KR20130055586A - 융합 단백질 함유 인간 세포거대바이러스에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 인간 세포거대바이러스에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자에 관한 것이다 {여기에서, (a) 상기 입자는 바이러스 당단백이 내재된 지질막으로 둘러싸여 있고, (b) 상기 입자는 바이러스 DNA 또는 캡시드 도 함유하지 않으며, 및 (c) 상기 입자는 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질을 함유하고 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 T-세포 항원 pp65아미노산의 W175 또는 A534 아미노산 위치에 삽입된 것임}.

Description

융합 단백질 함유 인간 세포거대바이러스에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자 및 이의 용도 {VIRAL PARTICLE RELEASED AFTER INFECTION OF MAMMALIAN CELLS BY HUMAN CYTOMEGALOVIRUS (HCMV) CONTAINING A FUSION PROTEIN AND USE THEREOF}
본 발명은 인간 세포거대바이러스(Human cytomegalovirus; HCMV)에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자, {여기에서, (a) 상기 입자는 바이러스 당단백 (glycoprotein)이 내재된 지질막 (lipid membrane)으로 둘러싸여 있고, (b) 상기 입자는 바이러스 DNA 또는 캡시드 (capsid)도 함유하지 않으며, (c) 상기 입자는 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 함유함} 및 상기 바이러스 입자 또는 복수의 상기 바이러스 입자들의 용도에 관한 것이다.
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인간 세포거대바이러스 (Human cytomegalovirus; HCMV) 감염증은 하기 고형 기관(solid organ) 또는 조혈모세포 이식 환자 질병의 주요 원인이다 [1-9]. 더구나, 임신중 바이러스 감염은 서반구에서 신생아의 지속된 후유증의 가장 빈번한 원인 중 하나이다 [10;11]. 따라서, HCMV 백신 개발은 가장 최우선적 목표로서 인식되어 왔다[12].
이러한 백신의 하나의 목표는 산모 감염 또는 적어도 교차성-태반 감염(cross-placental transmission)을 방지함일 것이다. 중화 항체(neutralizing antibodies)의 유도가 이를 달성하기에 필수적으로 간주된다. 반면에, 이식 수용자에서의 재활성화 방지 및 감염 통제는 세포성 반응(cellular response), 특히, CD8 T 세포를 통한 매개에 의하여 제공 가능한 것으로 간주된다 [13-15]. 입양성(adoptive) T-세포 이식체(cell transfer)와 조합할 수도 있는, 임파구 반응 (lymphocyte response)을 유도하는, 이식 수용자의 치료학적 백신화 (Therapeutic vaccination)는 이식후 기간에서의 HCMV의 바이러스성 재활성화로 인한 부작용을 경감시킴이 바람직할 것이다 [16].
HCMV 백신 개발을 위한 유망한 접근시도들에도 불구하고, 아직까지 제형화된 허가된 제품은 없는 실정이다 [10;17-19]. 상기한 방지를 제공하는 면역학적 작용제 (immune effectors)를 위한 다수의 연구들로부터, HCMV에 대한 이상적인 백신은 항바이러스성 중화 항체(antiviral neutralizing antibodies) 및 T 임파구(lymphocytes) 모두를 유도해야 함이 명백할 것으로 밝혀졌다 [10;17;18;38]. 그러나, 이와 같은 유니버설(universal) HCMV 백신에 관심이 되어 왔다. 최근 임상 연구에서 HCMV 단백질을 발현하는 알파바이러스 레플리콘 (alphavirus replicons)이 잘 용인되고 지속적인 세포성(cellular) 및 체액성 반응 (humoral responses)을 유도함을 임상실험에서 입증되었다 [19]. 또 다른 연구에서는 백신으로서 정제된 gB을 채택하고 유의적인 수준의 HCMV 중화 항체가 유도 가능한 것과 같은, 유망한 결과를 도출하였다 [18]. 이러한 백신들은 선천적 (congenital) HCMV 감염증의 예방에 대한 사용가능성을 제공하였다.
마우스에서의 선행연구들을 통하여, 본원에서는 DB라 약칭되는, 소위 농염체 (dense bodies)가 놀랍게도, 면역성(immunogenic) 있음이 입증되었다 [20]. 당업계에 일반적으로 알려지고 본원에서 사용되는 바와 같이, 농염체는 인간 세포거대바이러스(human cytomegalovirus; HCMV)에 의한 포유동물 세포의 감염 후에 분비되는 바이러스 입자(viral particle)이며, 여기에서,
a) 상기 입자는 상기 입자는 바이러스 당단백(glycoprotein)이 내재된 지질막 (lipid membrane)으로 둘러싸여 있고, (b) 상기 입자는 바이러스 DNA 또는 캡시드 (capsid)도 함유하지 않은 것이다.
바람직하게는, 상기 농염체는 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)도 함유한다. 농염체 및 이의 제법은 또한 국제특허 출원 제 WO 00/53729호에 개시되어 있다.
이들의 놀라운 면역원성과 관련하여, HCMV 백신으로서 DB 개발을 위한 노력이 있어 왔다. 최근 실험에서 DB가 그 항원 특성면에서 변형 가능함이 입증되었다 [21;22]. 이는 주(major) DB-구성요소(component) pp65 및 재조합 (recombinant) HCMV에 의하여 바이러스(viral) IE1-단백질(protein)로부터 이종성 (heterologous) MHC-계(class) I 부여된 펩티드(peptide)로 구성된 융합 단백질 (fusion protein)을 발현함으로서 달성된다. 이는 감염된 인간 포피 섬유아세포 (human foreskin fibroblasts; HFF)에서의 재조합 DB (recDB)를 형성시킨다. 상기 융합 단백질을 함유한 recDB는 감염된 HFF로부터 분비되었다 [21]. 이러한 입자들의 HLA-A2 형질전환(transgenic) HHD-마우스(mice)로의 적용은 CD8+ T 임파구 반응(lymphocyte response)을 유도하고, 이는 시험관내 (in vitro) 실험에서 분리된 T 세포의 펩티드 자극 후에 명백해졌다 [22]. 그러나, HCMV 특이적 (specific) T 세포는 CD8+ T 세포 분획 (cell fractions)들을 생체외 실험에서 (ex-vivo) 엘리스폿 (Elispot) 분석법(analysis)에 의하여 직접 시험하는 경우에는 즉각적으로 검출되지는 않았다. 이는 원칙적으로 치료학적 적용에 적합함에도 불구하고, 이러한 입자들로는 바람직한 정도로 현격한 것으로 판명되지 않았으며, 더군다나, 이러한 감염된 HFF 배양물로부터 이러한 recDB의 수율은 매우 낮았다.
따라서, 본 발명의 근본적인 해결 과제는 백신으로서 적합한 바이러스 농염체(여기에서 상기 바이러스성 농염체가(viral dense body)가 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 함유하고, 바람직하게는 상기 백신이 하나 이상의 이종성 펩티드에 대하여 면역적 반응을 나타낼 수 있음)를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 해결 과제는 바이러스 농염체 (여기에서 상기 바이러스성 농염체가(viral dense body)가 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 함유하고, 바람직하게는 상기 농염체가 중화 항체 생성 및/또는 CD8+T 임파구 반응 형성을 유도 가능함)를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가적인 해결 과제는 바이러스 농염체 (여기에서 상기 바이러스성 농염체가(viral dense body)가 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 함유하고, 상기 농염체가 고수율로 제조 가능함)을 제공하는 것이다.
이러한 해결 과제 및 기타 과제들은 후술되는 독립항의 주제로서 해결된다. 바람직한 구현예들도 또한 종속항들로부터 추론 가능하다.
보다 구체적으로는, 본 발명의 상기 해결과제는 본 발명의 첫 번째 측면의 1차 구현예로서, 인간 세포거대바이러스(Human cytomegalovirus; HCMV)에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자, {여기에서, (a) 상기 입자는 바이러스 당단백(glycoprotein)이 내재된 지질막 (lipid membrane)으로 둘러싸여 있고, (b) 상기 입자는 바이러스 DNA 또는 캡시드 (capsid)도 함유하지 않으며, 및 (c) 상기 입자는 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 함유하고 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 T-세포 항원 pp65아미노산의 W175 또는 A534 아미노산 위치에 삽입된 것임}에 의하여 해결되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 2차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 T-세포 항원 pp65의 W175 아미노산 위치에 삽입되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차 및 2차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 3차 구현예로서, 상기 T-세포 항원 pp65의 아미노산 서열은 서열번호 1 (SEQ ID NO: 1)에 따른 아미노산 서열을 포함하는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차 및 3차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 4차 구현예로서, 상기 입자는 매우 높은 항원성(antigenic)을 갖는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차 및 4차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 5차 구현예로서, 상기 입자는 중화 항체(neutralizing antibodies) 형성을 유도 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차 및 5차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 6차 구현예로서, 상기 입자는 CD8+T 임파구 반응 형성을 유도 가능한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차 및 6차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 7차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 MHC-계(class) I 부여 항원(presented antigen)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차 및 7차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 8차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 pp65과 상이한 하나 이상의 단백질(들)의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차 및 8차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 9차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백 (glycoprotein)의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차 및 9차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 10차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백 (glycoprotein) gB의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차 및 9차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 11차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백 (glycoprotein) gH의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차 및 9차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 12차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 스트레인(strain)과 상이한 특정 당단백 (glycoprotein)의 변이체 (variants)인 2개 이상의 HCMV 당단백을 포함 또는 당단백(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 12차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 13차 구현예로서, 상기 특정 당단백 (glycoprotein)의 2개 이상의 변이체 (variants)중의 하나는 HCMV Towne 스트레인의 변이체이며, 상기 특정 당단백 (glycoprotein)의 2개 이상의 변이체 (variants)중의 다른 하나는 HCMV Ad169 스트레인의 변이체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 12차 및 13차 구현예중의 하나의 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 14차 구현예로서, 상기 당단백 (glycoprotein)은 HCMV의 gB 단백질인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 및 8차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 15차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 단백질 IE1의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 및 8차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 16차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백의 하나 이상의 부분 및 HCMV 단백질 IE1의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 및 8차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 17차 구현예로서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 이외의 인간 병원체(human pathogen)의 부분인 단백질의 하나 이상의 부분(들)인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 17차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 18차 구현예로서, 상기 HCMV 이외의 인간 병원체(human pathogen)의 부분인 단백질은 세포독성(cytotoxic) T 임파구가 HCMV 이외의 인간 병원체로 자연 감염(natural infection)된 인체에서 형성되는 단백질인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 18차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 19차 구현예로서, 상기 HCMV 이외의 인간 병원체(human pathogen)는 HIV-1, HBV, HCV 및 인플루엔자 (influenza)를 포함한 그룹(group)으로부터 선택된 인간 병원체인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차, 9차, 10차, 11차, 12차, 13차, 14차, 15차, 16차, 17차, 18차 및 19차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 20차 구현예로서, 상기 융합 단백질(fusion protein)은 전장(full-length) T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합 단백질인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차, 9차, 10차, 11차, 12차, 13차, 14차, 15차, 16차, 17차, 18차, 19차 및 20차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 21차 구현예로서, 상기 바이러스 입자(viral particle) 또는 입자들은 질병(disease)의 치료 및/또는 예방을 위한 약제(medicament) 제조를 위한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차, 9차, 10차, 11차, 12차, 13차, 14차, 15차, 16차, 17차, 18차, 19차 및 20차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 22차 구현예로서, 상기 바이러스 입자(viral particle) 또는 입자들은 질병(disease)의 치료 및/또는 예방을 위한 방법(method)에 사용되는 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 21차 및 22차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 23차 구현예로서, 상기 질병은 하나 이상의 이종성 펩티드 또는 이의 유도체에 대한 중화 항체의 형성 또는 하나 이상의 이종성 펩티드 또는 이의 유도체에 대한 CD8+T 임파구 반응 (lymphocyte response)의 유도에 의하여 치료 및/또는 예방 가능한 질병인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차, 9차, 10차, 11차, 12차, 13차, 14차, 15차, 16차, 17차, 18차, 19차 및 20차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 24차 구현예로서, 상기 바이러스 입자(viral particle) 또는 입자들은 백신(vaccine) 제조를 위한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 24차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 25차 구현예로서, 상기 백신(vaccine)은 HCMV 감염증(infection)을 치료 및/또는 예방을 위한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 24차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 26차 구현예로서, 상기 백신(vaccine)은 이식 (transplantation) 부작용(side effect)을 치료 (treatment) 및/또는 예방(prevention)을 위한 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 26차 구현예이기도 한, 첫 번째 측면의 27차 구현예로서, 상기 백신(vaccine)은 고형 기관 (solid organ) 또는 조혈모세포 (haematopoetic stem cells)의 이식인 것이다.
본 발명의 첫 번째 측면의 26차 및 27차 구현예중 어느 하나이기도 한, 첫 번째 측면의 28차 구현예로서, 상기 부작용은 HCMV 감염증 또는 감염증 진행 도중에 기인한 것이다.
본 발명의 해결과제는 본 발명의 첫 번째 측면의 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 두 번째 측면으로서, 본 발명은 질병 또는 부작용을 치료 및/또는 예방을 위한 약제 제조를 위한 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차, 9차, 10차, 11차, 12차, 13차, 14차, 15차, 16차, 17차, 18차, 19차 및 20차 구현예중 어느 하나에 따른 바이러스 입자의 사용(use)으로 해결되는 것이다 (여기에서, 질병 또는 부작용은 전술한 구현예들의 개개 및 임의의 구현예 및 개개 및 임의의 측면에서 정의된 질병 또는 부작용임).
본 발명의 해결과제는 본 발명의 세 번째 측면의 1차 구현예이기도 한, 본 발명의 세 번째 측면으로서, 본 발명은 질병 또는 부작용을 치료 및/또는 예방을 위한 백신 제조를 위한 첫 번째 측면의 1차, 2차, 3차, 4차, 5차, 6차, 7차, 8차, 9차, 10차, 11차, 12차, 13차, 14차, 15차, 16차, 17차, 18차, 19차 및 20차 구현예중 어느 하나에 따른 바이러스 입자의 사용(use)으로 해결되는 것이다 (여기에서, 질병 또는 부작용은 전술한 구현예들의 개개 및 임의의 구현예 및 개개 및 임의의 측면에서 정의된 질병 또는 부작용임).
이종성 펩티드 서열의 pp65로의 삽입위치가 연이은 DB 형성의 효율성에 대하여 결정이라는 견지에 기초하여, 본 발명자들은 놀랍게도 본 발명의 바이러스 입자에 포함되고 T-세포 항원 pp65의 하나 이상의 부분(들) 및 하나 이상의 이종성펩티드를 함유하는 융합단백질이 상기 이종성 펩티드가 pp65 아미노산 서열의 아미노산 위치 W 175 또는 아미노산 위치 A534 에 삽입시에 DB에 유리한 특성을 부여됨을 발견하였다. 이러한 융합 단백질의 유리한 특성들은 (1) 이종성 펩티드에 대한 중화 항체 유도, (2) 상기 이종성 펩티드에 대한 CD8+T 임파구 반응 유도, (2) 및 상기 DB의 고수율 생성을 포함한다. 게다가, pp65에서의 이러한 두 지점은 상기 융합 단백질을 포함하는 DB의 효율적 생성 및 분리를 제공한다. 상기 융합 단백질에서 관찰되는 상기 CD8+T 임파구 반응은 CD8T 세포성 반응을 발생시켰고, 이는 CD8T 세포 분획(cell fractions)의 생체외 엘리스팟 분석실험(ex vivo Elispot analyses)에서 쉽게 탐지된다.
당업계에서 UL 83으로도 지칭되는 T-세포l 항원 pp65은 문헌에 개시되어 있다 (Pande, H, Lee, T.D., Churchill, M.A. and Zaia, J.A, "Structural analysis of a 64-kDa major structural protein of human cytomegalovirus (Towne): identification of a phosphorylation site and comparison to pp65 of HCMV (AD169); Virology 178 (1), 6-14 (1990)).
pp65의 기능 및 단백질의 기능 및 적절한 폴딩(folding)에 중요한 도메인(domain)에 대하여 잘 알려진 바는 없다. 결론적으로, pp65 내에서 기능적으로 관련된 영역을 확실히 제공하는 삽입위치에 대한 근거는 없다. 삽입위치 선택 (insertion site selection)은 베타-헤르페스바이러스(beta-herpesviruses)에 보존된 영역을 회피하고 2차원 구조 {(α-헬릭스(helices) 및 β-시트(sheets)}도 예측할 수 있도록 수행되었다. 이는 보존된 영역들, α-헬릭스 및 β-시트들이 구조적으로나 기능적으로 중요할 수 있으며, 파괴되지 않아야 한다는 가정하에 수행되었다. 그러나 대부분의 변이체들은 recDB를 효과적으로 형성하는데 실패하였고, 이는 이러한 전략이 적절한 삽입 부위를 동정할 수 없음을 의미한다. 이러한 견지에서, 본 발명자들은 RV-SB3 및 RV-SB6에서의 삽입 위치가 recDB 생성 측면에서 보다 적합한 것으로 입증됨을 놀랍게도 발견하였다.
본원에서 나타난 바와 같이, DB-SB3 및 DB-SB6에 의한 HFF로의 키메라(chimeric) pp65의 외인성 도입은 pp65NLV 및 IE1TMY의 효율적인 부여를 이끈다. HLA-A2 형질전환(transgenic) HHD 마우스로의 이러한 입자들의 도입은 이러한 T 세포의 동족성 펩티드로의 시험관내(in-vitro) 신장(expansion) 후에 탐지가능한 모든 펩티드에 대한 CD8 T 세포성 반응성을 촉발한다. pp65의 548 위치에서 IE1-펩티드를 recDB에 삽입한 선행 실험에서도 유사한 실험결과를 얻었다 [21;22]. 그러나, 후자의 recDB를 이용하여, 둘중 하나의 펩티드에 대한 CD8 T 세포가 생체외 (ex vivo) 실험에서 직접 탐지되지는 않았으며, 이는 프라이밍(priming)이 비효율적임을 의미한다. 대조적으로, DB-SB3의 적용은 pp65NLV-특이적 및 IE1TMY-특이적 CD8 T 세포의 감지 가능한 빈도를 쉽게 이끌었다. 이는 이러한 recDB가 내인성 및 이종성 펩티드 모두에 대한 매우 높은 면역원성이며 유도된 T 세포임을 의미한다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 이종성 펩티드는 항원성 펩티드(antigenic peptide)이며, 보다 바람직하게는 항원성 이종성 펩티드(antigenic heterologous peptide)인 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 이종성 펩티드는 HCMV의 IE1 단백질 또는 이의 부분과 상이한 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 상기 펩티드 길이는 약 4 내지 40 아미노산 잔기, 바람직하게는 약 6 내지 25 아미노산 잔기, 보다 바람직하게는 약 8 내지 15 아미노산 잔기, 가장 바람직하게는 약 8 내지 12 아미노산 잔기인 것이다.
본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같이, 예를 들어, 1 내지 5과 같은 범위의 한계치를 특정화하는 임의의 구절은 1 내지 5, 즉, 1, 2, 3, 4 및 5의 임의의 정수를 의미한다. 환원하면, 2개 정수에 의하여 정의되는 임의의 범위는 상기 한정의 상기 한계치를 정의하는 2개의 정수 및 상기 범위에 의하여 포함되거나 포함하는 임의의 정수를 포함하는 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명의 바이러스 입자의 항원성(antigenicity)은 선원의 농염체, 보다 구체적으로는, 전장 T-세포 항원 pp65를 포함하는 융합 단백질을 함유한 농염체들과 비교시에 증가된 것이다.
본 발명의 하나의 구현예로서, 본 발명의 바이러스 입자의 생성(formation)은 참고문헌[25]에 개시된 농염체 생성보다 큰 것이다.
바람직하게는, HCMV 단백질 IE1이 ppUL123으로 지칭됨도 당업자에게 인지될 것이다.
또한 상기 입자에 포함된 융합 단백질은 바람직한 구현예로서 키메라 단백질(chimeric protein)임도 인지될 것이다.
본 발명은 나아가 구현예 및 장점들이 적용됨을 나타내는 도면, 특징, 실시예 및 서열목록에 의해 기술된다.
본 발명은 인간 세포거대바이러스(Human cytomegalovirus; HCMV)에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자, {여기에서, (a) 상기 입자는 바이러스 당단백 (glycoprotein)이 내재된 지질막 (lipid membrane)으로 둘러싸여 있고, (b) 상기 입자는 바이러스 DNA 또는 캡시드 (capsid)도 함유하지 않으며, (c) 상기 입자는 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질(fusion protein)을 함유함} 및 상기 바이러스 입자 또는 복수의 상기 바이러스 입자들의 용도에 관한 것이다.
도 1은 HCMV 재조합의 감염된 HFF의 간접 면역형광 분석법(indirect immuno fluorescence analysis) 결과이며, (구체적으로는 세포를 4일간 지적된 바이러스로 감염시키고 연이어 면역형광 분석법을 수행하였고, 개개 바이러스로 표시되는 재조합 pp65의 구조는 하단 미세그래프(micrographs) 표기하고 삽입 위치를 플랭크(flanking)하는 pp65의 N-말단(terminal) 아미노산을 표기함);
도 2은 다양한 융합 단백질(B)에 대한 시간(time; d.p.i) 기능으로서의 게놈 코피수(genome copies)/ml를 의미하는 다이아그램(diagram)으로 표시된 정량적 DNA-PCR 분석법 결과인 면역블롯 분석법 (immuno blot analysis; A) 실험 결과 및 추가의 면역블롯 분석법 결과(C)를 나타낸 도이며 {구체적으로는, (A)는 pp65-융합 단백질의 발현, 재조합 바이러스의 복제(replication) 및 융합 단백질의 비리온(virions) 및 DB로의 패키징(packing) 효율성을 나타낸 도로서, 2- 및 4-일 감염된 HFF의 면역 블롯 분석법 결과로서, 세포들을 분석을 위하여 2 m.o.i.로 감염시키고 지정된 시간에 회수하였다. 필터(Filters)를 pp65-특이 단일클론 항체 65-33으로 프로브(probe)하였다. 개개 레인(lane)에서의 단백질 양은 β-액틴(actin)에 대하여 정상화시켰다. (B)는 감염된 HFF 세포 배양 상등액중 바이러스 게놈(viral genomes)에서의 정량적 DNA-PCR 분석결과를 나타낸 도이며, 세포들을 10 게놈/세포 (m.o.i.)로 감염시키고 배양 상등액을 지정된 시간에 회수하였고 냉동시켰다. PCR 분석법을 동일한 어세이법으로 병렬적으로 수행하였다. (C)는 recDB 또는 비리온(virions)에서 패키징(packed)한 pp65의 면역블롯 분석법을 도시한 것으로서, 세포를 6-7 일간 재조합 바이러스 또는 wt RV-HB5로 감염시키고, 상등액을 비리온(virions)- 및 DB-분획(fractions)을 회수하기 위하여 글리세롤-타타레이트 경사 원심분리기(glycerol-tartrate gradient centrifugation)을 수행하였다. 이러한 분획물은 단일클론 항체 65-33 또는 내부 표준(internal standard)으로서, 바이러스성(viral) gB에 대한 단일클론 항체를 이용한 면역블롯법으로 분석하였다);
도 3은 IFN-γ-엘리스팟 분석법(Elispot analysis) 결과를 나타낸 도이며 (이 다이아그램은 반응성 세포(responder cells)로서의 pp65NLV-CTL (A) 또는 IE1TMY-CTL (B)을 이용하여 다양한 융합 단백질에 대한 대응하는 CD8+c세포의 백분율(%)를 나타냄. 구체적으로 도 3은 recDB 처치된 HLA-A2 양성(positive) HFF에 의해 제시된 IFN-γ-엘리스팟 분석법(Elispot analysis) 결과를 나타낸 도로서, 세포를 지정된 DB로 처리하고 반응성 세포(responder cells)로서의 pp65NLV-CTL (A) 또는 IE1TMY-CTL (B)을 이용하여 IFN-γ-엘리스팟 분석법(Elispot analysis)에서 자극용 세포(stimulator cells)로 연이어 사용하였다);
도 4은 IFN-γ-엘리스팟 분석법(Elispot analysis) 결과를 나타낸 도이며 (이 다이아그램은 자극용 세포(stimulator cells)로서 RMA-S cells을 이용하여 다양한 융합 단백질에 대응하는 CD8+c세포의 백분율(%)를 나타냄. 구체적으로 도 4은 recDB으로 면역화된 HHD-마우스로부터 CD8+ 풍부 비장 세포(enriched spleen cells)의 세포외 (ex vivo) IFN-γ-엘리스팟 분석법(Elispot analysis) 결과를 나타낸 도로서, 동족성 펩티드를 적재한 RMA-S 세포를 자극용 세포로 채택하고 막대 크기(Bar sizes)는 문헌(Bet al [37])에 개시된 바와 같이, 선형 회귀 분석법(linear regression analysis)으로 결정된, IFN-γ 분비(secreting) CD8 T 세포의 가장 개연성있는 빈도(frequency)를 표기하고 오차 바(Error bars)는 95% 신뢰 구간(confidence intervals)을 의미한다};
도 5은 전장(full-length) pp65 {서열 번호(SEQ ID NO):1}의 아미노산 서열을 표기한 것이다.
하기의 예들은 단지 본 발명의 설명의 목적을 설명하고자 하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 보호범위를 제한하고자 함이 아니다.
실시예 1. 재료 및 방법
1. 세포
1차 인간 포피 섬유아세포(Primary human foreskin fibroblasts)인 CTL 세포주(lines) 및 T2 세포를 문헌에 개시된 바대로 배양하였다 [23]. RMA-S 세포를 [24] 10% FCS, 2 mM L-글루타민(glutamine), 50 mg 겐타마이신(gentamicin) L-1 및 5μM β-메르캅토에탄올(mercaptoethanol)을 첨가한 RPMI 1640 배지 (PAA Laboratories, C, Germany)에서 배양하였다.
2. 플라즈미드(Plasmids) 및 바이러스(viruses)
바이러스 DNA의 돌연변이 생성을 위하여, HCMV 박테리아 인공 크로모좀(bacterial artificial chromosome; BAC) pHB5을 이용하였다[25]. pHB5의 돌연변이 생성을 문헌 [21]에 개시된 바와 같이, galK 양성/음성 선택법(positive/negative selection procedure) [26]에 따라 수행하였다. UL83 으로 삽입된 DNA 서열은 HLA-A2 부여 펩티드(presented peptide) IE1TMY [IE1297-305]를 코드화(encoded)하고 정확한 프로테오좀성 과정(proteasomal processing)을 가능하게 하는 추가의 아미노산에 의하여 플랭크(flanked)되는 판독 프레임(reading frame)을 개방한다. pp65에 융합된 추가의 폴리펩티드(polypeptide)는 TSDACMMTMYGGISLLSEFC를 밑줄친 HLA-A2 부여된 노나펩티드(presented nonapeptide)로 판독한다. BAC 클론(clones)으로부터의 바이러스 재구성(Viral reconstitution)을 문헌(Hobom et al.[27]}에 따라 수행하였다.
바이러스 스톡(Virus stocks)을 제조하고, 적정하고, 문헌 [28]에 개시된 바대로 48 시간동안 (p.i.) IE1 양성 세포를 판독하거나 또는 세포외 바이러스 게놈(extracellular viral genomes)을 TaqMan DNA PCR 분석법을 수행하거나 하여 정량하였다. HFF를 7일간 감염시켰다. 0.1 (m.o.i.)로 감염으로 대략 10 세포내 바이러스 게놈 (intracellular viral genomes)의 수가 되도록 하였다.
3. 농염체(Dense Body; DB) 정제, 간접 면역형광 분석법 및 면역블롯법
DB를 이리미에르 등 (Irmiere and Gibson [29]) 및 선행문헌 [20]에 공개된 바와 같은 글리세롤 타타레이트 경사 초원심분리법 (glyceroltartrate gradient ultracentrifugation)으로 후기 감염된 HFF로부터 정제하였다. 간접 면역형광 분석법 (Indirect immunofluorescence analysis)을 문헌 [30]에 개시된 바대로 수행하였다. 상기 pp65를 단일클론항체(monoclonal antibody) 65-33 (W. Britt 제공, University of Alabama, Birmingham, Alabama, USA) 및 FITC 접합 2차 항체(conjugated secondary antibodies, DAKO, Hamburg, Germany)를 이용하여 표지하였다. 핵(nucleus)을 DAPI으로 대조염색을 수행하였다. 면역형광 분석법으로부터 얻은 데이터를 1000 배 확대 비율로 확대한 현미경 (Axiophot-1 microscope, Zeiss)을 이용하여 수득하였다. 면역블롯법(immunoblotting)을 위해, 단백질 시료를 환원 조건하에 변성시키고, SDS-PAGE로 분리하고 1시간 45분간, 400 mA로 일렉트로블롯팅법 (electroblotting)으로 니트로셀룰로오스 막 (nitrocellulose membranes, Millipore, Schwalbach, Germany)으로 옮겼다. 상기 막을 pp65, β-액틴(actin, Rockland, Gilbertsville, PA, USA) 및 당단백 (glycoprotein B; gB) [31]에 대한 항체로 배양하였다. 웨스턴블롯법 (Western blots)을 항-마우스(anti-mouse) 또는 항 래빗(anti-rabbit) 2차 항체로 프로브(probe)하고, ALEXA Fluor 680 (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) 또는 IRdye 800 (Rockland)에 결합하였다. 블롯팅된(Blotted) 단백질을 분석기기 (Odyssey infrared imaging system, LI-COR, Lincoln, Nebraska, USA)를 이용하여 탐지하고 정량화하였다.
2.4 recDB로 배양한 HFF의 인테페론(Interferon) γ - 엘리스팟 어세이법(Elispot assay)
효소연계 면역스팟 어세이법(Enzyme linked immunospot (Elispot) assays)를 기존문헌 [23;32]대로 수행하였다. HLA-A0201 (A2) 제한(restricted) HCMV-유래 펩티드 (derived peptides) pp65495-503 (pp65NLV-CTL) [33;34] 및 IE1297-305 (IE1TMY-CTL) [35] 에 특이적인 CTL 세포주를 본 실험에 사용하였다. 상기 CTL 세포주를 HLA-A2/huCD8 이중 형질전환 (double-transgenic; tg) 마우스를 면역화하여 제조하였다 [23].
2.5 HLA-A2 형질전환 마우스 모델
812 주령 HLA-A2 형질전환 마우스(HHD mice, [36])를 6μg DB RV-HB5 (DB-HB5), RV-SB3 (DB-SB3) 또는 RV-SB6 (DB-SB6), 각각 또는 PBS와 함께 복강주사로 면역화하였다. 임파구를 면역화 후 7일째에 비장으로부터 준비하였다. CD8 T 세포를 MACS 분류(sorting)로 농축시키고 IFN-γ 분비 세포의 빈도는 펩티드-적재(peptide loaded) RMA-S HHD 또는 T2 자극용 세포 (stimulator cells)를 이용하여 생체외 (ex vivo)에서 직접적으로 엘리스팟 (Elispot)으로 분석하였다. 이러한 조건하에 회사(Millipore, Schwalbach/Ts., Germany)의 엘리스팟 플레이트(Elispot plates)를 사용하였다. 상기 엘리스팟 어세이법(Elispot assay)를 제조업체의 사용설명서에 따라 수행하였다. 반응성 세포(responding cells)들의 빈도(frequency)는 문헌(B[37])에 개시된 바와 따라 선형회귀 분석법(linear regression analysis)에 따라 결정하였다.
실시예 2. 삽입 위치 선택은 세포질성 DB 형성에 결정적이다.
본 실시예에서 상술되는 바와 같이, 이종성 펩티드(heterologous peptide)의 삽입위치(insertion site) 선택은 세포질성 DB(cytoplasmic DB) 형성에 결정적이다.
추후 개발될 백신 후보 가능성은 후속의 대규모 양산이 가능할 수 있는 수율에 결정적으로 좌우된다. 선행연구에서, DB는 이종성 펩티드 서열을 피막 단백질 (tegument protein) pp65에 융합시킴으로서 이들의 항원적 특성이 변형 가능함을 입증함으로서 제공될 수 있다 [21]. 그러나, HCMV의 개개 재조합체(recombinant)로 감염시킨 세포는 오로지 제한된 양의 recDB만을 분비한다. 그러므로, 상기 가설을 pp65 내의 다른 부위에서 이종성 펩티드 아미노산 서열과 같은 이종성 서열의 삽입이 recDB의 수율을 증대시킬 수 있음을 시험하였다.
분자의 서로 다른 부분의 5개 위치를 삽입할 위치로 선택하였다 (도 1). 상기 삽입된 펩티드는 HCMV IE1 단백질로부터 유래된 HLA-A2 부여된 (presented) 노나펩티드(nonapeptide) TMYGGISLL (IE1TMY)을 포함하는 20 아미노산으로 구성된다 [35]. 재조합 바이러스 (Recombinant viruses)를 galK-기반 선택 과정(based selection procedure)[21;22]을 이용하여 상기 HCMV BAC plasmid pHB5 [25]을 변형함으로서 재조하였다. 재조합 BAC-플라즈미드(plasmids)를 제한적 엔도뉴클레아제 소화 작용 (restriction endonuclease digestion) 및 삽입위치의 뉴클레오티드 시퀀싱(nucleotide sequencing)에 의하여 정확하게 분석하였다 (데이타 표시무). 재조합 바이러스의 재구성(Reconstitution)을 상기 BAC-플라즈미드(plasmids)로 HFF를 감염시킴으로서 연이어 수행하였다. 상기에서 얻은 바이러스를 DB 형성을 위하여 시험하였다. HFF의 HCMV 감염의 하나의 특징은 DB의 세포질내 축적이며, 이는 간접 면역 형광 분석법 (indirect immuno fluorescence analysis; IFA)으로 시각화가 가능하다. 결론적으로, HFF는 새롭게 생성된 변이체(mutants)들로 감염되었고 IFA를 pp65-특이적 항체(specific antibody)를 이용하여 감염 후 (days post infection; d.p.i.) 4일째에 수행되었다. (도 1). 상기 변이체 RV-SB3 및 RV-SB6로 감염시킨 세포들만이 선천적 바이러스 감염 세포 (parental-virus infected cells)에서의 DB 형성에 상응하는 세포질성 DB 형성을 나타냈다. 대조적으로, RV-SB2, RV-SB4 및 RV-SB5 감염 세포들에서는 아무런 DB 형성 또는 거의 없는 DB 형성을 나타냈다. 이러한 세포에서 후기(late-stage) 감염된 HFF에서 전형적으로 발견되는 pp65의 핵-세포질성 전좌 (nucleo-cytoplasmic translocation)가 손상되었음에 주목하라. 이러한 결과는 pp65 내에서의 이종성 펩티드 서열의 삽입을 위한 위치 선택이 recDB 형성에 결정적임을 의미한다. IFA-실험결과에 기반으로 하여 RV-SB3 및 RV-SB6 바이러스들을 후속 분석을 위하여 선택되었다.
실시예 3. 양친성 스트레인와 RV - SB3 및 RV - SB6 와의 비교
본 실시예에서 상술되는 바와 같이, 재조합 바이러스 RV-SB3 및 RV-SB6을 pp65-발현, 비리온 방출(virion release) 및 pp65의 입자로의 패키징 (packaging) 측면에서 양친성 스트레인(parental strain)와 필적하였다.
RV-SB3- 및 RV-SB6-감염 HFF에서의 pp65의 발현 수준을 면역블롯 분석법(immunoblot analysis)으로 시험하였다. 세포를 둘 중의 하나의 바이러스 또는 양친성 (parental) RVHB5으로 2일 또는 4일간 각각 감염시켰다. 세포 용해물 (Cells lysates)를 시스템 (Odyssey infrared imaging system)을 이용하여 정량적 면역블롯 분석법 (quantitative immunoblot analysis)을 실시하였다. 세포성 액틴 (cellular actin)의 양을 내부 표준(internal standard)으로 간주하였다 (도 2A). RV-SB3- 및 RV-SB6-감염 세포에서의 pp65-융합 단백질의 발현 수준은 양친성 (parental) RVHB5으로 감염된 세포에서의 pp65 수준과 비교시, 감염 후 (p.i) 2일째 감소하였다. 그러나 감염 후 (p.i) 4일째, 상기 2개의 융합 단백질의 상기 수준은 RV-HB5 감염 세포에서의 pp65 수준보다 높은 것으로 나타났다. 이는 recDB 합성을 지향하기에 충분한 단백질이 RV-SB3- 및 RV-SB6-감염세포에서 합성되었음을 의미한다.
HFF에서 복제할 재조합 스트레인(strains)들의 능력을 시험하기 위하여, 세포를 0.1 감염다중도(m.o.i.)로 감염시켜 10 게놈 복제수(genome copies)/세포(cell)로 만들고 배양 상등액을 감염 후(p.i.) 7일까지 매일 회수하였다. 상등액으로 분비된 바이러스 DNA를 정량적(quantitative) PCR 분석법을 이용하여 정량하였다 (도 2B). RV-SB3 및 RV-SB6 모두는 양친성(parental) RV-HB5과 유사한 수준으로 복제되는 것으로 판명되었다.
상기 융합 단백질의 패키징(Packaging)은 글리세롤 경사 원심분리법(glycerol gradient centrifugation)으로 감염된 HFF 상등액으로부터 회수된, 정제된 비리온(virions) 및 DB를 면역블롯 분석법(immunoblot analysis)으로 최종 분석을 수행하였다. 이 경우에, 표준화 (normalization)는 내부 표준(internal standard)으로 바이러스 막(viral envelope) 당단백(glycoprotein) B (gB)을 이용하여 수행하였다. 상기 재조합 스트레인(recombinant strain)이 이들의 양친성 스트레인(parental strain)과 비교시에는 pp65의 비리온(virions) 또는 DBs로의 패키징(packaging)은 차이가 없었다 (도 2C). 총괄하여 검토하면, 이러한 결과는 RV-SB3 및 RVSB6 모두가 RV-HB5과 pp65의 발현 및 패키징(packaging) 및 감염 세포에서의 복제(replication) 면에서 필적하는 것을 나타낸다.
실시예 4. DB - SB3 - 또는 DB - SB6 -처리 HFF 에 의한 pp65NLV 및 IE1TMY 모두의 발현
본 실시예는 pp65NLV 및 IE1TMY 모두가 DB-SB3- 또는 DB-SB6-처리(treated) HFF에 의하여 제공됨을 나타낸다.
백신 개발을 위한 recDB 사용의 하나의 목표는 이식 환자에서의 세포독성(cytotoxic) T 세포 재구성(reconstitution)을 뒷받침하는 것일 것이다. 이러한 세포들은 문헌([13;15] 리뷰(review) [16])에 알려진 바와 같이, 바이러스 재활성화 (viral reactivation) 및 질병의 치료 및 예방에 결정적인 중요성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 따라서, 상기 recDB가 pp65-유래 pp65NLV 및 IE1-유래 IE1TMY 모두가 HFF의 MHC-계(class) I 부여 과정(presentation pathway)으로 도입가능한지 여부를 시험하였다.
따라서, 세포를 recDB로 처리하고 이어서, 인터페론(interferon)-γ 엘리스팟 분석법 (Elispot analysis)을 수행하였다(도 3). 반응성 세포(responder cells)로서, 모든 펩티드 (pp65NLVCTL; IE1TMY-CTL)에 대한 CTL 클론(clones)을 사용하였다 [23]. DB-SB3- 및 DB-SB6-처리된 (treated) 세포들 모두가 IE1TMY 및 pp65NLV을 부여하였다. 상기 pp65NLV 부여(presentation) recDB 및 wt-DB 사이와 필적하였고, 이는 IE1-유래(derived) 서열의 삽입이 HFF에서의 pp65-부여를 손상시키지 않음을 의미한다. 세포들의 DB-SB3 처리는 pp65-특이적 반응 (specific response)에 필적하는 수준으로 다수의 반응성 (responding) IE1TMY-CTL로 이끌었다. 그러나, 세포의 DB-SB6 처리는 IE1-특이적 어세이상에서 현격하게 감소된 수의 양성 스팟(positive spots)을 이끌었다. 이는 DB 배양 후 IE1-펩티드를 부여하는 HFF의 능력이, 상기 펩티드가 pp65에 삽입되는 위치에 좌우됨을 의미한다.
실시예 5. 재조합 ( recombinant DB ; recDB )의 면역화는 IE1TMY -특이적 및 pp65NLV -특이적 CD8 T 세포를 이끈다.
본 실시예는 재조합 (recombinant DB; recDB)의 면역화는 IE1TMY-특이적 및 pp65NLV-특이적 CD8 T 세포의 유의적인 빈도(frequency)를 제공함을 의미한다.
선행실험들에서 recDB이 마우스에서 IE1TMY-특이적 CD8 T 세포를 유도 가능함을 나타냈다. 그러나, 이러한 세포들은 동족성(cognate) 펩티드로 면역화된 마우스로부터 분리된 CD8 T 세포 분획의 시험관내 자극(in-vitro stimulation) 후에만 탐지 가능했다. 반응성(responding) CD8 T 세포들은 세포외 실험(ex-vivo)에서 직접적으로 탐지되지 않았으며, 이는 상기 특이적 세포들의 전체수 및 이러한 recDB에 대한 전체적인 반응이 낮음을 의미한다 [21]. 새롭게 확립된 recDB의 면역학적 잠재력을 평가하기 위하여, HLA-A2 형질전환 HHD-마우스를 아쥬반트(adjuvant) 없이 상이한 DB로 면역화하였다. 예측한대로, IE1TMY 또는 pp65NLV에 특이적인 반응성 CD8 T 세포는 시험관내(in vitro) 자극 후에 탐지가능하였다 (데이타 표시무).
면역화된 마우스로부터의 세포도 세포외 (ex - vivo) 실험으로 직접 시험하였다. 이를 위하여, 상기 비장 세포의 CD8+ 분획들을 MACS-분류법(sorting)으로 분리하고 펩티드 적재 항원 부여 세포 (peptide loaded antigen presenting cells)을 이용하여 엘리스팟 분석법 (Elispot analysis)으로 시험하였다. IE1TMY에 특이적인 CD8 T세포를 DB-SB3 및 DB-SB6 모두로 면역화한 후에 탐지가능하였다 (도 4). DB-SB3에 의하여 준비된 IE1-특이적 반응은 DB-SB6에 의한 반응보다 강력하게 나타났으나, 모두 명백하게 탐지가능한 수준에 도달하였다. DB-SB3로의 면역화 후에, pp65NLV에 대하여 반응하는 CD8 T 세포들은 wt-DB에 비하여 대략 3배 높은 수준으로 탐지가능하였다.
그러나, 놀랍게도, 이러한 반응은 DB-SB6로의 면역화 후에 선택된 실험 조건에서는 탐지되지 않았으며, pp65NLV-특이적 반응은 생체외 (ex vivo) 실험에서는 탐지할 수 없었다. 이러한 결과는 2차 실험에서 확인되었으며, 이는 DB-SB6에 의한 면역화 (immunizing)로 면역우성화된 (immunodominant) pp65NLV펩티드에 대하여 발생하는 CD8 T 세포 반응이 불충분함을 의미한다 (도 4). 필적하는 결과가 T2 세포를 항원 부여(antigen presentation)를 위한 선택시에도 나타났다 (데이타 표시무). 게다가, 이는 이러한 세포들이 어세이의 탐지 한계치 이하에서 매우 작은 빈도로 유도됨을 의미한다. 이와 상응하여, 시험관내 실험에서 pp65NLV-특이적 T 세포의 재자극(restimulation)은 IE1TMY-특이적 세포에 비하여 지체되었다 (데이타 표시무).
종합하면, 상기한 실험들은 특히, 이종성 항원 펩티드에 대한 CD8 T 세포 반응을 발생시키는, DB-SB3의 잠재력을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> Vakzine Projekt Management GmbH <120> Viral particle released after infection of mammalian cells by human cytomegalovirus (HCMV) containing a fusion protein and use thereof <130> V 10025 PCT <150> EP10003712.6 <151> 2010-04-06 <160> 1 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 561 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> synthetic <400> 1 Met Glu Ser Arg Gly Arg Arg Cys Pro Glu Met Ile Ser Val Leu Gly 1 5 10 15 Pro Ile Ser Gly His Val Leu Lys Ala Val Phe Ser Arg Gly Asp Thr 20 25 30 Pro Val Leu Pro His Glu Thr Arg Leu Leu Gln Thr Phe Ile His Val 35 40 45 Arg Val Ser Gln Pro Ser Leu Ile Leu Val Ser Gln Tyr Thr Pro Asp 50 55 60 Ser Thr Pro Cys His Arg Gly Asp Asn Gln Leu Gln Val Gln His Thr 65 70 75 80 Tyr Phe Thr Gly Ser Glu Val Glu Asn Val Ser Val Asn Val His Asn 85 90 95 Pro Thr Gly Arg Ser Ile Cys Pro Ser Gln Glu Pro Met Ser Ile Tyr 100 105 110 Val Tyr Ala Leu Pro Leu Lys Met Leu Asn Ile Pro Ser Ile Asn Val 115 120 125 His His Tyr Pro Ser Ala Ala Glu Arg Lys His Arg His Leu Pro Val 130 135 140 Ala Asp Ala Val Ile His Ala Ser Gly Lys Gln Met Trp Gln Ala Arg 145 150 155 160 Leu Thr Val Ser Gly Leu Ala Trp Thr Arg Gln Gln Asn Gln Trp Lys 165 170 175 Glu Pro Asp Val Tyr Tyr Thr Ser Ala Phe Val Phe Pro Thr Lys Asp 180 185 190 Val Ala Leu Arg His Val Val Cys Ala His Glu Leu Val Cys Ser Met 195 200 205 Glu Asn Thr Arg Ala Thr Lys Met Gln Val Ile Gly Asp Gln Tyr Val 210 215 220 Lys Val Tyr Leu Glu Ser Phe Cys Glu Asp Val Pro Ser Gly Lys Leu 225 230 235 240 Phe Met His Val Thr Leu Gly Ser Asp Val Glu Glu Asp Leu Thr Met 245 250 255 Thr Arg Asn Pro Gln Pro Phe Met Arg Pro His Glu Arg Asn Gly Phe 260 265 270 Thr Val Leu Cys Pro Lys Asn Met Ile Ile Lys Pro Gly Lys Ile Ser 275 280 285 His Ile Met Leu Asp Val Ala Phe Thr Ser His Glu His Phe Gly Leu 290 295 300 Leu Cys Pro Lys Ser Ile Pro Gly Leu Ser Ile Ser Gly Asn Leu Leu 305 310 315 320 Met Asn Gly Gln Gln Ile Phe Leu Glu Val Gln Ala Ile Arg Glu Thr 325 330 335 Val Glu Leu Arg Gln Tyr Asp Pro Val Ala Ala Leu Phe Phe Phe Asp 340 345 350 Ile Asp Leu Leu Leu Gln Arg Gly Pro Gln Tyr Ser Glu His Pro Thr 355 360 365 Phe Thr Ser Gln Tyr Arg Ile Gln Gly Lys Leu Glu Tyr Arg His Thr 370 375 380 Trp Asp Arg His Asp Glu Gly Ala Ala Gln Gly Asp Asp Asp Val Trp 385 390 395 400 Thr Ser Gly Ser Asp Ser Asp Glu Glu Leu Val Thr Thr Glu Arg Lys 405 410 415 Thr Pro Arg Val Thr Gly Gly Gly Ala Met Ala Gly Ala Ser Thr Ser 420 425 430 Ala Gly Arg Lys Arg Lys Ser Ala Ser Ser Ala Thr Ala Cys Thr Ala 435 440 445 Gly Val Met Thr Arg Gly Arg Leu Lys Ala Glu Ser Thr Val Ala Pro 450 455 460 Glu Glu Asp Thr Asp Glu Asp Ser Asp Asn Glu Ile His Asn Pro Ala 465 470 475 480 Val Phe Thr Trp Pro Pro Trp Gln Ala Gly Ile Leu Ala Arg Asn Leu 485 490 495 Val Pro Met Val Ala Thr Val Gln Gly Gln Asn Leu Lys Tyr Gln Glu 500 505 510 Phe Phe Trp Asp Ala Asn Asp Ile Tyr Arg Ile Phe Ala Glu Leu Glu 515 520 525 Gly Val Trp Gln Pro Ala Ala Gln Pro Lys Arg Arg Arg His Arg Gln 530 535 540 Asp Ala Leu Pro Gly Pro Cys Ile Ala Ser Thr Pro Lys Lys His Arg 545 550 555 560 Gly

Claims (30)

  1. 인간 세포거대바이러스에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자 {여기에서, (a) 상기 입자는 바이러스 당단백이 내재된 지질막으로 둘러싸여 있고, (b) 상기 입자는 바이러스 DNA 또는 캡시드도 함유하지 않으며, 및 (c) 상기 입자는 하나 이상의 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합단백질을 함유하고 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 T-세포 항원 pp65아미노산의 W175 또는 A534 아미노산 위치에 삽입된 것임}.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 T-세포 항원 pp65 아미노산의 W175 아미노산 위치에 삽입된 것인 바이러스 입자.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 T-세포 항원 pp65의 아미노산 서열은 서열번호 1에 따른 아미노산을 포함하는 바이러스 입자.
  4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 매우 높은 항원성(antigenic)을 갖는 바이러스 입자.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 중화 항체 형성을 유도 가능한 것인 바이러스 입자.
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 CD8+T 임파구성 반응 형성을 유도 가능한 것인 바이러스 입자.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 MHC-계 I 부여 항원인 것인 바이러스 입자.
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 pp65과 상이한 하나 이상의 단백질(들)의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것인 바이러스 입자.
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것인 바이러스 입자.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백 gB의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것인 바이러스 입자.
  11. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백 gH의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것인 바이러스 입자.
  12. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 스트레인과 상이한 특정 당단백의 변이체인 2개 이상의 HCMV 당단백을 포함 또는 당단백(들)로 구성되는 것인 바이러스 입자.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 특정 당단백의 2개 이상의 변이체중의 하나는 HCMV Towne 스트레인의 변이체이며, 상기 특정 당단백의 2개 이상의 변이체중의 다른 하나는 HCMV Ad169 스트레인의 변이체인 것인 바이러스 입자.
  14. 제 12항 또는 제 13항에 있어서, 상기 당단백은 HCMV의 gB 단백질인 것인 바이러스 입자.
  15. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 단백질 IE1의 하나 이상의 부분(들)을 포함 또는 부분(들)로 구성되는 것인 바이러스 입자.
  16. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 당단백의 하나 이상의 부분 및 HCMV 단백질 IE1의 하나 이상인 것인 바이러스 입자.
  17. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 이종성 펩티드는 HCMV 이외의 인간 병원체의 부분인 단백질의 하나 이상의 부분(들)인 것인 바이러스 입자.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 HCMV 이외의 인간 병원체의 부분인 단백질은 세포독성 T 임파구가 HCMV 이외의 인간 병원체로 자연 감염된 인체에서 형성되는 단백질인 것인 바이러스 입자.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 HCMV 이외의 인간 병원체는 HIV-1, HBV, HCV 및 인플루엔자를 포함한 그룹으로부터 선택된 인간 병원체인 것인 바이러스 입자.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 융합 단백질은 전장 T-세포 항원 pp65 및 하나 이상의 이종성 펩티드를 포함하는 융합 단백질인 것인 바이러스 입자.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자 또는 입자들은 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 약제 제조를 위한 것인 바이러스 입자.
  22. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자 또는 입자들은 질병의 치료 및/또는 예방을 위한 방법에 사용되는 것인 바이러스 입자.
  23. 제 21항 또는 22항에 있어서, 상기 질병은 하나 이상의 이종성 펩티드 또는 이의 유도체에 대한 중화 항체의 형성 또는 하나 이상의 이종성 펩티드 또는 이의 유도체에 대한 CD8+T 임파구 반응의 유도에 의하여 치료 및/또는 예방 가능한 질병인 것인 바이러스 입자.
  24. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이러스 입자 또는 입자들은 백신 제조를 위한 것인 바이러스 입자.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 백신은 HCMV 감염증을 치료 및/또는 예방을 위한 것인 바이러스 입자.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 백신은 이식 부작용을 치료 및/또는 예방을 위한 것인 바이러스 입자.
  27. 제 26항에 있어서, 상기 백신은 고형 기관 또는 조혈모세포 이식인 것인 바이러스 입자.
  28. 제 26항 또는 27항에 있어서, 상기 부작용은 HCMV 감염증 또는 감염증 진행 도중에 기인한 것인 바이러스 입자.
  29. 질병 또는 부작용을 치료 및 예방하기 위한 약제 제조를 위한 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자의 사용 (여기에서, 상기 질병 또는 부작용은 전술한 항중 어느 한 항에 정의된 질병 또는 부작용임).
  30. 질병 또는 부작용을 치료 및 예방하기 위한 백신 제조를 위한 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 바이러스 입자의 사용 (여기에서, 상기 질병 또는 부작용은 전술한 항중 어느 한 항에 정의된 질병 또는 부작용임).
KR1020127028033A 2010-04-06 2011-04-06 융합 단백질 함유 인간 세포거대바이러스에 의한 포유동물 세포의 감염 후 분비되는 바이러스 입자 및 이의 용도 KR101839535B1 (ko)

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