta en la técnica tal como, por ejemplo, altura, edad, salud general del paciente, cáncer específico o enfermedades co-presentadas siendo tratadas, grado de severidad, forma de administración, régimen de dosis, uso de medicaciones concomitantes, etc.

Los términos "tratamiento" o "tratar" como se usa en la presente significan detención del crecimiento de tumor, inhibición del crecimiento de tumor, prevención de incidencia o recurrencia del crecimiento de tumor y/o reducción en severidad o efecto de cáncer.

La frase "eficacia sostenida" como se usa en la presente se refiere a nivel sostenido de efecto farmacodinámico, por ejemplo inhibición del crecimiento de tumor, o concentración de plasma del compuesto de la invención por más de cuatro (4) horas. El beneficio de una eficacia sostenida incluye menos frecuencia y/o cantidad de dosificación.

La frase "propiedades PK/PD aceptables" como se usa en la presente, se refiere a un perfil de farmacocinética (PK) y farmacodinámica (PD) que permiten al compuesto ser administrado una vez al día (QD) o dos veces al día (BID) para el propósito destinado, es decir, como un tratamiento de cáncer. Las propiedades PK/PD contempladas incluyen parámetros tales como biodisponibilidad, aclaramiento y estabilidad metabólica.

El compuesto de la invención puede también existir como una sal de adición de ácido. Sales farmacéuticamente aceptables y metodología común para prepararlos se conocen por uno de experiencia en la técnica. Véase, por ' ejemplo, P. Stabl, et al. Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selections and Use (VCHA/Wiley-VCH, 200): S. M. Berge, et al., "Pharmaceutical Salts" Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 66, No. 1, Enero 1977. Sales preferidas del compuesto de la invención incluye la sal de ácido clorhídrico, sal de ácido metansulfónico y sal de bisulfato. Alguien experto en la técnica está consciente de procedimientos para elaborar sales de ácidos, particularmente, las sales de ácidos preferidas de la presente invención.

Preferiblemente, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de cáncer de mama, colorrectal, mama, cabeza y cuello, próstata, gástrico, pancreático, hígado, renal, pulmón, melanomas, sarcomas, leucemia o metastásico avanzado. Más preferiblemente, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer, seleccionado del grupo que consiste de cáncer de mama, colorrectal, gástrico, pancreático y cáncer metastásico avanzado. También preferida es una modalidad de la presente invención que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto de la invención para el tratamiento de cáncer de mama o cáncer colorrectal. En una modalidad más preferida, la presente invención proporciona un método para tratar cáncer gástrico o pancreático que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la invención, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable, a un paciente en necesidad del mismo.

En una modalidad preferida, la presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que comprende un compuesto de la invención en combinación con uno o más portadores, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables. En una modalidad particular, la composición además comprende uno o más de otros agentes terapéuticos.

El compuesto de la invención se puede preparar esencialmente como se describe en los ejemplos posteriores.

Abreviaturas: DCM Diclorometano DMF N,N-dimetilformamida EtOAc Acetato de etilo THF Tetrahidrofurano DMSO Dimetilsulfóxido TA Temperatura Ambiente ACN Acetonitrilo IPA Alcohol isopropílico Preparación 1 3-Cloro-6-(1 -metil-1 H-p¡razol-4-il)piridazina matraz de fondo redondo de 3000 mi que contiene una solución de 1 -meti l-(4,4, 5, 5-tetrameti 1-1 ,3, 2-dioxaborolan-2-il)-1 H-pirazol (76 g, 365.3 mmol), 3,6-dicloropiridazina (68 g, 456.4 mmol) en 1,4-dioxano (1200 mi) se agregó una solución acuosa de 2C03 (127 g, 919 mmol) en agua (480 mi). Después que se agregó cloruro de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocen]paladio(ll) (7.5 g, 9.2 mmol), la mezcla se purgó con N2 por 20 minutos y se agitó a 80 °C por 16 . La mezcla de reacción se vertió en agua (300 mi) y diclorometano (2000 mi), y la capa acuosa se extrajo con DCM (3 x 800 mi). Las capas orgánicas combinadas se secaron sobre Na2S0 anhidro y se concentraron bajo vacío. El producto crudo se purificó con cromatografía en gel de sílice eluyendo con DCM/metanol (40:1) para proporcionar el compuesto del título como un sólido amarillo pálido (56 g, 63.1 %). MS (m/z): 195.1 (M + H).

Preparación 2 3-Hidrazinil-6-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)piridazina matraz de fondo redondo de 1000 mi que contiene una solución de monohidrato de hidrazina (280 mi, 4.89 mol) en etanol (300 mi) se agregó 3-cloro-6-(1 -metil-1 /-/-pirazol-4-il)piridazina (60 g, 308.3 mmol) a 4°C. La. solución clara resultante se calentó a reflujo por 18 h, y después se enfrió a 10°C. El producto precipitado se recolectó por filtración y se secó bajo vacío para proporcionar el compuesto del título como un sólido blanco (53 g, 90.4 %) y se usó como tal.

Preparación 3 6-(1 -Metil-1 H-pirazol-4-il)-[1 ,2,4]tr¡azolo[4,3-b]piridazina-3-tiol A una solució n i I -G -( 1 -metil-1 H-pirazol-4-il)piridazina (53 g, 278.6 mmol) en etanol (550 mi) se agregó una solución acuosa de OH (17.2 g, 306.6 mmol) en agua (130 mi), seguido por CS2 (36 mi, 596.7 mmol). La mezcla se agitó a 60-67 °C por 3 h bajo atmósfera de N2 y se enfrió a TA. Los solventes se removieron bajo vacío y el residuo se disolvió en NaOH 1N acuoso (350 mi). Los insolubles se filtraron y lo filtrado se acidificó a pH 2~3 con HCI 1N acuoso. Lo precipitado se recolectó, se lavó con agua, y se secó bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (50 g, 77.3 %). MS (m/z): 233.0 Preparación 4 1 H-indazol-5-amina A un autoclave de 5000 mi equipado con una entrada de H2, un termómetro y un agitador mecánico se agrega una solución de 5-nitro-1 H-indazol (500 g, 3.06 mol) en tetrahidrofurano (THF, 3500 mi), seguido por paladio en carbono (10 %, 50 g, 141 mmol). La mezcla resultante se agitó durante la noche a 25 °C bajo atmósfera de H2 (5 kg de presión). Después se purgó con N2, la mezcla se filtró, y lo filtrado se concentró bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (420 g, 100 %) como un sólido marrón. MS (m/z): 134.1 (M + H).

Preparación 5 5-yodo-1 H-indazol A una solución de HCI concentrado (1.3 I, 15.8 mol) en agua (3.5 L) se agregó 1 H-indazol-5-amina (500 g, 3.8 mol), seguido por una solución de NaN02 (285 g, 4.1 mol) en agua (1 I) en porciones a 0-5°C. La suspensión roja resultante se agregó lentamente a una solución de Kl (3.1 kg, 18.7 mol) en agua (3 I) a 50°C para mantener la generación de gas en control. La mezcla resultante se agitó a 50 °C por 1.5 h, se enfrió a 10 °C y se basificó a pH 8 con solución de Na2C03 acuosa saturada. Los sólidos se recolectaron por filtración y redisolvieron en ETOAc (20 L). La solución se lavó con solución de Na2S03 acuosa saturada (3 x 5 I), se secó sobre Na2S04 anhidro y se filtró a través de una columna en gel de sílice corta. Lo filtrado se concentró bajo vacío para proporcionar el compuesto del título (680 g, 74.2 %). MS (m/z): 244.9 (M + H).

Preparación 6 5-yodo-2-met i 1-2 H-indazol A una solución de 5-yodo-1 H-indazol (500 g, 2.05 mol) en EtOAc (4 I) se agregó tetrafluoroborato de trimetiloxonio (450 g, 3.04 mol). Después la suspensión blanca resultante se agitó a temperatura ambiente por 2 h, se concentró bajo vacío. Se agregó agua helada (1 I) al residuo, y se basificó a pH 12 con solución de NaOH acuosa al 10%. Los sólidos se recolectaron por filtración, y redisolvieron en DCM (5 I).

Los insolubles se filtraron y lo filtrado se lavó con solución de NaOH acuosa al 10% (2 x 100 mi). La capa orgánica se secó sobre Na2S04 anhidro, se filtró a través de una columna en gel de sílice corta, y se concentró. Se agregó metil ter-butil éter al residuo para proporcionar una suspensión y el producto se recolectó por filtración para proporcionar el compuesto del título (360 g, 68.0%). MS (m/z): 259.0 (M + H).

Ejemplo 1 6-(1 -Metil- 1 H-pirazol-4-il)-3-(2-metil-2H-indazol-5-iltio)-[1 ,2,4]triazol[4,3-b]piridazina A una solución de 6-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-[1 ,2,4]triazol[4,3-b]piridazina-3-tiol (2.3 g, 10.0 mmol) en DMF (20 mi) se agregó 5-yodo-2-metil-2H-indazol (2.6 g, 10.0 mmol), tris(dibencilidenacetona) dipaladio(O) (460 mg; 502.7 pmol), 4,5-bis(difenilfosfino)-9,9-dimetilxanteno (580 mg, 1.0 mmol), diisopropiletilamina (4 mi, 22.9 mmol). La mezcla se purgó con N2 y se agitó a 100°C por 18 h. Se removió DMF bajo vacío, y el residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea (gel de sílice Combi-Flash) eluyendo con DCM/metanol (20:1) para proporcionar un producto crudo. El producto crudo se suspendió en 20 mi de DCM para proporcionar una suspensión, y el producto crudo se recolectó por filtración para proporcionar el compuesto del título (1.9 g, 52.5 %) como un sólido amarillo. MS (m/z): 363.1 (M + H).

Ejemplo 1a 6-(1-Metil-1H-pirazol-4-il)-3-(2-metil-2H-indazol-5-iltio)-[1,2,4]triazol[4,3-b]piridazina A una solución de 6-(1 -metil-1 H-pirazol-4-il)-[1 ,2,4]triazol[4,3-b]piridazina-3-tiol (50 g, 268 mmol) en DMF (750 ml) se agregó 5-yodo-2-metil-2H-indazol (55.5 g, 215.1 mmol), ácido 2-Piridincarboxílico (5.5 g, 44.7 mmoles), Yoduro de cobre (I) (4 g, 21.0 mmoles), y Carbonato de Cesio (212.5 g, 652.2 moles). La mezcla se sometió a N2 y se agitó a 100°C por 10 horas. La mezcla de reacción después se enfrió a temperatura ambiente y se vertió en agua (2000 ml). Después de la agitación a temperatura ambiente por 30 min, la mezcla se extrajo con un solvente mezclado (2 I X 2, CHCI3/IPA = 3/1). La capa orgánica combinada después se lavó cuatro veces con solución mezclada (25% NH4OH(ac)/salmuera = ¼; 800 ml), LiCI saturado <ac) (11), salmuera saturada (1.5 I X 2), y se secó sobre Na2S04. La solución orgánica se concentró bajo presión reducida para proporcionar un producto sólido crudo marrón. El producto crudo se trituró con acetato de etilo (800 mi) a temperatura ambiente por 3 horas y el producto puro se recolectó por filtración para proporcionar el compuesto del título (68 g, 87.2 %) como un sólido blanco. MS (m/z): 363.0 (M + H).

Los compuestos de la presente invención se han observado por ser de alta potencia, por ser de alta selectividad para el receptor c-Met, por exhibir propiedades PK/PD aceptables, y por demostrar eficacia sostenida.

Los siguientes ensayos se realizan esencialmente como se describe en la presente demostrando que los compuestos de la presente invención potencialmente inhibe la fosforilación de c-Met en células, potencialmente inhibe c-Met in vivo y demuestra la actividad anti-tumor dependiente de la dosis en ciertos modelos de injerto heterólogo.

Ensayo in vitro de Fluorescencia Resuelta en Tiempo de cMet Homogéneo (HTRF) Este ensayo se basa en tecnología HTRF y se usa para detectar la fosforilación de péptido de tirosina etiquetado con biotina por enzima cMet. Después que la reacción se completó, se usó estreptavidina etiquetada con XL665 para reconocer la unidad de biotina y se usó un anticuerpo anti-fosfo-tirosina etiquetado con Europio (Eu3+) para reconocer la tirosina fosforilada. El proceso de detección se basa en la transferencia de energía entre el Eu3+ excitado y la estreptavidina etiquetada con XL665. El objetivo de este protocolo es calcular la capacidad de los compuestos probados para inhibir la fosforilación del producto de esta reacción y calcular sus valores IC50 relativos.

Si se desea, se puede preparar un compuesto de referencia como una solución base 1 mM en DMSO al 100% y se preparan los compuestos de prueba como soluciones base 10 mM en DMSO al 100%. Se prediluye el compuesto de referencia 1 mM y los compuestos de prueba 10 mM a 8 µ? y 80 µ? de soluciones DMSO al 10% en una placa de dilución de 96 cavidades. Los compuestos se diluyen serialmente (1:3) usando EVO 200 Tecan Freedom y se generan curvas de dilución de 10 puntos para cada uno de los compuestos probados. Se transfieren 10 µ? de compuestos serialmente diluidos a una placa de ensayo de 96 cavidades usando Temo (Tecan). Cada placa de ensayo contiene controles de actividad máxima enzimática y actividad mínima enzimática. Las cavidades de control de actividad máxima contienen 10 µ? de DMSO al 10% y las cavidades de control de actividad mínima contienen 10 µ? de ácido etilen diamina tetraacético 50 mM (EDTA) disuelto en DMSO al 10%, 20 µ? de solución de sustrato [Bio-PolyGT (CisBio)(0.576 µ?) y ATP (65.14 uM) preparado en amortiguador de dilución enzimática (EDB) Tris(hidroximetil)ani¡nometano, amortiguador base Trizma®, pH 7.5, 50 mM: DL-ditiotreitol (DTT), 2 mM; 0.0005% TX-100; MgCI2, 10 mM; y EDTA, 250 µ?)] se agrega a la placa de ensayo usando Multidrop (Thermo). Se agregan 10 µ? de mezcla enzimática [cMet (12 nM) preparada en EDB] a la placa de ensayo usando Multidrop (Thermo) para iniciar la reacción. La placa de ensayo se agita por 30 segundos y después se incuba a TA por 90 minutos. Después de los 90 minutos de incubación, se agregan 40 µ? de amortiguador de detección a la placa de ensayo [Streptavidin-XL665 (SA-XL665) (Cisbio) (144 nM) y anticuerpo anto-fosfotirosina etiquetado con Eu3+ (EuK)(CisBio)(6nM) preparado en 2.6*KF/EDTA ácido 4-(2-hidroxietil)piperazin-1 -etansulfónico; amortiguador (HEPES) ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N'-(2-etansulfónico, pH 7.0, 50 mM; BSA, 0.2%; EDTA, 20 mM; KF, 800 mM)] usando Multidrop (Thermo). Las placas de ensayo se incuban a TA por 60 minutos antes de leer las señales de fluorescencia de emisión a 620 nm y excitación a 665 nm en un instrumento Victor3 (PerkinElmer Corporation). Las relaciones 665/620 se normalizan para cada placa y se trazan los valores de porcentaje de inhibición contra concentración del compuesto para calcular los valores IC50 relativos. Los valores IC50 para el compuesto del ejemplo 1 son 0.010 µ? con una desviación estándar de 0.00071 y un tamaño de muestra de 2. El valor IC5o para la forma salina de mesilato del ejemplo 1 es 0.025 µ? con una desviación estándar de 0.0082 y un tamaño de muestra de 2. Estos datos demuestran que el compuesto de la invención es un potente inhibidor de c-Met.

ELISA a base de Célula Met (pY1349) NCI-H460 Estimulada con HGF Se cultivaron células NCI-H460 (adquiridas de ATCC) en medio RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado con Suero de Bovino Fetal al 10% (FBS) y se colocaron (antes de volverse 70% confluente) en placas de fondo plano de 96 cavidades a una densidad de 20,000 células por cavidad en volumen de 80 µ?. Las células después se incubaron durante la noche en una incubadora de cultivo celular (C02 al 5%, Humedad Relativa de 95% (RH) y 37°C) y se dejaron adherirse a la placa. A la siguiente mañana las células se lavaron con 2 volúmenes de un Medio de Suero Reducido (RSM, medio RPMI 1640, suplementado con FBS al 0.5%). Después de remover el último lavado, se agregaron 80 µ? de RSM a cada cavidad de las placas celulares. Las placas celulares se incubaron por 2.5 horas en una incubadora de cultivo celular, y entonces se dosificaron con compuestos. Los inhibidores del compuesto primero se solubilizaron a 10 mM en DMSO al 100% y después se diluyeron 100 µ? con RSM de DMSO al 2%. Subsecuentemente las diluciones seriales del compuesto (1:3) se prepararon sobre un intervalo de 100 µ? hasta 0.005 µ?. Las células se dosificaron con la adición de 20 µ? de la solución base del compuesto para producir una concentración de DMSO final de 0.45 y una dosis de concentración del compuesto final que varía entre 20 y 0.001 µ?. Después de la dosificación con los compuestos, las placas celulares suavemente se agitaron para mezclarlas y dejarlas incubar por 30 minutos en una incubadora de cultivo celular. Después que se completó la dosis, las células se estimularon con la adición de 20 µ? por cavidad del Factor de Crecimiento Hepatocito (HGF) a una concentración final de 100 ng/ml en RSM (se estimularon todas las cavidades excepto las cavidades MIN, las cavidades MIN se dosificaron con 20 µ? de RSM). Después de 10 minutos de incubación en una incubadora de cultivo celular, el líquido se removió de las cavidades de la placa celular, y las células se sometieron a lisis por la adición de 50 µ? de Meso Scale enfriado en hielo Discovery® (MSD, Gaithersburg, Maryland), Amortiguador de Lisis IX (150 mM NaCI, 20 mM Tris, pH 7.5, 1 mM EDTA, 1 mM de ácido etilen glicol tetraacético y TRITON® X-100 al 1%) suplementado con Fosfatasa I y II e Inhibidores de Proteasa (Sigma, St. Louis, MO). Después de la lisis a TA por 30 minutos, los lisados se transfieren a y se capturan en una placa 4-spot PhosphoMet de 96 cavidades Multi-Spot MSD® que es bloqueada con BSA (a 30 mg/ml Bloque A en Amortiguador de Lavado Tris IX) y después se lava una vez con Amortiguador de Lavado Tris. Después de 2 horas de captura (a TA) los lisados se remueven de la placa MSD® y la placa se lava con Amortiguador de Lavado Tris IX. Después del secado, se agrega 25 µ? del anticuerpo Anti-Total Met Sulfo-Tag 5 nM (anticuerpo de detección; MSD® preparado en Amortiguador de Lavado Tris IX suplementado con 10 mg/ml de BSA y Bloqueador D-R al 0.1% (MSD®)) a las cavidades de la placa MSD®. Después de 1 hora de captura (a TA) las cavidades de la placa MSD® se lavan con Amortiguador de Lavado Tris IX, y después se agrega 150 I de Amortiguador de Lectura IX T (con surfactante, MSD®). Inmediatamente después de la adición del Amortiguador de Lectura, las placas se analizan con un lector de placa Imager SECTOR 6000 MSD®. Se determinan los valores IC50 relativos usando unidades de actividad MSD calculando el porcentaje de inhibición con respecto a los controles "MIN" y "MAX" en la placa y después se fijan los valores de porcentaje de inhibición y los datos de respuesta de dosis de diez puntos a una ecuación logística de cuatro parámetros. El compuesto del ejemplo 1 muestra un valor IC50 relativo de 0.036 µ?, n = 1 (0.038 µ?, n = 1 para la forma salina de mesilato) indicando que el compuesto del ejemplo 1 potencialmente inhibe la fosforilación c-Met en células in vitro.

Ensayo de inhibición (IVTI) dirigido a c-Met in vivo Se cultivan células S114 (sobre-expresan tanto HGF humano como c-Met humano) en un medio de crecimiento (Medio Eagle Modificado por Dulbecco) suplementado con suero de ternero fetal al 10% y expandido. Las células se cosechan y se lavan dos veces con salina amortiguada de fosfato y se mezclan 2x106 células con volumen igual de matriz BD Matrigel™ (BD Bioscience, Franklin, NJ) y se inyecta subcutáneamente en el flanco de ratones sin pelo (sin pelo atímicos, de Harían, Indianápolis, IN). Al día 8 después del implante, se administran los compuestos (formulados en acacia al 10% o carboximetiicelulosa al 1%/laur¡l sulfato de sodio al 0.5%/antiespumante al 0.05% como suspensión) a animales por alimentación por sonda oral a 50 mg/kg. Los animales se sacrifican a las 2 horas después de la dosis, y se recolectan los tumores y se almacenan en congelamiento hasta que se necesiten.

Los tumores congelados se pulverizan usando mano de mortero. Los tejidos pulverizados se transfirieron a un tubo que contiene perlillas de Matriz D de Lisis (MP Biomedicals, Solón, OH) y 600 µ? de amortiguador de lisis (amortiguador RIPA, que contiene 50 mM de Tris-HCI, pH 7.4, 150 mM de NaCI, 1% NP-40, 05% de desoxicolato de sodio, 0.1% SDS de Boston Bioproducts, Inhibidores de Fosfatasa I y II e Inhibidores de Proteasa (Signa, St Louis, MO)). Se usa un interruptor celular FastPrep® (MP Biomedicals, Inc.) para transformar el tejido y lisar las células. Los Usados se pasan a través de una aguja de calibre 20 y se transfieren a un tubo limpio. Se determina la concentración de proteína por el método Bradford conocido por uno de experiencia en la técnica.

Se cargan los lisados de tumor en placas ELISA fosfor-Met MSD® y se determina el nivel fosfor-c-Met usando el mismo protocolo como ELISA a base de célula H460. El valor ED50 de inhibición de S 114 in vivo para el compuesto del ejemplo 1 es 0.32 mg/kg con un intervalo de confianza del 95% delimitado por 0.23 mg/kg y 0.41 mg/kg. El TEC50 para el ejemplo 1 es 0.18 µ? con un intervalo de confianza del 95% delimitado por 0.13 µ? y 0.23 µ?. Estos resultados indican que el ejemplo 1 es un potente inhibidor de c-Met in vivo.

Modelos de tumor de injerto heterólogo Se cultivan células U87MG de glioblastoma humano, células MKN45 de cáncer gástrico humano o células KP4 pancreáticas y se implantan subcutáneamente en el flanco trasero de ratones nu/nu CD-1 hembras las cuales se han aclimatado por una semana en la jaula del animal después de recibirlos del proveedor. Los ratones se seleccionan al azar en grupos de 10 ratones por grupo. Se prepara el compuesto de prueba en un vehículo apropiado y se administra por sonda gástrica oral cuando los tumores se estabilizan (7-21 días después del implante, o cuando el volumen de tumor medio alcanza ~100 mm3). Se determina la respuesta del tumor realizando mediciones del volumen del tumor dos veces a la semana durante el curso del tratamiento. También se monitorean las fluctuaciones en peso corporal como una medición general de toxicidad. El compuesto del ejemplo 1 se administra oralmente dos veces al día por 28 días.

Para análisis estadístico, los volúmenes del tumor del sujeto individual se transforman a volumen log y se analizan con un análisis de mediciones repetidas de dos vías de varianza por tiempo y tratamiento, usando los procedimientos MIXED en software SAS (versión 8.2). El modelo de correlación para las mediciones repetidas es energía espacial. Los grupos tratados se comparan con el grupo control al tiempo de punto final. Los procedimientos MIXED también se usan separadamente para cada grupo de tratamiento para calcular medias ajustadas y errores estándar en cada punto de tiempo. Ambos análisis reportan para la autocorrelación dentro de cada sujeto.

Tabla 1: Eficacia Antitumoral del Ejemplo 1 en injertos heterólogos de glioblastoma U87MG Tabla 2: Eficacia Antitumoral del Ejemplo 1 en injertos heterologos gástricos MKN45 Tabla 3: Eficacia Antitumoral del Ejemplo 1 en injertos heterologos pancreáticos KP4 Estos datos demuestran que el compuesto de la invención inhibe el crecimiento del tumor in vivo.

El compuesto de la invención se ha encontrado por exhibir propiedades in vivo superiores en relación a compuestos estructuralmente relacionados, tal como el ejemplo 25 de WO 2008051808 A2 en adelante "el compuesto de referencia". El compuesto de referencia y el compuesto de la invención tienen pesos moleculares similares y potencia in vitro comparable, la cual está dentro de la relación significante mínima (MSR) así no es diferente estadísticamente (IC50 de c-Met de 0.010 µ? para el compuesto del ejemplo 1 comparado a 0.015 µ? para el compuesto de referencia). El ensayo H460 muestra un IC50 de 0.036 µ? para el compuesto del ejemplo 1 comparado a 0.065 µ para el compuesto de referencia. Para el ensayo H460, los valores de potencia están dentro del MSR y no son estadísticamente diferentes entre sí.

Similarmente, tanto el compuesto del ejemplo 1 como el compuesto de referencia son altamente selectivos para el receptor c-Met. En una selección Cerep de cinasa 99 que emplea el Express Diversity Kinase Profile™, ambos compuestos inhibe únicamente c-Met. El Express Diversity Kinase Profile™ es un servicio de selección desarrollado por Cerep SA (París, Francia). Detalles de condiciones del ensayo y/o información de contacto se pueden encontrar en su sitio de red http://www.cerep.fr/cerep/users/pages/catalog/profiles/catalog.asp).

Sin embargo, comparando frente a frente el compuesto del ejemplo 1 contra el compuesto de referencia muestra que después de 8 horas el compuesto de fórmula I exhibe una ventaja significante en exposición a plasma e inhibición de fosfo cMet en tumores S 114 comparado al compuesto de referencia en estudios de inhibición del tumor in vivo como se muestra en la tabla 4 posterior.

Tabla 4 ** realizado en experimentos separados del estudio frente a frente. *** 16 mg/kg de dosis administrada *** 20 mg/kg de dosis administrada Los resultados anteriores indican que el compuesto del ejemplo 1 produce un efecto farmacodinámico más sostenido (durante 8 horas) comparado al compuesto de referencia. Los datos anteriores sugieren que el compuesto del ejemplo 1 puede ser dosificado menos frecuentemente (por ejemplo BID o régimen diario) mientras el compuesto de referencia puede requerir regímenes de dosificación mucho más frecuentes que pueden engendrar problemas de cumplimiento por el cuidador o el paciente. El análisis de los datos de % de inhibición de fos-Met muestra que la concentración de plasma para ambas dosis (8 mg/kg y 20 mg/kg) del compuesto del ejemplo 1 son estrictamente diferentes comparada a la dosis correspondiente del compuesto de referencia con un valor p de <0.0001. Además, ambas dosis del compuesto del ejemplo 1 son estadísticamente diferentes del grupo vehículo, p <0.0001, y también estadísticamente diferentes entre sí, p = 0.0058. Estos datos se analizan usando análisis de varianza de una vía. La relación de error por experimentación para todas las comparaciones en pares es estrictamente controlada al 5% usando el método de Tukey para pruebas múltiples.

En estudios IVTI, cada compuesto se administra oralmente y se formula en 10% p/v de acacia. Se recolectan muestras de sangre de ratón con anti-coagulante (tubo Vacutainer de punta morada-EDTA) después de la dosis usando técnicas de punción cardiaca. Los tubos se invierten por 3-5 veces y se colocan en hielo hasta la centrifugación a 3000 RPM (1800 x g) por 10 minutos a 4°C para obtener el plasma. Se pipetean alícuotas de plasma y se almacenan en una placa de 96 cavidades limpia. Las muestras de plasma se almacenan inmediatamente a -80°C. Envíos de muestras de plasma se envasan en hielo seco y las muestras se congelan a -80°C hasta el análisis.

Se prepara 0.1 mg/ml de solución base de cada fármaco y serialmente se diluyen en plasma combinado de ratón para preparar estándares que varían de 1 a 5000 ng/ml. Los estándares o muestras de plasma (0.025 mi) en placas de 96 cavidades se tratan por precipitación de proteína con la adición de 0.1-0.2 mi de metanohacetonitrilo (1/1, v/v) que contiene estándar interno. Las mezclas se centrifugan a 4000 rpm a 4°C por 10 minutos y se transfieren alícuotas (0.05 mi) de las fracciones sobrenadantes resultantes a una diferente placa de 96 cavidades. Las muestras y estándares se analizan con un Espectrómetro de Masa Quadrupole API 4000 Triple (Sciex, División of MDS Inc., Toronto, Canadá) acoplado a un sistema HPLC Shimadzu (LC-IOAD, Shimadzu Corporation) y un Automuestreador Gilson 215. Las muestras se inyectan en una columna HPLC de 5 pm de Betasil C18 20 x 2.1 mm Javelin (Thermo Electron Corp. Cat#70105-022106) y se eluyen con un gradiente. Las condiciones cromatográficas consisten de fase móvil A de agua/NH4HC03 1M (2000:10, v/v) y fase móvil B de MeOH/NH4HC03 1 M (2000:10, v/v) que se corre sobre un gradiente de 2.5 minutos a una velocidad de flujo de 1.5 ml/min. Se utiliza una forma de ión positivo con turbo rocío y una temperatura de fuente iónica de 740°C para detección espectrométrica de masa. Se realiza la cuantificación usando monitoreo de reacción múltiple (MRM) en las siguientes transiciones: Ejemplo 1 (m/z 363.05 hasta m/z 163.10) y el compuesto de referencia (m/z 363.05 hasta m/z 163.10). Lotes de regresión lineal de compuestos relaciones de área de pico estándar interno contra concentraciones de fármaco se derivan con 1/x2 Cuadrática.

El compuesto de la presente invención también es significantemente más soluble que el compuesto de referencia.

La solubilidad del Ejemplo 1 y el compuesto de referencia (ejemplo 25 de la publicación 808) se miden colocando una cantidad pequeña de cada una en in vial de vidrio, tapado y haciendo girar el vial durante la noche a condiciones ambientales (8 horas). La media incluye fluido gástrico simulado (SGF) el cual comprende HCI 001N, lauril sulfato de sodio al 0.05% y NaCI al 0.2%; fluido intestinal simulado en ayunas (SIF en ayunas) el cual está compuesto de NaH2P04 29 mM, Na taurocolato 3 mM, iecitina 0.75 mM, NaCI 103 mM y NaOH a pH 6.5; fluido intestina simulado después de la alimentación (SIF después de la alimentación) el cual comprende ácido acético 144 mM, Na taurocolato 15 mM, Iecitina 3.75 mM y NaCI 204 mM y NaOH a pH 5.0; y amortiguadores a pH 4.5, 6, 7.5 los cuales son amortiguadores de fosfato 28-56 mM. Las concentraciones del compuesto se determinan usando HPLC Agilent 1200 (LC5) con un detector UV. La fase móvil usa A (85%) la cual es agua que contiene TFA al 0.1% y B (15%) la cual es ACN a una velocidad de flujo de 1 ml/min y tiempo de corrida de 10 minutos. Se usa la Columna de Zorbax, Bonus-RP (3.5 pm, 4.6 x 75 mm; SN: USTM002428) en los estudios.

Los datos posteriores muestran que el compuesto del Ejemplo 1 es aproximadamente 13 y 14 veces más soluble en el fluido intestinal simulado (SIF) en ayunas y después de la alimentación respectivamente cuando se comparan al compuesto de referencia.

Tabla 5: Solubilidad dinámica mg/ml Solubilidad 2: Selección de Solubilidad Cinética Se usa el ensayo para determinar el intervalo de concentración en el cual un compuesto que se ha pre-solubilizado en DIVISO a 10 mM puede precipitar a partir de una solución. El ensayo se conduce en un formato de selección en una placa de 96 cavidades y mediciones de nefelometría (dispersión de luz) a partir del compuesto precipitado en amortiguador de fosfato acuoso (50 mM; pH 7.4). Este método consiste de una incubación de 2 horas a TA (temperatura ambiente) del compuesto en amortiguador a concentraciones de 10, 20, 40, 60, 80 y 100 µ? (en donde el % de DMSO se mantiene constante). Las placas se leen previamente por el nefelómetro para determinar si raspados o partículas de polvo están presentes y esto se usa para la sustracción antecedente. Los valores reportados son las concentraciones a las cuales el último soluble y el primero insoluble se logran. Estos ensayos no son optimizados para valorar la solubilidad del equilibrio o determinar una solubilidad cinética "verdadera".

Los datos de selección posteriores muestran que el compuesto del Ejemplo 1 es al menos 3 veces más soluble en amortiguador de pH 7.4 cuando se compara con el compuesto de referencia.

Tabla 6 El compuesto de la invención muestra una diferencia significante en los parámetros de farmacocinética comparados con el compuesto de referencia en estudios de biodisponibilidad en rata. El compuesto de la presente invención proporciona una separación en plasma 18 veces inferior y vida media de eliminación terminal 4 veces más después de una dosis intravenosa de 1 mg/kg en formulación de solución. Después de una dosis oral de 10 mg/kg en formulación de suspensión de acacia al 10%, el compuesto de la presente invención proporciona una exposición 57 veces y 93 veces superior medida por la concentración de plasma pico o plasma de área bajo la curva (AUC), respectivamente. La biodisponibilidad oral del compuesto de la presente invención es 65.8% comparado con 14.6% para el compuesto de referencia, un incremento de 4.5 veces.

En estudios de biodisponibilidad en rata, cada compuesto es administrado intravenosamente (IV) u oralmente (PO). La dosificación intravenosa es formulada en una formulación en solución y la dosificación oral es formulada en acacia al 10% en p/v. Se recolectaron muestras de sangre en rata usando tubos de recolección anti-coagulante (EDTA) y se realizó centrifugación para obtener muestras de plasma. Se pipetean alícuotas de plasma y almacenan inmediatamente a <-20°C. Embarques de muestras de plasma se empacan en hielo seco si es necesario y las muestras son congeladas a <-20 °C hasta el análisis.

Se prepara una solución base de cada fármaco y se diluye en plasma de rata combinado para preparar estándares. Los estándares de plasma o muestras son tratados por precipitación de la proteína o extracción líquido-líquido usando solvente orgánico que contiene estándar interno. Las muestras son centrifugadas y alícuotas de las fracciones de sobrenadante resultante son transfectadas. En el caso de precipitación de proteína, el sobrenadante es diluido y analizado usando un Espectrómetro de Masas acoplado a un sistema de HPLC y un automuestreador. En el caso de extracción líquido-líquido, el sobrenadante es secado bajo N2 a 40 °C, reconstituido y analizado usando un Espectrómetro de Masas acoplado a un sistema de HPLC y un automuestreador. La cuantificación se realiza usando monitoreo de reacción múltiple (MRM) y trazos de regresión lineal de compuestos a relaciones de área pico estándar interno contra concentraciones de fármaco.

Tabla 7 *Biodisponibilidad de rata realizada usando sal de mesilato del compuesto del ejemplo 1.

Los datos anteriores muestran que la sal de mesilato del compuesto del ejemplo 1 es más biodisponible que el compuesto de referencia. Además, para propósitos de dosificación oral, los datos disponibles sugieren niveles de exposición similar para la base y formas de sal del compuesto del ejemplo 1.

El compuesto del ejemplo 1 también debe ser formulado y/o administrado en un régimen de combinación con un agente(s) anticancerígeno(s) adecuado(s) u otras terapias adyuvantes. Tales combinaciones pueden estar en la forma de un coctel en donde dosis individuales de diferentes terapias son administradas juntas, secuencialmente o después de intervalos apropiados.

El compuesto de la presente invención es preferiblemente formulado como una composición farmacéutica administrado por una variedad de rutas que incluyen pero no se limitan a oral, rectal, transdermal, subcutánea, intravenosa, intramuscular e intranasal. El compuesto de la presente invención es preferiblemente administrado oralmente o intravenosamente. El compuesto es preferiblemente formulado previo a la administración, la selección de cual ruta usar se hará por el especialista que atiende o cuidador calificado. Muy preferiblemente, una composición del compuesto de la presente invención se formula para administración oral. Una forma de dosificación particularmente preferida del compuesto de la presente invención es una tableta, capleta o cápsula. También se prefiere una formulación sólida de liberación rápida la cual puede ser apropiadamente recubierta o saborizada para mejorar la facilidad de cumplimiento con terapia dependiendo de la edad del paciente o preferencias. En aún otra modalidad preferida, la composición farmacéutica de la presente invención además comprende uno o más agentes terapéuticos adicionales.

Composiciones farmacéuticas y procesos para prepararlas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY (A. Gennaro, et al., eds., 19a ed., Mack Publishing Co., 1995). De este modo, uno de habilidad es capaz de formular el compuesto de la presente invención como un sólido, liquido, intravenoso, depósito subcutáneo, parche transdermal u otra formulación sin experimentación indebida.

El compuesto de la presente invención es en general efectivo sobre un amplio rango de dosificación. Por ejemplo, dosificaciones por día pueden caer dentro del intervalo de aproximadamente 1 mg hasta , aproximadamente 1000 mg de dosis diarias totales, preferiblemente 10 mg hasta 500 mg de dosis diaria total. Más preferiblemente, la dosificación es aproximadamente 50 a 200 mg por día. Muy preferiblemente, la dosificación es aproximadamente 50-80 mg dos veces diariamente (b.i.d). En algunos casos dosis por debajo del límite inferior de los intervalos mencionados anteriormente pueden ser más que adecuadas, mientras en otros casos dosis todavía mayores pueden ser empleadas. Los intervalos de dosis anteriores no están propuestos para limitar el alcance de la invención en cualquier forma. Se entenderá que la cantidad del compuesto de la invención actualmente administrado se determinará por un especialista en vista de las circunstancias relevantes que incluyen la condición a ser tratada, la ruta elegida de administración, los compuestos administrados en caso de un coctel o una terapia de combinación de dosis fija, la edad, peso, respuesta del paciente individual, y la severidad de los síntomas del paciente entre otros factores.

Modelos de Injerto Heterólogo y Tumores Relevantes de c-Met La sobre expresión de c-Met es una característica común para muchos tumores humanos, que incluyen pulmón, mama, colorrectal, gástrico, renal, pancreático, cabeza y cuello (1,2). Las mutaciones que activan c-Met en el dominio cinasa están implicadas como la causa de varios tumores, tales como carcinoma de células renales papilares hereditario, carcinoma hepatocelular en infantes y cáncer gástrico (3-7). Los inhibidores de c-Met de Pfizer demostraron eficacia antitumoral en muchos tumores de injerto heterólogo humano, que incluyen U87MG, GTL16, H441, Caki-1, y PC3 (8).

Referencias 1. Christinsen, JG., Burrows, J., and Salgia, R. Cáncer Letters 225: 1-26, 2005. 2. Birchmeier, C, Birchmeier, W., Gherardi, E., and Vande Woude, GF. Nat Rev Mol Cell Biol 4: 915-925, 2003. 3. Di Renzo, MF., Olivero, M., Martone, T. Et al.

Oncogene 19: 1547-1555, 2000. 4. Lee, JH., Han, SU, Cho, H. et al. Oncogene 19: 4947- 4953, 2000. 5. Ma, PC, Kijima, T., Maulik, G. et al. Cáncer Res 63 : 6272-6281, 2003. 6. Park, WS., Dong, SM., Kim, SY. et al. Cáncer Res 59 : 307-310, 1999. 7. Schmidt, L., Duh, FM., Chen, F., et al. Nat Genet 16: 68-73, 1997. 8. Zou, HY., L¡, Qiuhua., Lee, JH., et al. Cáncer Res 67: 4408-4417, 2007.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Un compuesto de la fórmula o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

2. Una sal de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la sal es la sal de ácido clorhídrico, sal de bisulfato, o sal de ácido metansulfónico.

3. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende el compuesto de conformidad con la reivindicación 1, o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable y uno o más portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables.

4. Un método para tratar cáncer seleccionado de cáncer gástrico, glioblastoma y cáncer pancreático, caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva del compuesto o sal de la invención, a un paciente en necesidad del mismo.

5. El compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 0 reivindicación 2, para uso en terapia.

6. Un compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, para uso en el tratamiento de cáncer gástrico, pancreático, glibolastoma, mama o colorrectal.

7. Uso del compuesto o sal de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, en la manufactura de un medicamento para tratar cáncer seleccionado de cáncer gástrico, cáncer pancreático y glioblastoma.