MX2012009568A - Composiciones antimicrobianas liquidas. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con composiciones antimicrobianas líquidas que tienen una alta actividad antimicrobiana. La invención se relaciona adicionalmente con un método para preparar las composiciones antimicrobianas líquidas así como también con su uso como un conservador en los productos alimenticios.

Description

COMPOSICIONES ANTIMICROBIANAS LÍQUIDAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se relaciona con composiciones antimicrobianas liquidas, con métodos para preparar las composiciones, con su uso como un conservador y con métodos para la conservación de alimentos en donde se utilizan las composiciones.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La necesidad de métodos para la conservación de alimentos es grande. Se ha estimado que una gran parte del suministro de alimento en el mundo se pierde como un resultado del deterioro microbiano y las infecciones microbianas trasmitidas por los alimentos representan una amenaza constante y grave para la salud humana.

Varias especies bacterianas que pueden contaminar y crecer en los productos alimenticios y cultivos son patogénicas o producen · toxinas y originan un rango de enfermedades por intoxicación de alimentos. A pesar de la mejora sustancial en la tecnología e higiene, los productos alimenticios se pueden exponer a deterioro y bacterias patogénicas en el ambiente de manipulación de alimentos y el número de intoxicaciones por alimentos sigue aumentando en la mayoría de los países. Las técnicas de conservación de alimentos, por ejemplo procesamiento por calor, congelación, ultrasonido, irradiación, y tratamiento a alta presión, reducen significativamente la carga microbiana pero un aspecto particular es la evidencia de que los alimentos procesados se contaminan con los microorganismos luego de procesamiento y antes de empaque. De la creciente preocupación en la industria alimenticia son los problemas microbianos relacionados con varios alimentos tales como lácteos y productos cárnicos, alimentos frescos y refrigerados y comida de mar.

Especialmente se sabe que los productos alimenticios en el rango de pH de 4.5 a 7.0 son susceptibles a deterioro microbiano por microorganismos, que incluyen patógenos y bacterias que forman esporas. En los niveles inferiores de pH, son más importantes las levaduras, mohos y bacterias tolerantes a ácido. Principalmente, los alimentos procesados no se consumen directamente después de procesamiento, permitiendo por lo tanto que crezcan bacterias que sobrevivan al proceso de producción o se introduzcan mediante post-contaminación. Dado que el consumo de alimento puede ocurrir sin el recalentamiento de los alimentos procesados a temperaturas suficientes durante un tiempo suficiente, existe un riesgo de intoxicación alimenticia o deterioro de alimentos.

Adicionalmente, la tendencia reciente por los alimentos procesados de forma mínima con las calidades nutricionales intrínsecas y sensoriales de los alimentos crudos y frescos ha elevado el riesgo de seguridad. Los tratamientos de conservación más leves, tales como alta presión hidrostática y técnicas de campo de pulso eléctrico han demostrado ser exitosos, pero a menudo se basan en obstáculos efectivos, es decir cadena de frío y adición de antimicrobianos naturales.

Ha habido una extensa búsqueda conducida en el campo de seguridad de los alimentos para desarrollar diseños de productos antimicrobianos eficientes, que resultan en una combinación de condiciones de composiciones, procesamiento y vida útil.

La nisina es una sustancia antibacteriana similar al péptido producida por Lactococcus lactis subsp. lactis. Esta comprende 34 aminoácidos y es activa contra las bacterias gram- positivas principalmente. La nisina no es tóxica y está libre de efectos secundarios. La nisina es una sustancia Generalmente Reconocida como Segura y se utiliza ampliamente en una variedad de alimentos. Ejemplos de tales productos son queso fundido, leche, crema espesa, postres lácteos, mezclas para helado, huevo líquido, productos de harina horneados calientes, salsas y cerveza. La nisina es estable al calor y sobrevive a temperaturas de pasteurización con pérdida mínima de actividad.

Usualmente, la nisina se obtiene mediante fermentación de una especie de Lactococcus lactis y se formula adicionalmente como un polvo seco que se puede utilizar como un conservador como tal o después de primero haber sido disuelto en un disolvente adecuado. El Delvoplus® y Nisaplin® son nombres de marca para un polvo de nisina que contiene 1 millón IU por gramo. Ellos se distribuyen por DSM y Danisco, respectivamente. Estos productos de nisina en polvo tienen varias desventajas: se genera polvo luego de manejo, y dosificación y es difícil la mezcla de cantidades pequeñas de polvos en los productos. Por lo tanto, se prefieren comercialmente las composiciones de nisina líquida que no tienen las desventajas descritas anteriormente.

Se conocen en la técnica composiciones antimicrobianas líquidas que comprenden nisina. Aunque se han reportado que las composiciones antimicrobianas líquidas que comprenden nisina tienen actividad contra bacterias gram- positivas (ver Mota- eira et al. (2000), Montville et al. (1999), US 5,584,199 y US 4,597,972) y aún bacterias gram- negativas (ver EP 0 453 860, US 5,260,271 y US 5, 559,096), existe todavía una necesidad de composiciones antimicrobianas líquidas que comprenden la nisina que tiene una actividad antimicrobiana mejorada, particularmente contra bacterias gram- positivas encontradas en la industria alimenticia.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN De forma sorprendente, ahora se han encontrado las composiciones antimicrobianas que comprenden la nisina y ácidos de lúpulo que tienen una muy alta actividad contra bacterias gram- positivas. Debido a su alta actividad antimicrobiana se necesitan solo pocas cantidades de las composiciones para la acción efectiva contra las bacterias por ejemplo bacterias gram-positivas . Las composiciones tienen buena estabilidad microbiológica que en combinación con su buena estabilidad química y física hace las composiciones adecuadas para almacenamiento prolongado y por lo tanto les da una larga vida útil. Adicionalmente, las composiciones de la invención pueden tener una baja turbidez, que las hace adecuadas para uso en las aplicaciones alimenticias, en donde es de importancia la adición de aditivos de baja turbidez. A la luz de las anteriores características, las composiciones de la invención se pueden emplear ventajosamente como conservadores de alimentos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN De acuerdo con un primer aspecto la invención proporciona un método para preparar una composición de nisina líquida que comprende ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos, preferiblemente una composición de nisina liquida acuosa que comprende ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos. El método comprende las etapas de: a) preparar una primera nisina liquida que contiene la composición que tiene un pH de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3.5 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3.5 a aproximadamente 9.5, más preferiblemente aproximadamente 4 a aproximadamente 9, todavía más preferiblemente aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.5, aún más preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, y en particular aproximadamente 5.5 a por debajo de 7, b) aislar los compuestos sólidos de la primera nisina líquida preparada que contiene la composición, c) poner en contacto los compuestos sólidos aislados con una solución que tiene un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3, y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3 para preparar una segunda composición de nisina liquida, y d) remover los compuestos sólidos de la segunda composición de nisina liquida, caracterizado porque el método comprende adicionalmente la etapa de agregar por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácidos de lúpulo. La etapa d es opcional, pero en una realización preferida se desarrolla en el método de la invención. La adición de los ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos se puede hacer antes de, durante o después de por lo menos una de las etapas del método de la invención. En una realización preferida la adición se hace después de la etapa b, por ejemplo los ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o combinación de los mismos se pueden agregar a la segunda composición de nisina liquida. Los ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos se pueden agregar en forma liquida o sólida.

El término "ácidos de lúpulo" como se utiliza aquí significa los componentes de ácido amargos de los lúpulos e incluyen ácidos beta de lúpulos (lupulonas) , ácidos alfa de lúpulos (humulonas) y sus sales. También abarca extractos de ácido de lúpulos (tales como aquellos descritos en la US 5,286,506 (incorporada como referencia)). Se considera que muchos análogos de ácidos alfa y beta de lúpulo que incluyen cohumulonas, humulonas, adhumulonas, colupulonas, lupulonas y adlupulonas. Todos estos se incluyen en el término "ácidos de lúpulo" como se utiliza aquí. En una realización preferida de la invención los ácidos de lúpulo son ácidos beta de lúpulo, por ejemplo ácidos beta purificados de lúpulo. Los ácidos de lúpulo se pueden preparar mediante extracción y purificación de lúpulos naturales o mediante síntesis química. Por ejemplo, los productores de extractos de lúpulo aislan los ácidos alfa y beta de lúpulo comercialmente a través de varias técnicas cromatográficas y han desarrollado una técnica para separar las dos fracciones ácidas utilizando dióxido de carbono líquido bajo condiciones supercríticas. Un subproducto de la operación es un producto que contiene ácidos beta de lúpulo y resinas de lúpulo. Las resinas de lúpulo también se abarcan dentro del término "ácidos de lúpulo" como se utiliza aquí. El término "derivados de ácido de lúpulos" como se utiliza aquí significa compuestos que son derivados químicamente de ácidos alfa de lúpulo, ácidos beta de lúpulo o resinas de lúpulo ya sea a través de procesos biosintéticos naturales o procesos sintéticos utilizando la intervención humana. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, hexahidrocolupulona y tetrahidroisohumulona (ver por ejemplo US 5,455,038 (incorporada como referencia).

En una realización adicional el método de la invención comprende la etapa de ajustar el pH de la segunda composición de nisina liquida a un valor de pH deseado tal como un pH entre 1.5 y 6, por ejemplo un pH entre 2 y 3 o un pH entre 5 y 6.

Opcionalmente, se puede agregar por lo menos uno de los compuestos funcionales adicionales mencionados adelante antes, durante o después de por lo menos una de las etapas del método de la invención. Por ejemplo, un crioprotector , por ejemplo glicerol, se puede agregar durante la etapa c, de tal manera que la segunda composición de nisina liquida comprende 35% a 60% p/p de crioprotector. En otro ejemplo, un compuesto que reduce o disminuye la formación de espuma y/o un compuesto antimicrobiano adicional, por ejemplo un ácido orgánico o una sal del mismo, se puede agregar antes de la etapa b. En una realización preferida sin embargo por lo menos un compuesto funcional adicional se agrega después de la etapa d y antes de la etapa de ajuste de pH, o durante o después de la etapa de ajuste de pH.

En una realización la etapa a comprende mezclar la nisina con una solución acuosa para preparar una primera nisina liquida que contiene la composición que tiene una concentración de sal inorgánica final (por ejemplo NaCl) de 1.5 M o menor, preferiblemente 0.05 M a 1.5 M y más preferiblemente 0.1 M a 1.5 M. La primera composición que contiene nisina líquida tiene un pH de aproximadamente 1.5 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3.5 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 3.5 a aproximadamente 9.5, más preferiblemente aproximadamente 4 a aproximadamente 9, todavía más preferiblemente aproximadamente 4.5 a aproximadamente 8.5, aún más preferiblemente aproximadamente 5 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 5.5 a aproximadamente 7.5, y en particular aproximadamente 5.5 a por debajo de 7. Cualquier fuente de nisina se puede suspender y/o disolver en la solución acuosa. La nisina puede estar en la forma de polvo o puede ser una preparación fermentada líquida. En una realización preferida la nisina es un polvo, preferiblemente un polvo seco. Por ejemplo, se pueden utilizar las composiciones en polvo de nisina disponibles comercialmente tales como Delvoplus® y Nisaplin®. La fuente puede comprender todas las variantes de nisina conocidas que incluyen, pero no se limitan a, la nisina A, la nisina Z o una combinación de las mismas. La solución acuosa puede ser una solución de amortiguador, por ejemplo un amortiguador de fosfato tal como NaH2P04 /Na2HP04. Por supuesto también se pueden utilizar otros amortiguadores adecuados. Estos incluyen, pero no se limitan a, amortiguadores de acetato, amortiguadores de lactato, amortiguadores de citrato, glicina/amortiguadores de HCl y cualquier combinación de los mismos.

Los compuestos sólidos se pueden separar/aislar a partir de la primera composición que contiene nisina liquida mediante técnicas de aislamiento' bien conocidas. En una realización preferida la etapa b se desarrolla por medio de centrifugación, filtración o cualquier, combinación de las mismas .

Posteriormente, se puede preparar una segunda composición de nisina liquida por ejemplo al poner en contacto, por ejemplo disolver o mezclar o suspender, los compuestos sólidos aislados con/en una solución, preferiblemente una solución acuosa, que tiene un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3, y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3. En una realización un compuesto funcional adicional mencionado adelante se agrega durante esta etapa. En una realización los ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos se agregan durante esta etapa. Por ejemplo, los compuestos sólidos aislados se pueden disolver en una solución que tiene un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 y que comprende los ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos. Alternativamente, los compuestos sólidos aislados se pueden disolver en una solución que tiene un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5 y luego los ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos se agregan a la composición de nisina obtenida. Después de disolver los compuestos respectivos, el pH debe estar en el rango de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3, y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3. Si este no es el caso, el pH se debe ajusfar de nuevo al rango de pH respectivo.

Luego, se puede purificar la segunda composición de nisina liquida al remover por ejemplo los desechos restantes y/o las proteínas sin nisina o partes de la misma. Esta etapa de purificación se puede desarrollar mediante técnicas de aislamiento bien conocidas. En una realización preferida la etapa d se desarrolla por medio de centrifugación, filtración o cualquier combinación de los mismos. En una realización ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos se agregan antes, durante o, preferiblemente, después de la etapa de purificación.

Opcionalmente, antes de su uso final en un producto alimenticio las composiciones de nisina liquidas de la invención se pueden pasteurizar o esterilizar mediante filtro. Esto puede por ejemplo ser hecho después de la etapa c o d. Preferiblemente, la pasteurización o esterilización ocurre a un pH bajo (por ejemplo pH de menos de 3), con el fin de proteger la nisina de la desnaturalización por calor. Una formulación líquida pre- pasteurizada ofrece ventajas significativas comparadas con el uso de nisina en polvo. La nisina en polvo se debe rehidratar normalmente, estandarizar, y pasteurizar en el usuario final antes se puede agregara los alimentos pre- procesados. Debido al riesgo de contaminación bacteriana, no se pueden agregar polvos no estériles directamente a los alimentos que no experimentan ningún procesamiento adicional para eliminar contaminantes bacterianos. Una composición de nisina líquida pasteurizada o esterilizada por filtro es esencialmente aséptica, de tal manera que se puede agregar directamente a los alimentos pre-procesados (es decir precocidos) (tales como carnes, quesos y salsas listas para comer) sin la necesidad de ninguna etapa de cocción adicional. Esto es una conveniencia para los alimentos procesados, asi como también una forma para asegurar mayor eficacia antimicrobiana. Muchas plantas no tienen la capacidad de controlar efectivamente el pH cuando se rehidrata la nisina. Cuando estas plantas se pasteurizan con calor esta nisina rehidratada a niveles mayores de pH (especialmente > 5), hay pérdida significativa de la actividad antimicrobiana debido a la desnaturalización por calor de la nisina. Las composiciones de nisina liquidas de la invención evitan este problema y reducen los riesgos de estandarización y rehidratación indebida.

El método descrito anteriormente resulta en una composición de nisina liquida que tiene una actividad mucha mayor contra microorganismos, particularmente bacterias gram-positivas, que composiciones de nisina liquida descritas en la técnica anterior. En otras palabras, el método de la presente invención resulta en composiciones de nisina liquida que tienen una concentración inhibidora mínima (MIC) muy inferior contra microorganismos, particularmente bacterias gram-positivas , que las composiciones de nisina líquida descritas en la técnica anterior. Más aún, la presencia de ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos mejora adicionalmente la actividad antimicrobiana de la composición de nisina liquida altamente activa, debido a que la combinación de la nisina y ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos demuestra un efecto sinérgico contra microorganismos, particularmente bacterias gram-positivas .

Por lo tanto, una composición de nisina obtenible mediante un método de acuerdo con la invención es otra parte de la presente invención. La composición de nisina puede ser sólida, pero preferiblemente es una composición liquida.

En una realización las composiciones de nisina de la invención tienen un MIC de 1.0 pg/ml o menor contra por lo menos una bacteria gram-positiva . El MIC se refiere a la concentración mínima de un compuesto o composición necesaria para inhibir el crecimiento del organismo probado. Preferiblemente, el MIC es un promedio de por lo menos tres repeticiones independientes. Las composiciones de la presente invención tienen un MIC de 1.0 pg/ml o menor cuando se prueban el crecimiento de la inhibición de por lo menos una bacteria gram-positiva en el ensayo descrito aquí. En una realización las composiciones de la invención tienen un MIC de 0.5 pg/ml o menor, preferiblemente un MIC de 0.1 pg/ml o menor, más preferiblemente un MIC de 0.05 pg/ml o menor, aún más preferiblemente un MIC de 0.01 pg/ml o menor, todavía aún más preferiblemente un MIC de 0.005 pg/ml o menor, particularmente un MIC de 0.001 yg/ml o menor, más particularmente un MIC de 0.0005 yg/ml o menor contra por lo menos una bacteria gram-positiva y más particularmente un MIC de 0.0001 g/ml o menor contra por lo menos una bacteria gram-positiva. Las bacterias gram- positivas incluyen, pero no se limitan a, Micrococcus sp. , Listeria sp. , Bacíllus sp. , Staphylococcus sp. , Clostridium sp. , Streptococcus sp. , Lactobacillus sp. y Lactococcus sp. En una realización .la bacteria gram- positiva se selecciona del grupo gue consiste de · Bacillus, Lactococcus, Staphylococcus, Listeria y Micrococcus . Las especies adecuadas dentro del género Bacillus , Lactococcus, Staphylococcus, Listeria y Micrococcus incluyen, pero no se limitan a B. subtilis, L. lactis, S. aureus, L. innocua y M. luteus, respectivamente. Dentro de las especies dadas las cepas adecuadas incluyen, pero no se limitan a Bacillus subtilis ATCC 31578, Lactococcus lactis ATCC 19257, Staphylocoocus aureus ATCC 27661, Listeria innocua LMD 92.20 y Micrococcus luteus B212, respectivamente. En una realización preferida las composiciones de la presente invención tienen un MIC de 0.5 g/ml o menor, preferiblemente un MIC de 0.1 g/ml o menor, más preferiblemente un MIC de 0.05 yg/ml o menor, aún más preferiblemente un MIC de 0.01 yg/ml o menor, todavía aún más preferiblemente un MIC de 0.005 yg/ml o menor, particularmente un MIC de 0.001 g/ml o menor y más particularmente un MIC de 0.0005 pg/ml o menor contra por lo menos una cepa de M. luteus, preferiblemente M. luteus B212.

La actividad de nisina se puede medir utilizando los siguientes bio-ensayos bien conocidos por la persona experta (ver Pongtharangkul y Demirci, 2004), que incluyen la composición de nisina pre- tratar a un pH inferior. Brevemente, las placas de agar que contienen el M. luteus B212 (agar Iso-sensitest ) se preparan utilizando un cultivo de crecimiento reciente. Después de secado, se utiliza una bomba de vacio para crear pequeños agujeros en el agar. Las muestras y diluciones de los mismos (10 µ?) se transfieren en los agujeros y se dejan difundir en el agar durante 18 horas a 5o C. Posteriormente, las placas de agar se incuban durante 24 horas a 30° C y se miden las zonas de inhibición alrededor de las muestras que contienen agujeros. Paralelo a las muestras, se incluyen controles con cantidades conocidas de la nisina (0 - 1600 IU/ml) . Sus zonas de inhibición se utilizan para preparar una curva de calibración requerida para determinar los niveles de nisina de las muestras. Se llevan a cabo las etapas de forma aséptica. El IU para la nisina ya se ha definido como sigue. El Comité de la Organización Mundial de la Salud en Estandardización Biológica, Vigésimo segundo informe. El Informe Técnico de la Organización Mundial de la Salud Serie, No. 444 en 1970, ha establecido una preferencia de nisina de referencia internacional, y la unidad internacional (aquí adelante IU) se define como 0.001 mg de esta preparación. El Delvoplus® y el Nisaplin®, nombres de marca para los productos de nisina en polvo que contienen 1 millón IU por gramo, se distribuyen por DSM y Danisco, respectivamente. Mediante los medios del ensayo anterior se puede determinar la concentración de nisina en las. muestras .

Se puede medir el MIC de las composiciones de nisina mediante los medios del siguiente ensayo MIC. La actividad de nisina se mide utilizando el ensayo de caldo de microdilución estándar, bien conocido por la persona experta. Brevemente, un caldo Iso-sensitest que contiene Micrococcus luteus B212 se prepara utilizando un cultivo de crecimiento reciente. El número de células por mi se determina utilizando una cámara de recuento. Preferiblemente, se utiliza un conteo celular de 103. 100 µ? de inoculo se agrega a cada pozo de una placa de microtitulo de 96 pozos. Se agrega 100 µ? de una composición de nisina al primer pozo (Al) y se mezcla apropiadamente al pipetear hacia arriba y hacia abajo tres veces. Se hace una dilución en serie al transferir 100 µ? del primer pozo al siguiente pozo (A2) y se diluye apropiadamente. Esto se repite hasta que cada componente se diluye serialmente en 36 pozos. Luego, se incuban las placas a 30° C durante 7 días y se leen cada día para crecimiento bacteriano. Las concentraciones MIC son las concentraciones más bajas que inhiben completamente el crecimiento. En una realización preferida, el MIC se mide directamente después de la producción de las composiciones antimicrobianas.

En una realización las composiciones de la invención tienen un pH de aproximadamente 0 a aproximadamente 5, preferiblemente aproximadamente 0.5 a aproximadamente 4.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 4, preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3.5, preferiblemente aproximadamente 1 a aproximadamente 3, más preferiblemente aproximadamente 1.5 a aproximadamente 3 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 3. En tales condiciones de pH, la estabilidad microbiológica de las composiciones de la invención es buena y el MIC de las composiciones es bajo y estable durante almacenamiento.

En una realización adicional las composiciones de acuerdo con la invención comprenden 0.01 a 5%, preferiblemente 0.05 a 2.5%, más preferiblemente 0.1 a 1.0%, más preferiblemente 0.15 a 0.5% y en particular 0.2 a 0.3 % (p/p) de nisina.

En una realización adicional las composiciones de acuerdo con la invención comprenden 0.0000001 a 25%, preferiblemente 0.000001 a 15%, preferiblemente 0.000001 a 10%, preferiblemente 0.00001 a 5%, más preferiblemente 0.0005 a 1%, más preferiblemente 0.0002 a 0.9% y en particular 0.001 a 0.5% (p/p) de ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o combinaciones de los mismos.

Las composiciones de nisina de la invención pueden comprender una baja cantidad de sales tales como sales inorgánicas por ejemplo NaCl. Se debe entender que los compuestos funcionales adicionales mencionados adelante (por ejemplo los compuestos antimicrobianos tales como ácidos orgánicos o sus sales) no significa que están incluidos dentro de la definición de "sal". En una realización las composiciones de la invención comprenden una sal, por ejemplo sal inorgánica, a la relación de nisina de 100:1 a 1:100, preferiblemente 50:1 a 1:100, más preferiblemente 25:1 a 1:100 y en particular 10:1 a 1:100. En una realización las composiciones de nisina de la invención son esencialmente libres de sales, preferiblemente sales inorgánicas tales como por ejemplo NaCl. La sal inorgánica puede ser cualquier sal inorgánica adecuada, de grado alimenticio. Ejemplos de sales inorgánicas son NaCl, Na2S04, (Ca)3(P04)2, KN03, KC1 y MgC03. La concentración de estas sales en las composiciones es 100 mg/ml o menor, preferiblemente 50 mg/ml o menor, más preferiblemente 25 mg/ml' o menor y en particular 15 mg/ml o menor. La concentración de sal se puede medir mediante análisis catiónico separado, mediante análisis aniónico de absorción atómica, mediante HPLC o preferiblemente mediante determinación del contenido de cenizas mediante ignición (550+/- 25° C) . Las composiciones de nisina que tienen una baja concentración de sales inorgánicas son muy atractivas, debido a que ellas no interfieren con la matriz de alimento para dar reacciones indeseadas y alteraciones del gusto y/o estructura.

Las composiciones de nisina de la invención pueden comprender bajas cantidades de componentes diferentes de nisina, ácidos de lúpulo y sales. Estos componentes pueden ser proteínas o partes de los mismos. Se debe entender que los compuestos funcionales adicionales mencionados adelante (por ejemplo los compuestos antimicrobianos, agentes antiespumantes , tensoactivos , etc.) no significan que se incluyen dentro la definición de "componentes diferentes de nisina, ácidos de lúpulo y sal". En una realización las composiciones de la invención comprenden una relación de componente de nisina a nisina de 100:1 a 1:100, preferiblemente 10:1 a 1:100 y más preferiblemente 2:1 a 1:100. En una realización las composiciones de nisina de la invención son esencialmente libres de estos componentes. Los componentes se pueden originar a partir de la biomasa producida durante el proceso de fermentación de nisina utilizando Lactococcus lactis. La concentración de nisina primero se puede medir mediante el ensayo descrito anteriormente. Posteriormente, se puede estimar la concentración de proteina total utilizando ensayos clásicos conocidos por la persona experta. Se puede estimar la concentración de proteina sin nisina utilizando ensayos clásicos conocidos por la persona experta. Se puede estimar se puede estimar la concentración de proteina sin nisina al sustraer la concentración de nisina de la concentración de proteina total.

En todavía otra realización las composiciones de la invención son composiciones líquidas claras. Se pueden utilizar las composiciones de nisina líquidas claras sobre y/o en cualquier tipo de producto. En vista de su claridad, se pueden utilizar de forma ventajosa en los productos en donde la claridad es de importancia tales como productos basados en gelatina por ejemplo postre de gelatina, jugos de frutas, bebidas y aplicaciones de superficie sobre productos alimenticios. Las composiciones líquidas claras como se utilizan son composiciones líquidas que tienen una turbidez de 0 a 100 FNU, preferiblemente 0 a 50 FNU, más preferiblemente 0 a 25 FNU y particularmente 0 a 10 FNU. Las composiciones líquidas turbias son composiciones líquidas que tienen una turbidez por encima de 100 FNU . Se puede determinar la turbidez en FNU (Unidad Nefelométrica de Turbidez) con un método de difusión lumínica y se puede medir utilizando un fotómetro de turbidez Nephla con método de medición DIN EN 27027/ISO 7027. Las composiciones de nisina líquida claras así como también turbias se pueden preparar mediante medios del método de acuerdo con la invención. Una composición líquida clara se prepara, si una composición que contiene nisina líquida tiene un pH de aproximadamente 5 o mayor, preferiblemente un pH de aproximadamente 5 a aproximadamente 9, se prepara en la etapa a del método de la invención. Una composición líquida turbia se prepara, si una composición que contiene nisina líquida tiene un pH por debajo de aproximadamente 5, preferiblemente un pH de aproximadamente 1.5 a por debajo de aproximadamente 5, o un pH por debajo de aproximadamente 9, preferiblemente un pH por debajo de aproximadamente 9 a aproximadamente 12 se prepara en la etapa a del método de la invención. Tanto las composiciones de nisina líquida claras como las turbias tienen alta actividad anteriormente descrita contra microorganismos, en particular bacterias gram-positivas .

Un método en donde la concentración de sal inorgánica final (por ejemplo NaCl) de la primera composición que contiene nisina líquida (es decir la composición de nisina líquida preparada en la etapa a del método de acuerdo con la invención, ver arriba) que esté por encima de 1.5 M tiene varias desventajas en comparación con un método en donde la concentración de sal inorgánica final de la primera composición que contiene nisina líquida es 1.5 M o por debajo. En primer lugar, la primera composición de nisina líquida que tiene una concentración de sal inorgánica final por encima de 1.5 M muestra un desempeño de separación reducido en centrifugación (es decir tiene bajo índice de sedimentación) en comparación con composiciones de nisina líquida con una concentración de sal inorgánica final de 1.5 M o por debajo. En segundo lugar, la composición de nisina líquida final resultante que se prepara al desarrollar el método de acuerdo con la presente invención (es decir etapas a a c y opcionalmente etapa d y la etapa de ajuste de pH, ver arriba) en donde la primera composición que contiene nisina líquida que tiene una concentración de sal inorgánica final por encima de 1.5 tiene varias desventajas: Es turbia; - Esta tiene una pureza inferior a aquella de las composiciones de nisina líquida finales que se han hecho por medio de un método de acuerdo con la presente invención en donde la primera composición que contiene nisina líquida contiene una concentración de sal inorgánica final de 1.5 o por debajo; Esta tiene una actividad microbiana inferior a aquella de las composiciones de nisina liquida finales que se han hecho por medio de un método de acuerdo con la presente invención en donde la primera composición que contiene nisina liquida contiene una concentración de sal inorgánica final de 1.5 M o por debajo; y Esta tiene un mayor riesgo de precipitar que aquellas de las composiciones de nisina liquida finales que se han hecho por medio de un método de acuerdo con la presente invención en donde la primera composición que contiene nisina liquida contiene una concentración de sal inorgánica final de 1.5 M o por debajo Las composiciones de nisina liquidas de la invención tienen por lo menos una de las ventajas enumeradas adelante comparadas con las preparaciones de nisina liquida conocidas en la técnica anterior: las composiciones de la invención tienen una mejor eficacia antimicrobiana comparada con las composiciones de nisina liquida de la técnica anterior, y/o las composiciones de la invención son esencialmente libres de sales tales como por ejemplo sales inorgánicas por ejemplo NaCl y esencialmente libres de otros componentes sin nisina. Como un resultado de las mismas, en aplicaciones para alimento, se evita el uso de las composiciones de la invención que no interfieren con la matriz de alimento para dar reacciones y alteraciones no deseadas del gusto y/o estructura, y/o ~ las composiciones de la invención pueden ser claras, es decir tienen una baja turbidez (entre 0 y 100 FNU) . Tales composiciones no interfieren con el color y/o claridad de los productos a los que ellas se aplican.

De acuerdo con otra realización, las composiciones de la invención comprenden adicionalmente por lo menos un compuesto funcional adicional que incluye, pero no se limita a, un compuesto antimicrobiano adicional tal como un ácido por ejemplo ácido sórbico, ácido propiónico, ácido benzoico, ácido acético, ácido acético, ácido cítrico, ácido cinámico, o una sal de cualquiera de estos ácidos, una glucosa oxidasa, natamicina, lisozima, poli-L lisina, nistatina, lucensomicina , anfotericina B, filipina, pediocina, un ácido graso o ésteres de los mismos, especialmente un ácido caproico o caprílico y sus ésteres (tales como monocaprina) o un ácido laúrico y sus ésteres (tales como arginatos de monolaurina o laúrico) ; un tensoactivo por ejemplo SDS, Tween, ácidos grasos; un agente de ajuste de pH tal como HCl o NaOH o un agente amortiguador por ejemplo una sal de fosfato o sal de acetato; un crioprotector tal como glicerol o propandiol; un agente de espesamiento por ejemplo goma xantano, goma guar, goma Arábiga, goma tragacanto, goma gelano, goma garrofin, goma carragenina, goma ramxano, alginato, almidón, carboximetil celulosa, carboxietil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxipropil celulosa, metil celulosa, polivinil alcohol, polietilenglicol, polipropilenglicol . A pHs por debajo de 7, los ácidos de lúpulo, y en particular ácidos beta de lúpulo, cada vez son menos y menos solubles (debido a sus altos pKa) . Esto significa que las composiciones que tienen un pH de menos de aproximadamente pH 5 requieren algunos medios para mantener los ácidos de lúpulo a partir de la precipitación durante el manejo y el almacenamiento. Una vez se precipitan los ácidos de lúpulo en un ambiente de bajo pH, ellos forman grandes cristales que pueden ser muy difíciles . de rehidratar aún si se eleva el pH. Así, los ácidos de lúpulo pueden perder su actividad antimicrobiana, si se transporta en una solución a bajo pH. En una realización preferida las composiciones de la invención por lo tanto comprenden un agente de espesamiento. La presencia de un agente de espesamiento tiene el efecto de suspender ácidos de lúpulo en las composiciones y prevenir la formación de precipitados cristalinos insolubles. Cuando las composiciones de la invención se agregan a una composición alimenticia, típicamente los alimentos con pH por encima de 5.0, los ácidos de lúpulo suspendidos luego se pueden resolubilizar rápidamente y expresar su sinergia antimicrobiana con nisina. Más aún, las composiciones de la invención pueden comprender agentes que reducen o disminuyen la formación de espuma. Se pueden agregar los compuestos adicionales a las composiciones de la invención en forma sólida o líquida y se pueden mezclar con suficiente antelación o directamente antes de uso. Utilizando por lo menos un compuesto antimicrobiano adicional/conservador en las composiciones de nisina de la invención se espera que se estabilice adicionalmente y microbiológicamente y por lo tanto puede ser benéfico para su vida útil.

La actividad de la nisina presente en una composición líquida acuosa se puede incrementar sustancialmente al remover las impurezas. Más aún, el índice de solubilización de la nisina en composiciones acuosas se incrementa mediante la remoción de las impurezas tales como por ejemplo sales inorgánicas. La nisina puede estar en parte unida a las impurezas que resultan en la que no está disponible para su actividad conservador. En otras palabras, la nisina tiene una biodisponibilidad limitada en la presencia de impurezas. Como se utiliza, el término "biodisponibilidad" se refiere a la disponibilidad, cantidad (por ejemplo, concentración), o actividad de la nisina en una formulación liquida, semi-sólida o sólida. Las impurezas tales como las proteínas sin nisina u otros componentes sin nisina, residuos de pared celular y las sales pueden tener un efecto negativo sobre el índice de solubilización de nisina. Aproximadamente, se encuentra que menos del 50% de la nisina presente en la formulación líquida está disponible como un conservador en caso de que estas impurezas estén presentes. Se ha encontrado que las impurezas están presentes en los productos de nisina disponibles comercialmente . La nisina disponible comercialmente contiene en general 5-25% en la proteína sin nisina y residuos celulares. Estas impurezas se originan a partir del proceso de producción de la nisina. En la recuperación, purificación o reformulación luego de la fermentación se utilizan sales a menudo que aún están presentes en la formulación de nisina final.

En un aspecto adicional la invención se relaciona con una suspensión acuosa de la nisina que comprende un agente de espesamiento. La composición también debe incluir por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo. Por supuesto, también se puede utilizar dos o más agentes de espesamiento diferentes. Adicionalmente, la suspensión también puede comprender cualquier combinación de ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo. Los términos ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo tienen el significado como se definió anteriormente. Las suspensiones de la invención comprenden 0.01 a 5%, preferiblemente 0.05 a 2.5%, más preferiblemente 0.1 a 1%, más preferiblemente 0.15 a 0.5% y en particular 0.2 a 0.3% (p/p) de nisina. Las suspensiones de la invención comprenden 0.0000001 a 25%, preferiblemente 0.000001 a 15%, preferiblemente 0.000001 a 10%, preferiblemente 0.00001 a 5%, más preferiblemente 0.0005 a 1%, más preferiblemente 0.0002 a 0.9% y en particular 0.001 a 0.5% (p/p) de ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o combinaciones de los mismos. Las suspensiones de la invención comprenden 0.01 a 5%, preferiblemente 0.05 a 5%, preferiblemente 0.1 a 5%, más preferiblemente 0.2 a 5%, aún más preferiblemente 0.3 a 5%, más preferiblemente 0.4 a 5%, y en particular 0.5 a 5% (p/p) de agente de espesamiento. El agente de espesamiento se selecciona del grupo que consiste de goma xantano, goma guar, goma Arábiga, goma tragacanto, goma gelano, goma garrotín, goma carragenina, goma ramxano, alginato, almidón, carboximetil celulosa, carboxietil celulosa, hidroxipropilmetil celulosa, hidroxipropil celulosa, metil celulosa, polivinil alcohol, polietilenglicol y polipropilenglicol . En una realización preferida el agente de espesamiento es una goma tal como goma xantano. El pH de la suspensión de acuerdo con la invención es de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 11, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 10, aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 9, todavía aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 7 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 6. La suspensión de la invención es estable. La "suspensión estable" como se utiliza aquí significa una suspensión estable físicamente, es decir una suspensión que muestra 50% o menos, preferiblemente 40% o menos, más preferiblemente 30% o menos, aún más preferiblemente 20% o menos, más preferiblemente 10% o , menos y en particular 0% de sedimentación después de almacenamiento a temperatura ambiente durante 9 días a pH 5. Se puede medir la estabilidad física de las suspensiones mediante métodos conocidos en la técnica tal como el ensayo de sedimentación como se muestra aquí (ver Ejemplo 5) .

En una realización la suspensión de acuerdo con la invención comprende adicionalmente por lo menos un compuesto funcional adicional seleccionado del grupo que consiste de un compuesto antimicrobiano adicional, un tensoactivo, un agente de ajuste de pH, y un crioprotector . Ejemplos de compuestos antimicrobianos adicionales adecuados son ácidos tales como ácido sórbico, ácido propiónico, ácido benzoico, ácido acético, ácido acético, ácido cítrico, ácido cinámico, o sales de cualquiera de estos ácidos, una glucosa oxidasa, natamicina, lisozima, poli-L lisina, nistatina, lucensomicina, anfotericina B, filipina, pediocina, un ácido graso o ésteres de los mismos, especialmente un ácido caproico o caprílico y sus ésteres (tales como monocaprina) o un ácido laúrico y sus ésteres (tales como monolaurina o arginatos laúricos) . Ejemplos de tensoactivos adecuados son SDS, Tween, ácidos grasos, por nombrar solo unos pocos. Los ejemplos de agentes de ajuste de pH adecuados son entre otros HC1 o NaOH o agentes amortiguadores tales como sales de fosfato y sales de acetato. Ejemplos de crioprotectores adecuados son glicerol y propandiol. Más aún, las suspensiones de la invención pueden comprender agentes que reducen o disminuyen la formación de espuma. Se pueden agregar los compuestos adicionales a las suspensiones de la invención en forma sólida o líquida y se pueden mezclar con suficiente antelación o directamente antes de uso.

En una realización adicional la invención se relaciona con un método para preparar una suspensión de acuerdo con la invención, el método comprende las etapas de: a) agregar nisina, un agente de espesamiento y por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo, ya sea en forma separada o como una composición en polvo, a una solución acuosa (por. ejemplo agua), ¦ y b) mezclar para obtener una suspensión. Si es necesario, se puede ajustar el pH de la suspensión a un pH de aproximadamente 2 a aproximadamente 12, preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 11, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 10, aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 9, todavía aún más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 8, más preferiblemente aproximadamente 2 a aproximadamente 7 y en particular aproximadamente 2 a aproximadamente 6. Opcionalmente, antes de su uso final en un producto alimenticio se pueden pasteurizar las suspensiones de la invención y esterilizar por filtro. Esto se puede hacer por ejemplo directamente después de la etapa de 'mezcla. Preferiblemente, la pasteurización o esterilización ocurre a un bajo pH (por ejemplo pH de menos de 3), con el fin de proteger la nisina de la desnaturalización por calor. Una suspensión pre- pasteurizada ofrece ventajas .significativas comparada con el uso de nisina en polvo. La nisina en polvo normalmente se debe rehidratar, estandarizar, y pasteurizar en el usuario final antes de ser agregados a los alimentos pre-procesados . Debido a los riesgos de contaminación bacteriana, no se pueden agregar polvos no estériles directamente a los alimentos que no están experimentando ningún procesamiento adicional para eliminar los contaminantes bacterianos. Una suspensión de nisina pasteurizada o esterilizada por filtro es esencialmente aséptica, de tal manera que se puede agregar directamente a los alimentos pre- procesados (es decir pre- cocinados) (tales como carnes, quesos, o salsas listos para comer) sin la necesidad de ninguna etapa de cocción adicional. Esto es una conveniencia para el procesador de alimentos, así como también una forma para asegurar mayor eficacia antimicrobiana. Muchas plantas no tienen la capacidad de controlar efectivamente el pH cuando se rehidrata la nisina. Cuando estas plantas se pasteurizan con calor esta nisina rehidratada a niveles de pH mayores (especialmente > 5) , tiene pérdida significativa de actividad antimicrobiana debido a la desnaturalización por calor de la nisina. Las suspensiones de nisina de la invención evitan este problema y reducenlos riesgos de estandarización y rehidratación inadecuada.

La nisina, ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo, y agente de espesamiento se puede agregar de forma separada a la solución acuosa. Pueden estar en forma de polvo o en forma líquida (por ejemplo la nisina se puede agregar como una preparación fermentada liquida) . Alternativamente, puede estar presente la nisina, ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo, y el agente de espesamiento en una composición en polvo y esta composición en polvo se puede agregar a la solución acuosa. De tal manera que, en una realización adicional la invención se relaciona con una composición en polvo que comprende nisina, por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo, y un agente de espesamiento. La nisina y/o ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo y/o el agente de espesamiento se pueden agregar junto con un compuesto funcional adicional descrito anteriormente para la solución acuosa y luego se mezcla para obtener una suspensión. Alternativamente, los compuestos funcionales adicionales se pueden agregar después de que se ha obtenido la suspensión que comprende nisina, ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo, y agente de espesamiento. En una realización adicional la nisina se agrega primero a la solución acuosa, seguida por un compuesto funcional adicional y después de eso se agregan el agente de espesamiento y ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo y se mezcla la solución para obtener una suspensión. En todavía una realización adicional un agente de espesamiento se agrega primero a la solución acuosa, seguida por un compuesto funcional adicional y después se agregan la nisina y ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo y se mezcla la solución para obtener una suspensión. De nuevo en una realización adicional se agrega primero el compuesto funcional adicional a la solución acuosa, seguida por adición de ácidos de lúpulo y/o derivados de ácido de lúpulo, un agente de espesamiento y/o nisina. Cada orden de adición de los compuestos importantes es parte de la presente invención.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de una suspensión acuosa de acuerdo con la invención para - la preparación de un líquido de tratamiento para tratamiento de un alimento, comida o producto agrícola. El líquido de tratamiento se puede preparar al mezclar una solución acuosa con la suspensión de acuerdo con la invención. Se puede hacer el tratamiento del alimento, comida o producto agrícola mediante pulverización, sumergimiento, inmersión, cepillado por nombrar solo unos pocos.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona el uso de una composición o suspensión de acuerdo con la invención como un conservador en y/o sobre alimento, comida o productos agrícolas. En lo sucesivo, el término "suspensión" también incluye un líquido de tratamiento preparado a partir de una suspensión de acuerdo con la invención. Las composiciones y suspensiones de la invención no tienen desventajas asociadas con formulaciones en polvo: son más fáciles de utilizar (facilidad de dosificación) y no hay formación de polvo cuando se utilizan. Adicionalmente, se evita la formación de espuma y los problemas de disolución que ocurren cuando se solubiliza el polvo de nisina en un disolvente. Los niveles efectivos de la nisina para conservar productos alimenticios varían de 1 a 1500 IU/g o 0.025 a 37.5 ppm de nisina. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención se pueden utilizar solas, pero también en combinación con otras composiciones antimicrobianas, por ejemplo composiciones que comprenden ácidos orgánicos o sales de los mismos, lisozima. Se pueden aplicar las composiciones antimicrobianas al alimento, comida o productos agrícolas antes, durante o después de aplicación de las composiciones o suspensiones de acuerdo con la invención.

En un aspecto adicional la invención se refiere a un contenedor que comprende 1 a 1000 litros de una composición o suspensión de acuerdo con la invención. El contenedor puede ser una botella, bolsa o tanque, por nombrar solo unos pocos.

De acuerdo con un aspecto adicional, la invención proporciona un método para la conservación de alimentos, comida o productos agrícolas, en donde se utilizan las composiciones de nisina o suspensiones de la invención, por ejemplo aplicada en y/o sobre los productos respectivos. Las composiciones de nisina y suspensiones se pueden aplicar mediante pulverización, inmersión, sumergimiento, pulido, por nombrar solo unos pocos métodos. En el caso de que el sustrato/producto sea un liquido o semi- liquido, se puede agregar directamente. Las composiciones o suspensiones pueden aún dejar un recubrimiento, por ejemplo un recubrimiento antimicrobiano, sobre el sustrato se aplican a/sobre. Opcionalmente, en una etapa adicional, el producto se puede pasteurizar/esterilizar . Esta etapa por supuesto también se puede desarrollar antes de aplicación de las composiciones de nisina o suspensiones de la invención. Todos los tipos de productos alimenticios se pueden tratar con las composiciones o suspensiones de la invención. Los productos alimenticios pueden ser productos alimenticios lácteos; productos alimenticios que contienen o derivados de huevos (por ejemplo huevo liquido), carnes, especialmente aves de corral por ejemplo aves de corral recientemente sacrificadas, vegetales, crustáceos y pescados; productos de arroz tales como productos de arroz hervido; productos alimenticios de panadería; bebidas; productos alimenticios congelados; productos alimenticios claros tales como productos basados en gelatina alimenticios tales como postre de gelatinas; jugos; pastas; mermelada; fruta enlatada y otros productos enlatados; productos alimenticios en donde las composiciones o suspensiones de la invención se aplican a o sobre la superficie. Los productos alimenticios lácteos incluyen, pero no se limitan a, queso fundido, leche, crema espesa, postres lácteos, mezclas para helado, salsas y yogures. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención también se pueden utilizar en el tratamiento de alimento empacado y equipo de manejo y se pueden incluir en/sobre materiales de empaque utilizados para el empaque de alimento, comida o productos agrícolas. Las composiciones y suspensiones de la invención también se pueden utilizar como un desinfectante para superficies limpias y utensilios de cocina en plantas de procesamiento de alimento y cualquier área en la" que se prepara o se sirve los alimentos tales como hospitales, hogares geriátricos, restaurantes, especialmente restaurantes de comida rápida, delicatessen y similares. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención son capaces de inhibir el crecimiento bacteriano en productos durante un periodo extendido de tiempo, por ejemplo por lo menos aproximadamente 1 día, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 días y preferiblemente por lo menos aproximadamente 1000 días. Las composiciones y suspensiones de acuerdo con la invención se pueden utilizar para evitar el crecimiento bacteriano, por ejemplo el crecimiento de Bacterias gram- positivas tales como Staphylococcus , Streptococcus, Listeria , Bacillus , Clostrídium y Coryneform bacteria. Estos aún se pueden utilizar para prevenir el crecimiento de Bacterias gram-negativas tales como bacterias Gram negativas tales como bacterias Salmonella , Shigella , Escherichia Coli, Klebsiella , Pseudomonas, Bacterioides, y Actinobacillus.

Por lo tanto, un alimento, comida o producto agrícola que comprende una composición de nisina o suspensión de acuerdo con la invención es otra parte de la invención.

En todavía otro aspecto, la invención se refiere a un •método para producir un sólido, por ejemplo polvo, la composición de nisina comprende la etapa de someter la composición de nisina líquida de acuerdo con la invención a por ejemplo una etapa de secado, etapa de liofilización, etapa de cristalización (seguido si es necesario mediante filtración o centrifugación) o una etapa de precipitación (seguido si es necesario mediante filtración o centrifugación), por nombrar solo unas pocas. Las etapas se pueden desarrollar inmediatamente después de la etapa c, d o la etapa de ajuste de pH del método para preparar las composiciones de nisina de la invención como se describió anteriormente. Ellos también se pueden preparar después de que se han almacenado las composiciones de nisina líquidas de la invención durante un periodo de tiempo. Las composiciones de nisina sólidas/en polvo resultantes se pueden mezclar con composiciones en polvo que comprenden otros compuestos adecuados tales como por ejemplo los compuestos funcionales adicionales descritos anteriormente.

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no se deben interpretar como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Preparación de composiciones de nisina liquida Se preparan las siguientes composiciones de nisina liquida : Composición A: Siete gramos del polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelven en 63.1 gramos de una solución de HC1 acuosa (pH 2.0-3.0). Posteriormente, se agregan 28.5 gramos de glicerol y 1.4 gramos de ácidos beta de lúpulos (40% p/v; Steiner, USA) . La composición final tiene un pH de 3.0-4.5 y la masa total de la composición es 100 gramos. La concentración de sal inorgánica final de la composición es aproximadamente 3.5% p/p. La concentración final de nisina es 0.175% p/p, mientras que la concentración de ácido de lúpulos final es 0.56% p/p.

Composición B: Siete gramos del polvo de nisina Nisaplin® (Danisco,' Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelven en 63.1 gramos de una solución de HC1 acuosa (pH 5.5-6.5). Posteriormente, se agregan 28.5 gramos de glicerol y 1.4 gramos de ácidos beta de lúpulos (40% p/v; Steiner, USA) . La composición final tiene un pH de 3.0-4.5 y la masa total de la composición es de 100, gramos. La concentración de sal inorgánica final de la composición es aproximadamente 3.5% p/p. La concentración final de nisina es 0.175% p/p, mientras que la concentración de ácido de lúpulos final es 0.56% p/p.

Composiciones C y D: Diez gramos del polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl sé disuelven en una solución acuosa amortiguada de dihidrógeno fosfato de sodio 0.2 M y hidrógeno fosfato de disodio (pH aproximadamente 6; volumen total 100 mi) . La mezcla se combina posteriormente durante aproximadamente 15 minutos. La mezcla se centrifuga a 4,500xg durante 15 minutos a 10° C y se obtiene un sedimento que contiene nisina. Posteriormente, el sedimento se disuelve en una solución de ácido cítrico acuosa (pH 2.0 a 3.0; volumen total 100 mi). La mezcla se agita durante 15 minutos. La solución obtenida que contiene la nisina se centrifuga a 4,500xg durante 15 minutos a 10° C para remover los componentes sólidos restantes y para obtener una composición de nisina liquida. El pH de la composición de nisina liquida es 2.0 a 3.5 (Composición C) o el pH se ajusta a un pH de 5.0 y 6.5 mediante adición de NaOH (Composición D) . Posteriormente, se agregan a 70.1 gramos de composición C o composición D 28.5 gramos de glicerol y 1.4 gramos de ácidos beta de lúpulos (40% p/v; Steiner, USA) . La masa total de la composición es de 100 gramos. La concentración de sal inorgánica final de la composición es aproximadamente 3.5% p/p. La concentración final de nisina es 0.175% p/p, mientras que la concentración de ácido de lúpulos final es 0.56% p/p.

Composiciones E y F: La preparación de composiciones E y F es idéntica a la preparación de composiciones C y D con la condición que el sedimento se disuelve en una solución de HC1 acuosa que tiene un pH de 2.0 a 3.0. El pH de la composición de nisina liquida es 2.0 a 3.5 (Composición E) o el pH se ajusta a un pH de 5.0 y 6.5 mediante adición de NaOH (Composición F) . Posteriormente, se agregan a 70.1 gramos de composición E o composición F 28.5 gramos de glicerol y 1.4 gramos de ácidos beta de lúpulos (40% p/v; Steiner, USA) . La masa total de la composición es de 100 gramos. La concentración de sal inorgánica final de la composición es aproximadamente 3.5% p/p. La concentración final de nisina es 0.175% p/p, mientras que la concentración de ácido de lúpulos final es 0.56% p/p.

Composiciones G y H: Diez gramos del polvo de nisina Nisaplin® (Danisco, Dinamarca) que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl se disuelven en una solución de HC1 acuosa (pH 2.0-3.0; volumen total 100 mi). La mezcla obtenida se dializa durante 24 horas en una solución de HC1 acuosa de pH 2.0 a 3.0. Luego, la mezcla dializada se centrifuga a 4,500xg durante 15 minutos a 10° C para obtener una composición de nisina liquida. Posteriormente, se agregan 28.5 gramos de glicerol y 1.4 gramos de ácidos beta de lúpulos (40% p/v; Steiner, USA) a 70.1 gramos de la composición de nisina liquida obtenida. El pH se ajusta a un pH de 2.0 a 3.5 mediante adición de HC1 (Composición G) o el pH se ajusta a un pH de 5.0 y 6.5 debido a la adición de los ácidos beta de lúpulos (Composición H) . La composición es sustancialmente libre de sales inorgánicas. La concentración final de nisina es 0.175% p/p, mientras que la concentración de ácido de lúpulos final es 0.56% p/p.

Se utilizan las composiciones obtenidas en los siguientes experimentos .

Ejemplo 2 Ensayo MIC Para el ensayo MIC se obtienen células de Micrococcus luteus (B212) cultivadas recientemente a partir de un crecimiento de cultivo durante la noche en Caldo Iso Sensitest (Oxoid) a 30° C. Se prepara una suspensión madre de 6.6 x 105 unidades que forman colonia (CFU) /mi en salina fisiológica. Se agrega 30 µ? de la solución madre respectiva a 30 mi de Caldo Iso Sensitest (suspensión A) . Luego, se transfieren 100 µ? de suspensión A a cada pozo de una primer microplaca de 96 pozos. Se preparan las composiciones de nisina de acuerdo con el Ejemplo 1. Se utiliza 100 µ? de una composición de nisina en un ensayo de caldo de micro dilución estándar para determinar la Concentración de Inhibición Mínima (MIC) de cada composición de nisina. En un experimento separado las concentraciones MIC de las composiciones A y C se comparan con Staphylococcus aureus cultivados recientemente (ATCC 27661) . El experimento se hace de forma idéntica al experimento descrito anteriormente, con la condición que la suspensión madre preparada contiene 1.3 x 107 CFU/ml.

Los resultados, presentados en la Tabla 1, muestran que las composiciones C, D, E y F muestran mayor actividad (es decir MIC inferior) contra M. luteus a un pH de 2.0 a 3.5 a un pH de 5.0 y 6.5 que las composiciones A, B y H. El MIC de las composiciones C y E está entre aproximadamente 8- a aproximadamente 250-veces más bajo que el MIC de las composiciones A (todas las composiciones con un pH de 2.0 a 3.5), mientras que el MIC de las composiciones D y F es de aproximadamente 15- a aproximadamente 500-veces más bajo que el MIC de las composiciones B y H.

En un experimento separado las concentraciones MIC de las composiciones A y C se comparan con Staphylococcus aureus cultivados recientemente (ATCC 27661) . El experimento se hace de forma idéntica al experimento descrito anteriormente, con la condición que la suspensión madre preparada contiene 1.3 x 107 CFU/ml. Los resultados muestran que el MIC de la composición C para el microorganismo gram- positivo probado es de aproximadamente 2-veces más bajo que el MIC de la composición A (ver Tabla 2).

Ejemplo 3 Uso de las composiciones de nisina liquida en una aplicación de bebida En este experimento se prueban la composición A y C para su capacidad de reducir el conteo viable de diferentes microorganismos contaminantes en una aplicación de bebida. Se preparan las composiciones A y C de acuerdo con el Ejemplo 1. La bebida utilizada es una bebida de malta, Pony de Bavaria, Colombia. Para el experimento células de Listeria monocytogenes cultivadas recientemente (LM35b) y células de Leuconostoc mesenteroides aisladas de un producto contaminado se obtienen de un crecimiento de cultivo durante la noche a 30° C en Caldo de Conteo de Placa (Difco) . Las suspensiones madre de 6.1x105 y 7.1x105 CFU/ml, respectivamente, se preparan en salina fisiológica. Se agregan 100 µ? de las soluciones madre respectivas a 10 mi de bebida añadida con la composición A o C. La concentración de nisina probada es 0.5 ppm para células de Listeria monocytogenes a 10° C y 25° C y 4 ppm o 8 ppm para células de Leuconostoc mesenteroides a 10° C y 25° C, respectivamente. Se incluye un control que no comprende nisina para cada microorganismo. Se incuban las muestras a 10° C o 25° C y se mide el conteo total de microorganismos (en CFU/ml) en diferentes intervalos de tiempo utilizando métodos bien conocidos.

Se muestran los resultados en las Tablas 3, 4 y 5. Ellos demuestran claramente que el conteo viable de ambos microorganismos probados se reduce más mediante la composición C que mediante la composición A. Los resultados también demuestran que la composición C puede reducir más rápido el conteo viable total por debajo del limite de detección (es decir 10 CFU/ml) que la composición A.

Ejemplo 4 Uso de las composiciones de nisina liquida en un modelo de aplicación de alimento En este experimento se prueban las composiciones A y C para su capacidad de reducir el conteo viable de Listeria monocytogenes en un modelo de aplicación de alimento. Se preparan las composiciones A y C de acuerdo con el .Ejemplo 1. El modelo de aplicación es leche UHT semidesnatada obtenida de Friesche Vlag. Para el experimento las células de Listeria monocytogenes cultivadas recientemente (LM35b) se obtienen de un crecimiento de cultivo durante la noche en Caldo de Conteo de Placa (Difco) a 30° C. Una suspensión madre de 6.1x107 CFU/ml se prepara en salina fisiológica. Se agregan 100 µ? de la solución madre a 10 mi de la leche añadida con la composición A o C. Las concentraciones de nisina probadas son 6.25 y 12.5 yg/ml. Se incluye un control que no comprende nisina. Se incuban las muestras a 10° C y se mide el conteo total de microorganismos (en CFU/ml) en diferentes intervalos de tiempo utilizando métodos bien conocidos.

Los resultados (ver Tabla 6) demuestran claramente que la composición C da una mayor inhibición de crecimiento de Listeria monocytogenes en un modelo de aplicación de alimento a 10° C que la composición A.

Ejemplo 5 Preparación de suspensiones de nicina/ácidos de lúpulo Se preparan suspensiones acuosas que comprenden 7% p/p de polvo denisina (Silver Elephant, China, que contiene 2.5% p/p de nisina y por lo menos 50% p/p de NaCl), 28.5% p/p de glicerol, 1.4% p/p de ácidos beta de lúpulos (40% p/v; Steiner, USA) y 63% p/p de agua. Se agregan a estas suspensiones varios agentes de espesamiento en varias cantidades. Se establece el pH a pH 2 o pH 5 con soluciones de HC1 y NaOH. Se analiza la estabilidad física de las suspensiones después de almacenamiento durante 9 días a temperatura ambiente mediante análisis de la altura del frente de sedimentación en un tubo de 50 mi que contiene 47.5 mi de las suspensiones. Se preparan como un control suspensiones sin agente de espesamiento.

Los resultados se representan en la Tabla 7. La concentración de nisina en todas las suspensiones es 0.175% p/p. La concentración de ácido de lúpulos en todas las suspensiones es 0.56% p/p. Se expresa la sedimentación como el porcentaje de capa de separación que se observa. 0% indica que no ha ocurrido sedimentación y que la suspensión por lo tanto tiene una buena estabilidad física. Los resultados muestran que a pH 2 las suspensiones son físicamente estables cuando se utiliza goma xantano en una concentración de por lo menos 0.1% (p/p), mientras que a pH 5 las suspensiones son físicamente estables cuando se utiliza goma xantano en una concentración de por lo menos 0.2% (p/p). Los resultados muestran adicionalmente que a pH 2 y pH 5 las suspensiones no son físicamente estables cuando se utilizan CMC, alginato o HPMC.

Tabla 1: Valores MIC de composiciones de nisina/ácido de lúpulos en pg/ml contra M. luteus. 5 !0 ND no determinado Tabla 2: Valores MIC de composiciones de nisina/ácido de lúpulos en g/ml contra S. aureus. 15 Tabla 3: Reducción Log de conteo viable de L. mesenteroides después de 2 horas incubación a 10° C en una bebida.

Tabla 4: Reducción Log de conteo viable de L. mesenteroides y L. monocytogenes después de 2 horas incubación a 25° C en una bebida.

Tabla 5: días hasta que se reduce la L. monocytogenes hasta por debajo del limite de detección de 10 CFU/ml en una bebida a 10° C.

Tabla 6: Reducción Log de conteo viable de L. monocytogenes después de 24 horas incubación a 10° C en leche.

Tabla 7: Estabilidad física de composiciones de nisina/ácido de lúpulos con agentes de espesamiento diferentes.

REFERENCIAS Montville TJ, Chung HJ, Chikindas ML and Chen Y (1999), Nisin A depletes intracellular ATP and acts in bactericidal manner against Mycobacterium smegmatis . Letters in Appl. Microbiol. 28:189-193.

Mota-Meira M, LaPointe G, . Lacroix C and Lavoie MC (2000), MICs of Mutacin B-NY266, Nisin A, Vancomycin, and Oxacillin against bacterial pathogens. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44:24-29.

Pongtharangkul T and Demirci A (2004) . Evaluation of agar diffusion bioassay for nisin quantification, Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:268 -272.

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCION Habiendo descrito el presente invento, se considera como una novedad y, por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes. REIVINDICACIONES

1. Un método para preparar una composición de nisina liquida, que comprende las etapas de: a) Mezclar la nisna en polvo con una solución acuosa para preparar una primera nisina liquida que contiene una composición que tiene un pH de 3.5 a 12 y una concentración de sal inorgánica final de 1.5 M o por debajo, b) aislar los compuestos sólidos de la primera composición que contiene nisina liquida preparada mediante centrifugación, filtración o cualquier combinación de los mismos, c) poner en contacto los compuestos sólidos aislados con una solución que tiene un pH de aproximadamente 1 a aproximadamente 3 para preparar una segunda composición de nisina liquida, d) opcionalmente, remover los compuestos sólidos de la segunda composición de nisina liquida, caracterizado porque el método comprende adicionalmente la etapa de agregar por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende adicionalmente la etapa de ajustar el pH de la segunda composición de nisina liquida a un valor deseado.

3. Una composición de nisina liquida, caracterizada porque es obtenible mediante el método de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2.

4. La composición de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada porque tiene una concentración inhibidora mínima (MIC) de 0.05 yg/ml o menor contra Micrococcus luteus B212.

5. La composición de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, caracterizada porque tiene un pH de 1.5 a 5.

6. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, caracterizada porque la composición comprende una relación de sal a nisina de 100:1 a 1:100.

7. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, caracterizada porque comprende ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos en una cantidad de 0.00001 a 5% (p/p) .

8. La composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7> caracterizada porque comprende adicionalmente por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto antimicrobiano adicional, un tensoactivo, un agente de ajuste de pH, un crioprotector, un agente de anti- espumante y un agente de espesamiento.

9. La composición de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizada porque el compuesto es una sal de ácido sórbico .

10. Una suspensión acuosa que tiene un pH de 2 a 12 y que comprende nisina, una goma, y por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo.

11. La suspensión de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizada porque comprende 0.01 a 5% (p/p) de nisina y 0.05 a 5% (p/p) de goma y 0.0000001 a 25% (p/p) de ácidos de lúpulo, derivados de ácido de lúpulo o una combinación de los mismos .

12. La suspensión de acuerdo con la reivindicación 10 u 11, caracterizada porque la goma es goma xantano.

13. La suspensión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizada porque comprende adicionalmente por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de un compuesto antimicrobiano adicional, un tensoactivo, un agente de ajuste de pH, un agente de anti-espumante y un crioprotector.

14. Un método para preparar una suspensión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, caracterizado porque comprende las etapas de: a) agregar nisina, una goma y por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo, ya sea en forma separada o como una composición en polvo, a una solución acuosa, b) mezclar para obtener una suspensión, y c) si es necesario, ajustar el pH de la suspensión a 2 a 12.

15. Una composición en polvo para uso en un método de acuerdo con la reivindicación 14 que comprende nisina, una goma, y por lo menos un compuesto seleccionado del grupo que consiste de ácidos de lúpulo y derivados de ácido de lúpulo.

16. Uso de una suspensión acuosa como se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 en la preparación de un liquido de tratamiento para el tratamiento de un alimento, comida o producto agrícola.

17. Uso de una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 o una suspensión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 como un conservador en y/o sobre un alimento, comida o producto agrícola .

18. Un método para conservar un alimento, comida o producto agrícola, en donde una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 o una suspensión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 se aplica al alimento, comida o producto agrícola.

19. Un método para producir una composición sólida de nisina que comprende la etapa de someter una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 a una etapa de secado, etapa de liofilización, etapa de cristalización o etapa de precipitación.

20. Un alimento, comida o producto agrícola que comprende una composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9 o una suspensión de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13.