MX2012011639A - Particula viral liberada despues de la infeccion de celulas mamiferas mediante citomegalovirus humano (hcmv) que contiene una proteina de fusion y su uso. - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a una partícula viral liberada después de la infección de células mamíferas mediante citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), en donde a) la partícula está rodeada por una membrana de lípido en la cual se incrustan glicoproteínas virales, b) la partícula no contiene ADN viral ni cápsides; y c) la partícula contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterólogo, y en donde por lo menos un péptido heterólogo se inserta en la posición W175 o A534 del aminoácido de la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T.

Description

PARTICULA VIRAL LIBERADA DESPUES DE LA INFECCION DE CELULAS MAMIFERAS MEDIANTE CITOMEGALOVIRUS HUMANO (HCMV) QUE CONTIENE UNA PROTEINA DE FUSION Y SU USO Descripción de la Invención La presente invención se refiere a una partícula viral liberada después de la infección de células mamíferas mediante citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), en donde a) la partícula está rodeada por una membrana de lípido en la cual se incrustan glicoproteínas virales, b) la partícula no contiene ADN viral ni cápsides; y c) la partícula contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos de un péptido heterólogo; y el uso de tal partícula viral o de una pluralidad de tal partícula viral.

La infección con el citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés) es una causa importante de la enfermedad en pacientes después del trasplante de órgano sólido o de células madre hematopoyéticas [1-9]. Además, la transmisión del virus durante el embarazo es una de las causas más frecuentes de secuelas duraderas en el recién nacido en el hemisferio occidental [10; 11]. El desarrollo de una vacuna de HCMV se ha identificado así como un objetivo altamente prioritario [12].

Un propósito de tal vacuna será prevenir la infección en la madre o, por lo menos, la transmisión a través de la placenta. La inducción de anticuerpos neutralizantes se considera esencial para alcanzar esto. En cambio, la protección contra la reactivación y control de la infección en receptores de trasplante se considera producirse por respuestas celulares, particularmente mediadas a través de células T CD8 [13-15]. La vacunación terapéutica de receptores de trasplante, que trata la respuesta de linfocito, combinada posiblemente con transferencia de célula T adoptiva sería deseable para mejorar las consecuencias de la reactivación viral de HCMV en el período después del trasplante [16].

A pesar de procesos prometedores para desarrollar una vacuna de HCMV, todavía sin embargo no hay formulación autorizada disponible [10; 17-19]. A partir de numerosos estudios que tratan los efectores inmunológicos que producen la protección, parece evidente que una vacuna ideal contra HCMV debe inducir los anticuerpos neutralizantes antivírales y linfocitos T [10; 17; 18;38]. Hay, sin embargo, preocupación si tal vacuna de HCMV universal nunca pudo establecerse. Un estudio clínico reciente mostró que los replicones de alfavirus que expresan proteínas de HCMV fueron bien tolerados y se indujeron las respuestas celulares y humorales [19]. Otro estudio empleó gB purificado como una vacuna y proporcionó resultados alentadores, puesto que niveles significativos de anticuerpos neutralizantes de HCMV podrán inducirse [18]. Estas vacunas mantienen la promesa de utilizarse para la prevención de la infección por HCMV congénito.

En estudios anteriores en ratones, los llamados cuerpos densos, que también se refieren en la presente como DB, resultaron ser asombrosamente inmunogenéticos [20]. Como se entiende generalmente en la técnica y como también se utiliza en la presente un cuerpo denso es una partícula viral liberada después de la infección de células mamíferas mediante el citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), en donde a) la partícula está rodeada por una membrana de lípido en la cual se incrustan glicoproteínas virales, b) la partícula no contiene ADN viral ni cápsides.

Preferiblemente tal cuerpo denso también contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterólogo. Los cuerpos densos y su preparación también se describen en la solicitud de patente internacional WO 00/53729.

En vista de su inmunogenicidad sorprendente, se hicieron esfuerzos para desarrollar el DB como una vacuna de HCMV. Experimentos recientes proporcionaron evidencia experimental que DB puede modificarse en su contenido antigénico [21;22]. Esto se alcanzó expresando una proteína de fusión que consiste del DB principal-componente pp65 y un péptido presentado por MHC-clase I heterologo a partir de la proteína IE1 viral mediante un HCMV recombinante. Esto dio lugar a la formación de DB recombinante (recDB, por sus siglas en inglés) en fibroblastos de humanos infectados del prepucio. El recDB que contiene la proteína de fusión se liberó del HFF infectado [21]. La aplicación de estas partículas a ratones HHD transgénicos con HLA-A2 indujo una respuesta del linfocito T CD8 + , que llegó a ser evidente después de la estimulación del péptido in vitro de células T aisladas [22]. Sin embargo, las células T específicas de HCMV no podrían detectarse inmediatamente cuando las fracciones de célula T CD8+ se prueben directamente ex-vivo mediante el análisis Elispot. Esto indicó que, aunque en principio adecuado para aplicación terapéutica, el cebado no fue tan prominente como deseable con estas partículas. Además de esto, fue reducido el rendimiento de estos recDB a partir de cultivos de HFF infectados.

Por lo tanto, el problema subyacente de la presente invención fue proporcionar un cuerpo denso viral el cual es adecuado como una vacuna, en donde el cuerpo denso viral contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterologo y en donde preferiblemente la vacuna es capaz de producir una inmunorespuesta a por lo menos un péptido heterologo.

Un problema adicional subyacente de la presente invención fue proporcionar un cuerpo denso viral, en donde el cuerpo denso viral contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterólogo y en donde preferiblemente el cuerpo denso es capaz de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes y/o una respuesta del linfocito T CD8 + .

Un problema aún más subyacente de la presente invención fue proporcionar un cuerpo denso viral, en donde el cuerpo denso viral contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterólogo y en donde el cuerpo denso puede prepararse a altos rendimientos. Éstos y otros problemas son solucionados por la materia objeto de las reivindicaciones independientes anexas. Las modalidades preferidas pueden tomarse también de las reivindicaciones dependientes anexas.

Más específicamente, el problema subyacente de la presente invención es solucionado en un primer aspecto que es también la primera modalidad del primer aspecto, por una partícula viral liberada después de la infección de células mamíferas mediante el citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), en donde a) la partícula está rodeada por una membrana de lípido en la cual se incrustan glicoproteínas virales, b) la partícula no contiene ADN viral ni cápsides; y c) la partícula contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterólogo, y en donde por lo menos un péptido heterólogo se inserta en la posición W175 o A534 del aminoácido de la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T.

En una segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo se inserta en la posición W175 del aminoácido de la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T.

En una tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera y segunda modalidad del primer aspecto, la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T comprende una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO: 1.

En una cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda y tercera modalidad del primer aspecto, la partícula es altamente antigénica.

En una quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera y cuarta modalidad del primer aspecto, la partícula es capaz de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes.

En una sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta y quinta modalidad del primer aspecto, la partícula es capaz de inducir una respuesta del linfocito T CD8 + .

En una séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta y sexta modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo es un antígeno presentado por MHC-clase I.

En una octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta y séptima modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o se forma de una o más partes de una o más proteínas que son diferentes de pp65.

En una novena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de una glicoproteína de HCMV.

En una décima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava y novena modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de la glicoproteína gB de HCMV.

En una undécima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava y novena modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de la glicoproteína gH de HCMV.

En una duodécima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava y novena modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos dos glicoproteínas de HCMV que son variantes de una glicoproteína particular de diferentes cepas de HCMV.

En una decimotercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la duodécima modalidad del primer aspecto, una de al menos dos variantes de la glicoproteína particular es la variante de la cepa Towne de HCMV y la otra de por lo menos las dos variantes de la glicoproteína particular es la variante de la cepa Ad169 de HCMV.

En una decimocuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la duodécima y la decimotercera modalidad del primer aspecto, la glicoproteína es la proteína gB de HCMV.

En una decimoquinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de la proteína IE1 de HCMV.

En una decimosexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de una glicoproteína de HCMV y una o más partes de la proteína HCMV IE1.

En una decimoséptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima y octava modalidad del primer aspecto, por lo menos un péptido heterólogo es una o más partes de una proteína que es parte de un patógeno humano distinto a HCMV.

En una decimoctava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la decimoséptima modalidad del primer aspecto, la proteína que es parte de un patógeno humano distinto de HCMV, es una proteína contra la cual los linfocitos citotóxicos T se forman en humanos durante la infección natural de humanos con el patógeno humano distinto de HCMV.

En una decimonovena modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la decimoctava modalidad del primer aspecto, el patógeno humano distinto de HCMV es el patógeno humano seleccionado del grupo que comprende HIV-1, HBV, HCV e influenza.

En una vigésima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava y decimonovena modalidad del primer aspecto, la proteína de fusión es una proteína de fusión que comprende un antígeno pp65 de célula T de longitud completa y por lo menos un péptido heterólogo.

En una vigésima primera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena y vigésima modalidad del primer aspecto, la partícula viral, o una pluralidad de tal partícula, es para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad .

En una vigésima segunda modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena y vigésima modalidad del primer aspecto, la partícula viral, o una pluralidad de tal partícula, es para uso en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

En una vigésima tercera modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima primera y vigésima segunda modalidad del primer aspecto, la enfermedad es una enfermedad que puede tratarse y/o prevenirse mediante la formación de anticuerpos neutralizantes contra por lo menos un péptido heterólogo o un derivado de los mismos, o por la inducción de una respuesta de linfocito T CD8+ contra por lo menos un péptido heterólogo o un derivado del mismo.

En una vigésima cuarta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena y vigésima modalidad del primer aspecto, la partícula viral, o una pluralidad de tal partícula, es para la fabricación de una vacuna.

En una vigésima quinta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima cuarta modalidad del primer aspecto, la vacuna es para el tratamiento y/o prevención de la infección por HCMV.

En una vigésima sexta modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima cuarta modalidad del primer aspecto, la vacuna es para el tratamiento y/o prevención de efectos secundarios del trasplante.

En una vigésima séptima modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima sexta modalidad del primer aspecto, el trasplante es el trasplante de un órgano sólido o células madre hematopoyéticas.

En una vigésima octava modalidad del primer aspecto que es también una modalidad de la vigésima sexta y vigésima séptima modalidad del primer aspecto, el efecto secundario es causado por o es acompañada con una infección por HCMV.

El problema subyacente de la presente invención se soluciona en un segundo aspecto que es también la primera modalidad del segundo aspecto, mediante el uso una partícula viral de acuerdo con cualquiera de la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena y vigésima modalidad del primer aspecto para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o efectos secundarios, por lo que la enfermedad o efectos secundarios, es una enfermedad o son los efectos secundarios como se define en cada una y cualquiera de las modalidades anteriores y en cada uno y cualquier aspecto.

El problema subyacente de la presente invención se soluciona en un tercer aspecto que es también la primera modalidad del tercer aspecto, mediante el uso de una partícula viral de acuerdo con la primera, segunda, tercera, cuarta, quinta, sexta, séptima, octava, novena, décima, undécima, duodécima, decimotercera, decimocuarta, decimoquinta, decimosexta, decimoséptima, decimoctava, decimonovena y vigésima modalidad del primer aspecto para la fabricación de una vacuna para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o efectos secundarios, por lo que la enfermedad o efectos secundarios es una enfermedad o son efectos secundarios como se define en cada una y cualquiera de las modalidades precedentes y de cada uno y cualquier aspecto.

Basándose en el conocimiento de que el sitio de inserción para secuencias de péptido heterólogas en pp65 fue crítico para la eficiencia de la formación del DB subsecuente, los presentes inventores han encontrado sorpresivamente que la proteína de fusión que se contiene en las partículas virales de la invención y que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos de un péptido heterólogo, confiere características ventajosas al DB si el péptido heterólogo se inserta en la posición W 175 del aminoácido o en la posición A534 del aminoácido de la secuencia del aminoácido pp65. Las características ventajosas de estas proteínas de la fusión comprenden la inducción de anticuerpos neutralizantes contra el péptido heterólogo, la inducción de una respuesta del linfocito T CD8+ al péptido heterólogo y la producción de tal DB a un alto rendimiento. Además, estos dos lugares en pp65 permiten la formación y liberación eficiente de DB que contienen las proteínas de fusión. La respuesta del linfocito T CD8+ observada para estas dos respuestas de las células T CD8 cebadas con las proteínas de fusión, que son fácilmente detectables mediante análisis de Elispot ex vivo de las fracciones de célula T CD8.

El antígeno pp65 de célula T, que también se refiere en la técnica como UL 83, se ha descrito por Pande, H. y colaboradores. (Pande, H, Lee, T.D., Churchill, M.A. y Zaia, J.A, "Structural analysis of a 64-kDa major structural protein of human cytomegalovirus (Towne): identification of a phosphorylation site and comparison to pp65 of HCMV (AD 169); Virology 178 (1), 6-14 (1990)).

Poco se conoce sobre la función de pp65 y sobre los dominios, importante para la función y plegamiento apropiado de la proteína. Por lo tanto, no hay ninguna justificación para la selección de sitio de inserción que definitivamente ahorra las regiones funcionalmente relevantes dentro de pp65. La selección de sitio de inserción se realizó de una manera para evitar las regiones conservadas en beta-herpesvirus y también estructuras secundarias previstas (hélices a y placas ß). Esto se hizo asumiendo que las regiones conservadas, hélices a y placas ß podrían ser estructural y funcionalmente importantes y no deben destruirse. Sin embargo, la mayor parte de estos mutantes no pueden formar eficientemente el recDB, indicando que esta estrategia no podría identificar sitios de inserción apropiados. En la claridad de los mismos los presentes inventores encontraron sorpresivamente que los sitios de inserción en RV-SB3 y RV-SB6 demostraron ser más apropiados para la formación de recDB.

Como se muestra en la presente solicitud, la introducción exógena de pp65 quimérico mediante DB-SB3 y DB-SB6 en HFF lleva a la presentación eficiente de pp65NLV e IE1T Y. La aplicación de estas partículas a ratones HHD transgénicos con HLA-A2 ceban una respuesta de célula T CD8 contra ambos péptidos que podrán detectarse después de expansión in vitro de estas células T con el péptido cognado. Resultados similares también se han obtenido en experimentos anteriores, utilizando recDB con la inserción del péptido IE1 en la posición 548 de pp65 [21;22]. Sin embargo, utilizando el último recDB, las células T CD8 contra cualquier péptido fue directamente indetectable ex vivo, sugiriendo que el cebado fue ineficiente. La aplicación de DB-SB3, en cambio, llevó a frecuencias fácilmente detectables de células T CD8 específicas para pp65NLV e específicos para IEITMY. Esto indica que este recDB fue células T altamente inmunogenéticas e inducidas contra el péptido endógeno y heterólogo.

En una modalidad de la invención el péptido heterólogo es un péptido antigénico y más preferiblemente un péptido heterólogo antigénico.

En una modalidad de la presente invención cuyo péptido heterólogo es diferente de la proteína HCMV IE1 o de una parte del mismo.

En una modalidad de la presente invención la longitud de un péptido es de aproximadamente 4 a 40 residuos del aminoácido, preferiblemente de manera aproximada 6 a 25 residuos del aminoácido y más preferiblemente de manera aproximada 8 a 15 residuos del aminoácido y más preferiblemente de manera aproximada 8-12 residuos del aminoácido.

Como se utiliza preferiblemente, cualquier texto que especifique los límites de un intervalo tal como, por ejemplo, "de 1 a 5" se refiere a cualquier número entero de 1 a 5, es decir 1, 2, 3, 4 y 5. En otras palabras, cualquier intervalo que se defina por dos números enteros comprende ambos dos números enteros que definen los límites de la definición y cualquier número entero comprendido por o contenido dentro del intervalo.

En una modalidad de la presente invención la antigenicidad de la partícula viral de la invención se incrementó en comparación con los cuerpos densos de la técnica anterior, más específicamente los cuerpos densos en donde el cuerpo denso contiene una proteína de fusión que comprende el antígeno pp65 de célula T de longitud completa.

En una modalidad de la presente invención la formación de la partícula viral de la invención se incrementó en comparación con la formación de cuerpos densos como se describe en [25].

Se reconocerá por un experto en la técnica que, preferiblemente, la proteína IE1 de HCMV también se refiere como ppUL123.

También se reconocerá que es la proteína de fusión contenida en la partícula es, en una modalidad preferida de una proteína quimérica.

La presente invención es ahora además ilustrada por referencia a las siguientes figuras y ejemplos de los cuales las además las ventajas, características, y modalidades pueden tomarse, en donde La Fig. 1 muestra el resultado de un análisis de inmunofluorescencia indirecto de HFF, infectado con recombinantes del HCMV; La fig. 2 muestra el resultado de un análisis de inmunotransferencia (A), el resultado de un análisis de ADN-PCR cuantitativo como diagrama que indica las copias de genoma/ml como una función de tiempo (d.p.i, por sus siglas en inglés) para varias proteínas de fusión (B), y el resultado de un análisis de inmunotransferencia (C); La fig. 3 muestra el resultado de un análisis de I FN-y-Elispot como un diagrama que indica el porcentaje de células CD8+ de respuesta para varias proteínas de fusión o bien ya sea utilizando pp65NLV-CTL (A) o IE1T Y-CTL (B) como células respondedoras; La fig.4 muestra el resultado de un análisis de I FN-y-Elispot como un diagrama que indica el porcentaje de células CD8+ de respuesta para varias proteínas de fusión ya sea utilizando células RMA-S como células estimuladoras; y La fig. 5 muestra la secuencia de aminoácido de pp65 de longitud completa (SEC ID NO: 1) La fig. 1 muestra el resultado de un análisis de inmunofluorescencia indirecto de HFF, infectado con recombinantes del HCMV. Se infectaron células con los virus indicados durante cuatro días y procesaron posteriormente mediante el análisis de inmunofluorescencia. La configuración del pp65 recombinante, expresada por cada virus se indica abajo de los micrográfos. El aminoácido N-terminal de pp65, que flanquea el sitio de inserción se denota.

La fig. 2 muestra la expresión de las proteínas de fusión pp65, la replicación de virus recombinantes y eficiencia del empaquetamiento de proteínas de fusión en viriones y DB. (A), análisis de inmunotransferencia de HFF infectado 2 días y 4 días. Se infectaron células en un m.o.i. de 2 y recolectaron en los tiempos indicados para el análisis. Se probaron los filtros con el anticuerpo 65-33 monoclonal específico para pp65. Las cantidades de proteínas en cada línea se normalizaron contra ß-actina. (B), Análisis de ADN-PCR cuantitativo de genomas virales en el sobrenadante del cultivo celular de HFF infectado. Se infectaron células en un m.o.i. de 10 genomas/célula. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo en los puntos de tiempo indicados y congelaron. Se realizó el análisis de PCR en paralelo en el mismo ensayo. (C), Análisis de inmunotransferencia de pp65, empaquetado en recDB o viriones. Se infectaron células con los virus recombinantes o con RV-HB5 en peso durante 6-7 días. Se sometieron sobrenadantes a centrifugación de gradiente de glicerol-tartrato para recolectar los viriones y fracciones de DB. Se analizaron estas fracciones mediante inmunotransferencia, utilizando el anticuerpo monoclonal 65-33 o, como estándar interno, utilizando un anticuerpo monoclonal contra gB viral.

La fig. 3 muestra el resultado de un análisis de IFN-Y-Elispot de la presentación del MHC-clase I mediante HFF positivo a HLA-A2, tratado con recDB. Se trataron células con el DB indicado y utilizaron posteriormente como células estimuladoras en el análisis de IFN-Y-Elispot, utilizando pp65NLV-CTL (A) o IE1TMY-CTL (B) como células respondedoras.

La fig. 4 muestra el resultado de un análisis de IFN-Y-Elispot ex vivo de células de bazo enriquecidas con CD8+ de ratones HHD, inmunizados con el recDB. Las células RMA-S, cargadas con los péptidos cognados se tomaron como células respondedoras. Los tamaños de barra representan la mayoría de las frecuencias probables de IFN-? que secreta células T CD8, como se determina por el análisis de regresión lineal, descrito por Bóhm y colaboradores. [37]. Las barras de error indican 95% de intervalos de confianza.

Ejemplo 1: Materiales y Métodos 1. Células Se cultivaron fibroblastos de prepucio humanos primarios, líneas de CTL y células T2 como se describe antes [23]. Las células RMA-S [24] se hicieron crecer en el medio de RPMI 1640 (PAA Laboratories, Cólbe, Alemania) complementado con 10% de FCS, 2 mM de L-glutamina, 50 mg de gentamicina L-l y 5 µ? de ß-mercaptoetanol. 2. Plásmidos y virus Para la mutagénesis del ADN viral, se utilizó el cromosoma artificial bacteriano pHB5 de HCMV [25]. La mutagénesis de pHB5 se realizó de acuerdo con el procedimiento de selección positivo/negativo de galK [26] como se describe en otro lugar [21]. La secuencia del ADN insertada en el UL83 abre el marco de lectura codifica el péptido IE1TMY presentado por HLA-A2 [IE1297-305], flanqueado por aminoácidos adicionales para permitir el procesado proteasomal exacto. El polipéptido adicional fusionado a pp65 se lee TSDACMMTMYGGISLLSEFC. con el nonapéptido presentado por HLA-A2 que es subrayado. La reconstitución viral de clones BAC se realizó de acuerdo a Hobom y colaboradores. [27].

Las reservas de virus se generaron, titularon y cuantificaron contando las células positivas IE1 a 48 horas p.i. o mediante el análisis de PCR del ADN TaqMan de genomas virales extracelulares como se describe [28], HFF se infectaron durante 7 días. La infección a una moi de 0.1 dio lugar a un número de aproximadamente 10 genomas virales intracelulares. 3. Purificación del cuerpo denso, análisis de inmunofluorescencia indirecta e inmunotransferencia DB se purificó a partir de HFF infectado en etapa tardía mediante ultracentrifugación de gradiente de glicerol-tartrato como se publicó originalmente por Irmiere y Gibson [29] y describió previamente [20]. El análisis de inmunofluorescencia indirecta se realizó como se describe [30]. El pp65 se etiquetó utilizando el anticuerpo monoclonal 65-33 (amablemente proporcionado por W. Britt, University of Alabama, Birmingham, Alabama, USA) y los anticuerpos secundarios conjugados con FITC (DAKO, Hamburgo, Alemania). El núcleo se tiñó con DAPI. Los datos de análisis de inmunofluorescencia se recolectaron utilizando un microscopio Axiophot-1 (Zeiss) a ampliación de 1000 veces. Para inmunotransferencia, las muestras de proteína se desnaturalizaron bajo condiciones reductivas, separaron mediante SDS-PAGE y transfirieron sobre membranas de nitrocelulosa ( illipore, Schwalbach, Alemania) electrotransferencia a 400 mA durante 1 h 45 min. Se incubaron las membranas con anticuerpos contra pp65, ß-actina (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) y glicoproteína B (gB, por sus siglas en inglés) [31]). Los Western blots se probaron con anticuerpos secundarios anti-ratón o anticonejo, conjugaron a ALEXA Fluor 680 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) o IRdye 800 (Rockland). Las proteínas transferidas se detectaron y cuantificaron utilizando el sistema de proyección de imagen infrarrojo Odyssey (LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA). 2.4 Ensayo de Interferón ?-Elispot de HFF incubado con recDB El ensayo Immunospot ligado a enzimas (Elispot, por sus siglas en inglés) se realizó como se describe antes [23;32]. Las líneas de CTL se especifican para los péptidos pp65495-503 derivados del HCMV restringidos por HLA-A0201 (A2) (pp65NLV-CTL) [33;34] e IE1297-305 (IE1 TMY-CTL) [35] se utilizaron en estos análisis. Las líneas de CTL se han generado inmunizando ratones doble-transgénicos (tg, por sus siglas en inglés) HLA-A2 huCD8 [23]. 2.5 Modelo de ratones transgénicos HLA-A2 Ratones transgénicos HLA-A2 de 8-12 semanas de edad (ratones HHD, [36]) se inmunizaron intraperitonealmente con 6 g de DB de RV-HB5 (DB-HB5, por sus siglas en inglés), RV-SB3 (DB-SB3) o RV-SB6 (DB-SB6), respectivamente, o con PBS. Se prepararon Mnfocitos a partir de los bazos en el día 7 después de la inmunización. Se enriquecieron células T CD8 mediante MACS de clasificación y la frecuencia de células secretoras de IFN-? se analizaron mediante Elispot directamente ex vivo, utilizando células estimuladoras RMA-S HHD o T2 cargadas por péptido. En este ajuste las placas de Elispot de Millipore (Schwalbach/Ts. , Alemania) se utilizaron. Se realizó el ensayo de Elispot de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las frecuencias de células respondedoras se determinaron mediante el análisis de regresión lineal como se describe por Bóhm y colaboradores. [37]. Ejemplo 2: Selección del sitio de inserción es crítica para la formación del DB citoplásmico Como se ilustrará en este ejemplo, la selección del sitio de inserción del péptido heterólogo es crítica para la formación del DB citoplásmico.

El potencial de un candidato a la vacuna para además desarrollarse críticamente depende del rendimiento que puede alcanzarse para aumento adicional. En trabajo previo, la prueba podría documentar que DB puede modificarse en su contenido antigénico fusionando una secuencia del péptido heterólogo a la proteína pp65 de tegumento [21]. Sin embargo, las células infectadas con el recombinante respectivo de HCMV liberaron solamente cantidades limitadas de recDB. Por lo tanto, la hipótesis se probó que la inserción de la secuencia heteróloga tal como la secuencia de aminoácido de un péptido heterólogo en otros sitios dentro de pp65 mejorará el rendimiento de recDB.

Cinco sitios en diferentes porciones de la molécula se seleccionaron para la inserción (Fig. 1). El péptido insertado consistió en 20 aminoácidos que comprenden el nonapéptido presentado por HLA-A2 TMYGGISLL (IE1TMY, por sus siglas en inglés) de la proteína HCMV IE1 [35]. Se generaron virus recombinantes modificando el plásmido pHB5 de HCMV BAC [25], utilizando el procedimiento de selección basado en galK [21;22]. Se analizaron plásmidos BAC recombinantes para exactitud mediante digestión de endonucleasa de restricción y secuenciado de nucleótido del sitio de inserción (datos no mostrados). La reconstitución de virus recombinantes se realizó posteriormente mediante transfección de los plásmidos BAC en HFF. Se probaron los virus resultantes para la formación de DB. Un contraste de infección por HCMV de HFF es la acumulación citoplásmica de DB, que puede visualizarse mediante análisis de inmunofluorescencia indirecta (IFA, por sus siglas en inglés). Por lo tanto, HFF se infectó con los mutantes nuevamente generados e IFA se realizó a 4 días después de la infección (d.p.i., por sus siglas en inglés), utilizando un anticuerpo específico para pp65 (Fig. 1). Solamente las células infectadas con los mutantes RV-SB3 y RV-SB6 mostraron la formación del DB citoplásmico de una manera comparable a la formación de DB en células infectadas con virus parental. En cambio, no o solamente poca formación de DB se vio en células infectadas por RV-SB2, RV-SB4, y RV-SB5. Observar que en estas células, el traslado mucleocitoplasmático de pp65, que se ve típicamente en HFF infectado en etapa tardía se deterioró. Estos resultados indicaron que la selección de sitio para la inserción de secuencias de péptido heterólogo dentro de pp65 fue crítica para la formación de recDB. Basado en los resultados de IFA los virus RV-SB3 y RV-SB6 se eligieron para análisis adicional.

Ejemplo 3: Comparación de RV-SB3 y RV-SB6 con la cepa parental Como se mostrará en este ejemplo, los virus recombinantes RV-SB3 y RV-SB6 son comparables a la cepa parental con respecto a la expresión de pp65, virión liberado y empaquetado de pp65 en partículas.

Los niveles de expresión de pp65 en HFF infectado por RV-SB3 y RV-SB6 se probaron mediante análisis de inmunotransferencia. Se infectaron células con el virus o con RVHB5 parental por dos o cuatro días, respectivamente. Los lisados celulares se sometieron a análisis de inmunotransferencia cuantitativo, utilizando el sistema de proyección de imagen infrarrojo Odyssey. La cantidad de actinia celular se tomó como el estándar interno (Fig. 2A). Los niveles de expresión de proteínas de fusión pp65 en células infectadas por RV-SB3 y RV-SB6 se redujeron a 2 días p.i., comparados a los niveles de pp65 en células infectadas con RV-HB5 parental.

Sin embargo, a 4 días p.i., los niveles de las dos proteínas de fusión parecían ser incluso mayores como los de pp65 en células infectadas por RV-HB5. Esto indicó que suficiente proteína se sintetizó en células infectadas por RV-SB3 y RV-SB6 para dirigir la síntesis de recDB.

Para probar la capacidad de las cepas recombinantes para replicar en HFF, se infectaron células en un m.o.i. de 0.1, dando por resultado 10 copias/célula de genoma y el sobrenadante de cultivo se recolectó en intervalos diarios hasta 7 días p.i. El ADN viral liberado en el sobrenadante se cuantificó utilizando el análisis de PCR cuantitativo (Fig. 2B). Tanto RV-SB3 y RV-SB6 demostraron replicarse a niveles similares como el RV-HB5 parental.

El empaquetado de las proteínas de fusión finalmente se analizó mediante el análisis de inmunotransferencia de viriones purificados y DB, recolectados de sobrenadantes de HFF infectados mediante centrifugación de gradiente de glicerol. En este caso, la normalización se realizó utilizando la glicoproteína B (gB, por sus siglas en inglés) envuelta viral como estándar interno. No se encontraron diferencias en el empaquetado de pp65 en viriones o DBs cuando las cepas recombinantes se compararon con su cepa parental (Fig. 2C). Tomado juntos estos resultados indicaron que tanto RV-SB3 y RVSB6 fueron comparables a RV-HB5 en expresión y empaquetado de pp65 y en replicación en células infectadas.

Ejemplo 4: Expresión de pp65NLV e IE1T Y mediante HFF tratado por DB-SB3 o DB-SB6 El presente ejemplo muestra que tanto pp65NLV e IE1TMY son presentados por HFF tratado por DB-SB3 o DB-SB6.

Una meta para utilizar recDB para el desarrollo de vacunas sería para soportar la reconstitución de célula T citotóxica en pacientes después del trasplante. Estas células se han mostrado para ser de importancia crítica para la prevención de reactivación virales y enfermedad ([13; 15] repasadas en [16]). Así se probó si el recDB era capaz de introducir el pp65NLV derivado de pp65 y el IE1T Y derivado de IE1 en la trayectoria de MHC-clase I de HFF.

Por consiguiente, las células se trataron con recDB y sometieron posteriormente a análisis de interferón-? Elispot (Fig. 3). Como células respondedoras, los clones de CTL contra ambos péptidos (pp65N LV-CTL; I E 1 TM Y-CTL) se utilizaron [23]. Ambas células tratadas con DB-SB3 y DB-SB6 presentaron IE1TMY y pp65NLV. La presentación de pp65NLV fue comparable entre recDB y DB en peso, indicando que la inserción de la secuencia derivada de IE1 no deterioró la presentación de pp65 en HFF. El tratamiento de células con DB-SB3 llevó a números de IE1TMY-CTL de respuesta a niveles que fueron comparables a la respuesta de específica para pp65. Sin embargo, el tratamiento de células con DB-SB6 llevado a un número marcadamente reducido de puntos positivos en el ensayo específico para IE1. Esto indicó que la capacidad de HFF para presentar el péptido IE1 después de la incubación de DB fue sensible al sitio, en donde el péptido se insertó en pp65.

Ejemplo 5: Inmunización con DB recombinante (recDB, por sus siglas en inglés) da lugar a células T CD8 específicas para IEITMY y específicas para pp65NLV Este ejemplo muestra que la inmunización con DB recombinante (recDB, por sus siglas en inglés) ceba células T CD8 específicas para IEITMY y específicas para pp65NLV de frecuencias significativas.

Los experimentos anteriores han mostrado que recDB pude inducir células T CD8 específicas para IEITMY en ratones. Estas células fueron, sin embargo, solo detectables después de la estimulación in vitro de las fracciones de célula T CD8 de ratones inmunizados con el péptido cognado. Ninguna de las células T CD8 respondedoras se detectaron directamente ex-vivo, indicando que el número total de células específicas, y así la respuesta total a los recDB fue reducida [21]. Para evaluar el potencial inmunológico del recDB nuevamente establecido, los ratones HHD transgénicos HLA-A2 se inmunizaron con el DB diferente en ausencia de adyuvante. Como se esperó, las células T CD8 respondedoras específicas para IE1TMY o pp65NLV fueron detectables después de la estimulación in vitro (datos no mostrados) .

Las células de ratones inmunizados fueron también probadas directamente ex-vivo. Para esto, las fracciones CD8 + de las células del bazo se separadas mediante clasificación de MACS y probadas en el análisis de Elispot, utilizando células presentadoras de antígeno cargado con péptido. Las células T CD8, específicas para IE1TMY podrán detectarse después de la inmunización con DB-SB3 y DB-SB6 (Fig. 4). La respuesta de específica para IE1 preparada mediante DB-SB3 pareció ser más fuerte que la respuesta inducida por DB-SB6, pero ambas alcanzaron niveles claramente detectables.

Después de la inmunización con DB-SB3, las células T CD8 reactivas contra el pp65NLV podrán detectarse a un nivel de aproximadamente tres veces, comparado a DB en peso.

Sorpresivamente, sin embargo, esta respuesta fue indetectable en el marco experimental elegido después de la inmunización con DB-SB6 y una respuesta específica para pp65NLV no podría ser detectada ex vivo. Este resultado se confirmó en un segundo experimento e indicó que la respuesta de la célula T CD8, preparada contra el péptido pp65NLV inmunodominante inmunizando con DB-SB6 fue ineficiente (Fig. 4). Los resultados comparables se obtuvieron cuando las células T2 se eligieron para la presentación del antígeno (datos no mostrados). Además, esto indica que estas células se indujeron en solamente frecuencias bajas debajo del límite de detección del ensayo. De acuerdo con esto, la reestimulación de células T pp65NLV-específico in vitro se retrasó comparada con células específicas para IEITMY (datos no mostrados).

Tomados juntos estos experimentos probados particularmente el potencial de DB-SB3 para cebar una respuesta de célula T CD8 contra un péptido antigénico heterólogo.

Lista de referencias: En la presente solicitud se refiere a las varias referencias como sigue: [1] wintshi K, Brennan DC. Prevention and management of cytomegalovirus infection in solid-organ transplantation. Expert Rev Anti Infect Ther 2007; 5(2):295-304. [2] Rubin RH. The pathogenesis and clinical management of cytomegalovirus infection in the organ transplant recipient: the end of the 'silo hypothesis'. Curr Opin Infect Dis 2007; 20(4):399-407. [3] Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Dierkhising RA, Kremers WK, Patel R, y colaboradores.. Delayed-onset primary cytomegalovirus disease after liver transplantation. Liver Transpl 2007; 13(12):1703-9. [4] Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Kremers WK, Cosió FG, Patel R, y colaboradores.. Delayed-onset primary cytomegalovirus disease and the risk of allograft failure and mortality after kidney transplantation. Clin Infect Dis 2008; 46(6):840-6. [5] Peggs KS. Cytomegalovirus following stem cell transplantation: from pharmacologic to immunologic therapy. Expert Rev Anti Infect Ther 2004; 2(4):559-73. [6] Hebart H, Einsele H. Clinical aspects of CMV infection after stem cell transplantation. Hum Immunol 2004; 65(5):432-6. [7] Ljungman P. Risk assessment in haematopoietic stem cell transplantation: viral status. Best Pract Res Clin Haematol 2007; 20(2):209-17. [8] Boeckh M, Nichols WG, Papanicolaou G, Rubín R, Wingard JR, Zaia J. Cytomegalovirus in hematopoietic stem cell transplant recipients: Current status, known challenges, and future strategies. Biol Blood Marrow Transplant 2003; 9(9):543-58. [9] Boeckh M, Nichols WG. The impact of cytomegalovirus serostatus of donor and recipient before hematopoietic stem cell transplantation in the era of antiviral prophylaxis and preemptive therapy. Blood 2004; 103(6):2003-8. [10] Plotkin SA. Cytomegalovirus vaccines. In: Plotkin SA, Orenstein WA, Offit PA, editors. Vaccines. 5 ed. Elsevier, 2008: p. 1 147-54. [11] Cheeran MC, Lokensgard JR, Schleiss MR.

Neuropathogenesis of congenital cytomegalovirus infection: disease mechanisms and prospects for intervention. Clin Microbiol Rev 2009; 22(1 ):99-126, Table. [12] Stratton KR, Durch JS, Lawrence R.S. Vaccines for the 21st Century. A Tool for Decisionmaking. Washington, DC: National Academy Press, 2001. [13] Reddehase MJ, Mutter W, Munch K, Buhring HJ, Koszinowski UH. CD8-positive T lymphocytes specific for murine cytomegalovirus immediate-early antigens medíate protective immunity. J Virol 1987; 61 :3102-8. [14] Wills MR, Carmichael AJ, Sissons JG. Adaptive Cellular Immunity to Human Cytomegalovirus. In: Reddehase MJ, editor. Cytomegalovirus: Molecular Biology and Immunology. Caister Academic Press, Wymondham, Norfolk, U.K., 2006: p. 341-65. [15] Walter EA, Greenberg PD, Gilbert MJ, Finch RJ, Watanabe KS, Thomas ED, y colaboradores.. Reconstitution of cellular immunity against cytomegalovirus in recipients of allogeneic bone marrow by transfer of T-cell clones from the donor. N Engl J Med 1995; 333(16): 1038-44. [16] Herr W, Plachter B. Cytomegalovirus and varicella-zoster virus vaccines in hematopoietic stem cell transplantation. Expert Rev Vaccines 2009; 8(8):999-1021. [17] Schleiss MR. Cytomegalovirus vaccine development. Curr Top Microbiol Immunol 2008; 325:361-82. [18] Pass RF, Zhang C, Evans A, Simpson T, Andrews W, Huang ML, y colaboradores.. Vaccine prevention of maternal cytomegalovirus infection. N Engl J Med 2009; 360(12): 1 191 -9. [19] Bernstein DI, Reap EA, Katen K, Watson A, Smith K, Norberg P, y colaboradores.. Randomized, double-blind, Phase 1 trial of an alphavirus replicón vaccine for cytomegalovirus in CMV seronegative adult volunteers. Vaccine 2009; 28(2):484-93. [20] Pepperl S, Munster J, Mach M, Harris JR, Plachter B. Dense bodies of human cytomegalovirus induce both humoral and cellular immune responses in the absence of viral gene expression. J Virol 2000; 74(13):6132-46. [21] Mersseman V, Besold K, Reddehase MJ, Wolfrum U, Strand D, Plachter B, y colaboradores. Exogenous introduction of an immunodominant peptide from the nonstructural IE1 protein of human cytomegalovirus into the MHC class I presentation pathway by recombinant dense bodies. J Gen Virol 2008; 89(Pt2):369-79. [22] Mersseman V, Bohm V, Holtappels R, Deegen P, Wolfrum U, Plachter B, y colaboradores.

Refinement of strategies for the development of a human cytomegalovirus dense body vaccine. Med Microbiol Immunol 2008; 197(2):97-107. [23] Besold K, Frankenberg N, Pepperl-Klindworth S, Kuball J, Theobald M, Hahn G, y colaboradores. Processing and MHC class I presentation of human cytomegalovirus pp65-derived peptides persist despite gpUS2-l 1 -mediated immune evasión. J Gen Virol 2007; 88(Pt 5): 1429-39. [24] Townsend A, Ohlen C, Bastin J, Ljunggren HG, Foster L, Karre K. Association of class I major histocompatibility heavy and light chains induced by viral peptides. Nature 1989; 340(6233):443-8. [25] Borst EM, Hahn G, Koszinowski UH, Messerle M. Cloning of the human cytomegalovirus (HCMV) genome as an infectious bacterial artificial chromosome in Escherichia coli: a new approach for construction of HCMV mutants. J Virol 1999; 73(10):8320-9. [26] Warming S, Costantino N, Court DL, Jenkins NA, Copeland NG. Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection. Nucleic Acids Res 2005; 33(4):e36. [27] Hobom U, Bruñe W, Messerle M, Hahn G, Koszino ski UH. Fast screening procedures for random transposon libraries of cloned herpesvirus genomes: mutational analysis of human cytomegalovirus envelope glycoprotein genes. J Virol 2000; 74(17):7720-9. [28] Besold K, Wills M, Plachter B. Immune evasión proteins gpUS2 and gpUSI I of human cytomegalovirus incompletely protect infected cells from CD8 T cell recognition. Virology 2009; 391(1):5-19. [29] Irmiere A, Gibson W. Isolation and characterization of a noninfectious virionlike particle released from cells infected with human strains of cytomegalovirus. Virology 1983; 130: 118-33. [30] Schmolke S, Drescher P, Jahn G, Plachter B. Nuclear targeting of the tegument protein pp65 (UL83) of human cytomegalovirus: an unusual bipartite nuclear iocalization signal functions with other portions of the protein to medíate its efficient nuclear transport. J Vi rol 1995; 69: 1071-8. [31] Utz U, Britt W, Vugler L, Mach M. Identification of a neutralizing epitope on glycoprotein gp58 of human cytomegalovirus. J Virol 1989; 63:1995-2001. [32] Frankenberg N, Pepperl-Klindworth S, Meyer RG, Plachter B. Identification of a conserved H LA-A2-restricted decapeptide from the IE1 protein (pUL123) of human cytomegalovirus. Virology 2002; 295(2):208-16. [33] Wills MR, Carmichael AJ, Mynard K, Jin X, Weekes MP, Plachter B, y colaboradores. The human cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response to cytomegalovirus is dominated by structural protein pp65: frequency, specificity, and T-cell receptor usage of pp65- specific CTL. J Virol 1996; 70:7569-79. [34] Diamond DJ, York J, Sun JY, Wright CL, Forman SJ. Development of a candidate HLA A*0201 restricted peptide-based vaccine against human cytomegalovirus infection. Blood 1997; 90(5): 1751-67. [35] Gallez-Hawkins 6, Villacres MC, Li X, Sanborn MC, Lomeli A, Zaia J A. Use of transgenic HLA A*0201/Kb and HHD II mice to evalúate frequency of cytomegalovirus IE1-derived peptide usage in eliciting human CD8 cytokine response. J Virol 2003; 77(7):4457-62. [36] Pascólo S, Bervas N, Ure JM, Smith AG, Lemonnier FA, Perarnau B. HLAA2.1 -restricted education and cytolytic actívity of CD8( + ) T lymphocytes from beta2 microglobulin (beta2m) HLA-A2.1 monochain transgenic H-2Db beta2m double knockout mice. J Exp Med 1997; 185(12):2043-51. [37] Bohm V, Simón CO, Podlech J, Seckert C, Gendig D, Deegen P, y colaboradores. The immune evasión paradox: immunoevasins of murine cytomegalovirus enhance priming of CD8 T cells by preventing negative feedback regulation. J Virol 2008; 82(23): 11637-50. [38] Pepperl-Klindworth S, Plachter B. Current perspectives in vaccine development. In: Reddehase MJ, editor. Cytomegaloviruses: Molecular Biology and Immunology. Caister Academic Press Ltd, Wymondham, Norfolk, U.K., 2006.

Las características de la presente invención descritas en la especificación, reivindicaciones, listado de secuencias y/o dibujos pueden separadamente y en cualquier combinación de las mismas ser materiales para realizar la invención en varias formas de la misma.

Claims (30)

REIVINDICACIONES

1. Una partícula viral liberada después de la infección de células mamíferas mediante citomegalovirus humano (HCMV, por sus siglas en inglés), en donde a) la partícula está rodeada por una membrana de lípido en la cual se incrustan glicoproteínas virales, b) la partícula no contiene ADN viral ni cápsides; y c) la partícula contiene una proteína de fusión que comprende una o más partes del antígeno pp65 de célula T y por lo menos un péptido heterólogo, y en donde por lo menos un péptido heterólogo se inserta en la posición W175 o A534 del aminoácido de la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T.

2. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 1, en donde por lo menos un péptido heterólogo se inserta en la posición W175 del aminoácido de la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T.

3. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en donde la secuencia de aminoácido del antígeno pp65 de célula T comprende una secuencia de aminoácido de acuerdo con la SEC ID NO: 1.

4. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la partícula es altamente antigénica.

5. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la partícula es capaz de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes.

6. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde la partícula es capaz de inducir una respuesta del linfocito T CD8 + .

7. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde por lo menos un péptido heterólogo es un antígeno presentad por MHC-clase I.

8. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o se forma de una o más partes de uno o más proteínas que son diferentes de pp65.

9. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de una glicoproteína de HCMV.

10. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de la glicoproteína gB de HCMV.

11. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de la glicoproteína gH de HCMV.

12. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o consiste de por lo menos dos glicoproteínas de HCMV que son variantes de una glicoproteína particular de diferentes cepas de HCMV.

13. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 12, en donde una de por lo menos dos variantes de la glicoproteína particular es la variante de la cepa de Towne de HCMV y la otra de por lo menos dos variantes de la glicoproteína particular es la variante de la cepa Ad169 de HCMV.

14. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 13, en donde la glicoproteína es la proteína gB de HCMV.

15. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de la proteína IE1 de HCMV.

16. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde por lo menos un péptido heterólogo comprende o es una o más partes de una glicoproteína de HCMV y una o más partes de la proteína IE1 de HCMV.

17. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde por lo menos un péptido heterólogo es una o más partes de una proteína que es parte de un patógeno humano distinto de HCMV.

18. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 17, en donde la proteína que es parte de un patógeno humano distinto de HCMV, es una proteína contra la cual los linfocitos T citotóxicos se forman en humanos durante la infección natural de humanos con el patógeno humano distinto de HCMV.

19. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 18, en donde el patógeno humano distinto de HCMV es un patógeno humano seleccionado del grupo que comprende VIH-1, HBV, HCV e influenza.

20. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en donde la proteína de fusión es una proteína de fusión que comprende un antígeno pp65 de célula T de longitud completa y por lo menos un péptido heterólogo.

21. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, o una pluralidad de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

22. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, o una pluralidad de la misma, para uso en un método para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad.

23. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 21 a 22, en donde la enfermedad es una enfermedad que puede tratarse y/o prevenirse mediante la formación de anticuerpos neutralizantes contra por lo menos un péptido heterólogo o un derivado de los mismos, o por la inducción de una respuesta de linfocito T CD8+ contra por lo menos un péptido heterólogo o un derivado de la misma.

24. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20, o una pluralidad de la misma, para la fabricación de una vacuna.

25. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la vacuna es para el tratamiento y/o prevención de la infección por HCMV.

26. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 24, en donde la vacuna es para el tratamiento y/o prevención de efectos secundarios del trasplante.

27. La partícula viral de acuerdo con la reivindicación 26, en donde el trasplante es el trasplante de un órgano sólido o células madre hematopoyéticas.

28. La partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 26 a 27, en donde el efecto secundario se causa cerca o va junto con una infección por HCMV.

29. Uso de una partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento y/o prevención de enfermedades o efectos secundarios, por lo que la enfermedad o efectos secundarios es una enfermedad o son efectos secundarios como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

30. Uso de una partícula viral de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 20 para la fabricación de una vacuna para el tratamiento y/o prevención de una enfermedad o efectos secundarios, por lo que la enfermedad o efectos secundarios es una enfermedad o son efectos secundarios como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.