MX2012000980A - Conjugados de agonistas de oligómeros-opioides. - Google Patents

Conjugados de agonistas de oligómeros-opioides.

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Jennifer Riggs-Sauthier
Bo-Liang Deng
Timothy A Riley
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Nektar Therapeutics
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Abstract

La invención provee conjugados en los cuales los agonistas de opioide, la hidroxicodona (oxicodona) y la hidrocodona (hidrocodeinona) están enlazados covalentemente a los oligómeros de polietilenglicol; un conjugado de la invención, cuando es administrado por varias vías de administración, exhibe características que son diferentes de las del agonista de opioide no enlazado a los oligómeros de PEG.

Description

CONJUGADOS DE AGONISTAS DE OLIGÓMEROS-OPIOIDES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de prioridad a la Solicitud de Patente no Provisional E.U.A. No. 12/558,395, presentada el 1 de Septiembre de 2009, Solicitud Provisional de Patente E.U.A. No. 61/350,853, presentada el 2 de Junio de 2010 y Solicitud Provisional de Patente E.U.A. No. 61/227,399, presentada el 21 de Julio de 2009, cuyas descripciones de las solicitudes provisionales y no provisionales anteriores se incorporan en la presente para referencia.
CAMPO DE LA INVENCIÓN Esta invención proporciona (entre otras cosas) opioides químicamente modificados que poseen ciertas ventajas sobre opioides que carecen de la modificación química. Los opioides químicamente modificados descritos en la presente, se refieren a y/o tienen aplicaciones en (entre otros) los campos de descubrimiento de fármacos, farmacoterapia, fisiología, química orgánica y química de polímeros.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los agonistas de opioides tales como morfina, han sido ampliamente usados para tratar pacientes que sufren de dolor. Los opioides ejercen sus efectos analgésicos y otros farmacológicos a través de las interacciones con receptores opioides, de los cuales, existen tres clases principales: receptores mu (µ), receptores kappa (?), y receptores delta (d). La mayoría de los agonistas opioides clínicamente usados son relativamente selectivos para receptores mu, aunque los agonistas opioides típicamente tienen actividad agonista a otros receptores opioides (particularmente a concentraciones incrementadas).
Los opioides ejercen sus efectos inhibiendo selectivamente la liberación de neurotransmisores tales como, acetilcolina, norepinefrina, dopamina, serotonina y sustancia P.
Farmacológicamente, los agonistas opioides representan una clase importante de agentes empleados en el manejo del dolor. Desafortunadamente, el uso de agonistas opioides está asociado con el potencial de abuso. Además, la administración oral de agonistas opioides a menudo resulta en metabolismo de primer paso significante. Desafortunadamente, la administración de agonistas opioides resulta en efectos significantes mediados por el SNC, tales como respiración reducida, lo cual puede resultar en muerte. De este modo, una reducción de cualquiera de estas u otras características, podría mejorar su deseabilidad como fármacos terapéuticos.
La presente descripción parece atender estas y otras necesidades en la técnica proporcionando (entre otras cosas), un conjugado de oligómero no peptídico, soluble en agua y un agonista opioide.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En una o más modalidades de la invención, se proporciona un compuesto, el compuesto comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido (preferiblemente vía un enlace estable) a un oligómero no peptídico, soluble en agua.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un compuesto, el compuesto comprende un residuo de un agonista opioide kappa covalentemente unido (preferiblemente vía un enlace estable) a un oligómero no peptídico, soluble en agua [en donde se entiende que un agonista opioide kappa (i) es preferencialmente selectivo para receptores opioides kappa sobre tanto receptores opioides mu como receptores opioides delta, dentro de las mismas especies de mamífero, y (ii) tendrá actividad agonista al receptor kappa].
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un compuesto, el compuesto comprende un residuo de un agonista opioide mu covalentemente unido (preferiblemente vía un enlace estable) a un oligómero no peptídico, soluble en agua [en donde se entiende que un agonista opioide kappa (i) es preferencialmente selectivo para receptores opioides mu sobre tanto receptores opioides kappa como receptores opioides delta, dentro de las mismas especies de mamífero, y (ii) tendrá actividad agonista al receptor mu].
En una o más modalidades de la invención se proporciona un compuesto, el compuesto comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido vía un enlace adecuado a un oligómero no peptídico, soluble en agua, en donde el agonista opioide tiene una estructura abarcada por la siguiente fórmula: Fórmula I en donde: R1 es H o un radical orgánico [tal como metilo, etilo y -C(0)CH3]¡ R2 es H u OH; R3 es H o un radical orgánico; R4 es H o un radical orgánico; la línea punteada ("— ") representa un enlace doble opcional; Y1 es O (oxígeno) u S; y R5 se selecciona a partir del grupo que consiste de (sin considerar la estereoquímica), en donde R6 es un radical orgánico [que incluye C(0)CH3].
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un compuesto, el compuesto comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido vía un enlace estable o degradable a un oligómero no peptídico, soluble en agua, en donde el agonista opioide es seleccionado a partir del grupo que consiste de asimadolina, bremazocina, enadolina, etilcetociclazocina, GR89.696, ICI204448, ICI197067, PD117,302, nalbufina, pentazocina, quadazocina (WIN 44,441-3), salvinorina A, espiradolina, TRK-820, U50488, y U69593.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona una composición, la composición comprende: (i) un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido vía un enlace estable a un oligómero no peptídico, soluble en agua; y (ii) opcionalmente, un excipiente farmacéuticamente aceptable.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona una forma de dosificación, la forma de dosificación comprende un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido vía un enlace estable a un oligómero no peptídico, soluble en agua.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método, el método comprende unir covalentemente un oligómero no peptídico, soluble en agua, a un agonista opioide.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método, el método comprende administrar un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido vía un enlace estable a un oligómero no peptídico, soluble en agua.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método, el método comprende enlazar (por ejemplo, enlazar selectivamente) receptores opioides mu, en donde dicho enlace se logra administrando un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido a un oligómero no peptídico, soluble en agua. En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método que comprende enlazar (por ejemplo, enlazar selectivamente) receptores opioides mu, en donde dicho enlace se logra administrando una cantidad efectiva de un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido a un oligómero no peptídico, soluble en agua a un paciente mamífero.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método, el método comprende enlazar (por ejemplo, enlazar selectivamente) receptores opioides kappa, en donde dicho enlace se logra administrando un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido a un oligómero no peptídico, soluble en agua. En una o más modalidades de la invención, se proporciona un método que comprende enlazar (por ejemplo, enlazar selectivamente) receptores opioides kappa, en donde dicho enlace se logra administrando una cantidad efectiva de un compuesto que comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido a un oligómero no peptídico, soluble en agua a un paciente mamífero.
Estos y otros objetos, aspectos, modalidades y características de la invención, llegarán a ser más completamente aparentes cuando se lean en conjunto con la siguiente descripción detallada.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que muestra los cambios múltiplo en la afinidad de unión para receptores mu, kappa, y delta sobre una molécula de origen, nalbufina, trazada como una función de longitud PEG para conjugados de PEG-nalbufina, como se describe con mayor detalle en el ejemplo 4. Como se muestra en la figura 1 , afinidad de unión disminuye como una función de la longitud de cadena de PEG en los receptores de opioide kappa, pero no en los receptores de opioide delta, demostrando de este modo que la conjugación PEG diferentemente afecta la unión en estos subtipos de receptor de opioide.
Las figuras 2A y 2B son gráficas que muestran la permeabilidad in vitro y relaciones de flujo de varios conjugados de nalbufina, como se describe con mayor detalle en el ejemplo 9. Estas gráficas muestran que (i) la permeabilidad de conjugados de PEG-nalbufina en células Caco-2 disminuye como una función de longitud de cadena PEG (figura 2A) y, (ii) conjugados PEG-nalbufína son igualmente sustratos para transportadores de flujo (figura 2B).
La figura 3 es una gráfica que muestra relaciones cerebro lasma de varios conjugados PEG-balbufina, como se describe con mayor detalle en el ejemplo 10. Esta gráfica muestra resultados de conjugación PEG en una disminución en las relaciones de cerebro:plasma de nalbufina.
La figura 4 es una gráfica que muestra el pliegue porcentual por el número total de ratones, n, en el grupo de estudio, versus dosis de conjugado de mPEGn-0-morfina administrado en un ensayo analgésico para evaluar el grado de reducción o prevención de dolor visceral en ratones como se describe en detalle en el ejemplo 18. Morfina se usa como un control; molécula de origen no conjugada, sulfato de morfina, también se administra para proveer un punto adicional de referencia. Conjugados que pertenecen a la siguiente serie de conjugados: mPEG2-7,9-0-morfina se evalúan.
La figura 5 es una gráfica que muestra el pliegue porcentual por el número total de ratones, n, en el grupo de estudio, versus dosis de conjugado de mPEGn-O-hidroxicodona administrado en un ensayo analgésico para evaluar el grado de reducción o prevención de dolor visceral en ratones como se describe en detalle en el ejemplo 18. Morfina se usa como un control; molécula de origen no conjugada, oxicodona, también se administra para proveer un punto adicional de referencia. Conjugados que pertenecen a la siguiente serie de conjugados: mPEG- ^.g-O-hidroxicodona se evalúan.
La figura 6 es una gráfica que muestra el pliegue porcentual por el número total de ratones, n, en el grupo de estudio, versus dosis de conjugado de mPEGn-O-codeína administrado en un ensayo analgésico para evaluar el grado de reducción o prevención de dolor visceral en ratones como se describe en detalle en el ejemplo 18. Morfina se usa como un control; molécula de origen no conjugada, codeína, también se administra para proveer un punto adicional de referencia. Conjugados que pertenecen a la siguiente serie de conjugados: mPEG3-7,9-0-hidroxicodona se evalúan.
Las figuras 7-9 son gráficas que indican los resultados de un ensayo analgésico de latencia de placa caliente en ratones como se describe en detalle en el ejemplo 19. Específicamente, las figuras corresponden a las gráficas que muestran latencia (tiempo para lamer su pata trasera), en segundos versus dosis del compuesto. La figura 7 provee resultados para conjugados de PEG-i.s-O-hidroxicodona asi como para molécula de origen no conjugada; la figura 8 provee resultados para conjugados mPEG-i-s-O-morfina así como para una molécula de origen no conjugada; y la figura 9 provee resultados para mPEG2-5, conjugados de 9-O-codeína así como para la molécula de origen. La presencia de un asterisco por un punto de datos indica p<0.05 versus solución salina por medio de ANOVA/Dunnett's.
La figura 10 muestra los perfiles de concentración de plasma promedio-tiempo (+SD) para los compuestos, oxicodona (mPEG0-oxicodona), mPEGi-O-hidroxicodona, mPEG2-0-hidroxicodona, mPEG3-0-hidroxicodona, mPEG4-0-h¡droxicodona, mPEG5-0-hidroxicodona, mPEG6-0-hidroxicodona, mPEG7-0-hidroxicodona, y mPEGg-O-hidroxicodona, después de una administración intravenosa de 1.0 mg/kg a ratas como se describe en el ejemplo 21.
La figura 11 muestra los perfiles de concentración de plasma promedio-tiempo (+SD) para los compuestos, oxicodona (mPEG0-oxicodona), mPEGrO-hidroxicodona, mPEG2-0-hidroxicodona, mPEG3-O-hidroxicodona, mPEG4-0-hidrox¡codona, mPEG5-0-hidroxicodona, mPEG6-0-hidroxicodona, mPEG7-0-hidroxicodona, y mPEGg-O-hidroxicodona, después de una administración oral de 5.0 mg/kg a ratas como se describe en el ejemplo 21.
La figura 12 muestra los perfiles de concentración dé plasma promedio-tiempo (+SD) para los compuestos, morfina (mPEGo-morfina), y conjugados de mPEGi-7i9-0-morfina, después de una administración intravenosa de 1.0 mg/kg a ratas como se describe en el ejemplo 22.
La figura 13 muestra los perfiles de concentración de plasma promedio-tiempo (+SD) para los compuestos, morfina (mPEG0-morfina), y conjugados de mPEGi.^g-O-morfina, después de una administración oral de 5.0 mg/kg a ratas como se describe en el ejemplo 22.
La figura 14 muestra los perfiles de concentración de plasma promedio-tiempo (+SD) para los compuestos, codeína (mPEG0-codeína), y conjugados de mPEGi-7,9-0-codeína, después de una administración intravenosa de 1.0 mg/kg a ratas como se describe en el ejemplo 23.
La figura 15 muestra los perfiles de concentración de plasma promedio-tiempo (+SD) para los compuestos, codeína (mPEG0-codeína), y conjugados de mPEGi-7i9-0-codeína, después de una administración oral de .0 mg/kg a ratas como se describe en el ejemplo 23.
Las figuras 16A, 16B y 16C ilustran las relaciones de cerebro: plasma de varios conjugados mPEGn-0-morfina oligoméricos, mPEGn-O-codeína y mPEGn-0-hidroxicodona, respectivamente, después de la administración IV a ratas como se describe en los ejemplo 26. Se proporciona la relación de cerebro:plasma de atenolol en cada figura como una base de comparación.
Las figuras 17A-17H ilustran concentraciones de cerebro y plasma de morfina y varios conjugados de mPEGn-0-morfina con el tiempo después de la administración IV a ratas como se describe en el ejemplo 27. La figura 17A (morfina, n=0); figura 17B (n=1); figura 17C (n=2); figura 17D (n=3); figura 17E (n=4); figura 17F (n=5); figura 17G (n=6); figura 17H (n=7).
Las figuras 18A-18H ¡lustran concentraciones de cerebro y plasma de codeína y varios conjugados de mPEGn-0-codeína con el tiempo después de la administración IV a ratas como se describe en el ejemplo 27. La figura 18A (codeína, n=0); figura 18B (n=1); figura 18C (n=2); figura 18D (n=3); figura 18E (n=4); figura 18F (n=5); figura 18G (n=6); figura 18H (n=7).
Las figuras 19A-19H ilustran concentraciones de cerebro y plasma de oxicodona y varios conjugados de mPEGn-0-oxicodona con el tiempo después de la administración IV a ratas como se describe en el ejemplo 27. La figura 19A (oxicodona, n=0); figura 19B (n=1); figura 19C (n=2); figura 19D (n=3)¡ figura 19E (n=4); figura 19F (n=5)¡ figura 19G (n=6); figura 19H (n=7).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Como se usa en esta especificación, las formas singulares "un," "uno", y "el" incluyen referentes plurales a menos que el contexto claramente lo dicte de otra forma.
En la descripción y reivindicación de la presente invención, la siguiente terminología será usada de conformidad con las definiciones descritas posteriormente.
"Oligómero no peptídico soluble en agua" indica un oligómero que es al menos 35% (en peso) soluble, preferiblemente más de 70% (en peso), y más preferiblemente más de 95% (en peso) soluble, en agua a temperatura ambiente. Típicamente, una preparación acuosa no filtrada de un oligómero "soluble en agua" transmite al menos 75%, más preferiblemente al menos 95%, de la cantidad de luz transmitida por la misma solución después de la filtración. Es más preferido, sin embargo, que el oligómero soluble en agua sea al menos 95% (en peso) soluble en agua o completamente soluble en agua. Con respecto a ser "no peptídico", un oligómero es no peptídico cuando tiene menos de 35% (en peso) de residuos aminoácido.
Los términos "monómero", "sub-unidad monomérica" y "unidad monomérica" se usan intercambiablemente en la presente y se refieren a una de las unidades estructurales básicas de un polímero u oligómero. En el caso de un homo-oligómero, una unidad estructural de repetición única forma el oligómero. En el caso de un co-oligómero, dos o más unidades estructurales son repetidas - ya sea en un patrón o aleatoriamente - para formar el oligómero. Los oligómeros preferidos usados en conexión con la presente invención son homo-oligómeros. El oligómero no peptídico soluble en agua típicamente comprende uno o más monómeros unidos en serie para formar una cadena de monómeros. El oligómero se puede formar de un tipo de monómero único (es decir, es homo-oligomérico) o dos o tres tipos de monómero (es decir, es co-oligomérico).
Un "oligómero" es una molécula que posee desde aproximadamente 2 a aproximadamente 50 monómeros, preferiblemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 30 monómeros. La arquitectura de un oligómero puede variar. Los oligómeros específicos para uso en la invención incluyen aquellos que tienen una variedad de geometrías tal como lineal, ramificada, o bifurcada, que se describen con mayor detalle posteriormente.
"PEG" o "polietilenglicol", como se usa en la presente, se entiende que abarca cualquier poli(óxido de etileno) soluble en agua. A menos que se indique de otra forma, un "oligómero PEG" (también llamada un oligoetilenglicol) es uno en el cual sustancialmente todas (y más preferiblemente todas) las sub-unidades monoméricas son sub-unidades de óxido de etileno. El oligómero puede, sin embargo, contener distintas porciones protectoras de extremo o grupos funcionales, por ejemplo, para conjugación. Típicamente, los oligómeros PEG para uso en la presente invención comprenderán una de las siguientes dos estructuras: "-(Ch^Ch^C n- " o "-(ChkChbOJn-iChbCHa-," dependiendo de si los oxígenos terminales se han desplazado, por ejemplo, durante una transformación sintética. Para oligómeros PEG, "n" varía desde aproximadamente 2 a 50, preferiblemente desde aproximadamente 2 a aproximadamente 30, y los grupos terminales y arquitectura del PEG completo pueden variar. Cuando el PEG . adicionalmente comprende un grupo funcional, A, para enlazar, por ejemplo, a un fármaco de molécula pequeña, el grupo funcional cuando es covalentemente unido a un oligómero PEG no resulta en la formación de (i) un enlace oxígeno-oxígeno (-O-0-, un enlace de peróxido), o (ii) un enlace nitrógeno-oxígeno (N-O, O-N).
Un "grupo protector de extremo" generalmente es un grupo que contiene carbono no reactivo unido a un oxígeno terminal de un oligómero PEG. Los grupos protectores de extremo ejemplares comprenden un grupo alquilo de d-5, tal como metilo, etilo y bencilo), así como también arilo, heteroarilo, ciclo, heterociclo, y similares. Para los propósitos de la presente invención, los grupos protectores preferidos tienen pesos moleculares relativamente bajos tales como metilo o etilo. El grupo protector de extremo también puede comprende una etiqueta detectable. Tales etiquetas incluyen, sin limitación, fluorescentes, quimioluminiscentes, porciones usadas en etiquetado con enzima, etiquetas colorimétricas (por ejemplo, tintes), iones metálicos, y porciones radioactivas.
"Ramificado", en referencia a la geometría o estructura completa de un oligómero, se refiere a un oligómero que tiene dos o más polímeros que representan distintas "ramificaciones" que se extienden de un punto de ramificación.
"Bifurcado" en referencia a la geometría o estructura completa de un oligómero, se refiere a un oligómero que tiene dos o más grupos . funcionales (típicamente a través de uno o más átomos) extendidos de un punto de ramificación.
Un "punto de ramificación" se refiere a un punto de bifurcación que comprende uno o más átomos en los cuales un oligómero se ramifica o bifurca de una estructura lineal en una o más ramificaciones adicionales.
El término "reactivo" o "activado" se refiere a un grupo funcional que reacciona fácilmente a una velocidad práctica bajo condiciones convencionales de síntesis orgánica. En contraste es en aquellos grupos que ya sea no reaccionan o requieren catalizadores fuertes o condiciones de reacción no prácticas para reaccionar (es decir, un grupo "no reactivo" o "inerte").
"No reactivo fácilmente", con referencia a un grupo funcional presente en una molécula en una mezcla de reacción, indica que el grupo permanece mayormente intacto bajo condiciones que son efectivas para producir una reacción deseada en la mezcla de reacción.
Un "grupo protector" es una porción que previene o bloquea la reacción de un grupo funcional químicamente reactivo particular en una molécula bajo ciertas condiciones de reacción. El grupo protector variará dependiendo del tipo de grupo químicamente reactivo que es protegido así como las condiciones de reacción que se emplean y la presencia de grupos reactivos o protectores adicionales en la molécula. Los grupos funcionales los cuales se pueden proteger incluyen, por vía de ejemplo, grupos ácido carboxílico, grupos amino, grupos hidroxilo, grupos tiol, grupos carbonilo y similares. Los grupos protectores representativos para ácidos carboxílicos incluyen ésteres (tal como un éster de p-metoxibencilo éster), amidas e hidrazidas; para grupos amino, carbamatos (tal como terc-butoxicarbonilo) y amidas; para grupos hidroxilo, éteres y ésteres; para grupos tiol, tioéteres y tioésteres; para grupos carbonilo, acétales y cetales; y similares. Tales grupos protectores son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y se describen, por ejemplo, en T.W. Greene and G.M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Tercera Edición, Wiley, New York, 1999, y referencias citadas en esta.
Un grupo funcional en "forma protegida" se refiere a un grupo funcional que porta un grupo protector. Como se usa en la presente, el término "grupo funcional" o cualquier sinónimo del mismo abarca formas protegidas del mismo.
Un enlace "fisiológicamente escindible" o "hidrolizable" o "degradable" es un enlace relativamente lábil que reacciona con agua (es decir, es hidrolizado) bajo condiciones fisiológicas ordinarias. La tendencia de un enlace a hidrolizarse en agua bajo condiciones fisiológicas ordinarias dependerá no solamente del tipo general de enlace que conecta dos átomos centrales sino también de los sustituyentes unidos a estos átomos céntrales.
Tales enlaces son generalmente reconocibles por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Los enlaces hidrolíticamente inestables o débiles apropiados incluyen, pero no se limitan a, éster carboxilato, éster fosfato, anhídridos, acétales, cetales, éter de aciloxialquilo, ¡minas, ortoésteres, péptidos, oligonucléotidos, tioésteres, y carbonatos.
Un "enlace enzimáticamente degradable" significa un enlace que se somete a degradación por una o más enzimas bajo condiciones fisiológicas ordinarias.
Un enlace o unión "estable" se refiere a una porción o enlace químico, típicamente un enlace covalente, que es sustancialmente estable en agua, es decir, no sufre hidrólisis bajo condiciones fisiológicas ordinarias a cualquier grado apreciable durante un período de tiempo prologando. Los ejemplos de enlaces hidrolíticamente estables incluyen pero no se limitan a los siguientes: enlaces carbono-carbono (por ejemplo, en cadenas alifáticas), éteres, amidas, uretanos, aminas, y similares. Generalmente, un enlace estable es uno que exhibe una velocidad de hidrólisis menor que aproximadamente 1-2% por día bajo condiciones fisiológicas ordinarias. Las velocidades de hidrólisis de enlaces químicos representativos se pueden encontrar en libros de texto de química más estándares.
En el contexto de la descripción de la consistencia de oligómeros en una composición dada, "sustancialmente" o "esencialmente" significa casi totalmente o completamente, por ejemplo, 95% o más, más preferiblemente 97% o más, aún más preferiblemente 98% o más, aún más preferiblemente 99% o más, todavía aún más preferiblemente 99.9% o más, con 99.99% o más siendo más preferido de alguna cantidad dada.
"Monodisperso" se refiere a una composición de oligómeros en donde sustancialmente todos los oligómeros en la composición tienen un peso molecular único bien definido y número definido de monómeros, como se determina por cromatografía o espectrometría de masas. Las composiciones de oligómeros monodispersas están en un sentido puro, es decir, sustancialmente comprenden moléculas que tienen un número de monómeros único y definible antes que varios diferentes números de monómeros (es decir, una composición de oligómeros que tiene tres o más diferentes tamaños de oligómeros). Una composición de oligómeros monodispersa posee un valor de PM/Mn de 1.0005 o menos, y más preferiblemente, un valor de PM/Mn de 1.000. Por extensión, una composición comprendida de conjugados monodispersos significa que sustancialmente todos los oligómeros de todos los conjugados en la composición tienen un número único y definible (como un número total) de monómeros antes que una distribución y podría poseer un valor de PM/Mn de 1.0005, más preferiblemente, un valor de PM/Mn de 1.0000 si el oligómero no estuviera unido al residuo del opioide. Una composición comprendida de conjugados monodispersos puede incluir, sin embargo, una o más sustancias monoconjugadas tales como solventes, reactivos, excipientes, etcétera.
"Bimodal", en referencia a una composición de oligómeros, se refiere a una composición de oligómeros en donde sustancialmente todos los oligómeros en la composición tienen uno o dos números definibles y diferentes (como números totales) de monómeros antes que una distribución, y cuya distribución de pesos moleculares, cuando se gráfica como una fracción de número contra peso molecular, aparece como dos picos identificables separados. Preferiblemente, para una composición de oligómeros bimodal como se describe en la presente, cada pico es generalmente simétrico alrededor de su promedio, aunque el tamaño de los dos picos puede diferir. Idealmente, el índice polidispersidad de cada pico en la distribución bimodal, PM/Mn es 1.01 o menos, más preferiblemente 1.001 o menos, y aún más preferiblemente 1.0005 o menos, y muy preferiblemente un valor de PM/Mn de 1.0000. Por extensión, una composición comprendida de conjugados bimodales significa que sustancialmente todos los oligómeros de todos los conjugados en la composición tienen uno de dos números definibles y diferentes (como números totales) de monómeros antes que una gran distribución y podría poseer un valor de PM/Mn de 1.01 o menos, más preferiblemente 1.001 o menos y aún más preferiblemente 1.0005 o menos, y muy preferiblemente un valor de PM/Mn de 1.0000 si el oligómero no estuviera unido al residuo del opioide. Una composición comprendida de conjugados bimodales puede incluir, sin embargo, una o más sustancias monoconjugadas tales como solventes, reactivos, excipientes, etcétera.
Un "agonista opioide" es ampliamente usada en la presente para referirse a un compuesto orgánico, inorgánico, u organometálico que típicamente tiene un pero molecular menor de aproximadamente 1000 Daltons (y típicamente menos de 500 Daltons) y que tiene algún grado de actividad como agonistas mu y/o kappa. Los agonistas opioides abarcan oligopéptidos y otras biomoléculas que tienen menos de aproximadamente 1000.
Una "membrana biológica" es cualquier membrana, típicamente hecha de células o tejidos especializados, que sirve como una barrera para al menos algunas entidades extrañas o materiales de otra forma indeseables. Como se usa en la presente una "membrana biológica" incluye aquellas membranas que están asociadas con barreras protectoras fisiológicas incluyendo, por ejemplo: la barrera sangre-cerebro (BBB); la barrera de sangre-fluido cerebroespinal; la barrera de sangre-placental; la barrera sangre-leche; la barrera sangre-testículos; y barreras mucosales incluyendo mucosa vaginal, mucosa uretral, mucosa anal, mucosa bucal, mucosa sublingual, mucosa rectal, etcétera. A menos que el contexto lo dicte claramente de otra forma, el término "membrana biológica" no incluye aquellas membranas asociadas con el tracto gastrointestinal medio (por ejemplo, estómago e intestino delgado).
Una "velocidad de cruce de membrana biológica", como se usa en la presente, proporciona una medida de la capacidad del compuesto para cruzar una membrana biológica (tal como la membrana asociada con la barrera de sangre-cerebro). Una variedad de métodos se pueden usar para valorar el transporte de una molécula a través de cualquier membrana biológica dada. Los métodos para valorar la velocidad de cruce de membrana biológica asociada con cualquier barrera biológica dada (por ejemplo, la barrera de sangre-fluido cerebroespinal, la barrera de sangre-placental, la barrera de sangre-leche, la barrera intestinal, etcétera), se conocen en la técnica, se describen en la presente y/o en la literatura relevante, y/o se pueden determinar por uno de experiencia ordinaria en la técnica.
Una "velocidad reducida de metabolismo" en referencia a la presente invención, se refiere a una reducción medible de la velocidad de . metabolismo de un conjugado de oligómero soluble en agua-fármaco de molécula pequeña cuando se compara con la velocidad de metabolismo del fármaco de molécula pequeña no unido al oligómero soluble en agua (es decir, el fármaco de molécula pequeña por si solo) o un material estándar de referencia. En el caso especial de "primera velocidad de paso reducida de metabolismo", la misma "velocidad reducida de metabolismo" se requiere excepto que el fármaco de molécula pequeña (o material estándar de referencia) y el conjugado correspondiente se administran oralmente. Los fármacos oralmente administrados son absorbidos del tracto gastrointestinal en la circulación portal y deben pasar a través del hígado previo a alcanzar la circulación sistémica. Debido a que el hígado es el sitio primario del metabolismo de fármaco o biotransformación, una cantidad sustancial de fármaco se puede metabolizar antes de que alcance la circulación sistémica. El grado de primer paso de metabolismo, y por consiguiente, cualquier reducción del mismo, se puede medir por un número de diferentes procedimientos. Por ejemplo, las muestras de sangre animal se pueden colectar a intervalos sincronizados y el plasma o suero se analiza por cromatografía líquida/espectrometría de masas para niveles de metabolitos. Otras técnicas para medir una "velocidad reducida de metabolismo" asociada con el primer paso de metabolismo y otros procesos metabólicos son conocidas en la técnica, descritas en la presente y/o en la literatura relevante, y/o se pueden determinar por uno de experiencia ordinaria en la técnica. Preferiblemente, un conjugado de la invención puede proporcionar una velocidad reducida de reducción de metabolismo que satisfaga al menos uno de los siguientes valores: al menos aproximadamente 30%; al menos aproximadamente 40%; al menos aproximadamente 50%; al menos aproximadamente 60%; al menos aproximadamente 70%; al menos aproximadamente 80%; y al menos aproximadamente 90%. Un compuesto (tal como un fármaco de molécula pequeña o conjugado del mismo) que es "oralmente biodisponible" es uno que preferiblemente posee una biodisponibilidad cuando se administra oralmente de más de 25%, y preferiblemente más de 70%, donde una biodisponibilidad del compuesto es la fracción de fármaco administrado que alcanza la circulación sistémica en forma no metabolizada.
"Alquilo" se refiere a una cadena de hidrocarburo, típicamente que varía desde aproximadamente 1 a 20 átomos de longitud. Tales cadenas de hidrocarburo son preferiblemente, pero no necesariamente, saturadas y pueden ser ramificadas o de cadena recta, aunque típicamente es preferido de cadena recta. Los grupos alquilo ejemplares incluyen metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo, 1-metilbutilo, 1-etilpropilo, 3-metilpentilo, y similares. Como se usa en la presente, "alquilo" incluye cicloalquilo cuando tres o más átomos de carbono son referenciados. Un grupo "alquenilo" es un alquilo de 2 a 20 átomos de carbono con al menos un enlace doble carbono-carbono.
Los términos "alquilo sustituido" o alquilo de Cq-r sustituido" donde q y r son números enteros que identifican el intervalo de átomos de carbono contenidos en el grupo alquilo, denota los grupos alquilo anteriores que son sustituidos por uno, dos o tres halo (por ejemplo, F, Cl, Br, I), trifluorometilo, hidroxi, alquilo de C1.7 (por ejemplo, metilo, etilo, h-propilo, isopropilo, butilo, t-butilo, etcétera), alcoxi de Ci-7, aciloxi de C-i-7, heterocíclico de C3-7, amino, fenoxi, nitro, carboxi, carboxi, acilo, ciano. Los grupos alquilo sustituido se pueden sustituir una vez, dos veces o tres veces con los mismos o con diferentes sustituyentes.
"Alquilo inferior" se refiere a un grupo alquilo que consiste de 1 a 6 átomos de carbono, y puede ser de cadena recta o ramificado, como se ejemplifica por metilo, etilo, n-butilo, i-butilo, t-butilo. "Alquenilo inferior" se refiere a un grupo alquilo inferior de 2 a 6 átomos de carbono que tiene al menos un enlace doble carbono-carbono.
"Sustituyentes que no interfieren" son aquellos grupos que, cuando están presentes en una molécula, típicamente son no reactivos con otros grupos funcionales contenidos dentro de la molécula.
"Alcoxi" se refiere a un grupo -O-R, en donde R es alquilo o alquilo sustituido, preferiblemente alquilo de C C2o (por ejemplo, metoxi, etoxi, propiloxi, bencilo, etc.), preferiblemente CrC7.
"Excipiente farmacéuticamente aceptable" o "portador farmacéuticamente aceptable" se refiere al componente que se puede incluir en las composiciones de la invención para proporcionar una composición que tiene una ventaja (por ejemplo, más adecuada para administración a un paciente) sobre una composición que carece del componente y que se reconoce que no causa efectos toxicológicos adversos significativos a un paciente.
El término "arilo" significa un grupo aromático que tiene hasta 14 átomos de carbono. Los grupos arilo incluyen fenilo, naftilo, bifenilo, fenantrenilo, naftacenilo, y similares. "Fenilo sustituido" y "arilo sustituido" denotan un grupo fenilo y grupo arilo, respectivamente, sustituido con uno, dos, tres, cuatro o cinco (por ejemplo, 1 -2, 1 -3 o 1-4 sustituyentes) elegidos de halo (F, Cl, Br, I), hidroxi, hidroxi, ciano, nitro, alquilo (por ejemplo, alquilo de Ci-6), alcoxi (por ejemplo, alcoxi de d-6), benciloxi, carboxi, arilo, etcétera.
Una "porción que contiene aromático" es una colección de átomos que contienen al menos arilo y opcionalmente uno o más átomos. Las porciones que contiene aromático adecuadas se describen en la presente.
Por simplicidad, las porciones químicas son definidas y referidas completamente principalmente como porciones químicas univalentes (por ejemplo, alquilo, arilo, etc.). No obstante, tales términos también se usan para transportar porciones multivalentes correspondientes bajo las circunstancias estructurales apropiadas claras para aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, mientras una porción "alquilo" generalmente se refiere a un radical monovalente (por ejemplo, CH3-CH2-), en ciertas circunstancias una porción de enlace bivalente puede ser "alquilo", en este caso aquellos expertos en la técnica entenderán que el alquilo es un radical bivalente (por ejemplo, -CH2-CH2-), lo cual es equivalente al término "alquileno". (De manera similar, en circunstancias en las cuales una porción divalente es requerida y es establecida como siendo "arilo", aquellos expertos en la técnica entenderán que el término "arilo" se refiere a la porción divalente correspondiente, arileno). Se entiende que todos los átomos tienen su número normal de valencias para formación de enlace (es decir, 4 para carbono, 3 para N, 2 para O, y 2, 4, o 6 para S, dependiendo de la velocidad de oxidación del S).
"Cantidad farmacológicamente efectiva", "cantidad fisiológicamente efectiva", y "cantidad terapéuticamente efectiva" se usan intercambiablemente en la presente para significar la cantidad de un conjugado de oligómero soluble en agua-fármaco de molécula pequeña presente en una composición que es necesaria para proporcionar un nivel de umbral de agente activo y/o conjugado en el flujo sanguíneo o en el tejido objetivo. La cantidad precisa dependerá de numerosos factores, por ejemplo, el agente activo particular, los componentes y características físicas de la composición, población de pacientes propuesta, consideraciones del paciente, y similares, y fácilmente se puede determinar por un experto en la técnica, basado en la información proporcionada en la presente y disponible en la literatura relevante.
Un oligómero "difuncional" es un oligómero que tiene dos grupos funcionales contenidos en este, típicamente en sus términos. Cuando los grupos funcionales son los mismos, se dice que el oligómero es homodifuncional. Cuando los grupos funcionales son diferentes, se dice que el oligómero es heterobifuncional.
Un reactivo básico o reactivo ácido descrito en la presente incluye neutral, cargado, y cualquiera de las formas de sal correspondientes del mismo.
El término "paciente", se refiere a un organismo viviente que sufre o está propenso a una afección que se puede prevenir o tratar por administración de un conjugado como se describe en la presente, típicamente, pero no necesariamente, en la forma de un conjugado de oligómero soluble en agua- fármaco de molécula pequeña, e incluye tanto humanos como animales.
"Opcional" u "opcionalmente" significa que la circunstancia posteriormente descrita puede pero no necesita ocurrir necesariamente, de modo que la descripción incluye casos donde la circunstancia ocurre y casos donde no.
Como se indicó anteriormente, la presente invención se dirige a (entre otras cosas) un compuesto que comprende un residuo de un agonista . opioide covalentemente unido vía un enlace estable o degradable a un oligómero no peptídico, soluble en agua.
En una o más modalidades de la invención, se proporciona un compuesto, el compuesto comprende un residuo de un agonista opioide covalentemente unido vía un enlace estable o degradable a un oligómero no peptídico y soluble en agua, en donde el agonista opioide tiene una estructura abarcada por la siguiente fórmula: Fórmula I en donde: R1 es H o un radical orgánico [tal como metilo, etilo y -C(0)CH3]; R2 es H u OH; R3 es H o un radical orgánico; R4 es H o un radical orgánico; la línea punteada ("--") representa un enlace doble opcional; Y1 es O o S; y R5 se selecciona a partir del grupo que consiste de (sin considerar la estereoquímica), en donde R6 es un radical orgánico [que incluye C(O)CH3].
Ejemplos de grupos R3 incluyen alquilo inferior tal como metilo, opropilo, y lo similar, así como lo siguiente En una o más modalidades de la invención, se provee un compuesto, el compuesto comprendiendo un residuo de un agonista opioide unido covalentemente vía un enlace estable o degradable a un oligómero no peptídico, soluble en agua, en donde el agonista opioide tiene una estructura incluida por la siguiente fórmula: Fórmula II donde: N* es nitrógeno; Ar es seleccionado del grupo formado por ciclohexilo, fenilo, halofenilo, metoxifenilo, aminofenilo, piridilo, furilo y tienilo; Alq es seleccionado del grupo que consiste de etileno y propileno; Rn está seleccionado del grupo formado por alquilo inferior, alcoxi inferior, dimetilamino, ciclopropilo, 1 -pirrolidilo, morfolino (preferiblemente alquilo inferior como etilo); RII' está seleccionado del grupo conformado por hidrógeno, metilo, y metoxi; y RII" está seleccionado del grupo formado por hidrógeno y un radical orgánico (preferiblemente alquilo inferior).
Con respecto a la fórmula II, se entenderá que, dependiendo de las condiciones, una o ambas de las aminas, pero más normalmente, la amina marcada con un asterisco ("N*") en la fórmula II -- puede ser protonada.
Ejemplos de agonistas de opioide específicos incluyen aquellos seleccionados del grupo que consiste de acetorfina, acetildihidrocodeína, acetildihidrocodeinona, acetilmorfinona, alfentanilo, alilprodina, alfaprodina, anileridina, bencilmorfina, becitramida, buprenorfina, butorfanol, clonitazeno, codeína, desomorfina, dextromoramida, dezocina, diampromido, diamorfona, dihidrocodeína, dihidromorfina, dimenoxadol, dimefeptanol, dimetiltiambuteno, dioxafetil butirato, dipipanona, eptazocina, etoheptazina, etilmetiltiambuteno, etilmorfina, etonitazeno, etorfina, dihidroetorfina, fentanil y derivados, heroína, hidrocodona, hidroxicodona, hidromorfona, hidroxipetidina, isometadona, cetobemidona, levorfanol, levofenacilmorfanó, lofentanilo, meperidina, meptazinol, metazocina, metadona, metopon, morfina, mirofina, narceina, nicomorfina, norlevorfanol, normetadona, nalorfina, nalbufina, normorfina, norpipanona, opio, oxicodona, oximorfona, papavereto, pentazocina, fenadoxona, fenomorfano, fenazocina, fenoperidina, piminodina, piritramida, profeptazina, promedol, properidina, propoxifeno, sufentanilo, tilidina, y tramadol. En ciertas modalidades, el agonista opioide se selecciona a partir del grupo que consiste de hidrocodona, morfina, hidromorfona, oxicodona, codeína, levorfanol, meperidina, metadona, oximorfona, buprenorfina, fentanilo, dipipanona, heroína, tramadol, nalbufina, etorfina, dihidroetorfina, butorfanol, levorfanol.
Se cree que una ventaja de los conjugados de la presente invención es su capacidad para retener algún grado de actividad de agonista opioide mientras también exhibe una reducción en metabolismo y/o que resulta en una reducción de los efectos mediados del CNS asociados con el agonista opioide correspondiente en forma no conjugada. Aunque no se desee ligar por la teoría, se cree que los conjugados que contienen oligómero descritos en la presente --contrario a los agonistas opioides "originales" no conjugados--, son metabolizados ya fácilmente debido a que él oligómero sirve para reducir la afinidad total del compuesto a sustratos que pueden metabolizar agonistas opioides. Además (y nuevamente, sin desear ser ligado por la teoría), el tamaño adicional introducido por el oligómero --contrario al agonista opioide "original" no conjugado--, reduce la capacidad del compuesto para cruzar la barrera hemato-encefálica.
El uso de oligómeros (por ejemplo, de una composición monodispersa o bimodal de oligómeros, contrario a composiciones relativamente impuras), para formar los conjugados de la invención, puede ventajosamente, alterar ciertas propiedades asociadas con el fármaco de molécula pequeña correspondiente. Por ejemplo, un conjugado de la invención, cuando se administra por cualquiera de un número de rutas de administración adecuadas, tales como parenteral, oral, transdermal, bucal, pulmonar o nasal, exhibe penetración reducida a través de la barrera hematoencefálica. Se prefiere que el conjugado reducido, mínimo o efectivamente ningún cruce a través de la barrera hemato-encefálica, mientras todavía cruza las paredes gastro-intestinales (Gl) y en la circulación sistémica si la administración oral es propuesta. Sin embargo, los conjugados de la invención mantienen un grado de bioactividad, así como también biodisponibilidad en su forma conjugada en comparación con la bioactividad y biodisponibilidad del compuesto libre de todos los oligómeros.
Con respecto a la barrera hemato-encefálica ("BBB"), esta barrera restringe el transporte de fármacos de la sangre al cerebro. Esta barrera consiste de una capa continua de células endoteliales única unidas por uniones herméticas. Los capilares cerebrales, los cuales comprenden más de 95% del área de superficie total de la BBB, representa la ruta principal para la entrada de la mayoría de solutos y fármacos en el sistema nervioso central.
Para compuestos cuyo grado de habilidad para cruzar la barrera hemato-encefálica no es fácilmente conocido, tal capacidad puede ser determinada usando un modelo animal tal como en un modelo de perfusión cerebral de rata in situ ("RPM"), como se describe en la presente. Brevemente, la técnica RBP involucra canulación de la arteria carótida seguida por perfusión con una solución de compuesto bajo condiciones controladas, seguida por una fase de lavado para remover el compuesto que permanece en el espacio vascular. (Tal análisis puede ser conducido por ejemplo, por organizaciones de investigaciones de contrato, tales como Absorption Systems, Exton, PA). Más específicamente, en el modelo RBP, se coloca una cánula en la arteria carótida izquierda y las ramas laterales son ligadas. Un amortiguador fisiológico que contiene el analito (típicamente pero no necesariamente a un nivel de concentración 5 micromolar), es perfundido a una velocidad de flujo de aproximadamente 10 ml/min en un experimento de perfusión de paso único. Después de 30 segundos, la perfusión es detenida y los contenidos vasculares cerebrales son lavados con amortiguador libre de compuesto por unos 30 segundos adicionales. El tejido cerebral es entonces removido y analizado por las concentraciones de compuesto vía cromatografía líquida con detección de espectrometría de masas en serie (LC/MS/MS). Alternativamente, la permeabilidad de la barrera hemato-encefálica puede ser estimada basada en un cálculo del área de superficie polar molecular del compuesto ("PSA"), la cual es definida como la suma de contribuciones de superficie de átomos polares (usualmente oxígenos, nitrógenos e hidrógenos unidos) en una molécula. El PSA ha sido mostrado por correlacionarse con propiedades de transporte de compuesto tales como transporte de barrera hemato-encefálica. Los métodos para determinar el PSA de un compuesto se pueden encontrar, por ejemplo, en Ertl, P., et al., J. Med. Chem. 2000, 43, 3714-3717; and Kelder, J., er a/., Pharm. Res. 1999, 16, 1514-1519.
Con respecto a la barrera hemato-encefálica, el conjugado de fármaco de molécula pequeña-oligómero no peptídico, soluble en agua, exhibe una velocidad de cruce de barrera hemato-encefálica que es reducida comparada con la velocidad de cruce del fármaco de molécula pequeña no unido al oligómero no peptidico, soluble en agua. Reducciones ejemplares preferidas en las velocidades de cruza de barrera hemato-encefálica para los compuestos descritos en la presente incluyen, reducciones de: al menos aproximadamente 30%; al menos aproximadamente 40%; al menos aproximadamente 50%; al menos aproximadamente 60%; al menos aproximadamente 70%; al menos aproximadamente 80%; o al menos aproximadamente 90%, cuando se compara con la velocidad de cruce de la barrera hemato-encefálica del fármaco de molécula pequeña no unido al oligómero soluble en agua. Una reducción preferida en la velocidad de cruce de la barrera hemato-encefálica para un conjugado es al menos aproximadamente 20%.
Como se indica anteriormente, los compuestos de la invención incluyen un residuo de un agonista opioide. Los ensayos para determinar si un compuesto dado (con respecto a si el compuesto es conjugado o no), puede actuar como un agonista o un receptor mu o un receptor kappa, son descritos infra.
En algunos casos, los agonistas opioides se pueden obtener a partir de fuentes comerciales. Además, los agonistas opioides se pueden obtener a través de síntesis química. Procedimientos sintéticos para preparar agonistas opioides se describen en la literatura y en, por ejemplo, Patentes Estadounidenses Nos. 2,628,962, 2,654,756, 2,649,454, y 2,806,033.
Cada uno de estos (y otros) opioides se pueden unir covalentemente (ya sea directamente o a través de uno o más átomos) a un oligómero no peptídico soluble en agua.
Los fármacos de molécula pequeña usados en la invención generalmente tienen un peso molecular menor que 1000 Da. Los pesos moleculares ejemplares de fármacos de molécula pequeña incluyen pesos moleculares de: menos de aproximadamente 950; menos de aproximadamente 900; menos de aproximadamente 850; menos de aproximadamente 800; menos de aproximadamente 750; menos de aproximadamente 700; menos de aproximadamente 650; menos de aproximadamente 600; menos de aproximadamente 550; menos de aproximadamente 500; menos de aproximadamente 450; menos de aproximadamente 400; menos de aproximadamente 350; y menos de aproximadamente 300.
El fármaco de molécula pequeña usado en la invención, si es quiral, puede estar en una mezcla racémica, o una forma ópticamente activa, por ejemplo, un enantiómero ópticamente activo único, o cualquier combinación o relación de enantiómeros (es decir, mezcla escalémica). Además, el fármaco de molécula pequeña puede poseer uno o más isómeros geométricos. Con respecto a los isómeros geométricos, una composición puede comprender un isómero geométrico único o una mezcla de dos o más isómeros geométricos. Un fármaco de molécula pequeña para uso en la presente invención puede estar en su forma activa habitual, o puede poseer algún grado de modificación. Por ejemplo, un fármaco de molécula pequeña puede tener un agente de objetivo, marca, o transportador unido a este, previo a o después de la unión covalente de un oligómero. Alternativamente, el fármaco de molécula pequeña puede poseer una porción lipofílica unida a este, tal como un fosfolípido (por ejemplo, diestearoilfosfatidiletanoíamina o "DSPE," dipalmitoilfosfatidiletanolamina o "DPPE," etcétera) o un ácido graso pequeño. En algunos casos, sin embargo, es preferido que la porción de fármaco de molécula pequeña no incluya unión a una porción lipofílica.
La agonista opioide para acoplamiento a un oligómero soluble en agua y no peptídico, posee un grupo hidroxilo libre, carboxilo, tio, amino, o similares (es decir, "manual"), adecuado para unión covalente al oligómero. Además, el agonista opioide puede ser modificado por introducción de un grupo reactivo, preferiblemente por conversión de uno de sus grupos funcionales existentes a un grupo funcional adecuado para formación de un enlace covalente estable entre el oligómero y el fármaco.
Por consiguiente, cada oligómero está compuesto de hasta tres diferentes tipos de monómero seleccionados del grupo que consiste de: óxido de alqutleno, tal como óxido de etileno u óxido de propileno; alcohol ólefínico, tal como alcohol vinílico, 1-propenol o 2-propenol; vinil pirrolidona; hidroxialquil metacrilarnida o hidroxialquil metacrilato, donde alquilo es preferiblemente metilo; a-hidroxi ácido, tal como ácido láctico o ácido glicólico; fosfaceno, oxazolina, aminoácidos, carbohidratos tales como monosacáridos, sacárido o manitol; y N-acriloilmorfolina. Los tipos de monómero preferidos incluyen óxido de alquileno, alcohol olefínico, hidroxialquil metacrilamida o metacrilato, N-acriloilmorfolina, y a-hidroxi ácido. Preferiblemente cada oligómero es, independientemente, un co-oligómero de dos tipos de monómero seleccionados de este grupo, o, más preferiblemente, es un homo-óligómero de un tipo de monómero seleccionado de este grupo.
Los dos tipos de monómero en un co-oligómero pueden ser del mismo tipo de monómero, por ejemplo, dos óxidos de alquileno, tales como óxido de etileno y óxido de propileno. Preferiblemente, el oligómero es un homo-oligómero de óxido de etileno. Usualmente, aunque no necesariamente, el término (o términos) del oligómero que no es covalentemente unido a una molécula pequeña es cubierto para volverlo no reactivo. Alternativamente, el término puede incluir un grupo reactivo. Cuando el término es un grupo reactivo, el grupo reactivo es cualquiera seleccionado de modo que es no reactivo bajo las condiciones de formación del oligómero final o durante la unión covalente del oligómero a un fármaco de molécula pequeña, o es protegido como sea necesario. Un grupo funcional de extremo común es hidroxilo o -OH, particularmente para óxidos de oligoetileno.
El oligómero no peptídico soluble en agua (por ejemplo, "POLY" en varias estructuras proporcionadas en la presente), puede tener cualquiera de un número de diferentes geometrías. Por ejemplo, puede ser lineal, ramificado, o bifurcado. Muy típicamente, el oligómero no peptídico, soluble en agua es lineal o es ramificado, por ejemplo, tiene un punto de ramificación. Aunque mucha de la discusión aquí se enfoca en el poli(óxido de etileno) como un oligómero ilustrativo, la discusión y estructuras presentadas en la presente pueden ser fácilmente extendidas para abarcar cualquier oligómero no peptídico, soluble en agua descrito anteriormente.
El peso molecular del oligómero no peptídico, soluble en agua, excluyendo la porción enlazante, es generalmente relativamente bajo. Los valores ejemplares del peso molecular del polímero soluble en agua incluyen: por debajo de aproximadamente 1500; por debajo de aproximadamente 1450; por debajo de aproximadamente 1400; por debajo de aproximadamente 1350; por debajo de aproximadamente 1300; por debajo de aproximadamente 1250; por debajo de aproximadamente 1200; por debajo de aproximadamente 1 50; por debajo de aproximadamente 1100; por debajo de aproximadamente 1050; por debajo de aproximadamente 1000; por debajo de aproximadamente 950; por debajo de aproximadamente 900; por debajo de aproximadamente 850; por debajo de aproximadamente 800; por debajo de aproximadamente 750; por debajo de aproximadamente 700; por debajo de aproximadamente 650; por debajo de aproximadamente 600; por debajo de aproximadamente 550; por debajo de aproximadamente 500; por debajo de aproximadamente 450; por debajo de aproximadamente 400; por debajo de aproximadamente 350; por debajo de aproximadamente 300; por debajo de aproximadamente 250; por debajo de aproximadamente 200; por debajo de aproximadamente 150; y por debajo de aproximadamente 100 Daltons.
Los intervalos ejemplares de pesos moleculares del oligómero no peptídico soluble en agua (excluyendo el enlazante) incluyen: desde aproximadamente 100 a aproximadamente 1400 Daltons; desde aproximadamente 100 a aproximadamente 1200 Daltons; desde aproximadamente 100 a aproximadamente 800 Daltons; desde aproximadamente 100 a aproximadamente 500 Daltons; desde aproximadamente 100 a aproximadamente 400 Daltons; desde aproximadamente 200 a aproximadamente 500 Daltons; desde aproximadamente 200 a aproximadamente 400 Daltons; desde aproximadamente 75 a 1000 Daltons; y desde aproximadamente 75 a aproximadamente 750 Daltons.
Preferiblemente, el número de monómeros en el oligómero no peptldico, soluble en agua, cae dentro de uno o más de los siguientes intervalos: entre aproximadamente 1 y aproximadamente 30 (inclusivos); entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10. En ciertos casos, el número de monómeros en serie en el oligómero (y el conjugado correspondiente) es uno de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8. En modalidades adicionales, el oligómero (y el conjugado correspondiente) contiene 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, o 20 monómeros. En modalidades todavía adicionales, el oligómero (y el conjugado correspondiente) posee 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 monómeros en serie. Por consiguiente, por ejemplo, cuando el oligómero no peptídico, soluble en agua incluye CH3-(OCH2CH2)n-, "n" es un número entero que puede ser 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30, y puede caer dentro de uno o más de los siguientes intervalos: entre aproximadamente 1 y aproximadamente 25; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 20; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 15; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 12; entre aproximadamente 1 y aproximadamente 10.
Cuando el oligómero no peptídico soluble en agua tiene 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, o 10 monómeros, estos valores corresponden a un oligo(óxido de etileno) protegido en el extremo metoxi que tiene un peso molecular de aproximadamente 75, 119, 163, 207, 251 , 295, 339, 383, 427, y 471 Daltons, respectivamente. Cuando el oligómero tiene 1 1 , 12, 13, 14, o 15 monómeros, estos valores corresponden a oligo (óxido de etileno) protegido en el extremo metoxi que tiene pesos moleculares correspondientes a aproximadamente 515, 559, 603, 647, y 691 Daltons, respectivamente.
Cuando el oligómero no peptídico soluble en agua se une al agonista opioide (en contraste con la adición por etapas de uno o más monómeros para "hacer crecer" efectivamente el oligómero en el opioide), es preferido que la composición que contiene una forma activada del oligómero no peptídico soluble en agua sea monodispersada. En aquellos casos, sin embargo, donde una composición bimodal es empleada, la composición poseerá una distribución bimodal centrada alrededor de cualquiera de los dos números de monómeros anteriores. Idealmente, el índice de polidispersidad de cada pico en la distribución bimodal, Pm/Mn, es 1.01 o menos, y aún más preferiblemente, es 1.001 o menos, y aún más preferiblemente es 1.0005 o menos. Muy preferiblemente, cada pico posee un valor de PM/Mn de 1 .0000. Por ejemplo, un oligómero bimodal puede tener cualquiera de las siguientes combinaciones ejemplares de sub-unidades monoméricas: 1-2, 1 -3, 1 -4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, etcétera; 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 2-7, 2-8, 2-9, 2-10, etcétera; 3-4, 3-5, 3-6, 3-7, 3-8, 3-9, 3-10, etcétera; 4-5, 4-6, 4-7, 4-8, 4-9, 4-10, etcétera; 5-6, 5-7, 5-8, 5-9, 5-10, etcétera; 6-7, 6-8, 6-9, 6-10, etcétera; 7-8, 7-9, 7-10, etcétera; y 8-9, 8-10, etcétera.
En algunos casos, la composición que contiene una forma activada del oligómero no peptídico, soluble en agua será trimodal o aún tetramodal, teniendo un intervalo de unidades monoméricas como se describió previamente. Las composiciones de oligómero que tienen úna mezcla bien definida de oligómeros (es decir, es bimodal, trimodal, tetramodal, etcétera) se pueden preparar mezclando oligómeros monodispersos purificados para obtener un perfil deseado de oligómeros (una mezcla de dos oligómeros que difieren solamente en el número de monómeros es bimodal; una mezcla de tres oligómeros que difieren solamente en el número de monómeros es trimodal; una mezcla de cuatro oligómeros que difieren solamente en el número de monómeros es tetramodal), o alternativamente, se puede obtener de la cromatografía de columna de un oligómero polidisperso recubriendo el "corte del centro", para obtener una mezcla de oligómeros en un intervalo de peso molecular deseado y definido.
Es preferido que el oligómero no peptídico, soluble en agua, sea obtenido a partir de una composición que es preferiblemente unimolécular o monodispersa. Es decir, los oligómeros en la composición poseen el mismo valor de peso molecular discreto más que una distribución de pesos moleculares. Algunos oligómeros monodispersos se pueden comprar de fuentes comerciales tales como aquéllas disponibles de Sigma-Aldrich, o alternativamente, se pueden preparar directamente a partir de materiales de partida comercialmente disponibles tales como Sigma-Aldrich. Los oligómeros no peptídicos, solubles en agua, se pueden preparar como se describe en Chen Y., Baker, G.L., J. Org. Chem., 6870-6873 (1999), WO 02/098949, y Publicación de Solicitud de Patente Norteamericana 2005/0136031.
Cuando se presenta, la porción espadadora (a través de la cual el polímero no peptídico, soluble en agua, se une al opioide), puede ser un enlace único, un átomo único, tal como un átomo de oxigeno o un átomo de azufre, dos átomos, o un número de átomos. Una porción espadadora es típicamente pero no necesariamente de naturaleza lineal. La porción espadadora "X" es preferiblemente hidrolíticamente estable, y es preferiblemente también enzimáticamente estable. Preferiblemente, la porción espadadora "X" es una que tiene una longitud de cadena de menos de aproximadamente 12 átomos, y de manera preferible menor que aproximadamente 10 átomos, y en forma aún más preferible menor que aproximadamente 8 átomos y aún más preferible menos que aproximadamente 5 átomos, en donde la longitud significa el número de átomos en una única cadena, sin contar sustituyentes. Por ejemplo, un enlace de urea tal como este, Roi¡gómero-NH-(C=O)-NH-R'fármaco, se considera que tiene una longitud de cadena de 3 átomos (-NH-C(O)-NH-). En modalidades seleccionadas, el enlace de la porción espaciadora no comprende además grupos espaciadores.
En algunos casos, la porción espaciadora "X" comprende un éter, amida, uretano, amina, tioéter, urea, o un enlace carbono-carbono. Los grupos funcionales tales como aquéllos descritos posteriormente, e ilustrados en los ejemplos, típicamente se usan para formar los enlaces. La porción espaciadora también puede comprender de manera menos preferible (o estar adyacente a o flanqueado por) grupos espaciadores, como se describe además posteriormente.
De manera más específica, en modalidades seleccionadas, una porción espaciadora, X, puede ser cualquiera de las siguientes: "-" (es decir, un enlace covalente, que puede ser estable o degradable, entre el residuo del opioide de molécula pequeña y el oligómero no peptídico, soluble en agua), -C(0)0-, -OC(O)-, -CH2-C(0)0-, -CH2-OC(O)-, -C(0)O-CH2-, -OC(0)-CH2, -O-, -NH-, -S-, -C(O)-, C(0)-NH, NH-C(0)-NH, 0-C(0)-NH, -C(S)-, -CH2-, -CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-, -0-CH2-, -CH2-O-, -0-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-O-, -0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-, -0-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-0-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-0-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-0-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-0-, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)- H-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-, -NH-C(0)-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, -NH-C(0)-CH2-CH2-, -CH2-NH-C(0)-CH2-CH2, -CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-CH2, -C(0)-NH-CH2-, -C(0)-NH-CH2-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-, -0-C(0)-NH-CH2-CH2-, -NH-CH2-, -NH-CH2-CH2-, -CH2-NH-CH2-, -CH2-CH2-NH-CH2-, -C(O)-CH2-, -C(0)-CH2-CH2-, -CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-CH2-, -CH2-CH2-C(O)-CH2-CH2-, -CH2-CH2-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-, -CH2-CH2-CH2-C(0)-NH-CH2-CH2-NH-C(0)-CH2-, grupo cicloalquilo bivalente, -N(R6)-, R5 es H o un radical orgánico seleccionado del grupo que consiste de alquilo, alquilo sustituido, alquenilo, alquenilo sustituido, alquinilo, alquinilo sustituido, arilo y arilo sustituido.
Para propósitos de la presente invención, sin embargo, un grupo de átomos no se considera una porción de espaciador cuando está inmediatamente adyacente a un segmento de oligómero, y el grupo de átomos es el mismo que un monómero del oligómero tal como el grupo podría representar una mera extensión de la cadena de oligómero.
El enlace "X" entre el oligómero no peptidico, soluble en agua, y la molécula pequeña está formada típicamente por reacción de un grupo funcional en un término del oligómero (o uno o más monómero cuando se desea que el oligómero "crezca" en el agonista opioide) con un grupo funcional correspondiente dentro del opioide. Las reacciones ilustrativas se describen brevemente más abajo. Por ejemplo, un grupo amino en un oligómero puede reaccionar con un ácido carboxílico o un derivado de ácido carboxílico activado en la molécula pequeña, o viceversa, para producir un enlace de amida. Alternativamente, la reacción de una amina en un oligómero con un carbonato activado (por ejemplo, carbonato de succinimidilo o benzotriazilo) en el fármaco, o viceversa, forma un enlace de carbamato. La reacción de una amina en un oligómero con un isocianato (R-N=C=O) en un fármaco, o viceversa, forma un enlace de urea (R-NH-(C=0)-NH-R'). Además, la reacción de un grupo alcohol (alcóxido) en un oligómero con un haluro de alquilo, o grupo haluro dentro de un fármaco, o viceversa, forma un enlace de éter. En todavía otro procedimiento de acoplamiento, una molécula pequeña que tiene una función aldehido se acopla a un grupo amino oligómero por aminación reductiva, resultando en la formación de un enlace de amina secundaria entre el oligómero y la molécula pequeña.
Un oligómero no peptídico, soluble en agua particularmente preferido, es un oligómero que lleva un grupo funcional aldehido. A este respecto, el oligómero tendrá la siguiente estructura: CH30-(CH2-CH2-0)n-(CH2)p-C(0)H, en donde (n) es uno de 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 y 10 y (p) es uno de 1 , 2, 3, 4, 5, 6 y 7. Los valores preferidos (n) incluyen 3, 5 y 7 y los valores (p) preferidos 2, 3 y 4. Además, el átomo de carbono alfa a la porción -C(0)H puede ser sustituido opcionalmente con alquilo.
Típicamente, el término del oligómero no peptídico, soluble en agua que no lleva un grupo funcional es protegido para volverlo no reactivo. Cuando el oligómero incluye un grupo funcional adicional en un término diferente del propuesto para la formación de un conjugado, este grupo es seleccionado tal que no es reactivo bajo las condiciones de formación del enlace "X", o está protegido durante la formación del enlace "X".
Como se estableció anteriormente, el oligómero no peptídico, soluble en agua, incluye al menos un grupo funcional previo a la conjugación. El grupo funcional típicamente comprende un grupo electrofílico o nucleofílico para unión covalente a una molécula pequeña, dependiendo del grupo reactivo contenido dentro o introducido en la molécula pequeña. Los ejemplos de grupos nucleofílicos que pueden estar presentes en ya sea el oligómero o la molécula pequeña incluye hidroxilo, amina, hidrazina (-NHNH2), hidrazida (-C(0)NHNH2), y tiol. Los nucleófilo preferidos incluyen amina, hidrazina, hidrazida, y tiol, particularmente amina. Los fármacos de moléculas más pequeñas para unión covalente a un oligómero poseen un grupo amino, tio, aldehido, cetona, carboxilo o hidroxilo libre.
Los ejemplos de grupos funcionales electrofílicos que pueden estar presentes en ya sea el oligómero o la molécula pequeña incluyen ácido carboxílico, éster carboxílico, particularmente ésteres de ¡mida, ortoéster, carbonato, isocianato, isotiocianato, aldehido, cetona, tiona, alquenilo, acrilato, metacrilato, acrilamida, sulfona, maleimida, disulfuro, yodo, epoxi, sulfonato, tiosulfonato, silano, alcoxisilano, y halosilano. Los ejemplos más específicos de estos grupos incluyen éster o carbonato de succinimidilo, éster o carbonato de imidazoilo, éster o carbonato de benzotriazol, vinil sulfona, cloroetilsulfona, vinilpiridina, piridil disulfuro, yodoacetamida, glioxal, diona, mesilato, tosilato, y tresilato (2,2,2-trifluoroetansulfonato).
También se incluyen análogos de azufre de varios de estos grupos, tales como tiona, hidrato de tiona, tiocetal, es 2-tiazolidin tiona, etc., así como también hidratos o derivados protegidos de cualquiera de las porciones anteriores (por ejemplo, hidrato de aldehido, semiacetal, acetal, hidrato de cetona, semicetal, cetal, tiocetal, tioacetal).
Un "derivado activado" de un ácido carboxílico se refiere a un derivado de ácido carboxílico el cual reacciona fácilmente con nucleófilos, generalmente mucho más fácil que el ácido carboxílico no derivados. Los ácidos carboxílicos activados incluyen, por ejemplo, haluros de ácido (tal como cloruros de ácido), anhídridos, carbonatos, y ésteres. Tales ésteres incluyen ésteres de imida, de la forma general -(CO)0-N[(CO)-]2¡ por ejemplo, ésteres de N-hidroxisuccínimídilo (NHS) o ésteres de N-hidroxiftalimidilo. También son preferidos ésteres de imidazolilo y ésteres de benzotriazol. Particularmente son preferidos el ácido propiónico activado o ésteres de ácido butanoico, como se describe en la Patente Norteamericana No. 5,672,662 de co-propiedad. Estos incluyen grupos de la forma -(CH2)2-3C(=0)O-Q, donde Q se selecciona preferiblemente de N-succinimida, N-sulfosuccinimida, N-ftalimida, N-glutarimida, N-tetrahidroftalimida, N-norbornen-2,3-d¡carbox¡mida, benzotriazol, 7-azabenzotriazol, e imidazol.
Otros grupos electrofílicos preferidos incluyen carbonato de succinimidilo, maleimida, carbonato de benzotriazol, éter de glicidilo, carbonato de imidazoilo, carbonato de p-nitrofenilo, acrilato, tresilato, aldehido, y disulfuro de ortopiridilo.
Estos grupos electrofílicos se someten a reacción con nucleófilos, por ejemplo, hidroxi, tio, o grupos amino, para producir varios tipos de enlaces. Las reacciones que favorecen la formación de un enlace hidrolíticamente estable son preferidas para la presente invención. Por ejemplo, los ácidos carboxílicos y derivados activados de los mismos, los cuales incluyen ortoésteres, ésteres de succinimidilo, ésteres de imidazolilo, y ésteres de benzotriazol, reaccionan con los tipos anteriores de nucleófilos para formar ésteres, tioésteres, y amidas, respectivamente, de los cuales las amidas son hidrolíticamente más estables. Los carbonatos, incluyendo carbonatos de succinimidilo, imidazolilo, y benzotnazol, reaccionan con grupos amino para formar carbamatos. Los isocianatos (R-N=C=O) reaccionan con grupos hidroxilo o amino para formar, respectivamente, enlaces de carbamato (RNH-C(O)-OR') o urea (RNH-C(O)-NHR'). Los aldehidos, cetonas, glioxales, dionas y sus hidratos o aducios de alcohol (es decir, hidrato de aldehido, semiacetal, acetal, hidrato de cetona, semicetal, y cetal) se hacen reaccionar preferiblemente con aminas, seguido por reducción de la imina resultante, si se desea, proporcionar un enlace de amina (aminación reductiva).
Varios de los grupos funcionales electrofílicos incluyen enlaces dobles electrofílicos a los cuales se pueden adicionar grupos nucléofílicos, tales como tioles, para formar, por ejemplo, enlaces de tioéster. Estos grupos incluyen maleimidas, vinil sulfonas, vinil piridina, acrilatos, metacrilatos, y acrilamidas. Otros grupos comprenden grupos salientes que pueden ser desplazados por un nucleófilo; estos incluyen cloroetil sulfona, disulfuros de piridilo (que incluyen un enlace S-S escindiblé), yodoacetamida, mesilato, tosilato, tiosulfonato, y tresilato. Los epóxidos reaccionan abriendo el anillo por un nucleófilo, para formar, por ejemplo, un enlace de éter o amina. Las reacciones que involucran grupos reactivos complementarios tales como aquellos señalados anteriormente en el oligómero y la molécula pequeña se utilizan para preparar los conjugados de la invención.
En algunos casos el agonista opioide puede no tener un grupo funcional adecuado para conjugación. En este caso, es posible modificar el agonista opioide "original" de modo que tenga el grupo funcional deseado. Por ejemplo, si el agonista opioide tiene un grupo amida, pero un grupo amina es deseado, es posible modificar el grupo amida a un grupo amina por medio de un rearreglo Hofmann. El rearreglo Curtius (una vez que la amida se convierte a una azida) o rearreglo Lossen (una vez que la amida es convertida a hidroxiamida seguido por tratamiento con cloruro/base de tolien-2-sulfonilo).
Es posible preparar un conjugado de agonista opioide de molécula pequeña que lleva un grupo carboxilo en donde el agonista opioide de molécula pequeña que lleva un grupo carboxilo se acopla a un etilenglicol oligomérico amino terminado, para proporcionar un conjugado que tiene un grupo amida que enlaza covalentemente el agonista opioide de molécula pequeña al oligómero. Esto se puede realizar, por ejemplo, combinando el agonista opioide de molécula pequeña qué lleva un grupo carboxilo con el etilenglicol oligomérico amino terminado en la presencia de un reactivo de acoplamiento, (tal como diciclohexilcarbodiimida o "DCC") en un solvente orgánico anhidro.
Además, es posible preparar un conjugado de un agonista opioide de molécula pequeña que lleva un grupo hidroxilo en donde el agonista opioide de molécula pequeña que lleva el grupo hidroxilo se acopla a un haluro de etilenglicol oligomérico para resultar en un conjugado de molécula pequeña enlazada a éter (-0-). Esto se puede realizar, por ejemplo, usando hidruro de sodio para desprotonar el grupo hidroxilo seguido por reacción con un etilenglicol oligomérico terminado en haluro.
En otro ejemplo, es posible preparar un conjugado de un agonista de opioide de molécula pequeña que lleva un grupo cetona reduciendo primero el grupo cetona para formar el grupo hidroxilo correspondiente. Posteriormente, el agonista opioide de molécula pequeña que ahora lleva un grupo hidroxilo se puede acoplar como se describe en la presente.
En todavía otro ejemplo, es posible preparar un conjugado de un agonista opioide de molécula pequeña que lleva un grupo amina. En otro procedimiento, el agonista opioide de molécula pequeña que lleva el grupo amina y un oligómero que lleva el aldehido se disuelven en un amortiguador adecuado después esto se adiciona un agente de reducción adecuado (por ejemplo, NaCNBH3). Seguido de la reducción, el resultado en un enlace de amina formado entre el grupo amina del agonista opioide de molécula pequeña que contiene el grupo amina y el carbono de carbonilo del oligómero que lleva aldehido.
En otro procedimiento para preparar un conjugado de un agonista opioide de molécula pequeña que lleva un grupo amina, se combinan un oligómero que lleva ácido carboxílico y el agonista opioide de molécula pequeña que lleva el grupo amina, típicamente en la presencia de un reactivo de acoplamiento (por ejemplo, DCC). El resultado es un enlace de amida formado entre el grupo amina del agonista opioide de molécula pequeña que contiene el grupo amina y el carbonilo del oligómero que lleva el ácido carboxílico.
Los conjugados ejemplares de agonistas opioides de Fórmula I incluyen aquéllos que tienen la siguiente estructura: Fórmula l-Ca en donde cada uno de R2, R3, R4, la línea punteada ("—"), Y1 y R5 es como se define previamente con respecto a la Fórmula I, X es una porción espaciadora y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Conjugados ejemplares adicionales de los agonistas opioides de Fórmula I, incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula l-Cb en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, la línea punteada ("- Y1 es como se define previamente con respecto a la Fórmula I, X es una porción espadadora y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua. Más aún, conjugados ejemplares adicionales de los agonistas opioides de Fórmula I, incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula l-Cc en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, Y1 y R5 es como se define previamente con respecto a la Fórmula I, X es una porción espaciadora y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Conjugados ejemplares todavía adicionales de los agonistas opioides de Fórmula I, incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula l-Cd en donde cada uno de R1, R2, R3, R4, Y1 y R5 es como se define previamente con respecto a la Fórmula I, X es una porción espaciadora y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Conjugados ejemplares adicionales de los agonistas opioides de Fórmula I, incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula I-Ce en donde cada uno de R1, R3, R4, la linea punteada ("—"), Y1 y R5 es como se define previamente con respecto a la Fórmula I, X es una porción espaciadora y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Conjugados ejemplares adicionales están abarcados por las siguientes Fórmulas: 55 R3 15 (CH2GH20)n-CH3 en donde, cuando se presenta, cada uno de R1, R2, R3, R4, la línea punteada ("—"), Y1 y R5 es como se define previamente con respecto a la Fórmula I, y la variable "n" es un número entero desde 1 hasta 30.
Conjugados ejemplares de los agonistas de opioide de fórmula II incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula ll-Ca donde: N* es nitrógeno; Ar es seleccionado del grupo formado por ciclohexilo, fenilo, halofenilo, metoxifenilo, aminofenilo, piridilo, furilo y tienilo; Alq es seleccionado del grupo que consiste de etileno y propileno; RII está seleccionado del grupo formado por alquilo inferior, alcoxi inferior, dimetilamino, ciclopropilo, 1-pirrolidilo, morfolino (preferiblemente alquilo inferior como etilo); RII' está seleccionado del grupo conformado por hidrógeno, metilo, y metoxi; RII" está seleccionado del grupo formado por hidrógeno y un radical orgánico (preferiblemente alquilo inferior); X es un enlazador (por ejemplo, un enlace covalente "-" o uno o más átomos); y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua. Con respecto a la fórmula ll-Ca, se entenderá que, dependiendo de las condiciones, una o ambas de las aminas, pero más normalmente, la amina marcada con un asterisco ("N*") en la fórmula ll-Ca - puede ser protonada.
Conjugados ejemplares adicionales de los agonistas de opioide de fórmula II incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula ll-Cb donde: N* es nitrógeno; Ar es seleccionado del grupo formado por ciclohexilo, fenilo, halofenilo, metoxifenilo, aminofenilo, piridilo, furilo y tienilo; Alq es seleccionado del grupo que consiste de etileno y propileno; RII está seleccionado del grupo formado por alquilo inferior, alcoxi inferior, dimetilamino, ciclopropilo, 1-pirrolidilo, morfolino (preferiblemente alquilo inferior como etilo); RII' está seleccionado del grupo conformado por hidrógeno, metilo, y metoxi; RII" está seleccionado del grupo formado por hidrógeno y un radical orgánico (preferiblemente alquilo inferior); X es un enlazador (por ejemplo, un enlace covalente "-" o uno o más átomos); y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Con respecto a la fórmula ll-Cb, se entenderá que, dependiendo de las condiciones, una o ambas de las aminas, pero más normalmente, la amina marcada con un asterisco ("N*") en la fórmula ll-Cb - puede ser protonada.
Conjugados ejemplares adicionales de los agonistas de opioide de fórmula II incluyen aquellos que tienen la siguiente estructura: Fórmula ll-Cc donde: N* es nitrógeno; Ar es seleccionado del grupo formado por ciclohexilo, fenilo, halofenilo, metoxifenilo, aminofenilo, piridilo, furilo y tienilo; Alq es seleccionado del grupo que consiste de etileno y propileno; RII está seleccionado del grupo formado por alquilo inferior, alcoxi inferior, dimetilamino, ciclopropilo, 1-pirrolidilo, morfolino (preferiblemente alquilo inferior como etilo); RII' está seleccionado del grupo conformado por hidrógeno, metilo, y metoxi; RII" está seleccionado del grupo formado por hidrógeno y un radical orgánico (preferiblemente alquilo inferior); cada X es independientemente un enlazador (por ejemplo, un enlace covalente "-" o uno o más átomos); y cada POLY es independientemente un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Con respecto a la fórmula ll-Cc, se entenderá que, dependiendo de las condiciones, una o ambas de las aminas, pero más normalmente, la amina marcada con un asterisco ("N*") en la fórmula ll-Cc -- puede ser protonada.
Conjugados ejemplares adicionales son incluidos por las siguientes fórmulas: y de la vanable "n" es un número entero de 1 a 30.
Conjugados adicionales incluyen aquellos proporcionados abajo: (conjugado bremazocina ejemplar) (conjugado bremazocina ejemplar) (conjugado etilcetociclazocina ejemplar) (conjugado salvinorina A ejemplar) (conjugado de salvinorina A ejemplar) (conjugado de espiradolina ejemplar) (conjugado TRK-820 ejemplar) (conjugado TRK-820 ejemplar) (conjugado U50488 ejemplar) (conjugado U50488 ejemplar) 10 (conjugado U50488 ejemplar) 15 20 (conjugado U50488 ejemplar) (conjugado US69593 ejemplar) (conjugado US69593 ejemplar) en donde, para cada uno de los conjugados anteriores, X es un enlazador (por ejemplo, un enlace covalente "-" o uno o más átomos) y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Un conjugado adicional se proporciona abajo: en donde: R1 es acilo R2 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidrógeno, halógeno, alquino insustituido y alquilo sustituido por halógeno; R3 se selecciona a partir del grupo que consiste de halógeno y alcoxi; R5 se selecciona a partir del grupo que consiste de hidroxilo, éster, alcoxi, y alcoxialquilo; Ai es alquileno; X es un enlazador; y POLY es un oligómero no peptídico, soluble en agua.
Los conjugados de la invención pueden exhibir una velocidad de cruza de barrera hemato-encefálica reducida. Sin embargo, los conjugados mantienen al menos, aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, o más de la bioactividad del fármaco de molécula pequeña precursor no modificado.
Mientras se cree que el campo completo de los conjugados descritos en la presente han sido descritos, un oligómero opcionalmente clasificado puede ser determinado como sigue.
Primero, un oligómero obtenido a partir de un oligómero soluble en agua bimodal o monodisperso, es conjugado al fármaco de molécula pequeña. Preferiblemente, el fármaco es oralmente biodisponible, y en sí mismo, exhibe una velocidad de cruce de barrera hemato-encefálica no insignificante. Después, la capacidad del conjugado para cruzar la barrera hemato-encefálica es determinada usando un modelo apropiado y comparado con aquel del fármaco precursor no modificado. Si los resultados son favorables, es decir, si por ejemplo, la velocidad de cruce es significantemente reducida, entonces la biodisponibilidad del conjugado es además evaluada. Preferiblemente, los compuestos de conformidad con la invención mantienen un grado significante de bioactividad con relación al fármaco precursor, es decir, más de aproximadamente 30% de la bioactividad del fármaco precursor, o aún más preferiblemente, más de aproximadamente 50% de la bioactividad del fármaco precursor.
Las etapas anteriores son repetidas una o más veces usando oligómeros del mismo tipo de monómero pero que tienen un número diferente de subunidades y los resultados son comparados.
Para cada conjugado cuya capacidad para cruzar la barrera hemato-encefálica se reduce en comparación con el fármaco de molécula pequeña no conjugado, su biodisponibilidad oral es entonces valorada. Basados en estos resultados, es decir, basados en la comparación de conjugados de oligómeros de tamaño variante a una molécula de tamaño dad a una posición o ubicación dada dentro de la molécula pequeña, es posible determinar el tamaño del oligómero más efectivo proporcionando un conjugado que tiene un balance óptimo entre la reducción en el cruce de la membrana biológica, biodisponibilidad oral y bioactividad. El tamaño pequeño de los oligómeros hace tales selecciones factibles, y permite ajustar efectivamente las propiedades del conjugado resultante. Haciendo cambios incrementados, pequeños en tamaño de oligómero, y utilizando un procedimiento de diseño experimental, se puede identificar efectivamente un conjugado que tiene un balance favorable de reducción en la velocidad de cruce de membrana biológica, bioactividad, y biodisponibilidad oral. En algunos casos, la unión de un oligómero como se describe en la presente, es efectiva para incrementar actualmente la biodisponibilidad oral del fármaco.
Por ejemplo, uno de habilidad ordinaria en la técnica, usando experimentación de rutina, puede determinar un enlace y tamaño molecular mejor adecuado para mejorar la biodisponibilidad oral preparando primero una serie de oligómeros con diferentes pesos y grupos funcionales, y después obtener los perfiles de separación necesarios administrando los conjugados a un paciente y tomar muestras periódicas de sangre y/u orina. Una vez que una serie de perfiles de separación se han obtenido para cada conjugado probado, un conjugado adecuado puede ser identificado.
Modelos animales (roedores y perros), también pueden ser usados para estudiar el transporte de fármaco oral. Además, métodos no in vivo incluyen tejido escindido de intestino invertido de roedor y modelos de cultivo de tejido de monocapa de células Caco-2. Estos modelos son útiles en pronosticar la biodisponibilidad de fármaco oral.
Para determinar si el agonista opioide o el conjugado de agonista opioide y un oligómero no peptídico soluble en agua tiene actividad como agonista del receptor opioide mu, es posible probar tal compuesto. Por ejemplo, la KD (afinidad de enlace) y el Bmax (número de receptor), pueden ser determinados usando un procedimiento modificado a partir de aquel descrito en Malatynska et al. (1995) NeuroReport 6:613-616. Brevemente, receptores humanos mu pueden ser recombinantemente expresados en células de ovario de hámster Chino. Puede ser usado el radioligando [3H]-diprenorfina (30-50 Ci/mmol) con una concentración de ligando final de [0.3 nM]. La nalóxona es usada como un determinante no específico [3.0 nM], un compuesto de referencia y un control positivo. Las reacciones se llevan a cabo en 50 mM de TRIS-HCI (pH 7.4) que contiene 5 mM MgCI2, a 25 °C por 150 minutos. La reacción se termina por filtración a vacío rápido sobre filtros de fibra de vidrio. La radioactividad atrapada sobre filtros es determinada y comparada con los valores de control para valorar algunas interacciones de los compuestos de prueba con el sitio clonado de enlace mu.
Se pueden realizar pruebas similares para los agonistas del receptor opioide kappa. Véase por ejemplo, Lahti et al. (1985) Eur. jrnl. Pharmac. 109:281-284; Rothman et al. (1992) Peptides 13:977-987; Kinouchi et al. (1991) Eur. Jrnl. Pharmac. 207:135-141. Brevemente, los receptores kappa humanos se pueden obtener a partir de membranas cerebelares de cobayos. Puede ser usado el radioligando [3H]-U-69593 (40-60 Ci/mmol) con una concentración de ligando final de [0.75 nM]. El U-69593 se usa como un determinante no específico [1.0 µ?], un compuesto de referencia y control positivo. Las reacciones se llevaron a cabo en 50 mM de HEPES (pH 7.4) a 30 °C por 120 minutos. La reacción se terminó por filtración de vacio rápido sobre filtros de fibra de vidrio. La radioactividad atrapada sobre los filtros es determinada y comparada con valores de control para valorar algunas interacciones del compuesto de prueba con el sitio de enlace clonado kappa.
Los conjugados descritos incluyen no sólo los conjugados mismos, pero los conjugados en la forma de una sal farmacéuticamente aceptable también. Un conjugado como se describe en este documento puede poseer un grupo suficientemente ácido, un grupo suficientemente básico o ambos grupos funcionales y, en consecuencia, reaccionan con cualquiera de un número de bases inorgánicas y ácidos inorgánicos y orgánicos, para formar una sal. Ácidos comúnmente empleados para formar sales de adición de ácido son ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido yodhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico y lo similar y ácidos orgánicos tales como ácido p-toluenosulfónico, ácido metanosulfónico, ácido oxálico, ácido p-bromofenil-sulfónico, ácido carbónico, ácido succínico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido acético y lo similar. Ejemplos de esas sales son el sulfato, pirosulfato, bisulfato, sulfito, bisulfito, fosfato, monohidrogenfosfato, dihidrogenfosfato, metafosfato, pirofosfato, cloruro, bromuro, yoduro, acetato, propionato, decanoato, caprilato, acrilato, formiato, isobutirato, caproato, heptanoato, propiolato, oxalato, malonato, succinato, suberato, sebacato, fumarato, maleato, butina-1 ,4-dioate, hexina-l,6-dioato, benzoato, clorobenzoato, metilbenzoato, dinitrobenzoato, hidroxibenzoato, metoxibenzoato, ftalato, sulfonato, xilenosulfonato, fenilacetato, fenilpropionato, fenilbutirato, citrato, lactato, gamma-hidroxibutirato, glicolato, tartrato, metanosulfonato, propanosulfonato, naftaleno-1-sulfonato, naftaleno-2-sulfonato, mandelato y similares.
Sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de bases inorgánicas, tales como el amonio o hidróxidos de metales alcalinos o alcalinotérreos, carbonatos, bicarbonatos y similares. Esas bases útiles en la preparación de las sales de esta invención así incluyen hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, carbonato de potasio y similares.
La presente invención también incluye preparaciones farmacéuticas que comprenden un conjugado como se proporciona en la presente, en combinación con un excipiente farmacéutico. En general, el conjugado mismo estará en una forma sólida (por ejemplo, un precipitado), el cual puede ser combinado con un excipiente farmacéutico estable que puede estar en ya sea forma sólida o líquida.
Los excipientes ejemplares incluyen sin limitación, aquellos seleccionados a partir del grupo que consiste de carbohidratos, sales inorgánicas, agentes antimicrobianos, antioxidantes, tensoactivos, amortiguadores, ácidos, bases y combinaciones de los mismos.
Un carbohidrato tal como un azúcar, un azúcar derivatizado tal como un alditol, ácido aldónico, un azúcar esterificad y/o un polímero de azúcar, puede ser presente como un excipiente. Los excipientes carbohidratos específicos incluyen, por ejemplo: monosacáridos, tales como fructuosa, maltosa, galactosa, glucosa, D-manosa, sorbosa y similares; disacáridos, tales como lactosa, sacarosa, trehalosa, celobiosa, y similares; polisacáridos, tales como rafinosa, melezitosa, maltodextrinas, dextranos, almidones y similares; y alditoles, tales como manitol, xilitol, maltitol, lactitol, xilitol, sorbitol (glucitol), piranosil sorbitol, mioinositol y similares.
El excipiente también puede incluir una sal inorgánica o amortiguador tal como ácido cítrico, cloruro de sodio, cloruro de potasio, sulfato de sodio, nitrato de potasio, fosfato sódico monobásico, fosfato de sodio dibásico y combinaciones de los mismos.
La preparación también puede incluir un agente antimicrobiano para prevenir o disuadir el crecimiento microbiano. Ejemplos no limitantes de agentes antimicrobianos adecuados para la presente invención incluyen, cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio, alcohol bencílico, cloruro de cetilpiridinio, clorobutanol, fenol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, timersol, y combinaciones de los mismos.
Un antioxidante puede estar presente en la preparación también. Los antioxidantes son usados para prevenir la oxidación, con ello, previniendo el deterioro del conjugado u otros componentes de la preparación. Los antioxidantes adecuados para uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, ascorbil palmitato, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, ácido hipofosforoso, monotioglicerol, propilgalato, bisulfito de sodio, formaldehído sulfoxilato de sodio, metabisulfito de sodio, y combinaciones de los mismos.
Un tensoactivo puede estar presente como un excipiente. Tensoactivos ejemplares incluyen: polisorbatos, tales como "Tween 20" y "Tween 80", y pluronics tales como F68 y F88 (ambos de los cuales están disponibles de BASF, Mount Olive, New Jersey); esteres de sorbitán; lípidos, tales como fosfolípidos tales como lecitina y otras fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas (aunque preferiblemente no en forma liposomal), ácidos grasos y esteres grasos; esteroides, tales como colesterol; y agentes quelantes, tales como EDTA, zinc y otros cationes adecuados.
Los ácidos y bases farmacéuticamente aceptables, pueden estar presentes como un excipiente en la preparación. Ejemplos no limitantes de ácidos que pueden ser usados incluyen aquellos ácidos seleccionados partir del grupo que consiste de ácido clorhídrico, ácido acético, ácido fosfórico, ácido cítrico, ácido málico, ácido láctico, ácido fórmico, ácido tricloroacético, ácido nítrico, ácido perclórico, ácido fosfórico, ácido sulfúrico, ácido funiárico y combinaciones de los mismos. Ejemplos de bases adecuadas incluyen sin limitación, bases seleccionadas a partir del grupo que consiste de hidróxido de sodio, acetato de sodio, hidróxido de amonio, hidróxido de potasio, acetato de amonio, acetato de potasio, fosfato de sodio, fosfato de potasio, citrato de sodio, formiato de sodio, sulfato de sodio, sulfato de potasio, fumerato de potasio y combinaciones de los mismos.
La cantidad de conjugado en la composición variará dependiendo de un número de factores, pero óptimamente será una dosis terapéuticamente efectiva cuando la composición es almacenada en un contenedor de dosis unitaria. Una dosis terapéuticamente efectiva puede ser determinada experimentalmente por administración repetida de cantidades incrementadas del conjugado, para determinar cual cantidad produce un punto final clínicamente deseado.
La cantidad de cualquier excipiente individual en la composición variará, dependiendo de la actividad del excipiente y las necesidades particulares de la composición. Típicamente, la cantidad óptima de cualquier excipiente individual es determinada a través de la experimentación de rutina, es decir, preparando composiciones que contienen cantidades variantes del excipiente (que varía desde bajo a alto), examinando la estabilidad y otros parámetros, y después determinando el intervalo en el cual se logra el desempeño óptimo sin efectos adversos significantes.
En general, sin embargo, el excipiente estará presente en la composición en una cantidad de aproximadamente 1 % hasta aproximadamente 99% en peso, preferiblemente desde aproximadamente 5%-98% en peso, más preferiblemente, desde aproximadamente 15-95% en peso del excipiente, con concentraciones de menos de 30% en peso más preferidas.
Estos excipientes farmacéuticos mencionados anteriormente junto con otros excipientes y enseñanzas generales con respecto a las composiciones farmacéuticas, son descritos en Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19,h ed., Williams & Williams, (1995), the "Physician's Desk Reference", 52nd ed., Medical Economics, Montvale, NJ (1998), and Kibbe, A.H., Handbook of Pharmaceutical Excipiente, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000.
Las composiciones farmacéuticas pueden tomar cualquier número de formas, y la invención no está limitada en este sentido. Las preparaciones ejemplares son más preferiblemente en una forma adecuada para administración oral, tal como una tableta, capleta, cápsula, cápsula de gel, trocisco, dispersión, suspensión, solución, elixir, jarabe, gragea, parche transdérmico, atomizador, supositorio y polvo.
Las formas de dosificación oral son preferidas para estos conjugados que son oralmente activos, e incluyen tabletas, capletas, cápsulas, cápsulas de gel, suspensiones, soluciones, elíxires, y jarabes y pueden también comprende una pluralidad de gránulos, perlillas, polvos o pelotillas que son opcionalmente encapsulados. Tales formas de dosificación son preparadas usando métodos convencionales conocidos por aquellos en el campo de formulación farmacéutica y descrita en los textos pertinentes.
Las tabletas y capletas, por ejemplo, pueden ser manufacturas usando procedimientos y equipos de procesamiento de tableta estándares. Las técnicas de granulación y compresión directa, son preferidas cuando se preparan tabletas o capletas que contienen los conjugados descritos en la presente. Además del conjugado, las tabletas y capletas en general, contendrán materiales portadores farmacéuticamente aceptables, inactivos, tales como aglutinantes, lubricantes, desintegrantes, rellenadores, estabilizadores, tensoactivos, agentes colorantes y similares. Los aglutinantes son usados para impartir calidades cohesivas a la tableta y de este modo, asegurar que la tableta permanezca intacta. Los materiales aglutinantes adecuados incluyen, pero no se limitan a, almidón (que incluyen almidón de maíz y almidón pregelatinizado), gelatinas, azúcares (que incluyen sacarosa, glucosa, dextrosa y lactosa), polietilenglicol, ceras y gomas naturales y sintéticas, por ejemplo, acacia, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, polímeros celulósicos (que incluyen hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metilcelulosa, metilcelulosa, celulosa microcristalina, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa y similares) y Veegum. Los lubricantes son usados para facilitar la manufactura de tableta, promover el flujo del polvo y prevenir el tapado de partícula (es decir, rompimiento de partícula), cuando la presión se alivia. Los lubricantes útiles son estearato de magnesio, estearato de calcio y ácido esteárico. Los desintegrantes son usados para facilitar la desintegración de la tableta, y son en general, almidones, arcillas, celulosas, alginas, gomas o polímeros reticulados. Los rellenadores incluyen por ejemplo, materiales tales como dióxido de silicio, dióxido de titanio, alúmina, talco, caolín, celulosa en polvo y celulosa microcristalina, as! como también materiales solubles tales como manitol, urea, sacarosa, lactosa, dextrosa, cloruro de sodio y sorbitol. Estabilizadores, como es bien conocido en la técnica, son usados para inhibir o retardar las reacciones de descomposición de fármaco que incluyen, por medio del ejemplo, reacciones oxidativas.
Las cápsulas también son formas de dosificación oral preferidas, en tal caso, la composición que contiene conjugado puede ser encapsulada en la forma de un líquido o gel (por ejemplo, en el cado de una cápsula de gel) o sólido (que incluye particulados tales como gránulos, perlillas, polvos o pelotilla). Las cápsulas adecuadas incluyen cápsulas duras y blandas y son en general, elaboradas de gelatina, almidón o material celulósico. Las cápsulas de gelatina dura de dos piezas son preferiblemente selladas, tales como con bandas de gelatina o similares.
Incluidas están formulaciones parenterales en forma sustancialmente seca (típicamente como un liofilizado o precipitado, el cual puede estar en la forma de un polvo o torta), así como también formulaciones preparadas por inyección, las cuales son típicamente líquidos y requieren la etapa de reconstituir la forma seca de la formulación parenteral. Ejemplos de diluyentes adecuados para reconstituir composiciones sólidas previo a la inyección incluyen, agua bacteriostática para inyección, dextrosa al 5% en agua, salina amortiguad de fosfato, solución Ringer, salina, agua estéril, agua desionizada y combinaciones de los mismos.
En algunos casos, las composiciones propuestas para administración parenteral pueden tomar la forma de soluciones no acuosas, suspensiones o emulsiones, cada una típicamente siendo estéril. Ejemplos de solventes o vehículos no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como aceite de oliva y aceite de maíz, gelatina y ésteres orgánicos inyectables tales como oleato de etilo.
Las formulaciones parenterales descritas en la presente, también pueden contener adyuvantes tales como agentes preservativos, humectantes, emulsificantes y dispersantes. Las formulaciones son proporcionadas estériles por incorporación de un agente esterilizante, filtración a través de un filtro que retiene bacteria, irradiación o calor.
El conjugado también puede ser administrado a través de la piel usando parche transdérmico convencional u otro sistema de suministro transdérmico, en donde el conjugado está contenido dentro de una estructura laminada que sirve como un dispositivo de suministro de fármaco para ser fijado en la piel. En tal estructura, el conjugado está contenido en una capa, o "reservorio", "subyacente a una capa de respaldo superior". La estructura laminada puede contener un reservorio único, o puede contener reservónos múltiples.
El conjugado también puede ser formulado en un supositorio para administración rectal. Con respecto a supositorios, el conjugado es mezclado con un material base de supositorio el cual es (por ejemplo, un excipiente que permanece sólido a temperatura ambiente pero se ablanda, fusiona y disuelve a temperatura ambiente), tal como manteca de cacao (aceite de teobroma), polietilenglicoles, gelatina glicerinada, ácidos grasos, y combinaciones de los mismos. Los supositorios pueden ser preparados mediante, por ejemplo, realizando las siguientes etapas (no necesariamente en el orden presentado): fusionando el material base de supositorio para formar una fusión; incorporando el conjugado (ya sea antes o después de la fusión del material base de supositorio); verter la fusión en un molde; enfriar la fusión (por ejemplo, colocar el molde que contiene la fusión en un ambiente a temperatura ambiente) para con ello, formar supositorios; y remover los supositorios del molde.
La invención proporciona un método para administrar un conjugado como se proporciona en la presente, a un paciente que sufre de una condición que es sensible al tratamiento con el conjugado. El método comprende administrar, en general oralmente, una cantidad terapéuticamente efectiva del conjugado (preferiblemente proporcionado como parte de una operación farmacéutica). Otros modos de administración también están contemplados, tales como pulmonar, nasal, bucal, rectal, sublingual, transdermal y parenteral. Como se usa en la presente, el término "parenteral" incluye inyección subcutánea, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal, intracardial, intratecal e intramuscular, así como también inyecciones de infusión.
En casos en donde la administración parenteral es utilizad, puede ser necesario emplear algunos oligómeros más grandes que aquellos descritos previamente, con pesos moleculares que varían desde aproximadamente 500 hasta 30K Daltons (por ejemplo, que tienen pesos moleculares de aproximadamente 500, 1000, 2000, 2500, 3000, 5000, 7500, 10000, 15000, 20000, 25000, 30000 o aún más).
El método de administración puede ser usado para tratar cualquier condición que puede ser remediada o prevenida por administración del conjugado particular. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica, apreciarán cuales condiciones con un conjugado específico pueden tratar efectivamente. La dosis actual a ser administrada variará dependiendo de la edad, peso y condición general del sujeto, así como también la severidad de la condición siendo tratada, el juicio del profesional al cuidado de la salud, y el conjugado siendo administrado. Las cantidades terapéuticamente efectivas son conocidas por aquellos de habilidad en la técnica y/o son descritas en los textos de referencia pertinentes y literatura. En general, una cantidad terapéuticamente efectiva variará desde aproximadamente 0.001 mg hasta 1000 mg, preferiblemente en dosis desde 0.01 mg/día hasta 750 mg/día, y más preferiblemente, en dosis desde 0.10 mg/día hasta 500 mg/día.
La dosificación unitaria de cualquier conjugado dado (nuevamente, preferiblemente proporcionada como parte de una preparación farmacéutica), puede ser administrada en una variedad de programas de dosificación dependiendo del juicio del especialista, necesidades del paciente, etc. El programa de dosificación específico será conocido por aquellos de habilidad ordinaria en la técnica o puede ser determinado experimentalmente usando métodos de rutina. Los programas de dosificación ejemplares incluyen, sin limitación, administración cinco veces al día, cuatro veces al día, tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, tres veces semanalmente, dos veces semanalmente, una vez semanalmente, dos veces mensualmente, una vez mensualmente, y cualquier combinación de los mismos. Una vez que el punto final clínico se ha logrado, la dosificación de la composición se obstaculiza.
Una ventaja de administración de conjugados de la presente invención, es que una reducción en el metabolismo de primer paso se puede lograr con relación al fármaco precursor. Tal resultado es ventajoso para muchos fármacos oralmente administrados que son sustancialmente metabolizados por el paso a través del intestino. En esta forma, la separación del conjugado puede ser modulada seleccionando el tamaño molecular del oligómero, enlace y posición de la unión covalente proporcionando las propiedades de separación deseadas. Uno de habilidad ordinaria en la técnica puede determinar el tamaño molecular ideal del oligómero, basado en las enseñanzas en la presente. Las reducciones preferidas en el metabolismo de primer paso para un conjugado comparado con la molécula de fármaco pequeña no conjugado correspondiente incluyen: al menos aproximadamente 10%, al menos aproximadamente 20%, al menos aproximadamente 30; al menos aproximadamente 40; al menos aproximadamente 50%; al menos aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 80% y al menos aproximadamente 90%.
De este modo, la invención proporciona un método para reducir el metabolismo de un agente activo. El método comprende las etapas de: proporcionar conjugados bimodales o monodispersos, cada conjugado comprende una porción derivada de un fármaco de molécula pequeña covalentemente unido por un enlace estable a un oligómero soluble en agua, en donde dicho conjugado exhibe una tasa reducida de metabolismo comparada con la tasa de metabolismo del fármaco de molécula pequeña no unido al oligómero soluble en agua; y administrar el conjugado a un paciente. Típicamente, la administración se realiza vía un tipo de administración seleccionada a partir del grupo que consiste de administración oral, administración transdermal, administración bucal, administración transmucosal, administración vaginal, administración rectal, administración parenteral, y administración pulmonar.
Aunque es útil en la reducción, muchos tipos de metabolismo pueden ser reducidos (que incluyen metabolismo tanto de Fase I como Fase II), los conjugados son particularmente útiles cuando el fármaco de molécula pequeña es metabolizado por una enzima hepática (por ejemplo, una o más de las isoformas P450 del citocromo) y/o por una o más enzimas intestinales.
Todos los artículos, libros, patentes, publicaciones de patente y otras publicaciones referenciadas en la presente, están incorporados por referencia en sus totalidades, En el caso de una inconsistencia entre las enseñanzas de esta especificación y la técnica incorporada por referencia, el significado de las enseñanzas en esta especificación debe prevalecer.
EXPERIMENTAL Se entiende que mientras la invención ha sido descrita en conjunto con ciertas modalidades preferidas y específicas, la descripción anterior así como también los ejemplos que siguen, están propuestos para ¡lustrar y no limitar el campo de la invención. Otros aspectos, ventajas y modificaciones dentro del campo de la invención, serán aparentes para aquellos expertos en la técnica a la cual pertenece la invención.
Todos los reactivos químicos referidos en los ejemplos adjuntos, están comercialmente disponibles a menos que se indique de otro modo. La preparación de PEG-meros se describe en por ejemplo, la Publicación de Solicitud de Patente No. 2005/0136031.
Todos los datos de 1H-NMR (resonancia magnética nuclear) se generaron por un espectrómetro NMR manufacturado por Bruker (MHz= 200). Una lista de ciertos compuestos, así como también la fuente de los compuestos se proporciona abajo.
EJEMPLO 1 Preparación de Conjugados Oligómero-Nalbufina "Procedimiento A" Se preparó PEG-Nalbufina usando un primer procedimiento.
Esquemáticamente, se muestra posteriormente el procedimiento seguido por este ejemplo. 2 n = 3-20 Desalación de Clorhidrato de Nalbufina Dihidratada: Se disolvió Clorhidrato de nalbufina dihidratada (600 mg, de Sigma) en agua (100 mL). Se agregó K2CO3 acuoso saturado y después se ajustó el pH a 9.3 con solución de HCI 1 N, saturada con cloruro de sodio. La solución se extrajo con diclorometano (5 x 25 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera (100 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró a sequedad y se secó bajo alto vacío para proporcionar nalbufina (483.4 mg, 97% de recuperación). El producto se confirmó por 1H-ÑMR en CDCI3.
Síntesis de 3-Q-mPEG3-Nalbufina (2) fn = 3): Se disolvió Nalbufina (28.5 mg, 0.08 mmol) en una mezcla de acetona (2 mL) y tolueno (1.5 mL). Se agregó Carbonato de potasio (21 mg, 0.15 mmol), seguido por una adición de mPEG3-Br (44.5 mg, 0.20 mmol) a temperatura ambiente. La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente por 27.5 horas. Se agregó más carbonato de potasio (24 mg, 0.17 mmol). La mezcla se calentó con microonda CEM de forma que se logró 60°C por 20 minutos, y después de forma que se logró 100°C por 30 minutos. Se agregó DMF (0.2 mL). La mezcla se calentó con microonda a 60°C por 20 minutos, a 100°C por 30 minutos. La reacción se concentró para remover los solventes orgánicos, el residuo se mezcló con agua (10 mL), se extrajo con diclorometano (4 x 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S0 , se concentró. El producto crudo se verificó con HPLC y LC-MS. El residuo se mezcló nuevamente con agua (10 mL), se ajustó el pH a 2.3 con HCI 1 N, se lavó con diclorometano (2 x 15 mL). La solución acuosa se ajustó a pH 10.4 con NaOH 0.2 N, se extrajo con diclorometano (4 x 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea Biotage con 0-10% MeOH en diclorometano, resultando en el producto deseado 3-0-mPEG3-nalbufina (2) (n = 3) (32.7 mg) en 81% de rendimiento. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 3-Q-mPEG4-Nalbufina (2) fn = 4): Una mezcla de nalbufina (96 mg, 0.27 mmol) y mPEG4-OMs (131 mg, 0.46 mmol) en acetona (8 mL) en la presencia de carbonato de potasio (1 13 mg, 0.82 mmol) se calentó a reflujo por 16 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y lo sólido se lavó con acetona y DCM. La solución se recolectó y se concentró a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 0-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 3-O-mPEG4-nalbufina 2 (n = 4) (109 mg) en 74% de rendimiento. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 3-O-mPEGs-Nalbufina (2) (n = 5): Una mezcla de nalbufina (78.3 mg, 0.22 mmol) y mPEG5-OMs (118 mg, 0.36 mmol) en acetona (8 ml_) en la presencia de carbonato de potasio (93 mg, 0.67 mmol), se calentó a reflujo por 16 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y lo sólido se lavó con acetona y DCM. La solución se recolectó y se concentró a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 0-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 3-O-mPEG5-nalbufina (2) (n = 5) (101 mg) en 7 6% de rendimiento. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 3-0-mPEGfi-Nalbufina (2) (n = 6): Una mezcla de nalbufina (89.6 mg, 0.25 mmol) y mPEG6-OMs (164 mg, 0.44 mmol) en acetona (8 mL) en la presencia de carbonato de potasio (98 mg, 0.71 mmol), se calentó a reflujo por 18 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y lo sólido se lavó con acetona y DCM. La solución se recolectó y se concentró a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 0-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 3-O-mPEG6-nalbufina (2) (n = 6) (144 mg) en 91 % de rendimiento. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 3-0-mPEG7-Nalbufina (2) (n = 7): Una mezcla de nalbufina (67 mg, 0.19 mmol) y mPEG7-Br (131 mg, 0.33 mmol) en acetona (10 mL) en presencia de carbonato de potasio (67 mg, 0.49 mmol) se calentó a reflujo por 6 horas, se enfrió a temperatura ambiente, se filtró y lo sólido se lavó y diclorometano. La solución se concentró a sequedad. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 2-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 3-0-mPEG7-nalbufina (2) (n = 7) (40.6 mg). El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 3-0-mPEG«-Nalbufina (2) fn = 8): Una mezcla de nalbufina (60 mg, 0.17 mmol) y mPEG8-Br (105.7 mg, 0.24 mmol) en la presencia de carbonato de potasio (40.8 mg, 0.30 mmol) en tolueno/DMF (3 ml_/0.3 mL) se calentó con microonda CEM de forma que se logró 100 °C por 30 minutos. Entonces se agregó acetona (1 mL). Después la mezcla se calentó con microonda CEM de forma que se logró 100°C por 90 minutos, se agregaron más de K2C03 (31 mg, 0.22 mmol) y mPEG8-Br (100 mg, 0.22 mmol). La mezcla se calentó con microonda CEM de forma que se logró 100°C por 60 minutos. Se agregó nuevamente mPEG8-Br (95 mg, 0.21 mmol). La mezcla se calentó nuevamente con microonda CEM de forma que se logró 100°C por 30 minutos. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida. El residuo se mezcló con agua (2 mL) y salmuera (10 mL). El pH de la solución se ajustó a 1.56 con HCI 1 N, se extrajo con diclorometano (3 x 20 mL). La solución orgánica combinada se secó con Na2S0 , se concentró para proporcionar el residuo I (una mezcla de el producto deseado y material precursor). La solución acuosa se cambió a pH 10. 3 con NaOH 0.2 N, se extrajo con diclorometano (4 x 15 mL). La solución orgánica se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se concentró para resultar en el residuo II (19.4 mg), el cual contiene el producto y la nalbufina como material de partida. El residuo I se purificó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 2- 0% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 3-0-mPEGs-nalbufina (2) (n = 8) (44.6 mg). El producto se confirmó por H-NMR, LC-MS.
EJEMPLO 2 Preparación de Conjugados Oliqómero-Nalbufina "Procedimiento B" Se preparó PEG-Nalbufina usando un segundo procedimiento. Esquemáticamente, se muestra posteriormente el procedimiento seguido por este ejemplo.
Síntesis de 3-0-MEM-Nalbufina (3): Se disolvió Nalbufina (321.9 mg, 0.9 mmol) en acetona/tolueno (19 mL/8 mL). Entonces, se agregó carbonato de potasio (338 mg, 2.45 mmol), seguido por una adición de MEMCI (160 pL, 1.41 mmol). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente por 21 horas, se agregó MeOH (0.3 mL) para apagar la reacción. La mezcla de reacción se concentró bajo presión reducida a sequedad. El residuo se mezcló con agua (5 mL) y salmuera (15 mL), se extrajo con diclorometano (3 x 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se separó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 2-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 3-O-MEM-nalbufina (3) (341 mg) y la nalbufina como material de partida (19.3 mg). El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 6-0-mPEG3-3-0-MEM-Nalbufina (4) (n = 3): Un vial de 20 mi se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (85 mg 0.19 mmol) y tolueno (15 mL). La mezcla se concentró para remover 7 mL de tolueno. Se agregó DMF anhidro (0.2 mL). El vial se encendió con nitrógeno. Se agregó NaH (60% de dispersión en aceite mineral, 21 mg, 0.53 mmol), seguido por una adición de mPEG3-OMs (94 mg, 0.39 mmol). Después la mezcla resultante se calentó a 45°C por 22.5 horas, se agregó más de NaH (22 mg, 0.55 mmol). La mezcla se calentó a 45°C por otras seis horas, se agregó NaH (24 mg) y la mezcla se calentó a 45°C por otras 19 horas. Cuando la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (1 mL) para apagar la reacción. La mezcla se diluyó con agua (10 mL), se extrajo con EtOAc (4 x 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se separó por cromatografía en columna instantánea automática Biotage con 0-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 6-0-mPEG3-3-O-MEM-nalbufina (4) (n = 3) (79.4 mg) en 71 % de rendimiento. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 6-0-mPEG3-Nalbufina (5) (n = 3): Se agitó 6-O-mPEG3-3-0-MEM-nalbufina (4) (79.4 mg) en HCI 2 M en metanol a temperatura ambiente por seis horas. La mezcla se diluyó con agua (5 mL), y se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se lavó con diclorometano (5 mL), y el pH de la solución se ajustó a 9.35 con NaOH 0.2N y NaHCO3 sólido, se extrajo con diclorometano (4 x 30 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró para resultar en el producto 6-0-mPEG3-nalbufina (5) (n = 3) (62.5 mg) en 93% de rendimiento. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 6-0-mPEG4-3-Q-MEM-Nalbufina (4) (n = 4): Un matraz de fondo redondo de 50 mi se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (133.8 mg, 0.3 mmol) y mPEG4-OMs (145 mg, 0.51 mmol) y tolueno (20 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 12 mL de tolueno. Se agregó DMF anhidro (0.2 mL). Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 61 mg, 1.52 mmol). Después la mezcla resultante se calentó a 45°C por 21.5 horas, se agregó más de NaH (30 mg, 0.75 mmol). La mezcla se calentó a 45°C por otras cinco horas. Cuando la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (1 mL) para apagar la reacción. La mezcla se diluyó con agua (15 mL), y se extrajo con EtOAc (4 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se separó por cromatografía en columna instantánea automática en gel de sílice Biotage con 0-10% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 6-0-mPEG -3-O-MEM-nalbufina (4) (n = 4) (214.4 mg). El 1H-NMR mostró algo de mPEG -OMs en el producto. No se hizo ningún intento para purificación adicional. El producto se confirmó por 1H-NMR, LC-MS.
Síntesis de 6-O-mPEGd-Nalbufina (5) ín = 4): Se agitó 6-0-mPEG4-3-0-MEM-nalbufina (4) (214.4 mg) en 2 M HCI en metanol (30 mL) a temperatura ambiente por 6 horas. La mezcla se diluyó con agua (5 mL), y se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a 9.17 con NaOH 1 N, se extrajo con diclorometano (4 x 25 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S0 , y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea en gel de sílice usando 3-8% MeOH/DCM (Biotage) para resultar en el producto crudo 6-0-mPEG4-nalbuf¡na (5) (n = 4) (90.7 mg), junto con algo de producto impuro. El producto se confirmó por H-NMR, LC-MS. La parte impura se disolvió en DCM (~1.5 mL). Se agregó HCI 1 N en éter (20 mL), se centrifugó. El residuo se recolectó y redisolvió en DCM (25 mL). La solución DCM se lavó con 5% NaHC03 acuoso (20 mL), salmuera (2 x 30 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró para proporcionar otra parte del producto puro (24.8 mg).
Síntesis de 6-Q-mPEGs-3-Q-MEM-Nalbufina (4) (n = 5 : Un matraz de fondo redondo de 50 mi se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (103.9 mg, 0.23 mmol), mPEG5-OMs (151 mg, 0.46 mmol) y tolueno (38 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 20 mL de tolueno. Se agregó DMF anhidro (0.5 mL). Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 102 mg, 2.55 mmol). Después la mezcla resultante se calentó a 45°C por 18 horas, se agregó más de NaH (105 mg). La mezcla se calentó a 45°C por otras 5.5 horas. Se agregó NaH (87 mg) y la mezcla se calentó a 45°C por otras 17.5 horas. Cuando la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (3 mL) para apagar la reacción. La mezcla se diluyó con agua (10 mL), se extrajo con EtOAc (4 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre a2S04, se concentró. El residuo se separó por cromatografía en columna instantánea automática en gel de sílice Biotage con 3-8% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 6-0-mPEG5-3-0-MEM-nalbufina (4) (n = 5).
Síntesis de 6-Q»mPEG5-Nalbufina (5) (n = 5): La 6-0-mPEG5-3-0-MEM-nalbufina anterior (4) se agitó en HCI 2M en metanol (30 mL) a temperatura ambiente por 2.5 horas. La mezcla se diluyó con agua (5 mL), se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a 9.19 con NaOH 1 N, se extrajo con diclorometano ( x 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. Después de la purificación con cromatografía en columna instantánea en sílice, se observó mPEG5-OMs en 1H-NMR. El residuo se disolvió en DCM (~1 mL). Se agregó HCI 1 en éter (18 mL), se centrifugó. El residuo se recolectó y redisolvió en DCM (25 mL). La solución DCM se lavó con 5% NaHC03 acuoso (2 x 20 mL), salmuera (2 x 30 mL), se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se separó por cromatografía en columna instantánea en automáticamente gel de sílice Biotage con 4-8% MeOH en diclorometano para resultar en el producto 6-0-mPEG5-nalbufina (5) (n = 5) (55 mg).
Síntesis de 6-Q-mPEGfi-3-0-MEM-Nalbufina (4) (n = 6): Se disolvió 3-O-MEM-nalbufina (3) (77.6 mg, 0.17 mmol) y mPEG6-OMs (199 mg, 0.53 mmol) en tolueno (20 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 12 mL de tolueno. Se agregó DMF anhidro (0.2 mL), seguido por una adición de NaH (60% dispersión en aceite mineral, 41 mg, 1.03 mmol). Después la mezcla resultante se calentó a 45°C por 23 horas, se agregó más de NaH (46 mg). La mezcla se calentó a 45°C por otras 24 horas. Cuando la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (5 mL) para apagar la reacción. La mezcla se diluyó con agua (10 mL), se extrajo con EtOAc (4 x 15 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo directamente se usó para la siguiente etapa.
Síntesis de 6-0-mPEGfi-Nalbufina (5) (n = 6): Se agitó la 6-0-mPEG6-3-0-MEM-nalbufina anterior (4) en HCI 2M en metanol (30 mL) a temperatura ambiente por 20 horas. La mezcla se diluyó con agua (5 mL), se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a 9.30 con NaOH 1 N, se extrajo con diclorometano (5 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se disolvió en DCM (~1 mL). Se agregó HCI 1 N en éter (20 mL), se centrifugó. El residuo se recolectó y redisolvió en DCM (40 mL). La solución DCM se lavó con 5% NaHC03 acuoso (2 x 20 mL), agua (30 mL), salmuera (2 x 30 mL), se secó sobre a2S04, se concentró para resultar en el producto 6-0-mPEG6-nalbufina (5) (n = 6) (68 mg).
Síntesis de 6-Q-mPEG7-3-Q-MEM-Nalbufina (4. n = 7): Un matraz de fondo redondo de 50 mi se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (82.8 mg, 0.186 mmol), mPEG7-Br (151 mg, 0.46 mmol) y tolueno (15 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 9 mL de tolueno. Se agregó DMF anhidro (0.2 mL). Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 50 mg, 1.25 mmol). Después la mezcla resultante se calentó a 45°C por 22.5 horas, se agregó más de NaH (38 mg, 0.94 mmol). La mezcla se calentó a 45°C por otras 5 horas. Cuando la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (5 mL) para apagar la reacción. La mezcla se diluyó con agua (10 mL), y se extrajo con EtOAc (4 x 10 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO , se concentró. El residuo directamente se usó para la siguiente etapa.
Síntesis de 6-Q-mPEG7-Nalbufina (5) (n = 7): Se agitó la 6-O-mPEG7-3-O-MEM-nalbufina anterior (4) HCI en metanol (20 mL) a temperatura ambiente por 20 horas. La mezcla se diluyó con agua, y se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a 9.30 con NaHC03 y 0.2 N NaOH, se extrajo con diclorometano (4 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, se concentró. El residuo se purificó con cromatografía en columna instantánea en gel de sílice y se lavó con DCM en condición acídica, se ajustó el pH a 9.35, se extrajo con DC . El producto aún está contaminado con poco PEG. El residuo se disolvió en DCM (~2 mL). Se agregó HCI 1 N en éter (10 mL), se centrifugó. El residuo se recolectó y redisolvió en DCM (10 mL). La solución DCM se lavó con 5% NaHC03 acuoso, salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró para resultar en el producto 6-0-mPEG7-nalbufina (5) (n = 7) (49 mg).
Síntesis de 6-Q-mPEGR-3-Q-MEM-Nalbufina (4) (n = 8): Un matraz de fondo redondo de 50 mi se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (80.5 mg, 0.181 mmol), mPEG8-Br (250 mg, 0.56 mmol) y tolueno (15 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 6 mL de tolueno. Se agregó DMF anhidro (0.2 mL). Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 49 mg, 1.23 mmol). La mezcla resultante se calentó a 45°C por 23 horas, la mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (5 mL) y agua (10 mL) para apagar la reacción. La mezcla se extrajo con EtOAc (4 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre a2SO4, se concentró. El residuo directamente se usó para la siguiente etapa.
Síntesis de 6-0-mPEGR-Nalbufina (5) (n = 8): Se agitó la 6-0-mPEG8-3-0-MEM-nalbufina anterior (4) en 2 M HCI en metanol (20 mL) a temperatura ambiente por 17 horas. La mezcla se diluyó con agua, se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a 9.32 con NaHCO3 y 0.2 N NaOH, se extrajo con diclorometano (4 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se disolvió en DCM (~1 mL). Se agregó HCI 1 N en éter (20 mL), se centrifugó. El residuo se recolectó y redisolvió en DCM (30 mL). La solución DCM se lavó con acuoso 5% NaHCO3 (60 mL), agua (30 mL), salmuera (30 mL), se secó sobre Na2SO4, se concentró. El residuo se purificó con cromatografía en columna instantánea en gel de sílice usando 0-10% metanol en diclorometano para resultar en el producto 6-O-mPEGs-nalbufina (5) (n = 8) (78.4 mg).
Síntesis de 6-0-mPEGg-3-0-MEM-Nalbufina (4) fn = 9): Un matraz de fondo redondo de 50 mi se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (120 mg, 0.27 mmol), mPEG9-OMs (245 mg, 0.48 mmol) y tolueno (20 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 10 mL de tolueno. Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 63 mg, 1.57 mmol), seguido por una adición de DMF anhidro (0.5 mL). La mezcla resultante se calentó a 45°C por 17 horas. Se agregó más de NaH (60% dispersión en aceite mineral, 60 mg) en base a los resultados de HPLC, y después la mezcla se calentó a 45 °C por otras 5.5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se agregó solución acuosa de NaCI saturada (2 mL) y agua ( 5 mL) para apagar la reacción. La mezcla se extrajo con EtOAc (4 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea en gel de sílice usando 3-8% metanol en diclorometano (biotage) para proporcionar el producto 6-0-mPEGg-3-MEM-0-nalbufina (207 mg) en 90% de rendimiento.
Síntesis de 6-O-mPEGg-Nalbufina (5) (n = 9): Se agitó la 6-0-mPEG9-3-0-MEM-nalbufina anterior (4) (207 mg, 0.24 mmol) en HCI 2M en metanol (33 mL) a temperatura ambiente por 17 horas. La mezcla se diluyó con agua, y se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a 9.16 con NaOH 1 N, y se extrajo con diclorometano (4 x 25 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S0 , se concentró. El residuo se purificó con cromatografía en columna instantánea en gel de sílice usando 3-8% metanol en diclorometano para resultar en el producto 6-0-mPEG9-nalbufina (4) (n = 9) (129.3 mg) en 70% de rendimiento.
EJEMPLO 3 Preparación de Conjugados Oligómero-Nalbufina "Procedimiento C" Se preparó PEG-Nalbufina usando un tercer procedimiento. Esquemáticamente, se muestra posteriormente el procedimiento seguido por este ejemplo.
TrCI MsCI/TEÁ n\ 3, NaH HO TrO DC TrO' ToluenoVD F Síntesis de TrO-PEGs-OH (7) (n = 5): Se disolvió PEG5-di-OH (6) (n = 5) (5.88 g, 24.19 mmol) en tolueno (30 ml_), y se concentró para remover tolueno bajo presión reducida. El residuo se secó bajo alto vacío, se agregó D F anhidro (40 mL), seguido por una adición de DMAP (0.91 g, 7.29 mmol) y TrCI (cloruro de tritilo) (1 .66 g, 5.84 mmol). La mezcla resultante se calentó a 50°C por 22 horas. La reacción se concentró para remover los solventes (alto vacío, 50 °C). El residuo se mezcló con agua, y se extrajo con EtOAc (3 x 25 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2C03, se concentró. El residuo se purificó con cromatografía en columna instantánea en gel de sílice para resultar en 1.29 g del producto en 46% de rendimiento. El producto se confirmó con 1H-NMR en CDCI3.
Siguiendo un procedimiento similar para la preparación de TrO-PEG5-OH, se sintetizaron otros TrO-PEGn-OH a partir del PEGn-di-OH correspondiente.
TrO- ^¾Ms Síntesis de TrO-PEGs-OMs (8) fn = 5): Se agregó por goteo cloruro de metansulfonilo (0.35 mL, 4.48 mmol) a una solución agitada de TrO-PEG5-OH (8) (n = 5) (1.29 g, 2.68 mmol) y trietilamina (0.9 mL, 6.46 mmol) en diclorometano (15 mL) a 0°C. Después de la adición, la solución resultante se agitó a temperatura ambiente por 16.5 horas. Se agregó agua para apagar la reacción. La fase orgánica se separó y la solución acuosa se extrajo con diclorometano (10 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera (3 x 30 mL), se secó sobre Na2S04 y se concentró para proporcionar el producto como un aceite (1.16 g) en 78% de rendimiento. El producto (8) (n = 5) se confirmó con 1H-NMR en CDCI3.
Síntesis de TrO-PEGn-OMs (8) (n = varios): Siguiendo un procedimiento similar para la preparación de TrO-PEG5-OMS, se sintetizaron otros TrO-PEGn-OMs a partir del correspondiente TrO-PEGn-OH.
Síntesis de 3-0-MEM-6-0-TrO-PEGa-nalbufina (9) ín = 4): Un matraz redondo se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (120 mg, 0.27 mmol) [previamente preparado de conformidad con la síntesis del compuesto (3) proporcionado en el Ejemplo 2], TrO-PEG4-OMs (8) (n = 4) (143.4 mg, 0.28 mmol) y tolueno (40 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 30 mL de tolueno. Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 150 mg, 3.75 mmol), seguido por una adición de DMF anhidro (0.2 mL). La mezcla resultante se calentó a 45°C por 4.5 horas. Se agregó más de NaH (60% dispersión en aceite mineral, 146 mg), y la mezcla se agitó a 45°C por otras 18 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se saturó con solución acuosa de NaCI (2 mL), y se agregó agua (15 mL) para apagar la reacción. La mezcla se extrajo con EtOAc (4 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, y se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea en gel de sílice usando 0-10% metanol en diclorometano (Biotage) para proporcionar el producto 3-0-MEM-6-0-TrO-PEG4-nalbufina (9) (n = 4) (-150 mg).
Síntesis de 6-0-HO-PEG4-Nalbufina (10) (n = 4): Se agitó la 6-0-TrO-PEG4-3-0-MEM-nalbufina anterior (9) (n (150 mg) en 2 M HCI en metanol (12 mL) a temperatura ambiente por un día. La mezcla se diluyó con agua, y se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a pH 9.08 con NaOH, y se extrajo con EtOAc (3 x 20 mL). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2SO4, y se concentró. El residuo se purificó con cromatografía en columna instantánea en gel de sílice para resultar en el producto 6-O-OH-PEG4-nalbufina (10) (n = 4) (26.9 mg). El producto se analizó con 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.
Síntesis de 3-Q-MEM-6-0-TrO-PEGs-nalbufina (9) (n = 5): Un matraz redondo se colocó con 3-O-MEM-nalbufina (3) (318 mg, 0.71 mmol) [previamente preparado de conformidad con la síntesis del compuesto (3) proporcionado en el Ejemplo 2], TrO-PEGs-OMs (8) (n = 5) (518.5 mg, 0.93 mmol) y tolueno (100 mL). La mezcla se concentró para remover aproximadamente 75 mL de tolueno. Se agregó NaH (60% dispersión en aceite mineral, 313 mg, 7.8 mmol), seguido por una adición de anhidro DMF (1.0 mL). La mezcla resultante se agitó a temperatura ambiente por 30 minutos, y después a 60°C por 19.5 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente, se saturó con solución acuosa de NaCI (5 mL), y se agregó agua (5 mL) para apagar la reacción. La fase orgánica se separó y lo acuoso se extrajo con EtOAc. La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04, se concentró. El residuo se purificó por cromatografía en columna instantánea en gel de sílice usando 0-10% metanol en diclorometano (Biotage) para proporcionar el producto 3-0-MEM-6-0-TrO-PEGs-nalbufina (718 mg). El producto (9) (n = 5) impuro, se usó para la siguiente etapa sin purificación adicional.
Síntesis de 6-O-HO-PEGs-Nalbufina (10) (n = 5): Se agitó la 6-0-TrO-PEG5-3-O-MEM-nalbufina anterior (9) (n = 5) (718 mg) en HCI 2M en metanol (30 mL) a temperatura ambiente por 19 horas. La mezcla se diluyó con agua, y se concentró para remover el metanol. La solución acuosa se ajustó a pH 9.16 con NaOH, se extrajo con DCM (3 x 20 ml_). La solución orgánica combinada se lavó con salmuera, se secó sobre Na2S04( y se concentró. El residuo se purificó dos veces con cromatografía en columna instantánea en gel de sílice para proporcionar producto muy puro 6-0-HO-PEG5-nalbufina 10 (n = 5) (139 mg) y producto menos puro (48 mg). El producto se analizó con 1H-NMR, LC-Ms, HPLC.
EJEMPLO 4 Receptor de unión de conjugados de PEG-Nalbufina Usando técnicas de ensayo de unión de receptores convencionales, varias moléculas se ensayan para determinar la actividad de unión a subtipos de opioide kappa, mu y delta de receptores de opioides.
Brevemente, la afinidad de unión al receptor de la nalbufina y conjugados de PEG-nalbufina se mide usando ensayos de unión de radioligando en células CHO que expresan heterologamente el receptor opioide mu, delta o kappa humano. Células se colocan en placas de 24 pozos de 0.2-0.3* 106 células/pozo y se lavan con regulador de pH de ensayo que contiene 50 mM de Tris.HCI y 5 mM de MgCl2 (pH 7.4). Ensayos de unión de competición se conducen en células completas incubadas con concentraciones incrementadas de compuestos de prueba en la presencia de concentración apropiada de radioligando. 0.5 mM 3H Naloxona, 0.5 mM 3H Diprenorfina y 0.5 nM 3H DPDPE se usan como los radioligandos de competición para receptores mu, kappa y delta respectivamente. Incubaciones se llevan a cabo durante dos horas a temperatura ambiente usando pozos triplicados en cada concentración. Al final de la incubación, las células se lavan con 50 mM de Tris HCI (pH 8.0), se solubilizan con NaOH y radioactivamente unidos se miden usando un contador de centelleo.
Enlace específico está determinado por la sustracción del cpm enlazado en presencia de exceso de 50-100X de ligando frío. Ensayos de datos de enlace se analizan utilizando GraphPad Prism 4.0 e IC50 es generado por regresión no lineal de las curvas de dosis-respuesta. Valores de Ki se calculan con la ecuación de Cheng Prusoff utilizando los valores de Kd de isotermas de saturación como sigue: Ki = IC50 / (1 + [ligando] /Kd) Conjugados de PEG de nalbufina retienen afinidad de unión a los receptores opioides. El cuadro 1 muestra la afinidad de unión (Ki, en nM) para conjugados de PEG de nalbufina de los receptores opioides mu, delta y kappa. La pérdida de afinidad de unión tras la conjugación PEG es menor de 15 veces la nalbufina de origen en los tres subtipos de receptor. Véase el cuadro 1. Resultados de conjugación de PEG en una pérdida de 10- 5 veces en la afinidad de unión a los receptores opioides mu y kappa, pero no a los receptores opioide delta. Afinidad de unión a los receptores opioides delta es comparable o incluso mayor en algunos casos, que nalbufina de origen. Véase la figura 1. El cambio diferencial de afinidad de unión en los tres subtipos de receptores opioides implica que la selectividad del receptor de los conjugados de nalbufina está alterada en comparación con la nalbufina de origen.
CUADRO 1 Actividades de unión * Las series "3-O-mPEGn-nalbufina" de moléculas preparadas en el ejemplo 1 no muestran actividad de unión detectable; moléculas en donde un oligómero no péptidico, soluble en agua es unido de manera covalente en la posición 3-0 se cree que tienen el valor cuando, por ejemplo, el enlace covalente es una forma degradable de enlace. Algunos valores de actividad de unión en el cuadro anterior se han remplazado con valores obtenidos bajo condiciones de ensayo optimizadas. Aunque los valores originales se cree que son confiables y útiles, se han remplazado aquí en el interés de brevedad.
EJEMPLO 5 Preparación de conjugados de U50488 PEG-U50488 se puede preparar siguiendo los métodos mostrados esquemáticamente posteriormente.
EJEMPLO 5A Síntesis de conjugados de mPEGn-O-U50488 Siguiendo el esquemático general proporcionado posteriormente, conjugados de mPEGn o U504488 se pueden preparar. (+/+ n = 3, 5, 7 (+/-)-trans-2-(pirrolid¡n-1 -il)ciclohexanol ((+/-)- ): Pirrolidina (4.26 g, 60 mmol) fue agregado a una solución de óxido de ciclohexeno (1.96 g, 20 mmol) en H20 (6 mL), y la mezcla resultante se calienta en 90°C durante 16 horas. Después de enfriado, se remueve el solvente bajo presión reducida y el residuo resultante fue extraído con DCM (10 mL x 3). La fase orgánica fue combinada y se seca con Na2S04 anhidro. Después de remover el Na2S04 por filtración, el solvente se evapora y el material se seca bajo vacío para producir el compuesto deseado (+/-)-1(3.3 g, 19.5 mmol, rendimiento 98%). 1H NMR (CDCI3) d 4.06 (s, 1 H), 3.45-3.30 (m, 1 H), 2.75-2.63 (m, 2H), 2.62-2.50 (m, 2H), 2.51-2.42 (m, 1 H), 1.90-1.58 (m, 8H), 1.45-1.15 (m, 4 H).
(+/-)-Trans-N-metil-2-(pirrolidin-l-il)-c¡clohexanamina ((+/-)-2): A una solución de compuesto (+/-)-1 (1.01 g, 6.0 mmol) y TEA (0.98 mi, 7 mmol) en DCM (20 mi) se añade cloruro de metanosulfonilo (0.51 mi, 6.6 mmol) gota a gota. La mezcla de reacción fue agitada por 2 h a temperatura ambiente. Se remueve el solvente bajo presión reducida, y metilamina 5 mL (40% en H20) se agrega a temperatura ambiente. La solución fue agitada a temperatura ambiente por 16h adicionales. La mezcla de reacción fue agregada a DCM (50 mL) y se lava con solución de NaHC03 saturada (2 x 25 mL). Las fases orgánicas fueron combinadas y secadas con Na2S04 anhidro. Después de quitar el Na2S04 por filtración, se remueve el solvente y el material se seca bajo vacio para producir el compuesto deseado (+/-)-2 (1.0 g, 5.5 mmol, 91 % de rendimiento). 1H NMR (CDCI3) d 2.61 (s, 1 H), 2.49-2.30 (m, 6H), 2.29 (s, 3H), 2.09-1.96 (m, 2H), 1.67-1.52 (m, 7H), 1.1 1-1.02 (m, 3 H).
(+/-)-N-metil-N-[2-(pirrolidin-1-il)c¡clohexil]-2-(3-cloro-4-hidroxifenil)acetamida ((+/-)-4): Ácido 3-cloro-4-hidroxifenilacético (186 mg, 1 mmol) y NHS (115 mg, 3 mmol) se disolvieron en DCM (20 ml_). A continuación, DCC (1.1 mmol) se añade en la solución y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 16 horas durante el cual se formó un precipitado. Después de que el precipitado se elimina por filtración, el filtrado resultante se mezcla con el compuesto (+/-)3 (182 mg, 1 mmol). La solución resultante se agita a temperatura ambiente durante la noche. El solvente se elimina bajo presión reducida y el residuo resultante se somete a purificación por cromatografía instantánea (MeOH/DCM = 2% ~ 18%) para dar el producto deseado (+/-)-4 (120 mg, 0.34 mmol, rendimiento 34%). 1H RMN (CDCI3) d 7.12 (s, 1 H), 7 00-6.86 (m, 2H), 4.56 (s, 1 H), 3.66-3.61 (m, 2H), 3.09-2.85 (m, 6H), 2.85 (s, 3H), 1.71-1.45 (m, 8H), 1 .44-1.11 (m, 4H). LC/MS 351.1 [M+H]+.
(+/-)-N-metil-N-[2-(p¡rrolidin-1-il)c¡clohexil]-2-(3-cloro-4-metoxi-tri(etilenglicol)fenil)acetamida ((+/-)-5a): Compuesto (+/-)-4 (50 mg, 0.14 mmol), metoxi tri (etilenglicol)metanosulfonato (48.4 mg, 0.2 mmol) y K2CO3 anhidro (70 mg, 0.5 mmol) se añadieron a acetona (10 mi). La mezcla resultante se agita bajo reflujo durante 16 h. El sólido se remueve por filtración y el solvente se evapora a presión reducida. El residuo resultante se somete a purificación por cromatografía instantánea (MeOH/DCM = 2% ~ 15%) para dar el compuesto deseado (+/-)-5a (30 mg, 0.06 mmol, rendimiento 43%). 1H RMN (CDCI3) 6 7.31 (s, 1 H), 7.18 (d, 1 H), 7.06 (d, 1 H), 4.61- 4.51 (m 1 H), 4.19 (t, 2H), 3.90 (t, 2H), 3.76-3.44 (m, 10H), 3.36 (s, 3H), 2.95-2.83 (m, 6H), 2.1 1-1.19 (m, 12H). LC/MS 497.2 [M + H]+ (+/-)-N-met¡l-N-[2-(pirrolidin-1-il)ciclohex¡l]-2-(3-cloro-4-metoxi-penta(etilenglicol)fenil)acetamida ((+/-)-5b): Compuesto (+/-)-4 (80 mg, 0.23 mmol), metoxi penta(etilenglicol) metanosulfonato (108.9 mg, 0.33 mmol) y K2CO3 anhidro (112 mg, 0.8 mmol) se añaden a acetona (15 mi). La mezcla se agita a reflujo durante 16 h. El sólido se separa por filtración y el solvente se evapora bajo presión reducida. El residuo resultante se somete a purificación por cromatografía instantánea (MeOH/DCM = 2%~15%) para dar el compuesto deseado (+/-)-5a (60 mg, 0.10 mmol, rendimiento 45%). 1H RMN (CDCI3) d 7.25 (s, 1 H), 7.10 (d, 1 H), 6.85 (d, 1 H), 4.55-4.45 (m, 1 H), 4.14 (t, 2H), 3.87 (t, 2H), 3.81-3.42 (m, 18H), 3.37 (s, 3H), 2.90-2.35 (m, 6H), 2.09-1.15 (m, 12H). LC/MS 585.3 [M+H]+.
(+/-)-N-metil-N-[2-(pirrolidin-1-il)cíclohexil]-2-(3-cloro-4-metox¡-hexa(etilenglicol)fenil)acetamida ((+/-)-5c): Compuesto (+/-)-4 (50 mg, 0.23 mmol), metoxi hexa(etilenglicol)metanosulfonato (150 mg, 0.37 mmol) y K2C03 anhidro (1 12 mg, 0.8 mmol) se añaden a acetona (15 mi). La mezcla se agita a reflujo durante 16 h. El sólido se remueve por filtración y el solvente se evapora bajo presión reducida. El residuo resultante se somete a purificación por cromatografía instantánea (MeOH/DCM = 2%~15%) para dar el compuesto deseado (+/-)-5c (61 mg, 0.09 mmol, rendimiento 39%).
H RMN (CDCI3) d 7.27 (s, 1 H), 7.16 (d, 1 H), 6.88 (d, 1 H), 4.72-4.51 (m, 1 H), 4.16 (t, 2H), 3.89 (t, 2H), 3.79-3.49 (m, 26H), 3.38 (s, 3H), 3.18-2.53 (m, 6H), 2.10-1.12 (m, 12H). LC/MS 673.4 [M+H]+.
EJEMPLO 5B Síntesis de conjugados de di-mPEGn-CH2-U50488 Siguiendo el esquemático general proporcionado posteriormente, conjugados de di-mPEGn-CH2-U504488 se pueden preparar. 3-Ciclohexeno 1,1-dimetanol metoxi tri(etilenglicol) éter (2a): 3-Ciclohexeno 1 ,1-dimetanol 1 (284 mg, 2 mmol) se disuelve en DMF anhidro (6 mi). A temperatura ambiente, NaH (60% en aceite mineral, 320 mg, 8 mmol) se añade y la solución se agita durante 10 minutos adicionales. Metoxi tri(etilenglicol) mesilato (1.21 g, 5 mmol) se añade a la solución. La solución de reacción se agita a 45°C durante 18 horas y después solución saturada de NH4CI (30 mi) se añade a la solución. La solución se extrae con EtOAc (20 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04l se filtran y se elimina el solvente bajo presión reducida para dar compuesto 2a (850 mg, 1.96 mmol, 98% de rendimiento). 1H RMN (CDCI3) d 5.62-5.58 (m, 2H), 3.66-3.51 (m, 24 H), 3.38 (s, 6H), 3.34 (d, 2H), 3.25 (d, 2H), 2.01 (m, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.52 (t, 2H). LC/MS 435 [M+H , 452 [M+NH4]+, 457 [M+Na]+. 3-ciclohexeno 1 ,1-dimetanol metoxi di(etilenglicol) éter (2b): 3-ciclohexeno 1 ,1-dimetanol (426 mg, 3 mmol) 1 se disuelve en un DMF anhidro (9 mi). A temperatura ambiente, NaH (60% en aceite mineral, 480 mg, 12 mmol) y la solución se agita durante 10 minutos adicionales. Metoxi di(etilenglicol) mesilato (1.5 g, 7.5 mmol) se añade a la solución. La solución de reacción se agita a 45°C durante 18 horas y luego solución saturada de NH4CI (30 mi) se añade a la solución. La solución se extrae con EtOAC (20 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04, se filtran y el solvente se remueve bajo presión reducida para dar compuesto 2b (1 .18 g, 2.9 mmol, rendimiento 98%). 1H RMN (CDCI3) d 5.64-5.56 (m, 2H), 3.66-3.54 (m, 16 H), 3.35 (s, 6H), 3.33 (d, 2H), 3.28 (d, 2H), 1.99 (m, 2H), 1.87 (m, 2H), 1.53 (t, 2H). 3,3-Di[metoxi tri(etilenglicol)metil]-7-oxabiciclo[4.1.0]heptanos (3a): Compuesto 2a (850 mg, 1.96 mmol) se disuelve en DCM (20 mL). A temperatura ambiente, mCPBA (77% máximo, 0.75 g, ~ 3 mmol) se añade a la solución. La mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 3.5 h. Solución de a2S203 (10 mi) se añade a la solución y la agitación ocurre por un período adicional de 10 minutos. La solución resultante se extrae con DCM (20 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04l se filtran y el solvente se remueve bajo presión reducida para dar el compuesto 3a (870 mg, 1.86 mmol, 95% de rendimiento). 1H RMN (CDCI3) d 3.66-3.55 (m, 24 H), 3.38 (s, 6H), 3.27-3.12 (m, 6H), 1.99-1.67 (m, 6H). LC/MS 451 [M+H]+, 468 [M+NH4]+, 473 [M+ Na]+. 3,3-Di [metoxi di(etilenglicol)metil]-7-oxabiciclo [4.1.0] heptanos (3b): Compuesto 2b (1.18 g, 3.41 mmol) se disuelve en DCM (20 ml_). A temperatura ambiente, mCPBA (77% como máximo, 1.3 g, ~ 5.2 mmol) se añade a la solución. La solución de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 3.5 h. Solución de Na2S203 saturada (15 mi) se añade a la solución y la agitación se produce por un 10 minutos adicionales. La solución resultante se extrae con DCM (20 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04, se filtran y el solvente se remueve bajo presión reducida para dar el compuesto 3b (1.27 g, 3.12 mmol, 92% de rendimiento).
H RMN (CDCI3) d 3.65-3.54 (m, 24H), 3.38 (s, 6H), 3.27-3.10 (m, 6H), 2.00-1.68 (m, 6H).
Trans-(+/-)-4 o 5-di[metox¡ tri(etilenglicol)metil] -2-(1-pirrolidinil)-ciclohexanol (4a): Compuesto 3a (870 mg, 1.93 mmol) y pirrolidina (2.5 mi) se añade a agua (8 mi) y se calienta a reflujo durante 5 h. La solución resultante se extrae con DCM (10 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04, se filtran y el solvente se remueve bajo presión reducida para dar 4a como una mezcla de 4ax y 4ay (910 mg en total). El producto se utiliza en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Trans-(+/-)-4 o 5-di[metoxi di(etilenglicol)metil]-2-(1-pirrolidinil)-ciclohexanol (4b): Compuesto 3b (1.27 g, 3.12 mmol) y pirrolidina (2.5 mi) se añaden a agua (8 mi) y se calienta a reflujo durante 5 h. La solución resultante se extrae con DCM (10 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04, se filtran y el solvente se elimina bajo presión reducida, para proporcionar 4b como una mezcla de 4bx y 4by (1.3 g totales). El producto se utiliza en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Trans-(+/-)-4 o 5-di[metoxi tri(etilenglicol)metil]-N-metil-2-(1-pirrolidinil)-cyclohexanamina (5a): compuesto 4a (910 rtig, 1.74 mmol) se disuelve en DCM (20 mL) y TEA (0.42 mi, 3 mmol) se añade. A temperatura ambiente, cloruro de metanosulfonilo (0.16 mi, 2 mmol) se añade gota a gota. Después se continúa la agitación durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla resultante se evapora bajo presión reducida. El residuo resultante se disuelve en metilamina (40% p/p en agua, 6 mi) y la solución se agita a temperatura ambiente durante 30 h. La solución se extrae con DCM (10 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secaron con Na2SO4, se filtran y el solvente se elimina bajo presión reducida para dar 5a como una mezcla de 5ax y 5ay. El producto se utiliza en la reacción siguiente sin purificación adicional.
Trans-(+/-)-4 o 5-di[metoxi di(etilenglicol) metil]-N-metil-2-(1-pirrolidinil)-ciclohexanamina (5b): Compuesto 4b (1.3 g, 3 mmol) se disuelve en DCM (20 ml_) y TEA (0.84 mi, 6 mmol). A temperatura ambiente, el cloruro de metanosulfonilo (0.28 mi, 3.5 mmol) se añade gota a gota. Después se continúa la agitación durante la noche a temperatura ambiente, la mezcla resultante se evapora bajo presión reducida. El residuo obtenido se disuelve en metilamina (40% p/p en agua, 6 mi) y la solución se agita a temperatura ambiente durante 30 h. La solución resultante se extrae después con DCM (10 mi x 2). Las fases orgánicas se combinan, se secan con Na2S04, se filtran y se elimina el solvente bajo presión reducida para dar 5b como una mezcla de 5bx y 5by. El producto se utiliza en la siguiente reacción sin purificación adicional.
Trans-(+/-)-4 o-5-di[metoxi tri(etilenglicol)metil]-N-metil-N-[2-(pirrol¡din-1 -¡l)ciclohexil]-2-(3,4-dicloro)acetam¡da (6a): ácido 3,4-diclorofenilacetico (410 mg, 2 mmol), compuesto 5a (926 mg, 1.74 mmol) y DMAP (10 mg) se disolvieron en DCM (10 mL). A continuación, DCC (515 mg, 2.5 mmol) se añade a la solución y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 4 horas durante el cual se forma un precipitado. Después de que el precipitado se remueve por filtración, el solvente filtrado resultante se evapora y el residuo se somete a purificación por cromatografía instantánea (MeOH/DCM = 2% ~ 8%) para dar el producto deseado 6a como una mezcla de 6ax y 6ay (477 mg total, 0.34 mmol, rendimiento 20%).
H RMN (CDC ) d 7.39-7.33 (m, 2H), 7.15-7.10 (m, 1 H), 3.71-3.51 (m, 28H), 3.42-3.16 (m, 3H), 3.35 (s, 6H), 2.82, 2.79 (s, s, 3H total, relación 3:5), 2.70-2.30 (m, 5H), 1.73-1.17 (m, 1 1 H). LC/MS 721 [M+H]+, 743 [M+Na]+.
Trans-(+/-)-4 o 5-di[metoxi di(etilenglicol)metil]-N-metil-N-[2-(pirrolidin-1-il)ciclohexil]-2-(3,4-dicloro)acetamida (6b): ácido 3,4-diclorofenilacetico (707 mg, 3.45 mmol), compuesto 5b (1 .33 g, 2.98 mmol) y DMAP (10 mg) se disolvieron en DCM (10 mL). A continuación, DCC (865 mg, 4.2 mmol) se añade a la solución y la mezcla de reacción se agita a temperatura ambiente durante 4 horas durante el cual se forma un precipitado. Después de que el precipitado se separa por filtración, el solvente filtrado resultante se evapora y el residuo se somete a purificación por cromatografía instantánea (MeOH/DCM = 2% ~ 8%) para dar el producto deseado 6b como una mezcla de 6bx y 6by (306 mg total, 0.49 mmol, rendimiento 16%). 1H RMN (CDCb) d 7.33-7.27 (m, 2H), 7.06-7.04 (m, 1 H), 3.65-3.46 (m, 20H), 3.42-3.12 (m, 3H), 3.37 (s, 6H), 2.76, 2.74 (s, s, 3H total, relación 1.1 :1), 2.72-2.24 (m, 5H), 1.71-1.07 (m, 1 1 H). LC/MS 633 [M + H]+, 655 [M + Na]+.
EJEMPLO 6 Preparación de conjugados de oligomero-U69593 PEG-U69593 se puede preparar siguiendo el método esquemáticamente mostrado posteriormente. Técnicas sintéticas orgánicas convencionales se usan en llevar a cabo el método.
EJEMPLO 7 Preparación de conjugados diferentes con nalbufina, U50488, y U69593 Conjugados de los agonistas opíoides diferentes de nalbufina, U50488 y U69593 se pueden preparar en donde el esquema sintético general y los procedimientos establecidos en el ejemplo 1 se puede seguir excepto de que un agonista opioide de Fórmula I se sustituye por nalbufina, U50488 y U69593.
EJEMPLO 8 Eficacia in vitro de los conjugados de PEG-nalbufina La eficacia in vitro de los conjugados de PEG-nalbufina se determina utilizando un ensayo de unión GTPyS en las células CHO que expresan los receptores opioide mu o delta humano o células HEK que expresan el receptor opioide kappa humano. Compuesto de prueba y/o vehículo se pre-incuba con las membranas celulares y 3 µ? de GDP en regulador de pH HEPES modificado (pH 7.4) durante 20 minutos, seguido por la adición de perlas de SPA por otros 60 minutos a 30°C. La reacción se inicia por 0.3 nM [35S] GTPyS por un periodo de incubación de 30 minutos adicional. Incremento inducido por compuesto de prueba de unión de [35S] GTPyS por 50 por ciento o más (> 50%) en relación con la respuesta de agonista específico de subtipo de receptor indica posible actividad agonista de receptor opiato. 0.1 µ? de DPDPE, 1 µ? de U-69593 y 1 µ? de DAMGO se utilizan como los agonistas específicos para los receptores opioide delta, kappa y mu respectivamente. La actividad antagonista del receptor opioide se mide utilizando la inhibición de incremento inducido por agonista de respuesta de unión de [35S] GTPyS por 50 por ciento o más (> 50%). Nalbufina, 6-0-mPEG3-nalbufina, 6-O-mPEGg-nalbufina, 6-0-mPEGg-nalbufina se proyectan en concentraciones de 10, 1 , 0.1 , 0.01 y 0.001 µ? en ambos modos de agonistas y antagonistas. Valores de EC50 o IC5o se calcularon de las curvas de dosis-respuesta como una medida de la actividad agonista o antagonista de los compuestos de prueba, respectivamente.
El cuadro 2 muestra los valores EC50/IC50 de nalbufina y conjugados de PEG-nalbufina para activar o inhibir unión GTPyS, lo que refleja su actividad agonista o antagonista. Conjugados de PEG-nalbúfina son agonistas totales en los receptores opioides kappa y antagonistas en los receptores opioides mu, similares al perfil farmacológico de nalbufina. La EC50 de 6-0-mPEG3-nalbufina es similar a la de la nalbufina en el receptor opioide kappa, sugiriendo que no hay pérdida de eficacia en este tamaño PEG. Más allá de un tamaño de PEG de 3, la eficacia de los conjugados de PEG-nalbufina en el receptor opioide kappa disminuye como una función del tamaño de PEG, como se indica por el aumento en los valores CE50 de 6-0-mPEG6-nalbufina, y 6-O-mPEGg-nalbufina. PEG-nalbufinas parecen tener una potencia antagonista del receptor opioides mu comparable a la de la nalbufina de origen. En el receptor opioide delta, 6-O-mPEGg-nalbufina, actúa como un antagonístico débil, sin embargo, nalbufina, 6-O-mPEG3-nalbufiña, 6-O-mPEG6-nalbufina, no tiene ningún efecto sobre el receptor opioide delta.
CUADRO 2 Conjugados de PEG-nalbufina retienen ias propiedades farmacológicas in vitro de nabufina de origen EJEMPLO 9 Permeabilidad in Vitro La permeabilidad in vitro de conjugados de PEG-nalbufina se mide mediante un ensayo de transporte bi-direccional en células Caco-2. Conjugados de PEG-nalbufina se añaden a una concentración de 10 µ? ya sea el compartimiento apical o basolateral de las monocapas Caco-2 y se incuban durante dos horas. Al final de la incubación, las concentraciones en los compartimentos apicales y basolaterales se miden mediante LC-MS. La permeabilidad se calcula como Papp = J/A.Co, donde Papp es la permeabilidad aparente en cm/s, J es el flujo en moles/s, A es el área superficial del inserto en cm2 y Co es la concentración inicial en moles/cm3.
Figura 2A muestra la permeabilidad in vitro aparente de conjugados de PEG-nalbufina medida en células Caco-2 en la dirección A-B (apical-basolateral) y B-A (basolateral-apical). La permeabilidad de A-B, y en menor medida, disminuye la permeabilidad de B-A con longitud de cadena de PEG incrementada. La permeabilidad de A-B, que representa transporte mucosal-serosal in vivo es mayor que 1 *1 O*6 cm/s para todos los compuestos, indicando que la nalbufina y conjugados de PEG-nalbufina son probable que se absorban bien por vía oral.
Figura 2B muestra la relación de eflujo de conjugados de PEG-nalbufina, calculada como una relación de permeabilidades B-A/A-B. Una relación de eflujo mayor que la unidad es una reflexión de una asimetría en el transporte en las direcciones apical-basolateral y sugiere un papel para los transportadores en la permeabilidad completa. La relación de eflujo para la nalbufina de origen está cerca de la unidad, lo que indica qué no es un sustrato probable para los transportadores. Sin embargo, 6-0-mPEG5-nalbufina, 6-O-mPEG6-nalbufina, 6-0-MPEG7-nalbufina, 6-0-mPEG8-nalbufina, y 6-0-mPEG9-nalbufina tienen una relación de eflujo superior a 3, y por lo tanto son sustratos probables para los transportadores de eflujo en células Caco-2.
EJEMPLO 10 Penetración de cerebro in vivo de conjugados de PEG-nalbufina La capacidad de los conjugados de PEG-nalbufina para cruzar la barrera del cerebro sanguínea (BBB) y entrar en el sistema nervioso central se mide utilizando la relación cerebro:plasmá en ratas. En pocas palabras, las ratas fueron inyectadas por vía intravenosa con 25 mg/kg de nalbufina, conjugado de PEG-nalbufina o atenolol. Una hora después de la inyección, los animales fueron sacrificados y el plasma y el cerebro se recogieron y se congelan inmediatamente. Después de las extracciones de tejido y plasma, concentraciones de los compuestos en el cerebro y plasma fueron medidos usando LC-MS/MS. La relación cerebro: plasma se calcula como la relación de concentraciones medidas en el cerebro y plasma. Atenolol, que no cruza la BBB se utiliza como una medida de la contaminación vascular del tejido cerebral.
Figura 3 muestra la relación de las concentraciones cerebro: plasma de los conjugados de PEG-nalbufina. La relación cerebro: plasma de la nalbufina es 2.86:1 , que indica una concentración de cerca de 3 veces mayor de nalbufina en el cerebro en comparación con el compartimiento del plasma. Conjugación de PEG reduce significativamente la entrada de la nalbufina en el CNS como se demuestra por una relación de cerebro: plasma inferior de los conjugados de PEG-nalbufina. Conjugación con 3 unidades PEG reduce la relación cerebro:plasma a 0.23:1 , que indica que la concentración de 6-0-mPEG3-nalbufina en el cerebro es aproximadamente cuatro veces menor que en el plasma. 6-0-mPEG6-nalbufina y 6-0-mPEG9-nalbufina se excluyen de manera significativa del CNS, ya que sus relaciones cerebro: plasma no son significativamente diferentes del marcados vascular, atenolol.
EJEMPLO 11 Preparación de conjugados de oligómero-fentanilo Conjugados de mPEGn-O-fentanilo pueden ser preparados siguiendo los criterios de forma esquemática mostrados a continuación. Las técnicas sintéticas orgánicas convencionales son utilizadas en llevar a cabo los métodos sintéticos.
Un método ejemplar para la preparación de las siguientes estructuras, donde el oligómero PEG se coloca, es decir, unido de forma covalente, en el grupo N-(1-(2-feniletil) piperidin-4-il)fenilo: [en donde mPEGn es -(CH2CH20)n y n es un numero entero de 1 a 9], se provee posteriormente.
ESQUEMA 11 -A En el enfoque anterior, el material de inicio es un (haloetil)hidroxibenceno, donde el grupo hidroxilo forma el punto de unión para el oligómero PEG. El (haloetil)hidroxibenceno, es decir, (bromoetil)hidroxibenceno, se hace reaccionar con un oligómero mPEG activado halogenado o mesilado, con lo cual se forma el intermedio (haloetil)benceno modificado con PEG-oligómero deseado. Este intermedio se hace reaccionar con piperidin-4-ona en la presencia de un catalizador de transferencia de fase, el grupo bromo reacciona en el nitrógeno de piperidina-4-una para formar un próximo intermedio, L-(mPEG0i¡g-feniletil)piperidina-4-ona. La funcionalidad de cetona se reduce en presencia de un agente de reducción tal como borohidruro de sodio, y se convierte en un grupo amino, es decir, N-fenil-piperidin-4-amina, por reacción con anilina. Finalmente, el grupo amino secundario se convierte en una amina terciaria por la reacción con cloruro de propionilo para formar el producto deseado, como se indica en el esquema anterior.
Los conjugados de mPEGn-O-fentanilo que tienen el oligómero PEG situado en el grupo N-(1-(2-feniletil)piperidin-4-il)fenilo se sintetizan mediante un esquema de reacción que fue ligeramente modificado del esquema 1 1 -A anterior como se ilustra en el Esquema 1 1-B a continuación: ESQUEMA 11 -B enfoque anterior emplea grupo saliente tosilo toluenosulfonato) en varias etapas en la síntesis. Los conjugados de PEG-oligómero deseados (n = I a 9) se montan por la reacción de 3-(2-hidroxietil)-fenol di-tosilado con N-fenil-N-(piperidin-4-il)propionamida para formar N-(1-(3-h¡droxifeniletil)piperidin-4-il)-N-fenilpropionamida, en forma tosilada, seguido por la eliminación del grupo tosilo. El grupo PEG-oligómero después se introduce en las moléculas en la posición de fenil hidroxilo por la reacción de N-(1-(3-hidroxifeniletil)piperidin-4-il)-N-fenilpropionamida con un exceso molar de mPEGoiig-tosilato para formar los conjugados de mPEGn-0-fentanilo deseado. Las relaciones de los reactivos y las condiciones de reacción empleados generalmente se proporcionan en el esquema de reacción anterior.
Un método ejemplar para proporcionar las siguientes estructuras, donde el oligómero PEG se coloca, es decir, unido de forma covalente, en el grupo N-fenilo, se expone a continuación: ESQUEMA 11 -C El enfoque anterior ejemplar para la formación de un conjugado de mPEGn-O-fentanilo que tiene el oligómero PEG colocado en el anillo N-fenilo comienza con, por ejemplo, 2-bromoetilbenceno, como el material de inicio. El 2-bromoetilbenceno se hace reaccionar con piperidin-4-ona en la presencia de un catalizador de transferencia de fase para formar el 1-fenetilpiperidín-4-ona resultante. El 1-fenetilpiperidin-4-ona está acoplada a anilina mPEG0i¡g-sustituidos, que se prepara al tomar hidroxianilina N-protegida y haciendo reaccionar con oligómero mPEG activado, tal como bromometoxiPEGoiig, o mesilato de mPEG0i¡g0, seguido de la eliminación del grupo protector (véase la etapa (b) anterior). Como se indica en la etapa de reacción (c) anterior, 1-fenetilpiperidin-4-ona se hace reaccionar con anilina mPEGoiig-sustituida en presencia de un agente reductor para convertir el grupo ceto en una amina para formar el intermedio, 1 -feniletilpiperidin-4-ilamino-mPEGoiigobenceno. Finalmente, el grupo amino secundario se convierte en una amina terciaria, por reacción con cloruro de propionilo para formar el producto deseado como se indica en el esquema anterior.
Los conjugados de mPEGn-0'-fentanilo objetivo que tienen el oligómero PEG colocado en el grupo N-fenilo se sintetizan utilizando un esquema de reacción que se ha modificado ligeramente del esquema 11-C anteriormente como se ilustra en el Esquema 1-D a continuación: ESQUEMA 11-D Como se indica en el Esquema 11-D anterior, los conjugados de mPEGn-O-fentanilo deseados se preparan primero al hacer reaccionar 1-fenetilpiperidin-4-ona con 3-aminofenol bajo condiciones de reducción para convertir la funcionalidad ceto en amina, es decir, por reacción con el grupo amino de 3-aminofenol. El producto, 3-(1-fenetilpiperidin-4-ilamino) fenol, se hizo reaccionar entonces con anhídrido propiónico en presencia de una base (por ejemplo, trietilamina) y dimetilaminopiridina (DMAP) bajo condiciones efectivas para formar N-(3-hidroxifenil)-N-(1-fenetilpiperidin-4-il)propionamida. Por último, la introducción de la funcionalidad PEG oligomérica se lleva a cabo haciendo reaccionar el precursor, N-(3-hidroxifen¡l)-N-(1-fenetilpiperidin-4-il)propionamida, con un exceso molar de mPEG0i¡g0tosilato bajo condiciones de acoplamiento efectivas para formar los conjugados deseados. Las relaciones de los reactivos y las condiciones de reacción empleadas generalmente proporcionan en los esquemas de reacción anteriores.
EJEMPLO 11A Preparación de conjugados de m-mPEGn-O-fentanilo Síntesis de conjugado de m-mPEGi-O-fentanilo (n=1): Usando un método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O-fentanilo (n=2): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O-fentanilo (n=3): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O-fentanilo (n=4): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y" como se describe esquemáticamente en el esquema 11-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEG5-Q-fentanilo (n=5): Usando un método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEGe-O-fentanilo (n=6): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEG7-Q-fentanilo (n=7): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEG^-O-fentanilo (n=7): Usando un método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEG8-Q-fentanilo (n=8): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-B, el conjugado anterior se prepara.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O-fentanilo (n=9): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-B, el conjugado anterior se prepara.
Cada uno de los conjugados de mPEG-i-g-O-fentanilo se caracteriza por 1 H NMR (200 MHz Bruker) y por LC/MS.
EJEMPLO 12 Preparación de conjugados de m-mPEGn-O'-fentanilo Síntesis de conjugado de m-mPEGi-O'-fentanilo (n=1): Usando un método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-D, el conjugado anterior se prepara. En estas series, el mPEG oligomérico se une de manera covalente en la posición meta del grupo N-fenilo.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O'-fentanilo (n=2): El conjugado antenor se prepara usando el método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-D.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O'-fentanilo (n=3): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-D.
Síntesis de conjugado de m-mPEGd-O'-fentanilo (n=4): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-D.
Síntesis de conjugado de m-mPEGs-O'-fentanilo (n=5): El conjugado anterior se prepara Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O'-fentanilo (n=6): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1-D.
Síntesis de conjugado de m-mPEG7-Q'-fentan¡lo (n=7): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 -D.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O'-fentanilo (n=8): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto en el ejemplo 1 1 y como se describe esquemáticamente en el esquema 1 1 -D.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O'-fentanilo (n=8): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11-D.
Síntesis de conjugado de m-mPEGg-O'-fentanilo (n=9): El conjugado anterior se prepara usando el método expuesto en el ejemplo 11 y como se describe esquemáticamente en el esquema 11 -D.
Cada uno de los conjugados de mPEGi.g-O'-fentanilo se caracteriza por 1 H NMR (200 MHz Bruker) y por LC/MS.
EJEMPLO 13 Preparación de conjugados de para-mPEGn-O'-fentanilo Síntesis de conjugado de p-mPEGi-O'-fentanilo (n=1): El conjugado anterior se puede preparar usando el método expuesto en el ejemplo 11. En estas series, el mPEG oligomérico se une de manera covalente en la posición para del grupo N-fenilo.
Síntesis de conjugado de p-mPEGj-O'-fentanilo (n=4) El conjugado para-sustituido se prepara de acuerdó con el esquema de reacción mostrado posteriormente: Cromatografía en gel de sílice Cromatografía SG para remover algunas/no todas las impurezas Mezcla rolo oscuro-morado (conforme avanza el liempo) El conjugado de pPEG4-0-fentan¡lo deseado se prepara al primero hacer reaccionar 1-fenetilpiperidin-4-ona con 4-aminofenol bajo condiciones de reducción (por ejemplo, en la presencia de un agente reductor tal como NaBH(OAc)3) para con lo cual convertir la funcionalidad ceto en una amina, es decir, por reacción con el grupo amino de 4-aminofenol. El producto, 4-(1-fenetilpiperidin-4-ilamino)fenol, se hace reaccionar entonces con anhídrido propiónico en la presencia de base (por ejemplo, trietilamina) y dimetil-aminopiridina (DMAP) bajo condiciones efectivas para formar N-(4-hidroxifenil)-N-(1-fenetilpiperidin-4-il)propionamida. Por último, la introducción de la funcionalidad PEG oligomérica se lleva a cabo haciendo reaccionar el precursor, N-(4-hidroxifenil)-N-(1-fenetilpiperidin-4-il)propionamida, con un mPEG4tosilato bajo condiciones de acoplamiento efectivas para formar el conjugado deseado. Las relaciones de los reactivos y las condiciones de reacción empleadas generalmente se proporcionan en el esquema de reacción anterior.
Conjugados de pPEGoligo-O-fentanilo adicionales pueden prepararse de forma similar.
EJEMPLO 14 Preparación de HiPEGn-OMS (mPEGn-O-mesilato) para uso en los ejemplos 15. 16 v 17 En un frasco de vidrio de 40 mi se mezcla HO-CH2CH2OCH2CH2-OH (1.2 mi, 10 mmol) y DIEA (N.N-diisopropiletilamina, 5.2 mi, 30 mmol, 3 eq), la mezcla incolora resultante homogénea se enfría a 0°C y MsCI (1.55 mi, 20 mmol, 2 eq) se añade mediante una jeringa lentamente, durante 4 minutos, con agitación vigorosa. Una mezcla bifásica resultado después de la adición: sólido de color amarillo en la parte inferior y sobrenadante claro. El baño de hielo se retira y la reacción se deja calentar a temperatura ambiente durante la noche. En este punto, se disuelve en agua, se extrae con CHCI3 (3x50 mi), se lava con HCI 0.1 M/mezcla de salmuera 2x50 mi, seguido por 50 mL de salmuera. La capa orgánica se seca sobre MgS0 l se filtra para dar una solución de color amarillo y se evapora para dar aceite marrón (2.14 g). H RMN confirma la identidad del producto 3.3 (1H RMN d 3.1 (s, 3H), 3.3 (s, 3H), 3.5-3.55 (m, 2H), 3.6-3.65 (m, 2H), 3.7-3.75 (m, 2H), 4.3-4.35 (m, 2H) ppm).
Todos los demás PEGn-OMs's (n = 3, 4, 5, 6, 7 y 9) se hacen de manera similar y compuestos finales producidos en cada caso, se aislan como como aceites de color marrón. Datos de espectros de masa y NMR de protón (no mostrados) confirman la formación de productos OMs PEgilados deseados.
EJEMPLO 15 Preparación de conjugados de mPEGn-O-morfolina A continuación se describe la preparación de base libre usando hidrato de sulfato de morfina disponible comercialmente (procedimiento general).
Sulfato de morfina USP de espectro (510 mg) se disuelve en agua (70 mi). La solución después se basifica a pH 10 usando K2CO3 acuoso para dar una suspensión blanca. A la suspensión blanca DCM (diclorometano, 50 mi) se añade, pero no para disolver el sólido. La mezcla se hace ácida con HCI 1 M para dar lugar a una solución bifásica clara. La fase orgánica se separó y la fase acuosa se lleva con cuidado a un pH de 9.30 (monitoreado por un medidor de pH) utilizando la misma solución de K2C03 como el anterior. Una suspensión de color blanco resulta de nuevo. La mezcla heterogénea se extrajo con DCM (5x25 mi) y un sólido blanco insoluble contaminado tanto las capas orgánicas y acuosas. La capa orgánica se seca con MgS04, se filtra y se evapora rotatoriamente para obtener 160 mg de morfina libre (56% de recuperación). Ningún producto adicional se recupera de la torta del filtro usando MeOH, pero otros 100 mg se recuperan de la fase acuosa por la extracción de 2x50 mi con EtOAc para dar un rendimiento combinado de 260 mg (68%).
Protección del MEM de la base libre de morfina El enfoque general para la protección de la base libre de morfina con el grupo protector ß-metoxietoximetil éster ("MEM") es esquemáticamente mostrado a continuación.
Morfina base libre (160 mg, 0.56 mmol) se disuelve en 20 mi de acetona/tolueno (mezcla 2/1). A la solución resultante se añade K2C03 (209 mg, 1.51 mmol, 2.7 eq), seguido por MEMCI (96 µ?, 0.84 mmol, 1.5 eq) y la mezcla heterogénea resultante se agita durante una noche a temperatura ambiente. Después de cinco horas a temperatura ambiente, la reacción se considera completa por LC-MS. El tiempo de retención de base libre de morfina bajo condiciones de corrida de gradiente por seis minutos estándar (columna std 6 min, Onyx Monolyth C18, 50x4.6 mm; 0 a 100% de acetonitrilo 0.1% de TFA en agua 0.1 % de TFA, 1.5 ml/min, detección: UV254 , ELSD, MS, los tiempos de retención son citados para detector UV254, ELSD tiene alrededor de 0.09 minutos de retraso y MS tiene alrededor de 0.04 minutos de retraso respecto a los rayos UV) es de 1.09 min; tiempo de retención para el producto 1.54 min (std 6 min), las impurezas principales 1.79 min. La mezcla de reacción se evapora a sequedad, se disuelve en agua, se extrae con EtOAc (3x, capa orgánica combinada lavada con salmuera, se seca sobre MgS04, se filtra y se evapora rotatoriamente) para dar 160 mg (77%) del producto deseado como un aceite incoloro. La pureza del producto se estima en alrededor de 80% en UV254.
Protección MEM directa de sulfato de morfina (procedimiento general) El enfoque general para la protección de sulfato de morfina con el grupo protector ß-metoxietoximetil éster ("MEM") se muestra esquemáticamente a continuación. Aunque no se muestra explícitamente en el esquema siguiente, la morfina es actualmente hidrato de sulfato de morfina, morfine.0.5 H2S04.2.5 H20.
A una suspensión de 103 mg de hidrato de sulfato de morfina (0.26 mmol) en 10 mi de mezcla de solvente acetona:tolueno 2:1 se añaden 135 mg (1 mmol, 3.7 eq) de K2CO3 y la suspensión se agita a temperatura ambiente durante 25 minutos. A la suspensión resultante se añade 60 µ? (0.52 mmol) de MEMCI y la mezcla se deja reaccionar a temperatura ambiente. Se muestra después de una hora (38% de conversión nominal, picos adicionales en 1.69 minutos y 2.28 minutos), tres horas (40% de conversión nominal, pico adicional a 1.72 min (M + 1 = 493.2)), cuatro y media horas (56 de conversión nominal, pico adicional en 1.73 minutos), y veintitrés horas (> 99% de conversión nominal, pico adicional en 1.79 min - alrededor del 23% del pico del producto por la altura en UV25 ), a partir de entonces, la reacción se templa con MeOH, se evapora, se extrae con EtOAc para dar 160 mg de aceite claro.
La misma reacción se repite a partir de 2 g (5.3 mmol) de hidrato de sulfato de morfina, 2.2 g (16 mmol, 3 eq) de K2C03, 1.2 mi (10.5 mmol, 2 eq) de MEMCI en 100 mi de mezcla de solvente. El muestreo se produce después de dos horas (61% de conversión nominal, el pico extra en 1.72 minutos (M+1 = 492.8)), después de un día (80% de conversión nominal, el pico extra en 1.73 minutos), después de tres días (85% de conversión nominal, sólo pequeñas impurezas, 12 min de corrida de gradiente), y después de seis días (91 % de conversión), por lo tanto, la reacción se templa, se evapora, se extrae con EtOAc, se purifica en combi-instantáneo utilizando una columna de 40 g, DCM: MeOH 0 a 30% de fase móvil. Tres picos (en lugar de dos) fueron identificados, en donde el pico medio se colecta, 1.15 g (58% de rendimiento) de aceite de color amarillo claro, pureza UV254 de aproximadamente 87%.
Conjugación de morfina MEM-protegida para proporcionar un conjugado de morfina MEM-proteqida El enfoque general para conjugar morfina MEM-protegida con un oligómero soluble en agua para proporcionar un conjugado de PEG-oligómero de morfina MEM-protegida es esquemáticamente mostrado posteriormente.
A una solución de tolueno/DMF (2:1 mezcla, 0 volúmenes en total) se carga base libre de MEM-morfina por NaH (4-6 eq) y luego PEGnOMs (1 .2-1.4 eq.), se preparado con anterioridad. La mezcla de reacción se calienta a 55-75°C y se agita hasta que la terminación de la reacción se confirma por análisis LC-MS (12-40 horas dependiendo de la longitud de la cadena PEG). La mezcla de reacción se templa con metanol (5 volúmenes) y la mezcla de reacción se evapora a sequedad in vacuo. El residuo se re-disuelve en metanol (3 volúmenes) y se realiza la cromatografía usando un sistema de Combiflash (0-40% de MeOH/DCM). Las fracciones que contienen grandes cantidades de producto se colectan, se combinan y se evaporan a sequedad. Este material se purifica por RP-HPLC para dar los productos como el amarillo para los aceites de naranja.
Desprotección de conjugado de morfina EM-proteqida para proporcionar un conjugado de morfina El enfoque general para desproteger un conjugado de morfina MEM-protegida para proporcionar un conjugado de morfina se muestra esquemáticamente a continuación.
A una solución de sal TFA de conjugado de MEM-protegido suspendida en DCM (8 volúmenes) se carga de seis volúmenes de HCI 2M en éter dietílico. La mezcla de reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante dos horas y después se evapora a sequedad bajo presión reducida. El residuo aceitoso se disuelve en MeOH (8 volúmenes), se filtra a través de lana de vidrio y luego se evapora bajo presión reducida para dar aceite naranja a amarillo grueso en un rendimiento cuantitativo. Compuestos hechos por este método incluyen: a-6-mPEG3-0-morfina (compuesto A, n = 3) 217 mg de sal HCl con 97% de pureza (95% por UV254; 98% por ELSD) cc-6-MPEG4-0-morfina (Compuesto A, n = 4) 275 mg de sal HCl con 98% de pureza (97% en UV254, 98% por ELSD) a-6-mPEG5-0-morfina (compuesto A, n = 5) 1 77 mg de sal HCl con 95% de pureza (93% en UV254, 98% por ELSD) a-6-mPEG6-O-morfina (compuesto A, n = 6) 310 mg de sal HCl con 98% de pureza (98% en UV254; 99% por ELSD); a-6-mPEG7-0^morfina (compuesto A, n=7) 541 mg de sal HCl con 96% de pureza (93% por UV254, 99% por ELSD), y a-6-mPEG-Og-morfina (Compuesto A, n = 9) 466 mg de sal HCl con 98% de pureza (97% por UV254, 99% por ELSD). Además, conjugados de morfina que tienen un monómero PEG único adjunto, a-6-mPEGi-0-morfina (compuesto A, n = 1 ), 124 mg de sal HCl, 97% de pureza (95% de pureza por UV254, 98% por ELSD), así como ot-6-mPEG2-0-morfina (Compuesto A, n = 2), 485 mg de sal HCl, 97% de pureza (95% de pureza por UV254, 98% por ELSD) se preparan de manera similar.
EJEMPLO 16 Preparación de conjugados de mPEGn-O-codeína El enfoque general para conjugar codeína con un éster de sulfonato activado de un oligómero soluble en agua (usando IT1PEG3OMS como un oligómero representativo) para proporcionar un conjugado de codeína se muestra esquemáticamente a continuación.
Codeína (30 mg, 0.1 mmol) se disuelve en una mezcla de solvente tolueno/DMF (75:1) seguido por la adición de HO-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OMS (44 mi, 2 eq) y NaH (60% de suspensión en aceite mineral, 24 mg, 6 eq). La solución resultante de color amarillo homogénea se calienta a 45°C. Después de una hora, la reacción muestra 1 1% de conversión (pico extra en 2.71 min, 12 min de corrida), después de dieciocho horas, la reacción muestra un 7% de conversión (pico extra en 3.30 min, 12 min de corrida), y después de 24 horas, el reacción muestra 24% de conversión (cantidad de picos extras, dos más altos son 1.11 min y 2.79 min). En este punto, 16 mg adicionales de NaH se añaden y el calentamiento continúa durante seis horas, después de lo cual, 16 mg adicionales de NaH se añaden seguido por un calentamiento continuado de más de sesenta y seis horas. Por lo tanto, no queda material de inicio, y el análisis revela muchos picos extra, los dos más altos corresponden a 2.79 min y 3 min (pico de producto es el segundo más alto entre al menos 7 picos).
Esta síntesis se repite utilizando una escala 10x en donde 30 mi de la mezcla de solvente se utiliza. Después de dieciocho horas, el análisis revela 71 % de conversión nominal con picos adicionales en la UV (un pico alto en 3.17 min y muchos pequeños, en donde el pico deseado corresponde a 3.43 minutos en UV). Por lo tanto, 80 mg (2 mmol) de NaH se añade seguido por calentamiento continuado. Después de tres horas, los análisis revelan 85% de conversión nominal (varios picos extra, principal 3.17 min). Mezcla de reacción se diluye con agua, se extrae con EtOAc (3x, capa orgánica combinada se lava con salmuera, se seca sobre MgS04, se filtra y se evapora rotatoriamente) para obtener aceite amarillo (no sm en LC-MS, 90% puro por ELSD, 50% puro por impureza principal con UV en 3.2 min). El producto crudo se disuelve en DCM, se aplica a un pequeño cartucho lleno con S¡02 de malla 230-400, se seca, se eluye en una vía Combi-instantánea a través de un cartucho de columna pre-empacada 4g con el solvente A = DCM y solvente B = MeOH, gradiente 0 a 30% de B. Análisis revela dos picos de simetría pobre: un pequeño pico principal y un pico más grande, con una cola. LC-MS se utiliza para analizar fracciones, en donde ninguno se identifica como que contiene el producto puro. Fracciones combinadas que contienen cualquier producto (tt # 22-30) produce, después de la evaporación del solvente, 150 mg (34% de rendimiento) del producto impuro (pureza con LC-MS en 3.35 minutos en UV254, en donde aproximadamente 25% representa las principales impurezas 3.11 min, 3.92 min, 4.32, 5.61 minutos de una corrida de 12 min). Una segunda purificación por HPLC (solvente A = agua, 0.1% de TFA, solvente B = acetonitrilo, 0.1% de TFA) que emplea un gradiente que corresponde a 15-60% de B, 70 min, 10 ml/min) resulta en la separación pobre de los picos adyacentes. Sólo dos fracciones se limpian lo suficiente y proporcionan 21 mg de sal TFA (> 95% puro, 4.7% de rendimiento). Tres fracciones adicionales antes y después de que las fracciones que contienen el producto deseado (para un total de seis fracciones adicionales se combinan para proporcionar 70 mg de producto aproximadamente 50% de producto puro como las sales TFA.
Usando este mismo método, otros conjugados difieren en el número de unidades de óxido de etileno (n = 4, 5, 6, 7 y 9) se realizan usando estas condiciones de NaH descritas anteriormente.
Conversión de sales de TFA de conjugado de codeína-oligomero a sales HCI de codeina-oliqómero El método general para convertir sales TFA de codeína-oligómero a sales HCI de codeína-oligómero se muestran esquemáticamente posteriormente.
A una solución de sal de TFA de conjugado de codeína-oligómero suspendido en DCM (8 volúmenes) se carga 6 volúmenes de HCI 2M en éter dietílico. La mezcla de reacción se deja agitar a temperatura ambiente durante dos horas y después se evapora a sequedad bajo presión reducida. El residuo aceitoso se disuelve en MéOH (8 volúmenes), se filtra a través de lana de vidrio y luego se evapora bajo presión reducida para dar un aceite naranja a amarillo grueso en rendimiento cuantitativo. Siguiendo este procedimiento general, los siguientes compuestos se sintetizan: a-6-mPEG3-O-codeína (compuesto B, n = 3) 235 mg de sal HCI, 98% de pureza, cc-6-mPEG4-0-codeina (Compuesto B, n = 4) 524 mg de sal HCI, 98% de pureza; a-6-mPEGs-O-codeina (compuesto B, n= 5) 185 mg de sal HCI, 98% de pureza + 119 mg de sal HCI 97% de pureza, a-6-mPEG6-0-codeína (compuesto B, n= 6) 214 mg de sal HCI, 97% de pureza, a-6-mPEG7-0-codeína (compuesto B, n= 7) 182 mg de sal HCI, 98% de pureza; a-6-mPEGg-O-codeína (compuesto B, n= 9) 221 mg de sal HCI, 97% de pureza; a-6-mPEGi-O-codeína (Compuesto B, n= 1) 63 mg de sal Hcl, 90% de pureza, y ct-6-mPEG2-0-codeína (compuesto B, n= 2) 178 mg de sal HCI, 90% de pureza.
EJEMPLO 17 Preparación de conjugados de mPEGn-Q-hidroxicodona El enfoque general para conjugar hidroxicodona con un éster activado sulfonato de un oligómero soluble en agua (mediante "mPÉGnOMs" como un representante oligómero) para proporcionar un conjugado hidroxicodona esquemáticamente se muestra a continuación.
Compuesto C Reducción de oxicodona a a-6-hidroxicodona: A una solución de base libre oxicodona en THF seco bajo nitrógeno enfriado a -20°C, se agregó una solución 1.0 M THF de potasio tri-sec-butilborohidruro durante 15 minutos. La solución fue removida a -20°C en nitrógeno durante 1.5 horas y después agua (10 mL) se agregó lentamente. La mezcla de reacción se agita otros 10 minutos a -20°C y entonces se permitió calentar a temperatura ambiente. Se eliminaron todos los solventes bajo presión reducida y CH2CI2 se agregó al residuo restante. La fase de CH2CI2 fue extraída con una solución de agua HCI/NaCI 0.1 N y los extractos de solución HCI 0.1 N combinados fueron lavados con CH2CI2 y, a continuación, Na2C03 se agregó para ajustar el pH = 8. La solución fue extraída con CH2CI2. Los extractos de CH2CI2 se secan con Na2S04 anhidro. Después de quitar el solvente bajo presión reducida, se obtuvo la deseada a-6-HO-3-hidroxicodona.
Conjugación de mPEGnOMs a a-6-hidroxicodone: A una solución de tolueno/DMF (mezcla 2:1 , 10 volúmenes totales) fue cargada hidroxicodona (preparada como se expone en el párrafo anterior) seguido por NaH (4 eq) y, a continuación, mPEGnOMs (1.3 e.). La mezcla de reacción se calienta a 60-80°C y se agita hasta la finalización de la reacción fue confirmada por análisis de LC-MS (12-40 horas dependiendo de la longitud de la cadena de PEG). La mezcla de reacción se templa con metanol (5 volúmenes) y la mezcla de reacción se evaporó a sequedad en vacío. El residuo se re-disolvió en metanol (3 volúmenes) y fue cromatografiado mediante Combiflash (0-40% MeOH/DCM). Las fracciones que contienen grandes cantidades de producto fueron recogidas, combinadas y evaporadas a sequedad. Este material fue purificado luego por RP-HPLC para proporcionar los productos finales como aceites de color amarillo a naranja.
Conversión de sales de TFA conjugadas de hidroxicodona a sales conjugadas de HCI de hidroxicodona A una solución de sal TFA conjugado de hidroxicodona suspendida en DCM (8 volúmenes) fueron cargados 6 volúmenes de HCI 2M en éter dietílico. La mezcla de reacción se permitió remover a temperatura ambiente durante dos horas y luego se evaporó a sequedad bajo presión reducida. El residuo oleoso fue disuelto en MeOH (8 volúmenes), filtrado a través de lana de vidrio y luego se evaporó bajo presión reducida para dar un aceite espeso de naranja a amarillo con rendimiento cuantitativo. Después de este procedimiento general, se sintetizaron los compuestos siguientes: a-6-mPEG3-0-oxicodona (aka a-6-mPEG3-0-hidroxicodona) (compuesto C, n = 3) 242 mg de sal HCI, 96 por ciento de pureza; a-6-mPEG4-0-ox¡codona (aka a-6-mPEG4-0-hidroxicodona) (compuesto C, n = 4) 776 mg de sal HCI, 94 por ciento de pureza; a-6-mPEG5-0-oxicodona (aka a-6-mPEG5-0-hidroxicodona) (compuesto C, n = 5) 172 mg de sal HCI, 93 por ciento de pureza; a-6-mPEG6-0-oxicodona (aka a-6-mPEG6-0-hidroxicodona) (compuesto C, n = 6) 557 mg de sal HCI, 98% de pureza; a-6-mPEG7-0-oxicodona (aka a-6-mPEG7-0-hidroxicodona) (compuesto C, n = 7) 695 mg de sal HCI, 94 por ciento de pureza; y a-6-mPEG9-0-oxicodona (aka a-6-mPEGg-O-hidroxicodona) (compuesto C, n = 9) 435 mg de HCI sal 95 por ciento de pureza. Los compuestos siguientes, a-6-mPEG-i-O-oxicodona (aka a-6-mPEGrO-hidroxicodona) (compuesto C, n = 1 ) 431 mg de sal HCI 99% puro; y a-6-mPEG2-0-ox¡codona (aka a-6-mPEG2-O-hidroxicodona) (compuesto C, n = 2) 454 mg de sal HCI, 98% de pureza, asimismo se prepararon.
EJEMPLO 18 Ensayo analgésico in Vivo: retorcida de fenilquinona Un ensayo analgésico se utilizó para determinar si los conjugados de PEG-oligómero-opioide ejemplares pertenecientes a la siguiente serie de conjugado: mPEG2-7,9-0-morfina, mPEG3-7,9-0-codeína y mPEGi^.ej.g-O-hidroxicodona, son eficaces para reducir y/o prevenir el dolor visceral en ratones.
El ensayo utiliza ratones machos CD-1 (5-8 ratones por grupo), cada ratón siendo aproximadamente 0.020-0.030 kg en el día de estudio. Ratones fueron tratados según protocolos estándar. Ratones recibieron una sola dosis de "pre-tratamiento" de un compuesto carecen de fijación covalente de un oligómero soluble en agua, no peptídico (es decir, molécula de origen modificada con in-PEG oligómero), una versión correspondiente que comprende el compuesto covalentemente a un oligómero no peptídico, soluble en agua (es decir, el conjugado) o solución de control (IV, SC, IP u oralmente) treinta minutos antes a la administración de la solución fenilquinona (PQ). Cada animal recibió una inyección IP de un irritante (fenilquinona (PQ) que induce "retorcimiento" que puede incluir: contracciones del abdomen, retorcimiento y girando el tronco, arqueado de la espalda y la extensión de los miembros traseros. Cada animal recibió una inyección IP de PQ (1 mg/kg PQ, 0.1 mL/10 g de peso corporal). Después de la inyección, los animales fueron devueltos a su gabinete de observación y su comportamiento se observó. Contracciones fueron contadas entre 35 y 45 minutos después del 'pre-tratamiento'. Los animales fueron usados una vez. Cada artículo probado fue dosificado en un intervalo entre 0.1 y 100 mg/kg (n = 5-10 animales/dosis).
Los resultados se muestran en la figura 4 (mPEG2-7,9-0-morfina y control), figura 5 (mPEGi^e .g-O-hidroxicodona y control) y figura 6 (mPEG3- 7,9-O-codeína y control). Valores ED50 se muestran en los cuadros 3A y 3B a continuación.
CUADRO 3A Valores EDsn para series mPEGn-O-Morfina CUADRO 3B Valores EDSo para serie mPEGn-O-hidroxicodona EJEMPLO 19 Ensayo analgésico in Vivo: ensayo de latericia de placa caliente Ensayo analgésico de latencia de placa caliente se utilizó para determinar si los conjugados de agonista PEG-oligómero-opioide pertenecientes a las siguientes series conjugadas: mPEGvs-O-morfina, mPEG-i-5-O-hidroxicodona y mPEG2-5 9-0-codeína, son eficaces para reducir y/o prevenir el dolor visceral en ratones.
El ensayo utiliza ratones machos CD-1 (10 ratones por grupo), cada ratón teniendo aproximadamente 0.028-0.031 kg en el día de estudio. Ratones fueron tratados según protocolos estándar. Ratones recibieron una sola dosis de "pre-tratamiento" de un compuesto que carece de fijación covalente de un oligómero soluble en agua, no peptídico (molécula de origen sin modificar), una versión correspondiente que comprende el compuesto covalentemente unido a un oligómero soluble en agua, no peptídico (es decir, el conjugado), o solución control (SC) treinta minutos antes de la prueba de placa caliente. La temperatura de la placa caliente se fijó en 55 ± 1 °C, calibrado con un termómetro de superficie antes del comienzo del experimento. Treinta minutos después del "pre-tratamiento", cada ratón fue colocado sobre la placa caliente y latencia para lamer una pata trasera se registró al 0.1 segundo más cercano. Si no se ha producido ningún lamido dentro de 30 segundos, se quitó el ratón. Inmediatamente después de la prueba de la placa caliente, una sonda de temperatura fue insertada 17 mm en el recto y la temperatura corporal fue leída al 0.1 °C más cercano cuando el medidor se estabiliza (aproximadamente 10 segundos). Los animales fueron usados una vez. Cada artículo probado fue dosificado en un rango entre 0.3 y 30 mg/kg (n = 5-10 animales/dosis).
Resultados se muestran en la figura 7 (serie hidroxicodona), figura 8 (serie de morfina) y figura 9 (codeína). Gráficas ilustran la latencia (tiempo para lamer la pata trasera, en segundos) versus dosis del compuesto administrado en mg/kg.
EJEMPLO 20 Farmacocinética de compuestos PEG0i¡ao-opioide por dosis intravenosa (IV) v Oral (PO) en ratas Sprague-Dawley macho - diseño de estudio Ciento setenta y cinco (175) ratas adultas macho Sprague- Dawley con catéteres de arteria vena yugular y carótida (JVC/CAC) (Charles River Labs, Hollister, CA) permanentes se utilizaron para el estudio. Hay 3 ratas/grupo. Todos los animales estuvieron en ayunas durante la noche. Antes de la dosificación se pesaron las ratas, las colas y las tarjetas de la jaula fueron etiquetadas para la identificación y calcularon las dosis. Anestesia fue inducida y mantenida con isoflurano 3.0-5.0%. El JVC y CAC fueron exteriorizados, lavaron con HEP/solución salina (10 lU/mL HEP /mi solución salina) se taparon y etiquetaron para identificar la vena yugular y arteria carótida. La muestra de predosis fue recogida de JVC. Cuando todos los animales se habían recuperado de la anestesia y se procesaron las muestras de predosis, los animales para el grupo intravenoso fueron dosificados, por vía intravenosa (IV) a través de la JVC utilizando una jeringa de 1 mL que contiene el artículo de prueba adecuado, el volumen muerto del catéter fue lavado con solución salina 0.9% para asegurar que los animales reciban la dosis correcta y anímales del grupo control fueron tratados oralmente a través de la sonda.
Después de una dosis única IV, muestras de sangre fueron recolectadas en 0 (pre-dosis recolectada como se describe anteriormente), 2, 10, 30, 60, 90, 120 y 240 minutos y tras la dosis oral, muestras de sangre fueron recogidas 0 (pre-dosis recogida como se describió anteriormente), 15, 30, 60, 120, 240 y 480 minutos a través del catéter en la arteria carótida y procesaron como se indica en el protocolo. Tras el último punto de colección, los animales fueron sacrificados.
Análisis bioanalítico de las muestras de plasma se realizaron mediante métodos de LC-MS/MS.
Análisis farmacocinéticos: análisis PK se realizó mediante WinNonlin (Versión 5.2, Mountain View, CA 94014). Concentraciones en plasma que estaban por debajo de LLOQ fueron sustituidas por ceros antes de generar los cuadros y análisis PK. Los siguientes parámetros PK se calcularon utilizando el perfil de tiempo-concentración plasmática de cada animal: Co Concentración extrapolada a tiempo "cero" Cm¡sx Concentración máxima (pico) AUCaii Área de en el tiempo-concentración desde cero hasta el tiempo del último valor de concentración Ti/2(z) vida media de eliminación terminal AUC¡nf Área bajo el tiempo-concentración desde cero hasta el tiempo infinito TmáX tiempo para alcanzar la concentración máxima o pico tras la administración CL evacuación de cuerpo total Vz volumen de distribución basada en fase terminal VSs volumen de distribución en estado estacionario MRTiast tiempo promedio de residencia de la última concentración observable F biodisponibilidad La biodisponibilidad oral se estima usando datos de AUCan normalizados con dosis promedio para los compuestos donde uno de los grupos IV o PO con solo datos informados para <n=3/grupo.
EJEMPLO 21 Farmacocinética IV y PO de conjugados de mPEGn-O-hidroxicodona Un estudio farmacocinético se llevó a cabo en ratas Sprague-Dawley como se describe en el ejemplo 20 anterior. Compuestos administrados fueron conjugados de mPEGn-0-hidroxicodona, donde = 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9, así como el compuesto de origen, oxicodona. El objetivo fue determinar la farmacocinética del compuesto de origen y sus diversos conjugados oligómero administración por vía intravenosa y oral.
Un resumen de los parámetros de plasma PK tras el suministro de IV (1 mg/kg) y PO (5 mg/kg) de oxicodona, mPEG0 oxicodona, mPEG-i-O-hidroxicodona, mPEG2-O-hidroxicodona, mPEG3-O-hidroxicodona, mPEG4-O-hidroxicodona, mPEG5-O-hidroxicodona, mPEG6-O-hidroxicodona, mPEG7-O- hidroxicodona y mPEGg-O-hidroxicodona, se muestran en los siguientes cuadros, cuadros 4 y 5.
Basado en los datos observados (cuadro 4) para administración IV, mPEGg-O-hidroxicodona parece lograr mayor concentración plasmática con un valor medio t 2 3 veces más que el correspondiente valor medio ti/2 correspondiente después de oxicodona de origen fue dado.
La figura 10 muestra los perfiles de concentración de plasma media-tiempo para compuestos mPEGn-O-hidroxicodona administrados IV como se describió anteriormente, así como de oxicodona per se, cuando se administra en una concentración de 1.0 mg/kg.
Basándose en los datos observados (cuadro 5) para administración oral, mPEGs-O-hidroxicodona, mPEG6-0-hidroxicodona y mPEG7-0-hidroxicodona parece lograr mayor exposición media (aproximadamente 3-8 veces) en el plasma en comparación con la molécula de origen, oxicodona.
Figura 11 muestra los perfiles de concentración de plasma media-tiempo para los compuestos mPEGn-0-hidroxicodona descritos anteriormente, así como de oxicodona, cuando se administran oralmente a ratas en una concentración de 5.0 mg/kg.
CUADRO 4 Parámetros de PK comparativo de conjugados de mPEGn-O-hidroxicodona por vía intravenosa dados a r (Media ± SO) PEG- Cmáx T,e(z) AUCal, AUCinf MRT|ast CL Vss longitud (ng/ml) mln (m(n. ng/ml) (mín. ng/ml) mín (ml/min/kg) (l/kg) 0 495±56.0 47.0±3.99 12800±1090 1300011070 37.011.28 77.1i6.26 3.1710.293 1 425+41.3 47.2+6.37 9890+1320 1010011440 38.714.54 100H3.4 4.3110.222 2 513+48.8 44.6±1.80 1200011610 1220011650 37.012.60 83 3110.8 3.3610.298 3 746±2.08 48.5±7.83 13800±1050 1400011010 32.511.92 71.714.99 2.62+0.206 4 537±31.0 43.6±3.27 1 15001783 1 1600+827 35.612.88 86.516.36 3.3410.113 5 622±39.7 62.1±3.85 1690011800 1770011990 46.211.86 57.016.07 3.3010,184 6 445±83.6 62.2±5.17 1260012370 1310012390 47.711.41 77.9114.4 4.6810.938 7 489126.5 87.0±3.25 143001583 158001728 54.310.372 63.312.99 5.3110.139 9 955±149 143±14.3 1660012190 2100014230 52.714.04 48.919.41 6.3510.349 CUADRO 5 Parámetros de PK comparativo de conjugados de mPEGn-O-hidroxicodona por vía oral dados a ratas Spra dawlev(Media ± SD) PEG- Cmáx Tia(2) AUCal, AUC¡nf T~máx MRT|ast %F longitud (ng/ml) mfn (mín. ng/ml) (mín. ng/ml) mín mín 0 25.5+1.86 NC 4520 ±1660 NC 15.0 179+17.4 7.1 1 14.3±6.43 57.7* 10501205 1150* 15.0 66.8+23.8 2.1 2 99.4±47.3 48.5±12.0 591012690 583012600 15.0 55.4114.7 9.4 3 44.5±29.4 65.6* 362011910 4210* 15.0 84.7H7.0 5.3 4 55.8±4.69 70.3* 634011810 5280* 15.0 96.6133.6 11.0 5 178±14.7 75.8±1.08 32800+2020 3330012090 15.0 12414.84 37.6 6 171±76.6 85.4±7.83 35100110100 36200+10200 120 15416.46 55.3 7 114138.0 1 5±29.2 2040013670 22200+2900 120 17816.09 28.1 9 27.6±19.6 106(ri=l) 7620+4510 13500 (n=l) 120 203+43.8 9.2 n = 2, NC: no calculado. Tmax se reporta como valor mediano.
Para resumir los resultados, la administración intravenosa de hidroxicodona PEGilado con diferentes longitudes-PEG oligoméricas (PEG1 a PEG9) resultó en la concentración plasmática variable y exposiciones, en comparación con oxicodona. PEG con longitudes de cadena 3, 5, 7 y 9 muestran exposición media más alta (AUC) mientras que PEG6 mostró exposición media comparable (AUC) y PEG con longitudes de cadena 1 , 2 o 4 mostraron exposición media inferior ligeramente (AUC). Los compuestos cuya longitud PEG es superior a 5 mostraron tendencias de evacuación menor, mayor volumen de distribución en estado estacionario, aumentan los valores de vida media de eliminación, con mayor longitud de PEG.
Administración oral de hidroxicodona PEGilada con diversos PEG-longitudes oligoméricas (PEG1 a PEG9) dio lugar a la mejora en la exposición de plasma con la excepción de hidroxicodona covalentemente unida a PEG1 y PEG3. Biodisponibilidad oral fue mayor para hidroxicodona covalentemente unida a mPEG6, 55.3%) seguido de mPEG5-hidroxicodona y mPEG7-hidroxicodona con 37.6% y 28.1 %, respectivamente. Los valores de vida media de eliminación mostraron una tendencia creciente con el aumento de la longitud de PEG.
EJEMPLO 22 Farmacocinética IV y PO de conjugados mPEGn-O-morfina Un estudio farmacocinético se llevó a cabo en ratas Sprague-Dawley como se describe en el ejemplo 20 anterior. Compuestos administrados fueron conjugados mPEGn-0-morfina donde n = I, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9, asi como el compuesto de origen, morfina. El objetivo fue determinar la farmacocinética del compuesto de origen y sus diversos conjugados de oligómero administrados por vía intravenosa y oral.
Un resumen de parámetros de plasma PK tras rutas IV (1 mg/kg) y PO (5 mg/kg) de morfina, mPEGi-O-morfina, mPEG2-0-morfina, mPEG3-0-morfina, mPEG4-0-morfina, mPEGr-O-morfina, mPEG6-0-morfina, mPEG7-0-morfina, mPEGg-O-morfina, se muestran en el cuadro 6 y 7, respectivamente.
Para el grupo intravenoso: la figura 12 muestra los perfiles de concentración media de plasma-tiempo para los conjugados mPEGn-0-morfina después de la administración intravenosa de 1.0 mg/kg a ratas. Parece haber un dato atipico en cada animal que es inconsistente con los perfiles de plasma de mPEG2-0-morfina y fueron excluidos del análisis de PK.
Basado en los datos observados (cuadro 6), mPEGg-O-morfina parece lograr mayor concentración plasmática con un valor ??2 medio 4 veces más que el valor correspondiente de ti/2 observado después de dar la morfina de origen.
CUADRO 6 Parámetros PK comparativos de conjugados de mPEGn-O-morfina proporcionados por vía intravenosa a r PEG- Cmáx T1/2(z) AUCal, AUCinf MRTlast CL Vss longitud (ng/ml) mín (mín. ng/ml) (mín. ng/ml) mín (ml/min/kg) (i/kg) 0 132±5.86 51.1±20.8 2730+276 27601218 28.516.79 364+27.5 14.914.0 1 483±37.1 40.0+2.58 11400+1230 11500+1260 29.8+5.05 87.8+9.40 2.75+0.236 2 378±48.8 38.118.03 75101106 7410+404 26.415.90 13517.60 4.210.270 3 483+81.0 45.0+2.73 12700+1950 12900+1990 39.3+1.69 78.5111.8 3.4310.616 4 622±72.5 52.9+6.50 14600+1140 1500011270 40.110.962 67.115.58 3.1710.168 5 514±38.6 68.4±0.826 13200+998 1400011050 49.7+1.20 71.6+5.17 4.74+0.347 6 805+30.6 93,7117.1 1900011430 21600+2060 56.213.84 46.6+4.67 4.39+0.630 7 1110±123 111+32.9 18100+956 2120011990 49.615.20 47.4+4.21 4.76+0.997 9 1840±123 204+28.3 2330011460 2900013240 34.212.72 34.713.64 4.52+0.473 Para el grupo oral, la figura 13 muestra los perfiles de concentración de plasma media-tiempo para lo anterior describe conjugados mPEGn-0-morfina tras la administración oral (5.0 mg/kg) a ratas.
Basado en los datos observados (cuadro 7), mPEG4-0-morfina parece alcanzar mayores concentraciones de plasma entre los conjugados probados en comparación con la molécula de origen, morfina.
CUADRO 7 Parámetros de PK comparativo de conjugados de mPEGn-O-hidroxicodona por vía oral dados a ratas Spra dawlev(Media ± SD) PEG- Cmáx Ti,2(z) AUCaII AUCinf Tm RTlasl %F longitud (ng/ml) mín (mín. ng/ml) (mín. ng/ml) mín min 0 29.8+7.78 144±32.1 5510±667 7230±897 15.0 194±22.0 40.4¥ 2 3.84* 104* 448* 778* 15.0* 60.7* 0.15 3 30.3±4.42 377* 4250±2140 8370* 15.0 151+69.4 9.0 4 87.1+53.6 191+104 15600±7690 18200± 0300 30.0 149+26.7 22.1 5 35.6±19.8 247* 9190±5650 17400* 120 205+26.2 13.9 6 42.8±31.2 121 * 8290+4970 10800* 120 177+29.4 8.7 7 9.38±0.883 236* 2210+221 2720* 60.0 187+32.0 2.4 9 7.15+3.34 363* 1360±31 1 2270* 15.0 166+26.0 1.2 Sin parámetros PK reportados para mPEG^morfina por todas las concentraciones fueron <LLOQ. *n=2 En resumen, para los datos IV, administración de morfina PEGilada oligomérica con diferentes longitudes de PEG (PEG1 a PEG9) resultó en concentraciones de plasma superior y la exposición (AUC) en comparación con la morfina per se. Hay una clara tendencia de aumento en la AUC media con aumento de PEG-longitud de 5 en adelante, con AUC media 10 veces superior para el compuesto PEG9-morfina en comparación con la morfina no conjugada. La vida media promedio y tiempo de residencia medio también aumentaron con el aumento de la longitud de PEG. Los valores inferiores de evacuación media eran consistentes con los valores AUC medios superiores observados.
Volumen medio de distribución estimado para el estado estacionario, inmediatamente disminuye 5 veces con la introducción del PEG sencillo y alcanzó un valor constante en PEG-longitud 5. En general, PEGilación parece aumentar la eliminación [V2 y reducir la distribución de tejidos de morfina.
Basándose en los datos orales, administración de conjugados de morfina PEGilados con diferentes longitudes de PEG (PEG1 a PEG9) resultó en una reducción en la biodisponibilidad oral en comparación con la morfina. La reducción en la biodisponibilidad parece estar relacionada con el componente de absorción, en lugar del componente de metabolismo para estos PEG-conjugados. Entre los PEG-conjugados, el conjugado con PEG-longitud 4 mostró un valor F máximo (22.1 %), mientras que los conjugados con PEG-longitud más corta o más larga mostraron una clara tendencia de pérdida de absorción.
En este estudio, el valor de % de morfina F es 3 superior al valor de la literatura de 15% a 7.5 mg/kg (J. Pharmacokinet. Biopharm. 1978, 6:505- 9). No se conocen las razones de esta mayor exposición.
EJEMPLO 23 Farmacocinética IV y PO de conjugados mPEGn-0-codeína Un estudio farmacocinético se llevó a cabo en ratas Sprague-Dawley como se describe en el ejemplo 20 anterior. Compuestos administrados fueron conjugados de mPEGn-0-codeína donde n = I, 2, 3, 4, 5, 6, 7 y 9, así como el compuesto de origen codeína (n = 0). El objetivo fue determinar la farmacocinética del compuesto de origen, es decir, codeína, y sus diversos conjugados de oligómero administrados por vía intravenosa y oral.
Un resumen de parámetros de plasma PK siguiendo las rutas IV (1 mg/kg) y PO (5 mg/kg) para codeína, mPEG-i-O-codeína, mPEG2-O-codeína, mPEG3-O-codeína, mPEG4-O-codeína, mPEG5-O-codeína, mPEG6-O-codeína, mPEG7-O-codeína, mPEGg-O-codeína, se muestran en el cuadro 8 y cuadro 9, respectivamente.
Para el grupo IV: la figura 14 muestra los perfiles de concentración media plasma-tiempo para la molécula de origen, codeína, así como para los conjugados de mPEGn-O-codeína descritos anteriormente, después de administración intravenosa.
Basado en los datos observados (cuadro 8), mPEG6-0-codeína pareció lograr mayor concentración plasmática entre los conjugados probados con un valor medio ti 2 aproximadamente 2.5 veces más que el valor de ti/2 correspondiente observado tras la administración de la molécula de origen, codeína.
CUADRO 8 Parámetros PK comparativos de codeína y sus conjugados PEG oliqoméricos administrados por vía intravenosa a ratas PEG- Cmáx T1/2(z) AUCal, AUCinf MRT|ast CL Vss longitud (ng/ml) mín (mín. ng/ml) (mín. ng/ml) mín (ml/min/kg) (i kg) 0 469±20.4 42.1±3.15 1100011600 11400+2070 40.219.08 89.7+15.3 4.14+0.700 1 723+31.2 42.1 ±4.84 15500+2020 1570012130 32.214.59 64.618.75 2.22+0.899 2 685± 1.0 35.3±2.78 14500+1590 14600+1590 31.5+2.96 69.017.57 2.25+0.166 3 732±27.1 39.411.49 1730011520 17400+1550 33.8+2.40 57.7+4.89 2.07+0.127 4 746±70.0 57.1143.8 15200+2160 1540012240 27.514.55 65.9+10.4 2.30+0.720 5 533±38.9 42.7+3.56 115001878 117001913 31.811.53 86.2+7.04 2.9510.157 6 1780±149 58.0+4.79 4560012020 47100+2000 41.713.08 21.3+0.876 1.0810.143 7 443±43.3 74.515.76 12700+481 13700+320 50.712.07 73.1+1.73 5.20+0.596 9 730+68.0 109+1.80 17800+2310 2080012840 57.2+2.46 48.616.74 5.18+0.538 Tmáx se reporta como valor mediano.
Para el grupo oral, la figura 15 muestra los perfiles de concentración de plasma media-tiempo para la molécula de origen, codeína, frente a conjugados de mPEGn-codeína después de la administración de ratas (5.0 mg/kg).
Basado en los datos observados (cuadro 9), compuesto PEG-6, mPEG6-codeína, parece lograr mayor concentración plasmática (52 veces superior a AUCall media) entre los conjugados probados como la molécula de origen, codeína.
CUADRO 9 Parámetros de PK comparativos de codeína y varios conjugados de mPEGn-Codeína administrados oralm a ratas Sprague Dawley(Media ± SD) PEG- Cmáx T,e(2) AUCa„ AUC¡nf T"máx MRTiast %F longitud (ng/ml) mín (mín. ng/ml) (mín. ng/ml) mín mín 0 6.24±2.51 80.8" 328±216 431" 15.0 33.2±12.9 0.60 2 3.47±0.606 97.6±28.4 351+195 419±226 15.0 62.0+27.4 0.57 3 25.0±6.59 125±64.6 1920±245 2080±498 15.0 71.0±9.16 2 39 4 31.1±13.1 118+60.0 2530±682 2670±870 15.0 83.8±22.5 3.47 5 48.7±10.8 125±63.7 5510±963 5890±1470 15.0 108±35.4 10.1 6 617±56.4 126±54.1 70500±12300 74500±10000 15.0 119111.1 31.6 7 76.6±12.8 97.6* 17100±4220 16000* 120 17 21.7 26.9 9 31.5±8.43 143* 7320±3330 6840* 15.0 179±21.6 8.22 No se reportan parámetros PK para NKT-10479 ya que las concentraciones son LLOQ. #: n=1, *. n = 2. Tmáx se reporta En resumen, para los datos de IV, PEGilación de codeína con diversas longitudes de PEG oligoméricas (PEG1 a PEG9) mejora la exposición (AUC media) sólo ligeramente y una mejora moderada (aproximadamente 4 veces) fue observada para el conjugado de PEG-6. La evacuación y el volumen de distribución disminuyen para este PEG-conjugado por 4 veces. Conjugados con PEG-longitudes de 7 y 9 muestran más valores medios \V2, sin embargo, la evacuación media y volumen medio de distribución (Vss) disminuyeron para conjugados de PEG7- y PEG9-codeína.
Para los datos orales, la biodisponibilidad oral de codeína es muy baja (F=0.52%). Biodisponibilidad oral parece aumentar con el aumento de PEG-longitud desde 2 en adelante, alcanzando un máximo con 32% de biodisponibilidad para el conjugado de codeína con PEG-longitud 6, disminuyendo a partir de entonces. En general, ha medio y valores de residencia medios se incrementan con PEG-longitud. No hay diferencias en el tiempo para alcanzar las concentraciones pico (Tmax = 15 min) entre todos los compuestos probados, sugiriendo que la absorción fue rápida y no se modificó la tasa de absorción.
EJEMPLO 24 Unión in Vitro de conjugados mPEGn-O-opioides a los receptores de opioides Las afinidades de enlace de los diversos conjugados de PEG-opioide (mPEGn-O-morfina, mPEGn-0-codeína y mPEGn-O-hidroxicodona) fueron medidas in vitro en preparaciones de membrana preparadas a partir de células CHO que expresan heterólogamente los receptores opioides mu, kappa o delta humanos clonados. El desplazamiento de radioligando fue medido mediante ensayos de proximidad de centelleo (SPA).
Brevemente, diluciones seriales de los compuestos de prueba se colocaron en una placa de 96 pocilios que se agregaron perlas de SPA, membrana y radioligando. Las condiciones de ensayo para cada subtipo de receptores de opioides se describen en el cuadro 10 a continuación. Las placas se incuban por 8 horas durante la noche a temperatura ambiente, se giran a 1000 rpm para granular las perlas de SPA y la radiactividad fue medida utilizando el contador de centelleo de microplaca TopCount®. El enlace específico en cada concentración del compuesto de ensayo se calculó restando el enlace no específico medido en presencia de exceso de ligando frío. Se obtuvieron valores de IC50 por regresión no lineal de unión específica frente a las curvas de concentración y los valores de Ki se calcularon utilizando los valores de Kd que fueron experimentalmente predeterminados para cada lote de preparaciones de membrana.
CUADRO 10 Condiciones de ensayo para ensayos de unión del receptor de opioide Las afinidades de enlace de los conjugados de PEG oligoméricos de morfina, codeína e hidroxicodona se muestran en el cuadro 1 1. En general, todos los conjugados muestran unión medible para el receptor mu-opioide, consistente con la farmacología conocida de las moléculas de origen. Para un tamaño determinado de PEG, el orden de rango de afinidad de unión de mu-opioide fue PEG-morfina > PEG-hidroxicodona > PEG-codeína. Aumentar el tamaño de PEG resultó en una disminución progresiva en la afinidad de unión de todos los conjugados de PEG al receptor de opioide mu en comparación con la molécula de origen no conjugada. Sin embargo, los conjugados de PEG-morfina todavía mantienen una afinidad de alta unión que estaba dentro de 15X de morfina de origen. Las afinidades de unión de mu-opioide de PEG-hidroxicodonas fueron 20-50 veces inferiores a aquellas de los conjugados de PEG-morfina. Codeína y sus conjugados de PEG unidos con muy poca afinidad a los receptores de opioides mu. Conjugados de PEG-morfina también se unen a los receptores de opioides kappa y delta; el orden de rango de selectividad fue mu > kappa > delta. Afinidades de unión de conjugados de codeína e hidroxicodona para los receptores de opioide kappa y delta fueron significativamente menores que aquellos en el receptor mu-opioide.
CUADRO 11 Afinidades de unión de los conjugados PEG-opioide a receptores de opioide N/A indica que los valores Ki no se pueden calcular ya que una inhibición del 50% de unión no , se logra en la concentración más alta del compuesto probado.
EJEMPLO 25 Eficacia in Vitro de conjugados de mPEGn-O-opioide para inhibir la formación de cAMP La eficacia de los diversos conjugados de PEG-opioide se mide por su capacidad para inhibir la formación de cAMP tras la activación del receptor. Se realizaron estudios en células CHO heterólogamente expresando los receptores de opioides humanos delta, kappa o mu. cAMP fue medido utilizando un ensayo de fluorescencia de tiempo resuelto homogéneo HiRange (ensayo HTRF), que se basa en un principio de inmunoensayo competitivo (Cisbio, # de Cat. 62AM6PEC).
Brevemente, suspensiones de células expresando receptores de opioides mu, kappa o delta se prepararon en regulador de pH que contiene 0.5 mM isobutil-xantina de metilo (IBMX). Las células fueron incubadas con concentraciones variables de conjugados de PEG-opioides y 3 µ? forskolina durante 30 minutos a temperatura ambiente. cAMP fue detectado siguiendo un protocolo de ensayo de dos pasos por las instrucciones del fabricante y fluorescencia de tiempo resuelto se midió con la siguiente configuración: excitación de 330 nm; emisión de 620 nm y de 665 nm; espejo dicroico de 380 nm. La proporción de 665nm/620nm se expresa como datos de Delta F% y datos relacionados con el compuesto de prueba se expresaron como un porcentaje de respuesta máxima promedio en pozos sin forskolina. Valores de EC50 se calcularon para cada compuesto de una gráfica de respuesta a la dosis sigmoide de concentraciones frente a la respuesta máxima. Para determinar si los compuestos se comportaron como agonistas completos o parciales en el sistema, la máxima respuesta a las más altas concentraciones probadas de compuestos fueron comparadas a la producida por un agonista completo conocido.
Se muestran los valores de EC50 de inhibición de la formación de cAMP en células enteras en el cuadro 12. Conjugados PEG oligoméricos de morfina, codeína e hidroxicodona fueron plenamente agonistas en los receptores de opioides mu, aunque con diferentes eficacias. Morfina y sus conjugados fueron el más potente de las tres series de opioides probados, mientras que conjugados de PEG hidroxicodona y PEG codeína muestran eficacias significativamente menores. Se observó una disminución progresiva en la eficacia de los conjugados de PEG-morfina con el aumento de tamaño de PEG, sin embargo los conjugados conservan la potencia mu-agonista dentro de 40X del origen. En contraste con el efecto en los receptores de opioides mu, morfina y conjugados de PEG-morfina se comportaron como agonistas parciales débiles en el receptor de opioide kappa, produciendo 47-87% de la máxima respuesta posible. Valores de EC50 no podrán calcularse para los conjugados de codeína e hidroxicodona en los receptores de opioides kappa y delta ya no se pueden generar curvas de dosis-respuesta completas con la gama de concentraciones probadas (hasta 500 µ?).
En general, los resultados de la actividad funcional y unión del receptor indican que PEG-opioides son agonistas mu in vitro.
CUADRO 12 Eficacias in vitro de conjugados PEG-opioide EJEMPLO 26 Cerebro: relaciones de plasma de conjugados de mPEGn-O-opioide La capacidad de conjugados de mPEG-O-morfina, mPEG-O-codeína y mPEG-O-hidroxicodona para cruzar la barrera de sangre cerebro (BBB) y entrar al SNC (sistema nervioso central) se evaluó midiendo la proporción de cerebro:plasma en ratas con posterioridad a la administración IV.
Brevemente, grupos de 3 ratas fueron inyectados por vía intravenosa (i.v) con 5 mg/kg de cada una de morfina, conjugado de mPEGn-0-morfina, codeína y conjugados de m-PEGn-O-codeína. Conjugados de PEG^-2,3 y 4-oxicodona fueron administrados en 10 mg/kg i.v. y oxicodona y los otros tamaños de PEG de conjugados de oxicodona fueron administrados en 1 mg/kg (i.v). Las dosis de los conjugados de oxicodona tenían que ajustarse para permitir la detección de suficientes concentraciones en el tejido cerebral. Atenolol, que no cruza la BBB, fue utilizado como una medida de contaminación vascular del tejido cerebral y fue administrado en una concentración de 10 mg/kg a un grupo separado de ratas. Una hora después de la inyección, los animales fueron sacrificados y plasma y el cerebro se reunieron y congelaron inmediatamente. Tras extracciones de tejido y plasma, las concentraciones de los compuestos en el cerebro y plasma fueron medidas mediante LC-MS/MS. La relación cerebro:plasma se calcula como la relación de las concentraciones medidas en el cerebro y el plasma. Los resultados se muestran en la fig. 16A-16C y en los cuadros A-C.
CUADRO A CUADRO B Molécula Relaciones cerebro: plasma CUADRO C Molécula Relaciones cerebro: lasma Figuras 16A, 16B y 16C junto con los cuadros A, B y C muestran las relaciones de cerebro:plasma de diversos conjugados oligoméricos mPEGn-O-morfina, mPEGn-O-codeína y PEGn-O-hidroxicodona, respectivamente. En cada figura se muestra la relación del cerebro:plasma de atenolol para proporcionar una base para la comparación. PEG-conjugación da como resultado una disminución en la relación de cerebro.plasma de todos conjugados en comparación a la molécula de origen no conjugada respectiva, que en el caso de hidroxicodona es la oxicodona. Sólo PEG-1 -morfina muestra una mayor relación de cerebro .plasma que su origen, morfina.
EJEMPLO 27 Duración de concentraciones de cerebro y plasma de diversos conjugados ejemplares de mPEGn-O-opioides Se realizaron experimentos para determinar las concentraciones de diversos conjugados PEG-opioide oligoméricos en cerebro y plasma con el tiempo tras administración IV.
La metodología experimental y concentraciones utilizadas fueron las mismas que aquellas usadas para los experimentos puntuales en el tiempo, sencillos, descritos en el ejemplo de 26, sin embargo, el cerebro y plasma fueron recolectados en varios puntos de tiempo diferentes.
Todos los conjugados de PEG-hidroxicodona fueron administrados en 10 mg/kg iv, mientras que la oxicodona de origen se administró en 1 mg/kg iv.
Los datos de las concentraciones de cerebro y plasma frente al tiempo para los diversos conjugados de PEG-opioide administrados se muestran en las figuras 17A-17H (serie de morfina), figura 18A-18H (serie de codeína) y figuras 19A-19H (serie de oxicodona/hidroxicodona).
Los datos demuestran que el aumento máximo en concentraciones de cerebro para todas las moléculas de origen y PEG-conjugados oligoméricos se producen en el primer punto temporal, es decir, 10 minutos después de la inyección iv. Conjugación de PEG resulta en una reducción significativa en las concentraciones de cerebro y con conjugados de PEG mayores (> PEG-4), las concentraciones de cerebro permanecen relativamente bajas y constantes en el tiempo.
EJEMPLO 28 Preparación de conjugados mPEGn-O-hidrocodonol Preparación de mPEGn-OT (mPEGn-tosilato) (n=1 a 9) 1) Ts20, Yb(OTf)3, 2) PVP/DCM n = 1 - 9 m-PEGn-OH, que puede ser secado bajo alto vacío (también después de la evaporación de una pequeña adición de heptano o tolueno), se disolvió en DCM. Anhídrido toluenosulfónico (TS2O, 1.05 EQ) y iterbio (II I) triflato (Yb(OTf)3, 0.02 eq) fueron añadidos y la reacción se dejo remover toda la noche (tasa de reacción oscila tan rápido como 1 día a 5 días para consumir completamente mPEGnOH). Una vez que fue consumido mPEGnOH, 2-3 equivalentes de polivinilpiridina se agregó con DCM adicional para mantener la agitación. Después de > 24 horas, el PVP se filtra y el filtrado se evapora para producir ~95-100% de rendimiento después de vacío total.
Preparación de síntesis de conjugado de alfa-6-mPEGn-O-Hidrocodonol síntesis conjugado (n = 1 a 9) Alfa-6-mPEGn-O-hidrocodonol fue preparado de conformidad con el esquema que se proporciona a continuación (donde sustancialmente el mismo método se utilizó para cada n = 1 a 9).
Preparación de la base libre hidroxicodona Sal de bitartrato de hidrocodona fue disuelta en agua. A esto se añadieron 2 equivalentes de NaHC03 sólido. Hidrocodona precipita y diclormetano se agregó. La solución bifásica se deja agitar durante veinte minutos. Luego se separaron las capas y la capa acuosa básica se extrajo dos veces con diclorometano. La capa orgánica fue secada sobre MgS04 y evapora para dar la base libre de hidrocodona como un polvo blanco. Rendimiento aislado fue en general 95+%.
Preparación de base libre de 6-h¡drocodonol Hidrocodona fue disuelta en THF y enfriada a -20°C. Una solución de 1M K-Selectrida en THF se añadió a la solución de agitación a gotas durante aproximadamente una hora. Cuando la reacción es completada, se templa con 5 equivalentes de HCI 1 M y el THF eliminado en vacío. La solución se extrae tres veces con éter etílico. Se descartaron las capas orgánicas y la capa de ácido fue alcalina con K2C03 y se extrae tres veces con cloroformo. La capa orgánica se evapora para obtener la 6-hidrocodonol como un sólido. Rendimiento aislado fue generalmente de 95+%. Masa Exp. = 301.4 M+H = tiempo de retención 302.5 = 0.79 minutos.
Preparación de alquilación de 6-hidrocodonol con mPEGn-OT Hidrocodonol fue disuelto en la mínima cantidad de tolueno anhidro posible con calentamiento y un baño de ultrasonidos. A la solución de temperatura ambiente se agregaron 2 eq NaH (60% de dispersión en aceite mineral) en porciones con buena agitación. La mezcla se deja agitar a temperatura ambiente durante diez minutos y luego una solución qüe contiene 1.3 eq. de mPEGn-OT en tolueno se agregó por más de cinco minutos. Después de 15 minutos a temperatura ambiente, la mezcla se calienta en un baño de aceite de 60°C durante la noche. Análisis LC-MS mostró un consumo total de materiales de partida. La mezcla se templa vertiendo en agua y tolueno se quitó en vacío. El residuo acuoso se extrajo con CHCI3 y se descarta la capa acuosa. Las capas orgánicas combinadas fueron lavadas con NaHC03 saturado 1/2 y se extraen con 1 M HCI (ac) con agitación vigorosa. Las capas acuosas combinadas fueron lavadas con CHCI3 y concentradas en vacío para dar el producto crudo como aceite color ámbar oscuro.
El residuo fue purificado por HPLC fase inversa usando una columna C8. El rendimiento post-purificación en general fue de 25-50%, como se muestra en el cuadro 13.
CUADRO 13 Rendimientos para compuestos ejemplares alfa-6-mPEGn-O-Hidroxodonol Conversión a clorhidrato de alfa-6-mPEGn-O-hidrocodonol (n = 1 a 9) Sal de TFA mPEGn-hidrocodonol purificada con HPLC fue disuelta en 1M HCI (ac) y concentró en vacío. El residuo nuevamente fue disuelto en 1M HCI (ac) y se concentrado en vacío. El residuo formo azeótropo tres veces con acetonitrilo para dar sal HCI mPEGn hidrocodonol como un vidrio ámbar ligero.
El material resultante fue purificado a través de una columna C18 (Phenomenex Kinetics 50x3.0), donde la temperatura de columna fue de 40°C, el caudal fue de 1.5 mi por minuto, fase móvil A de 0.1% TFA/agua y fase móvil B de 0.1 %TFA/ACN y el gradiente tras 5%B al 100%B más de cuatro minutos, con una estancia en 100%B por un minuto y, a continuación, equilibrado a 5%B más de un minuto. Los resultados de purificación figuran en el cuadro 14.
CUADRO 14 Rendimientos para compuestos ejemplares alfa-6-mPEGn-O-hidrocodonol Usando ensayos de afinidad de unión del receptor opioide mu in vitro convencionales, valores de IC50 se determinan para cada uno de los compuestos alfa-6-mPEGn-O-hidrocodonol. Los resultados se proveen en el cuadro 15 CUADRO 15 Datos de unión del receptor para compuestos ejemplares alfa-6-mPEGn-0-hidrocodonol

Claims (20)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Un compuesto que tiene la fórmula: en donde n es un número entero que tiene un valor de 1 a 9, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 1.
3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 2.
4. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 3.
5. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 4.
6. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 5.
7. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 6.
8. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 7.
9.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 8.
10. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 9.
1 1 . - Un compuesto que tiene la fórmula: en donde n es un número entero que tiene un valor de 1 a 9, y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.
12. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque n es 1.
13. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque n es 2.
14. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 1 , caracterizado además porque n es 3.
15. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque n es 4.
16. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque n es 5.
17.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque n es 6.
18. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque n es 7.
19. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizado además porque n es 8.
20. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque n es 9.
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