MX2012015144A - Polipeptido que tiene actividad de acetil-xilan-esterasa y usos del mismo. - Google Patents

Polipeptido que tiene actividad de acetil-xilan-esterasa y usos del mismo.

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Abstract

La invención se refiere a un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un polipéptido variante o polinucleótido variante de la misma, en donde el polipéptido variante tiene por lo menos 82% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2 o el polinucleótido variante que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 82% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEO ID NO: 2. La invención caracteriza la secuencia de codificación de longitud completa del gen novedoso así como también la secuencia de aminoácidos del polipéptido funcional de longitud completa y equivalentes funcionales del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a métodos para usar el polipéptido en procesos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención adecuado para la producción de estas proteínas.

Description

POLIPEPTIDO QUE TIENE ACTIVIDAD DE ACETIL-XILAN-ESTERASA Y USOS DEL MISMO CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a secuencias que comprenden genes que codifican polipéptidos que tienen o ayudan en la actividad de degradación de material de carbohidratos. La invención caracteriza la secuencia de codificación de longitud, completa del gen novedoso asi como también la secuencia de aminoácidos de la proteina funcional de longitud completa, y variantes y fragmentos del gen o la secuencia de aminoácidos. La invención también se refiere a métodos para usar estas proteínas en procesos industriales. También se incluyen en la invención células transformadas con un polinucleótido de acuerdo con la invención adecuado para la producción de estas proteínas. También la invención se refiere a la expresión exitosa de los genes que codifican polipéptidos que tienen actividad de degradación de material de carbohidrato en un hospedero. . El hospedero :puede ser cualquier hospedero adecuado, por ejemplo Aspergillus niger o Talaromyces, por ejemplo, Talaromyces emersonii .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los carbohidratos constituyen ' los compuestos orgánicos más abundantes en la tierra. Sin embargo, muchos de estos carbohidratos se secuestran en polímeros complejos incluyendo almidón . (el carbohidrato de almacenamiento principal en semillas y granos), y una colección de carbohidratos y lignina conocidos como lignocelulosa. Los componentes de carbohidratos principales de lignocelulosa son celulosa, hemicelulosa y pectinas.. Estos polímeros, complejos son- frecuentemente referidos colectivamente como lignocelulosa.
La bioconversión de biomasa lignocelulósica renovable a' un . azúcar fermentable que se fermenta subsecuentemente para producir alcohol (por ejemplo, etanol) como una alternativa a combustibles líquidos ha atraído una atención intensiva de investigadores desde los años 1970, cuando empezó la crisis de petróleo debido a la disminución de la producción de petróleo por OPEC. El etanol se ha usado ampliamente como una mezcla de 10% a gasolina en los Estados Unidos o como un combustible puro para vehículos en Brasil en las últimas dos décadas. Más recientemente, el uso de E85, una mezcla de 85% de etanol se ha implementado especialmente para aplicaciones de ciudad limpia. La importancia del combustible bioetánol -se incrementará en paralelo con- los incrementos en los precios para el petróleo y el agotamiento gradual de sus fuentes. Adicionalmente, azúcares fermentables están siendo usados para producir plásticos, polímeros y otros productos biobasados y se espera que esta . industria crezca sustancialmen.te incrementando por lo tanto la demanda por azúcares fermentables de bajo costo abundantes que se pueden usar como, una materia prima en lugar, de materias primas basadas en petróleo.
El secuestro de tales grandes cantidades de carbohidratos en biomasa vegetal proporciona una ' fuente abundante de energía potencial en la forma de azúcares, . tanto azúcares de cinco, carbonos como de seis carbonos que se podrían usar para . numerosos procesos industriales y agrícolas. Sin embargo, .el enorme, potencial de energía de estos carbohidratos no es usado plenamente debido a que. los azúcares se bloquean ' en los polímeros complejos, y por consiguiente no son fácilmente accesibles para- fermentación. Los métodos que generan azúcares de biomasa vegetal proporcionarían materias primas económicamente competitivas, abundantes para fermentación en químicos, plásticos,' tales como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogas. ¦ A pesar del tipo de materia prima celulósica, el costo y la eficiencia hidrolítica de las enzimas son factores principales que . restringen la comercialización de los procesos de bioconversión de biornasa. Los . costos de producción de las enzimas microbianamente producidas se relacionan estrechamente con una productividad de la cepa productora de enzimas y rendimiento final de actividad en el caldo de fermentación.
A pesar de la investigación continuada de las últimas décadas para entender la degradación de la biomasa lignocelulósica enzimática y la producción de celulasa, sigue siendo deseable descubrir -o diseñar nuevas' celulasas y hemicelulasas altamente activas. También seria altamente deseable construir composiciones enzimáticas altamente eficientes capaces de llevar a cabo la biodegradación rápida y eficiente de los materiales lignocelulósicos, en particular tales celulasas y hemicelulasas que hayan incrementado la termoestabilidad .
Tales enzimas se pueden usar para producir azúcares para fermentación en químicos, plásticos, tales, como por ejemplo ácido succínico y (bio) combustibles , incluyendo etanol, metanol, butanol, combustibles líquidos sintéticos y biogas, para ensilaje, y también como enzima en otros procesos industriales, por ejemplo en las industrias de alimentos o alimenticias, textiles, de. pulpa o papel o detergente y otras industrias.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos que tiene la capacidad · de degradar (es decir ayudar en la. degradación de) , un carbohidrato (por ejemplo polisacáridos) , en particular, lignocelulosa . Los polinucleótidos de la invención codifican típicamente un polipéptido que tiene actividad de acetil-xilari-esterasa .
La invención también proporciona polipéptidos natural y recombinantemente producidos que tienen tal actividad, así como también líneas de células recombinantes que producen tales enzimas. También se proporcionan métodos para hacer y usar los polinucleótidos y polipéptidos de la invención.
De acuerdo con la invención, se proporciona de esta manera un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: .2 o una' secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o un polipéptido variante o polinucleótido variante de la misma, en donde el polipéptido variante tiene por lo menos 82% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2 o el polinucleótido variante que codifica un polipéptido que tiene por lo menos 82% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEO ID NO: 2.
Los polipéptidos de acuerdo' con la invención tienen propiedades favorables, en particular una actividad de degradación de celulosa. En una modalidad, el polipéptido de acuerdo con la invención tiene actividad de acetil-xilan-esterasa (abreviada a.AXE) .
En este punto-, una acetil-xilan-esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la desacetilación de los xilanos y los xilo-oligosacáridos . Este polipéptido puede catalizar la hidrólisis de los grupos acetilo del xilano pplimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo pero, típicamente, no de triacilglicerol . Este polipéptido no actúa típicamente en el mañano o pectina acetilada.
Además los . polipéptidos' pueden ¦ tener una alta termoestabilidad . Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden retener una actividad relativa alta (% de actividad inicial) como de función de tiempo de incubación (h) , por ejemplo 2 horas, 3 horas, 4 horas, cinco horas, seis horas, ocho horas, nueve horas, 10 horas o más, 20 horas o más, 30 horas o más en particular a altas temperaturas,, por ejemplo a 60°C o más a 65°C o más, o a 70°C o más, por ejemplo 8 horas a 65°C o 72 horas a 60°C.
La invención también proporciona un polinucleótido que comprende: (a) la secuencia de nucl ótidps expuesta . en SEQ ID NO: 1; o (b) una secuencia de nucleótidos que se híbrida selectivamente con un polinucleótido que es el. complemento inverso de SEQ ID NO: 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene, por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; o (d) un fragmento de una secuencia de nucleótidos como se define en (a),- (b) o (c) que es por' lo menos aproximadamente 100 nucleótidos en longitud; o (e) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético a una secuencia como se define en cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una ' secuencia de nucleótidos que es. el complemente inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (a), (b) , (c), (d) o (e).
También se proporciona de- acuerdo con la invención un vector, tal como un- vector de expresión, que incorpora una secuencia de polinucleótidos de la invención y una célula que comprende un polipéptido, un polinucleótido o un vector de la invención.
La invención también proporciona: un método para la preparación de un polipéptido que tiene actividad de acetil-xilan-esterasa, el método que comprende cultivar una' célula de la invención- bajo condiciones que permitan la .expresión del polipéptido y, opcionalmente, dé recuperar el polipéptido .expresado; un polipéptido obtenible mediante tal método; y una composición que comprendé: (i) un polipéptido de la invención, y; (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una. pectinasa.
Los polipéptidos de la invención que tienen actividad de acetil-xilan-esterasa se pueden usar en procesos industriales. De esta manera, la . invención proporciona un método, para el tratamiento de un substrato que comprende material de carbohidrato- el método qué comprende poner en contacto el substrato con un polipéptido o una composición de la invención.
En particular, la invención proporciona un método para producir un azúcar o- azúcares . de material lignocelulósico el método que comprende, poner en contacto el material lignocelulósico con un polipéptido o una . composición de la invención.
Los azúcares producidos de esta manera se" pueden usar en un proceso de fermentación. Por consiguiente, la invención proporciona un método para- producir un producto de fermentación, el método que comprende:' producir un azúcar fermentable usando lo descrito en lo anterior, y fermentar el azúcar fermentable resultante, para producir en consecuencia un producto de fermentación.
Un polipéptido . o una composición de la invención también se pueden usar, por ejemplo, en la preparación, de un producto alimenticio, en la preparación' de un detergente, en la preparación de un pienso para animal, en el tratamiento de pulpa o en la fabricación de un papel o en la preparación de una tela o textil o en la limpieza, del mismo.
La invención también proporciona: un matérial procesado obtenible al poner en contacto un material vegetal o material lignocelulósico con un polipéptido o una composición de la invención; un alimento o pienso que comprende un polipéptido- o una composición de la invención; y una planta o una parte de la misma que comprende un polinucleótido, un polipéptido, un vector o una célula de acuerdo con la invención.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA Figura 1: Mapa de pGBTOP para la expresión dé genes en A. niger. Se representa el gen de interés (GOI)- expresado del promotor de glucoamilasa (PglaA). Además, se representa el flanco de glucoamilasa (3'glaA) del cásete de expresión. En esta aplicación un gen de interés es la. secuencia de codificación de TEMER01754 como se define á partir de ahora.
BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS SEQ ID NG: 1 expone la secuencia de codificación de TEMER01754; SEQ ID ÑO: 2 expone la secuencia de aminoácidos de TEMER01754; SEQ ID NO: 3 expone la secuencia señal de TEMER01754; SEQ ID NO: . 4 expone la secuencia de- aminoácidos descrita en la base de datos UniProtKB como E9M3D1; SEQ ID NO: 5 expone la secuencia de codificación de SEQ ID . NO: 4 descrita en la base de datos UniProtKB como HQ185193, creada el .05-04-2011.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Por toda la . presente . especificación y '. las reivindicaciones acompañantes, las palabras "comprenden" e "incluyen" y . variaciones tales como "comprende",. "que comprende", "incluye" y "que incluye" se van a interpretar inclusivamente. Es decir, estas palabras se proponen para llevar la posible conclusión de otros elementos o números enteros no citados específicamente, donde el contexto lo permita .
Los artículos "un" y "una" se usan en este documento para referirse a uno o a más de uno (es decir, a uno o por lo menos uno) del objeto gramatical del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" puede proponer un elemento o más de un elemento.
La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos , por ejemplo enzimas que. tienen la capacidad de . modificar , por ejemplo degradar, un material de carbohidrato. Un material de carbohidrato es un material que comprende, consiste dé o consiste sustancialmente de uno o más carbohidratos. Las enzimas son en este documento una subclase de polipéptidos.
El substrato (también llamado materia prima) en este documento se usa para referirse a una sustancia que comprende material de carbohidrato, que se puede tratar con enzimas de acuerdo con' la invención, de modo que el material de carbohidrato en el mismo se modifica. Además del material de carbohidrato, el substrato puede contener cualquier otro componente, incluyendo pero no limitado a material no de carbohidrato y almidón.
La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican polipéptidos,. por ejemplo, enzimas que tienen la capacidad de modificar, por ejemplo degradar, un material de carbohidrato. Un material de carbohidrato es un material que comprende, consiste de · o consiste esencialmente de uno o más carbohidratos. Las enzimas son en este documento una subclase de polipéptidos .
Típicamente, un polipéptido de la invención codifica un polipéptido que tiene por lo menos actividad de acetil-xilan-esterása, tentativamente llamado TEMER01754, que tiene una secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2, o una secuencia que es uña variante de la misma, típicamente equivalente . funcionalmente al polipéptido que tiene la secuencia de SEQ ID NO: 2, o una secuencia que es un fragmento de cualquierá de los mismos.
En una modalidad, un polipéptido de . la invención puede tener una o más actividades alternativas y/o adicionales diferentes a aquellas de la actividad de acetil-xilan-esterasa y como se menciona en lo. anterior, por ejemplo una de las otras actividades de degradación de carbohidratos y/o hidrolización de carbohidratos mencionadas en este documento.
El carbohidrato, en este contexto incluye · todos los sacáridos, por ejemplo polisacáridps , oligosacáridos , disacáridos o monosacár'idos .
Un polipéptido de acuerdo con la invención puede modificar y/o degradar un material de carbohidrato al degradar químicamente o al degradar físicamente tal material o hidrolizar el carbohidrato. Lo físico incluye ,por ejemplo interrupción de la interacción entre microfibrillas de celulosa y/o abrir la estructura de fibra de-, celulosa. La modificación química del material de carbohidrato . puede dar por resultado la degradación de tal material, por ejemplo por hidrólisis, oxidación u otra modificación química tal como por la acción de una- liasa. La modificación física puede o no ser acompañada por modificación química.
Materiales de Carbohidrato Adecuados Un carbohidrato no de almidón adecuado para -la modificación por un polipéptido de la invención ¦ es lignocelulosa . Los polisacáridos principales que comprenden diferentes residuos lignocelulósieos, que. se pueden considerar como una materia prima renovable potencial, son celulosa (glucanos), hemicelulosas (xilanos, heteroxilanos y xiloglucanos ) . Además, alguna . hemicelulosa puede estar presente como glucomananos, por ejemplo en materias primas derivadas de madera. . La hidrólisis enzimática' de estos polisacáridos a azúcares solubles, por ejemplo glucosa, xilosa-, arabinosa, galactosa, fructosa, mañosa, ramnosa, ribosa, . ácido D-galácturónico ' y otras hexosas y pentosas se presenta bajo la acción, de diferentes enzimas que actúan conjuntamente.
Además, las pectinas y otras sustancias pépticas tales como arabinanos pueden constituir considerablemente la proporción de la masa seca de típicamente las paredes celulares de los te-jidos de la planta no de madera (aproximadamente un cuarto a la mitad de la masa seca pueden ser pectinas) .
La celulosa es un polisacárido lineal compuesto de residuos de glucosa enlazados por enlaces ß-1,4 xilosa. La característica lineal de las fibras de celulosa,, así como también la estequiometria ' de la glucosa ß-enlazada (relativa a a) genera estructuras más propensas a inter-trenzar el enlace de hidrógeno que las estructuras enlazadas a · altamente ramificadas del almidón. De esta manera, los polímeros de celulosa son en general menos solubles, y forman fibras más estrechamente enlazadas que las fibras encontradas en el almidón.
La hemicelulosa es un polímero complejo, y su composición frecuentemente varía ampliamente de organismo a organismo, y de un tipo de tejido a otro. En general, un componente principal de' hemicelulosa es xilosa ß-1,4-enlazada, un azúcar de cinco carbonos. Sin embargo, esta xilosa se ramifica frecuentemente en 0-3 y/u 0-2 y se. puede sustituir con enlaces a arabinosa, galactosa/, mañosa, ácido glucurónico,. ácido galacturónico o por la esterificación al ácido acético (y la esterificación de ácido ferúlico' a arabinosa) . La hemicelulosa también puede contener glucano, que es un término general para azúcares de seis carbonos ß-enlazados (tal como ¦ los ß-(1,3) (1,4) · glucanos y heteroglucanos mencionados previamente) y adicionalmente glucomananos (en los cuales tanto la glucosa como la mañosa están presentes en la cadena principal lineal, enlazadas entre sí por enlaces ß) .
La composición, carácter de sustitución, y grado de ramificación de la hemicelulosa es muy diferente en las plantas dicotiledóneas (dicotiledóneas, es decir, plantas cuya semillas tienen dos cotiledóneas u hojas de semillas tales como habas, cacahuates, almendras, chícharos, frijoles) como son comparadas con las planta monocotiledoneas (monocotiledoneas; . es decir, plantas que tienen una sola cotiledónea u hoja de semilla tales como maíz, trigo, arroz, pastos, cebada).. En la dicotiledóneas, la hemicelulosa está comprendida principalmente de xiloglucanos que son cadenas de glucosa 1, 4-p-enlazadas con. cadenas laterales de xilosilo 1 , ß-ß-enlazadas . . En las monocotiledoneas, incluyendo la mayoría de cultivos de cereales, los componentes principales de la hemicelulosa son los heteroxilanos . Estos están comprendidos principalmente de polímeros de cadena principal de xilosa 1 , 4-^-enlazadós con enlaces 1,3-OÍ a arabinosa, galactosa, mañosa y ácido glucurónico o ácido 4-0-metil-glucurónico asi como también xilosa modificada por ácidos acéticos éster-enlazados .. También presentes están los ß-glucanos comprendidos de cadenas de glucosilo 1,3- y 1,4-ß-enlazadas. En las monocotiledóneas, la .celulosa, heteroxilanos y ß-glucanos pueden estar presentes en aproximadamente cantidades iguales, comprendido cada uno a aproximadamente 15-25% del material seco de las . paredes celulares. También, las diferentes plantas pueden comprender diferentes cantidades de, y diferentes composiciones de, sustancias pépticas. Por ejemplo, la remolacha azucarera contiene aproximadamente 19% de pectina y aproximadamente 21% de arabinano sobre una base de peso seco.
Por consiguiente, una composición de la invención se puede adaptar en vista de la materia particular (también llamada substrato que se va a usar. Es decir, el espectro de actividades en una composición de la invención puede variar dependiendo de la materia prima en cuestión.
Las combinaciones enzimáticas o tratamientos físicos se pueden administrar concomitante o secuencialmente . Las enzimas se pueden producir · ya sea exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego aislarse y agregarse a la materia prima lignocelulósica . - Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de masa celular crudo, o material, vegetal (tal como rastrojo de maíz) , y similares se agregan a la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o el medio de producción enzimático o el material vegetal se pueden tratar para prevenir el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante calentamiento o adición de agentes antimicrobianos) , luego agregar a la ' materia prima. Estas mezclas enzimáticas crudas pueden incluir , el organismo que produce la enzima. Alternativamente, ; la enzima se puede producir en una fermentación que usa materia prima (tal como rastrojo de maíz), para . producir nutrición a un organismo que produce una enzima (s). De esta manera, las plantas que producen las enzimas pueden servir como la materia prima lignocelulosica y se agregan en la materia prima lignocelulosica.
Actividad Enzimatica Las endo-1, 4-p-glucanasas (EG) y exo-celobiohidrolasas (CBH) catalizan la hidrólisis de la celulosa insoluble a celooligosacáridos (celobiosa como un producto principal) , mientras que las ß-glucosidasas (BGL) convierten los oligosacáridos, principalmente celobiosa y celotriosa a glucosa.
Las xilanasas juntas con otras enzimas -auxiliares , por ejemplo a-L-arabinofuranosidasas, . feruloilo y acetilxilan-esterasas, glucuronidasas, y ,ß-xilosidasas ) catalizan la hidrólisis de parte de las hemicelulosas.
Las sustancias pépticas incluyen pectinas, arabinanos, galactanos y arabinogalactanos . Las pectinas son los polisacáridos más complejos en la pared celular .de la planta. Se construyen alrededor de una cadena, principal de unidades de ácido D-galacturónico a- ( 1, 4 ) -enlazado intercaladas a algún grado con L-ramnosa. En cualquier- pared celular existe una variedad de unidades estructurales que se ajustan a esta descripción y se han considerado en general que en una sola molécula péptica, las cadenas principales de diferente unidades estructurales son continuas entre si.
Las pectinasas incluyen, por ejemplo una endo-poligalacturonasa, una pectin-metil-esterasa, una ' endo-galactanasa, una béta-galactosidása, una pectina-acetil-esterasa, una endo-pectin-liasa, péctato-liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galactur'onasa, una expoligalacturonato-liasa, una ramnogalacturonan-hidrolasa, : una ramnogalacturonan^-liasa, una . ramnogalacturonan-acetil-esterasa, una . ramnogalacturonan-galacturonhidrolasa, una xilogalacturonasa, una a-arabinofuranosidasa .
Los tipos principales de la unidad estructural son: galacturonano (homogalacturonano) , que se puede sustituir . con metanol en el grupo carboxilo y acetato en 0-2 y 0-3; ramnogalacturonano I (RGI), en el cual las · unidades de ácido galacturónico alternan con las unidades ramnosa' que llevan galactano ( 1 , 4) -enlazado y cadenas laterales de arabinano ( 1 , 5) -enlazadas . Las cadenas laterales de arabinano se pueden unir directamente a ramnosa o indirectamente a- través de las cadenas de galactano; xilogalacturonano, con unidades xilosilo individuales en 0-3 ¦ de ácido galacturónico (estrechamente asociado con RGI) ; y ramnogalacturonano II (RGII) , una unidad menor particularmente completa que contiene azúcares inusuales, por ejemplo apiosa. Una unidad RGII puede contener dos residuos de apiosilo que, bajo condiciones iónicas adecuadas, puede formar reversiblemente ásteres con borato..
Como se expone en lo anterior, un polipéptido de la invención tendrá típicamente actividad de acetil-xilan-esterasa. Sin embargo, un polipéptido de la invención puede tener una o más de las actividades expuestas en lo anterior además de o alternativas a aquella actividad. También, una composición de la invención como se describe en este documento puede tener una o . más . de las actividades mencionadas en lo anterior además de aquellas proporcionadas por un polipéptido de la invención que tiene actividad de acetil-xilan-esterasa .
Secuencia de polinucleótidos La invención proporciona secuencias de polinucleótidos genómicos que comprenden el gen que codifica el TEMER01754 asi como también su secuencia de codificación. Por consiguiente/ la invención se refiere a un polinucleótido aislado que comprende la secuencia de nucleótidos genómicos de acuerdo con la secuencia de nucleótidos de codificación de acuerdo con SEQ ID NO: 1 y a variantes, tales como equivalentes funcionales, de cualquiera de las mismas. Un ejemplo un polipéptido variante de acuerdo con- la invención es SEQ ID NO: 4.
En particular, . la invención se refiere a un polinucleótido aislado que es capaz de hibridar selectivamente, por ejemplo bajo condiciones rigurosas, de manera preferente bajo condiciones altamente rigurosas, con el complemento inverso de un polinucleótido que comprende la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 1.
Más específicamente, · la invención se refiere a un polinucleótido que comprende o que consiste esencialmente de una secuencia de nucleótidos de acuerdo con SEQ ID NO: 1. Otra secuencia de polinucleótidos de acuerdo con la invención es SEQ ID NO: 5.
La invención también se refiere a un polinucleótido asilado que comprende o que consiste esencialmente de una secuencia que codifica por lo menos un dominio funcional de un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2 o una variante de la misma tal como un equivalente funcional, o fragmento de cualquiera de los mismos.
Como se usa en este documento, los términos "gen"' y "gen recombinante" se refieren a moléculas de ácido nucleico que se pueden aislar de DNA cromosómico, que incluye un marco de lectura abierto que codifica una proteína, por ejemplo la proteína acetil-xilan-esterasa de acuerdo con la presente invención.
Un gen puede incluir secuencias de codificación, secuencias no de codificación, intrones y/o secuencias reguladoras. Por otra parte, el término "gen" puede¦ referirse a una molécula de ácido nucleico aislada como se define en este documento.
Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, tal como una molécula de ácido nucleico. que tiene la secuencia de nücleótidos de SEQ ID NO: 1 o' una variante del mismo, tal como un equivalente funcional, se puede aislar usando técnicas de biología molecular estándares y la información de secuencia proporcionada en este documento. Por ejemplo, usando todos o una porción de la secuencia de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 1 como una sonda de hibridación, las moléculas de ácido nucleico de acuerdo con la' invención se pueden aislar, usando técnicas de hibridación y clonación estándares (por ejemplo, como se describe por Sambrook, J. , Fritsh, E .. F. , and Maniatis, T. Molecular ' Cloning: A Laboratory Manual .2nd, ed., · Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.) .
Por otra parte, una molécula de ácido nucleico que abarca todo o una porción de SEQ ID N0:1 se puede aislar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótido sintéticos diseñados con- base en la información de secuencia contenida en SEQ ID NO:' 1.
Un ácido; . nucleico de la invención se ¦ puede amplificar usando cDNA, mRNA o alternativamente, DNA genómico, como una plantilla- y cebadores de oligonucleótidos apropiados de acuerdo con las técnicas de amplificación de PCR estándares. El ácido nucleico de esta manera amplificado se puede clonar en un vector apropiado y se caracteriza por análisis de secuencia de DNA.
Adicionalmente, los ' oligonucleótidos que corresponden a o son hibridizables a una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención se pueden preparar mediante técnicas sintéticas estándares, por ejemplo, usando un sintetizador de DNA automatizado.
En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislado de la invención comprende la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO:. 1.
En otra modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es el complemento inverso de la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 o una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de tal secuencia de nucleótidos.
Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a otra secuencia de nucleótidos es . una que es suficientemente complementaria a la otra secuencia de nucleótidos tal que puede hibridarse a la otra secuencia de nucleótidos formando en consecuencia un dúplex estable.
Un aspecto de - la invención sé refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican un polipéptido de la invención o una variante, tal como un equivalente funcional del mismo, por ejemplo un fraqmento o dominio biológicamente activo, asi como . también moléculas de ácido nucleico suficientes para el uso como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido ' nucleico que codifican un polipéptido de la invención y fragmentos de tales moléculas de ácido nucleico adecuadas para el uso como cebadores PCR para la amplificación o mutación de las moléculas- de ácido nucleico.
Un polinucleótido de acuerdo con la invención se puede "aislar". En el contexto de esta invención, un "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" es un DNA o RNA que no está inmediatamente contiguo con una o ambas de las secuencias de codificación con las cuales está inmediatamente contiguo (uno en el extremo 5' y uno en el extremo 3') en el genoma ' de origen natural de origen natural del organismo del cual se deriva. De esta manera, en una modalidad, un ácido nucleico aislado incluye algo o todo de la secuencia no de codificación 5' (por ejemplo promotor) que están inmediatamente contiguas a la secuencia de codificación. El término incluye, por lo tanto, por ejemplo, un DNA recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido autónomamente- de replicación o virus, o en el DNA genómico de un pro.cariota o eucariota, o que existe como una molécula separada (por ejemplo, un cDNA o un fragmento de DNA genómico producido por PCR o tratamiento de endonucleasa de restricción) independiente de . otras secuencias. También incluye un DNA recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material viral, o medio de cultivo (cuando se produce por técnicas de DNA recombinante), o precursores químicos u otros químicos (cuando se sintetiza químicamente) . Por otra parte, un "fragmento de ácido nucleico aislado" es un fragmento de ácido nucleico que no es de origen natural como un fragmento y no se encontraría en el estado natural.
Como se usa en este documento, los términos "polinucleótido" o. "molécula de ácido nucleico" .se proponen para incluir moléculas de DNA (por ejemplo,' cDNA o DNA genómico) y moléculas de RNA (por ejemplo, mRNA) y análogos del DNA o RNA generados usando análogos de nucleótidos. La molécula de ácido nucleico puede ser de hebra individual o de doble hebra, pero de manera preferente es DNA de doble hebra. El ácido nucleico se puede sintetizar usando análogos o derivados de oligonucleotidos (por ejemplo, nucleótidos de inosina o fosforotioato) . Estos oligonucleotidos se pueden usar, por ejemplo, para preparar ácidos nucleicos que tienen alteradas las capacidades de apareamiento de bases o resistencia incrementada a nucleasas.
Otra modalidad de la invención proporciona una molécula de nucleico aislada que es antisentido a una molécula de ácido nucleico TEMER01754, por ejemplo, la hebra de codificación de · una molécula de ácido nucleico TEMER0175 . También se incluyen dentro del alcance de la invención las hebras complementarias de las moléculas de ácido nucleicos descritos en este documento. · A menos que se indique de otra manera, todas las secuencias de nucleótidos determinadas por la secuenciación de una molécula de DNA en este documento se determinaron usando un secuenciador de DNA automatizado y todas las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos codificados por las moléculas de DNA determinadas en este documento se predijeron por la traducción de una secuencia de DNA determinada como lo anterior. Por lo tanto, como es sabido en la técnica por cualquier secuencia de DNA determinada por este procedimiento automatizado, cualquier secuencia de nucleótidos determinada en este documento puede contener algunos errores. Las secuencias de nucleótidos determinadas por la automatización son típicamente por lo menos aproximadamente .90% idénticas, más típicamente de por lo menos aproximadamente 95% a por lo menos aproximadamente 99.9% idénticas a la secuencia de nucleótidos actual de la molécula de DNA secuenciada.
La secuencia actual se puede determinar más precisamente por. otros, procedimientos incluyendo métodos de secuenciación de DNA manuales bien conocidos en la técnica. Como también es sabido en la técnica, una inserción o supresión individual en una secuencia de nucleótidos determinada comparada con la secuencia actual provocará un cambio de marco en la traducción de la secuencia de nucleótidos tal que la secuencia de aminoácidos predicha 21 codificada por una secuencia de nucleótidos determinada será completamente diferente de la secuencia de aminoácidos actualmente codificada por la molécula de DNÁ secuenciada, comenzando en el punto de tal inserción' o supresión.
La persona experta en la técnica . es · capaz de identificar tales bases erróneamente identificadas y sabe cómo corregir tales errores. ' .
Una molécula de ácido . nucleico . de acuerdo con la invención puede comprender solamente una porción o un fragmento de la secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEQ ID NO: 1 (o de una variante de cualquiera de las mismas), por ejemplo un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una porción de un polipéptido TEMER01754.
La secuencia de nucleótidos determinada de la clonación del gen TEMER01754 y cDNA permite la generación de sondas y cebadores diseñados para el uso en identificar y/o clonar otros miembros de la familia TEMER0175 , asi como también homólogos de TEMER.01754 de otras especies.
La sonda/cebador comprende típicamente un oligonucleótido sustancialmente purificado que comprende típicamente una región de la secuencia de nucleótidos que se híbrida de manera preferente bajo condiciones altamente rigurosas a por lo menos de aproximadamente 12 a aproximadamente 15,. de manera preferente de aproximadamente 18 a aproximadamente 20, de manera preferente de aproximadamente 22 a aproximadamente 25> de manera más preferente de aproximadamente 30, aproximadamente 35, aproximadamente 40, aproximadamente 45, aproximadamente 50, aproximadamente 55, aproximadamente 60, aproximadamente 65, o aproximadamente 75 o más nucleótidos consecutivos de una secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: l o de una variante, tal como un equivalente funcional, de cualquiera de los mismos.
Las sondas basadas en . la secuencias de nucleótidos TEMER01754 se pueden ' usar para detectar transcriptos o secuencias TEMERÓ1754 genómicas que codifican los mismo polipéptidos u homólogos por ejemplo en; otros organismos. En modalidades preferidas,, la sonda comprende además un grupo de etiquetado unido a la misma, por ejemplo, el . grupo de etiquetado puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un cofactor de enzimas. Tales sondas también se pueden usar como parte de un kit de prueba de diagnóstico para identificar células que expresen un polipéptido, TEMER01754..
Los polinucleótidos en este punto pueden ser polinucleótidos sintéticos. Los polinucleótidos sintéticos se pueden optimizar en el uso de codón, de manera preferente de acuerdo con los métodos descritos en W02006/077258 y/o PCT/EP2007/055943, que se incorporan en este documento a manera de referencia. El documento PCT/EP2007/055943 trata la optimización del codón de par. La optimización de codón de par es un método en donde las secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido se han modificado con' respecto a. su codón de uso, en particular los codones de pares que se usan, para obtener una expresión mejorada de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido y/o producción mejorada de polipéptido codificado. Los codones ' de pares se definen como un conjunto de dos tripletos subsecuentes (codones) en una secuencia de codificación.
La invención se refiere además a un constructo de ácido nucleico que comprende él polinucleótido como se describe en lo anterior. "Constructo de ácido nucleico" se define, en este documento como una molécula de ácido nucleico, ya sea de hebra individual o doble hebra, que se aisla de un gen de origen natural o que se ha modificado para contener segmentos de ácido nucleico que se combinan y yuxtaponen de una manera que de otra manera no existirían en la naturaleza. El término "constructo de ácido nucleico" es sinónimo con el término "cásete de expresión" cuando el constructo de ácido nucleico contiene todas las secuencias de control requeridas para la expresión de. una secuencia de codificación. El término "secuencia de. codificación" como se define en este documento es una secuencia, que sé transcribe en el mRNA y se traduce en un activador transcripcional de un promotor de proteasa de la invención. Los limites de la secuencia de codificación se determinan generalmente por el codón de inicio ATG en el extremo 5' del mRNA y una . secuencia de codones de detección de traducción terminando en el marco de lectura abierto en el extremo 3' del mRNA. Una secuencia de codificación puede incluir, pero no se limita a, DNA, cDNA, y secuencias de ácido nucleico recombinantes . De manera preferente, el ácido nucleico tiene alto contenido de GC. El contenido de GC en este documento indica el número de nucleótidos G y C en el constructo, divididos por el número total de nucleótidos, expresado en %. El contenido de GC es de manera preferente 56% o más, 57% o más, 58% o más, 59% o más, 60% o más, o en el intervalo de 56-70% o el intervalo de 58-65%.
De manera preferente, el constructo de DNA comprende una secuencia de DNA promotora, una secuencia de codificación en asociación operativa con la secuencia de DNA promotora y secuencias de control tales como: una secuencia de terminación . traduccional orientada en 5' hacia la dirección 3' seleccionada de la siguiente lista de secuencias: TAAG, TAGA y TAAA, de manera preferente TAAA, y/o ¦ - una secuencia de codificación iniciadora traduccional orientada en 5' hacia la dirección 3' seleccionada de la . siguiente lista de secuencias: GCTACCCCC; GCTACCTCC; GCTACCCTC; GCTACCTTC; GCTCCCCCC; GCTCCCTCC; GCTCCCCTC; GCTCCCTTC; GCTGCCCCC; GCTGCCTCC; GCTGCCCTG; GCTGCCTTC; GCTTCCCCC; GCTTCCTCC; GCTTCCCTC; y GCTTCCTTC, de manera preferente GCT TCCTTC, y/o una secuencia iniciadora traduccional seleccionada de. la siguiente lista de secuencias: 5'-mwChkyCAAA-3 ' ; . 51 -mwChkyCACA-31 o 5 ' -mwChkyCAAG-3 ' , usando códigos de ambigüedad para los nucleótidos: m (A/C) w (A/T) ; y (C/T) ; k (G/T) ; h (A/C/T) , de manera preferente 5'- CACCGTCAAA-3 ' o 5 ' -CGCAGTCAAG-3 ' .
En el contexto de esta invención, el término "secuencia de codificación iniciadora traduccional" se define como los nueve nucleótidos inmediatamente cadena abajo del codón iniciador o de inicio del marco de lectura abierto de una secuencia de codificación de DNA. El codón iniciador o de inicio codifica la AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, pero también puede ser cualquier codón de inicio funcional tal como GTG.
En el contexto de esta- invención., el término "secuencia de terminación traduccional" se define como los cuatro nucleótidos que comienzan desde el codón de detección traduccional en el extremo 3' del marco de lectura, abierto, o la secuencia de codificación de nucleótidos orientado en 5' hacia la dirección 3' . .
En el contexto de esta invención, el término "secuencia iniciadora traduccional" se define como los diez nucleótidos inmediatamente cadena arriba del codón iniciador o de inicio del marco de lectura abierto de una 'secuencia de DNA que codifica un polipéptido .. · El codón iniciador o de inicio codifica la AA metionina. El codón iniciador es típicamente ATG, · pero también puede ser cualquier codón de inicio funcional tal como GTG. Es bien sabido en la técnica que el uracilo U, reemplaza el desoxinucleótido de timina, T, en RNA.
Homología e identidad Las secuencias de aminoácidos o nucleótidos se dice que son homologas cuando muestran un cierto nivel de similitud. Dos secuencias que son homologas indican un origen evolucionarlo común. Si dos secuencias homologas se relacionan estrechamente o' se relacionan más distantemente es indicado por "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", que es alto o bajo respectivamente. Aunque disputado, para indicar "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud", "nivel de homología"' o "porcentaje de homología" se . usan frecuentemente de · manera intercambiable.
Los términos "homología", "porcentaje ' de homología", "porcentaje de identidad" o "porcentaje de similitud" se usan intercambiablemente en este documento. Para el propósito de esta invención, se define en este documento que a fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de aminoácidos o de dos secuencias de ácidos nucleicos, las secuencias completas se alinean para propósitos de comparación óptimos. A fin de. optimizar . el alineamiento, entre · las dos secuencias se pueden introducir espacios en cualquiera de las dos secuencias qué son comparadas. Tal alineación se lleva a. cabo sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Alternativamente, la alineación se puede llevar a cabo sobre una longitud más corta, por ejemplo sobre . aproximadamente 20, áproximadamente 50, aproximadamente 100 o más ácidos nucleicos/basados o aminoácidos. La identidad es el porcentaje de igualaciones idénticas entre las dos secuencias sobre la región alineada reportada.
Una comparación de las secuencias y determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se puede lograr usando un algoritmo matemático. La persona, experta se percatará del hecho de que varios, programas de computadora diferentes están disponibles para alinear dos secuencias y determinar la homología entre las dos secuencias (Kruskal, J. B. (1983) An overview of sequence comparison In D. Sankoff and J. B. Kruskal, (ed. ) , Time warps, string edits and macromolecules : the theory and practice of sequence comparison, páginas 1-44 Addison Wesley) . El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos se puede determinar usando el algoritmo de Needleman y Wunsch para la alineación de dos secuencias . (Needleman, S. B. y Wunsch, C. D. (1970) J. Mol. ,Biol. 48, 443-453) . El algoritmo alinea las secuencias de aminoácidos así como también las secuencias de nucleótidos. El algoritmo de Needleman-Wunsch se ha complementado en. el programa de computadora NEEDLE. Para el propósito de esta invención se usó el programa NEEDLE del paquete EMBOSS (versión 2..8.0 o mayor, EMBOSS: The European Molecular Biology Opén Software Suite (2000) Rice, P. Longden, I. and Bleasby, A. Trends in Genetics 16, (6) páginas p 276-277, http://ernboss.bioinformatics.nl/) . Para secuencias de polipéptido, el BLOSUM62 se usó para la matriz de sustitución. Para secuencias de nucleótidos, se usa el EDNAFULL. Se pueden especificar otras matrices. Los parámetros opcionales usados para la alineación de las secuencias de aminoácidos son una penalizacion de espacio abierto de 10 y una penalizacion de extensión de . espacio de 0.5. La persona experta apreciará que todos estos parámetros diferentes producirán resultados ligeramente diferentes pero el porcentaje de identidad total de las dos secuencias no se altera significativamente cuando se usan . diferentes algoritmos.
Definición de la Homología Global La homología o identidad es el porcentaje de igualaciones idénticas entre las -dos secuencias completas sobre la región alineada total incluyendo cualquiera de los espacios o extensiones. La homología o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: el ' número de las posiciones correspondientes en la alineación que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación incluyendo los espacios. La identidad definida como en este documento se puede obtener de NEEDLE y se etiqueta en la salida del programa como " IDENTITY" .
Definición de Identidad Más Larga La homología- o identidad entre las dos secuencias alineadas se calcula como sigue: número de posiciones correspondientes en la alineación que muestra un aminoácido idéntico en ambas secuencias dividido por la longitud total de la alineación después de la resta del número total de espacios en la alineación. La identidad definida como en este documento se puede obtener de NEEDLE al usar la opción NOBRIEF y se etiqueta en la salida del programa como "identidad más larga". Para propósitos de la invención el nivel de identidad (homología) entre, las dos- secuencias (aminoácidos o. nucleótido) se calcula de acuerdo con la definición e "identidad más larga" como se puede llevar a cabo al usar el programa NEEDLE.
Las secuencias de polipéptidos de la presente invención se pueden usar adicionalmente como una "secuencia de consulta" para llevar a cabo una búsqueda contra las bases de datos de secuencia, por ejemplo para identificar otros miembros de familia o secuencia relacionadas. Tales búsquedas se pueden llevar a cabo usando los programas BLAST. El Software para llevar a cabo los análisis BLAST está públicamente disponible a través del Centro Nacional para Información de Biotecnología (httg : //www . ncbi . nlm. ni . gov) . El BLASTP se usa para las secuencias de aminoácidos y el BLASTN para secuencia de nucleótidos. El programa BLAST usa como omisiones: - Costo para el espacio abierto: omisión = 5 para nucleótidos/ 11 para polipéptidos - Costo al espacio extendido: omisión = 2 para nucleótidos/ 1 para polipéptidos - Penalización para la desigualdad de nucleótidos: omisión = -3 - . Bonificación para la igualación de nucleótido: omisión = 1 - Valor esperado : omisión = 10 - Tamaño de palabra: omisión = 11 para nucleótidos/ 28 para megablast/ 3 para polipéptidos Adicionalmente . el grado de identidad local (homología) entre, la. consulta de la. secuencia de aminoácido o la consulta de. . la secuencia de ácido nucleico y ' las secuencias homologas recuperadas se determinan por el programa BLAST . Sin embargo se comparan solo aquellos segmentos de secuencia que proporcionan una igualación arriba de un cierto umbral. Por consiguiente el programa calcula la identidad solo para estos segmentos de igualación. Por lo tanto la identidad, calculada de esta manera es referida como identidad local.
Hibridación Como se usa en este documento, el término "hibridar selectivamente", "híbrida selectivamente" ' y términos similares se proponen para describir condiciones para hibridación y lavado bajo lo cual las secuencias de nucleótidos por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%,, por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por ' lo menos aproximadamente 75%, por lo menos aproximadamente 80%, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 85%, de manera aún más preferente de por lo menos aproximadamente 90%, de manera preferente por lo menos 95%, de manera más preferente por lo menos aproximadamente 98% o de manera más preferente por lo menos aproximadamente 99% homologas, entre si permaneciendo típicamente hibridadas entre sí. Es decir, tales secuencias de hibridación pueden compartir por lo menos aproximadamente 50%, por lo menos aproximadamente 55%, por lo menos aproximadamente 60%,' por lo menos aproximadamente 65%, por lo menos aproximadamente 70%, por lo menos aproximadamente 75%, por lo , menos aproximadamente 80%, de manera más preferente- por lo menos aproximadamente 85%, de manera aún más preferente por lo menos aproximadamente 90%, de manera más preferente por lo menos 95%, de manera más preferente por lo menos 98% o de manera más preferente por lo menos aproximadamente 99% de identidad de secuencia.
Un ejemplo . no limitante,' preferido de tales condiciones de hibridación en las hibridación en cloruro de sodio/citrato de sodio 6X (SSC) en aproximadamente 45°C, seguido, por una o . más lavadas en 1 X SSC, 0.1% de SDS en aproximadamente 50 °C, de manera preferente a aproximadamente 55°C, de manera preferente a aproximadamente 60°C y. de manera aún más preferente de a aproximadamente 65°C.
Las condiciones ' altamente rigurosas incluyen, por ejemplo, hibridación a aproximadamente 68 °C en solución de 5x SSC/5x Denhardt 11.0% de SDS y lavado en SSC 0.2x/0.1% de SDS a temperatura ambiente. Alternativamente, el lavado se puede llevar -a cabo a 42 °C.
El técnico experto sabrá qué condiciones aplicar para las condiciones de hibridación rigurosas y altamente rigurosas. La guia adicional con respecto a tales condiciones es fácilmente leíble en la técnica, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores., 1989, Molecular Cloning, A .¦ Laboratory Manual, Cold Spring Har'bor Press, N.Y.; and Ausubel y colaboradores, (éds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.).
Por supuesto, un polinucleótido que se híbrida únicamente a una secuencia poli A (tal como el tracto poli (A) 3' terminal de los mRNAs) , o a un estiramiento complementario de residuos T (o U). , no se incluiría en un polinucleótido de la invención usado para hibridarse específicamente a una porción de un ácido nucleico de la invención, puesto que tal se hibridaría a cualquier molécula de ácido nucleico que contenga un estiramiento poli (A) o el complemento del mismo (por ejemplo, prácticamente cualquier clon de cDNA de doble hebra ) .
En un procedimiento típico., las bibliotecas de cDNA construidas de otros organismos., por ejemplo un hongo filamentoso, en particular de la familia de microorganismos Trichomaceae, por ejemplo del género Penicillium se puede clasificar tal como Penicillium decumbens .
Por ejemplo, . las cepas de Penicillium se pueden clasificar para polinucleótidos TEMER01754 homólogos ' por el análisis Northern blot. En la detección de los transcriptos homólogos a los polinucléótidos de acuerdo con · la invención, las bibliotecas de cDNA se pueden construir a partir de RNA aislado de la cepa apropiada, usando técnicas estándares bien conocidas por aquellas personas expertas en el campo. Alternativamente, una biblioteca ' de DNA genómico total se puede clasificar usando una sonda capaz de hibridarse a un polinucleótido TEMER01754 de acuerdo con la invención.
Las secuencias de genes homólogos se pueden aislar, por ejemplo, al llevar a cabo la PCR usando dos agrupamientos de cebadores de oligonucleótido degenerados diseñados sobre la base de las secuencias nucleótidos como enseñó en este documento .
La plantilla para la reacción puede ¦ ser cDNA obtenido mediante transcripción inversa de mRNA preparado de cepas conocidas o sospechadas que expresan un polinucleótido de acuerdo con la invención. El producto de PCR se puede subclonar y secuénciar para asegurar que las secuencias amplificadas representen las secuencias de una nueva secuencia de ácidos nucleicos TEMER01754, o un equivalente funcional de la misma.
El fragmento de PCR luego se puede usar para aislar un clon de cDNA . de longitud completa por una variedad de métodos conocidos. Por ejemplo, el fragmento amplificado se puede etiquetar y usar para clasificar- una biblioteca de bacteriófagos o cDNA cósmido. Alternativamente-, el fragmento etiquetado se puede usar para clasificar una biblioteca genómica .
La tecnología de PCR también se puede usar para aislar secuencias de ¦ cDNA de longitud completa de otros organismos. Por ejemplo, el RNA se puede aislar, siguiendo los procedimientos estándares, de una fuente celular o de tejido apropiada. Una reacción de transcripción inversa se puede llevar a cabo en el RNA usando un cebador de oligonucleótido especifico para la mayoría del extremo 5' del fragmento amplificado para el cebado de la primera síntesis de hebra.
El híbrido RNA/DNA resultante luego se puede "atar" (por ejemplo, con guaninas) usando una reacción, de transferasa terminal estándar, el híbrido se puede digerir con RNasa H, y la segunda síntesis de hebra luego se puede cebar (por ejemplo,·. con un cebador poli-C) . De esta , manera, las secuencias de cDNA cadena arriba del fragmento amplificado se puede aislar fácilmente. Para una revisión de estrategias de clonación útiles, véase por ejemplo, Sambrook y colaboradores.,' supra; y Ausubel y colaboradores ., supra . ·'.
Vectores Otros aspecto de la invención se refiere a vectores, incluyendo vectores de clonación y expresión, que comprenden un polinucleótido de la invención que' codifica un polipéptido TE ER01754 o . un equivalente funcional del mismo y método para desarrollar, transformar o transfectar tales vectores en una célula hospedera adecuada, por ejemplo bajo condiciones en las cuales la expresión de un polipéptido de la invención se presenta. Comó se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula . de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al cual, se ha enlazado .
Los pplinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector replicable recombinante,' por ejemplo un vector de clonación o expresión. El vector se puede usar para replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. De esta manera en una modalidad adicional, la invención proporciona un método para hacer polinucleótidos de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vector replicable, introducir el vector en una célula hospedera compatible, y desarrollar la célula hospedera bajo condiciones que llevan a cabo la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula hospedera. Las células hospederas adecuadas se describen- a continuación.
El vector en el cual el cásete de expresión o polinucleótido de la invención se inserta puede ser cualquier vector que se pueda someter convenientemente a procedimiento de DNA recombinante, y la elección del vector dependerá frecuentemente en. la célula hospedera en la cual se va a introducir.
Un vector de acuerdo con la invención puede ser un vector autónomamente de replicación, es decir un vector que existe como una entidad extracromosómica, la replicación de la cual es independiente de la replicación cromosómica, por ejemplo un plásmido. Alternativamente, el vector puede ser uno que, cuando se introduce en una célula hospedera, se integra en el genoma de la célula hospedera y se replica junto con el cromosoma (s) en el cual se ha integrado.
Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un rizo de DNA de doble hebra circular en el cual los segmentos de DNA adicionales se pueden ligar. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde los. segmentos del DNA adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Ciertos vectores son capaces de replicación- autónoma en una célula hospedera en la cual . se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen bacteriano de replicación y vectores de mamífero episomales ).. Otros vectores (por ejemplo vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedera y la introducción en la célula hospedera, y por consiguiente se replican junto con el genoma hospedero. Por otra parte, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de los genes a los cuales se enlazan operablemente. Tales vectores son referidos en este- documento como "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de DNA recombinante están frecuentemente en la forma de plásmidos. Los términos "plásmido", "vector" se pueden usar intercambiablemente .en este documento ya. que él plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención se propone para incluir tales otras formas de vectores de expresión, tales como cósmido, vectores virales (por ejemplo, retrovirus defectuosos de replicación, adenovirus y virus adenoasociados, y vectores fago que sirven funciones equivalentes.
Para la mayoría de hongos filamentosos y levaduras, el vector o constructo de expresión se integra -de manera preferente en el genoma de la célula, hospedera a fin de obtener transformantes estables. Sin embargo, para ciertas levaduras también los vectores episomales adecuados son disponibles en los cuales el constructo de expresión se puede incorporar para la expresión de nivel estable y alto, ejemplos de los mismos incluyen vectores derivados de los plásmidos 21-J y. pKDl de Saccharo yces y Kluyveromyces, respectivamente, . o vectores que contienen una secuencia AMA (por ejemplo AMAl de Áspergillus). En caso de que los constructos de expresión se integren en el genoma de la célula hospedera, los constructos se integran ya sea en sitios aleatorios en el genoma, o en sitios objetivos predeterminados usando recombinación homologa, en cuyo caso los sitios objetivos comprenden .de manera preferente un gen altamente expresado.
Por consiguiente, los vectores de expresión útiles en la presente invención incluyen vectores cromosómicos , episomales y derivados de virus por ejemplo vectores derivados de plásmidos bacterianos, bacteriófago, episoma de levadura, elementos cromosómicos de levadura, virus tales como baculovirus, virus de papova, virus de vaccinia, adenovirus, virus de viruela aviar, virus de la pseudorabia y retrovirus, y vectores derivados de combinaciones de los mismos, tales como aquellos derivados de elementos genéticos de plásmido y bacteriófago, tales como cósmidos y fagémidos.
Los vectores de acuerdo con la invención se pueden usar in vitro, para ' la producción de RNA o usar para transfectar o transformar una célula hospedera .· El vector de expresión recombinante se puede transcribir y . traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7.
Un vector de la invención puede comprender dos ¦ o más, por ejemplo tres, cuatro o cinco, polinucleótidos de la invención, por ejemplo para la sobreexpresión .
Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para lá expresión del ácido nucleico lo que significa que el vector de expresión recombinante incluye una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células hospederas que se usan para la expresión, que se enlaza operablemente a la secuencia de. ácidos nucleicos que se expresa .
Dentro de un ¦ vector, tal como un vector de expresión, "operablemente enlazado" se propone para . referirse a que la secuencia de nucleótidos de interés se enlaza a la secuencia (s) reguladora en una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedara cuando el vector se introduce en la célula hospedera), es decir el término "operablemente enlazado" se refiere a una . yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera propuesta. Una secuencia reguladora tal como un promotor, potencia.dor u otra señal de regulación de expresión "operablemente enlazada" a una secuencia de codificación se coloca de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se logra bajo una condición compatible con las secuencias de control o las secuencias se arreglan para que funcionen con untamente para su propósito propuesto, por ejemplo la transcripción inicia en un promotor y continúa a través de la secuencia de DNA que codifica' el polipéptido.
Un vector o constructo de expresión para una célula hospedera dada puede comprender de esta manera los siguientes elementos enlazados operablemente entre si en una orden consecutivo del extremo 5' al extremo 3' relativo con la hebra de purificación de la secuencia que codifica el polipéptido de la primera invención, (1) una secuencia promotora capaz de dirigir la transcripción de' la secuencia de nucleótidos que codifican el polipéptido en. la célula hospedera dada; (2). opcionalmente, una secuencia señal capaz de dirigir la secreción del polipéptido de la célula hospedera dada en un medio de cultivo; (3) una secuencia de DNA de la invención que codifica una forma madura y de manera preferente activa de un polipéptido que tiene actividad de acetil-xilan-esterasa; y de manera preferente también (4) una región de terminación de transcripción (terminador) capaz de terminar la transcripción cadena -abajo de la secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido.
Cadena abajo de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención puede haber una región no: traducida 3' que contiene uno o más sitios' de terminación, de transcripción (por ejemplo, un terminador) . El origen del terminador es menos critico. El terminador. puede, por ejemplo, ser nativo a la secuencia de DNA que codifica el polipéptido. Sin embargo, de manera preferente un terminador de levadura se usa en las células hospederas de levadura y un terminador fúngico filamentoso se usa en .la células hospederas filamentosas. De manera más preferente el terminador es endógeno, a la célula hospedera (en la cual la secuencia de nucleótidos .que codifica el polipéptido se va, a expresar). En la. región transcrita, un sitio de enlace 'a ribosoma para traducción puede estar presente. La porción de codificación de los transcriptos maduros expresados por los constructos incluirá un AUG de iniciación de traducción en el comienzo y un codón de terminación colocado apropiadamente en el extremo del polipéptido que se traduce.
La expresión . mejorada del polinucleótido de la invención también se puede lograr por la ¦ selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo promotor, conductor de secreción y/o regiones terminadorás, que pueden servir para incrementar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción del polipéptido de interés del hospedero de expresión y/o para proporcionar el control inducible de la expresión de un polipéptido de la invención.
Se apreciará, por aquellas personas expertas en el campo que el diseño del vector de expresión puede depender de tales factores como la selección de la célula hospedera que se transforma, el nivel de expresión del polipéptido deseado, etc. Los vectores, . tales como los vectores de expresión de la invención se pueden introducir a las células hospederas para producir en consecuencia proteínas o péptidos, codificados por ácidos nucleicos como se describe en este documento (por ejemplo, polipéptidos TE ER01754, formas mutantes de polipéptidos TEMER01754, fragmentos, variantes o equivalentes funcionales de los mismos. Los vectores, tales como vectores de expresión recombinantes , de la invención se pueden diseñar para la expresión de polipéptidos TEMER01754 en células procarióticas o eucarióticas .
Por ejemplo, los polipéptidos TEMER01754 se pueden expresar en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto (usando: vectores de expresión de baculovirus) , hongos filamentosos, células de . levadura o células de mamífero. En células hospederas adecuadas se plantean adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: ethods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Los ejemplos representativos de hospederos apropiados se describen a partir de ahora.
Medios y condiciones de cultivo apropiados para las células hospederas descritas en lo anterior se conocen en el campo .
El término "secuencias de control" o "secuencias reguladoras" se define en este documento para incluir por lo menos cualquier componente que pueda ser necesario y/o ventajoso para la expresión de un polipéptido. Cualquier secuencia de control puede ser nativa o extraña a las secuencias de ácidos nucleicos de la invención que codifican un polipéptido. Tales secuencias de control pueden incluir, pero no se limitan a, un promotor, o un conductor, secuencias de iniciación de traducción óptimas (como sé déscribe en Kozak, 1991, J. Biol . Chem. 266:19867-19870), una secuencia señal de secreción, una secuencia de pro-péptido, una secuencia de poliadenilación, un terminador de transcripción. En un mínimo, la secuencia de control incluye típicamente un promotor, y señales ' de detección transcripcionales y traduccionales . Como se expone en lo anterior, el término "operablemente enlazado" se define en este documento como una configuración en la cual una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa con la secuencia de codificación de la secuencia de DNA tal que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido.
Las secuencias de control, pueden estar provistas con ligaduras para el propósito de introducir sitios de restricción específicos que facilitan la ligación de las secuencias de control con la región de codificación de la secuencia de ácidos nucleicos que codifican un polipéptido. El término "operablemente enlazado" se define en este documento como una configuración en la cual una secuencia de control se coloca apropiadamente en una posición relativa con la secuencia de codificación de la secuencia de' DNA tal que la secuencia de control dirige la producción de un polipéptido.
La secuencia, de control puede ser una secuencia promotora- apropiada, una . secuencia de ácidos nucleicos, que es reconocida por una célula hospedera para la expresión de la secuencia de ácidos nucleicos. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcionales , que median la expresión del polipéptido. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos, que muestra la actividad transcripcional en la célula que incluye promotores mutantes, truncados e híbridos, y se puede obtener a partir de genes que codifican polipéptidos extracelülares o intracelulares ya sea homólogos o heterologos a la célula.
La secuencia de control también puede ser una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula fúngica filamentosa para terminar la transcripción. La secuencia terminadora se enlaza operablemente a la .3' terminal de la secuencia de ácidos nucleicos que codifican el polipéptido. Cualquier terminador, que es funcional en la célula, se puede usar en la presente invención.
La secuencia de control también puede ser un terminador. Los terminadores . preferidos para, las células fúngicas filamentosas se obtienen de los genes, que codifican TAKA-amilasa, de. A., oryzae, glucoamilasá de A. niger (glaA) , antranilato-sintasa de A. nidulans, alfa-glucosidasa de A. niger, gen trpC y proteasa .similar a tripsina de Fusarium oxysporum.
La secuencia de control también puede ser una secuencia líder adecuada, una región no traducida.de un mRNA que es importante para la traducción por la célula fúngica filamentosa. La secuencia líder se enlaza operablemente a la 5' terminal de la secuencia de. ácidos nucleicos . que codifican el polipéptido. Cualquier secuencia líder, que. es funcional en la célula, se . puede usar en la presente invención. Los líderes preferidos para las células fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que .codifican TAKA-amilasa de A. oryzae y triasa-fosfato-isomefasa de A. nidulans y glaA de A. niger.
Otras secuencias de control se pueden aislar del gen IPNS de Penicillium, o gen pcbC, él gen beta-tubulina . Todas las secuencias de control citadas en el documento O 01/21779 se incorporan con este documento a manera de referencia.
La secuencia de control también puede ser una secuencia de poliadenilación, una secuencia que se enlaza operablemente a la 3' terminal' de la secuencia de ácido nucleicos y que, cuando se transcribe, se reconoce por la célula fúngica filamentosa como una señal para agregar residuos de poliadenosina al mRNA transcrito. Cualquier secuencia de · poliadenilación que sea funcional a la célula, se puede usar en la presente invención. Las secuencias de poliadenilación preferidas para las células . fúngicas filamentosas se obtienen de los genes que codifican TAKA-amilasa de A. oryzae, glucoamilasa de A. niger, antranilato-sintasa de A. nidulans, proteasa similar a tripsina de Fusarium oxysporum y alfa-glucosidasa de A. niger.¦ Cuando el polipéptido de acuerdo con la invención se va a secretar de la célula hospedera en el medio de cultivo, una secuencia' señal apropiada se puede agregar al polipéptido a fin. de dirigir el polipéptido sintetizado de nuevo a la ruta de secreción de la célula hospedera. La persona experta en el campo sabe seleccionar una secuencia señal apropiada para un hospedero especifico. La secuencia señal puede ser nativa, a la célula hospedera, 6 puede ser extraña a la célula hospedera. Como ejemplo, una secuencia señal de un polipéptido nativo a la célula hospedera se puede usar. De manera preferente, el polipéptido nativo es un polipéptido altamente secretado, es decir un polipéptido. que se secreta en cantidades mayores que 10% de la cantidad total del polipéptido que se secreta. Las secuencias señal usadas de manera preferente de acuerdo con la invención son por ej emplo : pmeA.
Como una alternativa para una secuencia de señal, el polipéptido de la invención se puede fusionar a un polipéptido portador secretado, o' parte del mismo. Tal constructo quimérico se dirige a la ruta- de secreción por medio de la secuencia señal del polipéptido portador, o parte del mismo. Además, el polipéptido portador proporcionará un efecto estabilizador 'al polipéptido de acuerdo con la invención y o puede aumentar la solubilidad. Tal polipéptido portador puede ser cualquier polipéptido. De manera preferente, un polipéptido altamente secretado se usa como un polipéptido portador. El polipéptido portador puede ser nativo o extraño al polipéptido de acuerdo con la invención. El polipéptido portador puede ser nativo o puede ser extraño a la célula hospedera. Ejemplos de tales polipéptidos portadores son glucoamilasa, secuencia pre-pro del factor alfa-de apareamiento, del dominio d enlace a celulosa de 'proteína A de enlace a celulosa binding Clostridium cellulovorans, glutationa S-transferasa, dominio de enlace a quitina de quitinasa Al de¦ Bacillus circulans, dominio de enlace a maltosa codificado por el gen maiE de E. coli K12, beta-galactosidasa , y fosfatasa alcalina. Un polipéptido portador preferido para la expresión de tal constructo quimérico en células de Aspergillus es glucoamilasa. La proteína y polipéptido portadores pueden contener un motivo de aminoácido específico para facilitar el aislamiento del polipéptido; el polipéptido de acuerdo con la invención se puede liberar por un agente de liberación especial.- El agente de liberación especial. El agente de liberación puede ser una enzima proteolítica o un agente químico. Un ejemplo de tal motivo de aminoácido es el sitio .de escisión de KEX proteasa, que es bien conocido por la persona experta en el campo.
Una secuencia- señal se puede usar para facilitar la secreción y aislamiento de una proteína o polipéptido de la invención. Las secuencias señal se caracterizan típicamente por un núcleo de aminoácidos hidrofóbicos, que se escinden en general de la proteina madura durante la secreción en uno¦ o más eventos de escisión. Tales péptidos de señal contiene sitios de procesamiento que les permite la escisión- de la secuencia señal de las proteínas, maduras conforme pasan a través de la fruta secretora. La secuencia señal dirige la secreción de la proteína, tal como de un hospedero eucariótico en el cual el vector de expresión se transforma, y la secuencia señal se escinde subsecuente o concurrentemente La proteina luego . se puede purificar fácilmente del medio extracelular por métodos conocidos: Alternativamente, la secuencia señal se puede enlazar a la proteína de interés usando una secuencia, que facilita la purificación, tal como con un dominio GST . De esta manera por ejemplo, la secuencia que codifica el. polipéptido se puede fusionar a una secuencia marcadora,, tal como una secuencia que codifica un péptido, que facilita la purificación del polipéptido fusionado. En ciertas modalidades preferidas de este aspecto' de la invención, la secuencia marcadora es un péptido de hexa-histidina, tal como la etiqueta proporcionada en un vector pQE ' (Qiagen, Inc.), entre otros, mucho de los cuales son comercialmente disponibles. Como .se describe en Gentz y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 86:821-824 (1989), por ejemplo, la hexa-histidina proporciona purificación conveniente, de la proteína de fusión.. -La etiqueta HA es otro péptido útil para la purificación' que corresponde a un epítopo derivado de la proteína de hemaglutinina de influenza, que se ha descrito por Wilson y colaboradores, Cell 37:767 (1984), por ejemplo.
De manera preferente, una proteína de · fusión TEMER01754 de la invención se produce mediante técnicas de DNA recombinante estándares. Por ejemplo, los fragmentos de DNA que codifican las secuencias de polipéptido diferente · se ligan juntas dentro del marco de' acuerdo cón técnicas convencionales, por ejemplo al emplear terminales de extremo? romos ó de extremos escalonados para ligación, la . digestión enzimática de restricción proporciona terminales apropiadas, el relleno de los extremos cohesivos · como sea apropiado, el tratamiento de fosfatasa alcalina para evitar la unión indeseable, y ligación enzimática. En otra, modalidad, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadór de DNA automatizados. Alternativamente, la amplificación por PCR de fragmentos de genes se puede llevar a cabo · usando cebadores de anclaje, ' que dan origen a salientes complementarias entre dos fragmentos de genes consecutivos que se pueden recocer subsecuentemente y reamplificar para generar una secuencia de genes quiméricos (véase,, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds . Ausubel y colaboradores.
John Wiley & Sons: 1992) . ' Por otra parte, muchos vectores de expresión son comercialmente disponibles ya que codifican una porción de fusión (por ejemplo un polipéptido GST) . Un ácido nucleico que codifica TEMER01754 se puede clonar en tal vector de expresión tal que la- porción de fusión se enlaza dentro del marco a la proteina TEMER01754.
De ' manera preferente, la eficiencia de la integración objetivo en el genoma de la célula hospedera, es decir integración en un sitio objetivo predeterminado, se incrementa por las capacidades de recombinación homologas aumentadas de la célula hospedera. Tal fenotipo de la. célula implica de manera preferente un gen hdfA o hdfB deficiente como se describe en el documento W02005/095624. El: documento W02005/095624 da a conocer un método preferido para obtener una célula fúngica filamentosa que comprende eficiencia incrementada de integración objetivo.
Opcionalmente, la célula hospedera comprende una respuesta de proteína no plegada elevada (UPR) comparada con la célula de tipo silvestre para mejorar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. La UPR- se puede incrementar mediante técnicas descritas . en. los documentos US2004/0186070A1 y/o US2001/0034045A1 y/o W001/72783A2 y/o W02005/123763. Más específicamente, el nivel de proteína de HAC1 y/o IRE! y/o PTC2 se ha modulado, y/o la proteína SEC61 se ha diseñado a fin de- obtener una célula hospedera que tiene una UPR elevada..
Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada, la célula hospedera se modifica genéticamente para obtener un fenotipo que expresa menor expresión de proteasa y/o secreción de proteasa comparado con la célula de tipo silvestre a fin de. aumentar las capacidades de producción de un polipéptido de interés. Tal fenotipo se puede obtener por la supresión y/o modificación y/o inactivación de un regulador transcripcional de expresión de proteasas. Tal regulador transcripcional es por ejemplo prtT. Disminuyendo la expresión de las proteasas por modulación del prtT se puede llevar a cabo por técnicas descritas en el documento US2004/0191864A1.
Alternativamente, o en combinación con una UPR y/o un fenotipo que expresa menor expresión de proteasa y/o secreción de proteasa, la célula hospedera expresa un fenotipo deficiente de oxolato a fin de aumentar el rendimiento de producción de un polipéptido de interés. Un fenotipo deficiente de oxalato se puede obtener por técnicas descritas en el documento W02004/070022A2.
Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que expresa menor expresión de proteasa y/o secreción de proteasa y/o deficiencia de oxalato, la célula' hospedera expresa una combinación de diferencias fenotipicás comparado con la célula silvestre para aumentar el rendimiento de producción del polipéptido de interés. Estas diferencias pueden incluir,, pero se limitan a, expresión disminuida de glucoamilasa y/o alfa-amilasa neutra A y/o alfa-amilasa neutra B proteasa, y ácido oxálico hidrolasa. Las diferencias fenotipicás expresada por- la célula hospedera se pueden obtener por modificación genética de acuerdo con las técnicas descritas en el documento ÜS2004/0191864A1.
Alternativamente, o en combinación con una UPR elevada y/o un fenotipo que expresa menor expresión de proteasa y/o secreción de proteasa y/o deficiencia de oxalato y una combinación de diferencias fenotipicás comparado con la célula de tipo silvestre para aumentar el rendimiento de producción del polipéptido de interés, la célula : hospedera expresa una deficiencia en los genes de toxina, deshabilitando la capacidad de la célula hospedera fúngica filamentosa para expresar toxinas. Tales toxinas incluyen, pero no se limitan a, ocratoxinas, fumonisinas, ácido ciclapiazónico, ácido 3-nitropropionico, emodina, malformina, aflatoxinas y ácidos secalónicos. Tal deficiencia, es de manera preferente tal como se describe en el documento W02000/039322. ¦ . ' (Sobre) expresión En una modalidad preferida, los polinucleótidos de la presente invención como se describe en este documento se pueden sobre expresar en una cepa microbiana de la invención comparada con la cepa microbiana precursora en la cual el gen no se sobreexpresa .- La sobréexpresión de una secuencia de polinucleótidos se define en este documento como la expresión del gen de secuencia . que da por resultado una actividad de la enzima codificada por la secuencia en una cepa microbiana que es por lo menos aproximadamente 1.5 veces la actividad de la enzima en la microbiana precursora; de manera preferente la actividad de la enzima es por lo menos aproximadamente. 2 veces, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 3 veces, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 4 veces, de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 5 veces, de manera aún más preferente de por lo menos aproximadamente 10 veces y de manera mucho más preferente por . lo menos aproximadamente .20 veces la actividad de la enzima en la microbiana precursora.
El vector puede incluir además secuencias que flanquean el polinucleótido dando origen al RNA que comprende secuencias homologas a las secuencias genómicas o eucarióticas o secuencias genómicas virales. Esto permitirá la introducción de los polinucleótidos de la invención en el genoma de una célula hospedera.
Un vector de clonación integrativo puede integrarse al azar o en un sitio objetivo predeterminado en el cromosoma (s). de la célula hospedera en la cual se va a integrar. En una modalidad preferida de la invención, un vector de clonación . integrativo puede comprender un fragmento de DNA que es homólogo a una secuencia de DNA en- un sitio objetivo predeterminado en el genoma de la célula' hospedera para fijar como., objetivo la integración del vector, de clonación a est sitio predeterminado. A fin de promover la integración objetivo, el vector de clonación se puede linealizar de manera preferente antes de la transformación de la célula hospedera. La linealización se puede llevar a cabo de manera preferente tal que por lo menos uno pero preferentemente cualquier extremo del vector de ólonación se flanquea por secuencias homologas al sitio objetivo. La longitud de las secuencias homologas que flanquean el sitio objetivo es de manera preferente por lo menos aproximadamente O.lkb, tal como de aproximadamertté por lo menos 0.2kb,- de manera más preferente de por lo menos aproximadamente 0.5 kb, de manera aún más preferente de por lo menos aproximadamente lkb, de manera mucho más preferente por' lo menos aproximadamente 2 kb. De . manera preferente, las cepas hospederas precursoras se pueden modificar para frecuencia mejorada de la integración de DNA objetivo como se describe en los documentos WO2005/095624 y/o WO2007/115886.
El ejemplo de supresión proporcionado en la presente invención, usa el promotor del gen como flanco 5' y el gen como el flanco 3' para insertar un · marcador de selección entre el promotor ' el gen, alterando en consecuencia (es decir · inactivando funcionalmente ) la transcripción génica. Las secuencias de genes dadas en lo anterior se pueden usar para hacer genes funcionalmente inactivados similares. Los genes se pueden separar en dos, produciendo un flanco 5' y un flanco 3', pero el gen también se puede usar para clonar una pieza más grande de DNA genómico que contiene el promotor y las regiones terminadoras del gen, las cuales pueden funcionar como flanco 5' y flancos 31.
El sistema de vector puede ser un solo vector, tal como un solo plásmido, .o dos o más vectores, tales como dos · o más plásmidos, que . juntos contienen el DNA total que se introduce en el genoma de la célula hospedera.
El vector puede contener un polinucleótido de la invención orientado en una dirección antisentido para proporcionar la producción del RNA antisentido.
El DNA del vector se puede introducir en las células procarióticas o eucarióticas a través de técnicas de transformación o transfección convencionales. Gomo se usa en este documento, los. términos "transformación" ¦ y "transfección" se proponen para referirse a una variedad de técnicas reconocidas en el' campo para introducir ácido nucleico extraño (por ejemplo, DNA) en una célula hospedera, incluyendo co-precipitación de fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, . transducción, infección, lipofección; transfección . mediada 'por lipido catiónico o eléctroporación. Los- métodos adecuados para transformar o transfectar células hospederas se pueden encontrar en Sambrook, y colaboradores. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2"d,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989), Davis y colaboradores., Basic Methods in Molecular Biology (1986) y. otros manuales de laboratorio.
Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, solo una pequeña fracción de células se puede integrar al DNA extraño en su genoma . A fin de identificar y seleccionar esas integrantes, un gen que codifica un marcador seléccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células hospederas junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que confieren resistencia a los fármacos o que complementan un defecto en la célula hospedera. Incluyen por ejemplo genes marcadores versátiles que se pueden usar para la transformación de hongos y levaduras más filamentosos tales como genes de acetamidasa o DNAs (los genes amdS, niaD, facA o cDNAs de A. nidulans, A. oryzae . o A. niger}, o genes que proporcionan resistencia a antibióticos similar a G 18, higromicina, bleomicina, canamicina, metotrexato, fleomicina, resistencia a orbenomilo (benA) . Alternativamente, los marcadores de selección específicos se pueden usar tales como marcadores auxotróficos que requieren cepas hospederas mutantes correspondientes: por ejemplo URA3 (de S. cerevisiae o genes análogos de otras levaduras) , pyrG o pyrA (de A. nidulans o A. niger) ,¦ argB (de A. nidulans o A. niger) o trpC. En una modalidad preferida, el marcador de selección se suprime de la célula hospedera transformada después de la introducción del constructo de expresión para obtener las células hospederas transformadas capaces de producir el polipéptido que está libre de la selección de genes marcadores.
Otros marcadores incluyen. ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC) , orotidina-5 ' -fosfatodescarboxilasa (pvrA) , el gen de resistencia G418 bacteriano (este también se puede usar en la levadura, pero no en los hongos), el gen de resistencia a ampicilina (E. coli) , el gen de resistencia .a neomicina (Bacillus) , el gen natl de resistencia a nourseotricina de Streptomyces nursei, el gen ptrA de resistencia a piritiamina de Aspergillus oryzae y el gen uidÁ de E. coli, que codifica para ß-glucurohidasa (GUS) . Los vectores se pueden usar in vitro, por ejemplo para la producción de RNA o usar para transfectar o transformar- una célula hospedera., La expresión de las proteínas en las procariotas se lleva a cabo frecuentemente en E. coli con vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de cualquiera de las proteínas de fusión o no de fusión. Los vectores de fusión agregan un número, de aminoácidos a la proteína codificada en el mismo, por ejemplo a la aminoterminal de la proteína recombinante. Tales vectores de fusión sirven típicamente tres propósitos: 1) para incrementar la expresión de la proteína recombinante; 2) para incrementar la solubilidad de la proteína ' recombinante ; y 3) para ayudar en . la purificación de la proteína recombinante al aetuar como un ligando en la purificación por afinidad. Frecuentemente en los vectores de expresión de fusión, un sitio de escisión proteolítico se introduce en la unión de la porción de fusión y la proteína recombinante para permitir la. separació de la proteína recombinante- de la porción de fusión subsecuente a la- purificación de la proteína de fusión.
Como se indica, los vectores de · expresión contendrán de manera preferente marcadores seleccionables . Tres marcadores incluyen resistencia a la ; dihidrofolato reductasa o neomicina ' para el cultivo celular eucariótico y resistencia a la tetraciclina o ampicilina para el cultivo en E. coli y otras bacterias.
Los vectores preferidos para el uso en las bacterias se dan a conocer por ejemplo en el documento WO-Al-2004/074468, que se incorpora en este documento a manera de referencia. Otros vectores adecuados serán fácilmente evidentes para el artífice experto.
Para la secreción de la proteína traducida . en el lumen del retículo endoplásmico, en el espacio periplásmico o en el entorno extracelular, la señal de secreción . apropiada se puede incorpora en el polipéptido expresado. Las señales pueden ser endógenas al polipéptido o pueden ser señales heterólogas .
El polipéptido TEMER01754 se puede expresar en una forma modificada, tal como una proteína de fusión, y puede incluir no solo señales de secreción sino también regiones funcionales heterólogas adicionales. De. esta manera, por ejemplo, una región de aminoácidos adicionales, aminoácidos particularmente cargados, se puede- agregar a la N-terminal del polipéptido para mejorar la estabilidad y persistencia en la célula hospedera, durante la purificación o durante el manejo y almacenamiento subsecuente. También,, las porciones de péptido se pueden agregar al polipéptido para facilitar la purificación.
La invención proporciona un polipéptido aislado que tiene la secuencia de aminoácidos, de acuerdo con SEQ ID NO: 2, y un secuencia de aminoácidos obtenible al expresar el polinucleótido de SEQ ID NO: 1 en un hospedero apropiado. También, un péptido o polipéptido que comprende una variante de los polipéptidos anteriores, tal como un equivalente funcional, está comprendido dentro de la presente invención. Los polipéptidos anteriores están comprendidos colectivamente en el término "polipéptidos de acuerdo con la invención".
El término "péptido variante" o "polipéptido variante" se define en este documento como . un péptido o polipéptido, respectivamente, que comprende- una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácido específicos en una o más ' posiciones específicas n el péptido o polipéptido, respectivamente. Por consiguiente, un péptido señal variante es un péptido señal¦ que comprende una o más alteraciones tales como sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamientos de uno o más residuos de aminoácido específicos en una o más posiciones específicas en el péptido señal.
El término "polinucleótido" es idéntico al término "molécula de. ácido, nucleico" y en este documento'- se puéde leer intercambiablemente. El término se refiere a una molécula de polinucleótido, que es una molécula de ácido ribonucleico (RNA) o ácido desoxirribonucleico (DNA) , ya sea de una sola hebra o doble hebra. Un polinucleótido puede ya sea estar presente en forma aislada, o estar comprendido en moléculas o vectores de ácido nucleico recombinantes, o estar comprendido en una célula hospedera.
El término "polinucleótido variante" se define en este documento como un polinucleótido que comprende . una o más alteraciones, tales como sustituciones, inserciones, supresiones y/o truncamientos de uno o más nucleótidos en una o más posiciones específicas en el polinucleótido.
Los términos "péptido" y "oligopéptido" se consideran sinónimos (como es reconocido comúnmente) y cada término se puede usar intercambiablemente, como- el contexto lo requiera, para indicar una cadena de por lo menos dos aminoácidos acoplados por. enlaces de peptidilo. La palabra "polipéptido" se usa ' en este documento para cadenas que contienen más de siete residuos de aminoácido. Todas las fórmulas o secuencias de oligopéptidos y polipéptidos en este documento se escriben de izquierda a derecha y · en la dirección de la amino terminal a la carboxi terminal. El código de una letra de los aminoácidos usados en este documento se conoce comúnmente en el campo y se . pueden encontrar en Sambrook, y colaboradores. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd,ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
Por polipéptido o proteina "aislada" se propone un polipéptido o proteina removido de su medio ambiente nativo. Por ejemplo, los polipéptidos y proteínas recombinantemente producidos expresados en las células hospederas se consideran aislados para el propósito de la. invención, ya que son polipéptido nativos o recombinantes que se han purificado sustancialmente por cualquier técnica adecuada tal como, por ejemplo, el método de purificación de una sola, etapa dada . a conocer por Smith y Johnson, Gene 67:31-40 (1988).
El polipéptido de acetil-xilan-esterasa TEMER01754 de acuerdo con la invención se puede recuperar y purificar de cultivos celulares recombinantes por métodos conocidos en el campo. De manera más preferente, se emplea . cromatografía líquida de alto de.sempeño ("HPLC") para purificación.
Los polipéptidos de la presente invención incluyen productos naturalmente purificados, productos de procedimientos químicos sintéticos, y productos producidos por técnicas recombinantes de un . hospedero prpcariótico . o eucariótico, incluyendo, por ejemplo, células bacterianas, de lavadura, de planta superior,- de insecto y de mamífero. Dependiendo del hospedero empleado en un procedimiento de producción recombihante, los polipéptidos de la. presente invención se pueden glicosilar o no se pueden glicosilar. Además, los polipéptidos de la invención también pueden incluir un residuo de ¦ metionina modificado inicial, en algunos casos como resultado de los procesos mediados por hospedero.
La invención también caracteriza fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de acuerdo con la invención.
Los fragmentos biológicamente activos de un polipéptido de la invención incluyen polipéptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a o derivadas de la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER'0175'4 (por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2), que incluyen pocos aminoácidos que el polipéptido de longitud completa pero que muestran por lo menos una actividad biológica del polipéptido de longitud completa correspondiente. Típicamente,. los . fragmentos biológicamente activos comprenden un dominio o motivo con por lo menos una actividad del polipéptido TEMER01754.
Un fragmento biológicamente activo de un polipéptido de la invención puede ser un polipéptido que. es, por ejemplo, de aproximadamente 10, aproximadamente 25, aproximadamente 50, aproximadamente 100' o más aminoácidos en longitud o por lo menos aproximadamente 100 aminoácidos, por lo menos 150, 200, 250, 300, 350, 400 aminoácidos en longitud, o de una longitud arriba del número ' total de aminoácidos del polipéptido de la invención.
Por otra parte, otras porciones biológicamente activas, en las cuales otras regiones del polipéptido se suprimen, se pueden preparar mediante técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades biológicas de la forma nativa de un polipéptido de la invención.'.
La invención también caracteriza fragmentos de ácido nucleico que . codifican los fragmentos biológicamente activos anteriores del polipéptido TEMER01754.
Polipéptidos En otro aspecto de la invención, se proporcionan polipéptidos TEMER01754 mejorados. Los polipéptidos TEMER01754 mejorados son polipéptidos en donde se mejora por lo menos una actividad biológica. Tales polipéptidos se pueden obtener al introducir aleatoriamente mutaciones a lo largo de todo o ¦ parte de la secuencia de. codificación TEMER01754 tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden expresar recombinantemente y clasificar para actividad biológica.' Las variantes mejoradas de las secuencias de aminoácidos de la presente invención que conducen a una función de acetil xilan esterasa mejorada se pueden obtener por los genes correspondientes de la presente invención. Entre tales modificaciones incluyen: 1. PCR propensa a errores para introducir mutaciones aleatorias, seguido por una clasificación de variantes obtenidos . y aislamiento de variantes con propiedades cinéticas mejoradas. 2. Mezclado de familia de variantes relacionadas de los genes que codifican la enzima acetil-xilan-esterasa, seguido por una clasificación de variantes obtenidas y aislamiento de variantes con propiedades cinéticas . mej oradas .
Las variantes de- los genes de la presente invención que conducen a un nivel incrementado de mRNA y/o polipéptido, dando por resultado más actividad de acetil-xilan-esterasa se pueden obtener por las secuencias de polinucleótidos de los genes ... Entre tales- modificaciones incluyen: 1. Mejorar el uso de codón de tal manera' que los codones se adapten (óptimamente) al hospedero microbiano precursor. 2. Mejorar el uso del codón de pares en tal forma que los codones se adapten (óptimamente) al hospedero microbiano precursor. 3. La adición de secuencias estabilizadoras a la información genómica que codifica el polipéptido acetil-xilan-esterasa dando por resultado moléculas de mRNA con una vida media incrementada.
Los métodos preferidos para aislar variantes con propiedades catalíticas mejoradas' ó niveles incrementados de mRNA o polipéptido se describen en los documentos W2003/01 0183 y. W2003/01311. Los métodos preferidos para optimizar el uso de codón en las cepas microbianas precursoras se describen en el ' documento PCT/EP2007/05594. Los métodos preferidos para la adición de elementos de estabilización de los genes que codifican el polipéptido acetil-xilan-esterasa de la invención se describen .en el documento 02005/059149.
En- una modalidad preferida, el polipéptido TEMER01754 tiene una secuencia de aminoácidos de, acuerdo con SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, él polipéptido TEMER01754 es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos de acuerdo con SEQ ID NO: 2 y retiene por lo menos- una actividad biológica de un polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2, todavía difiere en la secuencia de aminoácidos debido a la variación o mutagénesis natural como se describe.
En una modalidad preferida adicional, el polipéptido TEMER01754 tiene una secuencia de aminoácidos codificada por un fragmento de ácido nucleico aislado capaz de hibridar a un ácido nucleico de acuerdo con SEQ ID NO: 1, de manera preferente bajo condiciones de hibridación altamente rigurosas.
Por consiguiente, el polipéptido TEMER01754 es de manera preferente un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos por lo menos 82%', por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 96%, por lo menos 97%,, por lo menos 98%, por lo menos 99% o más homologa a la secuencia de aminoácidos mostrada, en SEQ ID NO: 2 y, típicamente, retiene por lo menos una actividad funcional del polipéptido de acuerdo con SEQ ID NO: 2.
Los equivalentes funcionales de un polipéptido de acuerdo con la invención también se pueden identificar por ejemplo al clasificar bibliotecas de combinación de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento, del polipéptido de la invención para la actividad e acetil-xilan-esterasa . En una modalidad, una biblioteca variada de variantes se genera por muta-génesis de combinación en el nivel de ácido nucleico. Una biblioteca variada de variantes se puede producir' tal como, por ejemplo, ligar enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en las secuencias de genes tales que un conjunto degenerado de secuencias de polipéptido potenciales es expresable como polipéptidos individuales, o alternativamente como un conjunto de proteínas de fusión más grandes (por ejemplo para la expresión en fago) . Existe una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales de los polipéptidos de la- invención de una secuencia de oligonucleótidos degenerados. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; ltakura et al. (1984)' Annu . Rev. Biochem. 53:323; ltakura y colaboradores. (1984) Science 198:1056; Ike y colaboradores. (1983) Nucléic Acid Res. 11:477).
Además, las bibliotecas, de fragmentos de la secuencia de codificación de un polipéptido de la invención se pueden usar para generar una población variada de polipéptidos para clasificación de una selección subsecuente, de variantes. Por ejemplo, una biblioteca de fragmentos de secuencia de codificación se pueden generar al- tratar un fragmento de PCR de doble hebra de' la secuencia de codificación de interés con una nucleasa bajo condiciones en donde se presenta un corte solamente a aproximadamente uno por molécula, desnaturalizando el DNA de ' doble hebra, naturalizando de nuevo el DNA para formar DNA de doble hebra que puede incluir pares de sentido/antisentido de diferentes productos cortados/ remover las porciones de hebra individual de los dúplex deformados por el tratamiento con SI nucleasa, y ligar la biblioteca de fragmento resultante en un vector de expresión. Por este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica la N-terminal y los fragmentos internos de, arios tamaños de la proteina de interés.
Varias técnicas son conocidas en la técnica para clasificar productos génicos de bibliotecas de combinación hechas por mutaciones puntuales de truncamiento, y para clasificación de bibliotecas de cDNA para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Las técnicas más ampliamente usadas, que son aptas para análisis de alto rendimiento, para clasificación de bibliotecas génicas grandes incluyen típicamente clonar la biblioteca de genes en los vectores de expresión replicables, transformar células apropiadas con la ' biblioteca resultante de vectores, y expresar los genes de combinación bajo condiciones en las cuales la detección de una actividad deseada facilita él aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis de conjunto recursiva (REM) , una técnica que aumenta la frecuencia de los mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de clasificación para identificar variantes de un polipéptido de la invención (Arkin y Yourvan (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:7811-7815; Delgrave y colaboradores. (1993) Protein Engineering 6(3): 327-331).
Además de la secuencia de genes TEMER01754 mostrados en SEQ ID NO: 1, será evidente para la persona experta en la técnica que los polimorfismos de la secuencia de DNA pueden existir dentro de una población dada,- que puede conducir a cambios en la secuencia de aminoácidos del polipéptido TEMER01754. Tales polimorfismos genéticos pueden existir en las células de diferentes poblaciones o .dentro de una población debido a la variación alélica natural. Las variantes alélicas también pueden incluir equivalentes funcionales.' Los fragmentos de un polinucleótido de acuerdo con la invención también pueden comprender polinucleotidos que no codifican polipéptidos funcionales. Tales polinucleotidos pueden funcionar como sondas o cebadores para una reacción de PCR.
Los ácidos nucleicos de . acuerdo con .la invención independientemente de si codifican polipéptidos funcionales o no funcionales se pueden usar como sondas de hibridación o cebadores de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) . Los usos de las moléculas de ácido nucleico de la presente invención que no codifican un polipéptido que tienen una actividad de TEMER01754 incluyen, ínter alia, . (1) aislar el gen que codifica el Polipéptido TEMER01754 , o variantes alélicos del mimos de una biblioteca de cDNA por ejemplo de microorganismos adecuados; (2) hibridación in situ (por ejemplo FISH) a extensiones cromosómicas de metafase para proporcionar una ubicación cromosómica precisa del . gen TEMER01754 como se describe en Verma y colaboradores., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York (1988); (3) análisis de Northern bl.ot para detectar la expresión del mRNA de TEMER01754 en tejidos y/o células específicas y 4) sondas y cebadores que se pueden usar como una herramienta de diagnóstico para analizar la presencia de un ácido nucleico hibridizable a la sonda TEMER01754 en una muestra biológica dada. por ejemplo tejido).
También se abarca por la invención un método para obtener un equivalente funcional de un gen TEMER0175 .. Tal método implica obtener' una sonda etiquetada que incluye un ácido nucleico aislado que codifica todo o una porción de la secuencia de polipéptidos de acuerdo con SEO ID. NO: 2 o una variantes de la misma; clasificar una biblioteca de fragmento de ácido nucleico con l sonda etiquetada bajo condiciones que permiten la hibridación de. la sonda a fragmentos de ácido nucleico en la biblioteca, formar en consecuencia dúplex de ácido nucleico, y preparar una secuencia de genes de longitud completa de los fragmentos de ácido nucleico en cualquier dúplex etiquetado para obtener un gen relacionado con el gen TEMER01754. - En una modalidad, un ácido nucleico TEMER01754 de la invención es por lo menos 80%, por lo menos 81%, por lo menos 82%, por lo menos 83%, por lo menos 84%, por lo menos 85%, por lo menos 86%, por lo menos 87%, por lo menos 88%, por lo menos 89%, por lo menos 90%, por lo menos 91%, por lo menos 92%, por lo menos 93%, por lo menos 94%, por lo menos 95%, por lo menos 96%, por lo menos 97%, por lo menos 98%, por lo menos 99%, o más homólogo a una secuencia de ácidos nucleicos mostrada en SEO ID NO: 1 o el complemento de la misma.
Se proporcionan además: células hospederas que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. El polinucleótido puede ser heterólogo al genoma de la célula hospedera. El término "heterólogo", usualmente con respecto a la célula hospedera, significa que el polinucleótido. no se presenta naturalmente en el genoma de la célula hospedera o que el polipéptido no se produce naturalmente por esa célula.
En otra modalidad, la invención caracteriza células, por ejemplo, células hospederas transformadas o células hospederas recombinantes que contienen . un ácido nucleico abarcado por la invención. Una "célula transformada" o "célula recombinante" es una célula en la cual (o en un antepasado en el cual) se ha introducido, por medio de técnicas de DNA recombinante, un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Se incluyen tanto células procarióticas como eucarióticas, por ejemplo, bacterias, hongos,¦ levadura, y similar, se prefieren específicamente células de ' hongos filamentosos, tales como Aspergillus niger o Talaromyces emersonii.
Se puede elegir una célula hospedera que module la expresión de las secuencias insertadas, o modifique y procese el producto génico en una forma deseada, específica. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y procesamiento (por ejemplo, escisión) de los productos de proteína pueden facilitar el funcionamiento óptimo de la proteína.
Varias células hospederas tienen ·' mecanismos característicos . y específicos para procesamiento postraduccional y modificación de las proteínas y productos génicos. Las líneas de células apropiadas o' sistemas hospederos familiares para aquellas personas de experiencia en el campo de biología molecular y/o microbiología se pueden elegir para asegurar la modificación deseada y- correcta y procesamiento de lá p.roteina extraña expresada. Para este fin, las células hospederas eucarióticas que poseen la maquinaria celular para el procesamiento apropiado del transcripto primario, . glicosilación, y fosforilación ' del producto génico se pueden usar. Tales células hospederas son bien conocidas en la técnica.
Si se desea, una célula como se describe en lo anterior se' puede usar en la preparación de un polipéptido de acüerdo con la invención. Tal método comprende típicamente cultivar una célula hospedera (por ejemplo, transformada o transfectada con un vector de expresión como sé describe en lo anterior) bajo condiciones para proporcionar la expresión (por el vector) de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido., y recuperar opcionalmente el polipéptido expresado. Los polinucleótidos de la invención se pueden incorporar en un vector replicable recombinante, por ejemplo un vector de expresión. El vector se puede usar' para replicar el ácido nucleico en una célula hospedera compatible. De eta manera en una modalidad adicional, la invención proporciona un método ' para hacer un polinucleótido de la invención al introducir un polinucleótido de la invención en un vectór replicable, introducir el vector en una célula hospedera compatible y desarrollar la célula hospedera bajo condiciones que llevan a cabo la replicación del vector. El vector se puede recuperar de la célula hospedera. .
De manera preferente el polipéptido se produce como una proteina secretada en cuyo caso la secuencia de nucleótidos que codifica una forma madura del polipéptido en el constructo de expresión se enlaza operablemente a una secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia señal. De manera preferente, la secuencia señal es nativa (homologa) a la secuencia de nucleótidos que. codifica el polipéptido. Alternativamente, la secuencia señal es extraña (heteróloga) a la secuencia dé nucleótidos que codifica el polipéptido, en cuyo caso la secuencia señal es de manera preferente endógena a la célula hospedera en la cual la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la invención se' expresa. Los ejemplos de secuencias señal adecuada para células hospederas de levadura son. las secuencias señal derivadas de genes de; oí-factor de levadura. Similarmente', una secuencia señal adecuada para células hospederas fúngicas filamentosas es por ejemplo una secuencia señal derivada de un gen de amiloglucosidasa fúngica filamentosa (AG) , por ejemplo el gen glaA de A. niger. Este se puede usar en combinación con el promotor mismo de amiloglucosidasa (también llamada (gluco) · amilasa) , asi como también en combinación con otros promotores. Las secuencias señal híbridas también se pueden usar con el contexto de la presente invención.
Las secuencias líderes de secreción heteróloga preferidas son aquellas que se originan del gen de amiloglucosidasa fúngica (AG) (versiones de 18 y 24 aminoácidos ambas de glaA por ejemplo de Aspergillus) , el gen de a-factor (levaduras por ejemplo de Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de a-amilasa (Bacillus) .
Los vectores se pueden transformar o transfectar en una célula hospedera adecuada como se describe en lo anterior para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Este proceso puede comprender cultivar una célula hospedera transformada con un véctor de expresión como se describe en lo anterior bajo condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia de codificación que codifica el polipéptido.
Células hospederas La invención proporciona de . esta manera células hospederas transformadas o transfectadas con o que comprenden un polinucleótido o vector de la invención. De manera preferente el polinucleótido se lleva en un vector para la replicación y expresión del polinucleótido. Las células se elegirán para ser compatibles con. el vector y por ejemplo pueden ser células procarióticas (por ejemplo ' bacterianas) , fúngicas, de levadura ó de plantas.
Un hospedero heterologo también se puede elegir en donde el polipéptido de la invención se produce en una forma que está sustancialmente libre de otras enzimas degradadoras de celulosa o degradádores de hemicelulosa . Esto se puede lograr al elegir un hospedero qué no produzca normalmente tales enzimas .
La invención abarca a procesos para la producción del polipéptido de la invención por medio . de ·' expresión recombinante de una secuencia de DNA que codifica .el polipéptido. Para este' propósito la secuencia de DNA de la invención se puede usar para la amplificación génica y/o intercambio de señales de expresión, tales como- promotores, secuencias señal de secreción, a fin de permitir . la producción económica del polipéptido en una célula · hospedera homologa o heteróloga adecuada. Una célula hospedera homologa es una célula hospedera que es de la misma especie o que es una variante dentro de- la misma especie como las especies de las cuales la secuencia de DNA se deriva.
Las células hospederas . adecuadas son microorganismos de manera preferente procarióticos tales como bacterias, u organismos de manera preferente eucarióticos, por ejemplo hongos tales como levaduras u hongos filamentosos, o células de planta. En general, las células de levadura se prefieren sobre las células fúngicas debido . a que son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son ya sea deficientemente secretadas de levadura, o en algunos casos no se procesan apropiadamente (por ejemplo hiperglicosilación . en levadura) . En estos casos, se debe seleccionar un organismo hospedero fúngico.
La célula hospedera puede sobreexpresar el polipéptido, y las técnicas para diseñar la sobreexpresión son bien conocidas. El hospedero de esta manera puede tener dos o más copias del polinucleótido de codificación (y el vector de. esta manera puede tener dos o más copias por consiguiente) . . .
Las bacterias del género Bacillus son muy " adecuadas como hospederos heterólogos debido . a su capacidad para secretar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospederos son aquellas de los · géneros Streptomyces y Pseudomonas. Una célula hospedera de levadura preferida para la expresión dé la secuencia de DNA que codifica el polipéptido es - de los géneros Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula, Pichia, Yarrowia, y SchizoSaccharomyces .
De manera' má.s preferente una célula ' hospedera de levadura se selecciona del grupo que consiste de las especies Saccharomyces cerevisiae, Kluyveromyces lactis (también conocidas como Kluyveromyces marxianus var. lactis), Hansenula polymorpha, Pichia pastoris, . Yarrowia lipolitica y SchizoSaccharomyces pombe .
Mucho más preferidas son, sin embrago, células hospederas fúngicas (por ejemplo filamentosas). Las células hospederas fúngicas filamentosas preferidas se seleccionan del grupo que consiste de los géneros ' Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea , Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremoniu , Neurospora , Thermoascus , Myceliophtora , Sporotrichum, Thielavia , Chryosporium , Fusarium, Humicola , Neurospora y Talaromyces .
De manera más preferente una célula fúngica filamentosa es.de la especie que incluye, pero no se limita a Aspergillus niger, Aspergillus a.wamori, Aspergillus tubingensis, Aspergillus aculeatus, Aspergillus ¦' foe.tidus, Aspergillus ' nidulans, Aspergillus japonicus, Aspergillus oryzae y Aspergillus¦ ficuum, Trichoderma reesei/Hypocrea jecorina, ' Fusarium graminearum, Talaromyces emersonii, Penicillium decumbens, Acremonium alabamense, Neurospora rassa, Myceliophtora thernaophilurri , Sporotrichum cellulophilum, Disporotrichum dimorphosporum, ' Talaromyces emersonii, Talaromyces stipitatus y Thielavia terrestris.
Las células hospederas de acuerdo con la invención incluyen células de plantas, y la invénción por lo tanto se extiende a organismos transgénicos , tales como .plantas y partes de las mismas, que contienen una o más células de la invención. Las células pueden expresar heterólogamente el polipéptido de la invención o pueden contener heterólogamente uno o más de los polinucleótidos de la invención. La planta transgénica (o modificada genéticamente) por lo tanto puede haber sido insertada (por ejemplo establemente) en su genoma una secuencia que codifica uno o más de los polipéptidos de la invención. La transformación de las células de plantas se puede llevar a cabo usando técnicas conocidas, por ejemplo usando un plásmido Ti ó Ri de Agrobacterium tumefaciens. El plásmido (o vector) de esta manera puede contener secuencias necesarias para infectar una planta, y se pueden emplear derivados de los plasmidos Ti y/o Ri.
Alternativamente, se puede efectuar la infección directa de una parte de una planta, tal como una hoja, raíz o tallo. En esta - técnica, la planta que se infecta- se puede lesionar, por ejemplo al cortar la. planta con una navaja de afeitar o perforar la planta con una aguja o frotar la planta con un producto abrasivo. La lesión luego se inocula con el Agrobacterium. La planta o parte de la planta luego se puede desarrollar sobre un medio de cultivo adecuado y se deja desarrollar en una planta madura. La regeneración de las células transformadas en las plantas genéticamente modificadas se puede lograr al usar técnicas conocidas, por ejémplo al seleccionar retoños, transformados usando un antibiótico y al subcultivar los retoños en un medio que contiene los nutrientes apropiados, hormonas de planta y similares.
La invención también incluye células que se han modificado para expresar el polipéptido acetil-xilan esterasa de la invención o una variante del mismo. Tales células incluyen lineas de células eucarióticas superiores transitorias, o de manera preferente estables, tales como células de mamífero o células de insecto,' células eucarióticas inferiores tales como células de levadura y fúngicas (por ejemplo filamentosas) o células procarióticas tales como células bacterianas.
También es posible para los polipéptidos de la invención ser expresados transitoriamente en una línea de células o sobre, una membrana, tal como por ejemplo en un sistema de expresión de baculovirus. Tales sistemas, que se adapta para expresar los polipéptidos de acuerdo con la invención, también se' incluyen dentro del alcance de la presente la invención.
De acuerdo con la presente invención, la producción del polipéptido dé ' la invención se puede efectuar por el cultivo de hospederos de expresión microbiana, que se han transformado con uno o más polinücleotidos de la presente invención, en u medio de fermentación de nutrientes convencional.
Producción de Polipéptido/Enzimas Las células hospederas recombinantes de acuerdo con la invención se pueden cultivar usando procedimientos conocidos en la técnica. Para cada combinación de un promotor y una célula hospedera, son disponibles condiciones de cultivo que son conductoras para la expresión de la secuencia de DNA que codifica el polipéptido. Después de alcanzar la densidad celular deseada o titulo del polipéptido el cultivo se detiene y el polipéptido se recupera usando procedimientos conocidos.
El medio de fermentación puede comprender un medio de cultivo conocido que contiene una fuente de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, molasas, almidón, celulosa, xilan, pectina, hidrolizado de biomasa lignocelolitica etcétera) , una fuente de nitrógeno (por ejemplo, sulfato de amonio, nitrato de amonio, cloruro de amonio etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo extracto de levadura, extracto de malta, pectona, etcétera) y fuentes de nutrientes inorgánicos (por ejemplo fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, un inductor . (por ejemplo celulosa, pectina, xilano, maltosa, maltodextrina o xilogalacturonano) se puede incluir..
La selección del medio apropiado se puede basar en la elección del. hospedero de expresión y/o basar en los requerimientos reguladores del constructo de expresión. Tales medios son conocidos por aquellas personas expertas en el campo. El medio puede, si se desea, contener componentes adicionales que favorecen los hospederos de expresión transformados sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.
La producción del polipéptido por el hospedero transformado (fermentación) se puede llevar a cabo de acuerdo con cualquier procedimiento conocido. El tiempo de producción puede extenderse sobre' un periodo de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 30 días. Puede ser un proceso en lotes, continuo o alimentado en lotes, adecuadamente en una temperatura en el intervalo de 0-100 o 0-80°C, por ejemplo, de aproximadamente 0 a aproximadamente 60 °C y/o en un pH, por ejemplo, de aproximadamente 2 a aproximadamente 10, . o de aproximadamente 3 a aproximadamente 9. Las condiciones de fermentación preferidas son una temperatura en el intervalo de aproximadamente 20 a aproximadamente 55°C y/o en un pH de aproximadamente 3 a aproximadamente 5. Las condiciones apropiadas se seleccionan usualmente con base en la elección del hospedero de expresión y el polipéptido que se expresa.
Después de la fermentación, si es necesario, las células se pueden remover del caldo de fermentación por medio de centrifugación o. filtración. Después de que la fermentación se ha detenido o después de la remoción de ' las células, el polipéptido de la invención luego se puede recuperar y, si se desea, purificar y aislar por medios convencionales.
Composiciones de polipéptidos/enz mas La invención proporciona una composición que comprende un polipéptido de la invención y una- celulasa y/o hemicelulasa y/o una pectinasa.
Cuando el polipéptido de la invención es una celulasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una hemicelulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.
Cuando el polipéptido de la invención es una hemicelulasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una pectinasa además del polipéptido de la invención.
Cuando él polipéptido de la invención es una pectinasa, una composición de la invención comprenderá típicamente una celulasa y/o una hemicelulasa además en el polipéptido de la invención.
Una composición de la invención puede comprender una, dos o tres o¦ más' clases de celulasa, por ejemplo una, dos o todas de una endo-1 , 4- -glucanasa (EG) , un exo-celobiohidrolasa (CBH) y una ß-glucosidasa (BG) .
Una composición . de la invención puede comprender un polipéptido que tiene la misma- actividad enzimática, · por ejemplo el mismo tipo de celulasa, hemicelulasa y/o actividad de pectinasa como aquella proporcionada por un polipéptido de la invención.
Una composición de la invención puede comprender un polipéptido que tiene un tipo diferente de- actividad de celulasa y/o actividad d hemicelulasa y/o de actividad de pectinasa que aquella proporcionada por un polipéptido de la invención. Por ejemplo, una composición de la invención puede comprender un tipo de actividad de celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionada por un polipéptido de la invención y un segundo tipo de actividad de celulasa y/o hemicelulasa y/o actividad de pectinasa proporcionada por una hemicelulasa/pectinasa adicional.
En este punto, una celulasa es . cualquier polipéptido que sea capaz de degradar una . celulasa. Un polipéptido que es capaz de degradar la celulasa es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper' la celulasa en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en celodextrinas, o completamente en monómeros de glucosa. Una celulasa de acuerdo con la invención puede dar origen a- una población mezclada de celodextrinas y monómeros . de glucosa cuando se pone en contacto con la celulasa. Tal degradación se llevará a cabo típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.
En este punto, una hemicelulasa es cualquier polipéptido que sea capaz de degradar una hemicelulosa . Es decir, una hemicelulasa puede ser capaz de degradar uno o más de xilano, glucuronoxilano, arabinoxilano, glucomanano y xiloglucano. Un polipéptido que es capaz de degradar una hemicelulosa es uno que es capaz de catalizar el proceso de romper la hemicelulosa en polisácáridos más pequeños, a sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar, por ejemplo monómeros de azúcar de hexosa o pentosa. Una hemicelulasa de acuerdo con la invención puede dar origen a una población mezclada de oligosacáridos y monómeros de azúcar cuando se ponen en contacto con la hemicelulasa. Tal degradación se llevará cabo típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.
En ' este . punto, una pectinasa es cualquier polipéptido que es capaz de degradar una pectina. Un polipéptido que es capaz de degradar la pectina es µ?? que es capaz de catalizar el proceso de romper la pectina en unidades más pequeñas, ya sea parcialmente, por ejemplo en oligosacáridos, o completamente en monómeros de azúcar. Una pectinasa de acuerdo con la invención puede dar origen a una población mezclada de oligosacáridos y monómeros de' azúcar cuando se pone en contacto con la pectinasa. Tal¦ degradación se llevará a cabo típicamente por medio de una reacción de hidrólisis.
Por consiguiente, una composición de la invención puede comprender cualquier celulasa, por ejemplo, una celobiohidrolasa, una endo-ß-? , 4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß-(1,3) ( 1 , 4 ) -glucanasa .
En este punto, una celobiohidrolasa es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la hidrólisis de enlaces 1, 4^-D-glucosídicos en la celulosa o celotetraosa , liberando celobiosa de los extremos de las cadenas. Esta enzima también se puede referir como celulasa, 1,4-ß-celobiosidasa, 1, 4^-celobiohidrolasa, 1, 4^-D-glucan-celobiohidrolasa , avicelasa exo-1, 4^-D-glucanasa, exo-glucanasa o exoglueanasa . ' Puede tener el código EC 3.2.1.91.
En este punto, una endo-ß-?, 4-glucanasa (EC 3.2.1.4) es cualquier polipéptido que es capaz de. catalizar la endohidrólisis de los enlaces 1 , -ß-D-glucosídicos en la celulosa, ß-D-glucanos de liquenina o cereal. Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar los 1,4-enlaces en los ß-D-glucanos también que contienen . también 1,3-enlaces. Esta enzima también se puede referir como celulasa, avicelasa, ß-1, 4-endoglucan-hidrolasa, ß-?, 4-glucanasa, ¦ carboximetil-celulasa, celudextrinasa, endo-1 , 4-3-D-glucanasa, ß???-1,4-ß-D-glucanohidrolasa, endo-1 , 4- -glucanasa o endoglucanasa. El CEA en este documento es una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que se basa en su estructura 3D que se clasifica, bajo la familia de Glicosil-Hidrolasa 5 (GH5). Las actividades conocidas por él miembro de la familia GH5 incluyen qu tosanasa (EC 3.2.1.132); ß-manosidasa (EC 3.2.1.25); Celulasa ¦ (EC 3.2.1.4); glucan-1, 3- -glucosidasa (EC 3.2.1.58); liqueninasa (EC 3.2.1.73); glucan endo-1, d-ß-glucosidasa (EC 3.2.1.75); mañano endo-ß-?, 4-manosidasa (EC 3.2.1.78); . endo^-l,4-xilanasa (EC 3.2.1.8); celulosa ß-1, 4—celobiosidasa (EC 3.2.1.91); endo-ß-?, 6-galactanasa (EC 3.2.1.-)·; ß-1,3-mananasa (EC 3.2.1.-); endo-ß-?, 4-glucanasa especifico de xiloglucano (EC 3.2.1.151); manano-transglicosilasa (EC 2.4.1.-). El CEB en este documento es una endoglucanasa EC 3.2.1.4 que se basa en su^ estructura 3D, se clasifica bajo la familia de Glicosil-Hidrolasa 7 (GH7). Las actividades conocidas para los miembros de la familia GH7 incluyen endo-ß-1 , -glucanasa (EC 3.2.1.4); [extremo de reducción de acción] celobiohidrolasa (EC 3.2.1.-); quitosanasa (EC 3.2.1.132) ; endo-ß-? , 3-1, 4-glucanasa (EC 3.2.1.73) .
En este punto, una ß-glucosidasa (abreviada BG) (EC 3.2.1.21) es cualquier polipéptido que es. capaz de' catalizar . ¦ ' ¦ ¦' ·' 97 la hidrólisis de los residuos de ß-D-glucosa no de reducción, terminales con la liberación de ß-D-glucosa. Tal polipéptido puede tener una amplia especificidad para los ß-D-glucósidos y también puede hidrolizar uno o más de los siguientes: un ß-D-galactosida, una a-L-arabinosida,.. un ß-D-xilósido o un ß-D-fucósido. Esta enzima también se puede referir como amigdalasa, ß-D-glucósido-glucohidrolasa, celobiasa o gentiobiasa.
En este punto una ß- (1, 3i) (1, 4 ) -glucanasa (EC 3.2.1.73) es cualquier .polipéptido que. sea capaz de catalizar la hidrólisis de los enlaces 1 , 4-3-D-glucosidicos en ß-?^-glucanos que contienen enlaces 1,3- y 1,4-. Tal polipéptido puede actuar en los . ß-D-glucanos de liquenina y cereal, pero no en los ß-D-glucanos que contienen solamente enlaces .1,3- o 1,4-. Esta enzima también se puede, referir como liqueninasa, 1 , 3-1 ,-4^-D-glucano 4-glucanohidrolasa, ß-glucanasa, endo-ß-1, 3-1, -glucanasa, enlace de liquenasa o mezclado de ß-glucanasa. Una alternativa para este tipo de enzima es EC 3.2.1.6, que se describe como endo-1 , 3 ( ) -beta-glucanasa . Este tipo de enzima hidroliza enlaces 1,3- o 1,4- en. los beta-D-glucanos cuando el residuo de glucosa cuyo grupo reductor se implica en el enlace que se hidroliza se sustituye en C-3. Nombres alternativos incluyen endo-1, 3-beta-glucanasa, laminarinasa, 1 , 3- ( 1 , 3 ; 1 , 4 ) -beta'-D-glucano 3 (4) glucanohidrolasa; substratos incluyen laminarina, beta-D-glucanos de liquenina y cereal.
Una composición de acuerdo con la invención puede comprender una enzima de la familia GH61 o cualquier otra enzima que tenga actividad po.tenciadora de celulasa.
La actividad potenciadora de celulasa se define en este punto por aumentar la actividad de por lo menos una celulasa, y de manera preferente es ' la actividad GH61. Cuando una actividad potenciadora de celulasa está presente · en una mezcla, con una o más celulasas, por ejemplo en una mezcla con celobiohidrolasa (CBH) y beta-glucosidasa (BG) ,¦ aumentará la actividad de estas celulasas, que dará por resultado una mayor actividad de la mezcla para degradar la celulasa. Las enzimas en la familia GH61 se clasificaron originalmente como una familia de glicósido-hidrolasa con base en la medición de la actividad de endo-1 , -b-D-glucanasa muy débil ' én un miembro' de la familia (endoglucanasa ' (EC 3.2.1.4)). La estructura y modo de acción de estas enzimas son ciertamente no canónicas y no se pueden considerar como glicosidasas de buena fe. Sin embargo, se mantienen en la clasificación CAZ . y sobre la base de su capacidad para aumentar la descomposición de la lignocelulosa cuando se usa en conjunción con una celulasa o una mezcla de celulasas. Una revisión de los miembros conocidos de la familia GH61 se proporciona, en la figura 5 de Harris, PV y colaboradores, Biochemistry 2010, 49, 3305-3316.
Una composición de la invención puede comprender cualquier hemicelulasa, por ejemplo, una endoxil.anasa, una xilosidasa, una a-L-arabionofuranosidasa, una a-D-glucuronidasa, una. acetil-xilan-esterasa, una feruloil-esterasa, una cumároil-esterasa , una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa, una ß-mananasa o una ß-manosidasa .
En este punto, una endoxilanasa (EC 3.2.1.8) es cualquier polipéptido que es capaz de catalizar la endohidrólisis de enlaces 1 , 4^-D-xilosidicos en los xilanos. Esta enzima también se puede referir como endo-1, 4^-xila.nasa o 1, 4^-0-xilano-xilanohidrolasa . Una alternativa es EC 3.2.1.136, una glucuronoarabinoxilan-endoxilanasa , una enzima que es capaz de hidrolizar enlaces 1, 4-xilosidicos en los glucuronoarabinoxilanos .
En este punto, una ß-xilosidasa (EC 3.2.1.37) es cualquier polipéptido que es capaz- de catalizar la hidrólisis de 1, 4^-D-xilanos, para remover los residuos de D-xilosa sucesivos de las terminales no reductoras. Tales enzimas también pueden hidrolizar la xilobiosa. Esta enzima también se puede referir como xilan-l, 4^-xilosidasa, 1 , 4 -ß-D-xilan-xilohidrolasa, exo-1, -^-xilosidasa o xilobiosa.
En este punto, una a-L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que es capaz de actuar sobre a-L-arabinofuranósidos, -L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5)-, arabinoxilanos y arabinogalactanos . ¦ Esta enzima también se puede referir como a-N-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .
En este punto, una a-D-glucuronidasa (EC .3.2.1.139) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la siguiente forma: alfa-D-glucuronosida + H(2)0 = un alcohol + D-glucuronato . Esta enzima también se puede referir como alfa-glucuronidasa o alfa-glucosiduronasa . Estas enzimas también pueden, hidrolizar el ácido glucurónico 4-0-metilado, que también puede estar presente como un sustituyente en los xilanos. Alternativa es EC 3.2.1.131: xilan-alfa-1 , 2-glueuronosidasa, que cataliza la hidrólisis de los enlaces alfa-1 , 2- ( -0-metil ) glucuronosilo .
En este punto, una acetil-xilan-esterasa (EC 3.1.1.72) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la desacetilación de los xilanos y xilo-oligosacáridos . Tal polipéptido puede catalizar la. hidrólisis de los grupos acetilo del xilano polimérico, xilosa acetilada, glucosa acetilada, acetato de alfa-naftilo o acetato de p-nitrofenilo pero, típicamente, - no del triacilglicerol . Tal polipéptido tampoco puede actuar sobre el mañano o pectina acetilados.
En ese punto, una feruloil-esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma:, ferulil-sacárido + H(2)0' = ferulato + sacárido. El sacárido puede' ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Puede catalizar típicamente la hidrólisis del grupo .4-hidroxi-3-metoxicinamoilo (ferüloilo) de un azúcar esterificada, que es usualmente arabinosa en substratos "naturales" . [ El acetato de p-nitrofenol y el ferulato de metilo son típicamente substratos más pobres. Esta enzima también se puede referir ;como cinamoilo éster hidrolasa, ácido ferúlico' esterasa o hidroxicinamoil-est.erasa . También puede referirse como una enzima de accesorio de hemicelulasa, puesto que puede. ayudar a las xilanasas y pectinasas a descomponer la hemicelulosa y pectina de la pared celular de la planta.
En este punto, una cumaroil-esterasa (EC 3.1.1.73) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar una reacción de la forma: cumaroil-sacároido + H(2)0 = coumarato + sacárido. El sacárido puede ser, por ejemplo, un oligosacárido o un polisacárido. Esta enzima también se puede referir como trans-4-cumaroil-esterasa, trans-p-cumaroil-esterasa, p-cumaroil-esterasa o ácido p-cumárico-esterasa . Esta enzima también se encuentra dentro de EC¦ 3.1.1·.73 de modo que se puede referir como feruloil-esterasa .
En este punto, una -galactosidasa (EC 3.2.1.22) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos a-D-galactosa no ' reductores, terminales en los a-D-galactósidos, incluyendo oligosacáridos de galactosa, galactomananos, galactanos y arabinogalactanos . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar -D-fucósidos. Esta enzima también se puede referir como melibiasa .
En este punto, una a-galactosidasa (EC 3.2.1.23) es cualquier polipéptido que .sea capaz de catalizar - . la hidrólisis de los . residuos de ß-D-galactosa no reductores terminales en ß-D-galactósidos . Tal polipéptido también puede ser capaz de hidrolizar -L-arabinósidos . Esta enzima también se puede referir como exo- ( l->4 ) -ß-D-galactanasa o lactasa.
En- este punto, una ß-mananása (EC 3.2.1.78) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1, 4-p-D-manosidicos en mananos, galactomananos y glucomananos. Esta enzima también se puede referir como endo-1, 4^-manosidasa o endo-1, 4-mananasa.
En este punto, una ß-manosidasa (EC' 3.2.1.25) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos de ß-D-manosa no reductores, terminal en ß-D-manósidos . Esta enzima también se puede referir como mananasa o manasa.
Una composición de la invención puede comprender cualquier pectinasa, por ejemplo una endo poligalacturonasa, una pectina-metil-esterasa, una endo-galactanasa, una beta-galactosidasa, una pectina-acetil-esterasa, un endo-pectin-liasa, pectato-liasa, alfa ramnosidasa, un exo-galacturonasa, una exo-poligalacturonato-liasa, una ramnogalacturonano-hidrolasa, una ¦ ramnogalacturonano-liasa, una ramnogalacturonan-acetil-esterasa ,¦ una ramnogalacturonan-galacturonohidrolasa o una xilogalacturonasa .
En este punto, una endo-poligalacturonasa (EC 3.2.1.15) es cualquier .polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces es. cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis aleatoria de enlaces 1, 4-cx-D-galactosidur.ónicos en el pectato y otros galacturonanos . Esta enzima también se puede referir como poligalacturonasa-pectin-depolimerasa, ¦ pectinasa, endopoligalacturonasa, pectolasa, pectin-hidrolasa , pectin-poligalacturonasa, poli-a-1 , -galacturonido-glicanohidrolasa , y endogalacturonasa; endo-D-galacturonasa-glicanohidrolasa o poli (1, -a-D-galacturonido) En este punto, una pectin-metil-esterasa . (EC 3.1.1.11) es cualquier enzima que sea capaz de catalizar la reacción: pectin + n H2O = n metanol + pectato. La enzima también puede haber sido conocida como pectinasterasa, pectin-demetoxilasa, pectin-metoxilasa, pectin-metilesterasa, pectasa, pectin-esterasa o pectin-pectilhidrolasa.
En este punto, un endo-galactanasa (EC 3.2.1.89) es cualquier enzima' capaz de catalizar. la hidrólisis de enlaces 1 , 4- ~D-galactosídicos en arabinogalactanos . La enzima también puede ser conocida como arabinogalactan endo-l,4-p-galactosidasa, endo-1, 4^-galactanasa, galactanasa, arabinogalactanasa o arabinogalactan 4-ß-?-galactanohidrolasa .
En este punto, una pectin-acetil-esterasa ' se' define en este documento como cualquier enzima que tenga una actividad de acetil-esterasa que catalice la desacetilación de los grupos acetilo en los grupos hidroxilo de los residuos de GaiUA de pectina.
En este punto, una endo-pectin-liasa (EC 4.2.2.10) es cualquier enzima capaz de catalizar ' la escisión eliminativa de éster metílico de ( 1? ) -oí-D-galacturonano para proporcionar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-6-0-metil-oc-D-galact-4-enuronosilo . en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como pectin-liasa pectin-trans-eliminasa; endo-pectin-liasa, polimetilgalacturónico-transeliminasa, pectin-metiltranseliminasa, pectoliasa, ' PL, PNL o P GL o ( 1?4 ) -6-0-metil- -D-galacturonan-liasa .
En este punto, una pectato-liasa (EC 4.2.2.2) es cualquier enzima capaz de catalizar la escisión eliminativa de ( l-»4 ) -a-D-galacturonano para proporcionar oligosacáridos con grupos 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosilo en sus extremos no reductores. La enzima también puede ser conocida como poligalacturónico-transeliminasa, ácido péctico transeliminasa, poligalacturonato-liasa, endopectin-metiltranseliminasa,- pectato-transeliminasa, endogalacturonato-transeliminasa, ácido péctico-liasa, liasa péctica, una ácido a- , 4-D-endopolugalacturónico-liasa, PGA liasa, PPasa-N, ácido endo-a-1, 4-poligalacturónico-liasa, ácido poligalacturónico-liasa, pectin-trans-eliminasa, ácido poligalacturónico-trans-eliminasa o (1?4 ) -a-D-galacturonan-liasa.
En este punto, una alfa-ramnosidasa (EC 3.2.1.40) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar la hidrólisis de los residuos -L-ramnosa no. reductores terminales en a-L-ramnósidos o alternativamente en ramnogalacturonano . Esta enzima también puede ser conocida como a-L-ramnosidasa T, a-L-ramnosidasa N o -L-ramnósido-ramnohidrolasa.
En este punto, la exo-galacturonasa (EC 3.2.1.82) es cualquier polipéptido. capaz de. la hidrólisis 'del ácido péctico del digalacturonato de liberación, de extremo no reductor. La enzima también puede ser conocida como exo-poli-a-galacturonosidasa, exopoligalacturonosidasa o exopoligalacturanosidasa .
En este punto, la exo-galacturonasa (EC3.2.1.67.) capaz de catalizar: (1 , 4-a-D-galacturonido) n + H20 = es cualquier polipéptido capaz' de (1, 4-a-D-galacturonido) n-i + D-galacturonato. La enzima también puede ser conocida como galacturan-1 , 4-a-galacturonidasa, exopoli.galacturonasa, poli (galacturonato) -hidrolasa, exo-D-galacturonasa, exo-D-galacturonanasa, exopoli-D-galacturonasa o ¦ poli (1, 4-a-D-galacturonido) galacturonohidrolasa . , En- este punto, una exopoligalacturonato-liasa (EC 4.2.2.9) es cualquier polipéptido capaz de catalizar la escisión eliminativa de 4- ( 4-desoxi-a-D-galact-4-enuronosil) -D-galacturonato del extremo reductor del pectato, es decir la pectina esterificada . Esta enzima puede ser conocida como pectato-disacádico-liasa , pectato-exo-liasa, ácido exopéctico-transéliminasa, exopectato-liasa, ácido exopoligalacturónico-trans-eliminasa, PATE, exo-PATE, exo-PGL o disacárido de extremo reductor ( 1?4 ) -a-D-galacturonano-liasa.
En este punto, .la ramnogalacturonano-hidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar el enlace entre el ácido galactosilurónico y ramnopiranosilo en una endo-forma en estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes, que consisten del disacárido [ácido ( 1·, 2-alfa-L-ramnoil- (1,4) -alfa-galactosilurónico] .
En este. punto, la ramnogalacturonan-liasa es cualquier polipéptido que sea cualquier polipéptido que sea capaz de escindir enlaces a-L-Rhap- ( 1? ) -a-D-GalpA en una endo-forma en el ramnogalacturonano por la beta-eliminación .: En este punto, la ramnogalacturonano-acetil-esterasa es cualquier polipéptido que . cataliza la desacetilacion de la cadena principal de los residuos de ramnosa y ácido -galacturónico alternantes . en . el ramnogalacturonano.
En este. punto, la ramnogalacturonan-galacturonohidrolasa es cualquier polipéptido que sea capaz de hidrolizar el ácido galacturónico del extremo no reductor de estructuras de ramnogalacturonano estrictamente alternantes en una exo-forina.
En este punto,, la xilogalacturonasa es cualquier polipéptido que actúe sobre xilogalacturonano al escindir la cadena principal del ácido galacturónico sustituido con ß-xilosa en una enodo-manera . Esta enzima también puede ser conocida como xilogalacturonan-hidrolasa .
En este punto, una -L-arabinofuranosidasa (EC 3.2.1.55) es cualquier polipéptido que sea capaz de actuar sobre -L-arabinofuranósidos, -L-arabinanos que contienen enlaces (1,2) y/o (1,3)- y/o (1,5), arabinoxilanos y arabinogalactanos . Esta enzima también se puede referir como a-?-arabinofuranosidasa, arabinofuranosidasa o arabinosidasa .
En este punto, la endo-arabinanasa (EC 3.2.1.99) es cualquier polipéptido que sea capaz de catalizar endohidrólisis de los enlaces 1., 5-a-arabinofuranosidicos en 1 , 5-arabinanos . La enzima también puede ser conocida como endo-arabinasa, arabinan-endo-1 , 5-oí-L-arabinosidasa, endo-1 , 5-a-L-arabinanasa, endo-a-1 , 5-arabanasa; endo-arabanasa o 1, 5-oí-L-arabinan 1, 5-a-L-arabinanohidrolasa .
Una composición de la invención comprenderá típicamente por lo menos una celulasa y/o por lo menos una hemicelulasa y/o por lo menos una pectinasa (una de las cuales es un polipéptido de acuerdo con la invención) . Una composición de la invención puede. comprender una celobiohidrolasa, una endoglucanasa y/o una ß-glucosidasa . Tal composición también puede comprender una o más hemicelulasas y/o una o más pectinasas.
Una o más (por ejemplo dos, tres, cuatro o todas) de una amilasa, una proteasa, una lipasa, una ligninasa, una hexosiltransferasa o una glucuronidasa pueden estar presentes en una composición de la invención.
"Proteasa" incluyen enzimas que hidrolizan enlaces de péptido (peptidasas) , así como también enzimas que hidrolizan enlaces entre los péptidos y otras porciones, tales como azúcares (glicopeptidasas ) . Muchas proteasas se caracterizan bajo. EC 3'.4, y son adecuadas para el uso en la invención incorporada en este documento a manera de referencia. Algunos tipos específicos de proteasas incluyen, cisteína proteasas que incluyen pepsina, papaína y serina-proteasas que incluyen quimotripsinas , carboxipeptidasas y metaloendopeptidasas .
"Lipasa" incluye enzimas, que hidrolizan lípidos, ácidos grasos y acilglicéridos, incluyendo fosfoglicéridos, lipoproteínas , diacilgliceroles , y similares. En plantas, los lípidos se usan como componentes estructurales para limitar la pérdida de agua e infección patógena. Estos lípidos incluyen ceras derivadas de ácidos grasos, así como también cutina y suberina.
"Ligninasa" incluye enzimas que pueden hidrolizar o descomponer la estructura de los polímeros de lignina. Las enzimas que pueden descomponer la' lignina incluyen ligninas peroxidasas, manganeso-peroxidasas lacasas y feruloil-esterasas, y otras enzimas descritas en la técnica conocida para despolimerizar o de otra manera descomponer polímeros de lignina. También se incluyen enzimas capaces de hidrolizar enlaces formados. entre los azúcares hemicelulósicas (notablemente arabinosas) y lignina. Las ligninasas incluyen pero no se limitan al' siguiente .grupo de enzimas: lignina-peroxidasas (EC 1.11.14), manganesa-peroxidasas (EC 1.11.1.13), lacasas (EC 1.10.3.2) y feruloil-esterasas (EC 3.1.1.73) .
"Hexosiltransferasa" (2.4.1-) incluye enzimas, que son capaces de transferir grupos licosilo, más específicamente grupos hexosilo. Además de la transferencia de un grupo glicosilo de un donador que contiene glicosilo a otro compuesto que contiene glicosilo, el aceptor, las enzimas también pueden transferir el grupo glicosilo al agua como un aceptor. Esta reacción también es conocida como una reacción de hidrólisis, en lugar de una reacción de transferencia. Un ejemplo de una hexosiltransferasa que se puede usar en la invención es una ß-glucanosiltransferasa . Tal enzima puede ser capaz de catalizar la degradación del (1,3) (l,4)glucan y/o celulosa y/o un producto de degradación de celulosa.
"Glucuronidasa" incluye enzimas que catalizan la hidrólisis de un glucoronósido, por ejemplo ß-glucuronosida para producir una alcohol. Muchas glucuronidasas se han caracterizado y pueden ser adecuadas para el uso en la invención, por ejemplo ß-glucuronidasa (EC 3.2.1.31), hialurono-glucuronidasa (EC 3.2.1.36), glucuronosil-disulfoglucosamina-glucuronidasa (3.2.1.56), glicirrizinato- -glucuronidasa (3.2.1.128) o a-D-glucuronidasa (EC 3.2.1.139).
Una composición de la ' invención puede comprender una expansina o proteína similar a expansina, tal. como una swollenina (véase Salheimo y colaboradores., Eur. J. Biohem. 269, 4202-4211, 2002) o una proteína similar a swollenina.
Las expansinas están implicadas en la pérdida de la estructura de la pared celular durante el crecimiento de la célula de planta. Las expansinas se «han propuesto para alterar el enlace de hidrógeno entre . la celulosa y otros polisacáridos de . la , pared celular sin tener ' actividad hidrolítica. De esta manera, se cree que - permiten el deslizamiento de las fibras de celulosa y el agrandamiento de la pared celular. La swollenina, una proteína similar a expansina contiene un dominio de la Familia .de Módulo de Enlace de Carbohidrato N-terminal 1 ¦ (CBD) y un. dominio similar a la expansina C-terminal.. Para los propósitos de esta invención, una pr'oteína similar a expansina o próteína similar a swollenina pueden comprender uno o ambas de tales dominio y/o pueden- alterar la estructura de las 'paredes celulares (tal como alterar la estructura de la celulosa) , opcionalmente introducir cantidades detectables de azúcares reductoras .
Una composición de la invención puede' comprender el producto de polipéptido de una proteína de integración de celulosa, escafoldina o una proteína similar a escafoldina, por ejemplo CipA. o CipC de Clostridium thermocellum o Clostridium cellulolyticum respectivamente.
Las escafoldinas y las proteínas de integración de celulosa son subunidades de integración multifuncionales que pueden organizar subunidades celulóticas en un complejo de múltiples enzimas. Esto se logra por la interacción de dos clases complementarias de dominio, es decir un dominio de cohesión sobre la escafoldina y un dominio', de doquerina sobre cada unidad enzimática. La subunidad de escafoldina también lleva un módulo de enlace a celulosa (CBM) que media la unión del celulosoma a su substrato. Una escafoldina o una proteína de integración a celulosa para los propósitos de esta invención pueden comprender uno o ambos de tales dominios.
Una composición de la invención puede · comprender una proteína inducida por celulosa o proteína de modulación, por ejemplo como se codifica por el gen cipl o cip2 o genes similares de Trichoderma reesei 1 Hypocrea jecorina (véase Foreman y colaboradores., J. Biol. Chem. 27.8 (34), 31988-31997, 2003). El producto de polipéptido de estos genes son proteínas bimodulares, que contienen un módulo de enlace a celulosa y un dominio que funciona .o actividad que .no se puede relacionar con las familias de gicosilhidrolasa conocidas. Todavía, la presencia de un enlace a celulosa y la corregulación de la expresión de estos genes con componentes de celulasas indican actividades previamente no reconocidas con funciones potenciales en la degradación de la biomasa.
Una composición de la invención se puede componer de un miembro de cada una de las clases de los polipéptidos mencionados en lo anterior, varios miembros de una clase de polipéptidos, o cualquier combinación de estas clases de polipéptido.
Una composición de la invención se puede componer de polipéptidos, por ejemplo enzimas, de (1) proveedores comerciales; (2) polipéptidos que. expresan genes clonados, por ejemplo enzimas; (3) caldo complejo (tal como aquel que resulta del crecimiento de una cepa microbiana n el medio, en donde las cepas secretan proteínas y enzimas en el medio; (4) lisados celulares de cepas desarrolladas como en (3); y/o (5) polipéptidos que expresan material de planta, por ejemplo enzimas. Diferentes polipéptidos, por ejemplo enzimas en una composición de la invención se pueden obtener de diferentes fuentes.
Uso de los polipéptidos Los polipéptidos y composiciones de polipéptido de acuerdo con la invención se pueden.- usar en muchas aplicaciones diferentes. .Por ejemplo se pueden usar para producir azúcares fermentables . Los azúcares fermentables luego pueden, como parte del proceso de biocombustible, ser convertidas en bio'gas o etanol, butanol, isobutanol, 2 butanol u otras sustancias adecuadas. Alternativamente los polipéptidos y sus composiciones sé pueden usar como enzima, por ejemplo en la producción de productos alimenticios, en composiciones detergentes, en la industria del papel y pulpa en formulaciones antibacterianas, en productos, farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, dentífricos y lavados bucales. Algunos de los usos se ilustrarán con más detalle a continuación.
En los usos y métodos descritos a continuación, los componentes de las composiciones descritas en lo anterior se pueden proporcionar concomitantemente (es decir como una sola composición per se) o separada o secuencialmente . ¦ .' La invención también . se refiere al uso del polipéptido acetil-xilan-esterasa de acuerdo con la . invención y composiciones que comprenden tal enzima en los procesos industriales a pesar de la experiencia a largo plazo obtenida con estos procesos, él polipéptido acetil-xilan-esterasa de acuerdo con la invención puede caracterizar una variedad de ventajas significativas sobre las enzimas actualmente usadas. Dependiendo de la aplicación especifica, estas ventanas pueden incluir aspectos tales como, menores costos de producción, mayor especificidad hacia el substrato, antigenicidad reducida, pocas actividades secundarias indeseables, rendimientos mayores cuando se produce en un microorganismo adecuado, intervalos de pH y temperatura más adecuados, no inhibición por productos derivados de lignina, hidrofóbicos o menos inhibición de .producto, o en. el caso de la industria alimenticia¦ un mejor sabor o textura de un producto final asi como también un grado alimenticio y aspectos kosher.
En principio, un polipéptido : acetil-xilan-esterasa o composición de la invención se puede usar- en cualquier proceso que requiera el tratamiento de un material que comprenda polisacárido . De esta manera, un polipéptido o composición de la invención se puede usar en el tratamiento de material de polisacárido. En este punto, un material de polisacárido es un material que comprende o consiste esencialmente de uno. o, más típicamente, más de un polisacárido.
Típicamente, las plantas y materiales derivados de la misma comprenden cantidades significativas de material de polisacárido no de almidón. Por consiguiente, un polipéptido de la invención se puede usar en el tratamiento de una planta o material fúngico o un material derivado de los mismos.
Lignocelulosa Un componente importante del .material ' de polisacáridos no :de almidón de plantas es la. lignocelulosa (también referida en este documento como biomasa lignocelulolitica) . La lignocelulosa es el material de planta que comprende celulosa y . hemicelulosa y lignina. Los polímeros de carbohidratos (celulosa . y hemicelulosas ) se enlazan estrechamente a la lignina por los enlaces de hidrógeno y covalentes. Por consiguiente, un polipéptido de la invención se puede usar en el tratamiento de material lignocelulolítico. En este punto, el material lignocelulolítico .es un material que comprende o consiste esencialmente de lignocelulosa. De esta manera, en un método de la invención .para el tratamiento.de un polisacárido no de almidón, el polisacárido no de almidón puede ser un material/biomasa lignocelulósica .
Por consiguiente, la invención proporciona un método para tratar. un substrato que comprende pplisacárido no de almidón en el. cual el tratamiento comprende la degradación y/o hidrólisis y/p . modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.
La degradación en este contexto indica que el tratamiento da por resultado la generación de productos de hidrólisis de celulosa y/o hemicelulosa y/o una. sustancia péctica, es decir . sacáridos de longitud más corta están presentes como resultado del tratamiento que están, presentes en un polisacárido no de no almidón no tratado similar. De esta manera, degradación en este, contexto puede dar, por resultado la liberación de oligosacáridos y/o monómeros de azúcar.
Todas las. plantas contienen polisacáridos no de almidón como lo tienen virtualmente todos los materiales de polisacárido derivados de plantas.- Por consiguiente, en un método de la invención para el tratamiento de substrato que comprende un polisacárido no de almidón, el substrato se puede proporcionar en una forma de una planta o un material derivado de planta o un material que comprende una planta o material derivado de ¦ planta, por ejemplo, una pulpa de planta, un extracto de planta, un articulo alimenticio o ingrediente del mismo, una tela, un textil o un' articulo de ropa .
La biomasa lignocelulolitica adecuada para el uso en la invención incluye biomasa y puede incluir biomasa virgen y/o biomasa no virgen tal como biomasa agrícola, orgánicos comerciales,, restos de construcción y demolición, residuos sólidos municipales, papel residual y residuo de jardín. Las ' formas comunes de biomasa incluyen, árboles, matojos y pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz incluyendo fibra de granos, productos y subproductos de molienda de granos tales como maíz, trigo y ' cebada (incluyendo molienda en húmedo y molienda en seco) frecuentemente llamado, "salvado o. fibra" así- como también residuos sólidos municipales, papel residual y residuos de jardín. La biomasa también puede ser, pero no se . limita a, material herbáceo, , residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales-, papel residual y residuos de molienda de pulpa y papel. "Biomasa agrícola" incluye ramas, arbustos, - cañas, maíz y cáscaras de maíz, cultivos energéticos, bosques,. frutas, flores, granos, pastos, cultivos herbáceos, hojas, corteza, agujas, troncos, raíces, árboles jóvenes, cultivos de madera, de rotación corta, matojos, pastos varilla, árboles, vegetales', cáscaras de fruta, vides, pulpa de remolacha azucarera, afrecillos de trigo, cáscaras de avena, y maderas duras y blandas (no incluyen maderas con materiales perjudiciales) . Además, la biomasa agrícola incluye materiales residuales orgánicos generados de procesos agrícolas incluyendo actividades de granja y forestales, específicamente incluyendo residuo de madera forestal. La biomasa agrícola puede ser cualquiera de lo ya establecido singularmente o en cualquier combinación o mezcla de los mismos. Ejemplos adicionales de biomasa adecuada son hojas del primer foliar de huertos, matorral, residuo de molienda, residuo de madera urbano, residuo municipal, residuo de tala de árboles, aclareos forestales, cultivos de madera de rotación corta, residuo industrial, paja de trigo, paja de avena, paja de arroz, paja de cebada, paja de centeno, paja de lino, cáscaras de soya, cáscara.s de arroz, paja de arroz, alimentació de gluten de maíz, cáscaras de avena, caña de azúcar, rastrojo de maíz, tallos de maíz, mazorcas de maíz, cáscaras de maiz, pasto de la pradera, maicillo, cola de. zorro; pulpa de remolacha azucarera, pulpa de fruta cítrica, cáscaras de semillas, residuos celulósicos de animal, recortes de césped-, algodón, algas, árboles^ matojos, pastos, trigo, paja de trigo, bagazo de caña de azúcar, maíz, cáscaras' de maíz, mazorcas de maíz, grano de maíz, fibra de .granos, productos y subproductos de molienda en húmedo o en seco de granos, residuos sólidos municipales, papel residual, residuos de jardín, material herbáceo, residuos agrícolas, residuos forestales, residuos sólidos municipales, papel residual, pulpa, .residuos de molienda de papel, ramas, arbustos, cañas, maíz, cáscaras de maíz, un cultivo energético, bosque, una fruta, una flor, un grano, un pasto, un cultivo herbáceo, una hoja, corteza, una aguja, un tronco, una raíz, un árbol joven, un matojo, pasto varilla, un árbol, un vegetal, cáscara de fruta, una vid, pulpa de- remolacha azucarera, afrecillos de trigo, cáscaras de avena, madera dura o blanda, material residual orgánico generado de un proceso agrícola, residuo de madera forestal, o una combinación de cualquiera de dos o más de los mismos.
Aparte de la biomasa virgen o materias primas ya procesadas en industrias de alimentos y piensos o papel ' y pulpa, la biomasa/materia prima se puede pretratar adicionalmente con modificación con calor, mecánica y/o química o cualquier combinación de tales métodos a fin de aumentar la degradación enzimática.
Pretratam ento Antes del tratamiento enzimático, la materia prima se puede pre-tratar opcionalmente con modificación con calor, mecánica y/o química o cualquier cómbinación de tales métodos a fin de aumentar accesibilidad del substrato a hidrólisis enzimática y/o hidrolizar la hemicelulosa y/o solubilizar la hemicelulosa y/o celulosa y/o lignina, en cualquier forma conocida en la técnica. El pretratamiento puede comprender exponer el material lignocelulósico a agua (caliente), vapor (explosión de vapor) , un ácido, una base, un solvente, calor, un peróxido, ozono, trituración mecánica, molienda, o despresurización rápida, o una combinación de cualquiera o uno más de los mismos. Un pretratamiento químico se combina frecuentemente con pretratamiento con. calor, por ejemplo entre 150-220°C durante 1 a 30 minutos.
Presacarificación Después del paso de pretratamiento, se puede usar un paso de licuefacción/hidrólisis o presacarificación que implica la incubación con una enzima o mezcla de enzimas. El paso de presacarificación se puede llevar a cabo en muchas temperaturas diferentes pero se. prefiere que el paso de presacarificación se presente en la temperatura mejor adecuada a la mezcla de enzimas que se aplica, ó el óptimo de enzima predicha de las enzimas que se aplican.. La temperatura del paso de presacarificación puede variar de aproximadamente 0°C a aproximadamente 95°C, de aproximadamente 20°C a aproximadamente 85°C, de aproximadamente' 30°C a aproximadamente '70°C, de aproximadamente 40°C a aproximadamente 60°C, de aproximadamente 37°C a aproximadamente 50°C, preferiblemente aproximadamente 37°C a aproximadamente 8Ó°C, más preferiblemente' de' aproximadamente 60°C-70°C pero es de manera preferente de aproximadamente 65°C. El pH de la mezcla de presacarificación puede variar de aproximadamente 2.0 a aproximadamente 10.0, pero es de manera preferente de aproximadamente 3.0 a aproximadamente 7.0, de manera más preferente de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 6.0, aún de manera más preferente de aproximadamente 4.0 a aproximadamente 5.0'. Nuevamente, el pH se puede ajustar para maximizar la actividad enzimática y se puede ajustar con la adición de la enzima.
La reacción del paso de licuefacción/hidrólisis o presacarifi'cación puede presentarse de varios minutos ¦ a varias horas, tal como de aproximadamente 1 hora a aproximadamente a 120 horas, de manera preferente de aproximadamente 2 horas aproximadamente a 48 horas, de manera más preferente de. aproximadamente 2 a aproximadamente 24 horas, de manera mucho más preferente de aproximadamente 2. a aproximadamente 6 horas. El tratamiento con celulasa puede presentarse de varios minutos a varias horas tal como de aproximadamente 6 horas aproximadamente 120 horas, de. manera preferente de aproximadamente 12 a aproximadamente 72 horas, de manera más preferente de aproximadamente 24 a 48 horas.
Sacarificación La invención proporciona un método para producir un azúcar de un material lignocelulósico cuyo método comprende poner en contacto un polipéptido de la invención a una composición de la invención con el material lignocelulósico.' Tal método permite que- los azucares libres (moríómeros) y/u oligosacáridos se ' generen de la biomasa lignocelulósica . Estos métodos implican convertir la biomasa lignocelulósica a .azúcares libres y. oligosacáridos pequeños con un polipéptido o composición de la invención.
El proceso de convertir un carbohidrato complejo tal como lignocelulosa en azúcares permite preferiblemente la conversión en los azúcares fermentables . Tal proceso se puede referir como "sacarificación" .. Por consiguiente, un método de la invención puede dar por resultado la liberación de uno o más azúcares de. hexosa y/o pentosa, tal como uno o más de glucosa, xilosa, arabinosa, galactosa, ácido galacturónico, ácido glucurónico, mañosa, ramnosa, ribosa y fructosa.
Por . consiguiente, otro aspecto de la invención incluye métodos que usar el polipéptido de la composición de la invención descrito anteriormente junto ' con enzimas adicionales o tratamientos físicos tales como temperatura , y pH para convertir la biomasa de planta lignocelulósica a azúcares y oligosacáridos .
Aunque la composición se ha planteado como una sola mezcla . se reconoce que las enzimas se pueden agregar secuencialmente donde la temperatura, el pH, y otras condiciones se pueden alterar para incrementar' la actividad de cada enzima individual. Alternativamente, un pH y temperatura óptimos de pueden determinar para la mezcla de enzimas . . .
Las enzimas se hacen reaccionar con substrato bajo cualquier condición apropiada. Por ejemplo, las enzimas se pueden incubar a aproximadamente 25°C, aproximadamente 30°C, aproximadamente 35°C, aproximadamente 37°C, aproximadamente 40°C, aproximadamente 45°C, aproximadamente 50°C, aproximadamente 55°C, aproximadamente 60°C, aproximadamente 65°C, aproximadamente 70°C, aproximadamente 75°C, aproximadamente 80°C, aproximadamente 85°C, aproximadamente 90°C o mayor. Es decir, se pueden incubar a una temperatura de aproximadamente 20°C a aproximadamente 95°C, por ejemplo en soluciones amortiguadoras de resistencia iónica baja a media y/o de pH bajo a neutro. Por "resistencia- iónica media" se propone que la solución amortiguadora tenga una concentracion.de iones de aproximadamente 200 milimolar (mM) o menos para cualquier componente de ión individual. El pH puede variar de aproximadamente pH 2.5, a aproximadamente pH 3.0, a aproximadamente pH 3.5, a aproximadamente pH 4.0, a aproximadamente pH 4 • 5, a aproximadamente pH 5, a aproximadamente pH 5 • 5, a.. aproximadamente pH 6, a aproximadamente pH .6 .5, a aproximadamente pH 7, a aproximadamente pH 7. 5, a aproximadamente pH 8.0, - a aproximadamente pH 8 .5. En general, el intervalo de pH será de aproximadamente pH 3.0 a- aproximadamente pH 7. Para la producción de etanol se prefiere un medio ácido, por ej emplo pH=4, mientras que para la producción de biogas de pH neutro, por ejemplo pH=7 es deseablé. La incubación de las combinaciones de enzimas bajo estas condiciones da por resultado la liberación de cantidades sustanciales del azúcar de la lignocelulosa . Por cantidad sustancial se propone por lo menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de azúcar disponible.
Los polipéptidos, tales como enzimas, se pueden producir ya sea exógenamente en microorganismos, levaduras, hongos, bacterias o plantas, luego se aislan y se agregan, por ejemplo, a la · materia prima lignocelulósica . Alternativamente, las enzimas se producen, pero no se aislan, y el caldo de fermentación de masa celular crudo, o material de planta (tal como rastrojo de maíz), y similar se pueden agregar a, por ejemplo, la materia prima. Alternativamente, la masa celular cruda o medio de producción de enzimas o material de plantas se pueden tratar para prevenir . el crecimiento microbiano adicional (por ejemplo, mediante el calentamiento o adición de agentes antimicrobianos), luego se agregan a, por ejemplo, una materia prima. Estas mezclas de enzimas crudas pueden incluir el organismo que produce la enzima. Alternativamente, la enzima se puede producir en una fermentación que usa materia prima (tal como rastrojo de maíz) para proporcionar nutrición a un organismo que produce una enzima (s) . De esta manera, las' plantas que producen las enzimas pueden servir solas como una materia prima lignocelulósica y ser agregadas en materia prima lignocelulósica.
Fermentación de azúcares Los azúcares fermentables se pueden convertir a productos de fermentación de valor agregado útiles, ejemplos no limitantes de los cuales incluyen aminoácidos, .vitaminas, productos farmacéuticos, suplementos de pienso de animal, químicos de especial, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles u otros polímeros orgánicos, ' ácido láctico, y etanol, incluyendo combustible etanol. En particular, los azúcares se pueden usar como materias primas para fermentación en químicos, plásticos, tales, como por ejemplo ácido - succínico y (bio) combustibles, incluyendo etanol, metanol, combustibles líquidos sintéticos de butanol y biogas.
Por ejemplo,, en el método de la invención, una enzima o combinación . de enzimas actúa en un substrato lignocelulósico o biomasa de plantas, que sirve como la materia prima, para convertir este, substrato .complejo. . a azúcares simples y oligosacáridos para la producción de etanol u otros productos de fermentación útiles.'.
Los azúcares liberados de la biomasa se pueden convertir a productos de fermentación útiles tales como uno de aquellos que incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos, vitaminas, farmacéuticos, suplementos de piensos' de animal, químicos de especial, materias primas químicas^ plásticos, y etanol, incluyendo combustible etanol.
Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un producto de fermentación, el método que comprende: a. degradar la lignocelulosa usando . un método como se describe en este documento; y b. fermentación del material resultante, para preparar en consecuencia un producto de fermentación.
La fermentación se puede llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas Q anaeróbicas. De manera preferente, el proceso se lleva a cabo bajo condiciones microaerofílicas o limitadas de oxígeno.
Un proceso de fermentación anaeróbico se define en este documento como un proceso de fermentación que se ejecuta en ausencia de oxígeno o en el cual no se consume sustancialm nte nada' de oxígeno, de manera preferente de aproximadamente 5. o menos, de aproximadamente 2.5 o menos o aproximadamente 1 mmol/L/h o menos, y en donde las. moléculas orgánicas sirven tanto como donadores de electrones como aceptorés de electrones.
Un proceso de fermentación limitado de oxígeno es un proceso en el cual el consumo de oxígeno se' limita por la transferencia de oxigeno del gas a liquido.. El grado de limitación de oxigeno se determina por la cantidad y composición de flujo de gas entrante asi como también las propiedades de transferencia de mezclado/masa actuales del equipo de fermentación usado. De manera preferente, en un proceso bajo condiciones limitadas de oxigeno, la velocidad del consumo de oxigenó es por lo menos de aproximadamente 5.5, de manera más preferente por lo menos de aproximadamente 6 y aún de manera más preferente por lo menos de aproximadamente 7 mmol/L/h.
Un método para la preparación de un producto de fermentación puede comprender opcionalmente recuperación del producto de fermentación.
SSP La fermentación, y sacarificación también se pueden ejecutar en un modo de sacarificación y fermentación simultáneo (SSF) .. Una ' de las ventajas- de este modo es la reducción de la inhibición de azúcar en la hidrólisis enzimática (inhibición de azúcar en celulasas se .describe por Caminal B&B Volumen XXVII Páginas 1282-1290) .
Productos de fermentación Los productos de fermentación que · se pueden producir de acuerdo con la invención incluyen aminoácidos, vitaminas, farmacéuticos, suplementos de piensos de animal, químicos de especialidad, materias primas químicas, plásticos, solventes, combustibles, u otros polímeros orgánicos, ácido láctico y etanol, incluyendo combustible etanol (el término "etanol" que' se entiende por incluir alcohol etílico o mezclas de alcohol etílico y agua).
Los productos de valor agregado específicos que se pueden producir por los · métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, biocombustibles. (incluyendo etanol. y bütanol y un biogas) ; ácido láctico; un plástico; un químico de especialidad; un ácido orgánico, incluyendo ácido cítrico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido itacónico y ácido maleico; ácido 3-hidroxi-propiónico, ácido ac.rílico; ácido acético; 1 , 3-propano-diol ; etileno; glicerol; un solvente; un suplemento de pienso de animal; un producto farmacéutico, tal como antibiótico ß-lactama o una cefalosporina; vitaminas; un aminoácido, tal como lisina, metionina, triptófano, treonina, y ácido aspártico; una¦ enzima industrial, tal como una proteasa, una celulasa, una amilasa, una glucanasa, . una lactasa, una lipasa, una liasa, una oxidoreductasas , una transferasa o una xilanasa; y una materia prima química.
Biogas La invención también proporciona el uso de un polipéptido o composición descrito en este documento en un método para preparación de biogas. Él biogas se refiere típicamente a un gas producido por la descomposición bioquímica de materia orgánica por ejemplo material que contiene carbohidratos no de almidón, en ausencia de oxígeno. El biogas se origina de material biogénico y es un tipo de biocombustible . Un tipo de biogas se produce por digestión anaeróbica o fermentación de materiales biodegradables tales como biomasa, estiércol o aguas residuales, residuos municipales y cultivos ' energéticos . Este tipo de biogas está comprendido principalmente de metano y dióxido de carbono. El gas metano se puede quemar u oxidar con oxígeno; El aire contiene 21% de oxígeno. Esta liberación de energía permite que el biogas se use como combustible. El biogas se puede usar como un combustible de bajo costo en cualquier país para cualquier propósito de calentamiento, tal como cocción. También se puede usar en instalaciones de manejo de residuos modernas donde se puede usar para hacer funcionar cualquier tipo de motor térmico, para generar ya sea energía mecánica o eléctrica.
El primer paso en la producción de biogas microbiano consiste en la degradación enzimática de polímeros y substratos complejos (por ejemplo carbohidrato no de almidón) . Por consiguiente, la invención proporciona un método para la preparación de un biogas en el cual un substrato que comprende carbohidrato no de almidón se pone en contacto con un polipéptido o composición de la invención, para producir en consecuencia material fermentable que se puede convertir en un biogas por un organismo tal como .un microorganismo. En tal método, un polipéptido de la invención se puede proporcionar por medio de un organismo, por ejemplo un microorganismo que expresa tal polipéptido.
Uso de enzimas en los productos alimenticios Los polipéptidos y composiciones de la invención se pueden usar en un método para procesar material de plantas para degradar o modificar la celulosa o hemicelulosa- o sus constituyentes de sustancias pécticas dé las. paredes celulares de la planta o- material fúngico. Tales métodos se pueden usar en la preparación de producto alimenticio.- Por consiguiente, la invención proporciona un método para preparar un producto alimenticio método que comprende incorporar un polipéptido o composición de la invención durante la preparación del producto alimenticio.
La invención también proporciona un método para ¦procesar un material de planta el método que comprende ' poner en contacto el material de planta con- un polipéptido o composición de la invención para degradar o modificar la celulosa en el material · (planta) . De manera preferente, el material de planta ' es una pulpa de planta o extracto, de planta, tal como jugos.
Los materiales que . contienen celulosa/hemicelulosa/sustancia péctica y plantas incluyen pulpa de planta, partes de plantas y extractos de plantas. En el contexto de esta invención un extracto de un material de planta es cualquier sustancia que se pueda derivar del material de planta mediante la extracción (mecánica y/o química), procesamiento o por otras técnicas de separación. El extracto puede ser jugo, néctar, base, o concentrados hechos.de las mismas. El material de planta puede comprender o ser derivado de vegetales, por ejemplo, zanahorias, apio, cebollas, legumbres o plantas leguminosas (soya,- frijol de soya, chícharos) o fruta', por ejemplo pepita o fruta de semilla (manzanas, peras, membrillos, etcétera), uvas, tomates, cítricos (naranja, limón, lima, mandarina)., melones, ciruelas pasas, cerezas, grosellas negras, grosellas rojas,-frambuesas, fresas, · arándanos, piña y otras frutas tropicales, árboles y partes de los mismos (por. ejemplo, palen, de pinos) o cereal (avenas, cebada, trigo, maíz, arroz) . El material (que se hidrolizá) también pueden ser residuos agrícolas, tales como pulpa de remolacha azucarera, mazorcas de maíz, paja de trigo, cáscaras' de nuez' (molidas), o materiales reciclables, por ejemplo papel (residual) . .
Los polipéptidos de la invención de esta manera se pueden usar para tratar material de planta incluyendo pulpa de planta y extractos de plantas. También se puede usar para tratar productos alimenticios líquidos o sólidos o ingredientes de productos alimenticios comestibles, c se usa en esta acción de aceites de planta, almidón o como un espesante en alimentos.
Típicamente, los polipéptidos de la invención se usan como una composición/preparación de enzimas como se describe en lo anterior. La composición- se agregará generalmente a la pulpa de planta obtenible por, por ejemplo procesamiento mecánico tal como trituración o molienda del material de planta. La incubación de la composición con la planta se llevará a cabo típicamente por el tiempo de 10 minutos a 5 horas, tal como 30 minutos', a 2 horas, de manera preferente por aproximadamente 1 hora. La temperatura de procesamiento es de manera preferente de aproximadamente 10°C a aproximadamente 55°C, por ejemplo- de aproximadamente 15°C a aproximadamente 25°C, óptimamente de aproximadamente 20°C y uno se puede usar de aproximadamente 10 g aproximadamente 300 g, de manera preferente de aproximadamente 30 g a aproximadamente 70 g, óptimamente de aproximadamente 50 g de enzima por tonelada de material que se trata.
Todas las enzima (s) o sus composiciones usadas se pueden agregar secuencialmente o al mismo tiempo a la pulpa de planta. Dependiendo de la composición de la preparación de enzimas el material de planta primero se puede macerar (por ejemplo a un puré) o licúa. Usando los polipéptidos de la invención los parámetros de procesamiento tales como el rendimiento de la extracción, viscosidad del extracto y/o calidad del extracto, se pueden mejorar. '.
Alternativamente, o además de lo anterior, un polipéptido de la invención se puede agregar al jugo crudo obtenido del prensado o licuado de la pulpa de planta. El tratamiento del jugo crudo se llevará a cabo en una manera similar a la pulpa, de planta con respecto a la · dosificación, temperatura y tiempo de retención. Nuevamente, otras enzimas tales como aquellas planteadas previamente se pueden incluir. Las condiciones de incubación típicas son como se describen en el párrafo previo.
Una vez que el jugo crudo se ha incubado con los polipéptidos de la invención, el jugo luego se centrifuga o se (ultra) filtra para producir el producto final.
Después del tratamiento con el polipéptido de la invención el producto (final) se puede tratar con calor, por ejemplo a aproximadamente 100°C durante un tiempo de aproximadamente un 1 minuto a aproximadamente 1 hora, bajo condiciones para inactivar parcial o completamente el polipéptido ( s ) de la invención.
Una composición que contiene¦ un polipéptido de la invención también se puede usar durante la preparación de purés de frutas o.vegetales.
En el horneado el polipéptido puede mejorar la estructura de la masa, modificar su espesor o flexibilidad, mejorar el volumen de la barra y/o estructura de' la migaja o impartir mejores características texturales- tales como calidad de rompimiento, trituración o migaja.
La presente invención se refiere de esta manera a métodos para preparar una masa o un producto alimenticio basado ' en cereal que comprende' incorporar en la masa un polipéptido o composición de la presente invención. Esto puede mejorar una o más propiedades de la masa o el producto alimenticio basado en cereal obtenido de la masa relativa a una masa o un producto alimenticio basado en cereal en el cual el polipéptido no se incorpora.
La preparación del. producto alimenticio basado en cereal de acuerdo con la invención puede comprender además los pasos conocidos en la técnica tal como ebullición, secado, freído, cocinar al vapor y horneado de la masa obtenida.
Los productos que se hacen de una- masa que se hierve son por ejemplo- fideos hervidos, bolas . de masa hervidas, productos que se hacen de masa frita son por ejemplo donas, churros, fideos fritos, productos que se hacen de masa al vapor son por ejemplo bollos al vapor y fideos al vapor, ejemplos de . productos hechos de masas secas son pasta y fideos secos y ejemplos de productos hechos de masa horneada son pan, galletitas, pastel.
El término "propiedad mejorada" se define en este documento como cualquier característica de una masa y / o un producto obtenido a propiedad de una masa y/o un producto obtenido de la masa, particularmente un producto alimenticio basado en cereal, que se mejora por la acción del polipéptido de acuerdo con la invención relativo con una masa o producto en el cual el polipéptido de acuerdo con la invención no se incorpora. La propiedad mejorada puede incluir, pero no se limita, a, resistencia incrementada de la masa, elasticidad incrementada de la. masa, estabilidad incrementada de la masa, capacidad de maquinado mejorada de la masa,, resistencia mejorada a la fermentación de la masa, espesor reducido de la masa, extensibilidad mejorada de la masa, volumen incrementado del producto alimenticio basado en cereal, hinchamientó reducido' del producto alimenticio basado en cereal, estructura de migaja mejorada del producto horneado, blandura mejorada del producto alimenticio basado' en cereal, sabor mejorado del producto alimenticio basado en cereal, antienvejecimiento mejorado del producto alimenticio basado en cereal. Las propiedades mejoradas relacionadas con el tipo de pasta y fideo de los productos basados en cereal son por ejemplo firmeza mejorada, pegajosidad reducida, cohesividad mejorada y perdida de cocción reducida. .
La propiedad mejorada se puede determinar por comparación de una masa y/o un producto alimenticio · basado en cereal preparado con y sin la adición de un polipéptido de la presente invención. Las cualidades organolépticas se pueden evaluar usando ' procedimientos bien . -establecidos en- la industria de horneado, y pueden incluir, por ejemplo, el uso de un panel de cobradores de sabor entrenados.
El término "masa" se define en este documento como una mezcla de harina de cereal y otros ingredientes suficiente firmes para amasar o . enrollar. Ejemplos de cereales son trigo.,, centeno, maíz, cebada, arroz, sémola, alforfón y avena. El trigo es aquí y después propuesto para abarcar todas las especies conocidas de género Triticum, por ejemplo aestivum, durum, y/o spelta. Ejemplos de otros ingredientes adecuados son: el polipéptido acetil-xilan-esterasa de acuerdo con la presente invención, enzimas adicionales, aditivos químicos y/o auxiliares del procesamiento. La masa puede ser fresca, congelada, preparada o pre-horneada . La preparación . de una masa. de los ingredientes descritos en lo anterior es bien conocida en la técnica y comprende la mezcla de los ingredientes y auxiliares de procesamiento y uno o más pasos de moldeo y opcionalmente fermentación. La preparación de la masa congelada se describe por Lorenz in Frozen and Refrigerated Doughs and Batters.
El término "producto alimenticio basado en cereal" se define en este documento como cualquier producto preparado de una masa, ya sea de un carácter blando o crujiente. Ejemplos de productos alimenticios basado en cereal, ya sea de tipo blanco, claro u oscuro, que se puede producir ventajosamente por · la presente invención son pan (en particular pan de harina entera o centeno o blanco) , típicamente en la forma de barras o rollos, pan de tipo baguette Francés, pasta, fideos, donas, panecillos, pastel, pan pita, tortillas, tacos, pasteles, panqueques, bizcochos, galletitas, masa de torta, pan al vapor, y pan crujiente, y similares.
El término "producto horneado" se define en este documento como cualquier producto alimenticio basado en cereal preparado al hornear la masa.
Los . polisacáridos no de almidón (NSP) pueden incrementar la viscosidad de la digesta que puede, a su vez, disminuir la disponibilidad de nutrientes y el desempeño del animal. El uso del polipéptido . ácetil-xilan-esterasa .de la presente invención puede mejorar la utilización de fósforo así como también los minerales catiónicos y el polipéptido durante la digesta del animal.
La adición de nutrientes específicos al pienso mejora la digestión del animal y reduce en consecuencia costos de alimentación. Una cantidad de- aditivos alimenticios están siendo usados actualmente y se desarrollan continuamente nuevos conceptos. El uso de enzimas específicas similares a enzimas de degradación de carbohidratos no de almidón podría descomponer la fibra que libera energía así como también incrementar la digestibilidad de la proteína debido a mejor accesibilidad de la proteína donde la fibra se descompone. De esta manera el costo de alimentación podría disminuir asi como también los niveles de proteína en el pienso también se podría reducir.
Los polisacáridos no de almidón (NSPs) también están presentes virtualmente en todos los ingredientes alimenticios de origen de plantas. Los NSPs se usan deficientemente y pueden, cuando se solubillzan, ejercer efectos adversos en la digestión. Las enzimas exógenas pueden contribuir a una mejor utilización de estos NSPs y como consecuencia reducen cualquier efecto anti-nutricional . Las enzimas de degradación de carbohidratos no de almidón de la presente invención se pueden usar para este propósito en las dietas basadas en cereal' para aves de corral y, a un grado menor, para cerdos, y. otras especies.
Un polipéptido/enzima ' de degradación de carbohidratos no de almidón de la invención ' (de una composición que comprende el polipéptido/enzima de la invención) se puede usar en la industria de detergente, por ejemplo para la remoción de manchas de lavandería basadas en carbohidratos. Una composición de detergente puede comprender un polipéptido/enzima de la invención y, además, uno o más de una celulosa, una; hemicelulasa, una pectinasa, una¦ proteasa, una lipasa, una cutinasa, una amilasa o una carbohidrasa .
Uso de enzimas en composiciones detergentes Una composición detergente que comprende un polipéptido o composición de la invención puede, estar en cualquier forma conveniente, por ejemplo una pasta, un gel, un polvo o un líquido.. Un detergente líquido puede ser acuoso, que contiene típicamente hasta aproximadamente 70% de agua y de aproximadamente 0 a aproximadamente 30% de solvente orgánico o material no acuoso.
Tal composición detergente puede, po ejemplo,' ser formulada como una composición detergente de lavandería de mano o a máquina que incluye una composición aditiva de lavandería adecuada para el pretratamiento de telas manchadas y un enjuague agregado a la composición suavizante de telas, o se formulada como una composición detergente para el uso en operaciones de limpieza de superficies duras domesticas en general, o se formula para operaciones de lavado de platos a mano o a máquina.
En general, las propiedades de la enzima deben ser compatibles con el detergente seleccionado (por ejemplo, pH óptimo, compatibilidad con otros ingredientes enzimáticos y/o no enzimáticos, etcétera) y la enzima (s) debe estar presente en una cantidad efectiva.
Una composición de detergente puede comprender un surfactante, por ejemplo un surfactante aniónico o no iónico, un mej orador de detergente o un agente de formación en complejo, uno o más polímeros, un sistema blanqueador (por ejemplo una fuente de H202) o un estabilizador de enzimas. Una composición detergente también puede comprender cualquier otro ingrediente detergente convencional tal como, por ejemplo, un acondicionador que incluye una arcilla, un refuerzo de espuma, un supresor de espumación,. un agente anticorrosión, un agente de suspensión de manchas, un agente de redeposición de manchas, un tinte, un bactericida, un abrillantador óptico, hidrótropos, un inhibidor de manchas o un perfume.
Uso de enzixaas en el procesamiento de papel y pulpa Un polipéptido o composición de . la. presente invención se puede usar en la industria de papel y pulpa, inter alia en el proceso de blanqueo para aumentar la brillantez de las pulpas blanqueadas .¦ mediante lo cual la cantidad de cloro usado en los pasos de blanqueo se puede reducir, e incrementar el refinado ' de las pulpas en el proceso de papel reciclado (Eriksson, K.E.L.,- Wood Science and Technology 24 (1990) : 79-101; . Paice, y colaboradores, Biotechnol. y Bioeng. 32 ( 1988 ) : 235-239 y Pommier y colaboradores, Tappi Journal ( 1989) : 187-191 ) . Adicionalmente, un polipéptido o composición de la invención se- pueden usar para el tratamiento de pulpa lignocelulósica para mejorar la capacidad de blanqueado de la misma. Mediante lo cual la cantidad de cloro necesario para obtener un blanqueo satisfactorio de la pulpa se puede reducir.
Un polipéptido o composición; de la invención se puede usar en un método para reducir la velocidad en la cual las telas que contienen celulosa se vuelven ásperas o de reducir la aspereza de las telas que contienen celulosa, el método que comprende tratar las telas que contiene celulosa con un polipéptido o composición como se describe . en lo anterior. La presente invención se refiere además a un método para proporcionar clarificación de color de telas que contienen celulosa coloreada, el método que comprende tratar las telas que contienen celulosa coloreada con un polipéptido o composición como se describe en lo anterior, y un método para proporcionar una variación localizada en el color de las telas que contienen celulosa coloreada, el método que comprende tratar las telas que contienen celulosa coloreada con un polipéptido o composición como se describe en lo anterior. Los métodos de la invención se pueden llevar a cabo al tratar telas que contienen celulosa durante el lavado. Sin embargo, si se desea, el tratamiento de las telas también se puede llevar a cabo durante el remojado o enjuagado o simplemente el agregar' el polipéptido o composición como se describe en lo anterior al agua en la cual las telas están o se sumergirán.
Otros usos de enzimas Además, un polipéptido o composición de la presente invención también se puede usar en una formulación antibacteriana asi como también en productos farmacéuticos tales como pastillas para la garganta, pastas dentales y lavados bucales.
Los siguientes Ejemplos ilustran la invención: EJEMPLOS Materiales y Métodos Procedimientos de DNA Se llevaron a cabo procedimientos de DNA estándares como se describen en cualquier. lugar (Sambrook y colaboradores, 1989, Molecular cloriing: a laboratory manual, 2nd Ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York) a menos que se establezca de otra manera. El DNA se amplificó usando la corrección de pruebas de la enzima Physion polimerasa (Finnzymes) . Las enzimas de restricción fueron de Invitro.gen o New England Biolabs.
Preparación de las muestras de celulasa Las celulasas que se originan de Talaromyces emersoni i se expresaron en Aspergillus niger. Los filtrados concentrados de las enzimas se produjeron como se describe en el documento WO2004 /030468.· Después del crecimiento de Aspergillus. niger que contiene ' los sobrenadantes sin célula de plásmidos de expresión apropiadas se prepararon por centrifugación del caldo de fermentación a 5000 x g durante 30 minutos a · 4°C. Opcionalmente el sobrenadante se puede ajusfar a pH=5 con KOH 4 N y se puede .filtrar estéril sobre un filtro de 2 µp? (parte superior de botella) con solución para remover cualquier material fúngico. Además los sobrenadantes se pueden filtrar adicionalmente sobre un filtro de microfibra de Vidrio GF/A hatman (150 mm 0) para remover cualquier sólido., Los sobrenadantes se ultrafiltraron, se concentraron, y se almacenaron hasta el uso a 4°C o se congelaron a -20°C.
Método para la determinación de proteínas totales El método fue una combinación de precipitación de proteína usando ácido tricloroacético (TCA) para remover las sustancias perturbadoras y permitir la determinación de la concentración de proteínas con la . reacción de Biuret colorimétrica . En la reacción de Biuret, un ión de cobre (II) se reduce a cobre (I), que forma un complejo con un nitrógeno y carbonos de los enlaces de péptido en una. solución alcalina. Un color violeta indica la presencia de proteínas. La intensidad del color, y por consiguiente la absorción . a 546 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteínas,' de acuerdo con la ley de Beer-Lambert . La estandarización se llevó a cabo usando BSA (albúmina de suero bovino) y el contenido de proteínas se expresó en proteína g como equivalente/L BSA o proteína mg como equivalente/ml BSA. El contenido de proteínas se' calculó usando protocolos de cálculo estándares' conocidos en. la técnica, al graficar la OD546 versus la concentración de muestras con concentración conocida, seguido por el cálculo de la concentración de las muestras desconocidas usando la ecuación generada de la línea de calibración.
Métodos para la determinación de- la actividad de acetil- ¦ xilan-esterasa La actividad de acetil-xilan-esterasa se . determinó usando para-nitrofenil-acetato en una concentración¦ de 1.5 mM en solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM a pH 4.5. La incubación se llevó a cabo a 40°C durante 30 minutos. La actividad se calculó de la extinción determinada a 405 nm, y el coeficiente de extinción molar -de para-nitrofenol en las condiciones alcalinas, como es conocido por aquellas personas expertas en el campo. La actividad se expresa como ymol de pNP liberado por mi por minuto.
Preparación del substrato de paja de trigo pre-tratada lavada Paja de trigo pre-tratada diluida con ácido se puede obtener como se describe en Linde, M. y colaboradores, Biomass y Bioenergy 32 (2008), 326-332 y el equipo como se describe en Schell, D.J., Applied Biochemistry and Biotechnology (2003), volumen 105-108, páginas .69-85, se puede usar. La paja dé trigo pre-tratada se lavó con agua hasta que la solución con paja de trigo fue de pH 6.0 o mayor. El agua de lavado se filtró.
Hidrólisis extendida de celulosa Incubaciones de combinaciones de' enzimas, en solución de substrato de materia seca (dm) de paja de trigo pre-tratada (PWS) con ácido lavada al 2% . en solución amortiguadora de acetato de sodio 50 mM pH 4.5, se llevaron a cabo en una. escala de 10 mL. Las combinaciones de' -enzimas se agregaron en la dosis de proteina fija por gramo de materia seca de substrato. Las muestras se tomaron en tiempo, hasta 72 horas de incubación a' 65°C. Las reacciones se terminaron en el tiempo dado, al hacer girar lentamente el residuo, 'al pipetear el sobrenadante y al congelar las muestras hasta el análisis.
Análisis de la cantidad de glucosa liberada se llevó a cabo usando la RMN de flujo. El espectro 1H RMN se registró en un sistema Bruker AVANCE II BEST RMN que opera en una frecuencia de . protones a 500 MHz y una temperatura de sonda de 27°C.
Ejemplo 1 1.1. Construcción de plásmidos de expresión La secuencia que tiene SEC ID NO: 1 se clonó en..el vector pGBTOP (Figura 1) usando sitios EcoRI - y SnaBI, que comprenden el promotor de glucoamilasa y la secuencia terminadora.. La parte de E. coli se removió por' digestión Notl antes de la transformación de ACBS 513.88 de A. niger. 1.2. Transformación de A. niqer ; WT-1 de-. A. niger: Esta cepa de A. niger es CBS513.88 que comprende supresiones de los genes que codifican la glucoamilasa (glaA) , amilasa fúngica y amilasa ácida.. El WT 1. de A. niger se construye al. usar el procedimiento "sin gen marcador" como se describe . en' el documento EP 0 635.574. Bl.
Los constructos de expresión se co-transformaron al T-1 de la cepa A. niger de acuerdo con el método descrito por Tilburn, J. y colaboradores, (1983) Gene 26, 205-221 y Kelly, J. & Hynes, M. (1985) EMBO J., 4, 475-479 con las siguientes modificaciones: Las esporas se germinaron y se cultivaron durante 16 horas a 30 grados Celsius en un matraz de agitación colocado en un agitador giratorio a 300 rpm en un medio mínimo de Aspergillus (100 mi) . El medio mínimo de Aspergillus contiene por litro: 6 g de NaN03, 0.52 g de KC1, 1.52 g KH2P04, 1.12 mi 4 M KOH, 0.52 g MgS04.7H20, 10 g de glucosa, 1 g de casaminoácidos, 22. mg ZnS04. H20, 11 mg H3B03, 5 mg FeS04.7H20, .1.7 mg CoCl2.6H20, .1.6. mg CuS04.SH20, 5 mg MnC12.2H20,' 1.5 mg Na2Mo04.2H20, 50 mg de EDTA, 2 mg de riboflavina, 2 mg de tiamina-HCl, 2 mg de nicotinamida, 1 mg de piridoxina-HCL, 0.2 mg de ácido pantoténico, 4 g de biotina, 10 mi de solución de Penicilina (5000 IU/ml) Estreptomicina (5000 UG/ml) (Gibco) .
Novozym 234MR (Novo Industries) en lugar de helicasá se usa para, la preparación de protoplastos ; Después de la formación del protoplasto ·( 60-90 minutos), la solución amortiguadora de KC (KC1 0.8 , ácido cítrico 9.5 mM, pH 6.2) se agrega a un volumen final de 45 mi, la suspensión .de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a 3000 rpm. a 4 grados Celsius en un rotor de cubeta oscilante. Los protoplastos se resuspenden en 20 mi de solución amortiguadora de KC y subsecuentemente 25 mi de solución amortiguadora de STC (sorbitol 1.2 M, Tris-HCl 10 mM pH 7.5, CaC12 50 mM) se agregan. La suspensión de protoplastos se centrifuga durante 10 minutos a '3000 rpm a 4 grados Celsius en un rotor de cubeta oscilante, se lava en solución amortiguadora de STC y se resuspende en solución amortiguadora de . STC en una concentración de 10E8 protoplastos/ml ; - A 200 microlitros de la suspensión de protoplastos, se agregan el fragmento de DNA, disuelto en 10 microlitros de solución amortiguadora de TE (Tris-HCl 10 mM pH 7.5, EDTA 0.1 mM) y se agregan 100 microlitros de solución de PEG (20% de PEG 4000 (Merck), sorbitol 0.8 M, Tris-HCl 10 mM pH 7.5, CaC12 50 mM) ; Después de la incubación de la suspensión de DNA-protoplasto durante 10' minutos a temperatura ambiente, se agregan lentamente 1.5 mi de solución de PEG (60% de PEG 4000 (Merck), Tris-HCl 10 mM pH 7.5, CaC12 50 mM),. con mezclado repetido de los tubos. Después de la incubación durante 20 minutos a temperatura -ambiente, las suspensiones se diluyen con 5 mi de sorbitol 1.2 M, se mezclan por inversión y se centrifugan durante 10 minutos a 4000 rpm a temperatura ambiente. Los protoplastos se resuspenden levemente en 1 mi de sorbitol 1.2 M y se colocan en ' palcas sobre un medio de regeneración selectivo sólido que consiste de ya sea un medio mínimo de Aspergillus' sin riboflavina, tiamina.HCL, nicotinamida, piridoxina, ácido pantoténico, biotina, casaminoácidos y glucosa. En caso de selección de acetamida el medio contiene acetamida 10 mM como la única fuente de nitrógeno y sacarosa 1 como osmoticum y fuente de C. Alternativamente, los protoplastos se colocan en placas sobre PDA (Agar de Papa-Dextrosa, Oxoide) suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina y sacarosa 1 M como osmoticum. Las placas de regeneración se solidifican usando 2% de agar (agar No. 1, Oxoid Lll). Después de la incubación durante 6-10 días a 30 grados' Celsius, las conidiosporas de transformantes se transfirieren a las placas que consisten del medio selectivo de Aspergillus (medio mínimo que contiene acetamida como la única fuente de nitrógeno en el caso de la selección de acetamida o PDA suplementado con 1-50 microgramos/ml de fleomicina. en el caso de la selección de pleomicina) con 2% de glucosa y 1.5% de agarosa (Invi'trogen) y se incuba durante 5-10 días a 30 grados Celsius. Los transformantes individuales se aislan y este paso de purificación selectivo se repite una vez en el ' cual los transformantes purificados se almacenan.
Después de la transformación, los transformantes se seleccionaron en un medio que comprende acetamida como la única fuente de nitrógeno -y la. colonia se purificó. Los números de copias se estimaron por PCR cuantitativa .y seleccionaron los transformantes del número ' de copias bajos y altos. Los transformantes de copias altas se cultivaron en matraces de agitación en 100 mi de medio CS - ES como se describe en el documento EP 635- 5.74 a 34 °C a' 170 rpm en un agitador de incubadora usando un matraz de agitación deflector de 500 mi. Después de 3 y 4 días de fermentación, las muestras de sobrenadante se cosecharon para determinar la expresión por SDS-PAGE. 1.3 Contenido de proteínas Los sobrenadantes ultrafiltirados y concentrados de las fermentaciones de matraz de agitación de los transformantes que · expresan acet il-xilan-esterasa (TEMER01754) se analizaron para el contenido de proteínas. El contenido de proteínas se determinó que es 4 mg de proteína como equivalente/ml de BSA.
Ejemplo 2 2.1 Preparación de muestras de celulasa1 Una proteína potenciadora de celulasa, TEMER07589 (como .se describe en la solicitud, de patente copendiente DSM Casa 27666, presentada el mismo día como esta solicitud) y dos ex glucanasas, CBHI como se describe en la solicitud de . patente EP09158739.4 y CBHI I- (como se describe en la /.solicitud de patente copendiente DSM Caso 27829, presentado el mismo día como esta solicitud), respectivamente, y una beta-glucosidasa conocida por Murray y colaboradores., Protein expression and Purification, 2004, 38, 248-257, todas de Talaromyces emersonii, se .prepararon como se describe en el Ejemplo .1 para TEMER01754.. Los. contenidos, de proteínas de estas muestras se determinaron y se clasificaron de 20 a 60 mg de proteíná como equivalente equivalente/ml ¦ de BSA. Adicionalmente , una. endoxilanasa de Talaromyces emersonii, como se describé, en la patente de E.U.A 7514110, también se preparó como se describe en lo anterior. El contenido de proteínas de esta muestra fue 5 mg de proteína como equivalente/ml de BSA. La endoxilanasa se indicará en este punto como XEA. 2.2 Hidrólisis extendida de la mezcla de 4. enzimas con. suplementación de acet il-xilan-esterasa Las proteínas celulolíticas , que son beta-glucosidasa (BG),, CBHI,. CBHII y la proteíná; potenciadora de celulasa TEMER07589, se mezclaron en cantidades relativas de 9% de BG, 37% de TEMER07589, 30% de CBHI y 24% de CBHII, de la proteína total en. la mezcla. La mezcla se aplicó en hidrólisis extendida a una escala de 10 mi con paja de trigo pre-tratada con 2% de DM, a pH 4.5 y 65°C, en una dosis de. proteina de 15 mg de proteína como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja de trigo pre-tratada. La mezcla también se aplicó en incubaciones separadas, en las cuales 14 mg de mezcla de enzima + 1 mg de TEMER01754, o 14 mg de mezcla de enzima + 1 mg de XEA, o 13 mg de mezcla de enzima +. 1 mg de TEMER01754 + 1 mg XEA por gramo de materia seca de paja de trigo pre-tratada se aplicó. Como comparación, Filtrasa NL, u producto de celulasa . de Talaromyces emersonii clásico, también se incubó en la misma concentración de substrato, pH y temperatura, en una dosis de proteína total de 15 mg de proteína como equivalente de BSA por gramo de materia seca de paja de trigo pre-tratada. Las incubaciones duraron 72 horas y en varios intervalos de tiempo las muestras se tomaron. Las muestras se hicieron girar, y el sobrenadante se congeló hasta el. análisis por R . La liberación de la glucosa y la xilosa en el tiempo se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Liberación de glucosa y xilosa, expresada como mmol/L, durante la incubación de paja de trigo pre-tratada lavada con 2% de DM, a pH 4.5 y 65°C, por una mezcla de 4 enzimas (=4E) que contiene 1 BG, 1 CBHI, 1 CBHII y 1 proteina potenciadora de celulasa (TEMER07589 ) , en , cantidades relativas de 9%, 30%, 24% y 37% de proteina total de la mezcla, con o sin reemplazo parcial de la proteina celulolitica por la acetil-xilan-esterasa (TEMER0175. ) y/o endoxilanasa (XEA) y comparadas con FiltraseMR NL.
De este experimento, es claro que aún cuando a dilución de la. mezcla celulolitica en las incubaciones mediante la adición de acet il-xilan-e.sterasa y/o xilanasa, liberación de glucosa es casi la misma en todos los experimentos. La adición de la acetil-xilan-esterasa por si misma no tiene efecto benéfico en la liberación de xilosa en la mezcla simplificada. Sin embargo, la combinación de la acetil-xilan- sterasa y endoxilanasa muestra una liberación similar de xilosa como el producto clásico comercial FiltraseMR NL. El uso de la mezcla de 4 enzimas más la endoxilanasa también . se muestra que es menos efectiva en la liberación de xilosa como la combinación de las 4 enzimas más la endoxilanasa más acetil-xilan-esterasa/ o el FiltraseMr NL. De esta manera, la acetil-xilan-esterasa es esencial en la hidrólisis del xilano en paja de trigo pre-tratada con ácido.

Claims (25)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: . REIVINDICACIONES
1. Un polipéptido, que comprende lá secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID N0:1, o un polipéptido variante o polinucleótido variante de la misma, caracterizado porque el polipéptido variante tiene por. lo menos 82% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2 o el polinucleótido variante codifica un polipéptido que tiene por ló menos 82% de identidad de secuencia con la secuencia expuesta en SEQ ID NO: 2.
. 2. Un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque' el polipéptido tiene actividad de acetil-xilan-esterasa .
3. un polinucleótido, caracterizado porque comprende: (a) la secuencia de nucleótidos expuesta en SEQ ID NO: 1; o (b) una secuencia de nucleótidos que se hibridiza selectivamente con un polinucleótido que es el complemento inverso de SEQ ID NO: 1; o (c) una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1; o (d) un fragmento que tiene por . lo menos aproximadamente 100 nucleótidos en longitud de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) o (c) que tiene por lo. menos aproximadamente 100 nucleótidos n longitud; o (e) una secuencia que se degenera como un resultado del código genético a una secuencia como se define en cualquiera de (a) , (b) , (c) o (d) ; o (f) una secuencia de nucleótidos' que es el complemente inverso de una secuencia de nucleótidos como se define en (a) , (b) , (c) , (d) o (e) .
4. Un polipéptido ' de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque . codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2.
5. Un polipéptido de conformidad . con la reivindicación 3 o 4, caracterizado porque es una secuencia de DNA.
6. Un constructo de ácido nucleico, caracterizado porque comprende el polinucleótido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
7. Un constructo de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el contenido de GC es 56% o más, 58% o más, o de 58-65%.
8. Un vector, caracterizado porque incorpora una secuencia de poliriucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.
9. Una célula caracterizada porque comprende un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 o 7 o un vector de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Una célula de conformidad : con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula es una célula eucariotica.
11. Una célula de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada · porque la célula es una célula fúngica.
12. Una célula de conformidad con la reivindicación 11, caracterizada porque la célula fúngica se selecciona del grupo que consiste de los géneros Aspergillus, Trichoderma/Hypocrea, Fusarium, Disporotrichum, Penicillium, Acremonium, Neurospora, Thermoascus, Myceliophtora, Sporotrichum, Thielavia, Chryosporium, Fusarium, Humicola, Neurospora y Talaromyces .
13. Una célula ¦ de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la célula fúngica es de la especie Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Aspergillus nidulans, o Aspergillus niger.
14. Una célula de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9-13, caracterizada porque uno o más genes se suprimen, se silencian genéticamente o se alteran en totalidad o en parte, en donde opcionalmente el gen codifica una proteasa.
15. Una planta transgéhica o parte de la misma que comprende un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3-5, un constructo de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 o 7, un vector de acuerdo con La reivindicación 8 o una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9-14, caracterizada porque opcionalmente la planta es una planta de maíz, una planta de sorgo, una planta de tomate, una planta de trigo, una planta de semilla de aceite, una planta de colza, una planta de soja, una planta de cebada, un pasto, una planta de tabaco; una planta de los géneros Anacardium, Arachis, ragus, Atropa, Avena, Brassica, Citrus, Citrullus., Cápsicum, Cart amus, Cocos, Coffea, ferae, Cucumis, Cucúrbita, Daucus, Elaeis, Fragaria, Glycine, Gossypium, Helianthus, Ocallis, Hordeum, Hyoscyamus, Lactuca, Linum, Lolium, Lupinus, Lycopersicon, Malus, Maj oran-a , Medicago, Nicotiána, Olea, Oryza, Panieum, Pannisetum, Persea, eolus, Pistachio, Pisum, Pyrus, Prunus, Raphanus, Ricinus, Sécale, Senecio, Sinapis, Sorghum, Theobromus, Trigonella, Triticum, Vicia, Vitis, Vigna o Zea.
16. Un método para .la preparación de un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque tiene actividad de degradación de material de carbohidrato y/o de hidrolización de carbohidrato, el método que comprende cultivar una. célula de acuerdó con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14 bajo condiciones que . permite la expresión del polipéptido y, opcionalmente, recuperar el polipéptido expresado.
17. Una composición, caracterizada- porque comprende: (i) un polipéptido de acuerdo con la reivindicación l o 2 y;' (ii) una celulasa y/o una hemicelulasa y/o una pectinasa y/o un polipéptido que pertenece a la familia GH6.1.
18. Una composición de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque la celulasa es una celobiohidrolasa, celobiohidrolasa I, celobiohidrolasa II, una endo-ß-?, 4-glucanasa, una ß-glucosidasa o una ß-(1,3) (1, 4 ) -glucanasa . "
19. Una composición dé conformidad ' con la reivindicación 17 o 18, caracterizada . porque la hemicelulasa es una endoxilanasa, una ß-xilosidasa, una a-L-arabinofuranosidasa, un a-D-glucuronidasa, una acetil-xilan-esterasa, una feruloil-esterasa, una cumaroil-esterasa, una a-galactosidasa, una ß-galactosidasa , una ß-mananasa o una .ß-manosidasa.
20. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, caracterizada porque la pectinasa es una éndo-poligalacturonasa, una pectina-metil-esterasa, una endo-galactanasa, una beta-galactosidasa, una pectina-acetil-esterasa, una endo-pectin-liasa, una pectato-liasa, alfa-ramnosidasa, una exo-galacturonasa, una liasa, una ramnogalacturonan-hidrolasa, una ramnogalacturonan-liasa, una ramnogalacturonan-acetil-estérasa, una ramnogalacturonan^galacturonóhidrolasa, .una xilogalacturonasa, una alfa-arabinofuranosidasa o una endo-arabinanasa .
21. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a . 20, caracterizada porque comprende un ligninasa, una expansina, un polipéptido . similar a expansina, una swollenina o el producto de polipéptido e un gen que codifica una proteina de integración a celulosa o una proteina inducida por celulosa.
22. Un método para el tratamiento de un' substrato que comprende el material dé carbohidrato, opcionalmente un material de planta, caracterizado porque el método · comprende poner en contacto el substrato con un polipéptido de acuerdo con reivindicación 1 o- 2 y/o una composición de acuerdo con cualquiera de una de las reivindicaciones 11 a 21.
23. Un método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el ' substrato es un material ' de planta y el material de planta se proporciona en la forma de una planta, una pulpa, de planta, un extracto .de planta, un producto alimenticio o un ingrediente derivado del mismo o una tela, textil o articulo de ropa que comprende un material de planta.
24. Un método de conformidad con la reivindicación 22 y/o reivindicación 23, caracterizado porque el tratamiento comprende la degradación y/o modificación de celulosa y/o hemicelulosa y/o una sustancia péctica.
25. Uso ' de un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1 ó 2 y/o una composición de acuerdo con cualquiera de las · reivindicaciones' 17 a 21 para producir azúcar de un material lignocelulósico .
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