MX2012013800A - Composiciones y metodos para usar dispositivos bioactivos vivientes y no vivientes con componentes derivados de celulas formadoras de colonias de auto-renovacion cultivadas y expandidas in vitro. - Google Patents

Abstract

Esta invención se relaciona con métodos y usos de células para la prevención y tratamiento de una amplia variedad de enfermedades y trastornos y la reparación y regeneración de tejidos y órganos usando células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación (CF-SC), cultivadas in vitro poco pasadas y extensamente pasadas Por ejemplo, las células somáticas derivadas de la médula ósea de adultos (ABM-SC), o composiciones producidas por estas células, son útiles solas o en conjunto con otros componentes para tratar, por ejemplo, enfermedades, trastornos, patologías y lesiones cardiovasculares neurológicas, integumentarias, dermatológicas, periodontales e inmunomediadas.

Description

COMPOSICIONES Y MÉTODOS PARA USAR DISPOSITIVOS BIOACTIVOS VIVIENTES Y NO VIVIENTES CON COMPONENTES DERIVADOS DE CÉLULAS FORMADORAS DE COLONIAS DE AUTO-RENOVACIÓN CULTIVADAS Y EXPANDIDAS IN VITRO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona generalmente con la generación y uso de células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación (CF-SC) cultivadas in vitro, y composiciones producidas por dichas células, para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos. Un ejemplo de dichas CF-SC son las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (hABM-SC) .

La presente invención se relaciona además con la manipulación de poblaciones celulares de CF-SC durante el cultivo para modular (es decir, regular positivo o negativo) la producción de diversas composiciones solubles o secretadas producidas por células formadoras de colonias de auto-renovación cultivadas y expandidasin vitro.

El campo de la invención se relaciona además con las terapias de ingeniería de tejidos y basadas en células; particularmente, los métodos para usar y/o administrar CF-SC, o composiciones producidas por dichas células, que incluyen la administración a través de la incorporación en, o mezcla con, los portadores farmacéuticamente aceptables (tales como una solución farmacéuticamente aceptable o una matriz transitoria, permanente, o biodegradable) .

ANTECEDENTES Terapias basadas en células Generalmente, existen dos opciones principales para usar las terapias basadas en células para manejar y tratar el daño agudo y crónico del tejido en el que el objetivo general es la restauración funcional y/o cosmética del tejido dañado. Estas opciones de terapias basadas en células incluyen: 1) Reemplazo de Células - Uso de células para reemplazar el tejido dañado mediante el establecimiento de injerto a largo plazo; y 2) Suministro de Factores Tróficos - Uso de células y composiciones producidas por las células (por ejemplo, factores de crecimiento) para estimular los mecanismos de reparación endógenos a través de la liberación de factores entregados o producidos por las células sin injerto a largo plazo .

Las opciones terapéuticas basadas en células presentan además la posibilidad de manejar y tratar el daño del tejido por el uso de células autólogas o alogénicas. Cada uno de estas tiene determinadas ventajas y desventajas. El uso de células autólogas involucra los factores o parámetros siguientes : • El paciente es el donador; • Requiere la fabricación del producto celular sobre un basamento paciente a paciente; • Variabilidad en la identidad, pureza y potencia del producto celular; y, • Tiempo de retraso entre la decisión clínica para tratar y disponibilidad de células para el trasplante.

En contraste, el uso de células alogénicas involucra los factores o parámetros siguientes: • El donador es parte secundaria (es decir, el donador no es el paciente) ; » Riesgo asociado con la variabilidad del donador; o Múltiples pacientes tratables por lote fabricado de producto celular; o Consistencia aumentada de identidad, pureza y potencia del producto celular; y, « Tiempo de retraso disminuido entre la decisión clínica para tratar y disponibilidad de producto celular para el trasplante.

Reparación de órgano y tejido El potencial regenerativo de determinados tejidos en el cuerpo del mamífero se ha conocido por siglos, por ejemplo, los tejidos como la piel y hueso se conocen por repararse ellos mismos después de la lesión Sin embargo, un número de afecciones y enfermedades del sistema nervioso central (es decir, cerebro y médula espinal) , sistema de nervios periféricos y corazón afecta adversamente a los humanos debido al déficit de capacidad regenerativa en los tejidos afectados. Estas afecciones y enfermedades incluyen, por ejemplo, lesión a la médula espinal, esclerosis lateral amiotrófica (ALS) , enfermedad de Parkinson, accidente cerebro vascular, enfermedad de Huntington, lesión traumática del cerebro, tumores cerebrales, Enfermedad Fabry, enfermedades del corazón (tales como la insuficiencia cardiaca congestiva e infarto de miocardio) . Las estrategias del manejo clínico, por ejemplo, frecuentemente enfocan la atención más aún en la prevención del daño o lesión en vez del reemplazo o reparación del tejido dañado (por ejemplo, neuronas, células gliales, músculo cardíaco); incluido el tratamiento con esteroides exógenos y medicamentos farmacéuticos no celulares, sintéticos; y que tienen diversos grados de éxito que puede depender de la administración continua del medicamento sintético o esteroide.

Por ejemplo, la mayoría de las lesiones de la médula espinal son lesiones de compresión con los casos restantes involucrando el corte transversal completo de la médula espinal. Los tratamientos terapéuticos actuales de la lesión de la médula espinal incluyen la prevención de las lesiones adicionales de la médula espinal estabilizando físicamente la columna a través de procedimientos quirúrgicos y no quirúrgicos e inhibiendo la respuesta inflamatoria con terapia esteroidal.

Además, el envejecimiento es un componente negativo principal para casi cada enfermedad común que afecta los mamíferos, y una de las características de principio del envejecimiento en la degeneración de muchos tejidos que incluye aquellos de piel, hueso, ojo, cerebro, hígado, riñon, corazón, vasculatura, músculo, etcétera. Además, se conoce que la capacidad regenerativa ya limitada de determinados te idos del cuerpo declina con la edad, los mecanismos de mantenimiento y reparación del tejido en casi cada tejido declinan durante el curso de la vida.

Así, existe una necesidad de desarrollar métodos de tratamiento nuevos, mejorados y eficaces para enfermedades y afecciones, particularmente, enfermedades neurológicas y cardíacas y afecciones degenerativas relacionadas con la edad en los seres humanos .

Eri tropoyesis Las células hematopoyéticas en un ser humano sano u otro mamífero no tienen ordinariamente una capacidad limitada de auto-renovación a largo plazo. Sin embargo, el potencial de pérdida catastrófica de sangre (o necesidad de cualquier otra forma de un suministro suplementario de sangre) combinado con suministros limitados de sangre del donador, conlleva que se deseen completamente métodos, para mejorar, mantener o generar suministros de sangre roja in vitro.

La sangre es un tejido que circula altamente especializado consistente de varios tipos de células suspendidas en un medio fluido conocido como plasma. Los elementos celulares son: glóbulos rojos (eritrocitos) , que portan los gases respiratorios y le dan su color rojo porque contienen hemoglobina (una proteína que contiene hierro que une oxígeno en los pulmones y lo transporta a los tejidos en el cuerpo) , glóbulos blancos (leucocitos) , que combaten la enfermedad, y plaquetas (trombocitos) , fragmentos celulares que juegan una parte importante en la coagulación de la sangre. Los términos médicos relacionados con la sangre frecuentemente comienzan con hemo- o hemato- (BE: haemo- y haemato-) de la palabra griega "haima" para la "sangre". Las células de la sangre se producen en la médula ósea; en un proceso llamado hematopoyesis Las células rojas se degradan por el bazo y el hígado. Los eritocitos sanos tienen un tiempo de vida de 120 días antes que se sustituyen sistemáticamente por nuevos eritrocitos generados por el proceso de hematopoyesis. La transfusión de sangre es el uso terapéutico más común de la sangre. Se obtiene normalmente a partir de donadores humanos. Como existen diferentes tipos de sangre, y la transfusión de la sangre incorrecta puede causar complicaciones severas, se hace correspondencia cruzada para verificar si se transfunde el tipo correcto.

Una escasez de donadores de sangre y suministros inadecuados de glóbulos rojos para la transfusión es un problema común en el tratamiento de pacientes en todo el mundo Como consecuencia, existe una necesidad de métodos nuevos, mejorados y eficaces para aumentar la disponibilidad de glóbulos rojos que pueda proporcionar un medio para aliviar al menos alguna de las escaseces globales en los suministros de glóbulos rojos.

Piel Existen disponibles actualmente un número de tratamientos diferentes para las heridas de la piel tales como productos para el reemplazo epidérmico, productos para el reemplazo dérmico, productos artificiales para la piel, y apositos para heridas. Los ejemplos de algunos de estos se describen brevemente más abajo.

Productos para el Reemplazo Epidérmico De acuerdo con el fabricante, EPICEL™ (Genzyme Corp., Cambridge, MA) se compone de piel con células epidérmicas autólogas crecidas a partir de biopsia de la piel de los propios pacientes para el tratamiento de quemaduras. Las células se co-cultivan con la línea celular de ratón alimentadora en las capas de epidermis autóloga.

De acuerdo con el fabricante, MYSKIN™ (CellTran LTD, Sheffield, SI 4DP Reino Unido) es un sustituto epidérmico autólogo cultivado para el tratamiento de quemaduras, úlceras' y otras heridas no curativas. MYSKIN™ contiene células vivas expandidas de tejido de pacientes individuales. MYSKIN™ comprende una capa de queratinocitos (células epidérmicas) sobre un recubrimiento desarrollado similar a polímero que facilita la transferencia de células en la herida donde pueden iniciar la curación. MYSKIN™ usa una capa de sustrato de silicona de grado médico para apoyar la entrega de célula, cobertura de la herida y manejo del exudado.

De acuerdo con el fabricante, EPIDEX™ (Modex Therapeutics Ltd, Lausanne, Suiza) es un equivalente de piel epidérmica autóloga que se crece directamente a partir de células madre y precursoras derivadas del pelo tomado directamente a partir de un paciente en un procedimiento no quirúrgico .

De acuerdo con el fabricante, CELLSPRAY™ (Clinical Cell Culture Europe Ltd, Cambridge CB2 1NL, Reino Unido) es una suspensión de autoinjerto epitelial cultivado que se atomiza sobre la piel lesionada para proporcionar un revestimiento epidérmico rápido, promover la curación y optimizar la calidad de la cicatriz.

Productos de Reemplazo Dérmico De acuerdo con el fabricante, el Molde de Regeneración DérmicaINTEGRA™ (Integra LifeSciences Corporation, Plainsboro, Nueva Jersey) es un sistema de membrana bicapa para el reemplazo de la piel. La capa de reemplazo dérmica se elabora de una matriz de fibras porosas de colágeno de tendón bovino reticulado y un glicosaminoglicano (condroitina-6-sulfato) que se fabrica con una porosidad controlada y velocidad de degradación definida. La capa sustituta epidérmica temporal se elabora de polímero polisiloxano sintético (silicona) y funciona para controlar la pérdida de humedad de la herida. La capa de reemplazo dérmico de colágeno sirve como una matriz para la infiltración de fibroblastos, macrófagos, linfocitos, y capilares derivados a partir del lecho de herida.

De acuerdo con el fabricante, los fibroblastos alogénicos de recién nacidos DERMAGRAFT™ (Advanced Biohealing Inc., La Jolla, California) que crecen sobre un soporte con malla biodegradable , se indican para las úlceras diabéticas de espesor total .

De acuerdo con el fabricante, el implante quirúrgico PERMACOL™ (Tissue Science Laboratories, Inc. Andover, MA 01810) Permacol™ es una dermis porcina derivada de colágeno que, cuando se implanta en el cuerpo humano, no es alergénica y muy duradera.

De acuerdo con el fabricante, TRANSCYTE™ (Advanced Biohealing Inc., La Jolla, California 92037) TRANSCYTE™ es un sustituto temporal de piel de fibroblasto derivado de prepucio humano (alogénico) . El producto consiste de una membrana de polímero y células de fibroblastos humanos de recién nacidos cultivadas in vitro bajo condiciones asépticas en una malla de nailon. Antes del crecimiento celular, esta malla de nailon se recubre con colágeno dérmico porcino y termoadhiere a una membrana de polímero (silicona) . Esta membrana proporciona una epidermis sintética transparente cuando se aplica el producto a la quemadura. El sustituto temporal de piel derivado de fibroblasto proporciona una barrera temporal de protección. TRANSCYTE™ es transparente y permite la supervisión visual directa del lecho de herida.

De acuerdo con el fabricante, el gel RENGRANEX™ (Ortho- McNeil Pharmaceutical , Inc.® ETHICON, INC.) es un producto tópico para el cuidado de heridas fabricado de PDGF recombinante en un gel.

Productos Artificiales para la Piel (productos de combinación epidérmicos y dérmicos) De acuerdo con el fabricante, PERMADERM™ (Cambrex Bio Science Walkersville , Inc., Walkersville , Maryland) PERMADERM™ se construye a partir de capas epidérmicas y dérmicas autólogas de la piel y se indica para el tratamiento de quemaduras severas . El producto se reporta por ser flexible y crecer con el paciente.

De acuerdo con el fabricante, ORCEL™ (Ortec International, Nueva York, NY) el constructo de bicapa fabricado a partir de células epidérmicas alogénicas y fibroblastos cultivados en colágeno bovino, se indica para las quemaduras de espesor parcial. El fabricante no reporta evidencia de ADN detectable derivado del producto en dos pacientes humanos tratados con producto a las 2 o 3 semanas respectivamente .

De acuerdo con el fabricante, células alogénicas epidérmicas y fibroblastos cultivados en colágeno bovino APLIGRAF™ (Smith & Nephew, Londres, WC2 6LA Reino Unido), se indican para las úlceras venosas de la pierna.

Apositos para heridas De acuerdo con el fabricante, el Aposito de Película Transparente 3M™ TEGADERM™ (3M, St . Paul, Minnesota) es una película transpirable que proporciona una barrera bacteriana y viral a los contaminantes externos.

De acuerdo con el fabricante, el Sellador de Fibrina VH (Baxter, Deerfield, IL) TISSEEL™ se indica para el uso como un complemento a la hemostasia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con la producción y uso de poblaciones celulares estables y composiciones producidas de ese modo. La presente invención se relaciona principalmente con los tratamientos que involucran el uso de células alogénicas . Sin embargo, sería además igualmente posible realizar estos mismos tratamientos usando células autólogas . La presente invención se relaciona además en parte con el tratamiento de las afecciones dermatológicas, tales como heridas de la piel y trastornos y enfermedades inmunológicas que involucran la piel .

El término "población celular estable", como se utiliza en la presente significa una población celular aislada, cultivada ín vitro, que cuando se introduce en un organismo mamífero vivo (tal como un ratón, rata, ser humano, perro, vaca, etc) no resulta en la producción detectable de células que se diferenciaron en un tipo de célula especializada o tipos de células (tales como un condrocito, adipocito, osteocito, etc) y en donde las células en la población celular expresan, o mantienen la capacidad para expresar o la capacidad de ser inducidas para expresar, niveles detectables de al menos una composición terapéuticamente útil (tal como, receptor de TNF-alfa soluble o unido a membrana, antagonistas de IL-1R, antagonistas de IL-18, composiciones que se muestran en las Tablas 1A, IB, 1C, etc.).

Otra característica de las poblaciones celulares estables de la presente invención es que las células no exhiben diferenciación ectópica. El término "ectópico" significa "en el lugar equivocado" o "fuera de lugar". El término "ectópico" viene del griego "ektopis", que significa "desplazamiento" ("ek", fuera de + "topos", lugar = Fuera de lugar) . Por ejemplo, un riñon ectópico, es uno que no está en el lugar habitual, o, un embarazo extrauterino es un "embarazo ectópico". En el presente contexto, un ejemplo de diferenciación ectópica serían células que cuando se introducen en el tejido cardíaco, producen calcificaciones similares al tejido óseo y/o osificaciones. Se demostró que este fenómeno ocurre, por ejemplo, cuando las células madre mesenquimales se inyectan en el tejido cardíaco. Ver, Breitbach y otros, "Potential Risks of Bone Marrow Cell Transplantation Into Infarcted Hearts", Blood, Volumen 110, núm. 4 (agosto 2007) .

La presente invención se relaciona con la generación y uso de células somáticas de auto-renovación formadoras de colonia (denominadas de aquí en adelante como "CF-SC") cultivadas in vitro, expandidas, y productos producidos por dichas células, para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos. Más aun, la presente invención se relaciona además con la generación y uso de células somáticas de auto-renovación formadoras de colonia (denominadas de aquí en adelante como "CF-SC") extensamente expandidas, cultivadas in vitro, y los productos producidos por dichas células, para el tratamiento de una variedad de enfermedades y trastornos. Las ex.CF-SC son células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación (CF-SC) que se sometieron al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular durante el cultivo in vitro. Por lo tanto, las células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación que se expandieron in vitro se denominan de aquí en adelante como "CF-SC" (de modo que, a menos que se especifique de cualquier otra forma, este término incluye ambas poblaciones celulares que se sometieron a menos de aproximadamente 30 duplicaciones de población (por ejemplo, menos de aproximadamente 5, menos de aproximadamente 10, menos de aproximadamente 15, menos de aproximadamente 20, menos de aproximadamente 25 duplicaciones de población) y además las poblaciones celulares que se sometieron a más de aproximadamente 30, más de aproximadamente 40, o más de aproximadamente 50 duplicaciones de población in vitro) . Un ejemplo particular de CF-SC son las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (denominadas de aquí en adelante como "ABM-SC") . Más aún, un ejemplo particular de exCF-SC son las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto, que se sometieron al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular durante el cultivo in vitro (denominado de aquí en adelante como "exABM-SC" ) . Como consecuencia, el término "ABM-SC", a menos que se especifique de cualquier otra forma, incluye tanto las poblaciones celulares ABM-SC que se sometieron a menos de aproximadamente 30 duplicaciones de población (por ejemplo, menos de aproximadamente 5, menos de aproximadamente 10, menos de aproximadamente 15, menos de aproximadamente 20, menos de aproximadamente 25 duplicaciones de población) y además poblaciones celulares ABM-SC que se sometieron a más de aproximadamente 30, más de aproximadamente 40, o más de aproximadamente 50 duplicaciones de la población in vitro) .

El término "extensamente expandido" como se utiliza en la presente se refiere a poblaciones celulares que se sometieron al menos aproximadamente 30 o más duplicaciones de la población celular y en donde las células no son senescentes, son no inmortalizadas, y continúan manteniendo el cariotipo normal que se encuentra en las especies celulares de origen.

Como se utiliza en la presente, el término "capacidad sustancial para la auto-renovación" significa que tiene la capacidad de pasar a través de numerosos ciclos de división celular que resultan en la producción de múltiples generaciones de progenie de células (así, con cada división celular, una célula produce dos "células hijas" en donde al menos una célula hija es capaz de otra división celular) . Una medida de la "capacidad sustancial para la auto-renovación" se indica por la capacidad de una población celular para someterse al menos aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 o más duplicaciones celulares. Otra medida de la "capacidad sustancial para la auto-renovación" se indica por el mantenimiento de la capacidad de una población celular para repoblar, o acercarse a la confluencia en, un frasco de cultivo de tejido después de los pases de cultivo celular (cuando se mantienen las condiciones de cultivo iguales o similares) . Así, un ejemplo de "capacidad sustancial de auto-renovación" se demuestra cuando una población celular continúa repoblando un frasco de cultivo de tejido en un período de tiempo de al menos aproximadamente 25%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ó 100% del tiempo requerido para dicha repoblación durante las primeras duplicaciones de cultivo celular (tal como antes una población celular se sometió a más de aproximadamente 10 duplicaciones de población) . Otra medida de la "capacidad sustancial de auto-renovación" es el mantenimiento de una velocidad constante de tiempo de duplicación de la población o de una velocidad constante y relativamente rápida de la duplicación de la población.

Como se utiliza en la presente, el término "capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente" significa que las poblaciones celulares no pueden diferenciarse en múltiples tipos de células diferentes, ya sea in vitro o in vivo. Un ejemplo de células que tienen capacidad de diferenciación sustancial multipotente son las células madre hematopoyéticas que pueden diferenciarse en glóbulos rojos, células T, células B, plaquetas, etc ya sea in vitro o in vivo. Otro ejemplo de células que tienen capacidad de diferenciación sustancial multipotente son las células madre mesenquimales que pueden diferenciarse, por ejemplo, en osteocitos (hueso) , adipocitos (grasa) , o condrocitos (cartílago) . A diferencia, las células en una población celular que tienen "capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente" no pueden diferenciarse en múltiplestipos celularesin vitroo cuando se introduce en un organismo o tejido(s) objetivo in vivo. En una modalidad preferida de la invención, una población celular con "capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente" es una en la que al menos aproximadamente 80%, 90%, 95%, 98%, 99% o 100% de las células en la población celular no se pueden inducir a diferenciarse de forma detectablein vi tro o in vivo en más de un tipo de célula. Una célula "unipotente" o "célula progenitora unipotente" es un ejemplo de una célula que tiene capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente .

Como se utiliza en la presente, "célula madre" significa una célula o células que poseen las dos propiedades siguientes: 1) capacidad para auto-renovación, que es la capacidad de pasar a través de numerosos ciclos de división celular mientras que mantienen el estado indiferenciado, y, 2) potencia para la diferenciación, que es la capacidad de cambiar en una o más clases de tipos de células maduras y, en dicho cambio, ya no se someten a ciclos de división celular (por ejemplo, capacidad para cambiar en un osteocito, adipocito, condrocito, etc.). Como se utiliza en la presente, la potencia para la diferenciación significa que las células son células progenitoras ya sea totipotentes , pluripotentes , multipotentes , o unipotentes . Una "célula madre mesenquimal" es una célula madre de esta misma definición, pero en donde dicha célula se derivó u obtuvo a partir de tejido del mesénquima (tal como, por ejemplo, médula ósea, tejido adiposo o cartílago) . Ver, Horwitz y otros, " Clarification of the nomenclature for SC: The International Society for Cellular Therapy position statement", Cytotherapy, Volumen 7, núm. 5, págs . 393-395 (2005); y referencias citadas en la misma .

Como se utiliza en la presente, " totipotente" significa células que pueden convertirse en cualquier tipo de célula como se pueden encontrar durante cualquier etapa de desarrolloen el organismo de origen de las células. Las células totipotentes se producen típicamente por las primeras pocas divisiones del huevo fecundado (es decir, a continuación de la fusión de un óvulo y un espermatozoide) . Así, las células totipotentes pueden diferenciarse en tipos de células embrionarias y extraembrionarias .

Como se utiliza en la presente, "pluripotente" significa células que pueden diferenciarse en células derivadas de cualquiera de las tres capas germinales (endodermo, mesodermo, ectodermo) que se encuentran en el organismo de origen de las células.

Como se utiliza en la presente, "multipotente" significa células que pueden producir múltiples tipos (es decir, más de un tipo) de células diferenciadas. Una célula madre mesenquimal es un ejemplo de una célula multipotente.

Como se utiliza en la presente, "unipotente" significa células que pueden producir sólo un tipo de células. Las células unipotentes tienen la propiedad de auto-renovarse , pero pueden cambiar en sólo una clase de tipo de célula madura .

Como se utiliza en la presente, "cariotipo normal" significa que tiene una composición genética que comprende cromosomas del número y de la estructura que se encuentra típicamente en, y se considera normal para la especie de la que se derivan las células.

Como se utiliza en la presente, "tejido conectivo" es uno de los cuatro tipos de tejidos que se refiere por lo general en las clasificaciones tradicionales (siendo los otros tejido epitelial, músculo y nervioso). El tejido conectivo se involucra en el organismo y la estructura y apoyo del órgano y es por lo general derivado del mespdermo. Como se utiliza en la presente, "tejido conectivo" incluye aquellos tejidos denominados a veces como "tejido conectivo apropiado", "tejidos conectivos especializados" y "tejido conectivo embrionario" .

"Tejido conectivo apropiado" incluye tejido conectivo areolar (o laxo) , que tiene sujeto órganos y epitelios en el lugar y tiene una variedad de fibras proteináceas , que incluyen colágeno y elastina. El tejido conectivo apropiado incluye además tejido conectivo denso (o, tejido conectivo fibroso) que forma los ligamentos y tendones.

"Tejido conectivo especializado" incluye sangre, hueso, cartílago, adiposo y tejido conectivo reticular. El tejido conectivo reticular es una red de fibras reticulares (colágeno fino, tipo III) que forma un esqueleto suave para sostener los órganos' linfoides (ganglios linfáticos, médula ósea y bazo) .

"Tejido conectivo embrionario" incluye tejido conectivo mesenquimal y tejido conectivo mucoso. El mesénquima (también conocido como tejido conectivo embrionario) es la masa de tejido que se desarrolla principalmente a partir del mesodermo (la capa media del disco germinal trilaminar) de un embrión. De consistencia viscosa, el mesénquima contiene haces de colágeno y fibroblastos. El mesénquima se diferencia después en vasos sanguíneos, órganos relacionadas con la sangre y tejidos conectivos. El tejido conectivo mucoso (o tejido de la mucosa) es un tipo de tejido conectivo que se encuentra durante el desarrollo fetal; es más fácilmente encontrarlo como un componente de gelatina de Wharton (una sustancia gelatinosa en el cordón umbilical, que sirve para proteger y aislar las células del cordón umbilical) .

Como se utiliza en la presente, "inmortalizada" se refiere a una célula o línea celular que puede someterse a un número indefinido de duplicaciones celulares in vifcro. Las células inmortalizadas adquieren dicha capacidad a través de cambios genéticos que eliminan o evaden el límite natural sobre una capacidad de las células para dividirse continuamente. En contraste, las células "no inmortalizadas" son células eucariotas que, cuando se toman directamente del organismo y se cultivan in vitro (produciendo un "cultivo celular primario"), se pueden someter a un número limitado de duplicaciones celulares antes que senezcan (perdiendo capacidad para dividirse) y mueran. Por ejemplo, los cultivos primarios de la mayoría de los tipos de células no inmortalizadas de mamíferos, puede someterse por lo general a un intervalo relativamente definido pero reproduciblemente limitado de duplicaciones celulares (dependiendo del tipo de célula primaria) antes de la diferenciación, senescencia, o muerte.

Como se utiliza en la presente "injerto a largo plazo" significa la presencia detectable de células del donador que residen en (o como parte de) el tejido objetivo para las que (o en la que) dichas células se entregaron después de más de aproximadamente 4 semanas a partir del momento de la administración. "Más de aproximadamente 4 semanas" incluye periodos de tiempo de más de aproximadamente 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, y 24 semanas. "Más de aproximadamente 4 semanas" incluye además periodos de tiempo de más de aproximadamente 6 meses, 8 meses, 10 meses, 12 meses, 18 meses, 24 meses, 30 meses, 36 meses, 42 meses y 48 meses.

La presente invención se refiere además a la manipulación de poblaciones celulares CF-SC y exCF-SC durante el cultivo para modular (es decir, regular positivo o negativo) la producción de diversas composiciones solubles o secretadas producidas por las células formadoras de colonias de auto- renovación cultivadas y expandidas in vi tro.

La presente invención se relaciona además con poblaciones celulares extensamente expandidas que se caracterizan por la pérdida de la capacidad de diferenciarse en células óseas (osteocitos) . Por ejemplo, la presente invención se relaciona con poblaciones celulares extensamente expandidas que se caracterizan por la pérdida de la capacidad de generar depósitos de calcio cuando se cultivan en condiciones osteoinductivas , que incluyen con o sin cultivo en presencia de Noggin morfógeno de hueso suplementario (ver Ejemplo 16) . (Noggin de ratón y humano: Ver, por ejemplo, la base de datos de Proteína PubMed del Centro Nacional de Biotecnología de Estados Unidos con núms . de acceso NP_032737 y NP_005441 (respectivamente) ; ver además por ejemplo, Valenzuela, y otros, "Identification of mammalian noggin and its expression in the adult nervous system" , J. Neurosci. 15 (9) , 6077-6084 (1995) ) .

La presente invención se relaciona además con poblaciones celulares extensamente expandidas que se caracterizan por la pérdida de la capacidad para diferenciarse en células óseas y/o pérdida de capacidad para generar depósitos de calcio (como se describió anteriormente) , pero en donde dichas poblaciones celulares continúan secretando, o manteniendo la capacidad para secretar o para ser inducidos a secretar, al menos una composición terapéuticamente útil.

La presente invención se relaciona además con terapias basadas en células y de ingeniería de tejidos, particularmente, métodos para usar y/o administrar CF-SC y exCF-SC, o composiciones producidas por dichas células, que incluyen la administración a través de la incorporación en, o mezcla con, portadores farmacéuticamente aceptables (tales como una solución farmacéuticamente aceptable o una matriz transitoria, permanente o biodegradable) .

La presente invención se relaciona además con poblaciones celulares expandidas (es decir cultivadas y pasadas, in vi tro) y extensamente expandidas que son preferentemente negativas para la expresión del marcador de superficie celular STRO-1. Ver, por ejemplo, Stewart y otros, "STRO-1, HOP-26 (CD63), CD49a and SB-10 (CD166) as markers of primitive human marrow stromal cells and their more differentiated progeny: a comparative investigation in vitro" Cell Tissue Res. 2003 Se ; 313 ( 3 ) : 281 - 90 ; y, Dennis y otros, "The STR0-1+ marrow cell population is multipotential" Cells Tissues Organs . 2002 ; 170 ( 2 - 3 ) : 73 - 82 ; y, Oya obi y otros, "Isolation and characterization of human clonogenic osteoblast progenitors immunoselected from fetal bone marrow stroma using STRO-1 monoclonal antibody" , J Bone Miner Res. 1999 Mar; 14 (3) : 351-61.

La presente invención se relaciona además con la fabricación y uso de composiciones farmacéuticamente aceptables que contienen CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) con componentes estructurales y/o terapéuticos adicionales. Como un ejemplo, CF-SC o exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC o exABM-SC) y colágeno se pueden combinar en una solución farmacéuticamente aceptable para generar composiciones en formas líquida, semi-sólida o similar a sólida (matrices) para uso, por ejemplo, en el tratamiento, reparación y regeneración de los trastornos de la piel (por ejemplo, heridas de la piel, tales como quemaduras, abrasiones, laceraciones, úlceras, infecciones).] La presente invención generalmente se relaciona con el uso de células de auto-renovación, referidas en la presente descripción como células somáticas formadoras de colonias (CF-SC) que incluyen las células somáticas formadoras de colonias extensamente pasadas (exCF-SC) . Los ejemplos de dichas células son las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (ABM-SC) , que incluyen las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto extensamente pasadas (exABM-SC) , para uso en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos; particularmente enfermedades y trastornos que involucran la isquemia, trauma y/o inflamación (tal como, por ejemplo, insuficiencia cardíaca debido a infarto agudo de miocardio (AMI) y accidente cerebrovascular) .

Las células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación (CF-SC) tales como células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (ABM-SC) como se usa en la presente invención se preparan como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 20030059414 (solicitud de Estados Unidos núm. 09/960, 244, presentada el 21 de septiembre de 2001) y publicación de patente de Estados Unidos núm. 20040058412 (solicitud de Estados Unidos núm. 10/251, 685, presentada el 20 de septiembre de 2002). Cada una de estas solicitudes de patentes se incorporan de este modo como referencia en su totalidad. Particularmente, CF-SC aisladas de una fuente de población células (tales como, por ejemplo, de médula ósea, grasa, piel, placenta, músculo, sangre del cordón umbilical, o tejido conectivo) se cultivan en condiciones de bajo oxígeno (por ejemplo, menos que el atmosférico) y se pasan a bajas densidades celulares tal que CF-SC mantiene una velocidad de duplicación de la población esencialmente constante a través de numerosas duplicaciones de la población. Después de la expansión de las CF-SC a un número apropiado de células, las CF-SC se pueden usar para generar las composiciones de la presente invención. Por ejemplo, después de la expansión in vitro de CF-SC durante al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de población Celular las ex.CF-SC se pueden usar para generar composiciones de la presente invención. En una modalidad CF-SC y exCF-SC, como se usa en la presente invención, se derivan de la médula ósea (y se refieren en la presente descripción como ABM-SC y. exABM-SC, respectivamente) .

Una modalidad de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , como se usa en la presente invención, es una población celular aislada en donde las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90 y en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas después de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular.

Otra modalidad de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , como se usa en la presente invención, es una población celular aislada en donde las células de la población celular co-expresan CD49c, CD90, y una o más proteínas de superficie celular seleccionadas del grupo que consiste de CD44, antígeno HLA clase -1 y ? (beta) 2 -Microglobulina, y en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas después de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular.

Otra modalidad de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM- SC, respectivamente) , como se usa en la presente invención, es una población celular aislada en donde las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, pero son negativas para la expresión de la proteína de superficie celular CD10, y en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas después de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular.

Otra modalidad de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM- SC, respectivamente) , como se usa en la presente invención, es una población celular aislada en donde las células de la población celular co-expresan CD49c, CD90, y una o más proteínas de superficie celular seleccionadas a partir del. grupo consistente de CD44, antígeno HLA clase -1, y ? (beta) 2-Microglobulina, pero son negativas para la expresión de proteína de superficie celular CD10, y en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas después de al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular.

Otra modalidad de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , como se usa en la presente invención, es una población celular aislada en donde las células de la población celular expresan uno o más proteínas seleccionadas a partir del grupo consistente de proteínas solubles que se muestran en las Tablas 1A, IB y 1C, y en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas después de 3 O al menos aproximadamente 30, al menos aproximadamente 40, o al menos aproximadamente 50 duplicaciones de la población celular.

Los tejidos y órganos dañados pueden resultar de, por ejemplo, enfermedad (por ejemplo, heredable (genética) o enfermedades infecciosas (tales como infecciones bacterianas, virales y fúngicas) ) , trauma físico (tales como quemaduras, laceraciones, abrasiones, compresión o tejido invasivo y lesiones de órganos) , isquemia, enve ecimiento, exposición a productos químicos tóxicos, radiación ionizante, y desregulación del sistema inmune (por ejemplo, trastornos autoinmunes) .

La presente invención incluye el uso de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , fracciones de proteínas purificadas de CF-SC y exCF-SC, sobrenadantes de medios de cultivo acondicionados de CF-SC y exCF-SC, y fracciones de sobrenadantes de células derivados de medio acondicionado de CF-SC y exCF-SC. En una modalidad de la invención, los componentes anteriormente mencionados pueden combinarse con, o introducirse en matrices biodegradables fisiológicamente compatibles que contienen componentes adicionales tales como colágeno y/o fibrina (por ejemplo, colágeno o fibrina, recombinante o natural, purificado, humano, bovino, o porcino) , y/o ácido poliglicólico (PGA) , y/o compuestos estructurales o terapéuticos adicionales. Las matrices de combinación tales como éstas se pueden administrar al sitio del daño del tejido u órgano para promover, mejorar y/o resultar en la reparación y/o regeneración del tejido u órgano dañado.

Las modalidades de la invención incluyen el uso de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , que se incorpora en las composiciones farmacéuticamente aceptables que se pueden administrar en un estado líquido, semi-sólido o similar a sólido. Las modalidades de la invención se pueden administrar por métodos usados rutinariamente por los expertos en la industria pertinente, tal como, por ejemplo, mediante aplicación tópica, como atomizador o composiciones en aerosol, por inyección, e implantación.

El uso de CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , células y composiciones producidas por estas células como se describe en la presente invención para terapias regenerativas del tejido pueden proporcionar un número de beneficios en comparación con las terapias regenerativas del tejido y productos descritos previamente. Por ejemplo, el uso de las CF-SC y exCF-SC (tales como, por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC, respectivamente) , células exABM-SC y composiciones producidas de ese modo proporciona un medio de terapia regenerativa del tejido, que puede exhibir respuestas inmunológicas adversas reducidas (tales como inflamación y activación de células T reducida; ver por ejemplo, los Ejemplos 3A, 3B, 5, 18, y 19. Además, dado que ABM-SC y exABM-SCs son inmunológicamente silentes, los sujetos no necesitan ser HLA compatible o pre-acondicionados antes del tratamiento. Ver el Ejemplo 10, Parte II; ver además, la Figura 17.

La presente invención se relaciona además con el uso de CF-SC y exCF-SC (tales como células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto expandidas y extensamente expandidas (ABM-SC y exABM-SC humanas, respectivamente) ) , y los productos celulares generados por estas células, para inducir, mejorar, y/o mantener la hematopoyesis (particularmente, para la generación y producción in vitro de glóbulos rojos (eritrocitos) a partir de células progenitoras hematopoyéticas en un proceso llamado eritropoyesis) . Así, otra modalidad de la invención incluye el uso de dichas células y/o composiciones producidas por dichas células, para inducir, mejorar y/o mantener la generación y producción de glóbulos rojos (eritrocitos) .

Otro ejemplo del campo de la invención se relaciona con la prevención y tratamiento de trastornos inmunes, autoinmunes , e inflamatorios a través del uso de dichas células, poblaciones celulares, y composiciones producidas de ese modo.

En otro ejemplo, la presente invención proporciona composiciones y métodos para la reparación y regeneración de heridas de la piel (es decir, epidermis, dermis, hipodermis) ; que incluyen la fabricación y uso de matrices líquida, semi-sólida, y similar al sólido que incorporan CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC humanas) , o productos generados por dichas células, y compuestos estructurales o terapéuticos adicionales.

Resultados Ilustrativos de Estudios Preclínicos Estudios preclínicos farmacológicos in vivo demostraron los efectos beneficiosos de ABM-SC en el tratamiento del infarto de miocardio y accidente cerebrovascular . Por ejemplo, en un estudio investigativo de los efectos de la inyección intra-cardiaca de hABM-SC en un modelo de rata de infarto de miocardio (particularmente, para determinar la eficacia de hABM-SC en la restauración de la función cardiaca post-Ml (infarto agudo de miocardio) y evaluar la distribución y disposición de hABM-SC) , se demostró que hABM-SC produjo una mejoría significativa en la función cardiaca y significativamente redujo la fibrosis. Además, las hABM-SC no se observaron permanecer en el corazón cuatro semanas después de la inyección cardíaca, ni en ninguno de los órganos periféricos examinados ocho semanas después de la inyección. Además, en un estudio investigativo de la seguridad y eficacia de las ABM-SC porcinas y humanas en un modelo AMI en cerdos (particularmente, para evaluar la viabilidad, seguridad y eficacia de la administración de las células percutánea endomiocárdica guiada por NOGA™ a través de un catéter MYOSTAR™) se demostró que este método de entrega particular se toleró bien y dio lugar a mejorías significativas en los parámetros cardíacos. Del mismo modo, en una comparación del método de entrega de hABM-SC y recuperación del accidente cerebro vascular (particularmente, para determinar la eficacia de hABM-SC en la promoción de la recuperación neuromotora del accidente cerebrovascular isquémico) se observó que el tratamiento intravenoso. o intra-cerebral resultó en mejorías significativas en la actividad neuromotora.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra una separación en SDS PAGE 2-dimensional (pH 3.5 a 10; 12% de poliacrilamida) de proteínas secretadas por las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (ABM-SC aproximadamente a 27 duplicaciones de población) . Cada mancha en el gel representa una proteína distinta y separada, con intervalo de tamaño de aproximadamente 5-200 kilodaltons (kDa) . El eje X muestra las proteínas separadas de acuerdo con el punto isoeléctrico (pH 3.5 a 10) . El eje Y muestra las proteínas separadas de acuerdo con el peso molecular (por el paso a través de 12% de poliacrilamida) .

La Figura 2 muestra fotomicrografías de la diferenciación de PC- 12 en neuronas usando el factor de crecimiento nervioso (NGF) y medio acondicionado derivado de exABM-SC humanas (en aproximadamente 43 duplicaciones de población) . A) RPMI-ITS sólo medio. B) RPMI-ITS suplementado con NGF. C) RPMI-ITS suplementado con una dilución 1:50 de medios de control concentrados y NGF. D) RPMI-ITS suplementado con una dilución 1:50 de medios acondicionados concentrados derivados a partir de ABM-SC humanas y NGF. Las flechas indican sobrecrecimiento de neuritas. La extensión del sobrecrecimiento de neuritas en el panel D es significativamente más robusto que el de los paneles B y C.

La Figura 3 es una representación gráfica de la inhibición de la proliferación de células T inducida por mitógenos usando ABM-SC humanas. El Lote # RECB801 representa ABM-SC que se sub- cultivaron aproximadamente a 19 duplicaciones de población y el Lote # RECB906 representa exABM-SC que se sub-cultivaron aproximadamente a 43 duplicaciones de población. Para estimular la proliferación de células T, los cultivos se inocularon con 2.5 ó 10 microgramos/ml de Fitohemaglutinina ( "PHA" ) . Las células entonces se cosecharon más tarde después de 72 horas y se tiñeron con el anticuerpo CD3-PC7. Células madre mesenquimales humanas se usaron como un control positivo (Cambrex) . (Las células madre mesenquimales humanas se obtuvieron de Cambrex Research Bioproducts; ahora propiedad de Lonza Group Ltd. , Basilea, Suiza) .

La Figura 4 muestra fotomicrografías de piel de cerdo 7 días después de la herida incisional inducida quirúrgicamente. A) Herida N° 3 tratada con ABM-SC porcina alogénica (aproximadamente a 28 duplicaciones de población) muestra el cierre completo de la herida, prácticamente sin cicatriz. B) En comparación, la Herida N° 4 tratada con vehículo sólo revela una cicatriz visible. C) El gráfico representa la puntuación histomorfométrica de secciones de tejido de ambos grupos de tratamiento y muestra una reducción estadísticamente significativa (p = 0.03) en el número de histiocitos en las heridas tratadas con ABM-SC porcina (la significación estadística se determina usando una Prueba-T de dos colas para datos no pareados) ; comparar, barras de "Histiocitos" PBSG contra tratados con pABM-SC.

La Figura 5 es una representación gráfica (panel superior) del grado de re-epitelización a través de las heridas incisionales 7 días post- tratamiento . Las heridas tratadas con ABM-SC porcinas (aproximadamente a 28 duplicaciones de la población) tuvieron una epidermis más densa que aquellas tratadas con solo vehículo. La microfotografía en el panel inferior izquierdo (B) muestra (histológicamente) reparación completa y anatómicamente correcta de la epidermis en las heridas tratadas con ABM-SC porcinas. La microfotografía en la parte inferior derecha del panel (C) muestra (histológicamente) ABM-SC porcinas (cabezas de flecha) que aparecen injertadas, al menos transitoriamente, en la hipodermis en este intervalo de tiempo de 7 días .

La Figura 6 es una representación gráfica de la contracción mediada por ABM-SC de matrices de gel de colágeno hidratados sembrados 24 horas después de la reconstitución celular. ABM-SC humanas (aproximadamente a 27 duplicaciones de la población) se reconstituyeron en medios líquidos biodegradables basados en colágeno (a 1.8 x 10 6 células/ml) y después se almacenaron durante 24 horas aproximadamente a 4-8 °C. El día siguiente, la suspensión líquida de células se colocó en una placa de cultivo para formar una matriz de colágeno semi-sólido. Las matrices de colágeno semi-sólidos se mantuvieron en una incubadora de cultivo celular para facilitar la contracción durante el curso de tres días. Las matrices de colágeno preparados sin células no se contrajeron, demostrando que la contracción es dependiente de la presencia de células .

La Figura 7 es una representación gráfica de la contracción mediada por ABM-SC de matrices hidratadas de gel de colágeno sembradas a diferentes concentraciones celulares utilizando exABM-SC aproximadamente a 43 duplicaciones de población. Los datos demuestran que la velocidad y la magnitud absoluta de la contracción se relacionan con el número de células . Las células inactivadas con calor no contraen los geles, demostrando que esta actividad es un evento biofísico.

La Figura 8 es una representación gráfica de secreción mediada por ABM-SC de varias citocinas y proteasas de la matriz (es decir, IL-6, VEGF, Activina-A, MMP-1, y MMP-2) cuando se cultivan durante 3 días en matrices hidratadas de gel de colágeno utilizando exABM-SC aproximadamente a 43 duplicaciones de población.

La Figura 9 muestra fotomicrografías de ABM-SC humanas reconstituidas en medios biodegradables basados en colágeno como un líquido (panel de la izquierda, A) o un semisólido (panel de la derecha, B) (utilizando exABM-SC aproximadamente a 43 duplicaciones de población) . Cuando se reconstituye usando esta formulación, la suspensión celular puede permanecer como un líquido a 4 °C durante más de 24 horas. Cuando se coloca en una placa de cultivo y se incuba a 37 °C, la suspensión celular se solidificará en 1-2 horas, dando lugar a una estructura semi- sólida que se puede manipular físicamente .

La Figura 10 muestra fotomicrografías de un neotejido similar al sólido formado por el cultivo de ABM-SC humanas (aproximadamente a 43 duplicaciones de población) reconstituido en medios biodegradables basados en colágeno durante tres días. El panel superior izquierdo (A) muestra la flexibilidad del tejido cuando se estira. El panel superior derecho (B) muestra la textura general del neotejido similar a sólido. El panel inferior (C) muestra una sección histológica del tejido teñido por Tricromo de Masson, demostrando la matriz rica extracelular sintetizada por las ABM-SC. Los geles de control construidos por el mismo método, pero carentes de células, no se tiñen de azul por este método, demostrando que la matriz rica en colágeno y glicosaminoglicano se produce por las células.

La Figura 11 muestra un ejemplo de las cantidades de múltiples citocinas pro-regenerativas secretadas por ABM-SC humanas con y sin estimulación de TNF-alfa. Cuando las ABM- SC se sub-cultivan, secretan concentraciones potencialmente terapéuticas de varios factores de crecimiento y citocinas conocidos por aumentar la angiogénesis , modulan la inflamación y promueven la cicatrización de heridas. Las ABM-SC demostraron secretar consistentemente varias citocinas y factores de crecimiento in vitro; que incluyen factores proangiogénicos (por ejemplo, SDF-1 alfa, VEGF, ENA-78 y angiogenina) , inmunomoduladores (por ejemplo, IL-6 e IL-8) y los inhibidores de cicatriz/moduladores de la curación de heridas (por ejemplo, MMP-1, MMP-2, MP-13 y Activina-A) . Además, la liberación de varios de estos factores se modula por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) , una citocina inflamatoria conocida liberada durante el curso de la lesión aguda del tejido.

La Figura 12 muestra un modelo de lesión de respuesta en cascada (inflamación, regeneración, y fibrosis de la lesión a través de la cicatriz) y ejemplos de moléculas que pueden desempeñar papeles en la inflamación, regeneración y fibrosis.

La Figura 13 muestra un ejemplo de resultados mejorados de la función cardíaca en ratas tratadas con ABM-SC humanas. Cuatro semanas después del tratamiento, las ratas que reciben ABM-SC demostraron valores +dp/dt significativamente superiores (velocidad de pico positivo de cambio de presión) (A) . Los cambios que se expresan en la función cardiaca durante el curso del estudio restando los valores +dp/dt de la semana 0 de los valores de la semana 4 ("delta +dp/dt") demostraron que mientras las ratas tratadas con vehículo tuvieron disminuciones en la función cardiaca durante el curso del estudio (delta negativo) , los animales tratados con cualquiera de las preparaciones celulares mostraron mejoría significativa en la función cardiaca (B) . En comparación con las ratas tratadas con vehículo, aquellas que reciben ABM-SC demostraron valores tau (C) significativamente inferiores, lo que sugiere un mayor cumplimiento del ventrículo izquierdo. Tau es la constante de tiempo del decaimiento isovolumétrico de la presión ventricular izquierda. Para la velocidad del pico negativo de cambio de presión (-dp/dt), que expresa los cambios en la función cardíaca durante el curso del estudio restando los valores -dp/dt de la semana 0 de los valores de la semana 4 ("delta -dp/dt") demostraron que mientras las ratas tratadas con vehículo tuvieron disminuciones en la función cardiaca durante el curso del estudio (delta negativo) , los animales tratados con la preparación celular mostraron una mejoría significativa en la función cardíaca (D) . [*p<0.05, **p<0.01 por A OVA] .

La Figura 14 muestra reducción de la fibrosis y angiogénesis mejorada en un modelo de rata de infarto de miocardio tratado con ABM-SC humanas (hABM-SC) . La puntuación semi-cuantitativa se usó para evaluar los cambios en el tamaño del infarto en los corazones de ratas que reciben vehículo o ABM-SC siete días después de un infarto de miocardio. El análisis histopatológico, se realizó aproximadamente 30 días después de la administración de ABM-SC, lo que indicó reducción significativa en el tamaño del infarto en las ratas que reciben hABM-SC en comparación con el vehículo. De acuerdo con una escala predefinida, las ratas que reciben hABM-SC tuvieron puntuaciones histológicas aproximadamente dos puntos inferiores que los controles con vehículo. Esta figura muestra un ejemplo de reducción típica del tamaño del infarto.

La Figura 15 muestra los resultados obtenidos a partir del análisis histológico, realizado aproximadamente 30 días después de la administración de ABM-SC, la medición de cambios en la estructura del corazón de ratas que reciben vehículo o ABM-SC siete días después del infarto de miocardio .

La Figura 16 muestra que ABM-SC (RECB801) y exABM-SC (RECB906) alogénicas humanas suprimen la proliferación de células T inducida por mitógenos en un ensayo MLR de una vía (reacción mixta de linfocitos) .

La Figura 17 muestra que ABM-SC alogénicas porcinas fallan a la respuesta inmune ilícita mediada por células T en un experimento de reto MLR de 2 -vías. Un índice de división se calculó para las muestras recogidas en los valores iniciales y 3 ó 30 días post-tratamiento y se retó después in vi tro con medios, vehículo, pABM-SC o ConA. El índice promedio de división de todos los animales en el Día 3 o Día 30 para las células PBMC que se estimularon con ConA fue significativamente superior que el índice de división para las células PBMC a partir del vehículo y animales tratados con pABM-SC, tanto en el pretratamiento como necropsia (* p < 0.05) .

La Figura 18 muestra los cambios en el tamaño del déficit de perfusión fija cardíaca en tres pacientes mediante la comparación de las mediciones de los valores iniciales (BL) , con mediciones obtenidas a los 90 días post- tratamiento con hABM-SC.

La Figura 19 muestra los cambios en las fracciones de eyección cardíaca medidos en tres pacientes mediante la comparación de las mediciones de los valores iniciales (BL) con las mediciones obtenidas a los 90 días post- tratamiento con hABM-SC.

La Figura 20 muestra ejemplos de las cantidades de citocinas eritropoyéticas secretadas in vitro por hABM-SC (es decir, IL-6, Activina-A, VEGF, LIF, IGF-II, SDF-1 y SCF) . Los lotes ABM-SC se probaron para la secreción de citocinas usando Matriz de Anticuerpo para Citocina Humana RAYBIO™. (RayBiotech, Inc.) . Las células se cultivaron primero en DMEM avanzado libre de suero (GIBCO™) durante tres días para generar el medio acondicionado (CM) . El CM se concentró después usando Unidades de Filtro de Centrífuga CENTRICON™ PLUS-20 (Millipore) antes del análisis.

La Figura 21 demuestra que exABM-SC reducen los niveles de TNF-OÍ in vitro en una manera dependiente a la dosis. Las exABM-SC humanas (aproximadamente a 43 duplicaciones de población) se probaron por su capacidad para reducir los niveles de TNF-a cuando se cultivaron en diversas densidades de siembra (por ejemplo 10,000 células/cm2, 20,000 células/cm2, y 40,000 células/cm2). Las células se cultivaron durante 3 días en DMEM avanzado libre de suero (GIBCO™) ya sea solo o suplementado con 10ng/ml de TNF-or. Las células inactivadas con calor se incluyeron además como un control negativo. La concentración de TNF se muestra en el eje-Y. (el eje Y representa la concentración de sustancias en los medios que se concentraron lOOx) .

Las Figuras 22A y 22B demuestran que la reducción de TNF-a parece que se media por la secreción de sTNF-RI y sTNF-RII por exABM-SC (aproximadamente a 43 duplicaciones de población) . El nivel de expresión basal de sTNF-RI ocurre en ausencia de un inductor pro-inflamatorio (A) , mientras que sTNF-RII se detecta en niveles apreciables sólo cuando primero se ceba con TNF-a (B) . Estos datos revelan una relación inversa entre el número de células sembradas y los niveles tanto de sTNF-RI como sTNF-RII detectado, lo que sugiere que los receptores secretados por si mismos se pueden unir a y enmascarar el TNF-a. (el eje Y representa la concentración de sustancias en los medios que se concentraron lOOx) .

La Figura 23 demuestra que los niveles de secreción de IL-IRA (por exABM-SC aproximadamente a 43 duplicaciones de población) es dependiente a la dosis. El nivel de expresión basal de IL-IRA ocurre en ausencia de un inductor pro-inflamatorio, pero cuando se ceba aumenta aproximadamente 10 veces los niveles de TNF-a soluble. (el eje Y representa la concentración de sustancias en los medios que se concentraron lOOx) .

La Figura 24 , muestra la expresión del antagonista del receptor de IL-1 (IL-IRA) y la proteína de unión IL-18 (IL-18BP) por exABM-SC. Las exABM-SC humanas expresan niveles básales del antagonista del receptor de IL-1 (IL-IRA; Figura 24A) y proteína de unión IL-18 (IL-18BP; Figura 24B) aún en ausencia de una señal inflamatoria tal como TNF-alfa.

Las Figuras 25A, B, y C muestran que las ABM-SC humanas reducen los niveles de TNF-alfa (Figura 25A) e IL-13 (Figura 25B) mientras que inducen simultáneamente la expresión elevada de IL-2 (Figura 25C) en un ensayo de reacción mixta de PBMC. (R = PBMC en Respondedores, Self = PBMC tratada con Mitomicina-C aislada del mismo donador como del Respondedor, Stim = PBMC tratada con Mitomicina-C aislada de diferente donador . ) La Figura 26 muestra una representación gráfica de la inhibición de la proliferación de células mononucleares de sangre periférica humanas inducidas por mitógenos (PBMC) usando ABM-SC humanas. RECB801 representa un lote en particular de ABM-SC que se sub-cultivó aproximadamente a 19 duplicaciones de población y # RECB906 representa un lote en particular de ABM-SC que se sub-cultivó aproximadamente a 43 duplicaciones de población. Para estimular la proliferación de PBMC, los cultivos se inocularon con 2.5 microgramos/ml de fitohemaglutinina. Después de 56 horas en cultivo, las células se pulsaron con Timidina- [Metil-3H] y a las 72 horas se cuantificó la incorporación de isótopos (CPM) . Las células madre mesenquimales humanas (Cambrex) se incluyeron como un control positivo.

La Figura 27 representa los resultados de un ensayo de contracción con gel de colágeno porcino de grado médico; demostrando una curva eficaz de respuesta a la dosis de contracción de gel de colágeno como una función de la densidad de exCF-SC humana creciente y concentración de gel de colágeno creciente.

La Figura 28 representa cantidades de VEGF (Factor de Crecimiento Endotelial Vascular) producido en exCF-SC humanas cultivadas encapsuladas en neotejido de gel de colágeno porcino; demostrando que las concentraciones de VEGF aumentaron en los geles como una función de la densidad celular creciente.

La Figura 29 representa los resultados obtenidos en un ensayo in vitro de cierre de herida cuando los medios acondicionados que contienen factores producidos por exCF-SC humanas se comparan con los resultados obtenidos con los medios no acondicionados, demostrando que los medios acondicionados aumentaron significativamente la velocidad y magnitud del cierre de la herida en comparación a los medios no acondicionados.

La Figura 30 representa una determinación cuantitativa de los factores secretados presentes en los medios acondicionados a continuación de la exposición de exCF-SC humanas a IL-1 alfa (IL-la) (10ng/ml) durante 24 horas; demostrando que IL-la induce la expresión de algunos de los factores y regula positivamente la expresión de otros.

La Figura 31 representa una determinación cuantitativa de los factores secretados presentes en los medios acondicionados a continuación de la exposición de exCF-SC humanas a factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) (10ng/ml) durante 24 horas; demostrando que TNFa induce la expresión de algunos factores y regula positivamente la expresión de otros .

La Figura 32 representa una determinación cuantitativa de los factores secretados presentes en los medios acondicionados a continuación de la exposición de exCF-SC humanas a interferón gamma (IFNg) (10ng/ml) durante 24 horas; demostrando que IFNg induce la expresión de algunos factores y regula positivamente la expresión de otros.

La Figura 33 resume los efectos de factores inflamatorios en el perfil de secreción de exCF-SC humanas. Un código numérico se usa para indicar el grado y la naturaleza de estos efectos; divididos en 5 categorías en función de la magnitud y dirección del efecto.

Código : -2 = reducción de > 2; -1 = reducción de 0 a -2; 0 = sin cambio; +1 = inducción <10; +10 = inducción 10 a 1000; +1000 = inducción >1000.

Estos resultados demuestran que exCF-SC humanas modifican su perfil de secreción en respuesta a diferentes marcadores inflamatorios y por lo tanto uno puede esperar que las ABMSC humanas tengan efectos distintos dependiendo del medio ambiente in vivo.

La Figura 34 las cajas sólidas indican (por ejemplo, pero sin limitarse a) diversos sistemas biológicos en los que la inducción de los factores indicados pueden ser útiles en la presentación de los efectos terapéuticos (por ejemplo, vascular, inmune, regenerativo , inflamatorio, y los sistemas y mecanismos de reparación de la herida) .

La Figura 35 demuestra que casi 200 transcriptos se expresan diferencialmente al menos dos veces (p=0.01) en los Fibroblastos Dérmicos Humanos Neonatales (NHDF) que crecen en 4% de oxigeno y siembran a 30 células/cm2 comparado con NHDF que crecen en 20% de oxígeno y siembran a 3000 células/cm2. Ver además, la Tabla 2.

La Figura 36 muestra que las células derivadas de la médula ósea de adulto a partir de fuentes equinas (caballo) son capaces de rápida proliferación y elevado número de duplicaciones celulares cuando se cultivan y pasan in vitro en condiciones de bajo oxígeno (4% de oxígeno) y bajas densidades de siembra de células (60 células/cm2) .

La Figura 37 demuestra que las poblaciones celulares equinas derivadas de la médula ósea de adulto (caballo, EQ104) exhiben bioactividad (contracción de gel) cuando se cultivan en una matriz de colágeno.

La Figura 38 representa los niveles de VEGF en soportes cultivados de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) sembrados con exCF-SC humana; demostrando un aumento en el VEGF contenido en los constructos de PLGA como una función de la densidad celular creciente.

La Figura 39 muestra fotografías de las diversas formas de constructos de bio- ingeniería de la invención: A & B)gel de colágeno porcino sembrado con exCF-SC después del cultivo y reticulación para generar un constructo bioactivo no viviente estable mecánicamente; C) gel de colágeno porcino sembrado con exCF-SC después del cultivo y deshidratación para generar un constructo bioactivo no viviente de capa fina; y D) soporte no tejido de PLGA (esquina inferior izquierda) y constructo cultivado en soporte no tejido de PLGA sembradas con exCF-SC humana (esquina inferior derecha) . El cuarto de dólar de Estados Unidos se muestra para la comparación de tamaño (centro, arriba) .

La Figura 4 Oes un diagrama de flujo que ilustra un proceso de la invención para crear dispositivos bioactivos basados en colágeno. En modalidades, el proceso involucra 4 etapas principales como se indica.

Figura 41 Imágenes microscópicas fluorescentes de la viabilidad de células viva/muerta en constructos de colágeno teñidos sembrados con hABM-SC.

Figura 42 Mediciones de la contracción del gel de colágeno en el tiempo de constructos de colágeno porcino sembrados con hABM-SC.

Figura 43 Cuantificación de VEGF por ELISA a partir de constructos de gel de colágeno porcino sembrados con hABM-SC recogidos en lisados de constructos y medios acondicionados.

Figura 44 Viabilidad celular en constructos de colágeno sembrados con hABM-SC sin y con adición de 20 mM de HEPES al medio de cultivo.

Figura 45 Cuantificación de VEGF por ELISA en lisados de constructos cultivados de gel de colágeno porcino sembrados con hABM-SC.

Figura 46 Tiempos de digestión de colagenasa y viabilidad celular en los digestos de constructos de colágeno con hABM-SC cultivadas reticuladas con glutaraldehído .

Figura 47Cuantificación de VEGF por ELISA en los constructos de colágeno con hABM-SC procesados.

Figura 48 Viabilidad de hABM-SC después de sembrar el constructo de colágeno fragmentado con el procesamiento.

Figura 49 Cuantificación de VEGF por ELISA en los Usados de las iteraciones diversas del dispositivo.

Figura 50 Cuantificación de VEGF por ELISA en los lisados de las iteraciones diversas del dispositivo.

Figura 51 Cuantificación de VEGF por ELISA en los lisados de las iteraciones diversas del dispositivo.

Figura 52 Fotografía del constructo sembrado con células de colágeno cultivadas reticuladas con glutaraldehído antes de la deshidratación .

Figura 53 Fotografía de las modalidades de dispositivos durante la etapa de deshidratación.

Figura 54 Fotografía de los dispositivos 6601 sembrados con células Figura 55 Fotografía de los dispositivos ilustrativos de la invención.

Figura 56 Fotografía de iteración del dispositivo 6601 durante la prueba de retención de sutura.

Figura 57 Cuantificación de VEGF por ELISA en los lisados de las iteraciones diversas del dispositivo.

Figura 58 Cuantificación de VEGF por ELISA en los lisados de las iteraciones del dispositivo.

Figura 59 Prototipos de dispositivos bioactivos, GBT basados en colágeno. A. 46000, sin reticular. B. 46001, reticulado con 0.001% de glutaraldehído . Imagen de 46000-001 no disponible.

Figura 60 Reparación de lesiones del tendón flexor inducida quirúrgicamente usando sutura Kessler-Kaj ima (cabeza de flecha) y dispositivo GBT 46001.

La Figura 61 46001 se recorta en una tira de aproximadamente 0.7-0.9 cm de ancho x 2.8 era de diámetro, y se envuelve alrededor del tendón flexor digital.

La Figura 62 soporte SCAFTEX PLGA 90/10 solo (abajo a la izquierda, SCAFTEX sembrada con producto de terapia celular Garnet, GBT009 (abajo a la derecha) . El cuarto de dólar se incluye para la escala.

La Figura 63 dispositivo basado en PLGA GBT implantado en el pulgar después de la artroplastia CMC.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con el uso de terapias basadas en células sin depender del injerto celular a largo plazo. Particularmente, la invención se relaciona con el uso de células, y composiciones producidas por las células, en el tratamiento de diversas enfermedades y trastornos,- particularmente aquellas que involucran a los tejidos y órganos con limitada capacidad de auto-renovación (tales como, por ejemplo, tejidos neurológicos y cardiacos y órganos) . En modalidades de la invención, las células de la invención se ponen en contacto con un paciente que necesita tratamiento. El término "paciente" incluye tanto humanos como animales no humanos .

Típicamente, una célula madre u otras células progenitoras en fase inicial pierden plasticidad porque las células se han comprometido con una vía de diferenciación particular. A nivel biomolecular, como este proceso comienza a ocurrir la célula pierde la capacidad de responder a determinadas moléculas de señalización (por ejemplo, mitógenos y morfógenos) que pueden de cualquier otra forma conducir a la célula a que se divida o convierta en otro tipo de célula. Así, cuando una célula comienza a diferenciarse, abandona el ciclo celular (es decir, ya no puede volver a través de la mitosis) y entra en un estado irreversible llamado G0 en donde la célula ya no puede dividirse. La entrada en G0 se asocia también con senescencia replicativa (características distintivas de las cuales incluyen expresión aumentada de las proteínas intracelulares p21 y p53). Así, la pérdida de plasticidad (la capacidad para diferenciar en una variedad de tipos celulares) se considera típicamente un preludio a la diferenciación celular o senescencia celular. Además, la pérdida de plasticidad típicamente también se asocia con la pérdida de la capacidad de las células para la auto-renovación continua. En contraste, a este escenario típico, tradicionalmente aceptado, un resultado inesperado y sorprendente de la presente invención es que exCF-SC de la presente invención (por ejemplo, exABM-SC) continua para auto-renovar (que incluyen auto-renovación a un ritmo relativamente constante) a pesar de la pérdida de plasticidad. Como consecuencia, una modalidad de la · presente invención son las "células de la etapa final" terapéuticamente útiles con una capacidad continua para la auto-renovación (por ejemplo, células capaces de auto-renovación continua y producción de factores tróficos de apoyo (o "células tróficas de apoyo")) . En otra modalidad, las exCF-SC y exABM-SC de la presente invención no expresan cantidades significativas de p21 y/o p53, en donde una "cantidad significativa" de dichas moléculas es una cantidad que es indicativa de la senescencia celular (en donde la senescencia puede requerir niveles suficientes de expresión de p21, p53, y/ u otros reguladores del ciclo celular) .

Además, la mayoría de los expertos en el campo de la presente invención pueden esperar una célula tipo estroma no-hematopoyética que perdió plasticidad para tener utilidad limitada o capacidad de generar o favorecer la regeneración de órganos y tejidos. Así, otro resultado sorprendente e inesperado de la presente invención, es la capacidad para generar CF-SC pasadas extensamente (por ejemplo, ABM-SC) que perdieron plasticidad pero conservan la capacidad para generar nuevos tejidos in vitro y promover la regeneración del tejido in vivo.

La presente invención se refiere, entre otros, a los métodos para reparar, regenerar y/o rejuvenecer los tejidos usando células de auto-renovación, referidas en la presente descripción como células somáticas formadoras de colonias (CF-SC) (un ejemplo de los cuales son las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (ABM-SC) ) . Las células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación (CF-SC) tal como las células somáticas humanas derivadas de la médula ósea de adulto (ABM-SC) como se usan en la presente invención se preparan como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 20030059414 (solicitud de Estados Unidos núm. 09/260, 244, presentada el 21 de septiembre de 2001) y la publicación de patente de Estados Unidos núm. 20040058412 (solicitud de Estados Unidos núm. 10/251, 685, presentada el 20 de septiembre de 2002) . Cada una de estas solicitudes de patentes se incorpora de este modo como referencia en su totalidad. Además incorporadas como referencia en la presente descripción están las solicitudes de patentes provisional de Estados Unidos 60/929,151 y 60/929, 152 (cada una presentada el 15 de junio de 2007) , solicitud de patente provisional de Estados Unidos 60/955,204 (presentada el 10 de agosto de 2007), y solicitud de patente provisional de Estados Unidos 60/996, 093 (presentada el 1 de noviembre de 2007) .

La invención se relaciona además con composiciones y matrices que comprenden cultivo celular acondicionado derivado a partir de células CF-SC. La invención proporciona además métodos para tratar afecciones médicas en un paciente usando cultivo celular acondicionado derivado de células CF-SC. El término "cultivo celular acondicionado derivado de células CF-SC" se refiere al medio en que las células CF-SC crecieron, después que las células se eliminaron del medio. En modalidades, dicho cultivo celular acondicionado derivado de células CF-SC es sustancialmente libre de las células CF-SC. "Sustancialmente libre" significa que todas las células se eliminaron o una mayoría de las células se eliminaron. Opcionalmente, el cultivo celular acondicionado derivado de células CF-SC se trató con compuestos farmacéuticos, por ejemplo factores estimuladores tales como interleucina^l beta (IL-lb) , interleucina-1 alfa (IL-la) , factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) , interferón gamma (IFN-g) , Interléucina-2 (IL-2) , Factor de crecimiento transformante beta (TGF-b) , Factor de crecimiento nervioso (NGF) , Factor de crecimiento epidérmico (EGF ) , concavalina A (Con-A) , y/o fitohemaglutinina (PHA) , para nombrar unos pocos, para inducir la producción de medios de cultivo celular acondicionados .

Particularmente, CF-SC aisladas de una fuente de población de células (tales como, por ejemplo, de la médula ósea (ABM-SC y exABM-SC) , grasa, piel, placenta, músculo, sangre del cordón umbilical, o conectivo) , se permiten para adherirse a una superficie de cultivo celular en presencia de unos medios apropiados (tales como, por ejemplo, pero sin limitarse a, Medio Alfa Esencial Mínimo (por ejemplo, disponible de HYCLONE™) suplementado con 4 mM de glutamina y 10% de suero fetal bovino) y cultivado en condiciones de bajo oxígeno (tales como por ejemplo, pero sin limitarse a, 02 aproximadamente a 2-5%, C02 aproximadamente a 5%, balanceado con nitrógeno) y, posteriormente, se pasaron a bajas densidades celulares (tal como aproximadamente a 30-1000 células/cm2) de modo que el CF-SC mantiene una velocidad de duplicación de la población esencialmente constante (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a, una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas) a través de numerosas duplicaciones de población (tal como por ejemplo, pero sin limitarse a, pasando a través de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 y/o 50 duplicaciones de la población) .

Las modalidades de la invención se pueden generar con CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) cultivadas en condiciones de bajo oxígeno en donde dichas concentraciones de 02 se extienden de aproximadamente 1-20% (por ejemplo, en donde la concentración de 02es aproximadamente 1% , 2% , 3%, 4%, 5%, 6%, 7% , 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, , 15%, ó 20%) , más C02 y balanceado con nitrógeno. Por ejemplo , las ABM-SC se pueden cultivar en condiciones de bajo oxígeno en donde dichas concentraciones de 0 ¡¡concentraciones son aproximadamente 20%, menos de aproximadamente 20%, aproximadamente 1,5%, menos de aproximadamente 15%, aproximadamente 10%, menos de aproximadamente 10%, aproximadamente 7%, menos de aproximadamente 7%, aproximadamente 6%, menos de aproximadamente 6% , aproximadamente 5%, menos de aproximadamente 5%, aproximadamente 4%, menos de aproximadamente 4%, aproximadamente 3%, menos de aproximadamente 3%, aproximadamente 2%, menos de aproximadamente 2%, aproximadamente 1%, o en donde dichas condiciones de bajo oxígeno están en un intervalo de aproximadamente 1% aproximadamente a 20%, aproximadamente 1% aproximadamente a 15%, aproximadamente 1% aproximadamente a 10%, aproximadamente 1% aproximadamente a 5%, aproximadamente 5% aproximadamente a 20%, aproximadamente 5% aproximadamente a 15%, aproximadamente 5% aproximadamente a 10%, aproximadamente 10% aproximadamente a 15%, aproximadamente 10% aproximadamente a 20%, aproximadamente 2% aproximadamente a 8%, aproximadamente 2% aproximadamente a 7%, aproximadamente 2% aproximadamente a 6%, aproximadamente 2% aproximadamente a 5%, aproximadamente 2% aproximadamente a 4%, aproximadamente 2% aproximadamente a 3%, aproximadamente 3% aproximadamente a 8% , aproximadamente 3% aproximadamente a 7%, aproximadamente 3% aproximadamente a 6%, aproximadamente 3% aproximadamente a 5%, aproximadamente 3% aproximadamente a 4%, aproximadamente 4% aproximadamente a 8%, aproximadamente 4% aproximadamente a 7%, aproximadamente 4% aproximadamente a 6%, aproximadamente 4% aproximadamente a 5%, aproximadamente 5% aproximadamente a 8%, aproximadamente 5% aproximadamente a 7%, aproximadamente 5% aproximadamente a 6%, o aproximadamente 5%.

Las modalidades de la invención se pueden generar con CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) cultivadas en condiciones de bajo oxígeno en donde la concentración de C02 se extiende de aproximadamente 1-15% (por ejemplo, en donde la concentración de C02 es aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, ó 15%), más 02 bajo y balanceado con nitrógeno. Las modalidades de la invención se pueden generar con CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) pasadas sembrando las células a bajas densidades celulares, en donde dicha densidad celular se extiende de aproximadamente 1-2500 células/cm2 (por ejemplo, en donde la densidad celular es aproximadamente 1, 2, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000 ó 2500 células/cm2) . Por ejemplo, las ABM-SC se pueden pasar a densidades de siembra de menos de aproximadamente 2500 células/cm2, menos de aproximadamente 1000 células/cm2, menos de aproximadamente 500 células/cm2, menos de aproximadamente 100 células/cm2, menos de aproximadamente 50 células/cm2, menos de aproximadamente 30 células/cm2, o menos de aproximadamente 10 células/cm2. Las modalidades de la invención se pueden generar con CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) en donde las velocidades de duplicación de la población celular se mantienen en un intervalo de menos de aproximadamente 24-96 horas (por ejemplo, en donde la velocidad de duplicación de la población celular se mantiene a menos de aproximadamente 24, 30, 36, 42, 48, 54, 60, 66, 72, 78, 84, 90, ó 96 horas). Las modalidades de la invención se pueden generar con CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación esencialmente constante a través de un intervalo de duplicaciones de la población, tales como en un intervalo de aproximadamente 5-50 duplicaciones de población (por ejemplo, en donde la velocidad de duplicación de la población se mantiene durante aproximadamente 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, ó 5-50 duplicaciones de población) Las modalidades de la invención incluyen el uso de CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) incorporadas en composiciones farmacéuticamente aceptables que pueden estar en un estado líquido, semisólido o similar a sólido. El uso de los términos "estado líquido, semi- sólido o similar a sólido" pretende indicar que la composición farmacéuticamente aceptable en el que las células están contenidas puede abarcar un intervalo de estados físicos desde 1) un estado líquido común (tal como en una solución salina fisiológica normal), 2) hasta un intervalo amplio de estados de bajo a altamente viscosos que incluyen estados similar a jalea, gelatinoso, o viscoelásticos (en donde la composición farmacéutica contiene desde niveles de agua extracelular muy alto a muy bajos, por ejemplo, tal que la composición se extiende en viscosidad de un estado en donde "brota" lentamente como el aceite o miel a estados cada vez más gelatinosos o viscoelásticos que pueden ser similar a la gelatina, flexible, semi-elástico y/o maleable; 3) hasta un estado similar a sólido (que tiene niveles muy bajos de agua extracelular) en donde las células vivas en la matriz remodelaron el medio en el que se suspendieron inicialmente en una matriz resistente y no gelatinosa, pero todavía flexible, semi-elástica y maleable (que, por ejemplo, tiene algunas de las mismas propiedades flexible, semi-elásticas de la piel de mamíferos) ; ver, las Figuras 10A y 10B.

La viscoelasticidad, además conocida como anelasticidad, describe materiales que exhiben características tanto viscosa como elástica cuando se someten a deformación plástica. Los materiales viscosos, como la miel, resisten el flujo de cizallamiento y la deformación linealmente con el tiempo cuando se aplica una tensión. Los materiales elásticos se deforman instantáneamente cuando se estiran y con la misma rapidez vuelven a su estado original una vez que se elimina la tensión. Los materiales viscoelásticos tienen elementos de estas propiedades y, como tal, exhiben deformación dependiente del tiempo.

La administración clínica de las células en vehículos líquidos, semisólidos y similares a sólidos permitirá la aplicación de tratamientos que se forman para el contorno del lecho de herida, sin atrapar el exudado no deseado en la herida.

Combinar los componentes solubles en la matriz, tales como colágenos o fibrina con CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) induce a la población celular regular positivamente la expresión de importantes proteínas secretadas tales como citocinas y metaloproteinasas de la matriz. Además, la aplicación de ABM-SC a las heridas inducidas quirúrgicamente parece facilitar el cierre de las heridas y prevenir la cicatrización de ese modo resulta en una cicatriz mínima (ver, por ejemplo, Ejemplo 7) . En modalidades de la invención, la matriz que comprende CF-SC y/o células exCF-SC se ponen en contacto con un paciente que necesita tratamiento, por ejemplo, un paciente que tiene una herida'.

Además, las propiedades inmunomodu1adoras aparentes de CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) {ver, por ejemplo, Ejemplo 5) hacen atractivas las composiciones y terapias que incorporan estas células para el tratamiento de trastornos inmunológicos y enfermedades que involucran la piel (dermatológicas) , tal como por ejemplo, pero sin limitarse a, dermatosis inflamatorias crónicas, psoriasis, liquen plano, lupus eritematoso (LE) , enfermedad de injerto contra huésped (GVHD) y erupciones por fármacos (es decir, reacciones cutáneas adversas por los fármacos) .

Las proteínas secretadas y fracciones de sobrenadante de células de medios acondicionados de CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) se pueden fabricar a partir de condiciones libres de suero, concentradas y preparadas de manera tal como para hacerlos adecuados para el usoin vivo.

Cuando se preparan de esta manera, los medios acondicionados libres de suero de ABM-SC demostraron contener numerosas citocinas pro-regenerativas , factores de crecimiento y proteasas de la matriz en concentraciones terapéuticamente eficaces (ver, por ejemplo, Tablas 1A, IB y 1C) . La mezcla compleja de cientos de factores solubles producidos por ABM-SC se pueden distinguir por SDS PAGE 2D (ver, la Figura 1) . Las proteínas individuales y otras macromoléculas se pueden extirpar de estos geles e identificar usando técnicas practicadas habitualmente en la técnica, tales como, por ejemplo, espectrometría de masas MALDI-TOF (espectrometría de ionización-desorción mediante láser asistida por matriz/ tiempo de vuelo) .

Utilizando los métodos descritos (así como otras técnicas de separación tales como cromatografía o sistemas de cultivo celular de fibra hueca) , las proteínas deseadas o fracciones de sobrenadantes de células se pueden aislar, dializar, liofilizar y almacenar como un sólido, o reconstituir en un vehículo apropiado para la administración terapéutica. En una modalidad, las proteínas o fracciones de sobrenadantes de células se pueden reconstituir en un vehículo de colágeno semi- sólido o basado en fibrina, y aplicar tópicamente al lecho de herida.

Adicionalraente a los productos generados por CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) , cualquier número y tipo de compuesto farmacéuticamente aceptable, tales como moléculas pequeñas a compuestos macromoleculares grandes (incluidos los biológicos, tales como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos) se pueden incorporar para la administración con un portador farmacéuticamente aceptable, tales como matrices biodegradables en el que están contenidas CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) , o productos generados por dichas células. Como una muestra muy pequeña, tales moléculas adicionales pueden incluir productos farmacéuticos de moléculas pequeñas tales como anti-inflamatorios , antibióticos, vitaminas, y minerales (tal como el calcio), por nombrar sólo unas pocas categorías. Del mismo modo, una muy pequeña muestra de los productos biológicos puede incluir proteínas de la matriz extracelular, proteínas de la coagulación del plasma de la sangre, anticuerpos, factores de crecimiento, quimiocinas, citocinas, lípidos (tales como cardiolipina y esfingomielina) , y ácidos nucleicos (tales como ribozimas, oligonucleótidos antisentido, o constructos de expresión de ADNc) , que incluyen variantes terapéuticamente beneficiosas y derivados de dichas moléculas tales como diversas isoformas, fragmentos, y subunidades, así como variantes de sustitución, inserción, y deleción. Estos se mencionan simplemente en forma de ejemplo, como se puede apreciar por aquellos con experiencia en la materia que, en conjunto con la enseñanzas proporcionadas en la presente descripción, cualquier número de compuestos estructurales o terapéuticamente beneficiosos adicionales se pueden incluir para la administración con un portador farmacéuticamente aceptable, tales como matrices biodegradables en el que están contenidos CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) , o productos generados por dichas células.

Una modalidad de la invención incluye un método de estimulación del cierre de la herida en un paciente diabético, tal como un pie diabético o úlcera venosa de la pierna, o una herida post-quirúrgica . La estimulación de cierre de la herida se puede promover por el tratamiento con una composición farmacéutica de CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM^SC) , o productos generados por dichas células, combinadas con componentes de la matriz extracelular de origen natural y/o proteínas del plasma sanguíneo tales como, por ejemplo, recombinante o natural purificado humano, bovino, porcino, o colágenos recombinantes , lamininas, fibrinógeno y/o trombina. La composición farmacéutica se puede administrar a un mamífero, que incluyen un ser humano, en el sitio de daño tisular. En otra modalidad, una matriz biodegradable administrada tópicamente se forma a partir de una mezcla de componentes tales como colágeno purificado natural o recombinante, fibrinógeno y/o trombina, combinado con CF-SC y exCF-SC alogénico (tales como, ABM-SC y exABM-SO .

En otra modalidad de la invención, una composición farmacéutica de células alogénicas y la matriz se cultivan in vitro durante un período prolongado de tiempo (tal como, por ejemplo, pero sin limitarse a 1 día a un mes o más tiempo) , produciendo la formación de novo del tejido conectivo. En otra modalidad de la invención, la matriz biodegradable es el colágeno bovino o ácido poliglicólico (PGA) . En otra modalidad, la composición farmacéutica se cultiva en medios celulares libres de suero en condiciones de tensión de oxígeno reducida, por ejemplo, pero sin limitarse a, la tensión de oxígeno equivalente aproximadamente a 4-5% de 02, 5% C02, y balanceado con nitrógeno.

En una modalidad, la invención incluye un método para preparar una composición farmacéutica que comprende las etapas: (a) preparar una solución que comprende colágeno soluble, medio de cultivo celular libre de suero suplementado con glutamina, bicarbonato de sodio, y HEPES (que incluyen opcionalmente suplementación con insulina, transferrina, y/o selenio) ; (b) re-suspender CF-SC o exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC o exABM-SC) en la solución; y, (c) ) transferir la suspensión celular a un molde de tejido, o equivalente de éste, para solidificar a 37°C, por ejemplo, cuando se coloca en una incubadora de cultivo celular .

El método anterior para preparar una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente la etapa de incubar el cultivo durante un período prolongado de tiempo (tal como, por ejemplo pero sin limitarse a, 1-3 días o más) en condiciones de tensión baja de oxígeno equivalente aproximadamente a 4-5% 02, 5% C02, y balanceada con nitrógeno.

En otra modalidad, la invención incluye un método para preparar una composición farmacéutica que comprende las etapas de : a) preparar una solución que comprende fibrinógeno y trombina ; b) re-suspender CF-SC o exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC o exABM-SC) en la solución y, c) administrar la solución re-suspendida a una herida abierta .

En otra modalidad, la invención incluye un método para preparar una composición farmacéutica que comprende las etapas de : a) preparar una solución que comprende colágeno soluble, medio de cultivo celular libre de suero suplementado con glutamina, bicarbonato de sodio, y HEPES (opcionalmente que incluyen la suplementación con insulina, transferrina, y/o selenio) , y b) mezclar una fracción o fracciones de sobrenadante de células derivadas de CF-SC o exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC o exABM-SC) en la solución, y, c) transferir la solución a un molde de tejido, o equivalente de éste, para solidificar a 37°C, por ejemplo, cuando se coloca en una incubadora de cultivo celular.

El método anterior para preparar una composición farmacéutica puede comprender adicionalmente la etapa de incubar el molde de tejido, o equivalente de éste, en condiciones atmosféricas de tensión de oxígeno equivalente aproximadamente a 18-21% de 02 y 5% C02.

En otra modalidad, la invención incluye un método para preparar una composición farmacéutica que comprende las etapas de : a) preparar una solución que comprende fibrinógeno y trombina; b) mezclaruna fracción o fracciones de sobrenadante de células derivadas de CF-SC o exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC o exABM-SC) en la solución, y, c) administrar la solución a una herida abierta.

En otra modalidad la presente invención incluye la regeneración de tejidos, particularmente en el tratamiento de daño tisular causado por: trastornos inmunes relacionados (tales como trastornos autoinmunes) , inflamación (que incluyen trastornos inflamatorios tanto agudos como crónicos) , isquemia (tal como, infarto de miocardio) ; lesión traumática (tales como quemaduras, laceraciones y abrasiones); infección (tales como infecciones bacterianas, virales y fúngicas) ; y, heridas cutáneas crónicas. La presente invención incluye el tratamiento de una diversidad de daños y trastornos, por ejemplo, pero sin limitarse a, daños neurológicos y trastornos del sistema nervioso central (cerebro) y sistema nervioso periférico (por ejemplo, médula espinal) (por ejemplo, tal como se puede causar por trauma neurológico y enfermedades neurodegenerativas) . Otra modalidad de la invención incluye el tratamiento de enfermedades y trastornos que requieren regeneración de hueso, tejido conectivo, y cartílago, las enfermedades inflamatorias crónicas y agudas del hígado, insuficiencia vascular, y degeneración macular y corneal. Otra modalidad de la invención incluye tratar daños y trastornos cardiovasculares y pulmonares (por ejemplo, tales como isquemia de miocardio y reparación y regeneración de los vasos sanguíneos) . Otra modalidad de la invención incluye tratar daños y trastornos del tejido pancreático y hepático, así como otras glándulas endocrinas y exocrinas. Otra modalidad de la invención incluye tratar daños y trastornos del timo, así como otras células inmunes que producen y albergan órganos. Otra modalidad de la invención incluye tratar daños y trastornos del sistema genitourinario (por ejemplo, tales como el uréter y vejiga) . Otra modalidad de la invención incluye tratar hernias y tejidos herniados. Otra modalidad de la invención incluye el tratamiento, reparación, regeneración, y reconstrucción de válvulas cardíacas.

CF-SC y exCF-SC (tales como, AB -SC y exABM-SC) o proteína y fracciones de sobrenadante de células derivadas de CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) , se puede reconstituir además en un dispositivo basado en colágeno similar a sólido. Cuando las células se reconstituyen de dicha manera, la matriz de colágeno similar a sólido se remodela durante varios días, resultando en un neotej ido que fabricó su propia matriz única. Dichos neotej idos derivados de CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) son flexibles, suturables, y bioactivos (ver por ejemplo, la Figura 38) . Estas estructuras se pueden además esterilizar, reticular químicamente, liofilizar, o más aún procesar, rindiendo las células no viables e incapaces de crecer aún más .

Dichos dispositivos pueden ser particularmente beneficiosos en el tratamiento de' quemaduras, que incluyen heridas por quemaduras de espesor completo. Para reconstruir un lecho de herida vascularizada, los pacientes con quemaduras severas frecuentemente se tratan con un reemplazo dérmico artificial después de la resección quirúrgica del tejido muerto. Después que se sanó el lecho de herida, estos pacientes se tratan posteriormente con los productos para la piel artificial o aplicaciones de las células epiteliales en un intento de volver a crecer epidermis del huésped.

Las composiciones, tales como las descritas en la presente invención, cuando se usan en lugar de unos productos dérmicos artificiales convencionales (por ejemplo, DERMAGRAFT™) , pueden aumentar la longevidad de la piel alogénica injertada posteriormente, inhibiendo o reduciendo las reacciones inmunes indeseables mediadas por las células T (ver, por ejemplo, Ejemplo 5) . Modulando las respuestas inmunes mediadas por las células T, las composiciones de la presente invención pueden permitir la reaplicación posterior de la piel artificial por unas duraciones adecuadas para estimular el nuevo crecimiento de la piel de los propios pacientes .

Las ABM-SC anteriormente mencionadas demostraron exhibir las propiedades siguientes: In vitro o Secreción de citocinas importantes en la angiogénesis y reparación tisular. o Liberación de factores de prevención e inhibición de la cicatrización y recambio de la matriz.

« Promoción de la migración de las células endoteliales indicativas de actividad pro-angiogénica .

In vivo • Mejoría significativa en los resultados en múltiples modelos animales de infarto agudo de miocardio (AMI) y accidente cerebrovascular .

• Eficaz y bien tolerada entrega intracardíaca o intracerebral de células.

• Células no detectables en los tejidos ocho semanas post- inyección.

· No hay respuesta inmune medible contra las células.

En una modalidad de la invención, un número de factores celulares pro-regenerativos secretados por CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) se pueden usar en el tratamiento, reparación, regeneración y/o rejuvenecimiento de tejidos y órganos dañados (tales como, por ejemplo, los órganos y tejidos cardiacos y neuronales dañados mediante, por ejemplo, insuficiencia cardiaca debido al infarto agudo de miocardio (A I) o accidente cerebrovascular) . Estos incluyen los factores que se pueden secretar por CF-SC tales como ABM-SC como se muestra en la Figura 11. Por ejemplo, estos factores incluyen, pero sin limitarse a, SDF-1 alfa, VEGF , ENA-78, Angiogenina, BDNF, IL-6, IL-8, ALCAM, MMP-2, Activina, MMP-1, MMP-13, MCP-1. Ver la Figura 11. Los factores adicionales, tales como aquellos enumerados en las Tablas 1A, IB y 1C, se pueden además secretar por CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) .

La secreción de factores pro-regenerativos por CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM-SC) se puede mejorar o inducir por el tratamiento previo con factores estimuladores (tales como, por ejemplo, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) ) para inducir la producción de medios de cultivo celular acondicionados o para cebar las células antes de la administración de las células a un paciente.

La isquemia aguda, trauma o inflamación conducen a una constelación de eventos celulares y químicos en los órganos y tejidos afectados. Ver por ejemplo, la Figura 12. En la fase de inflamación ocurre allí una liberación de factores y un influjo de células al sitio de la lesión. En la fase de regeneración ocurre allí un reclutamiento de células circulantes para la correcta reparación de tejido funcional. Y, en la fase de fibrosis, ocurre allí una deposición de cicatrices fibróticas que potencialmente comprometen la función del órgano. Además, una variedad de citocinas y otras moléculas biológicas desempeñan una diversidad de funciones en cada uno de estos procesos. Ver por ejemplo, la Figura 12.

El uso de CF-SC y exCF-SC (tales como, ABM-SC y exABM- SC) en la presente invención incluye métodos para tratar y prevenir la inflamación, métodos para estimular órgano y regeneración de tejido, mientras que reduce la fibrosis (es decir, cicatrices en los tejidos), y métodos de estimulación de la angiogénesis a través de composiciones (por ejemplo, citocinas, proteasas, proteínas de la matriz extracelular, etc. ) producidas por CF-SC y exCF-SC estimuladas o no estimuladas (tales como, ABM-SC y exABM-SC) .

En otra modalidad, CF-SC y exCF-SC pueden inhibir el proceso biológico de la fibrosis. La fibrosis es un subproducto natural de la cicatrización de heridas, cicatrización e inflamación en muchos tejidos humanos. La fibrosis, además conocido como cicatrización fibrótica, es un obstáculo importante para regenerar tejido con función óptima, especialmente en el corazón y sistema nervioso central (CNS) , porque el tejido de la cicatriz desplaza células necesarias para la función óptima del órgano. El tratamiento con las células descritas en la presente invención ayuda a prevenir o reducir la fibrosis y de ese modo, facilita la curación del tejido dañado. La fibrosis se puede prevenir por efectos aditivos o sinérgicos de dos o más proteínas secretadas o composiciones celulares producidas, que incluyen moléculas de la superficie celular unidas a membrana. Además, las proteasas de matriz inducidas o producidas por las CF-SC y exCF-SC administradas (tales como ABM-SC y exABM-SC) pueden jugar una parte importante en la prevención de la fibrosis.

En otro uso ilustrativo de la presente invención, la angiogénesis , además conocida como neovascularización, se aumenta en un tejido deseado. La angiogénesis, o la formación de nuevos vasos sanguíneos, es un componente clave de la medicina regenerativa, porque el tejido recién formado debe tener una suministro de sangre, y la angiogénesis es crucial si las células endoteliales se pierden durante los procesos degenerativos, progresión de la enfermedad, o lesiones agudas para las que la presente invención es un tratamiento. Por tanto, el uso de CF-SC y exCF-SC (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) o composiciones producidas por dichas células son útiles en la estimulación de la angiogénesis en los tejidos objetivos y los órganos (especialmente, por ejemplo, en el tejido cardíaco dañado) . La angiogénesis es un componente importante de la reparación de tejidos y puede operar junto con la inhibición de la fibrosis para optimizar la curación de los tejidos dañados.

Otro uso ejemplar de la presente invención involucra la estimulación de los procesos de regeneración o rejuvenecimiento sin el injerto de las células administradas. Estudiosin vivo demostraron que el injerto de células a largo plazo o diferenciación específica a tejido de ABM-SC o exABM-SC humanas generalmente no se ve, lo que sugiere que el mecanismo por el cual estas células incitan la regeneración de tejidos no es a través del reemplazo de células, sino a través de una respuesta del huésped a las células en sí y/o factores que ellas producen. Esto no es sorprendente, sin embargo, dado que el papel de ABM-SC en la médula ósea es proporcionar soporte estructural y trófico. Por tanto, la presente invención incluye el tratamiento de tejidos y órganos dañados en donde las CF-SC y exCF-SC administradas (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) no exhiben injerto de órgano o tejido a largo plazo o permanente. En su lugar, las CF-SC y exCF-SC terapéuticas (por ejemplo, ABM-SC y exABM-SC) proporcionan factores de soporte tróficos, suprimen la muerte celular, inhiben la fibrosis, inhiben la inflamación (por ejemplo, respuestas inflamatorias de las células inmunes) , promueven la remodelación de la matriz extracelular, y/o estimulan la angiogénesis sin convertirse en parte del tejido reparado a un nivel significativo o detectable actualmente.

Un ejemplo adicional de la presente invención enseña que después de un período de tiempo, las células administradas no se detectan en cualquier parte del animal experimental, lo que sugiere que las células administradas se eliminan completamente del cuerpo. Esto sugiere que los factores secretados juegan un papel esencial en la reparación de tej ido dañado .

En aún otro ejemplo de la presente invención que ilustra su utilidad, las hABM-SCs descritas en la presente invención proceden de una fuente donadora. Como tal, estas células serán los trasplantes de células alogénicas en los pacientes que pueden sugerir que estas células trasplantadas puedan estimular una respuesta inmune adversa. Sin embargo, sorprendentemente, las células alogénicas trasplantadas descritas en la presente invención actualmente pueden suprimir la proliferación de células T inducidas por mitógeno in vitro y evitar la inducción de una respuesta inmune dependiente de células T in vivo. Una respuesta inmune mediada por células T es un factor clave en los procesos inmunes que son perjudiciales para la cicatrización, y los procesos regenerativos y de rejuvenecimiento.

Como se utiliza en la presente, "una cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para producir una mejoría detectable en el tejido, órgano o sistema biológico (por ejemplo, sistema inmune) desempeño, función, integridad, estructura o composición en donde dicha mejoría es indicativa de la mejora completa o parcial, restauración, reparación, regeneración o curación del tejido, órgano o sistema biológico dañado.

Las Tablas 1A, IB y 1C muestran una lista extensa de citocinas, factores de crecimiento, receptores solubles, y proteasas de la matriz secretadas por ABM-SC humana cuándo se sub-cultivan en medios de cultivo celular libres de suero. Concentrado #1 de sobrenadante de medios= DMEM Avanzado (Gibco™) suplementado con 4mM de L-glutamina. Concentrado #2 de sobrenadante de medios= RPMI-1640 que contiene 4mM de L-glutamina y HEPES (HyClone) suplementado con Insulina-Transferrina-Selenio-A (Gibco™) .

Los resultados demuestran que numerosos factores tróficos y receptores solubles importantes para la regeneración de tejido y modulación del sistema inmune se producen por ABM-SC en niveles terapéuticamente relevantes cuando se cultivan en estas condiciones. En particular, los experimentos anteriores demostraron que la suplementacion del medio de cultivo base con insulina, transferrina y selenio se necesitó para lograr niveles de proteína secretada, tal como los indicados en las Tablas 1A, IB y 1C.

Dispositivos Bioactivos Viviente y No Viviente Las modalidades de la invención incluyen la generación de soportes sembrados con CF-SC y/o exCF-SC que crean constructos similares a tejidos capaces de producir factores solubles y deposición de la matriz en los constructos para mejorar la cicatrización de la herida. Las propiedades del soporte, siembra de células, y condiciones de cultivo se evaluarán y optimizaran para producir constructos de ingeniería de tejido útiles en ayudar a la reparación y regeneración de tejidos tales como piel, hueso, nervio y músculo. Estos constructos de ingeniería de tejidos se pueden usar como productos para la entrega de factores terapéuticamente relevantes a los tejidos lesionados/dañados in vivo.

Específicamente, CF-SC y/o exCF-SC humanas o no humanas se pueden embeber en soportes de hidrogel de colágeno para la creación de constructos de ingeniaría de tejido. Los constructos de gel de colágeno sembrados con células se pueden mantener en cultivo in vitro para modular o estimular las células para secretar y producir factores relevantes en los constructos. Las condiciones de cultivo/parámetros se pueden variar posiblemente con estimulación química, mecánica, o eléctrica (por ejemplo, tensión baja de oxígeno, adición de factor de crecimiento, o agitación del frasco de cultivo) . El colágeno derivado de humano, porcino o bovino, por ejemplo, pero sin limitarse a, puede ser útil en la generación de estos productos. Estos constructos se pueden desarrollar además con la combinación o reemplazo de colágeno con otras matrices de origen natural que incluyen fibrina, ácido hialurónico, heparina, alginato, gelatina, quitosano, laminina o fibronectina .

Los constructos de ingeniería de tejido se pueden además generar a partir de soportes de polímeros sintéticos sembrados con CF-SC humana o no humana y/o exCF-SC. Específicamente, la FDA aprobó materiales tales como co-polímeros de ácido poli láctico-co-glicólico que se utilizarán debido a su buena biocompatibilidad y biodegradación. Estos co-polímeros se pueden producir en formaciones de soportes múltiples con propiedades específicas. Las velocidades de degradación se pueden adaptar variando las relaciones de co-polímeros de ácido láctico a ácido glicólico. Las preparaciones específicas de estos polímeros útiles como un constructo de ingeniería de tejido incluyen, pero sin limitarse a, mallas porosas no estructuradas. Los soportes de polímero sembrados con CF-SC y/o exCF-SC se pueden mantener en cultivo de manera similar a los constructos de colágeno y se optimizan usando las mismas manipulaciones como se describió anteriormente. Además, estos constructos se pueden generar con la adición o incorporación de matrices de origen natural en el soporte de polímero. Otros polímeros sintéticos útiles como soportes para constructos de ingeniería de tejidos con CF-SC y/o exCF-SC humano o no humano incluyen silicona no degradable, poli-tetrafluoroetileno, poli-dimetilsiloxano, polisulfonas y polietilenglicol degradable, policaprolactona y otros poliésteres o poliuretanos .

Los soportes sembrados con CF-SC y/o exCF-SC humana o no humana se pueden cultivar para formar neotejidos in vitro Estos constructos se pueden usar como constructos vivientes para la aplicación directa o crioconservación y posterior entrega a un sujeto humano o no humano, o se puede manipular aún más y transformar en constructos no vivientes para almacenar y más tarde aplicar al paciente. Los constructos vivientes pueden incluir suspensiones de células en matrices líquidas o semi- sólidas para inyección, células sembradas en matriz particulada para inyección, y células sembradas en constructos sólidos para la implantación. Estos constructos se pueden criopreservar desde el momento de la producción hasta la aplicación al sujeto para mantener los constructos con las células viables y las proteínas intactas. Además, estas mismas formulaciones se pueden procesar mas aún para producir constructos presentados no vivientes dejando los constructos con las células no viables, pero aún conservando los factores terapéuticamente relevantes y la matriz producida por las células en el constructo. Los métodos para producir constructos no viviente incluyen modificaciones químicas tales como irradiación, reticulación de proteína, aditivos para la estabilización de proteína, descelularización o manipulaciones de la temperatura tales como congelación, secado deshidrotérmico, y liofilización. Los tratamientos químicos de reticulación específica incluyen glutaraldehído, carbodiimidas (EDC) , compuestos poliepóxidos , diisocianatos , divinil sulfona, y genipina o ribosa de origen natural. Los métodos de esterilización pueden ser además manipulaciones usadas en los constructos de ingeniería de tejido para rendir no viviente o para la esterilización terminal; los métodos incluyen irradiación, haz de electrones, o tratamientos de plasma con gas. Los constructos no vivientes se pueden preservar y almacenar a temperatura ambiente .

Las modalidades de la invención incluyen dispositivos bioactivos (es decir, composiciones, artículos, objetos, fabricaciones, conjuntos, colecciones, productos, etc.) en donde los dispositivos son "vivientes" ("vivo"), "no vivientes", o una combinación de tantolabricaciones vivientes como no vivientes compuestas de CF-SC y exCF-SC vivas, CF-SC y exCF-SC no viviente, o una mezcla de CF-SC y exCF-SC tanto vivo como no viviente en cualquier combinación. Las modalidades de la invención incluyen además dichos dispositivos vivientes y no vivientes en donde los dispositivos se comprenden ya sea parcialmente o totalmente de los componentes derivados (con o sin purificación adicional, aislamiento y/o etapas de separación) de CF-SC y exCF-SC viviente y/o no viviente. Como se define en la presente descripción, los dispositivos "no vivientes" son: (a) dispositivos que contienen CF-SC y/o exCF-SC no vivientes; (b) dispositivos que contienen CF-SC y/o exCF-SC que se sometieron a una condición de tratamiento de la afección destinada a matarlos (por ejemplo, irradiación, congelación, congelación-descongelación, desecación con aire seco, reticulación química, calentamiento, liofilización) en donde dicho tratamiento puede o no puede ser eficaz al 100% (es decir, alguna fracción de CF-SC y/o exCF-SC permanece viviente ) , y, (c) dispositivos que contienen uno o más componentes derivados a partir de CF-SC y/o exCF SC viviente y no viviente (por ejemplo, separados, aislados o purificados) . Como se define en la presente descripción, un dispositivo "viviente" es un dispositivo que contiene CF-SC y/o ex.CF-SC vivas en donde dicho dispositivo se sometió a condiciones de tratamiento destinados a mantener en el mismo la viabilidad de CF-SC y/o exCF-SC. Un dispositivo "viviente" como se define en la presente descripción puede comprender, en parte, alguna porción de CF-SC y/o exCF SC no viviente (es decir, CF-SC y/o exCF-SC que están muertos) .

En una modalidad de la invención un dispositivo viviente comprende casi 100% de CF-SC y/o exCF-SC viviente. En otras modalidades de la invención, un dispositivo viviente comprende aproximadamente: 25% o más, 50% o más, 60 % o más, 70% o más, 75% o más, 80% o más, 85% o más, 90% o más, 95% o más, 98% o más, y 99% o más CF-SC y/o exCF-SC viviente.

En una modalidad de la invención un dispositivo no viviente puede comprender 100% o casi 100% de CF-SC y/o exCF-SC no viviente (es decir, muertas) . En otras modalidades de la invención, un dispositivo no viviente puede comprender aproximadamente: 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, 2% o menos, y 1% o menos de CF-SC y/o exCF-SC no viviente.

Las modalidades de la invención incluyen además dispositivos bioactivos que son rentables y fáciles de ensamblar (por aquellos con experiencia en la materia) con la adquisición de las partes componentes necesarias.

Las modalidades de la invención incluyen la producción y uso de dispositivos bioactivos de constructos de tejidos similar al dérmico compuestos de: (1) un soporte biodegradable (por ejemplo, un soporte compuesto de ácido poliglicólico (PGA) ) , y, (2) CF-SC y/o exCF-SC viviente, no viviente, o una mezcla de viviente y no viviente, o compuestos de uno o más componentes derivados a partir de CF-SC y/o exCF-SC (viviente o no viviente) .

Las modalidades de la invención incluyen dispositivos bioactivos que se seleccionaron, manipularon, o modificaron para lograr una velocidad deseada de biodegradacion. Las modalidades de la invención incluyen la biodegradacion de los soportes o constructos de bio- ingeniería en donde aproximadamente 100%, 98%, 95%, 90%, 85%, 80% o 50% del volumen o masa original del soporte o constructo de bio-ingeniería se eliminó, absorbió, deterioró, o de cualquier otra forma desmontó en 6 meses o menos, '3 meses o menos, 1 mes o menos, 3 semanas o menos, 2 semanas o menos, 1 semana o menos, 5 días o menos, 3 días o menos, 48 horas o menos, 24 horas o menos, 12 horas o menos.

Las modalidades adicionales de la invención incluyen los métodos para probar y evaluar diferentes materiales para biocompatibilidad y bioactividad cuando se usan junto con CF-SC y/o exCF-SC y componentes derivados de CF-SC y/o exCF-SC. Los métodos para probar la biocompatibilidad incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, probar la viabilidad celular, crecimiento celular y/o proliferación, metabolismo, supervivencia y actividad apoptótica. Los ejemplos de métodos y técnicas que se pueden usar para dichas evaluaciones incluyen, pero sin limitarse a, ensayos Calceína/EthD-1, ensayos CELL TITER GLO™, ensayos glucosa/lactato, evaluaciones histológicas. Los métodos para probar la bioactividad incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, pruebas para la secreción de factores tróficos y recambio de la matriz. Los ejemplos de métodos y técnicas que se pueden usar para dichas evaluaciones incluyen, pero sin limitarse a, los ELISA, medición del contenido de matriz, inmunotinción, y las evaluaciones histológicas.

Las modalidades de la invención incluyen la alteración de la densidad de siembra celular y condiciones de cultivo celular para generar dispositivos que contengan niveles terapéuticos deseados de factores endógenos y secretados. Los ensayos usados para evaluar dichos dispositivos incluyen, pero sin limitarse a, por ejemplo, inspección visual/manipulación, recuento de células y viabilidad, evaluaciones histológicas, factor trófico y mediciones de producción de la matriz (por ejemplo, usando los ELISA o estuches de matriz) , y comportamiento funcional {por ejemplo, contracción de gel, ensayos de co-cultivo celular) .

La invención proporciona además los métodos para preparar dispositivos bioactivos basados en colágeno. La Figura 40 es un diagrama de flujo que ilustra una modalidad de un proceso para preparar dispositivos bioactivos basados en colágeno. En la etapa 1, las células se preparan por métodos de la invención; en la etapa 2, las células se combinan con colágeno como se describe en la presente invención; en la etapa 3, las células se cultivan con colágeno como se describe en la presente invención y en la etapa 4 se procesan los constructos. Por ejemplo, en modalidades, las células de la invención se encapsulan en una biomatriz, por ejemplo, colágeno, solución de gel. Una vez que la solución de gel se solidifica, en modalidades el constructo se cultiva en condiciones de bajo oxígeno. Al final del período de cultivo, en modalidades, los constructos se procesan por reticulación, con, por ejemplo, glutaraldehído, seguido por lavado con, por ejemplo, glicina. En modalidades, los constructos se deshidratan, rindiendo las células inactivas, mientras que preservan los factores bioactivos secretados por las células. Los constructos se pueden usar como neotejido y/o un implante quirúrgico ya sea en el estado deshidratado, o después de la rehidratación. La deshidratación incluye deshidratación completa, es decir, que todo el líquido se evapora de los constructos en condiciones ambientales, pero no necesariamente incluye la deshidratación a un nivel de humedad específico más abajo de la humedad ambiental Un ejemplo de las modalidades de la invención. incluyen, pero sin limitarse a, combinar CF-SC y/o exCF-SC con colágeno (por ejemplo, colágeno de rata o porcino) a concentraciones finales aproximadamente de 2xl06 células/ml, aproximadamente 5xl06 células/ml o aproximadamente 6xl06 células/ml con aproximadamente 3 mg/ml, aproximadamente 4 mg/ml o aproximadamente de colágeno. Ver la Figura 27. La Figura 27 muestra los resultados con exCF-SC humanas sembradas a densidades diversas en los geles de colágeno porcino de grado médico (por ejemplo, THERACOL™; SEWONCELLONTECH, Seúl, Corea) ya sea en concentraciones de 3mg/ml ó 4mg/ml y cultivadas suspendidas en medios (n = 3 para cada condición en cada intervalo de tiempo) . Los diámetros de los constructos de gel se midieron a las 24, 48, y 72 horas. El porcentaje de contracción del área de superficie se calculó comparando los diámetros de dimensión inicial de x y y con los diámetros contraídos de cada intervalo de tiempo. Un gel de control que contiene células inactivadas con calor mostró poca contracción. En contraste, existió una respuesta a la dosis de contracción de gel de colágeno con la densidad celular creciente y además con la concentración de gel de colágeno creciente .

Las modalidades de la invención comprenden además la combinación de CF-SC y/o exCF-SC con colágeno (u otra matriz biocompatible) a concentraciones finales con intervalo de aproximadamente lxlO3 células/ml aproximadamente a lxlO7 células/ml. Por ejemplo, las modalidades de la invención pueden comprender colágeno (u otra matriz biocompatible) con células a una concentración final aproximadamente de: 1x10 3 células/ml o mayor, lxlO4 células/ml o mayor, lxlO5 células/ml o mayor, lxlO6 células/ml o mayor, lxlO7 células/ml o mayor, 2xl03 células/ml o mayor, 2xl04 células/ml o mayor, 2xl05 células/ml o mayor, 2xl06 células/ml o mayor, 3xl03 células/ml o mayor, 3xl04 células/ml o mayor, 3xl05 células/ml o mayor, 3xl06 células/ml o mayor, 4xl03 células/ml o mayor, 4xl04 células/ml o mayor, 4xl05 células/ml o mayor, 4xl06 células/ml o mayor, 5xl03 células/ml o mayor, 5xl04 células/ml o mayor, 5xl05 células/ml o mayor, 5xl06 células/ml o mayor, 6xl03 células/ml o mayor, 6xl04 células/ml o mayor, 6xl05 células/ml o mayor, 6xl06 células/ml o mayor, 7xl03 células/ml o mayor, 7xl04 células/ml o mayor, 7xl05 células/ml o mayor, 7xl06 células/ml o mayor, 8xl03 células/ml o mayor, 8xl04 células/ml o mayor, 8xl05 células/ml o mayor, 8xl06 células/ml o mayor, 9xl03 células/ml o mayor, 9xl04 células/ml o mayor, 9xl05 células/ml o mayor, 9xl06 célülas/ml o mayor.

Las modalidades de la invención pueden además comprender CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) en cualquier concentración final combinado con colágeno (u otra matriz biocompatxble) en concentraciones con intervalo aproximadamente de 0.1 mg/ml aproximadamente a 50 mg/ml. Por ejemplo, las modalidades de la invención pueden comprender CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) con colágeno (u otra matriz biocompatible) a una concentración aproximadamente de : 0.1 mg/ml o mayor, 0.5 mg/ml o mayor, 1 mg/ml o mayor, 2 mg/ml o mayor, 3 mg/ml o mayor, 4 mg/ml o mayor, 5 mg/ml o mayor, 6 mg/ml o mayor, 7 mg/ml o mayor, 8 mg/ml o mayor, 9 mg/ml o mayor, 10 mg/ml o mayor, 12 mg/ml o mayor, 15 mg/ml o mayor, 20 mg/ml o mayor, 25 mg/ml o mayor, 30 mg/ml o mayor, 40 mg/ml o mayor, 50 mg/ml o mayor.

Las modalidades de la invención incluyen la combinación de CF-SC y/o exCF-SC con una matriz biocompatible (por ejemplo, pero sin limitarse a colágeno) en una concentración de colágeno final combinada, concentración de células, y duración, optimizada para proporcionar un nivel deseado de producción/concentración del factor trófico (por ejemplo, pero sin limitarse a VEGF) . Ver por ejemplo, la Figura 28.

La Figura 28 representa los resultados obtenidos con exCF-SC humanas sembradas a densidades diversas de 2e6, 5e6, o 6e6 células/ml en 4mg/ml de neotejido de gel de colágeno porcino de grado médico y se cultiva suspendido en los medios ya sea durante 1, 3, o 6 días (n = 3 para cada condición en cada intervalo de tiempo) . Los constructos se rellenaron con medio fresco cada dos días o donde se indicó no se rellenaron durante los cultivos de 6 días. En cada intervalo de tiempo, los geles se lavaron 3 veces en solución salina equilibrada y se congelaron rápidamente. Los lisados se prepararon de cada gel por disociación mecánica en tampón de extracción de proteínas. Se usó ELISA en lisados de gel para cuantificar la cantidad (en ng) de VEGF contenidos en los constructos de gel de colágeno con hABM-SC (el error de la barras representan la desviación estándar de 3 geles separados) . Los controles incluyen gel solo sin cultivar, gel sembrado con 2e6 células/ml sin cultivar, y cultivos de 6 días de gel sembrado con 5e6/ml células inactivadas con calor. Los resultados indican un aumento del VEGF contenido en los geles con densidades de células crecientes. Un tiempo de cultivo de 3 días indica VEGF máxima en los geles de colágeno sembrado con hABM-SC.

Como modalidades ilustrativas de la invención, pero sin limitarse a, CF-SC y/o exCF-SC se pueden combinar en cualquier concentración celular descrita en la presente invención, con colágeno en cualquier concentración descrita en la presente invención, por una duración en un intervalo aproximadamente de 1 aproximadamente a 30 días. Por ejemplo, la duración antes mencionada puede ser, sin limitarse a, aproximadamente: 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 6 días, 7 días, 8 días, 9 días, 10 días, 11 días, 12 días, 13 días, 14 días, 15 días, 20 días, 25 días, y 30 días.

En modalidades de la invención, el neote ido de gel, o constructo de gel comprende un volumen total de gel de 1 mi a 20 mi, 2 mi a 10 mi, 3 mi a 8 mi a 5 mi a 7 mi . En las modalidades, el volumen total de gel es al menos 1 mi, al menos 2 mi , al menos 3 mi, al menos 4 mi, al menos 5 mi, al menos 6 mi, al menos 7 mi, al menos 8 mi, al menos 9 mi, al menos 10 mi, al menos 11 mi, al menos 12 mi, al menos 13 mi, al menos 14 mi, al menos 15 mi, al menos 16 mi, al menos 17 mi, al menos 18 mi, al menos 19 mi, y al menos 20 mi.

Las modalidades de la invención incluyen, pero sin limitarse a matrices y soportes biocompatibles tal como un soporte SCAFTEX™ PLGA (BMS, BioMedical Structures, LLC, RI, Estados Unidos) .

Las modalidades de la invención incluyen, pero sin limitarse a, CF-SC y/o exCF-SC cultivadas en matrices biocompatibles y soportes con medio que contiene suero, con medio que contiene factores de crecimiento y/o supervivencia suplementarios, con medio que es libre de proteína (es decir, medio químicamente definido) , o con medio que es libre de suero (por ejemplo, medio que contiene suplementos de proteína pero no suplementos de suero) .

Algunos ejemplos, sin limitarse a, productos de soportes comercialmente disponibles incluyen: • BIOBRANE™ (Bertek Pharmaceuticals Inc.), • PERMACOL™ (Tissue Science Laboratories, Inc.), • STRATTICE™ (LifeCell Corp.), • E-Z-DERM™ (Brennen Medical, Inc.), · MATRISTEM™ (Medline Industries, Inc.), • INTEGRA™ e INTEGRA™ Matriz autodispersable de la herida (Integra LifeSciences Corp.), • PRIMATRIX™ (TEI Biosciences) , • TISSUEMEND™ (TEI Biosciences) , · ALLODERM™ (LifeCell Corp.), • CYMETRA™ (LifeCell Corp.), • NEOFORM™ (Mentor Corp.) , o DermaMatrix (Musculoskeletal Transplant Foundation (MTF™) ) , o GRAFTJACKET™ y GRAFTJACKETXPRESS™ (LifeCell Corporation and Wright Medical Group) , » GAMMAGRAFT™ (Promethean LifeSciences , Inc.), • ORTHADAPT™ Bioimplant (Pegasus Biologics, Inc.), Algunos ejemplos, sin limitarse a, productos de soportes comercialmente disponibles que contienen células vivientes o no vivientes incluyen: • CELADERM™ (Advanced BioHealing, Inc.), • LASERSKIN™ (Fidia Advanced Biopolymers S.R.L., Italia) , • PERMADERM™ (Cambrex Corp.), • APLIGRAF™ (Organogénesis, Inc.), • ORCEL™ (Ortec International Inc., Israel), • DERMAGRAFT™ (Advanced Biohealing Inc.), y • TRA SCYTE™ (Advanced Biohealing Inc.).

Algunos ejemplos, sin limitarse a, métodos que se pueden usar para generar dispositivos bioactivos no vivientes incluyen células o dispositivos que se someten a tratamientos tales como: tratamientos de reticulación (por ejemplo, usando agentes como glutaraldehído, carbodiimidas, compuestos de poliepóxido, y divinilsulfona) ,· liofilización (que pueden permitir además el almacenamiento de los dispositivos a temperatura ambiente y funcionar para preservar el contenido de proteínas) ; células y o dispositivos que se someten a uno o más ciclos de descongelación/congelación (por ejemplo, tal como se usa actualmente para DERMAGRAFT™) ; y, descelularización (que también puede ayudar a disminuir la inmunogenicidad potencial que se puede causar por los péptidos inmunogénicos generados cuando las células y/o dispositivos se someten a congelación) . En modalidades de la invención, al menos un agente de reticulación, tal como glutaraldehído, está presente en la reacción de reticulación a una concentración de 0.0009 % a 0.09%, 0.001% a 0.08%, 0.005% a 0.05% y .008% a .08%. En modalidades, el agente de reticulación está presente en la reacción de reticulación a 0.01%, 0.05% o 0.005%.

La invención proporciona un dispositivo para la implantación en un animal, que comprende CF-SC y/o exCF-SC y matriz biocompatible y/o biodegradable (por ejemplo, pero sin limitarse a colágeno) en una concentración de colágeno final combinada, concentración de células, y duración, optimizada para proporcionar un nivel deseado de producción/concentración de factor trófico (por ejemplo, pero sin limitarse a VEGF) . Dicho dispositivo se puede implantar por ejemplo durante la cirugía. En modalidades, el dispositivo tiene propiedades físicas adecuadas, tales como ser flexible y duradero, tanto en el estado deshidratado como estado hidratado. En modalidades ilustrativas, los dispositivos son circulares o aproximadamente circulares y tienen un diámetro de al menos 23 mm, al menos 24 mm, al menos 26 mm, al menos 27 mm, al menos 28 mm, al menos 29 mm, al menos 30 mm y al menos 35 mm. En modalidades, los dispositivos pesan al menos 60 mg, al menos 65 mg, al menos 70 mg, al menos 80 mg, al menos 90 mg, al menos 100 mg, al menos 110 mg, al menos 115 mg, al menos 120 mg y al menos 130 mg .

En modalidades, los dispositivos de la invención se usan en la prevención o reparación de lesiones ortopédicas en animales, que incluyen los seres humanos. En modalidades, las lesiones ortopédicas incluyen, pero no sin limitarse a, lesiones que están en el cuello, brazo, espalda, codo, mano, pie, rodilla, muñeca, cadera y tobillo. Por ejemplo, las lesiones del tendón en animales, que incluyen seres humanos, se pueden ayudar por la fijación del dispositivo a la zona que necesita reparación. En modalidades, los dispositivos de la invención son aproximadamente rectangulares. Por ejemplo, las piezas circulares se pueden cortar en tiras para la fijación a una parte del cuerpo. En modalidades, el tendón especificado para la reparación está en la mano de un ser humano. En modalidades, el dispositivo se implanta quirúrgicamente en el cuerpo del animal lesionado, por ejemplo, ser humano. Por ejemplo, el dispositivo de la invención se puede usar como una alternativa a una reparación epi- tendinosa, en la que parece enrollarse eficazmente alrededor del tendón y proporcionar una superficie lisa de deslizamiento . Las reparaciones epi- tendinosas históricamente adicionan 20% de fuerza a la reparación, tal que los dispositivos bioactivos de la invención pueden excluir el uso de esta puntada. Si, factores adicionales se incrustan en el dispositivo, se puede obtener tanto resistencia del tendón flexor mejorada como formación de adherencias disminuidas En modalidades, los dispositivos de la invención incrustados con, por ejemplo, condrocitos, se usan como un espaciador en la cirugía de la artritis del pulgar (Artroplastia CMC) . Existen actualmente dos injertos principales que se usan para la cirugía de la articulación CMC que están aprobados por la FDA y no contienen un componente bioactivo consistente de células formadoras de cartílago.

Ejemplos de Bioensayos Una variedad de bioensayos que están disponibles se pueden usar para optimizar más aún la bioactividad y para estudiar e identificar más aún el modo de acción por el que se desempeñan las células, componentes celulares y dispositivos bioactivos de la invención. Algunos ejemplos, sin limitarse a, de dichos ensayos pueden incluir ensayos de la hendidura, evaluación de bioactividad usando constructos tridimensionales de piel como sistemas modelos in vitro (tales como aquellos descritos en Am. J. Pathol., 156(1) :193-200 (2000) y referencias citadas en la misma) , evaluaciones de la activación de macrófagos, y evaluaciones del efecto de factores suplementarios sobre los perfiles de secreción cualitativos y cuantitativos de los factores producidos por las células y dispositivos bioactivos de la invención.

El ensayo de la hendidura es un método sencillo, de bajo costo y bien conocido para medir la migración de la célula in vitro. El ensayo se realiza rayando una monocapa de cultivo celular para crear un hueco carente de células adherentes . Las imágenes del hueco pueden capturarse al inicio y en intervalos regulares durante la migración celular según se cierra el hueco (es decir, la hendidura) por la migración de las células y/o el cultivo a través del hueco. Una comparación de imágenes se realizó después para cuantificar la velocidad de migración de las células usando al menos un método de tratamiento experimental en comparación con un tratamiento control. Ver la Figura 29.

La Figura 29 representa los resultados que demuestran que hABM-SC produce factores que aumentan la velocidad y la magnitud del cierre en unos ensayos in vi rode cierre de la herida. Particularmente, los queratinocitos humanos normales (NHEK) se crecieron hasta una monocapa confluente antes que se rayó con una punta de pipeta para crear una herida por hendidura a través de la monocapa. Las fotografías se tomaron inmediatamente después que se hizo la hendidura a intervalos de 4 y 6 horas e incubaron con medios control o acondicionados . El grado del cierre de la herida se determinó comparando las fotografías de 4 y 6 horas con las imágenes iniciales usando el programa de análisis de imagen (CMA, Muscale LLC) para calcular el área de la hendidura. El grado de cierre se representa en esta figura como el porcentaje de la hendidura inicial. El medio acondicionado con factores secretados por células exCF-SC humana (Medio acondicionado Completo) aumentó el porcentaje de cierre en comparación con el medio control (Medio completo) no expuesto a las células hABM-SC. En los intervalos de tiempo tanto de 4 como 6 horas, el área de la hendidura que permanece en los pocilios tratados con medio acondicionado por células hABM-SC humanas exCF-SC se redujo significativamente en comparación con aquellos tratados con medio control (p< 0.001 y p< 0.01 respectivamente) , demostrando tanto una mayor velocidad de cierre como magnitud de cierre.

Los constructos de piel tridimensionales (tales como aquellos descritos en Am. J. Pathol., 156 (1) : 193-200 (2000) y las referencias citadas en el mismo) se pueden usar, por ejemplo, para analizar y optimizar el efecto de los dispositivos bioactivos de la invención sobre el crecimiento de la piel, desarrollo, modelado, re-modelado, y reparación de la herida.

La evaluación del efecto de los factores suplementarios sobre los perfiles de secreción de proteínas cualitativos y cuantitativos y otros compuestos producidos por las células y dispositivos bioactivos de la invención se puede realizar usando una variedad de factores suplementarios. Como tres ejemplos, pero sin, limitarse a, dichas evaluaciones, las Figuras 30, 31, y 32 muestran el efecto de IL-1 alfa (IL-la) , TNF-alfa (TNFa) , e interferón-gamma (IFNg) en el perfil de secreción de factores producidos por las células derivadas de la médula ósea expuestas o no expuestas a tratamientos exógenos con estas moléculas.

La Figura 30 representa los resultados de una determinación cuantitativa de los factores secretados en medio acondicionado usando matrices de vidrio para anticuerpo QUANTIBODY™ de Ray Biotech Inc. (Norcross, GA, Estados Unidos) después que las exCF-SC humanas se expusieron a IL-1 alfa (IL-la) (10ng/ml) durante 24 horas. Los cálculos de la cantidad de proteína detectada por cada anticuerpo se determinaron usando una curva estándar de cinco puntos usando el programa Analizador Q de Ray Biotech Inc.. Cada anticuerpo, junto con un control positivo y negativo, se ordenó en cuadruplicado. Los valores atípicos se eliminaron automáticamente de los datos en bruto a través del programa Analizador Q y los valores medios se determinaron para calcular la cantidad de proteína. Cada barra representa la media de tres réplicas biológicas ± la desviación estándar. Ocho factores se detectaron sólo después de la estimulación con IL-la (es decir, GM-CSF, GDNF, CXCL-16, MMP-3, ENA-78, GCP-2, RANTES, MIP-3a) , mientras que los factores adicionales se indujeron por tratamiento con IL-la al menos dos veces por encima de los niveles básales (por ejemplo, GDF-15, IL-8, GRO, MCP-1) . Debido a que IL-1 alfa está presente en las afecciones inflamatorias, la regulación positiva de estos factores por exCF-SC humanas es importante para la supresión de la inflamación, angiogénesis, regeneración de tejidos, y reclutamiento de efectores inmunes.

La Figura 31 representa los resultados de una determinación cuantitativa de los factores secretados en medios acondicionados usando matrices de vidrio para anticuerpo QUANTIBODY™ de Ray Biotech Inc. (Norcross, GA, Estados Unidos) después que exCF-SC humanas se expusieron a factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) (10ng/ml) durante 24 horas . Los cálculos de la cantidad de proteína detectada por cada anticuerpo se determinaron usando una curva estándar de cinco puntos usando el programa Analizador Q de Ray Biotech Inc. Cada anticuerpo, junto con un control positivo y negativo, se ordenó en cuadruplicado. Los valores atípicos se eliminaron automáticamente de los datos en bruto a través del programa Analizador Q y los valores medios se determinaron para calcular la cantidad de proteína. Cada barra representa la media de tres réplicas biológicas ± la desviación estándar. Cinco factores se detectaron sólo en la estimulación con TNFa (es decir, CXCL-16, ENA-78, ICAM-1, MIP-3a, RANTES) mientras que unos cinco factores adicionales se indujeron por tratamiento con TNFa al menos dos veces por encima de los niveles básales (es decir, GDF-15, PIGF, IL-8, GRO, MCP-1) . Debido a que TNFa está presente en las afecciones inflamatorias, la regulación positiva de estos factores por las hABMSC es importante para la supresión de la inflamación, angiogénesis , regeneración de tejidos, y reclutamiento de efectores inmunes.

La Figura 32 representa los resultados de una determinación cuantitativa de los factores secretados en los medios acondicionados usando matrices de vidrio para anticuerpo QUANTIBODY™ de Ray Biotech Inc. (Norcross, GA, Estados Unidos) después que exCF-SC humanas se expusieron a interferón gamma (IFNg) (10ng/ml) durante 24 horas. Los cálculos de la cantidad de proteína el programa Analizador Q de Ray Biotech Inc. Cada anticuerpo, junto con un control positivo y negativo, se ordenó en cuadruplicado. Los valores atípicos se eliminaron automáticamente de los datos en bruto a través del programa Analizador Q y los valores medios se determinaron para calcular la cantidad de proteína. Cada barra representa la media de tres réplicas biológicas ± la desviación estándar. Dos factores se detectaron sólo en la estimulación con IFNg (es decir, GDNF y CXCL16) mientras que dos factores adicionales se inducen por el tratamiento con IFNg al menos dos veces por encima de los niveles básales (es decir, PIGF y MCP-1) . Debido a que el IFNg está presente en las afecciones inflamatorias, la regulación positiva de estos factores por las hABMSC es importante para la supresión de la inflamación, angiogénesis , regeneración de tejidos, y reclutamiento de efectores inmunes.

La Figura 33 proporciona una comparación paralela de los efectos relativos del factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) , interferón gamma (IFNg) , e interleucina-1 alfa (IL-la) en las hABM-SC en comparación una a la otra. Los sobrenadantes (spnts) se recogieron a partir de cultivos de exCF-SC humanas, que se mantuvieron durante 2 días en medio completo (A EM + 10% de suero + glutamina) , seguido por 1 día en medio más vehículo (Basal) o medio más 10ng/ml de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa) , interferón gamma (IFNg) o interleucina-1 alfa (IL-la) . El análisis cuantitativo de más de 150 factores presentes en el sobrenadante se completó a través del uso de matrices RayBiotech Inc. Quantibody. La tabla ilustra la magnitud y dirección del cambio, si los hay, cuando se compararon los sobrenadantes básales y tratados. Un código numérico se usó para almacenar los efectos en 5 categorías en función de la magnitud y la dirección del efecto: -2 = reducción de > 2 ; -1 = reducción de 0 a -2; 0 = sin cambio; +1 = inducción <10; +10 = inducción 10 a 1000; +1000 = inducción >1000. Estos resultados demuestran que ABM-SC humanas modifican su perfil de secreción en respuesta a diferentes marcadores inflamatorios y por lo tanto uno puede esperar que las ABMSC humanas tengan efectos distintos dependiendo del medio ambiente in vivo.

La Figura 34 describe, sin limitarse a, ejemplos de diversos sistemas biológicos en los que la inducción de los factores indicados pueden ser útiles en la presentación de los efectos terapéuticos (por ejemplo, vascular, inmune, regenerativo, inflamatorio, y sistemas de reparación de la herida y mecanismos) .

La evaluación de los perfiles genómicos de expresión del transcripto se puede usar además para optimizar y analizar los efectos de las condiciones de cultivo celular en las células y dispositivos bioactivos de la invención. Por ejemplo, la Figura 35 representa gráficamente el hecho que cerca de 200 transcriptos se expresan diferencialmente al menos dos veces (p=0.01) en fibroblastos crecidos en 4% de oxigeno y sembrados a 30 células/cm2 vs . fibroblastos crecidos en 20% de oxígeno y sembrados a 3000 células/cm2. Estos resultados se describen además más abajo en la Tabla 2.

Específicamente, la identificación de los genes expresados diferencialmente se determinó usando Fibroblastos Dérmicos Humanos Neonatales (NHDF) que se cultivaron en condiciones de 4% de oxígeno y pasaron a densidades de siembra de células de 30 células/cm2 comparados con la expresión de genes en NHDF que se cultivaron en condiciones de 20% de oxígeno y pasaron a densidades de siembra de células de 3000 células/cm2. Se aisló ARN a partir de células NHDF expandidas en tres frascos cada uno en condiciones ya sea de bajo oxígeno (4%) y baja densidad de siembra de células (30 células/cm2) y alto oxígeno (20%) y alta densidad de siembra de células (3000 células/cm2) después de aproximadamente 37 duplicaciones de la población. El ARN se marcó con Cy5 e híbrido con el Genoma Completo Humano ONEARRAY™ de Phalanx Biotech Group (Palo Alto, California, Estados Unidos) que contiene 30,968 sondas humanas. Los cambios en veces de expresión génica en cada una las condiciones de crecimiento se determinaron para todas las tres muestras por triplicado. Se identificaron 196 sondas que se expresaron diferencialmente al menos dos veces (P = 0.01) . Estos datos demuestran que las NHDF expandidas en condiciones de bajo oxígeno y baja densidad de siembra de células resultan en un perfil de expresión génica significativamente diferente en comparación con las condiciones estándar de cultivo de tejidos.

Tabla 2 : Número de Transcriptos de Genes Afectados por Condiciones de bajo oxígeno/ Baja Densidad de Siembra de células Polvos Regenerativos y Terapéuticos Las modalidades de la invención incluyen la generación de tejidos in vitro (por ejemplo., músculo esquelético, músculo liso, dérmico, cartilaginoso, etc.) usando una combinación de CF-SC y/o exCF-SC (de fuentes humanas o no humanas) y una matriz biodegradable (por ejemplo, colágeno, PGA, etc . ) .

Las modalidades de la invención incluyen la generación de polvos regenerativos y terapéuticos secos o liofilizados producidos a partir de CF-SC y/o exCF-SC. Las modalidades de la invención incluyen además polvos regenerativos y terapéuticos producidos a partir de tejidos artificiales y matrices biológicamente compatibles (por ejemplo, matrices de colágeno) en la que se incorporaron CF-SC y/o exCF-SC (o componentes de CF-SC y/o exCF-SC) . Por ejemplo, CF-SC y exCF-SC, CF-SC y exCF-SC incorporadas en matrices biológicamente compatibles, así como CF-SC y exCF-SC incorporadas en tejidos artificiales se pueden procesar y utilizar de acuerdo con los métodos descritos y referidos más aún en la patente de Estados Unidos núm. 7,358,284 (Griffey, y otros,- incorporada de este modo como referencia en la presente descripción) . Las modalidades de la presente invención incluyen polvos regenerativos y terapéuticos secos o liofilizados que comprenden CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) que no incluyen o comprenden una membrana basal como parte de una matriz de tejido acelular.

Las modalidades de la invención incluyen el tratamiento de una afección médica en un paciente que necesita tratamiento contactando un polvo de la presente invención con el paciente. En las modalidades, los polvos regenerativos y terapéuticos de la invención se usan para tratar heridas abiertas, ayudar en la reparación o efecto periodontal, para el tratamiento de deformidades cutáneas {por ejemplo, cicatrices de acné, pliegues nasolabiales) , para el tratamiento de las cicatrices de las cuerdas vocales, quemaduras de tercer grado (por ejemplo, post-desbridamiento de la piel muerta aplicado, pero antes del trasplante cutáneo superficial) y/o en cualquier escenario clínico en el que el resultado deseado es la curación más rápida con menos cicatrices. Las modalidades de la invención incluyen crear tejidode novo como se describe en la presente invención y, posteriormente convertir estos tejidos en polvos de partículas no viviente, que se pueden usar como terapéuticos.

Las modalidades de la invención incluyen además el uso de polvos como una fuente de ECM (matriz extracelular) para construir otros tejidos deseados.

Las modalidades de la invención incluyen además la preparación y uso de polvos en líquido, semi-líquido, o en formas secas para la aplicación por inyección, pulverización, formación de capas, envasado, y en envolturas in vivo en animales humanos o no-humanos.

Aplicaciones Veterinarias Las modalidades de la invención incluyen además células, composiciones celulares, y dispositivos bioactivos derivados (al menos en parte) de células no humanas, así como métodos útiles en aplicaciones veterinarias (es decir, no-humanas) . Por ejemplo, las composiciones y dispositivos bioactivos se pueden derivar de, o usar para tratar, los animales en las categorías de, pero sin limitarse a, equino (por ejemplo, caballos/burros) , porcino (por ejemplo, cerdos) , canino [por ejemplo, perros) , felino (por ejemplo, gatos) , bovino (por ejemplo, vacas) , ovino (por ejemplo, ovejas) , caprino (por ejemplo, cabras) , camélidos (por ejemplo, camellos/llamas) , y murino (por ejemplo, ratas/ratones) .

A modo de ejemplo, pero sin limitarse a, se demostró que las células derivadas de la médula ósea de adultos de fuentes equinas (caballos) son capaces de rápida proliferación y alto número de duplicaciones de células cuando se cultivan in vifcroen bajo oxígeno (4%) y baja siembra de células (60 células/cm2) . Ver la Figura 36.

Particularmente, la Figura 36 representa un gráfico de la cinética de crecimiento de las células derivadas de la médula ósea equina (caballo) . Las células derivadas de la médula ósea del húmero y fémur de un potro de un mes se sembraron a 60,000 células/cm2 y expandieron en 4% de oxígeno para crear el Banco Maestro de Células (MCB) . El MCB y todos los Bancos de Células de Trabajo posteriores (WCB1 - WCB3) se sembraron a 60 células/cm2 para determinar las cinéticas de crecimiento de ABMSC equinas en 4% de oxígeno y baja densidad de siembra de células. Un total de 39 duplicaciones de población celular a partir del MCB se logró sobre cuatro expansiones con un promedio de 8 duplicaciones de población celular por expansión. Estos resultados demostraron que ABMSC equinas se pueden expandir con duplicaciones similares y cinéticas de crecimiento como ABMSC humanas propagadas en condiciones de bajo oxígeno y baja densidad de siembra de células .

Además, las poblaciones celulares equinas (caballos) derivadas de la médula ósea de adulto cultivadas en las condiciones descritas anteriormente mostraron exhibir el perfil único de expresión de proteína que se muestra en la Tabla 3. Particularmente, ABM-SC de caballo se caracterizaron por citometría de flujo para la expresión de marcadores de superficie en los bancos de células maestro y trabajo. Las células mononucleares de sangre periférica de caballos (PBMC) se usaron como control positivo para varios marcadores que fueron negativos en ABMSC de caballo. Estos resultados ilustran que ABMSC de caballo se pueden identificar por los marcadores de superficie CD44, CD49d, CD49e, CD49f, CD90, y CD147. Estos marcadores demuestran expresión consistente a través de todas las expansiones. Además, ABMSC de caballo expresan GM-CSF y Vimentina a través de todas las expansiones. Otros marcadores de superficie que se expresan en porcentajes menores son CD13 y MHC I. Los marcadores que se expresan en PBMC pero no se expresan en ABMSC de caballo y se pueden usar para detectar los posibles contaminantes son CD31, CD33, CD34 y CDllb.

Tabla 3 Además se demostró que las poblaciones celulares equinas (caballos) derivadas de la médula ósea de adulto exhiben el mismo tipo de bioactividad (contracción de gel) cuando se cultivan en una matriz de colágeno tal como se demostró previamente para células porcinas y humanas derivadas de la médula ósea de adulto. Ver, por ejemplo, la Figura 37. Por ejemplo, la Figura 37 muestra los resultados obtenidos cuando se sembraron ABM-SC equinas a 5e6 células/ml en 1.6 mg/ml de geles de colágeno de cola de rata y se cultivaron suspendidos en medios durante 3 días . Los diámetros de los constructos de gel se midieron a las 24, 48, y 72 horas. El porcentaje de la contracción del área de superficie se calculó comparando los diámetros de la dimensión inicial de x y y con los diámetros contraídos de cada intervalo de tiempo. Un gel de control que contiene células inactivadas con calor mostraron poca contracción con las células activas que contraen los geles significativamente hasta 5.8% del tamaño inicial después de 3 días en cultivo.

En otra modalidad de la invención, hABM-SC son capaces además de producir cantidades significativas de VEGF en matrices de células biocompatibles . Por ejemplo, la Figura 38 representa los niveles de VEGF en soportes cultivados de ácido poli-láctico-co-glicólico (PLGA) sembrados con exCF-SC. Las células se sembraron a densidades diversas de 3e6 células o 7e6 células sobre soportes no tejidos de polímero PLGA de 2 cm de diámetro y se cultivaron ya sea durante 1, 3, o 6 días. Los constructos se rellenaron con medio fresco en los días 2 y 4 de cultivo. En cada intervalo de tiempo, los constructos se lavaron 3 veces en solución salina equilibrada y se congelaron rápidamente. Los lisados se fabricaron de cada constructo por disociación mecánica en tampón de extracción de proteína. El ELISA se usó en lisados de constructo para cuantificar la cantidad (en ng) de VEGF contenido en los constructos de PLGA sembrados con hABM-SC. Los resultados indican un aumento en VEGF contenido en los constructos de PLGA con la densidad de células creciente.

Las modalidades de la invención incluyen ABM-SC (por ejemplo, CF-SC o exCF-SC humanas o no humanas) sembradas en matrices biocompatibles (tales como un soporte de PLGA) a densidades en el intervalo de aproximadamente 100 células/mm3 aproximadamente a 100000 células/mm3. Por ejemplo, las modalidades de la invención incluyen células sembradas en matrices biocompatibles aproximadamente a 100, 500, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000, 6000, 7000, 8000, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000, 35000, 40000, 45000, 50000, 60000, 70000, 80000, 90000 y 100000 células/mm3 o mayor.

Composiciones Regenerativas y Terapéuticas Adicionales y Aplicaciones Las modalidades de la invención incluyen el uso de composiciones bioactivas de la invención para el tratamiento y manejo de las lesiones relacionadas con el trauma agudo y crónico (por ejemplo, tal como ocurre entre el personal militar en el combate o en otros individuos que padecen quemaduras o lesiones causadas por proyectiles a alta velocidad) . Como consecuencia, las modalidades de la invención incluyen los métodos y composiciones útiles para el tratamiento y reparación de las lesiones por quemaduras, heridas dérmicas, lesión cerebral traumática. Las modalidades de la invención incluyen el uso de composiciones de la invención para el tratamiento y preservación de la función de las células nerviosas y la señalización neuronal (que incluyen, por ejemplo, pero sin limitarse a, tratamiento de afecciones neuropatológicas tales como enfermedad de Parkinson y de Alzheimer) .

Las modalidades de la invención incluyen además el uso de composiciones de la invención para el tratamiento y reparación de las lesiones inducidas quirúrgicamente, tales como en pacientes sometidos a mastectomía/cirugía reconstructiva de mama para promover la curación y reducción de la cicatrización en el sitio de la incisión.

Las modalidades adicionales de la invención incluyen el uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) ya sea directamente, o como se incorporan en las matrices biocompatibles , como se incorporan en composiciones y dispositivos bioactivos, y como se incorporan en polvos regenerativos y terapéuticos (que se pueden aplicar en cualquier forma final ya sea como un polvo seco, líquido, semi-líquido, pasta, sólido o semi-sólido) en donde dichos usos pueden particularmente incluirse (sin limitarse a) : • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) incorporado en hojas biocompatibles (es decir. , matrices similares a hojas; que se pueden empaquetar en paquetes para la movilidad y rápida aplicación en quemaduras u otras heridas "en el campo" ; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) en suspensión (por ejemplo, por ejemplo, para la aplicación atomizando, vaciando, o pegando en heridas abiertas) ; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para a mitigar lesiones tales como lesión traumática de cerebro; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para prevenir o mitigar la sepsis; ; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para promover o efectuar la curación de lesiones subagudas (por ejemplo, para mejorar el salvamento de la extremidad y prevenir la amputación) ; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para mejorar los resultados del injerto autólogo de piel (por ejemplo, para reducir el riesgo de rechazo o "fracaso para aceptar") ; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para la reducción o revisión de cicatrices desfigurantes ; • Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para retardar el curso de la enfermedad de Parkinson, Alzheimer u otras patologías neurológicas ; » Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para ayudar en la cicatrización de heridas crónicas y pobremente cicatrizantes, y « Uso de CF-SC y/o exCF-SC (o componentes derivados de éstas) para reducir, mejorar o eliminar cicatrices restrictivas (por ejemplo, para aumentar la movilidad y calidad de vida) .

• En determinadas modalidades de la invención, las ABM-SC son útiles en constructos de ingeniería de tejido de diversas formas y moldes Por ejemplo, la Figura 39 muestra fotografías de: A & B) gel de colágeno porcino sembrado con hABM-SC después del cultivo y la reticulación para generar un constructo bioactivo no viviente estable mecánicamente; C) gel de colágeno porcino sembrado con hABM-SC después del cultivo y deshidratación para generar un constructo bioactivo no viviente de capa fina; y D) soporte no tejido de PLGA (izquierda) y constructo cultivado con soporte no tejido de PLGA sembrado con hABM-SC.

Las modalidades adicionales de la invención incluyen además: • Composiciones bioactivas y dispositivos en donde los soportes sembrados con CF-SC y/o exCF-SC se co-cultivan con otros tipos de células para permitir la estimulación de factores específicos de tejidos de CF-SC y/o exCF-SC (por ejemplo, para la producción de factores útiles en el tratamiento de afección neural, vascular, hueso, cartílago, cardíaca) ; ; « Composiciones y dispositivos en donde los soportes sembrados con CF-SC y/o exCF-SC se cultivan con relaciones variadas de gas de 02, N2 y C02 para optimizar además la bioactividad deseada (esto puede incluir diversos porcentajes de oxígeno presente en el aire en contacto con los constructos cultivados para producir condiciones de hipoxia, atmosférica, o hiperóxica) ; • Composiciones y dispositivos en donde los soportes sembrados con CF-SC y/o exCF-SC se cultivan en condiciones variadas de medios de cultivo para optimizar aún más la bioactividad deseada (esto puede incluir la variación de las adiciones de factores químicos tales como proteínas factor de crecimiento, vitaminas, minerales, aminoácidos, azúcares, ácidos grasos, y tampones) ; » Composiciones y dispositivos en donde las formas particuladas de matriz natural o polímeros sintéticos se siembran con CF-SC y/o exCF-SC, o CF-SC y/o exCF-SC se encapsulan en forma particuladas, en vehículos microportadores de entrega de células (o componentes derivados de éstos) para el paciente. Más aun, las formas particuladas de constructos de ingeniería de tejido generados in vitro con CF-SC y/o exCF-SC y soportes se usan en conjunto con CF-SC y/o exCF-SC viables en vehículos portadores de entrega en el paciente.

• Los constructos de ingeniería de tejido generados a partir de CF-SC y/o exCF-SC y soportes se pueden usar para producir películas bioactivas, vendas, parches, suturas, mallas, o envoltorios. Múltiples formas, tamaños y espesores de estos constructos se pueden diseñar para aplicaciones específicas. Los vendajes o parches se pueden aplicar para cubrir el tejido de piel dañado. Los constructos flexibles se pueden usar como envoltorios bioactivos para encerrar más tejidos irregularmente conformados, tales como hueso, ligamentos, tendones, nervios y músculos.

• Las preparaciones de CF-SC y/o exCF-SC y soportes de matriz en cultivo se pueden diseñar específicamente para diferentes preparaciones de constructos que incluyen encapsulación de células, siembra de células por fuera alrededor del soporte, yuxtaposición del soporte con células para la secreción de factores a partir de células en el soporte.

Trastornos Inmunes Las células y composiciones de la presente invención se pueden usar para prevenir, tratar y/o aliviar, entre otros, enfermedades y trastornos inmunes, autoinmunes e inflamatorios. Algunos ejemplos de dichos trastornos se indican más abajo; estas listas son sólo ilustrativas y no se pretende ser exhaustivo con respecto a todas las enfermedades y trastornos inmunes, autoinmunes, e inflamatorios, ni se deben interpretar las siguientes como limitantes con respecto a las patologías que se pueden tratar con las células y composiciones de la presente invención.

Ejemplos de algunas enfermedades de etiología autoinmune completa o parcial: : Encefalomielitis diseminada aguda (ADEM) , enfermedad de Addison, Espondilitis anquilosante, Síndrome de anticuerpo antifosfolípido (APS) , Anemia aplástica, Hepatitis autoinmune, Ovaritis autoinmune, Enfermedad Celíaca, Enfermedad de Crohn, Diabetes mellitus tipo 1, Penfigoide gestacional, Síndrome de Goodpasture, Enfermedad de Graves, Síndrome de Guillain-Barré (GBS) , Enfermedad de Hashimoto, Púrpura trombocitopénica idiopática, Enfermedad de Kawasaki, Lupus eritematoso, Esclerosis múltiple, Miastenia gravis, Síndrome Opsoclonia mioclono (OMS) , Neuritis óptica, Tiroiditis de Ord, Pénfigo, Anemia perniciosa, Poliartritis, Cirrosis biliar primaria, Artritis reumatoide, Síndrome de Reiter, Síndrome de Sjógren, Arteritis de Takayasu, Arteritis temporal (también conocida como "arteritis de células gigantes"), Anemia hemolítica autoinmune Warm, y Granulomatosis de Wegener.

Ejemplos de algunas enfermedades sospechosas de estar vinculadas a la autoinmunidad: Alopecia universalis, Enfermedad de Behcet, Enfermedad de Chagas, Síndrome de fatiga crónica, Disautonomía, Endometriosis , Hidradenitis supurativa, Cistitis intersticial, Enfermedad de Lyme., Morfea, Neuromiotonía, Narcolepsia, Soriasis, Sarcoidosis, Esclerodermia, Colitis ulcerativa, Vitíligo, y Vulvodinia.

Ejemplos de algunas enfermedades y trastornos de hipersensibilidad inmune: Asma alérgico, Conjuntivitis alérgica, Rinitis alérgica ("fiebre del heno"), Anafilaxia, Miastenia gravis, Angioedema, Reacción de Arthus, Dermatitis atópica (eczema) , Anemia hemolítica autoinmune, Anemia perniciosa autoinmune, Enfermedad celiaca, Dermatitis de contacto (erupción por hiedra venenosa, Eosinofilia, Eritroblastosis fetal, Pulmón de granjero (reacción de tipo Arthus) , por ejemplo) , Síndrome de Goodpasture , Enfermedad de Graves , iroiditis de Hashimoto, Enfermedad hemolítica del recién nacido, Glomerulonefritis por complejo inmune, Trombocitopenia inmune, Miastenia gravis, Pénfigo, Fiebre reumática, Artritis reumatoide, Enfermedad del suero, Endocarditis bacteriana subaguda, Síntomas de lepra, Síntomas de malaria, Síntomas de tuberculosis, Lupus eritematoso sistémico, Arteritis temporal, Reacciones transíusionales , Rechazo de trasplantes, y Urticaria (ronchas) .

Ejemplo de algunos trastornos inflamatorios alergias, espondilitis anquilosante, artritis, asma, autismo enterocolitis, enfermedades autoinmunes, enfermedad de Behcet, inflamación crónica, glomerulonefritis , enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , enfermedades inflamatorias del intestino, enfermedad de inflamación pélvica, soriasis, artritis psoriásica, lesión por reperfusión, artritis reumatoide, rechazo de trasplantes, y vasculitis.

Ejemplo de algunos trastornos por inmunodeficiencias deficiencias de células B (tales como agammaglobulinemia ligada a X y Deficiencia de Inmunoglobulina Selectiva) , deficiencias de células T (tal como el síndrome de DiGeorge (Aplasia tímica) , Candidiasis mucocutánea crónica, Síndrome de Hiper-IgM y, Deficiencia del receptor de interleucina -12) , anormalidades combinadas de células B y células T (tales como Enfermedad de Inmunodeficiencia Combinada Severa (SCID) , Síndrome de Wiskott-Aldrich, y Ataxia-telangiectasia) , Deficiencias del Complemento (tales como Angioedema Hereditario o Edema angioneurótico hereditario y Hemoglobinuria paroxística nocturna) , Deficiencias de fagocitos (tales como deficiencia de adhesión leucocitaria, Enfermedad granulomatosa crónica (CGD) , Síndrome de Chédiak-Higashi, Síndrome de Job (síndrome de Hiper-IgE) , Neutropenia cíclica, Deficiencia de mieloperoxidasa, Deficiencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, y deficiencia de interferón-?) e Inmunodeficiencia Variable Común (CVID) , síndrome de Vici, y Síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) .

Modalidades de la invención Las modalidades particulares de la invención incluyen las siguientes: Al. Un método para administrar una cantidad terapéuticamente útil de una composición o composiciones biológicas a un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una población aislada de células formadoras de colonias de auto-renovación, en donde las células en. dicha población celular tienen capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente , en donde dichas células tienen un cariotipo normal, y en donde dichas células son no-inmortalizadas .

A2. Un método para administrar una cantidad terapéuticamente útil de una composición o composiciones biológicas a un sujeto, que comprende (i) aislar la composición o composiciones biológicas producidas por una población aislada de células formadoras de colonias de auto-renovación; y, (ii) administrar dicha composición o composiciones biológicas a dicho sujeto, en donde las células en dicha población celular tienen capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente , en donde dichas células tienen un cariotipo normal, y en donde dichas células son no inmortalizadas.

A3. Un método para reparar, tratar o promover la regeneración de tejido dañado en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una población aislada de células formadoras de colonias de auto-renovación, en donde las células en dicha población celular tienen capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente, en donde dichas células tienen un cariotipo normal, y en donde dichas células son no inmortalizadas A4. Un método para reparar, tratar o promover la regeneración de tejido dañado en un sujeto, que comprende: (i) aislar la composición o composiciones biológicas producidas por una población aislada de células formadoras de colonias de auto-renovación; y; (ii) administrar dicha composición o composiciones biológicas a dicho sujeto en donde las células en dicha población celular tienen capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente, en donde dichas células tienen un cariotipo normal, y en donde dichas células son no inmortalizadas.

A5. Un método para tratar o reducir la inflamación, actividad inmune o autoinmune en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto una cantidad eficaz de una población aislada de células formadoras de colonias de auto-renovación, en donde las células en dicha población celular tienen capacidad de diferenciación sustancialmente no multipotente , en donde dichas células tienen un cariotipo normal, y en donde dichas células son no inmortalizadas.

A6. Un método para tratar o reducir la inflamación, actividad inmune o autoinmune en un sujeto, que comprende (i) aislar la composición o composiciones biológicas producidas por una población aislada de células formadoras de colonias de auto-renovación; y; (ii) administrar dicha composición o composiciones biológicas a dicho sujeto en donde las células en dicha población celular no tienen capacidad sustancialmente de diferenciación multipotente, en donde dichas células tienen un cariotipo normal, y en donde dichas células son no inmortalizadas.

A7. El método de cualquiera de las modalidades Al a A6 , en donde antes de la administración, dicha población celular se pasó in vitro por un número de duplicaciones de población suficiente que causa a las células de dicha población perder la capacidad de diferenciación multipotente.

A8. El método de alguna de las modalidades Al a A7, en donde dicha población celular tiene capacidad de diferenciación unipotente .

A9. El método de cualquiera de las modalidades Al a A8, en donde dichas células tienen capacidad sustancial para la auto-renovación A10. El método de cualquiera de las modalidades Al a A9, en donde antes de la administración dicha población celular se pasó ín vitro por un número de duplicaciones de población mientras que conservan la capacidad sustancial para la auto-renovación.

All. El método de alguna de las modalidades Al a A10, en donde las células de dicha población celular aislada no son células madre embrionarias A12. El método de alguna de las modalidades Al a All, en donde las células en dicha población celular aislada no son células madre, células madre mesenquimales , células madre hematopoyéticas , células progenitoras adultas multipotentes (MAPC) , células madre adultas multipotentes (MASO o fibroblastos.

A13. El método de alguna de las modalidades Al a A12, en donde dichas células no se diferencian en uno o más tipos de células seleccionados del grupo que consiste de: a) osteocitos; b) adipocitos; y, c) condrocitos.

A14. El método de alguna de las modalidades Al a A13, en donde dichas células no depositan niveles detectables de calcio después del tratamiento en afecciones osteoinductivas A15. El método de la modalidad A14, en donde dichas afecciones osteoinductivas incluyen la exposición a Noggin exógenamente suministrado.

A16. El método de alguna de las modalidades Al a A15, en donde las células en dicha población celular aislada se derivan a partir de tejido conectivo.

Al7. El método de alguna de las modalidades Al a A16, en donde las células en dicha población celular aislada son células estromales A18. El método de alguna de las modalidades Al a A17, en donde las células en dicha población celular aislada co-expresan CD49c y CD90.

A19. El método de alguna de las modalidades Al a A18, en donde la población celular mantiene una velocidad de duplicación aproximadamente constante a través de múltiples duplicaciones de población in vitro, A20. El método de alguna de las modalidades Al a A19, en donde dichas células son negativas para la expresión detectable de uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste de: a) CD10; b) STRO-1; y, c) CD106/VCAM-1.

A21. El método de alguna de las modalidades Al a A20, en donde dichas células son positivas para la expresión detectable de uno o más antígenos seleccionados del grupo que consiste de: a) CD44; b) antígeno HLA Clase-1 ; y, c) ? (beta) 2 -Microglobulina, A22. El método de alguna de las modalidades Al a A21, en donde dichas células expresan o secretan cantidades detectables de composiciones seleccionadas del grupo que consiste de: a) TNF-RI; b) TNF-RI soluble; c) TNF-RII; d) TNF-RII soluble; e) antagonista de IL-1R; y, f) proteína de unión IL-18 .

A23. El método de alguna de las modalidades Al a A21, en donde dichas células expresan o secretan cantidades detectables de composiciones seleccionadas del grupo que consiste de composiciones mostradas en las Tablas 1A, IB y 1C.

A24. El método de alguna de las modalidades Al a A23, en donde las células en dicha población celular aislada se aislan inicialmente a partir de una fuente de tejido seleccionada del grupo que consiste de: a) médula ósea; b) tejido adiposo/graso; c) piel; d) placenta; e) cordón umbilical; f) tendón; g) ligamento; h) fascia muscular; e, i) otros tejidos conectivos.

A25. El método de la modalidad A24, en donde dicha fuente de tejido es humana A26. El método de alguna de las modalidades Al a A25, en donde dicha población celular mantiene una velocidad de duplicación aproximadamente constante a través de un número de duplicaciones de células in vitro seleccionados del grupo que consiste de: a) 1 a 5 duplicaciones de células; b) 5 a 10 duplicaciones de células; c) 10 a 20 duplicaciones de células; d) 20 a 30 duplicaciones de células; e) 30 a 40 duplicaciones de células; f) 40 a 50 duplicaciones de células; g) 1 a 50 duplicaciones de células,- h) 5 a 50 duplicaciones de células; i) 10 a 50 duplicaciones de células; j) 20 a 50 duplicaciones de células; k) 30 a 50 duplicaciones de células; 1) 1 a 10 duplicaciones de células; m) 1 a 20 duplicaciones de células; n) 1 a 30 duplicaciones de células; o) 1 a 40 duplicaciones de células; p) 5 a 20 duplicaciones de células; q) 5 a 30 duplicaciones de células; r) 5 a 40 duplicaciones de células; s) 10 a 30 duplicaciones de células; t) 10 a 40 duplicaciones de células; y, u) 20 a 40 duplicaciones de células.

A27. El método de alguna de las modalidades Al a A26, en donde dicha población celular se sometió a un número de duplicaciones de población seleccionados del grupo que consiste de: a) al menos aproximadamente 10 duplicaciones de población; b) al menos aproximadamente 15 duplicaciones de población; c) al menos aproximadamente 20 duplicaciones de población; d) al menos aproximadamente 25 duplicaciones de población; e) al menos aproximadamente 30 duplicaciones de población; f) al menos aproximadamente 35 duplicaciones de población; g) al menos aproximadamente 40 duplicaciones de población; h) al menos aproximadamente 45 duplicaciones de población; y i) al menos aproximadamente 50 duplicaciones de población.

A28. El método de alguna de las modalidades Al a A27, en donde dicha composición o composiciones biológicas están unidas en o a la superficie celular de dichas poblaciones celulares.

A29. El método de alguna de las modalidades Al a A28, en donde dicha composición o composiciones biológicas se secretan en el medio extracelular de dichas poblaciones celulares .

A30. El método de alguna de las modalidades Al a A29, en donde dicha composición o composiciones biológicas son una o más moléculas seleccionadas del grupo que consiste de: a) proteínas; b) carbohidratos; c) lípidos; d) ácidos grasos; e) derivados de ácidos grasos; d) gases; y, e) ácidos nucleicos .

A31. El método de la modalidad A30, en donde dichas proteínas se seleccionan del grupo que consiste de: a) proteínas glicosiladas ,- b) citocinas c) quimiocinas; d) linfocinas; e) factores de crecimiento; f) factores tróficos; g) proteínas morfogenéticas ; y, h) hormonas .

A32. El método de la modalidad A31, en donde dicha composición o composiciones biológicas se unen a e inactivan, o reducen, la actividad biológica de las moléculas seleccionadas del grupo que consiste de: a) ácidos grasos; b) derivados de ácidos grasos; c) moléculas de receptores; d) citocinas; e) quimiocinas; f) linfocinas; g) factores de crecimiento; h) factores tróficos; i) proteínas morfogenéticas ; y, j) hormonas.

A33. El método de la modalidad A32, en donde dicha composición o composiciones biológicas son receptores solubles que se unen a ligandos análogos seleccionados del grupo que consiste de: a) ácidos grasos; b) derivados de ácidos grasos; c) moléculas de receptores; d) citocinas; e) quimiocinas; f) linfocinas; g) factores de crecimiento; h) factores tróficos; i) proteínas morfogenéticas; y, j) hormonas.

A34. El método de alguna de las modalidades Al a A33, en donde dichas células se inducen para aumentar la expresión de una o más composiciones biológicas.

A35. El método de alguna de las modalidades Al a A33, en donde dichas células se inducen para expresar una o más composiciones biológicas.

A36. El método de alguna de las modalidades Al a A29, en donde dicha una o más composiciones biológicas es/son seleccionadas de las Tablas 1A, IB y 1C .

A37. El método de alguna de las modalidades Al a A29, en donde dicha o más composiciones biológicas se seleccionan del grupo que consiste de: a) TNF-RI; b) TNF-RI soluble; c) TNF-RII; d) TNF-RII soluble; e) antagonista de IL-1R; y, f) proteína de unión IL-18 A38. El método de alguna de las modalidades Al a A37, en donde las células en dicha población celular no exhiben injerto a largo plazo en, o con, los tejidos u órganos cuando se administran a un organismo mamífero vivo.

A39. El método de alguna de las modalidades Al a A38, en donde las células en dicha población celular mantienen aproximadamente constantes los niveles de producción de una o más composiciones terapéuticamente útiles in vivo.

A40. El método de la modalidad A39, en donde dichos niveles de producción se mantienen para una medida de tiempo seleccionada del grupo que consiste de: a) al menos aproximadamente 24 horas; b) al menos aproximadamente 48 horas; c) al menos aproximadamente 72 horas; d) al menos aproximadamente 4 días; e) al menos aproximadamente 5 días ; f ) al menos aproximadamente 6 días ; g) al menos aproximadamente 7 días; h) al menos aproximadamente 2 semanas; i) al menos aproximadamente 3 semanas; j) al menos aproximadamente 4 semanas; k) al menos aproximadamente 1 mes; 1) al menos aproximadamente 2 meses; m) al menos aproximadamente 3 meses; n) al menos aproximadamente 6 meses; y, o) al menos aproximadamente 1 año .

A41. El método de alguna de las modalidades Al a A40, en donde dicho paciente es humano.

A42. El método de alguna de las modalidades Al a A41, en donde dicho método se usa para tratar una enfermedad o trastorno seleccionado del grupo que consiste de: a) una enfermedad o trastorno neurológico; b) una enfermedad o trastorno cardíaco; c) una enfermedad o trastorno de la piel; d) una enfermedad o trastorno del músculo esquelético; e) una enfermedad o trastorno respiratorio; f) a enfermedad o trastorno hepático; g) una enfermedad o trastorno renal; h) una enfermedad o trastorno del sistema genitourinario; i) una enfermedad o trastorno de la vejiga; j) una enfermedad o trastorno endocrino; k) una enfermedad o trastorno hematopoyético ; 1) una enfermedad o trastorno pancreático; m) diabetes; n) una enfermedad o trastorno ocular; o) una enfermedad o trastorno de la retina; p) una enfermedad o trastorno gastrointestinal; q) una enfermedad o trastorno esplénico; r) una enfermedad o trastorno inmunológico; s) una enfermedad o trastorno autoinmune; t) una enfermedad o trastorno inflamatorio ; u) una enfermedad o trastorno hiperproliferativo, y, v) cáncer.

A43. El método de alguna de las modalidades Al a A42, en donde dichas células se modifican genéticamente.

A44. El método de la modalidad A43, en donde dichas células se modifican genéticamente mediante la introducción de una molécula de ácido nucleico recombinante .

A45. Un proceso para preparar una población celular aislada en alguna de las modalidades Al a A47, en donde dicho procedimiento comprende : i) obtener una población de la fuente de células de un organismo; y, ii) cultivar dicha población de la fuente de células in vitro.

Bl. Una composición que comprende una mezcla farmacéuticamente aceptable de células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación (CF-SC) , o medios de cultivo celular acondicionados derivados a partir de dichas células, y matriz extracelular recombinante aislada o de origen natural purificada o proteínas del plasma sanguíneo o B2. La composición de la modalidad Bl, en donde dichas CF-SC se derivan de la médula ósea.

B3. La composición de las modalidades Bl o B2 , en donde dichas CF-SC se derivan de un ser humano.

B4. La composición de alguna de las modalidades B1-B3, en donde dichas CF-SC se derivan de un mamífero adulto, que incluyen seres humanos.

B5. La composición de alguna de las modalidades B1-B4, en donde dichas CF-SC expresan una o más proteínas secretadas que se muestran en las Tablas 1A, IB y 1C.

B6. La composición de alguna de las modalidades B1-B5, en donde dicha matriz extracelular o proteínas del plasma sanguíneo comprenden una o más isoformas de longitud completa o procesadas como alternativa, fragmentos proteolíticos , o subunidades de moléculas seleccionadas del grupo que consiste de a) colágeno; b) elastina; c) fibronectina; d) laminina; e) entactina (nidógeno) ; f ) ácido hialurónico; g) ácido poliglicólico (PGA) ; h) fibrinógeno (Factor I) ; i) fibrina; j) protrombina (Factor II); k) trombina; 1) anti-trombina; m) Factor de piel Co- factor de Vlla (Factor III) ; n) Proteína C; o) Proteína S; p) Proteína Z; q) Proteína Z relacionada con inhibidor de proteasa ; r) Cofactor II de heparina; s) Factor V (proacelerina, factor lábil ) ; t) Factor-VII; u) Factor-VIII; v) Factor- IX; w) Factor-X; x) Factor-XI; y) Factor-XII; z) Factor-XIII; aa) factor von Willebrand; ab) precalicreína ; ac) quininógeno de alto peso molecular; ad) plasminógeno; ae) plasmina; af) activador tisular del plasminógeno; ag) uroquinasa; ah) inhibidor- 1 del activador del plasminógeno; y, ai) inhibidor-2 del activador del plasminógeno .

B7. La composición de alguna de las modalidades B1-B6, que comprende además citocinas o quimiocinas recombinantes aisladas o de origen natural purificadas.

B8. La composición de alguna de las modalidades B1-B7, en donde dicha matriz extracelular, proteínas del plasma sanguíneo, citocinas y/o quimiocinas se derivan de seres humanos .

B9. La composición de alguna de las modalidades B1-B8, en donde dicha mezcla farmacéuticamente aceptable forma una matriz semi-solidificada o solidificada.

B10. Un método para tratar el tejido dañado con la composición de alguna de las modalidades B1-B8, en donde la composición es un líquido Bll. El método de la modalidad B10, en donde el líquido se aplica por inyección.

B12. Un método para tratar el te ido dañado con la composición de alguna de las modalidades 1-9, en donde la composición se aplica como un líquido, pero después de eso forma una matriz semi-solidificada o solidificada.

B13. El método de las modalidades B10-B12 en donde dicho tejido se daña como un resultado de una afección seleccionada del grupo que consiste de: a) enfermedad; b) trauma físico; c) isquemia; d) envejecimiento; e) quemadura; f) infección bacteriana; g) infección viral; h) infección fúngica; e, i) desregulación del sistema inmune.

B14. El método de la modalidad B13, en donde el tejido dañado es la piel.

B15. Un método para usar la composición de alguna de las modalidades B1-B9 para el rejuvenecimiento facial de la piel.

B16. Un método para usar la composición de alguna de las modalidades B1-B9, en donde dicha composición inhibe la inflamación aguda Cl . Un método para tratar, reparar, regenerar, o curar un órgano dañado o tejido que comprende contactar dicho órgano o tejido dañado con una cantidad eficaz de células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación o composiciones producidas a partir de dichas células para efectuar dicho tratamiento, reparación, regeneración, o curación del órgano o tejido dañado.

C2. El método de la modalidad Cl , en donde dicho órgano dañado o tejido se pone en contacto con una cantidad eficaz de células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación o composiciones producidas a partir de dichas células por medios seleccionados del grupo que consiste de: a) inyección en el órgano o tejido dañado; b) aplicación sobre el órgano o tejido dañado; c) inyección proximal al órgano o tejido dañado; d) aplicación proximal al órgano o tejido dañado; y, e) administración intravenosa.

C3. El método de las modalidades Cl o C2 , en donde las células se derivan de la médula ósea C4. El método de alguna de las modalidades C1-C3, en donde las células son humanas .

C5. El método de alguna de las modalidades C1-C4, en donde las células, o composiciones producidas por dichas células, inhiben o reducen las respuestas inmunes adversas (tal como la autoinmunidad mediada por células) , fibrosis (cicatrización) y/o remodelación de tejidos adversos (por ejemplo, remodelación ventricular) .

C6. El método de alguna de las modalidades C1-C5, en donde las células, o las composiciones producidas por dichas células, controlan la inflamación y/o inhiben la inflamación aguda C7. El método de alguna de las modalidades C1-C5, en donde las células, o composiciones producidas por dichas células, estimulan o potencian la angiogénesis .

[0100] C8. El método de alguna de las modalidades C1-C5, en donde dichas células no exhiben niveles significativos o detectables de injerto permanente o a largo plazo en dichos órganos o tej idos dañados .

C9. El método de alguna de las modalidades C1-C8, en donde dichos órganos dañados se seleccionan del grupo que consiste de corazón, cerebro y médula espinal CIO. El método de alguna de las modalidades C1-C8, en donde dicho tejido dañado se selecciona del grupo que consiste de tejido cardiaco, tejido neuronal (que incluyen tejido del sistema nervioso central y periférico) , y tejido vascular (que incluyen arterias mayores y menores, venas y capilares) .

DI. Un método para inducir, mejorar y/o mantener la generación de nuevos glóbulos rojos in vitro.

D2. El método de la modalidad DI, en donde dicha inducción, mejora o mantenimiento se logra por el co-cultivo de células precursoras hematopoyéticas con células formadoras de colonias de auto-renovación.

D3. El método de la modalidad D2 , en donde dichas células formadoras de colonias de auto-renovación son células somáticas humanas derivadas de la médula ósea (hABM-SC) .

D4. El método de la modalidad D3 , en donde dichasi hABM-SC se derivan de un adulto.

D5. El método de alguna de las modalidades D1-D3, en donde dicho co-cultivo utiliza una barrera semi-permeable para mantener la separación de las células precursoras hematopoyéticas de las células formadoras de colonias de auto-renovación mientras que permite el intercambio de las composiciones producidas por dichas células formadoras de colonias de auto-renovación a través de dicha barrera.

D6. El método de la modalidad DI, en donde . dicha inducción, mejora o mantenimiento se logra por el co-cultivo de las células precursoras hematopoyéticas con composiciones aisladas producidas por las células formadoras de colonias de auto-renovación .

D7. El método de la modalidad D5 , en donde dichas células formadoras de colonias de auto-renovación son células somáticas humanas derivadas de la médula ósea (hABM-SC) .

D8. El método de la modalidad D6, en donde dichas hABM-SC se derivan de un adulto.

D9. El método de alguna de las modalidades D5-D7, en donde se liofilizan dichas composiciones aisladas.

DIO. El método de alguna de las modalidades D5-D7, en donde se criopreservan dichas composiciones aisladas.

Dll. El método de alguna de las modalidades D5-D7, en donde dichas composiciones aisladas se mezclan con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

D12. Un método para producir, aislar, purificar y/o envasar composiciones derivadas de células y/o factores tróficos .

D13. Un método para producir medio acondicionado, en donde dicho medio contiene suero o es medio libre de suero.

D14. Un método para aislar y purificar las fracciones y/o composiciones derivadas de las células a partir de medio acondicionado, en donde dicho medio contiene suero o es medio libre de suero.

D15. Un método para aislar, crioconservar, y/o expandir las células CD34 + de sangre de cordón (CBC) .

D16. El método de la modalidad D15, en donde dichas CBC se expanden en cultivos en suspensión.

D17. El método de la modalidad D15, en donde dichas CBC se expanden por co-cultivo con una capa alimentadóra de células formadoras de colonias de auto-renovación .

D18. El método de la modalidad D17, en donde dichas células formadoras de colonias de auto-renovación son células somáticas humanas derivadas de la médula ósea (hABM-SC) .

D19. Una solución de lavado que comprende Solución Salina Equilibrada con dextrosa (BSSD) .

D20. La solución de lavado de la modalidad D19 en donde dicha dextrosa está en una concentración de aproximadamente 4.5% de dextrosa.

D21. La solución de lavado de la modalidad D19 o D20, que comprende además albúmina de suero humano.

D22. La solución de lavado de la modalidad D21, en donde dicha albúmina de suero humano está en una concentración de aproximadamente 5% de albúmina de suero humano .

D23. Un medio de crioconservación que comprende dimetilsulfóxido (DMSO) y albúmina de suero humano en una Solución Salina Equilibrada.

D2 . El medio de crioconservación de la modalidad D23, en donde dicha concentración de DMSO es aproximadamente 5% y dicha concentración de HSA es aproximadamente 5%.

El. Una población celular aislada derivada de médula ósea, en donde más de aproximadamente 91% de las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, y en donde la población celular tiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas .

E2. La población celular aislada de la modalidad El, en donde la población celular se deriva de la médula ósea humana E3. La población celular aislada de las modalidades El o E2, en donde las células de la población celular que coexpresan CD49c y CD90 no expresan CD34 y/o CD45.

E]4. La población celular aislada de acuerdo con alguna de las modalidades El, E2 , o E3 , en donde las células de la población celular que co-expresan CD49c y CD90 expresan además al menos un factor de transcripción relacionado con el corazón seleccionado del grupo que consiste de GATA-4, Irx4 y Nkx2.5.

E5. La población celular aislada de acuerdo con alguna de las modalidades El, E2 , o E3 , en donde las células de la población celular que co-expresan CD49c y CD90 expresan además al menos un factor trófico seleccionado del grupo que consiste de: a) Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF) ; b) Cistatina-C; c) Interleucina-6 (IL-6) ; d) Interleucina-7 (IL-7) ; e) Interleucina-11 (IL-11) ; f) Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) ; g) Neurotrófina-3 (NT-3) ; h) Proteína Quimioatrayente de Macrófago-1 (MCP-1) ; i) Metaloproteinasa de la matriz-9 (MMP-9) ; j) Factor de Células Madre (SCF) ; y, k) Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) .

E6. La población celular aislada de acuerdo con alguna de las modalidades El, E2 , o E3 , en donde las células de la población celular que co-expresan CD49c y CD90 expresan además p21 o p53, y en donde la expresión de p53 es una expresión relativa de hasta aproximadamente 3000 transcriptos de p53 por 106 transcriptos de un ARNr 18s y la expresión de p21 es una expresión relativa de hasta aproximadamente 20,000 transcriptos de p21 por 106 transcriptos de un ARNr 18s.

E7. La población celular aislada de acuerdo con alguna de las modalidades El, E2 , o E3 , en donde la población celular aisladas se cultivó in vitro a través de un número de duplicaciones de población seleccionados del grupo que consiste de: a) al menos aproximadamente 15 duplicaciones de población; b) al menos aproximadamente 20 duplicaciones de población; c) al menos aproximadamente 25 duplicaciones de población; d) al menos aproximadamente 30 duplicaciones de población; e) al menos aproximadamente 35 duplicaciones de población; y, f) al menos aproximadamente 40 duplicaciones de población .

E8. Un método para preparar una población celular aislada derivada de la médula ósea, en donde más de aproximadamente 91% de las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, y en donde la población celular tiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas, que comprende las etapas de: a) cultivar una fuente de la población celular en condición de bajo oxígeno o una condición de bajo estrés oxidativo para producir una población celular adherente; y, b) cultivar la población celular adherente a una densidad de siembra de menos de aproximadamente 2500 células/cm2.

E9. El método de la modalidad E8, en donde la población celular se deriva a partir de médula ósea humana.

E10. El método de las modalidades E8 o E9, en donde la fuente de la población celular en la modalidad 8, en parte a) se cultiva a una densidad de siembra inicial seleccionada del grupo que consiste de: a) menos de aproximadamente 75000 células/cm2 ; y, b) menos de aproximadamente 50000 células/cm2.

Ell. El método de alguna de las modalidades E8 a E10, en donde la población celular adherente en la modalidad 8, en parte b) se cultiva a una densidad de siembra seleccionada del grupo que consiste de: a) menos de aproximadamente 2500 células/cm2; b) menos de aproximadamente 1000 células/cm2; c) menos de aproximadamente 100 células/cm2? d) menos de aproximadamente 50 células/cm2; y, e) menos de aproximadamente 30 células/cm2.

E12. El método de alguna de las modalidades E8 a Ell, en donde la condición de bajo oxígeno se selecciona del grupo que consiste de: a) entre aproximadamente 1 a 10% de oxígeno; b) entre aproximadamente 2 a 7% de oxígeno; d) menos de aproximadamente 20% de oxígeno; c) menos de aproximadamente 15% de oxígeno; d) menos de aproximadamente 10% de oxígeno; e) menos de aproximadamente 5% de oxígeno; y, f) aproximadamente 5% de oxígeno.

E13. El método de alguna de las modalidades E8 a E12, que incluye más aún lisar los glóbulos rojos en una fuente de la población celular antes de cultivar la fuente de la población celular.

E14. El método de alguna de las modalidades E8 a E12, que incluye más aún seleccionar una fuente fraccionada de la población celular por el paso a través de un gradiente de densidad antes de cultivar la fuente de la población celular.

E15. El método de alguna de las modalidades E8 a E14, en donde las células de la población celular que co-expresan CD49c y CD90, no expresan CD34 y/o CD45.

E16. El método de alguna de las modalidades E8 a E15, en donde las células de la población celular que coexpresan CD49c y CD90 expresan más aún al menos un factor de transcripción relacionado con el corazón seleccionado del grupo que consiste de GATA-4, Irx4 y Nkx2.5.

E17. El método de alguna de las modalidades E8 a E15, en donde las células de la población celular que co-expresan CD49c y CD90 expresan más aún al menos un factor trófico seleccionado del grupo que consiste de: a) Factor Neurotrófico Derivado del Cerebro (BDNF) ; b) Cistatina-C; c) Interleucina- 6 (IL-6); d) Interleucina- 7 (IL-7) ; e) Interleucina-11 (IL-11) ; f ) Factor de Crecimiento Nervioso (NGF) ; g) Neurotrófina-3 (NT-3) ; h) Proteína Quimioatrayente de Macrófago-1 (MCP-1) i) Metaloproteinasa de la matriz-9 (MMP-9) ; j) Factor de células madre (SCF) ; y, k) Factor de Crecimiento Endotelial Vascular (VEGF) .

E18. El método de alguna de las modalidades E8 a E15, en donde las células de la población celular que coexpresan CD49c y CD90 expresan más aun p21 o p53, y en donde la expresión de p53 es una expresión relativa de hasta aproximadamente 3000 transcriptos de p53 por 106 transcriptos de un ARNr 18s y la expresión de p21 es una expresión relativa de hasta aproximadamente 20,000 transcriptos de p21 por 106 transcriptos de un ARNr 18s.

E19. El método de alguna de las modalidades E8 a E15, en donde la población celular aislada se cultivó in vitro a través de un número de duplicaciones de población seleccionadas del grupo que consiste de: a) al menos aproximadamente 15 duplicaciones de población; b) al menos aproximadamente 20 duplicaciones de población; c) al menos aproximadamente 25 duplicaciones de población; d) al menos aproximadamente 30 duplicaciones de población; e) al menos aproximadamente 35 duplicaciones de población; y, f) al menos aproximadamente 40 duplicaciones de población. ]20. El uso de una población celular aislada de acuerdo con alguna de las modalidades El a E7 en la fabricación de un medicamento para tratar un humano que padece una afección seleccionada del grupo que consiste de: a) una afección degenerativa; b) una afección de lesión aguda; c) una afección neurológica; y, d) una afección cardíaca.

E21. El uso de una población celular aislada de acuerdo con alguna de las modalidades El a E7 en la fabricación de un medicamento para tratar un ser humano que padece de una afección degenerativa o lesión aguda.

E22. Una población celular aislada derivada de médula ósea, en donde más de aproximadamente 91% de las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, y en donde la población celular tiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas en una condición de bajo oxígeno.

E23. La población celular aislada de la modalidad E22, en donde la población celular se deriva de la médula ósea humana E24. La población celular aislada de las modalidades E22 o E23, en donde la condición de bajo oxígeno es entre aproximadamente de 1 a 10 % de oxígeno.

[Oioo] E25. La población celular aislada de la modalidad E24, en donde la condición de bajo oxígeno es aproximadamente de 5% de oxígeno.

E26. La población celular aislada de alguna de las modalidades E22 a E25, en donde la población celular se cultiva como una población celular adherente a una densidad de siembra de menos de aproximadamente 2500 células/cm2.

E27. La población celular aislada de alguna de las modalidades E22 a E25, en donde la densidad de siembra es menos de aproximadamente 1000 células/cm2.

E28. La población celular aislada de alguna de las modalidades E22 a E25, en donde la densidad de siembra es menos de aproximadamente 100 células/cm2.] E29. La población celular aislada de alguna de las modalidades E22 a E25, en donde la densidad de siembra es menos de aproximadamente 50 células/cm2.

E30. La población celular aislada de alguna de las modalidades E22 a E25, en donde la densidad de siembra es menos de aproximadamente 30 células/cm2.

E31. Un método para preparar una población celular aislada, en donde más de aproximadamente 91% de las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, y en donde la población celular tiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas, que comprende las etapas de: a) aspirar las células de la médula ósea de un ser humano; b) lisar el componente de glóbulos rojos de la médula ósea aspirada c) sembrar las células no lisadas de la médula ósea en un dispositivo de cultivo de te ido; d) permitir adherirse a una superficie las células no lisadas de la médula ósea; e) cultivar las células adherentes en una condición de 5% de oxígeno, y f) pasar las células adherentes a una densidad de siembra de 30 células/cm2.

E32. Una población celular aislada obtenible por el método de la modalidad E31.

E33. - Una población celular aislada obtenida por el método de la modalidad E31.

E34. Un método para preparar una población celular aislada, en donde más de aproximadamente 91% de las células de la población celular co-expresan CD49c y CD90, y en donde la población celular tiene una velocidad de duplicación de menos de aproximadamente 30 horas después de 30 duplicaciones celulares , que comprende las etapas de : a) aspirar las células de la médula ósea de un ser humano ,- b) seleccionar una fuente fraccionada de la población celular mediante el paso a través de un gradiente de densidad; c) sembrar las células fraccionadas en un dispositivo de cultivo de tejido; d) permitir adherirse a una superficie las células fraccionadas ; e) cultivar las células adherentes en una condición de 5% de oxígeno; y f) pasar las células adherentes a una densidad de siembra de 30 células/cm2.

E35. Una población celular aislada obtenible por el método de la modalidad E34.

E36. Una población celular aislada obtenida por el método de la modalidad E34.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Bioactividad de Células Somáticas derivadas de médula ósea adulta: Producción de Medio Acondicionado Libre de Suero La producción de medio acondicionado libre de suero se produjo como se describe a continuación para el uso en ensayos, tal como captura por anticuerpo en fase sólida de de proteínas secretadas (también como se describe a continuación) . Las exAB -SC humanas (Lote # RECB-819; a -43 duplicaciones de la población) se descongelaron y resuspendieron en DMEM Avanzado (GIBCO™; Catálogo #12491-015, Lote# 1216032 (Invitrogen Corp. , Carlsbad, California, Estados Unidos) ) suplementado con 4mM de L-glutamina (Catálogo #SH30034.01. Lotett 134-7944, (HYCLONE™ Laboratories Inc., Logan, Utah Estados Unidos)) o HyQ® RPMI-1640 (HYCLONE™ Catálogo # SH30255.01, Lote # ARC25868) que contiene 4mM de L-glutamina y suplementado con insulina-transíerrina-selenio-A (ITS) (GIBCO™; Catálogo #51300-044, Lote # 1349264). Las suspensiones celulares se sembraron después en frascos de cultivo T-225cm2 CELLBIND™ (Corning Inc., NY, Estados Unidos) (superficies de cultivo tratadas con un proceso de plasma de microondas patentado; ver, patente de Estados Unidos núm. 6,617,152) (n = 3) a 20,000 células/cm2 en 36ml de medio (n = 3 por condición) . Los cultivos se colocaron en una incubadora humidificada trigas a 37°C (4% de 02, 5% de C02 equilibrada con nitrógeno) durante aproximadamente 24 horas. Los cultivos se realimentaron después con medio fresco en el mismo día para retirar los desechos no-adherentes y retornaron a la incubadora. El día 3, los medios de cultivo celular se concentraron usando Unidades de Filtro de de centrífuga de 20ml CENTRICON™ PLUS-20 (Millipore Corp., Billerica, MA, Estados Unidos) , según las instrucciones del fabricante. En resumen, los concentradores se centrifugaron durante 45 minutos a 114OxG. Los sobrenadantes concentrados se transfirieron a crioviales limpios de 2ml y almacenaron a -80° C. Los medios de cultivo frescos se concentraron además como se describió para el uso como control negativo. Las células se retiraron después de frascos usando 0.25% de tripsina porcina EDTA (CELLGRO™ ; Catálogo #30-004-Cl (Mediatech Inc., Herndon, Virginia, Estados Unidos)). La tripsina se neutralizó después volviendo a adicionar un volumen igual de medio de cultivo celular que contiene 10% de suero fetal bovino. El recuento y análisis de viabilidad celular se realizó usando un Analizador en serie AcT 10 COULTER™ (Beckman Coulter, Fullerton, Calfornia) y ensayos de exclusión por azul tripán respectivamente.

Para realizar SDS-PAGE 2D, las ABM-SC humanas (Lote # PCH627; a ~27 duplicaciones de la población ) se descongelaron y resuspendieron en Medio Esencial Mínimo HyQ® (MEM) , Modificación Alfa (HYCLONE™; Catálogo # SH30265.01, Lote # ASA28110) suplementado con 4mM de L-glutamina (HYCLONE™; Catálogo # SH30034.01, Lote # 134-7944) ) o RPMI1640 (HYCLONE™; Catálogo # SH30255.01) suplementado con 4mM de L-glutamina (HYCLONE™; Catálogo # SH30034.01, Lote # 134-7944) . Las suspensiones celulares se sembraron después en frascos de cultivo T-225cm2 CELLBIND™ (n = 3) a 24-40,000 células/cm2 en 36ml de medio (n = 3 por condición) . Los cutivos se colocaron en una incubadora humidificada trigas a 37°C (4% de 02, 5% de C02, equilibrada con nitrógeno) durante aproximadamente 24 horas. Los cultivos se realimentaron con medio fresco en el mismo día para retirar los desechos no-adherentes y retornaron a la incubadora. Al siguiente día, los medios acondicionados se recogieron, mezclaron y centrifugaron a 1140xG durante 15 minutos para retirar los desechos celulares, y transferir después a tubos de centrífuga estériles para el almacenamiento a corto plazo a -80°C.

Ejemplo 2 Separación por SDS PAGE Bidimensional (2-D) de los factores secretados (Figura 1) Las alícuotas congeladas de medios acondicionados y medios control (muestras) se enviaron a Kendrick Labs, Inc. (Madison, WI) para el análisis. Antes de usar, las muestras se descongelaron y calentaron a temperatura ambiente. Aproximadamente 50ml de cada muestra se liofilizó y después se redisolvió en 200 microlitros de tampón SDS de ebullición (5% de dodecil sulfato, 5% de beta mercaptoetanol , 10% de glicerol y 60mM de Tris, pH 6.8) y 2 mi de agua ultrapura. Las muestras se dializaron después contra 5 mM de Tris, pH 7.0 durante dos días a 4°C usando membranas de 6-8,000 MWCO. La diálisis final se realizó usando solamente agua. Las muestras se liofilizaron otra vez, redisolvieron en 200 microlitros de tampón SDS de ebullición, y calentaron en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos antes de cargar en los geles.

La electrofolresis en gel bidimensional se realizó de acuerdo con el método de O'Farrell (O'Farrell, P.H., J. Biol .

Chem. 250: 4007-4021, 1975) como sigue: El enfoque isoeléctrico se llevó a cabo primero en tubos de vidrio de diámetro interior de 2.0 mm usando 2.0% de anfolinas, pH 3.5-10 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) por 20,000 volt-horas. 50ng de estándar interno de IEF (tropomiosina) se adicionó después a cada muestra. El estándar tropomiosina se usa como un punto de referencia en el gel, migra cómo un doblete con una mancha inferior de polipéptido de MW 33,000 y pl 5.2. El gradiente de pH en el tubo con gel para este conjunto de anfolinas se determinó usando un electrodo de pH de superficie.

Después del equilibrio durante 10 minutos en tampón 0 (10% de glicerol, 50 mm de ditiotreitol , 2.3% de SDS, 0.0625 M de tris, pH 6.8) cada tubo con gel se selló con la parte superior de un gel de apilamiento que, se le coloca en la parte superior de un gel en bloque de poliacrilamida al 12% (1.0 mm de espesor) . La electroforesis SDS con gel en bloque se llevó a cabo durante aproximadamente 5 horas a 25mA. Las siguientes proteínas (Sigma Chemical Co.) se adicionaron como estándares de peso molecular a un pocilio único en la porción de agarosá del gel (la agarosa se funde entre el gel del tubo con el gel del bloque): miosina (220,000 daltons) , fosforilasa A (94,000 daltons), catalasa (60,000 daltons), actina (43,000 daltons), anhidrasa carbónica (29,000 daltons) , y lisozima (14,000 daltons) . A continuación la tinción con plata de los estándares aparece como bandas en el borde básico del gel en bloque de acrilamida (Oakley y otros. Anal. Biochem 105:361-363, 1980). El gel se secó después entre dos hojas de papel celofán con el extremo cido a la izquierda. (Figura 1) . Si los geles se pretenden usar con análisis de espectrometría de masas se tiñen usando el método de tinte con plata de O'Connell y Stults (O'Connell y Stults. Electroforesis . 18:349-359, 1997).

Los resultados muestran que usando los métodos proporcionados, las ABM-SC humanas se pueden cultivar en ausencia de suero animal para producir medios acondicionados ricos en proteínas secretadas, y que dichas proteínas se pueden identificar y aislar individualmente. Los medios acondicionados producidos en tal caso se pueden procesar también, como alternativa, fraccionando las proteínas expresadas en función de un intervalo de pesos moleculares. Las técnicas para la concentración y fraccionamiento de proteína se conocen bien y se usan rutinariamente por las personas de habilidad ordinaria en la industria. Estas técnicas incluyen técnicas tales como cromatografía de afinidad, filtración por fibra hueca, 2D PAGE, y ultrafiltración de baja absorción.

Ejemplo 3A Secreción de Citocina Pro-Regenerativa por ABM-SC Humana Las ABM-SC humanas se sembraron en frascos "T" de cultivo celular triplicados a 6,000 células viables/cm2 que contienen medio AFG104. Después de permitir que las células se adhirieran y equilibraran durante 24 horas, el medio de cultivo se cambió completamente y los frascos se incubaron durante 72 horas. El medio se recogió, centrifugó y almacenó a -80° C hasta el análisis de citocinas usando estuches de ensayos ELISA colorimétricos disponibles en el comercio. Para el análisis de liberación de las citocinas secretadas, frascos idénticos se trataron con 10 mg/ml de TNF-alfa, adicionados durante las últimas 24 horas de la incubación de 72 horas. Para cada lote, se prepararon tres frascos de células y sobrenadante, procesaron y depositaron independientemente para las condiciones basal y estimuladas, designadas como Frasco Basal A, B y C o Frasco Estimulado A, B y C, respectivamente.

Los resultados muestran que cuando se sub-cultiva, ABM-SC secreta concentraciones potencialmente terapéuticas de varios factores de crecimiento y citocinas conocidas por aumentar la angiogénesis , inflamación y curación de la herida. Ver la Figura 11. Por lo tanto, ABM-SC demostró secretar consistentemente in vitro varias citocinas y factores de crecimiento; que incluyen factores proangiogénicos (por ejemplo, SDF-l alfa, VEGF, ENA-78 y angiogenina) , inmunomoduladores (por ejemplo, IL-6 e IL-8) e inhibidores de la cicatriz/moduladores de la curación de la herida (por ejemplo, MMP-1, MMP-2, MMP-13 y Activina-A) . Además, la liberación de varios de esos factores se modula por el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) , una citoquina inflamatoria conocida liberada durante el curso de la lesión aguda del tejido.

Ejemplo 3B Captura en Fase sólida e Identificación de factores secretados (Tablas 1A, IB y 1C) Los medios acondicionados se tamizaron para la presencia de diversas proteínas tales como citocinas, proteasas, y receptores solubles por matriz de proteínas para la captura de anticuerpo en fase sólida, usando la matriz de anticuerpo para citocina humana RAYBIO™ (RayBiotech, Inc., Norcross, GA, Estados Unidos) . En resumen, las alícuotas congeladas de medios acondicionados se descongelaron y calentaron a temperatura ambiente antes de usar. Las membranas de la matriz se colocaron en los pocilios de una bandeja de ocho pocilios (serie C 1000) . A cada pocilio se adicionó 2 mi de tampón de bloqueo IX (RayBiotech, Inc.) y se incubó después a temperatura ambiente durante 30 minutos para bloquear las membranas . El tampón de bloqueo se decantó después de cada envase, y las membranas se incubaron después con medios acondicionados (diluido 1:10 con tampón de bloqueo) a temperatura ambiente por 1 h. Los medios de cultivos frescos se usaron como controles negativos en lugar de PBS . Las muestras se decantaron después de cada envase y lavaron 3 veces con 2 mi de Tampón I de lavado IX (RayBiotech, Inc.) a temperatura ambiente, mientras se agita por 5 minutos. Las membranas de la matriz se colocaron después en un pocilio, con 1 mi de anticuerpo secundario conjugado con biotina preparado en tampón de bloqueo IX, e incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Las matrices se lavaron después varias veces con tampón de lavado. 2 mi de estreptavidina conjugada con HRP diluida 1:1000 con tampón de bloqueo IX se adicionó a cada membrana e incubó después a temperatura ambiente durante 2 horas . Las membranas se lavaron después varias veces con tampón de lavado IX. Los reactivos para la quimiluminiscencia se prepararon según instrucciones del fabricante (RayBiotech, Inc.) y aplicaron a cada membrana e incubaron a temperatura ambiente durante 2 minutos. Las membranas se colocaron después con la proteína hacia arriba en una lámina plástica. El opuesto de la membrana se cubrió después con otra pieza de lámina plástica. Las burbujas de aire se eliminaron de las membranas por alisado afuera del plástico. Las membranas se expusieron después a una película de rayos X (película Kodak X-OMAT AR™) y procesaron después usando un revelador de película.

La Tabla 1A, IB y 1C muestra una lista extensa de citocinas, factores de crecimiento, receptores solubles, y proteasas de matriz secretadas por ABM-SC humana cuando se sub-cultiva en medios de cultivo celular libres de suero. Concentrado #1 de sobrenadante de medios = DME Avanzado (Gibco™) suplementado con 4mM de L-glutamina. Concentrado #2 de sobrenadante de medios = RPMI-1640 que contiene 4mM de L-glutamina y HEPES (HyClone) suplementado con Insulina-Transferrina-selenio-A (Gibco™) .

Los resultados demuestran que numerosos factores tróficos y receptores solubles importantes para la regeneración de tejido y modulación del sistema inmune se producen por ABM-SC cuando se cultivan en estas condiciones. En particular, los experimentos anteriores demostraron que la suplementación del medio de cultivo base con insulina, transferrina y selenio se necesitó para lograr niveles de proteína secretada, tal como los indicados en las Tablas 1A, IB y 1C. Los niveles de proteína se muestran en las Tablas 1A, IB y 1C se evaluaron usando una matriz de anticuerpo para citoquina humana RAYBIO™ (RayBiotech, Inc.). Los valores se expresan como densidades ópticas medias (O.D.) . (N=2 para las muestras prueba. N=4 para los controles.) Los valores reportados con un (+ ) indican valores medios de O.D. para ese analito particular mayor que dos desviaciones estándares por encima de los valores medios de O.D. del control negativo respectivo. Los valores reportados con un (-) representan valores medios de O.D. para ese analito particular que no son mayores que dos desviaciones estándares por encima de los valores medios de O.D. del control negativo respectivo .

Tabla 1A: Tabla IB: Ejemplo 4 Bioactividad de Células Somáticas Humanas Derivadas de la Médula Ósea adulta: Neurogénesis In Vitro Mejorada por los Factores Secretados Una solución concentrada de colágeno se preparó primero resuspendiendo colágeno de cola de rata (Sigma Chemical) en 0.1N de ácido acético a una concentración final de 3. Omg/tnl . El medio basado en colágeno se preparó después como se describió por Bell y otros, Proc . Nati Acad Sci., Estados Unidos, volumen 76, núm. 3, páginas 1274-1278 (marzo 1979) con modificaciones; menores como se describe en la presente invención. En resumen, el medio con colágeno se preparó mezclando la solución de colágeno de cola de rata con DMEM 5X (JRH Biosciences) suplementado con 5mM de L-glutamina (CELLGRO™) , solución antibiótico-Antimicótico ( CELLGRO™) , y una solución tampón (0.05N de NaOH (Sigma Chemical), 2.2% de NaHC03 (Sigma Chemical) , y 60mM de HEPES (JRH Biosciences) en una relación de 4.7:2.0:3.3. Aproximadamente 500 microlitros de la suspensión celular con colágeno se adicionó a cada pocilio de un placa de cultivo celular de 24 pocilios. Las placas de 24 pocilios se colocaron después en una incubadora humidificada trigas a 37°C (4% de 02, 5% de C02, equilibrada con nitrógeno) durante 1 hora para permitir solidificar la solución de colágeno. PC-12 de rata congelada se descongelaron, lavaron en RPMI-1640 suplementado con 4raM de L-glutamina y HEPES (HYCLONE™) suplementado con Insulina-Transferrina-Selenio-A (GIBCO™) y centrifugaron a 350xg durante 5 minutos a 25 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en la misma solución a una concentración de 75,000 células viables/ml, con y sin 136ng/ml de beta-NGF de rata (D-NGF) (Sigma Chemical), dilución 1:50 de un medio RPMI-1640/ITS no acondicionado concentrado (usado como un control negativo), y una dilución 1:50 de medio RPMI-1640/Insulina-Transíerrina-selenio-A (ITS) acondicionado concentrado (el medio se acondicionó como se describió en el Ejemplo 1; los medios control negativo acondicionados y no condicionados, se concentraron como se describió en el Ejemplo 1) . A continuación, 1 mi de suspensión celular se dispensó uniformemente sobre la superficie de cada uno de 2 geles (1 mi de gel) para cada cohorte y se verificó después por microscopía de contraste de fase. Las placas se colocaron a continuación en una incubadora humidificada trigas a 37°C (4% de 02, 5% de C02, equilibrada con nitrógeno) . El medio de cultivo agotado se reemplazó cada 3 días con medio fresco. Las imágenes se capturaron el día 10. Ver la Figura 2 Estos resultados demuestran que la diferenciación de PC12 en neuronas por NGF se aumenta dramáticamente cuando se supleraenta con medios acondicionados producidos por ABM-SC humana. Es interesante que el grado de la diferenciación neural, como se evaluó por el número de axones y neuritas en el cultivo, no fue significativo cuando se adicionó medio acondicionado sólo. Mientras que alguna ramificación de las neuritas se observó en presencia de NGF solo, suplementar los cultivos con medio acondicionado aumentó drásticamente tanto el número como longitud de las neuritas. El trabajo previo en nuestro laboratorio mostró que suplementar los medios de cultivo RPMI con insulina, transferrina y selenio fue crítico para la diferenciación neural de PC12 en todas las condiciones probadas estándares experimentales publicadas. Estos datos indican que los medios acondicionados por ABM-SC humanas contienen componentes que suplementan o inducen la ramificación de neuritas en y por encima de los niveles obtenidos con medio RPMI/ITS sólo o con medio RPMI/ITS que contiene NGF. Ver la Figura 2.

Ejemplo 5 Bioactividad de Células Somáticas Derivadas de médula ósea adulta: Inhibición de la proliferación in vi tro de células T inducida por mitógenos Las ABM-SC humanas (Lote # RECB801 a ~ 18 duplicaciones de la población) y exABM-SC (RECB906 a ~ 43 duplicaciones de la población) , se sembraron en frascos de 75cm2 a una concentración de 6000 células viables/cm2 en medio completo (Medio-Mínimo Esencial alfa (HYCLONE™) suplementado con 4 mM de glutamina y 10% de suero fetal bovino, gamma- irradiado del lote seleccionado (HYCLONE™) e incubaron a 37°C en una incubadora humidificada trigas (4% de 02, 5% de C02, equilibrada con nitrógeno) . Después de 24 h, el medio agotado se aspiró y reemplazó con 15 mi de medio fresco. Las células madre mesenquimales humanas (hMSC, catálogo PT2501, Lote # 6F3837, obtenidas de Cambrex Research Bioproducts; ahora propiedad del Grupo Lonza Ltd. , Basilea, Suiza) se sembraron en frascos de 75 cm2 a una concentración de 6000 células viables/cm2 en 15ml de Medio de Crecimiento de Células Madre Mesenquimales (MSCGM™; Grupo Lonza Ltd. , Basilea, Suiza) e incubaron a 37°C en una incubadora humidificada con 02 atmosférico y 5% de C02. Después de 24 h, el medio agotado se aspiró y reemplazó con 15 mi de MSCGM ™ fresco. Tanto ABM-SC humana (hABM-SC) como hMSC se cosecharon después de 96 horas de cultivo. Las hABM -SC y hMSC cosechadas se sembraron en placas de 96 pocilios de fondo redondo a una concentración de 25,000 células viables/ml en medio RPMI-completo (HYCLONE™) . Las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) se marcaron con 1.25 microM Succinimidil Ester de Carboxifluoresceína (CFSE) y se cultivaron a 250,000 células/pocilio en medio RPMI-completo junto con hMSC, Lote # RECB801, hABM-SC Lote # RECB906 o sólo para estimular la proliferación de células T, los cultivos se inocularon con 2.5 ó 10 microgramos/ml de Fitohemaglutinina (Sigma Chemical) . Las células se recogieron después de 72 horas más tarde y se tiñeron con el anticuerpo CD3-PC7 (Beckman Coulter) , según instrucciones del fabricante, y analizaron en un citómetro Beckman FC 500, usando el programa FlowJo 8.0 (Tree Star, Inc., Ashland, Oregón) . Las células CD3+ se analizaron por el índice de división. Ver la Figura 3.

Estos hallazgos demuestran que exABM-SC posee la capacidad de inhibir la activación y proliferación de las células T y, por lo tanto, puede ser útil como terapéutico para suprimir el rechazo de injerto mediado por las células T, trastornos autoinmunes que involucran la desregulación de las células T, o para inducir un estado de tolerancia inmune a un producto diferente inmunogénico para la piel. Así, se puede prever el uso de exABM-SC humana alogénica o composiciones producidas por dichas células, para tratar pacientes con quemaduras en espera de la aplicación quirúrgica de un producto alogénico para la piel. En dicha modalidad, tratar una herida abierta primero con exABM-SC, o composiciones producidas por dichas células, puede actuar no sólo para ayudar a reconstruir el lecho de herida incitando las células huéspedes a migrar al sitio de la lesión, sino proporcionar además un ambiente permisivo para el injerto a largo plazo de piel alogénica o sustitutos de la piel.

Ejemplo 6 Reconstitución de ABM-SC porcino en el vehículo acuoso para la administración In Vivo ABM-SC porcinas se sembraron a 60 células/cm2, se realimentaron en el día 4, y crecieron durante un total de 6 días. Las células se recogieron y congelaron hasta su uso posterior. Las alícuotas congeladas de ABM-SC porcinas se descongelaron, lavaron en DPBSG (solución salina regulada con fosfato de Dulbecco (CELLGRO™) ) suplementado con 4.5% de glucosa) y centrifugaron a 350xg durante 5 minutos a 25 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en DPBSG a una concentración de aproximadamente 50 , 000/microlitros . Los recuentos celulares y ensayos de viabilidad se realizaron usando un analizador en serie AcT 10 COULTER™ (Beckman Coulter, Fullerton, CA) y mediante exclusión por azul tripán, respectivamente. La suspensión celular se cargó después en una jeringa de tuberculina de 1 ce.

Ejemplo 7 Bioactividad de Células Somáticas Derivadas de Médula ósea adulta: Tratamiento de Heridas Incisionales con ABM-SC alogénica porcina Dos cerdos de Yucatán, que pesan entre 57 kg y 78 kg se anestesiaron y se prepararon para la cirugía aséptica. Cuatro heridas incisionales que miden aproximadamente 50 mm de longitud se hicieron con una hoja de bisturí sobre ambos lados de dos animales (Núms. 3 y 4) para un total de ocho heridas por animal a lo largo del área de la piel paravertebral y torácica. El sangrado se detuvo insertando gasa estéril empapada con epinefrina en el sitio de la lesión. La gasa se retira después de aproximadamente 10-20 minutos y cada herida se trató con una dosis única de ABM-SC porcino, dividida en 12 inyecciones separadas uniformemente espaciadas alrededor de la incisión con unos 10-300 microlitros adicionales aplicado al propio lecho de la herida. Las heridas control se inyectaron de manera similar con sólo el vehículo (DPBSG) . Las heridas se cerraron después con Steri-Strips™ (3 ) y los animales se cubrieron con chaquetas de aluminio protectoras. Las chaquetas se chequearon varias veces cada día para asegurar la posición estable y apropiada. Los apositos de las heridas se supervisaron diariamente y se fotografiaron los cambios en los días 0, 1, 3, 5 y 7. Los animales se sacrificaron en el día 7 para la histopatología. Las secciones de tejido embebidas en parafina fijada en formalina se prepararon y tiñeron por H&E . La puntuación histomorfométrica se condujo por un patólogo veterinario experto a ciegas para el grupo de tratamiento .

Siete dias a continuación del tratamiento de las heridas, las lesiones tratadas con ABM-SC porcina alogénica no muestran casi ningún signo de cicatriz visible de (Figura 4) mientras que aquellos tratados con vehículo exhiben signos visibles de cicatrización. El análisis histomorfométrico de las heridas mostró marcada reducción en los macrófagos de tejido (histiocitos) en aquellos tratados con ABM-SC, mientras que no se observó diferencia significativa en ninguna de las otras puntuaciones histológicas evaluadas.

Cuando las secciones de tejido similares se anotaron por el grado de re-epitelización (un indicador bruto de la velocidad de curación de la herida) , aquellas tratadas con ABM-SC exhibieron un aumento marcado en la cantidad de células epiteliales repoblando el sitio de las incisiones (Figura 5) .

Ejemplo 8 Bioactividad de ABM-SC humanas en el vehículo de colágeno para la administración in vivo como agente terapéutico líquido, semi-sólido o de tipo sólido (Figura 6-9) Cuando se reconstituyó en un vehículo biodegradable basado en colágeno y se almacenó a 4°C, ABM-SC humanas (Lote # PCH610; ~ 27 duplicaciones de la población) mantienen la viabilidad celular alta durante al menos 24 horas (como se demuestra por la bioactividad celular en los ensayos de contracción de gel) . La solución de colágeno almacenada de esta forma se mantiene como un líquido y preservará las células en un estado suspendido sin pérdida significativa de viabilidad (Figura 6) . La bioactividad de las células se puede evaluar después usando un ensayo in vivo de reparación de la herida. Para llevar a cabo este ensayo, una solución concentrada de colágeno se preparó primero resuspendiendo colágeno de cola de rata (Sigma Chemical) en 0.1 N de ácido acético a una concentración final de 3.0 mg/ml. El medio con colágeno se preparó como se describió por Bell y otros (Proc. Nati Acad Sci., Estados Unidos, volumen 76, núm. 3, páginas 1274-1278 (marzo 1979)) con modificaciones menores como se describe en la presente invención. En resumen, el medio colágeno se preparó mezclando la solución de colágeno de cola de rata con DMEM 5X (JRH Biosciences) suplementado con 5mM de L-glutamina (CELLGRO™) , solución Antibiótico-Antimicótico (CELLGRO™ ; Catálogo #30-004-Cl) , y una solución tampón (0.05N de NaOH (Sigma Chemical), 2.2% de NaHC03 (Sigma Chemical) , y 60mM de HEPES (JRH Biosciences) en una relación de 4.7:2.0:3.3. Las células somáticas humanas de médula ósea adulta congeladas (hABM-SC) se descongelaron, lavaron en DMEM IX y centrifugaron a 350xg durante 5 minutos a 25 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en DMEM IX a concentración de aproximadamente 72,000 células totales/microlitros . Cincuenta microlitros de suspensión celular se adicionó después a 2 mi de medio con colágeno y se trituró suavemente (es decir, pipeteó suavemente arriba y abajo para obtener una suspensión homogénea de células en medio con colágeno) , produciendo una concentración final de células de aproximadamente 1,800 células/microlitros . La suspensión celular se almacenó después aproximadamente a 4-8 °C durante toda la noche. Al día siguiente, la suspensión líquida de células se transfirió del tubo cónico de 15 mi y dispensó en placas de 24 pocilios de cultivo celular aproximadamente a 500 microlitros/pocillo . Las placas se colocaron después en una incubadora trigas humidificada a 37°C (4% de 02, 5% de C02, equilibrada con nitrógeno) durante 1 hora para permitir que el colágeno solidificara en un gel semi- sólido. Los geles se retiraron después de las placas de 24 pocilios usando espátulas desechables estériles (VWR) y transfirieron a placas de cultivo de 12 pocilios Los geles se dejaron flotar después en 1.0 mi de DMEM IX por pocilio. Para los controles negativos, los geles se prepararon como se describió pero sin células. Tres pocilios se sembraron para cada condición (n=3) .

Para evaluar el grado en que la contracción de gel es dosis-dependiente, un ensayo similar se llevó a cabo en donde las exABM-SC humanas (Lote # RECB819 ; a ~ 43 duplicaciones de la población) se reconstituyeron en solución de colágeno a concentraciones diferentes de células inmediatamente después de la retirada del crioalmacenamiento . (Figura 7) . Una solución concentrada de colágeno se preparó primero resuspendiendo el colágeno de cola de rata (Sigma Chemical) en 0.1N de ácido acético a una concentración final de 3. Omg/ml . El medio de colágeno se preparó después como se describió por Bell y otros (1979) con modificaciones menores como se describe en la presente invención. En resumen, el medio colágeno se preparó mezclando la solución de colágeno de cola de rata con DMEM 5X (JRH Biosciences) suplementado con 5mM de L-glutamina ( CELLGRO™ ) , solución de antibiótico-antimicótico (Cellgro™) , y una solución tampón (0.05N de NaOH (Sigma Chemical) , 2.2% de NaHC03 (Sigma Chemical), y 60mM de HEPES (JRH Biosciences)) en una relación de 4.7:2.0:3.3. Las células somáticas humanas de médula ósea adulta congeladas (hABM-SC) se descongelaron, se lavaron en DMEM IX y centrifugaron a 350xg durante 5 minutos a 25 °C. Los sedimentos celulares se resuspendieron en DMEM IX en la concentración de aproximadamente 40,000, 80,000 y 200,000 células viables/microlitros . Cincuenta microlitros de suspensión celular se adicionó después a 2 mi de medio con colágeno y suavemente trituró. Aproximadamente 500micrdlitros de la suspensión de células con colágeno se adicionó a cada pocilio de una placa de cultivo de 24 pocilios. Las placas se colocaron después en una incubadora humidificada trigas a 37°C (4% de 02, 5% de C02 equilibrada con nitrógeno) durante 1 hora para permitir solidificar la solución de colágeno. Los geles se retiraron después de las placas usando espátulas desechables estériles (VWR) y transfirieron a placas de cultivo de 12 pocilios. Los geles se dejaron flotar después en 1.0 mi de DMEM IX por pocilio.

Como control negativo, los geles se prepararon como se describió anteriormente usando la concentración más alta de hABM-SC (5xl06/ml) excepto aquellas células que se inactivaron con calor (para eliminar la actividad biológica) . Las células inactivadas con calor se prepararon primero por calentamiento de la suspensión celular inicial en medio DMEM IX a 70 °C en un bloque térmico que contiene agua (transferencia de calor) durante 40 minutos. Tres pocilios se sembraron para cada condición (n=3) .

Para determinar el grado en que los geles se contraen con el tiempo, el porcentaje inicial o área de superficie de partida se calculó a partir de las imágenes digitales captadas a 0, 24, 48 y 72 horas usando un escáner dé cama plana. Para cada imagen, el diámetro del gel se midió tanto horizontalmente como verticalmente y después se promedió. Los resultados demuestran que tanto la velocidad como el grado de contracción de gel se efectuó de una manera dependiente de la dosis (Figura 7) .

Para determinar los niveles de determinadas proteínas secretadas producidas a partir de la ABM-SC humana en estos geles semisólidos, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) se realizó (en el día 3 de cultivo) en sobrenadantes de cultivo celular acondicionados recogidos de los medios líquidos que rodea los geles (Figura 8) . Los sobrenadantes se transíerieron a tubos estériles cónicos de 15 mi y se centrifugaron a 114 Oxg durante 15 minutos para eliminar los desechos celulares. Los sobrenadantes se transfirieron después a crioviales de 2 mi y se transfirieron a -80°C para almacenamiento a corto plazo. En el día del ensayo, los sobrenadantes se descongelaron y equilibraron a temperatura ambiente antes del uso. El análisis ELISA se realizó para detectar IL-6, VEGF, Activina-A, pro-MMP-1 y MMP-2 por ELISA (realizado según instrucciones del fabricante, todos los estuches se compraron de R&D Systems, Inc. (Minneapolis , MN, Estados Unidos)). Los resultados demuestran que los niveles terapéuticamente significativos de factores tróficos se pueden producir por estos neotejidos semi- sólidos y que estos niveles se pueden controlar ajustando la concentración celular. De los factores tróficos medidos, no se observaron niveles detectables en los cultivos que contienen sólo células inactivadas con calor. Las comparaciones estadísticas entre las condiciones de ensayo se determinaron por ANOVA unidireccional (*** p < 0.001) .

Las AB -SC humanas se pueden reconstituir también en una solución de colágeno para construir una estructura semi-sólida de gran formato que se puede usar como terapéutico tópico (Figura 9) . Para construir dicha estructura, una solución concentrada de colágeno se preparó primero resuspendiendo colágeno de cola de rata (Sigma Chemical) en 0.1N de ácido acético a una concentración final de 3. Omg/ml . El medio con colágeno acuoso se preparó mezclando la solución de colágeno de cola de rata con DMEM 5X (JRH Biosciences) suplementado con 5 mM de L-glutamina (CELLGRO™) , Solución antibiótico-Antimicótico (CELLGRO™) , y una solución tampón (0.286N de NaOH (Sigma Chemical), 1.1% de NaHC03 (Sigma Chemical) , y lOOmM de HEPES (JRH Biosciences) en una relación 6:2:2. Las hABM-SC congeladas se descongelaron y lavaron en DMEM IX y se centrifugaron después a 350xg durante 5 minutos a 25 °C. El sedimento celular se resuspendió en DMEM IX a una concentración de aproximadamente 90,000 células/microlitros . Aproximadamente 1.1 mi de la suspensión celular se adicionó después a 20 mi de medio con colágeno y suavemente se trituró para lograr una concentración final de células de 5 x 106 células/ml. La concentración final de colágeno fue 1.8mg/ml . La suspensión celular se dispensó después en una placa Petri de 10 cm (formación de placa) . La dosis eficaz de células en la solución de colágeno dispensado fue aproximadamente de 100 x 106 células viables. La placa formadora de 10 cm que contiene la suspensión celular se colocó después en una incubadora humidificada a 37 °C (5% de CO 2 ) durante 1 hora que permite solificar la solución de colágeno. El gel semi-sólido se retiró cuidadosamente después de la placa formadora de 10 cm y transfirió a una placa Petri de 15 cm (placa de cultivo) y se fotografió.

Para construir un neotejido tipo sólido derivado de ABM-SC humanas y colágeno, la estructura semi-sólida descrita anteriormente se puede colocar de nuevo en una incubadora de cultivo celular humidificada a 37°C (5% de C02) durante 2 días adicionales (Figura 10) . Para formar un neotejido de tipo sólido, un gel semi- sólido preparado como se describió anteriormente, con la excepción que la solución de colágeno final fue 1.4 mg/ml (en vez de 1.8 mg/mL) , se desprendió cuidadosamente de los bordes de la placa formadora de 10 cm y se dejó flotar en aproximadamente 82ml de DMEM IX que contiene la solución de Antibiótico-Antimicótico (CELLGRO™) en una placa de cultivo de 15 cm. El gel semi -sólido se transfirió después a una incubadora humidificada a 37 °C (5% de C02) durante unas 48 horas adicionales para facilitar la remodelación de la matriz en una estructura de tejido de tipo sólido, libre del sustrato de colágeno de partida. El neotej ido de tipo sólido se eliminó después de la placa de cultivo de 15 cm y fotografió. (Figuras 10A y 10B) . El análisis histológico del neotej ido por tinción con Tricrómico de Masson demuestra que la matriz es rica en colágenos y proteoglicanos humanos recién sintetizados. (Figura 10C) . Los geles control de colágeno no se tiñen por este método. Los colágenos y proteoglicanos se tiñen azul.

Los resultados de estos estudios indican que las madres ABM-SC congeladas se pueden dispensar en deshielo y reconstituir en un medio líquido basado en colágeno que se puede usar terapéuticamente como una suspensión líquida, constructo semi -sólido o neotej ido similar a sólido. Cuando se prepara de esa manera y almacena aproximadamente a 4- 10°C, la suspensión celular se mantiene como líquido mientras que mantiene la viabilidad celular satisfactoria durante más de 24 horas. Emplear dicho método para formular ABM-SC en la aplicación clínica proporciona después libertad considerable al médico que administra las células. La suspensión se puede administrar como un líquido inyectable o, como alternativa, se puede aplicar tópicamente a un lecho de herida. En este último caso, la suspensión celular líquida se puede anticipar para moldearse en el contorno de la herida y solidificar después en una estructura semi-sólida (por ejemplo, cuando se calienta a ~ 37 grados C) . Como alternativa, la suspensión se puede usar de tal manera como para fabricar constructos semi-sólidos o neotej idos de tipo sólido .

Estos datos muestran además que cuando se preparan por los métodos, las composiciones resultantes poseen cada una bioactividad importante para mediar la reparación de diversos tipos de heridas, particularmente aquellas que involucran la piel .

ExCF-SC (por ejemplo, exABM-SC) , o composiciones producidas por dichas células, preparadas en un medio líquido basado en colágeno por lo tanto, se pueden usar tópicamente para tratar heridas abiertas o como una alternativa inyectable a los rellenos dérmicos para el rejuvenecimiento facial En la forma semi-sólida, exCF-SC (por ejemplo, exABM-SC) o composiciones producidas por dichas células, se pueden usar tópicamente para tratar pacientes con quemaduras severas que quirúrgicamente se les retiró la piel de espesor completo dañada, actuando de ese modo como un reemplazo dérmico.

Los neotejidos sólidos producidos por exCF-SC (por ejemplo, exABM-SC) se pueden usar quirúrgicamente como una alternativa de la piel de cadáver humano (AlloDerm (ALLODERM™) , piel porcina ( PE MACOL™) y otros constructos derivados de animales (INTEGRA™) . Además, estos datos muestran además que la potencia de cada uno de estos diversos constructos se puede controlar alterando la dosis de células o composiciones producidas por las células.

Ejemplo 9 Mejoría de la Función Cardíaca en Ratas Tratadas con hABM-SC La administración de ABM-SC humanas para animales a continuación del infarto de miocardio demuestra que CF-SC (tal como ABM-SC) mejora la función cardiaca y mejoran la reparación del daño al tejido cardíaco estimulando la angiogénesis y reduciendo la fibrosis. Ver la Figura 15. Un modelo de rata para el infarto agudo de miocardio se utilizó por la oclusión de una arteria coronaria creando de ese modo una lesión cardíaca (es decir, región dañada del corazón) . Las ratas lesionadas se inyectaron intercardialmente ya sea con hABM-SC o vehículo.

Métodos de Función Cardíaca: Ratas Sprague-Dawley de ambos sexos (edad aproximada 3 meses) recibieron infarto de miocardio experimentalmente inducido a través de la colocación permanente de una ligadura de seda alrededor de la arteria coronaria izquierda descendente anterior (LAD) a través de una esternotomía mediana. Cinco días después de este procedimiento, las ratas se iniciaron en un régimen estándar de tratamiento con ciclosporina A que duró por la duración del estudio. En el día 7-8 a continuación del infarto, las ratas se anestesiaron, intubaron y una incisión intercostal se hizo para exponer el ápice de corazón. Un catéter ultrasónico Millar se insertó después a través de la pared ventricular, y las mediciones de presión en el tiempo se registraron durante un período de aproximadamente 30-60 segundos. Este modelo de producción del infarto y mediciones presión/tiempo de la función cardíaca es un modelo estándar, bien caracterizado por el cual se pueden evaluar los efectos de las terapias celulares en la función cardiaca (Ver por ejemplo, Müller-Ehmsen, y otros, Circulation. , 105 (14) : 1720-6 (2002) ) .

La composición de prueba se entregó usando una jeringa Hamilton de 100 microlitros equipada con una aguja de calibre 30 con poco espacio muerto. Cinco inyecciones separadas de 20 microlitros se realizaron en el curso de 2-3 minutos. Cuatro inyecciones se realizaron a distancias iguales alrededor del infarto visualizado, mientras que la quinta se colocó directamente en el centro de la región infartada, como se determinó por el área de decoloración. Después de la inyección, la incisión se suturó cerrada, el neumotorax se redujo, y los animales se quitaron del respirador y extubaron. Cuatro semanas después de la inyección (5 semanas post- infarto) , los animales se reanestesiaron, se expuso el corazón a través de una esternotomía mediana, e se insertó un catéter Millar. Las mediciones Dp/dt se tomaron como se describió anteriormente, después de que las ratas se sacrificaron mediante exsanguinación.

Resultados de la función del corazón (Figura 13) : Cuatro semanas después del tratamiento, las ratas que reciben ABM-SC demostraron valores +dp/dt significativamente superiores (pico de velocidad positiva de cambio de presión) (A) . Los cambios que se expresan en la función cardiaca durante el curso del estudio restando los valores +dp/dt de la semana 0 de los valores de la semana 4 ("delta +dp/dt") demostraron que mientras las ratas tratadas con vehículo tuvieron disminuciones en la función cardiaca durante el curso del estudio (delta negativo) , los animales tratados con cualquiera de las preparaciones celulares mostraron mejoría significativa en la función cardiaca (B) . En comparación con las ratas tratadas con vehículo, aquellas que reciben ABM-SC demostraron valores tau (C) significativamente inferiores, lo que sugiere una capacitancia aumentada del ventrículo izquierdo. Tau es la constante de tiempo del decaimiento isovolumétrico de la presión ventricular izquierda. Para la velocidad del pico negativo de cambio de presión (-dp/dt) , que expresa los cambios en la función cardíaca durante el curso del estudio restando los valores -dp/dt de la semana 0 de los valores de la semana 4 ("delta -dp/dt") demostraron que mientras las ratas tratadas con vehículo tuvieron disminuciones en la función cardiaca durante el curso del estudio (delta negativo) , los animales tratados con la preparación celular mostraron una mejoría significativa en la función cardíaca (D) [*p<0.05, **p<0.01 por ANOVA] Métodos de la Estructura del Corazón: Ratas sprague-Dawley recibieron infarto de miocardio inducido experimentalmente a través de la colocación de una ligadura de seda permanente alrededor de la arteria coronaria izquierda descendente anterior (LAD) . Los animales que recibieron un régimen estándar de tratamiento con Ciclosporina A (10 mg/kg subcutáneo diario) que duró por la duración del estudio.

En el día 7-8 a continuación del infarto, las ratas se anestesiaron, intubaron y una incisión intercostal sé hizo para exponer el ápice de corazón. Se accedió a la función cardiaca después de que el artículo de prueba se entregó usando una jeringa Hamilton de 100 microlitros equipada con una aguja de calibre 30 con poco espacio muerto. Cinco inyecciones separadas de 20 microlitros se realizaron en el curso de 2-3 minutos. Cuatro inyecciones se realizaron a distancias iguales alrededor del infarto visualizado, mientras que la quinta se colocó directamente en el centro de la región infartada, como se determinó por el área de decoloración. Después de la inyección, la incisión se suturó cerrada, el neumotorax se redujo, y los animales se quitaron del respirador y extubaron. Cuatro semanas después de la inyección (5 semanas post-infarto) , los animales se reanestesiaron, se expuso el corazón a través de una esternotomía mediana, y se accedió a la función cardiaca. Después de que las medidas funcionales se completaron las ratas se sacrificaron mediante exanguinación . Las ratas se anestesiaron profundamente usando primero una mezcla de ketamina (75mg/kg) y medetomidina (0.5mg/kg). La cavidad torácica se expuso quirúrgicamente después y el corazón se disecó y fijó por inmersión en 10% de formalina tamponada neutra. Los corazones después se seccionaron groseramente en tres piezas, orientaron en moldes de inclusión, y procesaron para incluir en parafina. Los tejidos de corazón se seccionaron después en 6 µta y tiñeron con Hematoxilina & Eosina (H&E) o Tricómico de Masson. Al menos seis secciones de cada corazón se tiñeron además con hematoxilina/eosina y tricrómico respectivamente. Específicamente, la tinción tricrómica permite la visualización de colágeno (azul) versus tejido muscular (rojo) . Dado que el colágeno indica la presencia de tejido en la cicatriz (ausencia de regeneración) , se determinaron las relaciones de colágeno en el músculo cardíaco normal. Una escala de puntuación semicuantitativa se ideó, con 0 como colágeno no detectable y 5 como máximo/ severo . Las secciones teñidas se enviaron después a un consejo de patólogos certificados para la puntuación histomorfométrica .

Cada portaobjetos contuvo tres secciones transversales del corazón, lo que demuestra una vista en sección transversal de ambos ventrículos a partir del área ventricular media (1) 1/3 distal del ventrículo (2) , y ápice del ventrículo (3) . Para los análisis histomorfométricos , se usó el siguiente esquema de clasificación: Ubicación del daño del tejido: Ventrículo izquierdo (LV) , Ventrículo derecho (LV) , Ambos ventrículos (BV) .

Porcentaje del ventrículo afectado dañado (tamaño de la lesión) : Dado en porcentaje (0 - 100%) Puntuación para el espesor del área del ventrículo experimentalmente dañada: dado en grado de 1-4 basado en el espesor estimado en milímetros. En comparación con puntos de referencia conocidos en las secciones de tejidos (por ejemplo el eritrocito promedio es de 7 mieras de diámetro; el haz muscular medio de miocardio es de 30 mieras de diámetro) . Grado 1 (menos de .5mm) ; Grado 2 ( .5mm a lmm) ; Grado 3 (lmm a 1.5mm) ; Grado 4 (1.5 mm +) .

La neovascularización en el área de daño tisular: (Grado de 0 a 4 , de normal (0) a la neovascularización en toda el área del daño tisular inicial (4) .

Daño vascular inicial: Incluye degeneración/necrosis de los vasos sanguíneos preexistentes, con trombosis y/o inflamación que resulta de la eliminación de los desechos vasculares restantes, expresado como un grado de 0 a 4, donde 0 es sin daño vascular presente, y 4 es el daño vascular en toda el área afectada.

Grado de la fibrosis en el área de daño tisular: Expresado como un grado de 0 a 4 , desde no fibrosis (0) hasta (4) en niveles de 20% de graduación de fibrosis y cicatrización del área inicial de los daños causados por el procedimiento de infarto. Por ejemplo, la fibrosis del 20% del ventrículo se le puede asignar un grado de (1) , y fibrosis del 40% del ventrículo se le puede asignar un grado de (2) , 60% puede recibir un (3) , y por encima de 60% puede recibir un (4) .

Resultados de la Estructura del corazón-. Las ratas se sacrificaron y el tejido cardíaco se seccionó y tiñó posteriormente. Un consejo de patólogos certificados realizó la puntuación semicuantitativa (Figura 15) para evaluar los cambios en el tamaño del infarto en los corazones de ratas que reciben vehículo o ABMSC siete días después del infarto del miocardio. El análisis histopatologico indicó una reducción significativa en el tamaño del infarto en las ratas que reciben hABM- SC en comparación con el vehículo. De acuerdo con una escala predefinida, las ratas que reciben hABM- SC tuvieron puntuaciones histológicas aproximadamente dos puntos más bajos que los controles del vehículo La Figura 14 muestra un ejemplo de reducción del tamaño típico del infarto. El análisis histopatologico determinó que hABM-SC rediajo la fibrosis y aumentó la vascularización en la zona del infarto (Figura 15) , consistente con la actividad pro-regenerativa. Así, se observó que las ratas tratadas con hABM-SC mostraron una mejoría dramática de la estructura del tejido cardiaco. Ver la Figura 14 y 15.

Ejemplo 10 Células Somáticas derivadas de Médula ósea adulta suprimen las respuestas inmunes mediadas Parte I:. Supresión de la proliferación de células T inducida por mitógenos en un ensayo MLR de una vía (reacción mixta de linfocitos) .

Métodos: ABM-SC y exABM-SC Humanas (Lote # RECB801 y RECB906, respectivamente) , se sembraron en frascos de 75cm2 a una concentración de 6000 células viables/cm2 en ISml de medio completo tal como DMEM Avanzado (GIBCO™; Catálogo #12491-015, Lote # 1216032 (Invitrogen Corp., Carlsbad, California, Estados Unidos) ) suplementado con 4mM de L-glutamina (Catálogo #SH30034.01. Lote # 134-7944, (HYCLONE™ Laboratories Inc., Logan, Utah, Estados Unidos)) o HyQ®; RPMI-1640 (HYCLONE™ Catálogo # SH30255.01, Lote # ARC25868) que contiene 4mM de L-glutamina y suplementado con Insülina-Transferrina-Selenio-A (ITS) (GIBCO™; Catálogo #51300-044, Lote # 1349264) e incubaron a 37°C en una incubadora humidificada trigas (4% de 02, 5% de C02, equilibrada con initrógeno) . Después de 24 horas, el medio agotado se aspiró y reemplazó con 15ml de medio fresco. Las células madre mesenquimales humanas (hMSC) (Lonza BioScience, anteriormente Cambrex Bioscience Catálogo # PT2501, Lote # 6F3837) se sembraron en frascos de 75 cm2 a una concentración de 6000 células viables/cm2 en 15ml de MSCGM™ (Lonza BioScience) e incubaron a 37°C en una incubadora humidificada a 02 atmosférico y 5% de C02. Después de 24 horas, el medio agotado se aspiró y reemplazó con 15 mi de MSCGM ™ fresco. Tanto hABM-SC como hMSC se cosecharon después de 96 horas en cultivo. Las hABM-SC y hMSC cosechadas se sembraron en placas de fondo redondo de 96 pocilios a una concentración de 25,000 células viables/ml en medio completo RPMI (Hyclone) . Las células humanas mononucleares de sangre periférica (PBMC) se marcaron con 1.25uM Succinimidil Ester de Carboxifluoresceína (CFSE) y cultivaron a 250,000 células/pocilio en medio RPMI-completo junto con hMSC, RECB801, RECB906 o solo . Para estimular la proliferación de células T, los cultivos se inocularon con 2.5 o 10 microgramos/ml de Fitohemaglutinina (Sigma Chemical) . Las células se cosecharon después de 72 horas más tarde y tiñeron con el anticuerpo CD3-PC7 (Beckman Coulter) , según las instrucciones del fabricante, y analizaron en un Citómetro Beckman FC 500, usando el programa Flow Jo. Solo se analizaron las células CD3+ clasificadas por el índice de división .

Resultados: ABM-SC y exABM-SC humanas alogénicas suprimen la proliferación de células T inducida por mitógenos en ensayo MLR unidireccional. Ver la Figura 16.

Parte II: ABM-SC porcinas alogénicas fallan a la respuesta inmune ilícita mediada por células T en un ensayo de reto MLR de 2 -vías .

Métodos: Sangre completa porcina se recogió para los inmunoensayos en el día 0 (antes del tratamiento) y en la necropsia (Día 3 o el Día 30 post-tratamiento) para el análisis de la respuesta inmune celular. PBMC de cada animal se cultivaron con pABM-SC, el mitógeno ConA, o medio solo. Las muestras se analizaron por citometría de flujo, y la cantidad de proliferación se calculó usando el programa FlowJo .

Las muestras de sangre completa se diluyeron 1:1 con DPBS (PBS de Dulbecco) -2% de suero porcino. La sangre diluida se recubrió sobre Ficoll (relación 2:1 de sangre diluida con Ficoll) y centrifugó a 350xG durante 30 minutos, con un ciclo de centrifugación que termina frenando con cero. La capa superior resultante se aspiró. Las capas intermedias, que contienen las células mononucleares deseadas, se mezclaron para cada muestra, y lavaron 3 veces con DPBS-2% de suero porcino. Después de lavar, el sedimento se resuspendió en 20 mi de tampón de lisis ACK e incubó durante 3 minutos, para eliminar los glóbulos rojos residuales, se centrifugó después durante 5 minutos, a 250xG. Los sedimentos se lavaron en 20 mi de DPBS-2% de suero porcino y se resuspendieron en 5 mi de medio RPMI completo (RPMI- 1640, 10% de suero porcino, 2 mM de L-glut, 20 mM de HEPES, 0.1 mM de NEAA, IX Penicilina-Streptomicina) . Las células se congelaron a una concentración de 20xl06 células/ml por centrifugación, y resuspensión en medio de congelación helado (10% de DMSO en suero porcino) e inmediatamente se adicionó a crioviales de 2 mi y colocaron en un congelador de velocidad programada. (velocidad de congelación= -25°C/min a -40 °C, +15°C/min a -12.0°C, -l°C/min a -40°C, -10°C/min a -120°C) . Las células se almacenaron en alícuotas de 2 mi por vial en fase de vapor de nitrógeno líquido hasta el uso.

E]n el día 0, las pABM-SC se sembraron en placas de cultivo de 96 pocilios a una concentración de 10,000 células/pocilio en medios AFG-104 de acuerdo con el estudio patrón para cada condición de prueba. Las placas se incubaron toda la noche a 37 °C en una incubadora humidificada con bajo 02 (4-5%) , ~5% de C02 equilibrada con nitrógeno.

Al día siguiente, las PBMC se marcaron con CFSE (Succinimidil Ester de Carboxifluoresceína) . En resumen, los viales de PBMC se descongelaron en baño de agua a 37°C, se lavaron con 10 mi de medio RPMI-Completo las células se centrifugaron a 300xg, y resuspendieron en DPBS Las concentraciones de células se ajustaron a lOxlO6 células/ml e incubaron con CFSE a una concentración final de 0.625mM durante 5 minutos. Las células se lavaron inmediatamente en 40 mi DPBS/5% de suero porcino helado y centrifugaron 10 minutos a 300xG. Las células se lavaron de nuevo en 25 mi de DPBS/5% de suero porcino y como antes se centrifugaron. Las células se lavaron una tercera y última vez en 10 mi de medio RPMI-completo. Las concentraciones celulares se ajustaron hasta una concentración final de 5xl06 células/ml. PBMC marcadas se adicionaron a la placa de ensayo de acuerdo con el patrón de estudio como sigue: el medio AFG-104 se aspiró y reemplazó con lOOmicrolitros de medio RPMI completo. 100 microlitros de medio RPMI-completo se adicionó a los pocilios no estimulados, lOOmicrolitros de medio con 20 microgramos/ml de ConA en medio RPMI-completo se adicionó a los pocilios estimulados, y 4.5% de Glucosa-medio RPMI-completo a las células vehículo. 500,000 PBMC marcadas se sembraron por pocilio en placas de 96 pocilios de acuerdo con el patrón de estudio. Las placas se incubaron durante 5 días a 37°C, 02 atmosférico (alto 02) , con humedad, 5% de C02 sin nitrógeno. Todas las condiciones se completaron en triplicado para cada muestra de sangre recibida. La estimulación con vehículo se completó para un subconjunto de muestras de sangre, pero no fue significativamente diferente que la media sola. Después de 5 días de co-cultivo, las células se cosecharon por citometría de flujo transfiriendo las células de la placa de 96 pocilios a un tubo de flujo. La tinción indirecta se realizó de acuerdo con protocolos estándares. El anticuerpo primario usado fue anticuerpo monoclonal anti-CD3 Pig de ratón conjugado con biotina; seguido por exposición al reactivo secundario Estreptavidina-PE-Cy7. Las células se resuspendieron en 200 microlitros de tampón de lavado de flujo y se analizaron en un dispositivo Coulter FC500.

Resultados: Un índice división se calculó para las muestras recogidas al inicio y a los 3 y 30 días posttratamiento y retó in vitro después con medio, vehículo, pABM-SC o ConA. El índice de división promedio de todos los animales en el día 3 o día 30 para las células CD3+ estimuladas con ConA fue significativamente mayor que el índice de división para las células CD3+ del vehículo y animales tratados con pABM-SC en el pre-tratamiento y en la necropsia (*p < 0.05) . ver la Figura 17.

Ejemplo 11 Desarrollo Clínico Un estudio Fase 1, de dosis creciente, de etiqueta abierta, se acometió para evaluar la seguridad de una dosis escaladora única de hAB -SC administrada por inyección endomiocárdica a los cohortes adultos de 30-60 días a continuación del infarto de miocardio agudo inicial. El objetivo primario de este estudio fue investigar la seguridad y factibilidad de dosis escaladoras únicas de hABM-SC entregados a través de múltiples inyecciones endomiocárdicas usando el catéter MYOSTAR ™, guiadas por el sistema electromecánico de mapeo cardíaco NOGA™ o NOGA XP™. Un objetivo secundario fue investigar la eficacia preliminar de las dosis escaladoras únicas de hABM-SC, medida por el volumen ventricular izquierdo, dimensión, tamaño del infarto de miocardio y tensión.

El protocolo de estudio establece que los sujetos de prueba se deben seguir durante 12 meses con supervisión frecuente para la seguridad. Las evaluaciones de eficacia se deben realizar en visitas a los 90 días y seis meses las de seguimiento. La población del estudio pretendida es mayores de edad de 30 a 75 años con un infarto agudo de miocardio (AMI) en los 30 días anteriores que se trataron exitosamente con revascularización percutánea restaurando TIMI II o el flujo superior, con una fracción de eyección ventricular izquierda de más de o igual a 30%, según se midió por imágenes de perfusión miocárdica (SPECT) .

Criterios de inclusión y Exclusión: Los criterios de inclusión para el estudio comprenden: (1) 30-75 años de edad (incluido) ; (2) 30-60 días desde AMI (definido como el MI más reciente que causa una duplicación en las concentraciones de la enzima troponina I (cTnl) específica a la función cardiaca relativas a los niveles normales, además de los cambios en el ECG consistentes con MI con confirmación por imágenes de perfusión miocárdica [SPECT] ) ; (3) revascularización percutánea exitosa para restaurar TIMI II o flujo mayor al área infartada; (4) prueba de embarazo negativa (hCG en suero) en mujeres de edad fértil potencial (dentro de 24 horas antes de la dosificación) , (5) fracción de eyección ventricular izquierda (LVEF) > 30% medido por imágenes de perfusión miocárdica (SPECT) , (6) pruebas de enzimas cardíacas (CPK, CPK MB, cTnl) dentro del intervalo normal en los valores iniciales; (7) deben ser ambulatorios Los criterios de exclusión para el estudio comprenden: (1) estenosis significativa de la arteria coronaria que puede requerir revascularización percutánea o quirúrgica dentro de los seis meses de inscripción, (2) trombo (móvil o mural) del ventrículo izquierdo (LV) , (3) alta bloqueo auriculoventricular de alto grado (AVB) , (4) taquicardia ventricular frecuente, recurrente, sostenida (>30 segundos) o no-sostenida > 48 horas después de AMI; (5) alteraciones electrocardiográficas clínicamente significativas que pueden interferir con la seguridad del sujeto durante el mapeo intracardíaco y procedimiento de inyección, (6) fibrilación auricular con frecuencia cardíaca no controlada, (7) enfermedad valvular severa (por ejemplo, estenosis aórtica, estenosis mitral, insuficiencia valvular severa que requiere un reemplazo de la válvula) , (8) historia del reemplazo de las válvulas del corazón, (9) miocardiopatía idiopática, (10) enfermedad vascular periférica severa, (11) enzimas hepáticas (aspartato aminotransferasa [AST] /alanina aminotransferasa [ALT] ) > 3 veces el límite superior de la normalidad (ULN) ; (12) creatinina sérica > 2.0 mg/dL; (13) historia de cáncer activo en los tres años anteriores (con excepción del carcinoma de células básales) , (14) trasplante anterior de médula ósea; (15) infección conocida con el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) ; (16) pruebas de infección concurrente o sepsis en la radiografía de tórax (CXR) o hemocultivo; (17) articipación en un ensayo clínico experimental en los 30 días anteriores a la inscripción; (18) abuso de alcohol o drogas recreativas en los seis meses antes de la inscripción; (19) procedimiento quirúrgico mayor o traumatismo mayor dentro de los 14 días antes de la inscripción; (20) enfermedad autoinmune conocida (por ejemplo, lupus eritematoso sistémico [SLE] , esclerosis múltiple) , ( 21) elevaciones clínicamente significativas en protrombina (PT) o tiempo parcial de tromboplastina (PTT) relativo a as normas de laboratorio; (22) trombocitopenia (recuento de plaquetas < 50 , 000/mm3 ) ; (23) diabetes mellitus tipo I o tipo II controlada inadecuadamente, que se define como un cambio en el régimen de medicación antidiabética en los 3 meses antes o HbAlc > 7.0%; (24) hipertensión no controlada se define como una presión arterial sistólica (SBP) > 180 mmHg y/o presión arterial diastólica (DBP) >100 mmHg; (25) uso de fármacos ionotróficos > 24 horas post A I; (26) otras afecciones comórbidas, tales como la inestabilidad hemodinámica, arritmias inestables, y la intubación, lo que, en opinión del investigador principal, pueden poner los sujetos en riesgo indebido o interferir con los objetivos del estudio, (27) cualquier otra enfermedad importante, que, en opinión del investigador principal, pueden interferir con la capacidad del sujeto para cumplir con el protocolo, seguridad comprometida del sujeto, o interferir con la interpretación de los resultados del estudio, y, (28) contraindicación (ya sea alergia o función renal dañada) para la inyección con medio de contraste para las evaluaciones de exploración CT adecuadas.

Estudio de la dosis y administración del fármaco: Los sujetos del mismo cohorte se dosifican no más cerca de tres días de diferencia, y la dosificación de los cohortes sucesivos se separan por aproximadamente cuatro semanas, a continuación de la revisión de los datos de seguridad de al menos tres semanas en todos los sujetos en la cohorte anterior Cohortes Dosis Cohorte 1 30 x 106 células Cohorte 2 100 x 106 células Cohorte 3 300 x 106 células Cohorte 4 300 x 106 células o MTD En el día de la dosificación, después de que las evaluaciones de los valores iniciales se completan e inmediatamente a continuación del mapeo ventricular percutáneo con el sistema de mapeo electromecánico NOGA™ o NOGA XP™ (Biosense Webster, Diamond Bar, California) , inyecciones secuenciales múltiples de hABM-SC se administran directamente en el miocardio a partir de un acceso del LV percutáneo, usando un catéter MYOSTAR™ Procedimientos de Estudio: Los sujetos potenciales se aprobarán y tamizarán en los 21 días antes de la administración planeada de hABM-SC, que debe ocurrir en los 30-60 días a continuación del IAM. Los procedimientos de tamizaje para determinar la elegibilidad se usan además como valores del inicio, a menos que los SOP del hospital requieran pruebas adicionales (es decir, inmediatamente antes de la cateterización) . Las pruebas de los valores iniciales para la eficacia del tratamiento deben consistir de una prueba de caminata de seis minutos, clasificación NYHA, análisis de sangre para la concentración del péptido natriurético tipo B (BNP) , ecocardiografía, cateterización cardíaca derecha e izquierda, imágenes de perfusión miocárdica (SPECT) y mapeo electromecánico NOGA™ o NOGA XP™ . En el día de la admisión, se hacen pruebas adicionales de sangre para los valores iniciales (incluyendo prueba del embarazo [hCG en suero] para sujetos femeninos de edad fértil potencial) , y se verifica la elegibilidad. En el día de la dosificación (Día 0 del estudio), los sujetos se someten a mapeo cardíaco electromecánico NOGA™ o NOGA XP™ y se coloca un catéter MYOSTAR™ en el ventrículo izquierdo. La dosis de hABM-SC se administra a través de inyecciones múltiples endomiocárdicas secuenciales en el tejido miocárdico dañado (definido por NOGA™ o NOGA XP™) . Después de la administración de hABM-SC, el ecocardiograma se realiza para detectar una posible perforación transmural, y el sujeto se admite directamente a la unidad de cuidados intensivos (ICU) por un mínimo de veinticuatro horas de observación con supervisión telemétrica cardiaca continua. Los sujetos estables sin complicaciones se dan de alta de la ICU a una unidad de etapa inferior (con monitorización cardíaca) y después se dan de alta a casa no antes de 72 horas después del procedimiento de dosificación. Los sujetos con complicaciones permanecen en la ICU bajo manejo médico óptimo hasta que se estabilice y sea adecuado dar el alta a la unidad de etapa inferior. Las evaluaciones de seguridad se realizan a los 7, 14, 21, 60 y 90 días y a los seis y doce meses a continuación de la administración de hABM-SC. Las evaluaciones de eficacia se realizan a los 90 días y seis meses después del procedimiento, e incluyen el volumen ventricular izquierdo, dimensión, tamaño del infarto de miocardio y tensión, medidos respectivamente por ecocardiografía de contraste mejorado, reperfusión de miocardio y análisis de viabilidad (SPECT) , cateterización cardíaca derecha e izquierda (90 días solamente), prueba de caminata de seis minutos, clasificación NYHA, y mapeo electromecánico NOGA™ o NOGA XP™ (90 días solamente) .

Los términos de seguridad en el estudio incluyen: (1) eventos adversos que se detallan en el protocolo del estudio, (2) cambios clínicamente significativos a partir de los valores iniciales en la sangre o componentes de sangre, incluyendo CBC, CMP, CPK/CPK MB, cTnl, PT/PTT, y análisis de anticuerpos HLA; (3) cambios clínicamente significativos desde el inicio de la actividad eléctrica cardíaca, evaluado por el electrocardiograma (ECG) o la telemetría cardiaca, (4) cambios clínicamente significativos a partir de los valores iniciales en la actividad eléctrica cardíaca según se evaluó por supervisión Holter 24 horas; (5) perforación miocárdica perioperatoria según se evaluó por ecocardiograma (post procedimiento) y, (6) cambios clínicamente significativos a partir de los valores iniciales en el estado físico y mental, según se evaluó por el examen físico, que incluye un examen neurológico focalizado. Si los signos y síntomas consistentes con el accidente cerebrovascular (ataque cardíaco) se observan, una consulta neurológica se debe obtener para una evaluación adicional.

Términos de Eficacia : Los términos de eficacia que se supervisan comprenden: (1) volumen sistólico final y/o diastólico final en comparación con los valores iniciales, según se midió por imágenes de perfusión miocárdica (SPECT) ; (2) tamaño del infarto de miocardio en comparación con los valores iniciales, según se midió por imágenes de perfusión miocárdica (SPECT); (3) dimensiones sistólica final y/o diastólica final en comparación con los valores iniciales según se midió por ecocardiografía 2-D de contraste mejorado; (4) amplitud de la acción de la tensión potencial en el área del miocardio inyectado con hABM-SC en comparación con los controles de los valores iniciales e históricos (proporcionados por el laboratorio central) según se midió por mapeo electromecánico NOGA™ o NOGAXP™; (5) gradientes de presión y gasto cardíaco en comparación con los valores iniciales según se determinó por cateterización cardíaca derecha e izquierda; (6) calidad de vida en comparación con los valores iniciales según se evaluó por la prueba de caminata de seis minutos; y, (7) clase funcional de la enfermedad cardiovascular (esquema de clasificación funcional NYHA) en comparación con los valores iniciales según se evaluó por el médico que realiza los exámenes físicos programados .

Entrega endomiocárdica de hABM-SC: hABM-SC se entrega al miocardio a través de inyección directa guiada por catéter dentro de la cámara ventricular. La entrega endomiocárdica de hABM-SC se logra con la ayuda del Sistema de Navegación Cardiaca NOGA™ (uno de los sistemas más avanzados para la visualización tridimensional de las propiedades físicas, mecánicas y eléctricas del miocardio intacto ín vivo; de Biosense-Webster, Diamond Bar, California) . La inyección presente se realiza con el catéter/MYOSTAR Cordis™. El sistema NOGA™ permite la visualización en tiempo real de la función del ventrículo izquierdo del corazón, detección del daño al tejido cardíaco, observación y colocación de la punta del catéter. Dada la afección tenue cardiaca de los pacientes post-AMI, un sistema de liberación relativamente no invasivo (en comparación con la entrega directa intracardiaca o a corazón abierto) , es decir, catéter de inyección MYOSTAR™ usado junto con el sistema de mapeo NOGA™, se seleccionó para la administración de hABM-SC.

Resutados Preliminares : Los resultados preliminares de 5 pacientes se obtuvieron. Los primeros 3 pacientes comprendieron el grupo de dosis inicial (30 millones de células) , mientras que los dos últimos pacientes recibieron la dosis escaladora segunda (100 millones de células) . En general, hABM-SC se toleró bien en todos los pacientes, con algunas tendencias a mejorar en la función cardíaca observada en varios pacientes.. Resultados más detallados se discuten a continuación.

Hallazgos de seguridad: Ninguna evidencia se encontró de respuesta inmune alogénica (según se midió por el perfil de anticuerpo pre-y post-tratamiento) en algunos pacientes.

Evaluaciones Cardiacas Funcionales : Mapeo Electromecánico NOGA: El mapeo funcional se realiza en el tiempo de tratamiento y a los 90 días después del tratamiento celular. Los mapas de tensión unipolares representativos se obtuvieron del segundo paciente en el cohorte de la primera dosis. Un déficit de la tensión claro puede ser visto en el área del infarto (datos no mostrados) . Quince inyecciones de células se realizaron en el margen del infarto usando la tensión unipolar como una guía. A los 90 días de seguimiento, una clara mejoría en la tensión unipolar puede ser vista, con voltajes cerca de los normales que prevalecen en la zona de infarto. Grados similares de mejoría en la tensión se observaron en los pacientes 1, 3 y 4 (datos no mostrados) .

Imagimática. de Perfusión miocárdica (SPECT) : La imagimática de perfusión se realizó al inicio, 90 días y 6 meses después del tratamiento con células de acuerdo con métodos previamente publicados.

Todas las imágenes se capturaron y analizaron digitalmente . La fracción de eyección, tamaño del déficit de perfusión y volumen ventricular se derivan a partir de este análisis, en condiciones básales y de estrés con adenosina, junto con un rescaneo de 24 horas con lavado. Resultados de cada paciente a cada intervalo de tiempo se discuten a continuación.

Déficit de Perf sión-. En general, los tamaños del déficit de perfusión, se piensa que representan los tamaños totales del infarto, ya sea que disminuyen o permanecen sin cambios durante los seis meses de seguimiento en los pacientes tratados. Dos pacientes mostraron reducciones en el déficit considerado "clínicamente significativo", que significa los déficits resueltos para menos del 4-5% de la pared ventricular total. En ambos casos, las áreas de mejoría corresponden a las áreas de mejoría de la tensión según se midió por mapeo NOGA. Aunque el mapeo NOGA se considera de investigación, estos datos apoyan la validez de la hipótesis que la tensión unipolar puede ser un sustituto para la medición del tamaño del infarto.

Fracción de Eyección (EF) : En general, la fracción de eyección en los pacientes del estudio mejoraron o permanecieron relativamente sin cambios. Un paciente experimentó una caída significativa en EF general (63% a 50% en seis meses) , pero este paciente experimentó un evento adverso grave durante el curso del tratamiento con las células lo que hace cuestionable si o no una dosis completa de células se administró en realidad al endomiocardio . Dos pacientes demostraron aumentos en EF muy por encima de lo esperado para este grupo de pacientes. La falta de controles placebo excluye cualquier conclusiones en lo que se refiere al mecanismo de esta mejoría.

Volumen diastólico final (EDV) : EDV se midió al inicio y a los 90 días y 6 meses a continuación del tratamiento. En general, EDV se mantuvo sin cambios en todos los pacientes durante los 6 meses de período de seguimiento, sugiriendo que ocurrió remodelación no significativa en estos pacientes.

La Figura 18 muestra los cambios en el tamaño del déficit de perfusión fija cardíaca en tres pacientes mediante la comparación de las mediciones de los valores iniciales (BL) , con mediciones obtenidas a los 90 días post- tratamiento con hABM-SC. La Figura 19 muestra los cambios en las fracciones de eyección cardíaca medidos en tres pacientes mediante la comparación de las mediciones de los valores iniciales (BL) con las mediciones obtenidas a los 90 días post-tratamiento con hABM-SC.

Ejemplo 12 ABM-SC humanas y composiciones derivadas de ese modo, para la producción de Glóbulos rojos In Vi tro.

Se conoce bien que el microentorno de la médula ósea, proporciona la combinación requerida de moléculas de la matriz, factores de crecimiento y citoquinas necesarias para apoyar y modular la hematopoyesis (Dexter y otros. 1981) . La mayoría, si no todos, los factores tróficos conocidos por conducir la auto-renovación de las células hematopoyéticas y diferenciación restringida del linaje se derivan de las células de apoyo mesenquimales (Quesenberry y otros 1985) . Roecklein y Torok-Storb (1995) demostraron que, aún en una población relativamente pura de estas células, se pueden aislar las sub-poblaciones que apoyan diferencialmente la hematopoyesis. A diferencia de los clones inmortalizados descritos en estas publicaciones anteriores, las hABM-SC usadas como se describe en la presente invención representan una población pura de CD45 negativo, células de apoyo no hematopoyéticas CD90/CD49c co-positivas que secretan muchos factores importantes para inducir y mantener la eritropoyesis, que incluyen sin limitarse a, IL-6 (Ullrich y otros. 1989), LIF (Cory y otros. 1991), SDF-1 (Hodohara y otros 2000) , SCF (Dai y otros. 1991) , Activina-A (Shao y otros. 1992) , VEGF e IGF- II (Miharada y otros. 2006) (Figura 20) .

Para generar glóbulos rojos a partir de una población inicial de precursores hematopoyéticos (por ejemplo células madre embrionarias (ES) , células madre hematopoyéticas (HSC) , células de sangre de cordón (CBC) o precursores de eritroblastos comprometidos (BFU-E) ) , ABM-SC humanas y/o composiciones producidas por dichas células se pueden utilizar para inducir, mejorar y/o mantener la eritropoyesis mediante la entrega de un "cóctel" de factores eritropoyéticos necesarios para, o para suplementar, crecimiento y diferenciación de precursores hematopoyéticos en eritroblastos. Ver la Figura 20.

Ejemplo 13 Producción, Aislamiento, Purificación y Envasado de Composiciones y Factores Tróficos Derivados de Células Un bioproceso de dos etapas corriente abajo se desarrolló para fabricar, recoger y purificar composiciones tales como factores de crecimiento secretados, citocinas, receptores solubles y otras macromoléculas producidas por ABM-SC y exABM-SC humanas. Este cóctel de composiciones celulares secretadas, producido como tal en las relaciones estequiométricas creadas por las células, tiene un tremendo potencial como un terapéutico pro-regenerativo, reactivo de cultivo celular y/o herramienta de investigación para estudiar la regeneración tisular y celular in vitro. Dichas composiciones se pueden usar además como una alternativa a las propias células para apoyar el crecimiento y diferenciación apropiada con el linaje de poblaciones celulares progenitoras eritroides de partida en cultivos en suspensión.

Producción de Medio Acondicionado Libre de Suero ABM-SC humanas criopreservadas (Lote no. P25-T2S1F1-5) se descongelan y resuspenden en un litro de DMEM avanzado (Gibco, catálogo # 12491-015, lote 284174 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, Estados Unidos) ) suplementado con 4 mM de L- glutamina (Hyclone Laboratories Inc., Logan, Utah, Estados Unidos catálogo # SH30255.01).

Las células se siembran en una cámara diez CellSTACK® de poliestireno Corning® Cellbind® (número de catálogo 3312, (Corning Inc., NY, Estados Unidos)) a una densidad de 20,000 a 25,000 células por cm . Un puerto de la unidad de la cámara diez CellSTACK® se ajusta con un accesorio de llenado de la cámara de cultivo CellSTACK® (número de catálogo Corning® 3333, (Corning Inc., NY, Estados Unidos)), mientras que el otro puerto se ajusta con un accesorio de llenado de la cámara de cultivo celular CellSTACK® de 37 mm, filtro de 0.1DM (Corning® número de catálogo 3284, (Corning Inc., NY, Estados Unidos) ) .

Los cultivos se colocan en una incubadora a 37 °C ± 1°C y se airean con una mezcla de gases en sangre (5 ± 0.25% de C02, 4 + 0.25% de 02, equilibrada con nitrógeno (GTS, Allentown, PA) ) durante 5 ± 0.5 horas. Después de 24 ± 2 horas post siembra, el medio se eliminó, reemplazó con 1 litro de medio fresco y aireado como se describió previamente. Aproximadamente, 72 + 2 horas más tarde el medio acondicionado libre de suero se retiró asépticamente de la unidad de la cámara diez CellSTACK® dentro de un gabinete de seguridad biológica y se transfirió a un frasco PETG de un litro. El medio acondicionado libre de suero se procesa posteriormente mediante filtración por flujo tangencial.

Ais2a.Tue.nto y Purificación de Medio Acondicionado Libre de Sueiro La filtración de flujo tangencial (TFF) se realiza en un reservorio de medio acondicionado libre de suero, recuperado de una unidad de cámara diez CellSTACK®, como se describió anteriormente. Una fibra hueca de polisulfona con un peso molecular de corte de 100 kilodaltons (kD) (número de catálogo M1ABS-360-01P (Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Domínguez, CA, Estados Unidos)) se emplea. El reservorio del acondicionado libre de suero (el retenido) se recircula a través del lumen de la fibra hueca tangencial a la cara del lumen. Las moléculas con un peso molecular de 100 kD o menos pasan a través del lumen dentro de un frasco PETG de 2 litros; esta fracción se denomina el permeado o filtrado. El retenido se recircula continuamente hasta que el volumen se reduce a aproximadamente menos de 50 mi. El retenido posteriormente se descarta y el permeado se conserva para el procesamiento posterior. El permeado resultante (aproximadamente 1 litro) es una solución clara, libre de suero que contiene moléculas de peso molecular pequeño libres de los desechos celulares y macromoléculas más grandes, denominado en la presente invención como Fracción # 1.

La Fracción # 1 se somete posteriormente a TFF adicional usando una fibra hueca de polisulfona con un peso molecular de corte de 10 kilodaltons (kD) (número de catálogo M11S-360-01P (Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Domínguez, CA, Estados Unidos) . La Fracción #1 se usa posteriormente como el retenido y recircula a través del lumen de la fibra hueca, tangencial a la cara del lumen. Las moléculas más pequeñas = lOkD (es decir amoniaco, ácido láctico etc.) se dejan pasar a través del lumen. Después que el volumen del retenido se reduce a 100 mi, se comienza la diafiltración de la solución. Un litro de alfa-MEM sin rojo fenol (HYCLONE, número de catálogo RR11236.01 (Hyclone Laboratories Inc., Logan, UT, Estados Unidos) ) se adiciona al reservorio del retenido en la misma velocidad que el permeado se bombea hacia fuera; manteniendo así el volumen del reservorio constante. El retenido resultante contiene sólo moléculas pequeñas con intervalo en peso molecular desde 10 kD hasta 100 kD; denominado en la presente invención como Fracción # 2.

La Fracción # 2 se puede procesar adicionalmente sometiéndola a TFF adicional usando una fibra hueca de polisulfona con un peso molecular de corte de 50 kilodaltons (kD) (número de catálogo M15S-360-01P (Spectrum Laboratories, Inc., Rancho Domínguez, CA, Estados Unidos)). La Fracción # 2 se recircula así a través del lumen de la fibra hueca, tangencial a la cara del lumen. Las moléculas más pequeñas = 50kD se pasan a través del lumen. Ambas corrientes del procesamiento se conservan como producto. El permeado resultante/filtrado está compuesto principalmente de moléculas de 10 kD a 50 kD (Fracción # 3) , mientras que el retenido comprende macromoléculas en el intervalo de 50 kD a 100 kD (Fracción # 4) .

Cada una de las fracciones resultantes se congela en frascos de 60 mi PETG (número de catálogo 2019-0060, Nalgene Nunc International Rochester NY) .

Dichas fracciones de proteínas aisladas se pueden someter posteriormente a procesamiento y envasado adicional corriente abajo aséptico, en donde dichas composiciones se pueden dializar, liofilizar, y reconstituir en una matriz seca, biocompatible, tal como LYOSPHERES™ (fabricada por BIOLYPH™, Hopkins, Minnesota, Estados Unidos) .

Ejemplo 14 Aislamiento, crioconservación, y expansión de células sanguíneas de cordón (CBC) CD34+ La producción a gran escala células de linaje eritroides comprometidas (CFU-E o reticulocitos) se pueden fabricar de una población de partida de células madre o precursores de los eritroblastos (por ejemplo células sanguíneas de cordón, células madre embrionarias, células madre hemapoyéticas y BFU-E) empleando los métodos que se describen a continuación.

La sangre del cordón umbilical de recién nacidos a término sanos se recoge en bolsas de recolección de sangre heparinizada. Una preparación de células limpias nucleadas se elabora adicionando solución de lisis de cloruro de amonio a la sangre del cordón, centrifugando después la mezcla a 300Xg durante 15 minutos a temperatura ambiente. El sobrenadante se aspira del sedimento celular, y el sedimento celular se lava en BSSD con 5% de albúmina sérica humana (solución de lavado) . Las células se centrifugan de nuevo a 300Xg durante 15 minutos a temperatura ambiente y la solución de lavado se elimina del sedimento celular por aspiración. Las células CD34+ se separan mediante clasificación celular magnética usando columnas-LS ASC (MACS®; Miltenyi Biotech, Gladbach, Alemania) usando protocolos establecidos. Las CBC CD34+ se resuspenden posteriormente en CSM-55 a aproximadamente 2millones de células/ml y crioconservan usando un congelador de velocidad controlada.

BSSD (solución salina equilibrada con 4.5% de dextrosa) se prepara como sigue : Para solución salina equilibrada, a la solución estéril de irrigación (BSS; Baxter, Deerfield, IL, Estados Unidos) adicionar 450 ± 0.5 gramos de dextrosa (EMD Life Sciences, Gibbstown NJ Estados Unidos), QS a un volumen final de 10.0 litros con BSS.

CSM-55 (Medio de almacenamiento criogénico 5% de DMSO, 5% de HSA) se prepara como sigue: En un frasco de 2 litros combinar 1.4 litros de BSSD con 400 mi de 25% de HSA (25% solución albúmina sérica humana de ZLB Behring, IL, Estados Unidos) y 200 mi de 50% de DMSO (50% de sulfóxido de dimetilo de Edwards Lifesciences Irvine Ca Estados Unidos) .

La solución de lavado se prepara con 400 mi de BSSD más 100 mi de 25% de HSA.

Expansión de CBC CD34+ en cultivos en suspensión Las células se resuspenden posteriormente en StemSpan® H300 (StemCell Technology) suplementado con 1. OU/ml de EPO recombinante humano (R&D Systems, catálogo #287-TC) , 10 LY0SPHERES™/1, e inoculan en un BIOPROCESS CONTAINER™ (bioreactor) o equivalente desechable HYCLONE™, de perfusión, a una concentración de células de 1.0 x 106/ml . Los cultivos se mantienen a 37°C con 5% de C02, 4% de 02, y equilibrada con nitrógeno, durante 3 semanas usando flujo continuo de medio de cultivo fresco. El día 14, los cultivos se suplementan con el antagonista de glucocorticoide Mifepristona para acelerar la enucleación, según es descrito por Miharada y otros 2006. El flujo continuo de medio de cultivo fresco se mantiene a una velocidad fija en estas condiciones hasta cosechar el día 21.

Expansión de CBC en una capa de alimentación de ABM-SC humana Las ABM-SC humanas crioconservadas se descongelan y resuspenden en Medio RPMI avanzado 1640 ( I VITROGEN™) suplementado con 1. OU/ml EPO recombinante humano (R&D Systems, catálogo #287-TC) , 4mM de L-glutamina, 10% de suero fetal bovino gamma- irradiado (Hyclone) del lote seleccionado, y siembran a una densidad de 10,000 células/cm2 en 40 fábricas de cultivo de células en capa (Corning) y mantienen a 37°C en 5% de C02, 4% de 02, y equilibrada con nitrógeno a 37°C. El día 5, la mitad del volumen de medio agotado se elimina de los cultivos y se repone adicionando la mitad del volumen posterior de medio fresco junto con 1.0 x 106 CBC/ml . El flujo discontinuo (on-off-on) de medio de cultivo fresco se engrana posteriormente para permitir recircular las condiciones de medio entre fresco (on) a acondicionado (off ) , y volver al medio fresco de nuevo (on) . El día 14, los cultivos se suplementan con el antagonista de glucocorticoide Mifepristona para acelerar la enucleación, según descrito como anteriormente. Los co-cultivos se mantienen en estas condiciones hasta cosechar el día 21.

Ejemplo 15 ABM-SC secreta receptores de depuración y antagonistas y reduce los niveles del factor-alfa de necrosis tumoral en modo dosis-dependiente Antecedentes.- Las modalidades de la presente invención incluyen métodos y composiciones para tratar, reducir, o prevenir la actividad inmune adversa (tales como inflamación o actividad autoinmune) en un individuo entregando cantidades terapéuticamente eficaces de exABM-SC o composiciones producidas por exABM-SC. Las modalidades de la invención incluyen la utilización de exABM-SC, o composiciones producidas basándose así en la producción a nivel basal o de origen natural de las composiciones secretadas in vitro. Como alternativa, las modalidades de la invención incluyen también la utilización de exABM-SC, o composiciones producidas manipulando así la exABM-SC para modular (regular positiva o negativamente) la cantidad y tipo de composiciones producidas (por ejemplo, por la administración de factores pro-inflamatorios tal como TNF-alfa) .

Por ejemplo, recién se encontró que exABM-SC produce al menos un receptor de depuración para la citocina del factor-alfa de necrosis tumoral (TNF-a) , y al menos un antagonista del receptor de la interleucina- 1 (IL-1R) , y al menos una proteína de unión (antagonista) de la citocina interleucina- 18 (IL-18) . Como consecuencia, las modalidades de la invención incluyen métodos y composiciones para usar y administrar poblaciones de células estables (tal como exABM-SC) que secretan consistentemente proteínas terapéuticamente útiles en su forma nativa.

El término "población de células estables" como se usa en la presente descripción significa una población de células aisladas, cultivadas in vi tro, que cuando se introducen en un organismo mamífero vivo (tales como un ratón, rata, ser humano, perro, vaca, etc.) no resultan en la producción de células detectables que se diferenciaron en un nuevo tipo de célula o tipos de células (tal como una neurona(s), cardiomiocito (s) , osteocito (s) , hepatocito (s) , etc.) y en donde las células en la población de células continúan secretando, o mantienen la capacidad para secretar o la capacidad para que se induzca la secreción, niveles detectables de al menos una composición terapéuticamente útil (tales como receptor de TNF-alfa soluble, antagonistas IL-1R, antagonistas IL-18, composiciones que se muestran en la Tabla 1A, IB y 1C, etc.) .

Para los propósitos de la presente invención, "receptor de depuración" significará cualquier receptor soluble o secretado (ya sea unido a membrana o libre en el medio extracelular) capaz de unirse a y neutralizar su ligando análogo.

Además de los factores pro- inflamatorios anteriormente enumerados, considerando la presente descripción se entiende también que la población de células de la presente invención se puede tratar con cualquier número, variedad, combinación, y/o concentraciones variables de factores recién conocidos o descubiertos posteriormente o identificados para manipular la concentración y tipo de composiciones producidas por la población de células de la presente invención. Por ejemplo, la población de células de la invención preferentemente se puede tratar con factores tales como: IL-lalfa, IL-lbeta, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-23, TNF-alfa, TNF-beta, y Leptina. Esta lista resumida de factores preferidos, sin embargo, no pretende ni se debe interpretar como limitante con relación al número de composiciones diferentes que se pueden usar para tratar la población de células de la presente invención, ni que estas composiciones se limitan a las proteínas, tal como se apreciará también que muchos otros tipos de compuestos se pueden usar también para manipular la población de células de la presente invención (que incluyen, en forma de ejemplos resumidos, otras macromóleculas biológicas tales como ácidos nucleicos, lípidos, carbohidratos, etc. y pequeñas mol culas y productos químicos tales como dimetilsulfóxido (DMSO) y óxido nitroso (NO) , etc) .

Métodos: La producción de medio acondicionado libre de suero se produjo como se describe a continuación para usar en ensayos de inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) (que se describe también a continuación) . Las exABM-SC humanas crioconservadas (Lote # MFG-05-15; a -43 duplicaciones de la población) se descongelaron y resuspendieron en DMEM avanzado (GIBCO™; catálogo #12491-015, Lote # 1216032 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA Estados Unidos)) suplementado con 4mM de L-glutamina (catálogo #SH30034.01. Lote # 134-7944, (HYCLONE© Laboratories Inc., Logan, UT, Estados Unidos)) con o sin 10ng/ml de TNF-a. Las suspensiones celulares se sembraron después en frascos de T-225cm2 CELLBIND™ (Corning Inc., NY, Estados Unidos) (superficies de cultivo tratadas con un proceso de plasma de microondas patentado; ver, patente de los Estados unidos núm. 6,617,152) (n = 3) a 10,000, 20,000, 40,000 células/cm2 en 36ml de medio (n = 3 por condición). Las células inactivadas con calor sembradas a 40,000 células/cm2 se usaron como un control negativo. Las células se inactivaron con calor transfiriendo una alícuota a un tubo estéril e incubando durante -40 minutos en un 70°C bloque térmico que contiene agua (para la transferencia eficaz de calor) . Los cultivos se colocaron en una incubadora humidificada a 37°C trigas (4% de 02/ 5% de C02, equilibrada con nitrógeno) por aproximadamente 24 horas. Los cultivos se realimentaron después con medio fresco el mismo día para eliminar los desechos no-adherentes y retornaron a la incubadora. El día 3, el medio de cultivo de células se concentró usando unidades de filtro para centrífuga de 20ml CENTRICON™ PLUS-20 (Millipore Corp., Billerica, MA, Estados Unidos), según instrucciones del fabricante. En resumen, los concentrados se centrifugaron durante 45 minutos a 1140xG. Los sobrenadantes concentrados (lOOx concentración final) se transfirieron a crioviales limpios de 2ml y almacenaron a -80° C hasta su uso posterior.

Para determinar los niveles de ciertas proteínas secretadas producidas a partir las ABM-SC humanas en estos cultivos adherentes, se realizaron ensayos de inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) el día 3, con sobrenadantes de cultivo acondicionado de células, 10Ox concentrados, recogidos como se describió anteriormente. El día del ensayo, sobrenadantes se descongelaron y equilibraron a temperatura ambiente antes de su uso. El análisis por ELISA se realizó para detectar TNF-a, soluble TNF-RI (sTNF-RI) , TNF-RII soluble (sTNF-RII) , antagonista del receptor de IL-1 (IL-IRA) y receptor alfa de IL-2 (llevados a cabo según instrucciones del fabricante; todos los estuches se adquirieron de R&D Systems, Inc. (Minneapolis, MN, Estados Unidos) ) .

Los resultados demuestran que los niveles terapéuticamente competentes de receptor de depuración secretado (por ejemplo, sTNF-RI) y antagonistas de receptor (por ejemplo IL-IRA) se producen por estos cultivos adherentes y que estos niveles se pueden controlar a ustando la concentración de células o dosis (Figura 21-23) . Cabe destacar que estos datos demuestran también que las células responden al medio inflamatorio en el que se colocan. Por ejemplo, a continuación del tratamiento con la citocina inflamatoria TNF-alfa potente, las células regulan positivamente la secreción de sTNF-RII (Figura 22B) e IL-IRA (Figura 23) . Es interesante que, en estas muestras de cultivos, los niveles de TNF-alfa se redujeron significativamente con cada aumento en la densidad de siembra celular (Figura 21) , lo que sugiere que el TNF-alfa se secuestró de algún modo ya sea por las ABM-SC o factores que secretan .

Está bien establecido que tanto sTNF-RI como sTNF-RII se pueden unir y neutralizar la actividad biológica de TNF-alfa. Debido a que los niveles medibles de cualquiera de las formas del receptor de TNF, así como del propio TNF-alfa, se reducen significativamente con cada aumento en la densidad celular de siembra, es probable que los sTNF-RI y sT F-RII derivados de ABM-SC se unen y enmascaran a TNF-alfa en este sistema de ensayo.

De los receptores solubles y antagonistas de receptor medidos, no se observaron niveles detectables en los cultivos que sólo contienen células inactivadas con calor. Las comparaciones estadíEs icas entre las condiciones de ensayo se determinaron por ANOVA unidireccional.

Ejemplo 16 Ensayo de inducción de osteogénesis : Las células ABM-SC humanas no presentan una diferenciación ósea característica in vitro cuando las poblaciones de células expandidas más allá de aproximadamente 25 duplicaciones de la población se exponen a condiciones estándares osteoinductoras o cuando la población de células expandidas más allá de aproximadamente 30 duplicaciones de la población se exponen a las condiciones osteoinductoras mejoradas Métodos: Las ABM-SC humanas y exABM-SC se sembraron a 3100 células/cm2 en placas de cultivo de 6-pocillos (Corning, catálogo # 3516) con 2.4ml de medio basal de células madre mesenquimales (MSCBM™ ; Lonza, catálogo #PT-3238) suplementado con MSCGM™ estuche SingleQuot (Lonza, catálogo #PT-4105) por pocilio, en lo adelante se refiere como medio de crecimiento de células madre mesenquimales (MSCGM™) . Aproximadamente cuatro horas más tarde, el MSCGM™ se cambió para las condiciones de prueba adecuadas. Aquellos pocilios control negativo se realimentaron con MSCGM™ sólo, o MSCGM™ suplementado con 5ng/ml híbrido de Noggin de ratón recombinante/Fc (R&D Systems, catálogo #719-NG) . Aquellos pocilios de prueba se trataron con medio de inducción de osteogénesis (OIM; Lonza catálogo #PT-3924 y #PT-4120) sólo (condiciones osteoinductoras estándares) o OIM suplementado con 5ng/ml híbrido de Noggin de ratón recombinahte/Fc (condiciones osteoinductoras mejoradas) . Los cultivos se mantuvieron después en una incubadora humidificada con C02 a 37°C y realimentaron con medio fresco cada 3-4 días durante 2 semanas. Después de 14 días, los cultivos se procesaron para la determinación de calcio usando el estuche de Calcio Liquicolor (Stanbio, catálogo #0150-250) , según instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron a 550nm usando un lector de microplaca SpectraMax Plus384.

Resultados; Las ABM-SC humanas y exABM-SC derivadas de la investigación Lote # MCB109 se cultivaron bajo condiciones osteoinductoras estándares (sólo OIM) o bajo condiciones osteoinductoras mejoradas (OIM y el morfógeno Noggin; OIM + Noggin) . Los cultivos controles negativos se mantuvieron ya sea en mediode crecimiento sólo (MSCGM™) o MSCGM™ suplementado con Noggin (MSCGM™ + Noggin) .

ABM-SC a aproximadamente 16 duplicaciones de la población presentaron un aumento de la deposición de calcio de aproximadamente 6 -veces cuando el medio OIM se suplemento con Noggin (es decir, las ABM-SC a aproximadamente 16 duplicaciones de la población depositaron ~5 microgramos de calcio/pocilio bajo las condiciones de OIM y ~30 microgramos/pocillo bajo las condiciones de OIM + Noggin) .

ABM-SC perdió la capacidad de depositar niveles detectables de calcio más allá de aproximadamente 16 duplicaciones de la población bajo condiciones estándares de OIM, sin embargo, esto se puede revertir suplementando con Noggin (es decir, exABM-SC a aproximadamente 25 duplicaciones de la población depositaron calcio no detectable bajo condiciones de OIM mientras que estas mismas células depositaron ~5 microgramos de calcio/pocilio bajo condiciones de OIM + Noggin) . A diferencia, más allá de aproximadamente 30 duplicaciones de la población (por ejemplo, a aproximadamente 35 y 43 duplicaciones de las poblaciones) exABM-SC no depositó niveles detectables de calcio bajo cualquiera de las condiciones probadas (OIM estándar o mejorado) .

Ejemplo 17 Expresión del antagonista del receptor IL-1 (IL-1RA) y la proteína de unión a IL-18 (IL-18BP) por ABM-SC Métodos : Las ABM-SC humanas que experimentaron aproximadamente 43 duplicaciones de la población celular (Lote # P17-T2S1F1-5) se descongelaron y sembraron en medio de crecimiento AFG suplementado con Brefeldina A a 3 microgramos/ml (IX) y colocaron en una incubadora humidificada 5% de C02 a 37°C durante 24 horas. Las células cultivadas se retiraron después de los frascos de cultivo usando tripsina porcina, lavaron y prepararon para citometría de flujo, según el protocolo de tinción CALTAG FIX & PERM® (CALTAG LABORATORIES; ahora es parte de Invitrogen Corp. (Carlsbad, California, Estados Unidos) . Las células se tiñeron ya sea con el anticuerpo puro de ratón anti-antagonista del receptor de IL-1 humano conjugado con FITC (IL-1RA; eBioscience, catálogo # 11-7015, clon CRM17) o anti-proteína de unión de IL-18 de conejo sin marcar (IL-18BP; Epitomics, catálogo # 1893-1, clon EP1088Y) en una dilución 1:10, ambos por 45 minutos a temperatura ambiente. El anticuerpo de carnero anti- conejo marcado con FITC de conejo-FITC se usó después para detectar el IL-18BP. Los controles de isotipos coincidentes se incluyeron como un control negativo (Beckman Coulter) .

Resultados : Las exABM-SC humanas expresan niveles básales del antagonista del receptor de IL-1 (IL-1RA; Figura 24A) y de la proteína de unión de IL-18 (IL-18BP; Figura 24B) aún en ausencia de una señal inflamatoria tal como TNF-álfa.

Ejemplo 18 ABM-SC humana reduce la expresión de TNF-alfa e IL-13 mientras simultáneamente aumenta la expresión de IL-2 Métodos: Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se co-cultivaron en RPMI-1640 que contiene 5% de albúmina sérica humana, lOmM de HEPES, 2mM de glutamina, 0.05 mM de 2 -mercaptoetanol , 100U/ml de penicilina, y 100microgramos/ml de estreptomicina, en una placa de 24 pocilios ya sea con 1) PBMC tratada con mitomicina-C del mismo donador (Respondedor + Auto) o 2) PBMC tratada con mitomicina-C derivada de una donante diferente (Respondedor + Estimulador) . Las PBMC de cada fuente se sembraron a 4xl05células/pocillo . Para cada condición, los cultivos se suplementaron con o sin ABM-SC humana a una densidad de siembra de 40,000 células/pocilio. Los cultivos se mantuvieron en una incubadora humidificada con 5% de C02 a 37 °C durante 7 días para condicionar el medio. Los sobrenadantes de cultivo acondicionado de células se recogieron y analizaron para la presencia de varias citocinas usando el ensayo 9-Plex SEARCHLIGHT™ (Pierce Protein Research Products, Thermo Fisher Scientific Inc., Rockford, IL) * Los análisis estadísticos se realizaron por A OVA unidireccional (análisis de varianza) .

Resultados: Los co-cultivos de PBMC alogénicos (Respondedores + Estimuladores) resultaron en un aumento marcado en los niveles de TNF-alfa e IL-13, como se esperaría por una reacción mixta de PBMC. Cuando se retó con ABM-SC humana, sin embargo, tanto IL-13 como TNF-alfa se redujeron significativamente (P< 0.001), lo que sugiere que la ABM-SC se puede utilizar terapéuticamente para tratar trastornos inflamatorios crónicos o rechazo de injerto reduciendo los niveles focales y séricos de los mediadores inflamatorios. Ver la Figura 25A, B, y C.

Notablemente, ABM-SC indujo la expresión elevada de IL-2 tanto en cultivos de PBMC mixtos autólogos (Respondedores + Auto) y alogénicos (Respondedores + Estimuladores) (P< 0.001) mientras que suprimen simultáneamente la proliferación de PBMC. Mientras que este resultado parece un poco paradójico dada la importancia de IL-2 en la promoción de la proliferación de células T, recientemente se demostró en ratones que la interrupción de la ruta de IL-2 resulta en la hiperplasia linfoide y autoinmunidad en lugar de la deficiencia inmune, lo que sugiere que el papel fisiológico principal de la IL-02 puede ser limitar o regular, en vez de mejorar las respuestas de células T (Nelson, "IL-2, Regulatory T-Cells, and Tolerance," Jour. Inmuno1. 172: 3983-3988 (2004)). Además, se ahora se conoce que la IL-2 es también crítica para promover la auto- tolerancia suprimiendo las respuestas de células T in vivo y que el mecanismo por el cual se produce es a través de la expansión y la maduración de las células T reguladoras CD4+/CD25+. Por lo tanto, se contempla que ABM-SC puede emplearse terapéuticamente para inducir la tolerancia de las células T apoyando indirectamente la maduración de las células T reguladoras a través de la regulación positiva inducida de IL-2.

Ejemplo 19 ABM-SC humana inhibe la proliferación de células mononucleares de sangre periférica inducida por mitógeno Métodos: Las células somáticas derivadas de médula ósea humana adulta (ABM-SC) se cultivaron in vitro durante 96 horas en una incubadora humidificada bajo 5% de C02 pasaron después en placas de 96 -pocilios de fondo redondo a una concentración de 25,000 células viables/ml en medio completo RPMI (HYCLONE™) . Las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) se cultivaron ya sea separadamente a 250,000 células/ml en medio completo RPMI, o con los lotes de ABM-SC RECB801 ( subcultivado a aproximadamente 19 duplicaciones de la población) o RECB906 (subcultivado a aproximadamente 43 duplicaciones de la población) . Para estimular la proliferación de PBMC, los cultivos se inocularon con 2.5microgramos/ml de fitohemaglutinina (Sigma Chemical Co.). Después de 56 horas en cultivo, las células se pulsaron con timidina- [metil-3H] (Perking Élmer, ImicroCi/pocillo) . Las células se cosecharon a las 72 horas usando un recolector Filtermaster sobre unos filtros de vidrios. Los filtros se leyeron en placas de Omnifilter un contador de centelleo NXT TopCount . Células madre mesenquimales humanas se incluyeron como un control positivo. (Las células madre mesenquimales humanas se obtuvieron de Cambrex Research Bioproducts ; ahora propiedad del Grupo Lonza, Ltd, Basilea, Suiza) . Los análisis estadísticos se realizaron con ANOVA unidireccional (análisis de varianza) .

Resultados: La proliferación inducida por PBMC se redujo significativamente cuando se retó con cualquier Lote de ABM-SC (P < 0.001). Ver, Figura 26. Las células madre mesenquimales (MSC) se incluyeron como control positivo. Estos datos sugieren que ABM-SC no sólo inhibe la proliferación inducida por mitógeno de la preparación total de PBMC, sino que la presencia de ABM-SC en este sistema de ensayo no induce la proliferación de varias subpoblaciones celulares dentro de la preparación (por ejemplo, monocitos, granulocitos , linfocitos) .

Ejemplo 20 Dispositivos bioactivos basados en colágeno Las siguientes abreviaturas se usan en este Ejemplo: ADG, formulación de medio basado en DMEM avanzado con L-glutamina y HEPES BSC, Gabinete de Bioseguridad (campana de flujo laminar) BSS, solución salina equilibrada CFM-G, un medio de crioconservación que contiene MEM, glicerol, suero de ternero y FBS DMEM, medio eagle modificado de Dulbecco DPBS, solución salina regulada con fosfato de Dulbecco ELISA, Ensayo inmunoabsorbente unido a enzima EthD-1, bromuro de etidio (tinción roja para células muertas) Glut, glutaraldehído hABMSC(s), célula(s) del estroma derivada de la médula ósea humana adulta HEPES , PBS, solución salina regulada con fosfato RPM, revoluciones por minuto VEGF, factor de crecimiento endotelial vascular Introducción Las células del estroma derivadas de médula ósea humana adulta (hABM-SC) secretan una amplia variedad de factores involucrados en la reparación y regeneración de tejidos. Cuando se combinan con el colágeno de cola de rata, estas células sobreviven durante un período de días, provocan al constructo contraerse de una manera dosis-dependiente y liberan los factores en el medio (referido al estudio RND-04-032-3) . El constructo generado a partir de la combinación y cultivo de hABM-SC y colágenos de cola de rata es una entidad flexible que contiene los factores terapéuticos que tienen el potencial de ser comercializados como un dispositivo médico. Este ejemplo proporciona los métodos para preparar los dispositivos médicos bioactivos basado en colágeno GMP, de grado clínico.

Cuatro etapas principales se involucraron en la producción de dispositivos bioactivos basados en colágeno: 1) preparación de células, 2) formación del gel de colágeno, 3) cultivo del colágeno más constructos celulares y 4) procesamiento del constructo de colágeno. Cada etapa contuvo una serie de variables y oportunidades para el ajuste. Más de 200 dispositivos diferentes con diversos grados de bioactividad, durabilidad, flexibilidad y tamaño se crearon.

Aumentar la densidad celular, concentración de colágeno, y/o volumen de gel de colágeno resultaron en bioactividad superior. En modalidades, una concentración de colágeno ya sea de 4 mg/ml o 6 mg/ml resultó en bioactividad óptima en este estudio. Los dispositivos producidos a partir de volúmenes de gel de colágeno hasta 9 mi fueron viables y resultaron en niveles superiores de VEGF. Sin embargo, los geles de volúmenes superiores redujeron la durabilidad comparada con otras iteraciones del dispositivo. Las concentraciones de reticulación con el glutaraldehído usadas para procesar los constructos fueron óptimas entre 0.005% -0.05%. La deshidratación en el plástico de polietileno en una campana de flujo laminar resultó en un dispositivo que fue delgado, flexible, y capaz de almacenarse a temperatura ambiente.

Los dispositivos bioactivos basados en colágeno se fabricaron con éxito usando hABM-SC y colágeno porcino de grado clínico. El protocolo a continuación proporciona los métodos para producir dispositivos médicos bioactivos, no-vivientes con relativamente bajo COGs, durabilidad y estabilidad. En modalidades de la invención, los parámetros identificados como óptimos incluyen: 6e6 de hABM-SC 3 o 4 días en cultivo 4 o 6 mg/ml de colágeno 6-9 mi volúmenes de gel 0.005%, 0.01% y 0.005% de glutaraldehído .

OBJETIVOS Los objetivos de este estudio se desarrollaron dispositivos médicos que 1) carecieron de células vivientes pero retuvieron los factores bioactivos 2) fueron dóciles para el almacenamiento a largo plazo y fácil transportación y 3) se pudieron expandir para la fabricación de GMP.

DISEÑO DEL ESTUDIO En este Ejemplo, la producción de dispositivos bioactivos basados en colágeno usando las hABM-SC involucró 4 etapas principales que se definen en la Figura 40. Cada etapa implica múltiples componentes que se pueden alterar para producir dispositivos con diferentes características. Este Ejemplo es un resumen de muchos experimentos más pequeños en donde los componentes se alteraron de modo gradual para identificar la mejor combinación para la producción de un dispositivo médico, no-viviente, con capacidad de expansión, bioactivo. Un resumen de los parámetros que se alteraron se presenta en la Tabla 4.

Tabla 4. Parámetros que varían en la creación de múltiples iteraciones del dispositivo .

Parámetros del constructo viviente: Formulación del gel múltiple (cambio con colágeno conc . y vol . de gel) Concentración de colágeno: 2mg/ml, 3mg/ml, 4mg/ml, 6mg/ml, 8mg/ml Número de células: 3e6, 6e6, 7.5e6, 15e6, 18e6 Volumen de gel : 2ml, 3ml, 4ml, 5ml, 6ml, 7ml, 8ml, 9ml Tiempo de cultivo: 1, 2, 3, 6, 9 días Régimen de alimentación: sin alimentación, 50% cada segundo día, 100% cada tercer día Preparación celular: congelada, cultivada Parámetros del constructo no viviente: Concentración Xlink: ninguna, 0.0001%, 0.001%, 0.005%, 0.01%, 0.05%, 0.1% 0.5% Tiempo Xlink: 0.5h, 1 h Tiempo apagado Xlink lh, 2h, 4 , toda la noche Tampón de lavado : ninguno, PBS, DPBS, BSS, BSS+dextrosa Superficie de deshidratación : plástico, lámina, placa Más de 200 combinaciones distintas/dispositivos se crearon. Los dispositivos se evaluaron por primera vez por las observaciones y mediciones físicas; tamaño, textura, color, perfil superficial. Los dispositivos se se consideraron aceptables por sus características físicas duraron para pruebas adicionales; cuantificación de factores por ELISA, prueba mecánica, digestión de la colagenasa.

MATERIALES Y MÉTODOS Células Tipo de célula: Nivel del producto hABMSC (se usaron múltiples lotes a lo largo de este estudio) Recipiente de cultivo: ninguno, las células se usaron directamente de viales congelados después de descongelar y resuspender Densidad de siembra: la densidad de siembra dentro de los constructos de gel de colágeno se varió a lo largo de estos estudios, pero incluyó el total de números de células en cada dispositivo de 6e6, 7e6, 8e6, 10e6, 15e6 células viables.

Materiales y equipo Materiales y equipo del dispositivo: DMEM avanzado con L-glutamina (ADG) : DMEM avanzado, 4 mM de glutamina, 20 mM de HEPES Colágeno: colágeno TheraCol de piel porcina 10 mg/ml (1%; Sewon Cellontech, Corea) Solución tampón de colágeno (para geles de 4 mg/ml de colágeno): 16 mi de bicarbonato sódico al 7.5%, 4 mi de HEPES 1M, 2 mi de hidróxido sódico 1N, 78 mi de agua estéril Solución tampón de colágeno (para geles de 6 mg/ml de colágeno): 20 mi de bicarbonato sódico al 7.5%, 6.66 mi de HEPES 1M, 5.3 mi de hidróxido sódico 1N, 68 mi de agua estéril DMEM 10X con L-glutamina: DMEM 10X, 10 mM de L-glutamina Soluciones de trabajo de glutaraldehído : 8% de solución madre de glutaraldehído diluida en DPBS IX a la concentración final solución de glicina 5M : glicina en polvo (Sigma) , DPBS IX DPBS IX Placas de cultivo en suspensión de 6 pocilios (pocilios de 35mm de diámetro, Grenier BioOne) Espátulas de punta plana V. Bolsas de esterilización Mueller 12"xl5" (plástico de polietileno) Azul tripán-Gibco catálogo# 15250-061 Gabinete de Bioseguridad (BSC) : Incubadora: Forma 3150 Centrífuga: Beckman Coulter Allegra 6R Hemocitómetro : Brightline Microscopio de fase inversa: Nikon modelo TS100 Materiales y equipo para la prueba del dispositivo: tinciones de calceína AM y EthD-1 (estuche de citoxicidad/viabilidad de células vivas/muertas, Molecular Probés) colagenasa/hialuronidasa (Stem Cell Technologies Inc.) solución salina equilibrada (BSS, ) ELISA de VEGF (estuche ELISA de VEGF Quantikine, RnD Systems) tij eras baño de agua a 37°C vórtice Procedimiento experimental Producción del dispositivo Cuatro etapas principales se completaron en la producción de dispositivos bioactivos basados en colágeno; 1) preparación de células, 2) formación del gel de colágeno, 3) cultivo del colágeno más constructos celulares y 4) procesamiento del constructo de colágeno como se definió anteriormente en la Figura 40.

En resumen, los constructos se formaron encapsülando las hABM-SC en una solución de gel de colágeno. Las placas de suspensión de seis pocilios con un diámetro de pocilio de 35mm se llenaron con la célula que contiene la solución de gel e incubaron a 37°C para la gelificación. Una vez que se solidificó la solución de gel se soltó del pocilio y cultivó en suspensión con medio. Los constructos de gel de colágeno se cultivaron en condiciones de bajo 02, durante las cuales las células contrayeron activamente los geles de colágeno. Al final del periodo de cultivo, los constructos se procesaron mediante la reticulación con el glutaraldehído seguido por el lavado con la glicina. El constructo se deshidrató finalmente dando lugar a las células inactivas mientras que preserva los factores bioactivos secretados por las células.

En cada etapa, hubo oportunidad para la variación. En donde el proceso se modificó o múltiples iteraciones se realizaron se proporcionan los detalles.

Preparación de células La mayoría de los dispositivos se fabricaron Usando nABM-SC descongeladas directamente a partir de los viales almacenados en nitrógeno líquido. Para estos constructos, las siguientes etapas se llevaron a cabo para preparar las células: 1. Los viales congelados se retiraron del tanque de nitrógeno líquido descongelaron en un baño de agua a 37°C por 6-10 minutos. 2. Las células se resuspendieron con medio ADG en tubos cónicos de 50 mi. 3. Las células en tubos cónicos se cenrtrifugáron a 1,240 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células^ . Los sobrenadantes se retiraron y las células se resuspendieron de nuevo en medio ADG para el recuento. 5. lOOul de muestra de suspensión celular se tomaron y diluyeron 1:10 en medio ADG. El recuento y viabilidad celular se evaluaron en un hemocitómetro usando esta muestra én una dilución 1:1 con azul tripán. Las células vivas que se contaron excluyen el azul tripán y las células muertas que se contaron retuvieron el colorante para teñirse de azul. 6. La concentración final de células se usó para alicuotar el número adecuado de células viables en un único tubo cónico de 50 mi. 7. Los tubos cónicos con suspensiones celulares se centrifugaron de nuevo a 1,240 rpm por 5 minutos para sedimentar las células. 8. Todo el líquido de sobrenadante se eliminó del sedimento celular. Los sedimentos estuvieron listos después para mezclarse con la solución de gel de colágeno durante la formación del constructo.

Formación del gel de colágeno Los constructos de gel de colágeno se formaron mezclando los componentes del gel junto con los sedimentos celulares. Los componentes se mezclaron siempre en el orden siguiente: DMEM 10X con L-glut, solución tampón de colágeno, colágeno madre TheraCol, y la mezcla se adicionó después para resuspender el sedimento celular.

La Tabla 4 resume los diferentes parámetros usados en generar los dispositivos. Tres soluciones tampón de colágenos diferentes se probaron para los geles de 4 mg/ml, 6 mg/ml, o 8 mg/ml. Todos los componentes de solución de gel se mantuvieron a 4°C hasta que se combinaron con las células para iniciar la formación del gel. 1. DMEM 10X con L-glutamina se adicionó ya sea a un tubo cónico de 50 mi (si se hacen 6 geles) o un frasco de 250 mi (si se hacen 12 geles) . El volumen de DMEM 10X para cada constructo fue 1/10 el volumen final del gel de constructo para llevar el DMEM a una solución de IX dentro del constructo. 2. La solución tampón de colágeno para la concentración final adecuada de 4 , 6, o 8 mg/ml de colágeno en el gel se adicionó al DMEM 10X y agitó para mezclar. 3. La solución madre de TheraCol 10 mg/ml se adicionó pipeteando el colágeno en el frasco mientras que se agita con la mano opuesta para distribuir uniformemente el colágeno en toda la solución. 4. Los componentes se mezclaron rápidamente en una solución homogénea pipeteando rápido la solución arriba y abajo con la misma pipeta (el colágeno revestirá el interior de la pipeta, pero fluirá con el pipeteado arriba y abajo durante la mezcla) . El frasco que contiene la solución se agitó también durante el pipeteado para auxiliar en el mezclado. 5. La solución se mezcló totalmente con apariencia de color rosa uniforme combinada a lo largo con la consistencia de viscosidad uniforme. 6. La solución de gel se pipeteó en el sedimento celular y pipeteó rápidamente arriba y abajo para resuspender completamente las células en la solución de gel. El pipeteado continuó hasta volver uniformemente turbia la solución con células resuspendidas y sin signos visibles de agregados celulares . 7. Esta suspensión de células se dispensó después uniformemente en todo el resto de la solución de gel de colágeno con pipeteado repetido arriba y abajo para distribuir uniformemente las células a lo largo de la solución de gel. 8. Una cantidad definida de células más una solución de colágeno se pipeteó en cada pocilio de cultivo de suspensión de las placas de 6 pocilios. Este volumen final osciló de 3 mi a 9 mi como dispositivos diferentes se crearon y probaron. 9. Las placas de cultivo que contienen las soluciones de gel se colocaron inmediatamente en la incubadora humidificada a 37°C con 5% de C02 y 18% de 02. Las placas se mantuvieron en reposo durante 1 hora para completar la gelificación del colágeno.

Cultivo del colágeno y constructos celulares 1. Después de 1 hora de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y colocaron en el BSC. 2. Los constructos de gel de colágeno después de completar la gelificación se levantaron de los pocilios de las placas usando una espátula de punta plana estéril. La espátula se insertó entre el borde del gel y la pared del pocilio y cortó alrededor de la circunferencia para separar completamente el gel de la pared del pocilio. 3. Usando la espátula los geles se levantaron del fondo de los pocilios empujando suavemente el borde hacia el centro a lo largo de la circunferencia. 4. Para constructos con volumen de gel de 4 , 5, 6, y 7 mi, se adicionaron 6 mi de medio de ADG a cada pocilio que contiene los constructos de gel de colágeno. Para constructos con volumen de gel de 8 y 9 mi, se adicionaron 4 mi de medio de ADG. 5. Cada constructo se aseguró de que flote libremente dentro del medio, o bien se usó una espátula para levantar aún más el constructo completo. 6. Las placas de cultivo se colocaron después en la incubadora humidificada con contenido de oxígeno bajo 4% de 02, 5% de C02 a 37°C para el cultivo. 7. Los constructos se cultivaron del día 1 a día 9. La mayoría de los constructos se cultivaron durante 64-72 horas .

Procesamiento del constructo de colágeno Después del cultivo de las células en los geles de colágeno, los constructos se procesaron para dar lugar a un dispositivo final no viviente. El procesamiento incluyó reticular con el glutaraldehído, extinguir el glutaraldehído y la deshidratación.

La reacción de reticulación con el glutaraldehído se terminó bajo la condición de exceso de grupos aminas. La adición de una alta concentración de solución de glicina dejó sin reaccionar los extremos libres del glutaraldehído para reaccionar con la glicina. Esta etapa de apagado puede prevenir y limitar el potencial tóxico para usar el glutaraldehído como agente reticulador. 1. Los constructos cultivados se reticularon por la adición de 6 mi de solución de glutaraldehído. Los constructos en gel se mantuvieron en las placas de cultivo originales durante toda la reticulación con el glutaraldehído y etapas de lavado. 2. La reticulación con el glutaraldehído se llevó a cabo durante 30 minutos o 1 h a temperatura ambiente con movimiento ligero en un agitador de placas. 3. La solución de glutaraldehído se eliminó de los pocilios y 6 mi de DPBS IX se adicionó para empezar el lavado del glutaraldehído residual. 4. Al menos cuatro lavados totales de 6 mi de DPBS IX se adicionaron durante 10 minutos y retiraron de cada pocilio. Para al menos dos de los lavados las placas se colocaron en un agitador de placas en agitación suave. 5. La reacción de reticulación con el glutaraldehído se extinguió mediante la adición de 6 mi de 0.5M de solución de glicina para cada pocilio. Las placas se colocaron en el agitador de placas con agitación suave durante el apagado con glicina a temperatura ambiente durante 2, 3, o 4 horas. 6. Al final del apagado con glicina, la solución se eliminó y los constructos se lavaron completamente de nuevo con DPBS por al menos cuatro lavados totales exactamente como se especifica en la etapa 4. 7. Después del último lavado, el líquido se retiró tanto como posible del pocilio alrededor del constructo para comenzar la deshidratación de los constructos dentro del BSC. 8. Una variedad de superficies de deshidratación se probaron; papel de aluminio, plástico de polietileno (específicamente 12"xl5" bolsas de esterilización de polietileno) , directamente en el fondo de la placa de cultivo de tejido. Estas superficies se colocaron dentro del BSC. 9. Cada constructo reticulado individual se transfirió de las placas de pocilios a la superficie deshidratación con una espátula de punta plana. 10. Los constructos se separaron al menos 10 cm uno de otro. Los constructos se dejaron en el BSC durante la noche con la luz de la campana apagada, el fuelle permanece encendido y la puerta de la campana abierta a su altura de funcionamiento apropiada. 11. Los constructos se deshidratan en discos tipo papel muy delgados después de la deshidratación durante la noche en el BSC produciendo la configuración del dispositivo que se usó en los experimentos de prueba adicionales.

Prueba del dispositivo La prueba del dispositivo se realizó de acuerdo con los métodos descritos en la presente invención. Las siguientes pruebas se realizaron: evaluación de los parámetros físicos, digestión de la colagenasa y bioactividad con ELISA de VEGF RESULTADOS Variación de parámetros de constructos vivientes Para estos experimentos, el enfoque fue en optimizar las condiciones de cultivo que pueden aumentar la cantidad y captura de factores secretados a partir de las hABM-SC dentro de los constructos vivientes de gel de colágeno. Los métodos iniciales incluyen la densidad variable, concentración del gel de colágeno y tiempo de cultivo de células dentro de los geles de colágeno.

Basado en los experimentos anteriores y tomando en consideración los COG, se exploraron en estos estudios densidades celulares de 2e6 células/ml y 5e6 células/ml . Los constructos fabricados durante los experimentos iniciales utilizaron geles de colágeno que fueron de 3 mi en volumen, pero los números de células totales finales fueron ya sea 6e6 o 15e6 células en cada gel. Las concentraciones de gel de colágeno fueron 3 mg/ml o 4 mg/ml (3 mi de volumen por cada gel) . La tercera variable en este estudio inicial fue cultivar la hABM-SC sembrada en geles de colágeno durante 1, 3, 6, o 9 días en baja tensión de oxígeno, 4% de 02, 5% de C02, tamponada con N2 a 37 °C. Las Figuras 41 & 42 representan los resultados de este estudio final con análisis de la viabilidad celular, morfología celular, actividad celular, y bioactividad del constructo.

La Figura 41 representa las imágenes de la tinción de la viabilidad celular (calceína AM en verde= viva, EthD-1 en rojo=muerta) de los constructos vivientes a partir de los primeros estudios completados . La fila superior de las imágenes en la Figura 41 resaltan la diferencia en la densidad celular de siembra y concentración de colágeno en la morfología celular entre los cuatro dispositivos después de 3 días en cultivo. Los constructos sembrados con una concentración superior de colágeno parece que tiene más células vivas. La muerte celular en los constructos de 3 mg/ml se elevó ligeramente también, observado por más tinción roja con EthD-1. También parece que los geles de colágeno pueden tolerar y mantener hasta 5 millones de ABM-SC por 1 mi de gel de colágeno. Debido a que los constructos con colágeno superior se contraen más y por lo tanto son más densos (referido por la Figura 42 para evidencia) , es posible que la aparición de más células viables en los dispositivos de 4mg/ml 5e6/ml en realidad es sólo debido al tamaño de gel reducido y densidad global aumentada.

En la fila inferior de la Figura 41, los dispositivos sembrados con el mismo número de células cultivadas, pero cultivados durante 1 a 9 días resaltan el impacto del tiempo de cultivo. Dentro de los tres primeros días de cultivo de los constructos de colágeno sembrados con células, las células manipulan el gel y lo contraen hasta un volumen menor. La morfología en el día 3 (Fig. 2f) muestra cierta alineación de las células con su contracción del gel. Las morfologías del día 3 al día 6 son similares, pero por el día 9 de cultivo más células muertas aparecen dentro de los constructos (tinción roja) .

Parece que un número mayor de células y la concentración de colágeno aumentada es preferible para mantener más viables, las células que se contraen. En teoría las células más viables deben dar lugar a más factores bioactivos .

Como se muestra en la Figura 42 tanto la densidad celular aumentada y el contenido de colágeno resultaron en una mayor contracción de los constructos. Los dispositivos con las ABM-SC a 5e6 se contrayeron más rápido y en grado mayor que aquellos con 2e6 de ABM- SC. Cuando el contenido de colágeno se aumentó a 4mg/ml, los constructos se contrayeron más rápido y en mayor grado. Cuando se combinaron, el efecto fue aditivo.

Para evaluar la bioactividad de estos constructos preliminarmente se cuantificó el VEGF dentro de los dispositivos y secretado en el medio de cultivo usando un ELISA y se resumió en la Figura 43. El VEGF contenido dentro de los constructos se determinó digiriendo el dispositivo, analizando una porción de esta solución y calculando después de nuevo para el contenido total (barras verdes) . El contenido de proteína total de los dispositivos se determinó usando un estuche de BCA (barras rojas) . La cantidad de VEGF por dispositivo se normalizó con el contenido total de proteína (barras púrpuras) . Para el análisis de los factores secretados, el medio de cultivo se recogió al final del experimento, se analizó y se representó como cantidad de factor por mi de medio de cultivo (barras azules) . Para algunos constructos, el sobrenadante no se analizó y por lo tanto, la barra azul se omite en ese conjunto de datos.

Los datos del ELISA resumidos en la Figura 43 indican que: 1) adicionar más células (15e6 vs 6e6) resulta en más VEGF por constructo, 2) aumentar el contenido de colágeno en los constructos (3mg/ml a 4 mg/ml) resulta en más VEGF por constructo, y 3) cultivar los dispositivos más de 6 días conduce a reducir el contenido de VEGF en cambio liberar más en el medio de cultivo.

También, los resultados de la Figura 43 demostraron que un protocolo de alimentación para un constructo cultivado durante 3 días fue mejor que no tener ningún cambio de medio en este período de tiempo, debido a una disminución en el contenido de VEGF cuando el constructo tuvo un cambio de medio todos los días. Para un constructo cultivado por seis días extensos, los protocolos de alimentación de presentar un cambio de medio todos los días o no cambiar el medio en absoluto fueron similares en el contenido de VEGF resultante, pero el contenido VEGF se redujo cuando el constructo tuvo un simple cambio de medio el día 3. Por lo tanto, el contenido óptimo de VEGF dentro del constructo se puede lograr sin cambiar el medio de cultivo del todo en cualquier tiempo de cultivo de 6 días. Esto es significativo para reducir tanto el coste de bienes asociados a los cambios de medios como reducir el tiempo de fabricación y costos del personal .

Los constructos que se cultivaron en el mismo medio durante todo el periodo de cultivo entero tuvieron VEGF máxima contenida dentro del dispositivo. Sin embargo, mientras que cultivar los constructos durante 6 días sin alimentación es beneficioso para mantener el alto contenido de VEGF, el medio de cultivo durante este tiempo se torna ligeramente ácido. Para mejorar las condiciones de cultivo, se probó la adición de HEPES al medio con los resultados que se muestran en la Figura 44.

La adición de 20 mM de HEPES a los medios de cultivo mejoró la supervivencia de las células en los construqtos de gel de colágeno durante el período de cultivo, como se observa en la Figura 44. Los constructos cultivados con 20 mM de HEPES en el medio tuvieron muchas más células viables (células verdes) y menos células muertas (rojo) ; que al comparar el panel de la derecha con el de la izquierda en la Figura 44. Por lo tanto, todos los experimentos posteriores incluyeron la adición de 20 mM de HEPES al medio DMEM avanzado con L-glutamina para el cultivo de los constructos.

Las siguientes observaciones se hicieron durante estos estudios iniciales: 1. La siembra celular aumentada condujo a aumentar la contracción de gel, secreción y contenido de VEGF. 2. Una concentración superior de colágeno condujo a aumentar la contracción de gel, secreción de VEGF, y captura de VEGF' dentro del constructo. 3. Los tiempos de cultivo del constructo de 1 y 3 días maximizaron la captura de VEGF contenida dentro de los constructos mucho más que tiempos de cultivo más largos.

Basado en estos resultados los constructos con 4mg/ml o más de concentración de colágeno, cultivados por menos de 6 días se continuaron para los estudios siguientes.

El enfoque durante esta fase siguiente fue preparar N=3 de unos pocos dispositivos de plomo para un análisis más riguroso y la comparación. El enfoque fue en la densidad celular, tiempo de cultivo y protocolo de alimentación. Todos los constructos se fabricaron a la mayor concentración de colágeno de 4 mg/ml . Los tiempos de cultivo de 1, 3, ó 6 días se consideraron con 6 días, los cultivos se alimentaron ya sea una vez el día 3 o nada en absoluto. Los resultados de la cuantificación del contenido de VEGF se presentan en la Figura 45.

Al comparar los cultivos de 6 días que fueron alimentados a los que no se alimentaron, surgió una clara tendencia. Los dispositivos sin alimentarse cultivados durante 6 días dieron lugar a niveles mejorados de VEGF dentro de los constructos. Sin embargo, los constructos con VEGF máxima fueron aquellos cultivados durante 3 días. Como se observó anteriormente, aumentar el número de células sembradas (6 vs 15 vs 18) se correlacionó con el aumento en los niveles de VEGF.

Basado en todos los datos anteriores, se decidió que los tiempos de cultivo se deben mantener a 4 días o menos y el contenido de colágeno se debe limitar a 4 mg/ml. Debido a los recursos limitados de ABM-SC y el impacto en el costo, se determinó también que se debe limitar a 6e6 ABM-SC por constructo . a) Variación de parámetros con el procesamiento de constructos no-vivientes El objetivo de la siguiente fase fue procesar los constructos vivientes para crear un dispositivo no viviente que es duradero y flexible, un producto final capaz de soportar el almacenamiento a temperatura ambiente y manejarse por los cirujanos durante la aplicación. Es importante destacar que las técnicas usadas durante el proceso deben conservar o no reducir significativamente los factores bioactivos secretados por las hABM-SC durante el cultivo de los constructos .

La reticulación con el glutaraldehído de los constructos se eligió como la forma más aceptable para producir un producto más duradero debido al protocolo sencillo requerido de la reticulación y otros productos de colágenos aprobados por la FDA antes utilizando este agente reticulante (es decir Zyderm y Zyplast) . La deshidratación después de la reticulación se elegió como el método para reducir el dispositivo en un delgado material flexible seco capaz de ser almacenado a temperatura ambiente . Los resultados presentados en esta sección resumen las modificaciones probadas para el procesamiento final. En lo adelante de este Ejemplo, el término dispositivo se refiere a los constructos no-vivientes que experimentaron el procesamiento de la reticulación con el glutaraldehído y deshidratación para dar lugar a un producto final. El término constructo se referirá al constructo de gel de colágeno sembrado con la célula antes del procesamiento.

Los primeros experimentos examinaron el impacto de la concentración del glutaraldehído (glut) y el tiempo de reticulación en la digestión del constructo y la viabilidad celular. Los resultados de estas primeras iteraciones "no-vivientes" procesadas se muestran en la Figura 46.

Un aumento en la concentración de glut o tiempo de reticulación aumentó la resistencia del constructo a la digestión con la colagenasa y redujo la viabilidad celular, como se muestra en la Figura 46. Aumentar la concentración de glut y no el tiempo de reticulación, demostró ser el método más eficaz para mejorar la reticulación de los constructos. Todos los protocolos de reticulación dieron lugar a constructos de colágeno que fueron mucho más duraderos para manejar. Los dispositivos fijos con Glut mantuvieron su integridad, a diferencia de los constructos no procesados que fácilmente pueden colapsar y derrumbarse después de la primera manipulación.

Aunque el protocolo de fijación, debe continuar optimizándose, se incorporaron los métodos para la deshidratación. En ausencia de acceso a un secador de vacío y previendo que uno no puede estar disponible durante la fabricación GMP, se utilizó el secado al aire en una cabina de bioseguridad. Las superficies de secado probadas incluyen plástico de polietileno flexible, fino, laminado (más referido como plástico) y la placa de cultivo de tejido usada para cultivarlos constructos. La Figura 47 muestra los resultados de la prueba de estudio inicial de las diferentes superficies, así como variación adicional de las condiciones de reticulación y sus efectos sobre los niveles de VEGF del dispositivo .

La deshidratación de la superficie de plástico ayudó a preservar la mayoría de VEGF durante el período de deshidratación en comparación con otras superficies. Desafortunadamente, la deshidratación directamente en la placa de cultivo de tejido resultó en dificultad para retirar el dispositivo deshidratado haciéndolo una superficie poco práctica para el procesamiento de fabricación futuro. Los dispositivos deshidratados en el celofán y superficies de lámina permitieron una superficie no adherente en la que los dispositivos se despegaron fácilmente al final del período de deshidratación. Por lo tanto, todo el desarrollo continuo de los dispositivos incluyó la deshidratación de los constructos en las superficies de plástico polietileno.

Los resultados en la Figura 47 reconfirman la observación inicial de que el glut aumentado da lugar a la reducción del contenido o recuperación de VEGF (observar la tendencia de izquierda a derecha) . También, un tiempo de fijación mayor (comparar 30min a 1 h) resultó en la disminución del contenido o recuperación de VEGF. La reticulación de los constructos con glut de concentración de 0.001% durante 30 min y deshidratación en el plástico dieron lugar a una disminución de VEGF en sólo 2 ng por debajo del constructo no-reticulado sin procesar.

Considerando todos los datos recogidos, se determinó que este método de procesamiento, glut con lavado de glicina y deshidratación, fue más factible para producir un dispositivo deshidratado reticulado que conserva VEGF suficiente. El dispositivo resultante fue un material muy delgado tipo papel que fue flexible y significativamente más duradero para el manejo en comparación con un constructo sin procesar. El constructo procesado fue más estable también en el estado de deshidratado lo que permite a los dispositivos almacenarse a largo plazo en temperatura ambiente.

Para evaluar la viabilidad celular después de la transformación completa incluyendo reticulación con glut y deshidratación, un dispositivo (6e6 células, 3 mi de volumen de gel, 4 mg/ml de colágeno, se cultivado durante 3 días, se procesó con 0.001% de glut durante 30 minutos, deshidratado) fse dividió con unas tijeras para piezas de menos de 1 mm 3 y sembraron en AFG (medio de crecimiento de hABM-SC con FBS al 10%) durante 6 días. Este cultivo se supervisó diariamente para observar cualquier revestimiento y/o expansión de las hABM-SC a partir del dispositivo de procesado. Las imágenes de campo claro y fluorescentes del cultivo se presentan en la Figura 48.

Los desechos y remanentes celulares estuvieron presentes en el cultivo, pero no se observó ningún cambio durante el período de cultivo para indicar la expansión de células viables procedentes del dispositivo. Después de 6 días de cultivo el desecho celular se tiñó con tinte calceína AM, que se absorbe activamente por las células vivas sólo viables y las tiñe de verde. La imagen de campo claro en la Figura 48 resalta un agregado de dispositivo/desecho celular presente después de 6 días de cultivo. Este agregado no se tiñó positivamente con el tinte de calceína, lo que demuestra que no había células viables dentro del agregado. Ninguna tinción positiva verde indicando la presencia de células viables se observó a lo largo del cultivo entero y todos los desechos. Estos resultados indican que el procesamiento de los constructos vivientes con 0.001% de glutaraldehído durante 30 minutos con deshidratación parece dar lugar al dispositivo no viviente o carente de células vivas.

Para evaluar la estabilidad de los constructos deshidratados, se analizó el contenido de VEGF de varios dispositivos que se mantuvieron a temperatura ambiente durante varios días. Este estudio también incluyó un dispositivo que se fijó usando etanol, constructos pre-procesados que se lavaron con diferentes tampones y dispositivos que se generaron con más de 3 mi de colágeno. Dos métodos para aumentar el contenido de colágeno se probaron; aumentar la concentración de colágeno a 6 mg/ml o aumentar el volumen del constructo a partir de 3 mi de solución de colágeno a 6 mi .

Aumentar la concentración de colágeno dentro de este experimento no resultó en ningún aumento del contenido de VEGF dentro del dispositivo, pero duplicar el volumen de gel resultó en duplicar la cantidad de VEGF. La duplicación del volumen de gel de colágeno dió como resultado la mejoría más notable de maximizar la cantidad del contenido de VEGF dentro del dispositivo. Aumentar el volumen de gel tuvo un impacto comparable en el contenido de VEGF al aumentar el número de células sembradas de 6e6 a 15e6. Este fue un hallazgo notable porque el costo de la materia prima para aumentar la cantidad de colágeno porcino usado para producir los dispositivos es significativamente menos caro que aumentar del número de las hABM-SC requeridas para cada dispositivo.

La continuación de los experimentos se basó en lograr mayores niveles de VEGF con los constructos de gel de colágeno en los volúmenes de 6 mi . La iteración dentro de la Figura 49 con el más alto nivel de VEGF en 52 ng fue el dispositivo con 6e6 células a 4 mg/ml de colágeno de un volumen de 6 mi se cultivado durante 3 días y reticulado con 0.0001% de glut durante 30 minutos y deshidratado. Esta iteración maximiza el nivel de VEGF, sin embargo, la durabilidad de este dispositivo no fue aceptable. Este nivel muy bajo de reticulación, 0.0001% de glutaraldehído, no fue capaz de soportar la manipulación moderada, mientras que mantiene su integridad. Después de la manipulación, el dispositivo colapso fácilmente sobre sí mismo y se deformó. Por lo tanto, se concluyó que una concentración de reticulación de glut de o superior a 0.001% era necesario para producir dispositivos que fueran suficientemente resistente para soportar la manipulación necesaria durante su aplicación al paciente. Esto, sin embargo, puede comprometer la bioactividad del dispositivo.

Los constructos con 4 mg/ml colágeno cultivados durante 2 días dieron lugar a niveles de VEGF comparables a los 3 días de cultivo. El resultado más significativo dentro de las iteraciones de la Figura 50 fue que aumentando la concentración de colágeno a 6 mg/ml a una concentración de reticulación de 0.001% de glut se maximizó el nivel de VEGF en comparación con otras iteraciones. Aumentar el colágeno a 8 mg/ml no aumentó aún más el VEGF. Los resultados en la Figura 48 del primer constructo producido con una concentración de colágeno de 6 mg/ml no resultó en el aumento de VEGF en comparación con su dispositivo homólogo con 4 mg/ml de colágeno debido a que la formulación de la solución de gel de colágeno no se optimizó para la 6 mg/ml de colágeno. Los dispositivos creados para los resultados de la Figura 50 fueron después de que la formulación de gel de 6 mg/ml de colágeno se cambió para optimizar la capacidad del gel para establecer y contraerse durante el período de cultivo. Por lo tanto, con la formulación de gel de la derecha los constructos de colágeno de 6 mg/ml no mejoraron la captura de VEGF dentro del dispositivo en comparación con las iteraciones de 4 mg/ml y 8 mg/ml.

La concentración de glut de 0.05% se descartó debido a la flexibilidad disminuida y la rigidez aumentada con la manipulación del dispositivo. Las concentraciones de Glut seleccionadas para los futuros dispositivos incluyeron 0.001%, 0.005%, y 0.01% .

Otro conjunto de dispositivos se prepararon para comparar los constructos de 4 mg/ml con los resultados presentados en la Figura 51. Estos datos muestran todas las posibles iteraciones que fueron competentes para un desarrollo adicional hasta este punto en tiempo. Las iteraciones múltiples se realizaron para reducir finalmente las modificaciones a menos de diez iteraciones del dispositivo. Una modificación incluida dentro de estos resultados fue observar los efectos del número de células aumentando sólo ligeramente por encima de 6e6 (en lugar del salto anterior de 6e6 a 15e6 células) .

Discusión Los dispositivos bioactivos basados en colágeno se pueden fabricar con éxito usando hABM-SC y colágeno porcino de grado clínico. Se crearon y probaron dispositivos múltiples con densidad celular variable, concentración de colágeno, volumen de gel de colágeno, tiempo de cultivo, concentración y tiempo de la reticulación con el glutaraldehído, tiempo de apagado con glicina, tampones de lavado, y superficie de la deshidratacion.

Los estudios demostraron que aumentar la densidad celular puede aumentar significativamente la cantidad de VEGF contenida dentro de un dispositivo. Sin embargo, adicionar de más células eleva significativamente el costo y por lo tanto, se determinó que los dispositivos pueden contener no más de 6e6 células/dispositivo y otros métodos para elevar el contenido de VEGF se podrán proseguir.

El hallazgo más significativo entre estos estudios fue que aumentando el contenido de colágeno de los constructos, ya sea por concentración o volumen, pueden aumentar la bioactividad. El colágeno aumentado dentro de un constructo contribuyó muy probablemente tanto a la actividad aumentada de las células para secretar más factores, como a la capacidad del gel para retener mejor estos factores dentro de la constructo. Después de probar un amplio intervalo de concentraciones y volúmenes de colágeno, se observó que ir más alto que 6mg/ml no permitió aumentos sustanciales en el contenido de VEGF . Como resultado, el colágeno de 6mg/ml se seleccionó como la concentración óptima usada en el desarrollo de dispositivos adiocionales . Aumentar el volumen de gel de colágeno por encima de 6 mi parece que disminuye la resistencia del dispositivo, pero estas iteraciones se consideraron todavía para probar y desarrollar además, que proporcionan otros beneficios, tal como contenido superior de VEGF.

El procesamiento de los constructos de colágeno sembrados con células cultivadas mediante la reticulación con el glutaraldehído y deshidratación resultó en un dispositivo que no contiene células viables detectables o células capaces de expandirse aún más en cultivo. Aumentar la concentración de glutaraldehído resultó en un constructo más duradero, pero concentraciones por encima de 0.05% disminuyeron la flexibilidad del dispositivo resultante. Las concentraciones de Glut consideradas adicionalmente fueron 0.005%, 0.01% y 0.05%.

Para mantener el tiempo de procesamiento total más corto y debido a tiempos más largos que impactaron negativamente en la bioactividad, un tiempo de reticulación de 30 minutos se seleccionó para las iteraciones de dispositivos futuros. La superficie de deshidratación del plástico de polietileno demostró ser superior sobre papel de aluminio y las placas de cultivo. El polietileno se puede esterilizar y dejar una superficie no adherente en la que los dispositivos se retiran fácilmente después de la deshidratación .

En un esfuerzo para preservar el contenido de VEGF tanto como sea posible, los protocolos finales de procesamiento no incluyen lavar los constructos cultivados antes de la reticulación con el glutaraldehído y sólo lavar después de la reticulación con DPBS.

Ejemplo 21 Dispositivos bioactivos basados en colágeno: Evaluación de dispositivos en la reparación del tendón de la mano Las abreviaturas en el Ejemplo 20 se usan también en este Ejemplo .

SUMARIO Para reparar el tendón de la mano, el dispositivo necesitó de 1) ser lo suficientemente fuerte para tolerar la sutura a sí mismo o tejido receptor, 2) contener factores bioactivos competentes, 3) tolerar la manipulación por cirujanos y 4) ser delgada y flexible.

Los dispositivos bioactivos basados en colágeno que cumplen los criterios preliminares de resistencia, bioactividad, apariencia, factibilidad de ampliación fabricación de GMP y la distribución del producto con éxito y de forma reproducible fueron generados usando hABM-SC como se describe en la presente. Seis dispositivos se determinaron tener las características necesarias para seguir probándolos aún más por los cirujanos de la mano. Estos dispositivos varían en dimensión, fuerza y bioactividad al garantizar los requisitos básicos para la fabricación y aplicación terapéutica .

Los elementos de los dispositivos presentados son: 1) el uso de materiales de calidad-GMP, 2) métodos de producción que se pueden ampliar para la fabricación y 3) características físicas y funcionales que satisfagan a los usuarios finales: cirujanos de mano. Los seis dispositivos finales fueron finos y flexibles. Se manipularon fácilmente y manejaron repetidamente después de la rehidratación. El VEGF, se usa como un marcador sustituto para la bioactividad, se midió a niveles de nanogramos en todos los dispositivos. También, todos dispositivos pueden soportar la prueba de retención de sutura, resistiendo varios gramos de peso antes de alcanzar el fallo por carga.

OBJETIVO Los objetivos de este estudio fueron: 1) usar materiales GMP y métodos para crear los dispositivos bioactivos basados en colágeno, para la reparación del tendón de la mano y 2) evaluar las características físicas y funcionales de estos dispositivos.

DISEÑO DEL ESTUDIO En este estudio se alteraron elementos en varias combinaciones para crear una serie de dispositivos que cumplen tanto los criterios de fabricación como clínicos. Para la fabricación los requisitos incluyeron; 1) dispositivo hecho de materiales de calidad-GMP, 2) proceso que se pueden acomodar a la expansión y 3) dispositivo que se puede almacenar a temperatura ambiente y tiene potencial para la estabilidad a largo plazo. Los dispositivos preferidos tienen las siguientes características: 1) muy delgados, 2) flexibles, 3) fácil de manipular 4) fuertes lo suficiente como para resistir una sutura y 5) grandes lo suficiente como para cortarse al tamaño y forma deseados.

Basado en las propiedades de los dispositivos, la factibilidad para fabricar a gran escala, un subconjunto de los dispositivos se avanzaron para pruebas adicionales. Este informe resume los métodos para fabricar y analizar el subconjunto que se seleccionó para consideración adicional.

MATERIALES Y MÉTODOS Células Tipo de Células: hABMSC Lote # P15-T2S1F1-5 , aproximadamente 50e6 células por vial Recipiente de cultivo: ninguno, las células se usaron directamente de viales congelados después de descongelar y resuspender Densidad de siembra: 6e6 células viables sembradas en cada constructo de gel de colágeno Materiales y equipo Materiales y equipo del dispositivo: DMEM avanzado con L-glutamina (ADG) : DMEM avanzado, 4 mM de glutamina, 20 mM de HEPES Colágeno: colágeno TheraCol al 1% de piel porcina 10 mg/ml (Sewon Cellontech, Corea) Solución tampón de colágeno (para geles de colágeno de 4 mg/ml) : 16 mi de bicarbonato de sodio al 7.5%, 4 mi de HEPES 1M, 2 mi de hidróxido de sodio 1N, 78 mi de agua estéril Solución tampón de colágeno (para geles de colágeno de 6 mg/ml) : 20 mi de bicarbonato de sodio al 7.5%, 6.66 mi de HEPES 1M, 5.3 mi de hidróxido de sodio 1N, 68 mi de agua estéril DME 10X con L-glutamina: DMEM 10X, 10 mM de L-glutamina 0.005% o 0.01% de solución de trabajo de glutaraldehído : 8% de solución madre de glutaraldehído, DPBS IX Solución de glicina 5M: glicina en polvo (Sigma) , DPBS IX DPBS IX Placas de cultivo en suspensión de 6 pocilios (pocilios de 35mm de diámetro, Grenier BioOne) Espátulas de punta plana V. Bolsas de esterilización Mueller I2"xl5" (plástico de polietileno) Azul tripán-Gibco catálogo# 15250-061 Gabinete de Bioseguridad (BSC) : Incubadora: Forma 3150 Centrífuga: Beckman Coulter Allegra 6R Hemocitómetro : Brightline Microscopio de fase inversa: Nikon modelo TS100 Materiales y equipo del prueba de dispositivo: Tinciones de calceína AM y EthD-1 (estuche de citoxicidad/viabilidad de células vivas/muertas, Molecular Probes) colagenasa/hialuronidasa (Stem Cell Technologies Inc.) solución salina equilibrada (BSS) ELISA de VEGF (Estuche ELISA de VEGF Quantikine, RnD Systems ) Balanza Aparato de prueba mecánica (dos estantes de probetas de laboratorio con pinzas que sostienen la barra con la pinza pequeña para sujetar el dispositivo) Sutura Ethibond 3-0 (Ethicon) canasta de peso (gasa con clip de papel y grapas) pesos (5g, lOg, 20g) tij eras baño de agua a 37°C vórtice Procedimiento experimental Producción del dispositivo En modalidades de la invención, cuatro etapas principales se involucran en la producción del dispositivo bioactivo basado en colágeno; 1) preparación de células, 2) formación de gel de colágeno, 3) cultivo de colágeno más constructos de células y 4) procesamiento del constructo de colágeno .

En resumen, los constructos se forman encapsulando las hABM-SC en una solución de gel de colágeno. Las placas de seis pocilios con un diámetro de pocilio de 35 mm se llenaron con la célula que contiene la solución de gel e incubó. Una vez que la solución de gel se solidificó se separó del pocilio y se cultivó en suspensión con el medio. Los constructos de gel de colágeno se cultivaron en condiciones de bajo 02 por un período de aproximadamente 3 días, durante el cual las células contraen activamente los geles de colágeno. Al final del período de cultivo, los constructos se procesan por la reticulación con el glutaraldehído, apagado con la glicina para detener la reacción del glutaraldehído, y deshidratación haciendo las células inactivas mientras que preserva las moléculas secretadas por las células.

En cada etapa, hay oportunidad para la variación. Se proporcionan detalles de dónde se modificó en el proceso o realizaron múltiples iteraciones.

Preparación de las células La mayoría de los dispositivos se fabricaron usando hABM-SC tomada de viales almacenados en nitrógeno líquido. Para estos constructos, se tomaron las etapas posteriores para preparar los elementos: 1. Los viales congelados a 50e6 de hABMSC/vial se retiraron del tanque de nitrógeno líquido y descongelaron en un baño de agua a 37°C durante 6-10 minutos. 2. Las células se resuspendieron con medio ADG en tubos cónicos de 50 mi. 3. Las células en tubos cónicos se centrifugaron a 1,240 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. 4. Se eliminaron los sobrenadantes y las células se resuspendieron de nuevo en ADG medios para el recuento. 5. 100 ul de muestra de suspensión celular se diluyó 1:10 en medio ADG. El recuento y viabilidad celular se evaluó en un hemocitómetro usando esta muestra en una dilución 1:1 de azul tripán. Las células vivas se contaron y excluyeron las azul tripán y se contaron las células muertas que conservan el tinte para teñir azul. 6. La concentración de células final se usó para alícuota 36e6 o 72e6 células viables totales en un único tubo cónico de 50 mi. 36e6 células se utilizaron para fabricar un lote de 6 constructos de gel y 72e6 para fabricar un lote de 12 geles. 7. Los tubos cónicos con suspensiones de células se centrifugaron de nuevo a 1,240 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células. 8. Todo el líquido sobrenadante se eliminó del sedimento celular. Los sedimentos no se resuspendieron aún.

Para ' el mismo dispositivo fabricado con células cultivadas, un vial se descongeló, las hABM-SC se sembraron en frascos en T e incubaron durante la noche a 2.2e4 células/cm2. Los días siguientes las células se cosecharon, lavaron y resuspendieron en medio ADG. Las células cosechadas se procesaron de la misma manera comenzando con la etapa 5 anterior.

Formación del gel de colágeno: Los constructos de gel de colágeno se fabricaron mezclando el componente de gel junto con los sedimentos celulares. Los componentes se mezclan siempre en el orden siguiente: DMEM 10X con L-glut, solución tampón de colágeno, colágeno madre TheraCol y, después el sedimento celular.

La Tabla 5 resume los componentes y proporciones usadas para generar los diferentes constructos analizados en este estudio. Dos soluciones diferentes de tampón de colágeno se usaron para geles de 4 mg/ml o 6 mg/ml . Todos los componentes de la solución de gel se mantuvieron a 4°C hasta que se combinaron con las células para iniciar la formación del gel. 1. DMEM 10X con L-glutamina se adicionó ya sea a un tubo cónico de 50 mi (si se fabrican 6 geles) o un frasco de 250 mi (si se fabrican 12 geles) . 2. La solución tampón de colágeno para la concentración final adecuada de 4 o 6 mg/ml de colágeno en el gel se adicionó al DMEM 10X y agitó para mezclar. 3. La solución madre de TheraCol 10 mg/ml se adicionó pipeteando el colágeno en el frasco mientras que se agita con la mano opuesta para distribuir uniformemente el colágeno en toda la solución.

. Los componentes se mezclaron rápidamente en una solución homogénea pipeteando rápidamente la solución arriba y abajo con la misma pipeta (el colágeno recubrirá el interior de la pipeta, pero seguirá fluyendo con el pipeteado arriba y abajo durante la mezcla) . El frasco que contiene la solución se agitó también durante el pipeteado para ayudar en la mezcla. Al menos 2 mi de la solución se mantuvo siempre en la punta de la pipeta sin dispensar totalmente toda la solución para evitar la introducción de burbujas en la solución . 5. La solución se mezcló completamente hasta la aparición de un color rosa completamente uniforme combinado con la consistencia uniforme de la viscosidad. 6. 10 mi de la solución de gel se pipeteó en el sedimento celular y se pipeteó rápidamente arriba y abajo para resuspender completamente las células en la solución de gel. El pipeteado continuó hasta que la solución se volvió uniformemente turbia con las células resuspendidas y sin signos visibles de agregados de las células. 7. Esta suspensión de células se dispensó uniformemente después en todo el resto de la solución de gel de colágeno con el pipeteado repetido arriba y abajo para distribuir uniformemente las células en toda la solución de gel. Al menos 2 mi se mantuvieron siempre dentro de la punta de la pipeta para evitar la introducción de burbujas. 8. 4- 9 mililitros de célula más la solución de colágeno se pipeteó en cada pocilio de las placas de cultivo en suspensión de 6 pocilios.

Las placas de cultivo que contienen las soluciones de gel se colocaron inmediatamente en la incubadora humidificada a 37°C con 5% de C02 y 18% de 02. Las placas se mantuvieron en reposo durante 1 hora para completar la gelificación del colágeno .

Tabla 5 Cantidad de cada componente adicionado junto para fabricar el constructo de gel de colágeno.

Hay dos diferentes formulaciones de tampón de gel de colágeno, ya sea para geles de 4 o 6 mg/ml .

Parámetros finales de constructos de gel de colágeno: 6e6 células/constructo Concentración de colágeno: 4 mg/ml o 6 mg/ml Variación de los volúmenes de gel: 4 mi, 5 mi, 6 mi, 7ml, 8 mi, o 9 mi 1 mM de L-glutamina DMEM IX 0.45% de bicarbonato de sodio 15.9 mM de hidróxido de sodio 20 M de HEPES Cultivo de colágeno más constructos celulares 1. Después de 1 hora de incubación, las placas se retiraron de la incubadora y colocaron en el BSC. 2. Los constructos de gel de colágeno después de la gelificación completa se levantaron de los pocilios de las placas usando una espátula de punta plana estéril. La espátula se insertó entre el borde del gel y la pared del pocilio y cortó alrededor de la circunferencia hasta separar completamente el gel de la pared del pocilio. 3. Usando la espátula los geles se levantaron desde el fondo de los pocilios empujando suavemente el borde hacia el centro a lo largo de la circunferencia. 4. Para los constructos con volúmenes de gel 4, 5, 6, y 7 mi , se adicionaron 6 mi de medio de ADG a cada pocilio que contiene los constructos de gel de colágeno. Para constructos con volúmenes de gel de 8 y 9 mi, se adicionaro 4 mi de medio ADG. 5. Cada constructo fue probó para asegurar que fue flotando libremente dentro del medio, o bien una espátula se usó para levantar aún más el constructo completamente. 6. Las placas de cultivo se colocaron, continuación en la incubadora humidificada a 37 °C con bajo oxígeno 4% de 02, 5% de C02 para el cultivo. 7. La mayoría de los constructos se cultivaron durante 3 días (entre 64-72 horas) . Una iteración se cultivó durante 2 días (entre 40-48 horas) .

Procesamiento del constructo de colágeno: Después del cultivo de las células en los geles de colágeno, los constructos se procesaron para hacer un dispositivo final no viviente. El procesamiento incluye la reticulación con el glutaraldehído, apagado del glutaraldehído y la deshidratación .

La reacción de reticulación con el glutaraldehído se termina bajo la condición de grupos amina en exceso. La adición de solución de glicina en alta concentración deja sin reaccionar los extremos libres del glutaraldehído para reaccionar con la glicina. Esta etapa de apagado puede prevenir y limitar la toxicidad potencial de usar glutaraldehído como agente de reticulación. 1. Los constructos cultivados durante 2-3 días se reticularon mediante la adición de 6 mi de la solución de trabajo adecuada de glutaraldehído; 0.005%, 0.01%, o 0.05%.

Los constructos de gel se mantuvieron en las placas originales de cultivo durante toda la reticulación con el glutaraldehído y etapas de lavado . 2. La reticulación con glutaraldehído se llevó a cabo durante 30 minutos a temperatura ambiente con un movimiento ligero en un agitador de placas. 3. Después de 30 minutos, la solución de glutaraldehído se eliminó de los pocilios y 6 mi de DPBS IX se adicionó para comenzar el lavado del glutaraldehído residual . 4. Al menos cuatro lavados totales de 6 mi de DPBS IX se adicionaron durante 10 minutos y retiraron de cada pocilio. Durante al menos dos de los lavados de las placas se colocaron en un agitador de placa de agitación suave. 5. La reacción de reticulación con el glutaraldehído se apagó mediante la adición a cada pocilio de 6 mi de solución de glicina 0.5M. Las placas se colocaron en el agitador de placas con agitación suave durante el apagado con glicina a temperatura ambiente durante 2, 3, o 4 horas. Los efectos del tiempo de apagado de 2 y 4 horas se probaron en la viabilidad de las células cultivadas en estos dispositivos (resultados mostrados en la Figura 52) . 6. Al final del apagado con la glicina, la solución se retiró y los constructos se lavaron completamente de nuevo con DPBS por al menos cuatro lavados en total exactamente como se especifica en la etapa 4. 7. Después del último lavado, el líquido se eliminó tanto como es posible del pocilio alrededor constructo reticulado para comenzar la deshidratación de los constructos dentro del BSC. 8. Una bolsa de esterilización de polietileno 12"xl5" se coloca en el BSC con el lado del plástico de polietileno hacia arriba. 9. Cada constructo reticulado sencillo se transfirió de las placas de pocilios a la superficie de plástico con una espátula de punta plana. 10. Los constructos se separaron al menos 10 cm entre sí. Los constructos se dejaron durante la noche en el BSC con la luz de la campana apagada, el fuelle permanece encendido y la puerta de la campana abierta a su altura de funcionamiento apropiada . 11. Los constructos se deshidratan en un disco muy fino tipo papel después de la deshidratación durante la noche en el BSC produciendo la configuración del dispositivo que se usó en experimentos de prueba adicionales.

Nomenclatura del dispositivo Cada dispositivo se le dió un número de 4-5 dígitos. El primer dígito corresponde a la concentración de colágeno dentro del gel, o bien 4 mg/ml o 6 mg/ml, de modo que el primer dígito es cualquiera "4" o "6". El segundo dígito se refiere al volumen del gel de colágeno"4" para 4 mi, "5" para 5 mi, etc. Los últimos dos a tres dígitos especifican el por ciento de la concentración de glutaraldehído usada para reticular el constructo de colágeno. Por, ejemplo si se usó una concentración de 0.005% glutaraldehído, los últimos dos o tres dígitos de la nomenclatura del dispositivo serán "005". Como un ejemplo final un dispositivo marcado "6601" implica un constructo fabricado con la concentración de colágeno de 6 mg/ml con un volumen de 6 mi reticulado con 0.01% de glutaraldehído .

Todas las iteraciones finales de dispositivos contienen 6e6 hABMSC cultivadas en hidrogeles de colágeno TheraCol durante 3 días en placas de cultivo en suspensión de 6 pocilios (diámetro inicial de 35 mm) .

Prueba de dispositivo La prueba de dispositivo se realizó en los dispositivos biactivos basados en colágeno de este Ejemplo Las siguientes pruebas de dispositivos se realizaron: Parámetros físicos, digestión con colagenasa, bioactividad con ELISA de VEGF y propiedades mecánicas mediante la prueba de retención de sutura .

RESULTADOS Producción del dispositivo La concentración de colágeno, volumen de gel de colágeno, y concentración del glutaraldehído reticulante se alteró para producir dispositivos con diferentes propiedades. Muchas de estas variaciones se resumen en las Tablas 5 y 6.

Las evaluaciones preliminares del dispositivo se basaron en la factibilidad de fabricación así como la inspección visual y táctil. Las siguientes observaciones se hicieron y alteraron la estrategia y los métodos para dispositivos de nueva generación; 1. Los constructos de gel de colágeno de 4 mg/ml fueron más pequeños que los de 6 mg/ml . 2. El volumen de gel máximo tolerado en las placas de 6 pocilios fue de 9 mi con 4 mi de medio de cultivo. 3. Los volúmenes de gel menores de 3 mi no completaron el gel ni formaron constructos sólidos. 4. La reticulación con glutaraldehído permitió la durabilidad aumentada en el manejo de los constructos. 5. La reticulación a cualquier concentración produjo un dispositivo que después de la rehidratacion fue mucho más duradero que un dispositivo no reticulado.

El ejemplo de un constructo reticulado con glutaraldehído previo a la deshidratación se muestra en la Figura 52. Las mediciones reales de la resistencia de las iteraciones del dispositivo se discuten a continuación.

La etapa de procesamiento final de la producción del dispositivo es la etapa de deshidratación . Esta se realizó permitiendo que el constructo reticulado y lavado para deshidratar sobre una superficie de polietileno en el BSC bajo flujo de aire laminar. La Figura 53 ilustra algunas iteraciones de dispositivos durante la deshidratación (en n = 6 dispositivos de 6 iteraciones diferentes) .

Varias observaciones se hicieron durante el proceso de secado : 1. Los constructos con volúmenes más grandes de gel son tanto más gruesos como más grande en diámetro que los constructos de volumen de gel más pequeños. 2. Los constructos más grandes y gruesos toman más de 12 horas para deshidratar completamente. (Observar: La deshidratación completa se refiere aquí a la evaporación de todo el líquido de los constructos en las condiciones de ambiente de aire de flujo laminar en el BSC. Esto, sin embargo, no especifica que los constructos se deshidrataron hasta un nivel de humedad específico cuantificado por debajo de la humedad del aire ambiental.) 3. Los constructos de colágeno 4 mg/ml fueron capaces de deshidratarse completamente en menos de 12 horas . 4. La deshidratación de los constructos condujo a completar la evaporación de cualquiera de las gotas de líquido visible con la consiguiente disminución en la altura de los geles. 5. Durante la deshidratación, la apariencia de la superficie fue de claro y brillante a blanco y opaco después de la deshidratación completa.

Los dispositivos finales completamente deshidratados tienen un espesor menor que a 0.5 mm.

Como se ha mencionado, es importante extinguir cualquier glutaraldehído que permanenece ya que los residuos sin reaccionar pueden resultar tóxicos para las células circundantes. Una forma de acceder a la toxicidad potencial de los dispositivos fijos es tratar de cultivar las células en la parte superior de los dispositivos. Ya sea hABM-SC o condrocitos humanos se adicionó en la parte superior de los dispositivos y su viabilidad se observó en el tiempo de cultivo. La Figura 54 representa los resultados de la citotoxicidad tanto de los condrocitos como las hABM-SC después de 4 días de cultivo sobre la superficie de los dispositivos que tuvieron tiempos de apagado con glicina 2 o 4 horas durante la etapa de procesamiento de la producción del dispositivo. Estos resultados demuestran la etapa de lavado con glicina más de 4 horas permite reducir la toxicidad del dispositivo reticulado con glutaraldehído . Los dispositivos que tienen un tiempo de lavado con glicina de 2 horas mostraron un aumento de células muertas en la superficie del dispositivo después del cultivo (tinción roja) . Los dispositivos con un tiempo de lavado con glicina de 4 horas tuvieron una alta densidad de células unidas y vivas a través de la superficie (tinción verde) .

Propiedades físicas de los dispositivos finales deshidratados Muchos dispositivos no avanzaron hasta la prueba final, ya que no reunieron los criterios necesarios de la indicación, los cirujanos o factibilidad para la ampliación. Seis dispositivos, enumerados en la Tabla 6, se consideraron aceptables y dignos de análisis adicional. Una fotografía de cinco de las seis iteraciones finales del dispositivo bioactivo basados en colágeno se muestra en la Figura 55.

Todas estas iteraciones tuvieron una concentración inicial de colágeno de 6 mg/ml dentro del constructo. Las variaciones en parámetros tales como volumen de gel de colágeno y concentraciones de glutaraldehído de los constructos con concentración de colágeno de 6 mg/ml permitieron variaciones significativas en las propiedades físicas de las configuraciones del dispositivo.

Un aumento en el volumen inicial usado para generar los constructos de colágeno resulta en aumento tanto del diámetro como del peso de la configuración del dispositivo. La ilustración visual, así como la documentación cuantitativa, de estas diferencias se proporciona en la Figura 55 y Tabla 6, respectivamente.

Tabla 6 Parámetros de los seis dispositivos finales.

Tabla 6 Los últimos seis dispositivos se crearon variando el volumen del gel y concentración de glutaraldehído . Esta tabla resume los parámetros e ilustra el sistema de numeración usado para nombrar los dispositivos. Para cada dispositivo el valor de cada columna se combinó en secuencia para dar el nombre final. Por ejemplo 6501 estaba compuesto por "6" mg/ml de colágeno + "6" millones de células + "5" mi de gel + "0.01"% de glutaraldehído .

Tabla 7. Tabla de propiedades físicas de iteraciones del dispositivo.

Tabla 7: Tabla de propiedades físicas de los diámetros y pesos secos de las iteraciones de los 6 dispositivos finales. Se midieron los diámetros de n = 5 dispositivos. Los pesos se midieron de n = 3 dispositivos. *medidas tomadas en sólo n = 2 dispositivos.

Las seis versiones de los dispositivos bioactivos basados en colágeno discutidos en esta sección fueron igualmente delgados y flexible en el estado deshidratado. La rehidratación de los dispositivos reveló diferencias en durabilidad, difiriendo específicamente con las diferentes concentraciones de reticulación con glutaraldehído. Los dispositivos reticulados con 0.05% fueron sustancialmente más rígidos, aunque todavía flexibles. El dispositivo reticulado 66005 con 0.005% de glutaraldehído fue muy flexible y plegable sin romperse después del manejo. En general, estos seis dispositivos oscilaron en la flexibilidad, pero tuvieron gestión y manejo aceptables. Los dispositivos generados a partir de volúmenes de gel de colágeno de 7 mi se notaron más grueso después de la rehidratación en comparación con las versiones de 5 y 6 mi .

Propiedades funcionales de los dispositivos La bioactividad y resistencia de los dispositivos se evaluaron y compararon. El factor de crecimiento endotelial vascular, VEGF, es una proteína competente que puede ser terapéuticamente beneficioso para la curación y regeneración de tejidos y se expresa en cantidades elevadas por la hAB -SC en cultivo. La cantidad de VEGF contenida en los geles de colágeno se usó como un marcador sustituto de la bioactividad de los dispositivos.

La resistencia de la configuración del dispositivo es importante en la factibilidad del manejo, durabilidad, y uso de estos dispositivos como un producto potencial. La aplicación del dispositivo como un producto para ayudar en la curación o regeneración de un tejido puede incluir con mucha probabilidad la sutura del dispositivo al tejido y por lo tanto se evaluó la resistencia mediante la prueba de retención de la sutura para comparar las iteraciones del dispositivo .

Las cantidades de VEGF contenidas en los dispositivos se midieron por la digestión con la colagenasa en mediciones de ELISA realizadas en estos digestos de colagenasa. La prueba de retención de la sutura se realizó usando equipo de laboratorio estándar. El dispositivo se aseguró con una pinza en el extremo superior y una puntada de sutura colchón a través del extremo inferior. La sutura se unió con una cesta de pesos. La resistencia de los dispositivos se evaluó aumentando el peso hasta que el dispositivo falle y el hilo de sutura se estire. Una fotografía del dispositivo 6601 contenido en el aparato de prueba de resistencia durante una prueba de retención de la sutura mientras sostiene un peso de 20g se muestra en la Figura 56.

La Figura 57 y 58 demuestra los resultados para las cantidades de VEGF (ng) contenidas en los dispositivos, así como las cargas máximas de peso (g) que los dispositivos pueden soportar antes de fallar durante la prueba de retención de la sutura. La Figura 51 demuestra estos resultados para quince iteraciones diferentes del dispositivo con la Figura 58 que representa los mismos datos de sólo las seis iteraciones finales.

Observaciones : 1. Los niveles de VEGF fueron inferiores en el dispositivo creado a partir de células cultivadas en comparación con las hABM-SC criopreservadas que se descongelaron rápidamente y adicionaron al colágeno. 2. Los niveles de VEGF fueron superiores en todos los dispositivos fabricados con el colágeno de 6 mg/ml en comparación con el de 4 mg/ml. 3. Los dispositivos con 6 mg/ml de concentración de colágeno reticulado ya sea con 0.005% o 0.01% de glutaraldehído contienen como promedio cantidades de VEGF de 20 ng o superior. 4. Los más fuertes de los dispositivos con concentración de colágeno de 4 mg/ml, 46005 y 4601, contienen menos que 20 ng de VEGF. 5. Aumentar el volumen de gel, sin la adición de más células o aumentar la concentración de colágeno, se correlaciona con el contenido superior de VEGF. 6. Parece que hay una relación inversa entre la resistencia (concentración de glutaraldehído) y bioactividad; resistencia o concentración superior de glutaraldehído se correlaciona con una bioactividad inferior. 7. 6 mg/ml de colágeno reticulado con 0.05% de glutaraldehído puede soportar más peso que los dispositivos reticulado con 0.01%. 8. Una tendencia parece mostrar que disminuye la resistencia con el aumento del volumen de gel de colágeno por encima de 5 mi.

Una compensación se observó entre optimizar la resistencia máxima con la bioactividad máxima. La mayoría de los dispositivos con niveles muy altos de VEGF tuvieron poca resistencia, y aquellos con más resistencia tuvieron niveles de VEGF inferiores (por debajo de 10 ng) .

La Figura 58 representa los mismos datos de la Figura 57 pero sólo para cinco de los seis dispositivos que se consideraron además como candidatos potenciales del producto. Los datos del dispositivo 6701 no se completaron porque hubo muy pocos dispositivos fabricados de esta iteración que se usaron a su vez para otros estudios. Estas iteraciones del dispositivo representan dispositivos que son factibles con la fabricación y aceptable con respecto al alcance de los criterios objetivos iniciales; 1) muy delgado, 2) flexible, 3) durable 4) suficientemente fuerte como para sostener una sutura, 5) suficientemente grande como para cortarse a su tamaño y forma deseados .

Los datos e imágenes para las iteraciones del dispositivo son los que se muestran en la Figura 55, Tabla 7, y Figura 58. Las diferencias y características notables de estos dispositivos: Iteración del dispositivo 66005 tiene la concentración de glutaraldehído inferior de 0.005%, que puede permitir al dispositivo degradarse más rápidamente in vivo que las otras iteraciones finales.

Dispositivos 6501, 6601 y 6701 mantienen un buen equilibrio entre resistencia y bioactividad con niveles moderados de ambos , Dispositivos 6501, 6601 y 6701 difieren en los diámetros de dispositivo y espesores potenciales después de la rehidratación. 6501 tiene el diámetro más pequeño y es el más delgado, mientras que 6701 tiene el diámetro más grande y es más grueso.

Los dispositivos 6505 y 6705 tienen una reticulación con el glutaraldehído superior de 0.05% y por lo tanto dan lugar a dispositivos que son mucho más fuerte con bioactividad alrededor de 10 ng de VEGF.

Ejemplo 22 Pruebas del dispositivo bioactivo basado en colágeno de eparación del tendón de la mano Introducción : Los principales objetivos de este Ejemplo fueron probar las propiedades mecánicas, incluyendo flexibilidad, facilidad de uso y manejo de los dispositivos bioactivos basados en colágeno de la presente invención en un modelo de cadáver humano para reparar el tendón flexor de la mano. Un objetivo secundario fue discutir ampliamente las propiedades bioquímicas y físicas competentes de los dispositivos que pueden ofrecer ventajas en la cirugía del tendón flexor. Por último, el estudio evaluó el uso potencial de un dispositivo basado en PLGA como espaciador en la articulación CMC esto se simuló también usando el mismo miembro cadavérico .

Métodos : Un cadáver fresco congelado se usó para simular laceración del tendón flexor y posterior reparación aumentada con los dispositivos de la invención. De manera estándar, una exposición extensible se realizó revelando la vaina del tendón flexor, tendones flexores, así como el sistema de polea. Usando una cuchilla estándar # 15, múltiples tendones flexores se laceraron en diversas zonas anatómicas, incluyendo Zonas Verdan 1-3 (Zona 1 que es distal a la inserción FDS, Zona 2 proximal a la inserción FDS al nivel de las articulaciones metacarpo- falangiano (MCF) , Zona 3 proximal a la articulación MCP en la extensión distal del ligamento transverso del carpo) . Los tendones flexores se repararon con una técnica estándar que consiste en Fiberwire 4-0 con una puntada Bunnell modificada. Los dispositivos se colocaron entonces circunferencialmente alrededor de la reparación. Se suturaron en el lugar con Prolene 6-0 o se envolvió delicadamente alrededor del tendón para efectuar una cobertira circunferencial completa. Los tendones se movilizaron después para asegurar que el dispositivo no se desplazó fuera de sitio del tendón lacerado. Varios dispositivos se utilizaron y analizaron de acuerdo con la facilidad de uso, flexibilidad, capacidad de aceptar puntadas, y capacidad de permanecer en su lugar después de la movilización del tendón.

Resultados Basado en las pruebas de tres dispositivos bioactivos basados en colágeno separados (46000, 46001, y 46000-001; Figura 59), el primer dispositivo (46001, reticulado) se manejó más fácil que los dispositivos posteriores evaluados (46000, no reticulado y 46000-001, secado al aire, reticulado, secado al aire) . Los tres dispositivos fueron capaces de aceptar suturas (Prolene, calibre 6-0) que se usan típicamente en una reparación epi-tendinosa. El dispositivo se suturó con éxito con el propio tendón sin dificultad con el uso de la técnica de microcirugía estándar (Figura 60). Aunque más difícil, el dispositivo se puede suturar a sí mismo .

Después de sumergir los dispositivos en agua estéril, todos fueron flexibles y capaces de adaptarse al tendón en un patrón circunferencial. El dispositivo no reticulado 46000, sin embargo, se volvió pastoso y menos sólido con la manipulación adicional, lo que sugiere que, al menos para los dispositivos no reticulados, pre-humedecer antes de la aplicación puede no ser deseable. También hubo formación de retorcimiento en los dispositivos hidratados con movilización activa del tendón, simulando protocolos de rehabilitación temprana (es decir, colocar y sostener o movimiento activo temprano) utilizados frecuentemente en los días posteriores a la cirugía. Como resultado, los conceptos para aplicar los dispositivos en su forma seca y/o cortar los dispositivos en tiras se discutieron como opciones para minimizar el "retorcimiento y agrupamiento" con el movimiento temprano (Figura 61) . Los dispositivos se probaron después en su forma seca; a diferencia de aquellos que se pre-humedecieron, estos parecen integrarse bien con el tendón subyacente sin agrupamiento. En modalidades, en el período post-operatorio temprano cuando no hay movilización activa del tendón, un producto que tiene una liberación inmediata de los factores puede ser más eficaz que uno que tiene una liberación más lenta en el tiempo. Si el dispositivo debe migrar del área de reparación, sin embargo, los factores locales serán incapaces de actuar sobre el tejido local. En una modalidad, el dispositivo se dejó en el lado dorsal del tendón, impidiendo posiblemente al sustrato desplazarse sobre la superficie palmar.

Las opciones actuales de tratamiento quirúrgico para la cirugía de la artritis del pulgar (Artroplastia CMC) consisten en un procedimiento en el que se extirpa ya sea una parte de, o el trapecio completo durante la cirugía de la artritis del pulgar. Varias técnicas y modificaciones se describieron para tratar esta forma común de artritis. Un dispositivo de la presente invención (Figura 62) se colocó en la articulación del pulgar CMC, seguida la disección cadavérica de rutina. El espaciador parece ser del tamaño adecuado para esta articulación y se fija bien en el espacio (Figura 63 ) .

Ejemplo 23 Prueba del dispositivo bioactivo basado en colágeno de reparación del tendón de la mano Introducción: Los objetivos principales del estudio fueron para probar las propiedades físicas y mecánicas, incluyendo tamaño, forma, flexibilidad y manejo de dispositivos bioactivos basados en colágeno de acuerdo con la invención en un modelo de cadáver humano para reparar el tendón flexor de la mano. El principal objetivo de estas pruebas fue evaluar múltiples dispositivos para identificar un único dispositivo preferido que puede ofrecer ventajas en la cirugía del tendón flexor .

Diseño del estudio: Los dispositivos se evaluaron primero por su apariencia física general; tamaño, forma, flexibilidad, durabilidad, facilidad de manipulación.

Los dispositivos que se consideraron apropiados basado en evaluaciones preliminares físicas, se cortaron en tiras y aplicaron a un tendón.

Los dispositivos que se pueden aplicar con éxito a o alrededor de un tendón, se evaluaron en la capacidad de soportar el movimiento.

Métodos : Un cadáver fresco congelado se usó para simular laceración del tendón flexor y posterior reparación aumentada con dispositivos médicos implantables de tejidos blandos de la invención. De un modo estándar, una exposición extensible se realizó revelando la vaina del tendón flexor, tendones flexores, así como, el sistema de poleas. Usando una cuchilla estándar # 15, los tendones flexores se laceraron en diferentes zonas anatómicas, incluyendo Zonas Verdán 1-3 (Zona 1 que es distal a la inserción FDS, Zona 2 proximal a la inserción FDS al nivel de las articulaciones matacrpo-falangianas (MCF) , Zona 3 que es proximal a la articulación MCP en la extensión distal del ligamento transverso del carpo) . Los tendones flexores se repararon con una técnica estándar consiste en Fiberwire 4-0 con una puntada Bunnell modificada (Figura 64) . Los dispositivos se suturaron en su lugar a varios niveles (Zonas 1-3) dentro del sistema de polea del tendón flexor en un esfuerzo para reproducir las limitaciones anatómicas que se encuentran con frecuencia. Específicamente, el tendón flexor del dedo largo se seccionó en la región de la zona 3 , que requiere tanto una reparación primaria del tendón flexor, además de la potenciación con un dispositivo de la invención. El dedo índice se preparó específicamente para aceptar un dispositivo en la zona 2, tradicionalmente un área que representa una reparación difícil debido a la naturaleza crítica de sus sistemas de poleas, así como el espacio limitado para aceptar en teoría el volumen adicionado.

Antes de la aplicación, los dispositivos circulares se cortaron en tres a cuatro tiras. Las tiras intermedias se usaron primero. Las tiras del dispositivo se aplicaron a los tendones reparados o normales envolviéndose alrededor de la circunferencia con una configuración de solapamiento lineal o con una configuración de no- solapamiento "moño". En la aplicación de solapamiento lineal, el dispositivo se envolvió lineal y completamente alrededor del tendón solapándose sobre sí mismo y se aseguró con una puntada a través de extremo del dispositivo que se solapa debajo del propio dispositivo. La aplicación "moño" se realizó en algunos casos e incluyó envolver el dispositivo alrededor de la circunferencia del tendón sin solapamiento y en su lugar poner los extremos paralelos entre sí. En esta configuración, el dispositivo se aseguró al tendón en tres lugares con una puntada en cada extremo del dispositivo debajo del tendón y cosió uno en el medio que sostiene juntas las piezas adyacentes del dispositivo. Suturas Prolene 6-0 se usaron en asegurar el dispositivo al tendón. Los tendones se movilizaron después para asegurar que el dispositivo no desplazó fuera del sitio de tendón lacerado. Diversas iteraciones del dispositivo se usaron y evaluaron, tanto en los estados seco como hidratado (10 minutos de hidratación en agua), de acuerdo con las dimensiones físicas, facilidad de uso, flexibilidad, capacidad de aceptar puntadas, y capacidad de permanecer en su lugar después de la movilización del tendón.

Resultados A continuación se presenta una revisión de seis dispositivos bioactivos basados en colágeno diferentes (cinco iteraciones representadas en la Figura 65) . La Tabla 8 representa la evaluación general de cada dispositivo después de la evaluación de las dimensiones, retención de sutura, adecuación en el uso y aplicación para reparar el tendón flexor .

Dispositivos aplicados en seco: Dispositivos aplicados después de 10 min de rehidratación : Tabla 8. Resumen de los resultados al probar todas las iteraciones del dispositivo prototipo tanto secas como hidratadas para la aceptación de las dimensiones y retención de sutura después de la aplicación para reparar el tendón flexor (NP = sin realizar; NC = sin comentario) .

A continuación la sección discute las observaciones específicas hechas durante la prueba de cada una de las seis iteraciones de los dispositivos probados en este estudio: Dispositivo 6501: El diámetro del dispositivo seco 6501 permitió la envoltura completa alrededor del tendón flexor extirpado del dedo de largo, en la zona 3, pero no dejó el exceso de material para la manipulación adicional (Figura 66) . El diámetro del dispositivo 6501 en el estado húmedo fue todavía bastante pequeño, pero el espesor fue aceptable. La flexibilidad y resistencia de la sutura de este dispositivo fue buena .

Dispositivo 6601: Una tira del dispositivo 6601 se aplicó al tendón del dedo pequeño en la zona 3. El diámetro fue muy aceptable, con una longitud que permite la configuración moño con el exceso de material (mostrado en la Figura 67) . El manejo y flexibilidad del dispositivo en los estados tanto seco como hidratado fue aceptable durante la aplicación del dispositivo al tendón. La tira de dispositivo 6601 aceptó bien las suturas tanto abajo en el tendón como en sí misma. Esta ubicación en la zona 3 del dedo pequeño limitó específicamente el espacio alrededor del tendón, pero el dispositivo se aplicó fácilmente al tendón y se suturó deslizándose suave dentro del espacio. Durante la movilización del tendón el dispositivo se mantuvo en su lugar a lo largo la circunferencia y se deslizó suavemente con el tendón .

Dispositivo 6701: El dispositivo 6701 se pudo cortar en tiras múltiples. Una única tira seca, se colocó en la reparación de la polea A2, que rodea el dedo índice del tendón flexor, con el consiguiente cierre de la vaina y fue bien tolerada con la movilización del dedo con el dispositivo que permanece unido al tendón de deslizamiento de la zona 2 (Figura 68a) . El espacio disponible dentro de esta posición a lo largo del tendón flexor del dedo índice es específicamente estrecho y limitado, pero el dispositivo se pudo aplicar y suturar en el tendón más adecuadamente que con la unión posterior que permanece durante el deslizamiento de la polea.

Sin embargo, una tira rehidratada del dispositivo 6701 se aplicó a la zona 3 del dedo medio volviéndose demasiado gruesa y no retuvo bien las suturas durante la aplicación en el tendón (Figura 68b) . El diámetro del dispositivo 6701 fue preferido dejando exceso de longitud después de envolver alrededor de los tendones para permitir manipulaciones adicionales .

Dispositivo 6505: Este dispositivo se observó tener un diámetro similar al de 6501, que fue demasiado pequeño, y por lo tanto los dispositivos 6505 no se probaron adicionalmente . La aplicación al tendón no se realizó.

Dispositivo 6705: La flexibilidad del dispositivo 6705 fue buena y el espesor fue satisfactorio, tanto cuando estaba seco y después de la hidratación. La aplicación de este dispositivo fue muy aceptable con flexibilidad durante la aplicación alrededor del tendón. Se pudo suturar bien con la aplicación "moño" al tendón en la zona 3 del dedo índice que tiene cada extremo de la tira del dispositivo suturada al tendón y una única sutura a través de piezas adyacentes del dispositivo (tres suturas representadas en la Figura 69) . El espacio disponible a lo largo el tendón flexor del dedo índice es específicamente estrecho y limitado, pero el dispositivo se pudo aplicar y suturar el tendón más que adecuadamente.

Dispositivo 66005: El diámetro y el espesor del dispositivo 66005, tanto en seco como rehidratado, fue muy aceptable. Una tira del dispositivo de 66005 en estado seco, se aplicó al tendón del dedo anular, zona 3, usando la configuración de solapamiento lineal. Después de la movilización del tendón, el dispositivo resistió el " agrupamiento" y se rompió en el sitio de la sutura desplazándose lejos del tendón. Una segunda tira se aplicó usando la configuración moño con la sutura en el tendón. Cuando el sistema de poleas se empleó, la movilización fue aceptable.

Conclusión: Basado en las pruebas de seis dispositivos bioactivos basados en colágeno separados (6501, 6601, 6701, 6505, 6705, y 66005; Figura 65- observar que 66005 falta en la foto), todos fueron versiones mejoradas en comparación con los dispositivos evaluados en el Ejemplo 22. Todos los dispositivos de segunda generación fueron más duraderos con manejo mejorado, en particular en el estado hidratado. Cuatro de los seis dispositivos pudieron aceptar bien las suturas (Prolene, calibre 6-0) que se usan típicamente en una reparación epi- tendinosa (uno que es aceptable y uno no se probó) . Estos cuatro dispositivos se aseguraron con éxito por el tendón sin dificultad (tanto suturado en el tendón como en sí mismo) y resistió la movilización de los tendones sin desplazamiento del dispositivo lejos del tendón. Todos los dispositivos aplicados a los tendones de las zonas 2 y 3, incluyendo el espacio restringido de la zona 2 del dedo índice y de la zona 3 del dedo pequeño, fueron fácilmente capaces de fijarse dentro del espacio alrededor del tendón durante la aplicación y después de la aplicación con la movilización de los tendones. La manipulación y aplicación de los dispositivos en los tendones con sutura fue preferida en el estado seco. En general, la iteración del dispositivo 6601 fue el dispositivo preferido basado en los aspectos probados; dimensiones del dispositivo, flexibilidad, manejo, aplicación y aseguramiento al tendón con suturas.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes REIVINDICACIONES ;

1. Una matriz biocompatible o biodegradable que comprende una población aislada de células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación derivadas de la médula ósea (CF-SC) o cultivos de células acondicionadas derivados de dichas células, en donde dichas CF-SC no tienen capacidad de diferenciación multipotente , en donde dichas CF-SC tienen un cariotipo normal, en donde dichas CF-SC no son inmortalizadas, en donde dichas CF-SC expresan CD13, CD44, CD49c, CD90, HLA Clase-1 y ? (beta) 2 -Microglobulina, y en donde dichas CF-SC no expresan CD10, CD34, CD45, CD62L, o CD106.

2. Un tejido o neotejido que comprende la matriz de la reivindicación 1.

3. La matriz de la reivindicación 1, que además comprende un compuesto farmacéuticamente aceptable.

4. La matriz de la reivindicación 3, en donde el compuesto se selecciona del grupo que consiste de un lípido, una proteína, un ácido nucleico, un antiinflamatorio, un antibiótico, una vitamina, y un mineral.

5. La matriz de la reivindicación 1, que comprende una proteína seleccionada del grupo que consiste de una proteína del plasma sanguíneo bovino, porcino y/o humano natural o recombinante .

6. La matriz de la reivindicación 5, en donde la proteína es trombina o fibrinógeno.

7. La matriz de la reivindicación 1, en donde la matriz comprende colágeno o ácido poliglicólico .

8. La matriz de la reivindicación 1, en donde la matriz comprende colágeno a una concentración de 4 mg/ml a 6 mg/ml .

9. Un método para tratar una afección médica en un paciente que lo necesita, que comprende contactar la matriz de la reivindicación 1 con el paciente.

10. El método de la reivindicación 9, en donde la afección médica es dermatológica.

11. El método de la reivindicación 10, en donde la herida es una herida de pie diabético, una herida por úlcera venosa de la pierna, o una herida post-quirúrgica .

12. El método de la reivindicación 9, en donde la afección médica es ortopédica.

13. La matriz de la reivindicación 1, en donde dichas CF-SC se derivan de una fuente no humana.

14. La matriz, de la reivindicación 13, en donde la fuente no humana se selecciona del grupo que consiste de: una fuente equina; una fuente porcina; una fuente canina; una fuente felina; una fuente bovina ; una fuente ovina; una fuente caprina; una fuente de camélidos y una fuente murina.

15. El método de la reivindicación 9, en donde el paciente es un animal no humano.

16. Un método para preparar una composición farmacéutica que comprende: (a) preparar una solución que comprende colágeno soluble ; (b) suspender la población aislada de células somáticas formadoras de colonias de auto-renovación derivadas de la médula ósea (CF-SC) , en donde dichas CF-SC no tienen capacidad de diferenciación multipotente , en donde dichas CF-SC tienen un cariotipo normal, en donde dichas CF-SC no son inmortalizadas, en donde dichas CF-SC expresan CD13, CD44, CD49c, CD90, HLA Clase-1 y ? (beta) 2-Microglobulina, y en donde dichas CF-SC no expresan CD10, CD34, CD45, CD62L, o CD106 en la solución de (a) ; y, (c) transferir la suspensión celular de (b) a un molde del tejido.

17. Un polvo que comprende la matriz de la reivindicación 1.

18. El polvo de la reivindicación 17, en donde la matriz comprende colágeno o ácido poliglicólico .

19. Un método para tratar una afección médica en un paciente que lo necesita que comprende contactar el polvo de la reivindicación 17 con el paciente.

20. El método de la reivindicación 19, en donde la afección médica se selecciona del grupo que consiste de una herida abierta, una deformación dérmica, una cicatriz en las cuerdas vocales, una quemadura de tercer grado y una lesión periodontal .