MX2012002719A - Ensayos opticos y de imagenes por resonancia magnetica (mri) para proteasas. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona nanoplataformas multifuncionales para evaluar la actividad de una proteasa in vivo o in vitro, junto con métodos para recupera imágenes y detentar la presencia de tejidos cancerosos y precanceroso, y el tratamiento terapéutico de los mismos, incluyendo el monitoreo del tratamiento. Las nanoplataformas de diagnóstico comprende nanopartículas y se enlazan entre si u otras partículas vía un enlace de oligopéptido que comprende una secuencia de consenso específica para la proteasa objetivo. La escisión de la secuencia por la proteasa objetivo se puede detectar usando varios sensores, y los resultados del diagnóstico se pueden correlacionar con el pronóstico de cáncer. Las nanoplataformas no enlazadas individuales también son adaptables para tratamientos terapéutico de hipertermia del tejido canceroso.

Description

ENSAYOS OPTICOS Y DE IMAGENES POR RESONANCIA MAGNETICA (MRI) PARA PROTEASAS Campo de la Invención La presente invención se refiere a nanoplataformas multifuncionales para ensayos de diagnósticos, imágenes, monitoreo, y tratamiento terapéutico de tejidos cancerosos.

Antecedentes de la Invención Proteasas Un número de proteasas está asociado con la progresión de la enfermedad en el cáncer, y se sabe que son sobre-expresadas por varias líneas celulares de cáncer, como se muestra en la Figura 1. Los ejemplos incluyen Metaloproteinasas de Matriz (MMPs, por sus siglas en inglés) , Serina Proteasas de Tejido, y las Catepsinas. Muchas de estas proteasas son ya sobre-reguladas en las células cancerosas (es decir, tienen una actividad mucho mayor en el tumor que en el tejido saludable), mal expresadas (es decir, se encuentran en compartimientos donde no se deberían encontrar) o están involucradas en el desarrollo embriónico (pero no se deberían encontrar a cualquier grado significativo en una célula adulta) .

Hay 21 diferentes MMPs conocidas que están agrupadas en familias con base en sus sustratos: colagenasas, gelatinasas, estromelisinas , matrilisina, metaloelastasa, Ref . :228540 enamelisina, y MMPs de tipo membrana. Las MMPs usualmente se producen por células estromales que rodean un tumor, y aunque no se producen por las células cancerosas por si mismas, son vitales para la supervivencia y progresión del cáncer por diversas razones. Primero, escinden los factores de crecimiento unidos a la superficie celular de las células estromales y epiteliales y los liberan para interactuar con las células cancerosas para estimular el crecimiento. Segundo, juegan un papel en la angiogénesis abriendo la matriz extracelular (ECM, por sus siglas en inglés) al nuevo desarrollo de vasos así como también liberando factores pro-angiogénicos e iniciando cascadas de proteasas pro-angiogénicas . Las MMPs juegan un papel principal en la metástasis de tumor degradando la ECM y la membrana de basamento (BM, por sus siglas en inglés) , permitiendo que las células cancerosas pasen a través de las barreras de tejido, conduciendo a la invasión celular. También liberan fragmentos de ECM y BM, lo cual estima el movimiento celular.

Diversas serina proteasas también tienen papeles bien documentados en el cáncer, especialmente activador de plasminógeno de urocinasa (uPA, por sus siglas en inglés) y plasmina. Se ha encontrado que los niveles elevados de expresión de urocinasa y varios otros componentes del sistema de activación de plasminógeno están correlacionados con la malignidad de tumor. El uPA es una proteasa muy específica que enlaza a su receptor, uPAR, y escinde el plasminógeno inactivo (un zimógeno) a la plasmina activa. Esta es la primera etapa en una cascada bien conocida que causa angiogénesis en tumores. Se cree que la degradación de tejido que sigue de la activación de plasminógeno facilita la invasión de tejido y contribuye a la metástasis. La plasmina es una proteasa un poco no específica que escinde las proteínas o péptidos incluyendo la activación de procolagenasas , degradación de la ECM, y liberación/activación de factores de crecimiento. Aunque la plasmina es un poco no específica y una secuencia de consenso es difícil de determina, el uPA tiene una secuencia de consenso bien definida.

Las catepsinas, con unas pocas excepciones, son cisteína proteasas. Frecuentemente encontradas en la trayectoria lisosomal/endosomal , las catepsinas usualmente operan a valores de pH bajos, pero algunas son aún activas a pH neutro. Tres de las catepsinas, B, D, y L, son activas a pH neutro y frecuentemente son mal expresadas en cáncer, causando la activación fuera de las células. Esta activación fuera de la célula puede causar degradación de ECM.

Imágenes por Resonancia Magnética Las Imágenes por Resonancia Magnética (MRI, por sus siglas en inglés) son una herramienta de diagnóstico no invasiva para obtener imágenes del interior de un cuerpo.

Proporciona información acerca de las alteraciones patológicas, tales como tumores, de tejidos vivientes (imágenes médicas) . Las imágenes por MR se basan en los tiempos de relajación espín de los protones (""?) , excitados usando patrones de impulso de radiofrecuencia (FR) en un campo magnético externo. La variación de los tiempos de relajación Ti (tiempo de relajación longitudinal o espín-red) y relajación T2 (tiempo de relajación transversal o espín-espín) genera contrastes de imágenes entre diferentes tejidos y patologías dependiendo de cómo se colecta la imagen por MR. Más específicamente, cuando un paciente se coloca dentro del campo magnético (B0) del imán de MR del aparato, los protones del cuerpo se alinean en la dirección del campo externo (B0) . Además, el eje magnético de cada protón comienza a girar (movimiento de precesión) alrededor de la dirección de este campo. Algunos de estos protones progresan con movimiento de precesión con sus momentos magnéticos apuntando en una dirección cercanamente paralela al campo magnético externo, mientras que otros progresan con movimiento de precesión con sus momentos magnéticos apuntando casi anti-paralelos al campo. Esto crea un momento magnético neto en los tejidos del paciente, con el magnetismo (M) del tejido orientado exactamente paralelo al campo externo (B0) . Los cortos impulsos de radiofrecuencia (RF) se transmiten en el paciente a diferentes ángulos cambiando la orientación de los momentos magnéticos de los protones, induciendo una corriente eléctrica en una bobina receptora fuera del cuerpo del paciente. Estas señales se usan para reconstruir la imagen por MR.

Para reconstruir una imagen, se necesitan diversas señales de MR, y se deben transmitir diversos impulsos. Entre las transmisiones de impulso, los protones sufren dos diferentes procesos de relajación: relación Tx y T2. El operador de MRI determina si el contraste de tejido será determinado principalmente por diferencias en ?1 (imagen ponderada en Ti) o T2 (imagen ponderada en T2) modificando la sincronización y secuencia de impulsos. Por ejemplo, para imágenes ponderadas en Ti, los tejidos que exhiben un fuerte magnetismo inducirán señales fuertes y generalmente aparecerán brillosos en la imagen, mientras que los tejidos que exhiben magnetismo débil inducirán señales débiles y aparecerán oscuros. Las secuencias de impulsos se realizan por programas de computadora que controlan los aspectos de hardware del proceso de medición de MRI. Ti se define como el tiempo hasta que la magnetización de protones ha vuelto a ganar 63% de su valor original. El tiempo de relajación Ti es una medición del tiempo que los núcleos de 1H excitados requieren para alinearse con el campo magnético externo. En general, Tx es más largo en tejidos que tienen ya sea moléculas más pequeñas más móviles (es decir, fluidos) o moléculas más grandes menos móviles (es decir, sólidos) , mientras que Tx es más corto en tejidos que tienen moléculas de movilidad y tamaño medio (es decir, grasa) . La relajación T2 es causada por el intercambio de energía de los protones excitados y núcleos magnéticos cercanos { ? , y menos importante, 13C y 15N) . Las imágenes ponderadas T2 se basan en el desfasado local (pérdida de coherencia de fase) de espines orientados en un ángulo al campo externo después de la transmisión del impulso de RF. T2 se define como el tiempo cuando la magnetización (Mxy) ha perdido 63% de su valor original. Los tejidos fluidos o tipo fluidos típicamente tienen un T2 largo (la señal de MR desaparece lentamente) , y las sustancias y tejidos sólidos tienen un T2 corto. El tiempo de relajación T2* (también llamado T2 estrella) posee dos componentes aditivos, el tiempo de relajación T2 y la contribución de las no uniformidades del campo magnético local a la relajación total. En la ausencia de un impulso externamente aplicado, el efecto de T2* puede causar rápida pérdida de coherencia, y por lo tanto la pérdida de magnetización transversal y la señal de MRI . Con base en su definición, T2* siempre es más corto que T2.

Mz(t) : componente z de la magnetización de espín nuclear Mz,eq: valor de equilibrio térmico de Mz -t/T.

M (t) =M 'x.y e 1 Mxy(t) : componente de M que es perpendicular a B0 ?: relación giromagnética ??0 : diferencia de la resistencia del campo localmente variado Los agentes de contraste de MRI paramagnéticos y superparamagnéticos (tales como nanopartículas magnéticas, "MNPs" ) se pueden usar para cambiar la intensidad de señal del tejido que es capturado en imagen alterando los tiempos de relajación Ti y/o T2 de los núcleos de ?? en el tejido. En general, los agentes de contraste positivos causan una reducción en el tiempo de relajación Ti (intensidad de señal incrementada en imágenes ponderadas en Ti) , y aparecen brillosos en las imágenes por MR. Los agentes de contraste negativos resultan en tiempos de relajación Tx y T2 más cortos, y aparecen predominantemente oscuros en la MRI. Los agentes de contraste de MRI más comunes se basan en quelatos orgánicos de cationes de gadolinio. Aunque menos tóxicos que los agentes de contraste yodados (comúnmente usados en rayos X o CT) , los agentes de gadolinio se han vinculado a la fibrosis sistémica nefrogénica cuando se usan en algunos pacientes con diálisis. Además, los agentes de contraste de gadolinio requieren el contacto directo con el agua in vivo a ser activada. Algunas partículas de óxidos de hierro también se usan como medio de contraste superparamagnético en MRI. Estos agentes exhiben fuertes propiedades de relajación Ti, y debido a las diferencias de susceptibilidad a sus alrededores, también producen un campo magnético local fuertemente variado el cual aumenta las relajaciones T2 y T2* de los espines de 1H en el tejido. Las Nanopartículas de Óxido de Hierro de Partícula Pequeña (SPIONs, por sus siglas en inglés) de menos de 300 nm pueden permanecer intravasculares por varias horas y por consiguiente pueden servir como agentes de acumulación de sangre. Sin embargo, también se pueden absorber rápidamente por el sistema reticuloendotelial y llegar a distribuirse entre el tejido saludable y acumularse en el hígado. También tienden a agruparse en tamaños no efectivos . Las dispersiones acuosas de nanocristales por debajo de 20 nm estabilizados únicos (tamaño hidrodinámico) de óxidos de hierro se clasifican como partículas ultrapequeñas de óxido de hierro (USPIO, por sus siglas en inglés) . Típicamente, estos materiales generan contrastes positivos en imágenes por MR ponderadas en Ti y contrastes negativos en imágenes ponderadas en T2. Las relajabilidades típicas para dispersiones USPIO acuosas son ri = 10-20 mM^s"1 para aumento de Tx, y r2 = aproximadamente -100 mM^s"1 para disminución de T2 en campos de MRI clínicos de 60-100 MHz (1.4 a 2.35 T) . Las relaj abilidades ri y r2 son mediciones de la capacidad del agente para aumentar o disminuir, respectivamente, las relajaciones longitudinales o transversales de los espines de protones en el tejido. , , , ,-, , ,. „ donde c ( Fe ) : mM , Ti , T2 : s .

Un agente de contraste de MRI de óxido de hierro comercial es Feridex® (Bayer Healthcare) , el cual consiste de un núcleo de Y~Fe203 de 4-5 nm de diámetro y un recubrimiento de dextrano.

Retrodispersión de la Luz La Resonancia de Plasmón Superficial (SPR, por sus siglas en inglés) ocurre cuando una onda electromagnética interactúa con los electrones de conducción de un metal . El campo eléctrico periódico de la onda electromagnética causa una oscilación colectiva de los electrones de conductancia a una frecuencia resonante con relación a la red de iones positivos. La luz se absorbe o dispersa a esta frecuencia resonante. El proceso de absorción se caracteriza por la conversión de fotones resonantes incidentes en fotones o vibraciones de la red de metal, mientras que la dispersión es la re-emisión de fotones resonantes en todas direcciones. Debido a estos dos procesos, el pico de SPR experimentalmente observable de cualquier nanoestructura de metal presenta componentes tanto de absorción como dispersión. Gustav Mié fue el primer científico en desarrollar un método para calcular los espectros de SPR de nanoestructuras de metal (noble) resolviendo la ecuación de Maxwell para nano-objetos esféricos . La teoría de "Mié" se ha extendido gradualmente para una variedad de objetos con geometrías simples, tales como esferoides y barras. Sin embargo, las soluciones exactas para las ecuaciones de Maxwell solamente se han encontrado para esferas, cubiertas esféricas concéntricas, y cilindros infinitos. Por lo tanto, se requiere la aproximación para resolver las ecuaciones para otras geometrías. La aproximación dipolar discreta (DDA, por sus siglas en inglés) es el método de elección preferido en el arte, debido a que se puede adaptar fácilmente a cualquier geometría.

La extinción óptica ?(?) de nanopartículas que son menores que la longitud de onda de la fuente de luz de excitación, es: ?(?) = S(X) + A(X) donde ? es la longitud de onda, S es la dispersión, y A es la absorbancia. El factor de eficiencia de extinción Qext/ el cual es la suma del factor de eficiencia de dispersión Qsca y el factor de eficiencia de absorción Qa S/ se define como el cociente de Cext y el área de sección transversal física nR2. Los factores de eficiencia de dispersión y absorción se pueden calcular de acuerdo con la teoría general de Mié, la cual se explica, en algunos detalles, a continuación. Ambas pueden expresar como series infinitas Re denota la parte real del índice de refracción, m es la relación del índice de refracción de la nanopartícula esférica n a aquel del medio circundante nm, mientras que x es el parámetro de tamaño. ? es la longitud de onda incidente, R es el diámetro de la nanopartícula. ?? y ?? son las funciones de Riccati -Bessel . El apóstrofo representa la primera diferenciación con respecto al argumento entre paréntesis .

£W=(¾)+¾A) =(¾)^ ?(?) es la absorbancia o densidad óptica de la muestra, e (M^cnf1) es la absorción molar (cas) coeficiente de dispersión (esca) o extinción (ee*t)/ c (M) es la concentración de las especies que absorben y dispersan la luz y A(cm) es la longitud de la trayectoria óptica.

Los coeficientes de dispersión y absorción molar están directamente relacionados con la sección transversal de dispersión y absorción por medio de la siguiente ecuación: ext 0.2303 donde NA es el número de Avogrado. Las nanopartículas de metal muestran secciones transversales de absorción notablemente grandes en comparación con los tintes orgánicos y complejos metálicos. Un ejemplo típico es las nanoesferas que se han usado para el tratamiento de hipertermia fototérmica inducida por láser de células cancerosas, que presenta una sección transversal de absorción de 2.93 x 10"15 m2 (e = 7.66 x 109 M"1 cm"1) a su máxima resonancia de plasmón de ? = 528 nm. Esto es cinco órdenes de magnitud mayor que del tinte de NIR verde de indocianina comúnmente usado (e = 1.08 x 104 M"1 cm"1 a ? = 778 nm) o el sensibilizador rutenio (II) -tris-bipiridina (1.54 x 104 a M"1 cm"1 a ? = 452 nm) y cuatro órdenes de magnitud mayor que rodamina-6G (e = 1.16 x 105 M"1 cm"1 a ? = 530 nm) o verde de malaquita (e = 1.49 x 105 M"1 cm"1 a ? = 617 nm) . Las nanopartículas de metal también poseen propiedades de dispersión de luz notables. Las nanoesferas de oro de 80 nm de diámetro tienen aproximadamente las mismas características de dispersión de Mié que las perlas de poliestireno de 300 nm (ambos presentan CSca = 1.23 x 1014 m2 a ? = 560 nm, correspondiente al coeficiente de dispersión molar de 3.22 x 1010 M"1 cm"1) . Esta fuerte dispersión es cinco órdenes de magnitud mayor que la emisión de luz (fluorescencia) de fluoresceína (e = 9.23 x 104 M"1 era"1 a ? = 521 nm, rendimiento de cuanto de emisión = 0.98 a ? = 483 nm) .

Hay una necesidad en el arte de métodos mejorados para detectar cuantitativamente la progresión del cáncer y etapas de la enfermedad que se puedan aplicar in vitro e in vivo. También hay una necesidad de caracterización in vivo del cáncer, de modo que el tratamiento se pueda dirigir al tejido canceroso más maligno. También hay una necesidad de imágenes in vivo de la ubicación del tejido canceroso y extensión en todas las partes del cuerpo, incluyendo el cerebro, lo cual se puede realizar y observar en resolución en tiempo real .

Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona nanoplataformas y montajes de nanoplataformas para detectar la actividad de proteasa. Los montajes comprenden una primera nanoplataforma que comprende una primera nanopartícula y una capa protectora, una segunda nanoplataforma que comprende una segunda nanopartícula y una capa protectora, y un enlace de oligopéptido entre las primera y segunda nanoplataformas . El enlace comprende una secuencia de consenso de proteasa. Además, al menos una de las primera o segunda nanoplataformas adicionalmente comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de porfirinas, clorinas, bacterioclorinas , ftalocianinas , biotina, derivados de las mismas, y combinaciones de las mismas.

La invención también proporciona una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataformas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

También se proporciona un método para detectar la actividad de una proteasa asociada con una célula cancerosa o precancerosa en un mamífero. El método comprende poner en contacto una muestra de fluido del mamífero con un ensayo de diagnóstico que comprende el montaje de nanoplataforma de la invención. El ensayo luego se expone a una fuente de energía, y se detectan los cambios de la extinción óptica del ensayo. Estos cambios corresponden a la actividad de proteasa.

También se proporciona un método adicional para detectar la actividad de una proteasa asociada con una célula cancerosa o precancerosa en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataformas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El ensayo luego se ubica en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa. La región luego se expone a una fuente de energía, y se detecta el espectro de retrodispersión del ensayo.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un método de imágenes MRI para detectar la actividad de una proteasa asociada con una célula cancerosa o precancerosa en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataformas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El ensayo luego se ubica en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa. Los impulsos de radiofrecuencia se transmiten a la región de interés, y luego se adquieren los datos de imágenes por MR que comprenden valores de ?? y T2.

También se proporciona un método de imágenes MRI adicional para detectar la actividad de una proteasa asociada con una célula cancerosa o precancerosa en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataformas de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el enlace de montaje comprende la secuencia de consenso de proteasa SGRSA (SEC ID NO: 2) . El ensayo luego se ubica en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa. Los impulsos de radiof ecuencia se transmiten a la región de interés, y luego se adquieren los datos de imágenes por MR que comprenden valores de Tx y T2. Dependiendo de los resultados de este ensayo, el método de imágenes se repite usando otras secuencias de consenso específicas.

La invención también proporciona una nanoplataforma terapéutica que comprende una primera nanopartícula y una capa protectora que rodea la nanopartícula. La capa protectora se selecciona del grupo que consiste de nanocapas de siloxano, monocapas de ligando, y combinaciones de las mismas .

También se proporciona una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye la nanoplataforma de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

La invención también proporciona un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas o precancerosas en un mamífero. El método comprende administrar al mamífero la composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye la nanoplataforma terapéutica de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable. El ensayo luego se ubica en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa . La nanoplataforma luego se calienta usando excitación magnética A/C, por lo cual el tejido en la región de interés se calienta a una temperatura de al menos aproximadamente 40°C.

La invención también se relaciona con nanoplataformas terapéuticas para inhibir el crecimiento de células cancerosas o precancerosas en un mamífero por excitación magnética A/C de las nanoplataformas , calentando las células cancerosas o precancerosas.

Los agentes de contraste de MRI de la invención también se proporcionan en la invención. Los agentes comprenden una nanopartícula de núcleo/cubierta que tiene un núcleo de acero. Los agentes de contraste de MRI tienen una rx de más de aproximadamente 100 mM^s"1 para aumento de Tx y una r2 con un número entero mayor que aproximadamente -2,000 mM^s"1 para disminución de T2.

La invención también se relaciona con un montaje de nanoplataformas adicional para monitorear la progresión del tratamiento de cáncer en un mamífero. El montaje comprende una nanoplataforma que comprende una primera nanopartícula y una capa protectora, una partícula, y un enlace de oligopéptido entre la nanoplataforma y la partícula. El enlace comprende una secuencia de consenso de proteasa. El método comprende poner en contacto una primera muestra de fluido del mamífero con un primer ensayo de diagnóstico que comprende la nanoplataforma; exponer el primer ensayo a una fuente de energía,- y detectar los cambios en el espectro de absorción o emisión del primer ensayo con el tiempo con relación al espectro de absorción o emisión del primer ensayo previo al contacto con la primera muestra de fluido, en donde los cambios corresponden a un primer nivel de actividad de proteasa en la primera muestra. Este proceso se repite en una última etapa durante el tratamiento del cáncer y los niveles de actividad de proteasa subsecuentes se comparan con los niveles de proteasa iniciales (o primeros) . Con base en los cambios en los niveles de actividad de proteasa, luego se hace una determinación para incrementar, disminuir, o cambiar el método de tratamiento.

Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 representa las cuatro etapas principales de la progresión del cáncer y las proteasas asociadas con estas etapas; La Fig. 2 ilustra el etiquetado con biotina usando una mezcla estadística de ligandos furtivos anclados a dopamina y ligandos furtivos anclados a dopamina biotinilados a la capa de protección de siloxano con terminación amino alrededor de la nanopartícula de Fe/Fe304 usando CDI; La Fig. 3 es una ilustración de la escisión de dos nanoplataformas que comprenden una nanopartícula de Fe/Fe304 con un recubrimiento de ligando furtivo que presenta porfirinas químicamente unidas enlazadas con una secuencia de escisión de urocinasa; La Fig. 4 ilustra un método de enlace alternativo que utiliza una porfirina como parte del enlace entre dos nanoplataformas ; La Fig. 5 ilustra un método de montaje alternativo por el cual los ligandos se pre-enlazan usando una secuencia de escisión antes que se unan a la superficie de la nanoparticula; La Fig. 6 representa un esquema de reacción para sintetizar el Ligando A de acuerdo con los procedimientos descritos en el Ejemplo 3; La Fig. 7 representa la unión de un compuesto porfirina al Ligando del Ejemplo 3; La Fig. 8 muestra un esquema de reacción para unir las etiquetas de biotina a las nanoplataformas; La Fig. 9 ilustra un método alternativo para el enlace del ligando furtivo antes de unirse a las nanoparticulas ; La Fig. 10 es una gráfica de los tiempos de relajación Ti de Nanoparticulas de Fe/Fe3C>4 sin (punto A) y con (punto B) estabilización de ligando, del Ejemplo 11; La Fig. 11 muestra los tiempos de relajación de T2 de Nanoparticulas de Fe/Fe304 sin (A) y con (B) estabilización de ligando, del Ejemplo 11; La Fig. 12 ilustra que la disminución de -(r2/ri) sigue aproximadamente una cinética de pseudo primer orden, como se calcula en el Ejemplo 11; Las Figs. 13 (A) -13(B) muestran la fluorescencia relativa de la Nanoplataforma de Fe/Fe3C>4 que presenta la carboxilato porfirina (TCPP) sódica "libre" (Figura 13(1)) y tetracarboxilato porfirina sódica dopada con zinc (Figura 13 (II) ) del Ejemplo 12; La Fig. 14 representa las intensidades de fluorescencia de las nanopartículas de Fe/Fe304 que presentan TCPP sódica dopada con zinc y TCPP sódica del Ejemplo 12; La Fig. 15 muestra la fluorescencia de la nanoplataforma de Fe/Fe304 cuando la concentración de TCPP sódica no unida en PBS se incrementa en el Ejemplo 12; La Fig. 16 ilustra la microscopía de fluorescencia de la nanoplataforma de Fe/Fe304 con porfirinas atadas del Ejemplo 12; La Fig. 17 ilustra los datos del ensayo en orina de ratas impregnadas con células cancerosas tipo MATB III usando el sensor basado en interruptor de luz en el Ejemplo 13; La Fig. 18 muestra el gráfico de las intensidades relativas de la luminiscencia de TCPP que ocurre a ? = 656 nm usando los datos de la Figura 17; Las Figs . 19 (A) -19(F) ilustran los espectros de foto conteo único, de las extremidades izquierda y derecha de los ratones del Ejemplo 14 registrados a través de un microscopio de fluorescencia; La Fig. 20 es una gráfica de la cinética de escisión de proteasa observada como una función de la concentración de proteasa (urocinasa) del Ejemplo 15; La Fig. 21 muestra el espectro de retrodispersión de UV/Vis de un dímero de nanopartículas en agua en la presencia de urocinasa del Ejemplo 16; La Fig. 22 es una gráfica que muestra los cambios en la extinción óptica con el tiempo del Ejemplo 16; La Fig. 23 ilustra un gráfico de la extinción óptica a 40 nm dividida por la extinción óptica a 600 nm con el tiempo del Ejemplo 16; La Fig. 24 ilustra el espectro de UV/Vis de la tetracarboxifenil porfirina (TCPP, por sus siglas en inglés) "libre" y unida a Fe/Fe304, junto con los complejos de zinc de la porfirina en H20 a una concentración de 7.5 x 10"6 del Ejemplo 17; La Fig. 25 es una imagen de MRI de dos ratones del Ejemplo 19; La Fig. 26 ilustra el volumen de tumor promedio (mm3) de los estudios de control e inhibición de tumor por hipertermia del Ejemplo 20; La Fig. 27 es una gráfica del cambio de temperatura con el tiempo para las pruebas de hipertermia para varias nanopartículas y nanoplataformas del Ejemplo 21; La Fig. 28 representa las velocidades de absorción específicas calculadas para varias nanopartículas de Fe y Fe203 como una función del diámetro de partícula promedio del Ejemplo 22; La Fig. 29 es una gráfica que muestra las velocidades de absorción específicas calculadas como una función de la forma del campo magnético usado para los tratamientos de hipertermia ; La Fig. 30 ilustra el área de superficie disponible de las nanopartículas esféricas para el enlace de ligando como una función de su diámetro del Ejemplo 24; La Fig. 31 muestra el número de ligandos anclados a dopamina por nanopartículas como una función del diámetro de nanopartícula del Ejemplo 24; La Fig. 32 ilustra el efecto de las variaciones en el diámetro de nanopartícula sobre el número de ligandos que forman una monocapa en la superficie de la nanopartícula del Ejemplo 24; La Fig. 33 es una gráfica de los resultados del monitoreo in vi ro del tratamiento de cáncer del Ejemplo 25; La Fig. 34 es una gráfica que muestra el efecto de las nanopartículas en la viabilidad de células madre neurales (NSC, por sus siglas en inglés) del Ejemplo 26; La Fig. 35 es una gráfica que muestra el efecto de las nanopartículas en la viabilidad de células cancerosas B16F10 del Ejemplo 26; La Fig. 36 es una imagen del campo brilloso de NSCs cargadas con la nanoplataforma de Fe/Fe304 del Ejemplo 26 mostrando la tinción positiva de azul de Prusia para la presencia de hierro y contrateñidas con rojo rápido nuclear; La Fig. 37 es una imagen de microscopio electrónico de transmisión de NSC cargadas con nanoplataformas de Fe/Fe304 del Ejemplo 26 (ampliación de 30,000x); La Fig. 38 es una gráfica que muestra la eficiencia de carga de las nanoplataformas de Fe/Fe304 del Ejemplo 26, con base en la concentración de Fe por célula NSC cargada con varias concentraciones de las nanoplataformas , donde indica resultados estadísticamente significativos (valor p menor que 0.05) cuando se comparan con el control; La Fig. 39 es una gráfica que muestra las mediciones de temperatura después de AMF de NSCs cargadas con las nanoplataformas de Fe/Fe304 del Ejemplo 26, y controles de NSC en la pelotilla y en el sólido de agarosa, donde "*" indica resultados estadísticamente significativos (valor p menor que 0.1) cuando se comparan con el control.

Las Figs. 40(A)-(40F) son imágenes de secciones de tejido de ratones que portan tumor de melanoma del Ejemplo 26; La Fig. 41 es una gráfica que compara los volúmenes de tumor en ratones inyectados con células de melanoma B16-F10 y solución salina sin AMF con ratones inyectados con B16-F10 y NSCs cargadas con nanopartículas (con o sin tratamiento de AMF) del Ejemplo 26; Las Figs. 42(A)-(42B) son imágenes de geles 2-D de tejido de melanoma de ratones tratados con solución salina + AMF (Figura 42A) o NSCs cargadas con nanopartículas + AMF (Figura 42B) del Ejemplo 26; La Fig. 43 es una tabla de las proteínas identificadas de tejidos de melanoma de ratones tratados con solución salina + AMF o NSCs cargadas con nanopartículas + AMF del Ejemplo 26; La Fig. 44 es un esquema que representa la formación de montajes de nanoplataformas usando nanoplataformas recubiertas con Au y oligopéptido SEC ID NO: 66 (suprimido en el N-terminal por 1 residuo y el C-terminal por 2 residuos), como se describe en el Ejemplo 27; La Fig. 45 es una gráfica de los resultados de las pruebas de estabilidad del Ejemplo 27; La Fig. 46 es una gráfica de la eficiencia de carga de las nanoplataformas recubiertas con Au del Ejemplo 27, donde los círculos negros indican la captación de Fe (en pg de Fe/célula) por las células cancerosas B16F10, los cuadrados indican la captación de fe (en pg de Fe/célula) por las células madre, y los triángulos indican la captación de Fe (en pg de Fe/célula) por las células epiteliales MS-1, como una función de la concentración de Fe en el medio de culti o; La Fig. 47 es un esquema para multiplexar nanoplataformas usando múltiples tintes de cianina en una nanopartícula con recubrimiento central furtivo para la detección de múltiples proteasas simultáneamente; La Fig. 48 es una gráfica de los espectros de emisión de varios tintes de cianina; La Fig. 49 es un esquema que representa la oligoplexión de nanopartículas del Ejemplo 28; La Fig. 50 es una imagen de monocitos/macrófagos cargados con nanopartículas del Ejemplo 29; Las Figs . 51(A)-(51D) son imágenes M I usando los agentes de imágenes de nanoplataforma en ratones que portan melanomas de pulmón con metástasis B16F10 del Ejemplo 30; La Fig. 52 es una imagen de ratones 1 hora después que se inyectan con la nanoplataforma de interruptor de luz usando tintes de cianina del Ejemplo 31; La Fig. 53 es una imagen de ratones 2 horas después de que se inyectan con la nanoplataforma de interruptor de luz usando TCPP y cromoforos de rodamina del Ejemplo 31; La Fig. 54 es una imagen de ratones 24 horas después que se inyectan con la nanoplataforma de interruptor de luz usando TCPP y cromoforos de rodamina del Ejemplo 31; y La Fig. 55 es una gráfica de los datos de XRD del Ejemplo 26.

Breve Descripción del Listado de Secuencias La siguiente solicitud contiene un listado de secuencias en formato leíble por computadora (CRF, por sus siglas en inglés) , presentado como un archivo de texto en formato ASCII titulado "40884_PCT_SequencedListing.txt", creado el 24 de Agosto de 2010, como de 18 KB. Los contenidos del CRF se incorporan para referencia en la presente.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención proporciona nanoplataformas de diagnóstico, imágenes, y terapéuticas y métodos que usan las mismas. Las nanoplataformas son estructuras a nanoescala (= 100 nm) diseñadas como plataformas generales para crear una variedad de ensayos y dispositivos teranósticos (de diagnóstico y terapéuticos) multitareas. Las nanoplataformas de la invención comprenden un núcleo de nanopartícula inorgánica con una o más capas protectoras. El núcleo inorgánico preferiblemente comprende una nanopartícula de núcleo/cubierta. La capa protectora preferiblemente se selecciona del grupo que consiste de nanocapas de siloxano, monocapas de ligando, y combinaciones de las mismas. Los recubrimientos de oro también se pueden usar además de las capas protectoras. Las nanoplataformas adicionalmente pueden comprender grupos funcionales químicamente unidos (es decir, moléculas o compuestos) unidos a la capa protectora. Estos grupos funcionales preferiblemente se localizan dentro, y se captan selectivamente por tejidos, y preferiblemente se dirigen a tejidos cancerosos. Las capas protectoras y grupos funcionales también se pueden utilizar para modificar las propiedades de la nanoplataforma, tal como la solubilidad. Los grupos funcionales preferidos se seleccionan del grupo que consiste de porfirinas, clorinas, bacterioclorinas , ftalocianinas, biotina, derivados de las mismas, y combinaciones de las mismas.

En algunas modalidades, los grupos funcionales se unirán directamente a la capa protectora. En otras modalidades, los grupos funcionales se unirán a la monocapa vía enlaces de oligopéptido, los cuales se escinden selectivamente por una proteasa en el tejido objetivo. Dos o más nanoplataformas también se pueden enlazar conjuntamente vía estos enlaces de oligopéptido. Las nanoplataformas también se pueden enlazar a partículas, tales como cromóforos y tintes vía estos enlaces de oligopéptido. En modalidades adicionales, los compuestos porfirina se pueden usar en conjunto con enlaces de oligopéptido para enlazar dos nanoplataformas . Se apreciará que la combinación particular de los componentes de estas nanoplataformas multifuncionales se puede adaptar para imágenes de diagnóstico, detección, monitoreo, y tratamiento terapéutico de tejidos cancerosos.

Núcleo Inorgánico de Nanopartículas Como se señaló previamente, las nanoplataformas preferiblemente comprenden un núcleo inorgánico, el cual comprende una nanopartícula . El término "nanopartícula" como se usa en la presente se refiere a partículas de metal con tamaños abajo de 100 nm. Las nanopartículas preferidas serán bimagnéticas y comprenden un núcleo de metal o aleación de metal y una cubierta^ de metal . Los núcleos preferidos se seleccionan del grupo que consiste de Au, Ag, Cu, Co, Fe, y Pt . Aún más preferiblemente, las nanopartículas presentan un núcleo de Fe fuertemente paramagnético . Las cubiertas preferidas se seleccionan del grupo que consiste de Au, Ag, Cu, Co, Fe, Pt, los óxidos metálicos (por ejemplo, FeO, Fe30 , Fe203, FexOy (óxido de hierro no estequiométrico) , CuO, Cu20, NiO, Ag20, Mn203) de los mismos, y combinaciones de los mismos. Una nanopartícula particularmente preferida es una nanopartícula de núcleo/cubierta de Fe/Fe304 superparamagnético . Las nanopartículas adecuadas están disponibles de NanoScale® Corporation, Manhattan, Kansas, incluyendo sin limitación, aquellas disponibles bajo el nombre NanoActive®.

Las nanopartículas preferiblemente tienen un diámetro total promedio desde aproximadamente 3 nm a aproximadamente 100 nm, más preferiblemente desde aproximadamente 5 nm a aproximadamente 20 nm, y aún más preferiblemente desde aproximadamente 7 nm a aproximadamente 10 nm. El núcleo de la nanopartícula preferiblemente tiene un diámetro desde aproximadamente 2 nm a aproximadamente 100 nm, más preferiblemente desde aproximadamente 3 nm a aproximadamente 18 nm y más preferiblemente desde aproximadamente 5 nm a aproximadamente 9 nm. La cubierta de metal de la nanopartícula de núcleo/cubierta preferiblemente tiene un espesor desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm, y más preferiblemente desde aproximadamente 1 nm a aproximadamente 2 nm. Las nanopartículas también tienen preferiblemente un área de superficie de puntos múltiples de Brunauer-Emmett-Teller (BET) desde aproximadamente 20 m2/g a aproximadamente 500 m2/g, más preferiblemente desde aproximadamente 50 m2/g a aproximadamente 350 m2/g, y aún más preferiblemente desde aproximadamente 60 m2/g a aproximadamente 80 m /g. Las nanopartículas preferiblemente tienen un área de superficie de poros acumulativa de adsorción de Barret-Joyner-Halenda (BJH) que tiene una anchura entre 17.000 A y 3000.000 Á desde aproximadamente 20 m2/g a aproximadamente 500 m2/g, y más preferiblemente desde aproximadamente 50 m2/g a aproximadamente 150 m2/g. Las nanopartículas también tienen preferiblemente un área de superficie de poros acumulativa de desorción de BJH que tiene una anchura entre 17.000 Á y 3000.000 Á desde aproximadamente 50 m2/g a aproximadamente 500 m2/g, y más preferiblemente desde aproximadamente 50 m2/g a aproximadamente 150 m2/g. La población de nanopartículas preferiblemente es sustancialmente monodispersa , con una distribución de tamaño de masa/tamaño muy estrecho. Más preferiblemente, la población de nanopartículas tiene un índice de polidispersidad desde aproximadamente 1.2 a aproximadamente 1.05. Es particularmente preferido que las nanopartículas usadas en las nanoplataformas de la invención sean partículas discretas. Es decir, se evita preferiblemente el agrupamiento de nanocristales (es decir, partículas nanocristalinas) .

Capas Protectoras El núcleo inorgánico preferiblemente se recubre con una o más capas protectoras. En un aspecto, la nanopartícula se recubre con una capa protectora de siloxano órgano-funcional, y más preferiblemente una capa de siloxano aminofuncional (ASOX, por sus siglas en inglés) . La capa de siloxano preferiblemente protege al núcleo del biodeterioro bajo condiciones fisiológicas. Los siloxanos aminofuncionales preferidos se seleccionan del grupo que consiste de 3-aminopropiltrietoxisilano, 3-aminopropiltrimetoxisilano, 3-( trimetoxisilil) propanonitrilo, y 3- (trietoxisilil ) propanonitrilo . Los siloxanos adecuados se pueden comprar, o se pueden sintetizar vía métodos conocidos (es decir, aminólisis de cloroalquiltrimetoxisilanos o hidrogenación de cianoalquiltrimetoxisilanos) . El espesor de la capa de siloxano se puede modificar dependiendo del uso final y la cantidad de tiempo que la nanoplataforma permanecerá in vivo. Preferiblemente, la nanoplataforma comprende una nanopartícula que contiene hierro recubierta con una capa de aminosiloxano . Dependiendo del espesor de la capa de aminosiloxano, la nanopart ícula que contiene hierro preferiblemente se biodegradarán dentro de aproximadamente 2 días a aproximadamente 2 semanas, liberando cationes de hierro. Ventajosamente, estos cationes de hierro aumentarán el daño oxidante al tejido de tumor vía química de hierro (II/III) aumentado de especies reactivas de oxígeno (ROS) . Mientras que la capa de ligando "furtivo" clásico (discutido más adelante) afectará la biocompat ibilidad, el espesor óptimo de la capa de aminosiloxano protectora controlará la cinética de la liberación de hierro (II/III) de las nanoplataformas de nanopart ículas bimagnéticas .

Para la formación de complejos de los dímeros de nanopartículas y estabilización de los montajes de nanopart ículas , las nanopart ículas son preferiblemente recubiertas "furtivas" o estabilizadas con una capa de ligandos. Las nanopart ículas estabilizadas preferiblemente comprenden una capa protectora que rodea la nanopart ícula . El recubrimiento furtivo se puede unir directamente a la nanopart ícula , o se puede agregar como una segunda monocapa que rodea la capa protectora de siloxano. Por ejemplo, una combinación preferida es una capa de aminosiloxano rodeada por una capa de ligando furt ivo- dopamina . El término "estabilizado" como se usa en la presente significa el uso de una cubierta de ligando para cubrir, proteger, o impartir propiedades a la nanopartícula . El recubrimiento furtivo hace que las nanoplataformas eviten el sistema ret iculoendotel ial , y habilita el uso de las nanoplataformas dentro de un mamífero por al menos 2 días, y preferiblemente desde aproximadamente 2 días a aproximadamente 14 días para el diagnóstico y tratamiento.

Los ligandos comprenden grupos funcionales que son atraídos a la superficie metálica de la nanopart ícula . Preferiblemente, los ligandos comprenden al menos un grupo seleccionado del grupo que consiste de tioles, alcoholes, compuestos nitro, fosfinas, óxidos de fosfina, resorc inarenos , selenuros, ácidos fosf ínicos, ácidos fosfónicos, ácidos sulfónicos, sulfonatos, ácidos carboxí1 icos , disulfuros, peróxidos, aminas, nitrilos, isonitrilos, tionitrilos, oxinitrilos, oxisilanos, alcanos, alquenos, alquinos, compuestos aromáticos, y porciones seleno. Las capas protectoras preferidas se seleccionan del grupo que consiste de monocapas de alcanotiolato , monocapas de aminoalquilt iolato , monocapas de alquilt iosulfato , y fenoles orgánicos (por ejemplo, dopamina y derivados de la misma) . Una clase de ligandos particularmente preferida comprende unidades de oligoet ilenglicol con anclajes a base de dopamina. El espesor de la capa de ligando se puede adaptar dependiendo de la longitud de los ligandos individuales y preferiblemente es menor que aproximadamente 15 nm, y más preferiblemente desde aproximadamente 2.9 nm a aproximadamente 7 nm . Por ejemplo, un ligando de tetraetilenglicol tiene una longitud de aproximadamente 2.9 nm, mientras que un ligando de octaetilenglicol tiene una longitud de aproximadamente 4.2 nm .

Los ligandos particularmente preferidos tienen anclajes a base de dopamina y se seleccionan del grupo que consiste de: y combinaciones de los mi smos , donde n = 2-25 (preferiblemente 3-11), cada R1 se selecciona del grupo que consiste de grupos hidroxilo protegidos y no protegidos, cada R2 se selecciona individualmente del grupo que consiste de -OH, donde * designa el átomo donde R2 enlaza al ligando, cada R3 se selecciona individualmente del grupo que consiste de -OH, -COOH, y -NH2, -N(R )2, -N(R4)3, -NHR4, -NH-CO-AA, y -CO-NH-AA, donde cada R4 se selecciona del grupo que consiste de grupos alquilo (preferiblemente grupos alquilo de Ci-C4) , AA es cualquier aminoácido, y M se selecciona del grupo que consiste de Zn2+, Pd2+, Mg2t, Al3+, Pt2+, Ni2+, Eu3+, y Gd3+ . Cuando están presentes, los grupos protectores preferidos se seleccionan del grupo que consiste de grupos bencilo, siloxilo, éster carboxílico, y [1, 3] dioxol (acetónido) . Preferiblemente, los ligandos son hidrofílieos . Más preferiblemente, los ligandos tienen un coeficiente de división de octanol/agua (valor de log P) de al menos aproximadamente 5, y preferiblemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente -1.5. El ancla de dopamina ayuda a la solubilidad. Por ejemplo, el tetraetilenglicol tiene un coeficiente de división de octanol/agua de log P = 1.26, mientras que el ligando de tetraetilenglicol anclado a dopamina tiene un log P de -0.2. Igualmente, el log P de octaetilenglicol es -1.88, mientras que el log P de un octaetilenglicol anclado a dopamina es -1.16.

Para la unión a los enlaces de oligopéptido, los ligandos preferidos preferiblemente reaccionarán fácilmente con el grupo tiol de la cisteína terminal del enlace de oligopéptido (discutido más adelante) . La glicina en el lado C-terminal será conectada vía un enlace éster a la función alcohol del ligando en la otra nanopartícula, formando un dímero de nanopartícula.

Como se discute adicionalmente más adelante, los ligandos se pueden conectar previo a la unión a las nanopartículas , o después que las nanopartículas se han sometido a recubrimiento furtivo. Si los ligandos se unen entre su antes del recubrimiento furtivo, los grupos protectores, cuando están presentes, se pueden desproteger en una etapa usando hidrógeno/paladio sobre carbono.

La superficie de nanopartícula preferiblemente será esencialmente cubierta completamente con ligandos. Es decir, al menos aproximadamente 70%, preferiblemente al menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente aproximadamente 100% de la superficie de la nanopartícula tendrá ligandos unidos. El número de ligandos requeridos para formar una monocapa será dependiente del tamaño de la nanopartícula (y monocapa) , y se puede calcular usando modelación molecular o los métodos de modelación de ligando descritos en el Ejemplo 22. Por ejemplo, una nanopartícula que tiene un diámetro de 20 nm requiere aproximadamente 1,030 ligandos furtivos para la cobertura completa de la superficie, mientras que una nanopartícula con diámetro de 12 nm requiere 412 ligandos furtivos de dopamina para la cobertura completa de la superficie .

En el arte se conocen varias técnicas para unir los ligandos a la superficie de varias nanopartículas o a la capa protectora de siloxano. Por ejemplo, las nanopartículas se pueden mezclar en una solución que contiene los ligandos para promover el recubrimiento de la superficie de nanopartícula. Alternativamente, los recubrimientos se pueden aplicar a nanopartículas exponiendo las nanopartículas a una fase vapor del material de recubrimiento de modo que el recubrimiento se une o enlaza con la nanopartícula. Preferiblemente, los ligandos se unen a la nanopartícula o capa protectora de siloxano a través de enlace covalente. Nótese que para las monocapas de ligando a base de dopamina que rodean una capa protectora de siloxano, ambos grupos fenólicos no siempre se pueden conectar a los grupos amino terminal de la capa protectora de siloxano. Sin embargo, la formación de un enlace de carbamato a la nanopartícula es suficiente para la unión de los ligandos furtivos a base de dopamina.

Un método preferido de unión de ligando viene después, donde los ligandos ya se han enlazado vía una secuencia de oligopéptido . Una mezcla estequiométrica (preferiblemente aproximadamente 1/1, más preferiblemente aproximadamente 10/1 por peso con respecto a la masa de las nanopartículas) de los ligandos unidos se puede hacer reaccionar con las nanopartículas de Fe/Fe304 en THF anhidro. La mezcla luego se somete a sonicación preferiblemente por al menos aproximadamente 30 segundos y más preferiblemente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 5 minutos y luego se agita continuamente por aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 24 horas. El desplazamiento del ligando se puede seguir opcionalmente usando HPLC. Después de la terminación del recubrimiento furtivo, las nanopartículas bimagnéticas se pueden precipitar/separar con la ayuda de un imán fuerte. Las partículas luego se resuspenden preferiblemente en THF, y se recolectan. La sonicación por al menos aproximadamente 10 segundos, y preferiblemente aproximadamente 30 segundos, seguida por agitación por aproximadamente 5 minutos volverá a dispersar las nanopartículas en el medio líquido. El proceso de lavado/redispersión se puede repetir hasta aproximadamente 25 veces, y preferiblemente hasta aproximadamente 10 veces antes de transferir las nanopartículas en un amortiguador acuoso (por ejemplo, PBS) . Se apreciará que el solvente residual también se puede remover en una corriente de argón. Preferiblemente, la cantidad de dímeros (deseados) contra monómeros y oligómeros luego se determina usando cromatografía de permeación "de gel .

Una capa de recubrimiento de oro también se puede usar para aumentar adicionalmente la estabilidad de las nanopartículas y protegerlas del biodeterioro.

Antes del uso para experimentos in vitro o in vivo, las nanopartículas recubiertas (si o no están unidas) luego se suspenden/disuelven preferiblemente en H20 esterilizada o destilada dos veces.

Grupos Funcionales Como se mostró anteriormente, en algunas modalidades, las nanopartículas son recubiertas con una capa de ligandos con grupos funcionales unidos para la captación selectiva por los tejidos objetivos. Los grupos funcionales preferidos se seleccionan del grupo que consiste de porfirinas, clorinas, bacterioclorinas , ftalocianinas , etiquetas de biotina, tintes, derivados de los mismos, y combinaciones de los mismos.

Se ha encontrado que las porfirinas (incluyendo clorinas y bacterioclorina) activan la captación selectiva por células cancerosas, lo cual sobre-expresa los receptores • de porfirina en sus membranas celulares. El receptor de LDL (lipoproteína de baja densidad) , el cual es sobre-expresado en células cancerosas, tiene la capacidad de captar porfirinas, ya sea solo y/o por mecanismo de captación simultánea de lípidos. Cuanto mayor la hidrofobicidad de una porfirina, clorina o bacterioclorina, tanto más fácil la captación se puede facilitar por el receptor de LDL. Ventajosamente, esta rápida captación por las células cancerosas conduce a la acumulación de nanoplataformas dopadas con porfirina en los tejidos cancerosos, solamente con menor acumulación en otros tejidos tales como el hígado o bazo. Cuanto están presentes, las nanoplataformas preferiblemente tendrán al menos aproximadamente 1 porfirina unida por nanopartícula, preferiblemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 20 porfirinas unidas por nanopartícula, y aún más preferiblemente desde aproximadamente 5 a aproximadamente 10 porfirinas unidas por nanopartícula. Las porfirinas particularmente preferidas se seleccionan del grupo que consiste de tetrahidroxifenil porfirinas y tetracarboxifenil porfirinas (TCPP, por sus siglas en inglés) metaladas y no metaladas.

Las etiquetas de biotina incrementan la solubilidad de las nanoplataformas y activan procesos de captación muy rápida virtualmente por todas las células de mamífero. Para asegurar la captación más rápida posible de la nanoplataforma por las células, así como también las cargas útiles más altas posibles, el grado de etiquetado de biotina se puede variar. Para este propósito, diferentes relaciones de los ligandos no etiquetados y etiquetados con biotina se pueden mezclar con las nanopartículas . Ver, por ejemplo, el esquema de reacción en la Fig. 2 la cual muestra el etiquetado de biotina de las nanopartículas de Fe/Fe304 preferidas. Preferiblemente, los ligandos etiquetados o no etiquetados se mezclan a una relación de aproximadamente 1:1 a aproximadamente 200:1. Debido a sus demandas estéricas similares, es más probable que los ligandos sigan una distribución estadística entre las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX que se puede describir por la distribución de Poisson (ver Ejemplo 24) . Como una consecuencia, el número de ligandos orgánicos biotinilados por nanopartícula variará, aunque la distribución preferiblemente será relativamente estrecha: para más de 95% de las nanopartículas, la máxima desviación una de otra preferiblemente será menor de 10 por ciento relativo. Además, existirá un proceso de selección cinética durante la carga celular, debido a que las nanoplataformas que presentan la estructura óptima serán recuperadas primero. Cuando están presentes, las nanoplataformas preferiblemente tendrán al menos aproximadamente 1 etiqueta de biotina, preferiblemente desde aproximadamente 1 a aproximadamente 50 etiquetas de biotina por nanopartícula, y aún más preferiblemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 10 etiquetas de biotina por nanopartícula.

Enlaces de Oligopéptido y Secuencias de Consenso Los enlaces de oligopéptido adecuados comprenderán la secuencia de consenso para la proteasa objetivo, un grupo ácido carboxílico terminal (C-terminal), y un grupo amina terminal (N-terminal) . El oligopéptido también puede comprender preferiblemente un grupo tiol en el C-terminal, y un grupo ácido carboxílico en el N-terminal. En algunas modalidades, el enlazante oligopéptido comprende una región hidrofílica de al menos 10 aminoácidos N-terminales a la secuencia de consenso de proteasa, y una región enlazante C-terminal a la secuencia de escisión, en donde la región enlazante C-terminal comprende un grupo reactivo tiol en su término. Aún más preferiblemente, el C-terminal del oligopéptido comprende un residuo cisteína, lisina, o aspartato. La región hidrofílica N-terminal del oligopéptido preferiblemente tiene una carga positiva o negativa en exceso a una relación de aproximadamente 1:1. La región hidrofílica N-terminal también comprende preferiblemente residuos aminoácidos capaces de formar enlaces de hidrógeno entre si.

Las regiones de enlace C-terminales particularmente preferidas comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste de GGGC (SEC ID NO: 14), AAAC (SEC ID NO: 15), SSSC (SEC ID NO: 16) , TTTC (SEC ID NO: 17), GGC (SEC ID NO: 38) , GGK (SEC ID NO: 39), GC (SEC ID NO: 40), GGD (SEC ID NO: 42), GXGD (SEC ID NO: 58), y GXGXGD (SEC ID NO: 59), donde X es cualquier aminoácido diferente de cisteína o lisina. Las regiones N-terminales particularmente preferidas del oligopéptido comprenden una secuencia seleccionada del grupo que consiste de SRSRSRSRSR (SEC ID NO: 1), KSRSRSRSRSR (SEC ID NO: 19), KKSRSRSRSRSR (SEC ID NO: 20), CGGG (SEC ID NO: 23), KGGG (SEC ID NO: 24), KGG (SEC ID NO: 37), KGXG (SEC ID NO: 60), y KGXGXG (SEC ID NO: 61), donde X es cualquier aminoácido diferente de cisteína o lisina, y DGXG (SEC ID NO: 62) y DGXGXG (SEC ID NO: 63) , donde X es cualquier aminoácido diferente de cisteína. El N-terminal también puede comprender uno o más grupos terminales seleccionados del grupo que consiste de lisina, ornitina, ácido 2,4-di aminobut íri co , y ácido 2 , 3 -diaminopropiónico . Otro oligopéptido preferido tiene la siguiente estructura general donde la "secuencia" puede ser cualquiera de las secuencias de oligopéptido o consenso descritas en la presente. Los ol igopépt idos se pueden comprar, o se pueden sintetizar usando métodos conocidos (por ejemplo, síntesis modificada de Merrifield) .

Preferiblemente, la secuencia de consenso en los enlaces de oligopéptido se selecciona del grupo que consiste de secuencias de escisión de serina proteasa, secuencias de escisión de aspartil proteasa, secuencias de escisión de cisteína proteasa, y secuencias de escisión de me t aloproteasa . Aún más preferiblemente, la secuencia de consenso comprende una secuencia de escisión para una proteasa seleccionada del grupo que consiste de urocinasa, metalopeptidasa de matriz, catepsina, y gelatinasa. La proteasa particularmente preferida y sus secuencias de consenso correspondientes son listadas en la Tabla I a continuación.

Tabla I Con referencia a la Figura 1, las proteasas anteriores son asociadas con muchos eventos específicos de progresión del cáncer. Las etapas de progresión del cáncer se separan en cuatro eventos: mutación inicial, supervivencia celular/progresión del tumor, angiogénesis (desarrollo de nuevos vasos sanguíneos) , e invasión/reconstrucción de tejido. El arreglo de proteasas asociado con cada etapa puede dar una buena imagen de hasta dónde ha progresado el cáncer y cuál será el pronóstico. Las secuencias de oligopéptido más preferidas para seleccionar proteasas se listan en la tabla más adelante con el punto de escisión indicado por Tabla II * (incluyendo variantes de las mismas, las cuales se pueden suprimir en el N-terminal por 1, 2 o 3 residuos) Con referencia de nuevo a la Figura 1, se puede determinar un pronóstico de cáncer exacto usando los ensayos de la invención. En particular, si MMP-1 y MMP-7, pero ninguna de las otras dos proteasas se detectan por los ensayos de la invención, el pronóstico de cáncer es para supervivencia celular/progresión de tumor. Si uPA y MMP-7 se detectan por los ensayos (pero no MMP-1 o MMP-2) , el pronóstico es para angiogénesis . Si se detectan todas las cuatro proteasas, el pronóstico es para invasión y metástasis eventual. Por consiguiente, las mediciones in vivo de estas cuatro proteasas hacen posible la determinación espacialmente resuelta de la progresión de tejido canceroso, y permiten un pronóstico más detallado que puede guiar el tratamiento hacia los tumores más activo en el cuerpo.

En la presencia de la proteasa, la secuencia de consenso del montaje de nanoplataforma es escindida, y el cambio causado por esta escisión se detecta por los ensayos de retrodispersión de luz y MRI de la invención. Por consiguiente, dependiendo de las proteasas de objetivo por la nanoplataforma, resultarán dos o más de las siguientes secuencias: KGGVPMS (SEC ID NO: 43), MRGGGC (SEC ID NO: 44), KGGIPVS (SEC ID NO: 45), LRSGGC (SEC ID NO: 46), KGGVPLS (SEC ID NO: 47), LTMGGC (SEC ID NO: 48), KGGGSGR (SEC ID NO: 49), SAGGGC (SEC ID NO: 50), CGGGSGR (SEC ID NO: 51), SAGGC (SEC ID NO: 52), DGGSGR (SEC ID NO: 53), SAGGK (SEC ID NO: 54), SRSRSRSRSRSGR (SEC ID NO : 55), KGGSGR (SEC ID NO: 56), SAGGD (SEC ID NO: 57), SAGGG (SEC ID NO: 69), DGGGSGR (SEC ID NO: 70), SAGGGD (SEC ID NO: 71), DGAGSGR (SEC ID NO: 72) (y variantes de las mismas las cuales se pueden suprimir en el N-terminal por 1 residuo), SAGAGD (SEC ID NO: 73) (y variantes de la misma las cuales se pueden suprimir en el C-terminal por 1 residuo), HHHGAGVPMS (SEC ID NO: 88)*, MRGAG (SEC ID NO: 89), HHHGAGIPVS (SEC ID NO: 90)*, LRSGAG (SEC ID O: 91), HHHGAGSGR (SEC ID NO: 92)*, HHHGAGRPFS (SEC ID NO: 93)*, MIMGAG (SEC ID NO: 94), HHHGAGVPLS (SEC ID NO: 95)*, LTMGAG (SEC ID NO : 96), HHHGAGVPLS (SEC ID NO : 97)*, LYSGAG (SEC ID NO: 98), HHHGAGGAAN (SEC ID NO: 99)*, LVRGGAG (SEC ID NO: 100), HHHGAGPQGLA (SEC ID NO: 101)*, GQRGIVGAG (SEC ID NO: 102), HHHGAGSLLKSR (SEC ID NO: 103)*, MVPNFNGAG (SEC ID NO: 104), HHHGAGSLLIFR (SEC IC NO: 105)*, S ANFNGAG (SEC ID NO: 106), HHHGAGSGWIA (SEC ID NO: 107)*, TVIVITGAG (SEC ID NO: 108), HHHGAGPR (SEC ID NO: 109)*, o AGAG (SEC ID NO: 110), donde * indica variantes de secuencia incluidas donde la secuencia se puede suprimir por 1, 2 o 3 residuos en el N-terminal .

Estructuras de Nanoplataforma Las nanoplataformas enlazadas preferiblemente serán usadas para la detección de proteasa (por ejemplo, agentes de contraste de RI o retrodispersión de luz) . Las nanoplataformas de diagnóstico se pueden enlazar de varias formas. En una modalidad, los montajes de nanoplataforma comprenderán al menos dos nanoplataformas enlazadas conjuntamente vía uno o más enlaces de oligopéptido . Como se señaló previamente, los enlaces de oligopéptido se pueden enlazar directamente a las nanopartículas de las nanoplataformas respectivas, o a una o más monocapas que rodean la nanopartícula . Las nanopartículas pueden caracterizar grupos funcionales químicamente unidos, tales como etiquetas de biotina o porfirinas. Tales grupos funcionales se pueden unir directamente a la nanopartícula o capa protectora, o se pueden unir a la nanopartícula (con o sin una monocapa) vía un enlace de oligopéptido . La Fig. 3 ilustra (no a escala) dos nanoplataformas que comprenden nanopartículas de Fe/Fe304 superparamagnéticas enlazadas por un enlace de oligopéptido que comprende una secuencia de consenso para urocinasa. ' P' representa porfirina (tal como tetra-4 -carboxifenil porfirina, TCPP) , la cual se enlaza al recubrimiento furtivo de las nanopartículas de Fe/Fe304.

En algunas modalidades, múltiples nanopartículas se pueden unir a una estructura central vía uno o más enlaces de oligopéptido. Las estructuras centrales adecuadas se seleccionan del grupo que consiste de nanopartículas y porfirinas. La Fig. 4 representa el enlace de dos nanoplataformas que utilizan una estructura central de porfirina que presenta cuatro secuencias de escisión unidas al recubrimiento furtivo de las nanopartículas. Las múltiples nanoplataformas también se pueden enlazar conjuntamente para formar complejos oligoméricos , como se muestra en la Fig. 49. Estos oligómeros de nanopartículas o nanoplataformas pueden comprender adicionalmente partículas diferentes de las nanopartículas (descritas posteriormente) como parte de la matriz oligomérica. Las nano lataformas también se pueden funcionalizar como se discute en la presente.

Se apreciará que los diversos componentes de las plataformas teranósticas se pueden ensamblar en diferentes órdenes. Por ejemplo, las nanopartículas pueden ser recubiertas furtivas, y luego enlazar vía la secuencia de oligopéptido . Igualmente, los ligandos primero se pueden enlazar vía un oligopéptido que comprende la secuencia de escisión de objetivo y luego se unen a las nanopartículas. La Fig. 5 ilustra este proceso. La porfirina se puede unir a la capa de ligando antes o después del recubrimiento. A pesar de todo, la distancia entre las nanoplataformas enlazadas preferiblemente es desde aproximadamente 5 nm a aproximadamente 70 nm, y más preferiblemente desde aproximadamente 10 nm a aproximadamente 30 nm.

Las nanoplataformas para tratamiento terapéutico de tejidos cancerosos preferiblemente no serán enlazadas. Estos nanodispositivos preferiblemente comprenderán una nanopartícula de núcleo/cubierta y un recubrimiento de ligando furtivo. En algunas modalidades, las nanoplataformas también incluirán preferiblemente una capa protectora de siloxano. Aún más preferiblemente, las nanoplataformas presentarán grupos funcionales químicamente unidos, tales como porfirinas, etiquetas de biotina, y combinaciones de las mismas. De nuevo, los componentes de las nanoplataformas se pueden ensamblar en varios órdenes. Las nano lataformas terapéuticas son particularmente adecuadas para tratamiento de hipertermia de tej idos cancerosos .

Sin considerar el método de detección o tratamiento, para uso in vivo, las nanoplataformas preferiblemente se biodegradan después de aproximadamente 2 días a aproximadamente 5 días, y se depuran de los sistemas del paciente después de aproximadamente 10 días. Más preferiblemente, las nanoplataformas que comprenden capas protectoras de siloxano se biodegradarán después de aproximadamente 5 días a aproximadamente 15 días, y se depuran de los sistemas del paciente después de aproximadamente 30 días. A la inversa, las nanoplataformas preferiblemente permanecerán in vivo sin biodegradación por al menos un período de 2 días después de la administración.

Además, cuando se usan in vivo, las nanoplataformas preferiblemente no se coagulan, sino permanecen como distintas nanoestructuras individuales o enlazadas. Además, cuando se usan in vivo, la mayoría de las nanoplataformas administradas preferiblemente serán absorbidas y localizadas en el tejido canceroso. Es decir, solamente pequeñas cantidades de las nanoplataformas se encontrarán en tejidos saludables, tales como el hígado o bazo. Por ejemplo, cuando 150 ig de nanoplataformas se administran por inyección IV, al menos aproximadamente 50% de las nanoplataformas administradas totales preferiblemente se localizarán en el tejido objetivo (tumor), mientras menos de aproximadamente 10% de las nanoplataformas preferiblemente se localizarán en tejidos saludables. Cuando se administran 500 pg de nanoplataformas (2 inyecciones IV consecutivas de 250 pg cada una dentro de 24 horas) , al menos aproximadamente 30% a aproximadamente 50% de las nanoplataformas administradas totales se localizarán en el tejido objetivo (tumor) .

Partículas En algunas modalidades, una nanoplataforma será enlazada a una partícula (en lugar de una segunda nanoplataforma, como se describió anteriormente) . Por ejemplo, la capa protectora de ligando de la nanoplataforma se puede enlazar vía un enlace de oligopéptido (por ejemplo, SEC ID NO: 66 variante) a una partícula, tal como TCPP, mostrada a continuación.

Estas modalidades son particularmente útiles para ensayos y métodos para monitorear el progreso de tratamiento de cáncer en un mamífero. Un número de diferentes tipos de partículas se pueden usar para medir la actividad de proteasa, como se discute con más detalle a continuación. Preferiblemente, las máximas espectrales de excitación y emisión de las partículas están entre 650 y 800 nm. Las partículas preferidas para el uso en los ensayos de diagnóstico se seleccionan del grupo que consiste de cromóforos/luminóforos (tintes) , puntos cuánticos, viológenos, y combinaciones de los mismos. 1. Cromóforos/Luminóforos Las partículas de cromóforo/luminóforo adecuadas para el uso en los ensayos de la invención incluyen cualquier tinte orgánico o inorgánico, fluoróforos, fosfóforos, nanopartículas que absorben luz (por ejemplo, Au, Ag, Pt, Pd) , combinaciones de los mismos, o los complejos metalados de los mismos. Preferiblemente, las partículas de cromóforo/luminóforo tienen un tamaño menor de aproximadamente 100 nm.

Los tintes orgánicos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de cumarinas, pireno, cianinas, bencenos, N-metilcarbazol, eritrosina B, N-acetil-L-triptofanamida, 2 , 5-difeniloxazol , rubreno, y N- (3-sulfopropil) acridinio. Los ejemplos específicos de cumarinas preferidas incluyen 7-aminocumarina , 7 -dialquilamino cumarina, y cumarina 153. Los ejemplos de bencenos preferidos incluyen 1,4 -bis (5-feniloxazol-2- il) benceno y 1 , 4 -difenilbenceno . Los ejemplos de cianinas preferidas incluyen oxacianinas, tiacianinas, indocianinas , raerocianinas , y carbocianinas . Otras cianinas ejemplares incluyen ECL Plus, ECF, C3-0xacianina, Tinte C3-Tiacianina (EtOH) , Tinte C3-Tiacianina (PrOH) , C5-Indocianina, C5-0xacianina, C5-Tiacianina, C7-Indocianina, C7-0xacianina, CypHer5, Tinte-33, Cy7, Cy7.5, Cy5.0, Cy5.5 , Cy3Cy5 ET, Cy3B, Cy3.0 , Cy3.5 , Cy2 , CBQCA, NIR1, NIR2 , NIR3 , NIR4, NIR820, SNIR1 , SNIR2 , SNIR4 , Merocianina 540, Yoduro de Pinacianol, Yoduro de 1, l-dietil-4 , 4-carbocianina, Stains All, Tinte-1041, o Tinte-304.

Los tintes de cianina son tintes orgánicos particularmente preferidos para el uso en las nanoplataformas . El tinte de cianina fluorescente se ata a la nanopartícula y experimenta rápido enfriamiento de fluorescencia por el plasmón del núcleo de Fe(0) . Esto se observa siempre que la atadura es menor que el radio Fórster del tinte de cianina (5-6 nm para Cy3.0 y Cy3.5, 6-7 nm para Cy5.0 y Cy5.5 , y aproximadamente 7 nm para Cy7 y Cy7.5 ) . La longitud máxima de la atadura, que consiste del ligando (-2.84 nm) y no más de 12 residuos aminoácido en las secuencias de escisión (hasta 4 nm) indica que las secuencias de escisión más cortas (uPA y MMP's) son adecuadas para el uso con tintes Cy3.x y Cy5.x, mientras que las catepsinas son preferiblemente enlazadas a tintes Cy5.x y Cy7.x para permitir el enfriamiento óptimo de los tintes de cianina atados. Para todas las cianinas, sus máximas emisiones son desplazadas al rojo con respecto a la autoflorescencia de la orina humana. Múltiples cianinas se pueden enlazar a una nanopartícula única para crear nanoplataformas de oligoplexión, como se muestra en la Fig. 47, para medir la actividad de hasta cuatro enzimas simultáneamente. Todos los cuatro tintes en la región UVA o azul del espectro electromagnético se pueden excitar simultáneamente, o cada tinte se puede excitar individualmente. Todos los tintes de cianina tienen una máxima excitación, la cual es desplazada al azul por 20-25 nm con respecto a su máxima emisión (típica para estados de singlete fluorescente) . Los espectros de emisión de NS-Cy3.0 (Aex = 538, Aem = 560), NS-Cy5.5 (Aex = 639, Aem = 660), NS-Cy7.0 (Aex = 740, Aem = 760) y NS-Cy7.5 (Aex = 808, Aem = 830) se muestran en la Fig. 48.

Los tintes inorgánicos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de porfirinas metaladas y no metaladas, ftalocianinas , clorinas (por ejemplo, clorofila A y B) , y cromóforos metalados. Las porfirinas preferidas se seleccionan del grupo que consiste de tetracarboxi - fenil-porfirina (TCPP) y Zn-TCPP. Los cromóforos metalados preferidos se seleccionan del grupo que consiste de complejos de rutenio polipiridilo, complejos de osmio polipiridilo, complejos de rodio polipiridilo, complejos de 3-(l-metilbenzoimidazol-2-il) -7- (dietilamino) -cumarina de iridio (III), y complejos de 3- (benzotiazol-2-il) -7- (dietilamino) -cumarina con iridio(III).

Los fluoróforos y fosfóforos adecuados se seleccionan del grupo que consiste de tintes fosforescentes, fluoresceínas , rodaminas (por ejemplo, rodamina B, rodamina 6G) , y antracenos (por ejemplo, 9-cianoantraceno, 9,10-difenilantraceno, l-Cloro-9, 10-bis (fenil-etinil) antraceno) . 2. Puntos Cuánticos Un punto cuántico es un semiconductor compuesto de átomos de elementos de los grupos II-VI o III-V de la tabla periódica (por ejemplo, CdSe, CdTe, InP) . Las propiedades ópticas de los puntos cuánticos se pueden manipular sintetizando (usualmente estabilizando) una cubierta. Tales puntos cuánticos se conocen como puntos cuánticos de núcleo-cubierta (por ejemplo, CdSe/ZnS, InP/ZnS, InP/CdSe) . Los puntos cuánticos del mismo material, pero con diferentes tamaños, pueden emitir luz de diferentes colores. Su brillantez se atribuye a la cuantificación de los niveles de energía debido al confinamiento de un electrón en todas las tres dimensiones espaciales. En un semiconductor volumétrico, un par de electrón-agujero se une dentro del radio de excitón de Bohr, lo cual es una característica para cada tipo de semiconductor. Un punto cuántico es menor que el radio de excitón de Bohr, lo cual causa la apariencia de niveles de energía discretos. La abertura de banda, ??, entre la banda de valencia y conducción del semiconductor es una función del tamaño y forma del nanocristal. Los puntos cuánticos presentan rendimientos de cuantos de luminiscencia ligeramente menores que los fluoróforos orgánicos tradicionales pero tienen secciones transversales de absorción mucho más grandes y velocidades de fotoblanqueado muy bajas. Los coeficientes de extinción molar de puntos cuánticos son aproximadamente 105 - 106 NT1 cm"1, lo cual es 10-100 veces más grande que los tintes.

Los puntos cuánticos de núcleo/cubierta tienen cubiertas de abertura de banda mayores alrededor de sus núcleos de abertura de banda menores, los cuales emiten luz sin alguna absorción por la cubierta. La cubierta pasiva la emisión no radiante superficial del núcleo mejorando el rendimiento de cuanto de fotoluminiscencia y previniendo la degradación natural. La cubierta de puntos cuánticos tipo 1 (por ejemplo, CdSe/ZnS) tiene una banda de conducción de energía mayor y una banda de valencia de energía menor que aquella del núcleo, resultando en el confinamiento tanto del electrón como agujero en el núcleo. Las bandas de conducción y valencia de la cubierta de puntos cuánticos tipo II (por ejemplo, CdTe/CdSe, CdSe/ZnTe) son ya sea ambas menores o ambas mayores de energía que aquellas del núcleo. Por consiguiente, los movimientos del electrón y el agujero se restringen a una dimensión. La recombinación radiante del excitón en la interfaz de núcleo-cubierta causa la emisión tipo II. Los puntos cuánticos tipo II se comportan como semiconductores indirectos cercanos a los bordes de banda y por lo tanto, tienen una cola de absorción en el rojo y casi infrarrojo. También se pueden usar puntos cuánticos semiconductores aleados (CdSeTe) , aunque son más preferidos los tipos I y II. La composición de aleación y estructura interna, las cuales se pueden variar, permite afinar las propiedades ópticas sin cambiar el tamaño de las partículas. Estos puntos cuánticos se pueden usar para desarrollar sondas fluorescentes casi infrarrojas para ensayos biológicos in vivo ya que pueden emitir hasta 850 nm.

Los puntos cuánticos particularmente preferidos se seleccionan del grupo que consiste de puntos cuánticos de núcleo/cubierta de CdSe/ZnS, puntos cuánticos de núcleo/cubierta de CdTe/CdSe, puntos cuánticos de núcleo/cubierta de CdSe/ZnTe, y puntos cuánticos semiconductores aleados (por ejemplo, CdSeTe) . Los puntos cuánticos son preferiblemente suficientemente pequeños para ser descargados vía la trayectoria renal cuando se usan in vivo. Más preferiblemente, los puntos cuánticos son menores de aproximadamente 10 nm de diámetro, aún más preferiblemente desde aproximadamente 2 nm a aproximadamente 5.5 nm de diámetro, y muy preferiblemente desde aproximadamente 1.5 nm a aproximadamente 4.5 nm de diámetro. Si es necesaria la emisión de diferente color para crear sensores múltiples (detección múltiple) , esto se puede lograr cambiando el tamaño del núcleo de punto cuántico produciendo diferentes longitudes de onda de emisión. Los puntos cuánticos. se pueden estabilizar o no estabilizar como se discutió anteriormente con respecto a las nanopartículas . Los ligandos preferidos para estabilizar puntos cuánticos son resorcinarenos .

Suministro Celular En algunas modalidades, las nanoplataformas y montajes se pueden cargar en células para suministro dirigido de las células al tejido canceroso. Para cada uno de los métodos discutidos en la presente, el suministro in vivo al tejido canceroso se puede realizar usando suministro celular. El suministro celular es un método de suministro particularmente preferido para el tratamiento de hipertermia magnética, discutido en la presente. Las células adecuadas para suministrar las nanoplataformas a los tejidos cancerosos incluyen cualquiera de las células de tumor trópico. Las células preferidas incluyen células madre, monocitos, macrófagos, y combinaciones de las mismas. Las células madre particularmente adecuadas para el suministro selectivo al tejido canceroso incluyen células madre neurales (NSCs, por sus siglas en inglés) , células madre de matriz de cordón umbilical, células madre de médula ósea, y células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo. En una modalidad, las células se cargan con montajes y nanoplataformas de hierro/óxido de hierro incubando las células en un medio de cultivo adecuado (tal como suero bovino fetal (FBS, por sus siglas en inglés) ) que contiene las nanoplataformas y montajes a un nivel que proporciona una concentración de Fe total desde aproximadamente 1 mg/1 a aproximadamente 250 mg/1 (y preferiblemente desde aproximadamente 10 mg/1 a aproximadamente 100 mg/1) por aproximadamente 1 a aproximadamente 72 horas (y preferiblemente por aproximadamente 12 a aproximadamente 24 horas) . Preferiblemente, la cantidad de Fe cargado en cada célula es desde aproximadamente 0.1 pg (picogramos) por célula a aproximadamente 10 pg/célula (y más preferiblemente desde aproximadamente 1 pg/célula a aproximadamente 5 pg/célula).

Los Métodos de la Invención Una ventaja de las nanoplataformas de la invención es la flexibilidad para adaptar los nanodispositivos y ensayos modificando las nanopartículas , partículas, capas protectoras, o grupos funcionales para adaptar la tecnología de sensor disponible, e igualmente, usando una variedad de tecnologías de sensor para detectar la actividad de enzima en tejidos cancerosos. Ventajosamente, las mismas nanoplataformas también se pueden usar para el tratamiento terapéutico dirigido del tejido canceroso.

Las nanoplataformas se pueden usar para detectar células pre-cancerosas o cancerosas asociadas con un cáncer seleccionado del grupo que consiste de un cáncer relacionado con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer del apéndice, astrocitoma cerebelar infantil, astrocitoma cerebral infantil, carcinoma celular basal , cáncer del conducto biliar extrahepático, glioma del tallo cerebral infantil, tumor cerebral en adultos, glioma maligno infantil, ependimoma infantil, meduloblastoma infantil, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales infantiles, glioma hipotalámico y de trayectoria visual infantil, cáncer de mama, cáncer de mama relacionado con el embarazo, cáncer de mama infantil, cáncer de mama masculino, tumor carcinoide infantil, tumor carcinoide gastrointestinal, linfoma del sistema nervioso central primario, cáncer cérvico, cáncer de colon, cáncer colorrectal infantil, cáncer esofágico, cáncer esofágico infantil, melanoma intraocular, retinoblastoma, glioma en adultos, cáncer hepatocelular (primario) en adultos, cáncer hepatocelular (primario) infantil, linfoma de Hodgkin en adultos, linfoma de Hodgkin infantil, tumores de células de isleta, sarcoma de Kaposi, cáncer renal (células renales) , cáncer renal infantil, cáncer hepático (primario) en adultos, cáncer hepático (primario) infantil, cáncer hepático de célula no pequeña, cáncer hepático de célula pequeña, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma No de Hodgkin en adultos, linfoma No de Hodgkin infantil, linfoma del sistema nervioso central primario, melanoma, mesotelioma maligno en adultos, mesotelioma infantil, cáncer de cuello escamoso metastásico con cáncer de boca primario oculto, síndrome de neoplasia endocrina múltiple infantil, neoplasma de célula de plasma/mieloma múltiple, micosis fungoides, síndromes mielodisplásicos , enfermedades mielodisplásicas/ mieloproliferativas , leucemia mieloide aguda en adultos, leucemia mieloide aguda infantil, mieloma múltiple, neuroblastoma, cáncer pulmonar de célula no pequeña, cáncer de ovarios infantil, cáncer epitelial de ovarios, tumor de célula germinal de ovarios, tumor de ovarios de bajo potencial maligno, cáncer pancreático, cáncer pancreático infantil, cáncer pancreático de célula de isleta, cáncer de paratiroides , cáncer de pene, neoplasma de célula de plasma/mieloma múltiple, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer de célula renal infantil, cáncer de célula transicional , uretra y pelvis renal, sarcoma de tejido blando en adultos, sarcoma de tejido blando infantil, -sarcoma uterino, cáncer de piel (sin melanoma), cáncer de piel infantil, melanoma, carcinoma de piel de célula Merkel, cáncer pulmonar de célula pequeña, cáncer de intestino delgado, carcinoma de célula escamosa, cáncer de estómago, cáncer de estómago infantil, linfoma de célula T cutánea, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de tiroides infantil, y cáncer vaginal.

Los montajes también se pueden usar para monitorear la progresión del tratamiento de cáncer en un mamífero.

Para cada uno de los métodos in vivo discutidos a continuación, las nanoplataformas se pueden administrar usando cualquier método adecuado, incluyendo sin limitación, intravenosamente, subcutáneamente, o vía inyección localizada directamente en o cerca del sitio del tumor (es decir, intratumoral o peritumoral) . Estas rutas de administración también son adecuadas para uso en conjunto con los métodos de suministro celular o liposomal discutidos en la presente.

Detección e Imágenes 1. Imágenes de Resonancia Magnética En un aspecto de la invención, las nanoplataformas de la invención funcionan sobre la base de tiempos de relajación de espín de protones (1H) en muestras biológicas o tejidos. Las nanoplataformas de diagnóstico funcionan como agentes de contraste de MRI , los cuales alteran los tiempos de relajación ?? y/o T2 de los núcleos de 1H en el tejido o muestra. Para imágenes in vivo, esto cambia la intensidad de señal del tejido que se captura en imágenes. El ensayo de nanoplataforma enlazada, o composición que comprende las nanoplataformas enlazadas, preferiblemente se administra a un mamífero usando un portador farmacéuticamente aceptable. La nanoplataforma se puede administrar por inyección intravenosa (iv) en la corriente sanguínea. Preferiblemente, aproximadamente 200 µ9 de nanoplataformas enlazadas se administran por inyección IV. Alternativamente, las nanoplataformas enlazadas disueltas en un amortiguador acuoso (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS, por sus siglas en inglés) ) se pueden administrar por inyección a una región localizada, tal como directamente en o cerca del sitio del tumor. También se puede usar el suministro liposomal, incluyendo liposomas termolábiles . También se puede usar el suministro celular.

La adquisición de datos por MRI puede iniciar casi inmediatamente después de la inyección. La adquisición de datos por MRI preferiblemente comienza una vez que los agentes de contraste de nanoplataforma se han absorbido por las células cancerosas y se localizan en el área objetivo del cuerpo o muestra. La concentración del ensayo de nanoplataforma en el tejido objetivo preferiblemente es dése aproximadamente 1 µg/g de tejido a aproximadamente 1,000 pg/g de tejido, y más preferiblemente desde aproximadamente 10 ug/g de tejido a aproximadamente 250 µg/g de tejido. Los datos significativos preferiblemente de adquieren después de aproximadamente 15 minutos a aproximadamente 24 horas después de la inyección de los ensayos de nanoplataforma enlazada, y más preferiblemente después de aproximadamente 30 min a aproximadamente 5 horas, dependiendo de cuándo pertenece la adquisición de datos. Los impulsos de RF cortos se transmiten en la región o muestra de interés. Las secuencias de impulso se pueden modificar dependiendo si el contraste de tejido será determinado principalmente por las diferencias de Ti (imagen ponderada en Ti) o T2 (imagen ponderada en T2) . El análisis y colección de datos automática se pueden implementar usando un programa de computadora (es decir, algoritmo) para valorar, preferiblemente en tiempo real, los datos transmitidos o colectados de la máquina de MRI . Los parámetros de secuencia de impulso se pueden ajustar adicionalmente por el operador de la máquina para maximizar el contraste.

Una secuencia preferida para uso en el método de la invención -es una secuencia de espín eco de Carr-Purcell Meiboom-Gill . Esta secuencia usa un impulso de excitación de 90° seguido por un tren de ecos inducido por una serie de impulsos de reenfoque de 180° separados por un arreglo de tiempos establecido por el usuario para lograr el completa decrecimiento de la señal. Los datos se adquieren durante el espín eco. Las secuencias de espín eco de CPMG producen imágenes ponderadas en T2. El proceso de adquisición de datos por MR y secuencia de impulso se puede repetir tantas veces como sea necesario para colectar múltiples conjuntos de datos durante un período dado de tiempo hasta que las nanoplataformas comienzan a biodegradarse (al menos aproximadamente 2 días, y preferiblemente desde aproximadamente 5-15 días cuando se usa una capa protectora de siloxano) . Se apreciará que el número total y frecuencia de las exploraciones de MRI repetitivas depende de la instrumentación usada. Ventajosamente, los resultados se pueden leer dentro de aproximadamente 1 hora después de la administración de las nanoplataformas . Estos conjuntos de datos luego se pueden comparar para determinar cualquier cambio. En la presencia de la proteasa objetivo, el enlace de oligopéptido entre las nanoplataformas se escinde, separando las nanoplataformas . Como una consecuencia, un cambio dramático en T2 preferiblemente será observado en los datos de MRI con el tiempo. En general, cuanto mayor el cambio observado en T2, tanto más activo el tejido canceroso. Preferiblemente, un cambio en T2 mayor de aproximadamente un factor de 5 (preferiblemente desde aproximadamente 5 a aproximadamente 10) se correlaciona con un cáncer de desarrollo, y más preferiblemente, un cambio de T2 mayor de aproximadamente un factor de 10 se correlaciona con un cáncer activo (metastásico) . Es particularmente preferido que los valores de Ti observados permanezcan sustancialmente sin cambio .

Los agentes de contraste de MRI de la invención preferiblemente tienen relaj abilidades de ri mayores de aproximadamente 100 mM"1 s"1 para mejoramiento de ?? y una r2 con un número entero mayor de aproximadamente -2,000 mM^s"1 (es decir -3,000 mM^s"1 se considera que es mayor que -2,000 mM^s"1) para disminución de T2.

La fuerte ponderación en Ti se puede lograr usando un impulso de recuperación de inversión. En esta secuencia, las secuencias de adquisición se preceden por un impulso de RF de 180°, el cual invierte la magnetización longitudinal. La señal luego se adquiere durante la recuperación de la magnetización longitudinal hacia el equilibrio. El intervalo entre el impulso de inversión y la primera secuencia de adquisición se llama el tiempo de inversión, TI. La velocidad de recuperación es inversamente proporcional a Ti.

Los datos adquiridos luego se pueden usar para generar una imagen. Más específicamente, dependiendo de la secuencia de impulso usada, una computadora utiliza un programa de software para construir la imagen con base en los datos. Los aparatos y programas de MR adecuados son conocidos en el arte. Se apreciará que el cambio de ?? o T2 causado por la escisión de la secuencia de proteasa es visualmente perceptible como contraste incrementado y cambia en las imágenes con el tiempo. Por ejemplo, la adquisición de datos se puede establecer para hacer tiempos T2 largos más brillosos en la imagen generada, o los tiempos T2 cortos se pueden establecer para dar una imagen más brillosa. En general, es preferido que la señal más fuerte sea correlacionada con una imagen más brillosa. En otro ejemplo, la adquisición de datos se puede establecer de modo que los tiempos T2 más cortos (inducidos por el ensayo de MRI de la invención) aparecen más brillosos en la imagen generada. Alternativamente, los valores de T2 pueden ser codificados de color, por ejemplo para mostrar el rojo en la imagen. Cuando el ensayo reacciona, los valores de T2 más cortos llegan a ser cada vez más rojos en las imágenes generadas con el tiempo. Se apreciará que un número de diferentes parámetros se pueden manipular por el operador de MRI para acumular suficiente información para construir las imágenes en un número de diferentes maneras.

Ventajosamente, la MRI permite la medición in-situ espacialmente resuelta de la actividad de proteasa e imágenes del tejido canceroso en cualquier parte en el cuerpo. El tiempo in vivo incrementado del ensayo también permite la detección de niveles de proteasa mucho menores, permitiendo la detección muy temprana de células cancerosas o precancerosas . Además, diferente de los agentes de contrastes de gadolinio, no se requiere un contraste directo entre el agua in vivo y el agente de contraste de MRI de nanoplataforma para observar suficientes contrastes de MRI con la invención, especialmente en imágenes ponderadas en T2.

De acuerdo con una modalidad adicional, se proporciona un método para diagnosticar la progresión de la enfermedad. En el método, se administra una nanoplataforma de diagnóstico que comprende una secuencia de escisión de consenso para urocinasa (SGRSA, SEC ID NO: 2), y los datos de MRI se adquieren como se describió anteriormente. Si la actividad de urocinasa se encuentra en el ensayo de MRI, entonces una nanoplataforma de diagnóstico que emplea una secuencia de consenso para matrilsina (MMP-7) se inyecta intravenosamente dos días después, seguida por la adquisición de datos de MRI. Si se detecta la actividad de matrilsina, el pronóstico es para angiogénesis o metástasis. Para confirmación, una nanoplataforma que comprende una secuencia de consenso para colagenasa (MMP-1) se inyecta intravenosamente dos días después. Si el ensayo es negativo, el pronóstico es para angiogénesis. Si el ensayo es positivo, el pronóstico es para metástasis. Si el primer ensayo de MRI de urocinasa fue negativo, entonces un fármaco de imágenes de MRI sensible a colagenasa (MMP-1) se administra después de dos días. Ventajosamente, empleando instrumentación de MRI moderna (B>>2Tesla) , una resolución de milímetros se puede lograr cuando se captura en imágenes el tejido canceroso que está sobre-expresando las proteasas relacionadas con el cáncer. Este tejido luego puede ser ya sea extirpado o tratado por hipertermia como método de tratamiento único o en combinación con un fármaco anti-cáncer que se suministra por un nanogel termosensible, liposoma o micela. El tiempo de ensayo también puede estar correlacionado con el pronóstico.

En general, cuanto más agresivo el cáncer, tanto mayor la concentración de una proteasa dada, significando que los cambios observados en r2/r1 serán más rápidos. 2. Retrodispersión de Luz En un aspecto adicional de la invención, las nanoplataformas de la invención funcionan sobre la base de la retrodispersión de luz. La dispersión de luz es un proceso físico donde una onda de luz entrante será reflejada (no absorbida) por una superficie. En contraste con los métodos de detección de fluorescencia/fosforescencia donde se requiere la absorción y re-emisión de luz, no ocurre absorción de luz durante la dispersión. Esto también significa que la frecuencia de la onda electromagnética dispersada sigue siendo la misma. Para superficies macroscópicas, el comportamiento de reflexión se puede describir por la ley de reflexión. Para partículas nanoscópicas sin embargo, la reflexión es un proceso mucho más complejo como se discutió previamente. Preferiblemente, los ensayos de nanoplataforma se pueden realizar in vitro e in vivo. El ensayo de retrodispersión de luz es particularmente ventajoso para la detección e imágenes de cánceres superficiales tales como melanomas. a. Métodos in vitro Los ensayos de nanoplataforma se pueden usar para detectar la actividad de proteasa en una muestra de fluido que comprende un fluido biológico, tales como muestras de orina o sangre de un animal. En un aspecto, se colecta una muestra de orina del mamífero y se mezcla físicamente con un ensayo de nanoplataforma enlazada. Preferiblemente, la concentración de la nanoplataforma en la orina es desde aproximadamente 10 a aproximadamente 1,000 ]ig de nanoplataforma por mi de orina, y más preferiblemente desde aproximadamente 50 a aproximadamente 250 yg de nanoplataforma por mi de orina. La excitación preferiblemente se realiza con una fuente de energía de longitud de onda apropiada seleccionada del grupo que consiste de una fuente de luz policromática, láser y diodo láser. La longitud de onda usada dependerá de las partículas usadas en el montaje de nanoplataforma . Preferiblemente, los intervalos de longitud de onda entre aproximadamente 200 nm y aproximadamente 1,000 nm. La luz retrodispersada tendrá la misma frecuencia que la fuente de energía entrante. La pérdida de las señales retrodispersadas cuando la proteasa en la muestra de orina escinde los enlaces de oligopéptido será observada como un cambio en la extinción óptica durante un período de tiempo desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 24 horas, y más preferiblemente desde aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1 hora. En la presencia de la proteasa, se observará un cambio típico en la extinción óptica de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 1. Por consiguiente, en el método de la invención, este cambio en la extinción óptica preferiblemente indica la presencia de una célula cancerosa o precancerosa en el mamífero. La sangre se puede colectar del mamífero y analizar de la misma manera como la orina como se discutió anteriormente.

Estos resultados de ensayo (del fluido biológico) luego se pueden correlacionar con un pronóstico para progresión de cáncer, con base en la actividad de proteasa específica detectada, como se discutió anteriormente con respecto a las proteasas preferidas, uPA, MMP-1, MP-2, y MMP-7, o con base en la velocidad del ensayo, como se discute a continuación. b. Métodos in vivo En una modalidad alternativa, la detección de la actividad de proteasa usando las nanoplataformas enlazadas se puede hacer in vivo en un mamífero. El ensayo de nanoplataforma de diagnóstico, o composición que comprende el ensayo, preferiblemente se administra usando un portador farmacéuticamente aceptable (es decir, amortiguador o liposoma) . El ensayo se puede administrar intravenosamente por inyección en la corriente sanguínea. Alternativamente, el ensayo disuelto en un amortiguador acuoso (por ejemplo, solución salina amortiguada con fosfato (PBS) ) se puede administrar por inyección a una región localizada, tal como directamente en o cerca del sitio de tumor. La nanoplataforma se utiliza preferiblemente a una concentración desde aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 ]ig por mi de PBS, y más preferiblemente desde aproximadamente 200 a aproximadamente 500 ig por mi de PBS. También se puede usar el suministro liposomal, incluyendo liposomas termolábiles . También se puede usar el suministro celular.

Una vez que el ensayo de nanoplataforma enlazada está en la cercanía del tejido canceroso, la excitación será dirigida a la región de interés usando una fuente de energía seleccionada del grupo que consiste de una fuente de luz policromática, láser, y diodo láser. Cuando el haz de luz o láser entra al tejido, la luz retrodispersada preferiblemente se registra vía un dispositivo de fibra óptica. La luz retrodispersada tendrá la misma frecuencia como la luz entrante, y la señal será mucho más fuerte (hasta desde aproximadamente 2 a aproximadamente 100 veces más fuerte) en la presencia de las nanoplataformas enlazadas que en su ausencia. Por consiguiente, la señal preferiblemente es más fuerte en los tejidos cancerosos donde las nanoplataformas se agregan que en el tejido saludable circundante. La pérdida de las señales retrodispersadas cuando la proteasa en el tejido canceroso escinde los enlaces de oligopéptido será observada como un cambio en la extinción óptica durante un período de tiempo desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 24 horas, y más preferiblemente desde aproximadamente 2 minutos a aproximadamente 1 hora. Notablemente, la señal será más fuerte que en el tejido saludable. En la presencia de la proteasa, se observará un cambio típico en la extinción óptica de aproximadamente 0.05 a aproximadamente 1. Por consiguiente, en el método de la invención, este cambio en la extinción óptica preferiblemente indica la presencia de una célula cancerosa o precancerosa en el mamífero. Los resultados del ensayo luego se pueden correlacionar con un pronóstico para la progresión del cáncer, con base en la actividad de proteasa detectada, como se discute con más detalle a continuación.

Usando ya sea el método de sensor (in vitro o in vivo) , el tiempo de ensayo de la presente invención es dependiente de la concentración de proteasa presente en la muestra o tejido. Las velocidades de escisión incrementarán por 3-5 veces por orden de magnitud de incremento de concentración de proteasa. En la presencia de un tumor agresivo, el tiempo de ensayo puede ser tan rápido como una fracción de un segundo. En tejido saludable, puede tomar aproximadamente 24 horas que se detecte la actividad. Por consiguiente, cuanto más rápido el ensayo, tanto más agresivo el tumor, y cuanto mayor la probabilidad de potencial metastásico del tumor. El uso de oligopéptidos específicos de proteasa para la construcción de unos nanosensores in vivo basados en nanopartículas para la determinación del potencial metastásico de tumores sólidos permite al médico y cirujano dirigir los tumores más avanzados primero. Preferiblemente, cuando el ensayo se inyecta directamente en la región del tumor (o región de tumor sospechada) , los resultados se pueden determinar alrededor de 30 minutos después de la inyección. Cuando el ensayo se administra intravenosamente, los resultados se pueden leer dentro de aproximadamente 1 hora después de la administración de la IV (para permitir que el ensayo alcance la región objetivo) , y hasta 24 horas después de la administración. En cualquier caso, una vez que el ensayo está en las cercanías del tumor, la actividad de proteasa detectada dentro de 10 minutos se puede correlacionar con una alta probabilidad que el tumor sea agresivo. Preferiblemente, si ninguna actividad se detecta dentro de los primeros 30 minutos, hay una probabilidad muy baja que el tumor sea agresivo. Igualmente, para la prueba in vitro, la actividad de proteasa detectada dentro de 10 minutos se puede correlacionar con una alta probabilidad que el tumor sea agresivo, mientras que ninguna actividad dentro de los primeros 30 minutos después del contacto de la muestra con el ensayo se puede correlacionar con una probabilidad muy baja que el tumor sea agresivo. Esta velocidad de reacción proporciona una ventaja distinta sobre los métodos de detección los cuales tomar varias horas para la terminación del ensayo (y resultados) . 3. Sensores basados en FRET Las nanoplataformas también son adecuadas para métodos de detección basados en resonancia de plasmón de superficie y trans erencia de energía de resonancia de Fórster (FRET, por sus siglas en inglés) entre partículas no idénticas (es decir, nanopartículas o una nanopartícula y porfirina) . FRET describe la transferencia de energía entre dos partículas. La resonancia de plasmón de superficie se usa para excitar las partículas. Una partícula donadora inicialmente en su estado excitado, puede transferir esta energía a una partícula aceptora en proximidad cercana a través del acoplamiento dipolo-dipolo no radiante. Brevemente, mientras que las partículas se unen por el oligopéptido, la emisión de la aceptora se observa en la excitación de la partícula donadora. Una vez que la enzima escinde el enlace entre las partículas, se observa el cambio de FRET, y los espectros de emisión cambian. Solamente se observa la emisión de la donadora. Con más detalles, si ambas partículas están dentro de la distancia de Fórster así llamada, la transferencia de energía ocurre entre las dos partículas y se observa un desplazamiento al rojo de absorbancia y emisión. Durante este proceso ultrarrápido, la energía del estado electrónicamente excitado o plasmón de superficie de la primera partícula es al menos parcialmente transferida a la segunda partícula. Bajo estas condiciones, la luz se emite desde la segunda partícula. Sin embargo, una vez que la unión entre las dos partículas se escinde por la enzima, la luz se emite solamente desde la primera partícula y se observa un desplazamiento al azul distinto de absorción y emisión. Esto es debido a que la distancia entre ambas partículas generalmente incrementa. a. Métodos in vitro Las nanoplataformas se pueden usar para detectar la actividad de proteasa en una muestra de fluido que comprende un fluido biológico, tal como muestras de orina o sangre de un mamífero. En un aspecto, una muestra de orina se colecta del mamífero y se mezcla físicamente con el ensayo de nanoplataforma . Preferiblemente, la concentración del luminóforo en la orina es desde aproximadamente lxlO"4 a aproximadamente lxlO"10M, y más preferiblemente desde aproximadamente lxlO"5M a aproximadamente lxlO"8M. La excitación preferiblemente se realiza con una fuente de energía de longitud de onda apropiada seleccionada del grupo que consiste de una lámpara de tungsteno, diodo láser, y láser. La longitud de onda usada dependerá de las partículas usadas en el montaje de nanoplataforma . Preferiblemente, la longitud de onda varía entre aproximadamente 400 nm y aproximadamente 1,000 nm, y más preferiblemente entre aproximadamente 500 nm y 800 nm. Los cambios de absorción y emisión de las partículas cuando la proteasa en la muestra de orina escinde los enlazantes de oligopéptido se observarán durante un período de tiempo desde aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 30 minutos, y preferiblemente desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 10 minutos, cuando está en la presencia de un tumor agresivo. En la presencia de la proteasa, se observará un desplazamiento al azul de absorción y emisión típico de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nm. Por consiguiente, en el método de la invención, un desplazamiento al azul de máximo espectro de absorción o emisión entre 5 y 200 nm preferiblemente indica la presencia de una célula cancerosa o precancerosa en el mamífero .

La sangre se puede colectar del mamífero y analizar como la orina como se discutió anteriormente. Preferiblemente, la concentración del ensayo en la muestra de sangre es desde aproximadamente lxl0"4 M a aproximadamente lxlO"10 M, y más preferiblemente desde aproximadamente lxlO"5 M a aproximadamente lxlO"8 M. La longitud de onda usada dependerá de las partículas usadas en el montaje de nanoplataforma . Preferiblemente, la longitud de onda varía entre aproximadamente 500 nm y aproximadamente 1,000 nm, y más preferiblemente entre aproximadamente 600 nm y 800 nm. Más preferiblemente, la excitación se realiza usando excitación de multifotones a una longitud de onda de aproximadamente 800 nm con un láser de Ti-zafiro debido a la fuerte auto-absorción de la sangre. Los cambios de emisión serán observados durante un período de tiempo desde aproximadamente 1 segundo a aproximadamente 30 minutos, y preferiblemente desde aproximadamente 30 segundos a aproximadamente 10 minutos, cuando está en la presencia de un tumor agresivo. Como con la orina, en la presencia de la proteasa en la sangre, se observará un desplazamiento al azul de emisión típico de entre aproximadamente 5 y aproximadamente 200 nm. Esto preferiblemente indica la presencia de una célula cancerosa o precancerosa en el mamífero .

Estos resultados de ensayo (de orina o sangre) luego se pueden correlacionar con un pronóstico para la progresión del cáncer, con base en la actividad de proteasa específica detectada o la velocidad del ensayo, como se discutió anteriormente.

El ensayo también se puede usar para monitorear el progreso del tratamiento de cáncer en un paciente con el tiempo determinando la presencia y nivel de varias proteasas en la sangre u orina de un paciente durante o entre los tratamientos. Los ensayos se pueden realizar en una base diaria mientras el paciente está sometido al tratamiento y los niveles de actividad de proteasa en comparación entre los niveles iniciales y subsecuentes. Igualmente, los ensayos se pueden realizar periódicamente (es decir, en una base mensual) después que un paciente ha entrado en recuperación para facilitar la detección temprana de reocurrencia de cáncer. Por consiguiente, el ensayo puede ayudar a determinar si el cáncer está disminuyendo o incrementando de severidad con base en los resultados del ensayo. b. Métodos in vivo El ensayo de nanoplataforma se puede administrar como se describió anteriormente para los métodos de detección por retrodispersión de luz. Una vez que el ensayo está en las cercanías de las células cancerosas, uno o dos láseres de Ti: zafiro de intersección preferiblemente se usan para excitar el ensayo. Otras fuentes de excitación adecuadas incluyen láseres de Nd:YAG (primer armónico a 1,064 nm) , y cualquier tipo de láser de tinte, alimentados por el segundo armónico del láser de Nd:YAG a 532 nm. La emisión de luz del ensayo luego será analizada usando una cámara, microscopio, o microscopio confocal . La luz emitida de las regiones cancerosas tiene un color diferente que la luz emitida de las regiones de te ido saludable debido a la mayor actividad de las proteasas objetivo en las regiones cancerosas. Ventajosamente, el tejido canceroso luego es visiblemente perceptible por un oncólogo o cirujano. Por ejemplo, las nanoplataformas se pueden usar para identificar el límite del tejido canceroso para facilitar la remoción del tejido canceroso y tumores mientras se conserva tanto tejido saludable como sea posible. Preferiblemente, el láser de Ti ¡zafiro se sintoniza á una longitud de onda de aproximadamente 830 nm para la excitación de multifotoñes de modo que solamente se puede observar la emisión de luz, pero no la excitación. Los resultados del ensayo luego se pueden correlacionar con un pronóstico para la progresión del cáncer, con base en la actividad de proteasa detectada. 4. Sensores Basados en Interruptor de Luz En otro aspecto, los ensayos utilizan una nanoplataforma que comprende una nanopartícula que tiene una o más capas protectoras unidas vía un enlace de oligopéptido a una porfirina u otro luminóforo orgánico o inorgánico. En este método, el plasmón de superficie de la nanopartícula de núcleo/cubierta es capaz de enfriar los espectros de emisión en estado excitado de la porfirina enlazada. Una vez que la proteasa escinde la secuencia de consenso, la porfirina se libera e ilumina, referido en la presente como un "interruptor de luz activado por enzimas". Ventajosamente, la apariencia de una nueva banda de luminiscencia/fluorescencia permite la detección mucho más sensible. Preferiblemente, la excitación se realiza a una longitud de onda desde aproximadamente 400 nm a aproximadamente 500 nm (monofotónico) o desde aproximadamente 800 nm a aproximadamente 90 nm (mul i otónico) . La excitación de porfirinas preferiblemente se realiza usando excitación trifotónica con láser Ti: zafiro a 870 nm. La emisión del ensayo luego será analizada usando una cámara, microscopio, o microscopio confocal . Los sensores basados en interruptor de luz se pueden utilizar en el mismo procedimiento exacto {in vitro o in vivo) como se discutió anteriormente con respecto a los sensores basados en FRET. Usando ya sea el método de sensor (in vitro o in vivo) , el tiempo de ensayo de la presente invención es dependiente de la concentración de la proteasa presente en la muestra o tejido, y se puede correlacionar directamente con la severidad del cáncer como se discute por los métodos de retrodispersión de luz.

Este método es particularmente adecuado para monitorear la progresión del cáncer y progreso del tratamiento. En un aspecto, una primera muestra (tal como orina) se colecta de un mamífero diagnosticado con cáncer y se mezcla con el ensayo de nanoplataforma . Después el ensayo es excitado usando una fuente de excitación adecuada y el espectro de emisión (o absorción) es analizado. La velocidad de hidrólisis enzimática se puede correlacionar después con la severidad del cáncer, como se describe en la presente. Las muestras también se pueden colectar del paciente en el tiempo y se comparan para determinar si el cáncer está incrementando o disminuyendo en severidad. Por ejemplo, una primera muestra se puede colectar de un paciente en el diagnóstico inicial de cáncer y se somete a un primer ensayo. Después de someter a un primer curso de tratamiento, una segunda muestra se puede colectar del paciente y se somete a un segundo ensayo. Los resultados se pueden comparar después con los resultados del primer ensayo para determinar si los niveles de actividad de enzima se han incrementado o disminuido. Si los niveles han disminuido, el pronóstico es que el tratamiento está trabajando y el curso del tratamiento debe mantenerse (o tal vez disminuirse) . Si los niveles se han incrementado, el pronóstico es que el tratamiento necesita ser incrementado o alterado. Si los niveles disminuyen dramáticamente, el pronóstico debería ser para remisión y el tratamiento se puede detener. El ensayo se puede realizar después de manera periódica para detectar la reincidencia del cáncer. Por lo tanto, los resultados de ensayo se pueden determinar si un curso particular de tratamiento es efectivo para tratar el cáncer .

El método de interruptor de luz también es adecuado para identificar el límite de tumores y tejidos cancerosos durante la cirugía para permitir la extirpación más precisa del tejido, como se describió anteriormente con respecto a los sensores con base en FRET.

Tratamiento Terapéutico La hipertermia (calentamiento de células a pocos grados por arriba de su temperatura de crecimiento) puede conducir a la muerte celular (capacidad reproductiva) , y también puede mejorar la sensibilidad de las células por radiación y quimioterapéuticos . Aunque la mayoría de las células cancerosas son ligeramente más susceptibles a la hipertermia que las células sanas, las últimas frecuentemente comparten el mismo destino cuando la porción entera del cuerpo se calienta de manera indiscriminada. Por lo tanto, el desarrollo de los métodos para dirigir selectivamente el tratamiento por hipertermia en células cancerosas es uno de los desafíos en este campo. Esto es igualmente importante cuando se intenta tratar tumores sólidos dentro del cuerpo humano, así como también el tratamiento de cánceres metastásicos .

En el método de la invención, la nanoplataforma terapéutica (no enlazada) o composición que comprende la nanoplataforma se administra a un mamífero, preferiblemente usando un portador farmacéuticamente aceptable. La nanoplataforma se puede administrar por inyección a una región localizada, tal como directamente en o cerca del sitio de tumor. La nanoplataforma se puede administrar intravenosamente por inyección en la corriente sanguínea. La cantidad de nanoplataforma en cada dosis es de manera preferible de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 0.10 g por kg de peso del paciente, y en forma más preferible de aproximadamente 0.010 a aproximadamente 0.025 g por kg de peso del paciente. El suministro liposomal de la nanoplataforma al tejido canceroso también se puede usar, incluyendo liposomas termolábiles . Sin embargo, el suministro celular de las nanoplataformas al tejido canceroso es particularmente preferido para el tratamiento por hipertermia. Cuando se calientan, las células de suministro perecen y liberan su carga directamente al tejido canceroso.

Una vez que la nanoplataforma ha sido incorporada por las células cancerosas y se localizan en el tejido canceroso, la región objetivo de interés se calienta usando excitación magnética A/C. La excitación se realiza preferiblemente a frecuencias que varían desde aproximadamente 50 a aproximadamente 500 kHz, y de manera preferible de aproximadamente 100 a aproximadamente 300 kHz. De manera preferible, el calentamiento magnético A/C comienza desde aproximadamente 12 horas a aproximadamente tres días después del suministro de la nanoplataforma al tejido canceroso. La excitación magnética A/C aumenta la temperatura de la nanoplataforma, este calor se disipa después y aumenta la temperatura del tejido canceroso, resultando en la inhibición del crecimiento, y muerte celular. Debido a que las nanoplataformas son absorbidas selectivamente por el tejido canceroso objetivo, el calor permanece relativamente confinado al tejido objetivo que minimiza el daño al tejido sano circundante. Preferiblemente, el tejido objetivo se calienta a una temperatura de al menos aproximadamente 40°C, de manera más preferible desde aproximadamente 42 °C a aproximadamente 60°C, y „de manera aún más preferible desde aproximadamente 45°C a aproximadamente 50°C. La duración del tratamiento preferiblemente se mantiene desde aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 2 horas, y en forma más preferible desde aproximadamente 10 minutos a aproximadamente 1 hora. La temperatura y duración de calentamiento se puede modificar dependiendo del objetivo del tratamiento.

A altas temperaturas (>60°C) que resultan de la hipertermia magnética A/C intensa y plasmónica, se observan carbonización parcial, desnaturalización de proteínas masivas y una disolución parcial de membranas mitocondriales y celulares en la solución amortiguadora circundante. Estos procesos resultan en necrosis (muerte celular prematura, no controlada) , que se caracteriza por inflamación celular, digestión de cromatina, y disrupción de la membrana plasmática y membranas de orgánulos, seguido por hidrólisis de ADN extensivo, vacuolación del retículo endoplásmico, ruptura del orgánulo (especialmente mitocondrias y lisosomas) y, eventualmente , lisis celular. El daño a los lisosomas usualmente activa la liberación de las cisteína proteinasas lisosomales (caspasas y otras proteasas) , que primero someten a lisis muchas estructuras celulares vitales y luego se liberan de la célula muerta. Las mismas pueden activar una reacción en cadena de muertes celulares adicionales de células cercanas.

Cuando se calientan a temperaturas medias desde aproximadamente 43°C a aproximadamente 45°C, las proteínas vitales de las células cancerosas se dañan (por ejemplo, se malforman) y/o la membrana celular parcialmente se disuelve en el medio acuoso circundante. El influjo de calcio desde el intersticio y retículo endoplásmico sincroniza el éxodo de masa del citocromo c de las mitocondrias . Estas desviaciones del metabolismo "normal" de una célula cancerosa puede conducir eventualmente a la apoptosis (muerte celular programada) . Después de la hipertermia, se observan incrementos significantes en TRAIL, (siglas en inglés de ligando que induce la apoptosis relacionada con el factor de necrosis tumoral (TNF, por sus siglas en inglés) . En breve, la hipertermia induce la apoptosis en células que son mediadas por caspasa-3 y otras caspasas como un resultado de la activación de los receptores de membranas de muerte celular de la familia del factor de necrosis tumoral. Para el tratamiento de hipertermia de tejido canceroso, se prefiere la apoptosis a necrosis porque es menos dañina para el tejido sano circundante.

Se ha encontrado que si las temperaturas de entre aproximadamente 43 °C y aproximadamente 45°C son retenidas por un periodo de tiempo prolongado (mayor que aproximadamente 1 hora, y de manera preferible entre aproximadamente 1 hora y aproximadamente 2 horas) , la respuesta inmunitaria antitumoral se puede mejorar notablemente. Además, las proteínas de choque de calor (hsp, por sus siglas en inglés) que son producidas en cantidades abundantes en células expuestas a calor, son potentes moduladores inmunitarios y pueden conducir a la estimulación de las respuestas inmunitarias innatas y adaptativas a tumores. La inmunoestimulación por hipertermia involucra tanto los efectos directos de calor en el comportamiento de las células inmunitarias así como también efectos indirectos mediados por la liberación de hsp.

Para el calentamiento óptimo, las nanopartículas utilizadas en las nanoplataformas, preferiblemente tienen una distribución de masa/tamaño muy estrecha como se describió previamente. Además, las nanopartículas preferiblemente caracterizan un núcleo de hierro fuertemente paramagnético . Comparado con los óxidos de hierro superparamagnéticos existentes para aplicaciones de hipertermia, el hierro superparamagnético posee un momento magnético superior y una magnetización de saturación superior. Esto permite tanto concentraciones más bajas de las nanoplataformas en el tejido que tratamientos existentes como periodos de calentamiento magnéticos A/C más cortos durante el tratamiento de pacientes. En forma aún más preferible, las nanopartículas también caracterizan un recubrimiento de Fe304 alrededor del núcleo de hierro. Las nanoplataformas terapéuticas particularmente preferibles comprenden una nanopartículas de núcleo/cubierta de Fe/Fe304 rodeada por una capa protectora de siloxano y monocapa de ligando. Un factor importante para hipertermia magnética de A/C es la velocidad de absorción específica o SAR de la nanopartícula, que se determina por SAR=C* ??/? t, donde C es la capacidad de calor específica de la muestra y T y t son la temperatura y tiempo, respectivamente. Por consiguiente, las nanoplataformas terapéuticas preferiblemente tendrán una velocidad de absorción específica (SAR) de al menos aproximadamente 50 W/g, de manera preferible desde aproximadamente 100 a aproximadamente 5,000 W/g, y en forma más preferible desde aproximadamente 1,500 a aproximadamente 2,000 W/g.

SAR es muy sensible a las propiedades del material. Aunque en las partículas de multidominio el calentamiento dominante es la pérdida de histéresis debido al movimiento de las paredes de dominio, que no es así en el caso de partículas pequeñas. Los dos mecanismos de contribución principales de SAR en nanopartículas magnéticas de dominio único son las relajaciones de Brownian (rotación de la nanopartícula completa) y Néel (cambio aleatorio del espín sin rotación de la partícula) . La transición entre los dos mecanismos ocurre entre 5-12 nm por varios materiales, pero también varía con frecuencia. Las nanopartículas preferidas serán dominadas por la relajación de Néel debido a la naturaleza superparamagnét ica del núcleo de hierro ( 0 ) .

El cuerpo humano tolera Fe2+ y Fe3+ mucho mejor que muchos otros metales (por ejemplo, Cd2 + ) . El nivel de absorción superior diario tolerable (UL, por sus siglas en inglés) para hierro es 45 mg por día para adultos. Si un procedimiento de tratamiento o imágenes requiere la absorción de más hierro, el tratamiento de quelación es factible. El quelante de hierro más ampliamente usado, desferrioxamina , remueve hasta 70 mg de hierro por día de la corriente sanguínea de un adulto. Asumiendo que el biodeterioro completo de las nanopart í cul as teranósticas es de 5 días, 575 mg de hierro se pueden proporcionar en seguida para las imágenes o tratamiento. Si la capa de protección de siloxano adicional está presente, el tiempo de vida de las nanopart í culas de Fe/ Fe304 /ASOX/ furt ivo se incrementa, y la dosificación de hierro en las nanoplat aformas se puede incrementar hasta aproximadamente 2.3 g por una dosis única. Además, una sobredosis de Fe3+ puede incrementar ampliamente la cantidad de especies de oxígeno reactivo (ROS, por sus siglas en inglés) en el cuerpo mejorando adicionalmente la inhibición del tumor.

Ventajosamente, el tratamiento de hipertermia podría seguir directamente los métodos de detección e imágenes descritos anteriormente. Es decir, las mismas plataformas o ensayos utilizados para las imágenes y detección en un paciente se pueden usar después para tratar inmediatamente el tejido canceroso detectado sin la administración de cualesquiera nanoplataformas adicionales u otros agentes .

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos describen métodos preferidos de acuerdo con la invención. Sin embargo, se entiende, que estos ejemplos se proporcionan en calidad de ilustración y no se deben aceptar como una limitación en el alcance general de la invención.

EJEMPLO 1 Síntesis de Ligandos Furtivos Orgánicos En este ejemplo, tres ligandos diferentes para el recubrimiento furtivo de las nanopartículas son sintetizados. El análisis de cada producto de reacción se dio por NMR de protones NMR) y/o NMR de carbono-13 (13C NMR) , que emplea un espectrómetro de NMR de 400 MHz (Varían: Universidad del Estado de Kansas) , y por Espectroscopia de Masa de Ionización de Electrorrocío (MS-ESI) , que emplea un espectrómetro de masa de trampa de iones lineal/triple cuadrupolo, híbrido (4000 Q-TRAP®, Applied Biosystems; Foster City, CA) con una fuente de electrorrocío .

A. Síntesis de Ligando A 1. Boc-protección de dopamina Una solución de dopamina (310 mg, 1.63 mmoles) en metanol (8 mi) se preparó y agitó bajo N2 por 5 minutos. Se adicionaron 1.8 mmol de trietilamina (TEA) a la solución seguido por Boc-anhídrido (393 mg , 1.8 mmoles) . La mezcla se agitó bajo N2 por 12 horas. El solvente se removió después bajo presión reducida. El residuo remanente se disolvió en 40 mi de CH2C12 y se lavó tres veces con 5 mi de cada uno de HCl 1.0 N y salmuera . La capa orgánica se secó después sobre Na2S04 anhidro. Después de la filtración, la fase orgánica se mantuvo a -5°C por 3 horas. Un precipitado blanco salió y se colectó por filtración. Rendimiento total 85%.

Espectro de 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) d: 1.73 (s, 9H) ; 2.48 (t, 2H); 3.02 (q, 2H); 6.40 (d, 1H); 6.54 (s, 1H) ; 6.61 (d, 1H) ; 6.83 (t, 1H) ; 6.85 (s, 1H) ; 6.76 (s , 1H) . 2. Protección con bencilo de Boc-dopamina Se disolvieron 3.47 gramos de dopamina Boc-protegida en 100 mi de dimeti1formamida (DMF) . Luego se adicionaron 12.6 gramos de K2C03 , y el sistema se protegió bajo N2. A continuación, 4.69 gramos de bromuro de bencilo (2 eq.) se adicionaron por goteo a la solución. La mezcla se agitó a temperatura ambiente por 24 horas sin luz. El sólido resultante se removió después por filtración a través de una almohadilla corta de celita, y la torta de filtro se lavó tres veces con 100 mi de éter. El filtrado combinado y la solución de lavado se lavó se lavaron tres veces con agua enfriada con hielo (50 mi) y salmuera (15 mi) . La capa orgánica se secó sobre Na2S04 anhidro y se concentró a 150 mi. Después del ajuste a -5°C por 5 horas, un precipitado blanco salió y se colectó por filtración a vacío. Rendimiento total 90%.

XH NMR (400 MHz , CDC13) d: 1.45 (s, 9H) ; 2.70 (t, 2H) ; 3.31 (q, 2H) ; 4.49 (s, 1H) ; 5.15 (d, 4H) ; 6.71 (d, 1H) ; 6.80 (s. 1H) ; 6.88 (d, 1H) ; 7.32 (t, 2H) ; 7.37 (t, 4H) ; 7.45 (d, 4H) . 3. Desprotección del grupo Boc Se disolvieron 4.3 gramos de Boc-dopamina protegida con bencilo en 150 mi de solución de CH2Cl2 de ácido trifluoroacético (TFA) al 5% y se agitó a temperatura ambiente por 5 horas. El solvente se removió bajo vacío y se obtuvo aceite claro. Rendimiento total 100% rendimiento.

XH NMR (400 MHz , CDC13) d: 2.79 (t, 2H) ; 3.08 (m, 2H) ; 5.11 (s, 4H) ; 6.68 (d, 1H) ; 6.75 (s, 1H) ; 6.90 (d, 1H) ; 7.32 (t, 2H) ; 7.35 (t, 4H) ; 7.42 (d, 4H) . 13C NMR (400 Hz , CDC13) d: 32.90; 41.85; 71.50; 72.00; 115.60; 116.25; 122.30; 127.60; 127.85; 128.35; 128.45; 128.63; 128.85; 136.70; 136.85; 148.45; 149.00; 160.88; 161.20; 161.58; 161.90. 4. Formación de amida Se disolvieron 1.43 gramos de dopamina protegida con bencilo y 0.43 gramos de anhídrido succínico (relación molar 1:1) en 6 mi de piridina. La solución se agitó a temperatura ambiente por 5 horas. El solvente se removió por co-evaporación con tolueno (5x5 mi) . Un sólido blanco se obtuvo y se lavó tres veces con CH2C12. Después del secado bajo vacío, se obtuvieron 1.4 gramos del producto. Rendimiento total 75%.

XH NMR (400 MHz , DMS0-d6) d: 2.29 (t, 2H) ; 2.42 (t, 2H) ; 2.60 (t, 2H) ; 3.21 (q, 2H) ; 5.09 (d, 4H) ; 6.71 (d, 1H) ; 6.94 (s, 1H) ; 6.96 (d, 1H) ; 7.32 (t, 2H) ; 7.38 (d, 4H) ; 7.45 (t, 4H) ; 7.90 (t, 1H) ; 12.08 (s, 1H) . MS-ESI+: m/z 434.2. Peso molecular: 433.5. 5. Formación de éster Se disolvieron 0.964 gramos del producto de reacción de la etapa 4 anterior y 0.426 gramos de l-etil-3- (3 -dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) (relación molar 1:1) en 100 mi de CH2C12 y se agitaron a temperatura ambiente por 10 minutos. A continuación, 0.433 gramos de tetraetilenglicol se adicionaron a la solución seguida por 5 mg de dimetilaminopiridina (DMAP) . Después de la agitación por 12 horas a temperatura ambiente, la fase orgánica se lavó tres veces con 10% de solución de H3P0 (10 mi) , agua (10 mi) , y salmuera (10 mi) . La fase orgánica se secó entonces sobre Mg2S04 anhidro. Después de la remoción del solvente bajo vacío, el residuo se cargó en una columna y se eluyó con acetona/cloruro de metileno 1:1. Se obtuvieron 0.42 gramos del producto ii (tetraetilenglicol con base en dopamina protegida con bencilo) . Rendimiento total 40%. También se aislaron 0.4 gramos del producto secundario iii.

XH NMR para el producto ii (400 MHz , CDC13) d: 2.39 (t, 2H) ; 2.57 (t, 1H) ; 2.70 (q, 4H) ; 3.44 (q, 2H) ; 3.60 (t, 2H) ; 3.65 (amplio 12H) ; 4.24 (t, 2H) ; 5.15 (d, 4H) ; 5.74 (t, 1H) ; 6.71 (d, 1H) ; 6.81 (s, 1H) ; 6.89 (d, 1H) ; 7.31 (t, 2H) ; 7.37 (t, 4H) ; 7.46 (d, 4H) . MS-ESI+: m/z 610.4. Peso molecular 609.3. 6. Desbencilación para producir el Ligando A Ligando A Se disolvieron 0.34 gramos de tetraetilenglicol con base en dopamina protegida con bencilo (ii) en 50 mi de metanol . A continuación, 77 mg de paladio sobre carbón (Pd/C) fueron adicionados bajo N2. Después de la evacuación tres veces, se aplicó 1 atm. de H2 y la mezcla se agitó por 24 horas a temperatura ambiente. El catalizador se removió filtrando a través de una almohadilla corta de celita. El solvente se movió entonces bajo vacío, resultando en 0.23 gramos del producto (Ligando A). Rendimiento total 100%.

XH NMR (400 MHz, DMSO-d6) d: 2.33 (t, 2H) ; 2.48 (q, 2H) ; 3.15 (multiplete amplio, 4H) ; 3.41 (t, 2H) ; 3.49 (t, 2H) ; 3.51 (multiplete amplio, 8H) ; 3.59 (t, 2H) ; 4.11 (t, 2H) ; 6.41 (d, 1H) ; 6.55 (s, 1H) ; 6.61 (d, 1H) .

B. Síntesis de Ligando B Ligando B Se trató 1.0 gramo de tetraetilenglicol con base en dopamina protegida con bencilo (producto ii de A.5. anterior) con 1 equiv. de Fmoc-Glicina y 1.2 equiv. de EDC en la presencia de 0.020 gramos de DMAP para dar arriba del 95% del producto acoplado. Los grupos bencilo y Fmoc se protegieron al mismo tiempo con hidrógeno/paladio sobre carbono (H2/Pd(C) en la presencia de 10 mi de CH3CN. El catalizador se removió filtrando a través de una almohadilla corta de celita. El solvente se removió entonces bajo vacío, resultando en el Ligando B. Rendimiento Total 35%.

XH NMR (400 MHz , DMS0-d6) d: 2.33 (t, 2H) ; 2.46 (q, 2H) ; 3.14 (q, 2H) ; 3.41 (t, 2H) ; 3.49 (t, 4H) ; 3.51 (multiplete amplio, 8H) ; 3.59 (t, 2H) ; 4.10 (t, 2H) ; 4.57 (t, 2H) ; 6.43 (d, 1H) 6.55 (s, 1H) ; 6.61 (d, 1H) ; 7.90 (t, 1H) ; 8.62 (s, 1H) ; 8.73 (s, 1H) . 13C NMR (400 MHz, DMSO-d6) d: 28.98; 29.85; 34.73; 60.25; 63.33; 68.30; 72.38; 115.49; 115.96; 119.22; 130.25; 143.54; 145.07; 170.48; 172.48.

C. Síntesis de Ligando C 1. Formación de uretano Se disolvieron 1.43 gramos de dopamina protegida con bencilo (de A.3. anterior) en 5 mi de DMF anhidro, junto con 0.83 gramos de tetraetilenglicol (proporción 1:1) y 0.50 gramos de carbonil-bis-imidazol (CDI) . La solución se agitó a temperatura ambiente por 1 hora y luego a 60°C por 4 horas. El solvente se removió entonces por co-evaporación con tolueno (5 x 5 mi) . Un sólido blanco se obtuvo y se lavó con CH2C12 3 veces. Después del secado en un vacío, se obtuvieron 1.66 gramos del producto. Rendimiento Total: 70%. H NMR (400 MHz , CDC13 d: 2.40 (s, 1H) ; 2.88 (m, 4H) ; 3.26 (q, 2H) ; 3.68 (t, 2H) ; 3.66 (12H amplio); 4.25 (t, 2H) ; 5.18 (d, 4H) ; 5.74 (t( 1H) ; 6.71 (d, 1H) ; 6.81 (s, 1H) ; 6.89 (d, 1H) ; 7.31 (t, 2H) ; 7.37 (t, 4H) ; 7.46 (d, 4H) , 8.24 (s, 1H) . MS-ESI+: m/z 553.2.

Desprotección para producir el Ligando Se disolvieron 0.35 gramos de ligando de tetraetilenglicol con base en dopamina protegida con bencilo en 50 mi de metanol . Se adicionaron 77 mg Pd/C bajo N2. Después de la evacuación tres veces, se aplicó 1 atm. H2 y la mezcla se agitó por 24 horas a temperatura ambiente. El catalizador se removió filtrando a través de una almohadilla corta de celita. Después de la remoción del solvente bajo vacío, se obtuvieron 0.235 gramos del producto (Ligando C) . Rendimiento Total: 98%.

XH NMR (400 MHz, DMS0-d6) d: 2.43 (t, 2H) ; 3.45 (t, 2H) ; 3.49 (t, 2H) ; 3.54 (multiplete amplio, 10H) ; 3.60 (t, 2H) ; 4.11 (t, 2H) ; 6.41 (d, 1H) ; 6.55 (s, 1H) ; 6.61 (d, 1H) .

EJEMPLO 2 Síntesis de Porfirina no metalada En este Ejemplo, se sintetizó una tetracarboxifenil porfirina no metalado (TCPP) . Primero, se disolvieron 1.50 gramos de 4 -carboxibenzaldehído en 80 mi de ácido acético. La solución se calentó a 100°C, seguido por la adición por goteo de una solución de 0.67 gramos de pirrólo en 10 mi de ácido acético por un periodo de 20 minutos. Al término de la adición, la solución resultante se calentó hasta 130°C lentamente y se mantuvo a 130°C por 1 hora. La mezcla se enfrió entonces a 80°C. A continuación, se adicionaron 100 mi de 95% de etanol y la temperatura se redujo a temperatura ambiente mientras se agitaba por 3 horas. La mezcla se almacenó entonces a -15°C por 24 horas. Un sólido púrpura se colectó por filtración a vacío. La torta de filtro se lavó entonces tres veces con 5 mi de etanol/ácido acético 50/50 frío, y se secó bajo alto vacío (bomba de aceite) durante la noche. Se obtuvieron 0.51 gramos del producto púrpura. Rendimiento Total 25.5%.

XH NMR (400 MHz , DMSO-d6) d: -2.94 (s, 2H) ; 8.35 (d, 8H) ; 8.39 (d, 8H) ; 8.86 (s, 8H) ; 13.31 (s, 4H) . 13C NMR (400 MHz , DMSO-d6) d: 119.31; 127.90; 130.51; 134.44; 145.42; 167.46. MS-ESI+: m/z 791.2. Peso Molecular 790.2.

EJEMPLO 3 Método de Síntesis Alternativo para el Ligando A La síntesis se inicia con la dopamina protegida con bencilo, que reacciona primero con anhídrido succínico y luego con di c i c lohexi 1 -carbodiimida (DCC) y N-hidroxi -benzotriazol (HOBT) para formar selectivamente un éster activo-HOBT (I) . Este éster activo reacciona con etilenglicol u octaet i lengl icol comerc ialmente disponible para el compuesto (II) , el cual después es desprotegido con H2/Pd(C) en tetrahidrofurano (THF) , resultando en el compuesto (III) . Este esquema de reacción se muestra en la Figura 6.

La purificación de todas las etapas se puede lograr descendiendo la cromatografía de columna usando sílice neutral como fase estacionaria y acetato de et i lo/n -hexano como eluyente. De acuerdo con la modelación molecular el ligando de octaet ilengl icol tiene una longitud de 3.7 nm, mientras que el ligando de tet raet i 1 engl i col es 2.5 nm en longitud.

La porfirina se puede unir al ligando previo a la estabilización de la nanopart ícula . En esta modalidad, el compuesto II se puede hacer reaccionar con tetracarboxifenil porfirina (TCPP) metalada (M=Zn2+ o Pd2+) o no metalada (M = 2H) usando DCC y N-hidroxi - succ inimida (NHS) como agentes de acoplamiento en THF, seguido por la desprotección con H2/Pd(C) en THF, como se muestra en la Figura 7. El compuesto resultante (IV) se puede purificar descendiendo la cromatografía de columna o HPLC de fase inversa (C18) usando gradientes de H20/acetonit rilo como fase móvil.

EJEMPLO 4 Estábil ización de nanopart ículas de Fe/Fe304 con Ligandos a base de dopamina En este Ejemplo, se estabilizaron nanopart ículas de núcleo/cubierta de Fe/Fe30 usando los Ligandos A y B sintetizados en el Ejemplo 1 anterior, seguido por la unión de la porfirina sintetizada en el Ejemplo 2. Las nanopart ículas se obtuvieron de NanoScale Corporation (Manhattan, KS ) . El núcleo de Fe ( 0 ) tuvo un diámetro de aproximadamente 5.4 nm . El espesor de la cubierta Fe304 fue aproximadamente 1.5 nm .

Primero, 26 mg del Ligando A con base en dopamina y 5 mg del Ligando B con base en dopamina se disolvieron en 5 mi de THF. Después se adicionaron 10 mg de nanopart í culas de Fe/Fe304, seguido por la sonicación por 60 minutos. Las nanopart ícul as estabilizadas se colectaron después usando un magneto. El sólido resultante se lavó después tres veces con 1 mi de THF, y se volvieron a disolver (dispersar) en 5 mi de THF. El enlace de cada ligando se muestra posteriormente, donde n = 3.

A continuación, se adicionaron 17 mg de tetracarboxi feni 1 porfirina (TCPP) , sintetizada en el Ejemplo 2, a la suspensión, junto con 2 mg de DMAP y 4 mg de EDC, seguido por sonicación por 60 minutos.

El sólido se colectó por magneto y se lavó con 3 mi de THF hasta que el lavado fue incoloro (aproximadamente 8 veces) . El sólido se secó después bajo vacío. Se obtuvieron 8.9 mg de sólido (nanopart í culas estabilizadas) . Rendimiento Total 20%. El enlace de porfirina se muestra posteriormente .

EJEMPLO 5 Modificación de nanopart ículas de Fe/Fe304 con 1 igandos a base de dopamina et iquetada con biotina En este Ejemplo, las nanopart ículas de núcleo/cubierta de Fe/Fe304 se estabilizaron usando el Ligando C sintetizado en el Ejemplo 1 anterior, seguido por el enlace de una etiqueta de biotina. Las nanopart ículas se obtuvieron de NanoScale Corporation (Manhattan, KS ) . El núcleo de Fe ( 0 ) tuvo un diámetro de aproximadamente 5.4 nm . El espesor de la cubierta de Fe304 fue de aproximadamente 1.1 nm .

En primer lugar, se disolvieron 30 mg del ligando C en 5 mi de THF . A continuación, se adicionaron 10 mg de las nanopart ículas de Fe/Fe304, seguido por sonicación por 60 minutos. Las nanopart ículas estabilizadas fueron colectadas después usando un magneto de hierro de 0.5T (Varían) . El sólido resultante se lavó después tres veces con 1 mi de THF, y se volvió a disolver (dispersar) en 5 mi de THF.

A continuación, se adicionaron 20 mg de biotina, 2 mg de DMAP, y 4 mg de EDC a la suspensión y se sometieron a sonicación por 60 minutos. El sólido se colectó usando un magneto y se lavó con THF (~8 veces con 3 mi) , hasta que el sobrenadante fue incoloro. El sólido se secó bajo vacío, y se obtuvieron 8.7 mg de sólido café.

Después se midió la solubilidad de las nanopartículas etiquetadas con biotina. Se adicionó por goteo amortiguador de fosfato (0.1 M, pH = 6.8) a 0.25 mg de las nanopartículas en una cubeta de vidrio. La suspensión se agitó continuamente con un agitador micromagnético (Fisher) . La dispersión de luz de la suspensión se registró a 700 nm. Una vez que las partículas se disolvieron, la extinción (es decir, absorción de luz y dispersión) a 700 nm disminuyó a menos de F = 0.01. La solubilidad se encontró que es de 105 mg/ml .

EJEMPLO 6 Síntesis de nanopartículas de Fe/Fe304 cubierta con siloxano En este Ejemplo, las nanopartículas de núcleo/cubierta de Fe/Fe304 se revistieron con una capa de protección de aminosiloxano (ASOX) . Las nanopartículas se obtuvieron de NanoScale Corporation (Manhattan, KS) . El núcleo de Fe(0) tuvo un diámetro de aproximadamente 5.4 nm. El espesor de la cubierta de Fe304 fue de aproximadamente 1.5 nm .

En primer lugar, se suspendieron 20 mg de nanopartículas de Fe/Fe304 en 10 mi de THF, seguido por la sonicación por 30 minutos. El sólido no disuelto se separó por precipitación a través de la centrifugación de baja velocidad a 1500 rpm.- La solución clara se transfirió a otro tubo de prueba y 0.3 mi de 3-aminopropiltrietoxisilano se adicionaron a la solución. Después de la sonicación por 10 horas, las nanopartículas se colectaron usando un magneto fuerte y la solución se removió cuidadosamente. Después del lavado con THF (3x5 mi) y secado bajo vacío, se colectaron 7.5 mg de nanopartículas protegidas con ASOX.

EJEMPLO 7 Enlace de ligandos a base de dopamina a nanopartículas de Fe/Fe304 protegidas con ASOX En este Ejemplo, las nanopartículas de Fe/Fe304-ASOX del Ejemplo 5 fueron recubiertas con los ligandos A-C a base de dopamina sintetizados en el Ejemplo 1, seguido por el enlace de porfirinas y etiquetas de biotina, respectivamente .

A. Enlace de Porfirinas En primer lugar, se disolvieron 26 mg de Ligando A y 5 mg del Ligando B en 5 mi de THF . A continuación, se adicionaron 10 mg de nanopartículas de Fe/Fe304-ASOX y 3.0 mg de COI, seguido por sonicación por 60 minutos. Las nanopartículas se colectaron usando un magneto, y el sólido se lavó con THF (3x1 mi) y se volvieron a disolver (dispersar) en 5 mi de THF. A continuación, se adicionaron 17 mg de TCPP porfirina, 2 mg de DMAP, y 4 mg de EDC a la suspensión y se sometieron a sonicación por 60 minutos. El sólido se colectó usando un magneto de hierro 0.5T (Varían), y se lavó con THF (8x3 mi) hasta que el lavado fue incoloro. El sólido se secó bajo vacío, y se obtuvieron 9.0 mg de sólido. Solubilidad en agua: 52 mg/ml .

B. Etiquetado por Biotina Primero se disolvieron 30 mg del Ligando C en 5 mi de THF. A continuación, se adicionaron 10 mg de nanopartículas Fe/Fe30-ASOX y 3.0 mg de COI, seguido por sonicación por 60 minutos. Las nanopartículas se colectaron usando un magneto de hierro 0.5T (Varían) . El sólido se lavó con THF (3x1 mi) y se volvió a disolver (dispersar) en 5 mi de THF. Después, se adicionaron 20 mg de biotina, 2 mg de DMAP, y 4 mg de EDC a la suspensión y se sometieron a sonicación por 60 minutos. El sólido se colectó magnéticamente y se lavó con THF (al menos con 8x3 mi, hasta que el sobrenadante fue incoloro) . El sólido se secó sobre vacío, y se obtuvieron 8.0 mg de sólido café. La solubilidad de las nanopartículas etiquetadas con biotina se incrementó dramáticamente a 205 mg/ml .

Un método alternativo de etiquetado con biotina se muestra en la Figura 8 usando los ligandos furtivos de oligoetilenglicol anclado con dopamina, y las nanopartículas de Fe/Fe304-ASOX. El grupo hidroxilo alifático libre en el ligando permite el enlace de una etiqueta de biotina por medio de una unión de éster usando química de EDC bien establecida. (EDC: 1-etil-3- (3-dimetilaminopropil) carbodiimida, HOBT: 1-hidroxibenzo-triazol, CDI : 1, 1-carbonildiimidazol) .

EJEMPLO 8 Método A de Montaje de Nanoplataforma Alternativa En este Ejemplo, un montaje de nanopartícula-nanopartícula fue preparado primero conectando anclajes de dopamina a una secuencia de consenso de proteasa. El anclaje de dopamina después se utilizó para enlazar dos nanopartículas conjuntamente, seguido por recubrimiento de la superficie remanente de la nanopartícula con ligandos de anclaje de dopamina (monodendato) .

A. Solución Madre de Ligando de Cloruro Ácido Primero, se disolvieron 50 mg de anclaje A con base en dopamina protegida con bencilo en 5 mi de cloruro de metileno. A continuación, 21.3 mg (1 equiv.) de cloruro cianúrico, 1 equiv. de Et3 , y 2 mg de DMF se adicionaron a la solución. Después de la agitación a temperatura ambiente por 3 horas, surgió un precipitado blanco. El precipitado se removió por filtración por una almohadilla corta de celita pre-secada y el filtrado se concentró bajo vacío para dar 48 mg de sólido blanco. Después, se adicionaron 20 mi de THF seco para disolver el sólido para hacer una solución madre.

B. Enlace con Secuencia de Escisión continuación, 5.6 mg de la secuencia de escisión proteasa objetivo (DGGGSGRSAGGGD, SEC ID NO: 65) se disolvieron en 5 mi de THF seco, seguido por la adición de 1 mi de la solución madre de cloruro ácido de anclaje de dopamina (hecha en la etapa previa) , junto con 1 mg de Et3N y 1 mg de DMAP. La solución se agitó a temperatura ambiente por 12 horas. El solvente se removió después bajo vacío. Después del lavado del residuo con éter (3x3 mi), se obtuvieron 4.6 mg de sólido blanquecino. MS-ESI": m/z 1,463.7. Peso Molecular: 1,462.7.

C. Adición del segundo anclaje con base en dopamina protegida con bencilo Después, 4.6 mg del producto C se disolvieron en 3 mi de DMF seca, seguido por la adición de 0.6 mg (1 equiv.) CDI. La solución se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos. A <_xmtinuacióri, se adicionaran 1.2 mg (1.1 equiv.) de anclaje D con base en dopamina. La solución se agitó a temperatura ambiente por 6 horas, en este punto TLC mostró que la mayoría de D desapareció. La solución se vertió en 20 mi de éter y la fase orgánica se lavó con HCl 1N frío (3x2 mi) , agua fría (3x2 mi) y salmuera (1x2 mi) . Después del secado en solvente de MgS04 anhidro se removió bajo vacío, y se obtuvieron 3.1 mg del sólido E.

D. Desbencilación Se disolvieron 3.1 mg del producto E en 5 mi de metanol, seguido por la adición de 3 mg de Pd/C al 10%. El sistema se sometió a atmósfera de H2 1 atm. por 12 horas mientras que se agitaba. El catalizador se removió filtrando por un papel filtro fino. Se obtuvieron 2.3 mg de aceite claro F después de la remoción del solvente .

E. Montaje de Nanopartículas Finalmente, 2.3 mg de anclajes F con base en dopamina enlazada se disolvieron en 5 mi de THF, seguido por la adición de 3 mg de nanopartículas de Fe/Fe304 (NanoScale Corporation) . La suspensión se sometió a sonicación a temperatura ambiente por 1 hora, y las nanopartículas se colectaron por un magneto fuerte, y se lavaron con THF (5x3 mi) . Después del secado bajo vacío por 2 horas, se obtuvieron 2.2 mg de nanopartículas enlazadas. La superficie remanente de la nanopartícula se puede recubrir después con ligandos. Alternativamente, la nanopartícula ya puede ser protegida con recubrimiento furtivo previo a la unión de anclajes de dopamina enlazados, o tener una capa protectora de siloxano.

EJEMPLO 9 Método B de Montaje Alternativo En este procedimiento, cuatro secuencias de consenso de proteasa objetivo se enlazan a una tetracarboxilfenil porfirina (TCPP) . Al otro extremo las secuencias de escisión son enlazadas a las puntas de glicina de dos nanopartículas de Fe/Fe304/AS0X o Fe/Fe304 con recubrimiento furtivo.

A. Solución Acida COOH) en 3 mi de cloruro de tionilo. La solución se sometió a reflujo por 2 horas a 85°C. El cloruro de tionilo en exceso se removió bajo vacío. El sólido se secó además bajo alto vacío por 6 horas.

B . Enlace de la Secuencia de Escisión con Porfirina Después de disolver el sólido en 5 mi de DMF seca, se adicionaron 32 mg (4 equiv.) de la secuencia de escisión ( DGGGSGRSAGGGD ; SEC ID NO : 65 ) , seguido por 0.05 mi de Et3N y 2 mg de DMAP . La solución se agitó a temperatura ambiente por 18 horas. El espectro de masa mostró la desaparición de materiales de partida y la porfirina acoplada a la secuencia de di-péptido. MS-ESI": m/z 2,884.3. Peso Molecular: 2,883.3.

C. Nanopartículas con recubrimiento furtivo Las nanopartículas con recubrimiento furtivo se prepararon suspendiendo 8 mg de nanopartículas de Fe/Fe304 en 5 mi de THF, seguido por la adición de 20 mg de ligando de tetraetilenglicol con base en dopamina . La mezcla se sometió a sonicación por 60 minutos. Las nanopartículas se colectaron entonces por un magneto fuerte, y el ligando en exceso se lavó lejos por THF (5x3 mi) .

D. Enlace de Porfirina Las nanopartículas de Fe/Fe304 modificadas con dopamina tetraetilenglicol (es decir, con recubrimiento furtivo) se suspendieron en 5 mi de THF, seguido por la adición de 1 mi de la solución de DMF de secuencia de escisión unida a porfirina y se adicionaron 6 mg de EDC. La mezcla se sometió a sonicación a temperatura ambiente por 60 minutos. Las nanopartículas se colectaron por un magneto de nuevo, y se lavaron con THF (10x3 mi) . Se obtuvieron 6.2 mg de nanopartículas con recubrimiento furtivo enlazadas a porfirina después del secado bajo vacío.

EJEMPLO 10 Método Alternativo de Enlace del Ligando Furtivo En este Ejemplo, dos ligandos a base de dopamina se enlazaron de acuerdo con el esquema de reacción en la Figura 9. El ligando de partida (I) fácilmente reacciona con el grupo tiol de la cisteína terminal de la secuencia de escisión para urocinasa. Otras secuencias de escisión también se podrían enlazar vía sus grupos de cisteína terminal. La glicina se conectará vía un enlace éster a la función alcohol del segundo ligando (TI) usando química de EDC/HOBT bien establecida. Los ligandos luego se pueden desproteger en una etapa con hidrógeno/paladio sobre carbono, como se describió previamente .

EJEMPLO 11 Medición de los Tiempos de Relajación de NMR La influencia de varias concentraciones de los agentes de contraste de MRI de nanopart í cula de Fe/Fe30 de la invención en el comportamiento de la relación en Ti y T2 de espines de ^"H en agua se determinó usando una NMR de 400 MHz (Varían, resistencia de campo de 9.4 T) . Se utilizaron nanopart ículas estabilizadas con ligandos de tetraetilenglicol, y nanopart ículas sin recubrimiento furtivo. Las nanopart ículas con recubrimiento furtivo presentan porfirinas químicamente unidas (Ver Ejemplo 4 anterior) . Como se muestra en la Tabla IV, las concentraciones incrementadas (de hasta 160 µg) de nanopart ículas de Fe/Fe304 fueron suspendidas (sin recubrimiento furtivo) o disueltas (con recubrimiento furtivo) en 1.0 mi de H20/D20 (90/10 v/v) . A esto se agregó 1.0 x 10"10 mol de urocinasa (Sigma Aldrich, St . Louis, MO) disuelta en 0.1 mi de H20/D20 (90/10 v/v) . Las nanopart ículas se enlazaron vía una secuencia de consenso de urocinasa. El núcleo de Fe tuvo un diámetro de 5.4 + 1.1 nm, y la cubierta de F304 tuvo un espesor de 1.0±0.4 nm . En proximidad cercana (d<10nm) , los espines magnéticos se acoplan y por lo tanto, los superparamagne tos se fortalecen entre si en un campo magnético. Las mediciones se condujeron a 300K (26.8°C) en tubos de NMR estándar. Se utilizaron secuencias de impulso de ?? y T2 estándares: Tabla III - Secuencias de Impulso T1 - Secuencia de impulso de recuperación de inversión: [di] - [180] - [t] - [90] - [adquisición] , donde el retraso, t, fue variado T3 - Secuencia de impulso de Carr-Purcell Heiboom-Gill (CPMGT) o espín- eco: [di] - [90] - [espín-eco] - [adquisición] , donde el período de espín-eco es un bloque de t-180-t y el retraso, t, fue variado Tabla IV - Resultados de Secuencia de Impulso La resistencia de campo usada fue mayor que en las MRIs clínicas, sin embargo, los datos obtenidos a mayores campos son muy comparables con los tiempos de vida en aplicaciones de RI clínica.

Las nanopartículas de Fe/Fe30 recubiertas con ligando furtivo lograron relaj abilidad en Tx de rx = 150+20 mM s"1 y una relajabilidad en T2 de r2 = -4300+250 mM s"1, y r2/ri = -28, lo cual es ventajoso en el mejoramiento en Tx, disminución en T2 y la relación o r2 y rx en comparación con los agentes de contraste de MRI existentes. De acuerdo con los resultados de las simulaciones de Monte-Cario reportadas previamente, las nanopartículas de Fe/Fe304 acopladas influyen en la relación en T2 de los espines de 1H circundantes similares a una nanopartícula de sus radios combinados. En la presencia de urocinasa, la secuencia de escisión de consenso específica (SGRSA, SEC ID NO: 2) del enlazante se cortará y, por lo tanto, las nanopartículas de Fe/Fe30 llegan a separarse. En consecuencia, ahora disminuyen el tiempo de relajación en T2 a un grado menor.

Después de la escisión de proteasa del enlazante, rx incrementó ligeramente a 180+20 mM s"1, mientras que r2 incrementó a -2,350±250 mM s"1, con la relación r2/ri siendo -13. El cambio remarcable en T2 combinado con un valor casi constante para ?? permite la medición in situ espacialmente resuelta de la actividad de proteasa en el cuerpo de mamífero comparando las imágenes de MRI ponderadas en ?? y T2 en varios tiempos .

Los resultados se representan en las Figuras 10-11. La línea A es la nanopartícula recubierta con ligando no furtivo. La línea B es la nanopartícula recubierta con ligando furtivo. La Figura 10 indica que las nanopartículas bimetálicas tanto estabilizadas con tetraetilenglicol como no estabilizadas incrementan el tiempo de relajación ?? . La presencia de la capa de tetraetilenglicol no estorba los efectos magnéticos de la nanopartícula en la mezcla de H20/D20 circundante. Hay una ventaja clara de las nanopartículas de Fe/Fe304/ en comparación con los agentes de contraste basados en gadolinio. El incremento de ?? máximo observado fue 16 veces, el cual es cercano a los mejores resultados reportados en el arte.

La Fig. 11 muestra una disminución remarcable de T2 (hasta un factor de 57) cuando se agregan nanopartículas de Fe/Fe3C>4- . La disminución significativa observada de T2 demuestra que las nanopartículas se pueden usar como agentes de contraste de MRI . La presencia del ligando de tetra (etilenglicol ) conduce a una disminución más significativa de T2, como se muestra por la línea B. T2 incrementó para ambas partículas una vez que la concentración de la nanopartícula alcanzó 120 g/ml .

La Fig. 12 ilustra la disminución de -(r2/ri) con el tiempo cuando las nanopartículas enlazadas se escinden por urocinasa. Para esta medición, 40 µg de nanopartículas de Fe/Fe304 con recubrimiento furtivo etiquetadas con porfirina enlazadas por una secuencia de escisión de urocinasa ( DGAGSGRSAGAGD , SEC ID NO: 66) se disolvieron en 0.9 mi de H20/D20 a 300K (26.8°C) . A esto se agregó 1.0 x 10" mol de urocinasa (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) disuelta en 0.1 mi de H2O/D20 (90/10 v/v) . Las mediciones se condujeron a 300K (26.8°C) usando secuencias de impulso estándares para mediciones de Ti y T2 a 400 MHz . Los valores de ri y r2 luego fueron calculados y graficados en la gráfica en la Fig. 12.

EJEMPLO 12 Ensayos Basados en FRET Se estudió la fluorescencia de la tetracarboxilato porfirina sódica (a pH = 6.8 en PBS) y tetracarboxi lato porfirina sódica dopada con zinc, y los resultados se compararon con aquellos obtenidos para las nanopart ículas de Fe/Fe304 de núcleo/cubierta para nanopart ículas que presentan ligandos furtivos (NanoScale Corporation; Manhattan, KS ) con tet acarboxi fenil porfirina (TCPP) metalada y no metalada químicamente unida.

Primero, tanto la tetracarboxilato porfirina sódica "libre" como la tetracarboxilato porfirina sódica dopada con zinc son atadas a nanopart ículas de Fe/Fe304. Para preparar las nanopart ículas de Fe/Fe304 con protección furtiva, 35 mg de ligando de dopamina-t et rae t i lengl i col se disolvieron en 5 mi de THF . Luego, 11.0 mg de nanopart ículas de Fe/Fe304 se agregaron' y sometieron a sonicación a temperatura ambiente por 1 hora. El núcleo de las nanopart ículas tuvo un diámetro desde aproximadamente 3-5 nm . La cubierta de Fe304 tuvo un espesor menor de 2 nm . El sólido luego se colectó con un imán y el solvente se decantó cuidadosamente. El sólido se lavó con THF (3x3 mi) . Después del secado bajo vacío por 2 horas, se obtuvieron 10.0 mg de producto de nanopart ícula con protección furtiva.

El enlazante oligopéptido luego se unió a la porfirina metalada. Primero, 5.0 mg de la porfirina se sometieron a reflujo en 5.0 mi de S0C12 a 100°C por 30 minutos. El exceso de S0C12 luego se removió bajo alto vacío, y el sólido resultante se secó adi c ionalmente bajo vacío por 3 horas. Luego, 4 mg de la secuencia de oligopéptido y 5 mi de THF se agregaron al sólido de porfirina y se agitó a temperatura ambiente por 5 horas. El THF luego se removió bajo vacío, y se obtuvo un sólido de color verduzco. La espectrometría de masas por ionización de electrorrocío (ESI, por sus siglas en inglés) mostró una mezcla de al menos 2 especies de porfirinas enlazadas (mono-pépt ido y di-péptido enlazado a porfirina) . El mismo procedimiento se utilizó para unir el enlazante oligopéptido a la porfirina no metalada.

Zn-TCPP (??) TCPP No metalada (P2) Para unir las porfirinas a las nanopartículas , la porfirina metalada-sólido de oligopéptido se disolvió en 10 mi de THF seco. Luego, 5.0 mi de esta solución se agregaron a 10.0 mg de las nanopartículas de Fe/Fe304 atadas a dopamina tetraetilenglicol , seguido por 1.0 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) y 8.0 mg de EDC. La suspensión resultante se sometió a sonicación por 1 hora a temperatura ambiente. El precipitado sólido se colectó por imán y se lavó completamente con THF (8x2 mi) . La muestra luego se secó bajo alto vacío por 5 horas. Se obtuvieron 8.0 mg de producto. El procedimiento se repitió para unir la porfirina no metalada a la nanopartícula .

Como se muestra en las Figs . 13 (I) -13 (II) , para ambas porfirinas atadas, la intensidad de emisión se eleva ligeramente menos que lo lineal con la concentración incrementada de las nanoplataformas . Esto es una primera indicación de la transferencia de energía de Forster (FRET) , como se discute a continuación. El número de porfirinas que se atan a una nanopartícula de Fe/Fe30 (d = 20 nm) en las Figuras 13(1) -13 (II) se estimó que es 4.8 (Figura 13(1)) y 4.5 (Figura 13 (II) ) .

La Figura 14 muestra la dependencia de la concentración de tetracarboxilato porfirina sódica dopada con zinc y tetracarboxilato porfirina sódica, en una relación molar relativa de 9 a 1, en PBS . Mientras que la primera banda de fluorescencia a ? = 609 nm muestra saturación, la segunda banda a ? = 657 nm muestra un máximo de intensidad a la concentración de c = 8.0xl0"6 M nanoplataformas . Cuando la concentración incrementa, la transferencia de energía de Fórster (FRET) incrementa: el salto de los estados excitados de porfirina a porfirina incrementa el grado de conversión interna (menos radiación) . De este modo, el rendimiento cuántico de fluorescencia no excede un máximo de F = 0.011 para las porfirinas unidad a Fe/Fe304. Las emisiones de la tetracarboxilato porfirina sódica dopada con zinc (?? = 607 nm, ?2 = 657 nm) son mayores en energía que aquellas de la tetracarboxilato porfirina sódica "libre" (?? = 654 nm, ?2 = 718 nm) . Por lo tanto, FRET se dirige hacia la porfirina "libre", la cual muestra un ligero mejoramiento de emisión relativa (f < 2.2 del análisis de los espectros mostrado en la Figura 15 cuando se unen a nanopartículas de Fe/Fe304) . El número de porfirinas atadas a una nanopartícula de Fe/Fe304 (d = 20 nm) en la Figura 14 se estima que es 52.

Los espectros de emisión del montaje de nanoplataforma (????'5 M) en PBS en la presencia de aproximadamente lxlO"8 M de urocinasa se representa en la Fig. 15. La tetracarboxilato porfirina sódica no atada se agregó a la nanoplataforma de Fe/Fe304 que presenta tetracarboxilato porfirina sódica dopada con zinc y tetracarboxilato porfirina en una relación molar relativa de 9 a 1 en PBS. A: c=2.8xl0"6 M de porfirina agregada, B: c=5.6xl0~7 M de porfirina agregada, C: c=8.4xl0"7 M de porfirina agregada, D: c=1.2xl0"7 M de porfirina agregada. Una disminución distante de la banda de fluorescencia es visible a ?? = 607 nm. La dependencia de concentración de la fluorescencia que ocurre de las otras dos bandas de fluorescencia a (?2 = 654 nm, ?3 = 718 nm) es no lineal. La razón del comportamiento no lineal observado se puede encontrar en el rendimiento cuántico de alta fluorescencia de la tetracarboxilato porfirina sódica no atada, no metalada. Se estimó F=0.082, el cual es aproximadamente ocho veces mayor que en el estado atado, cuando la concentración de porfirina grande en la esfera alrededor de la nanopartícula de Fe/Fe304 conduce a FRET incrementado y, en consecuencia, la desactivación de menos radiación de los estados excitados.

En la Figura 16, las relaciones de las integrales de las bandas de fluorescencia mostradas a ?a = 607 nm, ?2 = 654 nm y ?3 = 718 nm se grafican contra el porcentaje molar de tetracarboxilato porfirina sódica no atada agregada (como se mide por HPLC usando una estación de trabajo Agilent (HP 1050) equipada con un sistema de detección óptico) . Las gráficas de R = ?(?2)/?(??) y R = ?(?3)/?(?!) incrementan con el porcentaje molar incrementado de la porfirina no atada agregada. Son bastante lineales en el intervalo de concentración desde 0 a 7 por ciento molar de tetracarboxilato porfirina sódica no atada agregada. Por lo tanto, la concentración de porfirina que se "libera" por la enzima urocinasa, la cual estará escindiendo la secuencia de escisión de urocinasa (SRGSA, SEC ID NO: 2) , se puede medir registrando los espectros de fluorescencia de la nanoplataforma a diferentes intervalos de tiempo y comparando las intensidades de fluorescencia a las tres longitudes de onda. Todas las tres longitudes de onda permiten mediciones in vivo en el tejido de mamífero, especialmente cuando se acopla con técnicas de conteo de fotón único (microscopía de fluorescencia) .

EJEMPLO 13 Sensor de Urocinasa In Vitro En este ejemplo, la TCPP se ató vía un oligopéptido que contiene una secuencia de escisión específica de urocinasa (SGRSA, SEC ID NO: 2) a un ligando de dopamina-tetraetilenglicol . Este ligando luego se unió a las nanopartículas de Fe/Fe304. El montaje se preparó usando los mismos procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 12, excepto que solamente se utilizó un tipo de porfirina (es decir, solamente no metalada o solamente metalada) .

Aunque la banda de plasmón del núcleo de Fe interno no aparece en el espectro de UV/Vis debido a su diámetro pequeño, fue capaz de enfriar la luminiscencia que ocurre de TCPP. Este tipo de sensor se basa en el enfriamiento de los estados excitados de cromóforos (por ejemplo, porfirinas) con enfriadores orgánicos (por ejemplo, viológenos) o inorgánicos (por ejemplo, metal, aleación, y nanopartículas de núcleo/cubierta) . Debido a la proximidad de la nanopartícula (~ 2 nm) a la porfirina, el plasmón de superficie de la nanopartícula de núcleo/cubierta es capaz de enfriar los espectros de emisión de la porfirina químicamente atada. Una vez liberada por la escisión de urocinasa, la luminiscencia incrementa significativamente. Este incremento de luminiscencia se puede detectar espectralmente . Cuando se utilizan diversos cromóforos que presentan espectros de emisión perceptibles, la actividad de varias enzimas se puede detectar simultáneamente.

El mecanismo de interruptor de luz se probó usando 3 muestras de orina de ratas impregnadas con células de cáncer tipo MATB III (modelo de roedor para cáncer de mama agresivo) , puesto que la urocinasa puede pasar los ríñones del mamífero y retiene al menos alguna actividad en la orina. Las muestras se colectaron 5 días (control) y 36 días después de la impregnación de cáncer, respectivamente, e inmediatamente se congelaron a -80°C. Antes de la prueba, las muestras de orina se descongelaron y calentaron a 37°C. El siguiente procedimiento se utilizó para probar cada muestra .

El montaje de nanoplataforma de nanopart í cula de TCPP se disolvió en agua bidestilada usando sonicación por 30 minutos. Luego, 100 µ? de orina se agregaron a una solución 5 x 108 M del montaje de nanoplataforma en agua. La temperatura se mantuvo constante a 34°C. Los espectros de fluorescencia se registraron cada 2 minutos.

Como se puede ver de la Figura 17, la luminiscencia de TCPP incrementó establemente con el tiempo para la orina del día 36. El control (orina del día 5) no demuestra un incremento significativo de luminiscencia. La Figura 10 muestra la gráfica de las intensidades relativas de la luminiscencia de TCPP que ocurre a ? = 656 nm usando la medición mostrada en la Figura 17. El ensayo se probó dos veces usando la orina del día 36, y las mediciones en la Figura 18 muestran que fue altamente reproducible .

EJEMPLO 14 Ensayo de Urocinasa In vivo Un ensayo de urocinasa in vivo se probó en ratones hembra Charles River, los cuales se han impregnado con células de melanoma de ratón B16F19 10 días antes de estas mediciones. Los ratones se anestesiaron y luego se administró una solución de un montaje de TCPP de nanopart ícula de Fe/Fe304 a los ratones intravenosamente (IV) o vía inyección directa en los tumores (IT, por sus siglas en inglés) . La solución IV fue 200 ]ig del montaje de nanopart ícula en 200 mi de PBS . La solución IT fue 100 ug del montaje de nanopart ícula en 200 mi de PBS. Para medir la actividad del ensayo, los ratones se anestesiaron y colocaron bajo un microscopio de fluorescencia que emplea un detector de conteo de fotón único. Este instrumento se ha construido internamente. Las regiones de tumor en las patas traseras de los ratones se excitaron usando luz láser (láser de Ti : zafiro, ? = 870 nm, P = 6.5 mW) en la región IR.

Los resultados de los espectros de conteo de fotón único, de los miembros derecho e izquierdo de los ratones, registrados a través de un microscopio de fluorescencia (resolución: l m x l m x l m) se ilustran en las Figs . 19(A)-19(F) (rojo: miembro izquierdo; azul: miembro derecho) . La figura 19A muestra los resultados del ratón 1, el cual fue inyectado IT 30 minutos antes de la medición. La figura 19B muestra los resultados del ratón 2 (sin tumores) , el cual fue inyectado IV 12 horas antes de la medición. La figura 19C muestra los resultados del ratón 3 (que porta tumores en ambas patas) , el cual fue inyectado IV 12 horas antes de la medición. La figura 19D muestra los resultados del ratón 4, el cual inyectado IV 24 horas antes de la medición. La figura 19 E muestra los resultados del ratón de control, no inyectado IT ni IV. El cuadro F es una repetición de C de 1 ratón 7.

La porfirina, TCPP, requiere excitación tri-fotónica a esta longitud de onda de excitación. Es remarcable que las concentraciones de señal obtenidas en las patas derechas de los ratones que portan tumor se correlacionan con el tamaño de tumor, mientras que la señal en el miembro izquierdo aparentemente no. La explicación de hipótesis es que la absorción del montaje de nanopart ícula por los tumores es demasiado rápida, que el primer tumor, lo cual se encuentra por las nanopart ículas inyectadas intravenosamente, incorpora casi todo. Se encontró que la inyección IT es menos eficiente que la inyección IV, debido a que la urocinasa no tiene el tiempo para escindir la mayoría de las secuencias de escisión y la porfirina no se ilumina.

EJEMPLO 15 Montajes de Nanopartícula-Porfirina En este Ejemplo, las nanopart í culas de Fe30 con protección furtiva se enlazaron a una o más ftalocianinas y/o clorinas orgánicas vía secuencias de consenso de proteasa objetivo. Los luminóforos presentan distintos espectros de emisión en la región entre 650 y 900 nm . Los ratones Charles River que portan melanomas B16F10 se inyectaron intravenosamente con 100 µg del ensayo de nanopart ícula en PBS . El área de objetivo luego se excitó usando un láser de Ti ¡zafiro a longitudes de onda que varían entre 800 y 1,050 nm . Una vez que la nanoplataforma está en la cercanía de tejido canceroso, el enlace se escinde por las proteasas. Esto detiene el enfriamiento de la luminiscencia por la nanopart ícula , y el luminóforo se ilumina. La intensidad de la luz se correlaciona directamente con el nivel de actividad de enzima. Además, se encontró una correlación positiva entre el tamaño de tumor y la intensidad de la luz emitida. Este mecanismo podría ser usado como una referencia visual para la localización de tumores, y como un mejorador de contraste luminiscente durante la cirugía de remoción de tumor. La Fig. 20 muestra la cinética de escisión de proteasa típicamente observada como una función de la concentración de proteasa (urocinasa) , a un pH 6.8 y temperatura de 36°C.

EJEMPLO 16 Sensor de Retrodispersión de Luz En este Ejemplo, se utilizó un espectrómetro UV/Vis para medir la actividad de uPA en dos diferentes experimentos.

Se preparó una primera plataforma usando nanoplat aformas de Fe/Fe304 enlazadas vía una secuencia de consenso de urocinasa (DGGSGRSAGGGC, SEC ID NO: 68) . Las nanoplataformas incluyeron un recubrimiento furtivo de ligando y porfirina unida. La solución se preparó disolviendo 0.010 mg de las nanoplataformas enlazadas en 3.0 mi de amortiguador de fosfato (pH = 6.8) que contiene 100 mi de orina de rata de ratas con cáncer pancreático avanzado (concentración estimada de urocinasa: 5 x 10"10 M) . El ensayo luego se excitó usando un haz de luz. El cambio en las propiedades ópticas es claramente perceptible en la escisión del enlazante de ol igopépt idos por urocinasa. El espectro de retrodispersión UV/Vis de un dímero de nanopart ícul a se muestra en la Fig. 21 durante un período de 120 minutos.

Se preparó un segundo montaje de nanoplataforma de acuerdo con el Ejemplo 9 usando una atadura de TCPP . Se disolvieron 1.0 mg de las nanoplataformas en 3.0 mi de amortiguador acuoso (0.01 M PBS) . La temperatura se mantuvo constante a 36.8°C. Luego, la urocinasa se agregó a la mezcla de PBS acuosa a una concentración de lxlO"10 M. El ensayo luego se excitó usando un haz de luz. El espectrómetro uv/Vis registró la extinción óptica E = absorción (A) + dispersión (S), a t = 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, y 40 minutos. Se asumió que el espectro de absorción no cambia durante 45 min, como lo mostró una medición de control tomada sin urocinasa. Por lo tanto, el cambio observable de la extinción se causa por el cambio de dispersión una vez que la atadura de oligopéptido se escinde por la enzima. La Figura 22 muestra los cambios de extinción durante un período de 40 min .

Para visualizar la cinética de reacción, la intensidad de señal a 440 nm , dividida por la intensidad de señal a 600 nm se gráfico contra el progreso de tiempo. Como lo indica la Figura 23, se ha . obtenido una inclinación lineal. La cinética observada permite una estimación de la cantidad de proteasa en el tejido. Es decir, la velocidad de escisión se relaciona directamente con la concentración de urocinasa, y por consiguiente, la velocidad de escisión se puede correlacionar con la agresividad del tumor.

EJEMPLO 17 Propiedades fotofísicas de montaj es de Nanopart ículas de Fe/Fe304 Las nanopart ículas de Fe/Fe304 se estabilizaron usando Ligandos 1-3, con ligandos 2-3 que presentan porfirinas químicamente unidas. Las nanopart ícul as tuvieron un diámetro de núcleo de aproximadamente 5.4 nm, y un espesor de cubierta de aproximadamente 1.5 nm .

Los ligandos se agregaron a las nanopart ícul as en THF anhidro (10/1 por peso con respecto a la masa de Fe/Fe304 ) y se sometieron a sonicación por 5 min, luego se agitaron continuamente por 24 h. Las nanopart ículas bimetálicas recubiertas luego se separaron del medio de dispersión con un imán permanente fuerte. Las nanopart ículas bimagnét icas luego se resuspendieron en THF, y se recolectaron. La sonicación por 30 segundos, seguida por agitación por 5 min redispersó las nanopart ículas en el medio líquido. El proceso de lavado/redispersión se repitió 10 veces. El solvente residual luego se removió en una corriente de argón. Finalmente, las nanopart í culas bimagnéticas recubiertas se suspendieron/disolvieron en H20 desionizada estéril.

La excitación luego se realizó usando un láser de Ti: zafiro a las longitudes de onda indicadas en la Tabla V a continuación. La emisión se observó usando un espectrómetro de fluorescencia Fluoromax® 2 (HORIBA Jobin Yvon; Edison, NJ) . La Tabla V muestra las propiedades fotofísicas de estos nanomontajes.

Tabla V - Propiedades Fotofísicas de los Montaj Fe/Fe304/porfirina Aex : Longitudes de onda de excitación, Aem: Longitudes de onda de emisión.

* Es posible la excitación de multifotoñes usando un láser de Ti ¡zafiro.

El rendimiento cuántico de fosforescencia no excedió un máximo de F = 0.011 para las porfirinas unidas a Fe/Fe304. La emisión de los núcleos de hierro (0) no fue detectable. Sin embargo, la capacidad de enfriamiento de luminiscencia de las nanopartículas de Fe/Fe304 fue claramente perceptible. El rendimiento cuántico de fosforescencia de las porfirinas no unidad a nanopartículas fue aproximadamente 2.2 a 2.5 veces mayor.

La Figura 24 muestra espectros de absorción UV/Vis típicos de la tetracarboxifenil porfirina (TCPP) "libre" y unida a Fe/Fe304, junto con los complejos de zinc de la porfirina en H20 a una concentración de 7.5 x 10"6 M. La relación de Fe/Fe304 a porfirina se estimó que es 1:1.2. Como se ve en la Figura 11, las posiciones de pico de la banda Soret (banda casi ultravioleta extremadamente intensa) son ? = 417 nm para TCPP y ? = 425 nm para Zn-TCPP. Los coeficientes de absorción son 4.8 x 105 M"1 crtf1 para TCPP y 4.1 x 105 M"1 cm"1 para Zn-TCPP, de acuerdo con la literatura. La unión química a las nanopartículas de Fe/Fe304 bimagnéticas vía un puente de dopamina-tetra (etilenglicol) disminuye el coeficiente de absorción de TCPP por un factor de 2.1, mientras que solamente una disminución menor (<1.1) se observa cuando se une Zn-TCPP.

EJEMPLO 18 Valores de Solubilidad y SAR de Nanoplataformas En este Ejemplo, se evaluaron los valores de solubilidad y SAR de varios montajes de nanopartícula usando Ligandos 1-7. Los ligandos se agregaron a las nanopartículas (descritas en las Tablas a continuación) en THF anhidro (10/1 por peso con respecto a la masa de Fe/Fe304) y se sometieron a sonicación por 5 min, luego se agitaron continuamente por 24 h. Las nanopartículas bimetálicas recubiertas luego se separaron del medio de dispersión con un imán permanente fuerte. Las nanopartículas bimagnéticas luego se resuspendieron en THF, y recolectaron. La sonicación por 30 segundos, seguida por agitación por 5 min redispersó las nanopartículas en el medio líquido. El proceso de lavado/redispersión se repitió 10 veces. El solvente residual luego se removió en una corriente de argón. Finalmente, las nanopartículas bimagnéticas recubiertas se suspendieron/disolvieron en H20 desionizada estéril. Se utilizaron los ligandos 1-7 a continuación.

Ligando 5 Para determinar la solubilidad, amortiguador de fosfato (0.1 M, pH = 6.8) se agregó por goteo a 0.25 mg de las nanopartículas en una cubeta de vidrio. La suspensión se agitó continuamente con un agitador micromagnético (Fisher) . La dispersión de luz de la suspensión se registró a 700 nm. Una vez que las partículas se disolvieron, la extinción (es decir, absorción y dispersión de luz) a 700 nm disminuyó a menos de E = 0.01.

La velocidad de absorción específica (SAR, por sus siglas en inglés) se calculó por SAR = c*AT/At, donde C es la capacidad de calor específico de la muestra, T es la temperatura, y t es el tiempo. Para determinar los valores de SAR, el aparato de hipertermia se desarrolló internamente y usa un calentador de inducción de trabajo pesado modificado convertido para medir el cambio de temperatura de la muestra.

En la puesta en marcha, se utilizó una sonda IR remota para detectar el cambio de temperatura. El aparato usa detección de fibra óptica remota y su frecuencia se fijó.

Tabla VI - Valores de Solubilidad y SAR de Com inaciones de Nanopartículas-Ligando (1-4) * Usado en los ensayos de ratón.

† Sólido en H20.

Diámetro del núcleo de nanopartícula y espesor de la cubierta en nm.

El error relativo en las mediciones de SAR es ± 8 porciento relativo.

Tabla VII - Valores de Solubilidad y SAR de Combinaciones Nanopartícula-Ligando (5-7) * Usado en los ensayos de ratón.

Tabla VIII - Valores de SAR de combinaciones de nanopartícula/ligando adicionales comparadas con las partículas de Fe comerciales Fe30, (Feridex®; Bayer Healthcare) . 2 Fe203 (Ferrotech; Nashua, NH) .

EJEMPLO 19 Imágenes de Resonancia Magnética Dos ratones hembra CB57BL/6 de ocho semanas de edad (eutanizados antes de este experimento) se inyectaron con 0.50 mi de agua (A) o nanopartículas magnéticas (B-D) . El sitio (B) contuvo 500 mg de nanopartículas de Fe/Fe304 con recubrimiento furtivo. El sitio (C) contuvo 25 mg de células madre de ratón, aisladas de médula ósea que se han dejado que absorban nanopartículas de Fe/Fe304 con recubrimiento furtivo atadas a porfirina. El sitio (D) contuvo 500 mg de nanopartículas de óxido de hierro comercialmente disponibles (Feridex®) . Los datos de MRI se adquirieron usando una MRI de imán permanente Hitachi 7000. Se utilizaron secuencias de impulso de Ti y T2 estándares. Como se muestra en la imagen de MR en la Figura 25, excepto para la inyección de agua, se obtuvieron contrastes de T2 perceptibles para todas las inyecciones .

EJEMPLO 20 Tratamiento de Hipertermia de Melanomas de BF16F10 en Ratones Charles River En este Ejemplo, se probó el efecto de las nanoplataformas de la invención en ratones Charles River con melanomas BF16F10 ubicados en la parte superior de sus patas traseras. Se utilizaron nanopartículas individuales para estos experimentos (es decir, las nanopartículas no se enlazaron por secuencias de consenso de proteasa) . Veinte ratones con BF16F10 se inocularon con células de melanoma de ratón en las partes inferiores de ambas patas traseras, y luego se dividieron en cuatro grupos. Las inyecciones de las plataformas teranósticas fueron directamente en la parte superior de la pata trasera y procedieron como sigue: • Un grupo ("pata derecha de control") se inyectó con 50 ]ig de nanopartículas de Fe/Fe304 recubiertas con ligando furtivo que presentan porfirinas TCPP unidas, se disolvió en 50 µ? de PBS en el día 6. En el día 8, se inyectaron 100 ug de las nanopartículas en 100 µ?. de PBS. En el día 10, se inyectaron 150 ig de las nanopartículas en 150 ih de PBS. Finalmente, en el día 12, se inyectaron 150 ug de nanopartículas en 150 µ?? de PBS.

• El segundo grupo ("pata derecha experimental") se inyectó de acuerdo con el mismo programa de inyección, seguido por tratamiento de hipertermia inmediato por 10 minutos. La temperatura incrementó a 49.8°C como se confirmó usando un dispositivo de medición de temperatura por fibra óptica (Neoptix) .

• El tercer grupo ("pata izquierda experimental") se inyectó solamente con PBS (solución salina amortiguada con fosfato) y se realizó irradiación AC/magnética . La temperatura incrementó a 42 °C. • El cuarto grupo ("pata izquierda de control") no fue tratado.

Los ratones fueron eutanizados después del día 14. Las trazas de las nanoplataformas se encontraron en el pulmón, bazo, e hígado (solamente trazas menores) . La mayoría del material (estimado que es más de 60 por ciento) se encontró como hierro residual en los tumores por si solos usando tinción con azul de Prusia.

La velocidad de inhibición de crecimiento de cáncer usando la hipertermia magnética fue 76% si los melanomas no tratados se utilizan como el control. La inyección de la nanoplataforma aún sin hipertermia condujo a 50% de inhibición de crecimiento de cáncer, lo cual se puede atribuir al biodeterioro de las nanopartículas y la química mejorada de hierro (II/III) de especies de oxígeno reactivas.

El volumen de tumor promedio (mm3) con el tiempo desde la fecha de incubación de las células de tumor en las patas de ratones se representa en la Fig. 26. Como se puede ver en la Fig. 26, la pata derecha experimental (nanoplataforma seguida por hipertermia) tuvo una inhibición significativa de crecimiento de tumor cuando se compara con el grupo no tratado. La velocidad de inhibición de crecimiento usando hipertermia magnética fue 78%, si un grupo adicional que recibió 5 inyecciones de PBS sin hipertermia se utiliza como un control (gráfica no mostrada) .

Las nanopart ículas que presentan la unión de porfirina también se inyectaron intravenosamente en otros dos grupos de ratones para determinar la absorción de tumor con este método para administrar las nanoplataformas . Un grupo fue administrado, intravenosamente, con 200 ig de la nanoplataforma en 200 µ? de PBS, mientras que el otro grupo fue administrado, intravenosamente, con 500 g de la nanoplataforma en 500 µ? de PBS. Los ratones fueron eutanizados y examinados. De nuevo, la mayoría (aproximadamente 60%) de las nanoplataformas administradas fueron encontradas en los tumores 12 horas después de la inyección.

EJEMPLO 21 Experimentos de Calentamiento Magnético En este Ejemplo, los ratones Charles River se inyectaron con varias soluciones en la parte superior de las patas traseras. El sitio de inyección luego se calentó usando un campo magnético A/C (366 kHz, H: 5.0 kAm"1) . Los sitios no calentados sirvieron como controles. El cambio de temperatura (??) con el tiempo se monitoreó con una sonda de fibra óptica en la parte superior de la pata trasera de los ratones. Los resultados se muestran en la Fig. 27. Los parámetros de prueba fueron como sigue: Tabla IX - Parámetros de prueba para Experimentos Calentamiento Magnético In vivo *Ferrotech (Nashua, NH) .

EJEMPLO 22 Cálculo y Optimización de valores de SAR En este Ejemplo, los cálculos teóricos se realizaron para determinar el efecto del tamaño de partícula y forma de campo magnético en valores de SAR. Primero, los valores de SAR se calcularon como una función del tamaño con base en SAR = C*AT/At . Las nanopartículas de Fe203 comercialmente disponibles sirvieron como una referencia. Como se muestra en la Fig. 28, se encontró que el tamaño promedio de la nanopartícula (diámetro en nm) así como también la distribución de tamaño afectan significativamente la SAR. Los resultados muestran que para el aparato de hipertermia magnética de 366 kHz, la distribución de tamaño óptima de las nanopartículas fue aproximadamente 10-12 nm para nanopartículas de Fe, y 17-19 nm para nanopartículas de Fe203. Las curvas poco profundas corresponden a la ampliación subsecuente de la distribución de tamaño (s = 0-0.5 de una distribución de tamaño de logaritmo normal) para explicar valores experimentales más realistas. Una distribución de tamaño más estrecha es deseable si el tamaño de nanopartícula promedio es cercano al deseable .

El efecto de la forma (seno, triangular, cuadrada) del campo magnético en los valores de SAR de nanopartículas de Fe (negro) y Fe203 (blanco) también se evaluó usando cálculos teóricos. Un resumen de los cálculos se muestra en la Fig. 29. Los cálculos muestran que los valores de SAR se pueden incrementar significativamente si se usan campos magnéticos cuadrados (debido a la contribución incrementada de relajación Neel a los valores de SAR completos) .

EJEMPLO 23 Datos de Nanodispositivo In Vi tro En este Ejemplo, se determinaron los valores de SAR, ATmax y solubilidad de varios nanodispositivos . Algunas de las nanopartículas en los nanodispositivos incluyeron capas protectoras de aminosiloxano (ASOX) , y/o etiquetas de biotina. Se utilizaron ligandos de tetraetilenglicol . Los ligandos no presentan porfirinas unidas. El calentamiento magnético se realizó con un aparato de hipertermia magnética desarrollado internamente usando un campo magnético A/C (H: 5.0 kAm"1, frecuencia 366 kHz (patrón de onda cuadrado)). El aparato usa un calentador de inducción de trabajo pesado convertido para medir el cambio de temperatura de una muestra, y detección de fibra óptica remota. El cambio de temperatura se detectó usando una sonda IR remota . La solubilidad de la nanoplataforma se determinó usando la prueba descrita en el Ejemplo 5 anterior. Los resultados se presentan en la Tabla X a continuación.

Tabla X - Datos de Nanodispositivo In Vitro * Concentración: 0.050 mg/ml de nanopartículas con recubrimiento furtivo.

Concentración de Fe de 0.0107-0.1150 mg/ml (como se determinó por detección de fluorescencia de plasma inductivamente acoplado (ICP, por sus siglas en inglés)) . † El espesor del Fe304 en las nanopartículas de la invención es aproximadamente 1.25±0.25 nm.

** Capa de ASOX ±2.1 nm.

*** Capa de ASOX ±2.5 nm.

+ Ferrotech.

EJEMPLO 24 Modelación del ligando En este Ejemplo, los cálculos se realizaron para determinar el número adecuado de ligandos para la cobertura de superficie completa de las nanopartículas. Para los cálculos, se asumió que las nanopartículas son formas como esferas perfectas donde el área de superficie {A) = 4nr2 = dn2. El área de superficie de nanopartículas esféricas como una función de sus diámetros se muestra en la Fig. 30.

La demanda de espacio de una unidad de dopamina, la cual es el "anclaje" para los ligandos de la invención se ha calculado que es 1.094 nm2. Para los propósitos de cálculos adicionales, se asumió que cada ligando tiene la misma afinidad hacia el enlace de superficie de modo que el enlace de múltiples ligandos para formar una monocapa en la superficie de la nanopartícula se puede describir como la distribución de Poisson: donde ? es el número esperado de ocurrencias, k es el número entero de ocurrencias, y f es la probabilidad de exactamente k ocurrencias. La Fig. 31 muestra el número ideal de ligandos anclados a dopamina por nanopartícula (para cobertura de superficie completa) como una función del diámetro de nanopartícula .

De acuerdo con este modelo contemplado, se puede distinguir el efecto de las variaciones en el diámetro de nanopartícula en el número de ligandos que forman una monocapa en la superficie de nanopartículas . Estos resultados se muestran en la Fig. 32. L: diámetro principal como se indica; L 0.9: 90 % con relación al diámetro principal; L 0.8: 80% con relación del diámetro principal; L 1.1: 110% con relación al diámetro principal; y L 1.20: 120% con relación al diámetro principal .

EJEMPLO 25 Monitoreo In Vitro del Tratamiento En este Ejemplo, se analizaron muestras de orina canina de perros diagnosticados con cáncer y que se sometieron a varias etapas de tratamiento usando los mismos procedimientos generales resumidos en los Ejemplos 13 y 14 con respecto a la orina de rata y ratones. Tres muestras de orina de caninos se obtuvieron del laboratorio de Medicina Veterinaria en la Universidad del Estado de Kansas. Las muestras se identif caron vía número de código y el análisis se realizó sin el conocimiento del estado de salud de cada animal . Las muestras de orina se colectaron y almacenaron a -80°C antes del experimento. El experimento se realizó en amortiguador PBS 1M (pH = 7.2) a 35°C. Para preparar la nanoplataforma, la TCPP se ató vía un oligopéptido que contiene una secuencia de escisión específica de urocinasa (SGRSA, SEC ID NO: 2) a un ligando de dopamina-tetraetilenglicol . Este ligando luego se unió a las nanopartículas de Fe/Fe304. El montaje se preparó usando los mismos procedimientos descritos anteriormente en el Ejemplo 12, excepto que solamente se utilizó una porfirina no metalada. El montaje de nanoplataforma de nanopartículas de TCPP se disolvió en el amortiguador usando sonicación por 30 minutos. La concentración final de nanopartículas en la solución fue 15 mg/1. Luego, 2 mi de la solución se llevaron a una cubeta de fluorescencia y se registró la lectura inicial. A esta solución se agregaron 25 µ? de cada muestra de orina, se mezcló, y las lecturas se registraron cada 2 minutos .

Las muestras luego se decodificaron y los resultados se analizaron. La muestra A fue de un perro normal. La muestra B fue de un perro diagnosticado con sarcoma anaplásico (2do cáncer) , sometido a quimioterapia con doxorrubicina , y que responde bien al tratamiento. La muestra C fue de un perro recientemente diagnosticado con linfoma renal, y enfermo. Las señales de fluorescencia generadas después de la adición de las muestras de orina de perro se graficaron contra el tiempo. La gráfica de tiempo contra el mejoramiento de fluorescencia indicó la cantidad de urocinasa presente en cada muestra.

Como se muestra en la Fig. 33, la muestra de orina obtenida del perro apenas diagnosticado con cáncer (Muestra C) mostró un rápido incremento de fluorescencia, y las mediciones se colectaron cada minuto, indicando una mayor velocidad de hidrólisis de enzima en comparación con las otras dos muestras las cuales solamente se colectaron cada 2 minutos. La muestra de orina del pero sometido a quimioterapia (Muestra B) tuvo un mejoramiento detectable de fluorescencia que el control (Muestra A) , pero fue aún mucho menor que la Muestra C. La orina puede contener moléculas fluorescentes que podrían excitarse en el intervalo de longitud de onda de excitación de 400-500 nm de modo que es importante analizar la muestra de orina por espectroscopia de fluorescencia y UV antes de los ensayos. Los datos indican la capacidad de los ensayos para monitorear y rastrear el progreso del tratamiento de cáncer in vitro, con base en los niveles de actividad enzimática.

EJEMPLO 26 Suministro de Células Madre de Nanoplataformas En este Ejemplo, se utilizaron células madre para suministrar las nanoplataformas al tejido canceroso. 1. Nanopartículas de Fe/Fe304 (Bi) Magnéticas Con Recubrimiento Furtivo Atadas a Porfirina Las nanopartículas de Fe/Fe304 etiquetadas con dopamina con recubrimiento furtivo que presentan TCPP atada se prepararon por reducción de Fe (III) seguido por formación de una cubierta de aminosiloxano . Las nanopartículas de núcleo/cubierta de Fe/Fe304 se sinterizaron por NanoScale Corporation (Manhattan, KS) . La adición del ligando furtivo orgánico en la presencia de CDI unió una capa furtiva orgánica anclada a dopamina alrededor de la capa de aminosiloxano. La etapa final consistió de la adición de unidades de dirección de TCPP a las nanopartículas de Fe/Fe30/ASOX/furtivo haciendo reaccionar los grupos hidroxilo terminales de las unidades de tetraetilenglicol con un grupo ácido carboxílico de TCPP.

La Microscopía Electrónica de Alta Resolución (HRTEM, por sus siglas en inglés) reveló que las nanopartículas están compuestas de nanobarras (5-10 nm de longitud, 1-4 nm de diámetro) . Después de la reducción de borohidruro de sodio, cada nanobarra contuvo un núcleo de Fe(0), como se identificó por HRTEM (constante de red: 0.287 nm) , una cubierta de Fe304 (espesor de aproximadamente 0.50-1.0 nm) . Las nanobarras forman agrupamientos de 16.0±1.5 nm de diámetro. Las nanopartículas tuvieron un área de superficie BET de aproximadamente 72.2 m2/g, un área de superficie acumulativa de adsorción de BJH de poros que tienen entre 17.000 Á y 3000.000 Á de 86.5 m2/g, y un área de superficie de desorción de BJH de poros que tienen una anchura entre 17.000 Á y 3000.000 Á de 91.1 m2/g. El análisis de fases (difracción de rayos X en polvo - XRD) se determinó usando una difracción de rayos X en polvo (Shimadzu, XRD-6000) para determinar que las nanopartículas son de estructura nanocristalina o amorfa. Los resultados de XRD se muestran en la Fig. 55, y muestran todas las líneas principales para Fe304, así como también para el núcleo de Fe (junto con óxido de hierro amorfo) .

La síntesis de la capa de aminosiloxano (ASOX, por sus siglas en inglés) se realizó adaptando un procedimiento de la literatura: 20 mg de las nanopartículas de Fe/Fe304 se suspendieron en 10 mi de THF. Después de la sonicación por 30 minutos, el sólido no disuelto (<1 mg) se separó por precipitación a través de centrifugación de baja velocidad (1500 RPM, 5 min) . La solución clara se transfirió a otro tubo de ensayo y a la solución se agregaron 0.30 mi de 3-aminopropiltrietoxilsilano, seguido por sonicación. Las nanopartículas recubiertas luego se colectaron por centrifugación de alta velocidad (15,000 RPM por 15 min). Después del lavado y redispersión en THF, las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX (7.5 mg) se colectaron, se secaron en alto vacío, y se almacenaron bajo argón. El espesor de la cubierta de aminosiloxano que rodea los agrupamientos completos de Fe/Fe304 fue de 2.0±0.4 nm, que es consistente con un diámetro promedio de las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX de 20±2.3 nm. Usando el programa IMAGE (NIH) , el índice de polidispersidad de las nanopartículas de Fe/Fe30/AS0X se determinó que es 1.15.

La capa de ligando furtivo se sintetizó disolviendo 40 mg de ligando a base de dopamina (Ll) en 5.0 mi de THF, junto con 20 mg de nanopartículas de Fe/Fe30/ASOX y 1.0 g de CDI se agregó como un sólido, seguido por sonicación. Las nanopartículas luego se colectaron por centrifugación de alta velocidad (15,000 RPM por 15 min.). Después del lavado y redispersión en THF, las nanopartículas de Fe/Fe304/furtivo (15 mg) se colectaron, se secaron en alto vacío, y se almacenaron bajo argón.

La porfirina se unió a las nanopartículas disolviendo 2.5 mg de TCPP en 5.0 mi de THF, junto con 20 mg de nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/furtivo, y se agregaron 1.0/0.05 g de EDC/HOBT como sólidos, seguido por sonicación. Las nanopartículas unidas a porfirina luego se colectaron por centrifugación de alta velocidad (15,000 RPM por 15 min.). Después del lavado y redispersión en THF, las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/furtivo etiquetadas con TCPP (13.5 mg) se colectaron, se secaron en alto vacío, y se almacenaron bajo argón. Usando espectroscopia de UV/Vis (Xabs(TCPP) = 416 nm, = 365,000 M"1 cm"1) se determinó que 5±0.5 unidades de TCPP se unieron a una nanopartícula de Fe/Fe304/ASOX con recubrimiento furtivo en promedio. El ligando furtivo tuvo una longitud de 2.5 nm, de modo que las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/furtivo resultantes fueron 25±2.3 nm de tamaño (diámetro) .

La demanda de espacio para el anclaje de dopamina es 1.094 nm2 (AM1) . Una nanopartícula de Fe/Fe304/ASOX de 20 nm de diámetro puede unir 1150 ligandos orgánicos. Las etiquetas de porfirina tienen un diámetro de 1.95 nm (A 1) . La relación molar de ligandos Ll/Ll-TCPP fue 1000/3.5. Asumiendo una distribución de Poisson, 99.33% de las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/furtivo a la relación elegida (5 unidades de TCPP por nanopartícula) presentan al menos una unidad de TCPP químicamente enlazada. Se determinó que la solubilidad de las nanopartículas de Fe/Fe304 orgánicamente recubiertas es 2.25 mg/ml, y la Velocidad de Adsorción Específica (SAR) a las condiciones de campo descritas aquí fue 620±30 Wg"1 (Fe) . Se determinó que el potencial zeta de las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/furtivo-TCPP usando Zeta Plus (instrumentos Brookhaven) es 34 mV en amortiguador de PBS 0.1 M a 298K. El área de superficie de BET se determinó que es 72±2 m2 g"1. 2. Cultivo de tejido de células madre neurales C17.2 y células de melanoma B16-F10 Las células de melanoma B16-F10 se compraron de ATCC (Manassas, VA) y se mantuvieron en Medio Eagle Modificado con Dulbecco (DMEM; Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS,- Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) y 1% penicilina-estreptomicina (Invitrogen) a 37 °C en una atmósfera humidificada que contiene 5% dióxido de carbono.

Las células madre neurales C17.2 (NSCs) , un obsequio de V. Ourednik (Universidad del Estado de Iowa; originalmente desarrollado en el laboratorio de Evan Snyder) , se mantuvieron en DMEM suplementado con 10% FBS (Sigma-Aldrich) , 5% suero de caballo (Invitrogen) , 1% Glutamina (Invitrogen) , y 1% penicilina-estreptomicina (Invitrogen) . 3. Citotoxicidad de nanopartículas de Fe/Fe304 en células madre neurales y células B16-F10 Los efectos citotóxicos potenciales de las nanopartículas de Fe/Fe304 (NanoScale Corporation, Manhattan, KS) se estudiaron incubando NSCs C17.2 y células de melanoma B16-F10 con diferentes concentraciones de nanopartículas (como se determina por el contenido de hierro) . Las células NSCs y B16-F10 se colocaron en placas a 50,000 células/cm2 y se incubaron durante la noche con sus medios respectivos que contienen nanopartículas a concentraciones de 5, 10, 15, 20, o 25 µ9/p?1 de hierro. Después de la incubación, el medio se removió y las células se lavaron dos veces con DMEM. Las células se recogieron vía tripsinización y los números de células vivas y muertas se contaron vía un hemocitómetro y tinción con azul de Tripano donde las células viables aparecen incoloras y las células no viables son teñidas en azul. Las células NSCs y B16-F10 se utilizaron en tres ensayos separados y cada experimento se hizo por triplicado.

El efecto tóxico de las nanopartículas de Fe/Fe304 incrementó con la concentración de hierro incrementada. La evaluación de la viabilidad celular para concentraciones variadas de nanopartículas de Fe/Fe304 en NSCs se muestra en la Fig. 34 y en células de cáncer B16-F10 se muestra en la Fig. 35. De manera interesante, las nanopartículas de Fe/Fe304 mostraron un efecto tóxico incrementado en las células B16-F10 en comparación con las NSCs . Las NSCs toleraron bien las nanopartículas de Fe/Fe304 hasta la concentración de 20 ug/ml de hierro (Fig. 34) . Sin embargo, el número de células B16-FIO se disminuyó en la exposición a solamente concentración de 5 ug/ml de hierro (Fig. 35) . 4. Estrategia y eficiencia de carga de células madre La eficiencia de carga de las nanopartículas de Fe/Fe304 en NSCs se evaluó usando el kit de tinción de Azul de Prusia de Perl (Polysciences , Inc., arrington, PA) . Después de la incubación durante la noche en medio NSC que contiene nanopartículas de Fe/Fe304 (25 ug/ml de Fe) , las NSCs se lavaron dos veces con DMEM y PBS y se fijaron con 4% glutaraldehído por 10 min. Las NSCs fijadas se incubaron en 4% ferrocianuro de potasio y 4% de HCl por 20 minutos. Después de 20 min de incubación, las NSCs se lavaron dos veces con IX PBS y contratiñeron con solución de fast red nuclear por 30 minutos. Las imágenes se capturaron usando un microscopio Zeiss Axiovert 40 CFL (New York) y una cámara Jenoptik ProgRes C3 (Jena, Alemania) .

La eficiencia de carga de NSCs con varias concentraciones de hierro de nanopartículas de Fe/Fe304 también se determinó espectrofotométricamente usando un método de estimación de ferrozina y hierro (Riemer et al., ensayo colorimétrico basado en ferrozina para la cuantificación de hierro en células cultivadas. Anal. Biochem. 331 (2) 370-75 (2004)). Para estimar la concentración hierro por célula única, la concentración de hierro total de células a cada concentración de nanopartícula de Fe/Fe304 se dividió por el número de células totales. Para este método, las células se incubaron durante la noche con medio de NSC que contiene diferentes concentraciones de nanopartículas de Fe/Fe304 y luego se lavaron dos veces con DMEM y IX PBS . Todas las NSCs (células de control y células cargadas con varias concentraciones de hierro de nanopartículas de Fe/Fe304) se sometieron a tripsinización, se centrifugaron, y se resuspendieron en 2 mi de agua destilada. Las células luego se sometieron a lisis agregando 0.5 mi de HCl 1.2 M y 0.2 mi de ácido ascórbico 2 M y se incubaron a 65-70°C por 2 horas. Después de 2 horas, se agregaron 0.2 < mi de reactivo que contiene Ferrozina 6.5 mM (HACH, Loveland CO) , neocuproína 13.1 mM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) , ácido ascórbico 2M (Alfa Aesar, Ward hill, MA) y acetato de amonio 5M (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) y se incubaron por 30 minutos a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, las muestras se centrifugaron a 1000 RPM por 5 minutos, y la densidad óptica del sobrenadante se midió por espectrofotómetro UV-VIS (Shimadzu, Columbia, MD) a 562 nm. Una curva estándar se preparó usando 0, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 2, y 5 ug/ml de muestras de sulfato de amonio ferroso. El agua con todos los otros reactivos se utilizó como una solución testigo .

Las nanopartículas de Fe/Fe304 se cargaron eficientemente en NSCs después de la tinción con azul de Prusia, las nanopartículas de Fe/Fe304 se detectaron en NSCs como material de tinción azul (Fig. 36) . Las imágenes de microscopio electrónico de NSCs mostraron nanopartículas de Fe/Fe30 cargadas como agregados en el citoplasma celular (Fig. 37) . Más de 90% de las células se cargaron con nanopartículas de Fe/Fe304. La eficiencia de carga de nanopartículas de Fe/Fe304 en NSCs incrementó con la concentración incrementada de nanopartículas de Fe/Fe30 en el medio. La concentración más alta de 1.6 pg de hierro por célula se identificó en las células incubadas con medio que contiene 25 µg/ml de hierro (Fig. 38) .

Las nanopartículas de Fe/Fe304 pueden haber aparecido como agregados antes que como nanopartículas de Fe/Fe304 únicas en el citoplasma de las células cargadas debido a que las nanopartículas de Fe/Fe304 marcadas con porfirina pueden haberse agrupado debido a que se adsorbieron a ácidos grasos o proteínas hidrofóbicas que se tomaron por el receptor de LDL . El agrupamiento de las partículas originalmente superparamagnéticas puede haber cambiado su comportamiento magnético a ferromagnético . 5. Cambios de temperatura inducidos por AMF in vi tro Para verificar el incremento de temperatura por NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 en un ambiente de tumor simulado, las NSCs se cargaron durante la noche con nanopartículas de Fe/Fe304 en un ambiente de tumor simulado, las NSCs se cargaron durante la noche con nanopartículas de Fe/Fe304 para una concentración total de Fe de 15 µg/ml. No fue posible insertar la sonda óptica en los melanomas actuales debido a que cuando esto se intento hubo fuga del parénquima de tumor gelatinoso desde la herida de entrada creada por la sonda. Por lo tanto, el ambiente de tumor fue imitado superponiendo las NSCs en pelotillas cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 o NSCs solas con agarosa, lo cual se dejó gelificar en un tubo de microcentrifuga . Después de la incubación, las células cargadas se lavaron dos veces con DMEM y dos veces con IX PBS para remover las nanopartículas de Fe/Fe304 libres. Las células se recogieron con 0.1% tripsina-EDTA, y lxlO6 células se formaron en pelotillas por centrifugación en tubos de centrifuga de 2 mi. Luego, se agregaron 1.5 mi de 4% solución de agarosa en la parte superior del precipitado celular para imitar la matriz extracelular en tejidos de tumor. Los tubos de centrifuga de agarosa que contienen NSCs en pelotillas sin nanopartículas de Fe/Fe304 se utilizaron como controles negativos y se hicieron como se describió anteriormente. El experimento se condujo por triplicado. Antes que cada tubo se expusiera a AMF, dos sondas ópticas se insertaron en el tubo: una en la pelotilla, y la segunda en la mitad del sólido de agarosa. Los tubos se expusieron a AMF por 10 min. , y la diferencia de temperatura con el tiempo se midió por las sondas.

El incremento de temperatura con el tiempo se comparó entre los controles de NSC y NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 (Fig. 39). Hubo un incremento de 2.6°C significativo de la temperatura de la pelotilla entre el control y las células cargadas con nanopartículas de Fe/Fe30 (prueba t, valor p 0.1) después de 10 minutos de tiempo de exposición a AMF. Además de la pelotilla en medio del sólido de agarosa, hubo un pequeño incremento de temperatura en ambos grupos debido al calentamiento residual; durante la exposición a AMF la bobina de inducción se calienta ligeramente y transfiere su calor al tubo a través del aire.

Es notable que puede ser innecesario el calentamiento de la región de tumor completa usando cantidades relativamente grandes de nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX. Debido a los núcleos de Fe(0) muy pequeños en los agrupamientos de Fe/Fe304 de nanobarras, el calentamiento magnético A/C principalmente ocurrirá de acuerdo con el mecanismo de Neel, resultando en el calentamiento local de las nanopartículas . Las nanopartículas más grandes (d > 20 nm) presentan el mecanismo Browniano de calentamiento, resultando en una agitación mucho mejor al nivel de nanoescala. La presencia de las unidades de tetraetilenglicol conduce a un enlace estrecho de moléculas de agua a las nanopartículas, el cual puede disminuir adicionalmente la difusión local. Por lo tanto, los "puntos calientes" que presentan una temperatura arriba de 45 °C pueden existir durante el calentamiento magnético A/C, lo cual puede conducir al daño local en múltiples ubicaciones de las células, aún cuando la temperatura total del tejido de tumor no se mejora significativamente. 6. Evaluación del injerto selectivo de NSCs e hipertermia magnética Los ratones hembra C57BL/6 (de 6-8 semanas de edad) se obtuvieron de Charles River Laboratories (Wilmington, MA) . Los ratones se mantuvieron por 1 semana después de su llegada para permitirles aclimatarse, y se mantuvieron de acuerdo con las directrices de IACUC aprobadas en la instalación de Comparative Medicine Group de la Universidad del Estado de Kansas . Todos los experimentos en animales se condujeron de acuerdo con estas directrices de IACUC. En el día 0, 3.5 x 105 células de melanoma B16-F10 se inyectaron subcutáneamente en 21 ratones C57BL/6, y los ratones se dividieron en tres grupos. En el día 5, lxlO6 NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 a una concentración de 20 ug/ml de hierro se inyectaron intravenosamente a dos grupos (NSC-nanopartículas de Fe/Fe304, grupo I y NSC-nanopartículas de Fe/Fe304 + AMF, grupo II) ; simultáneamente, se inyectó solución salina en el grupo III. En el 9o, 10°, y 11° día después de la inoculación del tumor, los ratones del grupo II con NSC cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 se expusieron a AMF por 10 min diariamente usando un aparato de campo magnético alterno (Superior Induction Company, Pasadena, CA) . La frecuencia se fijó (366 kHz, patrón de onda de seno) ; la amplitud de campo es 5 kA/m. Los volúmenes de tumor se midieron usando una pinza en los días 8, 10, y 12; se calcularon usando la fórmula 0.5aXb2, donde a es el diámetro más grande y b el diámetro más pequeño del tumor. Todos los ratones luego se eutanizaron en el día 15 y los tejidos se colectaron para estudios histoquímicos .

Los números significativos de NSCs cargadas con nanopartícula de Fe/Fe304 se identificaron en las secciones de tumor 4 días después de la administración de las células. Las imágenes se proporcionan en las Figs . 40(A)-(40F). Figs . 40 (A) -40(C): Secciones de tejido teñidas con azul de Prusia, contrateñidas con fast red nuclear de pulmón (Figura 40A) , hígado (Figura 40B) y tumor (Figura 40C) de ratones los cuales recibieron NSCs cargadas con nanopartículas seguido por tratamiento con AMF, notar la ausencia de NSCs teñidas de azul en las secciones de tumor. (Figura 40D) : NSCs cargadas con nanopartículas teñidas con azul de Prusia Positivo en la sección de tumor de ratones los cuales recibieron las nanoplataformas, pero sin tratamiento con AMF. (Figs. 40E-40F) . Ensayo TUNEL: Células apoptóticas verdes en ratones portadores de tumor con NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 + AMF (Figura 40E) en comparación con pocas células apoptóticas en ratones portadores de tumor con solamente tratamiento con solución salina (Figura 40F) . Las comparaciones de volumen de tumor se grafican en la Fig. 41. Los volúmenes de tumor más pequeños se observaron en el grupo que recibe NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 + AMF; la diferencia de volumen de tumor en comparación con el grupo de solución salina fue significativa en el día 12. No hubo diferencia significativa entre los ratones portadores de tumor que reciben NSC-nanopartícula de Fe/Fe304 pero no AMF y el grupo de solución salina. Hubo filtración de tumor después del día 12 en el grupo de solución salina debido al incremento de tamaños de tumor y por lo tanto las mediciones de volumen de tumor no se tomaron después del día 12.

Estos resultados demuestran que las células madre de tumor trópico cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 ex vivo y administradas intravenosamente pueden resultar en la regresión de tumores preclínicos después de la exposición del campo magnético A/C. Una ventaja del suministro basado en células de las nanopartículas de Fe/Fe304 parece ser que evita la aglomeración en el sistema reticuloendotelial (mononuclear fagocítico) , como se ve con otros métodos de suministro. 7. Análisis Histológico Los pesos de tumor se midieron para estimar la carga de tumor. El tumor, pulmón, hígado, y bazo se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido para análisis histológico. Los tejidos se seccionaron en un criostato (Leitz Kryostat 1720, Alemania) a 8-10 µ?t\ y se utilizaron para estudios de IHC. La tinción con azul de Prusia se realizó en estas secciones usando kit de tinción de azul de Prusia de Perl para identificar las NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304. La detección de células apoptóticas en las secciones de tejido se determinó usando el Sistema de etiquetado de extremo libre por desoxinucleotidil transferasa dUTP terminal fluorométrico DeadEnd (TUNEL) (Promega Corporation, Madison, WI) , según el protocolo del fabricante. ' Aunque, las NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 se podrían encontrar cerca o dentro del tumor si no se administró campo magnético A/C, no se encontrarán en tumores sometidos a exposición a AMF y se evaluarán al final del experimento. El material positivo a azul de Prusia también no se podría encontrar en el sitio de tumor, indicando que las NSCs perecieron y liberaron su carga, la cual fue posteriormente removida del sitio por las células fagocíticas. Las células madre cargadas con nanopartícula de Fe/Fe304 por si solas sin exposición a campo magnético A/C tuvieron un efecto de inhibición de tumor medible pero insignificante. Otra ventaja con el procedimiento basado en células madre fue que los efectos de la biodegradación y liberación de tensioactivo permanecen ocultos dentro de las células madre suministradas hasta que circulan al tumor. Por lo tanto, causarán daño mínimo en otra parte pero aumentarán el efecto de hipertermia en los tumores.

Los tumores se colectaron 24 horas después del último tratamiento con AMF en algunos de los ratones para investigar los mecanismos potenciales. Se encontró que el índice apoptótico ha incrementado en el grupo transplantado IV con NSC-nanopartícula de Fe/Fe304 después de tres rondas de AMF, indicando que la hipertermia magnética de objetivo tuvo un efecto medible en la viabilidad celular 24 horas después del último tratamiento. Esto corresponde al tiempo en el cual los volúmenes de tumor subcutáneos en el grupo que reciben NSCs cargadas con nanopartículas de Fe/Fe304 y AMF subsecuente fueron significativamente menores que los volúmenes de tumor en cualquiera de los otros grupos. Por lo tanto, la apoptosis parece ser un mecanismo involucrado en los volúmenes de tumor reducidos . 8. Preparación de la proteína por electroforesis de 2-Dimensiones (2-DE) La proteína total se preparó de los melanomas aislados de ratones administrados con solución salina o NSC-nanopartícula Fe/Fe304 + AMF para uso en el análisis de electroforesis en gel bidimensional (2 -DE) . El siguiente protocolo se utilizó como se describió previamente (Shevchenki et al., Mass spectrometric sequencing of proteins silver-stained polyacrylamide gels . Anal. Chem. 68 (5) 850-58 (1996)) . Brevemente, los tejidos de melanoma se homogenizaron usando un Pellet Pestle Motor (KONTES, Vineland, NJ) en la presencia de 0.5 mi de amortiguador de lisis (8 M urea, 2 M tiourea, 4% 3-colamidopropil-dimetilamonio-l-propan-sulfonato (CHAPS) , 100 mM ditiotreitol (DTT) , 25 mM Tris-Cl, y 0.2% anfolito (pH 3 a 10) (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) . El sobrenadante se colectó y luego se precipitó usando 2 volúmenes de acetona enfriada con hielo. La pelotilla de proteína final se disolvió en 100 µ? del amortiguador de muestra (8 M urea, 2 M tiourea, 4% CHAPS, 100 mM DTT, 25 mM Tris-Cl, y 0.2% anfolito (pH 3 a 10)). Las concentraciones de proteína se determinaron usando un kit de ensayo de proteína compatible con agente reductor y compatible con detergente (Bio-Rad, Hercules, CA) .

Los puntos de gel que representan 12 proteínas expresadas diferencialmente en los 2 grupos de ratón se identificaron usando el software de búsqueda de identificación MASCOT para identificar la huella de masa de péptido (PMF, por sus siglas en inglés) . Estos puntos de proteína se señalan en la Fig. 42 (A) -42(B). Las muestras de proteína se enfocaron usando 3-10 tiras de IPG lineales para la primera dimensión, separadas electroforéticamente en 12% geles de acrilamida, y teñidas con Biosafe Coomassie G-250 (compañía) . Los números con líneas de cabeza estrecha se refieren a puntos de proteína identificados por análisis MALDI-TOF. Se hizo un intento para identificar cada una de las proteínas que comprenden los 12 puntos diferencialmente expresados usando espectrometría de masas MALDI-TOF . Las proteínas identificadas se listan en la Tabla en la Fig. 43. Como se puede ver, la fosfoglicerato cinasa 1 (PGK-1) y receptor de neurotensina 1 fueron mucho más ligeramente expresados en tumores de los ratones que reciben NSC-nanopartícula de Fe/Fe304 intravenosa seguido por tratamiento con AMF que en los controles de solución salina+AMF.

De los siete puntos de proteína encontrados en el grupo tratado pero no el grupo de solución salina (duplicado cuatro veces; ver la Tabla en la Fig. 43) , una proteína cantidad identificada que potencialmente podría ejercer un efecto anti-tumor es fosfoglicerocinasa-1 (PGK-1) la cual es una proteína anti-angiogénica cuando se sobreexpresa en algunos tumores. Sin embargo, la sobreexpresión de PGK-1 en cáncer de próstata se ha mostrado que facilita el crecimiento del tumor. Por otra parte, hubo cinco puntos de proteína presentes en el grupo de control de solución salina que no estuvieron presentes en el grupo tratado. Uno de estos fue el factor 5 asociado al receptor TNF (TRAF5) , el cual se conoce que activa NF-kappaB. Otro, biliverdina reductasa B también incrementa la expresión de NF-kappa B. La NF-kappa B es un jugador central en la transición a un estado más invasivo en algunos tumores. La biliverdina B fue identificada como un marcador de proteína específico en carcinoma hepatocelular microdiseccionado, elevado en células de cáncer de colon resistentes a metotrexato y se induce en carcinoma renal. Por lo tanto, es posible que la bajo-regulación de estos genes podría haber sido un factor de reducción de tamaño de tumor. Mientras es preliminar, estos hallazgos proporcionan el antecedente de investigación adicional para revelar los mecanismos potenciales de atenuación de tumor por AMF después del suministro dirigido de nanopartículas de Fe/Fe304 por células madre de tumor trópico. 9. Análisis Estadístico Los análisis estadísticos se realizaron usando WinSTAT (A-Prompt Corporation, Lehigh Valley, PA) . Los medios de los grupos experimentales se evaluaron para confirmar que cumplen la suposición de normalidad. Para evaluar la significancia de las diferencias totales de volúmenes de tumor y pesos de tumor entre todos los grupos in vivo, el análisis estadístico se realizó por análisis de varianza (ANOVA, por sus siglas en inglés) . Un valor p menor de 0.1 se consideró como significativo. Después del ANOVA significativo, se utilizó el análisis post hoc usando diferencia de menor significancia (LSD, por sus siglas en inglés) para múltiples comparaciones. La significancia para prueba de post hoc se estableció a p < 0.05. Todos los datos de volúmenes y pesos de tumor se representan como media +/-error estándar (SE, por sus siglas en inglés) en las gráficas .

EJEMPLO 27 Nanoplataforma recubiertas con oro En este Ejemplo, las nanoplataformas se sintetizaron con un recubrimiento de oro. Las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX se prepararon suspendiendo 20 mg de nanopartículas de Fe/Fe30 en 10 mi de THF. Después de la sonicación por 30 minutos, el sólido no disuelto (< 1 mg) se separó por precipitación a través de centrifugación de baja velocidad (1500 RPM, 5 min) . La solución clara se transfirió a otro tubo de ensayo y se agregaron 0.30 mi de 3-aminopropiltrietoxisilano a la solución. Después de la sonicación por 10 horas, las nanopartículas se colectaron por centrifugación de alta velocidad (15,000 RPM por 15 min.). Después de la redispersión y colección subsecuente en THF (3x50 mi), las nanopartículas de Fe/Fe30/ASOX (7.5 mg) se colectaron, se secaron en alto vacío, y se almacenaron bajo argón.

Las nanopartículas de Fe/Fe304/Au protegidas con aminosiloxano se prepararon pre-adsorbiendo Au(III) (0.50 mg de H[AuCl4]) en medio acuoso a las funciones amino terminales de las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX . Las nanopartículas luego se colectaron por centrifugación de alta velocidad (15,000 RPM por 15 min. ) y se redispersaron en etanol . Dependiendo del espesor de la cubierta de Au que se deseó, luego se agregaron 2, 4 u 8 mg de H[AuCl4] , seguido por sonicación por 15 min. El Au(III) se redujo a Au(0) agregando 5 mg de NaBH a 20°C. La técnica de pre-sembrado resultó en la formación de cubiertas de oro. Las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au (14.0 g) se precipitaron por centrifugación (15,000 RPM) y tres veces se redispersaron en y colectaron del agua (3x50 mi) , se secaron en alto vacío, y se almacenaron bajo argón. Debido al agrupamiento de las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au, sus diámetros hidrodinámicos fueron más bien grandes. Los valores típicos variaron desde 550 nm a 750 nm con polidispersidades en el intervalo desde 1.3 a 1.5. Cuando se agregan tensioactivos (SDS, 0.01 M) , los diámetros hidrodinámicos cayeron a 200+20 nm.

Las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au/furtivo se prepararon uniendo un ligando furtivo basado en dopamina (ver Fig. 44) a la cubierta de Au por un procedimiento de dos etapas: A) cisteinamida y nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au (10 mg) se dejaron reaccionar bajo sonicación por 30 minutos en THF, seguido por cinco procedimientos de precipitación (15,000 RPM) y redispersión consecutivos; B) el ligando furtivo luego se unió usando el método de CDI bien establecido en THF, seguido por cinco procedimientos de precipitación (15,000 RPM) y redispersión consecutivos. Las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au/furtivo (7 mg) luego se secaron en alto vacío, y se almacenaron bajo argón. La caracterización de las nanopartículas se muestra en la Tabla XI .

Tabla XI. Caracterización de Nanopartículas Las pruebas de estabilidad se realizaron usando las cinco diferentes nanopartículas (0.50 mg/ml) de la Tabla XI anterior en amortiguador de PBS aireado. Para la medición de las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au/furtivo, se agregó 0.01M de SDS . Los resultados se muestran en la Fig. 45. Las nanopartículas de Fe/Fe304 no protegidas mostraron degradación completa y conversión química a sales/hidróxidos de hierro (II) y hierro (III) dentro de 16 horas. La adición de la capa furtiva orgánica en nanopartículas de Fe/Fe304/furtivo incrementó su tiempo de vida media desde 4 horas (sin protección) a aproximadamente 20 horas. La presencia de la capa protectora de aminosiloxano en nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX adicionalmente incrementó el tiempo de vida de las nanopartículas por un orden de magnitud a 240 horas. La adición de una segunda capa protectora de oro en las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au causó un segundo incremento a aproximadamente 2,500 horas. Aunque la adición de la capa furtiva orgánica en nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au/furtivo incrementó grandemente su solubilidad, no afectó significativamente su estabilidad en PBS aireado.

Los oligopéptidos que contienen secuencias de consenso de proteasa se sinterizaron en lotes de 250 mg usando un procedimiento de síntesis microheterogéneo, iniciando con un gel de Fmoc-Gly-Wang, seguido por la desprotección con piperidina/DMF (dimetilformamida) y acoplamiento al siguiente aminoácido protegido por Fmoc usando HBTU (2 - ( lH-Benzotriazol-1- il) -1 , 1 , 3 , 3 -tetrametiluronio) en DIEA (N, N-diisopropil-etilamina) /DMF . Después que la secuencia se sintetizó por adición paso por paso de aminoácidos protegidos por Fmoc adicionales, se desprotegió y se separó del gel Wang usando TFA (ácido trifluoroacético) . Las secuencias (purezas >99%) se resumen en la Tabla XII a continuación.

Tabla XII. Secuencias Las secuencias se unieron a las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au y nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au con recubrimiento furtivo, usando TCPP como tinte fluorescente y el mismo enlazante de ligando de dopamina como se utilizó para el recubrimiento furtivo. Tres de los grupos de carboxilato en cada TCPP fueron protegidos como ésteres de metilo (disponibles después de la cromatografía de columna) , y el TCPP luego se unió vía un enlace de amida al aminoácido terminal y el gel Wang previo a la liberación del péptido. El acoplamiento con las nanopartículas se realizó formando un enlace de éster usando EDC/HOBT, como se describió en la presente. Este esquema de reacción usando ligando de dopamina C (Ejemplo 1) y las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au (sin recubrimiento furtivo) se muestra en la Fig. 44.

Las mediciones resueltas con el tiempo se pueden usar para demostrar el "interruptor de luz" para proteasas relacionadas con el cáncer. Los resultados de emisión se obtuvieron por conteo de fotones único correlacionado con el tiempo. En el aparato usado en estos estudios, la muestra se excitó con aproximadamente 15 nJ, 15 fs impulsos del segundo armónico de un láser de Ti: zafiro a una velocidad de repetición de 80 MHZ. La longitud de onda de excitación se fijó a 400 nm con tamaños de punto de excitación de aproximadamente 1 mm. Esta combinación de energías de bajo impulso y tamaños de punto relativamente grandes resulta en densidades de energía que son suficientemente bajas que las excitaciones multifotónicas que se espera sean evitadas completamente. La detección se realizó con un Hamamatsu 6 µ MCP PMT y un aparato electrónico de conteo de fotón único correlacionado con el tiempo. La selección de longitud de onda se realizó usando filtros de interferencia. La función de respuesta de instrumento se determinó observando el dispersor de láser, y fue aproximadamente 60 ps FWHM. La detección de emisión polarizada se realizó usando un polarizador de emisión en un esquema de detección perpendicular relativo al láser de excitación.

Las nanoplataformas se prepararon usando las nanopartículas de Fe/Fe304 enlace de GAGSRGSAGAG (SEC ID NO: 66, suprimida por 1 residuo en cada uno del N-terminal y C-terminal) , y TCPP no metalada. Las nanoplataformas se dispersaron en PBS (0.1 µg/ml) , seguido por la adición de urocinasa después de 10 minutos. La TCPP libre tuvo un tiempo de vida de luminiscencia (decaimiento monoexponencial) de aproximadamente 9 ns . En contraste severo, la TCPP unida a Fe/Fe304 tuvo un tiempo de vida de fluorescencia drásticamente acortado debido al efecto de enfriamiento de plasmón de la nanopartícula . Se encontró que la presencia del plasmón de oro se agregó al efecto de enfriamiento de la nanopartícula. El mejoramiento de fluorescencia total de este sistema fue aproximadamente 75 (10 min después que se agregó la urocinasa) . Los tiempos de vida de fluorescencia ( ) y contribuciones relativas (f) al decaimiento total con y sin lxlO"7 M urocinasa en PBS, se muestran en la Tabla XIII a continuación.

Tabla XIII. Tiempos de Vida de Fluorescencia de Nanoplataforaía y Contribuciones Relativas al Decaimiento Total Se puede ver del mejoramiento de tiempo de vida observado que la TCPP llega a ser parcialmente separada de la nanopartícula. Se debe señalar que el plasmón de la cubierta de oro alrededor de Fe/Fe304 no solamente fluoresce un poco.

El Calentamiento Magnético, como se describió previamente, se realizó usando las nanopartículas recubiertas con oro. Las velocidades de SAR se determinaron a 366 Hz y 100 kHz para determinar su potencial para diferentes terapias. Aunque un campo de calentamiento magnético A/C de 366 Hz conduce a efectos de calentamiento más grandes, su penetración de tejido es muy limitada, y por lo tanto es principalmente adecuado para el tratamiento de melanoma y otros tumores superficiales. 100 Hz es la frecuencia establecida para aplicaciones de tejidos profundos. Los resultados se proporcionan en la Tabla XIV a continuación. Tabla XIV. Resultados de Calentamiento Magnético A/C ?Plasma Inductivamente Acoplado con detección de fluorescencia.

Los estudios de viabilidad y carga celular, como ya se describió, también se realizaron usando las nanopartículas recubiertas con Au. Las células se incubaron por 24 horas con medio que contiene varias concentraciones de nanopartícula. Las nanopartículas de Fe/Fe304/furtivo que presentan cinco unidades de TCPP químicamente unidas se cargaron en células de melanoma B16F10, NSCs de tumor trópico, y células epiteliales MS-1. Más de 90% de las células de melanoma B16F10 y células NSCs de tumor trópico se cargaron con nanopartículas . La carga en las células epiteliales MS-1 fue menos eficiente por un factor de cuatro. Las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au/furtivo que poseen el mismo número de unidades de TCPP unidas se absorbieron mucho más lento (por un factor de 20 y se cargaron muy ineficientemente) . Puesto que las nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/Au/furtivo son de manera distinta más grandes que Fe/Fe304/furtivo (18 contra 30 mm) , las nanopartículas recubiertas con Au pueden exceder el tamaño de poro disponible para la absorción de células mediada por receptor cuando se usan porfirinas como porciones de objetivo de células. Después de la tinción con azul de Prusia, las MNPs se detectaron en todos los tres tipos celulares como material con tinción azul. La carga más eficiente fue vista en las células incubadas con concentraciones de 25 ]ig/ml de Fe. La eficiencia de carga se muestra en la Fig. 46.

EJEMPLO 28 Oligómeros de Nanoplataforma En este Ejemplo, múltiples nanopartículas se enlazaron conjuntamente para formar oligómeros de nanoplataforma (agrupamientos) usando una secuencia de consenso de proteasa y enlaces de ligando entre cada partícula. Los oligómeros se representan en la Fig. 49 usando nanopartículas de Fe/Fe304/ASOX/furtivo, secuencia de oligopéptido GAGSGRSAGA (SEC ID NO: 66, suprimida en el N-terminal por 1 residuo y el C-terminal por 2 residuos) , y enlaces de dopamina. Los agrupamientos pueden tener cualquier tamaño entre 1 y 20 nanopartículas, y podrían incluir cualquiera de las secuencias de consenso descritas en la presente. Hasta cuatro secuencias de escisión (por ejemplo, uPA, MMP2, MMP9 y catepsina D) también se podrían usar en el agrupamiento . Las mediciones de MRI se realizaron en un tubo de NMR (400 MHz, Varían), 90 por ciento mol de H20, 10 por ciento mol de D20) , como se describió, usando 1 mL con una concentración de ensayo (u orinasa) de 5 g/ml, y T = 298K (24.8 °C) . Antes de la medición, el tiempo Ti de H20 fue 3.004 segundos, y el tiempo T2 fue 0.07579 segundos. Luego, lxlO"14 mol de urocinasa por mi se agregaron en 1 mi de H20/D20 (90/10) . Después de 10 minutos, i incrementó a 2.003 segundos, y T2 incrementó a 0.1334 segundos.

EJEMPLO 29 Suministro de Monocitos/Macrófagos Una línea de monocitos/macrófagos de tumor trópico de ratón (células RAW264.7 Mo/Ma, Colección de Cultivo Tipo Americano, Manassas, VA) se cargó con nanoplataformas de Fe/Fe304/ASOX-TCPP marcadas con biotina para evaluar su potencial para suministro a tejido cancerosos. Los monocitos son especialmente atractivos en esta capacidad debido a que son células autólogas que fácilmente se pueden obtener en números grandes para ensayos clínicos humanos futuros. Se cultivarán en su medio de cultivo respectivo.

La absorción de nanopartículas magnéticas unidas a siAR y nanopartículas magnéticas unidas a SN38 se ha analizado para contenido de hierro usando el ensayo espectrofotométrico de ferrozina (Riemer, et al., Colorimetric ferrozine-based assay for the quantitation of iron in cultured cells, Anal. Biochem. 2004, 331, 370-5) y por tinción con azul de Prusia (Shen et al. in vitro cellular uptake and effects of Fe304 magnetic nanoparticles on HeLa cells., Journal of Nanoscience and Nanotechnology 2009, 9, 2866-2871) . Se agregaron suficientes nanopartículas magnéticas a los monocitos/macrófagos o células de cáncer para lograr concentraciones de 10, 15, 20, y 25 pg/ml de Fe en el medio durante la noche. Después de la incubación, el exceso se removió por múltiples lavados de PBS . Las células luego se evaluaron para efectos citotóxicos usando el Ensayo de Proliferación Celular de Una Solución Acuosa Cell Titer 96, un ensayo MTS (Promega Corp., Madison, WI) para evaluar los números de células viables. Los monocitos/macrófagos cargados se colocaron en placas con células PAN 02 (relación 1:10 y 1:5) en "tubos planos" de cultivo de tejido estrechos, área de superficie de 10 cm2 durante la noche seguido por tres lavados de medio. Esto tubos pueden ajustarse confortablemente dentro de la bobina de inducción usada para crear el campo magnético alterno. Se colocaron en el centro de una bobina RF (1 pulgada (2.54 cm) de diámetro, 4 vueltas) y se trataron a 10 kA/m, 100 kHz, patrón de onda de seno, por 30 minutos. Los experimentos de viabilidad celular se realizaron 24 y 48 horas después del tratamiento. Todas las condiciones se realizaron por triplicado y se duplicaron dos veces. Además del ensayo de MTS, la despolarización mitocondrial y viabilidad celular se evaluaron usando cuantitativamente el kit furtivo microcondrial de HCS (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) . La tensión oxidativa también se midió detectando una disminución de glutationa reducida usando el sistema de tinte ThiolTracker (Invitrogen). Algunas células se tripsinizaron, lavaron, y volvieron a colocar en placas para evaluar la capacidad de las células para volverse a unir y crecer. La Fig. 50 muestra los monocitos/macrófagos cargados con las nanopartículas después de 4 horas. Las células cargadas aparecen azules debido a las porfirinas unidas.

EJEMPLO 30 Imágenes de MRI En este Ejemplo, las nanoplataformas se utilizaron como agentes de imágenes de MRI en ratones C57/BL6 impregnados con melanomas de pulmón de metástasis B16F10. Las nanoplataformas de Fe/Fe304/furtivo se cargaron en NSCs y se inyectaron en los ratones, y las imágenes ponderadas en Ti se colectaron en la Instalación de MRI del Centro de Imágenes de Oklahoma usando un NMR de 500 MHz . El tejido que contiene las nanopartículas aparece más brilloso en las imágenes y se indica por la flechas. Las imágenes se muestran en la Fig. 51(A) sección transversal de ratón, inyección intramuscular de nanopartículas de Fe/Fe30/furtivo (50 microgramos) ; Fig. 51(B) nodos de melanoma de pulmón después del suministro de células madre de las nanopartículas; Fig. 51(C) nodos de melanoma de pulmón adicionales; y Fig. 51(D) nanopartículas en el hígado y riñon después del suministro de células madre.

EJEMPLO 31 Imágenes de Interruptor de Luz En este Ejemplo, las nanoplataformas se utilizaron para capturar imágenes de tejido canceroso para demostrar la utilidad de este método para extirpación del tejido. Para estos estudios se utilizaron ratones hembra BALB/c que se han impregnado con cánceres 4T1 de metástasis (modelo de cáncer de mama agresivo) . Todos los tres ratones se impregnaron en sus penículos adiposos mamarios 18 días antes de las imágenes. Las mediciones se tomaron con el sistema de imágenes IVIS® Lumina de Caliper Life Sciences. Los ratones se eutanizaron con isoflurano antes y durante la medición.

Las nanopartículas de Fe/Fe304/furtivo (d=16 nm, de de núcleo de Fe = 10 nm) que presentan 30+/-5 tintes de cianina 3.0 por nanopartícula se utilizaron como las nanoplataformas de imágenes. Una secuencia de escisión de uPA usada fue GAGSGRSAGA (SEC ID NO: 66, suprimida en el N-terminal por 1 residuo y el C-terminal por 2 residuos) para el enlace de oligopéptido . El tinte de cianina fue muy hidrofóbico ( log (coeficiente de división de octanol/agua: 6.05)) (NI: (CH2)5-COOH, N2 : -C8Fi7) , por lo tanto el tinte se depositó en la ubicación de escisión. Un ratón sirvió como el control. El segundo ratón recibió 5 mg de nanoplataforma (3.1 mg de Fe total) disueltos en 200 µ? de PBS inyectado directamente en el sitio del tumor. El tercer ratón recibió 1 mg de nanoplataforma (0.62 mg de Fe total) disueltos en 200 µ? de PBS inyectado directamente en el sitio del tumor. Las imágenes se tomaron 1 hora después de la inyección, y se muestran en la Fig. 52 (izquierdo: control, mitas: 5 mg de nanoplataforma , derecho: 1 mg de nanoplataforma) . La excitación se realizó a 535 nm usando el sistema de imágenes molecular IVIS 3D de Caliper Lifesciences . La emisión ocurrió a 565 nm (máxima fluorescencia) . El halo alrededor del sitio de cáncer original es indicativo de la infiltración del tejido por células de cáncer. Los resultados indican que la cianina es escindida y permanece depositada en el sitio del cáncer, y es menos propensa a desagüe linfático.

El experimento anterior se repitió usando nanopartículas de Fe/Fe304/furtivo (d = 16 nm, d de núcleo de Fe = 10 nm) que presentan 30+/- tintes de TCPP por nanopartícula unida vía la misma secuencia de escisión como la nanoplataforma de imágenes. Otra nanoplataforma se preparó usando rodamina B como el tinte fluorescente. Un ratón sirvió como el control y no recibió inyección. El segundo ratón recibió 5 mg de la nanoplataforma de TCPP (3.1 mg de Fe total) disueltos en 200 µ? de PBS inyectado directamente en el sitio del tumor. El tercer ratón recibió 5 mg de la nanoplataforma de rodamina B (3.1 mg de Fe total) disueltos en 200 µ? de PBS inyectado directamente en el sitio del tumor. Las imágenes se tomaron 2 horas después de la inyección. La excitación se realizó a 480 nm con fluorescencia tanto de TCPP como rodamina B que ocurre en el intervalo integrado entre 600 y 750 nm. La imagen de los ratones con TCPP y rodamina B se muestra en la Fig. 53. Como se ve de la Fig. 53, la TCPP se transportó a través de las trayectorias de desagüe linfático ya sea debido a que su naturaleza es más hidrofóbica (que la cianina) o debido a que se enlaza a proteínas hidrofílicas que dejan el cáncer vía la trayectoria de desagüe linfático. El mismo desagüe fue visto con rodamina B. La Fig. 54 muestra imágenes de los mismos ratones, incluyendo el control, tomadas 24 horas después de la inyección de las nanoplataformas . Los tintes se han despejado del sistema linfático, pero permanecen en los tumores de metástasis. Guiado por estas imágenes, un cirujano u oncólogo podría extirpar los tumores mientras conserva tanto tejido saludable como sea posible.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (27)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Un montaje de nanoplataforma para detectar la actividad de proteasa, caracterizado porque comprende: una primera nanoplataforma que comprende una primera nanopartícula y una capa protectora; una segunda nanoplataforma que comprende una segunda nanopartícula y una capa protectora; y un enlace de oligopéptido entre las primera y segunda nanoplataformas , el enlace comprende una secuencia de consenso de proteasa, en donde al menos una de las primera o segunda nanoplataformas adicionalmente comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de porfirinas, clorinas, bacterioclorinas , ftalocianinas , biotina, derivados de las mismas, y combinaciones de las mismas.

2. El montaje de nanoplataforma de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la primera nanopartícula y segunda nanopartícula son nanopartículas de núcleo/cubierta respectivas.

3. El montaje de nanoplataforma de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque cada núcleo se selecciona individualmente del grupo que consiste- de Au, Ag, Cu, Co, Fe, y Pt.

4. El montaje de nanoplataforma de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque el núcleo es un núcleo de Fe fuertemente paramagnético.

5. El montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque cada cubierta se selecciona individualmente del grupo que consiste de Au, Ag, Cu, Co, Fe, Pt, los óxidos metálicos de los mismos, y combinaciones de los mismos.

6. El montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 2-4, caracterizado porque la cubierta comprende óxido de hierro.

7. El montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque las primera y segunda nanopartículas tienen un área de superficie de puntos múltiples de Brunauer-Emmett-Teller de al menos aproximadamente 20 m2/g.

8. El montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque las capas protectoras se seleccionan individualmente del grupo que consiste de nanocapas de siloxano, monocapas de ligando, y combinaciones de las mismas.

9. El montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque la secuencia de consenso de proteasa se selecciona del grupo que consiste de SGRSA (SEC ID NO: 2), VPMSMRGG (SEC ID NO: 3), IPVSLRSG (SEC ID NO: 4), RPFSMIMG (SEC ID NO: 5), VPLSLTMG (SEC ID NO: 6), VPLSLYSG (SEC ID NO: 7), IPESLRAG (SEC ID NO: 8), SGSPAFLAKNR (SEC ID NO: 9), DAFK (SEC ID NO: 10), SGKPILFFRL (SEC ID NO: 11), SGKPIIFFRL (SEC ID NO:12), GPLGMLSQ (SEC ID NO: 13), HGPEGLRVGFYESDVMGRGHARLVHVEEPHT (SEC ID NO: 25), GPQGLAGQRGIV (SEC ID NO : 26), SLLKSRMVPNFN (SEC ID NO: 27), SLLIFRSWANFN (SEC ID NO: 28), SGWIATVIVIT (SEC ID NO: 29), GAANLVRG (SEC ID NO: 74), y PRAGA (SEC ID NO: 75) .

10. Una composición, caracterizada porque comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8 y 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.

11. Un método de imágenes por resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) para detectar la actividad de una proteasa asociada con una célula cancerosa o precancerosa en un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) administrar al mamífero la composición de conformidad con la reivindicación 10; (b) ubicar el ensayo en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa ; (c) transmitir impulsos de radiofrecuencia a la región de interés; y (d) adquirir datos de imagen de MR de la región de interés, los datos de imagen de MR comprenden valores de Ti y T2.

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, los datos de imágenes por resonancia magnética (MR, por sus siglas en inglés) son ponderados en T2, caracterizado porque adicionalmente comprende detectar un cambio en los valores de T2 adquiridos con el tiempo, el cambio corresponde a la actividad de proteasa.

13. Un método de imágenes de MRI para detectar la actividad de una proteasa asociada con una célula cancerosa o precancerosa en un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) administrar al mamífero una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde la secuencia de consenso de proteasa es SGRSA (SEC ID NO: 2) ; (b) ubicar el ensayo en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa ; (c) transmitir impulsos de radiofrecuencia a la región de interés; y (d) adquirir unos primeros datos de imágenes de MR de la región de interés, los primeros datos de imágenes de MR comprenden valores de Ti y T2.

14. El método de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado porque los primeros datos de imágenes de MR indican actividad de proteasa, en donde el método adicionalmente comprende: (e) administrar al mamífero una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde la secuencia de consenso de proteasa es VPLSLTMG (SEC ID NO: 6) ; (f) enfocar el ensayo en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa; (g) transmitir impulsos de radiofrecuencia a la región de interés; y (h) adquirir unos segundos datos de imágenes de MR de la región de interés, los segundos datos de imágenes de MR comprenden valores de i y T2.

15. El método de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque las segundas imágenes de MR indican actividad de proteasa, la actividad se correlaciona con un pronóstico para angiogénesis o metástasis.

16. El método de conformidad con la reivindicación 15, caracterizado porque adicionalmente comprende: (i) administrar al mamífero una composición que comprende un ensayo de diagnóstico que incluye el montaje de nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-15, en donde la secuencia de consenso de proteasa es VPMSMRGG (SEC ID NO: 3); (j) ubicar el ensayo en una región de interés en el mamífero que se sospecha que tiene una célula cancerosa o precancerosa ; (k) transmitir impulsos de radiofrecuencia a la región de interés; y (1) adquirir unos terceros datos de imágenes de MR de la región de interés, los terceros datos de imágenes de MR comprenden valores de ?? y T2.

17. Una nanoplataforma, caracterizada porque comprende una primera nanopartícula y una capa protectora que rodea la nanopartícula, la capa protectora se selecciona del grupo que consiste de nanocapas de siloxano, monocapas de ligando, capa de recubrimiento de oro, y combinaciones de las mismas .

18. La nanoplataforma de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada porque adicionalmente comprende un grupo funcional seleccionado del grupo que consiste de porfirinas, clorinas, bacterioclorinas , ftalocianinas , biotina, derivados de las mismas, y combinaciones de las mismas.

19. La nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-18, caracterizada porque la capa protectora comprende una nanocapa de siloxano, en donde la nanoplataforma adicionalmente comprende una monocapa de ligando que rodea la nanocapa de siloxano.

20. La nanoplataforma de conformidad con la reivindicación 19, caracterizada porque adicionalmente comprende una capa de recubrimiento de oro que rodea la monocapa de ligando.

21. La nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-20, caracterizada porque la nanopartícula es una nanopartícula de núcleo/cubierta, el núcleo se selecciona del grupo que consiste de Au, Ag, Cu, Co, Fe, y Pt, y la cubierta se selecciona del grupo que consiste de Au, Ag, Cu, Co, Fe, Pt, los óxidos de metales de los mismos, y combinaciones de los mismos.

22. La nanoplataforma de conformidad con la reivindicación 21, caracterizada porque el núcleo es un núcleo de Fe fuertemente paramagnético.

23. La nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, caracterizada porque se enlaza vía un enlace oligopéptido a una partícula seleccionada del grupo que consiste de cromóforos/luminóforos , puntos cuánticos, viológenos y combinaciones de los mismos, el enlace de oligopéptidos comprende una secuencia de consenso de proteasa.

24. La nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-23, caracterizada porque la nanoplataforma no se enlaza a cualquiera de las otras nanoplataformas.

25. Una composición, caracterizada porque comprende un ensayo de diagnóstico que incluye la nanoplataforma de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17-22, 23, y 24 y un portador farmacéuticamente aceptable.

26. Un método para inhibir el crecimiento de células cancerosas o precancerosas en un mamífero, caracterizado porque comprende: (a) administrar al mamífero la composición de conformidad con la reivindicación 25; (b) ubicar el ensayo en una región de interés en el mamífero que se sospecha tiene una célula cancerosa o precancerosa; y (c) calentar la nanoplataforma usando excitación magnética A/C, en donde el tejido en la región de interés se calienta a una temperatura de al menos aproximadamente 40°C, en donde el calentamiento (C) resulta en la apoptosis de las células cancerosas o precancerosas .

27. Un agente de contraste MRI caracterizado porque comprende una nanopartícula de núcleo/cubierta que tiene un núcleo de hierro, el agente de contraste de MRI tiene una rx mayor que aproximadamente 100 mM^s"1 para el mejoramiento de Ti y una r2 con un número entero mayor que aproximadamente -2,000 mM^s"1 para la disminución de T2.