BR112012025392B1 - partícula viral liberada depois da infecção de células de mamíferos por citomegalovírus (hcmv) contendo uma proteína de fusão e seu uso - Google Patents

Abstract

PARTÍCULA VIRAL LIBERADA DEPOIS DA INFECÇÃO DE CÉLULAS DE MAMÍFERO POR CITOMEGALOVÍRUS (HCMV) CONTENDO UMA PROTEÍNA DE FUSÃO E SEU USO. A presente invenção refere-se a uma partícula viral liberada depois da infecção de células de mamífero por citomegalovírus de ser humano (HCMV), em que a) a partícula está envolvida por uma membrana de lipídio que glicoproteínas virais estão embutidas, b) a partícula contém nem DNA viral nem capsídeos; e c) a partícula contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo, e em que o pelo menos um peptídeo heterólogo é inserido na posição de aminoácido W175 ou A534 da sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T.

Description

[0001] A presente invenção refere-se a uma partícula viral liberada depois da infecção de células de mamífero por citomegalovírus de ser humano (HCMV), em que a) a partícula está envolvida por uma membrana de lipídio que glicoproteínas virais estão embutidas, b) a partícula contém nem DNA viral nem capsídeos; e c) a partícula contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo; e o uso de tal partícula viral ou de uma pluralidade de tal partícula viral.

[0002] Infecção com o citomegalovírus de ser humano (HCMV) é uma principal causa de doença em pacientes após o transplante de célula-tronco hematopoiética ou de órgão sólido [1-9]. Além do mais, transmissão do vírus durante gravidez é uma das causas mais frequentes causa de sequelas duradouras no recém-nascido no hemisfério ocidental [10;11]. O desenvolvimento de uma vacina de HCMV assim foi identificado como um objetivo de alta prioridade [12].

[0003] Um objetivo de tal vacina seria para prevenir infecção na mãe ou, pelo menos, transmissão através da placenta. Indução de anticorpos neutralizantes é considerado essencial para alcançar isso. Em contraste com isso, proteção contra reativação e controle de infecção nos receptores de transplante é considerado ser fornecido pelas respostas celulares, particularmente mediadas através de células T de CD8 [1315]. Vacinação terapêutica de receptores de transplante, que leva em conta a resposta de linfócito, possivelmente combinada com transferência de célula T adotiva seria desejável para melhorar as consequências de reativação viral de HCMV no período pós-transplante [16].

[0004] Apesar de abordagens promissoras para desenvolver uma vacina de HCMV, não há, no entanto, ainda nenhuma formulação licenciada disponível [10;17-19]. A partir de numerosos estudos que levam em conta os efetores imunes que fornecem proteção, parece evidente que uma vacina ideal contra HCMV induziria tanto anticorpos neutralizantes antivirais quanto linfócitos T [10;17;18;38]. Há, no entanto, uma preocupação se tal vacina de HCMV universal pode já ser estabelecida. Um estudo clínico recente mostrou que réplicons de alfa- vírus que expressam proteínas de HCMV eram bem tolerados e induziam respostas humorais e celulares sustentadas [19]. Um outro estudo empregava gB purificado como vacina e proviam resultados encorajadores, uma vez que níveis significativos de anticorpos neutralizantes de HCMV poderiam ser induzidos [18]. Essas vacinas mantiveram a promessa a serem usadas para a prevenção de infecção por HCMV congênita.

[0005] Nos estudos anteriores em camundongos, os corpos densos assim chamados, que são também chamados aqui de DB, provaram ser surpreendentemente imunogênicos [20]. Como em geral entendido na técnica e como também usados aqui um corpo denso é uma partícula viral liberada depois da infecção de células de mamífero por citomegalovírus de ser humano (HCMV), em que a) a partícula está envolvida por uma membrana de lipídio que glicoproteínas virais estão embutidas, b) a partícula contém nem DNA viral nem capsídeos.

[0006] De preferência tal corpo denso também contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo. Corpos densos e sua preparação são também descritos no pedido de patente internacional WO 00/53729.

[0007] Em virtude de sua imunogenicidade supreendente, esforços foram feitos para desenvolver DB como uma vacina de HCMV. Experiências recentes providas evidência experimentais que DB podem ser modificadas em seu teor antigênico [21;22]. Isso foi alcançado por expressão de uma proteína de fusão que consiste do principal Componente de DB pp65 e um peptídeo de classe I de MHC heterólogo oriundo da proteína de IE1 viral por um HCMV recombinante. Isso resultou na formação de DB recombinante (recDB) em fibroblastos de prepúcio de ser humano infectados (HFF). Os recDB contendo a proteína de fusão foram liberados a partir de HFF infectados [21]. Aplicação dessas partículas a camundongos HHD transgênicos de HLA- A2 induziam uma resposta de linfócito T de CD8+, que se tornou evidente depois que estimulação de peptídeo in vitro de células T isoladas [22]. No entanto, células T específicas de HCMV não poderiam ser imediatamente detectadas quando frações de célula T de CD8+ foram testadas diretamente ex-vivo por análise de Elispot. Isso indicou que, embora em princípio adequado para a aplicação terapêutica, iniciação não era tão proeminente quanto desejável com essas partículas. Para além disso, o rendimento desses recDB de culturas de HFF infectadas era baixo.

[0008] Portanto, o problema subjacente a presente invenção foi prover um corpo denso viral que é adequado como uma vacina, em que o corpo denso viral contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo e em que de preferência a vacina é capaz de eliciar uma resposta imune ao pelo menos um peptídeo heterólogo.

[0009] Um outro problema subjacente a presente invenção foi prover um corpo denso viral, em que o corpo denso viral contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo e em que de preferência o corpo denso é capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes e/ou uma resposta de linfócito T de CD8+.

[00010] Ainda um outro problema subjacente a presente invenção foi prover um corpo denso viral, em que o corpo denso viral contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais parte do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo e em que o corpo denso pode ser preparado em altos rendimentos.

[00011] Esses e outros problemas resolvidos pelo matéria objeto das reivindicações independentes ligadas. Concretizações preferidas podem ser tiradas das reivindicações dependentes ligadas.

[00012] Mais especificamente, o problema subjacente a presente invenção é resolvido em um primeiro aspecto que é também a primeira concretização do primeiro aspecto, por uma partícula viral liberada depois da infecção de células de mamífero por citomegalovírus de ser humano (HCMV), em que a) a partícula está envolvida por uma membrana de lipídio que glicoproteínas virais estão embutidas, b) a partícula contém nem DNA viral nem capsídeos; e c) a partícula contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo, e em que o pelo menos um peptídeo heterólogo é inserido na posição de aminoácido W175 ou A534 da sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T.

[00013] Em uma segunda concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo é inserido na posição de aminoácido W175 da sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T.

[00014] Em uma terceira concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira e da segunda concretização do primeiro aspecto, a sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.

[00015] Em uma quarta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda e da terceira concretização do primeiro aspecto, a partícula é altamente antigênica.

[00016] Em uma quinta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira e da terceira concretização do primeiro aspecto, a partícula é capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes.

[00017] Em uma sexta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta e da quinta concretização do primeiro aspecto, a partícula é capaz de induzir uma resposta de linfócito T de CD8+.

[00018] Em uma sétima concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta e da sexta concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo é um antígeno apresentado de classe I de MHC.

[00019] Em uma oitava concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta e da sétima concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou é formado de uma ou mais partes de uma ou mais proteínas que é/são diferente(s) de pp65.

[00020] Em uma nona concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou é uma ou mais partes de uma glicoproteína de HCMV.

[00021] Em uma décima concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava e da nona concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou é uma ou mais partes da glicoproteína de HCMV gB.

[00022] Em uma décima primeira concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava e da nona concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou é uma ou mais partes da glicoproteína gH de HCMV.

[00023] Em uma décima segunda concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava e da nona concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou consiste de pelo menos duas glicoproteínas de HCMV que são variantes de uma glicoproteína particular de diferentes cepas de HCMV.

[00024] É uma décima terceira concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da décima segunda concretização do primeiro aspecto, uma das pelo menos duas variantes da glicoproteína particular é a variante da cepa de Towne de HCMV e a outra das pelo menos duas variantes da glicoproteína particular é a variante da cepa de Ad169 de HCMV.

[00025] Em uma décima quarta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da décima segunda e a décima terceira concretização do primeiro aspecto, a glicoproteína é a proteína de gB de HCMV.

[00026] Em um décima quinta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou é uma ou mais partes da proteína IE1 de HCMV.

[00027] Em uma décima sexta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo compreende ou é uma ou mais partes de uma glicoproteína de HCMV e uma ou mais partes da proteína IE1 de HCMV.

[00028] Em uma décima sétima concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima e da oitava concretização do primeiro aspecto, o pelo menos um peptídeo heterólogo é uma ou mais partes de uma proteína que é parte de um patógeno de ser humano outro que não HCMV.

[00029] Em uma décima oitava concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da décima sétima concretização do primeiro aspecto, a proteína que é parte de um patógeno de ser humano outro que não HCMV, é uma proteína contra a qual linfócitos T citotóxicos são formados em seres humanos após infecção natural de seres humanos com o patógeno de ser humano outro que não HCMV.

[00030] Em uma décima nona concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da décima oitava concretização do primeiro aspecto, o patógeno de ser humano outro que não HCMV é patógeno de ser humano selecionado do grupo que compreende HIV-1, HBV, HCV e influenza.

[00031] Em uma vigésima concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava e a décima nona concretização do primeiro aspecto, a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo um antígeno pp65 de célula T de comprimento total e pelo menos um peptídeo heterólogo.

[00032] Em uma vigésima primeira concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima concretização do primeiro aspecto, a partícula viral, ou uma pluralidade de tal partícula, é para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.

[00033] Em uma décima segunda concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, a décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima concretização do primeiro aspecto, a partícula viral, ou uma pluralidade de tal partícula, é para o uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.

[00034] Em uma vigésima terceira concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da vigésima primeira e a vigésima segunda concretização do primeiro aspecto, a doença é uma doença que pode ser tratada e/ou prevenida pela formação de anticorpos neutralizantes contra o pelo menos um peptídeo heterólogo ou um seu derivado, ou pela indução de uma resposta de linfócito T de CD8+ contra o pelo menos um peptídeo heterólogo ou um seu derivado.

[00035] Em uma vigésima quarta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima concretização do primeiro aspecto, a partícula viral, ou uma pluralidade de tal partícula, é para a fabricação de uma vacina.

[00036] Em uma vigésima quarta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da vigésima quarta concretização do primeiro aspecto, a vacina é para o tratamento e/ou prevenção de infecção por HCMV.

[00037] Em uma vigésima sexta concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da vigésima quarta concretização do primeiro aspecto, a vacina é para o tratamento e/ou prevenção de efeitos colaterais de transplante.

[00038] Em uma vigésima sétima concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da vigésima sexta concretização do primeiro aspecto, o transplante é transplante de um órgão sólido ou células tronco hematopoiéticas.

[00039] Em uma vigésima oitava concretização do primeiro aspecto que é também uma concretização da vigésima sexta e da vigésima sétima concretização do primeiro aspecto, o efeito colateral é causado por ou está acompanhando uma infecção por HCMV.

[00040] O problema subjacente a presente invenção é resolvido em um segundo aspecto que é também a primeira concretização do segundo aspecto, por uso de uma partícula viral de acordo com qualquer uma da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima concretização do primeiro aspecto para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doenças ou efeitos colaterais, pelo que a doença ou efeitos colaterais é uma doença ou são efeitos colaterais como definidos em cada um e qualquer uma das concretizações precedentes e de cada um e qualquer aspecto.

[00041] O problema subjacente a presente invenção é resolvido em um terceiro aspecto que é também a primeira concretização do terceiro aspecto, por uso de uma partícula viral de acordo com qualquer uma da primeira, da segunda, da terceira, da quarta, da quinta, da sexta, da sétima, da oitava, da nona, da décima, da décima primeira, da décima segunda, da décima terceira, da décima quarta, da décima quinta, da décima sexta, da décima sétima, da décima oitava, da décima nona e da vigésima concretização do primeiro aspecto para a fabricação de uma vacina para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou efeitos colaterais, pelo que a doença ou efeitos colaterais é uma doença ou são efeitos colaterais como definidos em cada um e qualquer uma das concretizações precedentes e de cada um e qualquer aspecto.

[00042] Com base no discernimento que o sítio de inserção para sequências de peptídeos heterólogas para dentro de pp65 era crítico para a eficácia de formação de DB subsequente, os presentes inventores surpreendentemente verificaram-se que a proteína de fusão que está contido nas partículas virais da invenção e que compreende uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo, confere características vantajosas para o DB se o peptídeo heterólogo for inserido na posição de aminoácido W 175 ou na posição de aminoácido A534 da sequência de aminoácidos de pp65. As características vantajosas dessas proteínas de fusão compreendem a indução de anticorpos neutralizantes contra o peptídeo heterólogo, a indução de uma resposta de linfócito T de CD8+ ao peptídeo heterólogo e a produção de tal DB em um alto rendimento. Além do mais, esses dois locais em pp65 permitiram formação eficiente e liberação de DB contendo as ditas proteínas de fusão. A resposta de linfócito T de CD8+ observada para essas duas proteínas de fusão respostas de célula T de CD8 inicializadas, que estão prontamente detectáveis por análises de Elispot ex vivo de frações de célula T de CD8.

[00043] O antígeno pp65 de célula T, que é também mencionado na técnica como UL 83, foi descrito by Pande, H. e outros (Pande, H, Lee, T.D., Churchill, M.A. and Zaia, J.A, "Structural analysis of a 64-kDa major structural protein of human cytomegalovirus (Towne): identification of a phosphorylation site and comparison to pp65 of HCMV (AD169); Virology 178 (1), 6-14 (1990)).

[00044] Pouco é conhecido sobre a função de pp65 e sobre domínios, importantes para a função e dobramento adequado da proteína. Consequentemente, não há nenhuma análise racional para a seleção de sítio de inserção que definitivamente dispensaria regiões funcionalmente relevantes dentro de pp65. Seleção de sítio de inserção foi realizada de um modo a evitar regiões conservadas em vírus de betaherpes e também estruturas secundárias previstas (a-hélices e β- folhas). Isso foi feito admitindo-se que regiões conservadas, a-hélices e β-folhas poderiam ser estruturalmente e funcionalmente importantes e não seriam destruídas. No entanto, a maioria desses mutantes caíram eficazmente para formar recDB, indicando que essa estratégia não poderia identificar sítios de inserção adequados. Levando em sua consideração os presentes inventores surpreendentemente verificam que os sítios de inserção em RV-SB3 e RV-SB6 provaram ser mais apropriados para a formação de recDB.

[00045] Como é mostrado na presente aplicação de introdução exógena de pp65 quimérico por DB-SB3 e DB-SB6 para dentro de HFF levaram a apresentação eficiente de pp65NLV e IE1TMY. Aplicação dessas partículas a camundongos HHD transgênicos de HLA-A2 inicializavam uma resposta de célula T de CD8 contra ambos os peptídeos que poderiam ser detectados depois da expansão in-vitro dessas células T com o peptídeo cognato. Resultados similares foram também obtidos nas experiências anteriores, usando-se recDB com inserção do peptídeo de IE1 na posição 548 de pp65 [21;22]. No entanto, usando-se o último recDB, células T de CD8 contra qualquer peptídeo eram não detectáveis diretamente ex vivo, sugerindo que iniciação era ineficiente. Aplicação de DB-SB3, em contraste com isso, levou a frequências prontamente detectáveis de células T de CD8 específicas de IE1TMY e específicas de pp65NLV. Isso indica que esses recDB eram células T induzidos e altamente imunogênicas contra tanto o peptídeo endógeno quanto o peptídeo heterólogo.

[00046] Em uma concretização da invenção o peptídeo heterólogo é um peptídeo antigênico e mais de preferência um peptídeo heterólogo antigênico.

[00047] Em uma concretização da presente invenção que o peptídeo heterólogo é diferente da proteína de IE1 de HCMV ou uma sua parte.

[00048] Em uma concretização da presente invenção o comprimento de um peptídeo é de cerca de 4 a 40 resíduos de aminoácidos, de preferência cerca de 6 a 25 resíduos de aminoácidos e mais de preferência cerca de 8 a 15 resíduos de aminoácidos e mais de preferência cerca de 8-12 resíduos de aminoácidos.

[00049] Uma vez de preferência usada, qualquer palavra que especifica os limites de uma faixa tais como, por exemplo, "de 1 a 5" significa qualquer número inteiro de 1 a 5, isto é, 1, 2, 3, 4 e 5. Em outras palavras, qualquer faixa que é definida por dois números inteiros compreende ambos os dois números inteiros definindo os ditos limites da definição e qualquer número inteiro compreendido por ou contido dentro da dita faixa.

[00050] Em uma concretização da presente invenção a antigenicidade da partícula viral da invenção é aumentada comparada com os corpos densos da técnica anterior, mais especificamente aqueles corpos densos onde o corpo denso contém uma proteína de fusão compreendendo o antígeno pp65 de célula T de comprimento total.

[00051] Em uma concretização da presente invenção a formação da partícula viral da invenção é aumentada em comparação com a formação de corpos densos como descrita em [25].

[00052] Será reconhecido por uma pessoa versada na técnica que, de preferência, a proteína IE1 de HCMV é também chamada de ppUL123.

[00053] Será também reconhecida que a proteína de fusão contida na partícula é, em uma concretização preferida de uma proteína quimérica.

[00054] A presente invenção é agora ulteriormente ilustrada por referência às seguintes figuras e exemplos a partir dos quais outras vantagens, características e concretizações podem ser tiradas, em que figura 1 mostra o resultado de uma análise de imuno fluorescência indireta de HFF, infectado com recombinantes de HCMV; figura 2 mostra o resultado de uma análise de imuno blot (A), o resultado de um análise de DNA-PCR como um diagrama indicando cópias de genoma/ml como um tempo de função (d.p.i) para várias proteínas de fusão (B), e o resultado de uma outra análise imuno blot (C); figura 3 mostra o resultado de uma análise de IFN-Y-Elispot como um diagrama indicando a percentagem de células de CD8+ respondentes para várias proteínas de fusão ou usando-se ou pp65NLV-CTL (A) ou IE1TMY-CTL (B) como células respondentes; figura 4 mostra o resultado de uma análise de IFN-Y-Elispot como um diagrama indicando a percentagem de células de CD8+ respondentes para várias proteínas de fusão? ou usando-se células de RMA-S como células estimuladoras; e figura 5 mostra a sequência de aminoácidos pp65 de comprimento total (SEQ ID NO:1)

[00055] Figura 1 mostra o resultado de uma análise de imuno fluorescência indireta de HFF, infectado com recombinantes de HCMV. Células foram infectadas com os vírus indicados por quatro dias e foram subsequentemente processados por análise de imuno fluorescência. A configuração do pp65 recombinante, expressa por cada vírus é indicada abaixo dos micrográficos. O aminoácido N-terminal de pp65, flanqueando o sítio de inserção é significado.

[00056] Figura 2 mostra a expressão de proteínas de fusão de pp65, replicação de vírus recombinantes e eficácia de embalagem de proteínas de fusão em vírions e DB. (A), análise de Immuno blot de 2 - 4 dias de HFF infectados. Células foram infectadas em um m.o.i. de 2 e foram coletadas nos tempos indicados para análise. Filtros foram sondados com anticorpo 65-33 monoclonal específico de pp65. Quantidades de proteínas em cada raia foram normalizadas contra β- actina. (B), Análise de DNA-PCR quantitativa de genomas virais no sobrenadante de cultura de célula de HFF infectados. Células foram infectadas em um m.o.i. de 10 genomas/célula. Sobrenadantes de cultura foram coletados nos pontos de tempo indicados e foram congelados. Análise de PCR foi realizada em paralelo no mesmo ensaio. (C), Análise de Immunoblot e pp65, embalada em recDB ou vírions. Células foram infectadas com o vírus recombinantes ou com wt RV-HB5 por 6-7 dias. Sobrenadantes foram submetidos a centrifugação de gradiente de glicerol tartrato para coletar frações de DB e de vírions. Essas frações foram analisadas por immunoblot, usando-se anticorpo monoclonal 65-33 ou, como padrão interno, usando-se um anticorpo monoclonal contra gB viral.

[00057] Figura 3 mostra o resultado de uma análise de IFN-Y-Elispot da penetração de classe I de MHC por HFF positivo a HLA-A2, tratado com recDB. Células foram tratadas como DB indicado e foram subsequentemente usadas como células estimuladoras na análise de IFN-Y-Elispot, usando-se ou pp65NLV-CTL (A) ou IE1TMY-CTL (B) como células respondentes.

[00058] Figura 4 mostra o resultado de uma análise de IFN-Y-Elispot ex vivo de células de baço enriquecidas com CD8+ de camundongos HHD, imunizadas com recDB. Células de RMA, carregadas com o peptídeos cognatos foram tomados como células estimuladoras. Tamanhos de barra representam frequências mais prováveis de células T de CD8 de secreção de IFN-Y, como determinada por análise de regressão linear, descrita por Bohm e outros [37]. Barras de erro indicam 95% de intervalos de confidência.

Exemplo 1: Materiais e Métodos 1. Células

[00059] Fibroblastos de prepúcio de ser humano primários, linhas de CTL e linhas de T2 foram cultivados como descritos antes [23]. Células de RMA [24] foram desenvolvidas em meio de RPMI 1640 (PAA Laboratories, Colbe, Alemanha) foram suplementados 10% de FCS, L- glutamina a 2 mM, 50 mg de gentamicina L-1 e 5 μM de β- mercaptoetanol.

2. Plasmídios e Vírus

[00060] Para mutagênese do DNA viral, o cromossoma artificial bacteriano de HCMV (BAC) pHB5 [25] foi usada. Mutagênese de pHB5 foi realizada de acordo com o procedimento de seleção positivo/negativo de galK [26] como descrito em outro lugar [21]. A sequência de DNA inserida para dentro do quadro de leitura aberto de UL83 codificou o peptídeo apresentado por HLA-A2 IE1TMY [IE1297- 305], franqueado por aminoácidos adicionais para permitir processamento proteassomal exato. O polipeptídeo adicional fundido a pp65 lê TSDACMMTMYGGISLLSEFC, com o nanopeptídeo apresentado por HLA-A2 sendo sublinhado. Reconstituição viral oriundo de clones de BAC foi realizada de acordo com Hobom e outros [27].

[00061] Estoques de vírus foram gerados, foram titulados e foram quantificados ou por contagem de células positivas de IE1 a 48 horas p.i. ou por análise de PCR de DNA de TaqMan de genomas virais extracelulares como descritos [28]. HFF foram infectados por 7 dias. Infecção a um moi de 0,1 resultou uma série de genomas virais intracelulares grosseiramente.

3. Purificação de corpo denso, análise de imunofluorescência indireta e immunoblotting

[00062] DB foram purificados de HFF infectado de estágio tardio por ultracentrifugação de gradiente de glicerol-tartrato como originalmente publicado por Irmiere and Gibson [29] e descrito anteriormente [20]. Análise de imunofluorescência indireta foi realizada como descrita [30]. O pp65 foi marcado por uso de anticorpo monoclonal 65-33 (agradavelmente provido por W. Britt, University of Alabama, Birmingham, Alabama, USA) e anticorpos secundário conjugados por FITC (DAKO, Hamburg, Alemanha). O núcleo foi contra-manchado com DAPI. Dados oriundos de análise de imunofluorescência foram coletados usando-se um microscópio de Axiophot-1 (Zeiss) na ampliação de 1000 vezes. Para as amostras de proteína de immunoblotting, foram desnaturadas sob condições redução, foram separadas por SDS-PAGE e foram transferidas sobre membranas de nitrocelulose (Millipore, Schwalbach, Alemanha) por electroblotting a 400 mA por 1 h 45 min. As membranas foram incubadas com anticorpos contra pp65, β-actina (Rockland, Gilbertsville, PA, USA) e glicoproteína B (gB) [31]). Western blots foram sondados com anticorpos secundários de anticoelho e anticamundongo, foram conjugados a ALEXA Fluor 680 (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) ou IRdye 800 (Rockland). Proteínas manchadas foram detectadas e foram quantificadas usando-se o sistema de imagem de infravermelho de Odyssey (LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA).

4. 4 Ensaio de Elispot de Interferon Y de HFF incubado com recDB

[00063] Ensaios de immunospot (Elispot) ligados a enzima foram realizados como descritos antes [23;32]. Linhas de CTL específicas para os peptídeos de HCMV restritos de HLA-A0201 (A2) de pp65495-503 (pp65NLV-CTL) [33;34] e IE1297-305 (IE1TMY-CTL) [35] foram usadas nessas análises. As linhas de CTL foram geradas por imunização de camundongos transgênicos duplos (tg) de HLA-A2/huCD8 [23].

5. 5 Modelo de camundongo transgênico de HLA-A2

[00064] Camundongos transgênicos de HLA-A2 de 8-12 semanas de idade (camundongos de HHD), [36]) foram imunizados intraperitonealmente com 6 μg DB de RV-HB5 (DB-HB5), RV-SB3 (DB- SB3) ou RV-SB6 (DB-SB6), respectivamente, ou com PBS. Linfócitos foram preparados a partir dos baços no dia 7 depois da imunização. Células T de CD8 foram enriquecidas por classificação de MACS e a frequência de células de secreção de IFN-y foi analisada por Elispot diretamente ex vivo, usando-se células estimuladoras de RMA-S HHD ou T2 carregadas com peptídeo. Nesse conjunto de placas de Elispot de Millipore (Schwalbach/Ts., Alemanha) foram usadas. O ensaio de Elispot foi realizado de acordo com as recomendações do fabricante. Frequências de células respondentes foram determinadas por análise de regressão linear como descritas por Bohm e outros [37].

Exemplo 2: Seleção de sítio de inserção é crítica para a formação de DB citoplásmico

[00065] Como será ilustrado nesse exemplo, seleção do sítio de inserção do peptídeo heterólogo é crítico para a formação de DB citoplásmico.

[00066] O potencial de um candidato de vacina a ser ulteriormente desenvolvido criticamente depende do rendimento que pode ser alcançado para outra escalada para cima. No trabalho anterior, prova poderia ser com a condição de que DB pudessem ser modificadas em seu teor antigênico por fusão de uma sequência de peptídeos heteróloga à proteína de tegumento pp65 [21]. No entanto, células infectadas com o recombinante respectivo de HCMV liberadas apenas quantidades limitadas de recDB. Portanto a hipótese foi testada que inserção de sequência heteróloga tal como sequência de aminoácidos de um peptídeo heterólogo a outros sítios dentro de pp65 melhorariam o rendimento de recDB.

[00067] Cinco sítios de diferentes porções da molécula foram selecionados para inserção (figura 1). O peptídeo inserido consistia em 20 aminoácidos que incluem o nanopeptídeo apresentado por HLA-A2 TMYGGISLL (IE1TMY) da proteína de HCMV IE1 [35]. Vírus recombinantes foram gerados por modificação do plasmídio de BAC de HCMV pHB5 [25], usando-se o procedimento de seleção à base de galK [21;22]. Plasmídios de BAC recombinantes foram analisados com exatidão por sequenciação de nucleotídeo e digestão de endonuclease de restrição do sítio de inserção (dados não mostrados). Reconstituição de vírus recombinantes foi subsequentemente realizada por transfecção do plasmídio de BAC para dentro de HFF. Os vírus resultantes foram testadas quanto a formação de DB. Uma marca de infecção por HCMV de HFF é o acúmulo citoplásmico de DB, que pode ser visualizada por análise de imunofluorescência indireta (IFA). Consequentemente, HFF foram infectados com mutante precocemente gerados e IFA foi realizada a 4 dias pós-infecção (d.p.i.), usando-se um anticorpo específico de pp65 (figura1). Apenas células infectadas com os mutantes RV-SB3 e RV-SB6 mostraram a formação de DB citoplásmica de um modo comparável com a formação de DB in células infectadas por vírus parentais. Em contraste com isso, nenhuma ou apenas pouca formação de DB era visto nas células infectadas por RV-SB2, RV-SB4, e RV-SB5. Observar que nessas células, as translocação citoplásmica de núcleo de pp65, que é tipicamente visto nos HFF infectados de estágio tardio foi diminuído. Esses resultados indicavam que seleção de sítio para a inserção de sequências de peptídeos heterológicos dentro de pp65 eram críticos para a formação de recDB. Com base nos resultados de IFA dos vírus RV-SB3 e RV-SB6 foram escolhidos para outra análise.

Exemplo 3: Em comparação com RV-SB3 e RV-SB6 com a cepa parental

[00068] Como será mostrado messe exemplo, vírus recombinantes RV-SB3 e RV-SB6 são comparáveis com a cepa parental com relação à expressão de pp65, liberação de vírion e embalagem de pp65 em partículas.

[00069] Níveis de expressão de pp65 em RV-SB3- e RV-SB6-HFF infectados foram testados por análise de immunoblot. Células foram infectadas ou com vírus ou com RVHB5 parental por dois ou quatro dias, respectivamente. Lisados de células foram submetidos a análise de immunoblot quantitativa, usando-se o sistema de imagem com infravermelho de Odyssey. A quantidade de actina celular foi tirada como padrão interno (figura 2A). Níveis de expressão de proteínas de fusão de pp65 em células infectadas por RV-SB3 ou RV-SB6 foi reduzida a 2 dias p.i., em comparação com níveis de pp65 em células infectadas com RV-HB5 parental. No entanto, a 4 dias p.i., os níveis das duas proteínas de fusão pareceram ser ainda mais alto que aquele do pp65 em células infectadas por RV-HB5. Isso indicou que proteína suficiente foi sintetizada em células infectadas por RV-SB3 e RV-SB6 para dirigir a síntese de recDB.

[00070] Para testar a capacidade das cepas recombinantes para replicar em HFF, células foram infectadas a um m.o.i. de 0,1, que resultam em 10 cópias de genoma/célula e sobrenadante de cultura foi coletado em intervalos diários até 7 dias p.i.. DNA viral liberado para dentro do sobrenadante foi quantificado usando-se análise de PCR quantitativa (figura 2B). Tanto RV-SB3 quanto RV-SB6 provaram replicar para níveis similares como RV-HB5 parental.

[00071] Embalagem das proteínas de fusão foi finalmente analisada por análise de immunoblot de vírions purificados e DB, foram coletadas a partir de sobrenadantes de HFF infectados por centrifugação de gradiente de glicerol. Nesse caso, normalização foi realizada usando-se a glicoproteína B de envelope viral (gB) como padrão interno. Nenhuma diferença na embalagem de pp65 em vírions ou DBs foi encontrada quando as cepas recombinantes estavam em comparação com sua cepa parental (figura 2C). Tomados juntos esses resultados indicavam que tanto RV-SB3 quanto RVSB6 eram comparáveis com RV-HB5 na expressão e embalagem de pp65 e na replicação nas células infectadas.

Exemplo 4: Expressão tanto de pp65NLV quanto IE1TMY por HFF tratado com DB-SB3 ou DB-SB6

[00072] O presente exemplo mostra tanto que pp65NLV quanto IE1TMY são apresentados por HFF tratado com DB-SB3 ou DB-SB6.

[00073] Um objetivo de uso de recDB para o desenvolvimento de vacina seria para suportar reconstituição de célula T citotóxica em pacientes após o transplante. Essas células demonstraram ser de importância crítica para a prevenção de reativação e doença viral ([13;15] revisto em [16]). Assim testados se os recDB eram capazes de introduzir tanto o pp65NLV derivado de pp65 quanto o IE1TMY derivado de IE1 da trajetória de apresentação de classe I de MHC de HFF.

[00074] Correspondentemente, células foram tratadas com recDB e foram subsequentemente submetidas a análise de Elispot de interferon- Y (figura 3). Como células respondentes, clones de CTL contra ambos os peptídeos (pp65NLV-CTL; IE1TMY-CTL) foram usados [23]. Tanto células tratadas com DB-SB3 quanto DB-SB6 apresentaram IE1TMY e pp65NLV. A apresentação de pp65NLV era comparável entre recDB e wt-DB, indicando que a inserção da sequência derivada de IE1 não diminuiu apresentação de pp65 em HFF. Tratamento de células com DB-SB3 levou a séries de IE1TMY-CTL respondentes a níveis que eram comparáveis com a resposta específica de pp65. No entanto, tratamento de células com DB-SB6 levou a um número marcadamente reduzido de manchas positivas no ensaio específico de IE1. Isso indicou que a capacidade de HFF de apresentar o peptídeo de IE1 depois da incubação de DB era sensível ao sítio, onde o peptídeo foi inserido para dentro de pp65.

Exemplo 5: Imunização com resultados de DB recombinante (recDB) em células T de CD8 específicas de IE1TMY e pp65NLV

[00075] Esse exemplo mostra que imunização com iniciadores de DB recombinantes (recDB) de frequências significativas de células T de CD8 específicas de IE1TMY e pp65NLV.

[00076] Experiências anteriores mostraram que recDB poderiam induzir células T de CD8 específicas de IE1TMY em camundongos. Essas células eram, no entanto, apenas detectáveis depois de estímulo in-vitro de frações de célula T de CD8 de camundongos imunizados com o peptídeo cognato. Nenhuma célula T de CD8 respondente foi detectada diretamente ex-vivo, indicando que o número total de células específicas, e assim a resposta global àquele recDB era baixo [21]. Para avaliar o potencial imunológico dos recDB precocemente estabelecidos, camundongos HHD transgênicos de HLA-A2 foram imunizados com o diferente DB na ausência do auxiliar. Como esperado, células T de CD8 respondentes específicas para IE1TMY ou pp65NLV eram detectáveis depois do estímulo in-vitro (dados não mostrados).

[00077] Células oriundas de camundongos imunizados foram também testados diretamente ex-vivo. Para isso, as frações de CD8+ células de baço foram separadas por classificação de MACS e foram testados na análise de Elispot, usando-se células de apresentação de antígeno localizadas no peptídeo. Células T de CD8, específicas para IE1TMY poderiam ser detectadas depois de imunização tanto com DB- SB3 quanto DB-SB6 (figura 4). A resposta específica de IE1 inicializada por DB-SB3 pareceu ser mais forte do que a resposta induzida por DB- SB6, mas ambas alcançaram níveis claramente detectáveis. Depois de imunização com DB-SB3, células T de CD8 reativas contra o pp65NLV poderiam ser detectadas a um nível grosseiramente três vezes, em comparação com wt-DB.

[00078] Surpreendentemente, no entanto, essa resposta era não detectável no conjunto experimental escolhido depois da imunização com DB-SB6 e uma resposta específica de pp65NLV não poderia ser detectada ex vivo. Esse resultado foi confirmado em uma segunda experiência e indicava que a resposta de célula T de CD8, inicializada contra o peptídeo de pp65NLV imunodominante por imunização com DB-SB6 era ineficiente. (figura 4). Resultados comparáveis foram obtidos quando linhas de T2 foram escolhidas para a apresentação de antígeno (dados não mostrados). Além do mais, isso indica que essas células foram induzidas em apenas baixas frequências abaixo do limite de detecção do ensaio. De acordo com isso, re-estimulação de células T específicas de pp65NLV in vitro era atrasada em comparação com células específicas de IE1TMY (dados não mostrados).

[00079] Tomadas juntos essas experiências particularmente provaram o potencial de DB-SB3 para inicializar uma resposta de célula T de CD8 contra um peptídeo antigênico heterólogo.

Lista de Referências:

[00080] No presente pedido, são mencionadas as várias referências como se segue: [1] Mwintshi K, Brennan DC. Prevention and management of cytomegalovirus infection in solid-organ transplantation. Expert Rev Anti Infect Ther 2007; 5(2):295-304. [2] Rubin RH. The pathogenesis and clinical management of cytomegalovirus infection in the organ transplant recipient: the end of the 'silo hypothesis'. Curr Opin Infect Dis 2007; 20(4):399-407. [3] Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Dierkhising RA, Kremers WK, Patel R, e outros Delayed-onset primary cytomegalovirus disease after liver transplantation. Liver Transpl 2007; 13(12):1703-9. [4] Arthurs SK, Eid AJ, Pedersen RA, Kremers WK, Cosio FG, Patel R, e outros Delayed-onset primary cytomegalovirus disease and the risk of allograft failure and mortality depois de kidney transplantation. Clin Infect Dis 2008; 46(6):840-6. [5] Peggs KS. Citomegalovírus após o stem cell transplantation: from pharmacologic to immunologic therapy. 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[00081] As características da presente invenção reveladas no relatório, nas reivindicações, na listagem de sequência e/ou desenhos podem ser tanto separadamente ou em qualquer sua combinação ser material para a realização da invenção em várias suas formas.

Claims (30)

1. Partícula viral liberada depois de infecção de células de mamífero por citomegalovírus de ser humano (HCMV), caracterizada pelo fato de que a partícula viral é um corpo denso, em que a) a partícula está envolvida por uma membrana de lipídio em que glicoproteínas virais estão embutidas, b) a partícula não contém DNA viral nem capsídeos; e c) a partícula contém uma proteína de fusão compreendendo uma ou mais partes do antígeno pp65 de célula T e pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico, e em que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico é inserido na posição de aminoácido W175 ou A534 da sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T de SEQ ID NO: 1.

2. Partícula viral de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico é inserido na posição de aminoácido W175 da sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T.

3. Partícula viral de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a sequência de aminoácidos do antígeno pp65 de célula T compreende uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 1.

4. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que a partícula é altamente antigênica.

5. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que a partícula é capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes.

6. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a partícula é capaz de induzir uma resposta de linfócito T de CD8+.

7. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico é um antígeno apresentado de classe I de MHC.

8. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou é formado de uma ou mais partes de uma ou mais proteínas que é/são diferente(s) de pp65.

9. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou é uma ou mais partes de uma glicoproteína de HCMV.

10. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou é uma ou mais partes da glicoproteína gB de HCMV.

11. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou é uma ou mais partes da glicoproteína gH de HCMV.

12. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou consiste em pelo menos duas glicoproteínas de HCMV que são variantes de uma glicoproteína particular de diferentes cepas de HCMV.

13. Partícula viral de acordo com a reivindicação 12, caracterizada pelo fato de que uma das pelo menos duas variantes da glicoproteína particular é a variante da cepa de Towne de HCMV e a outra das pelo menos duas variantes da glicoproteína particular é a variante da cepa de Ad169 de HCMV.

14. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 12 a 13, caracterizada pelo fato de que a glicoproteína é a proteína gB de HCMV.

15. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou é uma ou mais partes da proteína IE1 de HCMV.

16. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico compreende ou é uma ou mais partes de uma glicoproteína de HCMV e uma ou mais partes da proteína IE1 de HCMV.

17. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico é uma ou mais partes de uma proteína que é parte de um patógeno de ser humano diferente de HCMV.

18. Partícula viral de acordo com a reivindicação 17, caracterizada pelo fato de que a proteína que é parte de um patógeno de ser humano diferente de HCMV é uma proteína contra a qual linfócitos T citotóxicos são formados em seres humanos mediante infecção natural de seres humanos com o patógeno de ser humano outro diferente de HCMV.

19. Partícula viral de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o patógeno de ser humano diferente de HCMV é patógeno de ser humano selecionado do grupo que compreende HIV-1, HBV, HCV e influenza.

20. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma proteína de fusão compreendendo um antígeno pp65 de célula T de comprimento total e pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico.

21. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, ou uma sua pluralidade, caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.

22. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, ou uma sua pluralidade, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método para o tratamento e/ou prevenção de uma doença.

23. Partícula viral de acordo com a reivindicação 21 ou 22, caracterizada pelo fato de que a doença é uma doença que pode ser tratada e/ou prevenida pela formação de anticorpos neutralizantes contra o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico ou um derivado do mesmo, ou pela indução de uma resposta de linfócito T de CD8+ contra o pelo menos um peptídeo heterólogo antigênico ou um derivado do mesmo.

24. Partícula viral de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, ou uma sua pluralidade, caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina.

25. Partícula viral de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a vacina é para o tratamento e/ou prevenção de infecção por HCMV.

26. Partícula viral de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a vacina é para o tratamento e/ou prevenção de efeitos colaterais de transplante.

27. Partícula viral de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo fato de que o transplante é transplante de um órgão sólido ou células tronco hematopoiéticas.

28. Partícula viral de acordo com a reivindicação 26 ou 27, caracterizada pelo fato de que o efeito colateral é causado por ou está acompanhando uma infecção por HCMV.

29. Uso de uma partícula viral como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou efeitos colaterais, pelo que a doença ou efeitos colaterais é uma doença ou são efeitos colaterais como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.

30. Uso de uma partícula viral como definida em qualquer uma das reivindicações de 1 a 20, caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de uma vacina para o tratamento e/ou prevenção de uma doença ou efeitos colaterais, pelo que a doença ou efeitos colaterais é uma doença ou são efeitos colaterais como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.

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